CN114392268A

CN114392268A - 鸡油菌多糖在制备竞争型葡萄糖苷酶抑制剂方面的应用

Info

Publication number: CN114392268A
Application number: CN202111618087.5A
Authority: CN
Inventors: 曾念开; 张玉卓; 王勇; 张絮; 徐畅; 韩云霄; �田润
Original assignee: Hainan Zhumei Agricultural Technology Co ltd; Hainan Medical College
Current assignee: Hainan Zhumei Agricultural Technology Co ltd; Hainan Medical College
Priority date: 2021-12-27
Filing date: 2021-12-27
Publication date: 2022-04-26

Abstract

本研究试验表明鸡油菌多糖可作为竞争型葡萄糖苷酶抑制剂使用。本发明将云南鸡油菌粗多糖通过蒸馏水和NaCl洗脱分离纯化后得到6个组分，分别为CY‑0、CY‑1、CY‑2、CY‑4、CY‑8、CY‑10，试验表明CY‑2组分属于竞争型抑制葡萄糖苷酶活性的组分，且CY‑2对α‑葡萄糖苷酶抑制为可逆性的。本研究可为相关葡萄糖苷酶抑制剂的研制和生产提供理论依据，有利于推动葡萄糖苷酶抑制剂相关产业的发展。

Description

鸡油菌多糖在制备竞争型葡萄糖苷酶抑制剂方面的应用

技术领域

本发明涉及药物技术领域，特别涉及鸡油菌多糖在制备竞争型葡萄糖苷酶抑制剂方面的应用。

背景技术

鸡油菌Cantharellus spp.在分类上隶属于鸡油菌目Cantharellales齿菌科Hydnaceae，其子实体香味独特，脆嫩可口，营养丰富，同时可预防视力下降、眼炎、皮肤干燥以及抵抗呼吸道传染病等疾病。对于鸡油菌多糖药理活性的研究过去主要集中在抗氧化、免疫调节和抗肿瘤等方面，对于抑制α-葡萄糖苷酶活性方面的研究较少。

靳文娟等^[1]采用酶-抑制剂模型检测硫酸化鸡油菌多糖(S-CCP)与鸡油菌多糖(CCP) 对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。实验结果表明，S-CCP与CCP对α-葡萄糖苷酶活性的抑制呈现良好量效性，在浓度为2mg/mL时，S-CCP与CCP对酶的抑制率均达到最大值，分别为64.7％与43.8％。S-CCP与CCP两者对α-葡萄糖苷酶抑制类型分别为混合型抑制与非竞争型抑制。可见，虽然鸡油菌多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性已有少数报道，但是天然鸡油菌多糖(CCP) 对酶的抑制率偏低，且抑制类型为非竞争性抑制，尚未发现从鸡油菌中分离得到竞争性抑制类型的高效抑制α-葡萄糖苷酶的多糖的相关报道。

[1]靳文娟,鲁晓翔.硫酸化鸡油菌多糖对α-葡萄糖苷酶活性的影响[J].食品科技,2012, 37(8):168–172.

发明内容

鉴于现有技术的不足，本研究以中国民间广泛食用的云南鸡油菌C.yunnanensisW.F.Chiu 为研究对象，分离出了抑制α-葡萄糖苷酶活性效果较好且属于竞争型抑制类型的多糖组分。本研究成果可以为α-葡萄糖苷酶抑制剂的研制提供参考。结合本研究成果，本申请提出一种鸡油菌多糖在制备竞争型葡萄糖苷酶抑制剂方面的应用。

本发明方案包括以下内容：

本发明提供了鸡油菌多糖在制备竞争型葡萄糖苷酶抑制剂方面的应用。

优选的，所述鸡油菌为云南鸡油菌。

优选的，所述葡萄糖苷酶包括α-葡萄糖苷酶。

优选的，所述抑制剂为可逆抑制剂。

本发明还进一步提供了所述的鸡油菌多糖的制备方法，该方法包括以下步骤：

取粗多糖，使用DEAE-52柱进行洗脱分离，洗脱液为浓度0～1.0mol/L的NaCl溶液；将洗脱后所得的组分进行纯化，即得精制多糖。

优选的，所述粗多糖为：采用水提醇沉法提取得到鸡油菌多糖溶液，再通过除蛋白及脱色后得到的粗多糖。

优选的，所述的鸡油菌多糖的制备方法包括以下步骤：

S1：取鸡油菌粉末，加乙醇溶液，超声提取后静置，弃上层清液，保留沉淀；沉淀中加入水，水浴加热浸提，过滤，保留滤液，浓缩滤液，得浓缩液；浓缩液中加入乙醇溶液，静置得沉淀；沉淀加水溶解后，加氯仿-正丁醇混合液进行萃取，去除蛋白质，得上清液，将上清液浓缩得浓缩液；将浓缩液进行脱色处理；脱色后得到的溶液加入乙醇溶液进行沉淀，离心后将沉淀冷冻干燥，得到粗多糖；

S2：将粗多糖加水溶解，然后使用DEAE-52柱进行分离，洗脱液为浓度0～1.0mol/L的 NaCl溶液，将洗脱后所得的组分浓缩，得浓缩液；注：粗多糖溶液可离心去除不溶物后再进行柱分离。

S3：将步骤S2所得浓缩液装入透析袋中用水进行透析，将透析后的浓缩液进行冷冻干燥，即得精制多糖。

优选的，洗脱液为浓度0.1～0.2mol/L的NaCl溶液。

优选的，步骤S1所述水浴加热浸提为：70～80℃水浴加热浸提至少2h。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明采用水提醇沉法提取云南鸡油菌多糖，利用DEAE-52纤维素柱，用蒸馏水和不同浓度的氯化钠对粗多糖进行分离，得到纯化多糖CY-0、CY-1、CY-2、CY-4、CY-8、CY-10。进一步研究表明：在α-葡萄糖苷酶抑制活性实验中，云南鸡油菌粗多糖和纯化多糖都表现出一定的抑制活性，且在相同浓度下，CY-2的抑制活性大于其他多糖，粗多糖的抑制活性小于其他纯化多糖，在0.25～2.0mg/mL的浓度范围内，各纯化多糖表现出不同的抑制活性趋势。抑制机制和酶动力学的实验表明CY-2对α-葡萄糖苷酶的抑制机制为可逆抑制，CY-2与α-葡萄糖苷酶可逆结合造成酶失活。CY-2对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为竞争抑制，抑制剂的浓度越大，其抑制作用越强。本研究可为相关葡萄糖苷酶抑制剂的研制和生产提供理论依据。

附图说明

图1：云南鸡油菌粗多糖、CY-0、CY-1、CY-2、CY-4、CY-8、CY-10以及阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制率曲线；

图2：2mg/mL、4mg/mL CY-2对α-葡萄糖苷酶的抑制机理的判定；

图3：2mg/m L CY-2对α-葡萄糖苷酶的抑制类型的判定。

具体实施方式

为对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，发明人结合实施例和附图进行说明，但以下实施例所描述的仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1云南鸡油菌粗多糖的提取

取鸡油菌粉末50g，加95％的乙醇1000mL，置于40℃的超声波仪器中超声30min，在超声过程中适当搅拌；常温静置过夜，弃上层清液，回收乙醇，保留沉淀；沉淀加入1000mL的蒸馏水，在70℃水浴锅内浸提2h，过滤，保留滤液，滤渣加入1000mL蒸馏水继续提取，一共提取4次，合并滤液，65℃旋转蒸发浓缩至250mL左右；浓缩液装入锥形瓶于恒温磁力搅拌器上边搅拌边加入4倍体积量95％的乙醇进行沉淀，并在4℃下静置24h；利用离心机(4000rpm，10min)将沉淀下来的多糖与乙醇分离，弃上清液，回收乙醇，得到沉淀。沉淀加200mL蒸馏水，搅拌均匀，使沉淀溶解；将沉淀溶解得到的溶液加入分液漏斗中并加入200mL的Sevage试剂(氯仿:正丁醇＝4:1，V/V)进行萃取，去除蛋白质，保留上清液，重复此过程3次，将上清液合并后适当浓缩，得浓缩液350mL，加入35g SP 825大孔树脂 (上海摩速科学器材有限公司)，置恒温摇床中脱色6h；脱色后得到的溶液加入4倍体积 95％乙醇进行沉淀，用保鲜膜封口，4℃静置过夜，离心(4000rpm，10min)，上清液置旋转蒸发仪60℃浓缩，回收乙醇；醇沉离心后将沉淀放入冷冻真空干燥机，冷冻干燥24h，得到云南鸡油菌粗多糖。

实施例2云南鸡油菌多糖的分离纯化

2.1 DEAE-52纤维素预处理

用电子天平称取纤维素75g加入适量蒸馏水，搅拌处理后密封，放置冰箱溶胀48h，弃去上层浑浊液，加入250mL 0.5mol/L的NaOH溶液，浸泡2h后用蒸馏水洗脱至中性。

2.2 DEAE-52纤维素装柱

将层析柱(4.5×80cm)垂直固定，加入去离子水100mL，把预处理好的DEAE-52纤维素缓慢倒入，用去离子水平衡静置12h。

2.3 DEAE-52柱色谱分离

精密称取1.5g云南鸡油菌粗多糖(即冷冻干燥后)溶解至10mL蒸馏水，装至离心管， 12000rpm，15min离心，保留上清液，舍弃沉淀；分别用蒸馏水、NaCl溶液(0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mol/L)洗脱，控制好洗脱速度，设定自动收集装置3min一次，以10mL装一管，每隔5管进行一次测定，检测方法为用苯酚-硫酸法；将各级洗脱液合并并且浓缩至15～20mL。

2.4粗多糖纯化

将透析袋剪至15cm长，在沸水中煮10min，取出将各级浓缩液装入透析袋MD34中，在自来水中透析24h，期间换自来水3次，接着，在蒸馏水中透析12h，期间换蒸馏水3次，透析后的浓缩液进行真空冷冻干燥24h，即得到各级组分云南鸡油菌精制多糖。

将得到的各级组分云南鸡油菌精制多糖分别命名为CY-0(蒸馏水洗脱)、CY-1(0.1mol/L NaCl洗脱)、CY-2(0.2mol/L NaCl洗脱)、CY-4(0.4mol/L NaCl洗脱)、CY-8(0.8mol/L NaCl洗脱)、CY-10(1.0mol/L NaCl洗脱)。

实施例3α-葡萄糖苷酶活性测定

参考李思维等^[2]的方法并稍作修改。

[2]李思维,卫倩倩,宋宵,等.党参多糖的抗氧化及降糖活性研究[J].临床医学研究与实践,2020,5(32):8–11.

3.1云南鸡油菌多糖样品的配制

精密称取云南鸡油菌多糖样品10mg，用4mL 0.01mol/L的PBS溶液(磷酸盐酸缓冲溶液)溶解，得到2.5mg/mL的云南鸡油菌多糖溶液，并将其稀释至0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL的多糖溶液各1mL。

3.2α-葡萄糖苷酶活性测定

云南鸡油菌多糖样品组：吸取云南鸡油菌多糖40μL于96孔板中，加入30μL的α-葡萄糖苷酶(0.2U/mL)，轻晃混匀，在37℃的生化培养箱中孵育10min，然后加入30μL的PNPG(4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷)溶液(0.5mmol/L)，在37℃的生化培养箱中孵育20min，最终在每孔加入50μL的碳酸钠溶液(0.2mol/L)终止反应，5min后用酶标仪在405nm下测定其吸光度；将上述步骤中的“加入30μL的α-葡萄糖苷酶(0.2U/mL)”改为“加入30μL 的PBS溶液”，其余步骤相同，则为云南鸡油菌样品对照组；空白对照组为用等量的PBS 溶液代替云南鸡油菌多糖，其余步骤相同；用阿卡波糖溶液作为阳性对照，每个样品三次平行实验。α-葡萄糖苷酶的抑制活性计算公式如下：

α-葡萄糖苷酶抑制率(％)＝[1–(A₁–A₂)/A₀]*100％

公式中A₁为云南鸡油菌多糖样品组的吸光度；A₂为云南鸡油菌多糖样品对照组的吸光度；A₀为空白对照组的吸光度。

3.3结果与分析

由图1可知，云南鸡油菌粗多糖以及纯化的各多糖组分对α-葡萄糖苷酶均有抑制作用。在0.25mg/mL～2.0mg/mL的范围内，云南鸡油菌粗多糖的抑制效率随浓度的增加而增加，但大于2.0mg/mL，抑制作用降低，在2.0mg/mL出现峰值。纯化多糖中CY-0、CY-4、CY-10 在多糖浓度为0.25mg/mL～2.5mg/mL的范围内呈现上升的趋势，且CY-4和CY-10随着浓度的增大，抑制作用增长幅度较CY-0大，CY-4对α-葡萄糖苷酶的抑制率从33.88％到61.43％， CY-10对α-葡萄糖苷酶的抑制率从33.68％到56.63％；CY-1、CY-2、CY-8在多糖浓度为0.25 mg/mL～2.5mg/mL的范围内呈现下降的趋势。在相同浓度的条件下，纯化后的云南鸡油菌多糖的抑制作用比粗多糖的抑制效率较好，其中CY-2的抑制效率最好，总体在68％以上，CY-2 在1.0mg/mL的时候抑制率出现峰值，抑制率达到75.25％，1.0mg/mL后抑制率趋于平缓。

实验结果表明，云南鸡油菌粗多糖和纯化多糖对α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，且与浓度有关。鸡油菌粗多糖的抑制作用小于纯化多糖的原因可能是各纯化多糖综合作用的结果。

实施例4α-葡萄糖苷酶抑制动力学

参照靳文娟等^[1]的方法。

4.1 PNP标准曲线的制作

依次向试管中加入0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL的PNP溶液(0.5 mmol/L)，再加入0.2mol/L的碳酸钠溶液至2.31mL，以蒸馏水为空白对照，用酶标仪在405 nm处测定其吸光度；以PNP的体积为横坐标，吸光度为纵坐标，做线性回归方程。

4.2云南鸡油菌多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制类型的确定

在固定底物PNPG的条件下，改变α-葡萄糖苷酶的用量，测定不同浓度的云南鸡油菌多糖对α-葡萄糖苷酶抑制的影响。以0.5mmol/L的PNPG为底物，不添加多糖为对照组，不同浓度的云南鸡油菌多糖为样品组，改变酶量为30、60、90、120μL，酶浓度为0.2U/mL；在96孔板中加入40μL的云南鸡油菌多糖，以30μL的PNPG混匀，后加入30、60、90、120μL 的酶液，轻晃混匀，置于37℃的生化培养箱中孵育15min，最终在每孔加入50μL的碳酸钠溶液(0.2mol/L)终止反应，用酶标仪在405nm下测定其吸光度。代入PNP标准曲线中求酶活力。以酶用量为横坐标，酶活力为纵坐标作图。根据动力学分析，判断是可逆抑制还是不可逆抑制。

酶活力单位的定义：在37℃、pH 6.8的条件下，在1min内PNPG能转化1μmol PNP 的酶量。

4.3云南鸡油菌多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学分析

研究云南鸡油菌多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型。在固定酶浓度为0.2U/mL的条件下，改变加入底物PNPG的浓度，测定云南鸡油菌多糖对α-葡萄糖苷酶酶活力的影响。方法同4.2，改变底物PNPG浓度为0.125、0.25、0.5、1.0、2.0mmol/L。以酶反应的初速度对底物浓度作图，通过Lineweaver-Burk双倒数方程作图，并判断抑制类型。

4.4结果与分析

4.4.1 CY-2对α-葡萄糖苷酶的抑制作用机理分析

抑制剂分为不可逆抑制剂和可逆抑制剂，在酶活体系中，不可逆抑制剂的存在，会使酶分子构象发生永久变化而失活，表现在其速率直线的原点向右平移，即直线不过原点；若有可逆性抑制剂存在，可得到一条过原点的直线，但斜率低于无抑制剂的。

由图2可知，α-葡萄糖苷酶经过2mg/mL CY-2作用后，酶量和酶活力之间的关系，通过对数据拟合，得到一条直线，方程为y＝0.0624x+0.0052，R²＝0.9863；α-葡萄糖苷酶经过4 mg/mL CY-2作用后，酶量和酶活力之间的关系，通过对数据拟合，得到一条直线，方程为y ＝0.0658x+0.0047，R²＝0.9913，两条曲线的纵截距很小，可近似于0，即过原点。CY-2的浓度增加，直线斜率降低，说明CY-2对α-葡萄糖苷酶的抑制属于可逆作用，抑制剂CY-2和底物PNPG竞争与α-葡萄糖苷酶的同一活性中心结合，从而干扰了酶与底物的结合，使酶的催化活性降低。

4.4.2 CY-2对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学分析

在测活体系中，加入一定浓度的α-葡萄糖苷酶溶液，改变底物PNPG的浓度，测定CY-2 对α-葡萄糖苷酶活力的影响，由Lineweaver-Burk双倒数做图法得到图3。2mg/mL CY-2条件下，对实验数据进行拟合，得到一条直线，直线方程为y＝304.69x+91.285，R²＝0.9934，没有抑制剂CY-2的作用条件下得到的直线方程为y＝164.47x+97.759，R²＝0.998。

由图3可知，在抑制剂CY-2存在时，直线斜率增大，此时横轴截距所代表的的表观Km 值增大，即酶对底物的亲和力降低；根据拟合得到的两条直线相交于第一象限，有抑制剂存在直线斜率增大，故可判定CY-2对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为竞争性抑制。由于CY-2和α- 葡萄糖苷酶的结合是可逆的，所以抑制程度取决于抑制剂CY-2与α-葡萄糖苷酶的相对亲和力以及底物浓度的相对比例。

在抑制机制和酶动力学的实验中表明CY-2对α-葡萄糖苷酶的抑制机制为可逆抑制，CY-2 与α-葡萄糖苷酶可逆结合造成酶失活。CY-2对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为竞争抑制，抑制剂的浓度越大，其抑制作用越强。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.鸡油菌多糖在制备竞争型葡萄糖苷酶抑制剂方面的应用。

2.根据权利要求1所述鸡油菌多糖在制备竞争型葡萄糖苷酶抑制剂方面的应用，其特征在于，所述鸡油菌为云南鸡油菌。

3.根据权利要求1所述鸡油菌多糖在制备竞争型葡萄糖苷酶抑制剂方面的应用，其特征在于，所述葡萄糖苷酶包括α-葡萄糖苷酶。

4.根据权利要求1所述鸡油菌多糖在制备竞争型葡萄糖苷酶抑制剂方面的应用，其特征在于，所述抑制剂为可逆抑制剂。

5.根据权利要求1所述鸡油菌多糖在制备竞争型葡萄糖苷酶抑制剂方面的应用，其特征在于，所述的鸡油菌多糖的制备方法包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述鸡油菌多糖在制备竞争型葡萄糖苷酶抑制剂方面的应用，其特征在于，所述粗多糖为：采用水提醇沉法提取得到鸡油菌多糖溶液，再通过除蛋白及脱色后得到的粗多糖。

7.根据权利要求1所述鸡油菌多糖在制备竞争型葡萄糖苷酶抑制剂方面的应用，其特征在于，所述的鸡油菌多糖的制备方法包括以下步骤：

S1：取鸡油菌粉末，加乙醇溶液，超声提取后静置，弃上层清液，保留沉淀；沉淀中加入水，水浴加热浸提，过滤，保留滤液，浓缩滤液，得浓缩液；浓缩液中加入乙醇溶液，静置得沉淀；沉淀加水溶解后，加氯仿正丁醇混合液进行萃取，去除蛋白质，得上清液，将上清液浓缩得浓缩液；将浓缩液进行脱色处理；脱色后得到的溶液加入乙醇溶液进行沉淀，离心后将沉淀冷冻干燥，得到粗多糖；

S2：将粗多糖加水溶解，然后使用DEAE-52柱进行分离，洗脱液为浓度0～1.0mol/L的NaCl溶液，将洗脱后所得的组分浓缩，得浓缩液；

8.根据权利要求5～7任一项所述鸡油菌多糖在制备竞争型葡萄糖苷酶抑制剂方面的应用，其特征在于，洗脱液为浓度0.1～0.2mol/L的NaCl溶液。

9.根据权利要求7所述鸡油菌多糖在制备竞争型葡萄糖苷酶抑制剂方面的应用，其特征在于，步骤S1所述水浴加热浸提为：70～80℃水浴加热浸提至少2h。