CN116515647A - 一种溜曲霉及其在制备单宁酶和/或降解单宁中的应用 - Google Patents
一种溜曲霉及其在制备单宁酶和/或降解单宁中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种溜曲霉及其在制备单宁酶和/或降解单宁中的应用，涉及单宁降解技术领域。本发明将溜曲霉TPPDA‑11的活菌体、死菌体和发酵清液中的至少一种用于制备菌剂，且溜曲霉TPPDA‑11应用于制备单宁酶和/或降解单宁中；为单宁酶的生产开发提供了新的路径，本发明解决了现有技术中缺乏降解单宁微生物菌种的问题。
Description
技术领域
本发明涉及单宁降解技术领域，具体涉及一种溜曲霉及其在制备单宁酶和/或降解单宁中的应用。
背景技术
抗营养因子是影响营养物质消化吸收和动物机体健康与生产的一类物质的统称。常见植物源饲料虽然富含营养物质，但存在一些抗营养因子，制约着植物源饲料的吸收和利用，植物源饲料中常见抗营养因子主要包括单宁、植酸、胰蛋白酶抑制因子和皂苷等。单宁是一类能够沉淀蛋白质的酚类化合物，也是一种典型抗营养因子，其会破坏并阻碍营养物质的消化利用，尤其是对单胃和水产动物。单宁的抗营养特性主要通过两条途径：其一是单宁能够沉淀蛋白质而影响蛋白质的吸收利用；其二是单宁能够沉淀重金属引起机体离子稳态失衡。一些饲用植物具有高含量的单宁，在饲料中的应用受到了严重的限制，如何高效的降解饲用植物中单宁已成研究难点与热点。
目前，降解饲料中单宁的方法主要包括物理、化学和微生物发酵，其中，物理和化学方法成本高、降解率低、且易污染环境；而微生物发酵方法相对低廉且不易污染环境，微生物发酵方法主要利用微生物分泌产生单宁酶来降解单宁，微生物发酵技术不仅能够改善饲料的营养成分，还可以破坏饲料中的有害因子，减少抗营养因子含量，促进饲料原料的消化与吸收。因此，开发能够产生单宁酶进而降解单宁的微生物菌种是目前亟待解决的问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种溜曲霉及其在制备单宁酶和/或降解单宁中的应用，以解决现有技术中缺乏降解单宁的微生物菌种的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种溜曲霉（Aspergillus tamarii），命名为溜曲霉 TPPDA-11，于2023年05月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63452，保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，溜曲霉的ITS核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
本发明还提供上述溜曲霉在制备单宁酶和/或降解单宁中的应用。
本发明还提供一种菌剂，包括上述的溜曲霉。
进一步，溜曲霉为活菌体、死菌体和发酵清液中的至少一种。
进一步，发酵清液通过以下方法制备得到：将溜曲霉进行发酵培养，固液分离，得发酵清液。
进一步，发酵培养时，接种量为1×106-1×108CFU/mL，转速为100-120rpm，温度为20-30℃，时间为72-96h。
进一步，在12000rpm和4℃条件下固液分离20min。
本发明提供的溜曲霉经过培育能够产生大量的溜曲霉活菌体，本发明对培养方法没有特别的限制，只要通过该培养方法可以使所述溜曲霉大量增殖即可，例如，可以将溜曲霉在平板培养基中培养至产孢，利用生理盐水洗脱孢子并充分振荡、稀释后获得孢子悬浮液，孢子液可以4℃冰箱下保存备用，或者直接接种至发酵培养基中进行发酵培养。
本发明还提供一种降解单宁的方法，包括以下步骤：
将上述溜曲霉和含有单宁的样品按体积比1-3：1进行发酵。
进一步，在pH值4-6、20-30℃和100-120rpm条件下发酵72-96h。
进一步，含有单宁的样品中，单宁含量为10-20g/L。
发酵后可以采用加入甲醇的方式终止降解，发酵后还可以进一步对单宁经降解获得的产物进行纯化处理，例如，采用萃取、结晶、过滤等方式；含有单宁的样品可以为含有单宁的溶液，单宁具体可以为鞣花单宁、没食子单宁；含有单宁的样品也可以通过将含有单宁的植物原料经提取处理得到。
发酵可以是将溜曲霉的发酵菌体（活菌体或者死菌体）与含有单宁的样品混合，使得溜曲霉中的单宁酶对单宁进行降解，也可以是将溜曲霉的发酵产物(含有单宁酶的发酵清液，或者从溜曲霉的发酵液中提取、纯化得到的单宁酶)与所述含有单宁的样品混合，以对单宁进行降解。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明筛选得到了能降解单宁的溜曲霉 TPPDA-11，然后将其用于制备单宁酶和/或降解单宁中，为单宁酶的生产开发提供了新的路径，有效解决了生物降解抗营养因子单宁的生产问题。
2、本发明的溜曲霉 TPPDA-11在制备单宁酶和降解单宁中具有很好的效果，经发酵培养得到的发酵清液中单宁酶的酶活性较高，对单宁的特异性转化能力强；其单宁降解率最高为94%，具有很好的应用价值。同时，本发明溜曲霉 TPPDA-11中的单宁酶在进行单宁降解时，使用便捷，具有广泛的pH和温度的耐受性，酶解效率高。
附图说明
图1为初筛菌株形态学示意图；
图2为复筛菌株孢子液形态学示意图；
图3为菌种发育树示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：溜曲霉 TPPDA-11的分离筛选
通过传统分离方法从华南农业大学林学院辣木树下的土样分离筛选微生物，具体步骤如下：
S1、采样：采集华南农业大学林学院辣木树下的土样（北纬23°07’，东经113°19’）；
S2、富集：取10g土样于90mL的无菌水中，于28℃、120 rpm条件下培养过夜。过夜培养液采用梯度稀释的方法稀释至10-1-10-5，富集培养基选用马铃薯葡萄糖培养基（主要成分为马铃薯提取液、葡萄糖），将梯度稀释后的菌液以2vt%的接种量接种于马铃薯葡萄糖培养基中，进行富集培养得到富集菌株；
S3、初筛：选用察氏固体培养基外加单宁酸作为初筛培养基，外加0.04g/L溴酚蓝作为指示剂，将S2得到的富集菌株取200 μL接种于初筛培养基中进行涂布，37℃下培养4d，通过初筛培养基中的溴酚蓝指示剂是否有显色反应，并形成透明圈及透明圈直径与菌体直径比值大小(D/d)，筛选出初筛菌株，具体可参见图1所示；
S4、复筛：选用察氏固体培养基外加单宁酸作为复筛培养基，将S3得到的初筛菌株取200 μL接种于复筛培养基中进行涂布，37℃下培养4d，培养至产孢，用无菌水对孢子进行洗脱制成孢子液，筛选出复筛菌株，具体可参见图2所示；
S5、复筛种子培养：选用察氏液体培养基外加单宁酸、葡萄糖及NaCl作为复筛种子培养基，将孢子液以接种量为106-108CFU/mL接种于复筛种子培养基中，在温度为30℃、转速为120rpm的条件下进行复筛种子培养96h，得到复筛种子液；再将复筛种子液以接种量为2vt%接种至复筛发酵培养基中，在温度为30℃、转速为120rpm的条件下进行复筛发酵培养96h，得到复筛发酵液；取复筛发酵液在温度为4℃、转速为12000rpm的条件下离心20min得到的上清液为复筛发酵清液，采用BCA法测定复筛发酵清液和离心沉淀物中的蛋白含量，计算得到复筛发酵清液中胞外蛋白达到3.41µg/µL，复筛发酵沉淀物中胞内蛋白达到3.39µg/µL；
S6、将S4得到的终筛菌株接种于PDA培养基，利用引物ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）和ITS5（GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）对复筛菌株基因进行PCR扩增，对PCR扩增后的产物进行测序，序列测定由上海生工生物工程公司完成，序列测序结果如SEQ ID NO：1所示，将所测序序列提交至NCBI（National Center for BiotechnologyInformation），所测序列与NCBI数据库中进行比对，结果显示该序列与溜曲霉同源性为100%，说明本发明分离的降解单宁的菌株为溜曲霉（菌种发育树见图3）；
其中，初筛培养基包括30g/L的蔗糖、10g/L的单宁酸、3g/L的NaNO3、1g/L 的K2HPO4、0.5g/L的MgSO4·7H2O、0.5g/L的KCl、0.01g/L的FeSO4、0.04g/L的溴酚蓝和1.8%琼脂；
复筛培养基包括30g/L的蔗糖、10g/L的单宁酸、3g/L的NaNO3、1g/L 的K2HPO4、0.5g/L的MgSO4·7H2O、0.5g/L的KCl、0.01g/L的FeSO4、0.04g/L的溴酚蓝和1.8%琼脂；
复筛种子培养基和复筛发酵培养中的培养基组分为：30g/L的蔗糖、10g/L的单宁酸、3g/L的NaNO3、1g/L 的K2HPO4、0.5g/L的MgSO4·7H2O、0.5g/L的KCl和0.01g/L的FeSO4，发酵初始pH用40%浓度的NaOH溶液调整为5。
示例性地，复筛种子培养的条件至少满足：温度为35-39℃、100-200rpm、时间为72-96h；复筛发酵培养的条件至少满足：接种量为1-3vt%、温度为25-35℃、转速为100-200rpm、时间为72-96h。
实施例2：制备单宁酶和/或降解单宁
制备单宁酶和/或降解单宁时，步骤如下：
（1）将实施例1得到的溜曲霉接种至平板培养基中进行涂布，在37℃的条件下培养至产孢，加入10mL左右的生理盐水，洗脱并充分振荡、稀释后获得浓度为107CFU/mL的孢子悬浮液，4℃冰箱保存备用；
（2）将步骤（1）得到的孢子悬浮液以接种量为2vt%接入发酵培养基中，摇匀后用四层纱布封口在温度为25℃、转速为110rpm的摇床中进行发酵培养90h，完成发酵产酶过程，得到发酵液；
（3）将步骤（2）得到的发酵液在温度为4℃、转速为12000rpm的条件下离心20min得到的上清液为发酵清液，将发酵清液与底物浓度10g/L的单宁酸水溶液以体积比为1：1进行混合，在温度为25℃、pH为5、转速为110rpm的条件下发酵90h，得到降解产物。将降解产物加入甲醇终止降解，混匀后测定单宁的含量，计算得到单宁的降解率可达92%。
实施例3：制备单宁酶和/或降解单宁
制备单宁酶和/或降解单宁时，步骤如下：
（1）将实施例1得到的溜曲霉接种至平板培养基中进行涂布，在温度为37℃ 的条件下培养至产孢，加入10mL左右的生理盐水，洗脱并充分振荡、稀释后获得浓度为107CFU/mL的孢子悬浮液，4℃冰箱保存备用；
（2）将步骤（1）得到的孢子悬浮液以接种量为2vt%接入发酵培养基中，摇匀后用四层纱布封口在温度为30℃、转速为120rpm的摇床中进行发酵培养72h，完成发酵产酶过程，得到发酵液；
（3）将步骤（2）得到的发酵液在温度为4℃、转速为12000rpm的条件下离心20min得到的上清液为发酵清液，将发酵清液与底物浓度为10g/L的单宁酸水溶液以体积比为2：1进行混合，在温度为30℃、pH为6、转速为120rpm的条件下发酵72h，得到降解产物。将降解产物加入甲醇终止降解，混匀后测定单宁的含量，计算得到单宁的降解率可达94%。
实施例4：制备单宁酶和/或降解单宁
制备单宁酶和/或降解单宁时，步骤如下：
（1）将实施例1得到的溜曲霉接种至平板培养基中进行涂布，在温度为37℃ 的条件下培养至产孢，加入10mL左右的生理盐水，洗脱并充分振荡、稀释后获得浓度为107CFU/mL的孢子悬浮液，4℃冰箱保存备用；
（2）将步骤（1）得到的孢子悬浮液以接种量为2vt%接入发酵培养基中，摇匀后用四层纱布封口在温度为20℃、转速为100rpm的摇床中进行发酵培养96h，完成发酵产酶过程，得到发酵液；
（3）将步骤（2）得到的发酵液在温度为4℃、转速为12000rpm的条件下离心20min得到的上清液为发酵清液，将发酵清液与底物浓度为20g/L的单宁酸水溶液以体积比为3：1进行混合，在温度为20℃、pH为4、转速为100rpm的条件下发酵96h，得到降解产物。将降解产物加入甲醇终止降解，混匀后测定单宁的含量，计算得到单宁的降解率可达94%。
对比例1：
采用常规方法制备单宁酶和/或降解单宁，步骤如下：
（1）发酵培养基的组分和含量为：蔗糖30g/L、NaNO32g/L、K2HPO 1g/L、KCI 0.5g/L、MgSO40.5g/L、FeSO40.01g/L，其余为水；灭菌后立即加入黑曲霉(Aspergillus niger)，在温度为30℃、转速为120 rpm 的条件下摇床培养96h得到发酵液；
（2）酶解培养基的组分和含量为：单宁酸10g/L、NaNO32g/L、K2HPO 1g/L、KCI 0.5g/L、MgSO40.25g/L、FeSO40.01g/L，用40%的NaOH溶液调节pH值为5；将步骤（1）得到的发酵液以2vt%的接种量移至酶解培养基中，在温度为30℃、转速为120rpm的条件下摇床培养4天得到酶解液；
（3）将步骤（2）得到的酶解液离心后测定单宁的含量，计算得到单宁的降解率为83%。
综上所述，由实施例1-4和对比例1可知，溜曲霉在降解单宁上具有很好的应用效果，单宁降解率达到92%以上，在制备单宁酶和降解单宁上具有很好的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种溜曲霉（Aspergillus tamarii），其特征在于，命名为溜曲霉TPPDA-11，于2023年05月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63452。
2.根据权利要求1所述的溜曲霉，其特征在于，所述溜曲霉的ITS核苷酸序列如SEQ IDNo：1所示。
3.权利要求1-2任一项所述的溜曲霉在制备单宁酶和/或降解单宁中的应用。
4.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1-2任一项所述的溜曲霉。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述溜曲霉为活菌体、死菌体和发酵清液中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，发酵清液通过以下方法制备得到：将溜曲霉进行发酵培养，固液分离，得发酵清液。
7.一种降解单宁的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1-2任一项所述的溜曲霉和含有单宁的样品按体积比1-3：1进行发酵。
8.根据权利要求7所述的降解单宁的方法，其特征在于，在pH值4-6、20-30℃和100-120rpm条件下发酵72-96h。
9.根据权利要求7所述的降解单宁的方法，其特征在于，所述含有单宁的样品中，单宁含量为10-20g/L。
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