CN106318889A - 一种具有解磷能力的肠杆菌属菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有解磷能力的肠杆菌属菌株及其应用。所述菌株分类命名为肠杆菌属YA‑2(Enterobacter sp.YA‑2)，于2016年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016094。本发明提供的菌株适用于擦洗尾矿，也适用于其它难溶性磷酸盐及缺磷土壤。所述菌株能将擦洗尾矿中的难溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐，从而提高擦洗尾矿的利用效率，通过研究其最适宜的生长条件及其耐盐碱性、耐温性等，并将菌株接种于酸性红壤中，菌株的定殖能力强，显著的提高了小白菜的干重和鲜重，故适合应用于提高农作物的产量。

Description

一种具有解磷能力的肠杆菌属菌株及其应用
技术领域
本发明涉及磷尾矿中难溶性磷酸盐生物降解技术领域，尤其涉及一种具有解磷能力的肠杆菌属菌株及其应用。
背景技术
磷是植物必须的营养元素之一，是植物细胞内化合物重要的构成原件，植物体内全磷含量占干重的0.1-0.5％。没有挥发损失，淋溶损失也小，土壤中多余的磷基本上固定下来，成为土壤积累态P。磷肥在土壤中易被固定，易与土壤中的Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+结合，形成难溶性磷酸盐，P肥当季利率不高，一般只有10-20％或更低，但其积累利用率较高。
自2010年开始，中国磷肥工业的发展面临的问题表现为高品位磷矿资源的缺乏，以中低品位居多，而在水溶性磷肥的制造过程中需要的是高品位磷矿，如何合理利用现有资源是解决我国磷源的主要途径。云南磷矿资源储量量大质优，但高品位的优质富矿稀缺，在磷矿采选过程中产生大量的副产品如擦洗尾矿，仅滇池地区就达到约100万t/a，常年堆放在尾矿库，占用大量的土地资源，不仅造成宝贵资源的极大浪费，而且大量的排弃废石加大了对环境和土地资源的极大浪费。
土壤中存在大量的微生物，能够通过其生理代谢活动将这些含磷化合物中的磷释放出来，因而人们将这样一类微生物称作为解磷或溶磷微生物(Phosphate-solubilizingbacterium,PSB)，即可以把难溶性或不溶性磷转化为可溶性磷，供植物吸收利用的微生物。
申请号为CN201210040912.2的中国专利公开了一株解磷细菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其分类命名为成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)RKMC-7，保藏编号为CGMCC No.5005。该专利虽然在降解土壤中的磷盐效果较好，但是由于擦洗尾矿中的难溶形无机磷酸盐的种类较多，含量较高，该解磷细菌在降解擦洗尾矿中效果并不理想。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明公开了一种具有解磷能力的肠杆菌属菌株及其应用。本发明针对磷精矿生产过程中产生的固废物擦洗尾矿，筛选出一株能将擦洗尾矿中难溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐的菌株YA-2，从而提高擦洗尾矿的磷元素利用率。
本发明的技术方案如下：一种具有解磷能力的肠杆菌属菌株，所述菌株分类命名为肠杆菌属YA-2(Enterobacter sp.YA-2)，于2016年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2016094。
本发明在磷矿山杂草根际筛选出解磷菌，磷矿山植物根际的解磷微生物数量较多，种群丰富，具有较强的解磷能力和抗逆性，从磷矿山植物根际筛选出高效的无机解磷细菌，旨在为开发利用擦洗尾矿，缓解磷危机提供科学依据。
菌株YA-2经上海华大基因科技股份有限公司测序，根据16S rDNA的测序结果，在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov在线查询分析，利用Blast软件在GenBank中与其它的16SrDNA序列进行同源性比较，结果表明该片段与肠杆菌属Enterobacter sp.EU884439.1和Enterobacter hormaechei strain M.D.JF690889.1的16S rDNA的序列同源性最高，为97％，菌株YA-2的16S rDNA序列如SEQ ID NO 1所示。用MGEA 5.05中的邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树。依据菌落形态特征及序列比对结果，菌株YA-2为肠杆菌属。在无机磷细菌固体培养基上，其菌落特征为形状不规则，呈乳白色、表面光滑、不透明、稍隆起、边缘不整齐、表面湿润粘稠，容易挑起(图1)。菌株YA-2在莱卡荧光显微镜下的照片，该菌株的形态学描述为呈短杆状，两端钝圆(图2)。能溶解不同类型的难溶性磷酸盐，并将其转化为可溶性磷酸盐。在实验室摇瓶条件下，该菌株对擦洗尾矿的解磷率为2.9％。
所述菌株的初步筛选培养基为无机磷固体培养基：葡萄糖9～12g，(NH4)2SO4 0.4～0.6g，NaCl 0.2～0.4g，KCl 0.2～0.4g，MnSO4.4H2O 0.02～0.05g，FeSO4.7H2O 0.02～0.05g，MgSO4.7H2O 0.2～0.5g、Ca3(PO4)2 8～12g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5。
所述菌株的复筛选用无机磷液体培养基：葡萄糖9～12g，(NH4)2SO4 0.4～0.6g，NaCl 0.2～0.4g，KCl 0.2～0.4g，MnSO4.4H2O 0.02～0.05g，FeSO4.7H2O 0.03g，MgSO4.7H2O0.2～0.5g、Ca3(PO4)2 8～12g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5。
作为优选，所述菌株的初步筛选培养基为无机磷固体培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MnSO4.4H2O 0.03g，FeSO4.7H2O 0.03g，MgSO4.7H2O 0.3g、Ca3(PO4)2 10g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5。所述菌株的复筛培养基为无机磷液体培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MnSO4.4H2O 0.03g，FeSO4.7H2O0.03g，MgSO4.7H2O 0.3g、Ca3(PO4)2 10g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5。
所述菌株培养过程中的碳源为果糖、葡萄糖和乳糖中的一种或几种；氮源为硝酸铵、氯化铵、尿素、硝酸钾和硫酸铵中的一种或几种；氯化钠浓度为0.5～4.5％；硫酸钾浓度为0.035～0.115％；培养温度为26～30℃；作为优选，所述菌株最适碳源为果糖，氮源为硝酸铵，氯化钠浓度为0.5％，硫酸钾浓度为0.075％，培养温度为28℃。
本发明提供所述肠杆菌属菌株在降解无机磷酸盐中的应用。
本发明还提供所述肠杆菌属菌株在降解擦洗尾矿无机磷酸盐中的应用，所述擦洗尾矿中的无机磷酸盐为磷酸钙盐、磷酸铁盐和磷酸铝盐，其中磷酸钙盐的含量最多，无机磷酸盐以P2O5计总含量为15～18wt％。
所述降解在液体培养基中进行，操作如下：磷酸三钙、磷矿粉、擦洗尾矿、磷酸铁和磷酸铝分别在1×105Pa条件下灭菌30min，然后分别按1～3％的接种量将菌株种子液接种于不加磷源的无机磷液体培养基中，置于恒温摇床培养6～8天，培养温度为26～30℃，培养结束后采用用钼蓝比色法测定溶液中有效磷含量，所述菌株种子液中活菌浓度为5×107～5×108CFU.mL-1。
本发明还提供含有所述肠杆菌属菌株的微生物菌剂。
所述微生物菌剂的制备方法包括如下步骤：
(1)将肠杆菌属菌株YA-2活化后接种至NB培养基中，26～28℃摇床培养至对数生长后期，收集摇瓶菌种；
所述NB培养基成分为牛肉膏2～4g，蛋白胨8～11g，氯化钠4～6g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4。
(2)将摇瓶菌种采用无菌水制成微生物菌剂，微生物菌剂中活菌浓度为107～109CFU.mL-1。
本发明还提供所述微生物菌剂在提高农作物产量中的应用。
本发明在磷矿山植物根际筛选出所述菌株，该菌株降解难溶性或不溶性磷酸盐的大致机理是通过微生物分泌有机酸进行化学溶解以及产生相关生物酶进行酶解反应从而降解磷酸盐，所述菌株在降解过程中产生的有机酸如乳酸、草酸、氨基酸和柠檬酸等，在降解过程中，培养基的pH会明显降低；相关的生物酶为酸性磷酸酶等。所述菌株用于降解擦洗磷矿时培养基的pH降低的幅度大于降解其他单一的磷酸盐(如磷酸三钙、磷酸铁等)，且菌株在降解擦洗磷矿时产生的生物酶含量也远远高于降解其他单一的磷酸盐。所述菌株在擦洗尾矿中的降解效果更好，适用于擦洗尾矿的降解，从而提高了擦洗尾矿的磷素利用率，便于回收利用擦洗尾矿。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供的菌株适用于擦洗尾矿，也适用于其它难溶性磷酸盐及缺磷土壤。所述菌株能将擦洗尾矿中的难溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐，从而提高擦洗尾矿的利用效率，通过研究其最适宜的生长条件及其耐盐碱性、耐温性等，并将菌株接种于酸性红壤中，菌株的定殖能力强，显著的提高了小白菜的干重和鲜重，故适合应用于提高农作物的产量。所述菌株YA-2的高效解擦洗尾矿的能力以及良好的耐性，为开发利用高效低成本的磷素相关制剂，充分利用低品位磷矿，缓解磷危机提供科学依据。
所述菌株保藏证明如下：
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；
保藏单位地址：中国，武汉，武汉大学；
保藏编号：CCTCC NO:M 2016094；
分类命名：肠杆菌属YA-2(Enterobacter sp.YA-2)；
保藏日期：2016年3月7日。
附图说明
图1为YA-2在固体培养基中生长的平板照片；
图2为菌株YA-2在莱卡荧光显微镜下的照片；
图3为不同碳源对菌株YA-2解磷能力的影响
图4为不同氮源对菌株YA-2解磷能力的影响
图5为不同磷源对菌株YA-2解磷能力的影响
图6为NaCl对解磷细菌YA-2生长的影响
图7为硫酸钾对细菌YA-2生长的影响
图8为尿素对细菌YA-2生长的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
实施例1无机解磷菌菌株YA-2的获得
一、无机解磷细菌菌株YA-2的分离筛选过程如下：
(1)土壤采自云南省昆明市晋宁县昆阳磷矿植被复垦区杂草根际，采用抖土法将收集的土样放入密封袋内立刻带回实验室冷藏，备用。
无机磷固体培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MnSO4.4H2O0.03g，FeSO4.7H2O 0.03g，MgSO4.7H2O 0.3g、Ca3(PO4)2 10g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.5。
无机磷液体培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MnSO4.4H2O0.03g，FeSO4.7H2O 0.03g，MgSO4.7H2O 0.3g、Ca3(PO4)2 10g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5。
牛肉膏蛋白胨(NB)培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。
(3)初筛：称取5g土壤装于250mL无菌三角瓶，加入100mL无菌水，充分摇匀，静置一段时间，采用用无菌水稀释成10-4、10-5、10-6、10-7倍的稀释液。吸取0.1mL均匀涂布于无机磷固体培养基，28℃培养3-7d，选取长势较好且具有溶磷圈的单株菌在牛肉膏蛋白胨培养基上进行多次分离纯化，分离出纯种，并进一步做功能鉴定。
(4)将分离纯化的菌株YA-2用灭菌牙签点接于无机磷固体培养基上，28℃培养7d后，产生明显的溶磷圈。经测量与计算，溶磷圈直径为12.5mm，菌落直径其6.25mm，溶磷圈与菌落比值为2。
(4)复筛：将不加磷源的无机磷液体培养基100mL分装于250mL三角瓶中，1×105Pa，30min灭菌，接种前分别精确加入1g灭菌磷酸三钙，将种子液按1.5％的接种量接种，28℃，180r.min-1摇床培养7d，培养液经高速(6000r.min-1)离心10min，取2mL上清液于50mL容量瓶中，用少量蒸馏水润洗瓶口，加2滴二硝基酚，用2M 1/2H2SO4与4M NaOH调节溶液酸度后，溶液在比色前加入5mL钼锑抗，加水定容至刻度，于室温放置30min，在700nm处比色，测其吸光度。并计算有效磷增量(扣除对照后的值/mg.L-1)。
计算公式如下：P＝K×V/V1
其中：P为有效磷增量；K为从标准曲线查得显色液的磷含量(μg.mL-1)；V为显色时溶液定容的体积(mL)；V1为显色时吸取上清液的体积(mL)。
微生物解磷率(％)＝[(接菌的发酵培养基中有效磷总量-接灭活菌的发酵培养基的对照组中的解磷总量)/添加的磷源中的总磷量]×100％
测定结果显示，与不接种菌株的对照相比，菌株YA-2的解磷量增加了84ug/mL，解磷率为2.4％。
实施例2培养基的优化
(5)摇瓶发酵：从保存培养基上挑取一环菌种，接到灭好菌的装有50mL种子培养基的150mL三角瓶中，于28℃，180r.min-1过夜培养。
(6)最佳碳源、氮源的筛选：在原有无机磷液体培养基的基础上对碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉，添加量均为10g/L)和氮源(硫酸铵0.05g/L、硝酸钾0.0644g/L、硝酸铵0.0303g/L、尿素0.0277g/L)进行筛选，1*105Pa条件下灭菌30min，按1.5％的接种量将种子液接种于培养基中，置于恒温摇床(180r.min-1,28℃)摇床培养7d，用钼蓝比色法测定溶液中有效磷含量。同时作不接种对照，3次重复。
图3为不同碳源对菌株YA-2解磷能力的影响。由图3可知，当碳源为果糖时，菌株YA-2的解磷能力最强，解磷率为2.90％。图4当以硝酸铵为氮源时，菌株YA-2的解磷能力较强，解磷率为2.5％。
(7)菌株对不同难溶性磷源的解磷作用：将无机磷液体培养基(不加磷源)100mL分装于250mL三角瓶中，分别加入1g磷酸三钙、磷矿粉、擦洗尾矿、磷酸铁、磷酸铝，1*105Pa条件下灭菌30min，按1.5％的接种量将种子液接种于培养基中，置于恒温摇床(180r.min-1,28℃)摇床培养7d，用钼蓝比色法测定溶液中有效磷含量。同时作不接种对照，3次重复。
图5为菌株YA-2在磷酸三钙、磷矿粉、磷酸铁、磷酸铝、擦洗尾矿作为磷源时，培养7d后，测定其对不同磷酸盐的解磷能力。由图5可知，菌株YA-2对擦洗尾矿的解磷能力最强，解磷率为2.9％，YA-2溶解不同难溶性磷酸盐的顺序为：擦洗尾矿>磷酸三钙>磷矿粉>磷酸铝>磷酸铁。
实施例3菌株在不同磷源下酸性磷酸酶活性与有机酸总量
菌株在不同磷源下磷酸酶活性的测定
标准曲线的制作：取6支试管，依次吸取lg/L标准对硝基酚溶液。0，1，2，3，4，5mL分别装于试管中，用无菌水定容至5mL。在每个试管中再加入1mL 0.5mol/L氯化钙和4mL氢氧化钠，震荡后过滤，测定420nm条件下滤液吸光值。以每小时IL发酵液(培养液)中作用于底物并释放出产物的微摩尔数称为1个酶活力单位，记为umolL-1h-1，简写Eu。
吸取1mL发酵液，加入4mL pH值为6.5的MUB，再加0.025mol.L-1对硝基苯磷酸二钠溶液lmL，震荡几秒钟。塞住瓶塞，37℃培养lh后，加入lmL0.5mol/L的氯化钙和4mL0.5moll/L氢氧化钠，震荡后用折叠滤纸过滤悬液。将澄清滤液在420nm比色。此为酸性磷酸酶活性测定方法，碱性磷酸酶时所用MUB试剂pH值为11。
MUB储备液：硼酸3.15g，柠檬酸7g，顺丁烯二酸5.8g，Tris 6.05g，1molL-1NaOH244mL定容到500mL，冷藏保存。
菌株在不同磷源下有机酸总量的测定
准确称取4g氢氧化钠并用蒸馏水定容至1000mL，用精确配制的0.05mol/L草酸进行标定，标定氢氧化钠溶液的浓度0.081967mol/L。将细菌发酵液稀释10倍，用移液管精确吸取10mL到三角瓶中，加入酚酞指示液2滴，用标定好的氢氧化钠滴定液(0.081967mol/L)滴定，滴定至溶液显粉红色。根据所用氢氧化钠溶液体积，计算出发酵液中总酸含量，总酸含量以草酸计。每1mL氢氧化钠滴定液相当于3.688525mg草酸(C2H2O4)。
酸性磷酸酶是无机解磷细菌在生长过程中分泌的一种酶，它能使死亡的菌体分解，并将菌体中的有机磷转化为无机磷，这部分无机磷被微生物吸收后又可以参加微生物的新陈代谢过程。测定在不同磷源下菌株YA-2培养7d后所产生的酸性磷酸酶活性，由表1可知，在含有擦洗尾矿的培养基中，菌株YA-2所产生的酸性磷酸酶活性显著高于另外四种磷源，为3285.17umol.L-1h-1，磷矿粉与磷酸铝作为磷源时，酶活性之间差异不显著，且相对较低。无机解磷细菌YA-2在含有不同磷源时所产生的酸性磷酸酶活性不同。
表1菌株在不同磷源下酸性磷酸酶活性/umol.L-1h-1
注：表中标记字母表示Duncan多重比较结果。不同字母表示差异显著，相同字母表示差异不显著(p<0.05)，以下出现字母的图、表具有相同意义。实验数据采用SPSS软件进行分析，表中数据表示在p<0.05水平显著差异，其中a、b、c和d的标注方法如下：将全部平均数从大到小依次排列,在最大的平均数上标上字母a,用该平均数减去以下各平均数得到极差,凡极差小于相应p下的值,即差异不显著的,都标上字母a,直到与某个平均数的极差大于或等于LSR0.05值,即出现显著差异时则在此平均数上标以字母b,再以此标有b的平均数为标准,与以上各个比它大的平均数相比较,凡差异不显著的均加标字母b，又以标有b的最大平均数为标准,与以下各未标记的平均数相比,凡差异不显著的继续标上字母b,直到某一个与之差异显著的平均数则标以字母c，如此重复进行比较,直到最小的一个平均数有了标记字母为止。
目前多数学者认为解磷机制主要有机酸的作用，首先，土壤微生物在其代谢过程中可分泌多种有机酸，如草酸、琥珀酸、延胡索酸、羟基乙酸、乳酸和柠檬酸等，一方面降低了培养介质的pH值，直接溶解难溶性磷；另一方面，有机酸与Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+等离子螯合，使得磷难溶性磷酸盐中释放出来。测定在不同磷源下菌株YA-2培养7d后所产生的有机酸的含量，由表2可知，在含有磷酸铝的培养基中，菌株YA-2所产生的有机酸含量显著高于另外四种磷源，为225.1mg.L-1，其次是擦洗尾矿，有机酸含量为169.5mg.L-1。在以磷矿粉为磷源时，菌株不产生有机酸。无机解磷细菌YA-2在含有不同磷源下所产生的有机酸含量不同。
表2菌株在不同磷源下有机酸总量的测定/mg.L-1
表中数据表示在p<0.05水平下显著差异，a、b、c、d的标注参考表1。
由表1和表2可知，菌株YA-2用于降解擦洗尾矿以及磷酸盐中，降解擦洗尾矿过程中的培养基中酸性磷酸酶的活性远远高于其他培养基中，有机酸含量也比较高，虽然具体降解机理还不完全清楚，但是从结果上来看，故菌株YA-2更适合用于降解擦洗尾矿，有利于回收擦洗尾矿，绿色环保。
实施例4菌株YA-2的耐性
(1)无机解磷细菌YA-2的耐热性：将菌株YA-2接种于无机磷固体培养基上，在不同温度30℃、35℃、40℃、45℃下进行培养，观察细菌生长情况。细菌YA-2的耐热性较强，在40℃时生长良好，超过40℃死亡，如表3所示。
表3菌株YA-2的耐热性
(2)细菌的耐盐性：把菌株的种子液按照1.5％的接种量接种到装有100mL无机磷液体培养基的三角瓶中，NaCl浓度分别为0.5％、1.5％、2.5％、3.5％、4.5％的三角瓶中，振荡培养24h，各发酵液适当稀释后，在600nm测其吸光度Abs，比较各菌株的耐盐情况。结果表明：如图6所示，菌株YA-2长势最好的盐浓度为0.5％，最大耐盐强度为4.5％，随着盐浓度的增加，菌株长势略有下降趋势。NaCl作为培养基中主要盐类成分对解磷菌的解磷能力有较大的影响。盐一般通过调节渗透压进行影响微生物生长。在低渗溶液中，溶液中水分子大量渗入微生物细胞内，使微生物细胞发生膨胀，严重的会导致细胞破裂而死亡；在高渗溶液中，微生物体内的水分子大量向细胞外渗出，使微生物的细胞发生质壁分离，从而使细胞出现“生理干燥”，造成细胞活动呈抑制状态、甚至死亡。
(3)硫酸钾、尿素对细菌生长的影响：将无机磷液体培养基中的氯化钾替换为硫酸钾，称硫酸钾0.35g(相当于原有培养基中所含钾离子的量)，其含量分别为0.035％、0.075％、0.115％、0.125％、0.135％。将培养基中的硫酸铵替换为尿素，分别设置浓度梯度为0.28g/L、0.68g/L、0.78g/L、0.88g/L、0.98g/L。28℃振荡培养7d，各发酵液适当稀释后在600nm波长下测定其吸光度Abs，比较各菌株对硫酸钾及尿素的耐性。结果表明：钾是难溶性无机磷培养基中的必备成分之一，钾含量过多或过少都会影响细菌的生长繁殖，不同菌株对所需最适K+含量及对K+的耐性各不相同。如图7所示，菌株YA-2的最适硫酸钾含量为0.075％，随着K+浓度的增加，细菌生长受到抑制。
尿素是农用较多的一种氮肥，其氮素形态为酰胺态氮，由于对于不同的解磷细菌而言，其所需的氮源种类各异。本试验研究了细菌对尿素的耐性，为细菌的在实践中的应用提供依据。由图8可知，菌株YA-2在尿素浓度为0.028％-0.078％范围内，吸光度变化不明显，相比较而言，尿素浓度为0.078％时，细菌的生长繁殖效果最好。超过这一浓度，细菌生长受抑制。
实施例5菌株对小白菜的促生效应
(1)红壤经风干后过2mm筛，每盆装土8kg，土壤湿度调节到田间持水量的80％，种植小白菜，45天后采样，测定小白菜植株的干、鲜重。
(2)小白菜种子：尽量选择大小一致的作物种子(称重法)，用10％H2O2溶液浸泡30min进行消毒，处理之后再用去离子水反复冲洗干净，晾干，播种。
(3)将菌株活化后，用接种环挑取少量菌体接种于含有50mL NB培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4)150mL三角瓶，28℃,180r/min摇床培养48h，用无菌水制成菌悬液，并使菌悬液浓度达到108CFU.mL-1，待小白菜苗长出2-3片真叶长出时，在加菌盆钵中加入单株菌悬液50mL，对照组加入等量的NB培养基。
不同处理对小白菜的生物量如表4所示。
表4无机解磷细菌对小白菜鲜重和干重的影响
由表2可以看出，与对照相比，无机解磷细菌YA-2显著的增加了小白菜的鲜重和干重，分别增加了80％和22.7％，均存在显著差异。该结果主要是由于磷细菌增加了土壤磷素释放而改善了小白菜磷素营养造成的。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南磷化集团有限公司
<120> 一种具有解磷能力的肠杆菌属菌株及其应用
<130> 2016.08.31
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1198
<212> DNA
<213> 肠杆菌属YA-2
<400> 1
cgtcttgccg cagactacac atgcagtcga acggtaacag gaagcagctt gctgcttcgc 60
tgacgagtgg cggacgggtg agtaatgtct gggaaactgc ctgatggagg gggataacta 120
ctggaaacgg tagctaatac cgcataacgt cgcaagacca aagaggggga ccttcgggcc 180
tcttgccatc ggatgtgccc agatgggatt agctagtagg tggggtaacg gctcacctag 240
gcgacgatcc ctagctggtc tgagaggatg accagccaca ctggaactga gacacggtcc 300
agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc 360
catgccgcgt gtatgaagaa ggccttcggg ttgtaaagta ctttcagcgg ggaggaaggc 420
tgccagcagc cgcggtaata cggagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag 480
cgcacgcagg cggtctgtca agtcggatgt gaaatccccg ggctcaacct gggaactgca 540
ttcgaaactg gcaggctaga gtcttgtaga ggggggtaga attccaggtg tagcggtgaa 600
atgcgtagag atctggagga ataccggtgg cgaaggcggc cccctggaca aagactgacg 660
ctcaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 720
acgatgtcga cttggaggtt gtgcccttga ggcgtggctt ccggagctaa cgcgttaagt 780
cgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca 840
caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tactcttgac 900
atccagagaa ctttccagag atggattggt gccttcggga ctctgagaca gtgctgcatg 960
gctgtcgtca gctcgtgttg tgaaatgtgg ggtagtcccg cacgagcgca cccttatcct 1020
ttgtgcagcg gtagccggga ctcaagagac tgcatgatac tgaagaagag gtggggatga 1080
actcagtcat ctggccttac agtaggctac acacgtgcta ccatgcctac aaggatggac 1140
ctcgggagca gcggaacctc taagtgtgcg cgcgtcgtgc tgtatgaaat tccgcgca 1198

Claims (9)

1.一种具有解磷能力的肠杆菌属菌株，其特征在于，所述菌株分类命名为肠杆菌属YA-2(Enterobacter sp.YA-2)，于2016年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2016094。
2.如权利要求1所述的具有解磷能力的肠杆菌属菌株，其特征在于，所述菌株的初步筛选培养基为无机磷固体培养基,成分如下：葡萄糖9～12g，(NH4)2SO4 0.4～0.6g，NaCl 0.2～0.4g，KCl 0.2～0.4g，MnSO4.4H2O 0.02～0.05g，FeSO4.7H2O 0.02～0.05g，MgSO4.7H2O0.2～0.5g、Ca3(PO4)2 8～12g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5；
所述菌株的复筛选用无机磷液体培养基，成分如下：葡萄糖9～12g，(NH4)2SO4 0.4～0.6g，NaCl 0.2～0.4g，KCl 0.2～0.4g，MnSO4.4H2O 0.02～0.05g，FeSO4.7H2O 0.03g，MgSO4.7H2O 0.2～0.5g，Ca3(PO4)2 8～12g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5。
3.如权利要求1所述的具有解磷能力的肠杆菌属菌株，其特征在于，所述菌株培养过程中的碳源为果糖、葡萄糖和乳糖中的一种或几种；氮源为硝酸铵、氯化铵、尿素、硝酸钾和硫酸铵中的一种或几种；氯化钠浓度为0.5～4.5％；硫酸钾浓度为0.035～0.115％；培养温度为26～30℃。
4.含有如权利要求1所述的肠杆菌属菌株的微生物菌剂。
5.如权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂的制备方法包括如下步骤：
(1)将肠杆菌属菌株YA-2活化后接种至NB培养基中，26～28℃摇床培养至对数生长后期，收集摇瓶菌种；
所述NB培养基成分为牛肉膏2～4g，蛋白胨8～11g，氯化钠4～6g，蒸馏水1000mL，pH7.2-7.4。
(2)将摇瓶菌种采用无菌水制成微生物菌剂，微生物菌剂中活菌浓度为107～109CFU.mL-1。
6.如权利要求1所述的肠杆菌属菌株在降解无机磷酸盐中的应用。
7.如权利要求1所述的肠杆菌属菌株在降解擦洗尾矿无机磷酸盐中的应用，其特征在于，所述擦洗尾矿中的无机磷酸盐为磷酸钙盐、磷酸铁盐和磷酸铝盐，无机磷酸盐以P2O5计总含量为15～18％。
8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述降解在液体培养基中进行，操作如下：磷酸三钙、磷矿粉、擦洗尾矿、磷酸铁和磷酸铝分别在1×105Pa条件下灭菌30min，然后分别按1～3％的接种量将菌株种子液接种于不加磷源的无机磷液体培养基中，置于恒温摇床培养6～8天，培养温度为26～30℃，培养结束后采用用钼蓝比色法测定溶液中有效磷含量，所述菌株种子液中活菌浓度为5×107～5×108CFU.mL-1。
9.如权利要求4或5所述的微生物菌剂在提高农作物产量中的应用。
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