CN105132324A

CN105132324A - 一株小麦根际多粘类芽孢杆菌wxd 6-4及其应用

Info

Publication number: CN105132324A
Application number: CN201510563635.7A
Authority: CN
Inventors: 郭长虹; 王晓丹; 程园园; 刘佳莉; 刘莎莎; 张丹
Original assignee: Harbin Normal University
Current assignee: Harbin Normal University
Priority date: 2015-09-07
Filing date: 2015-09-07
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2035-09-07
Also published as: CN105132324B

Abstract

本发明公开了一株小麦根际多粘类芽孢杆菌WXD？6-4，属于生物技术领域。该小麦根际多粘类芽孢杆菌WXD？6-4分类命名为多粘类芽孢杆菌Paenibacillus？polymyxa，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？No.8997。本发明多粘类芽孢杆菌WXD？6-4可以合成IAA、嗜铁素，溶解难溶无机磷，能够促进植物生长，其发酵液对禾旋孢腔菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、灰葡萄孢菌等多种植物病原真菌都具有较好的抑制作用，且对小麦根腐病的防治具有重要意义，适于作为农业菌剂加以开发利用。

Description

一株小麦根际多粘类芽孢杆菌WXD 6-4及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株小麦根际多粘类芽孢杆菌WXD6-4及其应用。

背景技术

小麦是世界总产量第二的粮食作物，仅次于玉米。近年来，小麦根腐病的发生降低的小麦的产量。目前主要采用施用化肥、农药等化学方法解决这一问题，但是也不能根治，而且会造成环境污染、抗药性提升、土壤微生物结构改变、食品安全性降低等问题。由于微生物不会对环境造成污染，可以解决上述由于化学和农业防治造成的环境问题，而且对人类无危害，能有效地根治植物病害所以微生物肥料、微生物制剂的研究已经成为热点。植物根际促生菌(Plantgrowthpromotingrhizobacteria,PGPR)是泛指可以直接和/或间接地促进植物生长，增加农作物产量，生存在根周围、表面、根内的有益微生物。PGPR通过许多途径促进植物生长和和防治植物病害。

芽孢杆菌(Bacillusspp.)是PGPR重要的组成部分，既可以促进植物生长，还有生物防治作用。PGPR主要通过合成IAA和嗜铁素，溶解土壤中难溶的磷，促进植物营养物质的吸收，从而促进植物生长；PGPR主要产生的抑菌物质为脂肽化合物，包括丰原素(Fengycin)、伊枯草菌素(Ituin)和表面活性素(Surfactin)等，其在防治植物病害方面起着重要作用。因此，开发能够促进植物生长且能够有效防治植物病害的PGPR是目前研究工作的重点。

发明内容

本发明的目的在于提供一株小麦根际多粘类芽孢杆菌WXD6-4及其应用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明提供了一株小麦根际多粘类芽孢杆菌WXD6-4，该小麦根际多粘类芽孢杆菌WXD6-4分类命名为多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.8997。

该菌能够合成吲哚乙酸、嗜铁素，还能够溶解无机磷。本发明公开了小麦根际多粘类芽孢杆菌WXD6-4作为促进植物生长菌剂的应用。所述的菌剂为促吲哚乙酸合成的菌剂、促嗜铁素合成的菌剂或溶解无机磷的菌剂中的一种或几种。

本发明还公开了枯草芽孢杆菌CYY-25在制备用于促进植物生长的菌剂中的应用。

所述的菌剂为促吲哚乙酸合成的菌剂、促嗜铁素合成的菌剂或溶解无机磷的菌剂中的一种或几种。

本发明公开了小麦根际多粘类芽孢杆菌WXD6-4作为防治植物病原真菌引起的植物病害的菌剂的应用。

本发明公开了小麦根际多粘类芽孢杆菌WXD6-4在制备用于防治植物病原真菌引起的植物病害的菌剂中的应用。

所述的菌剂为防治小麦根腐病的菌剂。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的小麦根际多粘类芽孢杆菌WXD6-4于2014年4月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCCNo.8997。

本发明多粘类芽孢杆菌WXD6-4可以合成IAA、嗜铁素，溶解难溶无机磷，能够促进植物生长，其发酵液对禾旋孢腔菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、灰葡萄孢菌等多种植物病原真菌都具有较好的抑制作用，且对小麦根腐病的防治具有重要意义，适于作为农业菌剂加以开发利用。

保藏说明

本发明对小麦根际多粘类芽孢杆菌WXD6-4进行了下述保藏：

保藏时间：2014年4月3日，保藏地点：中国，北京。北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏号为CGMCCNo.8997，分类命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)。

附图说明

图1为多粘类芽孢杆菌WXD6-4(Paenibacilluspolymyxa)在PDA培养基上的生长状况。

图2为多粘类芽孢杆菌WXD6-4(Paenibacilluspolymyxa)在不同浓度L-色氨酸下IAA合成量的变化。

图3为多粘类芽孢杆菌WXD6-4(Paenibacilluspolymyxa)发酵液对植物病原真菌的抑制作用；

其中，A串珠镰刀菌；B稻梨孢菌；C尖孢镰刀菌；D核盘菌；E禾谷镰刀菌；F灰葡萄孢菌；G茄链格孢菌；H立枯丝核菌；I金黄壳孢菌；J禾旋孢腔菌；

图4为多粘类芽孢杆菌WXD6-4(Paenibacilluspolymyxa)对小麦促生30d时盆栽效果。

图5为多粘类芽孢杆菌WXD6-4(Paenibacilluspolymyxa)对小麦根腐病的生防效果；

其中，A为只破坏；B为破坏加病原菌；C为破坏加病原菌和WXD6-4；

图6为多粘类芽孢杆菌WXD6-4(Paenibacilluspolymyxa)构建的系统发育树图谱。

具体实施方式

下面结合具体的附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次以上重复实验，结果取平均值。

一、芽孢杆菌WXD6-4的分离

称取5g实验室盐碱土栽培的小麦根际土，至于含有玻璃珠和45mL无菌水的三角瓶中，在培养摇床上剧烈振荡30min(37℃)后于80℃的水浴锅中保持15min。然后用无菌水进行梯度稀释后涂布于PDA固体板上，参见图1，37℃培养1-2d，挑取单菌落进行划线纯化，纯化到第六代，制成甘油菌于-80℃中保存。将该菌命名为WXD6-4。

二、芽孢杆菌WXD6-4的鉴定：

采用CTAB/NaCl方法提取分离菌株DNA。

根据原核生物16SrDNA保守序列通用引物

F8：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

F1541：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’进行扩增。扩增条件：94℃变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min(共30个循环)；72℃10min，4℃无限循环。将PCR所得产物送至上海生工进行DNA序列测定。将序列在NCBI数据库中进行BLAST序列分析。同时，根据构建的系统发育树，参见图6，确定菌株WXD6-4为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)。

三、菌种的保藏

该菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)，保藏日期为2014年4月3日，保藏编号为CGMCCNo.8997。分类命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)。

多粘类芽孢杆菌WXD6-4(Paenibacilluspolymyxa)可用于生产吲哚乙酸和/或嗜铁素和/或溶磷和/或产生抑制植物病原真菌的物质。

四、应用多粘类芽孢杆菌WXD6-4(Paenibacilluspolymyxa)生产嗜铁素的具体步骤如下：

定性测定：采用Schwyn和Neilands的方法，将菌株点接种到铬奥醇CAS(Chromeazurolsulphonate)固体板上，28℃培养3-5d，观察菌落周围的颜色变化，有橘黄色圈产生即有产生嗜铁素能力。

定量测定：采用王平等描述的水溶性色素产生菌铁载体的定量检测法，样品中嗜铁素的相对含量为A/Ar，该值越小，说明合成嗜铁素能力越强。

检测结果表明，多粘类芽孢杆菌WXD6-4(Paenibacilluspolymyxa)的菌落周围有橘黄色的透明晕圈产生。A/Ar值为0.49，说明菌株WXD6-4合成嗜铁素的能力较强。

五、应用多粘类芽孢杆菌WXD6-4(Paenibacilluspolymyxa)生产吲哚乙酸具体可包括如下步骤：

采用Salkowski比色法测定菌株WXD6-4分泌IAA的能力。将菌株在DF培养基中培养(180r/min)2d，然后再取1mL微量转入到添加不同浓度L-色氨酸(0，200和500μg/mL)的新DF培养基中继续培养2d，每个浓度重复3次。取样测OD₆₀₀吸光值。剩下的菌液10,000r/min离心10min，取500μL上清液，添加2mLSalkowski试剂，室温下进行暗反应20min，测OD₅₃₅吸光值。

图2即为菌株WXD6-4的IAA合成量。由图可知，多粘类芽孢杆菌WXD6-4(Paenibacilluspolymyxa)在L-色氨酸浓度为0，200，500μg/mL时，合成IAA量分别为0.002，0.039，0.090μg/mL。该菌株在L-色氨酸浓度为0时几乎不能合成IAA，但该菌株随着L-色氨酸浓度增加，合成IAA量也相应增加。

六、多粘类芽孢杆菌WXD6-4(Paenibacilluspolymyxa)溶解无机磷的能力：

定性测定：采用Nguyen的方法，将菌株点接种到NBRIP固体板上，28℃培养3-5d，观察菌落周围是否有透明晕圈出现，出现透明晕圈则说明该菌有溶解无机磷的能力。

定量测定：采用钼锑抗法，将菌株接种到NBRIP液体培养基中，28℃摇床培养(180r/min)5d，菌液10,000r/min离心10min，取上清50μL，加入2.5mL钼锑抗混合显色剂，定容至50mL，反应30min，660nm测吸光值。对照为去离子水与钼锑抗混合显色剂反应。

结果表明，多粘类芽孢杆菌WXD6-4(Paenibacilluspolymyxa)的菌落周围能形成无色透明晕圈。发酵液内有效磷含量为91.75μg/mL，说明菌株WXD6-4具有溶解无机磷的能力。

七、芽孢杆菌WXD6-4产生的抑菌物质对植物病原真菌生长的抑制效果

将菌株在液体LB培养基中培养1d，然后用高压灭菌锅121℃灭菌40min，离心收集上清液，将处理过的发酵液以5％的浓度加入到PDA固体培养基中，得到含有菌株WXD6-4分泌物的培养基。参见图3，将直径7mm的植物病原真菌(串珠镰刀菌、稻梨孢菌、尖孢镰刀菌、核盘菌、禾谷镰孢菌、灰葡萄孢菌、茄链格孢菌、立枯丝核菌、金黄壳囊孢菌、禾旋孢腔菌)接种在固体板中央，对照为不含有菌株WXD6-4分泌物的培养基，3-5d后观察统计真菌直径。

结果如图4所示，多粘类芽孢杆菌WXD6-4(Paenibacilluspolymyxa)产生的抑菌物质对10种植物病原真菌的生长均有不同程度的抑制作用，统计结果如下表1：

表1

八、芽孢杆菌WXD6-4对小麦的促生效果

土壤取于黑龙江省大庆市，为盐碱土。

多粘类芽孢杆菌WXD6-4(Paenibacilluspolymyxa)在LB液体培养基中过夜培养(180r/min，37℃)，4℃离心收集菌体，重悬于无菌水中，即制成多粘类芽孢杆菌WXD6-4(Paenibacilluspolymyxa)菌液。

将小麦种子用0.5％(体积比)次氯酸钠溶液表面消毒10min，用无菌水多次冲洗，然后分组处理(每组50粒种子)：用制备的菌液浸泡2h为实验组；无菌水浸泡2h为对照组。

将处理后的小麦种子均匀种在盛有0.5kg盐碱土的盆中，每盆10株，每组种植5盆，于温室内培养。实验组每周浇灌一次菌液，对照组浇等量无菌水。30d后拍照并测量株高、根长、植株干鲜重。

经过多粘类芽孢杆菌WXD6-4(Paenibacilluspolymyxa)处理的小麦，植株高、根长、植株鲜重、植株干重与对照相比分别增加13.7％、49.1％、34.2％、65.2％，如下表2：

表2

注：同列不同字母表示显著水平P<0.05。

九、芽孢杆菌WXD6-4对小麦根腐病的生防效果

小麦根腐病病原菌(禾旋孢腔菌)的制备：将活化在PDA平板上的禾旋孢腔菌用刀片刮下菌丝到液体PDA培养基中培养(180r/min，28℃)2d。用灭菌的纱布过滤，即得到病原菌菌液。

介质为蛭石，装盆之前121℃灭菌30min，将小麦种子均匀种到盆中(5粒/盆)，待其生长14d后，用石英砂揉搓小麦根部，根部破坏后浸泡在病原菌菌液中2h，再将小麦重新种回无菌蛭石中，立即用多粘类芽孢杆菌WXD6-4(Paenibacilluspolymyxa)菌液对重新种回蛭石中的小麦幼苗进行灌根。仅破坏小麦根部为A处理，破坏后加病原菌为B处理，C处理为破坏加病原菌和WXD6-4。C处理每天浇灌一次WXD6-4菌液，A处理和B处理浇等量无菌水。7d后观察统计结果。

从图5可以观察到只破坏根部的小麦生长最好；破坏并且加病原菌的小麦叶子枯黄，几乎没有水分；破坏加病原菌再加WXD6-4菌液的小麦，叶子只有上半部分枯黄，有水分。结果统计如下表3：

表3

注：A.只破坏；B.破坏加病原菌；C.破坏加病原菌和WXD6-4。

综上所述，本发明公开的多粘类芽孢杆菌WXD6-4能够合成吲哚乙酸，能够合成嗜铁素。而且，该菌能够溶解无机磷。

本发明的多粘类芽孢杆菌WXD6-4(Paenibacilluspolymyxa)在促进植物生长中的应用，植物具体可为小麦。促进植物生长具体可为促进植物在盐碱土中的生长。

多粘类芽孢杆菌WXD6-4对植物病原真菌拮抗作用的广谱性。

多粘类芽孢杆菌WXD6-4在生物防治方面的应用，所述植物具体可为小麦。所述病害可具体为小麦根腐病。

多粘类芽孢杆菌WXD6-4产生的抑菌物质对病原真菌的拮抗作用。

Claims

1.一株小麦根际多粘类芽孢杆菌WXD6-4，其特征在于，该小麦根际多粘类芽孢杆菌WXD6-4分类命名为多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.8997。

2.权利要求1所述的小麦根际多粘类芽孢杆菌WXD6-4作为促进植物生长菌剂的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的菌剂为促吲哚乙酸合成的菌剂、促嗜铁素合成的菌剂或溶解无机磷的菌剂中的一种或几种。

4.权利要求1所述的小麦根际多粘类芽孢杆菌WXD6-4在制备用于促进植物生长的菌剂中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的菌剂为促吲哚乙酸合成的菌剂、促嗜铁素合成的菌剂或溶解无机磷的菌剂中的一种或几种。

6.权利要求1所述的小麦根际多粘类芽孢杆菌WXD6-4作为抑制植物病原真菌生长的菌剂的应用。

7.权利要求1所述的小麦根际多粘类芽孢杆菌WXD6-4作为防治植物病原真菌引起的植物病害的菌剂的应用。

8.权利要求1所述的小麦根际多粘类芽孢杆菌WXD6-4在制备用于防治植物病原真菌引起的植物病害的菌剂中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的菌剂为防治小麦根腐病的菌剂。