CN108395994B - 一株白僵菌及其在防治南方蓝莓蛴螬中的应用 - Google Patents

一株白僵菌及其在防治南方蓝莓蛴螬中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株对蛴螬高效寄生的白僵菌菌株，该菌株的培养方法以及该白僵菌菌株在防治南方蓝莓蛴螬方面的应用。该白僵菌菌株已于2017年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC NO.15090，专门用于防治蓝莓蛴螬类害虫，具有毒力强、杀虫速度快等特点。

Description

一株白僵菌及其在防治南方蓝莓蛴螬中的应用
技术领域
本发明属于害虫生物防治技术领域，涉及一株白僵菌（Beauveria majiangensis）菌株及其在防治南方蓝莓蛴螬（白星花金龟、粗狭肋鳃金龟、斑青花金龟）上的应用。
背景技术
蛴螬，是鞘翅目金龟子幼虫的统称。这类害虫分布广、种类多、食性杂、适应性强、生活隐蔽、生活史长短不一，是地下害虫中最大的类群，也是危害最重，造成损失最大的种类（中国北方常见金龟子彩色图鉴[M].北京林业出版社，1979；浅析我国地下害虫的发生与防治现状[M].中国农业出版社，2005:389-393.）。
2015-2017年间，中国南方蓝莓病虫害调查发现，蛴螬对蓝莓危害率达40%以上，尤其在南方蓝莓种植面积最大的省份贵州省，蓝莓受白星花金龟、粗狭肋鳃金龟、斑青花金龟等几种优势害虫的危害率高达60%，致使麻江县每年经济损失高达2000万元，而面对这一紧张局势，果农不得不采取大量施用化学农药辛硫磷来防治，致使蛴螬产生了抗性，且污染了环境，因此，探索开发高效、安全、经济的绿色防控迫在眉睫。
白僵菌（Beauveria）是一类寄主范围广、致病性强的虫生真菌，作为一种新型的生物农药，因其具有专一性强、补偿抗性、对环境友好等化学农药无可比拟的特征，长期以来，一直是全球关注的焦点。白僵菌可寄生的害虫有700余种，其中被广泛选择作为真菌杀虫剂应用于防治农林业害虫的是球孢白僵菌（白僵菌及其在农业生产上的应用[J].仲恺农业工程学院学报，2012,25(4):66-69.），且利用其防治玉米螟、松毛虫、茶小绿叶蝉等已成为世界范围内应用成功的典范，但关于B. majiangensis防治蓝莓病害虫的应用尚属空白。
目前虽然已有一些关于蛴螬白僵菌菌株筛选和田间防效的报道，但稳定性和时效性不好，除了株系差异影响白僵菌的毒力外，不同地理种群的白僵菌对害虫的致病力也存在明显差异。比如，来自北方的白僵菌很难在南方农作物生产中发挥作用，因此探索和筛选针对性强、高毒力菌株是应用真菌进行生物防治过程中必须攻克的关键环节。
发明内容
有鉴于此，本发明针对以上农业生产的重要需求而研发，发现一株与以往菌株不同的高效生防菌株B. majiangensis，测定了该菌株的特征及生物学特性，并建立了该菌株的防治应用技术。
本发明的目的在于提供一株对蛴螬高效寄生的白僵菌菌株，该菌株的培养方法以及该白僵菌菌株在防治南方蓝莓蛴螬方面的应用。
本发明的一方面，提供了一株白僵菌，所述的白僵菌菌株MJ1015为麻江白僵菌(Beauveria majiangensis)，分离于贵州省麻江县蓝莓园被侵染的蛴螬虫体上，已于 2017年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)， 保藏编号：CGMCC NO.15090。
所述白僵菌菌株形态特征：
在PDA培养基上培养10-13天，菌落直径可达3-6 mm，无气味产生，气生菌丝分隔，具分支，透明，表面光滑，宽1.6-2.2μm。产孢细胞单生或侧面簇生，基部呈圆柱形，有时呈近球形，长3.8-12.9 (-16.2) μm，宽1.2-1.5(-2.3) μm，顶部具一个不明显的小于1μm的齿状轴。分生孢子呈椭圆形，透明，隔，表面光滑，长2.4-3.8μm，宽1.6-2.3μm，Q = 1.6-2.6（Lm =2.1, Wm =1.4 , Qm =1.6）。
本发明的另一方面，提供了一株白僵菌的培养方法及其生物学特性：
将白僵菌菌株MJ1015接种在改良的PDA培养基（马铃薯180-220g/L，葡萄糖15-20g/L，琼脂15-20g/L，加蒸馏水定容到0.8-1 L，用KH2PO4调至PH为4-6）上，分别置于16℃-32℃气候箱（湿度均为100%）内，每2天观察记录菌丝生长及产孢量情况。结果表明，菌株MJ1015菌落生长及产孢最适宜的温度均是25-27℃。
本发明的另一方面，提供了所述白僵菌菌株在防治蓝莓害虫白星花金龟、粗狭肋鳃金龟、斑青花金龟上的应用：
本发明使用的菌株是从贵州省麻江县蓝莓园被侵染的蛴螬虫体上分离所得，为贵州本土菌株，能很好适应本地的自然环境，尤其在适合蓝莓生长的酸性土壤中（PH=4-6）萌发率很高。该菌株对蓝莓蛴螬具有高致病性，且耐酸性强，在适宜蓝莓生长的温度及酸碱性(PH4-6)范围内，生长速度和产孢量均很大。对防治南方蓝莓蛴螬提供了一种生物防治资源，具有毒力强、杀虫速度快等特点。同时解决了用化学农药防治蛴螬产生的农药残留、环境污染等问题，具有良好的开发潜力和生产价值。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作进一步详细描述。
实施例1 白僵菌菌株的保藏及菌株形态特征
白僵菌菌株MJ1015为麻江白僵菌(Beauveria majiangensis)，分离于贵州省麻江县蓝莓园被侵染的蛴螬虫体上，已于2017年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC NO.15090，保藏地址：北京。
在PDA培养基上培养13天，菌落直径可达4.81mm，无气味产生，气生菌丝分隔，具分支，透明，表面光滑，宽1.6-2.2μm。产孢细胞单生或侧面簇生，基部呈圆柱形，有时呈近球形，长3.8-12.9 (-16.2) μm，宽1.2-1.5(-2.3) μm，顶部具一个不明显的小于1μm的齿状轴。分生孢子呈椭圆形，透明，隔，表面光滑，长2.4-3.8μm，宽1.6-2.3μm，Q = 1.6-2.6（Lm =2.1, Wm =1.4 , Qm =1.6）。
实施例2 白僵菌的培养方法及其生物学特性
将白僵菌菌株MJ1015接种在改良的PDA培养基（马铃薯200g/L，葡萄糖18g/L，琼脂18g/L，加蒸馏水定容到1L，用KH2PO4调至PH为5.0）上，分别置于16℃、19℃、23℃、26℃、29℃、32℃气候箱（湿度均为100%）内，每2天观察记录菌丝生长及产孢量情况。结果表明，菌株MJ1015菌落生长及产孢最适宜的温度均是26℃，在此温度下第14天的菌落直径和产孢量分别为5.12cm（见表1）和120.45*106个孢子/ml（见表2）。
表1 不同温度下白僵菌菌株MJ1015的菌落生长特征
温度 第2天 第4天 第6天 第8天 第10天 第12天 第14天
16℃ 0.09 0.25 0.28 0.67 1.07 1.41 1.73
19℃ 0.11 0.46 0.57 1.16 1.71 2.25 2.68
23℃ 0.25 0.56 0.89 2.01 2.48 2.91 3.51
26℃ 0.51 1.28 1.75 2.52 3.21 4.02 5.12
29℃ 0.43 1.12 1.62 2.50 3.19 3.89 4.95
32℃ 0.39 1.05 1.21 2.13 3.05 3.78 3.98
注：表中数据为4次重复的平均值（单位：cm）
表2 不同温度下白僵菌菌株MJ1015的产孢特征
温度 第14天的产孢量（10<sup>6</sup>个孢子/ml）
16℃ 14.65
19℃ 20.14
23℃ 68.36
26℃ 120.45
29℃ 109.98
32℃ 99.85
注：表中数据为4次重复的平均值。
将本发明的白僵菌MJ1015菌株的分生孢子用吐温-80无菌水配制成浓度为1*106个孢子/ml的分生孢子悬浮液。然后用微量移液器吸取该悬浮液5ul接种于PDA培养基（培养基分别用K2HPO4和KOH调制为PH=5、6、7、9、11、13）中央，每皿一点，每个PH做10个重复。最后置于温度为26℃、相对湿度为100%的条件下培养。培养8天后，用游标卡尺十字交叉测量菌落生长直径，记录生长速率，计算出平均生长速率（mm/d）；继续培养至14天后，统计不同PH下菌株的产孢量（表3）。
表3 不同PH对MJ1015菌株的生长速率及产孢量
PH 生长速率（mm/d） 产孢量（10<sup>6</sup>个孢子/ml） 显著性
5 3.15 120.45 A
6 3.08 118.23 A
7 2.15 98.67 B
9 2.09 80.54 B
11 1.80 35.89 C
13 0.46 0 D
注：表中数值均为平均值，不同大写字母表示差异性显著。
由表3可知，白僵菌菌株MJ1015在PH为5-13的培养基上均可生长，随着PH的增大，其生长速率和产孢量都逐渐降低，最适生长范围是PH=5-6，当PH为13时抑制其生长，且不产孢。
实施例3白僵菌菌株在防治蓝莓害虫上的应用
本发明使用的菌株是从贵州省麻江县蓝莓园被侵染的蛴螬虫体上分离所得，为贵州本土菌株，能很好适应本地的自然环境，尤其在适合蓝莓生长的酸性土壤中（PH=4-6）萌发率很高。专门用于防治蓝莓蛴螬类害虫，尤其是蓝莓害虫白星花金龟、粗狭肋鳃金龟、斑青花金龟上的应用，具有毒力强、杀虫速度快等特点。
蓝莓最适生长的土壤PH范围是4-6，因此菌株的耐酸性是检验能否防治南方蓝莓蛴螬的首要标准，也是应用菌株进行大田防治的关键所在。
所述白僵菌菌株在防治蓝莓害虫白星花金龟、粗狭肋鳃金龟、斑青花金龟上的应用：
取3株菌株CH1、CH2、SWS1（分别采自贵州省赤水市、贵州省遵义地区凤岗县，经分离纯化所得，鉴定均为球孢白僵菌）及MJ1015一起侵染健康活跃的白星花金龟、粗狭肋鳃金龟、斑青花金龟的2龄幼虫。将上述4种菌株的分生孢子以0.1%吐温-80无菌水配制成浓度为1*108孢子/ml的孢子悬浮液，每组设3个重复区，每区20头，每头浸蘸5秒，置于无菌的滤纸上，任其爬行晾干身体上的水分，然后放入盛有无菌土的玻璃盒中，每天观察记录幼虫的侵染、死亡情况，连续观察40天。
接种30天后，本发明中的MJ1015菌株对三种蛴螬的死亡率均达到90%以上，死亡高峰期在13-20天，且接种3天后就出现死虫。由表4、5、6可知，MJ1015菌株对三种蛴螬的致病力均最强，死亡高峰期亦比较提前，显著高于其他菌株。
表4不同菌株对白星花金龟幼虫的致病力测定
菌株名称 死亡率（%） 死亡高峰期 显著性
MJ1015 94.56 第16、17、18天 A
CH1 38.01 第26、27天 B
CH2 40.12 第26、27天 B
SWS1 60.45 第24、25、26天 C
表5不同菌株对粗狭肋鳃金龟幼虫的致病力测定
菌株名称 死亡率（%） 死亡高峰期 显著性
MJ1015 98.67 第13、14、15天 A
CH1 40.15 第30、31天 B
CH2 43.26 第28、29天 B
SWS1 70.67 第25、26、27天 C
表6不同菌株对斑青花金龟幼虫的致病力测定
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以上所述，仅为本发明专利较佳的实施例，但本发明专利的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明专利所公开的范围内，根据本发明专利的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都属于本发明专利的保护范围。

Claims (4)

1.一株白僵菌菌株，其特征在于：所述的白僵菌菌株已于2017年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC NO.15090。
2.权利要求1所述白僵菌菌株的培养方法，其特征在于，该方法是将白僵菌菌株接种在改良的PDA培养基上，置于16℃-32℃气候箱，湿度为100％，菌株菌落生长及产孢最适宜的温度为25-27℃；所述改良的PDA培养基的组成为马铃薯180-220g/L，葡萄糖15-20g/L，琼脂15-20g/L，加蒸馏水定容到0.8-1L，用KH2PO4调至PH为3-6。
3.如权利要求2所述的白僵菌菌株的培养方法，其特征在于，所述白僵菌菌落生长及产孢最适宜的温度为26℃。
4.权利要求1所述白僵菌菌株在防治蓝莓蛴螬方面的应用，其特征在于，所述蓝莓蛴螬为白星花金龟、粗狭肋鳃金龟、斑青花金龟。
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