CN113373064B - 一种诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊释放游动孢子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊释放游动孢子的方法，包括以下步骤：荔枝霜疫霉菌孢子囊的产生、游动孢子囊的诱导产生、游动孢子集中释放、游动孢子的收集，配制营养液和培育环境设置，使得诱导荔枝霜疫霉菌产生孢子囊及集中释放游动孢子的最佳条件，短期内即可诱导大量的游动孢子囊并集中释放游动孢子，且获得的孢子囊成囊量大，游动孢子释放率高，萌发率好，既解决了一般方法很难集中释放游动孢子的问题，又避免了利用水培法诱导产生游动孢子囊容易被污染的难题。

Description

一种诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊释放游动孢子的方法
技术领域
本发明涉及微生物培养技领域，特别涉及一种诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊释放游动孢子的方法。
背景技术
荔枝霜疫霉病(Peronophythora，litchi)也称荔枝霜霉病、荔枝疫病，其病原为卵菌纲霜疫霉属荔枝霜疫霉菌，是荔枝主要病害之一。该病害最早是在1934年于中国的台湾地区被发现，后来中国大陆荔枝主栽区、澳大利亚、泰国、越南、巴布新几内亚等地相继发现此病害。该病不仅危害近熟果实，同时危害嫩叶、嫩梢、结果枝、幼果从而引起大量落花落果。发病初期，受害花穗为褐色，且大量脱落，果实为暗褐色甚至黑色；发病中后期若遇多雨时节，花穗、果实等变褐色腐烂，病部表面长满白色霜霉状物。荔枝霜疫病在荔枝采后贮藏运输和销售过程中常导致果实腐烂。病菌主要为害近成熟的果实，也为害花穗、幼果、果柄、结果小枝和叶片，常引起大量落果、烂果和贮运期间果品损失。该病的侵染所需时间极短，且荔枝结果期间又多为阴雨天气，若不提前进行防治几乎年年都会流行。我国荔枝霜疫霉病平均发病率在20％以上，严重的高达60％；春雨、梅雨季较长的年份，烂果率达30-50％，严重影响产量、品质以及鲜果的储运和外销，大大限制了荔枝霜产业的发展。因此，研究该病害的致病机理及研发有效的防控措施是我国荔枝产业的重大需求。
研究并明确荔枝霜疫病发生流行规律及病菌的致病机理是研发病害防控技术的前提条件，而研究病害流行规律需进行病菌人工接种技术，其人工接种体是游动孢子，同时，致病机理研究也需要大量的游动孢子进行致病性测定，而传统的获得游动孢子的方法是通过孢子囊释放游动孢子，从而获得最终的接种体，该常规方法产孢量低，产孢时间长，孢子囊很难集中释放游动孢子，不能满足大批量获得游动孢子的目的。因此，很有必要建立一种简易、高效的诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊集中释放，并产生大量游动孢子的方法，旨在为开展荔枝霜疫霉菌的致病机理及揭示病害的发生规律奠定基础，为研发荔枝霜疫病防控措施提供技术支撑。
发明内容
鉴以此，本发明提出一种诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊释放游动孢子的方法，来解决上述产孢量低，产孢时间长，孢子囊很难集中释放游动孢子，不能满足大批量获得游动孢子的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：一种诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊释放游动孢子的方法：包括以下步骤：
(1)荔枝霜疫霉菌孢子囊的产生：在无菌工作台上将切割0.5×0.5cm荔枝霜疫霉菌块接种于装有培养液且直径为11cm的培养皿中，在黑暗条件下培养4～6d，再置于白色日光灯光照700～900lux、温度23～30℃下连续培养1～3d，产生荔枝霜疫霉菌孢子囊；
(2)游动孢子囊的诱导产生：待步骤(1)中的培养皿产满菌丝后，将无菌L型玻棒涂抹长满菌丝的平板，再置于20～30℃中光照静置培养20～30h，即可诱导产生游动孢子囊；
(3)游动孢子集中释放：在步骤(2)的培养皿加入无菌水，收集荔枝霜疫霉菌孢子囊，并移至10～20℃培养箱中静置40～60min，即可释放出大量的游动孢子；
(4)游动孢子的收集：用灭菌后的毛笔轻轻刷洗步骤(3)得到的培养皿表面的菌丝，以达到脱离培养基的目的，过滤，所得到的过滤液即为荔枝霜疫霉菌游动孢子悬浮液。
进一步的，所述步骤(1)中培养液包括以下原料：V8蔬菜汁8～15份、防风草根汁1～6份、荔枝果皮多酚2～10份、二裂酵母发酵产物溶孢物0.3～1.2份、琼脂粉3～8份、去离子水80～100份，所述V8蔬菜汁为美国Campbell Soup Company公司生产。
进一步的，所述步骤(1)中培养液包括以下重量份原料：V8蔬菜汁10份、防风草根汁3份、荔枝果皮多酚6份、二裂酵母发酵产物溶孢物0.7份、琼脂粉5份、去离子水90份。
进一步的，所述培养液的制备方法为将V8蔬菜汁、防风草根汁、荔枝果皮多酚、二裂酵母发酵产物溶孢物、琼脂粉、去离子水混合搅拌5～30min，再于100～130℃高压蒸汽灭菌10～30min。
进一步的，所述步骤(2)中光照为700～900lux
进一步的，所述步骤(4)中使用双层无菌纱布过滤，过滤1～3次。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊释放游动孢子的方法，配制营养液和培育环境设置，使得诱导荔枝霜疫霉菌产生孢子囊及集中释放游动孢子的最佳条件，短期内即可诱导大量的游动孢子囊并集中释放游动孢子，既解决了一般方法很难集中释放游动孢子的问题，又避免了利用水培法诱导产生游动孢子囊容易被污染的难题。
(1)集中释放：传统方法是诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊产生，成囊量高，并逐步释放游动孢子无法集中释放大量游动孢子，或者绝大多数疫霉菌是在4℃低温处理后释放游动孢子，本发明采用了抹伤荔枝霜疫霉菌菌丝体，再通过光照和低温刺激受伤菌体，在13℃条件下处理45-60min后可集中产生大量游动孢子，本发明具有短时间内诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊产生并集中大量释放游动孢子的优点。
(2)方法简便：传统是用水培法诱导产生荔枝霜疫霉菌孢子囊和游动孢子的释放，这些方法步骤比较复杂，且这些方法要求需不断的换水或保湿，而且要通过收集孢子囊后再刺激游动孢子释放，存在操作繁琐、工作量大的缺点，无法满足大量试验的需求。
(3)诱导周期短：本发明的方法可以在7-10d内获得大量的荔枝霜疫霉菌的游动孢子悬浮液，与传统水培法诱导方法相比，诱导周期缩短。
附图说明
图1为实施例3诱导产生的荔枝霜疫霉菌孢子囊；
图2为实施例3集中释放的荔枝霜疫霉菌游动孢子。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊释放游动孢子的方法：包括以下步骤：
(1)荔枝霜疫霉菌孢子囊的产生：在无菌工作台上将切割0.3×0.3cm荔枝霜疫霉菌块接种于装有培养液且直径为11cm的培养皿中，在黑暗条件下培养5d，再置于光照700lux、温度23℃下连续培养1d，产生荔枝霜疫霉菌孢子囊；培养液的制备是将V8蔬菜汁8份、防风草根汁1份、荔枝果皮多酚2份、二裂酵母发酵产物溶孢物0.3份、琼脂粉3份、去离子水80份混合搅拌5min，再于100℃高压蒸汽灭菌10min；
(2)游动孢子囊的诱导产生：待步骤(1)中的培养皿产满菌丝后，将无菌L型玻棒涂抹长满菌丝的平板，再置于20℃中静置培养20h，即可诱导产生游动孢子囊；
(3)游动孢子集中释放：在步骤(2)的培养皿加入15ml无菌水，收集荔枝霜疫霉菌孢子囊，并移至10℃培养箱中光照700lux静置40min，即可释放出游动孢子；
(4)游动孢子的收集：用灭菌后的毛笔轻轻刷洗步骤(3)得到的培养皿表面的菌丝，使菌丝脱离培养基，再使用双层无菌纱布过滤1次，所得到的过滤液即为荔枝霜疫霉菌游动孢子悬浮液。
实施例2
一种诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊释放游动孢子的方法：包括以下步骤：
(1)荔枝霜疫霉菌孢子囊的产生：在无菌工作台上将切割0.3×0.3cm荔枝霜疫霉菌块接种于装有培养液且直径为11cm的培养皿中，在黑暗条件下培养7d，再置于光照900lux、温度30℃下连续3d，产生荔枝霜疫霉菌孢子囊；培养液的制备是将V8蔬菜汁15份、防风草根汁6份、荔枝果皮多酚10份、二裂酵母发酵产物溶孢物1.2份、琼脂粉8份、去离子水100份混合搅拌30min，再于130℃高压蒸汽灭菌30min；
(2)游动孢子囊的诱导产生：待步骤(1)中的培养皿产满菌丝后，将无菌L型玻棒涂抹长满菌丝的平板，再置于30℃中光照900lux静置培养20～30h，即可诱导产生游动孢子囊；
(3)游动孢子集中释放：在步骤(2)的培养皿加入18ml无菌水，收集荔枝霜疫霉菌孢子囊，并移至20℃培养箱中静置60min，即可释放出大量的游动孢子；
(4)游动孢子的收集：用灭菌后的毛笔轻轻刷洗步骤(3)得到的培养皿表面的菌丝，使菌丝脱离培养基，使用双层无菌纱布过滤3次，所得到的过滤液即为荔枝霜疫霉菌游动孢子悬浮液。
实施例3
一种诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊释放游动孢子的方法：包括以下步骤：
(1)荔枝霜疫霉菌孢子囊的产生：在无菌工作台上将切割0.5×0.5cm荔枝霜疫霉菌块接种于装有培养液且直径为11cm的培养皿中，在黑暗条件下培养5d，再置于光照800lux、温度25℃下连续培养2d，产生荔枝霜疫霉菌孢子囊；培养液的制备是将V8蔬菜汁8份、防风草根汁1份、荔枝果皮多酚2份、二裂酵母发酵产物溶孢物0.3份、琼脂粉3份、去离子水80份混合搅拌18min，再于121℃高压蒸汽灭菌20min；
(2)游动孢子囊的诱导产生：待步骤(1)中的培养皿产满菌丝后，将无菌L型玻棒涂抹长满菌丝的平板，再置于25℃中静置光照800lux培养24h，即可诱导产生游动孢子囊；
(3)游动孢子集中释放：在步骤(2)的培养皿加入17ml无菌水，收集荔枝霜疫霉菌孢子囊，并移至13℃培养箱中静置45min，即可释放出大量的游动孢子；
(4)游动孢子的收集：用灭菌后的毛笔刷洗步骤(3)得到的培养皿表面的菌丝，使用双层无菌纱布过滤2次，所得到的过滤液即为荔枝霜疫霉菌游动孢子悬浮液。
实施例4
一种诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊释放游动孢子的方法：包括以下步骤：
(1)荔枝霜疫霉菌孢子囊的产生：在无菌工作台上将切割0.3×0.3cm荔枝霜疫霉菌块接种于装有培养液且直径为11cm的培养皿中，在黑暗条件下培养5d，再置于光照700lux、温度23℃下连续培养1d，产生荔枝霜疫霉菌孢子囊；培养液的制备是将V8蔬菜汁8份、防风草根汁1份、荔枝果皮多酚2份、二裂酵母发酵产物溶孢物0.3份、琼脂粉3份、去离子水80份混合搅拌18min，再于121℃高压蒸汽灭菌20min；
(2)游动孢子囊的诱导产生：待步骤(1)中的培养皿产满菌丝后，将无菌L型玻棒涂抹长满菌丝的平板，再置于20℃中静置培养20h，即可诱导产生游动孢子囊；
(3)游动孢子集中释放：在步骤(2)的培养皿加入15ml无菌水，收集荔枝霜疫霉菌孢子囊，并移至10℃培养箱中光照700lux静置40min，即可释放出游动孢子；
(4)游动孢子的收集：用灭菌后的毛笔轻轻刷洗步骤(3)得到的培养皿表面的菌丝，使菌丝脱离培养基，再使用双层无菌纱布过滤1次，所得到的过滤液即为荔枝霜疫霉菌游动孢子悬浮液。
实施例5
一种诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊释放游动孢子的方法：包括以下步骤：
(1)荔枝霜疫霉菌孢子囊的产生：在无菌工作台上将切割0.3×0.3cm荔枝霜疫霉菌块接种于装有培养液且直径为11cm的培养皿中，在黑暗条件下培养7d，再置于光照900lux、温度30℃下连续3d，产生荔枝霜疫霉菌孢子囊；培养液的制备是将V8蔬菜汁8份、防风草根汁1份、荔枝果皮多酚2份、二裂酵母发酵产物溶孢物0.3份、琼脂粉3份、去离子水80份混合搅拌18min，再于121℃高压蒸汽灭菌20min；
(2)游动孢子囊的诱导产生：待步骤(1)中的培养皿产满菌丝后，将无菌L型玻棒涂抹长满菌丝的平板，再置于30℃中光照900lux静置培养20～30h，即可诱导产生游动孢子囊；
(3)游动孢子集中释放：在步骤(2)的培养皿加入18ml无菌水，收集荔枝霜疫霉菌孢子囊，并移至20℃培养箱中静置60min，即可释放出大量的游动孢子；
(4)游动孢子的收集：用灭菌后的毛笔轻轻刷洗步骤(3)得到的培养皿表面的菌丝，使菌丝脱离培养基，使用双层无菌纱布过滤3次，所得到的过滤液即为荔枝霜疫霉菌游动孢子悬浮液。
对比例1
本对比例与是实施例3的区别在于，培养液包括以下重量份原料：V8蔬菜汁5份、防风草根汁8份、荔枝果皮多酚15份、二裂酵母发酵产物溶孢物2份、琼脂粉1份、去离子水120份。
对比例2
本对比例与是实施例3的区别在于，培养液包括以下重量份原料：V8蔬菜汁10份、荔枝果皮多酚6份、二裂酵母发酵产物溶孢物0.7份、琼脂粉5份、去离子水90份。
对比例3
本对比例与是实施例3的区别在于，培养液包括以下重量份原料：V8蔬菜汁10份、防风草根汁3份、二裂酵母发酵产物溶孢物0.7份、琼脂粉5份、去离子水90份。
对比例4
本对比例与是实施例3的区别在于，培养液包括以下重量份原料：V8蔬菜汁10份、防风草根汁3份、荔枝果皮多酚6份、琼脂粉5份、去离子水90份。
一、观察测定
(1)在上述实施例1～5和对比例1～4中步骤(3)收集荔枝霜疫霉菌孢子囊时，取出1ml测定产生的孢子囊数量，在100倍镜视野下计算孢子囊的数量。
(2)用量程为10μL移液枪吸取5μL的上述实施例1～5和对比例1～4的悬浮液置于血球计数载玻片上，在100倍镜视野下计算游动孢子的数量。平均取样3次，计算出5μL悬浮液中游动孢子的释放率；
Figure BDA0003161784270000081
(3)将实施例1～5和对比例1～4的荔枝霜疫霉菌游动孢子悬浮液在黑暗10℃下3h刺激游动孢子萌发，平均取3次，通过100倍镜检计算5μL悬浮液中游动孢子的萌发率；
Figure BDA0003161784270000082
测试结果如下：
Figure BDA0003161784270000083
由上述表格结果可知，本发明的诱导方法有助于荔枝霜疫霉菌产生孢子囊及集中释放游动孢子，并且获得的孢子进行刺激处理后，诱导周期缩短，孢子萌发率高；
其中，实施例1～5和对比例1比较，成囊量、游动孢子释放率、游动孢子萌发率较好，说明培养液的原料科学配比，在适当的比例浓度内，达到较好的诱导效果；
实施例1～5和对比例2比较，成囊量对比明显，说明防风草根汁在一定程度上有促进成囊的效果，与培养液混合，能抑制霜疫霉生长和产生孢子囊的活性；
实施例1～5和对比例3比较，游动孢子释放率较高，说明在营养液中加入荔枝果皮多酚结合适当的培养条件下可促进孢子囊集中释放游动孢子；
实施例1～5和对比例4比较，成囊量和孢子释放率相当，孢子萌发率稍高，说明在步骤(1)培养液中的二裂酵母发酵产物溶孢物在培养时可通过提高游动孢子的应激性，提高孢子囊活力，促进萌芽。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种诱导荔枝霜疫霉菌（Peronophythora litchi）孢子囊释放游动孢子的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）荔枝霜疫霉菌孢子囊的产生：将荔枝霜疫霉菌块接种于装有培养液的培养皿中，在黑暗条件下培养4~6d，再置于光照700~900lux、温度23~30℃下连续培养1~3d，产生荔枝霜疫霉菌孢子囊；
培养液包括以下重量份原料：V8蔬菜汁8~15份、防风草根汁1~6份、荔枝果皮多酚2~10份、二裂酵母发酵产物溶孢物0.3~1.2份、琼脂粉3~8份、去离子水80~100份；
（2）游动孢子囊的诱导产生：待步骤（1）中的培养皿产满菌丝后，将无菌玻棒涂抹长满菌丝的平板，再置于20~30℃中光照静置培养20~30h，即可诱导产生游动孢子囊；
（3）游动孢子集中释放：在步骤（2）的培养皿加入无菌水，收集荔枝霜疫霉菌孢子囊，并移至10~20℃培养箱中静置40~60min，即可释放出游动孢子；
（4）游动孢子的收集：用灭菌后的毛笔刷洗步骤（3）得到的培养皿表面的菌丝，过滤，所得到的过滤液即为荔枝霜疫霉菌游动孢子悬浮液。
2.如权利要求1所述的诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊释放游动孢子的方法，其特征在于：所述步骤（1）中培养液包括以下重量份原料：V8蔬菜汁10份、防风草根汁3份、荔枝果皮多酚6份、二裂酵母发酵产物溶孢物0.7份、琼脂粉5份、去离子水90份。
3.如权利要求1所述的诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊释放游动孢子的方法，其特征在于：所述培养液的制备方法为将V8蔬菜汁、防风草根汁、荔枝果皮多酚、二裂酵母发酵产物溶孢物、琼脂粉、去离子水混合搅拌5~30min，再于100~130℃高压蒸汽灭菌10~30 min。
4.如权利要求1所述的诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊释放游动孢子的方法，其特征在于：所述步骤（2）中光照为700~900lux。
5.如权利要求1所述的诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊释放游动孢子的方法，其特征在于：所述步骤（4）中使用双层无菌纱布过滤，过滤1~3次。
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