CN105900837A - 一种通过悬浮培养快速繁育铁兰种苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属植物栽培技术领域，涉及一种通过悬浮培养快速繁育铁兰种苗的方法，包括愈伤组织诱导及增殖、胚性愈伤组织液体悬浮、胚状体萌发不定芽、不定芽诱导生根、移栽和管理过程。本发明工艺流程简单，以铁兰叶片为材料进行组织培养，可以在短时间内获得大量可用于生产栽培的种苗，前期培养周期短，且所得种苗的生理年龄一致，生长整齐，占地面积小，成本低，适合工厂化育苗和规模化栽培，为铁兰人工种植产业的发展提供技术支持。

Description

一种通过悬浮培养快速繁育铁兰种苗的方法

技术领域

本发明属植物栽培技术领域，涉及一种铁兰种苗的繁殖方法，具体是一种利用铁兰叶片诱导形成的愈伤组织，诱导胚性愈伤组织及胚状体，通过悬浮培养胚状体增殖，再经胚状体萌发、不定芽生长、不定芽生根诱导、无菌苗移栽等过程，获得大量种苗的繁育方法。

背景技术

铁兰(Tillandsia cyanea)，又称扇凤梨，属于凤梨科(Bromeliaceae)铁兰属，是多年生单子叶植物，原产美洲热带及亚洲热带地区，约有500多个原生种，园艺栽培观赏的约60种。铁兰茎短，植株相对来说比较矮小，总苞片可观赏数月，属迷你型观赏性植物，具有很强的净化空气的能力，可用于美化环境，适于盆栽装饰室内，摆放于阳台、窗台、书桌等，也可悬挂在客厅、茶室、还可做插花陪衬材料。

铁兰通常用分株法繁殖，即在花后萌发的吸芽发育到一定大小时，从母株分离栽种，获得新的植株。这种方法繁育种苗非常缓慢，繁殖系数很低，不能作为铁兰种苗批量繁育的方法。

利用组织培养技术繁育铁兰种苗是目前较为常用的方法，均通过不定芽增殖途径获得批量种苗。该方法周期相对较长，从取材到批量出苗需要2-3年时间，繁育过程中需要投入相对较多的人力和物力进行多次批量继代，才能获得批量种苗，效率低，成本高。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过悬浮培养快速繁育铁兰种苗的方法，以铁兰叶片为材料进行组织培养，可以在短时间内获得大量可用于生产栽培的种苗，所得种苗的生理年龄一致，生长整齐，前期培养周期短(每14d一代)，占地面积小，成本低，适合工厂化育苗和规模化栽培。

本发明所采用的技术方案：

一种通过悬浮培养快速繁育铁兰种苗的方法，包括愈伤组织诱导及增殖、胚性愈伤组织液体悬浮、胚状体萌发不定芽、不定芽诱导生根、移栽和管理过程，其步骤如下：

1、愈伤组织诱导及增殖

取铁兰无菌苗叶片，切段后接种于愈伤组织诱导培养基上，培养40～50d，叶片基部分化出易碎的愈伤组织；将愈伤组织与叶片分离后，接种到新鲜的愈伤组织诱导培养基上继续培养，愈伤组织增殖分化，形成淡黄色的大量疏松易碎的胚性愈伤组织。培养条件：培养温度25～29℃，光照培养。光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m^-2·s^-1。所述愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加6-BA 2.0～3.0mg/L、NAA 0.02mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH为5.8。

2、胚性愈伤组织液体悬浮

将疏松易碎的胚性愈伤组织块轻轻压碎，接种到继代培养基Ⅰ中进行黑暗悬浮培养，温度25℃，转数90rpm，每7d继代1次，3次后，形成胚状体；更换为继代培养基Ⅱ，培养条件不变，延长继代周期至每14d继代1次。所述继代培养基Ⅰ是以MS培养基为基本培养基，并添加2,4-D 0.1mg/L；所述继代培养基Ⅱ是以MS培养基为基本培养基，并添加2,4-D 0.1mg/L、KT 0.05mg/L。

3、胚状体萌发不定芽

将经过继代培养得到的胚状体，接种到不定芽诱导培养基上培养，25～30℃下暗培养，胚状体开始逐渐变绿，发生毛状体，培养90d后，萌发形成无根不定芽丛。所述不定芽诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加6-BA 1.0mg/L、NAA 0.01mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH 5.8。

4、不定芽诱导生根

待不定芽伸长到2～3cm时，将不定芽丛进行单株分离，接种到生根培养基上，25～30℃下暗培养，培养40d后，在不定芽的基部形成棕色的根，根上有根毛，部分分叉。所述生根培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，并添加NAA 1.0mg/L、IBA 0.5mg/L、蔗糖20g/L、卡拉胶6.5g/L，pH 5.8。

5、移栽和管理过程

A.出瓶方法：将生根苗连瓶放置在控温大棚中炼苗，一周后将苗移出培养瓶外，洗净小苗根部的培养基，进行移栽；

B.基质制作：分别取草炭土、椰糠和河沙，按体积比计：草炭土：椰糠：河沙＝3～5：2～4：1的比例配成基质，提前浇透水，并覆盖薄膜保湿；

C.移栽方法：将已经湿透的基质进行浅翻，然后耙平，并用竹棒打孔，孔深0.5cm，将小苗根部轻轻放到孔中，并用周围的基质填充，稍压实，并用喷雾的方法淋定根水；

D.管理方法：移栽后7～10d，覆盖薄膜保湿，基质湿度保持80％～90％，然后逐渐降低到70％；空气湿度保持90％以上，遮阴度60％～70％，然后逐渐减少到30％；15～20d后幼苗生新根，30d后可见新叶抽出，以后平均每20～25d抽生1片新叶，2年时株高20cm，叶片数40～50片时，自然开花；

E.施肥方法：15～20d后，晴天上午采用0.2％～0.3％尿素溶液喷雾后，并用清水淋洗，每7d施肥1次，半年后改为花多多9号，按说明施用；

F.病虫害防治方法：利用500倍多菌灵、500倍百菌清、800倍甲霜灵复合防病，利用菊酯类杀虫剂除虫。

本发明工艺流程简单，以铁兰叶片为材料进行组织培养，可以在短时间内获得大量可用于生产栽培的种苗，前期培养周期短，且所得种苗的生理年龄一致，生长整齐，占地面积小，成本低，适合工厂化育苗和规模化栽培，为铁兰人工种植产业的发展提供技术支持。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。

一、铁兰种苗繁殖

实施例一

1、愈伤组织诱导及增殖

取铁兰无菌苗叶片，切成0.5-1cm的小段50段，接种于愈伤组织诱导培养基(MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.02mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH 5.8)，培养30d后，接种外植体基部出现小突起，培养40～50d后，逐渐形成易碎的愈伤组织；将愈伤组织与叶片分离后，接种到新鲜的愈伤组织诱导培养基上继续培养，每40d继代一次，愈伤组织增殖分化，形成淡黄色的大量疏松易碎的胚性愈伤组织。培养条件：培养温度25℃，光照培养。光照时间10h/d，光照强度23μmol·m^-2·s^-1。

2、胚性愈伤组织液体悬浮

将疏松易碎的胚性愈伤组织块轻轻压碎为约2mm×2mm的小块40块，接种到继代培养基Ⅰ(MS+2,4-D 0.1mg/L，pH 5.8)中进行黑暗悬浮培养，温度25℃，转数90rpm，每7d继代1次，3次后，形成胚状体；更换为继代培养基Ⅱ(MS+2,4-D0.1mg/L+KT 0.05mg/L，pH 5.8)中继续培养，培养条件不变，延长继代周期至每14d继代1次。

3、胚状体萌发不定芽

将经过继代增殖培养得到的胚状体，接种到不定芽诱导培养基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.01mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH 5.8)上培养，25℃下暗培养，胚状体开始逐渐变绿，发生毛状体，培养90d后，萌发形成无根不定芽丛。

4、不定芽诱导生根

待不定芽伸长到2～3cm时，将不定芽丛进行单株分离，取300株接种到生根培养基(1/2MS+NAA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+卡拉胶6.5g/L，pH5.8)上，25℃下暗培养，培养40d后，在不定芽的基部形成棕色的根，根上有根毛，部分分叉。

5、移栽和管理过程

A.出瓶方法：将200株生根苗连瓶放置在控温大棚中炼苗，一周后将苗移出培养瓶外，洗净小苗根部的培养基，进行移栽；

B.基质制作：分别取草炭土、椰糠和河沙，按体积比计：草炭土：椰糠：河沙＝3：2：1的比例配成基质，提前浇透水，并覆盖薄膜保湿；

C.移栽方法：将已经湿透的基质进行浅翻，约2～3cm深，然后耙平，并用竹棒打孔，孔深0.5cm，将小苗根部轻轻放到孔中，并用周围的基质填充，稍压实，并用喷雾的方法淋定根水；

D.管理方法：移栽后8d，覆盖薄膜保湿，基质湿度保持80％～90％，然后逐渐降低到70％；空气湿度保持90％以上，遮阴度60％～70％，然后逐渐减少到30％；15～20d后幼苗生新根，30d后可见新叶抽出，以后平均每20～25d抽生1片新叶，2年时株高20cm，叶片数40～50片时，自然开花；

E.施肥方法：15～20d后幼苗生新根，晴天上午采用0.2％～0.3％尿素溶液喷雾后，并用清水淋洗，每7d施肥1次，半年后改为花多多9号，按说明施用；

F.病虫害防治方法：利用500倍多菌灵、500倍百菌清、800倍甲霜灵复合防病，利用菊酯类杀虫剂除虫。

实施例二

1、愈伤组织诱导及增殖

取铁兰无菌苗叶片，切成0.5-1cm的小段50段，接种于愈伤组织诱导培养基(MS+6-BA 2.5mg/L+NAA 0.02mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH 5.8)，培养30d后，接种外植体基部出现小突起，培养40～50d后，逐渐形成易碎的愈伤组织；将愈伤组织与叶片分离后，接种到新鲜的愈伤组织诱导培养基上继续培养，每40d继代一次，愈伤组织增殖分化，形成淡黄色的大量疏松易碎的胚性愈伤组织。培养条件：培养温度27℃，光照培养。光照时间12h/d，光照强度27μmol·m^-2·s^-1。

2、胚性愈伤组织液体悬浮

将疏松易碎的胚性愈伤组织块轻轻压碎为约2mm×2mm的小块40块，接种到继代培养基Ⅰ(MS+2,4-D 0.1mg/L，pH 5.8)中进行黑暗悬浮培养，温度27℃，转数100rpm，每7d继代1次，3次后，形成胚状体；更换为继代培养基Ⅱ(MS+2,4-D 0.1mg/L+KT 0.05mg/L，pH 5.8)中继续培养，培养条件不变，延长继代周期至每14d继代1次。

3、胚状体萌发不定芽

将经过继代增殖培养得到的胚状体，接种到不定芽诱导培养基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.01mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH 5.8)上培养，28℃下暗培养，胚状体开始逐渐变绿，发生毛状体，培养90d后，萌发形成无根不定芽丛。

4、不定芽诱导生根

待不定芽伸长到2～3cm时，将不定芽丛进行单株分离，取300株接种到生根培养基(1/2MS+NAA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+卡拉胶6.5g/L，pH5.8)上，28℃下暗培养，培养40d后，在不定芽的基部形成棕色的根，根上有根毛，部分分叉。

5、移栽和管理过程

A.出瓶方法：将200株生根苗连瓶放置在控温大棚中炼苗，一周后将苗移出培养瓶外，洗净小苗根部的培养基，进行移栽；

B.基质制作：分别取草炭土、椰糠和河沙，按体积比计：草炭土：椰糠：河沙＝4：3：1的比例配成基质，提前浇透水，并覆盖薄膜保湿；

C.移栽方法：将已经湿透的基质进行浅翻，约2～3cm深，然后耙平，并用竹棒打孔，孔深0.5cm，将小苗根部轻轻放到孔中，并用周围的基质填充，稍压实，并用喷雾的方法淋定根水；

D.管理方法：移栽后10d，覆盖薄膜保湿，基质湿度保持80％～90％，然后逐渐降低到70％；空气湿度保持90％以上，遮阴度60％～70％，然后逐渐减少到30％；15～20d后幼苗生新根，30d后可见新叶抽出，以后平均每20～25d抽生1片新叶，2年时株高20cm，叶片数40～50片时，自然开花；

E.施肥方法：15～20d后幼苗生新根，晴天上午采用0.2％～0.3％尿素溶液喷雾后，并用清水淋洗，每7d施肥1次，半年后改为花多多9号，按说明施用；

F.病虫害防治方法：利用500倍多菌灵、500倍百菌清、800倍甲霜灵复合防病，利用菊酯类杀虫剂除虫。

实施例三

1、愈伤组织诱导及增殖

取铁兰无菌苗叶片，切成0.5-1cm的小段50段，接种于愈伤组织诱导培养基(MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.02mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH 5.8)，培养30d后，接种外植体基部出现小突起，培养40～50d后，逐渐形成易碎的愈伤组织；将愈伤组织与叶片分离后，接种到新鲜的愈伤组织诱导培养基上继续培养，每40d继代一次，愈伤组织增殖分化，形成淡黄色的大量疏松易碎的胚性愈伤组织。培养条件：培养温度29℃，光照培养。光照时间10h/d，光照强度30μmol·m^-2·s^-1。

2、胚性愈伤组织液体悬浮

将疏松易碎的胚性愈伤组织块轻轻压碎为约2mm×2mm的小块40块，接种到继代培养基Ⅰ(MS+2,4-D 0.1mg/L，pH 5.8)中进行黑暗悬浮培养，温度25℃，转数100rpm，每7d继代1次，3次后，形成胚状体；更换为继代培养基Ⅱ(MS+2,4-D 0.1mg/L+KT 0.05mg/L，pH 5.8)中继续培养，培养条件不变，延长继代周期至每14d继代1次。

3、胚状体萌发不定芽

将经过继代增殖培养得到的胚状体，接种到不定芽诱导培养基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.01mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH 5.8)上培养，25～30℃下暗培养，胚状体开始逐渐变绿，发生毛状体，培养90d后，萌发形成无根不定芽丛。

4、不定芽诱导生根

待不定芽伸长到2～3cm时，将不定芽丛进行单株分离，取300株接种到生根培养基(1/2MS+NAA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+卡拉胶6.5g/L，pH5.8)上，30℃下暗培养，培养40d后，在不定芽的基部形成棕色的根，根上有根毛，部分分叉。

5、移栽和管理过程

A.出瓶方法：将200株生根苗连瓶放置在控温大棚中炼苗，一周后将苗移出培养瓶外，洗净小苗根部的培养基，进行移栽；

B.基质制作：分别取草炭土、椰糠和河沙，按体积比计：草炭土：椰糠：河沙＝5：3：1的比例配成基质，提前浇透水，并覆盖薄膜保湿；

C.移栽方法：将已经湿透的基质进行浅翻，约2～3cm深，然后耙平，并用竹棒打孔，孔深0.5cm，将小苗根部轻轻放到孔中，并用周围的基质填充，稍压实，并用喷雾的方法淋定根水；

D.管理方法：移栽后7d，覆盖薄膜保湿，基质湿度保持80％～90％，然后逐渐降低到70％；空气湿度保持90％以上，遮阴度60％～70％，然后逐渐减少到30％；15～20d后幼苗生新根，30d后可见新叶抽出，以后平均每20～25d抽生1片新叶，2年时株高20cm，叶片数40～50片时，自然开花；

E.施肥方法：15～20d后幼苗生新根，晴天上午采用0.2％～0.3％尿素溶液喷雾后，并用清水淋洗，每7d施肥1次，半年后改为花多多9号，按说明施用；

F.病虫害防治方法：利用500倍多菌灵、500倍百菌清、800倍甲霜灵复合防病，利用菊酯类杀虫剂除虫。

二、种苗繁殖效果鉴定

1.铁兰无菌苗叶片愈伤组织诱导效果鉴定

为鉴定铁兰叶片愈伤组织诱导效果，对上述实施例的愈伤组织诱导情况进行观察，统计愈伤组织诱导数，计算诱导率，结果见表1。

表1铁兰无菌苗叶片愈伤组织诱导情况

项目	接种块数	诱导出愈伤组织的块数	诱导率
				实施例一	50	48	96％
实施例二	50	49	98％
				实施例三	50	46	92％

上述铁兰叶片愈伤组织诱导效果表明，本发明以改良的MS培养基进行诱导分化愈伤组织，分化率达90％以上，具有较好的分化效果。

2.铁兰胚性愈伤组织增殖效果鉴定

为鉴定铁兰胚性愈伤组织增殖效果，对上述实施例的铁兰胚性愈伤组织增殖情况进行观察，统计增殖数，计算增值系数，结果见表2。

表2铁兰胚性愈伤组织悬浮培养增殖情况

上述胚性愈伤组织增殖效果表明，本发明以改良的MS培养基对愈伤组织进行悬浮增殖培养，获得的悬浮培养物均为胚性愈伤组织，具有较好的增殖效果和较高的增殖系数。

3.铁兰胚状体分化效果鉴定

为鉴定铁兰胚状体分化效果，对上述实施例的分化情况进行观察，统计铁兰胚状体分化数，计算分化率，结果见表3。

表3铁兰胚状体分化情况

项目	胚状体数	不定芽分化数	分化率	不定芽质量
					实施例一	40	37	92.5％	健壮
实施例二	40	38	95％	健壮
					实施例三	40	36	90％	健壮

上述胚状体分化效果表明，本发明以改良的MS培养基(MS+6-BA+NAA+蔗糖+卡拉胶)进行诱导分化不定芽，分化率可达90％以上，且分化的不定芽健壮，具有较好的分化率。

4.铁兰不定芽生根效果鉴定

为鉴定铁兰不定芽的生根效果，对上述实施例的不定芽生根情况进行观察，统计生根数，计算生根率，结果见表4。

表4铁兰不定芽的生根情况

上述不定芽生根效果表明，本发明以改良的1/2MS培养基(1/2MS+NAA+IBA+蔗糖+卡拉胶)对铁兰不定芽进行诱导生根，在短时间内诱导出完整根系，生根率达90％以上。

5.生根苗苗圃移栽效果鉴定

为鉴定生根苗的移栽成活效果，对上述实施例的生根苗苗圃移栽生长情况进行观察，统计成活数，计算生根率，结果见表5。

表5铁兰生根苗的移栽生长情况

项目	生根苗数	成活数	成活率
				实施例一	200	198	99.0％
实施例二	200	195	97.5％
				实施例三	200	196	98.0％

上述移栽效果表明，本发明以诱导出良好根系的生根苗进行苗圃移栽，以草炭土、椰糠和河沙的混合物为栽培基质，具有较高的生根苗移栽成活率，达到95％以上，可以满足批量种苗繁殖，为铁兰人工种植提供支持。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种通过悬浮培养快速繁育铁兰种苗的方法，其特征在于，包括愈伤组织诱导及增殖、胚性愈伤组织液体悬浮、胚状体萌发不定芽、不定芽诱导生根、移栽和管理过程，其步骤如下：

1)、愈伤组织诱导及增殖

取铁兰无菌苗叶片，切段后接种于愈伤组织诱导培养基上，培养40～50d，叶片基部分化出易碎的愈伤组织；将愈伤组织与叶片分离后，接种到新鲜的愈伤组织诱导培养基上继续培养，愈伤组织增殖分化，形成淡黄色的大量疏松易碎的胚性愈伤组织；培养条件：培养温度25～29℃，光照培养，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m^-2·s^-1；所述愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加6-BA 2.0～3.0mg/L、NAA 0.02mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH为5.8；

2)、胚性愈伤组织液体悬浮

将疏松易碎的胚性愈伤组织块轻轻压碎，接种到继代培养基Ⅰ中进行黑暗悬浮培养，温度25℃，转数90rpm，每7d继代1次，3次后，形成胚状体；更换为继代培养基Ⅱ，培养条件不变，延长继代周期至每14d继代1次；所述继代培养基Ⅰ是以MS培养基为基本培养基，并添加2,4-D 0.1mg/L；所述继代培养基Ⅱ是以MS培养基为基本培养基，并添加2,4-D 0.1mg/L、KT 0.05mg/L；

3)、胚状体萌发不定芽

将经过继代培养得到的胚状体，接种到不定芽诱导培养基上培养，25～30℃下暗培养，胚状体开始逐渐变绿，发生毛状体，培养90d后，萌发形成无根不定芽丛；所述不定芽诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加6-BA 1.0mg/L、NAA 0.01mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH 5.8；

4)、不定芽诱导生根

待不定芽伸长到2～3cm时，将不定芽丛进行单株分离，接种到生根培养基上，25～30℃下暗培养，培养40d后，在不定芽的基部形成棕色的根，根上有根毛，部分分叉；所述生根培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，并添加NAA 1.0mg/L、IBA 0.5mg/L、蔗糖20g/L、卡拉胶6.5g/L，pH 5.8；

5)、移栽和管理过程

A.出瓶方法：将生根苗连瓶放置在控温大棚中炼苗，一周后将苗移出培养瓶外，洗净小苗根部的培养基，进行移栽；

B.基质制作：分别取草炭土、椰糠和河沙，按体积比计：草炭土：椰糠：河沙＝3～5：2～4：1的比例配成基质，提前浇透水，并覆盖薄膜保湿；

C.移栽方法：将已经湿透的基质进行浅翻，然后耙平，并用竹棒打孔，孔深0.5cm，将小苗根部轻轻放到孔中，并用周围的基质填充，稍压实，并用喷雾的方法淋定根水；

D.管理方法：移栽后7～10d，覆盖薄膜保湿，基质湿度保持80％～90％，然后逐渐降低到70％；空气湿度保持90％以上，遮阴度60％～70％，然后逐渐减少到30％；15～20d后幼苗生新根，30d后可见新叶抽出，以后平均每20～25d抽生1片新叶，2年时株高20cm，叶片数40～50片时，自然开花；

E.施肥方法：15～20d后，晴天上午采用0.2％～0.3％尿素溶液喷雾后，并用清水淋洗，每7d施肥1次，半年后改为花多多9号，按说明施用；

F.病虫害防治方法：利用500倍多菌灵、500倍百菌清、800倍甲霜灵复合防病，利用菊酯类杀虫剂除虫。