CN102106257B

CN102106257B - 一种筛选麦类作物耐赤霉病菌毒素的方法

Info

Publication number: CN102106257B
Application number: CN 200910200606
Authority: CN
Inventors: 黄剑华; 陆瑞菊; 王亦菲; 陈志伟; 何婷
Original assignee: SHANGHAI CO-ELITE AGRICULTURAL SCI-TECH (GROUP) CO LTD; Shanghai Lvjian Agriculture Technology Co ltd; Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: SHANGHAI CO-ELITE AGRICULTURAL SCI-TECH (GROUP) CO LTD; Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2009-12-24
Filing date: 2009-12-24
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2029-12-24
Also published as: CN102106257A

Abstract

本发明提供一种筛选麦类作物耐赤霉病菌粗毒素的方法，该方法包括在小孢子培养前对花药给予赤霉病粗毒素的胁迫处理，从经粗毒素胁迫处理后的花药中分离出小孢子，置于添加赤霉病菌粗毒素诱导培养基中培养，获得胚状体后置于添加NaCl的分化培养基上培养，获得再生植株。本发明的整个筛选过程都在实验室可控条件下进行，使筛选结果真实可靠，筛选所得再生植株携带的抗性基因以及其他所有基因一次性纯合，基因所控性状的遗传稳定性高。

Description

一种筛选麦类作物耐赤霉病菌毒素的方法

技术领域

本发明属于作物遗传育种技术领域，涉及以种子作为繁殖方式的麦类作物的抗赤霉病性状的改良方法。

背景技术

小麦是我国人民的主要食粮，大麦是制造啤酒的主要原料。麦类赤霉病不仅能导致产量严重下降，更严重的是，由于病原菌产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇等毒素积累于病麦粒，影响人类健康。由于目前尚缺乏有效的防治技术，加之化学防治造成环境污染，因而，培育抗性品种是防止麦类赤霉病最有效的方法。国内外多年来麦类抗赤霉病育种的实践表明，传统杂交育种技术选育高抗材料的效率低，并且需要大量杂交后代群体作依托。所以，研发一种有效的实验室抗赤霉病筛选方法，必将提高大、小麦抗赤霉病育种的效率。

国内外研究表明，赤霉病菌毒素作为小麦抗赤霉病性的筛选剂已得到肯定(陆维忠等，2001)，组织水平耐赤霉病毒素的能力与供体植株水平耐赤霉病能力存在明显的相关性(陆维忠，1998)。在不同耐赤霉病类型品种间杂交的F1小孢子群体中，无疑含有丰富的抗赤霉病重组配子体。通过适当的赤霉病菌毒素胁迫筛选，可以选择获得多抗源的抗病重组体(欧阳俊闻，1990；Fadel等，1993)。

相对于花药培养而言，游离小孢子培养提供了一个单倍体、单倍体细胞的实验操作系统，它对胁迫的反应更为敏感，胁迫存活的胚状体和再生植株所携抗性基因及所有基因经染色体自然或人工加倍后，全部一次性纯合，基因所控性状遗传稳定性极高。相对传统杂交育种的田间选择而言，本发明的选择效率更高，劳动强度大大降低，更易在短时间内获得抗病性提高的多抗源基因重组体。

本发明依据的科学原理是：植物细胞全能性理论，植株水平的性状与细胞水平的表达存在一致性的理论和植物对逆境的适应与抵抗有多种形式，其中通过交叉适应获得抗逆性是一种普遍而有效的方式的理论。

发明内容

本发明针对麦类作物现有种质材料中缺乏抗赤霉病品种的不足，提供一种新的麦类单倍体细胞水平耐赤霉病粗毒素再生株系的获得及离体筛选的方法，且筛选条件易于统一控制，不受外界自然条件的限制。

花药培养形成的再生植株基本上源于小孢子脱分化、分化而来，所以在很大程度上，花药对胁迫的培养反应可以视为小孢子的反应。植物对胁迫的反应通常存在交叉适应。已有研究证明植物对生物胁迫和非生物胁迫的反应之间存在交叉适应。NaCl胁迫筛选也是一种对毒素胁迫存活苗的再次逆境选择。

因此，本申请第一方面提供一种筛选麦类作物耐赤霉病菌粗毒素的方法，该方法包括：

1)取麦类作物幼穗花药置于添加3.9×10^-5～1.95×10^-4mol/L赤霉病菌毒素的0.2-0.5M甘露醇提取液中培养1-3天；

2)由步骤1)处理后的花药分离获得小孢子；

3)将步骤2)获得的小孢子置于添加赤霉病菌毒素0.50-1.0×10^-4mol/L、2，4，5-T 0.3-0.8mg/L、KT 0.3-0.8mg/L，麦芽糖60-120g/L，pH 5.5-6.2的N₆诱导培养基中，获得胚状体；

4)将步骤3)获得的胚状体置于添加NaCl 200-500mg/L、6-BA 0.3-1.2mg/L、KT 0.5-2.0mg/L、NAA 0.01-0.1mg/L和麦芽糖10-50g/L，PH为5.5-6.2的2/3MS分化培养基中，获得再生植株，该再生植株为耐赤霉病菌粗毒素的麦类作物。

在一优选实施例中，在所述步骤1)前，先在0-8℃下处理所述麦类作物幼穗花药15-30天。

在另一优选实施例中，在3-5℃下处理所述麦类作物幼穗花药20天。

在一优选实施例中，所述方法还包括：

5)将步骤4)所得的再生植株转入添加有NAA 0.02-0.08mg/L、多效唑2.0-10.0mg/L和蔗糖10-40g/L，pH5.6-6.0的1/2MS生根壮苗培养基中，在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下进行25～30天的生根壮苗培养。

在一优选实施例中，所述方法包括：

1)从供体植株上取幼穗在5℃的低温下处理20d，灭菌后在超净台上分离出花药；

2)将步骤1)所得花药置于添加1.5×10^-4mol/L赤霉病菌毒素的0.3M甘露醇预处理/提取液中培养2d，获得粗毒素胁迫处理过的花药；

3)将步骤2)获得的花药在超净台上进行旋切分离，获得游离小孢子；

4)将步骤3)获得的小孢子置于添加赤霉病菌毒素0.75×10^-4mol/L、2，4，5-T0.5mg/L、KT 0.5mg/L，麦芽糖90g/L，pH 5.8的N₆诱导培养基中，获得胚状体；

5)将步骤4)获得的胚状体置于添加NaCl 300mg/L、6-BA 0.5-1.5mg/L、KT 0.5-2.0mg/L、NAA 0.01-0.1mg/L和麦芽糖30g/L，PH为5.8的2/3MS分化培养基中，获得再生植株。

在一优选实施例中，所述麦类作物选自大麦和小麦。

在一优选实施例中，步骤1)中所述甘露醇提取液为含有0.8-1.6×10^-4mol/L赤霉病菌毒素的0.3-0.4M甘露醇溶液。

在一优选实施例中，步骤4)中所述NaCl含量为300-500mg/L。

本申请还包括一种用于实施本申请所述的方法的套盒，其特征在于，该套盒含有本申请所述的甘露醇提取液、N₆诱导培养基和/或2/3MS分化培养基。

在一优选实施例中，所述甘露醇提取液为添加3.9×10^-5～1.95×10^-4mol/L赤霉病菌毒素的0.2-0.5M甘露醇提取液。

在一优选实施例中，所述套盒含有甘露醇提取液、N₆诱导培养基和2/3MS分化培养基，

所述甘露醇提取液为添加3.9×10^-5～1.95×10^-4mol/L赤霉病菌毒素的0.2-0.5M甘露醇提取液；

所述N₆培养基添加有赤霉病菌毒素0.50-1.0×10^-4mol/L、2，4，5-T0.3-0.8mg/L、KT 0.3-0.8mg/L，麦芽糖60-120g/L，pH 5.5-6.2；

所述2/3MS分化培养基添加NaCl 200-500mg/L、6-BA 0.3-1.2mg/L、KT0.5-2.0mg/L、NAA 0.01-0.1mg/L和麦芽糖10-50g/L，pH为5.5-6.2。

具体实施方式

本申请提供一种筛选麦类作物耐赤霉病菌粗毒素的方法，该方法包括：

1)取幼穗在低温下处理15-25d，灭菌后在超净台上分离出花药；

2)将步骤1)所得花药置于添加3.9×10^-5～1.95×10^-4mol/L赤霉病菌毒素的0.2-0.5M甘露醇预处理/提取液中培养1-3d，获得粗毒素胁迫处理过的花药；

3)分离步骤2)获得的花药，获得游离小孢子；

4)将步骤3)获得的小孢子置于添加赤霉病菌毒素0.50-1.0×10^-4mol/L、2，4，5-T 0.3-0.8mg/L、KT 0.3-0.8mg/L，麦芽糖60-120g/L，pH 5.5-6.2的N₆诱导培养基中，获得胚状体；

5)将步骤4)获得的胚状体置于添加NaCl 200-500mg/L、6-BA 0.3-1.2mg/L、KT 0.5-2.0mg/L、NAA 0.01-0.1mg/L和麦芽糖10-50g/L，PH为5.5-6.2的2/3MS分化培养基中，获得再生植株。

实施本申请时，可从大田选取中部小花，其小孢子发育处于单核早期、中期的穗子，放入冰箱冷藏10-30天，例如15天左右。冷藏的温度可以在0-8℃范围之间，例如可以为3-8℃。通常可在约5℃冷藏。

接种时，穗子先消毒，例如用饱和的漂白粉溶液消毒10-20min，无菌水冲洗2-4次。每个培养皿中置30-40枚花药，用含3.9×10^-5～1.95×10^-4mol/L赤霉病菌毒素的0.2-0.5M的甘露醇提取液黑暗预处理1-3天后，倒入15-20ml0.2-0.5M的甘露醇提取液，用高速分散器超速(例如3000-4000rpm)旋切，150目筛网过滤，滤液低速(例如800-1000rpm)离心，重复2-3次，收集小孢子。

用于预处理花药的甘露醇提取液可含有1.0-1.6×10^-4mol/L的赤霉病菌毒素，优选0.8-1.6×10^-4mol/L，更优选1.0-1.5×10^-4mol/L，更优选1.4-1.5×10^-4mol/L的赤霉病菌毒素。用于预处理花药的甘露醇提取液的浓度可以为约0.3-0.4M，优选为约0.3M。高速分散器旋切花药时所使用的甘露醇提取液的浓度可以为0.3-0.4M，优选为0.3M。

提取液用作预处理液处理花药时添加有3.9×10^-5～1.95×10^-4mol/L的赤霉病菌毒素。提取液用于提取小孢子时则不含赤霉病菌毒素。

提取获得的游离小孢子可置于诱导培养基中进行诱导培养。诱导培养基通常以N₆培养基为基本培养基，其中加有赤霉病菌毒素0.50-1.0×10^-4mol/L、2，4，5-T 0.3-0.8mg/L、KT 0.3-0.8mg/L，麦芽糖60-120g/L，pH 5.5-6.2。

N₆诱导培养基中赤霉病菌毒素的浓度为0.65-0.85×10^-4mol/L，更优选为0.75-0.80×10^-4mol/L。

2，4，5-T(2，4，5-三氯苯氧乙酸)的优选浓度为0.4-0.7mg/L，更优选为0.4-0.5mg/L。

可以用2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)替代2，4，5-T。2，4-D的浓度0.4-0.7mg/L，更优选为0.4-0.5mg/L。或者可使用2，4，5-T和2，4-D的混合物，两者的总浓度为0.4-0.7mg/L，更优选为0.4-0.5mg/L。

KT的优选浓度为0.4-0.65mg/L，更优选为0.4-0.5mg/L。

麦芽糖的浓度优选为80-100g/L，更优选为80-90g/L。

诱导培养基的pH优选为5.6-5.9，更优选为5.7-5.8。

培养前将先用该N₆诱导培养基洗涤小孢子1到2次，然后用培养基将小孢子密度调节至1.0～1.2×10⁵/ml，取大约1.5-3ml小孢子悬浮液接种于培养皿(30×15mm)，Parafilm封口，室温下(例如约25-28℃)暗培养15-25天。通常情况下是在25℃暗培养大约21天左右。

N₆培养基的配方如下表1所示(单位：mg/L)：

表1

N₆大量元素：

(NH₄)₂SO₄ 463

KNO₃ 2830

CaCl₂·2H₂O 166

MgSO₄·7H₂O 185

KH₂PO₄ 400

N₆微量元素：

H₃BO₃ 1.6

KI 0.83

MnSO₄·4H₂O 5.0

ZnSO₄·7H₂O 1.5

N₆铁盐：

Na₂EDTA 37.3

FeSO₄·7H₂O 27.8

N₆有机元素：

盐酸硫胺素 1.0

盐酸吡多辛 0.5

甘氨酸 2.0

烟酸 0.5

肌醇 100.0

N₆培养基可自行按上述配方配制，也可向Sigma等化学试剂公司购买成品。然后根据本文所述配方配制本文的N₆诱导培养基。本领域技术人员将理解，可对上述表1所示的浓度作出适当的变动，例如有大约5％(例如3％左右、2％左右、1％左右，或更低的变动范围)或更低的变动，由此配制得到的培养基仍然具有所需的生物学功能，仍能用于实施本发明。例如，以肌醇为例，每升N₆培养基中可含有大约95-105mg的肌醇(5％的变动幅度)。其它成分的浓度也如此变动。此外，N₆培养基中的成分也可使用功能和性质相同或相似的成分加以替换。

诱导培养后，将所得胚状体转移至分化培养基上。分化培养基以2/3MS为基本培养基，其中加有NaCl 200-500mg/L、6-BA 0.3-1.2mg/L、KT 0.5-2.0mg/L、NAA 0.01-0.1mg/L和麦芽糖10-50g/L，PH为5.5-6.2。

分化培养基中所添加的NaCl优选为200-400mg/L，更优选300-400mg/L。

6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)的优选浓度为0.4-0.8mg/L，更优选为0.5-0.6mg/L。

KT(6-糠氨基嘌呤)的优选浓度为1.0-1.8mg/L，更优选为1.2-1.5mg/L。

NAA(萘乙酸)的优选浓度0.02-0.08mg/L，更优选为0.03-0.06mg/L。在一具体实施方式中，NAA的浓度为0.05mg/L。

麦芽糖的浓度为20-40g/L，更优选为20-30g/L。

分化培养基的pH优选为5.7-5.8。

MS培养基的配方如下表2所示(单位：mg/L)：

表2

MS大量元素：

NH₄NO₄ 1650

KNO₃ 1900

CaCl₂·2H₂O 440

MgSO₄·7H₂O 370

KH₂PO₄ 170

MS微量元素：

H₃BO₃ 6.2

KI 0.83

MnSO₄·4H₂O 22.3

ZnSO₄·7H₂O 8.6

Na₂MoO₄·2H₂O 0.25

CuSO₄·5H₂O 0.025

CoCl₂·6H₂O 0.025

MS铁盐：

Na₂EDTA 37.3

FeSO₄·7H₂O 27.8

MS有机元素：

盐酸硫胺素 0.1

盐酸吡多辛 0.5

烟酸 0.5

甘氨酸 2.0

肌醇 100.0

MS可自行按上述配方配制，也可向Sigma等化学试剂公司购买成品。2/3MS培养基则是将MS培养基的大量元素减少1/3，而微量元素、铁盐和有机元素不变。然后根据本文所述配方配制本文的2/3MS诱导培养基。本领域技术人员将理解，可对上述表1所示的浓度作出适当的变动，例如有大约5％(例如3％左右、2％左右、1％左右，或更低的变动范围)或更低的变动，由此配制得到的培养基仍然具有所需的生物学功能，仍能用于实施本发明。例如，以肌醇为例，每升MS培养基中可含有大约95-105mg的肌醇(5％的变动幅度)。其它成分的浓度也如此变动。此外，2/3MS诱导培养基中的成分也可使用功能和性质相同或相似的成分加以替换。

在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下分化胁迫培养25～30天，直至分化出绿色再生植株。

分化出的再生植株可转入添加有NAA 0.02-0.08mg/L、多效唑(MET)2.0-10.0mg/L和蔗糖10-40g/L，pH5.6-6.0的1/2MS生根壮苗培养基。在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下进行25～30天的生根壮苗培养。

生根壮苗培养基中，NAA的优选浓度范围为0.03-0.06mg/L，更优选为0.04-0.05mg/L。

MET的优选浓度范围为3.0-8.0mg/L，更优选为4.0-6.0mg/L。在一具体实施例中，MET的浓度为5.0mg/L。

蔗糖的优选浓度范围为20-30g/L。在一具体实施例中，蔗糖的浓度为20g/L。

生根壮苗培养基的pH优选为5.8-5.9。

1/2MS生根壮苗培养基是将表2所示的MS培养基的大量元素减半，并加入本申请所述的添加成分后而配制得到。

上述成分可从市场上购得。例如，赤霉菌粗毒素DON购买于Sigma公司。

本申请也包括用于本申请筛选麦类作物耐赤霉病菌毒素的方法的上述各种提取液和培养基。

本申请另一方面提供甘露醇提取液，其可含有3.9×10^-5～1.95×10^-4mol/L的赤霉病菌毒素。该甘露醇提取液的浓度可以为约0.2-0.6M，优选为约0.3-0.5M。

甘露醇提取液优选含有0.8-1.6×10^-4mol/L，更优选1.0-1.5×10^-4mol/L，更优选1.4-1.5×10^-4mol/L的赤霉病菌毒素。

在一具体实施例中，所使用的甘露醇提取液为含1.5×10^-4mol/L的赤霉病菌毒素0.3M甘露醇提取液。

本申请也包括一种诱导培养基，用于实施本申请所述的筛选方法。该诱导培养基为N₆诱导培养基，以表1所示的N₆培养基的成分为基础，添加了赤霉病菌毒素0.50-1.0×10^-4mol/L、2，4，5-T 0.3-0.8mg/L、KT 0.3-0.8mg/L，麦芽糖60-120g/L，pH 5.5-6.2。

在诱导培养基中，赤霉病菌毒素的浓度为0.65-0.85×10^-4mol/L，更优选为0.75-0.80×10^-4mol/L。

2，4，5-T的优选浓度为0.4-0.7mg/L，更优选为0.4-0.5mg/L。

KT的优选浓度为0.4-0.65mg/L，更优选为0.4-0.5mg/L。

麦芽糖的浓度优选为80-100g/L，更优选为80-90g/L。

诱导培养基的pH优选为5.6-5.9，更优选为5.7-5.8。

在一具体实施例中，N₆诱导培养基添加赤霉病菌毒素0.75×10^-4mol/L、2，4，5-T 0.5mg/L、KT 0.5mg/L，麦芽糖90g/L，pH 5.8。

本申请也包括一种分化培养基，用于实施本申请的筛选方法。该分化培养基以2/3MS培养基为基础，添加有NaCl 200-500mg/L、6-BA 0.3-1.2mg/L、KT 0.5-2.0mg/L、NAA 0.01-0.1mg/L和麦芽糖10-50g/L，PH为5.5-6.2。

6-BA的优选浓度为0.4-0.8mg/L，更优选为0.5-0.6mg/L。

KT的优选浓度为1.0-1.8mg/L，更优选为1.2-1.5mg/L。

NAA的优选浓度0.02-0.08mg/L，更优选为0.03-0.06mg/L。在一具体实施方式中，NAA的浓度为0.05mg/L。

麦芽糖的浓度为20-40g/L，更优选为20-30g/L。

分化培养基的pH优选为5.7-5.8。

2/3MS培养基是指将表2所示的MS培养基的大量元素减少1/3，而微量元素、铁盐和有机元素不变。

本申请还包括一种生根壮苗培养基，用于实施本申请的筛选方法。该生根壮苗培养基是添加有NAA 0.02-0.08mg/L、多效唑(MET)2.0-10.0mg/L和蔗糖10-40g/L，pH5.6-6.0的1/2MS生根壮苗培养基。

生根壮苗培养基的pH优选为5.7-5.9，更优选约为5.8。

1/2MS培养基是将表2所示的MS培养基的大量元素减半所得的培养基。

在一具体实施例中，生根壮苗培养基是添加有NAA 0.05mg/L、多效唑(MET)5.0mg/L和蔗糖20g/L，pH5.8。

本申请还包括含有上述甘露醇提取液、诱导培养基、分化培养基和生根壮苗培养基的套盒。各提取液和培养基可分装在不同的容器中。任选地，该套盒还可包括指导使用其中所包含的试剂实施获得抗赤霉病性状稳定的材料的方法的说明书。

本申请中，所述麦类作物包括大麦和小麦。因此，本申请也包括采用本申请方法筛选得到的麦类作物的植株、幼苗、种子等。

与传统育种方法相比，本发明方法简便，易于掌握、实施；抗赤霉病株系的获得和抗赤霉病性状的筛选都在实验室完全一致的条件下进行，不受外界条件的影响；利用小孢子作为起始材料，可获得大量的胚状体，在小孢子培养过程中进行抗赤霉病性状离体筛选，可严格筛选，大胆淘汰；整个过程都在培养室中进行，同时又降低了劳动力和农田的使用，且可周年重复试验，不断提供筛选材料，既缩短了育种时间，又能获得大量的种质材料。

申请人的实验表明，利用本发明可在不到半年的时间内完成麦类作物株系筛选，获得抗赤霉病性状稳定的材料，种植后获得种子可用于进一步的田间检测。本发明可大大缩短育种时间。

下文将以大麦为例对本发明进行描述。应理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下可对本发明做出各种修改和变动。且也可采用本发明的方法用于其它禾谷类作物，并能产生相同的效果。以下实施例仅仅是阐述性的，本发明的范围由本申请的权利要求加以限定。如无特别说明，本发明所用的百分比为重量体积百分比。此外，应理解，上述各培养基中各成分的优选范围可任意组合，只要其能实现本发明的发明目的即可。

实施例1：大麦花药的耐赤霉病毒素处理及小孢子提取

从大田选取中部小花小孢子发育处于单核早期、中期的穗子，放入冰箱冷藏15天。接种时，穗子用饱和的漂白粉溶液消毒15min，无菌水冲洗3-4次。每个培养皿中置40枚花药，用含1.5×10^-4mol/L赤霉病菌毒素的0.3M的甘露醇提取液黑暗预处理3d后，倒入15ml 0.3M的甘露醇提取液，用3000rpm的高速分散器超速旋切，150目筛网过滤，滤液以800rpm低速离心，重复3次，收集小孢子。

实施例2：耐赤霉病毒素胚状体的获取

诱导培养基以N₆培养基为基本培养基，其中加有赤霉菌粗毒素0.75×10^-4mol/L、2，4，5-T 0.5mg/L、KT 0.5mg/L，麦芽糖90g/L，pH 5.8。培养前将小孢子用培养基洗涤1次，然后用培养基将小孢子密度调节至1.0～1.2×10⁵/ml，取1.5ml小孢子悬浮液接种于培养皿(30×15mm)，Parafilm封口，25℃暗培养21d。

实施例3：耐赤霉病毒素再生植株的获取

诱导培养21d后将胚状体转移至分化培养基上。分化培养基以2/3MS为基本培养基，其中加有NaCl 300mg/L、6-BA 0.5mg/L、KT 1.5mg/L、NAA 0.05mg/L和麦芽糖30g/L，PH为5.8。在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下分化胁迫培养25～30天，直至分化出绿色再生植株。

实施例4：耐赤霉病毒素再生植株的生根培养

选取分化出的再生植株，转入添加有NAA 0.05mg/L、多效唑(MET)5.0mg/L和蔗糖20g/L，pH5.8的1/2MS生根壮苗培养基。在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下进行25～30天的生根壮苗培养。

实施例5：再生植株种子的耐赤霉病毒素的测定

以大麦新品系B06-5为材料，经实施例1-4后，收获再生植株的种子，繁殖一代后取其种子置于添加浓度为1.5×10^-4mol/L赤霉菌粗毒素DON(纯品，购于sigma公司)的培养基上(6％琼脂)进行萌发，以原始材料的种子为对照品种，每瓶10粒，重复3次。

以不添加DON培养基上种子的胚芽/胚根长度为对照，计算其胚芽/胚根影响率(胚芽/胚根生长影响率＝(处理胚芽/胚根平均长度-对照胚芽/胚根平均长度)/对照胚芽/胚根平均长度×100％)。

统计结果表明：经本方法筛选获得的再生植株，它们的胚芽/胚根生长影响率明显小于对照材料，表明本方法获得的再生植株的耐赤霉病毒素能力可以经种子繁殖传递给后代。结果见表3。

表3

实施例6

以大麦品系B06-6为材料，利用本发明方法，进行了三次重复试验，从每次重复试验中均获得一批经赤霉病菌毒素胁迫后形成的胚状体和经NaCl胁迫后形成的再生植株。再生植株的种子经繁殖一代后的种子置于添加赤霉病菌纯毒素的培养基上进行萌发，所有供测试种子的胚芽和胚根影响率都不同程度地小于原始材料的种子，结果见表4。

影响率％如实施例5所述计算。

表4

应理解，上述实施例仅仅是阐述性的，本发明的范围由本申请的权利要求加以限定。

Claims

1.一种筛选大麦耐赤霉病菌粗毒素的方法，该方法包括：

1）取大麦幼穗花药置于添加3.9×10^-5～1.95×10^-4m_ol/L赤霉病菌毒素的0.2-0.5M甘露醇提取液中培养1-3天；

2）由步骤1）处理后的花药分离获得小孢子；

3）将步骤2）获得的小孢子置于添加赤霉病菌毒素0.50×10^-4-1.0×10^-4mol/L、2,4,5-T 0.3-0.8mg/L、KT 0.3-0.8mg/L、麦芽糖60-120g/L和肌醇95-105mg/L，pH 5.5-6.2的N₆诱导培养基中，获得胚状体；

4）将步骤3）获得的胚状体置于添加NaCl 200-500mg/L、6-BA 0.3-1.2mg/L、KT 0.5-2.0mg/L、NAA 0.01-0.1mg/L和麦芽糖10-50g/L，PH为5.5-6.2的2/3MS分化培养基中，获得再生植株，该再生植株为耐赤霉病菌粗毒素的大麦。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤1）前，先在0-8℃下处理所述大麦幼穗花药15-30天。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

5）将步骤4）所得的再生植株转入添加有NAA 0.02-0.08mg/L、多效唑2.0-10.0mg/L和蔗糖10-40g/L，pH5.6-6.0的1/2MS生根壮苗培养基中，在25±1℃，每天10~12小时光照的条件下进行25~30天的生根壮苗培养。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中所述甘露醇提取液为含有0.8×10^-4-1.6×10^-4mol/L赤霉病菌毒素的0.3-0.4M甘露醇溶液。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）中所述NaCl含量为300-500mg/L。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在3-5℃下处理所述大麦幼穗花药20天。

7.一种用于实施权利要求1－6中任一项所述的方法的套盒，其特征在于，该套盒含有权利要求1、3、4和5中任一项所述的甘露醇提取液、N₆诱导培养基和/或2/3MS分化培养基。

8.如权利要求7所述的套盒，其特征在于，所述甘露醇提取液为添加3.9×10^-5～1.95×10^-4mol/L赤霉病菌毒素的0.2-0.5M甘露醇提取液。

9.如权利要求7所述的套盒，其特征在于，所述套盒含有甘露醇提取液、N₆诱导培养基和2/3MS分化培养基，

所述甘露醇提取液为添加3.9×10^-5~1.95×10^-4mol/L赤霉病菌毒素的0.2-0.5M甘露醇提取液；

所述N₆培养基添加有赤霉病菌毒素0.50×10^-4-1.0×10^-4mol/L、2,4,5-T0.3-0.8mg/L、KT 0.3-0.8mg/L、麦芽糖60-120g/L和肌醇95-105mg/L，pH 5.5-6.2；

所述2/3MS分化培养基添加有NaCl 200-500mg/L、6-BA 0.3-1.2mg/L、KT0.5-2.0mg/L、NAA 0.01-0.1mg/L和麦芽糖10-50g/L，pH为5.5-6.2。