BR102018009014A2

BR102018009014A2 - Planta transgênica e método para a sua produção

Info

Publication number: BR102018009014A2
Application number: BR102018009014-3A
Authority: BR
Inventors: Guifang JIA; Chuan He
Original assignee: Epiplanta Biotech Ltd.
Priority date: 2017-05-24
Filing date: 2018-05-03
Publication date: 2019-03-19
Also published as: CA3003867C; RU2018115773A3; US20220017912A1; RU2018115773A; US20180340182A1; AU2018202996A1; US11046969B2; CN108949806A; EP3406726A1; US11891610B2; RU2758722C2; US11512322B2; ES2877273T3; US20230323379A1; CA3003867A1; AR111673A1; AU2018202996B2; EP3406726B1; PH12018000119A1

Abstract

planta transgênica e método para a sua produção. a presente invenção refere-se a uma planta transgênica e a um método para a sua produção. em particular, a presente invenção é direcionada a uma planta transgênica ou a uma célula vegetal na qual uma molécula de ácido nucleico que codifica uma desmetilase de m6a é introduzida, em que dita desmetilase de m6a possui os seguintes dois domínios: i) domínio n-terminal (ntd) tendo a função da desmetilase de oxidação de alkb; e ii) domio c-terminal (ctd). a presente invenção também é direcionada a um método para a produção de dita planta, compreendendo a introdução de uma molécula de ácido nucleico que codifica uma desmetilase de m6a em uma célula vegetal regenerável, e regeneração de uma planta transgênica a partir da célula vegetal regenerável.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PLANTA TRANSGÊNICA E MÉTODO PARA A SUA PRODUÇÃO.

Campo Técnico [0001] A presente invenção é direcionada a uma planta transgênica e a um método para a sua produção. Em particular, a presente invenção é direcionada à introdução de uma molécula de ácido nucleico em uma planta para aumentar a biomassa e/ou o rendimento da planta.

Antecedentes [0002] Devido ao aumento da população no mundo, a área da terra disponível para a agricultura está diminuindo. Aumentar a eficiência da agricultura e aumentar a diversidade das plantas de horticultura continua sendo o principal objeto de pesquisas. Os métodos convencionais para melhorar as culturas e as plantas de horticultura utilizam tecnologias de reprodução seletiva para identificar plantas com propriedades desejadas. Este tipo de tecnologias de reprodução seletiva, no entanto, possui vários defeitos: estas tecnologias são geralmente intensivas em mão-de-obra e resultam em plantas que geralmente compreendem complementos genéticos heterogêneos que nem sempre transferem características desejadas das plantas patenteadas.

[0003] O desenvolvimento da biologia molecular permite que as pessoas manipulem animais e plantas. A engenharia genética das plantas requer o isolamento e manipulação de materiais genéticos (geralmente na forma de DNA ou RNA) e a introdução de materiais genéticos nas plantas. Essa tecnologia resultou em plantas tendo uma variedade de características econômicas, agrícolas ou de horticultura melhoradas. Uma característica com significado econômico especial é uma característica de crescimento, por exemplo, alto rendimento.

[0004] O rendimento das sementes é uma característica muito importante, pois as sementes de muitas plantas são muito importantes

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2/48 para a nutrição do ser humano e dos animais. Não obstante do consumo das sementes per se ou dos produtos de refeição à base de sementes processadas, as culturas como milho, arroz, trigo e soja, são responsáveis por mais da metade das calorias totais ingeridas pelos seres humanos. Elas também são origens de açúcares, óleos e muitos tipos de metabólitos utilizados para processamento industrial. Com base na necessidade constante de encontrar genes para aumentar o rendimento de sementes, a técnica anterior divulgou métodos através da manipulação de níveis hormonais das plantas (WO 03/050287), através da manipulação de ciclos celulares (WO 2005/061702) e manipulação de genes envolvidos em reações de estresse salino (WO 2004/058980). Além do rendimento das sementes, o tamanho de mil sementes, o peso de uma única planta, o número de brotos e/ou a altura da planta também são características importantes para medir o rendimento das plantas. Além do mais, deve-se esclarecer que a taxa de crescimento de uma planta não está necessariamente relacionada com o seu rendimento. Por exemplo, quando o fertilizante é suficiente, o arroz tende a crescer muito rápido e alto durante a fase inicial e apresenta acomodação durante a última fase. Isso leva à diminuição do rendimento.

[0005] As tecnologias transgênicas introduzem genes artificialmente isolados e modificados no genoma de um organismo e levam a modificações hereditárias de características do organismo devido à expressão dos genes introduzidos. Pesquisas de tecnologias transgênicas de plantas concentram-se principal mente nos campos de engenharia genética anti-insetos, engenharia genética anti-doenças, engenharia genética de resistência ao estresse, engenharia genética de qualidade, etc. As plantas transgênicas que foram comercializadas são principal mente variedades anti-inseto e anti-herbicida. O plantio dessas variedades diminui o uso de pesticidas químicos em 37%, aumenPetição 870180036364, de 03/05/2018, pág. 81/137

3/48 ta o rendimento das culturas em 22% e aumenta o lucro dos agricultores em 68%. As atuais tecnologias transgênicas, no entanto, aumentam o rendimento indiretamente através das propriedades anti-inseto e anti-herbicida, etc.

[0006] As pesquisas anteriores sobre epigenética geralmente se concentram nas modificações reversíveis do DNA e histona. Recentemente, os pesquisadores gradualmente movem seu interesse para o campo da modificação do RNA. Até agora, os cientistas descobriram centenas de modificações no RNA. A N⁶-metiladenoesina (m⁶A) é a modificação de RNA mais abundante no mRNA através de todos os eucariontes. A modificação de m⁶A foi descoberta há mais de quarenta anos, mas sua função não era conhecida até que o inventor do presente pedido encontrou a desmetilase de m⁶A, proteína FTO, pela primeira vez (Jia et al, A^-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nat Chem Biol, 2011, 7 (12): 885-887), relatou a reversibilidade da modificação do RNA pela primeira vez e iniciou a pesquisa de epigenética do RNA (ou epitranscriptoma) em 2011 Em 2012, os pesquisadores desenvolveram a tecnologia de sequenciamento de alto rendimento de transcriptoma total m⁶A assistida por anticorpo de m⁶A, m⁶A-seq (ou MeRIP). O resultado do sequenciamento mostra que existem cerca de 12.000 sítios de m⁶A em células humanas e de camundongos, principal mente distribuídos em 7.000 mRNAs transcritos de genes codificadores e 300 RNAs não codificadores (ncRNAs) transcritos de genes não codificadoers (Dominissini et al, Topology of the human and mouse m⁶A RNA methylomes revealed by m⁶A-seq. Nature, 2012, 485 (7397): 201-206; Meyer et al, Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell, 2012, 149 (7): 1635-1646). Até agora, observou-se no mamífero que os principais componentes da metiltransferase são METTL3, METTL14 e WTAP (liu et al, A METTL3Petição 870180036364, de 03/05/2018, pág. 82/137

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METTL14 complex mediates mammalian nuclear RNA A^-adenosine methylation. Nat Chem Biol, 2014, 10 (2): 93-95; Ping et al, Mammalian WTAP is a regulatory subunit of the RNA N6methyladenosine methyltransferase. Cell Res, 2014, 24 (2): 177-189). Existem dois tipos de desmetilases de m⁶A, que são FTO (massa gorda e obesidade associadas) e ALKBH5 (Jia et al, A^-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nat Chem Biol, 2011, 7 (12): 885-887 ; Zheng et al, ALKBH5 is a mammalian RNA demethylase that impacts RNA metabolism and mouse fertility. Mol Cell, 2013, 49 (1): 18-29). A m⁶A regula o processamento metabólico de mRNAs, incluindo recomposição, exportação nuclear, estabilidade e translação de proteína por meio de proteínas de ligação de m⁶A.

[0007] No campo das plantas, os pesquisadores descobriram que os mRNAs de todas as plantas compreendem m⁶A extensivamente. Ela é produzida por enzimas modificadoras de m⁶A (subunidades de enzimas modificadoras atualmente relatadas são classificadas como MTA (gene homólogo de METTL3) e FIP37 (gene homólogo de WTAP)), e possui importante efeito regulador no crescimento e desenvolvimento das plantas. Os pesquisadores descobriram que quando MTA ou FIP37 foram neutralizados da Arabidopsis thaliana, a semente não germinou normalmente. Quando MTA ou FIP37 foi parcialmente complementado durante o estágio de germinação, após a germinação, a perda de m⁶A de Arabidopsis thaliana inibiu severamente o crescimento e o desenvolvimento normais da planta (Zhong, S., Li, H., Bodi, Z., Button, J., Vespa, L., Herzog, M., and Fray, R.G. (2008). MTA is an Arabidopsis messenger RNA adenosine methylase and interacts with a homolog of a sex-specific splicing factor. Plant Cell 20, 12781288 ; Shen, L., Liang, Z., Gu, X., Chen, Y., Teo, Z.W., Hou, X., Cai,

W.M., Dedon, P.C., Liu, L., and Yu, H. (2016). A^-Methyladenosine

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RNA Modification Regulates Shoot Stem Cell Fate in Arabidopsis. Dev Cell 38, 186-200).

[0008] O inventor do presente pedido descobriu anteriormente que durante o processo de desmetilação da m⁶A no RNA, a FTO produziu duas novas modificações relativamente estáveis, hm⁶A (N⁶hidroximetiladenosina) e f®A (N⁶-formiladenosina), que tinham potencial efeito regulador sobre o processamento do RNA (Fu et al, FTOmediated formation of A^-hydroxymethyladenosine and Λ/⁶formyladenosine in mammalian RNA. Nat Commun, 2013, 4 :1798). Novos dados experimentais do inventor mostraram que a FTO podería remover as modificações de metilação do tRNA (os dados não foram publicados).

[0009] Tem sido tarefa das pesquisas de todos os cientistas da agricultura de como aumentar o rendimento das lavouras em área limitada da terra para alimentar a população crescente e como aumentar direta e efetivamente a biomassa e a produtividade das plantas. Para as culturas (tais como arroz, trigo, milho), as tecnologias tradicionais de transgênicos e as tecnologias de reprodução por hibridização podem otimizar um certo gene isolado e aumentar o rendimento em 10% a 30%. Para alcançar um rendimento extremamente elevado, precisase de efeitos sinérgicos de muitos genes. A regulação do nível metabólico de mRNA através da modificação de metilação de RNA, fornece a possibilidade de um método para a regulação de um único gene para obter um rendimento elevado ou aumentar a biomassa.

Sumário da Invenção [0010] O inventor surpreendentemente observou que através da introdução de desmetilase FTO de m⁶A em plantas, o nível metabólico de mRNA pode ser regulado e fornece a possibilidade de um método para regular um único gene para alcançar um rendimento elevado e/ou aumentar a biomassa. Para aumentar eficientemente o rendimento

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6/48 e/ou a biomassa das plantas, o inventor introduziu uma desmetilase de m⁶A heterogênea através das tecnologias transgênicas, e regulou dinamicamente o teor de m⁶A em mRNAs de plantas de modo a regular a recomposição, exportação nuclear, estabilidade e translação de proteína de mRNAs. Em comparação com o método de reprodução por hibridação tradicional que aumenta o rendimento em 20 a 30%, com o método da presente invenção, o rendimento das plantas aumentou 4 vezes e a biomassa aumentou 4 vezes pela regulação de um único gene. Realmente se alcançou o alto rendimento e a biomassa elevada das plantas através da regulação de um único gene.

[0011] Em particular, a presente invenção é direcionada aos aspectos que se seguem:

[0012] em um aspecto, a presente invenção é direcionada a uma planta transgênica ou célula vegetal na qual uma molécula de ácido nucléico que codifica uma demetilase de m⁶A é introduzida, em que a dita desmetilase de m⁶A possui os seguintes dois domínios:

i) domínio N-terminal (NTD) tendo a função da desmetilase de oxidação de AlkB; e ii) domínio C-terminal (CTD).

[0013] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para a produção de uma planta transgênica que apresenta uma biomassa aumentada, um rendimento aumentado (por exemplo, maior rendimento de sementes/grãos, maior rendimento de tubérculos, maior rendimento de folhas, maior rendimento de caule, maior rendimento de raízes, maior rendimento de algodão) ou a sua combinação, em que dito método compreende:

a) a introdução de uma molécula de ácido nucleico que codifica uma desmetilase de m⁶A em uma célula vegetal regenerável, em que dita desmetilase de m⁶A possui os seguintes dois domínios:

i) domínio N-terminal (NTD) tendo a função da desmetilase de

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7/48 oxidação de AlkB; e ii) domínio C-terminal (CTD); e

b) a regeneração de uma planta transgênica a partir da célula vegetal regenerável, em que a planta transgênica compreende no seu genoma dita molécula de ácido nucleico que codifica a desmetilase de m⁶A, e apresenta uma biomassa aumentada, um rendimento aumentado ou a combinação quando comparada com uma planta de controle que não compreende a molécula de ácido nucleico que codifica a desmetilase de m⁶A.

[0014] Em uma modalidade, dito método compreende ainda:

c) obter uma planta progênie derivada da planta transgênica da etapa b), em que dita planta progênie compreende no seu genoma dita molécula de ácido nucleico que codifica a desmetilase de m⁶A e apresenta uma biomassa aumentada, um rendimento aumentado ou a combinação quando comparado com uma planta de controle que não compreende a molécula de ácido nucleico que codifica a desmetilase de m⁶A.

[0015] Em uma modalidade, a desmetilase de m⁶A antes mencionada é uma proteína FTO. Dita proteína FTO é de vertebrados ou algas marinhas.

[0016] Em uma modalidade, dita proteína FTO possui pelo menos 40%, preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 99 %, o mais preferível 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 4.

[0017] Em uma modalidade, dita molécula de ácido nucleico que codifica a desmetilase de m⁶A possui pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 99%, o mais

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8/48 preferível 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 12.

[0018] A planta transgênica da presente invenção apresenta uma biomassa aumentada, um rendimento aumentado ou a combinação quando comparada com uma planta de controle que não compreende a molécula de ácido nucleico que codifica a desmetilase de m⁶A.

[0019] Em uma modalidade, a planta da presente invenção é selecionada do grupo que consiste de arroz, milho (Zea mays), soja, tabaco, batata, alfafa (Medicago sativa), colza (Brassica), dente de leão russo (Taraxacum Kok-saghyz), algodão, trigo, painço (Panicum miliaceum), linho, girassol e linho falso (Camelina sativa).

[0020] A presente invenção também é direcionada a um tecido, um órgão, um pólen, uma semente, um grão, uma fruta e uma planta progênie da planta transgênica supracitada.

Descrição dos Desenhos e das Sequências [0021] A Figura 1 mostra o mapa do plasmídeo pCAMBIA1307 no qual um ácido nucleico que codifica FTO é introduzido.

[0022] SEQ ID NO: 1 é a sequência da proteína FTO humana (Homo sapiens).

[0023] SEQ ID NO: 2 é a sequência da proteína FTO de porco (Sus scrofa).

[0024] SEQ ID NO: 3 é a sequência da proteína FTO de vaca (Bos taurus).

[0025] SEQ ID NO: 4 é a sequência da proteína FTO de Ostreococcus lucimarinus, de um tipo de alga marinha, Ostreococcus lucimarinusn.

[0026] SEQ ID NOs: 5 e 6 são sequências de ácido nucleico que codificam a proteína FTO humana. A SEQ ID NO: 5 é a sequência natural isolada de ser humano e a SEQ ID NO: 6 é a sequência que foi otimizada por códon para a expressão em plantas.

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9/48 [0027] SEQ ID NOs: 7 e 8 são sequências de ácido nucleico que codificam a proteína FTO de porco. A SEQ ID NO: 7 é a sequência natural isolada do porco e a SEQ ID NO: 8 é a sequência que foi otimizada por códon para a expressão em plantas.

[0028] SEQ ID NOs: 9 e 10 são sequências de ácido nucleico que codificam a proteína FTO de vaca. A SEQ ID NO: 9 é a sequência natural isolada de vaca e a SEQ ID NO: 10 é a sequência que foi otimizada por códon para a expressão em plantas.

[0029] SEQ ID NOs: 11 e 12 são sequências de ácido nucleico que codificam a proteína FTO de Ostreococcus lucimarinus. A SEQ ID NO: 11 é a sequência natural isolada de Ostreococcus lucimarinus e a SEQ ID NO: 12 é a sequência que foi otimizada por códon para a expressão em plantas.

Descrição Detalhada da Invenção [0030] A desmetilase de m⁶A ou os seus homólogos e os ácidos nucleicos que codificam a dita desmetilase ou os homólogos podem ser utilizados para produzir a planta transgênica da presente invenção. A desmetilase de m⁶A utilizada pela presente invenção pode estar presente em quaisquer vertebrados e algas marinhas. Dita enzima consiste da sequência de localização nuclear (NLS) e dos seguintes dois domínios: i) domínio N-terminal (NTD) tendo a função de desmetilase de oxidação de AlkB; e ii) domínio C-terminal (CTD).

[0031] Como aqui utilizado, homólogo significa uma proteína em um grupo de proteínas que desempenham a mesma função biológica. Homólogos são expressos por genes homólogos. Genes homólogos incluem alelos de ocorrência natural e variantes criadas artificialmente. A degeneração do código genético fornece a possibilidade de substituir pelo menos uma base da sequência de codificação da proteína de um gene com uma base diferente sem fazer com que a sequência de aminoácido do polipeptídeo produzido a partir do gene seja alterada.

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Homólogos são proteínas que, quando idealmente alinhadas, possuem pelo menos 40% de identidade, mais preferivelmente cerca de 50% ou mais, mais preferivelmente cerca de 60% ou mais, mais preferivelmente cerca de 70% ou mais, mais preferivelmente pelo menos 80% e ainda mais preferivelmente pelo menos 90% de identidade ao longo de todo o comprimento de uma proteína identificada como de aumento do rendimento e/ou da biomassa das plantas quando expressa em células vegetais.

[0032] Os homólogos são identificados através da comparação da sequência de aminoácido, por exemplo, manualmente ou através do uso de uma ferramenta baseada em computador utilizando algoritmos de busca conhecidos com base na homologia tais como aqueles comumente conhecidos e referidos como BLAST, FASTA e SmithWaterman. Um programa de alinhamento de sequência local, por exemplo, BLAST, pode ser utilizado para pesquisar um banco de dados de sequências para encontrar sequências similares, e o valor de Expectativa resumido (valor E) utilizado para medir a similaridade da base da sequência. Como uma proteína atingida com o melhor valor E para um organismo particular pode não ser necessariamente um ortólogo ou o único ortólogo, uma consulta recíproca é utilizada na presente invenção para filtrar as sequências atingidas com valores E significativos para identificação ortológica. A consulta recíproca implica a busca dos acertos significativos contra um banco de dados de sequências de aminoácido do organismo de base que são semelhantes à sequência da proteína de consulta. Um acerto é um ortólogo provável, quando o acerto da melhor consulta recíproca é a própria proteína de consulta ou uma proteína codificada por um gene duplicado após a especiação. Um outro aspecto da invenção compreende proteínas homólogas funcionais que diferem em um ou mais aminoácidos daquelas da proteína divulgada como o resultado de substituições de

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11/48 aminoácido conservativas, por exemplo, as substituições são entre: aminoácidos acídicos (negativamente carregados) tais como ácido aspártico e ácido glutâmico; aminoácidos básicos (positivamente carregados) tais como arginina, histidina e lisina; aminoácidos polares neutros tais como glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; aminoácidos neutros não polares (hidrofóbicos) tais como alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; aminoácidos tendo cadeias laterais alifáticas tais como glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; aminoácidos tendo cadeias laterais de hidroxila alifática tais como serina e treonina; aminoácidos tendo cadeias laterais contendo amida tais como asparagina e glutamina; aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas tais como fenilalanina, tirosina e triptofano; aminoácidos tendo cadeias laterais básicas tais como lisina, arginina e histidina; aminoácidos tendo cadeias laterais contendo enxofre tais como cisteína e metionina; aminoácidos naturalmente conservadores tais como valina-leucina, valina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, ácido aspárticoácido glutâmico e asparagina-glutamina. Um outro aspecto dos homólogos codificados por DNA úteis nas plantas transgênicas da invenção são aquelas proteínas que diferem de uma proteína divulgada como o resultado da eliminação ou inserção de um ou mais aminoácidos em uma sequência nativa.

[0033] Como aqui utilizado, “identidade percentual” significa a extensão em que dois segmentos de DNA ou proteína idealmente alinhados são invariantes ao longo de uma janela de alinhamento de componentes, por exemplo, sequência de nucleotídeo ou sequência de aminoácido. Uma “fração de identidade” para segmentos alinhados de uma sequência de teste e uma sequência de referência é o número de componentes idênticos que são compartilhados por sequências dos dois segmentos alinhados divididos pelo número total de componentes

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12/48 de sequência no segmento de referência sobre uma janela de alinhamento que é o menor da sequência de teste completa ou da sequência de referência completa. “Identidade percentual” (“% de identidade”) é a fração de identidade vezes 100.

[0034] A desmetilase de m⁶A utilizada na presente invenção pode ser a SEQ ID NO: 1, 2, 3 ou 4 do seu homólogo. Dito homólogo possui pelo menos 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%,

50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%,

62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%,

74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%,

86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,

98% ou 99% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 4.

[0035] O ácido nucleico que codifica a desmetilase de m⁶A utilizada na presente invenção pode ser qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 12 ou o seu gene homólogo. Dito gene homólogo possui pelo menos 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%,

52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%,

64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%,

76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87 %,

88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 12.

[0036] O ácido nucleico que codifica a desmetilase de m⁶A aqui definida pode não ser um ácido nucleico de comprimento total. Uma parte do ácido nucleico que codifica a desmetilase de m⁶A aqui definida pode ser preparada mediante a execução de uma ou mais eliminações a partir do ácido nucleico completo.

[0037] Outra variante de ácido nucleico utilizada na presente invenção é um ácido nucleico que híbrida com o ácido nucleico que codiPetição 870180036364, de 03/05/2018, pág. 91/137

13/48 fica a desmetilase de m⁶A aqui definida ou com uma parte do ácido nucleico que codifica a desmetilase de m⁶A aqui definida sob condições rigorosas.

[0038] As condições rigorosas apropriadas que promovem a hibridação de DNA são, por exemplo, 6,0 x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) ao redor de 45Ό, seguido por uma lavagem de 2,0 x SSC a 50Ό, são conhecidas daqueles versados na técnica o u podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology (1989). Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada de um baixo rigor de cerca de 2,0 x SSC a 50°C para um elevado rigor de cerca de 0,2 x SSC a 50°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada a partir das condições de baixo rigor na temperatura ambiente, ao redor de 22Ό, at é as condições de alto rigor ao redor de 65Ό. Tanto a temperatura quanto o sal podem ser variados, ou a temperatura ou a concentração de sal podem ser mantidas constantes enquanto a outra variável é alterada. O ácido nucleico utilizado na presente invenção pode hibridar especificamente com um ácido nucleico que codifica uma proteína FTO, por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 12 ou uma parte desta sob ditas condições.

[0039] Todos ou uma parte dos ácidos nucleicos da presente invenção pode ser sintetizado utilizando códons preferidos por um hospedeiro selecionado. Os códons preferidos de espécies podem ser determinados, por exemplo, a partir dos códons mais frequentemente utilizados nas proteínas expressas em uma espécie hospedeira particular. Por conseguinte, os ácidos nucleicos da presente invenção incluem aqueles obtidos através da execução da otimização de códons para proteínas FTO naturais para a expressão em plantas. Outras modificações das sequências de nucleotídeo podem resultar em mutantes tendo atividade ligeiramente alterada.

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14/48 [0040] A presente invenção é direcionada a uma planta transgênica na qual um gene que codifica a demetilase FTO de m⁶A supracitada ou um seu homólogo é introduzido, ou uma planta progênie desta. A presente invenção é também direcionada a uma célula, um tecido, um órgão, um pólen, uma semente, um grão ou uma fruta de dita planta.

[0041] Introduzido no contexto de inserir um fragmento de ácido nucleico (por exemplo, uma construção de DNA recombinante) em uma célula, significa transfecção ou transformação ou transdução e inclui referência à incorporação de um fragmento de ácido nucleico em uma célula eucariótica ou procariótica onde o fragmento de ácido nucleico pode ser incorporado no genoma da célula (por exemplo, cromossoma, plasmídeo, plastídeo ou DNA mitocondrial), convertido em um replicon autônomo, ou transitoriamente expresso (por exemplo, mRNA transfectado).

[0042] Planta inclui referência às plantas inteiras, órgãos vegetais, tecidos vegetais, sementes e células vegetais e a sua progênie. Células vegetais incluem, sem limitação, células de sementes, culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido caloso, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos. Progênie compreende qualquer geração subsequente de uma planta. [0043] De acordo com o uso, as plantas da presente invenção podem ser culturas alimentares, culturas econômicas, culturas de hortaliças, frutos, flores, gramíneas, árvores, culturas de matérias-primas industriais, culturas de alimentos ou culturas de medicamentos. Especificamente, ditas culturas alimentares incluem arroz, milho, soja, feijão, inhame, por exemplo, mandioca (Manihot esculenta Crantz), batata, cevada sem casca, fava, trigo, cevada, painço, centeio, aveia, sorgo, etc.; ditas culturas econômicos incluem chá de óleo, colza, semente de colza, linho, linho falso (Camelina sativa), amendoim, linho oleaginoso (Linum usitatissimum), maconha (Cannabis sativa), girassol, tabaco,

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15/48 algodão, beterraba, cana-de-açúcar, etc.; ditas culturas de hortaliças incluem rabanete, couve chinesa, tomate, pepino, pimenta, cenoura, etc.; ditas frutas incluem pêra, maçã, nogueira, cereja, morango, jujuba ou pêssego; ditas flores incluem flores para paisagem, por exemplo, orquídea, crisântemo, cravo, rosa, plantas verdes, etc., ditas gramíneas e árvores incluem populus, hevea brasiliensis, taxus chinensis e aquelas para o reflorestamento urbano ou aquelas que vivem em desertos e condições adversas como a seca; ditas culturas de matériasprimas industriais incluem dente-de-leão russo, guayule, Jatropha curcas, etc., ditas culturas alimentares incluem os gêneros alimentícios para o gado, tais como alfafa, etc.; ditas culturas de fármacos incluem ginseng, angélica e ganoderma, etc.

[0044] Planta transgênica inclui referência a uma planta que compreende no seu genoma um polinucleotídeo heterólogo. Preferivelmente, o polinucleotídeo heterólogo é integrado de forma estável no genoma de tal modo que o polinucleotídeo é passado para gerações sucessivas. O polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado no genoma isoladamente ou como parte de uma construção de DNA recombinante.

[0045] Heterólogo em relação à sequência significa uma sequência que se origina de uma espécie estranha, ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificada a partir da sua forma nativa na composição e/ou lócus genômico através da intervenção humana deliberada. [0046] A presente invenção preparou uma construção de DNA que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína FTO aqui descrita. A construção pode compreender a molécula de ácido nucleico que codifica a proteína FTO aqui descrita opcionalmente de maneira operável ligada a uma sequência promotora que funciona em uma célula hospedeira. Outros componentes de construção podem incluir elementos reguladores adicionais, tais como líderes 5’ e

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16/48 íntrons para melhorar a transcrição, regiões não trasladadas 3’ (tais como sinais e sítios de poliadenilação), DNA para passagem, peptídeos sinal, ou um ou mais genes marcadores seletivos.

[0047] Como aqui utilizado, promotor significa DNA regulador para inicializar a transcrição. Um promotor vegetal é um promotor capaz de iniciar a transcrição em células vegetais quer a sua origem seja ou não uma célula vegetal, por exemplo, é bem conhecido que os promotores de Agrobacterium são funcionais nas células vegetais. Assim, os promotores vegetais incluem DNA promotor obtido a partir de plantas, vírus e bactérias de plantas tais como bactérias Agrobacterium e Bradyrhizobium. Exemplos de promotores sob controle do desenvolvimento incluem promotores que preferencialmente iniciam a transcrição em certos tecidos, tais como folhas, raízes ou sementes. Tais promotores são referidos como preferidos do tecido. Os promotores que iniciam a transcrição apenas em certos tecidos são referidos como específicos do tecido. Um promotor específico do tipo de célula conduz principal mente a expressão em certos tipos de células em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Um promotor induzível ou reprimível é um promotor que está sob controle ambiental. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas, ou certas substâncias químicas, ou a presença de luz. Os promotores específicos do tecido, preferidos do tecido, específicos do tipo de célula e induzíveis constituem a classe de promotores não constitutivos. Um promotor constitutivo é um promotor que está ativo na maioria das condições. Promotores úteis na presente invenção não são especificamente limitados. Aqueles versados na técnica podem selecionar promotores adequados de acordo com o seu conhecimento. [0048] Como aqui utilizado ligado de maneia operável significa a associação de dois ou mais fragmentos de DNA em uma construção

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17/48 de DNA de modo a que a função de um, por exemplo, DNA codificador da proteína, é controlada pelo outro, por exemplo, um promotor.

[0049] A construção do DNA geralmente contém um gene marcador seletivo. Os genes marcadores seletivos são utilizados para fornecer um sistema eficiente para identificação daquelas células que são estavelmente transformadas pela recepção e integração de uma construção de DNA transgênico nos seus genomas. Os genes marcadores preferidos fornecem marcadores seletivos que conferem resistência a um agente seletivo, tal como um antibiótico ou herbicida. Células potencialmente transformadas são expostas ao agente seletivo. Na população de células sobreviventes estarão aquelas células onde, geralmente, o gene que confere resistência é integrado e expresso em níveis suficientes para permitir a sobrevivência celular. As células podem ser testadas mais adiante para confirmar a integração estável do DNA exógeno. Os genes marcadores seletivos comumente utilizados incluem aqueles que conferem resistência a antibióticos tais como canamicina e paromomicina (nptll), higromicina B (aph IV) e gentamicina (aac3 e aacC4) ou resistência a herbicidas tais como glufosinato (bar ou pat) e glifosato (aroA ou EPSPS). Exemplos de tais marcadores seletivos são ilustrados nas Patentes U.S. 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e 6.118.047, todos os quais são aqui incorporados por referência. Marcadores seletivos que fornecem uma capacidade de identificar visualmente os transformantes também podem ser empregados, por exemplo, um gene que expressa uma proteína colorida ou fluorescente tal como uma luciferase ou proteína fluorescente verde (GFP) ou um gene que expressa uma beta-glucuronidase ou gene uidA (GUS) para o qual vários substratos cromogênicos são conhecidos.

[0050] A introdução da construção de DNA recombinante em plantas pode ser realizada por qualquer técnica adequada, incluindo, mas não limitada a estas, absorção direta de DNA, tratamento químico, elePetição 870180036364, de 03/05/2018, pág. 96/137

18/48 troporação, microinjeção, fusão celular, infecção, transferência de DNA mediada por vetor, bombardeamento ou transformação mediada por Agrobacterium. Para o sistema de transformação de plantas baseado em Agrobacterium tumefaciens, elementos adicionais presentes nas construções de transformação incluirão sequências do lado direito e esquerdo de T-DNA para facilitar a incorporação do polinucleotídeo recombinante no genoma da planta.

[0051] Em geral, é útil introduzir DNA recombinante aleatoriamente, isto é, em uma localização não específica, no genoma de uma linhagem vegetal alvo. Em casos especiais, pode ser útil direcionar a inserção de DNA recombinante para obter a integração específica do sítio, por exemplo, para substituir um gene existente no genoma, para utilizar um promotor existente no genoma da planta, ou para inserir um polinucleotídeo recombinante em um sítio predeterminado conhecido de ser ativo para a expressão gênica. Vários sistemas de recombinação específica do sítio existentes que são conhecidos de funcionar em plantas incluem cre-lox como divulgado na Patente U.S. 4.959;317 e FLP-FRT conforme divulgado na Patente U.S. 5.527.695, ambas aqui incorporadas por referência.

[0052] Os métodos de transformação desta invenção são preferivelmente praticados em cultura de tecido nos meios e em um ambiente controlado. Meio refere-se às numerosas misturas de nutrientes que são utilizadas para cultivar células in vitro, isto é, fora do organismo vivo intacto. Os alvos de células receptoras incluem, mas não são limitados a estes, células do meristema, calos, embriões imaturos e células gaméticas tais como microsporos, pólen, esperma e óvulos. É contemplado que qualquer célula a partir da qual uma planta fértil pode ser regenerada é útil como célula receptora. Os calos podem ser iniciados a partir de fontes de tecido incluindo, mas não limitado a estes, embriões imaturos, meristemas apicais de mudas, microsporos e ouPetição 870180036364, de 03/05/2018, pág. 97/137

19/48 tros mais. Células capazes de proliferar como calos também são células receptoras para transformação genética. Métodos de transformação prática e materiais para a produção de plantas transgênicas desta invenção, por exemplo, vários meios e células alvo receptoras, transformação de células embrionárias imaturas e subsequente regeneração das plantas transgênicas férteis, são divulgados nas Patentes U.S. 6.194.636 e 6.232.526, que são aqui incorporadas por referência.

[0053] O desenvolvimento ou regeneração de plantas contendo o fragmento de ácido nucleico isolado exógeno estranho que codifica uma proteína de interesse é bem conhecido na técnica. As plantas regeneradas são autopolinizadas para fornecer plantas transgênicas homozigotas. De outro modo, o pólen obtido das plantas regeneradas é cruzado com as plantas cultivadas de sementes de linhagens agronomicamente importantes. Por outro lado, o pólen de plantas dessas linhagens importantes é utilizado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgênica da presente invenção contendo a molécula de ácido nucleico que codifica a proteína FTO é cultivada utilizando métodos bem conhecidos de uma pessoa versada na técnica.

[0054] As sementes de plantas transgênicas podem ser colhidas de plantas transgênicas férteis e serem utilizadas para cultivar gerações descendentes de plantas transformadas desta invenção, incluindo linhagens de plantas híbridas para seleção de plantas tendo uma característica melhorada. Além da transformação direta de uma planta com a molécula de ácido nucleico que codifica a proteína FTO, as plantas transgênicas podem ser preparadas através do cruzamento de uma primeira planta tendo a molécula de ácido nucleico que codifica a proteína FTO com uma segunda planta que carece da molécula de ácido nucleico. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico que codifica a proteína FTO pode ser introduzida na primeira linhagem vegetal que é passível de transformação, para produzir uma planta transgênica

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20/48 que pode ser cruzada com uma segunda linhagem vegetal para incorporar a molécula de ácido nucleico que codifica a proteína FTO na segunda linhagem vegetal.

[0055] A planta transgênica derivada da célula vegetal da presente invenção é cultivada para produzir maior rendimento e/ou biomassa em comparação com uma planta de controle. Como aqui utilizado, uma “planta de controle” significa uma planta que não contém a molécula de ácido nucleico que codifica a proteína FTO. Uma planta de controle é para identificar e selecionar uma planta transgênica que possui maior rendimento e/ou biomassa. Uma planta de controle adequada pode ser uma planta não transgênica da linhagem de origem utilizada para gerar uma planta transgênica, isto é, desprovida da molécula de ácido nucleico que codifica a proteína FTO. Uma planta de controle adequada pode em alguns casos ser uma progênie de uma linhagem vegetal transgênica hemizigótica que não contém a molécula de ácido nucleico que codifica a proteína FTO, conhecida como um segregante negativo.

[0056] O rendimento da planta transgênica aqui descrita significa a quantidade colhida do produto desejado pelo cultivo. Os padrões para avaliar os rendimentos de diferentes plantas são diferentes. Por exemplo, o motivo da avaliação dos rendimentos das culturas de cereais (arroz, trigo, milho, etc.), feijões e oleaginosas (soja, amendoim, colza, etc.) é a semente (grão); o algodão é o algodão em semente ou o algodão em pluma; aquele das culturas de inhame (batata doce, batata, mandioca, etc.) é a raiz tuberosa ou tubérculo; aquele das culturas de fibras da floema é a fibra dos caules ou a fibra das folhas; aquele da cana de açúcar é o caule; aquele da beterraba é a raiz; aquele do tabaco é a folha; aquele das culturas de adubo verde (alfafa, trevo, etc.) é o caule e a folha, etc. O significado do rendimento da mesma planta difere quando é cultivado para diferentes propósitos. Por exemPetição 870180036364, de 03/05/2018, pág. 99/137

21/48 pio, quando o milho é cultivado como cultura de alimento e ração pura, o rendimento é a quantidade de colheita de grãos, e quando é cultivado como silagem, o rendimento inclui a quantidade total de colheita de caules, folhas e espigas.

[0057] O rendimento aumentado da planta transgênica da presente invenção pode ser medido por muitos meios, incluindo medição do peso, número de sementes por planta, peso da semente, peso do tubérculo, número de sementes por unidade de área (isto é, sementes, ou peso das sementes, por acre), alqueires por acre, toneladas por acre, toneladas por acre, quilo por hectare.

[0058] Aqueles versados na técnica podem determinar o significado do rendimento para cada planta e o padrão para avaliá-lo de acordo com o conhecimento na técnica.

[0059] Biomassa significa a massa total dos materiais orgânicos existentes de um organismo. É expressa em peso seco, peso fresco, número de brotos, etc. na presente invenção. A biomassa aumentada da planta transgênica da presente invenção pode ser medida por vários meios, incluindo a medição do peso, peso seco ou peso fresco das partes acima do solo por planta, número de brotos, peso seco das partes acima do solo por unidade de área (isto é, peso seco ou peso fresco, por acre), alqueires por acre, toneladas por acre, toneladas por acre, quilo por hectare.

Exemplos [0060] A presente invenção é ainda ilustrada nos seguintes Exemplos. Deve ficar entendido que estes Exemplos, embora indicando as modalidades da invenção, são dados apenas a título ilustração. A partir da argumentação acima e destes Exemplos, uma pessoa versada na técnica pode verificar as características essenciais desta invenção, e sem se afastar do seu espírito e escopo, pode efetuar várias alterações e modificações da invenção para adaptá-la a vários usos e conPetição 870180036364, de 03/05/2018, pág. 100/137

22/48 dições. Além disso, várias modificações da invenção além daquelas aqui mostradas e descritas serão evidentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição anterior. Tais modificações também se destinam a cair dentro do escopo das reivindicações anexas.

[0061] Os materiais utilizados nos seguintes exemplos eram como se segue:

1. Formulação do caldo YEP para o crescimento de Agrobacterium (por litro): extrato de levedura 10 g/L + peptona 10 g/L + NaCI 5 g/L, PH 7.2. Para o meio sólido, 15 g/L de ágar foram adicionados.

2. Caldo de AAM de re-suspensão de Agrobacterium: 50 ml 20 x AA macroelemento, 10 ml 100 x FeEDTA, 10 ml 100 χ B5 macroelemento, 10 ml 100 x vitamina B5, 100 ml 10 χ AA aminoácido, 1 ml 100 mM acetossiringona, 68,5 g de sacarose, 36 g de glocose, 0,5 g de caseína hidrolisada. O volume foi ajustado para 1000 ml. O pH foi ajustado para 5,2. Esterilizado com uma membrana de acetato de celulose de 0,2 mm.

3. Macroelemento 20 χ AA: 59 g de KCI, 3 g de CaCh · 2Η₂Ο, 10 g de MgSO₄ · 7H₂O e 3 g de NaH₂PO₄ · H₂O. O volume foi ajustado com água destilada para 1 L. Armazenado a 4°C.

4. Aminoácido 10 χ AA: 8,76 g de Gin, 2,66 g de Asp, 1,74 g de Arg e 75 mg de Gly. O volume foi ajustado com água destilada para 1 L. Esterilizado com uma membrana de acetato de celulose de 0,2 mm. Armazenado a 4°C.

5. 10 ml de 100 x vitamina B5: 10 g de mioinositol, 1 g de cloridreto de tiamina, 100 mg de cloridreto de piridoxina e 100 mg de ácido nicotínico. O volume foi ajustado com água destilada para 1L. Armazenado a 4°C.

6. Macroelemento 100 χ B5: 1,320 mg de MnSO₄ · 4H₂O, 200 mg de ZnSO₄ · 7H₂O, 2,5 mg de CuSO₄ · 5H₂O, 25 mg de Na2MoO₄ · 2H₂O,

2,5 mg de C0CI2 · 6H2O, 300 mg de H3BO3 e 75 mg de Kl. O volume

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23/48 foi ajustado com água destilada para 1L. Armazenado a 4°C.

7. Meio NB: macroelementos e microelementos de meio N6, elementos orgânicos do meio B5, 300 mg/L de caseína hidrolisada, 500 mg/L de glutamina, 30 g/L de sacarose e 8 g/L de ágar.

Exemplo 1: obtenção de cDNA do gene da desmetilase de m⁶A [0062] Os genes de FTO foram pesquisados a partir do banco de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Sequências de aminoácido (SEQ ID NO: 1 a 4) e sequências de ácido nucleico (SEQ ID NOs: 5, 7, 9 e 11) de FTO humano (Homo sapiens), FTO de porco (Sus scrofa), FTO bovino (Bos Taurus) e FTO de algas (Ostreococcus lucimarinus CCE9901) foram obtidas. Os cDNAs correspondentes foram adquiridos ou sintetizados por GenScript quando não existem cDNAs comercializados. As sequências de aminoácido das SEQ ID NOs: 1 a 4 foram otimizadas em códons vegetais para sintetizar as sequências de ácido nucleico otimizadas por códons SEQ ID NOs: 6, 8, 10 e 12.

[0063] Os cDNAs do gene de FTO utilizados nos seguintes exemplos são SEQ ID NO: 5, 7, 9 e 11.

Exemplo 2: clonagem do gene de desmetilase de m⁶A [0064] Os cDNAs do gene de FTO (SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11) foram clonados no vetor binário de plantas pCAMBIA1307. O tamanho médio das sequências de genes inseridos foi de 1,5 kb. O plasmídeo obtido é mostrado na figura 1.

Exemplo 3: transformação das plantas

3.1. Introdução do gene de FTO do exemplo 2 em arroz com as tecnologias transgênicas

I. Induzir calos com embriões maduros de arroz como materiais de teste

1. Esterilização [0065] Sementes maduras de arroz (japonica nipponbare) foram

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24/48 artificialmente descascadas. As sementes que estavam completas, brilhantes e limpas e isentas de placa bacteriana foram selecionadas e colocadas em um frasco esterilizado de 100 ml. Álcool a 70% foi adicionado ao frasco para esterilizar durante 2 minutos. Depois, o álcool foi decantado e NaCIO a 20% foi adicionado para absorver durante 30 minutos. Então, o NaCIO foi decantado e as sementes foram lavadas de 4 a 5 vezes com água destilada esterilizada. Por fim, as sementes foram impregnadas com água destilada esterilizada durante 30 minutos.

2. Cultura de introdução (sob condições assépticas):

[0066] As sementes esterilizadas foram colocadas em papel de filtro esterilizado. Após a absorção da água na superfície pelo papel filtro, as sementes foram colocadas em meio NB (PH 5,8) contendo 2,0 mg/L 2, 4-D na densidade de 12 a 14 sementes por placa de Petri. Para garantir uma boa taxa de indução, a orientação de germinação das sementes foi feita paralelamente ao meio ou ligeiramente para baixo, e não para cima ou verticalmente para cima. Depois, a placa de Petri foi selada com membrana, e foi induzida e incubada durante 20 a 30 dias em uma incubadora com luz a 30°C, 50% de umidade até que obviamente calos soltos aparecessem. Em seguida, a subcultura foi executada.

3. Subcultura (sob condições assépticas):

[0067] A placa de Petri foi aberta em uma mesa de operação super limpa. Os calos que naturalmente se dividiram, cresceram vigorosamente e os que eram amarelos sólidos e brilhantes e que tinham o diâmetro de cerca de 3 mm foram colocados em meio NB (PH 5,8) contendo 2,0 mg/L de 2,4-D e 0,5 mg/L de 6-BA na densidade de 10 calos por placa de Petri, e foram incubados no escuro a 30°C. Se os calos com seriedade se tornassem macios, eles seriam movidos para a luz para serem subcultivados. A subcultura foi executada duas vePetição 870180036364, de 03/05/2018, pág. 103/137

25/48 zes, a cada 10 a 15 dias (o tempo da próxima subcultura foi determinado de acordo com o crescimento dos calos).

II. A cultura da Agrobacterium [0068] O vetor pCAMBIA1307 que carrega o gene de FTO e o gene de resistência a higromicina mostrado na figura 1 foi transfectado em Agrobacterium LBA4404. Em seguida, a Agrobacterium LBA4404 foi semeada em meio sólido YEP contendo 20 mg/L de Rifampin (Rif) e 50 mg/L de canamicina (Kan). Após o cultivo a 28°C durante dois dias, os monoclones de Agrobacterium foram adquiridos para serem submetidos à PCR de colônias para testar se a FTO foi transferida para o Agrobacterium. Monoclones positivos foram selecionados e colocados em 4 ml de caldo YEP (contendo 50 mg/L de Kan e 20 mg/L de Rif), e foram cultivados com agitação a 28°C, 220 rpm durante 20 a 36 h até que o ODeoo da solução bacteriana fosse de 0,8 a 1,0.

III. Infecção e co-cultura

1. A solução da Agrobacterium cultivada foi centrifugada a 4°C, 4000 rpm durante 10 min e foi preparada para suspensão com caldo AAM contendo 100/mol/L de acetossiringona. O ODeoo final da solução bacteriana foi de cerca de 0,2.

2. Os calos com determinadas dimensões foram adquiridos e colocados na suspensão da Agrobacterium a ser infectada durante 20 a 30 min.

3. Os calos foram retirados e colocados em papel de filtro esterilizado para serem secados durante 20 a 30 min, de modo a evitar danos indevidos dos calos provocados pelo crescimento excessivo da Agrobacterium durante a co-cultura.

4. Os calos foram colocados em meio NB (PH 5,2) contendo 2,0 mg/L 2,4-D e 100 pmol/L de acetossiringona e foram cultivados a 25°C durante 48 a 72 h no escuro.

IV. Triagem de calos com resistência

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26/48 [0069] Os calos foram retirados e lavados com agitação por água esterilizada por 5 a 6 vezes. Depois, os calos foram colocados em papel de filtro esterilizado para serem secados e depois colocados uniformemente em meio NB (PH 5,8) contendo 50 mg/L de higromicina para a primeira triagem. Os calos foram cultivados no escuro a 28°C e quando houve crescimento de mofo ou Agrobacterium, os calos foram oportunamente transferidos para uma nova placa de triagem.

[0070] Após a triagem durante cerca de 30 dias, novos calos foram produzidos. Eles foram transferidos para um novo meio NB (PH 5,8) contendo 50 mg/L de higromicina durante mais 7 a 10 dias de triagem. Se o crescimento fosse óbvio, eles seriam calos positivos. Se não houve nenhum crescimento (mesmo que não houve escurecimento ou morte), possivelmente eram falsos positivos.

V. Introdução da diferenciação dos calos com resistência e enraizamento [0071] Os calos amarelados vigorosamente cultivados após a segunda triagem (para garantir que os calos utilizados para diferenciar não estavam com defeito) foram colocados em meio NB (PH 5,8) contendo 2,0 mg/L de 6-BA, 0,5 mg/L de cinetina e 50 mg/L de higromicina na densidade de 2 a 3 clones positivos por frasco. Foi o suficiente para colocar um pouco de calos por clone. Os calos colocados devem ter alta qualidade e não grande quantidade. Depois de cultivado a 27°C no escuro durante 10 dias, eles foram deixados diferenciar na luz durante 10 a 20 dias. Depois que as folhas verdes apareceram, eles foram deixados enraizar na densidade luminosa de 4000lux, 14h/d.

[0072] As mudas fortes diferenciadas de cada clone foram colocadas em meio 1/2N6 (PH 5,8) contendo 0,5 mg/L de ácido naftalenoacético e 50 mg/L de higromicina para induzir o enraizamento na densidade de 2 a 3 mudas de cada frasco. As mudas foram cultivadas em a 30°C com luz na densidade luminosa de 4000lux, 14h/d. Após 7 a

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27/48 dias, as membranas de vedação foram abertas para adicionar uma quantidade apropriada de água. Após 2 a 3 dias, as mudas foram transplantadas.

VI. Preparação e transplante de mudas transgênicas [0073] As mudas de arroz com raízes, caules e folhas bem diferenciados foram adquiridas (quando as mudas crescem até a parte superior dos tubos de ensaio, as coberturas devem ser abertas em tempo hábil). As membranas de vedação foram abertas e uma quantidade apropriada de água destilada ou água esterilizada foi adicionada (para evitar o crescimento de bactérias no meio). As mudas foram preparadas durante cerca de 3 dias a uma semana. Depois que o ágar foi enxaguado, as mudas foram transplantadas para vasos de barro na estufa para crescer e serem testadas.

Exemplo 4. Teste das mudas transformadas

1. Detecção de PCR: O projeto dos iniciadores do gene de FTO [0074] Iniciadores para detecção de FTO humana (hFTO): hFTO-F: 5'-ATGAAGCGCACCCCGACTG-3' (SEQ ID NO:13); hFTO-R : 5'-GGGTTTTGCTTCCAGAAGCTGA-3' (SEQ ID NO: 14) ; [0075] Iniciadores para detecção de FTO de vaca (cFTO): cFTO-F: 5'-ATGAAGCGGACCCCGACG-3' (SEQ ID NO:15);

cFTO-R: 5'-GGGCCTGGTTTCCAGAAGCAG-3' (SEQ ID NO:16); [0076] Iniciadores para a detecção de FTO de porco (pFTO): pFTO-F: 5'-ATGAAGCGAACCCCAACCGC-3' (SEQ ID NO:17)_;pFTO-R: 5'- GGGTTTGGCTTCCAGAAGCAGAC -3' (SEQ ID NO:18); [0077] Iniciadores para a detecção do FTO de Ostreococcus lucimarinus (oIFTO):

oIFTO-F: 5'-ATGTCGCCGTCATCCTCCG-3' (SEQ ID NO: 19);

oIFTO-R: 5'-CACTTTGTTTTGCTCCTCCTCGAGAAA-3' (SEQ ID

NO:20).

[0078] O programa de reação PCR foi: 35 ciclos de 95°C ± 5 min,

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95°C ± 15s, 58°C 15s, 72°C 30s. Estendido a 72°C durante 10 min, armazenado a 4°C. Após a reação, os produtos da PCR foram submetidos a análise por eletroforese em gel de agarose a 1%.

2. Método para detectar rapidamente as mudas transgênicas: as folhas recentemente verdes de cerca de 1 cm foram cortadas e coletadas das mudas a serem testadas (ambos os lados tiveram incisões) e foram colocadas de forma plana no meio de teste (0,7% ágar, 1 ml/L de 6BA, 50 mg/L de higromicina) e foram cultivadas a 28°C durante 48 h (16 h de luz/8 h de escuro por dia). As plantas que tinham folhas frescas verdes eram positivas, enquanto que as folhas das mudas negativas tinham placas de necrose.

Exemplo 5. Avaliação dos efeitos de genes de FTO de várias espécies no arroz [0079] Os resultados do teste do arroz do exemplo 3 são mostrados na tabela 1 (a variedade japonica Nipponbare que não tinha sido introduzida com o gene FTO foi o controle). Os dados foram obtidos de 50 plantas de arroz transgênicas e controle no estágio de maturação. O peso seco foi determinado depois de colocado no forno a 105°C durante 20 min e no forno a 80°C durante 20 horas.

Tabela 1. Avaliação dos efeitos de FTOs de ser humano, vaca, porco e Ostreococcus lucimarinus introduzidas no arroz (plantas transgênicas / plantas de controle)

Os ácidos nu-	Planta	Número de	Peso	Peso	Biomassa	Biomassa	Biomassa
cleicos introdu-		brotos	fresco	seco das	da planta	(peso fresco	(peso seco
zidos que codifi-			das	sementes	inteira	das partes	das partes
cam as FTOs		Vezes de	sementes	Vezes de	(sementes	acima do	acima do
		aumento	Vezes de	aumento	mais as	solo após a	solo após a
			aumento		partes	remoção	remoção
					acima do	das semen-	das semen-
					solo)	tes)	tes)
					Vezes de	Vezes de	Vezes de
					aumento	aumento	aumento
FTO humana	arroz	2,54	4,58	4,15	2,61	2,41	3,87
(SEQ ID NO: 5)
FTO de vaca		2,15	4,15	3,71	2,37	2,22	3,61

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(SEQ ID NO: 7)
FTO de porco (SEQ ID NO: 9)	2,08	4,02	3,62	2,34	2,11	3,60
FTO de Ostreococcus lucimarinus (SEQ ID NO: 11 )	1,85	3,78	3,41	2,51	2,15	3,45

[0080] A Tabela 1 mostra que depois que os ácidos nucléicos que codificam as FTOs de várias espécies foram introduzidos no arroz, a biomassa e o rendimento das sementes foram aumentados.

[0081] O inventor também testou os ácidos nucleicos otimizados por códon que codificam as FTOs (SEQ ID NOs: 6, 8, 10 e 12) pelo mesmo método. Os dados são semelhantes aos acima e, portanto, não são mostrados neste artigo.

Exemplo 6 Avaliação do efeito do FTO em uma variedade de plantas [0082] Uma variedade de plantas foi transformada com o ácido nucleico que codifica a FTO humana (SEQ ID NO: 5) para obter uma variedade de células vegetais e plantas transgênicas nas quais o ácido nucleico que codifica a FTO foi introduzido. Os métodos são como se segue.

Método de transformação genética do tabaco

1. Materiais experimentais [0083] Materiais: Variedade de tabaco: K326; Agrobacterium: LBA4404; O gene HF (FTO humana) foi clonado no vetor acionado pelo promotor 35S pCAMBIA2300. A resistência projetada nas plantas eucarióticas foi resistência à canamicina.

[0084] Produtos químicos: macroelementos MS, microelementos

MS, sais de ferro MS, ácido indol acético (IAA), 6-benzilaminoadenina (6-BA), nicotinato de inositol (B1B6), sacarose, ágar, cefalosporina (Cef), carbenicilina (Carb), canamicina (Kn), gentamicina, rifampicina.

[0085] Meio MS (1 L): macroelementos (20x) 50 ml, microelementos (100x) 10 ml, Fe²⁺ (100x) 10 ml, sacarose 30 g, ágar 8 g. O pH foi de cerca de 6,0.

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30/48 [0086] Meio de pré-cultivo (1 L): macroelementos (20x) 50 ml, microelementos (100x) 10 ml, Fe²⁺ (100x) 10 ml, 6-BA (1000x) 2 ml, ΒιΒδ (200x) 5 ml, glicina (1000x) 1 ml, ágar 8 g. O pH foi de cerca de 6,0. Após esterilização em alta temperatura, IAA (0,2 mg/l) 1 ml foi adicionado.

[0087] Meio de cultura de diferenciação (1 L): com base no meio de pré-cultivo, cefalosporina 2 ml, carbenicilina 1 ml e canamicina 1 ml foram adicionados.

[0088] Meio de cultura de enraizamento (1 L): 1/2MS, IAA 2 mg/L, sacarose 30 g/L, ágar 5,8 g/L, pH = 5,8.

[0089] Caldo LB (1 L): triptona 10 g, extrato de levedura 5 g, NaCI 10 g.

[0090] Meio MSo: meio de cultura MS sem adição de ágar e contendo apenas macroelementos.

2. Transformação do tabaco (método do disco de folha) [0091] O tabaco foi transformado pelo método do disco de folha. Os discos de folhas cortadas de tabaco foram colocados no meio de pré-cultivo durante 1 a 2 dias, e depois embebidos em suspensão de Agrobacterium (MSo colocado em suspensão, diluído de 50 a 100 vezes) durante 3 a 5 minutos. Em seguida, os discos foram retirados e papel de filtro estéril foi utilizado para absorver o líquido em suas superfícies. Os discos de folha infectados foram respectivamente inoculados em um meio de pré-cultivo coberto com duas camadas de papel de filtro e cultivados a 26Ό durante 20 a 24 h no escuro. Os discos foram enxaguados com a água esterilizada adicionada com cefalosporina e carbenicilina (1000 vezes o líquido-mãe) durante 10 min. Eles foram finalmente enxaguados com água esterilizada durante 10 min. Subsequentemente, papel de filtro estéril foi utilizado para absorver o líquido nas suas superfícies, e depois os discos foram colocados no meio de cultura de diferenciação para cultura de diferenciação. Nos

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31/48 estágios iniciais, o subcultivo foi executado a cada 2 a 3 anos, e cada subcultivo deve ser realizado sob condições assépticas; após o subcultivo contínuo por três vezes, o subcultivo foi executado a cada duas semanas. O co-cultivo foi realizado até que o primeiro broto apareceu. Os botões foram transferidos para dentro dos vasos de cultivo de tecidos para o cultivo. Quando os botões cresceram para 2 cm, todos os calos nas partes basais dos botões e das folhas basais foram cortados em uma mesa de operação superlimpa, e depois os botões foram colocados no meio de cultura de enraizamento. Quando as raízes cresceram para 3 cm, mudas estéreis foram retiradas; o meio de cultura sólido foi esmagado suavemente, enquanto o meio de cultura residual foi extraído por enxágue. Depois disso, as mudas estéreis foram colocadas no solo, cobertas com sacos de plástico transparente (furados) e cultivadas durante cerca de uma semana e depois transferidas para o ar livre (crescendo no escuro nos primeiros 3 dias).

Método de transformação da batata

1. Materiais:

[0092] Variedade de batata: Dongnong 303; Agrobacterium: LBA4404; O gene HF (FTO humana) foi clonado no vetor acionado pelo promotor 35S pCAMBIA2300. A resistência projetada nas plantas eucarióticas foi resistência à canamicina.

2. Transformação da batata [0093] As batatas foram lavadas mediante o enxágue com água destilada, embebidas em álcool a 75% durante 30 segundos, embebidas em cloreto de mercúrio a 0,1% durante 10 min, lavadas com água esterilizada por 5 vezes e depois descascadas para serem cortadas em fatias com a espessura em torno de 1 mm. As fatias foram misturadas com a solução de Agrobacterium sob agitação suave para permitir que a solução de Agrobacterium entrasse em contato com os explantes suficientemente. Papel de filtro estéril foi utilizado para absorPetição 870180036364, de 03/05/2018, pág. 110/137

32/48 ver a solução de Agrobacterium excedente. Em seguida, os pedaços de batata foram colocados no meio de co-cultivo para o cultivo no escuro. Após a conclusão do co-cultivo, os pedaços de batata foram limpos por 3 vezes com água esterilizada e meio de cultura MS líquido, respectivamente. A solução de Agrobacterium excedente foi enxaguada. Os pedaços de batata foram transferidos para o meio de cultura de regeneração. Depois, os pedaços de batata foram transferidos para o meio de cultura de enraizamento até que os brotos crescessem para

1,5 a 2,0 mm e fossem cortados, para a propagação da triagem de enraizamento.

Transformação genética da soja

1. Materiais [0094] A cepa de Agrobacterium foi LBA4404; massas de embriões de células somáticas de soja Dongnong L13 no estágio globular; o plasmídeo transgênico foi um vetor acionado pelo promotor 35S pCAMBIA2300 no qual o gene HF foi clonado. A resistência projetada nas plantas eucarióticas foi resistência à canamicina.

Meio de cultura de tecidos vegetais e condições de cultura:

[0095] Meio de subcultura: MS + 15 mg/L -20 mg/L 2,4-D + 0,8% de ágar + 3% de sacarose pH = 5,8 de luz natural.

[0096] Meio de cultura de ressuspensão: meio de subcultura (líquido) + AS (0 a 100 pmol/L) pH = 5,8.

[0097] Meio de co-cultivo: meio de cultura de infecção + AS (0-100 pmol/L) pH = 5,6.

[0098] Meio de cultura para a triagem por esterilização: meio de subcultura + (50 a 300 mg/l) cefalosporina + 25 a 50 mg/l canamicina.

[0099] Meio de cultura de germinação 1: M S + 1% de carvão ativado + 0,8% de ágar + 10% iluminação de sacarose 16 h/d.

[00100] Meio de cultura de germinação 2: MS + 0,8% de ágar +

10% iluminação de sacarose 16 h/d.

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33/48 [00101] Meio de cultura de reforço de mudas: MSB +0,8% de ágar + 3% de glicose pH = 7 iluminação 16 h/d.

(nos últimos três meios de cultura, a canamicina 0 a 50 mg/L e cefalosporina 0 a 300 mg/L foram adicionados ao mesmo tempo)

2. Transformação infectada por Agrobacterium e regeneração de plantas [00102] As massas embrionárias de células somáticas de soja com os diâmetros de cerca de 3 mm foram colocadas no líquido de infecção de Agrobacterium preparado para infecção. Então, a solução bacteriana foi despejada e o papel de filtro estéril foi utilizado para absorver o líquido redundante para secar as massas embrionárias. Depois disso, as massas embrionárias foram inoculadas no meio de cocultura, depois no meio de cultura de triagem de esterilização contendo 50 mg/L de canamicina e 300 mg/L de cefalosporina (as concentrações diminuíram em sequência dependendo da situação, com a condição de que nenhuma bactéria cresceu). O tempo de infecção foi de 10 min. O tempo de co-cultura foi de 2 a 3 dias. A acetossiringona foi de 100 pmol/l. A concentração de Agrobacterium OD600 foi de 0,5 a 0,7. O subcultivo foi executado a cada 15 a 20 dias. O número das massas embrionárias de células somáticas resistentes (com os diâmetros em torno de 3 mm) como geradas foi inspecionado dentro de 3 meses. A relação de transformação (o número das massas embrionárias de células somáticas resistentes / número de massas embrionárias de células somáticas inoculadas x 100) foi calculada. Em seguida, as massas embrionárias de células somáticas resistentes foram transferidas para o meio de cultura germinativo 1 e depois para o meio de cultura germinativo 2 após 20 dias de germinação. Até o crescimento das plantas pequenas resistentes regeneradas, as ditas plantas foram transferidas para dentro do meio de cultura de reforço de mudas para obter as plantas transformadas.

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Transformação genética de alfafa

1. Materiais [00103] Variedade de alfafa; Gongnon-1; Agrobacterium: LBA4404; um vetor de expressão binária da planta pCAMBIA2300 em que o gene HF foi clonado e resistente a canamicina.

[00104] O meio de cultura foi um meio de cultura MS adicionado com várias substâncias reguladoras do crescimento, com um valor de pH de cerca de 5,8. A temperatura da cultura foi de 23 a 25°C. A intensidade de iluminação foi de 2000 Ix; o tempo de iluminação foi de 18 h/d. O subcultivo foi executado a cada 20 dias.

2. Preparação de calos [00105] Os hipocótilos foram utilizados como explantes para passar pela indução de calos e diferenciação embrionária somática. Após a maturação dos embriões somáticos, os embriões somáticos foram transferidos para MSo para teste de germinação.

3. Suspensão da cultura de calos embriogênicos [00106] 3 g de calos foram inoculados em um frasco de erlenmeyer de 150 ml contendo 40 ml de solução de cultura em suspensão para executar a cultura de suspensão. Um meio de cultura fresco foi utilizado para a mudança a cada 7 dias. A velocidade de rotação do agitador foi de 150 rpm. Luz de dispersão natural foi utilizada para iluminação. Após 15 dias, a velocidade de crescimento celular foi determinada. Os calos adequados foram inoculados no melhor caldo de indução de calo embriogênico que foi filtrado. A velocidade de rotação do agitador foi definida como 120 rpm. Um meio de cultura fresco foi utilizado para a mudança a cada 7 dias. A iluminação com luz de dispersão natural durou cerca de 30 d.

4. Transformação de Agrobacterium [00107] Os calos embriogênicos foram colocados em um tubo pequeno de centrífuga de 2,0 ml contendo 600 μΙ de meio de co-cultura

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35/48 líquido para o tratamento de ondas ultrassônicas de 8 s com um parâmetro de 100 mHz e a subsequente co-cultura de 4d. Os calos embriogênicos em suspensão infectados foram colocados em contato com a superfície em um meio de co-cultura semi-sólido contendo 100 pmol/L de acetossiringona paro o cultivo no escuro de 4 dias.

5. Triagem e regeneração de plantas transformadas [00108] Os calos embriogênicos co-cultivados foram inoculados no meio de cultura de diferenciação para o cultivo de 50 a 60 dias. Após 4 estágios embrionários, os calos embriogênicos cresceram em embriões somáticos maduros. Em seguida, eles foram transferidos para um meio de cultura de germinação de embriões somático. Após cerca de 20 a 30 dias, quando as plantas cresceram para cerca de 10 cm, as mudas foram transplantadas, em que a concentração de triagem de canamicina utilizada foi de 30 mg/l.

Transformação genética de colza

1. Materiais [00109] Variedade de colza do tipo repolho CY2 para transformação genética; cepa de Agrobacterium EHA105; um vetor de expressão binária de plantas pCAMBIA1301 no qual o gene HF foi clonado.

2. Transformação de Agrobacterium [00110] Colônias bacterianas frescas foram selecionadas por palito de dente para serem cultivadas em um caldo YEB contendo Km 50 mg/L e Rif 50 mg/L sob agitação a 28°C, até o estágio médio de divisão logarítmica (OD600 = 0,3). A solução bacteriana foi retirada para centrifugação a 12000 rpm durante 1 min, lavada uma vez com meio de cultura MS sob centrifugação e depois diluída em 10 vezes. As sementes CY2 de origem receptoras foram esterilizadas e inoculadas em um meio de cultura 1/2 MS para o cultivo das mudas estéreis. Após 5 a 7 d, os hipocótilos foram cortados em pequenas partes de cerca de 1 cm de comprimento para servirem como explantes para a transformaPetição 870180036364, de 03/05/2018, pág. 114/137

36/48 ção mediada por Agrobacterium tumefaciens com o plasmídeo pCAMBIA1301 que carrega o gene HF. A transformação foi realizada seguindo o método de Wang Fulin et al. (Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 5(26): 1129-1134(2011)). Os transformantes foram submetidos a triagem por higromicina (Hyg) 10 mg/l. As mudas resistentes a Hyg peneiradas submetidas a triagem enraizaram-se e foram domesticadas em vasos de estufa durante um período de tempo e depois transplantadas nos campos.

Transformação genética do algodão

1. Materiais e reagentes [00111] Variedade de algodão: Zhong 521; cepa de Agrobacterium GV3101; um vetor de expressão binária de plantas pCAMBIA2300 no qual o gene HF foi clonado e resistente a canamicina.

[00112] Meio de cultura MBS: ingrediente inorgânico MS + ingrediente orgânico B5 como meio de cultura básico, adicionado com diferentes ingredientes hormonais.

[00113] Líquido de infecção: sais inorgânicos MS + compostos orgânicos B5 +0,1 mg/L 2,4-D + 0,1 mg/L KT + 100 pmol/L AS (acetossiringona) + 30 g/l de glicose.

[00114] Co-cultura: sais inorgânicos MS + compostos orgânicos B5 +0,1 mg/L 2,4-D + 0,1 mg/L KT + 100 pmol/L AS (acetossiringona) + 30 g/L de glicose + 2,5 g/l de gel vegetal.

[00115] Meio de cultura de triagem: sais inorgânicos MS + compostos orgânicos B5 +0,1 mg/L 2,4-D + 0,1 mg/L KT + 30 g/L de glicose +

2,5 g/L de gel vegetal + canamicina 50 mg/L + 150 mg/L de carbenicilina.

2. Cultivo de explantes [00116] As sementes de algodão submetidas ao tratamento de retirada de fiapos com ácido sulfúrico concentrado foram limpas com água da bica; as sementes foram retiradas. Em seguida, as sementes

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37/48 submetidas ao tratamento de retirada de fiapos foram colocadas em um frasco erlenmeyer esterilizado sobre uma mesa de operação superlimpa. As sementes foram embebidas com álcool 70% a 75% durante 1 min, enxaguadas com água esterilizada e depois embebidas com hipoclorito de sódio a 2% durante 60 min. Posteriormente, o hipoclorito de sódio foi despejado e as sementes foram enxaguadas com água esterilizada por várias vezes e embebidas em água esterilizada durante 24 horas. Depois que as sementes foram reveladas, as coberturas da semente foram arrancadas. As sementes foram inoculadas em um meio de cultura de mudas de 1/2 MS para o cultivo no escuro a 28°C. As mudas com a idade de 5 d mais ou menos foram tomadas para serem cortadas em pequenos pedaços de 0,5 a 0,6 cm para servirem como explantes.

3. Co-cultura de explantes e Agrobacterium [00117] Os hipocótilos de mudas estéreis foram cortados em pequenas partes de 0,5 cm mais ou menos e ensopados em solução de Agrobacterium durante 30 a 40 min. Papel de filtro estéril foi utilizado para absorver a solução bacteriana. Ditas pequenas partes foram colocadas em um meio de cultura sólido MSB para o co-cultivo de 48 h.

4. Indução e seleção de calos e regeneração de plantas [00118] Os cortes de hipocótilo co-cultivados foram transferidos para dentro do meio de cultura de triagem sólido MSB contendo 50 mg/l de canamicina e 500 mg/l de carbenicilina. Até que o cultivo dure 60 d, as massas de calos positivas resistentes à canamicina foram selecionadas para serem transferidas para o meio de cultura acima livre de antibiótico para o sub-cultivo. Posteriormente, de acordo com o estado dos calos, os calos embriogênicos particulados foram obtidos através do ajuste da concentração de hormônio no meio de cultura, e depois os embrióides foram diferenciados para o cultivo de plantas regeneradas.

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Transformação genética do trigo (calos embriogênicos)

1. Materiais de teste [00119] Os tecidos embrionários imaturos foram utilizados para o cultivo. A variedade de teste foi Henong 827. Cepa de Agrobacterium C58. Um vetor de expressão binária vegetal pCAMBIA2300 no qual o gene HF foi clonado e resistente à canamicina.

[00120] Os meios de cultura utilizados no processo de transformação genética do trigo incluíram:

Meio de cultura de indução de calos MSW0: meio básico de MS + 2 mg/l de 2,4-D + 4 mg/l de picloreto + 0,5 g/l de glutamina + 0,75 g/l de MgCÍ2 + 0,1 g/l de caseína hidrolisada + 1,95 g/l de MES + 100 mg/L de ido ascórbico + 40 g/L de maltose + 4,5 g/L de ágar, pH 5,8;

Líquido de infecção PCM: meio básico MS + 2 mg/l de 2,4-D + 4 mg/l de picloreto + 0,5 g/l de glutamina + 0,75 g/l de MgCh + 0,1 g/l de caseína hidrolisada + 1,95 g/l de MES + 100 mg/L de ácido ascórbico + 200 pmol/L de acetossiringona + 40 g/L de maltose + 4,5 g/L de ágar, pH 5,8;

Meio de cultura de triagem de calo SM: meio básico MS + 2 mg/L de 2,4-D + 4 mg/L de picloreto + 0,5 g/L de glutamina + 0,75 g/l de MgCh + 0,1 g/L de caseína hidrolisada + 1,95 g/L de MES + 100 mg/l de ácido ascórbico + 250 mg/l de carbenicilina + 25 mg/l de G418 + 40 g/l de maltose + 4,5 g/l de ágar, pH 5,8;

Meio de cultura de diferenciação de calos resistentes RSM: meio básico MS + 2 mg/L de 2,4-D + 4 mg/L de picloreto + 0,5 g/l de glutamina + 0,75 g/l de MgCh + 0,1 g/l de caseína hidrolisada + 1,95 g/l de MES + 100 mg/L de ácido ascórbico + 250 mg/L de carbenicilina + 25 mg/L de G418 + 0,5 mg/L de cinetina + 0,2 mg/L de ácido naftaleno acético + 40 g/L de maltose + 4,5 g/L de ágar, pH 5,8.

2. Esterilização de grãos imaturos e inoculacão de embriões imaturos [00121] Os grãos imaturos foram coletados 12 a 15 dias após a po-

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39/48 linização do trigo para serem esterilizados na superfície com álcool a 70% durante 30 s, esterilizados com cloreto de mercúrio a 0,1% durante 8 min e limpos com água esterilizada por 4 a 5 vezes. Os embriões imaturos foram selecionados com agulhas dissecação e foram respectivamente inoculados no meio de cultura de indução de calo MSWO com a escama para cima, para o cultivo no escuro de 2 semanas a 25°C, e depois transferidos para o meio de cultura de diferenciação para iluminação de 16 h a 25°C e cultivo no escuro de 8 h durante 4 a 6 semanas.

3. Procedimentos de transformação genética mediada por Agrobacterium [00122] A Agrobacterium C58 contendo HF foi inoculada uniformemente com aplicador no meio de cultura sólido LB (pH 7,0, contendo 50 mg/L de canamicina e 50 mg/L de rifampicina) para o cultivo de 3 dias a 28°C e depois o cultivo de 1 dia a 23°C. Depois disso, uma pequena quantidade de Agrobacterium foi raspada do meio de cultura para ser transferida e inoculada no caldo YEP contendo o antibiótico antes mencionado para o cultivo durante a noite a 28°C, na velocidade de rotação do agitador de 250 rpm. A Agrobacterium foi coletada até que OD600 atingiu 1,0, e foi colocado novamente em suspensão com líquido de infecção PCM. A ressuspensão foi utilizada para absorver os calos durante 3 horas. Depois, a solução bacteriana foi despejada. Os calos foram transferidos para a dispersão no prato de cultura com papel de filtro estéril para o co-cultivo de 3 dias, depois transferidos para o meio de cultura de triagem para o cultivo no escuro de 2 semanas a 25°C, e depois transferidos para dentro do meio de cultura diferencial para o cultivo com iluminação a 25°C.

Transformação genética de painço [00123] O mesmo método como para o trigo foi utilizado. Transformação genética do linho

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1. Materiais [00124] Linho: Heiya 7; cepa de Agrobacterium tumefaciens EHA105; um vetor de expressão binária de plantas pCAMBIA1301 em que o gene HF foi clonado e resistente a canamicina.

2. Preparação de explantes [00125] Sementes carregadas e brilhantes Heiya 7 foram selecionadas, embebidas com álcool a 75% durante 5 min, embebidas com sobrenadante de pó alvejante a 20% durante 20 min, enxaguadas com água esterilizada por três vezes, e depois inoculadas em meio de cultura MS para o cultivo no escura de 5 a 7 dias a 25°C. 2 dias antes da aplicação, as sementes foram colocadas sob iluminação durante 16 horas por dia a 22°C para uso.

3. Preparação da solução bacteriana de Agrobacterium [00126] A propagação da cepa EHA105 contendo o gene de interesse foi executada utilizando um meio de cultura YEP, peptona 10 g/L, extrato de levedura 10 g/L, NaCI 5 g/L e canamicina 50 mg/L. Após a inoculação, a agitação da cultura foi realizada a 28°C durante 2 dias. A fase superior foi removida por centrifugação durante 10 min em 3000 r/min. A bactéria foi colocada em suspensão com um caldo de 1/2 MS (OD600 = 0,5) para transformação.

4. Teste de pressão seletiva [00127] Os hipocótilos de linho estéril foram cortados em pequenos pedaços de 0,3 a 0,5 mm. Ditos pequenos pedaços foram embebidos com água esterilizada durante 10 min, secos por absorção com papel de filtro estéril e respectivamente inoculados no meio de cultura MS de canamicina 50 mg/L para o cultivo em 24 a 26°C. O período de iluminação foi de 16 h por dia.

5. Co-cultivo [00128] Os hipocótilos de linho foram cortados em pequenos pedaços de 0,3 a 0,5 mm. Ditos pequenos pedaços foram embebidos com

Petição 870180036364, de 03/05/2018, pág. 119/137 uma suspensão de Agrobacterium EHA105 durante 10 a 20 min, secos por absorção com papel de filtro estéril e respectivamente inoculados no meio de cultura MS, B5 ou N6 de KT 2 mg/L, IAA 3,5 mg/L ou HL 150 mg/L. As condições de cultivo foram as mesmas como acima.

6. Triagem de cultura e enraizamento [00129] O meio de cultura de triagem foi o mesmo que aquele para o co-cultivo, e apenas diferiu na adição de 50 mg/L de canamicina e 1000 mg/L de cefalosporina. Os explantes co-cultivados durante 3 dias com Agrobacterium foram embebidos com solução de cefalosporina durante 10 a 20 minutos, secos por absorção com papel de filtro estéril, e depois inoculados no meio de cultura de triagem para o cultivo sob as mesmas condições mostradas acima. A esterilização e a formação de calos foram inspecionadas uma semana e duas semanas após a inoculação, respectivamente. Os brotos resistentes selecionados foram transferidos para o meio de cultura de enraizamento para o enraizamento induzido.

Transformação Genética do Girassol

1. Materiais [00130] H elianthusannuus Xinkuiza 6; cepa de Agrobacterium tumefaciens EHA105; um vetor de expressão de planta pCAMBIA1301 no qual o gene HF foi clonado.

2. Cultivo da cepa [00131] Colônias isoladas novas de Agrobacterium tumefaciens foram selecionadas para inocular em um caldo YEP (1% de extrato de levedura + 1% de triptona + 0,5% de extrato de carne bovina) sob agitação a 28Ό durante a noite. No dia seguinte, fora m transferidas e inoculadas em um caldo YEP de 20 mL contendo antibiótico na quantidade de inoculação de 1% para a vibração mais adiante e cultivo até o período de crescimento logaritmo; as bactérias foram coletadas por centrifugação e diluídas com líquido MES até que ODeoo atingiu 0,8

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42/48 como a concentração de trabalho para uso.

3. Meios de cultura [00132] Meio MSo: ingredientes básicos MS + 2% de sacarose + 0,8% de ágar, pH 5,8.

[00133] Meio basal GBA: MSo + 0,5 mg/L de BA P + 0,25 mg/L de IAA + 0,1 mg/L de GA3 + 30 g/L de sacarose + 0,8% de ágar, pH 5,8.

[00134] Meio de co-cultivo (M C): GBA + acetosseringona (A CS) (100 ml/l) + 30 g/L de sacarose + 0,8% de ágar, pH 5,8.

[00135] Meio de cultura de triagem (Μ B): GBA + Carb 400 mg/L + higromicina 10 mg/L + 30 g/L de sacarose + 0,8% de ágar, pH 5,8.

[00136] Meio de enraizamento (M R): 1/2M So + 0,2 mg/L de N A A + 250 mg/l de Carb + 5 mg/l de higromicina + 30 g/l de sacarose + 0,8% de ágar, pH 5,8.

4. Preparação de explantes [00137] As sementes que estavam carregadas, uniformes no tamanho e sem pragas e doenças foram selecionadas, descascadas, embebidas com etanol a 70% durante 1 min, enxaguadas com água esterilizada duas vezes, esterilizadas com AgNÜ3 a 1% durante 3 min e enxaguadas com água esterilizada três vezes. As sementes foram semeadas em meio de cultura sólido MSo e germinadas no escuro a 28°C; mudas estéreis foram obtidas após o cultivo durante 36 a 48 h. Raízes, cotilédones e phyllopodium de mudas estéreis foram cortados para revelar as pontas do caule e, em seguida, cortados longitudinalmente. Os explantes obtidos continham metade dos meristemas da ponta do caule e duas metades dos brotos axilares cotilédones.

5. Infecção [00138] Os explantes da ponta do caule preparados foram embebidos em solução bacteriana suficientemente durante 10 min, e depois retirados. O papel de filtro estéril foi utilizado para absorver suficientemente a solução bacteriana excedente nas superfícies dos explantes.

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Os explantes foram colocados em um meio de co-cultivo MC para o co-cultivo de 3 dias no escuro a 28°C, e controle foi fornecido.

6. Triagem de transformantes e regeneração vegetal [00139] Os explantes co-cultivados durante 3 dias foram transferidos para dentro um meio de cultura de triagem MB contendo 10 mg/ml de higromicina (Hyg) para o cultivo de 2 semanas e depois submetidos a triagem durante 2 a 3 vezes (2 semanas para cada vez). Os brotos resistentes selecionados foram transferidos para o meio de cultura de enraizamento MR para o enraizamento induzido.

Transformação genética de Taraxacum kok-saghyz Rodin (também chamado dente de leão russo)

1. Materiais [00140] Taraxacum kok-saghyz Rodin; cepa de Agrobacterium: GV3101; plasmídeo (pCAMBIA2300-35S-HF) que era um vetor binário pCAMBIA2300 portador do gene HF e resistente a canamicina.

2. Transformação genética e regeneração de Taraxacum kok-saghyz Rodin (1) Mudas cultivadas com tecido de bom desenvolvimento foram selecionadas. As extremidades das folhas foram removidas. O caule de Taraxacum kok-saghyz Rodin foi cortado em um comprimento de 2 cm. As folhas foram cortadas no tamanho de 1 cm². Elas foram colocadas em um meio de cultura MS adicionado com hormônios vegetais 6-BA e NAA para o cultivo no escuro de 2 dias;

(2) 200 μΙ foram retirados do tubo de glicerina de Agrobacterium GV3101 armazenados a -70°C e contendo o plasmídeo pCAMBIA2300-35S-HF a ser inoculado em 50 ml de LB (50 mg/l Gen + 100 mg/l Rif + 50 mg/l Kan) líquido para o cultivo durante a noite;

(3) A solução bacteriana cultivada durante a noite foi passada no meio de cultura sólido LB (50 mg/L Gen + 100 mg/L Rif + 50 mg/L Kan), colocada de cabeça para baixo, durante o cultivo de 2 dias a 28°C;

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44/48 (4) As colônias monoclonais foram selecionadas para inoculação no caldo LB (50 mg/L Gen + 100 mg/L Rif + 50 mg/L Kan), para agitação da cultura de 2 dias a 28°C;

(5) As soluções bacterianas cultivadas foram respectivamente inoculadas em 100 ml de líquido LB (50 mg/L Gen + 100 mg/L Rif + 50 mg/L Kan) em uma relação de 1:100 para o aumento da cultura, e ativadas até uma OD260 ao redor de 0,6 para infecção;

(6) As duas soluções bacterianas acima mencionadas foram respectivamente colocadas em 2 tubos de centrífuga grandes estéreis de 50 ml e centrifugadas durante 10 min a 5000 rpm;

(7) O sobrenadante foi descartado. As bactérias foram colocadas em suspensão em 100 ml de caldo MS e cultivadas durante 5 min a 28°C;

(8) Os explantes acima cultivados no escuro durante 2 dias foram colocados na solução bacteriana selecionada para agitação de cultura de 20 min a 28°C;

(9) Os explantes infectados foram espalhados no papel de filtro seco estéril, com a solução bacteriana excedente absorvida, para o cultivo no escuro de 2 dias;

(10) Após 2 dias, os explantes foram retirados e colocados no meio de cultura sólido MS (1 mg/L 6-BA + 0,1 mg/L NAA + 400 mg/L Cb (carbenicilina) + 50 mg/L Kan (canamicina)); o prato foi despejado a cada quinzena;

(11) Quando os brotos adventícios aumentaram para 2 cm, os brotos isolados foram quebrados e inseridos no meio de cultura de enraizamento 1/2MS (0,2 mg/L NAA + 50 mg/L Kan + 400 mg/L Cb) para o desenvolvimento;

(12) Após um mês, as mudas cultivadas no tecido fortes foram domesticadas durante 1 dia, transplantadas em solo nutriente (solo turfístico: vermiculita = 3:1), cobertas com película durante 1 semana e colocadas em ambiente de cultivo para posterior cultivo.

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Transformação genética de milho

1. Materiais e reagentes [00141] Variedade de milho: Qi 319; cepa de Agrobacterium: GV3101; plasmídeo (pCAMBIA2300-35S-HF) que era um vetor binário pCAMBIA2300 portador do gene HF e resistente a canamicina.

[00142] Meio de cultura D: NaFeEDTA 10 ml/L + N6 macroelementos 50 ml/L + microelementos B5 10 ml/L + Di comba (2,4-D) 1 ml/L (5 ml/L) + RTV 10 ml/L + ácidos Casamina (caseína hidrolase) 0,5 g/L + L-Prina 700 mg/L + inositol 100 mg/L + Sacarose 20 g/L, pH 5,8.

[00143] Meio de cultura D-lnf: NaFeEDTA 10 ml/L + N6 macroelementos 50 ml/L + microelementos B5 10 ml/L + Di comba (2,4-D) 1 ml/L + RTV 10 ml/L + ácidos Casamina (caseína hidrolase) 0,5 g/L + LPrina 700 mg/L + inositol 100 mg/L + Sacarose 68,5 g/L + glicose 36 g/L, pH 5,2.

[00144] Meio de cultura D-AS: meio de cultura D + glicose 10 g/L + ágar em pó 8 g/L + AS (0,5 M) 200 μΙ + AgNO3 1 ml/L (tanto AS quanto AgNO3 tiveram a concentração final de 100 μΜ, e foram adicionados após a esterilização do meio de cultura quando esfriados para a mistura uniforme).

[00145] Meio de cultura D-Cef: meio de cultura D + AgNO3 1 ml/L + cef 1 ml/L.

2. Transformação genética e regeneração do milho (1) Preparação do embrião imaturo de milho: folhas de milho, sedas de milho e algumas partes redundantes foram removidas; uma faca foi inserida na parte superior para adicionar etanol a 70 %; o milho entrou na mesa de operação super-limpa; 30 s depois, ele foi retirado e seco por sopro na mesa de operação super-limpa durante cerca de 15 a 20 min; 2/3 da superfície do grão foi descascado; o embrião imaturo foi descascado.

(2) A solução bacteriana adicionada em D-lnf (contendo AS) foi diluída

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46/48 até uma OD600 de 0,3 a 0,5 e durou mais de 1 hora. O embrião imaturo foi lavado uma vez com D-lnf (livre de AS), e depois embebido na solução bacteriana, de cabeça para baixo com a mão durante 30 s, e permaneceu durante 5 min. Observado sem feridas aparentes, o embrião imaturo foi retirado, secado por absorção com papel de filtro estéril e colocado no meio de cultura sólido D-AS para o co-cultivo de 3 dias no escuro a 25Ό.

(3) Estágio de restauração da cultura: o embrião imaturo co-cultivado durante 3 dias foi enxaguado em água esterilizada (adicionado com 1% de cef) por três vezes, 20 min para cada vez, e depois seco por absorção com papel de filtro, e transferido para o meio de cultura sólido D-Cef, e a restauração da cultura no escuro a 25°C durante 7 dias. Posteriormente, a etapa de triagem por pressurização foi executada: em 4 ciclos, com intervalo de 2 semanas entre qualquer um de dois.

O 1^o ciclo: meio de cultura D + cef (1%) + PPT (5 mg/ml).

O 2^o ciclo: meio de cultura D + cef (1%) + PPT (10 mg/ml).

O 3^o ciclo: meio de cultura D + cef (1%) + PPT (10 mg/ml).

O 4^o ciclo: meio de cultura D + cef (1%) + PPT (10 mg/ml).

(4) Estágio de restauração após triagem: meio de cultura D + 6-BA (5 mg/L), em que a concentração de 2,4-D ou Dicamba foi diluída 5 vezes e sacarose 30 g/L (ou sacarose 20 g/L, glicose 10 g/L); o período foi de 2 semanas; cultivo no escuro.

(5) Estágio de indução após triagem: meio de cultura D + 6-BA (5 mg/L), em que a concentração de 2,4-D ou Dicamba foi diluída 5 vezes e sacarose 50 g/L, sem a adição de glicose + cef 1 ml/L; cultivo no escuro.

(6) Estágio de diferenciação: meio de cultura D, ainda sem a adição de qualquer hormônio; a concentração de sacarose foi de 30 mg/L, sem a adição de glicose, + cef 1 ml/L; cultivo com iluminação.

(7) Estágio de enraizamento: meio de cultura 1/2 MS.

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Transformação genética de linho falso (Camelina sativa) (por um método de gotejamento de flores)

1. Materiais e reagentes [00146] Camelina sativa; cepa de Agrobacterium: GV3101; plasmídeo (pCAMBIA2300-35S-HF) que era um vetor binário pCAMBIA2300 portador do gene HF e resistente a canamicina.

2. Transformação genética da Camelina sativa por um método de goteiamento de flores (1) Camelina sativa do tipo silvestre foi semeada em solo nutriente (húmus: vermiculita: perlita = 4 : 2 : 1), 5 grãos/vaso (diâmetro: 9 cm), e colocada em ambiente de cultivo para o cultivo. O ambiente de cultivo tinha a temperatura de 16 a 20°C e a umidade relativa de 60%. A intensidade de iluminação foi de 4000 1x. O período de iluminação foi de 16 h de iluminação/8 h de escuro. Quando o caule principal da planta Camelina sativa crescia para 5 cm e os ramos laterais eram apenas em forma de botão, as inflorescências superiores foram removidas para promover o crescimento e o desenvolvimento dos ramos secundários. Quando as plantas cresceram até o estágio de plena floração, elas foram preparadas para a transformação. 2 dias antes da transformação, as vagens de frutos formadas foram cortadas.

(2) Quando Agrobacterium GV3101 contendo o plasmídeo pCAMBIA2300-35S-HF foi cultivada até que o valor de OD600 fosse 0,8, foi infiltrada isometricamente no meio de cultura (1/2 MS, 5% sacarose, 200 μΙ/L Silwet L-77) para colocar novamente em suspensão as bactérias e transformar a Camelina sativa. Após a transformação, uma pipeta foi utilizada para sugar a suspensão de Agrobacterium para infiltração no meio de cultura e pingar nos botões florais de Camelina sativa, assegurando que cada botão floral fosse gotejado. Depois disso, películas conservantes foram utilizadas para cobrir as plantas transformadas para manter a umidade. As plantas ficavam de pé no escuro no

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48/48 ambiente de cultivo durante o cultivo de 1 dia, e depois eram cultivadas sob condições normais.

(3) Após o amadurecimento das plantas, as sementes foram coletadas e designadas como sementes de geração TO. 50 mg/L de canamicina foram utilizados para pesquisar as sementes de Camelina sativa de geração TO obtidas para obter plantas transgênicas positivas.

[00147] O rendimento e a biomassa das plantas transgênicas compreendendo o ácido nucleico que codifica a FTO obtida a partir dos modos acima e as plantas de controlo que não compreendem a FTO foram medidas. Os resultados são mostrados na tabela 2.

Tabela 2. Alterações do rendimento e da biomassa após o ácido nucleico que codifica a FTO ter sido introduzido em uma variedade de plantas

gene	Planta (Órgãos para a avaliação do rendimento)	Rendimento Vezes de aumento	Biomassa (peso fresco das partes acima do solo após a remoção das sementes) Vezes de aumento
FTO humana (SEQ ID NO: 5)	milho (semente)	4,12	2,81
soja (semente)	4,00	2,75
tabaco (folha)	3,65	2,54
batata (tubérculo)	3,83	2,61
alfalfa (caule e folha)	2,43	2,43
colza (semente)	4,21	2,94
Dente de leão russo (Taraxacum kok-saghyz) (solução de látex na raiz)	3,25	2,88
algodão (algodão em semente)	3,91	2,67
Trigo	3,78	2,58
painço (semente)	4,08	2,79
linho (para óleo) (semente)	3,77	2,58
girassol (semente)	3,88	2,69
linho falso (semente)	4,09	2,79

[00148] A partir da tabela 2, pode-se observar que após a introdução da FTO em uma variedade de plantas, o rendimento e a biomassa foram aumentados.

Claims

1. Planta transgênica na qual uma molécula de ácido nucleico que codifica uma desmetilase de m⁶A é introduzida, caracterizada pelo fato de que dita desmetilase de m⁶A possui os seguintes dois domínios:

2. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita desmetilase de m⁶A é a proteína FTO (massa gordurosa e associada com a obesidade).

3. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que dita proteína FTO é de vertebrados ou algas marinhas.

4. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que dita proteína FTO possui pelo menos 40%, preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 99%, o mais preferível 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 4.

5. Planta transgênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que dita molécula de ácido nucléico que codifica a desmetilase de m⁶A possui pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 99%, o mais preferível 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 12.

6. Planta transgênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que dita planta apre-

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2/4 senta uma biomassa aumentada, um rendimento aumentado ou a combinação quando comparada com uma planta de controle que não compreende a molécula de ácido nucléico que codifica a desmetilase de m⁶A.

7. Planta transgênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que dita planta é selecionada do grupo que consiste de arroz, milho (Zea mays), soja, tabaco, batata, alfafa (Medicago sativa), colza (Brassica), dente de leão russo (Taraxacum Kok-saghyz), algodão, trigo, painço (Panicum miliaceum), linho, girassol e linho falso (Camelina sativa).

8. Tecido, um órgão, um pólen, uma semente, um grão ou uma fruta da planta, caracterizado pelo fato de que é como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. Progênie de planta da planta, caracterizada pelo fato de que é como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

10. Célula vegetal na qual uma molécula de ácido nucleico que codifica uma desmetilase de m⁶A é introduzida, caracterizada pelo fato de que dita desmetilase de m⁶A possui os seguintes dois domínios:

11. Célula vegetal, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que dita desmetilase de m⁶A é a proteína FTO.

12. Célula vegetal, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que dita proteína FTO é de vertebrados ou algas marinhas.

13. Célula vegetal, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que dita proteína FTO possui pelo menos 40%, preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo me-

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3/4 nos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 99%, o mais preferível 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 4.

14. Célula vegetal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizada pelo fato de que dita molécula de ácido nucleico que codifica a desmetilase de m⁶A possui pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 99%, o mais preferível 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 12.

15. Método para a produção de uma planta transgênica que apresenta uma biomassa aumentada, um rendimento aumentado ou a combinação, caracterizado pelo fato de que dito método compreende:

a) introduzir uma molécula de ácido nucleico que codifica uma desmetilase de m⁶A em uma célula vegetal regenerável, em que dita desmetilase de m⁶A possui os seguintes dois domínios:

i) domínio N-terminal (NTD) tendo a função da desmetilase de oxidação de AlkB; e ii) domínio C-terminal (CTD); e

b) regenerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal regenerável, em que a planta transgênica compreende no seu genoma dita molécula de ácido nucleico que codifica a desmetilase de m⁶A, e apresenta uma biomassa aumentada, um rendimento aumentado ou a combinação quando comparada com uma planta de controle que não compreende a molécula de ácido nucleico que codifica a desmetilase de m⁶A.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que dito método ainda compreende:

c) obter uma planta progênie derivada da planta transgênica da etapa

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b), em que dita planta progênie compreende no seu genoma dita molécula de ácido nucleico que codifica a desmetilase de m⁶A, e apresenta uma biomassa aumentada, um rendimento aumentado ou a combinação quando comparada com um planta de controle que não compreende a molécula de ácido nucleico que codifica a desmetilase de m⁶A.

17. Método, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que dita desmetilase de m⁶A é a proteína FTO.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que dita proteína FTO é de vertebrados ou algas marinhas.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que dita proteína FTO possui pelo menos 40%, preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 99%, o mais preferível 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 4.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizado pelo fato de que dita molécula de ácido nucléico que codifica a desmetilase de m⁶A possui pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 99%, o mais preferível 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 12.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizado pelo fato de que dita planta é selecionada do grupo que consiste em arroz, milho (Zea mays), soja, tabaco, batata, alfafa (Medicago sativa), colza (Brassica), dente de leão russo (7araxacum Kok-saghyz), algodão, trigo, painço (Panicum miliaceum), linho, girassol e linho falso (Camelina sativa).