CN106800601A - 一种嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体包括铰链区，所述铰链区为IgG4‑CH3。本发明通过向CAR分子结构中引入IgG4‑CH3铰链区，在体外培养过程中能够特异性的提高CAR T细胞的扩增效率，且主要促进CD4+CAR T细胞的扩增，无需将CD4和CD8 T细胞分开单独培养，在混合体系中就能完成，增加了CD4+CAR T细胞的扩增效率。

Description

一种嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种嵌合抗原受体及其应用，具体为采用嵌合抗原受体扩增CAR T细胞的方法，一种新的增加CD4+CAR T细胞扩增的方法。
背景技术
近5年来，嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor,CAR)等过继性免疫疗法迅速的从基础科研阶段转化至临床试验，并在临床试验中展现出强大的肿瘤杀伤效果。CAR为能够特异性靶向肿瘤抗原的重组受体，一般由单链抗体可变区基因片段(Singlechain fragment variable，scFv)、铰链区(Hinge，H)、跨膜区、共刺激分子、CD3ζ链等元件组成。
目前为止，已发展出第四代CAR分子，由于普遍认为胞内的信号传导区域，尤其是共刺激分子是决定CAR T细胞杀伤和维持的重要元件，因此CAR分子的改造升级主要关注新的共刺激分子的发现和应用，而对于其他非信号传导区域的研究还甚少，例如对于铰链区的研究。为获得合适的共刺激信号来激活CAR T细胞，提高CAR T细胞的应答和体内维持时间，许多不同的共刺激分子被单独或者串联应用于CAR分子的改造升级过程，例如：CD28,41BB，OX40，ICOS，CD27等。
铰链区为位于scFv和T细胞膜之间的一段区域，铰链区通常来源于IgG家族，例如IgG1和IgG4，还有些来源于IgD和CD8，其中IgG1来源的铰链使用最为广泛。目前对于铰链区的研究和发现主要集中于以下四点：1.增强scFv区域的灵活性，从而降低CAR分子与其特异性靶点之间的空间约束，进而促进CAR T细胞与肿瘤细胞之间的突触形成。例如为了克服空间约束和增强scFv的灵活性，MUC1特异性CAR分子中就引入了一个来源于IgD的铰链区。2.拉近scFv与其靶向表位之间的距离，从促进突触的形成。例如，CD22特异性CAR分子就需要一个铰链区拉近与肿瘤细胞的距离才能够发挥最优的杀伤效果。3.通过检测铰链区的表达水平来反映CAR分子的表达水平，从而方便CAR分子表达水平的监测。然而，关于铰链区对于CAR T细胞扩增影响的研究却还没有。
尽管CAR T细胞在临床试验中取得了惊人的疗效，但仍然存在很多的阻碍。例如，CAR T细胞的扩增效率还有待提高，特别是CD4+的CAR T细胞。通常的体外培养体系中，CD8T细胞具有明显的生长优势，因此培养结束时主要获得的为CD8 T细胞，CD4 T细胞百分比极低。最近，研究发现CAR T细胞中CD4和CD8 T细胞的比例对于CAR T细胞的抗肿瘤活性有很大的影响，CAR T细胞中CD4 T细胞的比例与CAR T细胞的治疗效果成正相关，因此为了获得大量的CD4 CAR T细胞，就需要在体外培养过程中，首先分选出CD4和CD8 CAR T细胞，然后再通过不同的细胞因子组合分别扩增CD4和CD8 CAR T细胞，这无疑增加了巨大的劳动力和成本。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种嵌合抗原受体及其应用，通过向CAR分子结构中引入IgG4-CH3铰链区，在体外培养过程中能够特异性的提高CAR T细胞的扩增效率，主要促进CD4+ CAR T细胞的扩增，无需将CD4和CD8 T细胞分开单独培养，在混合体系中就能完成，增加了CD4+ CAR T细胞的扩增效率。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括铰链区，所述铰链区为IgG4-CH3。
发明人意外发现，当嵌合抗原受体带上了IgG4-CH3铰链区会促进CAR T细胞数量的增长，尤其是CD4+的CAR T细胞增长明显，增长数量的倍数相比于没有带上这个铰链区的CAR T细胞倍数的1.5-2倍。
根据本发明，所述铰链区的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1所述的核酸序列如下：
Ggcggaggtagctctggcggtggatccggcgggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa.
根据本发明，所述嵌合抗原受体还包括信号肽、抗原识别区、跨膜区和胞内区。
优选地，所述信号肽为GM-CSF信号肽，所述GM-CSF信号肽的核酸序列如SEQ IDNO.2所示。
SEQ ID NO.2所述的核酸序列如下：
Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatccca.
优选地，所述抗原识别区为抗CD19抗体、抗Meso抗体或抗PSCA抗体中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述抗CD19抗体的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.3所述的核酸序列如下：
Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgc.
优选地，所述抗Meso抗体的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.4所述的核酸序列如下：
Tagaattcctgaggagacggtgaccgtggtcccttggccccagacgtccataccgtaatagtaagtcatcattcctcttgcacagtaatacacagccgtgtcctcgggagtcacagagttcagctgcagggagaactggttcttggatgtgtctgggttgatgctcattcgacttttcacagatactgcatagtcgttataccacttggacctgtagtatgtccttcccagccactcaaggcctctcgatggggactgcctgatccagttccaagtagcactgttgctagagacactgtccccggagatggcacaggtgagtgagagggtctgcgagggcgtcacgagtcctggacctgactgctgcagctgtacctggctggatccggtggcggtggcagcggcggtggtggttccggaggcggcggttctcagcctgtgctgactcagtcgtcttccctctctgcatctcctggagcatcagccagtctcacctgcaccttgcgcagtggcatcaatgttggtccctacaggatatactggtaccagcagaagccagggagtcctccccagtatctcctgaactacaaatcagactcagataagcagcagggctctggagtccccagccgcttctctggatccaaagatgcttcggccaatgcaggggttttactcatctctgggctccggtctgaggatgaggctgactattactgtatgatttggcacagcagcgctgctgtgttcggaggaggcacccaactgaccgtcctctccggaattctagaacaacagggt.
优选地，所述抗PSCA抗体的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。
SEQ ID NO.5所述的核酸序列如下：
Gacattcagctgacccaatctccaagctctttgtccgcctctgtgggggatagggtcaccatcacctgcagtgccagttcaagtgtaagattcattcactggtaccagcagaaaccaggaaaagctcccaaaagactcatctatgacacatccaaactggcttctggcgtcccttctaggttcagtggctccgggtctgggacagacttcaccctcaccattagcagtctgcagccggaagatttcgccacctattactgtcagcagtggagtagtagcccattcacgttcggacaggggaccaaggtggagataaaaggcagtactagcggcggtggctccggaggcggctccggaggtggcggcagctcagaggttcagctggtggagtctgggggtggccttgtgcagccagggggctcactccgtttgtcctgcgcagcttctggcttcaacattaaagactactatatacactgggtgcgtcaggcccctggtaagggcctggaatgggttgcatggattgatcctgagaatggtgacactgaatttgtcccgaagttccagggccgtgccactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctgcagatgaacagcctgcgtgctgaggacactgccgtctattattgtaaaacgggggggttctggggtcaaggaaccctggtcaccgtctcgagcgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgc.
优选地，所述的跨膜区为人CD28跨膜区，所述人CD28跨膜区的核酸序列如SEQ IDNO.6所示。
SEQ ID NO.6所述的核酸序列如下：
Attgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc.
优选地，所述胞内区为人CD3ζ胞内结构域，所述人CD3ζ胞内结构域的核酸序列如SEQ ID NO.7所示。
SEQ ID NO.7所述的核酸序列如下：
Agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc.
优选地，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、抗CD19抗体、抗PSCA抗体或抗Meso抗体中的任意一种抗体、人CD28跨膜区和人CD3ζ胞内结构域串联构成的嵌合抗原受体。
本发明中，所述铰链区特异性地针对这三种嵌合抗原受体的CAR T细胞的数量增长效果更好，CAR T细胞的细胞数量增长明显，CD4+的CAR T细胞数量显著增长。
第二方面，本发明提供一种重组慢病毒，将包含如第一方面所述的嵌合抗原受体的病毒载体与包装辅助质粒pMD2.G和psPAX2共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。
第三方面，本发明提供一种嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞通过将如第二方面所述的重组慢病毒转染到T细胞中表达。
优选地，所述T细胞为CD4+ T细胞和其他T细胞的组合；
优选地，所述其他T细胞为CD3+ T细胞和/或CD8+ T细胞。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的嵌合抗原受体、如第二方面所述的重组慢病毒用于扩增CAR T细胞。
优选地，所述如第一方面所述的嵌合抗原受体、如第二方面所述的重组慢病毒用于扩增CD4的CAR T细胞。
本发明中，所述嵌合抗原受体可以明显促进CAR T细胞的扩增，其作为一种新的CAR T细胞扩增的方法，可以克服体外培养体系中，CD8 T细胞具有明显的生长优势，培养结束后主要获得的为CD8 T细胞，CD4 T细胞百分比极低的问题，也避免了分选出CD4和CD8CAR T细胞的步骤，可以直接用于扩增CAR T细胞，CAR T细胞数量增长明显，尤其是CD4+的CAR T细胞增长尤其显著。
所述嵌合抗原受体包括铰链区，所述铰链区为IgG4-CH3。
根据本发明，所述铰链区的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1所述的核酸序列如下：
Ggcggaggtagctctggcggtggatccggcgggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa.
根据本发明，所述嵌合抗原受体还包括信号肽、抗原识别区、跨膜区和胞内区。
优选地，所述信号肽为GM-CSF信号肽，所述GM-CSF信号肽的核酸序列如SEQ IDNO.2所示。
SEQ ID NO.2所述的核酸序列如下：
Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatccca.
优选地，所述抗原识别区为抗CD19抗体、抗Meso抗体或抗PSCA抗体中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述抗CD19抗体的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.3所述的核酸序列如下：
Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgc.
优选地，所述抗Meso抗体的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.4所述的核酸序列如下：
Tagaattcctgaggagacggtgaccgtggtcccttggccccagacgtccataccgtaatagtaagtcatcattcctcttgcacagtaatacacagccgtgtcctcgggagtcacagagttcagctgcagggagaactggttcttggatgtgtctgggttgatgctcattcgacttttcacagatactgcatagtcgttataccacttggacctgtagtatgtccttcccagccactcaaggcctctcgatggggactgcctgatccagttccaagtagcactgttgctagagacactgtccccggagatggcacaggtgagtgagagggtctgcgagggcgtcacgagtcctggacctgactgctgcagctgtacctggctggatccggtggcggtggcagcggcggtggtggttccggaggcggcggttctcagcctgtgctgactcagtcgtcttccctctctgcatctcctggagcatcagccagtctcacctgcaccttgcgcagtggcatcaatgttggtccctacaggatatactggtaccagcagaagccagggagtcctccccagtatctcctgaactacaaatcagactcagataagcagcagggctctggagtccccagccgcttctctggatccaaagatgcttcggccaatgcaggggttttactcatctctgggctccggtctgaggatgaggctgactattactgtatgatttggcacagcagcgctgctgtgttcggaggaggcacccaactgaccgtcctctccggaattctagaacaacagggt.
优选地，所述抗PSCA抗体的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。
SEQ ID NO.5所述的核酸序列如下：
Gacattcagctgacccaatctccaagctctttgtccgcctctgtgggggatagggtcaccatcacctgcagtgccagttcaagtgtaagattcattcactggtaccagcagaaaccaggaaaagctcccaaaagactcatctatgacacatccaaactggcttctggcgtcccttctaggttcagtggctccgggtctgggacagacttcaccctcaccattagcagtctgcagccggaagatttcgccacctattactgtcagcagtggagtagtagcccattcacgttcggacaggggaccaaggtggagataaaaggcagtactagcggcggtggctccggaggcggctccggaggtggcggcagctcagaggttcagctggtggagtctgggggtggccttgtgcagccagggggctcactccgtttgtcctgcgcagcttctggcttcaacattaaagactactatatacactgggtgcgtcaggcccctggtaagggcctggaatgggttgcatggattgatcctgagaatggtgacactgaatttgtcccgaagttccagggccgtgccactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctgcagatgaacagcctgcgtgctgaggacactgccgtctattattgtaaaacgggggggttctggggtcaaggaaccctggtcaccgtctcgagcgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgc.
优选地，所述的跨膜区为人CD28跨膜区，所述人CD28跨膜区的核酸序列如SEQ IDNO.6所示。
SEQ ID NO.6所述的核酸序列如下：
Attgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc.
优选地，所述胞内区为人CD3ζ胞内结构域，所述人CD3ζ胞内结构域的核酸序列如SEQ ID NO.7所示。
SEQ ID NO.7所述的核酸序列如下：
Agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc.
优选地，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、抗CD19抗体、抗PSCA抗体或抗Meso抗体中的任意一种抗体、人CD28跨膜区和人CD3ζ胞内结构域串联构成的嵌合抗原受体。
本发明中，所述铰链区特异性地针对这三种嵌合抗原受体的CAR T细胞的数量增长效果更好，CAR T细胞的细胞数量增长明显，CD4+的CAR T细胞数量显著增长。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过向CAR分子结构中引入IgG4-CH3铰链区，在体外培养过程中能够特异性的提高CAR T细胞的扩增效率，且主要促进CD4+ CAR T细胞的扩增，无需将CD4和CD8 T细胞分开单独培养，在混合体系中就能完成，增加了CD4+ CAR T细胞的扩增效率；
(2)发明人意外发现，当嵌合抗原受体带上了IgG4-CH3铰链区会促进CAR T细胞数量的增长，尤其是CD4+的CAR T细胞增长明显，增长数量的倍数相比于没有带上这个铰链区的CAR T细胞倍数的1.5-2倍。
附图说明
图1为本发明的嵌合抗原受体的合成基因序列图谱；
图2为本发明流式检测不同培养时间点的CD3和GFP双阳性的T细胞；
图3为本发明IgG-CH3铰链的引入能够促进CD19特异性CAR T细胞的体外扩增，其中，图3(A)为CAR T细胞比例，图3(B)为CAR T细胞数量；
图4为本发明IgG-CH3铰链的引入主要促进CD4+ CD19特异性CAR T细胞的扩增，其中，图4(A)为19-.28zT中的CD8+的CAR T和CD4+的CAR T细胞比例，图4(B)为19-H.28zT中的CD8+的CAR T和CD4+的CAR T细胞比例；
图5为本发明IgG-CH3铰链的引入能够促进Mesothelin特异性CAR T细胞的体外扩增，其中，图5(A)为CAR T细胞比例，图5(B)为CAR T细胞数量；
图6为本发明IgG-CH3铰链的引入主要促进CD4+ Mesothelin特异性CAR T细胞的扩增，其中，图6(A)为Meso.28zT中的CD8+的CAR T和CD4+的CAR T细胞比例，图6(B)为Meso-H.28zT中的CD8+的CAR T和CD4+的CAR T细胞比例；
图7为本发明IgG-CH3铰链的引入能够促进PSCA特异性CAR T细胞的体外扩增，其中，图7(A)为CAR T细胞比例，图7(B)为CAR T细胞数量；
图8为本发明IgG-CH3铰链的引入主要促进CD4+ PSCA特异性CAR T细胞的扩增，其中，图8(A)为PSCA.28zT中的CD8+的CAR T和CD4+的CAR T细胞比例，图8(B)为PSCA-H.28zT中的CD8+的CAR T和CD4+的CAR T细胞比例。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1：嵌合抗原受体的构建
(1)通过全基因合成含有IgG4-CH3铰链区的19-H.28z、Meso-H.28z、PSCA-H.28z以及不含有铰链区的19.28z、Meso.28z、PSCA.28z CAR分子序列，合成基因的C端含限制性内切酶PmeⅠ的酶切位点，N端含限制性内切酶SpeⅠ的酶切位点，CAR分子全长基因图谱如图1所示；
所述IgG4-CH3铰链区的核酸序列如SEQ ID NO.1所示：
Ggcggaggtagctctggcggtggatccggcgggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa.
所述GM-CSF信号肽的核酸序列如SEQ ID NO.2所示：
Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatccca.
所述抗CD19抗体的核酸序列如SEQ ID NO.3所示：
Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgc.
所述抗Meso抗体的核酸序列如SEQ ID NO.4所示：
Tagaattcctgaggagacggtgaccgtggtcccttggccccagacgtccataccgtaatagtaagtcatcattcctcttgcacagtaatacacagccgtgtcctcgggagtcacagagttcagctgcagggagaactggttcttggatgtgtctgggttgatgctcattcgacttttcacagatactgcatagtcgttataccacttggacctgtagtatgtccttcccagccactcaaggcctctcgatggggactgcctgatccagttccaagtagcactgttgctagagacactgtccccggagatggcacaggtgagtgagagggtctgcgagggcgtcacgagtcctggacctgactgctgcagctgtacctggctggatccggtggcggtggcagcggcggtggtggttccggaggcggcggttctcagcctgtgctgactcagtcgtcttccctctctgcatctcctggagcatcagccagtctcacctgcaccttgcgcagtggcatcaatgttggtccctacaggatatactggtaccagcagaagccagggagtcctccccagtatctcctgaactacaaatcagactcagataagcagcagggctctggagtccccagccgcttctctggatccaaagatgcttcggccaatgcaggggttttactcatctctgggctccggtctgaggatgaggctgactattactgtatgatttggcacagcagcgctgctgtgttcggaggaggcacccaactgaccgtcctctccggaattctagaacaacagggt.
所述抗PSCA抗体的核酸序列如SEQ ID NO.5所示：
Gacattcagctgacccaatctccaagctctttgtccgcctctgtgggggatagggtcaccatcacctgcagtgccagttcaagtgtaagattcattcactggtaccagcagaaaccaggaaaagctcccaaaagactcatctatgacacatccaaactggcttctggcgtcccttctaggttcagtggctccgggtctgggacagacttcaccctcaccattagcagtctgcagccggaagatttcgccacctattactgtcagcagtggagtagtagcccattcacgttcggacaggggaccaaggtggagataaaaggcagtactagcggcggtggctccggaggcggctccggaggtggcggcagctcagaggttcagctggtggagtctgggggtggccttgtgcagccagggggctcactccgtttgtcctgcgcagcttctggcttcaacattaaagactactatatacactgggtgcgtcaggcccctggtaagggcctggaatgggttgcatggattgatcctgagaatggtgacactgaatttgtcccgaagttccagggccgtgccactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctgcagatgaacagcctgcgtgctgaggacactgccgtctattattgtaaaacgggggggttctggggtcaaggaaccctggtcaccgtctcgagcgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgc.
所述人CD28跨膜区的核酸序列如SEQ ID NO.6所示：
Attgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc.
所述人CD3ζ胞内结构域的核酸序列如SEQ ID NO.7所示：Agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc.
(2)通过限制性内切酶PmeⅠ和SpeⅠ双酶切慢病毒表达载体pwpxld-eGFP以及合成的CAR分子片段：19-H.28z、Meso-H.28z、PSCA-H.28z、19.28z、Meso.28z、PSCA.28z；
(3)通过琼脂凝胶电泳回收含有粘性末端的目的基因：19-H.28z、Meso-H.28z、PSCA-H.28z、19.28z、Meso.28z、PSCA.28z和线性化的表达载体pwpxld-EGFP；
(4)通过T4DNA连接酶(Invitrogent公司)，将CAR分子DNA片段连接至pwpxld-eGFP表达载体中，转化至Top10感受态细胞中，挑取阳性质粒，最终获得CAR分子的慢病毒表达载体：pwpxld-19.28z-eGFP、pwpxld-19-H.28z-eGFP、pwpxld-Meso.28z-eGFP、pwpxld-Meso-H.28z-eGFP、pwpxld-PSCA.28z-eGFP、pwpxld-PSCA-H.28z-eGFP。
实施例2：慢病毒包装
当细胞铺满100mm培养皿板底80-90％时，进行慢病毒包装：
(1)病毒包装前2h，培养基更换为含有1％胎牛血清的DMEM，每个培养皿5mL/100mm；
(2)每个100mm培养皿的293T细胞需加入的包装质粒如下：
试剂 剂量
pWPXLd-CAR-eGFP质粒 4.5μg
pMD2.G辅助质粒 1.5μg
psPAX2 6μg
质粒加入至500μL opti-MEM培养基内，混匀；
其中，pWPXLd-CAR-eGFP质粒包括：pwpxld-19.28z-eGFP、pwpxld-19-H.28z-eGFP、pwpxld-Meso.28z-eGFP、pwpxld-Meso-H.28z-eGFP、pwpxld-PSCA.28z-eGFP、pwpxld-PSCA-H.28z-eGFP；
(3)36μg PEI加入至另一500μL opti-MEM培养基内，混匀，室温静置5min；
(4)将质粒与PEI混合，吹打混匀，室温静置25-30min；
(5)将1mL混合物均匀加入至1个100mm dish的293T细胞上；
(6)包装后6h更换培养基(含有1％胎牛血清的DMEM)，6mL/100mm培养皿；
(7)病毒包装后24h、48h、72h收取病毒上清，并补加6mL新鲜培养基；
(8)1000g离心10min，0.45um滤器过滤，4℃保存待用。
实施例3：CAR T细胞的构建
(1)人体T细胞的分离纯化：采用Ficoll(GE公司)密度梯度离心法从全血中分离外周血单个核细胞(PBMC)；PBMC再经T细胞磁珠分选试剂盒(美天旎公司)分选出T细胞；T细胞采用T细胞活化试剂盒(美天旎公司)激活72h；
(2)慢病毒转染T细胞：T细胞激活后72h，去磁珠，用含10％胎牛血清，300IU/mLIL2，的1640培养基重悬细胞，加入实施例2制备的病毒上清，每106细胞加入1mL病毒上清，聚凝胺8μg/mL，于37℃，5％CO2培养箱培养12h后，用含300IU/mL IL-2的新鲜培养基重悬，每106个细胞加入1mL培养基。
实施例4：CAR T(19-H.28z T和19.28z T)细胞的扩增培养
CAR T细胞体外扩增培养过程中，细胞密度需维持在0.5-1×106个/ml培养基，每2天补充一次新鲜培养基，调整细胞密度。每2-3天进行一次细胞计数，同时采用流式检测CART细胞百分比，CAR分子后带有GFP标签，因此流式检测GFP百分比即可代表CAR T细胞百分比，同时检测CD3、CD4、CD8直到体外培养结束，一般15-20天。
19-H.28z T和19.28z T细胞培养的结果如图2，图3(A)-图3(B)和图4(A)-图4(B)所示，可以看出，从图2显示19-H.28z T细胞百分比由3％上升至40.7％，19.28z T细胞百分比由8％培养后为7.4％，从图3(A)-图3(B)显示，19.28z T细胞与GFP T细胞的细胞数量恒定，19-H.28z T细胞扩增细胞数约为19.28z T细胞的2倍，从图4(A)-图4(B)显示，19-H.28zT细胞增加的主要是CD4+ CAR T细胞，而19.28z T细胞中的CD4+和CD8+ CAR T细胞在整个培养过程中保持稳定。
实施例5：CAR T(Meso-H.28z T和Meso.28z T)细胞的扩增培养
CAR T细胞体外扩增培养过程中，细胞密度需维持在0.5-1×106个/ml培养基，每2天补充一次新鲜培养基，调整细胞密度。每2-3天进行一次细胞计数，同时采用流式检测CART细胞百分比，CAR分子后带有GFP标签，因此流式检测GFP百分比即可代表CAR T细胞百分比，同时检测CD3、CD4、CD8直到体外培养结束，一般15-20天。
Meso-H.28z T和Meso.28z T细胞培养的结果如图2，图5(A)-图5(B)和图6(A)-图6(B)所示，可以看出，从图2显示Meso-H.28z T细胞百分比由34％上升至74.3％，Meso.28z T细胞百分比由33.1％培养后为34.9％，从图5(A)-图5(B)显示，Meso.28z T细胞与GFP T细胞的细胞数量恒定，Meso-H.28z T T细胞扩增细胞数约为Meso.28z T细胞的1.5倍，从图6(A)-图6(B)显示，Meso-H.28z T细胞增加的主要是CD4+ CAR T细胞，而Meso.28z T细胞中的CD4+和CD8+ CAR T细胞在整个培养过程中保持稳定。
实施例6：CAR T(PSCA-H.28z T和PSCA.28z T)细胞的扩增培养
CAR T细胞体外扩增培养过程中，细胞密度需维持在0.5-1×106个/ml培养基，每2天补充一次新鲜培养基，调整细胞密度。每2-3天进行一次细胞计数，同时采用流式检测CART细胞百分比，CAR分子后带有GFP标签，因此流式检测GFP百分比即可代表CAR T细胞百分比，同时检测CD3、CD4、CD8直到体外培养结束，一般15-20天。
PSCA-H.28z T和PSCA.28z T细胞培养的结果如图2，图7(A)-图7(B)和图8(A)-图8(B)所示，可以看出，从图2显示PSCA-H.28z T细胞百分比由4.7％上升至31.1％，PSCA.28zT细胞百分比由3.4％培养后为3.8％，从图7(A)-图7(B)显示，PSCA.28z T细胞与GFP T细胞的细胞数量恒定，PSCA-H.28z T细胞扩增细胞数约为19.28z T细胞的2倍，从图8(A)-图8(B)显示，PSCA-H.28z T细胞增加的主要是CD4+ CAR T细胞，而PSCA.28z T细胞中的CD4+和CD8+ CAR T细胞在整个培养过程中保持稳定。
综上所述，本发明通过向CAR分子结构中引入IgG4-CH3铰链区，在体外培养过程中能够特异性的提高CAR T细胞的扩增效率，且主要促进CD4+ CAR T细胞的扩增，无需将CD4和CD8 T细胞分开单独培养，在混合体系中就能完成，增加了CD4+ CAR T细胞的扩增效率，提供一种新的增加CD4+ CAR T细胞扩增的方法。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东昭泰体内生物医药科技有限公司
<120> 一种嵌合抗原受体及其应用
<130> 2017
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工合成序列
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ggcggaggta gctctggcgg tggatccggc gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 60
ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 120
ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 180
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 240
accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 300
gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 351
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atccca 66
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gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg gtatcagcag 180
aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc 240
ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 300
gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc 360
ggagggggga ctaagttgga aataacaggc tccacctctg gatccggcaa gcccggatct 420
ggcgagggat ccaccaaggg cgaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg 480
ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc cgactatggt 540
gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag ggtctggagt ggctgggagt aatatggggt 600
agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat caaggacaac 660
tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccatttac 720
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tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 180
tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 240
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gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

Claims (9)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括铰链区，所述铰链区为IgG4-CH3。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区的核酸序列如SEQ IDNO.1所示。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括信号肽、抗原识别区、跨膜区和胞内区；
优选地，所述信号肽为GM-CSF信号肽；
优选地，所述GM-CSF信号肽的核酸序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，所述抗原识别区为抗CD19抗体、抗Meso抗体或抗PSCA抗体中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述抗CD19抗体的核酸序列如SEQ ID NO.3所示；
优选地，所述抗Meso抗体的核酸序列如SEQ ID NO.4所示；
优选地，所述抗PSCA抗体的核酸序列如SEQ ID NO.5所示；
优选地，所述的跨膜区为人CD28跨膜区；
优选地，所述人CD28跨膜区的核酸序列如SEQ ID NO.6所示；
优选地，所述胞内区为人CD3ζ胞内结构域；
优选地，所述人CD3ζ胞内结构域的核酸序列如SEQ ID NO.7所示。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、抗CD19抗体、抗PSCA抗体或抗Meso抗体中的任意一种抗体、人CD28跨膜区和人CD3ζ胞内结构域串联构成的嵌合抗原受体。
5.一种重组慢病毒，其特征在于，将包含如权利要求1-4中任一项所述的嵌合抗原受体的病毒载体与包装辅助质粒pMD2.G和psPAX2共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。
6.一种嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞通过将如权利要求5所述的重组慢病毒转染到T细胞中表达。
7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述T细胞为CD4+T细胞和其他T细胞的组合；
优选地，所述其他T细胞为CD3+T细胞和/或CD8+T细胞。
8.一种如权利1-4中任一项所述的嵌合抗原受体、如权利要求5所述的重组慢病毒用于扩增CAR T细胞。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述权利1-4中任一项所述的嵌合抗原受体、如权利要求5所述的重组慢病毒用于扩增CD4的CAR T细胞。
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