KR20070111920A - 인간 에리트로포이에틴 호르몬과 인간 면역글로불린 Ｆｃ융합을 통한 에리트로포이에틴을 대량으로 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 조혈 호르몬인 에리트로포이에틴을 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 최적화된 코돈으로 이루어진 인간 에리트로포이에틴 유전자와 최적화된 코돈으로 이루어진 인간 면역글로불린의 Fc의 유전자가 융합된 유전자를 포함하는 발현벡터, 이를 도입한 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 인간 에리트로포이에틴을 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 발현벡터 및 형질전환체를 이용하면 인간 에리트로포이에틴 호르몬을 대량으로 생산할 수 있어 유용하게 사용될 수 있다.

에리트로포이에틴, 면역글로불린, 융합

Description

인간 에리트로포이에틴 호르몬과 인간 면역글로불린 Ｆｃ 융합을 통한 에리트로포이에틴을 대량으로 생산하는 방법{Method for mass production of human EPO by EPO-Fc fusion}

도 1은 본 발명의 최적화된 코돈으로 이루어진 EPO의 염기서열과 야생형 EPO의 염기서열의 비교에 관한 것이다.

도 2는 본 발명의 최적화된 코돈으로 이루어진 인간 면역글로불린 IgG1의 염기서열과 야생형 IgG1의 염기서열의 비교에 관한 것이다.

도 3은 본 발명의 EPO-Fc 발현 벡터 모식도에 관한 것이다.

도 4는 본 발명의 발현벡터에 의해 발현되는 EPO-Fc 융합단백질의 발현을 효소면역측정법으로 확인한 것이다.

도 5는 본 발명의 발현벡터에서 발현되는 EPO-Fc 융합단백질의 in vivo 생활성을 확인한 것이다.

도 6은 본 발명의 발현벡터에서 발현되는 EPO-Fc 융합단백질의 약동학을 확인한 것이다.

에리트로포이에틴(Erythropoietin, EPO)은 신장에서 생성 분비되는 조혈호르몬으로서, 적혈구계의 세포에 특이적으로 작용하며, 골수 중의 적아구계 전구세포의 분화와 증식을 조절하는 순환 당단백질이다(Carnot 등,Compt. Rend., 143:384, 1906). 에리트로포이에틴은 주로 태아의 간이나 성인의 신장에서 생산되며 혈중 저산소 상태에서 생성이 증가하여 적혈구 세포의 생산을 조절한다. 천연형 인간 EPO는 단일형(monomer)의 산성 당단백질(acid glycoprotein)로서 전체 분자량이 약 34 kDa 정도이며, 당을 제외한 단백질 분자량은 약 18 kDa이다. 또한, 아미노산 Asn 24, Asn 38 및 Asn 83의 위치에 3개의 N-결합 당쇄와 Ser 126 위치에 하나의 뮤신형(mucin-type) O-결합 당쇄를 포함하며, 이 같은 당쇄부분은 생체 활성에 필수적인 역할을 하므로, EPO의 당함량이 감소하면 이의 생물학적 반감기가 급격히 감소되어 생물학적 활성을 소실하게 된다.

정상인의 경우에 EPO는 혈액 1 ㎖당 약 15 내지 30 ｍU, 즉 0.01 mM 수준으로 유지되지만(Gaarcia, J.F., Lab. Clin.Med., 99, 624-635, 1982), 재생 불량성 빈혈 등과 같은 질병을 앓고 있는 환자에서는 정상인보다 높은 농도의 EPO가 생성되므로 이들의 혈액이나 뇨에서 EPO를 분리 생산하기도 한다(White et al., Rec. Progr. Horm. Res., 16, 219, 1960;Espada et al., Biochem. Med., 3, 475, 1970; Fisher, Pharmacol. Rev., 24, 459, 1972). 그러나, 이러한 방법은 EPO를 대량생산하기 위한 원료의 공급이 제한되어 있고, 정상인의 뇨에서는 EPO의 농도가 낮을 뿐 만 아니라 활성 저해제가 있어 이를 제거하기 위해 고도의 정제 기술이 요구된다는 단점이 있다(미국특허 제 4,397,840 호, 제 4,303,650 호 및 제3,865,810 호). 또한, 양의 혈장에서 EPO를 추출하는 방법이 개발되었으나, 양의 EPO가 사람에게 항원으로 작용할 수 있다는 단점이 있는 것으로 알려져 있다(Goldwasser, Control cell. Dif. Develop., Part A, 487-494, 1981).

수기모토(Sugimoto) 등은 나말바(Namalva), BALL-1, NALL-1, TALL-1 및 JBL을 포함한 인간 임파구를 동물 체내에서 증식시킴으로써 EPO를 생산하는 방법을 보고한바 있으나(미국특허 제 4,377,513 호), 이 방법은 인간 종양세포를 사용하므로 안전성 확보를 위한 연구가 요구된다.

또한, 사람의 EPO 유전자를 클로닝하는 유전자재조합 기술을 이용하여 동물세포(대한민국 특허공고 제89-1011 호 및 제 93-5917 호) 및 효모 또는 곤충세포(대한민국 특허공개 제 95-5988 호)에서 발현시키는 방법들이 개발되었다. 그러나, 효모 또는 곤충세포는 주로 고 만노즈형(high mannose type)의 당단백질을 생성하고 당화능이 낮아서 인간 EPO와 같은 복합형(complex type)의 당단백질을 생성하지 못하며, 이 같은 형태로 생성된 당쇄구조는 인체 내에서 항원성을 유발시킬 위험이 있으므로 인간 EPO를 발현시키기 위한 숙주세포로는 적절하지 못하다. 또한 동물세포를 이용하여 인간 EPO를 제조하면 천연형과 가장 유사한 EPO를 생산할 수 있으나 발현율이 매우 낮으며, 생산비용이 고가인 단점이 있다.

이에 본 발명자는 인간 EPO 유전자 및/또는 인간 면역글로불린 Fc 유전자의 염기서열의 코돈을 최적화하여 이들 유전자가 인프레임(in frame) 상에서 발현되도 록 융합된 융합 유전자가 동물세포에서 고효율로 EPO 당단백질을 발현할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다. 특히, 인간 EPO 및 인간 면역글로불린 Fc 유전자 모두의 염기서열의 코돈이 최적화된 이들 유전자의 융합유전자를 사용함으로써 유전자 발현레벨을 증가시킬 수 있음을 발견하였다. 또한, 발현율 증가를 위하여 효율적인 발현벡터를 개발하여 고효율의 EPO-Fc 발현벡터를 당화 능력이 뛰어난 숙주세포에 형질도입함으로써, 활성을 지니고 있는 EPO-Fc 융합단백질을 안정적으로 대량 생산할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 동물 세포에서 인간 EPO 당단백질을 고효율로 발현하는 인간 EPO 유전자 및 인간 면역글로불린 Fc 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 벡터를 형질도입한 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 인간 EPO-Fc 융합단백질을 대량으로 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 특히, 인간 EPO 유전자 및 인간 면역글로불린 Fc 유전자 중 적어도 하나의 염기서열의 코돈이 최적화된 이들 유전자의 융합 유전자를 포함하는, 동물세포에서 인간 EPO 당단백질을 고효율로 발현하는 재조합 발현 벡터, 상기 벡터를 형질도입한 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 인간 EPO-Fc 융합단백질을 대량으로 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 Fc 유전자와 인간 EPO 유전자를 포함하는 발현벡터에서, Fc 유전자의 염기서열이 코돈 최적화뿐만 아니라 Fc 수용체 및/또는 보체와의 결합에 필수적인 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하도록 염기서열이 더욱 변형된 인간 면역글로불린 Fc 유전자와 인간 EPO 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 벡터를 형질도입한 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 인간 EPO-Fc 융합단백질을 대량으로 생산하는 방법, 및 상기 방법에 따라 제조되는 인간 EPO-Fc 융합단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 고효율로 발현되는 인간 EPO-Fc 융합단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 EPO 단백질의 C 말단이 면역글로불린의 Fc의 N 말단과 펩타이드 결합으로 연결된 EPO-Fc 융합 단백질 및 이를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "융합단백질" 이란 상이한 2 개 이상의 폴리펩타이드가 펩타이드 결합(peptide bond)을 통하여 한가닥의 폴리펩타이드로 연결된 단백질을 의미하며, 유전자 수준에서의 재조합으로 하나의 폴리펩타이드로 번역되게 하는 방법으로 용이하게 제작될 수 있다.　 본 발명에서 EPO 단백질의 C 말단은 면역글로불린의 Fc의 N 말단과 펩타이드 결합으로 연결된 형태인 융합단백질이다.

본 발명의 EPO-Fc 융합 단백질은 1 내지 20 아미노산 길이를 가지는 펩타이드 링커를 통하여 연결될 수 있다. EPO-Fc 융합 단백질은 Fc로 융합되지 않은 EPO에 비하여 생체내 안정성 및 대사속도가 개선되었다. 호르몬은 생체내에서 짧은 활 성 유지 시간을 가지고 있는 한계점이 있으나, EPO를 Fc와 융합시킴으로써 이런 문제점을 해결할 수 있었다.

본 발명에서 제공하는 EPO는 이와 동일한 기능을 가지는 동족체를 가지는 모든 동물 유래일 수 있다. 치료하고자 하는 개체에 따라, EPO의 기원은 적합하게 선택될 수 있다. 바람직하게는 인간 유래의 EPO이다.

EPO 단백질과 융합될 수 있는 Fc 는 인간, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체일 수 있다.　 바람직하게는 인간의 IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD에서 유래한 Fc, 더욱 바람직하게는 인간의 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 에서 유래한 Fc이다.

본 발명의 융합단백질에 제공되는 Fc는 힌지 영역을 포함하지 않을 수도 있으나 바람직하게는 힌지영역을 포함한다. 전체 힌지 영역을 포함할 수도 있고, 하나 이상의 시스테인을 포함하는 힌지 영역의 단편 형태일 수도 있다. 또한 neonatal Fc receptor (FcRn)에 결합하는 CH2-CH3 영역을 포함한다. 본 발명의 바람직한 양태에서 융합단백질에 제공되는 Fc는 Fc 수용체 결합에 중요한 한 아미노산이 치환(Leu 235-Glu 235)되어 있으며, 보체 결합에 중요한 3개의 아미노산이 치환 (Glu 318-Ala, Lys 320-Ala, Lys 322-Ala)되어 있다.

본 발명의 EPO-Fc 융합 단백질은 단량체 또는 힌지영역의 시스테인에 의해 디설피드 결합을 형성한 이량체 형태일 수 있다. 상기 단량체 또는 이량체의 EPO-Fc 융합 단백질은 적혈구 형성 이상 질환은 물론 투석(dialysis)과 항암 화학 요법 에 의한 빈혈증 치료에 사용될 수 있음을 예시할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

또한, EPO-Fc 융합 단백질은 당쇄를 보유하거나 제거된 형태일 수 있다.　 단백질의 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다.　 또한, 경우에 따라 EPO-Fc 융합 단백질은 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 융합단백질을 코딩하는 핵산서열을 제공하는데, 바람직하게 상기 핵산서열은 인간 EPO유전자 및 인간 면역글로불린 Fc 유전자 중 적어도 하나의 염기서열이 코돈 최적화된 것을 포함하며, 더욱 바람직하게는 상기 핵산서열은 인간 EPO 유전자 및 인간 면역글로불린 Fc 유전자의 염기서열 모두가 최적화된 코돈으로 구성된 EPO-Fc 융합 유전자를 포함한다.

또 다른 구체적 양태에서, 상기 융합 유전자의 Fc유전자는 Fc수용체 및/또는 보체와의 결합에 필수적인 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되는 염기서열의 변이체를 포함할 수 있다.

코돈 최적화된 유전자는 야생형 유전자서열이 아닌, 인간에서 가장 빈번하게 이용되는 코돈만으로 이루어진 유전자 서열을 갖는다. EPO 유전자와 Fc 유전자 모두 코돈 최적화를 통해 야생형 유전자 서열에서 변형되었으며, 이에 따라 유전자 발현 증진이 이루어졌다. 동물세포에서 야생형 유전자 서열을 갖는 EPO-Fc를 발현 하는 발현벡터와 코돈 최적화된 유전자로 이루어진 EPO-Fc를 발현하는 발현벡터를 비교해 보았을 때, 코돈 최적화를 통해 EPO-Fc융합유전자의 발현이 증가했음을 관찰하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 EPO-Fc 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터를 제공한다. 동물세포에서 EPO-Fc 융합단백질 같은 당단백질을 대량 생산하기 위해서는 우선 효율적인 발현벡터를 개발하는 것이 필수적이다. 이에, 본 발명의 바람직한 한 양태에서는 다음과 같은 여러 가지 요소를 고려하여 제작한, 인간 EPO-Fc 융합단백질을 대량 생산하기 위한 고효율 발현벡터를 제공한다:

1) 본 발명의 발현벡터에 포함되는 최적화된 코돈을 갖는 EPO유전자는 서열번호 1로 기재되어 있으며, 최적화된 코돈을 갖는 인간 면역글로불린 IgG1의 Fc유전자는 서열번호 2로 기재되어 있다. 이 두 유전자가 in frame으로 융합된 융합단백질을 만들기 위해, Nhe I 제한효소의 인식 유전자가 들어가서 두 유전자가 연결되고, 최종적인 EPO-Fc융합 단백질에서 두 단백질 사이에 두 개의 아미노산 (valine, serine)이 포함된다.

2) 프로모터(promoter)는 유전자 발현을 조절하는데 있어 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이에, 본 발명의 발현벡터는 프로모터 유전자를 포함하도록 제조된다. 본 발명의 발현벡터에 포함되는 프로모터는 현재까지 가장 강력한 프로모터로 알려진 서열번호 3으로 기재되는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 초기 유전자(early gene)의 프로모터인 것이 바람직하다.

3) 포유동물 유전자들은 인트론(intron)을 포함하는데 인트론이 있을 때가 없을 때보다 발현 수준이 현저히 증가된다는 보고가 있다(Korb et al., Nucleic Acids Res, 25, 5901-5908, 1993). 이는 인트론이 mRNA를 안정화시키고 전사효율을 증가시키기 때문인 것으로 생각되었다. 이에, 본 발명의 발현벡터는 서열번호 4로 기재되는 토끼의 베타 globin 유전자의 두번째 인트론 서열 (globin intervening sequence, 이하 "gIVS"라고 약칭함)인 것이 바람직하다.

4) mRNA의 안정성을 높이기 위해서는 폴리아데닐레이션 모티프(polyadenylation motif, pA)가 중요하다(Drummond et al., Nucleic Acids Res, 25, 7375-7394, 1985). 본 발명의 발현벡터는 폴리아데닐레이션 모티프를 포함하며, 폴리아데닐레이션 모티프는 서열번호 5로 기재되는 소 성장 호르몬(bovine growth hormone, BGH) 유전자의 폴리아데닐레이션 모티프(polyadenylation motif)인 것이 바람직하다.

5) 본 발명의 발현 벡터를 형질도입하여 EPO-Fc를 과발현하는 세포주를 선별하기 위해 선별 마커 유전자가 필요하다. 이에, 본 발명의 발현 벡터는 선별 마커 유전자를 포함하도록 제조되며, 선별 마커 유전자는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 유래 세포주인 CHO/dhfr- 세포에서 선별을 용이하게 하기 위한 선별마커 유전자인 서열번호 6으로 기재되는 디히드로폴레이트 리덕타제(dihydrofolate reductase, 이하 “DHFR”이라 약칭함) 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. CHO/dhfr- 세포는 DHFR 유전자가 훼손되어 핵산 생합성 과정이 불완전한 CHO 세포로써, DHFR 유전자를 포함하여 제작한 본 발명의 EPO-Fc 발현 벡터를 상기 세포에 형질도입할 경우, 핵산 합성 능력을 회복하게 되므로 EPO-Fc 발현 벡터가 도입되어 EPO-Fc를 발현하는 세포만 특이적으로 선별할 수 있다.

따라서, 본 발명자들은 인간 EPO-Fc 발현에 미치는 상기와 같은 다양한 인자들을 고려하여 1) 인간 EPO-Fc를 코딩하는 유전자, 2) 프로모터 서열, 3) 인트론 서열, 4) 폴리아데닐레이션 모티프 서열 및 5) 선별마커 유전자를 포함하는 인간 EPO를 발현시키기 위한 재조합 발현벡터를 제조하였다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 코돈 최적화가 이루어진 EPO-Fc융합 유전자를 삽입하였고, 가장 강력하다고 알려진 사이토메갈로바이러스 초기 유전자의 프로모터를 이용하여 EPO-Fc 발현율을 극대화 하였으며, mRNA를 안정화 시키고 전사효율을 증가시키기 위해 인트론을 포함하고 있는 gIVS와 소 성장 호르몬 유전자의 폴리아데닐레이션 모티프를 포함시켰다. 또한, 본 발명의 발현 벡터를 형질도입하여 EPO-Fc 융합유전자를 과발현하는 세포주를 선별하기 위한 마커 유전자로 DHFR 유전자를 포함시켰다.

본 발명자들은 상기 구성 요소들을 포함하는 발현 벡터를 제조하고, 이를 "pAD11-EPO^co-FC^co"라 명명하였다.

본 발명의 발현벡터는 EPO-Fc 융합유전자를 고발현하기 위한 벡터로 제작된 것으로, 이를 대량으로 생산할 수 있는 효율적인 발현 벡터이다. 그러나, 본 발명의 발현벡터에 포함되는 EPO호르몬-Fc 융합 유전자 대신 LH, hCG, TSH, 인자 Ⅷ 및 IL-12 등의 유전자를 단독으로 혹은 Fc 융합을 포함하도록 발현 벡터를 제조할 수 있으며, 이렇게 제조된 발현벡터가 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질을 대량생산하는데 유용하게 사용될 수 있다는 것은 당업자에게 있어서 자명하다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터를 숙주세포에 형질도입한 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서는 인체 내에서 고활성을 나타내는 인간 EPO 호르몬의 고발현 세포주를 제조하기 위하여, 당화능이나 당화체계가 비교적 잘 갖춰져 있으면서 인체 내에서 항원성을 유발하지 않고 안전하며 높은 생체내 활성을 나타낼 수 있는 당구조를 생성하는 포유동물 세포 중 햄스터 세포류인 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, 이하 “CHO”라 약칭함) 세포를 숙주세포로 이용한다.

또한, CHO 유래 세포주인 CHO/dhfr- 세포는 DHFR 유전자가 훼손되어 핵산 생합성 과정이 불완전한 CHO 세포로써, 본 발명의 EPO-Fc발현 벡터(pAD11- EPO^co-Fc^co)에 포함된 DHFR 유전자로 인하여 발현 벡터를 가진 CHO 세포는 핵산 합성 능력을 회복하게 된다. 따라서, 핵산이 없는 세포 배양액으로 CHO 세포를 배양함으로써 발현 벡터를 가진 세포만의 선별이 가능하다. 또한, DHFR 기질 유사체인 메토트렉세이트 (methotrexate, MTX)가 첨가된 배양액에서 세포가 성장하는 것은 DHFR 유전자가 세포내에서 증폭됨으로써 가능한데, 본 발명의 EPO-Fc 발현 벡터는 DHFR 유전자를 포함하고 있으므로 EPO-Fc유전자도 동시에 증폭된다. 따라서, 세포 배양액에 DHFR의 기질 유사체인 MTX를 첨가함으로써, EPO-Fc 발현 세포군의 EPO-Fc 단백질 발현 정도를 개선할 수 있다.

본 발명에서는 EPO-Fc를 발현하는 벡터를 CHO/dhfr- 세포에 형질 감염시킨 후 고농도의 MTX에서 고발현하고 동질성(homologous)을 나타내는 클론을 선별 배양하여 EPO-Fc가 안정적으로 고발현 되는 세포주를 확립하고 이를 2006년 4 월 15일에 한국세포주은행에 기탁번호 제 KCLRF-BP-00132 번으로 기탁하였다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 이용하여 인간 EPO-Fc를 대량 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 인간 EPO-Fc를 대량 생산하는 방법은,

1) 인간 EPO 유전자 및 인간 면역글로불린의 Fc 유전자를 포함하되 이들 중 적어도 하나의 염기서열이 코돈 최적화된 유전자를 포함하는 EPO-Fc 융합단백질을 발현하는 발현벡터를 제조하는 단계와;

2) 단계 1에서 제조된 발현벡터를 숙주세포에 형질도입하는 단계;

3) 단계 2에 의해 형질도입된 형질전환체를 선별하는 단계; 및

4) 단계 3에서 선별된 재조합 형질전환체를 배양하여 생산되는 EPO-Fc융합단백질을 수득하는 단계를 포함하는 인간 EPO-Fc 융합 단백질의 생산 방법을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 상기 방법은 상기 단계 4의 재조합 형질전환체의 배양 전에, 단계 3에서 선별된 재조합 형질전환체로부터 안정적으로 EPO-Fc를 생산하는 재조합 형질전환체를 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 단계 1에 있어서, 발현벡터는 최적화된 코돈으로 이루어진 인간 EPO 유전자 및 최적화된 코돈으로 이루어진 인간 면역글로불린 Fc 유전자를 포함하는 것 이 바람직하고, 여기에 프로모터 서열, 인트론 서열, 폴리아데닐레이션 모티프 서열 및 선별마커 유전자를 더 포함하는 벡터인 것이 더욱 바람직하며, 본 발명에서 제조한 벡터인 “pAD11- EPO^co-Fc^co” 벡터인 것이 특히 바람직하다.

상기 단계 2에 있어서, 숙주 세포는 DHFR 유전자가 훼손되어 핵산 생합성 과정이 불완전한 CHO 세포인 CHO/dhfr- 세포인 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 재조합 EPO- Fc 발현벡터( pAD11 - EPO ^co - Fc ^co )의 제조

<1-1> 코돈 최적화된 인간 EPO 유전자의 이용

코돈 최적화된 인간 EPO를 발현하는 세포주를 제조하는데 필요한 인간 EPO 유전자를 제조하기 위해, 야생형 EPO 아미노산 서열을 참고하여, 가장 빈번하게 mammalian 세포에서 사용되는 코돈으로 변환한 유전자를 합성하였다 (Top Gene Technologies사에 의뢰하여 합성함, www.topgenetech.com). 합성시에 클로닝을 위하여 합성 개시 코돈인 ATG의 upstream위치, 즉 5'에 EcoR I 인식부위를 넣었으며, 인간 면역글로불린 서브타입 1 (IgG1)의 Fc유전자와 in-frame으로 연결하기 위한 Nhe I 인식부위와, 벡터로의 클로닝을 위한 Not I을 3'에 삽입하였다. 도면 1은 야생형 EPO 유전자서열 (EPO^wt)과 코돈을 최적화한 EPO 유전자서열 (EPO^co)을 alignment한 것이다. 야생형에 비해 약 20.2%에 해당하는 유전자가 코돈 최적화를 통해서 다른 염기로 치환되었다.

<1-2> 코돈 최적화된 인간 면역글로불린 Fc 유전자의 이용

코돈 최적화된 인간 면역글로불린, IgG1의 Fc 영역의 유전자를 제조하기 위해서, 야생형 IgG1 Fc 아미노산 서열을 참고로 하여 생합성을 의뢰하여 확보 하였다 (Top Gene Technologies사에 의뢰하여 합성함, www.topgenetech.com). 야생형 Fc에 비해, Fc 수용체 결합에 중요한 한 아미노산이 치환 (Leu 235-Glu 235)되어 있으며, 보체 결합에 중요한 3개의 아미노산이 치환 (Glu 318-Ala, Lys 320-Ala, Lys 322-Ala)되어 있다. Fc영역에 해당되는 유전자 외에, N-말단에 Gly 아미노산을 링커로 삽입하고, C-말단에 링커로서 Gly-Gly-Gly-Asn-Ser 다섯 개의 아미노산을 삽입하였다. 이렇게 링커를 넣어서, 융합하고자 하는 유전자를 Fc의 N-말단 및 C-말단 모두에 넣을 수 있도록 제작되었다. N-말단 링커 5' 쪽으로는Nhe I 인식부위를 넣었고, C-말단의 링커 3' 쪽으로는 BamH I 인식부위가 오고, 종결코돈이 오고, Not I 인식부위를 넣었다. 도면 2는 야생형 IgG1 Fc의 유전자서열 (IgG1 Fc^wt)과 코돈을 최적화하고, Fc수용체/보체 결합에 중요한 염기를 치환함으로써 최종적으로 얻은 IgG1 Fc의 유전자서열 (IgG1 Fc^co)을 alignment한 것이다. 야생형에 비해 약 16%에 해당하는 유전자가 코돈 최적화를 통해서 다른 염기로 치환되었다.

<1-3> 코돈 최적화된 인간 EPO와 인간 면역글로불린 Fc 유전자를 발현하는 최종 벡터의 개발

코돈 최적화된 인간 EPO 유전자가 생합성되어 삽입된 클로닝 벡터 pUC57벡터를 Nhe I, Not I으로 절단한 후에, 생합성되어 얻은 코돈 최적화된 Fc 유전자 역시 Nhe I, Not I으로 절단하여 ligation하여 pUC57 EPO^co-Fc^co 벡터를 만들었다. 이후 최종 벡터인 pAD11 벡터로 유전자를 옮기기 위해, EcoR I, Not I으로 잘라낸 EPO^co-Fc^co 유전자를 동일한 제한효소로 잘린 pAD11 벡터로 옮겨서 최종적으로 건설하고, "pAD11- EPO^co-Fc^co"로 명명하였다 (도3).

< 실시예 2> 인간 EPO- Fc 발현세포 선별

상기 실시예 1에서 제조한 재조합 인간 EPO-Fc 발현벡터, pAD11- EPO^co-Fc^co 를 세포주에 형질도입시켜 재조합 인간 EPO가 발현되는지 확인하고자 하였다. 구체적으로, 배양중인 DG44 세포(ATCC, catalog # CRL-1651)를 60 mm 디쉬 플레이트당 5 ×105 개로 접종한 후에 18시간 동안 배양하였다. 이후, 배양액(MEM-a + 10% FBS)을 4.5 ml의 신선한 배지로 교체해 준 뒤, 약 4시간 후 EPO-Fc 발현 벡터인 pAD11- EPO^co-Fc^co 플라스미드 및 대조군 벡터인 pAD11플라스미드를 각각 CaPO4 동시침전(coprecipitation) 방법으로 형질도입시켰다. 즉, 먼저 각 DNA 10 ㎍을 순수한 증류수와 혼합하여 최종 부피가 225 ㎕가 되도록 한 후, 2.5 M CaCl2 용액 25 ㎕를 넣어 볼텍서(vortexer)로 혼합하였다. 상기 DNA가 들어있는 튜브에 2 × HBS 용액(280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.5 mM Na2HPO42H2O, 12 mM 덱스트로스, 50 nM HEPES) 250 ㎕를 한 방울씩 천천히 떨어뜨려 주었다. 이후 10분간 상온에서 반응을 시켜준 후, 세포 배양 접시에 넣어주고, 6시간 동안 배양하였다. 이후 PBS로 3번 세척한 뒤, 다시 신선한 배양배지(MEM-a + 10% FBS)를 첨가해 48 시간 동안 배양하였다. 결손세포인 CHO/dhfr- 세포는 핵산 생합성 능력이 없기 때문에 핵산이 없는 최소 필수 영양배지인 MEM-α배지 상에서는 생존할 수가 없지만, EPO^co-Fc^co 유전자와 DHFR 유전자가 함께 도입된 재조합 CHO 세포는 핵산 생합성 능력이 있기 때문에 MEM-α배지를 이용하여 선택 배양할 수 있다. 구체적으로, pAD11-EPO^co-Fc^co 플라스미드로 형질전환시켜서 배양중인 세포를 여러 배수(1/2, 1/5, 1/10, 1/20, 1/50, 1/100, 1/200, 1/500)로 희석하여 HT 보충제를 넣지 않은 배지로 100 mm 디쉬에서 배양하면서 1차 스크리닝을 수행하였다.　 스크리닝 동안은 일주일에 한번씩 배지만 갈아주고, 계대(passage)는 거치지 않았으며, 이후, 약 2주에서 3주 후에 분리하기 좋게 콜로니가 형성된 플레이트를 선별하였다.　 선별된 플레이트로부터 콜로니를 수득하여 24 웰 플레이트로 옮겨 계대배양하였다.　 약 일주일에서 2주일 후에 24 웰 플레이트에 있는 세포 클론에 트립신 처리하여 세포를 수득한 뒤 2 ×10⁴ 세포수/웰 농도로 다시 24 웰 플레이트에 플레이팅 하였다.　 48시간 후에, 상층액을 수득하여 hEPO의 발현 레벨을 효소면역측정법에 의하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 효소면역측정 키트(Quantikine™ IVD™ ELISA, R& D System)중 항체흡착 플레이트의 각 웰에 분석용 희석액을 100㎕씩 첨가하고 샘플 희석액으로 적절히 희 석한 표준액, 국제표준액(86 IU/ample, NIBSC) 및 검액들을 100㎕ 씩 가하여 잘 섞은 후 상온에서 1시간 반응시켰다. 희석용액으로 인혈청 알부민이 첨가된 제형 완충액 [3% D-만니톨(30mg/ml), 34.2mM 연화나트륨(2.0mg/ml), 12.5mM 무수인산이수소나트륨(1.5mg/ml), pH7.0 + 알부민(1.0mg/ml)]을 사용하였다. 각 웰의 잔여 반응액을 제거하고 세척용액 250㎕로 3회 세척한 후 효소항체 접합체액 200㎕를 가한 후 다시 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응 여액을 위의 방법으로 제거, 세척한 후 사용시 제조한 기질-발색용액 200㎕를 웰에 첨가하고 상온에서 20분간 발색시켰다. 발색이 완료된 후 반응 정지액 100㎕를 첨가하여 반응을 정지시키고 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준액의 함량을 횡축, 흡광도(A 450nm )를 종축으로 하여 표준곡선을 작성하고 작성된 표준곡선으로부터 국제표준액과 검액의 에리트로포이에틴의 함량을 구하고 희석배수를 곱하여 시료의 최종 함량을 산출하였다. 음성대조군인 pAD11 벡터만을 넣어서 형질전환된 세포와는 달리, pAD11-EPO^co-Fc^co 플라스미드로 형질전환되어 얻어진 클론들에서만 발현이 확인되었으며, 고발현을 하고 있는 6개의 클론을 확보할 수 있었다 (도4).

< 실시예 3> 인간 EPO- Fc 발현 증폭

이후, hEPO 고발현 세포주를 선별하기 위하여 MTX 농도 20 nM에서 1 μM까지 점진적으로 증가시킨 배양 배지에서 상기 실시예 2에서 선별된 클론을 배양하였다. 보다, 구체적으로, 1차로 선별된 클론들을 투석된 소 태아 혈청이 10% 함유된 MEM- α배지에서 MTX 농도를 순차적으로 증가시키면서 계대 배양하였다. MTX 농도 단계별로 각각의 클론들을 배양하여 MTX 농도에 저항성을 갖는 클론들을 선별하였으며, 각 단계의 클론별로 배양 상등액의 EPO 발현량을 측정함으로써 고발현 EPO 세포들을 2차로 선별하였다. 이때 EPO 발현량은 효소면역 측정법을 이용하여 측정하였다.

3차 선별로서, MTX 증폭시(amplification)의 이종성(heterogeneity)을 줄이기 위해 한계희석법(limiting dilution method)을 이용한 단일 클론 선별을 실시하였다. 즉, 불균일한 EPO 발현율을 나타내는 클론들을 한계희석법을 이용하여 EPO 발현율이 균일하고 생산성이 우수한 단일세포를 분리하는 실험을 진행하였다. 3차 선별은 96웰 플레이트에 세포를 웰당 1개 내지 2개의 클론씩 접종되도록 희석한 후 세포가 1개만 접종된 플레이트를 선별해 2-3주 배양한 후 콜로니를 형성하는 웰 플레이트의 세포를 분리한 다음 계대배양하여 EPO의 발현량을 효소면역 측정법으로 측정하여 EPO를 고발현하는 단일 세포들을 분리하였다. 3차 선별을 통해 분리된 세포주들 중 1 μM MTX에서 안정한 증식특성과 EPO 고생산성을 나타내는 재조합 CHO 세포주를 최종 선별하였다.

< 실시예 4> 인간 Epo - Fc 배양액 생산 및 정제

안정화된 재조합 에리트로포이에틴 생산 CHO 세포주를 무혈청 배양하여 배양상등액 7L를 수거하고 정제단계에 사용하였다. 이때 에리트로포이에틴 생산용 CHO 세포는 37℃에서 7일간 배양하였다.

여과막(Pellicon 2 Cassette Filter, Millipore사, MWCO 10K)을 펌프(MasterFlex, Millipore사)와 함께 장착하고 20L의 3차 멸균수로 여과장치의 내부를 세척하였다. 여과장치의 세척이 완료된 후 CHO 세포의 배양상등액을 펌프를 통해 여과장치에 주입하고 여액을 회수하여 재주입하는 방식으로 한외여과를 수행하였다. 한외여과가 완료된 후 배양 상등액 농축액의 부피는 300ml 였다. HiTrap rProtein A FF (Amersham-pharmacia biotech사)칼럼에 20mM 소디움 포스페이트 완충액(pH 7.0)으로 2 칼럼 용량만큼 평형화시켰다. 평형화된 칼럼에 농축액을 주입하고 20mM 소디움 포스페이트 완충액(pH 7.0)으로 칼럼을 세척하였다. 0.1M 소디움 사이트레이트 완충액 (pH 3.0)을 4칼럼 용량만큼 주입하여 단백질을 용출하였다.

활성화된 투석막(Spectra/Por Spectrum사, MWCO 12-14K)에 용출액을 넣고 봉합한 후 10배 용량의 3차 멸균수에 대하여 6시간 간격으로 3회 투석하여 용출액 내의 염의 농도를 5mM 이하가 되게 하였다. 단백질 용출액에 대한 시험관 내 함량을 상기 실시예 2에서 기술한 효소면역측정법에 의하여 측정하고 이를 통하여 각 정제 단계별 수율을 산출하였다.

< 실시예 5> 인간 Epo - Fc in vivo 생활성 분석

위의 실시예를 통해 얻은 EPO-Fc 단백질을 유럽 약전 에리스로포이에틴항의 생물학적 활성 측정 시험법에 따라 실험하여 정제된 EPO-Fc 단백질의 생물학적 활성을 측정하였다.

먼저 희석용액으로 인혈청 알부민이 첨가된 제형 완충액 [3% D-만니 톨(30mg/ml), 34.2mM 연화나트륨(2.0mg/ml), 12.5mM 무수인산이수소나트륨(1.5mg/ml), pH7.0 + 알부민(1.0mg/ml)]을 사용하여 생물학적활성 측정용 BRP-EPO 국제 표준품을 희석용액으로 희석하여 20, 40, 80 IU/ml의 희석 용액 열을 만들었다.

또한 정제된 EPO-Fc 용액은 효소면역측정법으로 함량을 측정한 후 희석용액으로 희석하여 20, 40, 80 IU/ml의 희석용액 열을 만들었다.

8주령의 B6D2F1 마우스를 준비하여 시험 개시일에 표준액과 검액 (각각 3 가지 농도) 그리고 희석용액 (대조군)을 0.5ml 씩 1회 피하 투여하여 총 투여량이 10, 20 및 40 IU가 되도록 하였다. 피하투여 4일 후에 마우스를 해부하여 복대정맥에서 채혈하고 얻어진 혈액을 즉시 K3 EDTA vacutainer 튜브 (Becton Dickinson)에 넣어 혈액의 응고를 방지하였다.

Retic-COUNTTM(thiazole orange) 용액 (Becton Dickinson)을 폴리스티렌 튜브(12 X 75mm)에 1.0ml 씩 분주한 후 채혈한 혈액을 각 튜브에 5ul씩 첨가하여 가볍게 섞어 주었다. 이후 각 튜브의 염색반응은 상온, 암소에서 30분간 수행하여 레티큘로사이트(reticulocyte) 수치를 측정하였다. 이때 수치는 유세포측정기(Flow cytometry system)를 이용하여 측정하였다(620nm). EPO의 생물학적 활성을 산출하기 위한 통계처리는 유럽 약전의 parallel line assay의 일반적인 통계처리 방법에 준하여 실시하였다.

통계처리 결과 EPO-Fc의 생물학적 활성은 표준액 대비 195% 의 생물학적 활성을 나타내었다 (도5).

다음으로 EPO-Fc의 Rat에서의 약동학을 알아보았다. 수컷 SD rat(250~300g, 8주령, 총 54두)에 0.1% BSA saline을 희석용액으로 사용하여 만든 EPO 표준액과 EPO-Fc 검액 100IU/kg을 피하투여 하였다. 0, 5, 15, 30min, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 96 hr 경과 후 동맥에서 채혈하고 약30분간 상온에서 응고시킨 후, 원심분리기를 사용하여 3000rpm에서 10분간 원심분리 후 혈청을 분리하여 냉동보관 하였다. 이후 혈청을 효소면역측정법에 의하여 EPO의 농도를 측정하여 통계처리 하였다. 측정 결과 최대혈중농도는 EPO 표준액의 경우 8시간 만에 91.4 mU/ml에 도달하였고 EPO-Fc의 경우 12시간 만에 44.5 mU/ml에 도달하였다. 반감기의 경우 EPO 표준액의 경우 10.8시간 이였고 EPO-Fc의 경우 약 두 배 정도 늘어난 21.4 시간이었다 (도6).

이상 기재한 바와 같이, 본 발명에 따르면 의학적 수요가 높은 EPO를 EPO-Fc 융합단백질 형태로 안정적이고도 고효율로 발현시킬 수 있으며, 그에 따라 그러한 단백질의 대량 생산을 가능하게 하였다.

<110> Progen Co., Ltd. Genexine Inc. <120> Method for mass production of human EPO by EPO-Fc fusion <130> PA9603-121/KR <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 579 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized EPO gene <400> 1 atgggcgtgc acgagtgccc cgcctggctg tggctgctgc tgagcctgct gagcctgccc 60 ctgggcctgc ccgtgctggg cgcccccccc cgcctgatct gcgacagccg cgtgctggag 120 cgctacctgc tggaggccaa ggaggccgag aacatcacca ccggctgcgc cgagcactgc 180 agcctgaacg agaacatcac cgtgcccgac accaaggtga acttctacgc ctggaagcgc 240 atggaggtgg gccagcaggc cgtggaggtg tggcagggcc tggccctgct gagcgaggcc 300 gtgctgcgcg gccaggccct gctggtgaac agcagccagc cctgggagcc cctgcagctg 360 cacgtggaca aggccgtgag cggcctgcgc agcctgacca ccctgctgcg cgccctgggc 420 gcccagaagg aggccatcag cccccccgac gccgccagcg ccgcccccct gcgcaccatc 480 accgccgaca ccttccgcaa gctgttccgc gtgtacagca acttcctgcg cggcaagctg 540 aagctgtaca ccggcgaggc ctgccgcacc ggcgaccgc 579 <210> 2 <211> 693 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized Fc gene of human IgG1 <400> 2 cccaagagct gcgacaagac ccacacctgc cccccctgcc ccgcccccga gctggagggc 60 ggccccagcg tgttcctgtt cccccccaag cccaaggaca ccctgatgat cagcaggacc 120 cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg agccacgagg accccgaggt gaagttcaac 180 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac gccaagacca agccccggga ggagcagtac 240 aacagcacct acagggtggt gagcgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 300 aaggcctacg cctgcgccgt gagcaacaag gccctgcccg cccccatcga gaagaccatc 360 agcaaggcca agggccagcc cagagagccc caggtgtaca ccctgccccc cagccgggag 420 gagatgacca agaaccaggt gagcctgacc tgcctggtga agggcttcta ccccagcgac 480 atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac cacccccccc 540 gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagagccgg 600 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 660 acccagaaga gcctgagcct gagccccggc aag 693 <210> 3 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter of Cytomegalovirus early gene <400> 3 gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca 60 attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 120 aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 180 gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga ctatttacgg 240 taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac 300 gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt 360 cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg 420 cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc 480 attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt 540 aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 600 agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttaac tgcttatcga aatt 654 <210> 4 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> globin intervening sequence of rabbit <400> 4 gtgagtttgg ggacccttga ttgttctttc tttttcgcta ttgtaaaatt catgttatat 60 ggagggggca aagttttcag ggtgttgttt agaatgggaa gatgtccctt gtatcaccat 120 ggaccctcat gataattttg tttctttcac tttctactct gttgacaacc attgtctcct 180 cttattttct tttcattttc tgtaactttt tcgttaaact ttagcttgca tttgtaacga 240 atttttaaat tcacttttgt ttatttgtca gattgtaagt actttctcta atcacttttt 300 tttcaaggca atcagggtat attatattgt acttcagcac agttttagag aacaattgtt 360 ataattaaat gataaggtag aatatttctg catataaatt ctggctggcg tggaaatatt 420 cttattggta gaaacaacta catcctggtc atcatcctgc ctttctcttt atggttacaa 480 tgatatacac tgtttgagat gaggataaaa tactctgagt ccaaaccggg cccctctgct 540 aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct ggttattgtg 600 ctgtctcatc attttggcaa agaattgtaa tacgactcac tatagggcga attg 654 <210> 5 <211> 232 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polyadenylation motif of bovine growth hormone <400> 5 ctagagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc 60 cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa 120 atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg 180 ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg ga 232 <210> 6 <211> 564 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dihydrofolate reductase gene <400> 6 atggttcgac cattgaactg catcgtcgcc gtgtcccaaa atatggggat tggcaagaac 60 ggagacctac cctggcctcc gctcaggaac gagttcaagt acttccaaag aatgaccaca 120 acctcttcag tggaaggtaa acagaatctg gtgattatgg gtaggaaaac ctggttctcc 180 attcctgaga agaatcgacc tttaaaggac agaattaata tagttctcag tagagaactc 240 aaagaaccac cacgaggagc tcattttctt gccaaaagtt tggatgatgc cttaagactt 300 attgaacaac cggaattggc aagtaaagta gacatggttt ggatagtcgg aggcagttct 360 gtttaccagg aagccatgaa tcaaccaggc cacctcagac tctttgtgac aaggatcatg 420 caggaatttg aaagtgacac gtttttccca gaaattgatt tggggaaata taaacttctc 480 ccagaatacc caggcgtcct ctctgaggtc caggaggaaa aaggcatcaa gtataagttt 540 gaagtctacg agaagaaaga ctaa 564

Claims (13)

1) 인간 EPO 유전자 및 인간 면역글로불린의 Fc 유전자를 포함하되 이들 중 적어도 하나의 염기서열이 코돈 최적화된 유전자를 포함하는 EPO-Fc 융합단백질을 발현하는 발현벡터를 제조하는 단계와;

2) 단계 1에서 제조된 발현벡터를 숙주세포에 형질도입하는 단계;

3) 단계 2에 의해 형질도입된 형질전환체를 선별하는 단계; 및

4) 단계 3에서 선별된 재조합 형질전환체를 배양하여 생산되는 EPO-Fc 융합단백질을 수득하는 단계를 포함하는 인간 EPO-Fc 융합 단백질의 생산 방법.

제1 항에 있어서, 상기 발현벡터 내 인간 EPO 유전자의 염기서열이 코돈 최적화된 것인 방법.

제 1 항에 있어서, 상기 발현벡터 내 인간 면역글로불린 Fc 유전자의 염기서열이 코돈 최적화된 것인 방법.

제 1 항에 있어서, 상기 발현벡터 내 인간 EPO 유전자 및 인간 면역글로불린 Fc 유전자의 염기서열 모두가 코돈 최적화된 것인 방법.

제 1 항에 있어서, 상기 Fc 유전자는 235번 아미노산인 루이신 또는 318번, 320번 및 322번의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되도록 더욱 변형된 것인 방법.

제 5 항에 있어서, 상기 Fc 유전자는 235번 아미노산인 루이신이 글루타민으로, 그리고 318번, 320번 및 322번의 아미노산이 모두 알라닌으로 치환되도록 변형된 것인 방법.

제 1 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 동물 세포인 방법.

제 7 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 DHFR 유전자가 훼손된 CHO/dhfr- 세포인 방법.

제 5 항에 있어서, 상기 숙주세포에 발현벡터를 형질도입한 후 형질도입된 형질전환체를 MTX를 함유한 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1 항에 있어서, 상기 발현벡터는 인간 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단이 인간 EPO 유전자의 C-말단에 연결되도록 제조된 것인 방법.

제 1 항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조되는 인간 EPO-Fc 융합단백질.

제 11 항의 융합단백질을 코딩하는 핵산 서열.

기탁번호 KCLRF-BP-00132 의 세포주.

Images