CN114032219A - Cyp4f22基因突变体、多肽、试剂盒、构建体及重组细胞 - Google Patents

Cyp4f22基因突变体、多肽、试剂盒、构建体及重组细胞 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物基因工程技术领域，公开了一种CYP4F22基因突变体、多肽、试剂盒、构建体及重组细胞，所述编码CYP4F22突变体的核酸是第8号外显子的844位核苷酸，存在C→T突变，或第11号外显子的1189位核苷酸，存在C→T突变；所述多肽具有p.R282W或p.R397C突变；所述试剂盒含有特异检测CYP4F22基因突变体p.R282W或p.R397C的试剂；所述核酸构建体含有CYP4F22基因p.R282W或p.R397C突变体；所述重组细胞由所述核酸构建体转染受体细胞获得。本发明可以用于先天性鱼鳞病的辅助诊断，用于发现先天性鱼鳞病潜在携带者，为该病的产前基因诊断提供依据。

Description

CYP4F22基因突变体、多肽、试剂盒、构建体及重组细胞
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种CYP4F22基因突变体、多肽、试剂盒、构建体及重组细胞。
背景技术
目前，先天性鱼鳞病是一组罕见的皮肤角化异常疾病，主要表现为全身表皮脱屑异常，并伴有一系列症状，如新生儿火棉胶膜、睑外翻、子痫、头皮和眉毛瘢痕性脱发、掌跖角化过度、多汗和可变红斑。先天性鱼鳞病包括临床表现和严重程度不同的几个主要亚型，包括丑角型鱼鳞病、板层型鱼鳞病和先天性鱼鳞病样红皮病。
CYP4F22作为导致先天性鱼鳞病的致病基因之一，其致病突变较为罕见，到目前为止，国内外共发现50个致病突变，其中超过70％的致病突变是点突变导致的错义突变和无义突变。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：CYP4F22基因新发变异缺乏蛋白水平的功能数据，影响新发变异的致病性评级，阻碍了该病临床诊断的确立和相关家庭的再生育产前基因诊断的进行。目前国际上还没有关于 CYP4F22基因相关突变位点导致先天性鱼鳞病的报道。
解决以上问题及缺陷的难度为：目前没有直接可利用的带有特定突变的 CYP4F22基因的构建体用于体外功能研究；缺乏带有特定突变的CYP4F22多肽；没有带有特定突变构建体的重组细胞，这几个问题均阻碍了CYP4F22基因新发变异的致病性评级。
解决以上问题及缺陷的意义为：以上问题的解决可以明确鱼鳞病表型相关的CYP4F22基因中新发变异的致病性，为明确患者的分子遗传学诊断、指导患者的精准治疗及其避免该家系的再生育风险有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种CYP4F22基因突变体、多肽、试剂盒、构建体及重组细胞。
本发明是这样实现的，一种CYP4F22基因突变体，所述编码CYP4F22突变体的核酸是第8号外显子的844位核苷酸，存在C→T突变，序列为SEQ ID NO：3；或第11号外显子的1189位核苷酸，存在C→T突变；序列为SEQ ID NO：5。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的CYP4F22基因突变体的多肽，所述多肽具有p.R282W，氨基酸序列为SEQ ID NO：4；或p.R397C突变，氨基酸序列为SEQ ID NO：6。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的CYP4F22基因突变体的用于筛选易患先天性鱼鳞病的生物样品的试剂盒，所述用于筛选易患先天性鱼鳞病的生物样品的试剂盒含有特异检测CYP4F22基因突变体p.R282W或p.R397C的试剂。
进一步，所述试剂为核酸引物：
CYP4F22基因c.844C→T突变所在外显子8的扩增引物：正向 5'-ggctcagacctgtaacccag-3'(SEQ ID NO：7)，反向5'-gagccaccacgcctaatg-3'(SEQ ID NO：8)；
CYP4F22基因c.1189C→T突变所在外显子11的扩增引物：正向 5'-ggtggctcggcctctag-3'(SEQ ID NO：9)，反向5'-tctccctgcacacacaactg-3'(SEQ ID NO：10)。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的CYP4F22基因突变体的核酸构建体，所述核酸构建体含有CYP4F22基因p.R282W或p.R397C突变体。
本发明的另一目的在于提供一种所述核酸构建体的构建方法，所述构建方法包括：
设计针对野生型CYP4F22 cDNA的全长的上下游扩增引物，上游引物带 Kpn I酶切位点，下游引物带BamH I酶切位点，PCR方法扩增CYP4F22开放读码框序列并进行Kpn I和BamH双酶切与纯化；商业化的GFP表达载体 (pAcGFP1-C1 vector)经Kpn I和BamH I双酶切并纯化后，与酶切纯化的 CYP4F22开放读码框片段，经T4连接酶连接成环状双链DNA后，转化DH5α感受态细胞，接种于卡那霉素抗性的琼脂糖平板中过夜培养，挑取单克隆进行Sanger测序，鉴定pAcGFP1-C1-CYP4F22-WT的序列。利用构建好的 pAcGFP1-C1-CYP4F22-WT野生型表达载体，通过定点突变法，分别构建 p.R282W或p.R397C突变体；
p.R282W突变体构建所用定点突变引物序列：
正向5’-tgaagtcatccaggaatggcggcgggcact-3’(SEQ ID NO：11)，反向 5’-ttcctggatgacttcagtggt-3’(SEQ ID NO：12)；
p.R397C突变体构建所用定点突变引物序列：
正向5’-CATTAAGGAGAGCCTGTGCCAGTACCCACCTGTCACT-3'(SEQ ID NO：13)，反向5’-CAGGCTCTCCTTAATGCACATAG-3’(SEQ ID NO：14)。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的核酸构建体转染获得的重组细胞，所述重组细胞由所述的含有CYP4F22基因p.R282W或p.R397C突变体的核酸构建体转染受体细胞而获得。
本发明的另一目的在于提供一种所述的重组细胞在筛选制备治疗先天性鱼鳞病的药物中的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的CYP4F22基因突变体、多肽、试剂盒、构建体及重组细胞，涉及分离编码 CYP4F22突变体的核酸，分离的多肽，筛选易患先天性鱼鳞病的生物样品的方法，用于筛选易患患先天性鱼鳞病的生物样品的试剂盒，构建体以及重组细胞。
本发明可以用于先天性鱼鳞病的辅助诊断，用于发现先天性鱼鳞病潜在携带者，为该病的产前基因诊断提供依据。
本发明以先天性鱼鳞病家系为研究对象，用全外显子组测序、Sanger测序和限制性酶切片段长度多态性技术，鉴定了CYP4F22基因中的2个新的杂合致病突变，位于第8号外显子的844位核苷酸，存在C→T突变，第11号外显子的1189位核苷酸，存在C→T突变。目前国际上还没有关于CYP4F22基因相关突变位点导致先天性鱼鳞病的报道。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的先天性鱼鳞病家族的谱系图及病人临床表现的照片。
图2是本发明实施例提供的CYP4F22野生型与突变体的c.844或c.1189位点示意图。
图3是本发明实施例提供的CYP4F22第282位或第397位氨基酸位点在不同脊椎动物中的保守性分析示意图。
图4是本发明实施例提供的CYP4F22 p.R282W或p.R397C突变体3D建模示意图。
图5是本发明实施例提供的带有CYP4F22 p.R282W或p.R397C突变构建体的重组哺乳动物细胞内两个突变体蛋白表达水平的示意图。
图6是本发明实施例提供的带有CYP4F22 p.R282W或p.R397C突变构建体的重组哺乳动物细胞内两个突变体蛋白在细胞内定位的示意图。
图7是本发明实施例提供的选取4种能够调控蛋白表达的小分子药物 MG132、3-MA、Trichostatin A(TSA)、C646(均从Selleck公司购买)处理 CYP4F22野生型、p.R282W、p.R397C构建体重组的HEK293T细胞，免疫印记法检测野生型和突变型CYP4F22的表达图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种CYP4F22基因突变体、多肽、试剂盒、构建体及重组细胞，下面结合附图和实施例对本发明作详细的描述。
实施例1
本发明涉及人CYP4F22基因突变及其应用。具体地，本发明涉及分离编码 CYP4F22突变体的核酸，分离的多肽，筛选易患先天性鱼鳞病的生物样品的方法，用于筛选易患患先天性鱼鳞病的生物样品的试剂盒，构建体以及重组细胞。
本发明可以用于先天性鱼鳞病的辅助诊断，用于发现先天性鱼鳞病潜在携带者，为该病的产前基因诊断提供依据。
本发明通过目标区域捕获测序联合候选基因突变验证的方法确定了先天性鱼鳞病的新的致病突变--CYP4F22基因8号外显子、11号外显子上的c.C844T 和c.C1189T突变。
本发明提出了一种分离的编码CYP4F22突变体的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID NO：1相比，具有c.C844T和c.C1189T突变，即相对于野生型CYP4F22基因，本发明的CYP4F22基因突变体的第844位和第1189 位碱基均发生C突变为T。根据本发明的实施例，发明人确定了CYP4F22基因的新突变体，该突变体与先天性鱼鳞病的发病密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患先天性鱼鳞病。
本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQID NO：2相比，所述分离的多肽具有p.R282W或p.R397C突变，即该突变是由于c.C844T 或c.C1189T的错义突变而引起的，具体地，该突变表示：该分离的多肽，由于野生型CYP4F22的第282位或第397位Arg的密码子突变为Trp或Cys密码子。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患先天性鱼鳞病。
本发明提出了一种用于筛选易患先天性鱼鳞病的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测CYP4F22基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO：1相比，该CYP4F22基因突变体具有c.C844T和c.C1189T突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易患先天性鱼鳞病的生物样品。
本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的编码CYP4F22突变体的核酸。由此，利用本发明的构建体转染受体细胞评估突变体的蛋白表达水平。
本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗先天性鱼鳞病的药物。
在本发明中，提供一种编码CYP4F22突变体的核酸，所述编码CYP4F22 突变体的核酸是第8号外显子的844位核苷酸，存在C→T突变，序列为SEQ ID NO：3；或第11号外显子的1189位核苷酸，存在C→T突变；序列为SEQ ID NO：5。
在本发明中，提供一种多肽，CYP4F22突变体，分离的多肽具有p.R282W 氨基酸序列为SEQ ID NO：4；或p.R397C突变，氨基酸序列为SEQ ID NO：6。
在本发明中，提供一种用于筛选易患先天性鱼鳞病的生物样品的试剂盒，含有特异检测CYP4F22基因突变体p.R282W或p.R397C的试剂，所述试剂为核酸引物。
CYP4F22基因c.844C→T突变所在外显子8的扩增引物：正向5'-ggctcagacctgtaacccag-3'(SEQ ID NO：7)，反向5'-gagccaccacgcctaatg-3'(SEQ ID NO：8)；
CYP4F22基因c.1189C→T突变所在外显子11的扩增引物：正向 5'-ggtggctcggcctctag-3'(SEQ ID NO：9)，反向5'-tctccctgcacacacaactg-3'(SEQ ID NO：10)。
在本发明中，提供一种含有CYP4F22基因p.R282W或p.R397C突变体的核酸构建体。
设计针对野生型CYP4F22 cDNA的全长的上下游扩增引物，上游引物带 Kpn I酶切位点，下游引物带BamH I酶切位点，PCR方法扩增CYP4F22开放读码框序列并进行Kpn I和BamH双酶切与纯化；商业化的GFP表达载体 (pAcGFP1-C1 vector)经Kpn I和BamH I双酶切并纯化后，与酶切纯化的 CYP4F22开放读码框片段，经T4连接酶连接成环状双链DNA后，转化DH5α感受态细胞，接种于卡那霉素抗性的琼脂糖平板中过夜培养，挑取单克隆进行Sanger测序，鉴定pAcGFP1-C1-CYP4F22-WT的序列。利用构建好的 pAcGFP1-C1-CYP4F22-WT野生型表达载体，通过定点突变法，分别构建 p.R282W(pAcGFP1-C1-CYP4F22-R282W)或p.R397C (pAcGFP1-C1-CYP4F22-R397C)突变体；
p.R282W突变体构建所用定点突变引物序列:
正向5’-tgaagtcatccaggaatggcggcgggcact-3’(SEQ ID NO：11)，反向5’-ttcctggatgacttcagtggt-3’(SEQ ID NO：12)；
p.R397C突变体构建所用定点突变引物序列SEQ ID NO：9:正向 5’-cattaaggagagcctgtgccagtacccacctgtcact-3'(SEQ ID NO：13)，反向 5’-caggctctccttaatgcacatag-3’(SEQ ID NO：14)。
在本发明中，提供一种重组细胞，用所述的构建体转染受体细胞而获得。
实施例2
根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码CYP4F22突变体的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQIDNO：1相比，具有c.C844T和c.C1189T突变，发明人确定了CYP4F22基因的新突变体，这些新突变体与先天性鱼鳞病的发病密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患先天性鱼鳞病。
野生型CYP4F22基因的cDNA开放读码框区的核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示：
atgctgccca tcacagaccg cctgctgcac ctcctggggc tggagaagac ggcgttccgc
atatacgcgg tgtccaccct tctcctcttc ctgctcttct tcctgttccg cctgctgctg
cggttcctga ggctctgcag gagcttctac atcacctgcc gccggctgcg ctgcttcccc
cagcctcccc ggcgcaactg gctgctgggc cacctgggca tgtaccttcc aaatgaggcg
ggccttcaag atgagaagaa ggtactggac aacatgcacc atgtactctt ggtatggatg
ggacctgtcc tgccgctgtt ggttctggtg caccctgatt acatcaaacc ccttttggga
gcctcagctg ccatcgcccc caaggatgac ctcttctatg gcttcctaaa accttggcta
ggggatgggc tgctgctcag caaaggtgac aagtggagcc ggcaccgtcg cctgctgaca
cccgccttcc actttgacat cctgaagcct tacatgaaga tcttcaacca gagcgctgac
attatgcatg ctaaatggcg gcatctggca gagggctcag cggtctccct tgatatgttt
gagcatatca gcctcatgac cctggacagt cttcagaaat gtgtcttcag ctacaacagc
aactgccaag agaagatgag tgattatatc tccgctatca ttgaactgag cgctctgtct
gtccggcgcc agtatcgctt gcaccactac ctcgacttca tttactaccg ctcggcggat
gggcggaggt tccggcaggc ctgtgacatg gtgcaccact tcaccactga agtcatccag
gaacggcggc gggcactgcg tcagcagggg gccgaggcct ggcttaaggc caagcagggg
aagaccttgg actttattga tgtgctgctc ctggccaggg atgaagatgg aaaggaactg
tcagacgagg atatccgagc cgaagcagac accttcatgt ttgagggtca cgacacaaca
tccagtggga tctcttggat gctgttcaat ttggcaaagt atccggaata ccaggagaaa
tgccgagaag agattcagga agtcatgaaa ggccgggagc tggaggagct ggagtgggac
gatctgactc agctgccctt tacaactatg tgcattaagg agagcctgcg ccagtaccca
cctgtcactc ttgtctctcg ccaatgcacg gaggacatca agctcccaga tgggcgcatc
atccccaaag gaatcatctg cttggtcagc atctatggaa cccaccacaa ccccacagtg
tggcctgact ccaaggtgta caacccctac cgctttgacc cggacaaccc acagcagcgc
tctccactgg cctatgtgcc cttctctgca ggacccagga attgcatcgg acagagcttc
gccatggccg agttgcgcgt ggttgtggca ctaacactgc tacgtttccg cctgagcgtg
gaccgaacgc gcaaggtgcg gcggaagccg gagctcatac tgcgcacgga gaacgggctc
tggctcaagg tggagccgct gcctccgcgg gcctga。
野生型CYP4F22基因cDNA编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示：
mlpitdrllh llglektafr iyavstlllf llfflfrlll rflrlcrsfy itcrrlrcfpqpprrnwllg hlgmylpnea glqdekkvld nmhhvllvwm gpvlpllvlv hpdyikpllg asaaiapkddlfygflkpwl gdglllskgd kwsrhrrllt pafhfdilkp ymkifnqsad imhakwrhla egsavsldmfehislmtlds lqkcvfsyns ncqekmsdyi saiielsals vrrqyrlhhy ldfiyyrsad grrfrqacdmvhhftteviq errralrqqg aeawlkakqg ktldfidvll lardedgkel sdediraead tfmfeghdttssgiswmlfn lakypeyqek creeiqevmk greleelewd dltqlpfttm cikeslrqyp pvtlvsrqctediklpdgri
ipkgiiclvs iygthhnptv wpdskvynpy rfdpdnpqqr splayvpfsa gprncigqsfamaelrvvva ltllrfrlsv drtrkvrrkp elilrtengl wlkveplppr a。
本发明的CYP4F22基因突变体的cDNA开放读码框序列如SEQ ID NO：3所示：
atgctgccca tcacagaccg cctgctgcac ctcctggggc tggagaagac ggcgttccgc
atatacgcgg tgtccaccct tctcctcttc ctgctcttct tcctgttccg cctgctgctg
cggttcctga ggctctgcag gagcttctac atcacctgcc gccggctgcg ctgcttcccc
cagcctcccc ggcgcaactg gctgctgggc cacctgggca tgtaccttcc aaatgaggcg
ggccttcaag atgagaagaa ggtactggac aacatgcacc atgtactctt ggtatggatg
ggacctgtcc tgccgctgtt ggttctggtg caccctgatt acatcaaacc ccttttggga
gcctcagctg ccatcgcccc caaggatgac ctcttctatg gcttcctaaa accttggcta
ggggatgggc tgctgctcag caaaggtgac aagtggagcc ggcaccgtcg cctgctgaca
cccgccttcc actttgacat cctgaagcct tacatgaaga tcttcaacca gagcgctgac
attatgcatg ctaaatggcg gcatctggca gagggctcag cggtctccct tgatatgttt
gagcatatca gcctcatgac cctggacagt cttcagaaat gtgtcttcag ctacaacagc
aactgccaag agaagatgag tgattatatc tccgctatca ttgaactgag cgctctgtct
gtccggcgcc agtatcgctt gcaccactac ctcgacttca tttactaccg ctcggcggat
gggcggaggt tccggcaggc ctgtgacatg gtgcaccact tcaccactga agtcatccag
gaatggcggc gggcactgcg tcagcagggg gccgaggcct ggcttaaggc caagcagggg
aagaccttgg actttattga tgtgctgctc ctggccaggg atgaagatgg aaaggaactg
tcagacgagg atatccgagc cgaagcagac accttcatgt ttgagggtca cgacacaaca
tccagtggga tctcttggat gctgttcaat ttggcaaagt atccggaata ccaggagaaa
tgccgagaag agattcagga agtcatgaaa ggccgggagc tggaggagct ggagtgggac
gatctgactc agctgccctt tacaactatg tgcattaagg agagcctgcg ccagtaccca
cctgtcactc ttgtctctcg ccaatgcacg gaggacatca agctcccaga tgggcgcatc
atccccaaag gaatcatctg cttggtcagc atctatggaa cccaccacaa ccccacagtg
tggcctgact ccaaggtgta caacccctac cgctttgacc cggacaaccc acagcagcgc
tctccactgg cctatgtgcc cttctctgca ggacccagga attgcatcgg acagagcttc
gccatggccg agttgcgcgt ggttgtggca ctaacactgc tacgtttccg cctgagcgtg
gaccgaacgc gcaaggtgcg gcggaagccg gagctcatac tgcgcacgga gaacgggctc
tggctcaagg tggagccgct gcctccgcgg gcctga
突变型CYP4F22基因cDNA编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示：
MLPITDRLLH LLGLEKTAFR IYAVSTLLLF LLFFLFRLLL RFLRLCRSFY ITCRRLRCFPQPPRRNWLLG HLGMYLPNEA GLQDEKKVLD NMHHVLLVWM GPVLPLLVLV HPDYIKPLLG ASAAIAPKDDLFYGFLKPWL GDGLLLSKGD KWSRHRRLLT PAFHFDILKP YMKIFNQSAD IMHAKWRHLA EGSAVSLDMFEHISLMTLDS LQKCVFSYNS NCQEKMSDYI SAIIELSALS VRRQYRLHHY LDFIYYRSAD GRRFRQACDMVHHFTTEVIQ EWRRALRQQG AEAWLKAKQG KTLDFIDVLL LARDEDGKEL SDEDIRAEAD TFMFEGHDTTSSGISWMLFN LAKYPEYQEK CREEIQEVMK GRELEELEWD DLTQLPFTTM CIKESLRQYP PVTLVSRQCTEDIKLPDGRI IPKGIICLVS IYGTHHNPTV WPDSKVYNPY RFDPDNPQQR SPLAYVPFSA GPRNCIGQSFAMAELRVVVA LTLLRFRLSV DRTRKVRRKP ELILRTENGL WLKVEPLPPR A
本发明的CYP4F22基因突变体的cDNA开放读码框序列如SEQ ID NO：5所示：
atgctgccca tcacagaccg cctgctgcac ctcctggggc tggagaagac ggcgttccgc
atatacgcgg tgtccaccct tctcctcttc ctgctcttct tcctgttccg cctgctgctg
cggttcctga ggctctgcag gagcttctac atcacctgcc gccggctgcg ctgcttcccc
cagcctcccc ggcgcaactg gctgctgggc cacctgggca tgtaccttcc aaatgaggcg
ggccttcaag atgagaagaa ggtactggac aacatgcacc atgtactctt ggtatggatg
ggacctgtcc tgccgctgtt ggttctggtg caccctgatt acatcaaacc ccttttggga
gcctcagctg ccatcgcccc caaggatgac ctcttctatg gcttcctaaa accttggcta
ggggatgggc tgctgctcag caaaggtgac aagtggagcc ggcaccgtcg cctgctgaca
cccgccttcc actttgacat cctgaagcct tacatgaaga tcttcaacca gagcgctgac
attatgcatg ctaaatggcg gcatctggca gagggctcag cggtctccct tgatatgttt
gagcatatca gcctcatgac cctggacagt cttcagaaat gtgtcttcag ctacaacagc
aactgccaag agaagatgag tgattatatc tccgctatca ttgaactgag cgctctgtct
gtccggcgcc agtatcgctt gcaccactac ctcgacttca tttactaccg ctcggcggat
gggcggaggt tccggcaggc ctgtgacatg gtgcaccact tcaccactga agtcatccag
gaacggcggc gggcactgcg tcagcagggg gccgaggcct ggcttaaggc caagcagggg
aagaccttgg actttattga tgtgctgctc ctggccaggg atgaagatgg aaaggaactg
tcagacgagg atatccgagc cgaagcagac accttcatgt ttgagggtca cgacacaaca
tccagtggga tctcttggat gctgttcaat ttggcaaagt atccggaata ccaggagaaa
tgccgagaag agattcagga agtcatgaaa ggccgggagc tggaggagct ggagtgggac
gatctgactc agctgccctt tacaactatg tgcattaagg agagcctgtg ccagtaccca
cctgtcactc ttgtctctcg ccaatgcacg gaggacatca agctcccaga tgggcgcatc
atccccaaag gaatcatctg cttggtcagc atctatggaa cccaccacaa ccccacagtg
tggcctgact ccaaggtgta caacccctac cgctttgacc cggacaaccc acagcagcgc
tctccactgg cctatgtgcc cttctctgca ggacccagga attgcatcgg acagagcttc
gccatggccg agttgcgcgt ggttgtggca ctaacactgc tacgtttccg cctgagcgtg
gaccgaacgc gcaaggtgcg gcggaagccg gagctcatac tgcgcacgga gaacgggctc
tggctcaagg tggagccgct gcctccgcgg gcctga
突变型CYP4F22基因cDNA编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示：
MLPITDRLLH LLGLEKTAFR IYAVSTLLLF LLFFLFRLLL RFLRLCRSFY ITCRRLRCFPQPPRRNWLLG HLGMYLPNEA GLQDEKKVLD NMHHVLLVWM GPVLPLLVLV HPDYIKPLLG ASAAIAPKDDLFYGFLKPWL GDGLLLSKGD KWSRHRRLLT PAFHFDILKP YMKIFNQSAD IMHAKWRHLA EGSAVSLDMFEHISLMTLDS LQKCVFSYNS NCQEKMSDYI SAIIELSALS VRRQYRLHHY LDFIYYRSAD GRRFRQACDMVHHFTTEVIQ ERRRALRQQG AEAWLKAKQG KTLDFIDVLL LARDEDGKEL SDEDIRAEAD TFMFEGHDTTSSGISWMLFN LAKYPEYQEK CREEIQEVMK GRELEELEWD DLTQLPFTTM CIKESLCQYP PVTLVSRQCTEDIKLPDGRI IPKGIICLVS IYGTHHNPTV WPDSKVYNPY RFDPDNPQQR SPLAYVPFSA GPRNCIGQSFAMAELRVVVA LTLLRFRLSV DRTRKVRRKP ELILRTENGL WLKVEPLPPR A
发明人发现的新突变体与SEQIDNO：1相比，具有c.C844T或c.C1189T突变，即相对于野生型CYP4F22基因，本发明的CYP4F22基因突变体的第844位或第 1189位碱基均发生C突变为T。由此，其所编码的产物与野生型的CYP4F22相比，具有p.R282W或p.R397C突变，具体地，该突变表示：野生型CYP4F22的第282 位或397位氨基酸Arg突变为氨基酸Trp或Cys。
CYP4F22基因定位于19p13.12，全长43793bp，由14个外显子构成，编码产物是包含531个氨基酸的一种约60kD的细胞色素P450超家族蛋白，在12(R)- 脂氧合酶途径中起重要作用。目前发现CYP4F22的突变会引起先天性鱼鳞病。但是，本发明的CYP4F22基因突变位点c.C844T和c.C1189T并未见报道。
本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与野生型CYP4F22 相比，该分离的多肽具有p.R282W或p.R397C突变，即该突变是由于c.C844T和 c.C1189T的错义突变而引起的，具体地，该突变表示：该分离的多肽野生型 CYP4F22的第282、397位Arg氨基酸突变为Trp或Cys。根据本发明的一些具体示例，该多肽是由前述分离的编码CYP4F22突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患先天性鱼鳞病，也可以通过检测这些多肽在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易患先天性鱼鳞病。
本发明提出了一种用于筛选易患先天性鱼鳞病的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该用于筛选易患先天性鱼鳞病的生物样品的试剂盒包括：适于检测CYP4F22基因突变体的试剂，所述试剂为核酸探针或引物，
优选地，所述核酸探针或引物具有如下所示的核苷酸序列。由此，可以高效地筛选易患先天性鱼鳞病的生物样品。发明人发现，通过采用这些引物，可以在PCR反应体系中通过显著有效地完成对CYP4F22外显子8和外显子11的扩增。
CYP4F22外显子8的扩增引物：
正向5’-ggctcagacctgtaacccag-3’(SEQ ID NO：7)；
反向5’-gagccaccacgcctaatg-3’(SEQ ID NO：8)；
CYP4F22外显子11的扩增引物：
正向5’-ggtggctcggcctctag-3’(SEQ ID NO：9)；
反向5’-tctccctgcacacacaactg-3’(SEQ ID NO：10)。
本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的编码CYP4F22突变体的核酸，即本发明的CYP4F22基因突变体。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗先天性鱼鳞病的药物。其中，所述受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选该受体细胞来源于哺乳动物。
在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其为质粒、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。
本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。从而，本发明的重组细胞能够表达构建体所携带的CYP4F22基因突变体。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗先天性鱼鳞病的药物。根据本发明的实施例，优选所述受体细胞来源于哺乳动物细胞。
本发明利用构建的CYP4F22野生型(pAcGFP1-C1-CYP4F22-WT)和突变体(pAcGFP1-C1-CYP4F22-R282W，pAcGFP1-C1-CYP4F22-R397C)及其重组哺乳动物细胞HEK93T，进行药物筛选。由于CYP4F22两个突变体蛋白的表达显著下降，因此如果有药物能够增加突变体蛋白的表达，则说明该药物对先天性鱼鳞病的治疗有潜在效果。实施例中选取4种能够调控蛋白表达的小分子药物MG132、3-MA、Trichostatin A(TSA)、C646(均从Selleck公司购买)处理CYP4F22野生型、p.R282W、p.R397C构建体重组的HEK293T细胞，免疫印记法检测野生型和突变型CYP4F22的表达，统计学分析发现，TSA可以显著提高p.R282W和p.R397C突变体蛋白的表达，几乎可以达到野生型蛋白的表达水平；而其他三种药物没有显著性提升突变体蛋白的表达。该结果提示TSA在先天性鱼鳞病的治疗方面有潜在价值。如图7所示。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
<110>丰岱荣、赵丽娜、张亚宁
<120>CYP4F22基因突变体、多肽、试剂盒、构建体及重组细胞
<160>14
<210>1
<211>1596
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
atgctgccca tcacagaccg cctgctgcac ctcctggggc tggagaagac ggcgttccgc
atatacgcgg tgtccaccct tctcctcttc ctgctcttct tcctgttccg cctgctgctg
cggttcctga ggctctgcag gagcttctac atcacctgcc gccggctgcg ctgcttcccc
cagcctcccc ggcgcaactg gctgctgggc cacctgggca tgtaccttcc aaatgaggcg
ggccttcaag atgagaagaa ggtactggac aacatgcacc atgtactctt ggtatggatg
ggacctgtcc tgccgctgtt ggttctggtg caccctgatt acatcaaacc ccttttggga
gcctcagctg ccatcgcccc caaggatgac ctcttctatg gcttcctaaa accttggcta
ggggatgggc tgctgctcag caaaggtgac aagtggagcc ggcaccgtcg cctgctgaca
cccgccttcc actttgacat cctgaagcct tacatgaaga tcttcaacca gagcgctgac
attatgcatg ctaaatggcg gcatctggca gagggctcag cggtctccct tgatatgttt
gagcatatca gcctcatgac cctggacagt cttcagaaat gtgtcttcag ctacaacagc
aactgccaag agaagatgag tgattatatc tccgctatca ttgaactgag cgctctgtct
gtccggcgcc agtatcgctt gcaccactac ctcgacttca tttactaccg ctcggcggat
gggcggaggt tccggcaggc ctgtgacatg gtgcaccact tcaccactga agtcatccag
gaacggcggc gggcactgcg tcagcagggg gccgaggcct ggcttaaggc caagcagggg
aagaccttgg actttattga tgtgctgctc ctggccaggg atgaagatgg aaaggaactg
tcagacgagg atatccgagc cgaagcagac accttcatgt ttgagggtca cgacacaaca
tccagtggga tctcttggat gctgttcaat ttggcaaagt atccggaata ccaggagaaa
tgccgagaag agattcagga agtcatgaaa ggccgggagc tggaggagct ggagtgggac
gatctgactc agctgccctt tacaactatg tgcattaagg agagcctgcg ccagtaccca
cctgtcactc ttgtctctcg ccaatgcacg gaggacatca agctcccaga tgggcgcatc
atccccaaag gaatcatctg cttggtcagc atctatggaa cccaccacaa ccccacagtg
tggcctgact ccaaggtgta caacccctac cgctttgacc cggacaaccc acagcagcgc
tctccactgg cctatgtgcc cttctctgca ggacccagga attgcatcgg acagagcttc
gccatggccg agttgcgcgt ggttgtggca ctaacactgc tacgtttccg cctgagcgtg
gaccgaacgc gcaaggtgcg gcggaagccg gagctcatac tgcgcacgga gaacgggctc
tggctcaagg tggagccgct gcctccgcgg gcctga
<210>2
<211>531
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
mlpitdrllh llglektafr iyavstlllf llfflfrlll rflrlcrsfy itcrrlrcfpqpprrnwllg hlgmylpnea glqdekkvld nmhhvllvwm gpvlpllvlv hpdyikpllg asaaiapkddlfygflkpwl gdglllskgd kwsrhrrllt pafhfdilkp ymkifnqsad imhakwrhla egsavsldmfehislmtlds lqkcvfsyns ncqekmsdyi saiielsals vrrqyrlhhy ldfiyyrsad grrfrqacdmvhhftteviq errralrqqg aeawlkakqg ktldfidvll lardedgkel sdediraead tfmfeghdttssgiswmlfn lakypeyqek creeiqevmk greleelewd dltqlpfttm cikeslrqyp pvtlvsrqctediklpdgri
ipkgiiclvs iygthhnptv wpdskvynpy rfdpdnpqqr splayvpfsa gprncigqsfamaelrvvva ltllrfrlsv drtrkvrrkp elilrtengl wlkveplppr a
<210> 3
<211> 1596
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgctgccca tcacagaccg cctgctgcac ctcctggggc tggagaagac ggcgttccgc
atatacgcgg tgtccaccct tctcctcttc ctgctcttct tcctgttccg cctgctgctg
cggttcctga ggctctgcag gagcttctac atcacctgcc gccggctgcg ctgcttcccc
cagcctcccc ggcgcaactg gctgctgggc cacctgggca tgtaccttcc aaatgaggcg
ggccttcaag atgagaagaa ggtactggac aacatgcacc atgtactctt ggtatggatg
ggacctgtcc tgccgctgtt ggttctggtg caccctgatt acatcaaacc ccttttggga
gcctcagctg ccatcgcccc caaggatgac ctcttctatg gcttcctaaa accttggcta
ggggatgggc tgctgctcag caaaggtgac aagtggagcc ggcaccgtcg cctgctgaca
cccgccttcc actttgacat cctgaagcct tacatgaaga tcttcaacca gagcgctgac
attatgcatg ctaaatggcg gcatctggca gagggctcag cggtctccct tgatatgttt
gagcatatca gcctcatgac cctggacagt cttcagaaat gtgtcttcag ctacaacagc
aactgccaag agaagatgag tgattatatc tccgctatca ttgaactgag cgctctgtct
gtccggcgcc agtatcgctt gcaccactac ctcgacttca tttactaccg ctcggcggat
gggcggaggt tccggcaggc ctgtgacatg gtgcaccact tcaccactga agtcatccag
gaatggcggc gggcactgcg tcagcagggg gccgaggcct ggcttaaggc caagcagggg
aagaccttgg actttattga tgtgctgctc ctggccaggg atgaagatgg aaaggaactg
tcagacgagg atatccgagc cgaagcagac accttcatgt ttgagggtca cgacacaaca
tccagtggga tctcttggat gctgttcaat ttggcaaagt atccggaata ccaggagaaa
tgccgagaag agattcagga agtcatgaaa ggccgggagc tggaggagct ggagtgggac
gatctgactc agctgccctt tacaactatg tgcattaagg agagcctgcg ccagtaccca
cctgtcactc ttgtctctcg ccaatgcacg gaggacatca agctcccaga tgggcgcatc
atccccaaag gaatcatctg cttggtcagc atctatggaa cccaccacaa ccccacagtg
tggcctgact ccaaggtgta caacccctac cgctttgacc cggacaaccc acagcagcgc
tctccactgg cctatgtgcc cttctctgca ggacccagga attgcatcgg acagagcttc
gccatggccg agttgcgcgt ggttgtggca ctaacactgc tacgtttccg cctgagcgtg
gaccgaacgc gcaaggtgcg gcggaagccg gagctcatac tgcgcacgga gaacgggctc
tggctcaagg tggagccgct gcctccgcgg gcctga
<210> 4
<211> 531
<212> PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
MLPITDRLLH LLGLEKTAFR IYAVSTLLLF LLFFLFRLLL RFLRLCRSFY ITCRRLRCFPQPPRRNWLLG HLGMYLPNEA GLQDEKKVLD NMHHVLLVWM GPVLPLLVLV HPDYIKPLLG ASAAIAPKDDLFYGFLKPWL GDGLLLSKGD KWSRHRRLLT PAFHFDILKP YMKIFNQSAD IMHAKWRHLA EGSAVSLDMFEHISLMTLDS LQKCVFSYNS NCQEKMSDYI SAIIELSALS VRRQYRLHHY LDFIYYRSAD GRRFRQACDMVHHFTTEVIQ EWRRALRQQG AEAWLKAKQG KTLDFIDVLL LARDEDGKEL SDEDIRAEAD TFMFEGHDTTSSGISWMLFN LAKYPEYQEK CREEIQEVMK GRELEELEWD DLTQLPFTTM CIKESLRQYP PVTLVSRQCTEDIKLPDGRI IPKGIICLVS IYGTHHNPTV WPDSKVYNPY RFDPDNPQQR SPLAYVPFSA GPRNCIGQSFAMAELRVVVA LTLLRFRLSV DRTRKVRRKP ELILRTENGL WLKVEPLPPR A
<210> 5
<211> 1596
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgctgccca tcacagaccg cctgctgcac ctcctggggc tggagaagac ggcgttccgc
atatacgcgg tgtccaccct tctcctcttc ctgctcttct tcctgttccg cctgctgctg
cggttcctga ggctctgcag gagcttctac atcacctgcc gccggctgcg ctgcttcccc
cagcctcccc ggcgcaactg gctgctgggc cacctgggca tgtaccttcc aaatgaggcg
ggccttcaag atgagaagaa ggtactggac aacatgcacc atgtactctt ggtatggatg
ggacctgtcc tgccgctgtt ggttctggtg caccctgatt acatcaaacc ccttttggga
gcctcagctg ccatcgcccc caaggatgac ctcttctatg gcttcctaaa accttggcta
ggggatgggc tgctgctcag caaaggtgac aagtggagcc ggcaccgtcg cctgctgaca
cccgccttcc actttgacat cctgaagcct tacatgaaga tcttcaacca gagcgctgac
attatgcatg ctaaatggcg gcatctggca gagggctcag cggtctccct tgatatgttt
gagcatatca gcctcatgac cctggacagt cttcagaaat gtgtcttcag ctacaacagc
aactgccaag agaagatgag tgattatatc tccgctatca ttgaactgag cgctctgtct
gtccggcgcc agtatcgctt gcaccactac ctcgacttca tttactaccg ctcggcggat
gggcggaggt tccggcaggc ctgtgacatg gtgcaccact tcaccactga agtcatccag
gaacggcggc gggcactgcg tcagcagggg gccgaggcct ggcttaaggc caagcagggg
aagaccttgg actttattga tgtgctgctc ctggccaggg atgaagatgg aaaggaactg
tcagacgagg atatccgagc cgaagcagac accttcatgt ttgagggtca cgacacaaca
tccagtggga tctcttggat gctgttcaat ttggcaaagt atccggaata ccaggagaaa
tgccgagaag agattcagga agtcatgaaa ggccgggagc tggaggagct ggagtgggac
gatctgactc agctgccctt tacaactatg tgcattaagg agagcctgtg ccagtaccca
cctgtcactc ttgtctctcg ccaatgcacg gaggacatca agctcccaga tgggcgcatc
atccccaaag gaatcatctg cttggtcagc atctatggaa cccaccacaa ccccacagtg
tggcctgact ccaaggtgta caacccctac cgctttgacc cggacaaccc acagcagcgc
tctccactgg cctatgtgcc cttctctgca ggacccagga attgcatcgg acagagcttc
gccatggccg agttgcgcgt ggttgtggca ctaacactgc tacgtttccg cctgagcgtg
gaccgaacgc gcaaggtgcg gcggaagccg gagctcatac tgcgcacgga gaacgggctc
tggctcaagg tggagccgct gcctccgcgg gcctga
<210> 6
<211> 531
<212> PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
MLPITDRLLH LLGLEKTAFR IYAVSTLLLF LLFFLFRLLL RFLRLCRSFY ITCRRLRCFPQPPRRNWLLG HLGMYLPNEA GLQDEKKVLD NMHHVLLVWM GPVLPLLVLV HPDYIKPLLG ASAAIAPKDDLFYGFLKPWL GDGLLLSKGD KWSRHRRLLT PAFHFDILKP YMKIFNQSAD IMHAKWRHLA EGSAVSLDMFEHISLMTLDS LQKCVFSYNS NCQEKMSDYI SAIIELSALS VRRQYRLHHY LDFIYYRSAD GRRFRQACDMVHHFTTEVIQ ERRRALRQQG AEAWLKAKQG KTLDFIDVLL LARDEDGKEL SDEDIRAEAD TFMFEGHDTTSSGISWMLFN LAKYPEYQEK CREEIQEVMK GRELEELEWD DLTQLPFTTM CIKESLCQYP PVTLVSRQCTEDIKLPDGRI IPKGIICLVS IYGTHHNPTV WPDSKVYNPY RFDPDNPQQR SPLAYVPFSA GPRNCIGQSFAMAELRVVVA LTLLRFRLSV DRTRKVRRKP ELILRTENGL WLKVEPLPPR A
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>7
ggctcagacctgtaacccag
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>8
gagccaccacgcctaatg
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggtggctcggcctctag
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tctccctgcacacacaactg
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>11
tgaagtcatccaggaatggcggcgggcact
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>12
ttcctggatgacttcagtggt
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>13
cattaaggagagcctgtgccagtacccacctgtcact
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>14
caggctctccttaatgcacatag

Claims (8)

1.一种CYP4F22基因突变体，其特征在于，所述编码CYP4F22突变体的核酸是第8号外显子的844位核苷酸，存在C→T突变，序列为SEQ ID NO：3；或第11号外显子的1189位核苷酸，存在C→T突变，序列为SEQ ID NO：5。
2.一种应用如权利要求1所述的CYP4F22基因突变体的多肽，其特征在于，所述多肽具有p.R282W，序列为SEQ ID NO：4；或p.R397C突变，序列为SEQ ID NO：6。
3.一种应用如权利要求1所述的CYP4F22基因突变体的用于筛选易患先天性鱼鳞病的生物样品的试剂盒，其特征在于，所述用于筛选易患先天性鱼鳞病的生物样品的试剂盒含有特异检测CYP4F22基因突变体p.R282W或p.R397C的试剂。
4.如权利要求3所述的用于筛选易患先天性鱼鳞病的生物样品的试剂盒，其特征在于，所述试剂为核酸引物，所述核酸引物包括：
CYP4F22基因c.844C→T突变所在外显子8的扩增引物：正向SEQ ID NO：7；反向SEQ IDNO：8；
CYP4F22基因c.1189C→T突变所在外显子11的扩增引物：正向SEQ ID NO：9；反向SEQID NO：10。
5.一种应用如权利要求1所述的CYP4F22基因突变体的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体含有CYP4F22基因p.R282W或p.R397C突变体。
6.一种如权利要求5所述核酸构建体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
设计针对野生型CYP4F22 cDNA的全长的上下游扩增引物，上游引物带Kpn I酶切位点，下游引物带BamH I酶切位点，PCR方法扩增CYP4F22开放读码框序列并进行Kpn I和BamH双酶切与纯化；商业化的GFP表达载体(pAcGFP1-C1 vector)经Kpn I和BamH I双酶切并纯化后，与酶切纯化的CYP4F22开放读码框片段，经T4连接酶连接成环状双链DNA后，转化DH5α感受态细胞，接种于卡那霉素抗性的琼脂糖平板中过夜培养，挑取单克隆进行Sanger测序，鉴定pAcGFP1-C1-CYP4F22-WT的序列。利用构建好的pAcGFP1-C1-CYP4F22-WT野生型表达载体，通过定点突变法，分别构建p.R282W或p.R397C突变体；p.R282W突变体构建所用定点突变引物序列：正向SEQ ID NO：11，反向SEQ ID NO：12；p.R397C突变体构建所用定点突变引物序列：正向SEQ ID NO：13，反向SEQ ID NO：14。
7.一种应用如权利要求5所述的核酸构建体转染获得的重组细胞，所述重组细胞由所述的含有CYP4F22基因p.R282W或p.R397C突变体的核酸构建体转染受体细胞获得。
8.一种如权利要求7所述的重组细胞在筛选制备治疗先天性鱼鳞病的药物中的应用。
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