JP6143133B2 - ヒト化抗ヒト上皮成長因子受容体抗体、そのコード遺伝子及びその応用 - Google Patents
ヒト化抗ヒト上皮成長因子受容体抗体、そのコード遺伝子及びその応用 Download PDFInfo
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Description
本発明は治療用ヒト化遺伝子工学抗体の製造及び応用に関し、特に、特異性的にヒト上皮成長因子受容体（epidemic growth factor receptor、EGFR）に対しての抗体、そのコード遺伝子及びその応用に関する。
上皮成長因子受容体（EGFR）は上皮成長因子遺伝子（erbB）ファミリの一つであり、例えば、乳癌、結腸癌、頭頚腫瘍、腎癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌の多種の腫瘍の発展において重要的な影響がある。国内外の多くの研究によれば、EGFRに対する抗体は、細胞外にリガンドの結合を阻害することによりEGFRシグナル伝達経路の抑制を効率的に実現でき、EGFR表現による多種のヒト腫瘍、特に頭頚部鱗状細胞癌（80％〜100%）、結直腸癌(25%〜77%)、非小細胞型肺癌(40%〜80%)、膵臓癌などに対して優れた治療効果を有する。上皮成長因子受容体は、今まで深く研究され、且つ注目されている腫瘍治療標的の一つであり、遺伝子工学手段で抗EGFRのモノクローナル抗体を開発することは、今までの腫瘍治療の研究ホットスポットの一つである。
最近、2株の抗EGFRの治療性抗体が米国のFDAに許可され、即ちEGFRに対するマウス-ヒトキメラ抗体のセツキシマブ（Cetuximab、商品名「アービタックス」）、及び完全ヒト抗体のパニツムマブ（Panitumumab）であり、それらは結直腸癌及び頭頚部腫瘍の治療に用いられる。2005年では、抗EGFRのヒト化抗体ニモツズマブ（Nimotuzumab、商品名「ニモツズマブ」）は中国薬品監督局（CFDA）に許可される１類の新薬証書を獲得した。該標的に対して研究されている抗体として、ヒト化モノクローナル抗体Pertuzumab、ヒト化抗体Zalutumumab及びNecitumumabなどが含まれる。それらは結合の抗原エピトープはそれぞれ異なっているが、いずれもEGFR介在を抑制する生物学的機能を発揮できる。
ヒト抗体は治療性抗体の最終的な発展方向であり、臨床において、ヒト抗体を応用することにより、抗体の免疫原性を最大限に減少し、体内における抗体の半減期を延長でき、且つヒト免疫グロブリンのFc断片の免疫介在調節、ADCC及びCDC反応によって、抗体の生物学的反応を向上させることができる。ヒト抗体を開発するための主要な手段は、抗体ライブラリー技術及びトランスジェニックマウス技術を含む。最近、大容量抗体ライブラリー技術が既に成熟し、特にファージディスプレイ抗体ライブラリー技術は、多株の完全ヒト抗体の市販に成功した。既に構築された大容量抗体ライブラリーとして、CAT社の半合成抗体ライブラリー及びMarphosys AG社の全長合成抗体ライブラリーは、最も代表的な成功例である。特にMarphosys AG社のHuCAL GOLD技術により、開発利点を有する数十株の候補抗体が獲得され、最近、臨床段階にある項目が17件もある。該技術の最も大きい利点は、合理的な設計により抗体ライブラリーを最適化できることであり、また、その抗体フレーム遺伝子が置換可能のボックス構造なので、後期の抗体最適化及び改造に有利である。当該優勢に基づき、HuCALライブラリーは既にその抗体ライブラリーを第三世代まで更新し、ライブラリーの容量が4.5ｘ1010となり、抗体ライブラリーから親和力がpMレベルに至る高親和力の抗体を選ぶことができる。それで、最近では、技術の点で抗体ライブラリー技術を利用して治療性ヒト抗体を得ることは既に成熟し、今のところ最も成功した治療性抗体の開発手段の一つと認められている。出願人らは技術の最適化及び探索を通して、効率的なDNA接続及び転換の方法を発明し、更にそれを大容量ファージ抗体ライブラリーの構築に用いて、ライブラリー容量が1.35ｘ1010に至る大容量全合成ファージ単鎖ヒト抗体資源ライブラリーを構築した（ZL.200910091261.8）。そして、該抗体ライブラリーを利用して、異なる標的に対する特異性抗体が複数得られた。本発明の抗体Ame55は抗体ライブラリーからスクリーニングされて得られたものである。
本発明は、EGFRの発現に関する疾病、特にEGFRを発現する腫瘍及び自己免疫性疾病の治療及び予防に用いる抗体治療を提供する。
本発明の第一の目的は、ヒト抗EGFR抗体及びその活性断片のアミノ酸配列を提供することである。
本発明の第二の目的は、前記抗体またはその活性断片をコードする遺伝子を提供することである。
本発明の第三の目的は、EGFRを発現する悪性腫瘍及び自己免疫性疾病の治療薬物における前記抗体及びその活性断片の応用を提供することである。
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本発明は、ファージ表面ディスプレイ技術を用いて、多回のバイオパニング（bio-panning）により、大容量全合成ヒト単鎖抗体ライブラリーから特異性抗ヒトEGFRの単鎖遺伝子工学抗体(single chain variable fragment, scFv)を選ぶことである。本発明の実施例において、前記抗体の軽重鎖可変領域をそれぞれを哺乳類動物細胞の完全抗体一過性発現ベクターpABL及びpABG1に導入し、コトランスフェクション(cotransfection)HEK 293T細胞の一過性な分泌発現により、完全抗体Ame55を得る。
本発明が提供する抗体可変領域アミノ酸配列パターンはFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4である。ここで、FR1〜4は４つのフレームワーク領域を表示し、CDR1〜3は３つの超可変領域を表示する。FR1〜4は定常領域配列から分離されたもの（例えばヒト免疫グロブリン軽重鎖類、亜類または亜ファミリの最も一般なアミノ酸）であってもよく、個々の抗体フレームワーク領域から分離されたもの、または異なるフレームワーク領域遺伝子から組み合わされたものであってもよい。例えば、Kabatなどのライブラリに収録された無数のヒト抗体フレームワーク領域配列が挙げられる。
その中に、重鎖可変領域がヒト免疫グロブリン亜群ヒト重鎖VH Vファミリであり、軽鎖可変領域がLambda IIIファミリであるものがある。軽重鎖のCDR領域について、アラニンスキャニング及びその他の同類アミノ酸突然変異により大量の突然変異体を得て、軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3の突然変異体を評価した結果によれば、CDRL1の配列が SGDX1LGDKYX2X3(SEQ ID NO 1)である。ここで、X1がAla、Gly、Asn、Lysであってもよく、Lys及びGlyが好ましい；X2がAla、Val及びIleであってもよく、Alaが好ましい；X3がSer及びTyrであってもよく、Serが好ましい。CDR2Lの配列がEDX1KRPS（SEQ ID NO 2）であり、X1がSer、Thr、Ala及びGlyであってもよく、Serが好ましい。CDRL3の配列がX1X2WDX3DWX4MP（SEQ ID NO 3）であってもよく、ここで、X1がSer、Ala、Gly、Leu、Asn、Tyr及びGlnであり、Serが好ましい；X2がVal、Ser、Ala及びLeuであってもよく、SerまたはAlaが好ましい；X3がGly、Ala及びProであってもよく、Glyが好ましい；X4がGly及びSerであってもよく、Glyが好ましい。重鎖CDR2及びCDR3の突然変異体を評価する結果によれば、CDRH2の配列がX1IIYPX2DSDTRYSPSFQ(SEQ ID NO 5)であり、ここで、X1がGly及びSerであってもよく、Glyが好ましい；X2がGly及びSerであってもよく、Glyが好ましい。CDR3Hの配列がGIIYPSNVX1V（SEQ ID NO 6）であり、ここで、X1がAla、Ser及びGlyであってもよく、SerまたはAlaが好ましい。該抗体の軽重鎖CDR領域に対してアラニンスキャニングを行った結果、抗体とEGFRの結合に対して、軽重鎖CDR3及び軽鎖CDR1と重鎖CDR2が極めて重要であることが示され、一つのみのアミノ酸の変化により、親和力の数倍ないし数十倍の変更が起きる。具体的には実施例5を参照する。
本発明が提供するヒト抗ヒトEGFR抗体は、その軽鎖可変領域がSEQ ID NO 3に示されるアミノ酸配列を含む。
更に、その軽鎖可変領域は、SEQ ID NO 1及びSEQ ID NO 2に示されるアミノ酸配列を含む。
更に、その軽鎖可変領域は、SEQ ID NO 7に示されるアミノ酸配列を含む。
更に、本発明が提供するヒト抗ヒトEGFR抗体は、その重鎖可変領域が、SEQ ID NO 5及びSEQ ID NO 6に示されるアミノ酸配列を含む。
更に、その重鎖可変領域は、SEQ ID NO 4に示されるアミノ酸配列も含む。
更に、その重鎖可変領域はSEQ ID NO 8に示されるアミノ酸配列も含む。
本発明が提供するヒト抗ヒトEGFR抗体は、単鎖抗体、Fab、微型抗体、キメラ抗体または全長抗体免疫グロブリンIgG1、IgG2、IgA、IgE、IgM、IgG4、IgDを含む。
本発明が提供するヒト抗ヒトEGFR抗体Ame55は、その重鎖可変領域がVH5に由来し、その軽鎖可変領域がVλ3に由来し、その抗体亜型がIgG1である。
本発明が提供するヒト抗ヒトEGFR抗体は、その軽鎖可変領域がSEQ ID NO 3に示されるアミノ酸配列を含み、その重鎖可変領域がSEQ ID NO 6に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明が提供するヒト抗ヒトEGFR抗体は、その軽鎖可変領域がSEQ ID NO 3に示されるアミノ酸配列を含み、その重鎖可変領域がSEQ ID NO 5及びSEQ ID NO 6に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明が提供するヒト抗ヒトEGFR抗体は、その軽鎖可変領域がSEQ ID NO 7に示されるアミノ酸配列を含み、その重鎖可変領域がSEQ ID NO 8に示されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
本発明が提供するヒト抗ヒトEGFR抗体は、少なくとも約10-8Mの親和力でヒトEGFRと結合する。該抗体はEGFRリガンドとヒトEGFRの結合を抑制する。該抗体はEGFRを発現する細胞と結合する。前記の細胞は、ヒト皮膚癌細胞、ヒト肝癌細胞、ヒト結腸癌細胞、ヒト子宮頚癌細胞、卵巣癌細胞、ヒト肺癌細胞、膀胱癌細胞、乳癌細胞、腎癌細胞、前立腺癌細胞、頭頚部腫瘍鱗状細胞、膵臓癌細胞、滑膜線維芽細胞またはケラチノサイトである。
本発明は、前記抗体をコードする遺伝子を提供する。
その中に、軽鎖可変領域をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、
1）、SEQ ID NO 9に示されるDNA配列、
2）、ストリンジェントな条件下で、1）に限定されたDNA配列とハイブリダイズし、且つ前記の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、
3）、1）に限定されたDNA配列と比べて70％以上のホモロジーを有し、且つ前記の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
である。
1）、SEQ ID NO 9に示されるDNA配列、
2）、ストリンジェントな条件下で、1）に限定されたDNA配列とハイブリダイズし、且つ前記の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、
3）、1）に限定されたDNA配列と比べて70％以上のホモロジーを有し、且つ前記の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
である。
本発明において、「ストリンジェントな条件」ということは、（1）低いイオン強度及び高い温度でのハイブリダイズ及び溶出、例えば0.2×SSC、0.1%SDS、60℃；または（2）交配する時に変性剤を添加する、例えば50%（V/V）のホルムアミド、0.1%仔牛血清/0.1Ficoll、42℃など；または（3）2つの配列の間に、相同性が少なくとも70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、更に好ましくは95%以上の場合にハイブリダイズすることを意味する。
その中に、重鎖可変領域をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は：
1）、SEQ ID NO 10に示されるDNA配列、
2）、ストリンジェントな条件下で、1）に限定されたDNA配列とハイブリダイズし、且つ前記の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、
3）、1）に限定されたDNA配列と比べて70％以上のホモロジーを有し、且つ前記の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
である。
1）、SEQ ID NO 10に示されるDNA配列、
2）、ストリンジェントな条件下で、1）に限定されたDNA配列とハイブリダイズし、且つ前記の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、
3）、1）に限定されたDNA配列と比べて70％以上のホモロジーを有し、且つ前記の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
である。
なお、コドンの縮退を考えれば、本発明に記載の抗体をコードする遺伝子はSEQ ID NO 9およびSEQ ID NO 10に限定されず、例えば、そのコード領域において、アミノ酸配列を変えない場合、前記の抗体をコードする遺伝子配列を改変し、抗体コードが同じな遺伝子を獲得してもよい。当業者は、抗体が発現される宿主のコドンの偏向に応じて改造遺伝子を人工的に合成することにより、抗体の発現効率を向上することができる。
本発明は前記遺伝子を含む発現ベクターも提供する。
本発明は前記発現ベクターを含む宿主菌、宿主細胞または発現カセットを提供する。
本発明は、ファージディスプレイ抗体ライブラリー技術を利用して抗EGFR特異性単鎖抗体を選別して、抗体軽鎖、重鎖可変領域遺伝子を取り、且つそれを完全抗体発現ベクターにクローン化して、哺乳動物発現系またはその他の発現系により完全抗体の発現を行い、完全抗体タンパク質を取ることを含む前記抗体の製造方法を提供する。
前記抗体がEGFRを標的とする疾病治療薬物の製造における応用を提供する。
前記の薬物が抗腫瘍薬、抗炎症薬物または自己免疫性疾病を治療するための薬物である。
前記抗体を含有する薬物または検出試薬も本発明の保護範囲に含まれる。
更に、前記抗体を含有する薬物または検出試薬は、他の一種または多種の抗体と本発明の前記抗体を組み合わせて形成された混合製剤であってもよい。該抗体混合物における他の一種抗体または多種抗体は、他の一種の抗原またはEGFRの異なるエピトープに対する他の抗体であってもよい。疾病に関する複数の標的に対する複合製剤は、治療性抗体の重要な研究方向であることが報告されている。例えば、EGFR及びVEGFRという2つの標的、EGFR及びErbB2という2つの標的に対する抗体を組み合わせて使用すると、抗腫瘍の相乗効果を有する（Pennell NA, Lynch TJ. The Oncologist. 2009, 14: 399-411; Galer CE, Corey CL, Wang ZY, et al. Head Neck. 2011, 33(2): 189-198; Kawaguchi Y, Kono K, Mimura K, et al. British J Cancer, 2007, 97,494-501）；EGFRの異なるエピトープに対する抗体を組み合わせて使用することも、抗腫瘍の明確的な相乗効果をもたらすため（Pedersen MW, Jacobsen HJ, Koefoed K, et al. Cancer Res. 2010, 70: 588-597）、本発明に記載の抗体と他の抗体との複合製剤も、本発明が保護しようとするものである。
本発明は、各種の方法で細胞毒性剤と連結される前記ヒト化抗ヒトEGFR抗体を含有する抗体標的薬物を提供する。
前記の各種の連結方法は、抗体の標識化、体外架橋または分子カップリングである。
前記の細胞毒性剤は、化学分子、放射性同位体、ポリペプチド、毒素及び細胞への殺傷力を持つものまたはアポトーシスを誘導する特性を有するものを含む。
本発明が提供する抗体は、完全抗体、または各種の他の形式の遺伝子工学抗体である。例えば、抗EGFR抗体として、完全抗体または抗体断片であってもよい。抗体分子の自身は治療及び診断に用いることができる。抗体は、標識化、架橋またはカップリング、及び他のタンパク質やポリペプチド分子と融合発現して複合物（例えば細胞毒性物質、放射性毒素及び/または化学分子など）を形成することにより、診断及び治療に用いることができる。
本発明は、抗体をコードする独立遺伝子、発現ベクター、ベクターにて宿主細胞をトランスフェクションする関連制御技術及び宿主細胞、抗体発現工程及び細胞培養の上澄みから抗体を回収することを更に提供する。本発明は抗体を含有する組成物及び薬理学的に許可されるデリバリー分子または溶液も提供する。当該治療用組成物は無菌のものであり、低温で凍結乾燥されることができる。
本発明は、抗体をコードする独立遺伝子、発現ベクター、ベクターにて宿主細胞をトランスフェクションする関連制御技術及び宿主細胞、抗体発現工程及び細胞培養の上澄みから抗体を回収することを更に提供する。本発明は抗体を含有する組成物及び薬理学的に許可されるデリバリー分子または溶液も提供する。当該治療用組成物は無菌のものであり、低温で凍結乾燥されることができる。
本発明は、EGFRが誘導する一種または多種の生物学活性を抑制できる抗EGFR抗体を提供する。この抗体は、EGFRがそのリガンドとの結合を阻害することにより機能を発揮し、EGFRを発現する細胞を殺傷することにより機能を発揮し、または、EGFRと結合して複合物が内化されることで細胞表面のEGFRを消耗することにより機能を発揮することができる。EGFR拮抗剤のあらゆる阻害機能は、同様に本発明の目的と認められるべきである。
ここで開示の保護しようとするSEQ ID NO.1〜8に示される配列は、「保存配列改変」を含み、即ち、前記抗体または前記アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性を明らかに影響・変更しないヌクレオチド及びアミノ酸配列改変である。前記の保存配列改変は、ヌクレオチドまたはアミノ酸の置換、添加または欠落を含む。例えば部位特異的突然変異誘発及びPCR介在変異誘発などの本分野の標準技術により修飾をSEQ ID NO.1〜8に導入することは、保存配列改変の具体例であり、例えば、本発明の実施例において抗体CDR領域に対してアラニンスキャニングをすること、及び一部の部位に対してアミノ酸突然変異をすることなどである。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が相似な側鎖を有するアミノ酸残基またはその他アミノ酸残基に置換されることを含む。本分野において、相似な側鎖を有するアミノ酸残基ファミリはすでに定義された。これらのファミリは、アルカリ性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷的な極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、シスチン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、 フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。このため、同じ側鎖ファミリに由来の他のアミノ酸残基でヒト抗EGFR抗体の非必須アミノ酸残基を置換することが好ましい。
このため、ほとんど保存配列が改変された類似的な配列にコードされ、または保存配列が改変された類似的な配列を有する抗体を含める上記に開示のヌクレオチド配列にコードされた抗体及び/または上記に開示のアミノ酸配列を含有する抗体は、いずれも本発明の保護範囲にあると認められるべきである。
本発明は、本発明の前記抗体または抗体の抗原結合部位の分子を含有する二重特異性または多重特異性分子を提供する。
本発明は、抗体と他のタンパク質及び/またはポリペプチドとの融合タンパク質を提供し、本発明の前記抗体とある機能を有する他のタンパク質またはポリペプチド分子との複合物を含む。
更に、前記の融合タンパク質は、抗体遺伝子が他の抗体または抗体断片、免疫毒素またはサイトカイン遺伝子と連結し組み換え発現ベクターを構築して、哺乳動物細胞または他の発現系を通して獲得される組み替え融合タンパク質分子である。
本発明に記載の抗体Ame55は、良好な治療または応用の見通しを有し、主に組み換えヒトEGFRと特異的に結合する活性を有し、かつA431細胞の表面の天然EGFRと特異的に結合すると表現されている。ELISA及び免疫組織化学実験によって、該抗体は特異性が優れたことを確認した。Western Blotの結果によれば、それは非還元型EGFRのみと特異的に結合し、還元型EGFRと結合しない、または弱く結合することを確認した。
Biacore系によって、該抗体が種々の形状のEGFRと結合する能力を計測した結果、該抗体の組み換えEGFR細胞外領域-Fc融合タンパク質との親和力KDが0.23nM（Biacore3000）である。フローサイトメトリーの解析によると、該抗体がA431細胞表面のEGFRと結合する相対親和力は、市販の抗体であるニモツズマブより高く、市販の抗体であるアービタックスに相当する。本発明の実施例によれば、本発明のEGFR抗体がヒトEGFRと結合する親和力は1nM以下であり、その突然変異体の親和力は10nM以下である。
該抗体は体外でアービタックスとEGFRの結合を抑制することができ、逆に、アービタックスも該抗体とEGFRの結合を抑制することができる。該抗体とアービタックスのエピトープは空間構造の一部が重ねる可能性があると示されている。該抗体は、EGFとEGFRの結合を競争的に抑制することができる。
該抗体はA431細胞の遊走活性を明らかに抑制することができる。細胞スクラッチヒーリングテストの結果によれば、抗体は5-50μg/ml濃度下でA431細胞スクラッチのヒーリングを著しく抑制できる。その同時に、該抗体はA431細胞生長を抑制する機能を明らかに有する。
該抗体は、A431移植腫瘍の腫瘍生長を明らかに抑制する機能を有し、マウス一匹ごとに1mg/3dの投与量で与える場合、腫瘍の抑制率が90%以上であり、一匹ごとに0.2mg/3dの投与量で与える場合、腫瘍抑制率が60%以上である。
該抗体に対して定向及び部位特異的に突然変異を行い、親和力が5倍以上に上がった突然変異体抗体を多株取り、突然変異体抗体の体内腫瘍抑制活性が更に改善され、例えばAmeA2、AmeA2C3、AmeA2C3-HI2、AmeA2C1、AmeA1C1のような複数の抗体の投与量は0.2mg/3dである場合、腫瘍抑制活性が80%以上である。
本発明は、大容量の全長合成抗体ライブラリー技術により、抗EGFRの全ヒト抗体の1株及び一連の親和力が変わらない、または親和力が向上した突然変異体抗体を選別し、且つ発明した抗体は全てEGFRと特異的に結合し、その生物学的機能を抑制することができることを確認した。前記の完全ヒト抗EGFR遺伝子工学抗体の可変領域遺伝子、及び抗体遺伝子の特徴を有する完全抗体遺伝子を使用して、原核細胞、酵母細胞、真核細胞及びいずれかの組み替え系において、該抗体を発現及び生産し、または、これを基礎として再構成され、該抗体遺伝子を含有するあらゆる他の遺伝子を使用して、EGFRの生物学活性を抑制する抗体生成物を取得し、または、体外標識化または架橋の方法で取得された複合物を使用して、臨床でEGFRを過乗発現するまたは突然変異的に発現する悪性腫瘍及び/または自己免疫性疾病を治療するための特異的抗体薬物を製造することができる。
以下、実施例を挙げて本発明の内容を更に説明するが、本発明はこれらに限られない。本発明の主旨や実質を違反しない場合、本発明の方法、工程または条件に対する改変または置換は、全て本発明の範囲に属する。
特に説明しない場合、実施例に用いられる技術手段は当業者に公知の通常手段である。下記実施例に用いられる材料、試剤などは、特に説明しない場合、いずれも商業の経路で得られるのである。
特に説明しない場合、実施例に用いられる技術手段は当業者に公知の通常手段である。下記実施例に用いられる材料、試剤などは、特に説明しない場合、いずれも商業の経路で得られるのである。
実施例１大容量ファージ抗体ライブラリーから特異的抗体を選ぶ
一、材料及び方法：
1. 材料：大容量全長合成ファージ単鎖抗体ライブラリーは中国人民解放軍軍事医学科学院に構築されたものであり、（ZL200910091261.8）、ライブラリー容量は1.35ｘ1010である。抗体ライブラリーを選別するための抗原は、構築された哺乳動物細胞で発現・精製されるEGFR-Fc融合タンパク質（濃度が1mg/mlである）であり、菌株はXL1-Blue（米国 Stratagene）である；用いられたファージはM13KO7（米国Invitrogene 社）である。真核生物発現ベクターpABG1及びpABLは室温で保存されたものであり、ベクターの構造情報は図16に示されたようであり、哺乳動物細胞であるHEK293T細胞はinvitrogene社から購入されたものである。
一、材料及び方法：
1. 材料：大容量全長合成ファージ単鎖抗体ライブラリーは中国人民解放軍軍事医学科学院に構築されたものであり、（ZL200910091261.8）、ライブラリー容量は1.35ｘ1010である。抗体ライブラリーを選別するための抗原は、構築された哺乳動物細胞で発現・精製されるEGFR-Fc融合タンパク質（濃度が1mg/mlである）であり、菌株はXL1-Blue（米国 Stratagene）である；用いられたファージはM13KO7（米国Invitrogene 社）である。真核生物発現ベクターpABG1及びpABLは室温で保存されたものであり、ベクターの構造情報は図16に示されたようであり、哺乳動物細胞であるHEK293T細胞はinvitrogene社から購入されたものである。
2. 方法
2.1 EGFR-Fc融合タンパク質の発現及び精製：
対象としてEGFRの全長細胞外領域（北京義翹神州生物社より購入する(NCBI配列: NM_005228.3)）を選択し、SEQ ID NO 11及びSEQ ID NO 12に示すセンス及びリバースプライマーEGFRF及びEGFRRを設計し、PCR増幅により細胞外ドメイン全長遺伝子を取得し、それを制限酵素EcoRI及びNheI部位でpABG1真核発現ベクターにクローン化し、構築された組み換えプラスミドに対してシークエンシングを行って正確性を判断した後、プラスミドを抽出し、HEK293T細胞をトランスフェクションして一過性発現を行い、Protein A アフィニティーカラムで発現の上澄みを精製し、且つBradford法で精製生成物に対してタンパク質の定量を行う。
2.1 EGFR-Fc融合タンパク質の発現及び精製：
対象としてEGFRの全長細胞外領域（北京義翹神州生物社より購入する(NCBI配列: NM_005228.3)）を選択し、SEQ ID NO 11及びSEQ ID NO 12に示すセンス及びリバースプライマーEGFRF及びEGFRRを設計し、PCR増幅により細胞外ドメイン全長遺伝子を取得し、それを制限酵素EcoRI及びNheI部位でpABG1真核発現ベクターにクローン化し、構築された組み換えプラスミドに対してシークエンシングを行って正確性を判断した後、プラスミドを抽出し、HEK293T細胞をトランスフェクションして一過性発現を行い、Protein A アフィニティーカラムで発現の上澄みを精製し、且つBradford法で精製生成物に対してタンパク質の定量を行う。
2.2 EGFR-hisの発現及び精製
この工程は、方法2.1に基づいて完成された。プライマーEGFRR1(SEQ ID NO 13)を設計し、プライマーEGFRF及びEGFRR1を利用してEGFR細胞外領域全長遺伝子を増幅し、制限酵素EcoRI及びBamHI部位によりpABG1真核発現ベクターにクローンし、構築された組み換えプラスミドに対してシークエンシングを行って正確性を判断した後、プラスミドを抽出し、HEK293T細胞をトランスフェクションして一過性発現を行い、Ni+アフィニティーカラムで発現後の上澄みを精製し、且つBradford法で精製生成物に対してタンパク質の定量を行う。
この工程は、方法2.1に基づいて完成された。プライマーEGFRR1(SEQ ID NO 13)を設計し、プライマーEGFRF及びEGFRR1を利用してEGFR細胞外領域全長遺伝子を増幅し、制限酵素EcoRI及びBamHI部位によりpABG1真核発現ベクターにクローンし、構築された組み換えプラスミドに対してシークエンシングを行って正確性を判断した後、プラスミドを抽出し、HEK293T細胞をトランスフェクションして一過性発現を行い、Ni+アフィニティーカラムで発現後の上澄みを精製し、且つBradford法で精製生成物に対してタンパク質の定量を行う。
2.3ファージ抗体ライブラリーの作製、Pharmacia社の組み換えファージ選別ユーザーマニュアル（Cat.NO.XY-040-00-05）を参照したが、それを少し修正した。具体的には、下記の通りである：
冷凍保存の抗体ライブラリーを取得し、200ml 2×YTCG（グルコース濃度0.5%）の培地で37℃でOD600=0.5まで培養し、MOI=20:1の比率でヘルパーファージM13KO7を添加し、室温で20min静置する。37℃、150rpmの緩やかな搖動テーブルで1h培養し、終濃度が50μg/mlになるまでにカナマイシンを添加し、且つ終濃度が0.1mmol/LになるまでIPTGを添加し、30℃、220rpmの搖動テーブルで10から12h培養する。翌日に、培養された上澄みを遠心分離で取得し、1/5体積のPEG8000緩衝液（20%PEG+2.5mol/L NaCl）を添加し、均一に混合し後で氷に45min放置し、ファージを沈殿させる。4℃、10000gで20min遠心分離し、上澄みを捨てて、2%BSA及び15%グリセロールを含むPBS緩衝液5mlに沈降を再懸濁させ、使用時のため-70℃で冷凍保存する。
冷凍保存の抗体ライブラリーを取得し、200ml 2×YTCG（グルコース濃度0.5%）の培地で37℃でOD600=0.5まで培養し、MOI=20:1の比率でヘルパーファージM13KO7を添加し、室温で20min静置する。37℃、150rpmの緩やかな搖動テーブルで1h培養し、終濃度が50μg/mlになるまでにカナマイシンを添加し、且つ終濃度が0.1mmol/LになるまでIPTGを添加し、30℃、220rpmの搖動テーブルで10から12h培養する。翌日に、培養された上澄みを遠心分離で取得し、1/5体積のPEG8000緩衝液（20%PEG+2.5mol/L NaCl）を添加し、均一に混合し後で氷に45min放置し、ファージを沈殿させる。4℃、10000gで20min遠心分離し、上澄みを捨てて、2%BSA及び15%グリセロールを含むPBS緩衝液5mlに沈降を再懸濁させ、使用時のため-70℃で冷凍保存する。
2.4 ファージの力価の測定
宿主菌（XL1-Blue）の単一クローンを選択してLB培地に接種し、37℃、150rpm搖動テーブルで対数増殖期（OD600=0.5）までに培養する。調製されたファージ懸濁液50μlを取り、LB培地でそれを10倍ずつ段階的に希釈する。一定の倍数に希釈された懸濁液に対数増殖期の宿主菌を入れて、37℃、150から180rpm搖動テーブルで1h培養する。培養後の菌液100または200μlをLBプレートに塗布し、37℃で一夜培養して、翌日にコロニー数を計数し、力価を計算する。
宿主菌（XL1-Blue）の単一クローンを選択してLB培地に接種し、37℃、150rpm搖動テーブルで対数増殖期（OD600=0.5）までに培養する。調製されたファージ懸濁液50μlを取り、LB培地でそれを10倍ずつ段階的に希釈する。一定の倍数に希釈された懸濁液に対数増殖期の宿主菌を入れて、37℃、150から180rpm搖動テーブルで1h培養する。培養後の菌液100または200μlをLBプレートに塗布し、37℃で一夜培養して、翌日にコロニー数を計数し、力価を計算する。
2.3 抗EGFR特異性抗体の選別、Pharmacia社の組み換えファージ選別ユーザーマニュアル（Cat.NO.XY-040-00-05）を参照したが、それを少し補正した。具体的には、下記の通りである：
組み換えタンパク質抗原EGFR-Fcを被覆緩衝液で20μg/mlまで希釈して1ml/管のように免疫管を被覆し、4℃で一夜被覆する。翌日に、PBSで免疫管を2min/回で2回洗浄し、その後、2%BSAで37℃で2hブロッキングする。製造されたファージ抗体ライブラリーをブロッキング液（2%BSA、0.1%Tween 20）で37℃で30minブロッキングする。プレブロッキングファージ抗体ライブラリーをブロッキングの免疫管に入れて、4℃で一夜反応させる。免疫管における溶液を捨てて、洗浄する。第一ラウンド：PBSTにて5min/回で10回洗浄し、PBSにて5min/回で5回洗浄する；第二ラウンド：PBSTにて5min/回で15回洗浄し、PBSにて5min/回で10回洗浄する；第三ラウンド：PBSTにて5min/回で15回洗浄し、PBS+NaClにて5min/回で15回洗浄する。0.2mol/Lのグリシン-塩酸（pH2.2）を1ml添加して溶離させ、室温で10min反応した後直ちに1mol/L TrisでpH7.4までに中和する。第三ラウンドの洗浄では、まず、0.2mol/Lのグリシン-塩酸(Ph4.5)1mlを入れて溶離させ、室温で10min反応し、溶離液を捨てて、PBSで3min/回で2回洗浄する。次に、一般的に溶離する。中和後の溶離液を吸い取り、その中に、対数増殖期の大腸菌XL1-Blue 9mlを入れ、37℃、搖動テーブルで緩やかに1h培養する。その同時に、免疫管をPBSで洗浄した後、対数増殖期の大腸菌XL1-Blue 1 mlで直接的に感染させ、37℃、150rpm搖動テーブルで1h培養した後、溶離後の感染菌液及び直接的に感染された菌液から、それぞれ1%を取って2×YTCTGブレートに塗布し、37℃で明瞭なコロニーを形成するまでに培養し、クローンの数を統計し、投入産出比率を計算する。その同時に、残った菌液を2×YTCTGプレートに塗布し、37℃で一夜培養する。2×YTCTG液体培地でコロニーを採取して、適量の菌液を2×YTCTG液体培地100mlに投入し、37℃、搖動テーブルでOD600=0.5になるまでに培養する際に、MOI=20:1の比率でヘルパーファージM13KO7を添加し、室温で20min静置する。37℃、150rpmの緩やかな搖動テーブルで1h培養し、同体積の2×YTCT培地を添加し、最終濃度が50μg/mlになるまでにカナマイシンを添加して、且つ最終濃度が0.15mMになるまでにIPTGを添加して、30℃、200rpm搖動テーブルで10 h培養し、遠心分離により培地の上澄みを回収して、1/5体積のPEG8000 緩衝液（20%PEG+2.5mol/L NaCl）を添加し、均一に混合された後で氷に45min放置し、ファージを沈殿させる。4℃、10000gを20min遠心分離し、上澄みを捨てて、2%BSAを含むPBS緩衝液5mlに沈降を懸濁させ、使用時のため-70℃で冷凍保存する。3つのファージに対し力価を測定し、比率により合併し、次の選別に用いる。
組み換えタンパク質抗原EGFR-Fcを被覆緩衝液で20μg/mlまで希釈して1ml/管のように免疫管を被覆し、4℃で一夜被覆する。翌日に、PBSで免疫管を2min/回で2回洗浄し、その後、2%BSAで37℃で2hブロッキングする。製造されたファージ抗体ライブラリーをブロッキング液（2%BSA、0.1%Tween 20）で37℃で30minブロッキングする。プレブロッキングファージ抗体ライブラリーをブロッキングの免疫管に入れて、4℃で一夜反応させる。免疫管における溶液を捨てて、洗浄する。第一ラウンド：PBSTにて5min/回で10回洗浄し、PBSにて5min/回で5回洗浄する；第二ラウンド：PBSTにて5min/回で15回洗浄し、PBSにて5min/回で10回洗浄する；第三ラウンド：PBSTにて5min/回で15回洗浄し、PBS+NaClにて5min/回で15回洗浄する。0.2mol/Lのグリシン-塩酸（pH2.2）を1ml添加して溶離させ、室温で10min反応した後直ちに1mol/L TrisでpH7.4までに中和する。第三ラウンドの洗浄では、まず、0.2mol/Lのグリシン-塩酸(Ph4.5)1mlを入れて溶離させ、室温で10min反応し、溶離液を捨てて、PBSで3min/回で2回洗浄する。次に、一般的に溶離する。中和後の溶離液を吸い取り、その中に、対数増殖期の大腸菌XL1-Blue 9mlを入れ、37℃、搖動テーブルで緩やかに1h培養する。その同時に、免疫管をPBSで洗浄した後、対数増殖期の大腸菌XL1-Blue 1 mlで直接的に感染させ、37℃、150rpm搖動テーブルで1h培養した後、溶離後の感染菌液及び直接的に感染された菌液から、それぞれ1%を取って2×YTCTGブレートに塗布し、37℃で明瞭なコロニーを形成するまでに培養し、クローンの数を統計し、投入産出比率を計算する。その同時に、残った菌液を2×YTCTGプレートに塗布し、37℃で一夜培養する。2×YTCTG液体培地でコロニーを採取して、適量の菌液を2×YTCTG液体培地100mlに投入し、37℃、搖動テーブルでOD600=0.5になるまでに培養する際に、MOI=20:1の比率でヘルパーファージM13KO7を添加し、室温で20min静置する。37℃、150rpmの緩やかな搖動テーブルで1h培養し、同体積の2×YTCT培地を添加し、最終濃度が50μg/mlになるまでにカナマイシンを添加して、且つ最終濃度が0.15mMになるまでにIPTGを添加して、30℃、200rpm搖動テーブルで10 h培養し、遠心分離により培地の上澄みを回収して、1/5体積のPEG8000 緩衝液（20%PEG+2.5mol/L NaCl）を添加し、均一に混合された後で氷に45min放置し、ファージを沈殿させる。4℃、10000gを20min遠心分離し、上澄みを捨てて、2%BSAを含むPBS緩衝液5mlに沈降を懸濁させ、使用時のため-70℃で冷凍保存する。3つのファージに対し力価を測定し、比率により合併し、次の選別に用いる。
2.5ファージELISAで陽性クローンを同定する
選別されたクローンをウェルごとに2×YTCTG培地250μlで、96ウェルプレートに入れ、37℃、搖動テーブルでOD600=0.5になるまでに培養し、ヘルパーファージ1×108cfuを加入し、室温で15min静置し、37℃、150rpmの搖動テーブルで1h培養し、同体積の2×YTCTKI（カナマイシン50μg/ml、IPTG 0.2mmol/L ）を添加し、30℃、搖動テーブルで一夜培養する。翌日に、遠心分離により上澄みを回収して、最終濃度が2%となるようにBSAを添加し、最終濃度が0.1%となるようにTween 20を加入し、使用時のため37℃で15min静置する。被覆液で抗原（EGFR）を1μg/mlまで希釈して、50μl /ウェルで96ウェルELISA プレートに添加して、4℃で一夜被覆する。翌日に、被覆液を捨てて、3min/回で、ELISA プレートをPBSTにて2回洗浄し、PBSにて1回洗浄し、200μl /ウェルで37℃で2%BSA+0.1Tween 20により2hブロッキングする。ブロッキング液を捨てて、50μl /ウェルのようにブロッキングされたモノクローンファージ抗体を添加して、37℃で1h静置する。液体を捨てて、200μl /ウェル及び5min/回でPBSTにて2回、PBSにて1回洗浄する。1：5000の希釈比率で、PBSTにてHRPで標識化されたマウス抗M13抗体を希釈すると同時に、最終濃度が2%であるBSAを加入し、37℃で15 minプレブロッキングする。プレブロッキングされたマウス抗M13抗体を50μl /ウェルのようにELISA プレートに添加して、37℃で30min静置する。液体を捨てて、200μl /ウェル及び5min/回でPBSTにて2回、PBSにて1回洗浄する。洗浄液を捨てて50μl /ウェルのようにOPD底物顕色液を添加し、室温で静置して顕色させる。2N H2SO4で顕色を終止させる。マイクロプレートリーダーで光吸収値を測定する。
被覆緩衝液(pH 9.6): Na2CO3 1.59g、 NaHCO3 2.93g、1Lまで二重蒸留水を入れる；
ブロッキング液：l×PBS + 2%BSA + 0.1%Tween 20；
洗浄液：l×PBS + 0.1%Tween 20；
OPD底物液希釈液：0.2M Na2HPO4 (28.4g/L) 25.7ml、0.1Mクエン酸(19.2g/L)24.3ml、蒸留水50ml。
選別されたクローンをウェルごとに2×YTCTG培地250μlで、96ウェルプレートに入れ、37℃、搖動テーブルでOD600=0.5になるまでに培養し、ヘルパーファージ1×108cfuを加入し、室温で15min静置し、37℃、150rpmの搖動テーブルで1h培養し、同体積の2×YTCTKI（カナマイシン50μg/ml、IPTG 0.2mmol/L ）を添加し、30℃、搖動テーブルで一夜培養する。翌日に、遠心分離により上澄みを回収して、最終濃度が2%となるようにBSAを添加し、最終濃度が0.1%となるようにTween 20を加入し、使用時のため37℃で15min静置する。被覆液で抗原（EGFR）を1μg/mlまで希釈して、50μl /ウェルで96ウェルELISA プレートに添加して、4℃で一夜被覆する。翌日に、被覆液を捨てて、3min/回で、ELISA プレートをPBSTにて2回洗浄し、PBSにて1回洗浄し、200μl /ウェルで37℃で2%BSA+0.1Tween 20により2hブロッキングする。ブロッキング液を捨てて、50μl /ウェルのようにブロッキングされたモノクローンファージ抗体を添加して、37℃で1h静置する。液体を捨てて、200μl /ウェル及び5min/回でPBSTにて2回、PBSにて1回洗浄する。1：5000の希釈比率で、PBSTにてHRPで標識化されたマウス抗M13抗体を希釈すると同時に、最終濃度が2%であるBSAを加入し、37℃で15 minプレブロッキングする。プレブロッキングされたマウス抗M13抗体を50μl /ウェルのようにELISA プレートに添加して、37℃で30min静置する。液体を捨てて、200μl /ウェル及び5min/回でPBSTにて2回、PBSにて1回洗浄する。洗浄液を捨てて50μl /ウェルのようにOPD底物顕色液を添加し、室温で静置して顕色させる。2N H2SO4で顕色を終止させる。マイクロプレートリーダーで光吸収値を測定する。
被覆緩衝液(pH 9.6): Na2CO3 1.59g、 NaHCO3 2.93g、1Lまで二重蒸留水を入れる；
ブロッキング液：l×PBS + 2%BSA + 0.1%Tween 20；
洗浄液：l×PBS + 0.1%Tween 20；
OPD底物液希釈液：0.2M Na2HPO4 (28.4g/L) 25.7ml、0.1Mクエン酸(19.2g/L)24.3ml、蒸留水50ml。
2.6 ファージ単鎖抗体を完全抗体に転換する
ベクターpABG1及びpABLをそれぞれに抗体重鎖（例えばSEQ ID NO 10）及び軽鎖(例えばSEQ ID NO 9)可変領域遺伝子をクローン化するために用い、それぞれにプライマーH5F（SEQ ID NO 14）及びHR(SEQ ID NO 15)によりVH5可変領域遺伝子を増幅させる；L3F（SEQ ID NO 16）及びLR(SEQ ID NO 17)によりVλ3可変領域遺伝子を増幅させる。Vλ3可変領域遺伝子が制限酵素Bsr GI及びHindIII切断部位によりベクターPABLにクローンされ、VH5可変領域遺伝子が制限酵素Afl II及びNheI切断部位によりベクターpABG1にクローンされる。組み替えプラスミドが大腸菌DH5αを形質転換し、組み換えプラスミドに対して菌液PCR及びシークエンシング同定を行うことで、正しく構築された完全抗体の軽、重鎖発現ベクターを取得する。大量のプラスミドを抽出した後、抗体軽重鎖を1：1のモル比でHEK293T細胞にトランスフェクションして、完全抗体の一過性発現を行い、ProteinA アフィニティーカラムで上澄みを精製し、精製後の完全抗体に対し電気泳動解析、親和力及び特異性の測定などを行う。
ベクターpABG1及びpABLをそれぞれに抗体重鎖（例えばSEQ ID NO 10）及び軽鎖(例えばSEQ ID NO 9)可変領域遺伝子をクローン化するために用い、それぞれにプライマーH5F（SEQ ID NO 14）及びHR(SEQ ID NO 15)によりVH5可変領域遺伝子を増幅させる；L3F（SEQ ID NO 16）及びLR(SEQ ID NO 17)によりVλ3可変領域遺伝子を増幅させる。Vλ3可変領域遺伝子が制限酵素Bsr GI及びHindIII切断部位によりベクターPABLにクローンされ、VH5可変領域遺伝子が制限酵素Afl II及びNheI切断部位によりベクターpABG1にクローンされる。組み替えプラスミドが大腸菌DH5αを形質転換し、組み換えプラスミドに対して菌液PCR及びシークエンシング同定を行うことで、正しく構築された完全抗体の軽、重鎖発現ベクターを取得する。大量のプラスミドを抽出した後、抗体軽重鎖を1：1のモル比でHEK293T細胞にトランスフェクションして、完全抗体の一過性発現を行い、ProteinA アフィニティーカラムで上澄みを精製し、精製後の完全抗体に対し電気泳動解析、親和力及び特異性の測定などを行う。
二、結果
1. Ame55ファージ抗体の選別及び鑑定
第三回の選別で得られたモノクローナル抗体を同定して、特異的ファージ抗体を取得し、Ame55単鎖抗体のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はSEQ ID NO 18及びSEQ ID NO 19のように示される。Ame55単鎖抗体の軽鎖可変領域、重鎖可変領域のヌクレオチド配列はそれぞれSEQ ID NO 9及びSEQ ID NO 10のように示される。Ame55単鎖抗体の軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれSEQ ID NO 20及びSEQ ID NO 21のように示される。
ファージのレベルでAme55の特異性を解析し、EGFR-Fcを陽性抗原とし、CD4-D2、AHC、TNF、VEGF、TTC、PBSを対照抗原とし、4℃で一夜ELISA プレートを被覆し、ファージの上澄みを入れて、HRP標識化抗M13抗体を二次抗体として使用してAme55ファージの上澄みの特異性結合の活性をELISA検測する。結果として、Ame55はEGFR-Fcだけと特異的に結合する。（図1）
1. Ame55ファージ抗体の選別及び鑑定
第三回の選別で得られたモノクローナル抗体を同定して、特異的ファージ抗体を取得し、Ame55単鎖抗体のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はSEQ ID NO 18及びSEQ ID NO 19のように示される。Ame55単鎖抗体の軽鎖可変領域、重鎖可変領域のヌクレオチド配列はそれぞれSEQ ID NO 9及びSEQ ID NO 10のように示される。Ame55単鎖抗体の軽鎖可変領域、重鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれSEQ ID NO 20及びSEQ ID NO 21のように示される。
ファージのレベルでAme55の特異性を解析し、EGFR-Fcを陽性抗原とし、CD4-D2、AHC、TNF、VEGF、TTC、PBSを対照抗原とし、4℃で一夜ELISA プレートを被覆し、ファージの上澄みを入れて、HRP標識化抗M13抗体を二次抗体として使用してAme55ファージの上澄みの特異性結合の活性をELISA検測する。結果として、Ame55はEGFR-Fcだけと特異的に結合する。（図1）
2. 完全抗体の発現及び精製
ファージ抗体Ame55の軽重鎖可変領域遺伝子をそれぞれ完全抗体一過性発現ベクターpABL及びpABG1にクローン化し、その完全抗体組み換え発現ベクターを構築し、且つHEK293T細胞一過性発現系で哺乳動物細胞の一過性分泌発現を実現した。Protein Aカラムで精製した後、完全抗体タンパク質のサンプルを取り、その分子量は約150KDである。（図2）。
ファージ抗体Ame55の軽重鎖可変領域遺伝子をそれぞれ完全抗体一過性発現ベクターpABL及びpABG1にクローン化し、その完全抗体組み換え発現ベクターを構築し、且つHEK293T細胞一過性発現系で哺乳動物細胞の一過性分泌発現を実現した。Protein Aカラムで精製した後、完全抗体タンパク質のサンプルを取り、その分子量は約150KDである。（図2）。
実施例2 Ame55結合活性の検出
一、材料及び方法：
1. 材料：
ヒト上皮鱗状癌細胞A431は中国科学院上海細胞ライブラリーから購入されたものであり、アービタックス（CT）はメルク社（ドイツ）の製品である；ニモツズマブ(Hr-3)は北京百泰生物制薬公司の市販されている抗EGFRヒト化抗体である；アバスチン（Avastin、Bevacizumab, rhuMAb-VEGF）はロシュ社から購入されたものである；CM5チップはGE社の製品であり、抗ヒト免疫グロブリンFc捕獲センサ及びストレプトアビジンセンサはいずれも艾瑞生物技術（上海）有限公司から購入されたものである。組み替えヒト上皮成長因子(EGF)は上海欣百諾生物公司から購入されたものである；FreeStyleTM293-F細胞株、発現培地及びトランスフェクション試剤はinvitrogen社から購入されたものである。
一、材料及び方法：
1. 材料：
ヒト上皮鱗状癌細胞A431は中国科学院上海細胞ライブラリーから購入されたものであり、アービタックス（CT）はメルク社（ドイツ）の製品である；ニモツズマブ(Hr-3)は北京百泰生物制薬公司の市販されている抗EGFRヒト化抗体である；アバスチン（Avastin、Bevacizumab, rhuMAb-VEGF）はロシュ社から購入されたものである；CM5チップはGE社の製品であり、抗ヒト免疫グロブリンFc捕獲センサ及びストレプトアビジンセンサはいずれも艾瑞生物技術（上海）有限公司から購入されたものである。組み替えヒト上皮成長因子(EGF)は上海欣百諾生物公司から購入されたものである；FreeStyleTM293-F細胞株、発現培地及びトランスフェクション試剤はinvitrogen社から購入されたものである。
2. 方法
2.1 抗体のA431細胞表面EGFRとの結合活性の免疫蛍光測定
（1）A431細胞を104/ウェルのように96ウェルプレートに植える；
（2）一夜培養した後、培地を捨てて、PBSで2回洗浄する；
（3）5%脱脂粉乳（PBS調製）で、37℃で1hブロッキングした後、4°Cで放置する；
（4）5%脱脂粉乳（PBST調製）で被検サンプルとしての一次抗体を1μg/mlに希釈し、37℃で30minプレブロッキングした後、4°Cで放置する。市販薬物であるアービタックス（Ct）及びニモツズマブ（Hr-3）を陽性抗体対照とし、アバスチン(Avs)を陰性抗体対照とする；
（5）ブロッキング液を捨てて、ブロッキング済みの抗体を加入し、4℃で1hインキュベートする；
（6）PBSTで240rpm、3min/回で3回洗浄する、；
（7）上澄みを捨てて、5%脱脂粉乳でプレブロッキングされたFITC標識ヤギ抗ヒトIgG二次抗体を入れて、4℃で30min結合させる；
（8）PBSTで240rpm、3min/回で3回洗浄する、；
（9）蛍光顕微鏡で観測する。
2.1 抗体のA431細胞表面EGFRとの結合活性の免疫蛍光測定
（1）A431細胞を104/ウェルのように96ウェルプレートに植える；
（2）一夜培養した後、培地を捨てて、PBSで2回洗浄する；
（3）5%脱脂粉乳（PBS調製）で、37℃で1hブロッキングした後、4°Cで放置する；
（4）5%脱脂粉乳（PBST調製）で被検サンプルとしての一次抗体を1μg/mlに希釈し、37℃で30minプレブロッキングした後、4°Cで放置する。市販薬物であるアービタックス（Ct）及びニモツズマブ（Hr-3）を陽性抗体対照とし、アバスチン(Avs)を陰性抗体対照とする；
（5）ブロッキング液を捨てて、ブロッキング済みの抗体を加入し、4℃で1hインキュベートする；
（6）PBSTで240rpm、3min/回で3回洗浄する、；
（7）上澄みを捨てて、5%脱脂粉乳でプレブロッキングされたFITC標識ヤギ抗ヒトIgG二次抗体を入れて、4℃で30min結合させる；
（8）PBSTで240rpm、3min/回で3回洗浄する、；
（9）蛍光顕微鏡で観測する。
2.2 Western Blotting
（1）EGFR-his抗原に対して還元及び非還元SDS-PAGEゲル電気泳動を行った。分離ゲル濃度はそれぞれ10%である。
（2）半乾燥転移法でタンパク質をゲルからニトロセルロース膜に転移させる。電気泳動終了後、半乾燥電気転移法で電気泳動ゲルを200mAで2h転写する。膜に転移した後、5％脱脂乳にて37℃で2hブロッキングする；
（3）ブロッキングした後、膜を切り分け、Ct、hR-3、Ame55をそれぞれに10μg/ml加入し、4℃で一夜結合させる；
（4）TBSTにて10min/回で4回洗浄する、；
（5）1:5000の比率で5%脱脂粉乳に希釈する、且つHRP標識羊抗ヒトIgG（予めに37℃で30minプレブロッキングする）を入れて、37℃で40min育成する；
（6）二回インキュベートした後にTBSTにて10min/回で3回洗浄する、；
（7）顕色：ECL発光液をいれて暗室で現像する。
（1）EGFR-his抗原に対して還元及び非還元SDS-PAGEゲル電気泳動を行った。分離ゲル濃度はそれぞれ10%である。
（2）半乾燥転移法でタンパク質をゲルからニトロセルロース膜に転移させる。電気泳動終了後、半乾燥電気転移法で電気泳動ゲルを200mAで2h転写する。膜に転移した後、5％脱脂乳にて37℃で2hブロッキングする；
（3）ブロッキングした後、膜を切り分け、Ct、hR-3、Ame55をそれぞれに10μg/ml加入し、4℃で一夜結合させる；
（4）TBSTにて10min/回で4回洗浄する、；
（5）1:5000の比率で5%脱脂粉乳に希釈する、且つHRP標識羊抗ヒトIgG（予めに37℃で30minプレブロッキングする）を入れて、37℃で40min育成する；
（6）二回インキュベートした後にTBSTにて10min/回で3回洗浄する、；
（7）顕色：ECL発光液をいれて暗室で現像する。
2.3 Biacore 3000 システムで抗体の親和力を測定する
pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5の10mM NaACを調製し、適当な倍数で抗体を希釈し、CM5チップに予濃縮をし、最適なpHのNaACを被覆希釈液とするとともに、被覆に最適の抗体の希釈濃度を分析する。
被覆：最適なpHを持つNaACで抗体を希釈し、最適な希釈度を選択し、且つCM5チップの一つの通路を選択してカップリングに用いて、カップリング抗体の目標値は2000RUである。もう一つの通路を選択して対照グループとする。試験の条件は25℃、流速が20μL/minであり、緩衝液がHBS-EP（pH7.4、Bia- Certified）である。チップカップリング抗体が目標値となると、チップ表面をブロッキングする。
再生条件の解析：100nMのEGFR-Fcがチップ表面を流れ、それをチップ表面の抗体と結合させて安定した後、最適な再生条件を確定するために、最も優れた再生効果を得るまでにpH3.5、pH2.5、pH2.0、pH1.5の10mMグリシン-塩酸及びpH8.5のホウ酸塩緩衝液を順にチップ表面を流れさせる。
抗体が抗原と結合する動力学の解析：Broford法で抗原EGFR-Fcの濃度を測定し、且つHBS-EP緩衝液で抗原サンプルを希釈し、異なる濃度（0から100 nMから異なる濃度を5つ選ぶ）のEGFR-Fc希釈液を測定する抗体通路及び対照抗体通路に流し、流速が20μL/minであり、結合時間が3minであり、安定時間が1minであり、解離時間が15minである。再生条件：10mM グリシン-塩酸 pH1.5及びpH8.5の硼酸塩緩衝液、流速が20μL/minであり、溶液ごとに30s再生する。
結合定数の計算：Bia-evaluation解析ソフト4で1：1 Langmuir結合モードにより、得られたセンシング図面をフィッティングし、抗原と抗体の結合の動力学定数を計算する。
pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5の10mM NaACを調製し、適当な倍数で抗体を希釈し、CM5チップに予濃縮をし、最適なpHのNaACを被覆希釈液とするとともに、被覆に最適の抗体の希釈濃度を分析する。
被覆：最適なpHを持つNaACで抗体を希釈し、最適な希釈度を選択し、且つCM5チップの一つの通路を選択してカップリングに用いて、カップリング抗体の目標値は2000RUである。もう一つの通路を選択して対照グループとする。試験の条件は25℃、流速が20μL/minであり、緩衝液がHBS-EP（pH7.4、Bia- Certified）である。チップカップリング抗体が目標値となると、チップ表面をブロッキングする。
再生条件の解析：100nMのEGFR-Fcがチップ表面を流れ、それをチップ表面の抗体と結合させて安定した後、最適な再生条件を確定するために、最も優れた再生効果を得るまでにpH3.5、pH2.5、pH2.0、pH1.5の10mMグリシン-塩酸及びpH8.5のホウ酸塩緩衝液を順にチップ表面を流れさせる。
抗体が抗原と結合する動力学の解析：Broford法で抗原EGFR-Fcの濃度を測定し、且つHBS-EP緩衝液で抗原サンプルを希釈し、異なる濃度（0から100 nMから異なる濃度を5つ選ぶ）のEGFR-Fc希釈液を測定する抗体通路及び対照抗体通路に流し、流速が20μL/minであり、結合時間が3minであり、安定時間が1minであり、解離時間が15minである。再生条件：10mM グリシン-塩酸 pH1.5及びpH8.5の硼酸塩緩衝液、流速が20μL/minであり、溶液ごとに30s再生する。
結合定数の計算：Bia-evaluation解析ソフト4で1：1 Langmuir結合モードにより、得られたセンシング図面をフィッティングし、抗原と抗体の結合の動力学定数を計算する。
2.4 フローサイトメトリー
1）EDTAパンクレアチン処理した生長状態が優れたA431細胞を、予冷のPBSに再懸濁させ、洗浄した後、計数し、濃度6×106個/mlとなるように調製する。得られた溶液を100μL /管で1.5ml の遠心分離管にそれぞれ入れて氷に置く。
2）予冷したPBSで測定する抗体を150ug/ml、15ug/ml、1.5ug/ml、0.15ug/mlに希釈し、それぞれ100μLを取り予冷の細胞と混合させる。氷上で40minインキュベートする；
3）4℃の予冷却の遠心分離機に入れ、4000rpm×8minで遠心分離して、上澄みを軽く吸い捨てる；予冷却のPBS溶液1mlを入れて、3回洗浄する；
4）各管に1:100で希釈されたプレブロッキングしたFITC-ウサギ抗ヒトIgG二次抗体を入れて、氷上で30minインキュベートする；
5）前記の3）工程を繰り返して3回洗浄する。
6）各管の細胞に予冷却のPBS溶液500μLを入れ、軽く吹き払って均一させ、サンプルを氷に置いて、フローサイトメーターにて蛍光解析する。測定する抗体を入れないサンプルを対照とする。
1）EDTAパンクレアチン処理した生長状態が優れたA431細胞を、予冷のPBSに再懸濁させ、洗浄した後、計数し、濃度6×106個/mlとなるように調製する。得られた溶液を100μL /管で1.5ml の遠心分離管にそれぞれ入れて氷に置く。
2）予冷したPBSで測定する抗体を150ug/ml、15ug/ml、1.5ug/ml、0.15ug/mlに希釈し、それぞれ100μLを取り予冷の細胞と混合させる。氷上で40minインキュベートする；
3）4℃の予冷却の遠心分離機に入れ、4000rpm×8minで遠心分離して、上澄みを軽く吸い捨てる；予冷却のPBS溶液1mlを入れて、3回洗浄する；
4）各管に1:100で希釈されたプレブロッキングしたFITC-ウサギ抗ヒトIgG二次抗体を入れて、氷上で30minインキュベートする；
5）前記の3）工程を繰り返して3回洗浄する。
6）各管の細胞に予冷却のPBS溶液500μLを入れ、軽く吹き払って均一させ、サンプルを氷に置いて、フローサイトメーターにて蛍光解析する。測定する抗体を入れないサンプルを対照とする。
二、結果
1. 抗体Ame55は非変性EGFRと特異的に結合する
EGFR-hisに対して還元及び非還元SDS-PAGEゲル電気泳動を行い、それぞれに10μg/mlのAme55、アービタックス及びニモツズマブを一次抗体とし、HRP標識羊抗ヒトIgGを二次抗体として、それをWestern blot検測し、その結果を図3のように示す。Amet55は非還元のEGFRのみと特異的に結合する。
1. 抗体Ame55は非変性EGFRと特異的に結合する
EGFR-hisに対して還元及び非還元SDS-PAGEゲル電気泳動を行い、それぞれに10μg/mlのAme55、アービタックス及びニモツズマブを一次抗体とし、HRP標識羊抗ヒトIgGを二次抗体として、それをWestern blot検測し、その結果を図3のように示す。Amet55は非還元のEGFRのみと特異的に結合する。
2. Ame55はA431細胞表面のEGFRと特異的に結合する
EGFRを発現するA431細胞を抗原とし、それぞれにAmet55、無関係抗体であるアバスチン、対照抗体であるアービタックス及びニモツズマブを一次抗体とし、FITC標識羊抗ヒトIgGを二次抗体とし、細胞免疫蛍光検測を行い、その結果を図4に示す。結果によれば、Ame55（図4のB）及び陽性対照抗体アービタックス（図4のC）とニモツズマブ（図4のD）はA431細胞表面のEGFRと特異的に結合することができるが、陰性対照抗体アバスチン（図4のA図）はそれと結合しない。更にフローサイトメトリーにてAme55のA431細胞との結合を解析した結果、一定の濃度範囲内で、該抗体はA431細胞と使用量に依存するように結合する。濃度が1μg/ml未満である場合、Ame55のの蛍光強度は対照抗体アービタックスとニモツズマブの間である。（図5A、図5B、図5C）。
EGFRを発現するA431細胞を抗原とし、それぞれにAmet55、無関係抗体であるアバスチン、対照抗体であるアービタックス及びニモツズマブを一次抗体とし、FITC標識羊抗ヒトIgGを二次抗体とし、細胞免疫蛍光検測を行い、その結果を図4に示す。結果によれば、Ame55（図4のB）及び陽性対照抗体アービタックス（図4のC）とニモツズマブ（図4のD）はA431細胞表面のEGFRと特異的に結合することができるが、陰性対照抗体アバスチン（図4のA図）はそれと結合しない。更にフローサイトメトリーにてAme55のA431細胞との結合を解析した結果、一定の濃度範囲内で、該抗体はA431細胞と使用量に依存するように結合する。濃度が1μg/ml未満である場合、Ame55のの蛍光強度は対照抗体アービタックスとニモツズマブの間である。（図5A、図5B、図5C）。
3. Biacore 3000でAme55とEGFR-Fcとの親和力を測定する
Ame55をCM5チップ表面に被覆し、異なる濃度のEGFR-Fcを流動相として、Biacore 3000システムにて該抗体とEGFR-Fcとの親和力を測定し、その結果を図6に示し、フィッティングした後、その親和力KDは0.231nMであり、Ka=4.21ｘ105であり、Kd=9.73ｘ10-5である。
Ame55をCM5チップ表面に被覆し、異なる濃度のEGFR-Fcを流動相として、Biacore 3000システムにて該抗体とEGFR-Fcとの親和力を測定し、その結果を図6に示し、フィッティングした後、その親和力KDは0.231nMであり、Ka=4.21ｘ105であり、Kd=9.73ｘ10-5である。
実施例3 Ame55の体外活性及びエピトープ解析
一、方法
1.抗体が競争的に結合することを抑制する試験
Ame55を固定相としてCM5チップに被覆し、被覆及び再生の条件が実施例2の方法と同様であり、50nMのEGFR-Fcを第一流動相としてサンプル通路を流させ、時間が3minであり、PBS-Tにて3min洗浄した後、1000nMのアービタックスを第二流動相としてサンプル通路を流させ、時間が3minである。その後、サンプル通路をPBSTにて3min洗浄する。なお、同様に、自身競争抑制対照として1000nMのAme55を第二流動相として前記試験を行う。同様に、アービタックスを固定相として前記試験を繰り返す。
一、方法
1.抗体が競争的に結合することを抑制する試験
Ame55を固定相としてCM5チップに被覆し、被覆及び再生の条件が実施例2の方法と同様であり、50nMのEGFR-Fcを第一流動相としてサンプル通路を流させ、時間が3minであり、PBS-Tにて3min洗浄した後、1000nMのアービタックスを第二流動相としてサンプル通路を流させ、時間が3minである。その後、サンプル通路をPBSTにて3min洗浄する。なお、同様に、自身競争抑制対照として1000nMのAme55を第二流動相として前記試験を行う。同様に、アービタックスを固定相として前記試験を繰り返す。
2. EGFとEGFRと競争的に結合することを抑制する試験
EGF1μg/ウェルで96穴プレートを被覆し、4℃で一夜被覆する。Ame55と陽性対照抗体アービタックス及び無関係対照抗体（本発明で選別の抗IL-6R抗体）をそれぞれに3:1、2:1と1:1のモル比で、2.5μg/ウェルのEGFR-Fcと混合して、37℃で30minプレブロッキングした後、ブロッキング後のEGF被覆したELISAプレートに加え、37℃で1h結合させ、5min/回でPBSTで3回洗浄し、及びPBSで1回洗浄し、プレブロッキングしたHRP標識ヤギ抗ヒトIgGを第2抗体として、37℃で30 min反応させ、PBST及びPBSで洗浄した後、OPD底物顕色液を添加して顕色させ、2N H2SO4の添加により反応が終止した後、OD450nmで光吸収値を測定する。
EGF1μg/ウェルで96穴プレートを被覆し、4℃で一夜被覆する。Ame55と陽性対照抗体アービタックス及び無関係対照抗体（本発明で選別の抗IL-6R抗体）をそれぞれに3:1、2:1と1:1のモル比で、2.5μg/ウェルのEGFR-Fcと混合して、37℃で30minプレブロッキングした後、ブロッキング後のEGF被覆したELISAプレートに加え、37℃で1h結合させ、5min/回でPBSTで3回洗浄し、及びPBSで1回洗浄し、プレブロッキングしたHRP標識ヤギ抗ヒトIgGを第2抗体として、37℃で30 min反応させ、PBST及びPBSで洗浄した後、OPD底物顕色液を添加して顕色させ、2N H2SO4の添加により反応が終止した後、OD450nmで光吸収値を測定する。
3. A431細胞スクラッチヒーリング試験
予め6ウェルプレートの底部にで、ウェルごとに五等分になるように均等分割の直線マークを引く。マークされた6ウェルプレートにA431細胞を105細胞/ウェルのように植える。細胞が対数生長期に成長する際に、200μLピペットで直線に垂直となるように細胞面にマークする。マークした後、PBSで2回洗浄し、最終濃度が25μg/mlになるように被測定の抗体Ame55、陽性対照抗体アービタックス、陰性対照抗体アダリムマブ（米国Abbott社の製品）をウェルに入れて、また、１つの空白ウェルを空白対照とする。それぞれ0h、12h、24hを観測の時間点として、直線で固定位置をマークし、且つ過程を動態的に撮影する。
予め6ウェルプレートの底部にで、ウェルごとに五等分になるように均等分割の直線マークを引く。マークされた6ウェルプレートにA431細胞を105細胞/ウェルのように植える。細胞が対数生長期に成長する際に、200μLピペットで直線に垂直となるように細胞面にマークする。マークした後、PBSで2回洗浄し、最終濃度が25μg/mlになるように被測定の抗体Ame55、陽性対照抗体アービタックス、陰性対照抗体アダリムマブ（米国Abbott社の製品）をウェルに入れて、また、１つの空白ウェルを空白対照とする。それぞれ0h、12h、24hを観測の時間点として、直線で固定位置をマークし、且つ過程を動態的に撮影する。
4. A431細胞の生長を抑制する試験
1）細胞の接種：A431細胞をパンクレアチンで消化して、十分に吹き散らして、計数する；0.5%牛胎児血清を含有する1640培地で細胞濃度を5000 個/mlに調整し、200μL/ウェルで6枚の96ウェルプレートに入れて（最終的に、800から1000個細胞/ウェルのように均一的に分散させる）、細胞は壁に貼り付くように完全に伸ばすために37℃、5% のCO2で24hインキュベートする；
2）測定する抗体を入れて培養する：96ウェルプレートの上澄みを捨てて、PBSにて1回洗浄し、それぞれ200nMのアービタックス（CT）、ニモツズマブ（hR3）、Ame55を調製し、200μL/ウェルで96ウェルプレートに入れて、濃度ごとに3つの複ウェルで、5枚の96ウェルプレートに並行的に入れて、37℃、5%のCO2で培養する；3日目及び5日目に液を変える。0、3、4、5、6、7日目に1枚のプレートをランダムに選択して、染色させる；
3）クリスタルバイオレットの染色：96ウェルプレートの培地を除去し、PBSにて1回洗浄する；100μL/ウェルのように4％パラホルムアルデヒドを入れて、室温で15min静置する；フォルムアルデヒドを捨てて、100μL/ウェルのようにPBSにて希釈された0.5％クリスタルバイオレットの溶液（無水アルコールで調製する5％クリスタルバイオレットの溶液を10倍に希釈する）を入れて、室温で静置して15min染色する；クリスタルバイオレットの溶液を捨てて、水道水に浸漬して、多回洗浄する；室温で蒸留水に浸漬して、560rpm/minの水平搖動テーブルで30 min脱色する；水分を除去し、空気中に一夜乾燥する；
4）細胞の密度の測定： 0日目から7日目の6つの96ウェルプレートを回収し、同じバッチとして脱色及びOD値を測定する。ウェルごとに200μLのsorenson’s溶液を入れて、400rpm/minの水平搖動テーブルで30 min脱色する；各ウェルから100μLを取って新しい96ウェルプレートに置いて、590nmの光吸収値を測定し、630nmの光吸収値を内部参考とする。細胞生長の曲線を絵る。
sorenson’s溶液の調製方法：Ａ液：クエン酸ナトリウム8.967ｇを超純水305mlに溶解する；B液：0.1N HCl 195 ml（38% HCl 1.6mlを超純水193.4 mlに添加する、「酸を水に添加する」）；C液：95%アルコール500 ml（無水アルコール475 mlを超純水25 mlに添加する）；総体積が1LまでにA+B+Cを混合する。
1）細胞の接種：A431細胞をパンクレアチンで消化して、十分に吹き散らして、計数する；0.5%牛胎児血清を含有する1640培地で細胞濃度を5000 個/mlに調整し、200μL/ウェルで6枚の96ウェルプレートに入れて（最終的に、800から1000個細胞/ウェルのように均一的に分散させる）、細胞は壁に貼り付くように完全に伸ばすために37℃、5% のCO2で24hインキュベートする；
2）測定する抗体を入れて培養する：96ウェルプレートの上澄みを捨てて、PBSにて1回洗浄し、それぞれ200nMのアービタックス（CT）、ニモツズマブ（hR3）、Ame55を調製し、200μL/ウェルで96ウェルプレートに入れて、濃度ごとに3つの複ウェルで、5枚の96ウェルプレートに並行的に入れて、37℃、5%のCO2で培養する；3日目及び5日目に液を変える。0、3、4、5、6、7日目に1枚のプレートをランダムに選択して、染色させる；
3）クリスタルバイオレットの染色：96ウェルプレートの培地を除去し、PBSにて1回洗浄する；100μL/ウェルのように4％パラホルムアルデヒドを入れて、室温で15min静置する；フォルムアルデヒドを捨てて、100μL/ウェルのようにPBSにて希釈された0.5％クリスタルバイオレットの溶液（無水アルコールで調製する5％クリスタルバイオレットの溶液を10倍に希釈する）を入れて、室温で静置して15min染色する；クリスタルバイオレットの溶液を捨てて、水道水に浸漬して、多回洗浄する；室温で蒸留水に浸漬して、560rpm/minの水平搖動テーブルで30 min脱色する；水分を除去し、空気中に一夜乾燥する；
4）細胞の密度の測定： 0日目から7日目の6つの96ウェルプレートを回収し、同じバッチとして脱色及びOD値を測定する。ウェルごとに200μLのsorenson’s溶液を入れて、400rpm/minの水平搖動テーブルで30 min脱色する；各ウェルから100μLを取って新しい96ウェルプレートに置いて、590nmの光吸収値を測定し、630nmの光吸収値を内部参考とする。細胞生長の曲線を絵る。
sorenson’s溶液の調製方法：Ａ液：クエン酸ナトリウム8.967ｇを超純水305mlに溶解する；B液：0.1N HCl 195 ml（38% HCl 1.6mlを超純水193.4 mlに添加する、「酸を水に添加する」）；C液：95%アルコール500 ml（無水アルコール475 mlを超純水25 mlに添加する）；総体積が1LまでにA+B+Cを混合する。
二、結果
1. Ame55及びアービタックスがEGFRと結合することを競争的に抑制する作用
Ame55を固定相とし、EGFRを第1の流動相とする（1）、PBSTにて一定の時間に洗浄しする（2）、Ame55（A）及びアービタックス（B）を第2の流動相とする（3）、その後PBSTにて洗浄する（4）。逆に、アービタックスを固定相とし、EGFRを第1の流動相とする（1）、PBSTにて一定の時間に洗浄する（2）、Ame55（D）及びアービタックス（C）を第2の流動相とする（3）、その後PBSTにて洗浄する（4）ことを含む、上記の二つの抗体のエピトープの解析を初めに行った結果（図7A、図7B、図7C及び図7Dを参照）、Ame55 と結合するEGFRは更にアービタックスと結合することができないことを示す（図7B、図7AがAme55の自身抑制対照である）。すなわち、Ame55はEGFRとアービタックスとの結合を抑制することができ、逆に、EGFRはアービタックスと結合すると、さらにAme55と結合することができないことを示す（図7D、図7Cがアービタックスの自身抑制対照である）。即ち、アービタックスはEGFRとAme55との結合を抑制することができる。該結果によれば、二つの抗体の間に抗原エピトープの競争抑制作用を有する可能性があり、その理由は抗原エピトープ構造が類似性または相同性を有するためである可能性がある。
1. Ame55及びアービタックスがEGFRと結合することを競争的に抑制する作用
Ame55を固定相とし、EGFRを第1の流動相とする（1）、PBSTにて一定の時間に洗浄しする（2）、Ame55（A）及びアービタックス（B）を第2の流動相とする（3）、その後PBSTにて洗浄する（4）。逆に、アービタックスを固定相とし、EGFRを第1の流動相とする（1）、PBSTにて一定の時間に洗浄する（2）、Ame55（D）及びアービタックス（C）を第2の流動相とする（3）、その後PBSTにて洗浄する（4）ことを含む、上記の二つの抗体のエピトープの解析を初めに行った結果（図7A、図7B、図7C及び図7Dを参照）、Ame55 と結合するEGFRは更にアービタックスと結合することができないことを示す（図7B、図7AがAme55の自身抑制対照である）。すなわち、Ame55はEGFRとアービタックスとの結合を抑制することができ、逆に、EGFRはアービタックスと結合すると、さらにAme55と結合することができないことを示す（図7D、図7Cがアービタックスの自身抑制対照である）。即ち、アービタックスはEGFRとAme55との結合を抑制することができる。該結果によれば、二つの抗体の間に抗原エピトープの競争抑制作用を有する可能性があり、その理由は抗原エピトープ構造が類似性または相同性を有するためである可能性がある。
2. Ame55はEGFとEGFRとの結合を競争的に抑制する作用
競争ELISA方法でAme55によるEGFのEGFRとの結合を競争的に抑制する作用を解析する。結果によれば、EGFRと抗体のモル比が1:1、1:2及び1:3である場合、Ame55はEGFRとEGFの結合を明らかに抑制するが、陰性対照抗体はそれを抑制する作用を発揮しない。Ame55の抑制活性は同濃度の対照抗体としてのアービタックスより低い（図8参照）。
競争ELISA方法でAme55によるEGFのEGFRとの結合を競争的に抑制する作用を解析する。結果によれば、EGFRと抗体のモル比が1:1、1:2及び1:3である場合、Ame55はEGFRとEGFの結合を明らかに抑制するが、陰性対照抗体はそれを抑制する作用を発揮しない。Ame55の抑制活性は同濃度の対照抗体としてのアービタックスより低い（図8参照）。
3. Ame55 によるA431細胞の遊走を抑制する作用
当該実施例の方法3に記載のように、25ug/ML試験抗体グループの細胞スクラッチヒーリングの状況に対して、固定部位を動態的に24h観測する（図9）、A431細胞遊走活性を抑制する点について、Ame55はアービタックスと同じ抑制活性を示した。一方で、もう一つの陰性対照抗体であり、市販のTNFαに対する抗体薬物であるアダリムマブは、その遊走を抑制する活性がない。該結果は、Ame55はEGFR生物学活性を抑制する機能を有し、臨床で腫瘍転移を治療する応用において優れた作用を有することを示す。
当該実施例の方法3に記載のように、25ug/ML試験抗体グループの細胞スクラッチヒーリングの状況に対して、固定部位を動態的に24h観測する（図9）、A431細胞遊走活性を抑制する点について、Ame55はアービタックスと同じ抑制活性を示した。一方で、もう一つの陰性対照抗体であり、市販のTNFαに対する抗体薬物であるアダリムマブは、その遊走を抑制する活性がない。該結果は、Ame55はEGFR生物学活性を抑制する機能を有し、臨床で腫瘍転移を治療する応用において優れた作用を有することを示す。
4. Ame55によるA431細胞生長を抑制する作用
A431などのEGFRを発現する細胞は、自己分泌されたEGFをEGFR受体に作用させることにより、下流の経路を活性化させ、受容体を脱リン酸化し、細胞の生長及び遊走などを促進する。従って、更に、A431細胞増殖試験でAme55のEGFRを発現する細胞の生長に対する影響を評価し、細胞の生長状況を連続的に観測する。当該実施例の方法4と同様に試験を行った結果によれば（図10）、Ame55はA431細胞の生長を抑制する作用を有するが、その抑制強度は対照抗体アービタックスより弱く、もう一つの対照抗体ニモツズマブ(Nimotuzumab)に相当する。
A431などのEGFRを発現する細胞は、自己分泌されたEGFをEGFR受体に作用させることにより、下流の経路を活性化させ、受容体を脱リン酸化し、細胞の生長及び遊走などを促進する。従って、更に、A431細胞増殖試験でAme55のEGFRを発現する細胞の生長に対する影響を評価し、細胞の生長状況を連続的に観測する。当該実施例の方法4と同様に試験を行った結果によれば（図10）、Ame55はA431細胞の生長を抑制する作用を有するが、その抑制強度は対照抗体アービタックスより弱く、もう一つの対照抗体ニモツズマブ(Nimotuzumab)に相当する。
実施例4 Ame55の体内における腫瘍抑制活性の測定
約20gのメスのヌードマウス47匹の背部の皮下に、濃度が5ｘ107のA431細胞100μLを接種する。腫瘍が50から150mm3に成長する際に、マウスの体重を測定し、腫瘍を測った後、それぞれを生理食塩水、アービタックス、アダリムマブ及びAme55という４つのグループに分ける。そのうち、陽性対照組としてアービタックスは市販の抗EGFRモノクローナル抗体であり、陰性対照としてアダリムマブがTNFαに対する市販の抗体薬物であり、生理食塩水を荷瘤対照とし、抗体の投与量は全て1mg/匹であり、3日ごとに1回投与し、投与する前に体重及び腫瘍の大きさを測定する。腫瘍の計算方法がπ/6*長径*短径2である。36日後に、マウスを殺して腫瘍を取り出し、腫瘍の重さを測定し、統計学的に解析する。
A431細胞移植腫瘍を研究の対象として、Ame55の荷瘤マウスの腫瘍の生長を抑制する作用を評価する。試験結果によれば、1mg/匹の剤量でAme55はA431移植腫瘍の生長を明らかに抑制する作用を有し（図11）、6回続けて投与した後、投与を終止し、4週間観測する。腫瘍の重さの結果によれば、対照グループの腫瘍の平均重量が3.65gであり、Ame55グループの腫瘍の平均重量が0.32gであり、腫瘍の抑制率が90%以上である（図12、13）。
約20gのメスのヌードマウス47匹の背部の皮下に、濃度が5ｘ107のA431細胞100μLを接種する。腫瘍が50から150mm3に成長する際に、マウスの体重を測定し、腫瘍を測った後、それぞれを生理食塩水、アービタックス、アダリムマブ及びAme55という４つのグループに分ける。そのうち、陽性対照組としてアービタックスは市販の抗EGFRモノクローナル抗体であり、陰性対照としてアダリムマブがTNFαに対する市販の抗体薬物であり、生理食塩水を荷瘤対照とし、抗体の投与量は全て1mg/匹であり、3日ごとに1回投与し、投与する前に体重及び腫瘍の大きさを測定する。腫瘍の計算方法がπ/6*長径*短径2である。36日後に、マウスを殺して腫瘍を取り出し、腫瘍の重さを測定し、統計学的に解析する。
A431細胞移植腫瘍を研究の対象として、Ame55の荷瘤マウスの腫瘍の生長を抑制する作用を評価する。試験結果によれば、1mg/匹の剤量でAme55はA431移植腫瘍の生長を明らかに抑制する作用を有し（図11）、6回続けて投与した後、投与を終止し、4週間観測する。腫瘍の重さの結果によれば、対照グループの腫瘍の平均重量が3.65gであり、Ame55グループの腫瘍の平均重量が0.32gであり、腫瘍の抑制率が90%以上である（図12、13）。
実施例5 Ame55の軽重鎖可変領域突然変異体の評価方法
1. アラニンスキャニング
部位特異的突然変異プライマーを設計してCDRL1、CDRL3、CDRH2及びCDRH3のそれぞれにアラニンスキャニングする。当該位置がアラニンである場合、それをそれぞれにGly及びSerに突然変異させる。方法として、プラスミド部位特異的突然変異を採用する。 [参照文献：王栄浩、陳瑞川、劉潤忠。ファスト部位特異的突然変異の最適化方法。厦門大学学報（自然科学版）、2008, Vol 47、sup 2, 282-285]。
1. アラニンスキャニング
部位特異的突然変異プライマーを設計してCDRL1、CDRL3、CDRH2及びCDRH3のそれぞれにアラニンスキャニングする。当該位置がアラニンである場合、それをそれぞれにGly及びSerに突然変異させる。方法として、プラスミド部位特異的突然変異を採用する。 [参照文献：王栄浩、陳瑞川、劉潤忠。ファスト部位特異的突然変異の最適化方法。厦門大学学報（自然科学版）、2008, Vol 47、sup 2, 282-285]。
2. ForteBio QKeにより抗体の親和力を測定する
生物素試剤セルでEGFR-Fc融合タンパク質をビオチン化させ（biotinylation）、ビオチン化されたEGFR-FcをPBSで濃度100nMまで希釈し、20minかけてそれをストレプトアビジンセンサの表面に被覆し、HEPES EPでセンサを5min洗浄し、測定する突然変異体抗体及び親抗体Ame55を20nMの濃度で測定用ウェルに入れて、それを洗浄後のストレプトアビジンセンサ表面のEGFR-Fcと結合させ、結合時間が10minであり、結合がバランスになった後に、複合物をHEPES EPに解離させ、解離時間が20minである。ForteBioソフトウェアパッケージで親和力を解析する。
生物素試剤セルでEGFR-Fc融合タンパク質をビオチン化させ（biotinylation）、ビオチン化されたEGFR-FcをPBSで濃度100nMまで希釈し、20minかけてそれをストレプトアビジンセンサの表面に被覆し、HEPES EPでセンサを5min洗浄し、測定する突然変異体抗体及び親抗体Ame55を20nMの濃度で測定用ウェルに入れて、それを洗浄後のストレプトアビジンセンサ表面のEGFR-Fcと結合させ、結合時間が10minであり、結合がバランスになった後に、複合物をHEPES EPに解離させ、解離時間が20minである。ForteBioソフトウェアパッケージで親和力を解析する。
3. 突然変異体及び親抗体の腫瘍抑制活性の比較
実験方法は実施例4と同じであるが、グループ及び使用量を下記のように設定する：生理食塩水対照、アービタックス対照、Ame55親抗体対照及びAme55の各突然変異体抗体（Ametumumabs）AmeA1C1、AmeA1C3、AmeA1C3-HI2、AmeA2、AmeA2C1、AmeA2C3、AmeA2C3-HI2という全10グループを設置し、グループごとに8匹であり、投与量が0.2mg/匹であり、投与頻度が3d/回であり、投与回数が全6回であり、投与終止6日後にマウスを殺してその腫瘍の重さを測定する。
実験方法は実施例4と同じであるが、グループ及び使用量を下記のように設定する：生理食塩水対照、アービタックス対照、Ame55親抗体対照及びAme55の各突然変異体抗体（Ametumumabs）AmeA1C1、AmeA1C3、AmeA1C3-HI2、AmeA2、AmeA2C1、AmeA2C3、AmeA2C3-HI2という全10グループを設置し、グループごとに8匹であり、投与量が0.2mg/匹であり、投与頻度が3d/回であり、投与回数が全6回であり、投与終止6日後にマウスを殺してその腫瘍の重さを測定する。
二、結果
1. 突然変異体の親和力を解析する
Ame55アミノ酸配列の上で、軽、重鎖可変領域及びフレーム部分領域に対してアミノ酸を突然変異させる。アラニンスキャニング及び定向突然変異の方法により突然変異体を設計する。ForteBio QKeタンパク質分子相互作用システムで突然変異体の親和力を更に選別・評価する。結果によれば（表1）、親抗体Ame55と比べて、軽鎖CDR1及びCDR3、重鎖CDR2及びCDR3の領域における複数のアミノ酸部位は、すべて抗体がEGFRとの結合能力を維持するために重要であり、その原因は、該部位のアミノ酸が相互作用に直接的に関与する、または、該部位のアミノ酸が抗体の正しい空間構造を維持するために重要であるからかもしれない。これらのアミノ酸に改変された部位において、最も注意するべきなのは軽鎖の第26位及び第89位のアミノ酸、及び重鎖の第54位及び第107位のアミノ酸である。先に単点で.アミノ酸置換した後、軽鎖の第89位アミノ酸をValからAlaまたはSerに改変した結果、親和力が4倍以上に向上し、更に軽鎖第26位のGlyまたはLysと組み合わせした結果、親和力が更に向上し、親抗体と比べて親和力が5倍以上に向上したことが発見された。
また、重鎖の54位、第107位アミノ酸をそれぞれSerに置換し、軽鎖89A/Sと組み合わせて発現した後、抗体の親和力は89A/Sよりある程度向上した。親和力の向上は抗体の生物学活性に影響を及ぼすことを更に証明するために、さらにそのうちのAmeA1C1（突然変異軽鎖第26位がGly、第89位がSerである）、AmeA1C3（突然変異軽鎖第26位がLys、第89位がSerである）、AmeA1C3-HI2（突然変異軽鎖第26位がLys、第89位がSerであるとともに、突然変異重鎖第107位がSerである）、AmeA2（突然変異軽鎖第89位がAlaである）、AmeA2C1（突然変異軽鎖第26位がGly、第89位がAlaである）、AmeA2C3（突然変異軽鎖第26位がLys、第89位がAlaである）、AmeA2C3-HI2（突然変異軽鎖第26位がLys、第89位がAlaであるとともに、突然変異重鎖第107位がSerである）という7株の突然変異体抗体の体内活性を評価する。
1. 突然変異体の親和力を解析する
Ame55アミノ酸配列の上で、軽、重鎖可変領域及びフレーム部分領域に対してアミノ酸を突然変異させる。アラニンスキャニング及び定向突然変異の方法により突然変異体を設計する。ForteBio QKeタンパク質分子相互作用システムで突然変異体の親和力を更に選別・評価する。結果によれば（表1）、親抗体Ame55と比べて、軽鎖CDR1及びCDR3、重鎖CDR2及びCDR3の領域における複数のアミノ酸部位は、すべて抗体がEGFRとの結合能力を維持するために重要であり、その原因は、該部位のアミノ酸が相互作用に直接的に関与する、または、該部位のアミノ酸が抗体の正しい空間構造を維持するために重要であるからかもしれない。これらのアミノ酸に改変された部位において、最も注意するべきなのは軽鎖の第26位及び第89位のアミノ酸、及び重鎖の第54位及び第107位のアミノ酸である。先に単点で.アミノ酸置換した後、軽鎖の第89位アミノ酸をValからAlaまたはSerに改変した結果、親和力が4倍以上に向上し、更に軽鎖第26位のGlyまたはLysと組み合わせした結果、親和力が更に向上し、親抗体と比べて親和力が5倍以上に向上したことが発見された。
また、重鎖の54位、第107位アミノ酸をそれぞれSerに置換し、軽鎖89A/Sと組み合わせて発現した後、抗体の親和力は89A/Sよりある程度向上した。親和力の向上は抗体の生物学活性に影響を及ぼすことを更に証明するために、さらにそのうちのAmeA1C1（突然変異軽鎖第26位がGly、第89位がSerである）、AmeA1C3（突然変異軽鎖第26位がLys、第89位がSerである）、AmeA1C3-HI2（突然変異軽鎖第26位がLys、第89位がSerであるとともに、突然変異重鎖第107位がSerである）、AmeA2（突然変異軽鎖第89位がAlaである）、AmeA2C1（突然変異軽鎖第26位がGly、第89位がAlaである）、AmeA2C3（突然変異軽鎖第26位がLys、第89位がAlaである）、AmeA2C3-HI2（突然変異軽鎖第26位がLys、第89位がAlaであるとともに、突然変異重鎖第107位がSerである）という7株の突然変異体抗体の体内活性を評価する。
2. 突然変異体とAme55の腫瘍抑制活性の比較
突然変異体と親抗体の活性の差異を更に評価するため、投与量を低い量の0.2μg/匹までに下げ、親和力が異なる程度向上した突然変異体及び親抗体に対して、腫瘍を移植したマウスに腫瘍抑制活性を比較する。結果によれば、対照抗体群の腫瘍の平均重さが1.854gであり、投与量が0.2μg/匹である場合、親抗体Ame55組（腫瘍の平均重量が0.71g）の腫瘍抑制活性は約60%に低下したが、突然変異体抗体の腫瘍抑制活性が親抗体より明らかに優れ、その腫瘍抑制率がそれぞれ67%から93%であり、一部の抗体の活性が商業化抗体アービタックス（腫瘍抑制率91%）に相当する。該結果によれば、突然変異体親和力の向上が体内生物学活性を改善することに対して有利である。異なるグループの腫瘍生長状況及び腫瘍重量統計解析は図14に示す。
突然変異体と親抗体の活性の差異を更に評価するため、投与量を低い量の0.2μg/匹までに下げ、親和力が異なる程度向上した突然変異体及び親抗体に対して、腫瘍を移植したマウスに腫瘍抑制活性を比較する。結果によれば、対照抗体群の腫瘍の平均重さが1.854gであり、投与量が0.2μg/匹である場合、親抗体Ame55組（腫瘍の平均重量が0.71g）の腫瘍抑制活性は約60%に低下したが、突然変異体抗体の腫瘍抑制活性が親抗体より明らかに優れ、その腫瘍抑制率がそれぞれ67%から93%であり、一部の抗体の活性が商業化抗体アービタックス（腫瘍抑制率91%）に相当する。該結果によれば、突然変異体親和力の向上が体内生物学活性を改善することに対して有利である。異なるグループの腫瘍生長状況及び腫瘍重量統計解析は図14に示す。
実施例6 Ame55軽鎖がEGFRと特異的に結合する能力の測定
本発明では、単独のAme55軽鎖がEGFRと特異的に結合する能力を持つかどうかを験証するために、Ame55の単独の軽鎖（SEQ ID NO.20に記載のアミノ酸配列）を一つのVH3生殖細胞系遺伝子ファミリに由来の抗体重鎖（配列がSEQ ID NO. 22のように示す）と組み合わせ、且つHEK293一過性発現システムで一過性発現させ、Protein Aカラムで精製してもう一つのAme55軽鎖を有する新しい抗体Ame-9Bを得た。Fortebioタンパク質相互作用システムでAme-9BのEGFRとの結合能力を検測し、具体な方法として実施例5を参照する。結果によれば、親和力が低下したが（約6倍低下した）、Ame-9Bは依然としてEGFRとの結合能力を保持した（図15参照）。
本発明では、単独のAme55軽鎖がEGFRと特異的に結合する能力を持つかどうかを験証するために、Ame55の単独の軽鎖（SEQ ID NO.20に記載のアミノ酸配列）を一つのVH3生殖細胞系遺伝子ファミリに由来の抗体重鎖（配列がSEQ ID NO. 22のように示す）と組み合わせ、且つHEK293一過性発現システムで一過性発現させ、Protein Aカラムで精製してもう一つのAme55軽鎖を有する新しい抗体Ame-9Bを得た。Fortebioタンパク質相互作用システムでAme-9BのEGFRとの結合能力を検測し、具体な方法として実施例5を参照する。結果によれば、親和力が低下したが（約6倍低下した）、Ame-9Bは依然としてEGFRとの結合能力を保持した（図15参照）。
産業上の利用可能性
本発明の抗体のヒトEGFRとの結合の親和力は1nM以下であり、その突然変異体の親和力が10nM以下である。且つ、抗体タンパク質IgGの免疫活性及び生物活性の同定を完成した。本発明は前記の抗体がEGFR発現細胞A431荷瘤モデルマウスの腫瘍生長を抑制する優れた生物学活性を有することを確認した。本発明の抗体は標的EGFRの抗腫瘍及びその他疾病（例えば炎症及び自己免疫性疾病）を予防及び治療するための特異的抗体薬物を提供することができる。
本発明の抗体のヒトEGFRとの結合の親和力は1nM以下であり、その突然変異体の親和力が10nM以下である。且つ、抗体タンパク質IgGの免疫活性及び生物活性の同定を完成した。本発明は前記の抗体がEGFR発現細胞A431荷瘤モデルマウスの腫瘍生長を抑制する優れた生物学活性を有することを確認した。本発明の抗体は標的EGFRの抗腫瘍及びその他疾病（例えば炎症及び自己免疫性疾病）を予防及び治療するための特異的抗体薬物を提供することができる。
Claims (18)
- 軽鎖可変領域がSEQ ID NO. 20に示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO. 21に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ヒト化抗ヒトEGFR抗体、あるいは、軽鎖可変領域がSEQ ID NO. 20に示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域がSEQ ID NO. 21に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ヒト化抗ヒトEGFR抗体であって、SEQ ID NO. 20に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および／またはSEQ ID NO. 21に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域において、以下のアミノ酸置換を有する抗体：
（１）SEQ ID NO. 20の26位のアミノ酸がGlyで置換され、かつ、SEQ ID NO. 20の89位のアミノ酸がSerで置換されているか、
（２）SEQ ID NO. 20の26位のアミノ酸がLysで置換され、かつ、SEQ ID NO. 20の89位のアミノ酸がSerで置換されているか、
（３）SEQ ID NO. 20の26位のアミノ酸がGlyで置換され、かつ、SEQ ID NO. 20の89位のアミノ酸がAlaで置換されているか、
（４）SEQ ID NO. 20の26位のアミノ酸がLysで置換され、かつ、SEQ ID NO. 20の89位のアミノ酸がAlaで置換されているか、
（５）SEQ ID NO. 20の26位のアミノ酸がLysで置換され、SEQ ID NO. 20の89位のアミノ酸がSerで置換され、かつ、SEQ ID NO. 21の107位のアミノ酸がSerで置換されているか、
（６）SEQ ID NO. 20の89位のアミノ酸がAlaで置換されているか、あるいは、
（７）SEQ ID NO. 20の26位のアミノ酸がLysで置換され、SEQ ID NO. 20の89位のアミノ酸がAlaで置換され、かつ、SEQ ID NO. 21の107位のアミノ酸がSerで置換されている。 - 単鎖抗体、Fab、ミニ抗体、キメラ抗体または完全抗体免疫グロブリンIgG1、IgG2、IgA、IgE、IgM、IgG4、IgDであることを特徴とする、請求項1に記載の抗体。
- 請求項1または2に記載の抗体をコードする遺伝子。
- 軽鎖可変領域をコードする遺伝子のヌクレオチド配列が
1）、SEQ ID NO. 9に示されるDNA配列、
であることを特徴とする、請求項3に記載の遺伝子。 - 重鎖可変領域をコードする遺伝子のヌクレオチド配列が
1）、SEQ ID NO. 10に示されるDNA配列
であることを特徴とする、請求項3に記載の遺伝子。 - 請求項4または5に記載の遺伝子を含む発現ベクター。
- 請求項6に記載の発現ベクターを有する宿主菌、宿主細胞または発現カセット。
- 少なくとも10-8Mの親和力でヒトEGFRと結合することを特徴とする、請求項1に記載の抗体。
- EGFRリガンドがヒトEGFRと結合することを抑制することを特徴とする、請求項1に記載の抗体。
- ヒト皮膚癌細胞、ヒト肝癌細胞、ヒト結腸癌細胞、ヒト子宮頚癌細胞、卵巣癌細胞、ヒト肺癌細胞、膀胱癌細胞、乳癌細胞、腎癌細胞、前立腺癌細胞、頭頚部腫瘍鱗状細胞、膵臓癌細胞、滑膜線維芽細胞またはケラチノサイト細胞から選ばれる細胞の細胞膜上に発現するEGFRと結合することを特徴とする請求項1に記載の抗体。
- 請求項1または2に記載の抗体の、抗腫瘍薬、抗炎症薬物または自己免疫性疾病を治療するための薬物である薬物の製造における使用。
- 請求項1または2に記載の抗体を含む薬物または検出試薬。
- 他の一種または多種の抗体と請求項1または2に記載の抗体を混合して調製される混合製剤であることを特徴とする、請求項12に記載の薬物または検出試薬。
- 各種の形式で細胞毒性剤に連結する請求項1または2に記載の抗体を含む抗体標的薬物分子。
- 前記の各種の接続形式は、抗体の標識化、体外架橋または分子カップリングであることを特徴とする請求項14に記載の抗体標的薬物分子。
- 前記の細胞毒性剤は、化学分子、放射性同位体、ポリペプチド、毒素、及び細胞への殺傷力を持つものまたはアポトーシスを誘導する特性を持つものであることを特徴とする請求項14に記載の抗体標的薬物分子。
- 請求項1または2に記載の抗体と、ある機能を有する他のタンパク質またはポリペプチド分子との複合物を含むことを特徴とする、抗体と他のタンパク質及び/またはポリペプチドとの融合タンパク質。
- 抗体遺伝子が免疫毒素、抗体または抗体断片またはサイトカイン遺伝子と連結して組み換え発現ベクターを構築し、哺乳動物細胞または他の発現系で組み替え融合タンパク質分子を取得することを特徴とする請求項17に記載の融合タンパク質。
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