CN108699150B - 治疗性抗-cd9抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供新型结合化合物及其治疗应用。

Description

治疗性抗-CD9抗体
技术领域
本发明涉及生物学、免疫学和医学领域。
背景技术
黑素瘤由恶性黑素细胞引起。其主要是由于紫外线暴露所致。在所有不同类型的皮肤癌中，恶性黑素瘤具有最高的死亡率。据估计2012年全世界有约55,000人死于转移性黑素瘤，该数量每年在稳步增加。如果未发生扩散，则大多数患者通过移除黑素瘤来治愈。患有扩散性黑素瘤的患者利用化学疗法、放射疗法和/或最近开发的免疫疗法诸如过继性T细胞疗法或所谓的检查点抑制剂抗体进行治疗。这些新的免疫疗法清楚地表明免疫系统能够识别并攻击黑素瘤肿瘤细胞。然而，此类疗法的应答速率小于50％并且5年生存率为约30％。因此，高度需要附加的治疗选项。本发明提供用于抵抗、预防和/或检测黑素瘤和其它疾病的手段和方法。
本发明的一些实施方案提供了患者来源的人抗体，所述抗体特异于CD9。重要的是，该抗体来源于晚期IV黑色素瘤患者，所述患者在免疫治疗后完全缓解并且在治疗后10年仍然存活且健康。被命名为AT14-012的人抗体能够结合含CD9的细胞，如黑素瘤、胰腺癌、食道癌和结肠癌细胞。
除其它事项之外，跨膜蛋白CD9，也被称为MRP-1、MIC3、DRAP-27和TSPAN-29，是分子量为约23kDa-27kDa的四跨膜蛋白。其普遍存在于多种类型细胞的表面上，包括黑素细胞、内皮细胞、特定类型的神经细胞、肌肉骨骼细胞和特定类型的免疫细胞。CD9还存在于血小板上。CD9具有四个跨膜结构域、小细胞内环和被称为EC1结构域和EC2结构域的两个细胞外环(图1)。CD9与许多其它蛋白质(诸如最重要的整联蛋白(β1整联蛋白)、EWI蛋白(EWI-2和EWI-F)、CD81、CD63和EGFR)相互作用。除了其它事项之外，CD9在细胞粘附、增殖和迁移(包括肿瘤增殖和转移)中起作用。鉴于CD9存在于包括血小板在内的多种类型细胞的细胞表面上，担心目前已知的CD9特异性抗体具有不良副作用。实际上，Kawakatsu等人，1993年描述了抗-CD9抗体的血小板附聚效应导致灵长类模型中的致命性血栓形成。由于肺动脉血栓形成，注射抗-CD9抗体的猴子在5分钟内死亡。这在本专利申请的实施例中被证实：已知的抗-CD9抗体ALB6诱导血小板的强附聚(实施例3)。虽然已经开发并描述了多个CD9抗体，但由于这种严重的副作用，在目前为止，这些已知的CD9抗体均未进行临床试验。
然而，有趣的是，如实施例所示，与原发性黑素细胞相比，抗体AT14-012具有对黑素瘤细胞的更高结合亲和力。此外，与原发性结肠上皮细胞相比，AT14-012对结肠癌具有较高的结合活性。此外，AT14-012结合多种原发性AML母细胞和多种骨髓瘤细胞系，然而其仅表现出对原代人扁桃体细胞的弱反应性。这些示例示出抗体AT14-012优先结合到成簇的CD9而不是结合到单体CD9。已知通过CD9的棕榈酰化有利于形成CD9的同型簇，并且CD9同型簇的含量在原发性肿瘤细胞上，特别是在转移性肿瘤细胞上升高(Yang等人，2006)。因此，AT14-012的优先结合可有助于发现抗体AT14-012对多种肿瘤细胞比对表达CD9的非肿瘤细胞具有更高的结合亲和力。此外，由于结合到成簇的CD9，AT14-012的多聚化可触发专门抑制肿瘤生长或疾病传播的机制。
重要的是，尽管目前已知的CD9特异性抗体，诸如例如ALB6具有如上所述的严重血小板附聚副作用，因此涉及作为副作用的血栓形成的风险，但本发明人已证明抗体AT14-012和AT14-012的多种变体结合相同的独特表位，在体外不诱导任何可检测的血小板附聚。尽管AT14-012和此类变体结合并且甚至轻微活化血小板，但未观察到附聚。
这提供了AT14-012和这些变体优于目前已知的CD9特异性抗体的重要优点，即显著降低血栓形成的风险。实际上，AT14-012来源于其中的黑素瘤患者未示出任何血栓形成迹象。事实上，该黑素瘤患者未表现出由其免疫疗法治疗导致的不良副作用的任何信号，甚至未表现出白癜风，这是导致色素损失的皮肤疾病。
鉴于上述特性，抗体AT14-012或其具有相同结合特异性的功能部分或功能等同物或变体是抵抗、预防和/或检测与表达CD9的细胞相关的病症如黑素瘤的具有吸引力的选择。治疗有益效果已经由以下事实显而易见：该抗体从进入完全缓解并且是长期黑素瘤幸存者的黑素瘤患者中分离。此外，如实施例中所示，AT14-012结合黑素瘤、胰腺癌、食道癌和结肠癌细胞、多种AML母细胞和一些多发性骨髓瘤细胞系。此外，实施例已示出AT14-012在体内黑素瘤小鼠模型中显著对抗肿瘤生长和转移性肿瘤的发展。因此，抗体AT14-012，以及其具有相同结合特异性的功能部分和功能等同物，以及具有对与AT14-012相同表位的特异性和/或与AT14-012竞争结合到CD9的相同表位的其它结合化合物特别适用于检测和/或抵抗与含CD9的细胞相关的疾病，例如CD9阳性肿瘤、骨质疏松症、关节炎、肺部炎症、COPD、结肠炎、阿尔茨海默病以及与先天淋巴细胞相关的病症。此外，因为CD9还在细胞外囊泡上表达，因此这些囊泡也是抗体AT14-012或上述结合化合物的感兴趣的靶。
如实施例中所示，抗体AT14-012结合位于m4区域中的CD9表位。该表位至少包含对应于如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172、L173和F176的CD9氨基酸。具体地讲，其展示出AT14-012结合到如图2所示的CD9序列的氨基酸K169、D171、V172、L173和F176。
CD9特异性抗体在本领域中已知。然而，这些抗体通常不是人的，并且识别不同的表位。本发明所述的人抗体来源于人工文库，其中免疫球蛋白重链和轻链随机配对。相比之下，AT14-012来源于具有自然配对的重链和轻链的人类患者。例如，国际专利申请WO 2009/157623描述了得自人噬菌体展示文库的抗体10E4，其结合如图2所示的CD9序列的氨基酸位置186-191。
WO 2014/145940描述了示出结合到如图2所示的CD9序列的氨基酸位置112-191的鼠CD9特异性单克隆抗体Z9.1和Z9.2，并且WO 2013/099925描述了结合如图2所示的CD9序列的氨基酸位置112-194的鼠抗体CD9-12A12。
WO 2004/007685涉及抗体mAb7，其结合氨基酸序列PKKDV，所述氨基酸序列PKKDV存在于如图2所示的CD9序列的氨基酸位置167-171上。
WO 95/033823涉及鼠单克隆抗体ES5.2D8，其结合CD9序列GLWLRFD。该序列位于如图2所示的CD9序列的氨基酸位置31和37之间。
欧洲专利EP 0508417要求保护抗CD9的氨基酸序列的鼠抗体，所述序列选自如图2所示的CD9序列的氨基酸位置35-60、113-142、131-166和163-191。
本领域中已知的其它CD9特异性抗体为鼠抗体ALB6和HI9a。如实施例中所示，与AT14-012相比，这些鼠类抗体还结合不同的表位。例如，AT14-012显著结合如图2所示的CD9氨基酸K169、D171、V172、L173和F176，然而ALB6不显著结合这些氨基酸残基。此外，如实施例中所示，抗体AT14-012能够结合CD9突变体(突变体m1)，其中CD9的残基112-134(编号如图2所示)由CD81的对应区域置换，然而ALB6和HI9a不能结合该突变体。此外，HI9a能够结合突变体m4(其中CD9的残基168-180由CD81的对应区域置换)，然而AT14-012不结合该突变体m4。最后，实施例示出抗体ALB6结合m3中的氨基酸Q161和m4中的F176。因此，与AT14-012相比，ALB6和HI9a结合不同的表位。
实施例还示出，AT14-012反应性限于灵长类动物，未观察到对表达CD9的小鼠和兔血小板的结合。这证实了与例如确实结合小鼠CD9的鼠抗体ALB6和HI9a相比，由AT14-012结合的CD9中的表位的独特性。
总之，本发明提供了一种新型人CD9特异性抗体，其特异于新型CD9表位。
发明内容
因此，本发明的一些实施方案提供一种分离的、合成的或重组的抗体、或其功能部分或功能等同物，其特异于(即，能够特异性结合)位于如图2所示的CD9序列的氨基酸位置154-181内的至少6个氨基酸。优选地，所述抗体或功能部分或功能等同物特异于如图2所示的CD9序列的氨基酸位置168-181内的至少6个氨基酸。本发明还提供了一种分离的、合成的或重组的抗体、或其功能部分或功能等同物，其特异于(即，能够特异性结合)如图2所示的CD9序列的氨基酸位置168-181内的至少5个氨基酸。
一些实施方案提供了一种分离的、合成的或重组的抗体、或其功能部分或功能等同物，其特异于CD9的表位，其中所述表位包括选自下列的至少一个氨基酸残基：如图2所示的CD9序列的氨基酸K169、D171、V172、L173和T175。一些实施方案提供了一种分离的、合成的或重组的抗体、或其功能部分或功能等同物，其特异于CD9的表位，其中所述表位包括选自下列的至少一个氨基酸残基：如图2所示的CD9序列的氨基酸K169、D171、V172和L173。根据本发明的所述抗体或功能部分或功能等同物优选地还能够特异性结合如图2所示的CD9序列的氨基酸F176。一些实施方案提供了特异于CD9的表位的抗体或功能部分或功能等同物，其中所述表位包括选自下列的至少两个氨基酸残基：如图2所示的CD9序列的氨基酸K169、D171、V172、L173、T175和F176。在一些实施方案中，所述抗体或功能部分或功能等同物特异于CD9的表位，其中所述表位包括选自下列的至少三个、或至少四个或至少五个氨基酸残基：如图2所示的CD9序列的氨基酸K169、D171、V172、L173、T175和F176。所述表位优选包括至少三个、四个或五个氨基酸残基，所述氨基酸残基选自如图2所示的CD9序列的氨基酸K169、D171、V172、L173和F176。优选的实施方案提供根据本发明所述的分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其特异于CD9的表位，其包含对应于如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172、L173和F176的氨基酸。一些实施方案提供根据本发明所述的分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其特异于CD9的表位，其包含对应于如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172、L173和F176的氨基酸。
如本文所用，术语“如图2所示的CD9序列”意指如图2所示的人CD9蛋白的氨基酸序列(UniProt号P21926；基因库登录号NP-001760)。
如本文所用，表述“位于如图2所示的CD9氨基酸位置X和Y内”和“位于如图2所示的CD9序列的氨基酸位置X和Y内”涵盖位于所列位置之间并且包括位置X和/或Y的氨基酸的序列。此外，术语涵盖位于所列位置之间并且不包含位置X和/或Y的氨基酸的序列。
如本文所用，术语“抗体”是指特异于靶表位的免疫球蛋白，其包含至少一个重链可变区(VH)，所述重链可变区与轻链可变区(VL)配对。
“抗体的功能部分”在本文中被定义为与所述抗体在种类方面，而不一定在数量方面，具有至少一种共享属性的部分。所述功能部分能够与所述抗体结合相同的抗原，尽管不一定到相同的程度。在一个实施方案中，抗体的功能部分包含至少重链可变结构域(VH)。抗体的功能部分的非限制性示例为单结构域抗体、单链抗体、纳米抗体、单一抗体、单链可变片段(scFv)、Fd片段、Fab片段和F(ab')2片段。
“抗体的功能等同物”在本文中被定义为人工结合化合物，其包含抗体的至少一个CDR序列，优选地重链CDR3序列。所述功能等同物优选地包含抗体的重链CDR3序列，以及所述抗体的轻链CDR3序列。更优选地，所述功能等同物包含抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及所述抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。抗体的功能等同物例如通过改变抗体来制备，使得所得化合物的至少抗原结合特性在种类上，而不一定在量上基本上相同。这以许多方式进行，例如通过保守氨基酸取代，由此氨基酸残基被另一个具有大致相似特性(尺寸、疏水性等)的残基取代，使得抗体的总体功能基本上不受影响。
如由技术人员所熟知的，抗体的重链是构成免疫球蛋白分子的两种类型的链中的较大者。重链包含恒定结构域和可变结构域，所述可变结构域参与抗原结合。抗体的轻链是构成免疫球蛋白分子的两种类型的链中的较小者。轻链包含恒定结构域和可变结构域。可变结构域通常但不总是与重链的可变结构域一起参与抗原结合。
互补决定区(CDR)是存在于重链可变结构域和轻链可变结构域中的超变区。在全抗体的情况下，重链的CDR 1-3和连接的轻链的CDR 1-3一起形成抗原结合位点。
如本文所用，术语“根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物”也被称为“根据本发明的结合化合物”。
术语“特异于”、“能够特异性结合(able to specifically bind)”和“能够特异性结合(capable of specifically binding)”在本文中可互换使用，并且是指抗体或其功能部分或功能等同物与其表位之间的相互作用。这意指相比于其它抗原或氨基酸序列，所述抗体或其功能部分或功能等同物优先结合到所述表位。因此，虽然抗体、功能部分或等同物可非特异性结合到其它抗原或氨基酸序列，但所述抗体或功能部分或功能等同物对其表位的结合亲和力显著高于所述抗体或功能部分或功能等同物对其它抗原或氨基酸序列的非特异性结合亲和力。
如果CD9的所述表位恰好也存在于另一种蛋白质中，则能够结合CD9的特定表位的根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物还可特异于其它非CD9细胞。在这种情况下，本文中被称为特异于CD9的抗体也特异于包含相同表位的此类其它蛋白质。
“结合亲和力”是指抗体或功能部分或功能等同物的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。该亲和力一般可由平衡解离常数(KD)表示，它被计算为ka对kd的比率，参见，例如，Chen,Y.等人，(1999)J.Mol Biol 293:865-881。亲和力可通过本领域已知的常见方法测量，诸如例如表面等离子体共振(SPR)测定，诸如BiaCore(GE Healthcare)或IBIS TechnologiesBV(Hengelo，the Netherlands)的IBIS-iSPR仪器，或溶液相测定，诸如Kinexa。
氨基酸或核酸序列的同一性的百分比或术语“序列同一性％”在本文中被定义为在比对两个序列后与参考序列中的残基相同的候选氨基酸或核酸序列中残基的百分比，并如果需要引入空位以实现最大百分比同一性。用于比对的方法和计算机程序是本领域熟知的，例如“Align 2”。
根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物优选能够结合黑素瘤细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞和食道癌细胞。此类结合化合物适用于抵抗各种类型的癌症，并且因此具有广泛的适用性。优选对于至少黑素瘤的特异性。
在一些实施方案中，根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物是人抗体或其功能部分或功能等同物。与其中非人CDR或可变区序列通常导致人受体中的抗-鼠免疫应答的鼠或人源化抗体相反，人氨基酸序列的存在降低了在人类患者的治疗使用期间不良副作用的机会。
在一个特别优选的实施方案中，提供了根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物，其中所述抗体具有IgG同种型，优选地IgG1或IgG3。这对人类的医疗应用是有利的。
根据本发明的优选的抗体是抗体AT14-012。这种抗体是优选的，因为其结合至少黑素瘤、胰腺癌、食道癌和结肠癌细胞、多种AML母细胞和一些多发性骨髓瘤细胞系。此外，已经展示出AT14-012抵抗体内肿瘤转移。因此，这种抗体特别适用于抵抗与表达CD9的细胞相关联的病症，诸如例如涉及CD9阳性肿瘤细胞的癌症，如黑素瘤。有趣的是，AT14-012具有IgG3同种型并且属于VH3-09家族。抗体AT14-012的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及轻链CDR1、CDR2和CDR3序列在表1和图3中示出。
如本文所用，术语“AT14-012”涵盖全部抗体及其功能部分和功能等同物，其具有抗体AT14-012的至少重链和轻链CDR1-3序列，优选地至少重链可变区序列和轻链可变区序列。此类抗体和功能部分以及功能等同物例如包含分离和/或纯化的抗体、重组抗体和/或使用AT14-012核酸序列获得的抗体，所述AT14-012核酸序列已针对生产宿主细胞诸如例如CHO细胞进行密码子优化。
基于表1和图3中所示的AT14-012序列，可能产生抗体或其功能部分或功能等同物，其包含特异于CD9的AT14-012的至少一个CDR序列。因此，本发明提供了一种分离的、重组的和/或合成的抗体或其功能部分或功能等同物，其包含抗体AT14-012的至少一个CDR序列，如表1和图3所示。所述至少一个CDR序列优选地至少包含CDR3序列。因此，还提供了一种分离的、合成的或重组的抗体，或其功能部分或功能等同物，其至少包含具有序列avsgyypyfdy的重链CDR3序列和具有序列qqyyttp的轻链CDR3序列。优选地，提供了结合化合物，其包含抗体AT14-012的至少两个CDR3，更优选地至少三个CDR3。在一些实施方案中，抗体AT14-012的重链和轻链的至少两个或三个CDR共同存在于根据本发明的一个结合化合物中。优选地，根据本发明的结合化合物包含抗体AT14-012的所有三个重链CDR和所有三个轻链CDR。
任选地，将所述CDR序列中的至少一个优化，从而产生变体结合化合物，优选地以便改善结合功效、选择性和/或稳定性。这例如通过诱变程序进行，随后优选测试所得化合物的稳定性和/或结合功效并选择改善的CD9特异性结合化合物。根据本发明，技术人员能够很好地生成包含至少一个改变的CDR序列的变体。例如，应用保守氨基酸取代。保守氨基酸取代的示例包括用一个疏水残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个疏水残基，并且用一个极性残基取代另一个极性残基，例如用精氨酸取代赖氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，或用谷氨酰胺取代天冬酰胺。优选地，本发明供一种抗体或功能部分或功能等同物，其包含与抗体AT14-012的CDR序列具有至少80％的同一性的CDR序列，使得有利的CD9结合特性被保持或甚至改善。因此，包含与抗体AT14-012的CDR序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列的变体结合化合物也在本发明的范围内。优选地，所述结合化合物包含重链和轻链CDR 1-3序列，其与抗体AT14-012的重链和轻链CDR 1-3序列具有至少80％的同一性。优选地，此类变体的CDR序列的不超过三个，优选地不超过两个，优选地不超过一个氨基酸与原始AT14-012CDR序列不同。
除了优化CDR序列以便改善结合功效或稳定性之外，还可优化框架区中的至少一个中的至少一个序列。这优选地进行以便改善结合功效或稳定性。例如，通过使编码此类框架序列的核酸分子突变来优化框架序列，此后优选测试所得结合化合物的特性。这样，可获得改善的结合化合物。在一个优选的实施方案中，将人种系序列用于根据本发明的抗体中的框架区。人种系序列的使用使所述抗体的免疫原性风险最小化，因为这些序列较不容易包含体细胞改变，所述体细胞改变对于框架区来源于其中的个体而言是独特的，并且当应用于另一个人类个体中时可能导致免疫原性应答。因此，本发明还提供了根据本发明的合成的或重组抗体或功能部分或功能等同物，与AT14-012的框架区相比，其在框架区中包含至少一个突变。另外，或作为另外一种选择，本发明提供了根据本发明的合成的或重组抗体或功能部分或功能等同物，与抗体AT14-012的恒定区相比，其在恒定区中包含至少一个突变。此类与AT14-012相比具有至少一个突变的结合化合物在自然界中不存在。相反，其被人工生产。在一个实施方案中，抗体AT14-012的IgG3Fc区至少部分地被IgG1Fc区取代。这通常增加所得免疫球蛋白的稳定性和半衰期。
在一些实施方案中，根据本发明的结合化合物包括人可变区。在一些实施方案中，所述结合化合物包含人恒定区和人可变区。在一些优选的实施方案中，所述结合化合物是人抗体。对于在人类中的治疗应用而言，使用人CD9特异性抗体优于使用非人抗体。用于诊断和/或治疗人类疾病的非人类抗体的体内使用受到多种因素的阻碍。具体地讲，人体可将非人抗体识别为外来抗体，这将导致针对非人抗体的免疫原性应答，从而导致不良副作用和/或抗体从循环的快速清除。当施用于人类个体时，人抗体减少了副作用的机会，并且当与非人抗体相比时，由于减少清除而通常导致循环中的更长半衰期。
在一些实施方案中，根据本发明的结合化合物是嵌合抗体。在此类嵌合抗体中，将感兴趣的序列(诸如，感兴趣的附加结合位点)提供给根据本发明的结合化合物。
根据本发明的结合化合物优选为单克隆抗体。单克隆抗体是由单分子物种组成的抗体。单克隆抗体可通过生产单克隆抗体的细胞或重组DNA技术大量生产。
因此，可使用本领域已知的技术(诸如例如诱变)来生成基于抗体AT14-012的变体结合化合物。通常，在保持抗原特异性的同时，容忍介于80％和99％之间的序列变异。因此，一个实施方案提供一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其包含：
-重链CDR1序列，所述重链CDR1序列与序列DYAMH具有至少80％的序列同一性；以及
-重链CDR2序列，所述重链CDR2序列与序列giswnsgsivyadsvkg具有至少80％的序列同一性；以及
-重链CDR3序列，所述重链CDR3序列与序列avsgyypyfdy具有至少80％的序列同一性；以及
-轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列与序列kssqsvlyssnnknylg具有至少80％的序列同一性；以及
-轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列与序列wastres具有至少80％的序列同一性；以及
-轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列与序列qqyyttp具有至少80％的序列同一性。所述抗体或功能部分或功能等同物优选特异于CD9的表位，所述表位包含至少一种选自如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172和L173的氨基酸，更优选地特异于CD9的表位，所述表位包含对应于如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172、L173和F176的氨基酸。
优选地，所述序列同一性为至少85％，更优选至少86％，更优选至少87％，更优选至少88％，更优选至少89％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选地至少97％，更优选至少98％，更优选地至少99％，更优选地100％。
除非另外指明，本文所用的CDR编号和定义根据Kabat等人(1991)。不同编号系统(包括Kabat编号、EU编号和IMGT编号)之间的对应是本领域技术人员所熟知的。
因此，一些实施方案提供一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其包含：
-重链CDR1序列，所述重链CDR1序列与序列DYAMH具有至少85％，优选地至少90％，更优选地至少95％的序列同一性；以及
-重链CDR2序列，所述重链CDR2序列与序列giswnsgsivyadsvkg具有至少85％，优选地至少90％，更优选地至少95％的序列同一性；以及
-重链CDR3序列，所述重链CDR3序列与序列avsgyypyfdy具有至少85％，优选地至少90％，更优选地至少95％的序列同一性；以及
-轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列与序列kssqsvlyssnnknylg具有至少85％，优选地至少90％，更优选地至少95％的序列同一性；以及
-轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列与序列wastres具有至少85％，优选地至少90％，更优选地至少95％的序列同一性；以及
-轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列与序列qqyyttp具有至少85％，优选地至少90％，更优选地至少95％的序列同一性。所述抗体或功能部分或功能等同物优选特异于CD9的表位，所述表位包含至少一种选自如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172和L173的氨基酸，更优选地特异于CD9的表位，所述表位包含对应于如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172、L173和F176的氨基酸。
一些实施方案提供一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其包含：
-重链CDR1序列，所述重链CDR1序列与序列DYAMH具有至少97％的序列同一性；以及
-重链CDR2序列，所述重链CDR2序列与序列giswnsgsivyadsvkg具有至少97％的序列同一性；以及
-重链CDR3序列，所述重链CDR3序列与序列avsgyypyfdy具有至少97％的序列同一性；以及
-轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列与序列kssqsvlyssnnknylg具有至少97％的序列同一性；以及
-轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列与序列wastres具有至少97％的序列同一性；以及
-轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列与序列qqyyttp具有至少97％的序列同一性。所述抗体或功能部分或功能等同物优选特异于CD9的表位，所述表位包含至少一种选自如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172和L173的氨基酸，更优选地特异于CD9的表位，所述表位包含对应于如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172、L173和F176的氨基酸。
在实施例中，示出重链CDR1中的突变和/或CDR3中的一个或两个突变和/或轻链CDR2中的突变导致结合与抗体AT14-012相同的表位，并且具有的结合亲和力等于或高于AT14-012的结合亲和力的抗体。重要的是，如实施例中进一步所示，重链CDR1和/或重链CDR3和/或轻链CDR2中具有此类突变的抗体AT14-012的变体也具有其不附聚血小板的特性，即使与AT14-012相比，所述变体具有对CD9更高的亲和力也是如此。因此，所述实施例示出包含重链CDR1和/或重链CDR3序列的抗体，所述序列与重链CDR1具有至少80％的同一性，抗体AT14-012的重链CDR3和轻链CDR2序列具有与抗体AT14-012相同的新的独特的特性，包括对于CD9的新型表位的特异性且不存在血小板附聚。抗体AT14-012的亲和力与不存在血小板附聚无关，相反与不存在血小板附聚相关的关键特征是识别CD9上的独特表位。
因此，一个实施方案提供一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其特异于CD9的表位，所述表位包含至少一种选自如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172和L173的氨基酸，并且包含：
-重链CDR1序列，所述重链CDR1序列与序列DYAMH具有至少80％的序列同一性；以及
-重链CDR2序列giswnsgsivyadsvkg；以及
-重链CDR3序列，所述重链CDR3序列与序列avsgyypyfdy具有至少80％的序列同一性；以及
-轻链CDR1序列kssqsvlyssnnknylg；以及
-轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列与序列wastres具有至少85％的序列同一性；以及
-轻链CDR3序列qqyyttp。所述抗体或功能部分或功能等同物优选特异于CD9的表位，所述表位包含对应于如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172、L173和F176的氨基酸。
用于确定抗体或其功能部分或功能等同物是否特异于CD9的表位的方法是本领域已知的并且例如描述于本文的实施例中，所述CD9的表位包含至少一种选自如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172和L173。实际上，所述实施例示出如何结合到CD9，被抗体结合的CD9的表位，并且能够确定抗体对CD9的亲和力。
实施例还示出，可在不影响结合特异性和亲和力和/或不影响结合特异性和亲和力的程度的情况下，形成框架区中的突变。实际上，重链框架区1中的T29N突变，轻链框架区3中的L94P突变和轻链框架区4中的L120V突变(IMGT编号)对AT14-012的结合或对与AT14-012相比示出改善的结合的AT14-012的变体的改善的结合不具有重大影响。
如前所述，给定CDR序列的最多3个氨基酸残基通常可变化，同时保持相同类型的结合活性(在种类上，不一定在量上)。因此，根据本发明的结合化合物优选地包含重链和轻链CDR1-3序列，其中最多3个，优选最多2个，更优选最多1个氨基酸与抗体AT14-012的重链和轻链CDR1-3序列不同。在一些实施方案中，根据本发明的结合化合物的重链和轻链CDR1-3序列与抗体AT14-012的重链和轻链CDR1-3序列相同。因此，本发明还提供一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其包含：
-重链CDR1序列，所述重链CDR1序列具有序列DYAMH；以及
-重链CDR2序列，所述重链CDR2序列具有序列GISWNSGSIVYADSVKG；以及
-重链CDR3序列，所述重链CDR3序列具有序列AVSGYYPYFDY；以及
-轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列具有序列KSSQSVLYSSNNKNYLG；以及
-轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列具有序列WASTRES；以及
-轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列具有序列QQYYTTP。
在一些实施方案中，根据本发明的结合化合物的重链和轻链CDR1-3序列与抗体AT14-012的变体的重链和轻链CDR1-3序列相同，其具有的亲和力相当于或高于抗体AT14-012的亲和力。
因此，本发明还提供一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其包含：
-重链CDR1序列，所述重链CDR1序列具有序列DYAMY；以及
-重链CDR2序列，所述重链CDR2序列具有序列GISWNSGSIVYADSVKG；以及
-重链CDR3序列，所述重链CDR3序列具有序列AVSGYYPYFDY；以及
-轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列具有序列KSSQSVLYSSNNKNYLG；以及
-轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列具有序列WASTRES；以及
-轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列具有序列QQYYTTP。
因此，本发明还提供一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其包含：
-重链CDR1序列，所述重链CDR1序列具有序列DYAMH；以及
-重链CDR2序列，所述重链CDR2序列具有序列GISWNSGSIVYADSVKG；以及
-重链CDR3序列，所述重链CDR3序列具有序列AVSGYFPYFDY；以及
-轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列具有序列KSSQSVLYSSNNKNYLG；以及
-轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列具有序列WASTRES；以及
-轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列具有序列QQYYTTP。
因此，本发明还提供一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其包含：
-重链CDR1序列，所述重链CDR1序列具有序列DYAMH；以及
-重链CDR2序列，所述重链CDR2序列具有序列GISWNSGSIVYADSVKG；以及
-重链CDR3序列，所述重链CDR3序列具有序列AVSGYYPYFHY；以及
-轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列具有序列KSSQSVLYSSNNKNYLG；以及
-轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列具有序列WASTRES；以及
-轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列具有序列QQYYTTP。
因此，本发明还提供一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其包含：
-重链CDR1序列，所述重链CDR1序列具有序列DYAMY；以及
-重链CDR2序列，所述重链CDR2序列具有序列GISWNSGSIVYADSVKG；以及
-重链CDR3序列，所述重链CDR3序列具有序列AVSGYFPYFDY；以及
-轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列具有序列KSSQSVLYSSNNKNYLG；以及
-轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列具有序列WASTRES；以及
-轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列具有序列QQYYTTP。
因此，本发明还提供一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其包含：
-重链CDR1序列，所述重链CDR1序列具有序列DYAMY；以及
-重链CDR2序列，所述重链CDR2序列具有序列GISWNSGSIVYADSVKG；以及
-重链CDR3序列，所述重链CDR3序列具有序列AVSGYYPYFHY；以及
-轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列具有序列KSSQSVLYSSNNKNYLG；以及
-轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列具有序列WASTRES；以及
-轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列具有序列QQYYTTP。
因此，本发明还提供一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其包含：
-重链CDR1序列，所述重链CDR1序列具有序列DYAMH；以及
-重链CDR2序列，所述重链CDR2序列具有序列GISWNSGSIVYADSVKG；以及
-重链CDR3序列，所述重链CDR3序列具有序列AVSGYFPYFHY；以及
-轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列具有序列KSSQSVLYSSNNKNYLG；以及
-轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列具有序列WASTRES；以及
-轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列具有序列QQYYTTP。
因此，本发明还提供一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其包含：
-重链CDR1序列，所述重链CDR1序列具有序列DYAMY；以及
-重链CDR2序列，所述重链CDR2序列具有序列GISWNSGSIVYADSVKG；以及
-重链CDR3序列，所述重链CDR3序列具有序列AVSGYFPYFHY；以及
-轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列具有序列KSSQSVLYSSNNKNYLG；以及
-轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列具有序列WASTRES；以及
-轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列具有序列QQYYTTP。
本发明还提供一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其包含：
-重链CDR1序列，所述重链CDR1序列具有序列DYAMY；以及
-重链CDR2序列，所述重链CDR2序列具有序列GISWNSGSIVYADSVKG；以及
-重链CDR3序列，所述重链CDR3序列具有序列AVSGYYPYFDY；以及
-轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列具有序列KSSQSVLYSSNNKNYLG；以及
-轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列具有序列WASIRES；以及
-轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列具有序列QQYYTTP。
因此，本发明还提供一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其包含：
-重链CDR1序列，所述重链CDR1序列具有序列DYAMH；以及
-重链CDR2序列，所述重链CDR2序列具有序列GISWNSGSIVYADSVKG；以及
-重链CDR3序列，所述重链CDR3序列具有序列AVSGYFPYFDY；以及
-轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列具有序列KSSQSVLYSSNNKNYLG；以及
-轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列具有序列WASIRES；以及
-轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列具有序列QQYYTTP。
本发明还提供一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其包含：
-重链CDR1序列，所述重链CDR1序列具有序列DYAMH；以及
-重链CDR2序列，所述重链CDR2序列具有序列GISWNSGSIVYADSVKG；以及
-重链CDR3序列，所述重链CDR3序列具有序列AVSGYYPYFHY；以及
-轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列具有序列KSSQSVLYSSNNKNYLG；以及
-轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列具有序列WASIRES；以及
-轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列具有序列QQYYTTP。
本发明还提供一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其包含：
-重链CDR1序列，所述重链CDR1序列具有序列DYAMY；以及
-重链CDR2序列，所述重链CDR2序列具有序列GISWNSGSIVYADSVKG；以及
-重链CDR3序列，所述重链CDR3序列具有序列AVSGYFPYFDY；以及
-轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列具有序列KSSQSVLYSSNNKNYLG；以及
-轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列具有序列WASIRES；以及
-轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列具有序列QQYYTTP。
本发明还提供一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其包含：
-重链CDR1序列，所述重链CDR1序列具有序列DYAMY；以及
-重链CDR2序列，所述重链CDR2序列具有序列GISWNSGSIVYADSVKG；以及
-重链CDR3序列，所述重链CDR3序列具有序列AVSGYYPYFHY；以及
-轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列具有序列KSSQSVLYSSNNKNYLG；以及
-轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列具有序列WASIRES；以及
-轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列具有序列QQYYTTP。
本发明还提供一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其包含：
-重链CDR1序列，所述重链CDR1序列具有序列DYAMH；以及
-重链CDR2序列，所述重链CDR2序列具有序列GISWNSGSIVYADSVKG；以及
-重链CDR3序列，所述重链CDR3序列具有序列AVSGYFPYFHY；以及
-轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列具有序列KSSQSVLYSSNNKNYLG；以及
-轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列具有序列WASIRES；以及
-轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列具有序列QQYYTTP。
本发明还提供一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其包含：
-重链CDR1序列，所述重链CDR1序列具有序列DYAMY；以及
-重链CDR2序列，所述重链CDR2序列具有序列GISWNSGSIVYADSVKG；以及
-重链CDR3序列，所述重链CDR3序列具有序列AVSGYFPYFHY；以及
-轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列具有序列KSSQSVLYSSNNKNYLG；以及
-轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列具有序列WASIRES；以及
-轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列具有序列QQYYTTP。
一种特别优选的抗体包含：
-重链CDR1序列，所述重链CDR1序列具有序列DYAMY；以及
-重链CDR2序列，所述重链CDR2序列具有序列GISWNSGSIVYADSVKG；以及
-重链CDR3序列，所述重链CDR3序列具有序列AVSGYFPYFDY；以及
-轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列具有序列KSSQSVLYSSNNKNYLG；以及
-轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列具有序列WASTRES；以及
-轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列具有序列QQYYTTP。如实施例中所展示的，此类抗体具有特别高的亲和力(参见图19B)。
优选地，根据本发明的结合化合物包含抗体AT14-012的可变重链序列和/或可变轻链序列，或具有至少80％同一性的重链可变序列和轻链可变序列。表1和图3中还示出了抗体AT14-012的重链可变区和轻链可变区。因此，还提供了根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物，其包含与序列evqvvesggglvqpgrslrlscaasgftfddyamhwvrqapgkglewvsgiswnsgsivyadsvkgrftisrdnaknslylqlnslraedtafyycakavsgyypyfdywgqgilvtvss具有至少80％的序列同一性的重链可变区序列，和/或与序列divmtqspdslsvslgeratinckssqsvlyssnnknylgwyqqkpgqppklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqyyttpstfgqgtrleik具有至少80％的序列同一性的轻链可变区序列，或与抗体AT14-012的上述重链可变区序列和/或轻链可变区序列具有至少85％，更优选至少86％，更优选至少87％，更优选至少88％，更优选至少89％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选地至少97％，更优选至少98％，更优选地至少99％，或甚至100％同一性的序列。优选地，在重链可变区和轻链可变区中，重链CDR1、CDR2和CDR3序列与序列dyamh(CDR1)、giswnsgsivyadsvkg(CDR2)和avsgyypyfdy(CDR3)具有至少80％的序列同一性，并且轻链CDR1、CDR2和CDR3序列与序列kssqsvlyssnnknylg(CDR1)、wastres(CDR2)和qqyyttp(CDR3)具有至少80％的序列同一性。所述抗体或功能部分或功能等同物优选特异于CD9的表位，所述表位包含至少一种选自如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172和L173的氨基酸，更优选地特异于CD9的表位，所述表位包含对应于如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172、L173和F176的氨基酸。同一性越高，结合化合物越类似抗体AT14-012。优选地，根据本发明的结合化合物包含抗体AT14-012的重链可变区序列和轻链可变区序列两者，如表1和图3所示，或者与其具有至少80％，优选至少85％，或至少86％，或至少87％，或至少88％，或至少89％，或至少90％，或91％，或至少92％，或至少93％，或至少94％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％同一性的重链可变区序列和轻链可变区序列。
特别优选的是抗体或其功能部分或功能等同物，其特异于CD9的表位，所述CD9的表位包含至少一种选自如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172和L173的氨基酸，优选地特异于CD9的表位，所述CD9的表位包含对应于如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172、L173和F176的氨基酸，并且包含：
-重链可变区序列EVQVVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQLNSLRAEDTAFYYCAKAVSGYYPYFDYWGQGILVTVSS，或
EVQVVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMYWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQLNSLRAEDTAFYYCAKAVSGYFPYFDYWGQGILVTVSS或
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EVQVVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQLNSLRAEDTAFYYCAKAVSGYFPYFHYWGQGILVTVSS或
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EVQVVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMYWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQLNSLRAEDTAFYYCAKAVSGYFPYFHYWGQGILVTVSS和/或
-与序列DIVMTQSPDSLSVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLGWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPSTFGQGTRLEIK具有至少80％的序列同一性的轻链可变区序列，优选地由此CDR1、CDR2和CDR3序列包含与序列KSSQSVLYSSNNKNYLG(CDR1)、WASTRES(CDR2)和QQYYTTP(CDR3)具有至少80％的序列同一性的序列，更优选地轻链可变区序列DIVMTQSPDSLSVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLGWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPSTFGQGTRLEIK或DIVMTQSPDSLSVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLGWYQQKPGQPPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPSTFGQGTRLEIK。
如前已经提及的，考虑此类免疫球蛋白在体内的稳定性，根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物优选具有IgG同种型，更优选地IgG1或IgG3。此外，如实施例中所示，当抗体处于IgG3主链中时，抗体AT14-012能够触发肿瘤细胞中的补体依赖性细胞毒性(CDC)。此外，IgG Fc尾部中的突变(E345R，EU编号，如Kabat 1991中所述)迫使在靶向结合时抗体六聚化，肿瘤细胞表面上的C1q沉积并经由CDC进一步诱导浓度依赖性细胞死亡(De Jong2016)。因此，在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的抗体、功能部分或功能等同物具有IgG3同种型。在另一个优选的实施方案中，根据本发明的抗体、功能部分或功能等同物具有IgG同种型，优选地IgG1或IgG3，更优选地IgG3，并且包含氨基酸位置345(EU编号)处的精氨酸。
如实施例中所示，抗体AT14-012能够特异性结合如图2中所示的CD9序列的氨基酸K169、D171、V172、L173和F176。现在已知的是，可获得或生成与相同表位竞争AT14-012的结合化合物。例如，提供包含上述氨基酸残基中的至少4个，优选地至少5个或6个的CD9肽，或者由上述氨基酸残基中的至少4个，优选地至少5个或6个组成的CD9肽，此后，用此类CD9肽，或包含此类CD9肽的免疫原性化合物，或编码此类CD9肽的核酸分子或其功能等同物对非人动物进行免疫，优选地之后进行一次或多次加强给药。随后，由所述非人动物收获特异于CD9的抗体。另选地或除此之外，由所述非人动物收获CD9特异性B细胞。此类CD9特异性B细胞特别适用于生产CD9特异性抗体。从所述免疫动物收获的CD9特异性B细胞例如用于制备杂交瘤，由所述杂交瘤获得CD9特异性抗体。在其它实施方案中，从所述免疫动物收获的所述CD9特异性B细胞用Bcl-6核酸，并且利用抗/凋亡核酸诸如例如Bcl-xL或Mcl-1进行转导，并且长期离体培养B细胞培养物，如例如欧洲专利1974017和美国专利9,127,251中所述的。这样，生成长期复制B细胞培养物，其中B细胞复制并产生抗体。在一些实施方案中，收获由所述杂交瘤或由此类B细胞培养物产生的CD9特异性抗体，并且例如优选地在抗体人源化以便减少副作用之后，用于抗-CD9治疗。在一些实施方案中，测试得自所述非人类动物的抗体和/或B细胞与抗体AT14-012对于结合到CD9的竞争。这例如通过将表达CD9的细胞与得自所述非人动物的所述抗体或B细胞一起温育，并且随后添加抗体AT14-012来进行。作为对照，优选在不存在任何其它抗体或B细胞的情况下，将表达CD9的细胞与抗体AT14-012一起温育。如果表达CD9的细胞与得自非人动物的抗体或B细胞的预温育看起来影响AT14-012与所述细胞的结合，则认为得自所述非人动物的所述抗体或b细胞与抗体AT14-012竞争对CD9的结合。
在一些实施方案中，对得自所述非人动物的CD9特异性B细胞的编码可变结构域的核酸序列进行测序，以便获得CD9特异性可变结构域的核酸序列，随后将包含这些序列的一种或多种核酸分子引入生产细胞，诸如例如大肠杆菌、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO细胞(小鼠骨髓瘤)或293(T)细胞中，用于产生CD9特异性抗体。所述一个或多个核酸序列优选地针对所述生产细胞进行密码子优化。如本文所用，术语“密码子”是指编码特异性氨基酸残基的核苷酸(或其功能等同物)的三倍体。术语“经密码子优化的”是指来自原始的动物核酸序列的一个或多个密码子被某些生产细胞优选的一个或多个密码子置换。这些置换密码子优选编码与已置换的原始动物密码子相同的氨基酸残基。
在一些实施方案中，将得自所述非人类动物或所述非人类动物的免疫细胞的CD9特异性抗体人源化，这意指动物氨基酸序列的至少一部分，优选地框架序列的至少一部分或整体被人序列置换以便减少对人类的不良副作用。
动物免疫方案，包括合适的给药程序和助剂，用于从此类免疫动物获得和纯化抗体和/或免疫细胞的程序，竞争实验以及非人抗体的人源化程序是本领域熟知的。例如，参见Hanly等人，1995。
在一些实施方案中，包含或由下列组成的CD9肽或包含此类CD9肽的化合物用于筛选噬菌体展示库以便鉴定和/或分离CD9特异性免疫球蛋白(通常为Fab片段)：选自如图2所示的K169、D171、V172、L173、T175和F176的CD9氨基酸残基中的至少4个、优选地至少5个、或6个，优选地选自K169、D171、V172、L173、和F176的CD9氨基酸残基。在一些实施方案中，使用天然噬菌体展示文库。在优选的实施方案中，使用来源于一个或多个黑素瘤患者的噬菌体展示文库，使得文库将已经有偏差。在一些实施方案中，测试得自所述噬菌体展示文库的CD9特异性免疫球蛋白与抗体AT14-012对于结合到CD9的竞争。这例如使用本文所述的竞争测试来进行。
利用如上所述的方法获得、制备或选择的抗体通常将与用抗体AT14-012竞争相同CD9表位的至少一部分。因此，本发明还提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其与抗体AT14-012竞争结合到CD9。一些实施方案提供一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分或功能等同物，其与抗体AT14-012竞争结合到至少4个CD9氨基酸，所述CD9氨基酸选自如图2所示的K169、D171、V172、L173和F176。在一些实施方案中，所述抗体或功能部分或功能等同物与抗体AT14-012竞争结合到至少4个、或至少5个CD9氨基酸，所述CD9氨基酸选自如图2所示的K169、D171、V172、L173和F176。在一些实施方案中，所述抗体或功能部分或功能等同物与抗体AT14-012竞争结合到如图2所示的CD9氨基酸K169、D171、V172、L173和F176。
本发明的另一个方面提供了根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物，其偶联到另一种化合物。在一个实施方案中，根据本发明的结合化合物偶联到另一个治疗部分，诸如化学治疗药物或其它毒化合物或放射性化合物，以形成所谓的“抗体-药物缀合物”。在另一个实施方案中，偶联到根据本发明的结合化合物的部分是免疫调节分子，诸如例如CD3特异性抗体。此类CD3特异性抗体能够结合T细胞，并且如果偶联到根据本发明的结合化合物，则其将T细胞靶向到含CD9的细胞，诸如黑素瘤细胞，从而增强抗黑素瘤T-细胞应答。这提供甚至更强的抗黑素瘤效应。因此，本发明的一个优选的实施方案提供双特异性或多特异性结合化合物，其包含根据本发明的CD9特异性结合化合物和免疫调节分子，优选地CD3-特异性结合化合物。另一个优选的实施方案提供抗-CD9化合物，所述化合物包含根据本发明的结合化合物和毒性部分，所述结合化合物特异于CD9。在一些其它实施方案中，根据本发明的结合化合物偶联到标签。这允许使用此类标记的结合化合物检测含CD9的细胞，诸如例如黑素瘤细胞。其它实施方案提供根据本发明的结合化合物，所述结合化合物偶联到另一CD9特异性结合化合物。在一些实施方案中，此类其它CD9特异性结合化合物也是根据本发明的结合化合物。因此，本发明提供了一种化合物，所述化合物包含彼此偶联的根据本发明的两种结合化合物，诸如例如两种偶联的AT14-012抗体或其功能部分或功能等同物。在一些实施方案中，根据本发明的结合化合物偶联到另一CD9特异性结合化合物，诸如例如当前已知的抗CD9抗体，以便产生双特异性化合物。在一些实施方案中，抗体AT14-012的重链与另一CD9特异性抗体的重链配对，以便产生双特异性抗体。根据本发明的双特异性化合物和双特异性抗体允许例如增加含CD9的细胞的结合，尤其是当两种偶联的结合化合物特异于不同CD9表位时。因此，此类双特异性化合物和/或双特异性抗体非常适用于治疗或诊断应用。还可在测定中使用根据本发明的双特异性化合物和双特异性抗体，其中将不同的含CD9的细胞结合到相同的双特异性结合化合物。
在一些实施方案中，提供了一种合成或重组抗体、或其功能部分或功能等同物，其包含根据本发明的抗体的一个Fab片段，优选地AT14-012Fab片段，和另一个CD9特异性抗体的一个Fab片段。所得的结合化合物对CD9具有单特异性，但是每个Fab臂通常将结合其自己的CD9表位。在一些实施方案中，由Fab片段识别的表位彼此不同。在另一个实施方案中，表位相同。Fab臂可结合具有不同亲和力的表位。另选地，Fab臂以基本上相同的亲和力结合其表位，这意指Fab臂的KD彼此相差不超过30％，优选地不超过20％，或不超过10％。
在一些实施方案中，提供了一种合成或重组抗体、或其功能部分或功能等同物，其包含根据本发明的抗体的一个Fab片段，优选地AT14-012Fab片段，和另一抗体的一个Fab片段。例如，此类抗体包含根据本发明的抗体的一个Fab片段和特异于补体调节蛋白的阻断抗体的一个Fab片段或特异于共抑制T细胞分子的阻断抗体。特异于补体调节蛋白的阻断抗体(其中Fab片段存在于此类抗体中)的优选示例是CD55阻断抗体、CD46阻断抗体或CD59阻断抗体，更优选地CD55阻断抗体。针对特异于共抑制T细胞分子的阻断抗体(其中Fab片段存在于所述抗体中)的阻断抗体的优选示例为抗-CTLA4抗体、抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体、抗-PD-L2抗体、抗-SIRPα抗体、抗-TIM3抗体、抗-LAG3抗体、抗-CD276抗体、抗-CD272抗体、抗-KIR抗体、抗-A2AR抗体、抗-VISTA抗体和抗-IDO抗体，优选地抗-PD-1抗体或抗-PD-L1抗体。
因此，本发明还提供了根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物，其偶联到另一种化合物。在一些实施方案中，所述其它化合物是可检测的标签、化学治疗药物、毒性部分、免疫调节分子、另一种CD9特异性结合化合物、或放射性化合物。一些实施方案提供了抗体AT14-012，其偶联到另一化合物，例如上述化合物中的任一种。一些实施方案提供双特异性抗体、或其功能部分或功能等同物，其包含抗体AT14-012的Fab片段和另一CD9特异性抗体的Fab片段。一些实施方案提供双特异性抗体、或其功能部分或功能等同物，其包含与另一CD9特异性抗体的重链配对的抗体AT14-012的重链。
在一些实施方案中，根据本发明的结合化合物经由连接子诸如例如酸不稳定的腙连接子，或经由肽连接子如瓜氨酸-缬氨酸，或通过硫醚键，或通过分选酶A催化的转酰胺化与另一部分(诸如例如化学治疗剂或CD3特异性抗体)偶联，其详细描述于WO 2010/087994中。
分选酶催化的转酰胺化涉及在抗体的重链上，优选在重链的C末端部分上和在待偶联到所述抗体的部分上工程化分选酶识别位点(LPETGG)。抗体和部分通常还包含GGGGS序列和用于纯化目的的标签，诸如HIS标签。随后进行分选酶介导的转酰胺化，然后进行点击化学连接。在分选酶催化的转酰胺作用中，“点击化学连接”通常涉及例如含炔试剂，和例如含叠氮化物的试剂的化学偶联，所述试剂由分选酶通过将甘氨酸加成到抗体的重链的分选酶基序上和待偶联到抗体的部分(诸如蛋白质、肽或抗体)上的分选酶基序上来添加。在一个实施方案中，本发明因此提供了根据本发明的抗体，其中在抗体的重链上，优选地在重链的C末端部分上工程化分选酶识别位点(LPETGG)，所述抗体优选地还包含GGGGS序列和纯化标签，诸如HIS标签。
在另一个实施方案中，根据本发明的结合化合物经由硫醚键偶联到另一个部分。在这种情况下，优选地将一个或多个半胱氨酸掺入根据本发明的结合化合物中。半胱氨酸包含硫醇基团，并且因此，将一个或多个半胱氨酸掺入到根据本发明的结合化合物中，或者由根据本发明的结合化合物的一个或多个半胱氨酸置换一个或多个氨基酸，使得所述结合化合物能够偶联到另一个部分。优选将所述一个或多个半胱氨酸在一定位置处引入根据本发明的结合化合物中，其中它不显著影响所述结合化合物的折叠，并且不显著改变抗原结合或效应子功能。因此，本发明还提供了根据本发明的结合化合物，所述结合化合物包含抗体AT14-012的重链序列，其中所述AT14-012序列(除半胱氨酸之外)的至少一个氨基酸已经被半胱氨酸取代。
本发明的另一个方面提供了根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物，其与另一种治疗剂组合。例如，根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物与另一种试剂组合，所述试剂能够至少部分地治疗或预防与表达CD9的细胞相关的病症，优选地选自下列的病症：CD9阳性癌症、骨质疏松症、关节炎、肺部炎症、COPD、结肠炎和与先天性淋巴细胞相关的病症。与另一治疗剂组合的根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物可用于治疗和/或预防CD9阳性癌症。此类试剂的示例为补体调控蛋白、特异于共抑制T细胞分子的抗体、针对突变的BRAF的小分子(例如维罗非尼(vemurafenib)或达拉菲尼(dabrafenib))和其它化学疗法试剂。因此，本发明提供了至少部分地治疗或预防与根据本发明的表达CD9的细胞相关的病症的用途或方法，由此根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物与可用于治疗和/或预防与表达CD9的细胞相关的病症，优选地CD9阳性癌症相关的治疗剂组合。本发明还提供了一种成套试剂盒，其包含根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物以及可用于治疗和/或预防与表达CD9的细胞相关的病症，优选地CD9阳性癌症的治疗剂。此类试剂的优选的但非限制性示例为补体调控蛋白、特异于共抑制T细胞分子的抗体、针对突变的BRAF的小分子(例如维罗非尼(vemurafenib)或达拉菲尼(dabrafenib))和其它化学治疗剂。例如，实施例示出抗体AT14-012E345R在人补体因子存在下通过CDC有效杀死肿瘤细胞，所述人补体因子缺乏CD55(一种C3转化酶形成的抑制剂)的表达。因此，当抗体与能够刺激C3转化酶形成或能够抵抗C3转化酶形成的抑制的试剂，诸如CD55阻断抗体组合时，可诱导肿瘤细胞的补体依赖性细胞死亡。
针对其它补体调节蛋白，阻断其增强CDC的抗体，诸如CD46阻断抗体或CD59阻断抗体，还可有利地与根据本发明的抗体、功能部分或功能等同物组合。
因此，本发明提供了至少部分地治疗或预防与根据本发明的的表达CD9的细胞相关的病症的用途或方法，由此根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物与能够刺激C3转化酶形成或能够抵抗C3转化酶形成的抑制的试剂组合。所述试剂优选为CD55阻断抗体、CD46阻断抗体或CD59阻断抗体，更优选地CD55阻断抗体。所述病症优选为CD9阳性癌症，更优选地选自黑素瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、食道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌(stomachcancer)、鳞状细胞癌、AML、多发性骨髓瘤、胃癌(gastric cancer)、肝癌、脑癌、卡波西肉瘤、粘液表皮样癌、绒毛膜癌、纤维肉瘤、宫颈癌、神经胶质瘤、腺癌、肺腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌和小细胞肺癌。
本发明还提供了一种成套试剂盒，其包含根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物以及可用于治疗和/或预防与表达CD9的细胞相关的病症，优选地CD9阳性癌症的治疗剂。在一个优选的实施方案中，所述试剂为能够刺激C3转化酶形成或能够抵抗C3转化酶形成的抑制的试剂。所述试剂优选为CD55阻断抗体、CD46阻断抗体或CD59阻断抗体，更优选地CD55阻断抗体。本发明还提供了一种成套试剂盒，其包含根据本发明的核酸分子或功能等同物、载体或细胞，以及能够刺激C3转化酶形成或能够抵抗C3转化酶形成的抑制的试剂。所述试剂优选为CD55阻断抗体、CD46阻断抗体或CD59阻断抗体，更优选地CD55阻断抗体。
根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物还任选地与特异于共抑制T细胞分子的抗体，诸如阻断PD1-PDL1-轴的抗体组合。阻断PD1-PDL1轴的抗体，具体地讲结合PD1的那些，现在被广泛用于治疗各种各样的晚期癌症患者。示例示出当抗体AT14-012与纳武单抗(Nivolumab)(Opdivo,Bristol-Myers Squibb)、抗-PD-1抗体组合时，与仅利用AT14-012治疗相比，极大增强肿瘤生长的抑制。
针对共抑制T细胞分子的抗体优选为阻断抗体。如本文所用，“阻断抗体”是指其与其抗原的结合减少或阻断抗原和其钯之间的相互作用的抗体或片段。例如，针对CTLA-4的阻断抗体是指减少或阻断可溶性人CTLA-4与表达CD80和CD86(B7-1和B7-2)的细胞的结合并且由此抑制CTLA-4的T细胞抑制活性的抗体。针对共抑制T细胞分子的适宜抗体包括但不限于特异于下列的阻断抗体：细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、程序性死亡-1(PD-1)、PD-配体1(PD-L1)、PD-L2、信号调节蛋白α(SIRPα)、含T细胞免疫球蛋白-和粘蛋白结构域-3的分子3(TIM3)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、CD276、CD272、A2AR、VISTA和吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)。
因此，本发明提供了至少部分地治疗或预防与根据本发明的表达CD9细胞相关的病症的用途或方法，由此根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物与特异于共抑制T细胞分子的阻断抗体组合。所述抗体优选地选自：抗-CTLA4抗体、抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体、抗-PD-L2抗体、抗-SIRPα抗体、抗-TIM3抗体、抗-LAG3抗体、抗-CD276抗体、抗-CD272抗体、抗-KIR抗体、抗-A2AR抗体、抗-VISTA抗体和抗-IDO抗体。用作另外的免疫治疗组分的合适的抗体为纳武单抗、派姆单抗、lambrolizumab、伊匹单抗和lirilumab。在特别优选的实施方案中，所述抗体为阻断PD1-PDL1-轴的抗体，诸如抗-PD1抗体或抗-PDL1抗体，更优选地抗-PD1抗体。所述病症优选为CD9阳性癌症，更优选地选自黑素瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、食道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、鳞状细胞癌、AML、多发性骨髓瘤、胃癌、肝癌、脑癌、卡波西肉瘤、粘液表皮样癌、绒毛膜癌、纤维肉瘤、宫颈癌、神经胶质瘤、腺癌、肺腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌和小细胞肺癌。
本发明还提供了一种配套试剂盒，其包含根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物以及特异性于共抑制T细胞分子的阻断抗体。本发明还提供了一种配套试剂盒，其包含根据本发明的核酸分子或功能等同物、载体或细胞和特异于共抑制T细胞分子的阻断抗体。所述抗体优选地选自：抗-CTLA4抗体、抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体、抗-PD-L2抗体、抗-SIRPα抗体、抗-TIM3抗体、抗-LAG3抗体、抗-CD276抗体、抗-CD272抗体、抗-KIR抗体、抗-A2AR抗体、抗-VISTA抗体和抗-IDO抗体。用作另外的免疫治疗组分的合适抗体为纳武单抗、派姆单抗、lambrolizumab、伊匹单抗和lirilumab。在一个特别优选的实施方案中，所述抗体是阻断PD1-PDL1-轴的抗体，诸如PD1阻断抗体或PDL1阻断抗体，更优选地PD1阻断抗体。
根据本发明的配套试剂盒可包含一个或多个容器，所述容器填充有包含根据本发明的抗体、功能部分或功能等同物的药物组合物，以及包含能够刺激C3转化酶形成或能够抵抗C3转化酶形成的抑制的试剂，优选地CD55阻断抗体，或特异于共抑制T细胞分子的阻断抗体，优选地PD1或PDL1阻断抗体的药物组合物。配套试剂盒或一个或多个容器还任选地包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。与此类配套试剂盒或一个或多个容器相关联的可以为各种书面材料，诸如使用说明或呈由政府机构规定的形式的管理药物产品的制造、使用或销售的通知，该通知反映制造、使用或销售机构的批准。优选地，配套试剂盒包含使用说明。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含根据权利要求1-15中任一项所述的抗体或功能部分或功能等同物，可用于治疗和/或预防与表达CD9的细胞相关的病症，优选地CD9阳性癌症的治疗剂，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个优选的实施方案中，所述试剂为能够刺激C3转化酶形成或能够抵抗C3转化酶形成的抑制的试剂，优选地CD55阻断抗体、CD46阻断抗体或CD59阻断抗体，更优选地CD55阻断抗体。在另一个优选的实施方案中，所述试剂为特异于共抑制T细胞分子的阻断抗体，优选选自：抗-CTLA4抗体、抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体、抗-PD-L2抗体、抗-SIRPα抗体、抗-TIM3抗体、抗-LAG3抗体、抗-CD276抗体、抗-CD272抗体、抗-KIR抗体、抗-A2AR抗体、抗-VISTA抗体和抗-IDO抗体，更优选地PD1阻断抗体或PDL1阻断抗体。
另外，本文还提供的是核酸分子及其功能等同物，以及载体，其编码根据本发明的抗体、功能部分或功能等同物或结合化合物的至少一个CDR区域。优选地，此类结合化合物的至少重链CDR1-3区域和轻链CDR 1-3区域由根据本发明的一种或多种核酸分子或功能等同物或载体编码。在一些实施方案中，编码根据本发明的结合化合物的重链可变区和轻链可变区。因此，本发明的一些实施方案提供具有至少15个核苷酸的长度的分离的、合成的或重组的核酸分子或其功能等同物或载体，其编码根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物的至少一个CDR区域。优选地，所述CDR区域是来自抗体AT14-012或如本文所述的其变体的CDR区域，所述变体具有与抗体AT14-012相同或更高的结合亲和力。
在一些实施方案中，根据本发明的核酸分子具有至少30个核苷酸，更优选地至少50个核苷酸，更优选地至少75个核苷酸的长度。根据本发明的核酸分子例如从B细胞分离，所述B细胞能够产生根据本发明的抗体。所述B细胞优选产生抗体AT14-012，或如本文所述的其变体，所述变体具有与抗体AT14-012相同或更高的结合亲和力。一些实施方案提供了一种或多种核酸分子、或功能等同物或载体，其编码AT14-012或如本文所述的其变体的至少重链CDR3序列和轻链CDR3序列，所述变体具有与抗体AT14-012相同或更高的结合亲和力。
如本文所用，术语“编码根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物的至少一个CDR区域的，具有至少15个核苷酸的长度的分离的、合成的或重组的核酸分子、或其功能等同物”也被称为“根据本发明的核酸分子或功能等同物”。
如本文所用，本发明的核酸分子或核酸序列优选包含核苷酸链，更优选DNA、cDNA或RNA。在其它实施方案中，本发明的核酸分子或核酸序列包含其它种类的核酸结构，例如DNA/RNA螺旋、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和/或核酶。此类其它核酸结构被称为核酸序列的功能等同物。因此，术语“核酸分子的功能等同物”涵盖包含非天然核苷酸、修饰核苷酸和/或非核苷酸构建块的链，其表现出与天然核苷酸相同的功能。
表1和图3中示出了编码抗体AT14-012的重链和轻链CDR区域的核酸序列。本发明还涵盖具有不同于表1和图3中所示的CDR核酸序列中任一个的序列的核酸分子，但其中存在编码与表1和图3中所示相同的一个或多个CDR氨基酸序列的核酸密码子。例如，此类核酸分子包含核酸序列，所述核酸序列已针对生产细胞经密码子优化，所述生产细胞例如大肠杆菌或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO细胞(小鼠骨髓瘤)或293(T)细胞，从而能够大规模生产具有与抗体AT14-012相同的一个或多个CDR氨基酸序列的根据本发明的结合化合物。应当指出的是，抗体生产可通过任何重组抗体生产体系进行；此处提及的四个生产细胞体系仅是至今为止可用的许多体系中的一些示例。如本文所用，术语“密码子”是指编码特异性氨基酸残基的核苷酸(或其功能等同物)的三倍体。术语“经密码子优化的”是指原始的人核酸序列中的一个或多个密码子被由某些抗体生产体系优选的一个或多个密码子置换。这些置换密码子优选编码与已置换的原始人密码子相同的氨基酸残基。另选地，一个或多个置换密码子编码不同的氨基酸残基。这优选地导致保守氨基酸取代，但这不是必需的。通常，在恒定区和框架区中，通常允许一个或多个氨基酸取代。在CDR区域中，优选使用编码与已置换的原始人密码子相同的氨基酸残基的密码子。
此外，本发明还涵盖编码与抗体AT14-012的CDR序列不同，但基于所述CDR序列的重链或轻链CDR的核酸分子，只要所得的CDR与抗体AT14-012的CDR序列具有至少80％的序列同一性即可。
因此，本发明还提供核酸分子或其功能等同物或载体，其包含与抗体AT14-012的CDR序列具有至少80％，优选至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％的序列同一性的序列。优选地，所得的CDR与根据本发明的抗体的原始CDR序列在不超过三个，优选地不超过两个，优选地仅一个氨基酸上有所不同。
一些实施方案提供了根据本发明的一种或多种核酸分子或功能等同物或载体，其编码抗体AT14-012或其具有相同或更高结合亲和力的变体的至少重链CDR 1-3和轻链CDR1-3区域。因此，本发明还提供了根据本发明的一种或多种核酸分子或功能等同物或载体，其包含：
-重链CDR1，其编码核酸序列，所述核苷酸序列编码序列dyamh和/或DYAMY，和/或
-重链CDR2，其编码核酸序列，所述核酸序列编码序列giswnsgsivyadsvkg，和/或
-重链CDR3，其编码核酸序列，所述核酸序列编码序列avsgyypyfdy或avsgyfpyfdy或avsgyypyfhy或avsgyfpyfhy，和/或
-轻链CDR1，其编码核酸序列，所述核酸序列编码序列KSSQSVLYSSNNKNYLG，和/或
-轻链CDR2，其编码核酸序列，所述核酸序列编码序列WASTRES和/或WASIRES，和/或
-轻链CDR3，其编码核酸序列，所述核酸序列编码序列QQYYTTP。
本发明还提供一种或多种核酸分子或功能等同物或载体，其包含与选自下列的一个或多个序列具有至少80％的序列同一性的序列：
-gat tat gcc atg cac；以及
-ggt att agt tgg aat agt ggt agc ata gtc tat gcg gac tct gtg aag ggc；以及
-gcc gtg agt ggt tat tat ccc tac ttt gac tac；以及
-aag tcc agc cag agt gtt tta tac agc tcc aac aat aag aac tac tta ggt；以及
-tgg gca tct acc cgg gaa tcc；以及
.cag caa tat tat act act cct。
这些是如表1和图3中所示的抗体AT14012的重链和轻链CDR1-3核酸序列。在一些实施方案中，所述序列同一性为至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少96％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或100％。
优选地，AT14-012的上述重链和轻链CDR1-3序列或与其具有至少80％同一性的序列全部均存在。因此，本发明还提供了一种或多种核酸分子或功能等同物或载体，其包含
-重链CDR1，其编码与序列gat tat gcc atg cac具有至少80％的序列同一性的核酸序列，和
-重链CDR2，其编码与序列ggt att agt tgg aat agt ggt agc ata gtc tat gcggac tct gtg aag ggc具有至少80％的序列同一性的核酸序列，和
-重链CDR3，其编码与序列gcc gtg agt ggt tat tat ccc tac ttt gac tac具有至少80％的序列同一性的核酸序列，和
-轻链CDR1，其编码与序列aag tcc agc cag agt gtt tta tac agc tcc aac aataag aac tac tta ggt具有至少80％的序列同一性的核酸序列，和
-轻链CDR2，其编码与序列tgg gca tct acc cgg gaa tcc具有至少80％的序列同一性的核酸序列，和
-轻链CDR3，其编码与序列cag caa tat tat act act cct具有至少80％的序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述序列同一性为至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少96％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或100％。优选地，所编码的CDR氨基酸序列与抗体AT14-012的重链和轻链CDR1-3氨基酸序列在不超过三个，优选地不超过两个，优选地仅一个氨基酸方面有所不同。
一些实施方案提供根据本发明的核酸分子或功能等同物或载体，其编码根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物的至少重链可变区序列和/或轻链可变区序列。优选地，所述至少一种核酸分子或功能等同物或载体编码抗体AT14-012的至少重链可变区序列和/或轻链可变区序列，或与其具有至少80％同一性的序列。
本发明还提供一种或多种核酸分子或功能等同物或载体，其包含与序列gaa gtgcag gtg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggc agg tcc ctg aga ctc tcctgt gca gcc tct gga ttc acc ttt gat gat tat gcc atg cac tgg gtc cgg caa gctcca ggg aag ggc ctg gag tgg gtc tca ggt att agt tgg aat agt ggt agc ata gtctat gcg gac tct gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tccctg tat ctg caa ctg aac agt ctg aga gct gag gac acg gcc ttc tat tac tgt gcaaaa gcc gtg agt ggt tat tat ccc tac ttt gac tac tgg ggc cag gga att ttg gtcacc gtc tcc tca具有至少80％的序列同一性的序列，和/或包含与序列gac atc gtg atgacc cag tct cca gac tcc ctg tct gtg tct ctg ggc gag agg gcc acc atc aac tgcaag tcc agc cag agt gtt tta tac agc tcc aac aat aag aac tac tta ggt tgg taccag cag aaa cca gga cag cct cct aag ctg ctc att tac tgg gca tct acc cgg gaatcc ggg gtc cct gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc act ctc accatc agc agc ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tat tac tgt cag caa tat tat actact cct tcc acc ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa具有至少80％的序列同一性的序列。
优选地，根据本发明的一种或多种核酸分子或其功能等同物或载体编码类似于如表1和图3所示的AT14-012的重链可变区和轻链可变区的重链可变区及轻链可变区两者。本发明还提供一种或多种核酸分子或功能等同物或载体，其包含与序列gaa gtg cag gtggtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggc agg tcc ctg aga ctc tcc tgt gcagcc tct gga ttc acc ttt gat gat tat gcc atg cac tgg gtc cgg caa gct cca gggaag ggc ctg gag tgg gtc tca ggt att agt tgg aat agt ggt agc ata gtc tat gcggac tct gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tcc ctg tatctg caa ctg aac agt ctg aga gct gag gac acg gcc ttc tat tac tgt gca aaa gccgtg agt ggt tat tat ccc tac ttt gac tac tgg ggc cag gga att ttg gtc acc gtctcc tca具有至少80％的序列同一性的序列，和包含与序列gac atc gtg atg acc cag tctcca gac tcc ctg tct gtg tct ctg ggc gag agg gcc acc atc aac tgc aag tcc agccag agt gtt tta tac agc tcc aac aat aag aac tac tta ggt tgg tac cag cag aaacca gga cag cct cct aag ctg ctc att tac tgg gca tct acc cgg gaa tcc ggg gtccct gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agcctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tat tac tgt cag caa tat tat act act cct tccacc ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa具有至少80％的序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述序列同一性为至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少96％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或100％。
在一些实施方案中，提供核酸分子及其功能等同物和载体，其编码根据本发明的抗体或功能部分或等同物。在一些实施方案中，本发明提供了核酸分子及其功能等同物和载体，其编码抗体AT14-012或其功能部分或功能等同物。在一些实施方案中，所述核酸分子或功能等同物或载体针对非人重组表达体系，诸如非人宿主细胞如大肠杆菌、CHO、NSO或293细胞进行密码子优化。
一些实施方案提供一种载体，其包含根据本发明的核酸分子或功能等同物。如本文所用，“包含根据本发明的核酸分子或功能等同物的载体”也被称为“根据本发明的载体”。这些术语涵盖根据本发明的一种或多种载体，其包含根据本发明的一种或多种核酸分子或功能等同物。如本文所用，单数术语“一个”涵盖术语“一个或多个”。
用于构建包含根据本发明的一种或多种核酸分子或功能等同物的载体的方法是本领域熟知的。适用于产生本发明载体的载体的非限制性示例是逆转录病毒和慢病毒载体。此类载体适合多种应用。例如，包含根据本发明的治疗有益的核酸序列的本发明载体适用于针对黑素瘤的预防性或治疗应用。将此类载体施用于对其有需要的个体，优选人类，导致所述预防或治疗核酸序列在体内的表达，从而导致至少部分地治疗或预防黑素瘤。所述载体也可用于包括感兴趣的核酸分子的体外表达的应用，例如用于(商业)生产根据本发明的抗体或功能等同物。因此，根据本发明的核酸分子、功能等同物和载体特别可用于产生根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物，其特异于CD9。这例如通过将此类核酸分子或功能等同物或载体引入细胞中，使得细胞的核酸翻译机制将产生编码的抗体或功能部分或功能等同物来进行。在一些实施方案中，编码根据本发明的结合化合物的重链可变区和轻链可变区的至少一种核酸分子或功能等同物或载体在所谓的生产细胞中表达，例如大肠杆菌、CHO、NSO或293(T)细胞，其中一些适于商业抗体生产。值得注意的是，任何重组抗体生产体系均是合适的；提到的这四个生产细胞体系仅是至今为止可用的许多体系中的一些示例。如本文之前所述，在此类情况下，优选使用核酸分子或其功能等同物，其中如本文所提供的原始人AT14-012针对生产细胞进行密码子优化。所述生产细胞的增殖导致能够产生根据本发明的结合化合物的生产细胞系。优选地，所述生产细胞系适用于制备用于人类的抗体。因此，所述生产细胞系优选不含病原体诸如病原性微生物。在一些实施方案中，抗体AT14-012在此类生产细胞系中产生。
因此，本发明还提供一种分离的或重组的细胞，其包含根据本发明的至少一种核酸分子和/或功能等同物和/或载体。此类细胞优选是产生抗体的细胞，其能够产生根据本发明的结合化合物，例如抗体AT14-012。本发明还提供了一种制备根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物的方法，所述方法包括提供具有根据本发明的至少一种核酸分子或功能等同物或载体的细胞，并且使所述细胞翻译所述至少一种核酸分子或功能等同物或载体，从而产生根据本发明的所述抗体或功能部分或功能等同物。在一些实施方案中，所述抗体是任选具有一个或多个重链突变H40Y、Y112F和D116H和/或轻链突变T66I(IMGT编号)的AT14-012、或其功能部分或功能等同物。根据本发明的所述方法优选地还包括收获、纯化和/或分离根据本发明的所述抗体或功能部分或功能等同物的步骤。任选地在附加的纯化、分离或加工步骤之后，获得的根据本发明的结合化合物例如适用于人类治疗或诊断，
在一些实施方案中，将根据本发明的至少一种核酸分子或功能等同物或载体引入非人动物中，例如用于体内抗体生产。因此，本发明还提供一种分离的或重组的非人动物，其包含根据本发明的至少一种核酸分子或功能等同物或载体。用于制备转基因非人动物的方法是本领域已知的。参见例如EC Lee，Nature Biotechnology，2013。
根据本发明的结合化合物适用于针对黑素瘤。此外，CD9还在其它疾病中起作用，例如也表达CD9的其它类型的肿瘤。与CD9阳性细胞相关的疾病的其它非限制性示例是骨质疏松和关节炎(Iwai等人和Hattori等人)、肺部炎症和COPD(Takeda等人和Jin等人)和结肠炎(Wagner等人)。例如，CD9在卵巢切除术诱导的骨质疏松和胶原诱导的关节炎的骨侵蚀中在活化的破骨细胞中大量表达(Iwai等人和Hattori等人)。CD9也在先天淋巴细胞中表达。与CD9阳性细胞相关的疾病的其它非限制性示例是病毒感染(例如HIV或疱疹或流感)、细菌感染、CMV视网膜炎、口腔念珠菌病、血小板无力症和白喉。
因为根据本发明的结合化合物对CD9具有特异性，因此其也适用于针对这些病症。因此，根据本发明的结合化合物特别适合用作药物或预防剂。因此，提供了根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物用作药剂和/或预防剂的用途。在一些实施方案中，使用由人序列组成的根据本发明的结合化合物，以便在治疗人类个体时减少不良副作用的机会。所述抗体优选地包含抗体AT14-012。因此，本发明还提供了抗体AT14-012作为药剂和/或预防剂的用途。在一些实施方案中，基于AT14-012的序列，任选地使用编码相同AT14-012氨基的经密码子优化的核酸序列，或与其具有至少80％同一性的序列，合成或重组产生人序列。
本发明还提供了根据本发明的核酸分子或其功能等同物，或包含此类核酸分子或功能等同物的根据本发明的载体，或根据本发明的细胞，作为药剂和/或预防剂的用途。当施用根据本发明的一种或多种核酸分子或功能等同物(包含所述一种或多种核酸分子或功能等同物的载体)时，核酸分子或功能等同物将原位翻译成根据本发明的结合化合物。随后，所得的根据本发明的结合化合物将抵抗或预防与表达CD9的细胞相关的病症，例如表达CD9的肿瘤、骨质疏松症、关节炎、肺部炎症、COPD、结肠炎或与先天淋巴细胞相关的病症。同样，将根据本发明的细胞引入对其有需要的患者中将导致根据本发明的治疗或预防性抗-CD9抗体、或功能部分或功能等同物的生成。
一些实施方案供了根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物，或根据本发明的核酸分子或功能等同物或载体，或根据本发明的细胞，用于至少部分地治疗或预防与表达CD9的细胞相关的病症的方法中的用途。一些实施方案提供了抗体AT14-012在至少部分地治疗或预防与表达CD9的细胞相关的病症的方法中的用途。如本文所用，术语“与表达CD9的细胞相关的病症”是指包括存在表达CD9的疾病特异性细胞的任何疾病。在一些实施方案中，此类细胞是疾病的致病因子，如对于表达CD9的恶性肿瘤细胞通常是这种情况。在一些实施方案中，此类细胞的存在导致不良症状，例如炎症和/或疼痛。与表达CD9的细胞相关的病症的非限制性示例为具有表达CD9肿瘤细胞的癌症，例如黑素瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、食道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、AML、多发性骨髓瘤、胃癌、肝癌、宫颈癌、肾细胞癌、前列腺癌、脑癌、卡波西肉瘤、粘液表皮样癌、绒毛膜癌、纤维肉瘤、宫颈癌、神经胶质瘤、腺癌、肺腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌和小细胞肺癌。
如本文所用，表达CD9的肿瘤细胞也被称为CD9阳性肿瘤细胞或CD9阳性恶性肿瘤细胞。其中至少部分肿瘤细胞表达CD9的癌症被称为“CD9阳性癌症”。与表达CD9的细胞相关的病症的其它非限制性示例是骨质疏松症、关节炎、肺部炎症、COPD、结肠炎和与先天性淋巴细胞相关的病症。
因此，本发明还提供了根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物，或根据本发明的核酸分子或功能等同物或载体，或根据本发明的细胞，在至少部分地治疗或预防与表达CD9的细胞相关的病症的方法中的用途，其中所述病症选自CD9阳性癌症、骨质疏松症、关节炎、肺部炎症、COPD、结肠炎和与先天淋巴细胞相关的病症。所述CD9阳性癌症优选选自黑素瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、食道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、鳞状细胞癌、AML、多发性骨髓瘤、胃癌、肝癌、脑癌、卡波西肉瘤、粘液表皮样癌、绒毛膜癌、纤维肉瘤、宫颈癌、神经胶质瘤、腺癌、肺腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌和小细胞肺癌。
实施例示出AT14-012能够经由抗体依赖性细胞毒性(ADCC)杀死黑素瘤细胞，同时在原发性人动脉内皮细胞(HAEC)时观察到最少细胞死亡。此外，当抗体处于IgG3主链中时，抗体AT14-012已经示出能够触发补体依赖性细胞毒性(CDC)。因此，不希望受理论的束缚，据推测AT1412的抗肿瘤反应性至少部分地经由ADCC介导。因此，在一个优选的实施方案中，根据本发明或根据本发明的用途的抗体、功能部分或功能等同物能够诱导表达CD9的细胞中的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
用于所述方法中任一种的优选的抗体是本文所述的抗体AT14-012或抗体AT14-012的变体，所述变体具有与抗体AT14-012相同的结合特异性和相同或更高的亲和力。
在一些实施方案中，任选地具有突变H40Y、Y112F和D116H中的一个或多个和/或轻链突变T66I(IMGT编号)的抗体AT14-012、或其功能部分或功能等同物，或编码任选地具有突变H40Y、Y112F和D116H中的一个或多个和/或轻链突变T66I(IMGT编号)的AT14-012或其功能部分或功能等同物的至少一种核酸分子或功能等同物，或包含所述核酸分子或功能等同物的至少一种载体或细胞，优选用于至少部分地治疗和/或预防黑素瘤。如本文所用，术语“至少部分地治疗和/或预防黒素瘤”包括抵抗黑素瘤肿瘤生长和/或减轻由患者中存在黑素瘤细胞导致的症状。因此，还提供了任选地具有突变H40Y、Y112F和D116H中的一个或多个和/或轻链突变T66I(IMGT编号)的抗体AT14-012、或其功能部分或功能等同物、或编码任选地具有突变H40Y、Y112F和D116H中的一个或多个和/或轻链突变T66I(IMGT编号)的AT14-012或其功能部分或功能等同物的至少一个核酸分子或功能等同物、或包含所述核酸分子或功能等同物的至少一种载体或细胞，用于制备至少部分地治疗和/或预防黑素瘤的药剂和/或预防剂的用途。本发明还提供了任选地具有突变H40Y、Y112F和D116H中的一个或多个和/或轻链突变T66I(IMGT编号)的抗体AT14-012、或其功能部分或功能等同物，或编码任选地具有突变H40Y、Y112F和D116H中的一个或多个和/或轻链突变T66I(IMGT编号)的AT14-012或其功能部分或功能等同物的至少一种核酸分子或功能等同物，或包含所述核酸分子或功能等同物的至少一种载体或细胞，用于至少部分地治疗和/或预防黑素瘤的方法中的用途。
在一些实施方案中，根据本发明的结合化合物与治疗部分偶联，所述治疗部分诸如化学治疗药物或其它有毒化合物或放射性化合物或免疫调节分子，例如CD3特异性抗体，以分别形成所谓的“抗体-药物缀合物”或“嵌合抗原受体(CAR)T细胞”，其能够抵抗骨髓增生性或淋巴组织增生性病症。
其它实施方案提供了包含根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物的组合物。本发明还提供了包含根据本发明的核酸分子或功能等同物的组合物，以及包含根据本发明的载体或细胞的组合物。在一些实施方案中，所述抗体为AT14-012，其任选地具有突变H40Y、Y112F和D116H中的一个或多个，和/或轻链突变T66I(IMGT编号)。在一些实施方案中，根据本发明的组合物包含任选地具有突变H40Y、Y112F和D116H中的一个或多个，和/或轻链突变T66I(IMGT编号)的抗体AT14-012、或其功能部分或功能等同物，以及另一CD9特异性抗体。与AT14-012相比，所述其它CD9特异性抗体优选地结合不同CD9表位。不同CD9特异性结合化合物的此类组合特别适用于结合和/或抵抗CD9阳性细胞，诸如黑素瘤细胞或其它CD9阳性肿瘤细胞。
在一些实施方案中，根据本发明的组合物是药物组合物。此类药物组合物优选地还包含药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。合适的载体的非限制性示例例如包括钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白(例如BSA或RSA)和卵清蛋白。在一个优选的实施方案中，所述合适的载体包含溶液，例如盐水。根据本发明的药物组合物优选适用于人使用。
本发明还提供了一种用于至少部分地治疗和/或预防与表达CD9的细胞相关的病症的方法，所述方法包括向对其有需要的个体施用治疗有效量的根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物，和/或根据本发明的核酸分子或功能等同物，和/或根据本发明的载体或细胞，和/或根据本发明的组合物。如本文所用，“个体”或“受试者”为人类或非人类动物，优选地患有CD9阳性癌症、骨质疏松症、关节炎、肺部炎症、COPD、结肠炎、或与先天性淋巴细胞相关的病症的人类患者。在一些实施方案中，所述人类个体是黑素瘤患者。所述组合物优选为根据本发明的药物组合物。优选地经由一次或多次注射来施用根据本发明的结合化合物或核酸分子或功能等同物或载体或药物组合物。根据本发明的结合化合物的典型给药剂量介于0.1mg/kg和10mg/kg体重之间。
根据本发明的结合化合物也特别可用于检测表达CD9的细胞。例如，如果个体，优选地人类，被怀疑患有与表达CD9的细胞相关的病症，则可使用根据本发明的结合化合物测试来自所述个体的样品诸如血液或组织样品的表达CD9的细胞(也被称为CD9阳性细胞)的存在。在一些实施方案中，将所述样品与根据本发明的结合化合物混合，所述结合化合物将特异性结合CD9阳性细胞。结合到根据本发明的结合化合物的CD9阳性细胞，例如黑素瘤细胞，可从样品中分离和/或使用本领域已知的任何方法检测，所述方法例如但不限于使用磁珠、链霉抗生物素蛋白涂覆的珠子分离、或通过使用固定到柱子上的二抗分离。另选地或除此之外，标记根据本发明的结合化合物，以便能够检测所述结合化合物。此类结合化合物例如荧光标记、酶促标记、或放射性标记。另选地，使用针对所述结合化合物的标记的二抗检测根据本发明的结合化合物。
如果根据本发明的结合化合物看起来与患者样品的组分结合，则其指示存在CD9阳性细胞。这样，可检测特异性CD9阳性细胞如黑素瘤细胞的疾病。因此，一些实施方案提供根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物用于确定样品是否包含表达CD9的细胞的用途。在一些实施方案中，根据本发明的所述抗体或功能部分或功能等同物用于确定样品是否包含表达CD9的肿瘤细胞。本发明还提供了一种确定样品中是否存在表达CD9的细胞，优选地CD9阳性肿瘤细胞的方法，所述方法包括：
-使所述样品与根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物接触，以及
-使所述抗体或功能部分或功能等同物结合表达CD9的细胞(如果存在的话)，以及
-确定表达CD9的细胞，例如CD9阳性肿瘤细胞是否结合到所述抗体或功能部分或功能等同物，从而确定表达CD9的(肿瘤)细胞是否存在于所述样品中。在一些实施方案中，所述表达CD9的肿瘤细胞是黑色素瘤细胞。
如实施例中所示，抗体AT14-012特别适用于检测CD9阳性细胞，例如CD9阳性肿瘤细胞。因此，本发明还提供任选地具有突变H40Y、Y112F和D116H中的一个或多个，和/或轻链突变T66I(IMGT编号)的抗体AT14-012、或其功能部分或功能等同物用于确定样品是否包含表达CD9的细胞的用途。本发明还提供了任选地具有突变H40Y、Y112F和D116H中的一个或多个和/或轻链突变T66I(IMGT编号)的抗体AT14-012、或其功能部分或功能等同物用于确定样品是否包含表达CD9的肿瘤细胞的用途，所述表达CD9的肿瘤细胞例如黑色素瘤细胞或结肠直肠癌细胞或胰腺癌细胞或食道癌细胞或肺癌细胞或乳腺癌细胞或卵巢癌细胞或胃癌细胞或鳞状上皮细胞癌细胞或AML细胞或多发性骨髓瘤细胞或胃癌细胞或肝癌细胞或脑癌细胞或卡波西肉瘤细胞或粘液表皮样癌细胞或绒毛膜癌细胞或纤维肉瘤细胞或宫颈癌细胞或胶质瘤细胞或腺癌细胞或肺腺癌细胞或非小细胞肺癌细胞或膀胱癌细胞或小细胞肺癌细胞。
本发明还提供了一种确定样品中是否存在表达CD9的细胞，优选地CD9阳性肿瘤细胞的方法，所述方法包括：
-使所述样品与任选地具有突变H40Y、Y112F和D116H中的一个或多个和/或轻链突变T66I(IMGT编号)的抗体AT14-012接触，或与其功能部分或功能等同物接触，以及
-使任选地具有突变H40Y、Y112F和D116H中的一个或多个的抗体AT14-012、或其所述功能部分或功能等同物结合表达CD9的细胞(如果存在的话)，以及
-确定表达CD9的细胞，例如CD9阳性肿瘤细胞是否与任选地具有突变H40Y、Y112F和D116H中的一个或多个和/或轻链突变T66I(IMGT编号)的抗体AT14-012，或与其所述功能部分或功能等同物结合，从而确定所述样品中是否存在表达CD9的细胞。
一些实施方案提供了根据本发明的方法，其中所述样品包括血液样品、或骨髓样品或活体组织切片。在一些实施方案中，所述活体组织切片来自皮肤组织，以便测试黑素瘤和/或鳞状上皮细胞癌。在一些实施方案中，所述活体组织切片来自肠，以便测试胃癌、结肠直肠癌、食道癌或胃癌。在一些实施方案中，所述活体组织切片自胰腺组织以测试胰腺癌，或来自肺组织以测试肺癌，或来自乳腺组织以测试乳腺癌，或来自卵巢组织以测试卵巢癌，或来自肝脏组织以检测肝癌，或来自脑组织以测试脑癌或来自粘液表皮样组织以测试粘液表皮样癌，或来自宫颈组织以测试宫颈癌，或来自膀胱组织以测试膀胱癌。在一些实施方案中，所述样品为血液样品，其例如可用于测试AML、多发性骨髓瘤、癌症相关的细胞外囊泡(外分泌)，或上述实体肿瘤中任一种的转移的存在。
利用根据本发明的结合化合物的测试结果可用于样品的分类。例如，如果个体的样品看起来包含恶性肿瘤CD9阳性细胞，则所述样品可归类为包含疾病相关的细胞。随后可将此类类型用于诊断与表达CD9的细胞相关的病症。因此，一些实施方案提供根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物，其用于诊断与表达CD9的细胞相关的病症。所述病症优选选自：CD9阳性癌症、骨质疏松、关节炎、肺部炎症、COPD、结肠炎、以及与先天淋巴细胞相关联的病症。所述CD9阳性癌症优选选自黑素瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、食道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、鳞状细胞癌、AML、多发性骨髓瘤、胃癌、肝癌、脑癌、卡波西肉瘤、粘液表皮样癌、绒毛膜癌、纤维肉瘤、宫颈癌、神经胶质瘤、腺癌、肺腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌和小细胞肺癌。在一些优选的实施方案中，任选地具有突变H40Y、Y112F和D116H中的一个或多个和/或轻链突变T66I(IMGT编号)的抗体AT14-012、或功能部分或功能等同物用于上述检测和诊断。因此，本发明还提供任选地具有突变H40Y、Y112F和D116H中的一个或多个和/或轻链突变T66I(IMGT编号)的抗体AT14-012、或其功能部分或功能等同物，在诊断与表达CD9的细胞相关的病症中的用途。一些实施方案提供任选地具有突变H40Y、Y112F和D116H中的一个或多个和/或轻链突变T66I(IMGT编号)的抗体AT14-012、或其功能部分或功能等同物，在诊断黑素瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、食道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、鳞状细胞癌、AML、多发性骨髓瘤、胃癌、肝癌、脑癌、卡波西肉瘤、粘液表皮样癌、绒毛膜癌、纤维肉瘤、宫颈癌、神经胶质瘤、腺癌、肺腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌或小细胞肺癌中的用途。
本发明还提供了用于确定个体是否患有CD9阳性癌症的离体方法，所述方法包括：
-使来自所述个体的肿瘤细胞与根据本发明的抗体或功能部分或功能等同物接触，
-使所述抗体或功能部分或功能等同物结合表达CD9的细胞(如果存在的话)，以及
-确定表达CD9的细胞是否与所述抗体或功能部分或功能等同物结合，从而确定所述个体是否患有CD9阳性癌症。
此类CD9阳性癌症的非限制性示例在上文中列出。优选地，任选地具有突变H40Y、Y112F和D116H中的一个或多个和/或轻链突变T66I(IMGT编号)的抗体AT14-012或其功能部分或功能等同物用于所述方法。因此，一些实施方案提供了用于确定个体是否患有CD9阳性癌症的离体方法，所述方法包括：
-使来自所述个体的肿瘤细胞与任选地具有突变H40Y、Y112F和D116H中的一个或多个和/或轻链突变T66I(IMGT编号)的抗体AT14-012接触，或与其功能部分或功能等同物接触，
-使所述抗体或功能部分或功能等同物结合表达CD9的细胞(如果存在的话)，以及
-确定表达CD9的细胞是否与所述抗体或功能部分或功能等同物结合，从而确定所述个体是否患有CD9阳性癌症。
如实施例中所示，抗体AT14-012结合位于如图2所示的CD9序列的位置154-181，优选地168-181内的至少5个CD9氨基酸。抗体AT14-012结合CD9表位，所述表位包含对应于如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172、L173和F176的CD9氨基酸。具体地讲，AT14-012结合该CD9序列的氨基酸K169、D171、V172、L173和F176。既然这是已知的，就已经可能获得或产生具有对CD9具有特异性的其它抗体。如前所述，这可例如通过利用包含上述氨基酸残基中的至少4个，优选地至少5个的CD9肽或利用由上述氨基酸残基中的至少4个，优选地至少5个组成的CD9肽或利用包含此类CD9肽的免疫原性化合物，或利用编码此类CD9肽的核酸分子或其功能等同物免疫非人动物，优选随后进行一次或多次加强给药来进行。随后，可从所述非人动物收获特异于CD9的抗体和/或B细胞。在一些实施方案中，测试所述抗体或B细胞与抗体AT14-012对于结合到CD9的竞争。
另选地或除此之外，所述CD9肽用于筛选噬菌体展示文库，以便鉴定和/或分离CD9特异性免疫球蛋白，通常Fab片段。获得的抗体、B细胞或Fab片段通常将与抗体AT14-012竞争对CD9的结合。在一些实施方案中，进行竞争分析。
本发明还涵盖了上述CD9肽及其用途。因此，一些实施方案提供了一种分离的、重组的或纯化的CD9肽，其具有最多60个氨基酸残基的长度，其中所述肽包含至少5个氨基酸残基，所述氨基酸残基与如图2所示位于CD9氨基酸位置154-181内，优选地氨基酸位置168-181内的至少5个氨基酸残基相同。一些实施方案提供了一种分离的、重组的或纯化的CD9肽，其具有最多60个氨基酸残基的长度，其中所述肽包含至少6个氨基酸残基，所述氨基酸残基与如图2所示位于CD9氨基酸位置154-181内，优选地氨基酸位置168-181内的至少6个氨基酸残基相同。在一些实施方案中，所述CD9肽包含5个或6个氨基酸残基，所述氨基酸残基与位于如图2所示的CD9氨基酸位置169-176内的5个或6个氨基酸残基相同。在一些实施方案中，所述分离的、重组的或纯化的CD9肽至少包含对应于如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172、L173和F176的氨基酸。在一些实施方案中，所述分离的、重组的或纯化的CD9肽至少包含对应于如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172、L173和T175的氨基酸。优选地，所述CD9肽还包含对应于如图2所示的CD9序列的F176的氨基酸。
如本文所用，上述肽中的任一种被称为“根据本发明的CD9肽”。
在一些实施方案中，根据本发明所述的CD9肽具有最多55个氨基酸残基的长度。在一些实施方案中，根据本发明所述的CD9肽具有至多50个氨基酸残基或至多45个氨基酸残基或至多40个氨基酸残基的长度。在一些实施方案中，根据本发明所述的CD9肽具有至多35个氨基酸残基或至多30个氨基酸残基或至多25个氨基酸残基或至多20个氨基酸残基或至多15个氨基酸残基的长度。在一些实施方案中，所述根据本发明的CD9肽具有10个氨基酸残基或9个氨基酸残基或8个氨基酸残基的长度。
除了与图2中所示的人CD9蛋白质的位置154-181内，优选在所述CD9蛋白质的位置168-181内的至少6个氨基酸残基相同的氨基酸残基之外，根据本发明所述的CD9肽还可包含其它氨基酸残基。在一些实施方案中，所述其它氨基酸残基不来源于人CD9序列。被称为“非CD9氨基酸残基”的所述其它氨基酸残基可例如用于增强稳定性、和/或至增强免疫原性、和/或将CD9肽偶联到另一部分例如分子骨架或载体。此类骨架或载体的非限制性示例为钥孔戚血蓝蛋白和CLIPS骨架(例如双(溴甲基)苯、三(溴甲基)苯和四(溴甲基)苯，其描述于WO 2004/077062中)。因此，一些实施方案提供了一种分离的、重组的或纯化的CD9肽，其具有最多60个氨基酸残基的长度，其中所述肽包含至少5个氨基酸残基，所述氨基酸残基与如图2所示位于CD9氨基酸位置154-181内，优选地氨基酸位置168-181内的至少5个氨基酸残基相同。优选地，所述肽包含至少6个氨基酸残基，所述氨基酸残基与位于如图2所示的CD9氨基酸位置154-181内，优选地氨基酸位置168-181内的至少6个氨基酸残基相同，优选选自如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172、L173和F176，更优选地至少包含如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172、L173和F176，并且其中所述肽还包含至少1个、或至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少10个、或至少20个、或至少30个、或至少40个、或至少50个非CD9氨基酸残基，其中所述非CD9氨基酸残基的全长序列不存在于图2所示的对应CD9氨基酸位置中。此类肽优选地包含至少6个氨基酸残基，所述氨基酸残基与位于如图2所示的CD9氨基酸位置154-181内，优选地氨基酸位置168-181内的至少6个氨基酸残基相同，优选选自如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172、L173、T175和F176，更优选地至少包含如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172、L173、T175和F176。此类肽也被术语“根据本发明的CD9肽”涵盖。一些实施方案提供一种分离的、重组的或纯化的CD9肽，其具有至多60个氨基酸残基的长度，其中所述肽包含至少5个氨基酸残基，所述氨基酸残基与位于如图2所示的CD9氨基酸位置154-181内，优选地氨基酸位置168-181内的至少6个氨基酸残基相同，优选地至少包含如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172、L173和F176，更优选地K169、D171、V172、L173、T175和F176，其与包含非CD9的氨基酸残基的另一种肽偶联。一些实施方案提供一种分离的、重组的或纯化的CD9肽，其具有至多60个氨基酸残基的长度，其中所述肽包含如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172、和L173以及T175，并且优选地还包含如图2所示的CD9序列的F176残基，其中所述肽与包含非CD9氨基酸残基的另一种肽偶联。在一些实施方案中，所述肽经由肽键彼此偶联。在其它实施方案中，所述肽经由另一个非肽键，例如连接子彼此偶联。
如技术人员所已知的，一旦提供了免疫原性序列，就可能在一定程度上改变该序列，从而优选地优化所得免疫原的免疫原性和/或稳定性。这例如通过诱变程序进行，随后优选测试所得化合物的稳定性和/或免疫原性并选择改善的CD9抗原性化合物。技术人员能够很好地由特定氨基酸序列开始生成抗原变体。在一些实施方案中，进行置换网分析，其涉及由任何其它氨基酸残基置换一个或多个氨基酸残基，并测试所得化合物。在一些优选的实施方案中，使用保守氨基酸取代。保守氨基酸取代的示例包括用一个疏水残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个疏水残基，并且用一个极性残基取代另一个极性残基，例如用精氨酸取代赖氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，或用谷氨酰胺取代天冬酰胺。保守氨基酸取代的另一示例包括用丝氨酸取代苏氨酸或用酪氨酸取代苯丙氨酸。
因此本发明还提供根据本发明的分离的、重组的或纯化的CD9肽，其中选自如图2所示的CD9序列的K169、D171、V172、L173、T175和F176的至少一个氨基酸残基被另一氨基酸残基取代，其中所述肽包含在对应于如图2所示的CD9序列的K169的氨基酸位置处的精氨酸，和/或在对应于如图2所示的CD9序列的D171的氨基酸位置处的谷氨酸，和/或在对应于如图2所示的CD9序列的V172的氨基酸位置处的氨基酸残基，所述氨基酸残基选自异亮氨酸、亮氨酸和蛋氨酸，和/或在对应于如图2所示的CD9序列的L173的氨基酸位置处的氨基酸残基，所述氨基酸残基选自异亮氨酸、缬氨酸和蛋氨酸，和/或在对应于如图2所示的CD9序列的T175的氨基酸位置处的丝氨酸，和/或在对应于如图2所示的CD9序列的F176的氨基酸位置处的酪氨酸。
换句话讲，提供了根据本发明的“CD9肽”，其中位置169处的赖氨酸已被精氨酸取代，和/或其中位置171处的天冬氨酸被谷氨酸取代，和/或其中位置172处的缬氨酸已被异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代，和/或其中位置173处的亮氨酸已被异亮氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸取代，和/或其中位置176处的苯丙氨酸被酪氨酸取代。这些是保守氨基酸取代，使得所得的肽仍能够结合抗体AT14-012。所得的肽还能够结合或产生与抗体AT14-012竞争结合到CD9，优选地CD9中的相同表位的抗体或其功能部分或功能等同物。
在一些实施方案中，根据本发明的CD9肽的氨基酸残基选自天然存在于真核生物中的20个氨基酸残基，其也被称为“标准”或“规范”氨基酸。另选地，根据本发明的CD9肽中包含非天然氨基酸序列，例如D-氨基酸(即，氨基酸的D-立体异构体)或N-甲基氨基酸。
本发明还涵盖了根据本发明的核酸分子、或其功能等同物，其编码根据本发明的CD9肽。因此，本发明还提供了一种分离的、合成的或重组的核酸分子，或其功能等同物，其编码根据本发明的CD9肽。所述核酸分子或功能等同物优选地包含核苷酸的链，更优选地DNA、cDNA或RNA。在其它实施方案中，所述核酸分子或功能等同物包含其它种类的核酸结构，例如DNA/RNA螺旋、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和/或核酶。
所述核酸分子和功能等同物例如可用于使用核酸表达体系，例如大肠杆菌的宿主细胞、CHO、NSO或293(T)细胞来制备根据本发明的CD9肽。在一些实施方案中，根据本发明的所述核酸分子或功能等同物存在于基因递送载体中，所述基因递送载体有利于将所述核酸分子或功能等同物引入感兴趣的细胞中。因此，本发明提供了一种基因递送载体，优选载体，其包含根据本发明的核酸分子或功能等同物。本文还提供了一种宿主细胞，其包含根据本发明的核酸分子或功能等同物和/或根据本发明的基因递送载体。
如上文所述，根据本发明的CD9肽，或编码根据本发明的CD9肽的核酸分子或功能等同物，例如可用于获得根据本发明的CD9肽特异性抗体，例如与抗体AT14-012竞争结合到CD9的抗体。这例如通过利用CD9肽或利用编码根据本发明的CD9肽的核酸分子或功能等同物(或包含所述核酸分子或功能等同物的载体)免疫非人类动物来进行。另选地或除此之外，筛选噬菌体展示文库。因此，一些实施方案提供根据本发明的CD9肽的用途、或根据本发明的核酸分子或功能等同物的用途、或根据本发明的载体的用途，其用于制备、结合、检测和/或获得特异于CD9的免疫细胞，诸如B细胞和/或抗体或其功能部分或功能等同物，例如Fab片段。所述免疫细胞或抗体或其功能部分或功能等同物优选能够特异性地结合黑素瘤细胞。本文还提供了根据本发明的CD9肽用作免疫原的用途，以及编码根据本发明的CD9肽的核酸分子或功能等同物用作免疫原的用途。
本发明还提供了一种用于制备CD9特异性免疫细胞或CD9特异性抗体的方法，所述方法包括利用根据本发明的CD9肽，或利用根据本发明的核酸分子或功能等同物或载体将非人动物免疫。所述方法优选地还包括从所述非人类动物中收获CD9特异性免疫细胞或抗体。如前所述，所述免疫细胞或抗体或其功能部分或功能等同物优选能够特异性地结合黑素瘤细胞。
本文还可提供可通过根据本发明的方法获得的CD9特异性抗体或其功能部分或功能等同物，以及可通过根据本发明的方法获得的免疫细胞。所述CD9特定的抗体、功能部分、功能等同物或免疫细胞优选地与抗体AT14-012竞争结合到CD9。
所述非人类动物优选包括哺乳动物诸如啮齿动物或牛。在一些实施方案中，所述非人类动物包括小鼠、大鼠、兔子、美洲驼、骆驼、猪、家禽、牛、山羊、马、猿和/或大猩猩。
一些实施方案提供一种组合物，优选地免疫原性组合物，其包含根据本发明的CD9肽。在一些实施方案中，将CD9肽偶联到药学上可接受的载体或支架。一些实施方案提供一种组合物，优选地免疫原性组合物，其包含编码根据本发明的CD9肽的核酸分子或功能等同物。一些实施方案提供一种组合物，优选地免疫原性组合物，其包含载体，所述载体包含所述核酸分子或其功能等同物。根据本发明的免疫原性组合物优选还包含生物相容性添加剂，例如载体、稀释剂、赋形剂或填料。一些实施方案提供了包含根据本发明CD9肽的疫苗，或包含含有根据本发明的CD9肽的化合物的疫苗，或包含编码根据本发明的CD9肽的核酸分子或其功能等同物的疫苗。一些实施方案提供了根据本发明的组合物，其中所述组合物为药物组合物，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
根据本发明的CD9肽还可用于测试生物学样品中CD9特异性结合化合物，例如CD9特异性抗体或CD9特异性免疫细胞，诸如B细胞或T细胞的存在。例如，将包含抗体、B细胞和/或T细胞的来自个体的样品或此类样品的级分，与根据本发明的CD9肽或与包含根据本发明的CD9肽的化合物一起温育，以便筛选CD9特异性抗体和/或CD9特异性免疫细胞的存在。如果此类抗体或免疫细胞看起来存在于所述样品或所述样品级分中，并且结合根据本发明的CD9肽，则所述样品被分类为对CD9特异性结合化合物(即抗体和/或免疫细胞)呈阳性。
CD9特异性抗体或CD9特异性免疫细胞例如使用免疫测定法，例如Western印迹法、(捕获)ELISA或RIA来检测和/或定量。此类测定在本领域中为人们所熟知。根据本发明的标记的CD9肽(任选地在MHC络合物的环境中以便检测T细胞)例如与血液样品或组织样品(例如皮肤样品)或包含抗体、B细胞和/或T细胞的此类样品的级分一起温育，此后洗去未结合的结合化合物。随后，确定根据本发明的所述标记的CD9肽是否由CD9特异性抗体或免疫细胞结合。在一些实施方案中，根据本发明的未标记的CD9肽、或包含根据本发明的CD9肽的未标记的化合物(任选地在MCH络合物的环境中)与包含抗体和/或免疫细胞的样品，例如血液样品或组织样品例如皮肤样品，或包含抗体、B细胞和/或T细胞的此类样品的级分接触。温育后，优选进行一个或多个洗涤步骤以便除去非结合的抗体和未结合的免疫细胞。随后，例如使用特异性针对人类抗体或人免疫细胞的抗体来测试抗体或免疫细胞是否已经结合根据本发明的CD9肽，所述人类抗体或人免疫细胞偶联到标记物，例如荧光化合物或例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。在进一步洗涤步骤之后，优选地例如通过测量光发射或通过添加辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的底物来确定第二抗体是否已结合。此类检测技术在本领域中为人们所熟知。
在一些实施方案中，根据本发明的CD9肽、或包含根据本发明的CD9肽的化合物或组合物(在任选地MHC络合物的环境中)，与已经富集了抗体和/或免疫细胞的样品的级分接触。在一些实施方案中，所述级分是体外B细胞培养物或体外T细胞培养物。在一些实施方案中，根据本发明的CD9肽或包含根据本发明的CD9肽的化合物或组合物与已经从生物样品基本上纯化的抗体和/或免疫细胞，例如已经通过针对CD9阳性细胞进行选择而获得的纯化的B细胞级分和/或已经使用抗Ig抗体或蛋白质A或G纯化方法纯化的抗体/B细胞级分接触。蛋白质A或G纯化方法在本领域为人们所熟知，并且方案和试剂可商购获得。如本文所用，术语“从样品基本上纯化的免疫细胞”是指由免疫细胞组成的所得级分的细胞的至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％或至少95％。术语“从样品基本上纯化的抗体”是指由抗体组成的所得级分的物质的至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％或至少95％。
因此，本发明还提供了根据本发明所述的CD9肽，或包含根据本发明所述的CD9肽的化合物或组合物，用于结合和/或检测CD9特异性免疫细胞和/或CD9特异性抗体，或其功能部分或功能等同物的用途。所述免疫细胞和/或抗体或其功能部分或功能等同物优选能够特异性结合CD9阳性肿瘤细胞，例如黑素瘤细胞。本文还提供了本发明的CD9肽，或包含根据本发明的CD9肽的化合物，其用作用于CD9特异性结合化合物如抗体和/或免疫细胞的检测部分，以及一种用于确定样品是否包含CD9特异性抗体和/或CD9特异性免疫细胞的方法，所述方法包括将根据本发明的CD9肽或包含根据本发明的CD9肽的化合物或组合物与所述样品，或与包含抗体和/或免疫细胞的所述样品的级分一起温育，并且随后确定根据本发明的所述CD9肽是否被CD9特异性抗体和/或CD9特异性免疫细胞结合，或者确定包含根据本发明的所述CD9肽的所述化合物是否被CD9特异性抗体和/或CD9特异性免疫细胞结合。如果检测到此类结合，则推断所述样品包含CD9特异性抗体和/或CD9特异性免疫细胞，例如能够特异性结合CD9阳性肿瘤细胞如黑素瘤的抗体和/或免疫细胞。
还提供了一种用于确定样品是否包含CD9特异性抗体和/或CD9特异性免疫细胞，所述方法包括将根据本发明的CD9肽或包含根据本发明的CD9肽的化合物(任选地在MHC络合物的环境中)与包含已经从所述样品基本上纯化的抗体和/或免疫细胞一起温育，并且随后确定根据本发明的所述CD9肽是否被CD9肽抗体和/或CD9特异性免疫细胞结合，或包含根据本发明的所述CD9肽的所述化合物是否被CD9肽抗体和/或CD9特异性免疫细胞结合。
在一些实施方案中，如上文所述的检测测试的结果用于确定个体是否具有与表达CD9的细胞相关的病症。例如，如果测试CD9阳性肿瘤的存在的个体的样品看起来包含CD9特异性免疫细胞和/或CD9特异性抗体，则可推断所述个体遭受CD9阳性肿瘤，例如黑素瘤。所述样品优选地包含肿瘤细胞。例如，为了测试黑素瘤细胞的存在，优选使用具有怀疑黑素瘤的皮肤区域的活体组织切片。另选地，或除此之外，血液样品或淋巴结样品也可用于测试CD9阳性肿瘤细胞，因为转移性肿瘤通常在血液和淋巴系统中循环。
因此，本发明还提供了根据本发明的CD9肽用作诊断剂的用途，以及包含根据本发明的CD9肽的化合物或组合物用作诊断剂的用途。此外，本发明还提供了根据本发明的CD9肽用于诊断与表达CD9的细胞相关的病症的用途，所述与表达CD9的细胞相关的病症例如CD9阳性肿瘤、或骨质疏松症、或关节炎、或肺部炎症、或COPD、或结肠炎、或与先天性淋巴样细胞相关的病症，以及包含本发明的CD9肽的化合物或组合物用于诊断与表达CD9的细胞相关的病症的用途，所述与表达CD9的细胞相关的病症例如CD9阳性肿瘤、或骨质疏松症、或关节炎、或肺部炎症、或COPD、或结肠炎、或与先天淋巴细胞相关的病症。在一些实施方案中，所述CD9阳性癌症为黑素瘤。因此，一些实施方案提供了根据本发明的CD9肽在诊断黑素瘤中的用途，以及根据本发明的CD9肽在制备用于诊断黑素瘤的诊断试剂盒中的用途。
本发明还提供了一种诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括：
-根据本发明的CD9肽，或包含根据本发明的CD9肽的化合物或组合物，以及
-用于检测结合抗体结合的CD9肽或免疫细胞结合的CD9肽的装置。
例如，此类装置涵盖专门针对人抗体或人免疫细胞的标记抗体。在一些实施方案中，所述标记的抗体与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶缀合。
一些实施方案提供了一种用于确定个体是否具有CD9阳性肿瘤的方法，所述方法包括使根据本发明的CD9肽，或包含根据本发明的CD9肽的化合物或组合物(任选地在MHC络合物的环境中)与所述个体的抗体和/或免疫细胞接触，并且确定根据本发明的所述CD9肽，或包含根据本发明的CD9肽的所述化合物或组合物是否被所述个体的所述抗体和/或免疫细胞中的至少一种结合。如果根据本发明的CD9肽或所述化合物被所述个体的抗体和/或免疫细胞结合，则推断所述个体具有CD9阳性肿瘤。在一些实施方案中，所述CD9阳性肿瘤为黑素瘤。在一些实施方案中，根据本发明的CD9肽，或包含根据本发明的CD9肽的化合物与包含所述个体的抗体和/或免疫细胞的样品，例如血液样品或骨髓或活体组织切片，例如皮肤组织接触。在其它实施方案中，将根据本发明的CD9肽或化合物与来自所述个体的样品的级分接触，其中所述级分包含免疫细胞和/或抗体。在一些实施方案中，根据本发明的CD9肽或化合物与已经从所述样品基本上纯化的抗体和/或免疫细胞，例如已经通过针对CD9阳性细胞进行选择而获得的纯化的B细胞级分和/或已经使用抗Ig抗体或蛋白质A或G纯化方法纯化的抗体/B细胞级分接触。
根据本发明的新型CD9肽以及因此编码的核酸分子和功能等同物的另一种关注的应用是免疫治疗。例如，根据本发明的CD9肽，或因此编码的核酸分子或功能等同物可用于治疗CD9阳性肿瘤。如本文所用，“治疗”包括至少暂时减轻至少一种症状，和/或延缓或甚至停止疾病的进展。在一个优选的实施方案中，将根据本发明的CD9肽或因此编码的核酸分子或功能等同物，或者包含根据本发明的CD9肽的化合物或组合物施用于CD9阳性癌症患者，以便增强其免疫系统，从而导致增强的免疫应答。在一些实施方案中，来自CD9阳性癌症患者的幼稚T细胞或B细胞离体培养并与根据本发明的CD9肽或化合物一起温育，任选地在T细胞培养物的情况下在MHC络合物的环境中，以便获得CD9特异性T细胞或B细胞，其随后任选地在离体扩增后施用于患者。在一些实施方案中，所述CD9阳性癌症为黑素瘤。
在一些实施方案中，使用过继细胞疗法。优选在MHC络合物的环境中使用根据本发明的CD9肽，或在MHC络合物的环境中使用包含根据本发明的CD9肽的化合物或组合物来测试来自CD9阳性癌症患者的T细胞的结合或活化。识别所述CD9肽的T细胞离体扩增，随后施用于患者，这将导致抗CD9T细胞应答。
在一些实施方案中，使用供体淋巴细胞的过继细胞疗法。优选在MHC络合物的环境中使用根据本发明的CD9肽，或在MHC络合物的环境中使用包含根据本发明的CD9肽的化合物或组合物来测试来自接受同种异体HSCT的CD9阳性癌症患者或从HSCT供体分离的T细胞的结合或活化。
在一些实施方案中，对T细胞进行修饰以便向它们提供CD9特异性结合部分。所述T细胞优选来源于CD9阳性癌症患者。在一些实施方案中，产生嵌合抗原受体(CAR)T细胞。这些为具有经修饰的T细胞受体的T细胞，其已经具有感兴趣的结合特异性，优选地来源于抗体。通常，通过使来源于单克隆抗体的单链可变结构域域(scFv)融合到CD3-ζ跨膜结构域上来制备CAR T细胞，使得ζ信号将由scFv靶标识别时引发。
根据一些实施方案，使用根据本发明的CD9肽，或因此编码的核酸分子或功能等同物，或包含根据本发明的CD9肽的化合物或组合物，以便产生和/或分离CD9特异性抗体和/或B细胞，其继而被用于产生经修饰的T细胞。例如，使用所述CD9肽或化合物或核酸分子或功能等同物以便引发、检测和/或分离CD9特异性抗体或B细胞。随后，在一些实施方案中，将所述CD9特异性抗体的重链和/或轻链可变结构域提供给T细胞，从而产生具有CD9特异性的经修饰的T细胞。在一些实施方案中，随后将这些经修饰的T细胞施用于CD9阳性癌症患者，这将导致肿瘤特异性T细胞应答。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞为CAR T细胞。在一些实施方案中，在将所述抗体的重链和/或轻链可变结构域提供给T细胞之前，测试所述CD9特异性抗体或B细胞与抗体AT14-012对结合到CD9的竞争。优选选择此类竞争抗体用于产生具有CD9特异性的经修饰的T细胞。
因此，本发明还提供了根据本发明的CD9肽，或包含根据本发明的CD9肽的化合物或组合物，或编码根据本发明的CD9肽的核酸分子或其功能等同物，用作药物的用途。本发明还提供了根据本发明的CD9肽(任选地在MHC络合物的环境中)，或包含根据本发明的CD9肽的化合物或组合物(任选地在MHC络合物的环境中)，或编码根据本发明的所述CD9肽的核酸分子或其功能等同物，用于制备CD9特异性T细胞的用途。一些实施方案提供了一种用于制备经修饰T细胞的方法，所述方法包括使来自CD9阳性癌症患者的包含抗体的样品或包含B细胞的样品与根据本发明的CD9肽或化合物接触，导致针对CD9的结合抗体或B细胞，并且随后由所述CD9特异性抗体或B细胞获得一个或多个CD9特异性结构域，并且将所述一个或多个结构域提供给T细胞。一些实施方案提供一种生产经修饰的T细胞的方法，所述方法包括利用根据本发明的CD9肽或化合物或核酸分子或功能等同物免疫非人动物，从而引发针对CD9的免疫应答，并随后由来自所述非人动物的CD9特异性抗体或CD9特异性B细胞获得一个或多个CD9特异性结构域，或获得编码一个或多个CD9特异性结构域的一个或多个核酸序列，并将所述一个或多个结构域或所述一个或多个核酸序列提供给T细胞。
本文还提供了根据本发明的CD9肽在免疫疗法中的用途，以及编码根据本发明的CD9肽的核酸分子或功能等同物在免疫疗法中的用途。本文还提供了包含根据本发明所述的CD9肽的化合物或组合物用于免疫疗法的用途。一些实施方案提供了根据本发明的CD9肽，或包含根据本发明的CD9肽的化合物或组合物，或其编码CD9肽的核酸分子或功能等同物，用于制备抵抗与表达CD9的细胞相关的病症，例如CD9阳性肿瘤、或骨质疏松症、或关节炎、或肺部炎症、或COPD、或结肠炎、或与先天性淋巴细胞相关的病症的药物的用途。在一些实施方案中，所述CD9阳性癌症选自黑素瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、食道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、鳞状细胞癌、AML、多发性骨髓瘤、胃癌、肝癌、脑癌、卡波西肉瘤、粘液表皮样癌、绒毛膜癌、纤维肉瘤、宫颈癌、神经胶质瘤、腺癌、肺腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌和小细胞肺癌。
在一些实施方案中，如上文所述的根据本发明的检测测试的结果用于确定个体是否表现出针对CD9阳性肿瘤例如黑素瘤的免疫应答。例如，这对于确定已经接受免疫治疗的患有此类肿瘤的患者是否引发抗肿瘤免疫应答是优选的。因此，一些实施方案提供了用于确定个体是否表现出针对CD9阳性肿瘤的免疫应答的方法，所述方法包括使根据本发明的CD9肽(任选地在MHC络合物的环境下)，或包含根据本发明的CD9肽的化合物或组合物与所述个体的抗体和/或免疫细胞接触，和/或确定根据本发明的所述CD9肽，或包含根据本发明的所述CD9肽的所述化合物或组合物是否被所述个体的所述抗体和/或免疫细胞中的至少一种结合。如果所述CD9肽或所述化合物看起来被结合，则其指示所述个体表现出针对CD9阳性肿瘤的免疫应答。
一些实施方案中，抗体AT14-012竞争结合到CD9的分离的、重组的或纯化的抗体或其功能部分或功能等同物用于治疗黑素瘤。如实施例中所述，从完全缓解的黑素瘤患者中获得抗体AT14-012，证明AT14-012中针对黑素瘤有效。因此，与AT14-012竞争CD9的抗体也将是有效的。因此，将此类抗体施用于黑素瘤患者将有效抵消和/或杀灭黑素瘤细胞。因此，一些实施方案提供与抗体AT14-012竞争结合到CD9的分离的、重组的或纯化的抗体、或其功能部分或功能等同物，用作药物的用途。一些实施方案提供了与抗体AT14-012竞争结合到CD9的分离的、重组的或纯化的抗体或其功能部分或功能等同物用于制备药物的用途。
本发明还提供了与抗体AT14-012竞争结合到CD9的分离的、重组的或纯化的抗体或其功能部分或功能等同物在用于至少部分地治疗或预防黑素瘤的方法中的用途，以及抗体AT14-012竞争结合到CD9的分离的、重组的或纯化的抗体或其功能部分或功能等同物用于制备针对黑素瘤的药物的用途。
虽然本专利申请可作为相同实施方案的一部分或者作为单独实施方案的各部分来描述特征结构，但是本发明的范围还包括包含本文描述的特征结构中的全部或一些的任何组合的实施方案。
本发明在以下实施例中进一步说明。这些实施例不限制本发明的范围，而是仅用于澄清本发明。
附图说明
图1：人CD9的示意性结构。
图(1a)：人四跨膜蛋白CD9的示意图
四跨膜蛋白的特征在于四个跨膜区域和两个细胞外环：小细胞外环1(EC1)和大细胞外环2(EC2)。CD9的EC2在结构和构象上由两个半胱氨酸键(红色)(C152-C181和C153-C167)和保守的相邻残基(G154和P168)限定。四跨膜蛋白家族成员中的两个高度可变区域位于氨基酸位置154-167和168-181之间(以紫色示出)。
图(1b)：第二细胞外环的动画示意图。
第二细胞外环的动画示意图分成5个不同的区域，并由对应的氨基酸编号示出。这些区域基于与其它四跨膜蛋白家族成员诸如CD81的重叠来选择。这些区域在表位作图研究中进一步描述(图5)。
图2：人CD9的氨基酸序列(UniProt No.P21926)
图3：抗体AT14-012的氨基酸和核苷酸序列。CDR编号根据Kabat等人(1991)。
图4：靶ID
图(4a)：AT14-012与～25kDa大小的抗原反应。
在非还原和还原条件下，对于AT14-012针对Caco2、MelBLM和对照HL-60细胞系的裂解物(50μg)的结合探测蛋白质印迹(参见实施例2的材料和方法)。AT14-012示出针对～25kDa尺寸抗原的反应性并且当样品还原时丧失，这意味着AT14-012针对构象表位反应。
图(4b)：利用AT14-012对癌细胞系进行免疫沉淀的质谱分析指示CD9为靶标。
分选酶生物素标记的AT14-012或对照AT14-002与Caco2、MelBLM或对照HL-60的裂解物一起温育。在凝胶上运行免疫沉淀洗脱物，并用考马斯亮蓝染色，以示出尺寸为～25kDa的可见带，其尺寸与蛋白质印迹结果重叠。质谱法分析示出CD9作为AT14-012抗原。MS分析也鉴定了MelBLM细胞系的沉淀的CD9，然而对于HL-60洗脱物没有发现CD9。
图(4c)：通过商业抗体ALB6确认CD9。
IP洗脱物示出针对AT14-012和抗-CD9抗体ALB6的反应性，从而确认了CD9为AT14-012的靶抗原，然而对于HL-60裂解物的IP洗脱物没有发现反应性。
图5：表位作图
图(5a)：通过杂交或交换突变体的表位作图示出细胞外环2(EC2)和更具特异性的区域154-180作为AT14-012的主要表位。
表位作图示出细胞外环2具有所有抗-CD9抗体的表位。AT14-012示出针对可变CD9环m3和m4的结合丧失。
图(5b)：通过EC2的区域m4的丙氨酸扫描进行表位作图。
HI9a、ALB6和AT14-012(-Alexa647标记的)针对区域m4的丙氨酸突变体的反应性。将HI9a用作阳性对照。F176是示出针对两种抗体的结合丧失的唯一残基。附加的5个残基示出了针对AT14-012(K169、D171、V172、L173和T175)的结合丧失。
图6：肿瘤结合。
图(6a)：AT14-012具有针对实体肿瘤的广泛的结合反应性。结合到一组实体肿瘤细胞系的AT14-012相对于AT10-002抗体的流式细胞术分析。
图(6b)：AT14-012结合选定数量的急性骨髓性白血病细胞系。结合到一组AML细胞系的AT14-012相对于CD30抗体的流式细胞术分析。
图(6c)：AT14-012结合选定数量的多发性骨髓瘤细胞系。CD9相对于未染色的，以及结合到一组MM细胞系的AT14-012相对于AT10-002的流式细胞术分析。
图7：对健康细胞的结合
图7a：与原代黑素细胞相比，AT14-012与黑素瘤结合更强分析结合到黑素瘤细胞系和原代黑素细胞的AT14-012。AT10-002(抗流感)作为阴性对照被包括，帕尼单抗(抗EGFR1)作为用于结合到健康细胞的阳性对照。在利用一抗染色后，用抗IgG-PE标记细胞以用流式细胞仪可视化。
图7b：与原代结肠上皮细胞相比，AT14-012与结肠癌结合更强。与结肠癌细胞系和原代结肠上皮细胞结合的CD9PE和AT14-012A647的流式细胞术分析。AT10-002A647(抗流感)作为阴性对照被包括，包括抗CD81PE以确认Colo-320细胞上CD9表达的缺失。
图7c：与原代扁桃体淋巴细胞相比，AT14-012与黑素瘤结合更强。扁桃体淋巴细胞利用针对CD4、CD8和CD9的抗体染色，以分别区分CD4T、CD8T和CD19B细胞。
图8：血小板
图8a：AT14-012结合人血小板。固定或未固定的健康人血小板利用CD41、CD9或AT14-012生物素/SA-PeCy7染色。直方图是门控的CD1阳性。
图8b：AT14-012活化健康血小板。对于利用TRAP(阳性对照肽)、ALB6(阳性对照小鼠IgG1抗体)、FLAG(阴性对照小鼠IgG1抗体)、AT10-002或AT14-012抗体一起温育的PRP通过流式细胞术测定表面CD62P表达。
图8c：AT14-012不诱导血小板附聚。将全血与各种刺激物一起温育，并使用Multiplate读数器测量血小板附聚的诱导。
图9：体内实验
图9a：AT14-012在体内抑制淋巴结转移。用AT14-012或AT10-002对照抗体处理在两侧胁腹上皮下移植500.000个MelBLM GFP/荧光素酶黑素瘤细胞的NSG小鼠。在荧光素注射和随后的内部器官暴露后，使用生物发光成像仪使由箭头指示的淋巴结转移可视化。
图9b：AT14-012损害体内原发性黑素瘤肿瘤生长。自实验开始，用AT14-012或AT10-002对照抗体处理在两侧胁腹上皮下移植200.000个MelBLM GFP/荧光素酶黑素瘤细胞的NSG小鼠。通过厚度测量测定肿瘤生长。
图9C：AT14-012识别体内黑素瘤肿瘤。将用AT10-002(抗流感)或AT14-012处理的从NSG小鼠收获的MelBLM皮下肿瘤或留下的未处理的肿瘤包埋在石蜡中。对于免疫组织化学，用HRP标记的抗-λ或抗-κ抗体染色切片。
图9D：在AT14-012处理后降低的表面CD9水平。将从利用AT14-012或AT10-002对照抗体处理的NSG小鼠收获的皮下MelBLM肿瘤消化并利用AT10-002-生物素、AT14-012-生物素染色，然后用荧光标记的缀合的链霉抗生物素蛋白、或直接标记的HI9a CD9或抗IgG抗体染色，用于流式细胞术。样品在Fortessa X20(Becton Dickinson)上测量。
图9E-G：AT14-012阻碍SK-MEL-5黑素瘤的生长。用AT14-012或AT10-002对照抗体处理携带皮下SK-MEL-5黑素瘤肿瘤的NSG小鼠。E.通过厚度测量确定实时肿瘤生长。灰色区域指示抗体处理的时间段。F.称量离体分离的肿瘤。每个小鼠取平均重量。G.通过释放酶处理来消化肿瘤并用CD9HI9a-PE染色用于流式细胞术。
图10：AT14-012结合与最近建立的肿瘤细胞系上的CD9表达相关。对于结合到短期培养的黑素瘤细胞的AT14-012和CD9HI9a进行流式细胞术分析。A.黑素瘤细胞的CD9HI9a、AT14-012和AT10-002抗流感(对照)抗体染色的柱状图。B.针对背景染色校正的AT14-012对CD9HI9a信号的平均荧光强度。箭头指示来源于原始AT14-012患者的黑素瘤样品Mel06.07和Mel05.18。C.结合到已构建的细胞系(PANC01和CAPAN2)和最近患者来源的胰腺癌肿瘤细胞(53M和193)的AT14-012和CD9HI9a的流式细胞术分析。
图11：AT14-012结合限于(非)-人类灵长类动物。从A.NOD SCIDγc-/-(NSG)小鼠分离血小板富集的血浆；B.新西兰白兔；C.对食蟹猕猴(食蟹猴)和人类针对表达CD41的血小板进行电子选通。AT10-002、AT14-012和抗CD对相应物种的血小板的结合通过流式细胞术测定。
图12：抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。将铬标记的A.MelBLM或人动脉内皮细胞或B.与指定抗体一起温育的原代短期培养的黑素瘤细胞针对总人PBMC进行滴定。通过上清液中铬的释放来测定细胞死亡。
图13：AT14-012激发补体介导的肿瘤细胞死亡。A、B.将黑色素瘤细胞系与指定的抗体和人血清一起温育，随后使用抗C1q抗体通过流式细胞术测试C1q沉积。通过将C.悬浮液或D.过夜粘附的黑素瘤细胞与指定的抗体和兔补体一起温育来测定补体介导的细胞毒性。E.CD55阳性(MelBLM)和CD55阴性(Colo-205)与指定的抗体和人血清的温育。粘附细胞的悬浮液的细胞死亡百分比分别通过流式细胞术由DAPI测定或通过显微镜由TO-PRO3测定。
图14：AT14-012有利于结合到同型簇CD9。将两个黑素瘤和一个结肠癌细胞系与棕榈酰化2-BP的抑制剂或仅DMSO一起温育36小时。A.将细胞分离并用AT10-002流感对照抗体或不同的CD9抗体、AT14-012或可商购获得的HI9a和ALB6克隆体进行染色以用于流式细胞术。B.从CD9信号的m.f.i中减去AT10-002信号的柱状图的平均荧光强度。比率为DMSO条件的Δm.f.i.值除以对应的Δm.f.i.2-BP值并针对不同细胞系作图。比率为1指示抗体结合不受去棕榈酰化的影响。
图15：对HL60细胞上表达的区域m3的丙氨酸扫描未示出AT14-012结合的任何损失(n＝2)。令人惊讶的是，确定m3区域中的单个氨基酸的交换不会破坏AT14-012结合。作为对照，包括CD9-WT、CD9/CD81 EC2杂交突变体、EC2m3 CD9/CD81杂交突变体，并且结合数据示出与先前报道的数据重叠(图5)。
图16：与市售小鼠抗-CD9抗体相比，AT14-012具有对CD9的较低亲和力。A.将AT14-012(+对照AT10-002)和市售abs HI9a和ALB6(+对照抗-FLAG用于检测平板上CD9蛋白和OKT3的存在)的CD9结合进行比较。B.SPR曲线示出对于一个单个斑点状CD9-3xFLAG-兔Fc-分选酶-生物素蛋白，抗-CD9抗体AT14-012、ALB6和HI9a对各种抗体注射的结合。C.如通过SPR测定的人CD9的不同抗体的亲和力测量。ka以104秒-1*M-1计，kd以10-5秒-1计，KD以pM计。示出涂覆有7324RU重组CD9-3xFLAG-兔Fc-分选酶-生物素(0.5μg/mL)的一个CD9-点的结果。为了计算结合动力学，将来自三次重复注射的数据拟合至1:1结合模型。示出对于涂覆有0.5μg/mL或1.0μg/mL CD9-3xFLAG-兔Fc-分选酶-生物素的三个点的测量的平均值和标准偏差。*：当表观抗体解离率(kd)太低而不能精确拟合时，使用0.1*10-5的值。示出对于两个点上两次滴定的平均值，两个点均涂覆有0.5μg/mL CD9-3xFLAG-兔Fc-分选酶-生物素。为了计算结合动力学，使用来自三次重复注射的数据。
图17：K169、D171、V172、L173和F176是AT14-012表位的一部分。A.AT14-012(三角形，所有图中的底线)，ALB6(圆形)和HI9a(正方形)结合到重组表达的m4丙氨酸突变体上的ELISA数据。B.显示在CD9同源模型上的AT14-012表位(EC为细胞外取向并且IC为细胞内取向)。同源模型使用I-Tasser服务器(Yang等人，2015)进行构建，该服务器使用CD81同源模型(2AVZ；Seigneuret等人，2006)。截至2016年11月，公布了晶体结构(Zimmerman等人，2016)，并且基于该晶体结构的新构建的CD9同源模型未示出关于与AT14-012表位相关的残基取向的任何机会。C.AT14-012FACS与来自不同物种的细胞结合数据(参见图11)和来自多个物种(本文)的CD9序列(残基23-228)的比对增强了AT14-012表位。序列于2016年6月左右从ensembl.org网站上检索。对于所有发现的物种，前22个残基不能很好地分辨，因此在此省略。已知AT14-012与食蟹猴细胞反应，然而当测定与兔或小鼠细胞的结合时，结合丧失。侧接有C167和C182(绿色)的区域m4的比对突出显示(浅灰色)，并且更具体地，5个残基(深灰色)参与AT14-012结合。显然，F176L突变不引起AT14-012的结合的丧失(参见图11C中结合到食蟹猴细胞的AT14-012)。
图18：使用单细胞分选的2H15 B细胞和SPR(IBIS)的改善的AT14-012亲和力。A.以逐渐增加的浓度(0-1.33-4.0-13.30-40.0-133.0-和0nM的蛋白质)8次连续注射重组AT14-012的SPR曲线。绿线为针对CD81(无)结合反应性，橙色为结合到抗-人IgG-Fc，灰色为结合到抗-CH1纳米抗体，并且蓝色为结合到CD9。抗-IgG-Fc和aCH1的比率可用于观察B细胞sup中IgG的浓度和完整性(参见B)。B.如材料和方法中所述，在SPR中筛选800个克隆体后，再次测定新生长的B细胞sup的结合。增加八个克隆体(1D5、1F5、2D12、4H10、6E10、9E5、10B9和10D1)，然而最终没有4个怀疑的克隆体(1C9、2H10、9A9、9D12)。为了参考，在开始和结束时注射重组AT14-012。C.发现的克隆体的序列分析(包括亲和力)示出与其缔合/解离特征相关的突变的重叠。组1示出较快缔合和较慢解离，组2示出较快缔合和解离，并且组3示出关于WT序列(1G2、1G3、1G4、1G5)没有明显差异。
图19：结合在细胞和SPR上的AT14-012较高亲和力突变的设计、表达和分析。A.因为仅主要突变位于重链中，所以仅示出重链的比对。另外，制备组1(红色；H40Y和Y112F)和组2(蓝色-青色；D116H和T29N)和两个组一起(H40Y、Y112F、D116H和T29N)的组合。作为对照，添加导致缺乏CD9结合的一个突变以验证结果(深蓝；G110D)。原始AT14-012/2H15超突变以黄色突出显示。CDR编号根据IMGT编号系统(Lefranc 1997，Lefranc 1999和Lefranc等人2003)编号。B-C.将来自两种不同供体的细胞的MelWBO或短期培养的健康黑素细胞与不同AT14-012变体的CHO生产上清液一起温育。使用山羊-抗-人IgG-PE二抗通过流式细胞术检测结合。D-E.通过SPR在CD9涂覆的薄片上测定不同AT14-012变体的CHO生产上清液(重复示出)。#＝CHO生产上清液。亲和力为ka以104秒-1*M-1计，kd以10-5秒-1计，KD以pM计。示出对于两个斑点上两次滴定的平均值，两个斑点均涂覆有0.5μg/mLCD9-3xFLAG-兔Fc-分选酶-生物素。突变体样品为未纯化的生产悬浮液，其在PBST中稀释。-：未检测到结合*：检测到结合，但不能良好的拟合。
图20：使用AT14-012高亲和力突变体的血小板附聚测定。作为对照，采用TRAP、ALB6、和先前检查的重组纯化全长AT14-012 IgG1和IgG3，包括对照AT10-002 IgG1抗体。
图21：B细胞产生的AT14-012/2H15抗体具有同种异型IGHG3*16。从AT14-012/2H15B细胞分离mRNA。图改编自Vidarsson等人，2014。
图22：AT14-012与抗PD1的组合抑制体内肿瘤生长。利用表达SK-MEL-5荧光素酶的黑素瘤肿瘤细胞对携带人免疫系统的NSG小鼠进行皮下移植。用指定的抗体对小鼠每周两次进行处理。A.通过荧光素酶成像测定肿瘤生长。灰色区域指示抗体处理的时间段。B.基于实验结束时肿瘤的大小和第一次抗体注射时的肿瘤大小计算肿瘤生长抑制百分比(TGI)。
具体实施方式
实施例
实施例1-AT14-012B细胞克隆体的分离
材料和方法
黑素瘤细胞培养物。通过Rosalie Luiten(学术医学中心，皮肤病学系)获得黑素瘤细胞系MelBLM、Mel136.2和MelWBO，并使用标准组织培养技术保持在IMDM(LifeTechnologies)，8％胎牛血清中。为了最小程度地破坏细胞表面蛋白，使用Accutase(LifeTechnologies)或EDTA分离肿瘤细胞。
黑素瘤供体PBMC。研究方案由Leiden大学医学中心医学伦理委员会批准。通过过继转移自体血来源的肿瘤特异性T细胞与IFNα的组合来治疗IV期黑素瘤患者(VerdegaalCancer Immunol Immunother 2011)。
治疗之后肿瘤复发，并且患者是其同期组群中唯一的长期幸存者。
在治疗后五年收集血液，从ficoll梯度分离PBMC，并且冷冻至液氮直至B细胞分离。
B细胞永生化。使用FACSAria(Becton Dickinson)从解冻的患者的PBMC中分选出总IgG B细胞，并如Kwakkenbos Nat Med 2010中所述进行永生化。简而言之，在重组小鼠IL-21的存在下，在表达CD40L的L细胞上在36小时期间培养并活化总IgG B细胞。通过逆转录病毒转导，将表达Bcl6和Bcl-xL的专有构建体以及标记基因GFP引入B细胞中，从而使B细胞永生化。
B细胞培养。将永生化B细胞保持在补充有8％FCS(HyClone)、青霉素/链霉素(Roche)和重组小鼠IL-21(50ng/mL，内部生产的)的IMDM(Gibco)中。经γ-照射(50Gy)的表达CD40L的小鼠成纤维细胞被包括作为饲养细胞。对培养物进行常规测试，其对于支原体的存在呈阴性。
分离结合B细胞克隆体的黑素瘤。将永生化的IgG B细胞以每孔25个细胞接种于384孔板中，并使用L细胞和mIL21扩增。在培养大约2周之后，测试包含抗体的B细胞上清液与黑素瘤细胞系混合物的结合。使用抗-人IgG-PE抗体(Southern Biotech)，通过流式细胞术(FACS Canto和LSR Fortessa X20，Becton Dickinson)将阳性结合可视化。扩增阳性微培养物，并对单细胞分选的B细胞重复该过程，以从25个细胞微细培养物中回收黑素瘤反应性B细胞克隆体。帕尼单抗(抗EGFR1)被包含作为阳性对照抗体。
重组抗体生产。为了产生重组抗体，用
Figure BDA0001756397130000571
小型试剂盒(Qiagen)分离总RNA，生成cDNA，进行PCR并将重链可变区和轻链可变区克隆到pCR2.1TA克隆载体(Invitrogen)中。为了排除逆转录酶或DNA聚合酶诱导的突变，将多个克隆体进行测序。将AT14-012的重链可变区和轻链可变区以具有人IgG1或IgG3和κ恒定区的框形式克隆到基于pcDNA3.1(Invitrogen)的载体中。将所得载体瞬时转染293T细胞，并且使用AKTA纯化体系(GeneralElectric Lifesciences)由培养上层清液纯化重组抗体。出于对照的目的，在实验中包括识别流感病毒上的HA抗原的不相关对照抗体(AT10-002)。
结果
结合B细胞克隆体的黑素瘤的鉴定和分离。通过过继转移自体肿瘤反应性T细胞来治疗患有皮肤黑素瘤和进展性转移性疾病IV期的患者(Verdegaal Cancer ImmunolImmunotherapy 2011)。该肿瘤组织通过外科手术获得并用于建立自体黑素瘤细胞系。将外周血单核细胞从血液中分离，并与经致死剂量照射的自体黑素瘤细胞的共培养物一起置于T细胞培养基中。培养4周后，在功能测定法(Verdegaal Cancer Immunol.Immunotherapy2011)中确认培养的T细胞的肿瘤反应性。。患者接受两轮扩增的自体T细胞并显示出完全应答，并且在治疗后9年仍然没有肿瘤。
从过继性T细胞疗法后五年分离的PBMC中，利用专有的Bcl6/Bcl-xL构建体逆转录病毒转导总IgG B细胞库。通过流式细胞术测试永生化GFP阳性细胞中黑素瘤结合抗体的存在。
命名为AT14-012的IgG3 B细胞克隆体显示出对最初测试的两种黑素瘤细胞系(MelBLM和MelWBO)的强烈反应性。测定可变重链序列和可变轻链序列(参见图3)，并将DNA克隆到IgG1和IgG3主链中，用于在293或CHO细胞中产生重组抗体。
实施例2-AT14-012靶抗原为CD9
材料和方法
AT14-012靶鉴定和验证
将结肠癌细胞系Caco2(ATCC HTB-37)的细胞、黑素瘤细胞系MelBLM的细胞和人早幼粒细胞白血病细胞系HL-60的细胞(阴性对照)裂解(0,5％Triton X114(Sigma)、150mMNaCl、10mM Tris-HCL pH7.4、1,5mM MgCl2，补有充蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Roche))并用无关抗体(内部生成的RSV抗体D25)、蛋白-G和链霉抗生物素蛋白珠(Pierce)预清除以去除非特异性结合蛋白。为利用AT14-012直接进行蛋白质印迹法，将纯化的重组AT14-012在室温下在TBS+5％BSA(Thermo Fisher)和0.1％Tween20(Sigma)中在SDS-Page和涂印的裂解物上温育至少1小时。将印迹在TBST中洗涤3次并持续5分钟，并用山羊-抗-人-IgG(1:10.000标记的HRP稀释液；Jackson Laboratories)的iTBST+5％BSA溶液检测。同样，在通过化学发光处理进行显影之前，将印迹洗涤3次并持续5分钟。然后将预清除的裂解物与结合珠子的AT14-012黑素瘤特异性抗体或与作为阴性对照的流感特异性抗体AT10-002一起温育(3小时，在4℃下)。在裂解缓冲液中将抗体温育的珠洗涤三次，并且将结合的蛋白质从珠(0.1M甘氨酸，pH 10.5，150mM NaCl，1％Triton X100，1mM EDTA)中洗脱，并利用2M Tris pH7.4以1:10体积中和。同样，在SDS PAGE凝胶上运行样品。85％的IP样品在SDS-PAGE上运行，并且用Imperial蛋白染色剂(Pierce)进行染色，以染色总蛋白质，并且切除特定带用于质谱。其余的免疫沉淀(IP)样品在SDS-PAGE上运行并转移到PVDF膜(Bio-Rad)用于进行免疫印迹。将印迹与AT14-012或小鼠-抗-CD9(克隆ALB6，Beckmann Coulter)一起温育用于蛋白质印迹分析以确认CD9的种类(数据未示出)。
表位作图
最初通过产生CD9的杂交突变体(对CD81)进行表位作图。CD9上存在两个细胞外环：小EC1(残基34-58；或SEL)和大EC2(残基112-195；或LEL)，其可用作AT14-012的结合配偶体(图1a)。除野生型CD9构建体外，还生成置换第一个较小的环的一个交换突变体，以及置换CD81的对应残基的较大环的一个交换突变体。为了进一步解构二级环，提出了置换CD81的对应区域的预测α螺旋延伸物的较小交换突变体，从而导致5个交换突变体：m1(CD9的残基112-134被对应的CD81残基取代)，m2(CD9的残基135-151被对应的CD81残基取代)，m3(CD9的残基154-166被对应的CD81残基取代)，m4(CD9的残基168-180被对应的CD81残基取代)和m5(CD9的残基182-195被对应的CD81残基取代)，参见图1b。所述半胱氨酸在四跨膜蛋白(C152、C153、C167和C181)中是保守的，并且因此，在交换指定区域之后，结构特性/折叠将可能是完整的。二级结构预测示出CD9以与其它四跨膜蛋白相似的方式折叠，这指示只要保留半胱氨酸，这种方法就可以起作用。所有CD9和交换变体由CD9基因的GeneArt(Thermo Fisher Scientific)构建，并且是C-端FLAG标记的(3x FLAG：DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK)，以用于关于蛋白质印迹的可能检测。将CD9cDNA克隆到包含CD9cDNA的IRES-GFP 3'的pHEF-TIG第三代慢病毒载体中；VSV-G慢病毒颗粒在HEK293T细胞中产生。在纤维连接蛋白(Takara，Clontech，Japan)的存在下，利用这些病毒对多发性骨髓瘤CD9阴性细胞系HL-60(ATCCCCL-240)进行转导，并且针对GFP进行分选，以获得纯的过表达CD9的细胞群。基于14-012连同其它市售抗-CD9抗体(ALB6；Beckmann Coulter和HI9a；Biolegend)的FAC结合结果，生成区域m4的丙氨酸突变体(残基K169A、K170A、D171A、V172A、L173A、E174A、T175A、F176A、T177A、V178A、K179A和S180A)以检查该m4区域中的哪些特定氨基酸属于该表位。
在CD9的m3区域中使用丙氨酸扫描进行表位作图
如前所述进行丙氨酸扫描(参见属于图5B的材料和方法)。将CD9 cDNA克隆到包含CD9 cDNA的IRES-GFP 3'的pHEF-TIG第三代慢病毒载体中；VSV-G慢病毒颗粒在HEK293T细胞中产生。在纤维连接蛋白(Takara，Clontech，Japan)的存在下，利用这些病毒对多发性骨髓瘤CD9阴性细胞系HL-60(ATCC；CCL-240)进行转导，并且针对GFP进行分选，以获得纯的过表达CD9的细胞群。基于AT14-012连同其它市售抗-CD9抗体(ALB6和HI9a)的FAC结合结果，生成区域m3的丙氨酸突变体(残基G154A、L155A、G157A、G158A、V159A、E160A、Q161A、F162A、I163A、S164A、D165A、I166A)以检查该m3区域中的哪些特定氨基酸属于该表位。
结果
AT14-012的靶是CD9
使用结肠癌细胞Caco2(ATCC HTB-37)鉴定AT14-012的靶，因为AT14-012的结合在FAC上更高，但以相似的方式对黑素瘤细胞系MelBLM的裂解物进行了确认。探测Caco2、MelBLM或HL-60细胞的SDS-Page运行裂解物的蛋白质印记的AT14-012反应性，并利用多克隆山羊抗-人-IgG(HRP标记的；Jackson实验室)进行检测。所述印记示出针对～25kDa大蛋白质的反应性(图4a)。当裂解物在还原条件下运行时，反应性或信号丧失，这意指抗体与构象表位反应受半胱氨酸限制。Caco2或MelBLM裂解物的免疫沉淀(IP)与生物素标记的分选酶标记的AT14-012温育也产生～25kDa条带(图4b)。该带是特异性的，因为其在Caco2/MelBLM裂解物的AT10-002IP中以及在HL-60裂解物IP中均未观察到。免疫沉淀带的质谱(MS)分析示出CD9为靶蛋白。虽然，对于MelBLM细胞上的IP，考马斯带对于肉眼不可见，但MS分析示出揭示了相同的沉淀的CD9抗原。鉴定了属于细胞外环2的四种细胞外肽，获得10％的蛋白质覆盖率。未鉴定跨膜肽，因为它们由于其疏水性而难以检测。通过蛋白质印迹分析证实CD9由AT14-012结合(图4c)。简而言之，Caco2或HL-60裂解物利用AT14-012或利用流感特异性抗体AT10-002进行免疫沉淀。再次利用AT14-012和小鼠-抗-CD9(克隆ALB6)进行蛋白质印迹分析证实CD9为AT14-012的结合靶(图4c)。
CD9在健康细胞和恶性肿瘤细胞上广泛表达。已经生成CD9特异性抗体，并且可商购获得，诸如ALB6和HI9a。利用这些抗体，由Caco2和BLM细胞证实了CD9表达。与AT14-012的竞争实验示出，所有市售抗体均能够竞争AT14-012以及AT14-012本身的结合(数据未示出)。
为了更具体地鉴定AT14-012的结合表位，生成杂交突变体以交换CD9同系物CD81的蛋白区域，如材料和方法部分中所述。测试了抗体AT14-012、ALB6和HI9a与这些突变体的结合。据鉴定所有抗-CD9抗体与细胞外环2(EC2)结合，从而示出在CD81的EC2被交换时结合丧失，然而当第一细胞外环(EC1)被交换时结合保持。当用空载体或非转导细胞转导HL60细胞时，对于所有抗体均未观察到结合。由杂交突变体m1、m2、m3、m4和m5进一步检查EC2环上的表位，其中CD9的特定区域被交换为CD81的对应区域(图1b)。值得注意的是，半胱氨酸保留未被触及以便维持二级结构。m2和m5区域的交换对于任何抗-CD9抗体的结合没有任何影响，这示出表位不存在于这些区域中。可示出当区域m3被交换时，所有抗体的结合均被废除，这表明所有测试的抗体的表位均位于该区域中。AT14-012保持与m1突变体的结合，然而所有的市售抗体均丧失结合。ALB6和AT14-012示出针对m4突变体的结合丧失，然而HI9a保持结合。这些结果指示，AT14-012的主要表位存在于m3和/或m4中。这指导我们首先在m4中制备丙氨酸突变体(如材料和方法部分中所述)。在此，采用HI9a作为阳性对照，从而控制CD9丙氨酸突变体在转导的HL60细胞的表面上的表达。采用ALB6作为比较，用于检查该商业上广泛使用的抗-CD9抗体是否具有相似的表位。在FAC分析后，示出F176A是唯一示出丧失与ALB6结合的丙氨酸突变体。对于AT14-012，当残基K169、D171、V172、L173、T175和F176取代丙氨酸时，观察到结合丧失。因此，示出AT14-012的表位与ALB6的表位重叠，但在至少5个附加的氨基酸上不同。
AT14-012表位是线性的，并且仅位于区域m4中。在区域m4的丙氨酸扫描结合实验之后，继续更详细地研究m3区域，因为丧失了对杂交CD9/CD81突变体的结合(参见图15)。在区域m3中构建丙氨酸突变体，其跨越除了A156之外的氨基酸154至166。转导CD9阴性HL60细胞系，GFP整体分选表达CD9的细胞。通过FACS检查AT14-012、ALB6和HI9a对细胞的结合。令人惊讶的是，该区域中的单个丙氨酸置换均不消除AT14-012或HI9a的结合。EC2和m3CD9/CD81杂交突变体显示出所有抗体均缺失结合，因此，必须假定这种特定的杂交体可能被错误地折叠。根据CD81的晶体结构和CD9的同源模型(参见图15)，m3区域被“锁定”在m1、m2和m4之间的位置中。因此，当将任何大的氨基酸交换引入该区域中时，似乎所有抗-CD9抗体均可能丧失结合。另一方面，ALB6丧失对Q161A突变体的结合，因此，也解析了ALB6的表位(m3中的Q161和m4中的F176)。在分析区域m3和m4中的丙氨酸扫描后，可假设AT14-012靶向线性折叠的表位，其在构象上保持在一起或由CD9的其它周围部分(m2、m3和m5，参见图15中的同源模型)诱导。
AT14-012有利于结合到成簇的CD9。Martin Hemler实验室示出CD9的棕榈酰化有利于CD9同型簇的形成，并且CD9同型簇的水平在原发性肿瘤细胞，并且具体地讲转移性肿瘤细胞上升高(Yang JBC 2006)。为确定AT14-012对于CD9的棕榈酰化状态的依赖性，在2-溴棕榈酸酯(2-BP)(一种已知的棕榈酰化抑制剂)存在下培养肿瘤细胞。黑素瘤BLM细胞明显地示出AT14-012对经2-BP处理的细胞的结合减少，然而可商购获得的CD9HI9a抗体的结合不受去棕榈酰化的影响[图14A、B]。值得关注的是，观察到的效果在高侵袭性MelBLM(BartoloméAJP 2009)上最强，并且在非转移性结肠癌CaCo2细胞上未观察到。这表明CD9同型簇在晚期疾病中处于较高水平，从而表明AT14-012可用于监测肿瘤进展。
实施例3-AT14-012的功能特性
材料和方法
肿瘤细胞系。将黑素瘤(MelBLM、MelWBO、Mel136.2)、结肠癌(CaCo2、Colo320、HT29、LSTR)、胰腺癌(PANC-1、CAPAN-2、MiaPACA、BxPC3)、食道癌(OE19、OE33)和急性骨髓性白血病(THP-1)细胞系维持在标准组织培养条件下。为了最小程度地破坏细胞表面蛋白，使用Accutase(Life Technologies)分离肿瘤细胞。
流式细胞术和抗体。制备分离的实体瘤细胞和原代成纤维细胞、非贴壁肿瘤细胞和其它原代细胞，用于在96孔板中在50.000个细胞下的流式细胞术分析。将细胞与针对CD4、CD8、CD9、CD19、CD41、CD62P、CD81的市售抗体(Biolegend)一起温育。在室内生成的AT10-002、抗CD30或AT14-012未标记、被生物素或Alexa 647标记。未标记的抗体和生物素标记抗体分别用抗IgG-PE(Southern Biotech)或抗链霉抗生物素蛋白PeCy7(BectonDickinson)进行二次染色。在一些实验中，包括帕尼单抗(抗EGFR1)作为阳性对照抗体。在FACS Canto和LSR Fortessa X20(Becton Dickinson)上分析样品。
血小板活化。将包含柠檬酸盐的血液收集管(Becton Dickinson)中的从健康志愿者收集的血液以800g旋转10分钟。收集上部富集血小板的血浆级分(PRP)并用于测试血小板活化。简而言之，将10μL PRP在室温下与10μg/mL抗体、Fab2-片段或阳性对照凝血酶受体激活肽(TRAMP)一起温育20分钟。使用直接缀合的抗体(Biolegend)通过流式细胞术(LSRFortessa X20，BD)分析样品的CD41和CD62P/P-选择素的表面表达。CD9HI9a表达对于未刺激的血小板进行测定。
血小板附聚。在包含柠檬酸盐的血液收集管(Becton Dickinson)中收集来自健康志愿者的血液。使与300μL测定缓冲液混合的300μL全血在37℃下温热2分钟。加入阳性对照肽或抗体(终浓度10μg/mL)，并使用Multiplate分析仪(Cobas/Roche)及时测量血小板附聚。
异种移植小鼠。利用高浓度基质胶(Corning)中的200.000-500.000荧光素酶/表达GFP的MelBLM细胞对免疫缺陷小鼠进行皮下移植。以10mg/kg小鼠静脉内给予AT14-012或AT10-002对照抗体。在肿瘤注射当天开始抗体治疗或使得肿瘤生长3周以分别确定原发性皮下肿瘤的生长或转移的生长。通过厚度或在注射荧光素(Promega)后使用光子成像仪(Biospace lab)进行荧光素酶成像来确定皮下肿瘤生长。在实验结束时通过眼睛和荧光素酶成像将转移的存在可视化。
最近建立的肿瘤细胞系
从黑素瘤患者通过外科手术切除的肿瘤组织块被消化并投入培养。生长的细胞保持在标准组织培养条件下。
从胰腺癌患者获得的肿瘤组织太小而不能直接建立细胞系并且首先在NSG小鼠的皮肤下移植。收获、消化生长的肿瘤并保持在标准组织培养条件下。通过基于EpCam表达的流式细胞术细胞分选来分离小鼠来源的人肿瘤细胞和肿瘤浸润性成纤维细胞。
结果
AT14-012具有广泛的肿瘤反应性。通过与黑素瘤细胞系MelBLM和MelWBO结合来鉴定AT14-012。稍后，发现AT14-012显示出对所有测试的黑素瘤细胞系的结合反应性(图6a和图7a)。相对大量的文献表明CD9在多种实体瘤细胞上广泛表达和上调。与此一致，发现AT14-012与一组结肠癌、食道癌和胰腺癌细胞系反应(图6a和图7b)。迄今为止发现的唯一不与AT14-012相互作用的实体瘤细胞系是CD9阴性Colo-320结肠癌细胞系(图7b)。但在较小程度上也发现CD9在造血细胞上表达。在图6b和图6c中，示出AT14-012能够与选定数量的急性骨髓性白血病和骨髓性白血病细胞反应(AT14-012看起来结合BL-007、BL-009、BL-037、BL-054和BL-058，然而其不结合BL-014、BL-030和BL-055)。总之，这指示与仅用于黑素瘤相比，AT14-012可用于更广泛的治疗应用。
AT14-012比原代细胞更强地结合肿瘤。目前在临床中使用的用于实体癌症治疗的治疗性抗体中均不识别仅在肿瘤上表达的抗原。然而，与健康细胞相比，当抗原在肿瘤细胞上表达更高时，这些抗体的治疗窗自己就出现。例如，曲妥单抗(赫赛汀)用于治疗过表达HER2的乳腺癌。与此类似，已知CD9经常对于各种实体癌症被上调。如果与健康细胞相比，AT14-012对肿瘤细胞反应更强，则AT14-012可用于与赫赛汀相似的治疗环境中。
实际上，发现AT14-012对黑素瘤细胞比对原发性黑素细胞反应更强(图7a；所有黑素瘤细胞系均被AT14-012结合，而原代成纤维细胞未被结合。原代黑素细胞被AT14-012结合，但程度低于大多数黑素瘤细胞系)。另外，AT14-012对结肠癌细胞比对原发性结肠上皮细胞的反应更强(图7b；AT14-012比原发性结肠上皮细胞(下图)更强地结合CaCo2(上图)。最后，发现AT14-012对黑素瘤MelBLM细胞比对原发性扁桃体T和B淋巴细胞的结合更强(图7c；中间和右侧列中的下图展示与AT14-012对总CD4T细胞、总CD8T细胞和总CD19B细胞的结合相比(中间和右侧列的上图)，AT14-012对MelBLM的结合更强。)这些数据指示AT14-012可用于目前用于实体肿瘤的抗体治疗的临床环境。
AT14-012结合并活化血小板但不诱导附聚。先前已公布CD9在血小板上高度表达，并且靶向CD9的抗体可诱导血小板活化和附聚，这潜在地导致用此类抗CD9抗体治疗的患者的血栓形成。尽管分离出AT14-012的黑素瘤患者不显示出任何血栓形成的迹象，但需要确保AT14-012不引起这种严重的副作用。
首先，测定AT14-012与血小板的结合。将来自健康志愿者的富含血小板的血浆(PRP)与抗CD9的市售抗体一起温育或用AT14-012染色。固定血小板以排除由于血小板自动活化而导致的CD9的细胞表面表达的任何差异。如文献所预期的，市售CD9HI9a抗体强烈结合血小板(图8a的下图)。与此一致，AT14-012也示出与血小板的强烈相互作用(图8a的上图)。
接着，评估了血小板是否会在与AT14-012相互作用时被活化。已知凝血酶受体激活肽(TRAP)和市售CD9抗体ALB6刺激血小板的活化，如通过P-选择素/CD62P的细胞表面上调可视化。与未刺激的条件和无关的ALB6同种型匹配的FLAG抗体相比，与TRAP或ALB6一起温育的来自健康志愿者的PRP确实示出CD62P的这种表面诱导(图8b)。另外，呈重组IgG1和IgG3形式的AT14-012以及从原始B细胞克隆体的上清液纯化的抗体能够活化血小板(图8b)。
最后，确定AT14-102是否诱导血小板的附聚。为此，在添加AT10-002和AT14-012抗体的Fab2片段的情况下，将全血与之前相同的刺激物一起温育。如预期的，TRAP肽和ALB6抗体诱导血小板的强附聚(图8c)。与市售CD9ALB6抗体相比，AT14-012不以任何不同形式(IgG1、IgG3、从B细胞上清液纯化的(2H15)或Fab2片段)引发血小板的附聚(图8c)。总之，这示出尽管AT14-012结合并活化血小板，但AT14-012与血小板的相互作用不引发血小板附聚。这些发现与AT14-012供体不显示任何血栓形成迹象的观察结果一致。因此，推断AT14-012可在临床上使用但不涉及作为严重副作用的血栓形成。
AT14-012损害原发性肿瘤和继发性肿瘤的生长。建立肿瘤异种移植小鼠模型以确定AT14-012在体内环境中的抗肿瘤作用。免疫缺陷小鼠是适用于肿瘤移植的模型。
小鼠在两侧腹接受基质胶中的500.000荧光素酶/表达GFP的MelBLM细胞的皮下移植。使肿瘤生长3周，然后小鼠接受10mg/mL AT14-012或对照抗流感抗体(AT10-002)的静脉注射，每周两次，持续一周或两周(取决于皮下肿瘤的大小)。在肿瘤细胞移植后4周或5周时，处死小鼠并暴露内部器官。在AT10-002治疗组的4只小鼠中的3只中，发现大的荧光素酶阳性淋巴结，这表明MelBLM肿瘤细胞能够在淋巴结中转移并发展为继发性肿瘤。形成鲜明对比的是，接受AT14-012抗体的五只小鼠均不示出任何淋巴结转移迹象(图9a)。这证明AT14-012能够抑制肿瘤转移。
在随访实验中，小鼠在两侧腹接受200.000MelBLM GFP/荧光素酶肿瘤细胞。此时，在肿瘤移植的同时开始抗体注射(每周两次并持续2周，10mg抗体/kg小鼠)。每周两次通过厚度测定皮下肿瘤的尺寸。如图9b所示，与对照处理的小鼠相比，AT14-012中肿瘤的生长减小。这示出AT14-012对肿瘤生长具有负面效应。
对于结合的AT14-012抗体的存在，通过免疫组织化学测试从AT14-012或AT10-002对照抗体处理的小鼠收获的MelBLM皮下肿瘤。将肿瘤组织包埋在石蜡中，此后将切片与分别识别AT10-002或AT14-012抗体的轻链的HRP标记的抗-λ或抗-κ一起温育。如所预期的，AT10-002抗流感对照抗体不结合肿瘤组织，然而AT14-012明显结合肿瘤组织的外层并示出渗透到更深的层(图9C)。测试从经AT14-012或AT10-002对照抗体处理的小鼠收获的MelBLM皮下肿瘤细胞的单细胞消化物对CD9抗体AT14-012和HI9a的结合。与来自经AT10-002处理的小鼠的肿瘤细胞相比，从经AT14-012处理的小鼠收获的肿瘤细胞示出AT14-012和CD9HI9a两者结合均降低(图9D)。观察到的效果不是由于AT14-012表位被注射的AT14-012抗体预先占据，因为来自两个处理组的肿瘤细胞用抗IgG抗体染色呈阴性(图9D)。
值得关注的是，在重复实验中，利用AT14-012也能够损害皮下生长的SK-MEL-5黑素瘤的肿瘤生长(图9E)。当测定肿瘤的重量时，对肿瘤生长抑制的影响更明显。经AT14-012处理的肿瘤明显具有比来自经AT10-002处理的小鼠的对应物低的重量(图9F)。值得注意的是，当在离体分离和消化的SK-MEL-5肿瘤中测定CD9表达水平时，证实了在经AT14-012处理的MelBLM肿瘤上观察到的肿瘤细胞上CD9水平的下降(图9G)。
AT14-012结合近期患者来源的黑素瘤和胰腺肿瘤细胞。AT14-012能够识别宽范围的构建的实体瘤细胞系(图6A)。接着测试AT14-012结合反应性是否也适用于近期从癌症患者分离的肿瘤样品。测试短期培养的患者来源的黑素瘤细胞对AT14-012的结合。在测试的所有原发性黑素瘤样品上观察到具有AT14-012的阳性信号(图10A-B)。观察到AT14-012结合和CD9表达的强相关性(图10B)。值得注意的是，推断出来源于AT14-012来源于其的黑素瘤患者的肿瘤细胞是该组中最高的AT14-012结合物。同样，使患者来源的胰腺癌肿瘤细胞经历CD9抗体的结合。与AT14-012对构建的胰腺癌细胞系的有效结合一致(图6A)，AT14-012显示出针对所测试的患者来源的胰腺癌细胞系的强反应性(图10C)。
AT14-012反应性限于灵长类动物。一般来说四跨膜蛋白并且具体地讲CD9在大量细胞和组织中广泛表达，并且已被建议通过亲缘关系较远的物种进化保守(Garcia-Espana，Genomics，2008)。测试小鼠、兔、食蟹猴和人的血小板对AT14-012的结合。可以预知，CD9在所有测试物种的血小板上表达。然而，AT14-012仅与食蟹猴和人的血小板反应，未观察到与小鼠和兔的结合(图11A-C)。这一起表明AT14-012反应性仅限于灵长类动物。
实施例4-补体和抗体依赖性细胞毒性
材料和方法
补体依赖性细胞毒性(CDC)测定
将悬浮液或贴壁黑素瘤细胞在室温下用抗体标记半小时。随后将细胞与兔补体(S7764，Sigma)在37℃下温育45分钟。通过DAPI和流式细胞术(Fortessa X20，BectonDickinson)或ToPRO3和显微镜(Operetta，Perkin Elmer)分别测定悬浮液和贴壁细胞的细胞死亡百分比。
抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定
将铬-51标记的靶细胞与10μg抗体在37℃下温育30分钟。以系列稀释度添加CD3贫化PBMC，然后温育另外4小时。使用Wallac计数器在LumaPlates(Perkin Elmer)中检测上清液中释放的铬-51的存在。针对自发释放铬-51校正抗体诱导的细胞裂解的标绘值。
结果
AT14-012引发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。为了确定AT14-012是否具有经由抗体依赖性细胞毒性(ADCC)杀死肿瘤细胞的能力，肿瘤细胞用放射性铬标记，并且随后与AT14-012、阴性对照AT10-002(抗流感病毒)或阳性对照(西妥昔单抗，抗EGFR1)抗体一起温育。PBMC效应子/黑素瘤靶细胞比率有所变化。通过从培养基中的死细胞释放铬来测定细胞死亡百分比。比西妥昔单抗更低效果的AT14-012能够经由ADCC杀死MelBLM，然而当原代人动脉内皮细胞(HAEC)用作靶细胞时观察到最少的细胞死亡(图12A)。平行测试原发性短期培养的患者来源的黑素瘤细胞通过AT14-012经由ADCC的细胞杀灭。尽管观察到不同黑素瘤细胞之间的一些变型，但AT14-012能够示出优于AT10-002对照抗体的ADCC活性(图12B)。总之，这表明AT14-012的抗肿瘤反应性至少部分地经由ADCC介导。
AT14-012引发补体依赖性细胞毒性(CDC)。测试AT14-012抗体的多种变体引发补体介导的细胞毒性(CDC)的能力。2H15是来源于原始AT14-012永生化IgG3B细胞克隆体的抗体。基于2H15的AT14-012重组抗体在IgG1或IgG3主链中产生。此外，构建了在Fc尾部中包含E345R突变的AT14-012IgG1抗体的变体。已示出该突变迫使特定抗体在其靶上六聚化，从而有效引发补体介导的细胞毒性(CDC)(de Jong，PLOS Biology，2016)。
在人血清存在下将悬浮液中的黑素瘤细胞系与不同AT14-012变体一起温育，随后测试细胞表面上C1q的存在。如所预期的，在AT14-012六聚化变体的情况下观察到C1q沉积。此外，发现与从原始B细胞克隆体纯化的2H15抗体和重组产生的AT14-012 IgG3的C1q沉积。值得注意的是，AT14-012工程化为IgG1不将C1q吸引到细胞[图13A、B]。在兔补体存在下，将悬浮液MelBLM或SK-MEL5与AT10-002对照抗流感抗体或AT14-012变体中任一种一起温育。AT14-012 IgG1抗体不诱导类似于抗流感阴性对照抗体的任何细胞毒性[图13C]。与已公布的观察结果[de Jong，PLOS Biology，2016]形成鲜明对比和与已公布的观察结果一致，诱导抗体中的E345R突变引起浓度依赖性的经由CDC的细胞死亡[图13C]。这些观察结果与悬浮液和贴壁黑素瘤细胞相当[图13C、D]。值得关注的是，作为IgG3产生的AT14-012重组体(因此不具有E345R突变)也能够触发CDC[图13D]。令人惊讶的是，产生2H15抗体的原始B细胞确实吸引C1q，但不诱导补体介导的细胞死亡[图13A、C]。AT14-012 E345R在兔补体存在下通过CDC有效杀死肿瘤细胞。虽然AT14-012 E345R能够将人C1q吸引至细胞表面[图13A、B]，但在人补体因子存在下，抗体不能触发CDC介导的细胞死亡[图13E]。研究了兔补体和人补体之间的细胞杀灭的差异是否与补体调节蛋白(CRP)的表达相关。完全缺乏CD55表达的Colo-205(C3转化酶形成的抑制剂)确实在人血清存在下允许抗体介导的CDC[图13E]。这表明当与CD55阻断抗体组合时，AT14-012可能能够诱导肿瘤细胞的补体依赖性细胞死亡。
实施例5-亲和力测量
材料和方法
与市售抗-CD9抗体相比，ELISA结合AT14-012
以ELISA形式测定AT14-012(IgG1)和对照人AT10-002抗体的结合以与市售抗体ALB6、HI9a和小鼠抗体对照抗-FLAG(用于检测所述板的CD9-3xFLAG-兔Fc-分选-生物素)和抗-CD3OKT3(单克隆抗体)进行比较。ELISA设置与上文所述相似，以测定CD9分子的生物素酰化量。以类似于AT14-012的系列稀释度添加市售abs。用山羊抗-小鼠HRP标记的抗体(1:4000，得自Jackson)检测市售abs，然而用山羊抗-人HRP标记的抗体(1:4000，得自Jackson)检测人abs。为了以更好的方式比较亲和力差异，将抗体施用于表面等离子体共振(SPR)测定中在CD9-3xFLAG-兔Fc-分选酶-生物素涂覆的SPR薄片上。使用GraphPad 7.0软件计算EC50值。
使用表面等离子体共振(SPR)的亲和力测量
用于结合抗-CD9抗体的薄片以与对于AIMMprove检测所述相似的方式制备(参见下文)。再次，AT14-012(+对照)亲和力在“经典”设置中测量，在每次抗体注射后使薄片再生。通过在薄片上用在结合缓冲液(PBS+0.05％Tween20+0.05％叠氮化钠+0.01％BSA)中稀释的重组抗体的系列稀释度进行注射，在IBIS MX96仪器上分析结合。在每次注射中，注射复合物并温育8分钟，然后用系统缓冲液(PBS+0.05％Tween20+0.05％叠氮化钠)彻底洗涤12分钟以测量解离。对于每种测试的抗体，重复注射至少三次，并且将利用空白结合缓冲液的注射用作参照。每次连续注射后，用10mM甘氨酸-HCl，pH 2.0+150mM NaCl使薄片再生。用SPRintX软件(IBIS Technologies)处理实验数据，并使用Scrubber2软件(BioLogic)测定动力学常数。
CD9-EC2-3xFLAG-兔-Fc-分选酶-HIS(+对照CD81-EC2-3xFLAG-兔-Fc-分选酶HIS) 的克隆、表达、纯化和分选酶位点特异性生物素酰化
调整Freestyle细胞(Thermo)并在37℃与8％CO2下在振荡器平台(140rpm)上，在125mL带通气盖的康宁瓶中在无血清Freestyle培养基(Gibco)中培养一周。瞬时转染使用pcDNA3.4载体进行，所述pcDNA3.4载体包含与3xFLAG标签(-DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-)融合在一起的细胞外大环2(氨基酸112-195；UniProt P21926)的CD9序列，并且随后使用兔IgG1蛋白(氨基酸108-322；UniProt P01870)的Fc区域(CH2-CH3)进行。CD9通过-GGGT-连接子与3xFLAG标签间隔开，3xFLAG通过-GSS-连接子与兔Fc间隔开。分选酶HIS标签(-LPETGGHHHHHHstop)通过-GGGS-连接子与Fc部分间隔开。使用NcoI和PmeI限制酶(NEB)将插入物克隆到pcDNA3.4载体中，并使用Qiagen质粒大量试剂盒分离大DNA制剂。将Optimem(Gibco)中的DNA(3μg的质粒)和6μL的ExtremeGene9(Sigma)溶液在100μL Optimem中分别温育10分钟。将100μL Optimem-ExtremeGene9溶液混合物加入100μL Optimem-DNA混合物中并且温育另外30分钟，然后逐滴添加至具有0.5×10^6个细胞/mL的3ml培养物中。两天后，对培养基给料另外2mL新鲜的Freestyle培养基。培养5-7天后收获培养基并放入-80℃冷冻机中用于进一步使用。如果需要更大的产量，则按比例放大培养条件。使用定量兔IgGELISA(Jackson)测量蛋白质产量。将培养基解冻并过滤，然后在AKTA Explorer系统(GE)上以1mL/min的流速施加到5mL蛋白G柱(GE Healthcare)上。所述柱用PBS预平衡，直至达到稳定的UV280/215nm基线。在施加样品后，再次用至少5倍柱体积的PBS洗涤柱，直至保持稳定的UV280/215nm基线。结合的蛋白质用0.2M甘氨酸+150mM NaCl pH 2.5洗脱。用1:10v/v 1MTris pH 9.0中和顶部蛋白质级分。将级分合并，并施加到用PBS平衡的Superdex 200 16/60柱(GE)上。收集单体峰并在nanodrop 1000系统上定量，所述系统具有对于该蛋白质的适当的消光/尺寸设置。将蛋白质等分以用于进一步使用，并在-20℃下储存以用于短期储存。分选酶A(参见Wagner等人，2014，用于制备)以1:1摩尔比与10倍摩尔比的GGG-生物素亲核试剂一起使用以将生物素部分酶促附接到分子，其中HIS标签通过酶促分选酶A反应除去。反应在25mM Tris，150mM NaCl pH 7.5和2mM CaCl2中于37℃下进行4小时，其中偶尔轻轻涡旋。反应由1mM EDTA停止。在PBS平衡的Superdex200 16/60柱上将生物素酰化的CD9蛋白与分选酶A和较小组分(游离的GGG-生物素亲核试剂和游离的HIS标签)分离。收集顶部级分。通过ELISA检查生物素酰化的量。简而言之，将5ug/mL链霉抗生物素蛋白在PBS中过夜涂覆到96孔高结合ELISA板(Costar)上。以10ug/mL的PBS+2.5％BSA中的起始浓度，以连续两步稀释将生物素酰化的CD9施加到孔中并持续一小时。AT14-012也以系列稀释度添加以获得网格，来检查PBST+2.5％BSA中一小时内的最佳信号。通过在PBST+2.5％BSA中温育山羊-抗-人HRP标记的抗体(1:4000稀释，来自Jackson)并使用TMB/H2O2酸性溶液显色来检测AT14-012。使用1M H2S04终止反应，并在Perkin Elmer Envision读板机上使用450nM进行测量。蛋白质充分生物素酰化，并且最佳浓度介于2.5ug/mL和5ug/mL之间。对于对照蛋白CD81-EC2-3xFLAG-兔-Fc-分选酶-HIS重复上述所有步骤，因为CD9的编码区被置换为CD81的EC2编码区(氨基酸113-201；UniProt P60033)。该蛋白质的完整性和生物素酰化使用抗-CD81抗体克隆体JS81(BD)通过ELISA检查，并用山羊-抗-小鼠HRP标记的抗体(Jackson)进行检测。
在ELISA中使用可溶性CD9-EC2-FLAG-兔-Fc蛋白的AT14-012的表位作图
将区域m4的丙氨酸突变体(氨基酸169-180)克隆到上述pcDNA3.4载体中。蛋白质以小规模(3mL)表达并使用兔IgG ELISA定量。为了检查AT14-012、ALB6和HI9a结合，以5μg/mL包被抗-FLAG抗体(Sigma)在PBS中过夜。在PBST+2.5％BSA中,以1ug/mL，使未纯化的无血清上清液经历对FLAG抗体的结合并持续1小时。在洗涤随机生物素酰化的H19a后，使ALB6和AT14-012经历与捕集的CD9-FLAG-兔-Fc-分选酶HIS分子的结合。用链霉抗生物素蛋白-HRP(1:10.000稀释，来自Thermo)检测结合的抗体。如前文所述开发ELISA。使用EZ-Link NHS-生物素试剂盒(Thermo)进行抗体的随机生物素酰化。通过在室温下温育10倍摩尔比的生物素标记30分钟，对PBS中的纯化抗体进行处理。通过尺寸排阻法终止反应。通过在PBS预平衡的Superdex 200 16/60柱上施加样品(1mL，以1mg/mL)，将生物素酰化的抗体与游离标记物分离。
构建m4环状肽。
CD9(167-PKKDVLETFTVKS-180)的m4区域由肽合成实验室合成制备，通过LCMS分析并使用乙腈梯度通过RP-HPLC纯化。将肽冻干直至完成。该肽侧接两个附加丝氨酸，以模拟半胱氨酸结产生的空间(参见CD81的晶体结构)，然后侧接两个半胱氨酸，其使肽呈环状。为了检测或捕获目的，将生物素部分置于N末端，其由单个PEG2基团生物素-PEG(2)-CSPKKDVLETFTVKSSC(连接半胱氨酸)间隔开。
结果
AT14-012为中等亲和力抗体。首先，引入AT14-012的重链(4个氨基酸置换)和轻链(3个氨基酸置换)的超突变的量可能指示患者中的免疫系统未受到充分挑战，以为可变结构域序列带来附加的超突变。其次，可示出AT14-012不诱导血小板附聚，然而由其他人先前开发的市售抗体确实诱导血小板附聚。另外，患者未形成任何血栓形成或血小板减少症状(由于抗体介导的血小板破坏或附聚导致的低血小板计数)，并且不用任何可解决该未确诊问题的药物进行治疗。主要问题是AT14-012的较低亲和力是否有利于导致最佳血小板表型的抗-CD9抗体“类型”的特性，或由AT14-012靶向的CD9(m4)上的独特表位的使用是否导致最佳非附聚的血小板状态。使用重组表达的第二细胞外环CD9(EC2)在ELISA装置中测试AT14-012的结合，以检查利用常用市售鼠抗-CD9抗体的结合亲和力的差异。之前(图5)确定所有测试的抗-CD9抗体的表位位于EC2环中。尽管人和小鼠(市售)的抗体之间的两种ELISA设置不同(用不同的二抗检测)，但可估计与市售HI9a(EC50～20ng/mL)和ALB6(EC50～13ng/mL)相比，AT14-012的EC50显著更低(EC50～250ng/mL)。为了更好地估计与商业抗体相比，AT14-012的亲和力，采用无标记检测设置，其使用表面等离子体共振(SPR)。在CD9分层SPR薄片上采用三次独立注射。AT14-012在该设置中的平均亲和力在nM范围内(～44nM)，并且市售抗体对于ALB6为～145pM，且HI9a为～2.33pM(图16)。测得的AT14-012的解离速率为HI9a的700倍，这意指AT14-012能够非常容易地与CD9脱离。由于其低解离速率(kd)，HI9a为～19,000更高的亲和力。未检查HI9a或ALB6的较长解离时间，因为AT14-012的结果是显而易见的。结合之后ALB6仍然能够以缓慢的方式解离(与HI9a相比，～22更高的解离)并且当与HI9a相比时，有助于一定程度地较低但仍然非常高的亲和力。
使用重组表达的CD9-EC2m4丙氨酸突变体对AT14-012的表位确认。通过将随机生物素酰化的抗-CD9抗体温育到FLAG标签捕获的CD9-EC2-3xFLAG-兔Fc蛋白上使用ELISA设置来进一步详细研究表位。如材料和方法中所述，克隆并表达丙氨酸突变体(图5中所述的氨基酸K169A至S180A)。当在位置K169A、D171A、L173A、F176A处形成丙氨酸突变体时，AT14-012的结合完全丧失，并且可观察到V172A的显著减少的结合(图17A)，这与先前的FACS数据一致(图5)。如先前所观察的，ALB6示出与F176A突变体的减少的结合。HI9a不丧失对任何突变体的任何反应性，并且是ELISA板上CD9蛋白存在的内部对照。因此，可推断，HI9a的表位不存在于m3或m4中，或者引入这些区域的单个丙氨酸突变不消除结合，因为在该SPR设置中HI9a的亲和力具有显着高的值。表位关于CD9的构建的同源性作图(由红色突出显示)(图17B)，并且位于蛋白质的细胞外部分的边缘。FAC上m3的丙氨酸扫描未显示与AT14-012结合的任何丧失，并且在ELISA或SPR中可能不示出与环状构建的m4肽的任何结合(数据未示出)。因此，假设m4区域的正确折叠受到其它CD9区域(m3和m5)的强烈影响，所述其它CD9区域导致AT14-012构象线性表位。需要共晶来进一步详细地确认表位作图数据，并检查每个单一氨基酸对CD9表位以及AT14-012互补位的贡献。使用AT14-012对各种物种如食蟹猴、小鼠和兔细胞的结合进一步确认了表位作图数据(图11)。AT14-012能够与食蟹猴细胞反应，然而当测定与兔或小鼠细胞的结合时，结合丧失。有助于AT14-012表位的5个残基在图17C中进行比对(以深色/红色突出显示)。显然，当观察到兔和小鼠CD9m4序列的太多残基变化时，AT14-012结合丧失。可推测，区域m4中的兔突变(V172I、T175S、F176I和T177Q)和小鼠突变(D172Q、V172L、T175S和T177Q)导致AT14-012表位的主要构象变化或移位，这可解释AT14-012结合的丧失。要注意的是，单独的F176L突变不导致AT14-012对食蟹猴细胞的结合丧失(图17C)。
实施例6-亲和力改善的AT14-012
材料和方法
使用单细胞分选的2H15B细胞和SPR的亲和力改善的AT14-012
AT14-012的最初鉴定的B细胞克隆体(2H15；IgG3)使用BD FACs ARIA III在～20x384孔板中，在适当培养条件下进行单细胞分选。经由Operetta共聚焦机(Perking Elmer)观察bcl6/Bcl-xL转导的GFP阳性细胞来监控B细胞外生长(～70％)。将具有阳性信号的孔转移至新鲜的96孔板(总共8个板)中并培养至多1-2周，然后在96孔PCR板中收获上清液(100uL)并用PBS+0.05％Tween20+0.05％叠氮化钠以1:1稀释，并在-80℃冷冻机中密封冷冻直至进一步使用。两个孔属于原始2H15克隆体的对照上清液和抗-HRV克隆体的对照IgG3B细胞上清液，其不与CD9或CD81结合。SPR在IBIS Mx96仪器(IBIS Technologies)上进行。使用CFM微流体点样装置(Wasatch Microfluidics)将蛋白质固定在预涂有链霉抗生物素蛋白(G-STREP H825-065(Sens Technologies)的SPR薄片上。将生物素酰化的抗-人CH1纳米抗体(Thermo)和生物素酰化的全长抗-人Fc抗体(Jackson)以各种浓度点样用于定量(检查IgG浓度)以及定性测量(IgG完整性)。CD9-和CD81-3xFLAG-兔Fc-分选酶-生物素也以各种浓度点样以检测与系列稀释度的重组AT14-012(IgG1)抗体相比的CD9结合。检查所有点样的结合，使得可将相似量的点样的CD9和CD81进行比较。使用前面描述的IBIS表面等离子体共振成像仪监测IgG的结合，并且在每次连续注射后，用10mM甘氨酸-HCl pH2.0+150mMNaCl使薄片再生。每个板的注射总量详细如下：(1)利用PBST两次注射以增强基线，与(2)利用抗-兔进行一次注射以检查CD9和CD81是否仍然在薄片上并且不由于广泛剥离而随时间推移/使用降解，与(3)利用PBST进行一个注射(4)系列稀释度的重组AT14-012IgG1以测量IgG浓度的RU以及CD9结合(CD81作为对照结合)-1.33-4.0-13.30-40.0-133.0nM的蛋白质，(5)两行B细胞sups(A1至A12和B1至B12)，(6)重组AT14-012IgG1的一次注射，(7)两行B细胞sups(C1至C12和D1至D12)，(8)重组AT14-012IgG1的一次注射，(9)利用PBST的一个注射，(10)两行B细胞sups(E1至E12和F1至F12)，(11)重组AT14-012IgG1的一次注射，(12)取决于板，牺牲孔以包括对照B细胞sup(IgG3HRV克隆板1＝G1，板2＝G2等)，(13)一行B细胞sups(GX？至GX？，取决于板是哪个编号)，(14)取决于板，牺牲孔以包括对照B细胞B细胞sup(2H15；IgG3原始克隆体，板1＝G1，板2＝G2等)，(15)一行B细胞sups(HX？至HX？，取决于板是哪个编号)，(16)重组AT14-012IgG1的一次注射，(17)系列稀释度的重组AT14-012IgG1以测量IgG浓度的RU以及结合CD81的CD9作为对照结合)-1.33-4.0-13.30-40.0-133.0nM的蛋白质以检查在运行开始时和之后的RU差异，(18)利用抗-兔的一次注射以检查CD9和CD81是否仍在薄片上并且不由于剥离而随时间推移/使用降解，(19)利用PBST的一次最终注射。总计具有117次注射和对照检查(PBST和重组AT14-012IgG1)，其中缔合时间为8分钟，并且解离时间为8分钟，这导致每个板的总运行时间为～50小时。使用SPRintX软件(IBIS Technologies)处理数据。B细胞亚克隆RNA分离、cDNA扩增和测序如前所述执行(Kwakkenbos等人，2010)。
AT14-012高亲和力突变体的表达和分析
将CHO1-KSV细胞系在CD CHO培养基中培养一周，并且每2至3天更新一次。用指定的单突变体(H40Y、Y112F、D116H和T29N)，组合双突变体(H40Y/Y112F和D116H/T29N)和包括WT AT14-012在内组合的四重突变体(H40Y/Y112F/D116H/T29N)，和不示出CD9结合的对照突变体(G110D)瞬时表达细胞(改编自Rajendra等人，2015)。简而言之，将4.0×10^6个细胞/mL(10mL)置于补充有0.25％DMA(Sigma)的CD CHO培养基中。向培养物中加入3.2ug/mLDNA(表达重链和轻链的pXC39载体)，随后加入PEImax(Sigma)。两天后，加入10mL新鲜培养基的进料。7天后收获培养基，并且使用IgG定量ELISA(Jackson)将IgG表达量化。在FACS中并且以用于AIMMprove方法的使用相同SPR薄片设置的类似方式来测试细胞培养物上清液对MelWBO培养细胞的结合(参见其它地方)。使用Seaview软件进行比对(Gouy等人，2010)。
结果
使用SPR开发高亲和力AT14-012变体。如前所述，开发AT14-012抗体的主要问题可能是更高亲和力的变体(如与ALB6相当的亲和力)是否可导致血小板附聚。另选地，AT14-012是否靶向此类独特表位，其中亲和力将不产生任何差异？活化诱导的胞苷脱氨酶(其也被称为AID)仍然在永生化B细胞库中表达并具有活性。AID的表达不导致遗传不稳定性，所述遗传不稳定性导致生长停滞和细胞死亡，因为63％的接种的孔示出稳健的扩增(Kwakkenbos等人，2010)。因此，AID仍然能够随机诱导突变，或优选地在突变热点处诱导突变。鉴定导致更高亲和力抗体/抗原结合的突变的一种方法可以是分选可结合荧光标记的可溶性CD9蛋白的单一B细胞，并将其与IgG表达进行比较。简而言之，不能发现任何设置以使呈单一的四聚体形式(使用链霉抗生物素蛋白-PE)或多聚化形式(使用PE标记的葡聚糖)的可溶性CD9结合2H15B细胞(数据未示出)。这可能是由于2H15B细胞受体与B细胞本身的表面上表达的CD9的顺式结合。因此，使用类似设置以对原始2H15B细胞进行单细胞分选，但现在在SPR中测试所产生的IgG与重组CD9-EC2蛋白的结合(与用于AT14-012亲和力测定类似的CD9蛋白)。2H15单一B细胞能够产生足够量的待测试的IgG，尤其是在突变诱导增加结合时。最初，使用上清液中的大量2H15培养的IgG来检查最佳SPR设置，并将其与作为对照的浓度逐渐增加的重组AT14-012进行比较(图18A)。在验证2H15IgG的正确缔合和解离阶段后，采用以下设置，其中观察到的B细胞上清液中的IgG的浓度和完整性可能与在适当测定的IgG浓度下重组纯化的AT14-012的结合相关(参见图18A)。与对抗-人Fc和抗-CH1的结合相关的比率示出浓度与稳定产生抗体之间的良好相关性。抗-人Fc的SPR曲线以线性方式增加，而抗-CH1的SPR曲线以指数方式增加。在检查8个96孔板(～800个克隆体)和～400小时的SPR运行时间(未示出原始数据)后，能够鉴定具有增强或改变的结合模式的13个克隆体。将这些克隆体置于培养物中并在新生成的SPR薄片上再次进行检查(图18B)。在最初的13个克隆体中，仅8个克隆体仍然示出显著增强的结合。指定了3个不同的组，其中组1示出较快的缔合和较慢的解离(克隆体1D5、1F5、4H10、10B9和10D1)。组2克隆体示出较快的缔合但还示出较快的解离(克隆体2D12、4D4、6E10和9E5)并且组3不示出任何差异(克隆体1C9、2H10、9A9和9D12)。还对两种不同黑素瘤细胞系的高亲和力克隆体的增强的结合进行了检查和检测(数据未示出)。同样，组1克隆体示出FAC上的最佳细胞群体迁移。克隆体的重链中的一个单一突变归因于SPR中和细胞上的增强的结合模式(参见图18C)。令人惊讶地是，一个克隆体4D4是唯一具有轻链突变且没有重链突变的克隆体。还检查了多个克隆体，其确实示出IgG表达但没有CD9结合(被称为“disPROVE”，克隆体1E3、1E4、1E5、1F12、2A3和5B1)。并且，包括一些克隆体(1G2、1G3、1G4和1G5)，其在所有800个分析的克隆体中示出共有结合模式。已确定，这些克隆体是大多数种系(图18C)。最重要的突变是H40Y(4x)和Y112F(1x)(组1)和D116H(2x)和T29N(1x)(组2)。由于其它克隆体在重链中具有相同的突变并且还具有相等的CD9亲和力，因此省略了位于轻链中的L120V突变(克隆体4H10)以及S28N(克隆体9E5)两者。
在重组AT14-012背景中检查高亲和力突变体及其组合。高亲和力突变体在CHO细胞中瞬时表达为单、双或四重变体(参见图19A)用于定位和比对。采用导致缺乏CD9结合的WT AT14-012和突变体G110D作为对照。测定抗体的完整性并在SDS-page和蛋白质印迹上分解产物。当用兔抗-人IgG重/轻链抗体检测抗体时，未检测到明显的异常(数据未示出)。以系列稀释度将制备上清液用于黑素瘤细胞上以检查CD9细胞表面结合(图19B)。导致CD9结合缺失的G110D突变体真正干扰了与CD9的结合。如对B细胞上清液筛选所观察到的，T29N对改善的结合不具有主要影响。D116H确实示出预期的改善的结合。与单一D116H结合相比，这两个组2突变的组合不属于甚至更高的信号。同样，这个结果解释了T29N突变在重组形式中缺乏影响。幸运的是，在H40Y的情况下组1突变的结合显著更好地增加，对所有单一突变具有最大影响。至于双重组1突变体(H40Y/Y112F)，效果甚至变得更加增强。四重变体未显示出超过双重组1突变体的任何有益效果。与对于WT AT14-012(图7A)观察到的结合模式一致，与短期培养的健康黑素细胞相比，高亲和力变体也示出与黑素瘤细胞的增强的结合(图19C)。使用CD9SPR设置实现精确的结合特征图(图19D)。对较高结合的贡献通过对缔合和解离常数的概述很好地解释(图19E)。除T29N外，所有单一突变体均有助于增强的结合亲和力。H40Y突变体显示100倍增强，Y112F示出50倍增强，并且D116H示出10倍增强。与WT AT14-012(～220pM)相比，组合的组1突变体有助于250倍更高亲和力。令人惊讶的是，与组1双突变体相比，四重突变体高少于两倍(～455pM)。这导致具有与ALB6相当的亲和力范围的抗体。已知该小鼠抗-CD9抗体诱导血小板附聚，并用作血小板附聚测定中的阳性对照。现在，具有相当的结合亲和力来回答血小板附聚是亲和力相关还是表位相关的问题。
亲和力改善的AT14-012突变体不使血小板附聚。与文献一致，观察到可商购获得的抗CD9抗体ALB6抗体诱导血小板的附聚。形成鲜明对比的是，全血与抗CD9抗体AT14-012的温育不导致血小板附聚。重要的是，当在血小板附聚测定中测试高亲和力突变体时，AT14-012亲和力改善的变体均不能诱导血小板的附聚(图20)。在测定中包括ALB6抗体作为血小板附聚的阳性对照。双重组1突变体的亲和力与ALB6抗体的亲和力大致相同(图16C)。这指示AT14-012的亲和力与不存在血小板附聚无关，相反关键特征是识别CD9上的独特表位。
实施例7-IgG同种型和同种异型
材料和方法
从患者来源的肿瘤材料和癌细胞系对CD9开放阅读框测序
简而言之，使用Trizol试剂分离mRNA，并且使用随机引物进行cDNA扩增。使用Huang等人，1998中描述的CD9特异性引物通过PCR扩增CD9。由两个短期培养的原发性肿瘤材料源(AT14-012来源的)的冷冻细胞沉淀物分析CD9序列，所述源被命名为来自皮肤病变的Mel05.18和来自脑病变的Mel06.07。采用来自其它黑素瘤患者的两种其它的短期培养的原发性肿瘤材料(两者均为AT14-012结合阳性的)作为对照。此外，使用黑素瘤细胞系MelBLM、MelWBO、A375和Jurkat T细胞系(对于CD9结合呈阴性)以及AML细胞系HL-60以检查CD9序列。还分析了B细胞克隆体2H15和IgG3抗-HRV B细胞克隆体。对于PCR产物自身进行测序(CD9-fw 5’-TGCATCTGTATCCAGCGCCA-3’和CD9-rev 5’-CTCAGGGATGTAAGCTGACT-3’)。
IgG3 2H15同种异型的测序
通过使用Trizol方法(Kwakkenbos等人，2010)分离RNA来确定2H15B细胞克隆体的IgG3恒定区。使用随机引物制备cDNA。使用CH1正向引物(5’-CACCAAGGGCCCATCGGTCTTC-3’)和CH3反向引物(5’-TCATTACCCGGAGACAGG-3’)进行PCR反应。基于见于IMGT网站的人IgG3序列构建引物
(http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/alleles/index.php？ species＝Ho mo％20sapiens&group＝IGHC&gene＝IGHG3)。根据Vidarsson等人，2014，对PCR产物自身(正向和反向)进行测序，以确定同种异型。
对来自患者B细胞库的AT14-012IgG特异性重链和轻链进行测序
AT14-012的可变重链和轻链分别由cDNA扩增，所述cDNA由B细胞筛选时患者的总B细胞库的经分离RNA库构建。通过Trizol方法分离RNA，并如前所述制备cDNA(Kwakkenbos等人，2010)。首先，为了扩增重链，使用两种VH3家族特异性正向引物VH3-9L(5’-CCATGGAGTTGGGACTGAGC-3’)和VH3LB(5’-CACCATGGARYTKKGRCTBHGC-3’)的混合物以及IgG特异性反向引物OCG1(5’-GTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCTT-3’、OCG2(5’-CTGCTGAGGGAGTAGAGTCC-3’)和OCG3(5’-GGTGTGCACGCCGCTGGTCAG-3’)进行预扩增步骤。通过Qiagen凝胶提取试剂盒从DNA凝胶中收获PCR产物。进行二次扩增步骤以扩增AT14-012特异性序列。四种不同PCR反应使用一个AT14-012特异性重链正向引物(5’-gtgtccagtgtgaagtgcagg-3’)和以分步方式识别重排的HCDR3区域以覆盖最宽的VDJ重排序列的4个不同反向引物AT14-012Hrev A(5’-GGGATAATAACCACTCACGGC-3’)、AT14-012Hrev B(5’-GTAGGGATAATAACCACTCAC-3’)、AT14-012Hrev C(5’-GTCAAAGTAGGGATAATAAC-3’)和AT14-012Hrev D(5’-CCAGTAGTCAAAGTAGGG-3’)来进行。由此，未对框架4进行测序。将来自A、B、C和D PCR的最终PCR产物全部合并，并将一种单一DNA混合物连接到pCR2.1TA克隆载体(Thermo)中。由于HCDR3区域上的逐步退火，不需要单独对所有反向反应进行分析。由此，可通过测序鉴定哪种产物被哪种反向引物扩增。使用通用M13反向引物和M13正向引物对插入物进行测序。为扩增AT14-012轻链，执行类似的方案。用于扩增VK4家族步骤的正向引物为VK4L-Fw-前导-ATG:5’-ACCATGGTGTTGCAGACCCAG-3和VK4L 5’-TYYCTSYTSCTYTGGATCTCTG-3’以及反向引物OCK 5’-ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT-3’。对于第二AT14-012特异性扩增步骤，正向引物为Fw1-1412L 5’-CAGTCTCCAGACTCCCTGT-3’，然而三个LCDR3特异性反向引物为AT14-012Lrev A(5’-GGCCGAAGGTGGAAGGAGTAG-3’)AT14-012Lrev B(5’-GTCCCTTGGCCGAAGGTGGAAG-3’)和AT14-012rev C(5’-TGTCCCTTGGCCGAAGGTGG-3’)。同样，轻链的框架4不通过该PCR方法解构。
结果
AT14-012识别非突变的CD9。为了确认被AT14-012识别的CD9上的表位是非突变的，对一组不同的细胞类型进行序列分析。对包括来源于原始患者的黑素瘤细胞以及AT14-012/2H15原始B细胞的肿瘤细胞进行RT-PCR。测试的细胞均未示出AT14-012表位中的突变，这确认了AT14-012识别CD9上的野生型序列。另外，这些数据示出在Bcl6/xL永生化B细胞上表达的相应CD9结构域是野生型序列。
B细胞来源的2H15/AT14-012抗体具有同种异型IGHG3*16。原始患者来源的AT14-012/2H15 B细胞具有IgG3同种型。为确定产生的抗体的同种异型，分离B细胞的mRNA，并使用对Fc区域具有特异性的引物进行RT-PCR。获得的序列与公布的数据(Vidarsson等人，2014)一起显示出AT14-012患者来源的B细胞克隆体具有同种异型IGHG3*16(图21)。该IgG3同种异型对抗体(为并且应当为AT14-012)的影响目前未知。未公布的工作示出在效应子功能测定诸如CDC中所有同种异型的平行比较。
AT14-012重链序列和轻链序列能够从总B细胞库中检索。
本文的目的是研究AT14-012序列是否存在于患者的总B细胞库中。使用PCR方法对可变重链(VH3)和轻链(VK4)IgG家族施用预扩增步骤，成功获得了适当的AT14-012序列，其具有在二次AT14-012特异性PCR期间引入的超突变(参见材料和方法)。由于该方法的限制性，两种链的框架区域4不能被解构。在重链中没有发现明显的附加或更小的超突变(数据未示出)，但在轻链的位置T109(IMGT编号)处发现，发现不是所有序列均具有引入的超突变。原始种系序列包含丝氨酸，并且这种超突变在其特性方面相当保守，并且不应当对整体结构或CD9结合具有重大影响(未测试)。
实施例8-与抗-PD1抗体组合
材料和方法
人免疫系统小鼠的产生(van Lent，Methods Mol Biol，2010)
对经亚致死照射的(350cGy)新生(<1周龄)NSG小鼠进行肝内注射人CD34+CD38-造血祖细胞。确定良好重建并产生人免疫细胞的小鼠适用于异种移植实验。
结果
通过AT14-012与抗PD1组合对体内黑素瘤生长的强抑制。阻断PD1-PDL1-轴的抗体，具体地讲阻断结合PD1的那些，现在被广泛用于治疗各种各样的晚期癌症患者。反应率根据癌症类型而不同，一般来讲仅小部分患者对治疗反应良好。正在进行许多临床试验以测试抗PD1抗体与新型化合物和已注册化合物的组合。在人免疫系统(HIS)小鼠模型中，测试在纳武单抗(Opdivo，Bristol-Myers Squibb)存在下，AT14-012在根除肿瘤细胞方面的功效。通过将人造血干细胞移植到NSG小鼠中生成HIS小鼠(van Lent，Methods Mol Biol，2010)。免疫系统形成之后，如通过在循环中存在人免疫所表征的，小鼠接受过表达黑素瘤细胞的荧光素酶的皮下移植。在开始治疗之前，使肿瘤生长4周至尺寸为约100mm3。将小鼠随机分配到4个不同的治疗组，每周两次接受腹膜内抗体注射。
AT10-002(15mg/kg)+PBSAT10-002(15mg/kg)+纳武单抗(2.5mg/kg)
AT14-012(15mg/kg)+PBSAT14-012(15mg/kg)+纳武单抗(2.5mg/kg)
如通过荧光素酶成像所测定的，与AT10-002(抗流感)组中的小鼠相比，仅接受AT14-012抗体的小鼠显示出延缓的肿瘤生长(图22A、B)。有趣的是，当AT14-012与抗PD1抗体联合施用时，与其它抗体方案相比，肿瘤生长的抑制极大地增强。计算处死当天的肿瘤尺寸相对于治疗开始时的尺寸，从而显示出AT14-012+纳武单抗的组合使肿瘤的尺寸减少了近70％(图22B)。这些数据清楚地示出，将AT14-012抗-CD9抗体与刺激T细胞的抗体组合在根除肿瘤细胞方面具有很大潜力。
表1：抗体AT14-012
Figure BDA0001756397130000791
Figure BDA0001756397130000801
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<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR3
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(33)
<400> 5
gcc gtg agt ggt tat tat ccc tac ttt gac tac 33
Ala Val Ser Gly Tyr Tyr Pro Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 6
Ala Val Ser Gly Tyr Tyr Pro Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 7
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR1
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(51)
<400> 7
aag tcc agc cag agt gtt tta tac agc tcc aac aat aag aac tac tta 48
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
ggt 51
Gly
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 8
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR2
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(21)
<400> 9
tgg gca tct acc cgg gaa tcc 21
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 10
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR3
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(21)
<400> 11
cag caa tat tat act act cct 21
Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro
1 5
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 12
Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro
1 5
<210> 13
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AT14-012 重链
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(90)
<223> FW1
<220>
<221> misc_feature
<222> (106)..(147)
<223> FW2
<220>
<221> misc_feature
<222> (198)..(294)
<223> FW3
<220>
<221> misc_feature
<222> (328)..(360)
<223> FW4
<400> 13
gaa gtg cag gtg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggc agg 48
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttt gat gat tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
gcc atg cac tgg gtc cgg caa gct cca ggg aag ggc ctg gag tgg gtc 144
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
tca ggt att agt tgg aat agt ggt agc ata gtc tat gcg gac tct gtg 192
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tcc ctg tat 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
ctg caa ctg aac agt ctg aga gct gag gac acg gcc ttc tat tac tgt 288
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
gca aaa gcc gtg agt ggt tat tat ccc tac ttt gac tac tgg ggc cag 336
Ala Lys Ala Val Ser Gly Tyr Tyr Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
gga att ttg gtc acc gtc tcc tca 360
Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 14
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Val Ser Gly Tyr Tyr Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AT14-012 轻链
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(69)
<223> FW1
<220>
<221> misc_feature
<222> (120)..(165)
<223> FW2
<220>
<221> misc_feature
<222> (186)..(282)
<223> FW3
<220>
<221> misc_feature
<222> (304)..(339)
<223> FW4
<400> 15
gac atc gtg atg acc cag tct cca gac tcc ctg tct gtg tct ctg ggc 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
gag agg gcc acc atc aac tgc aag tcc agc cag agt gtt tta tac agc 96
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
tcc aac aat aag aac tac tta ggt tgg tac cag cag aaa cca gga cag 144
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
cct cct aag ctg ctc att tac tgg gca tct acc cgg gaa tcc ggg gtc 192
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
cct gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc act ctc acc 240
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
atc agc agc ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tat tac tgt cag caa 288
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
tat tat act act cct tcc acc ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att 336
Tyr Tyr Thr Thr Pro Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile
100 105 110
aaa 339
Lys
<210> 16
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Thr Thr Pro Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb7的靶
<400> 17
Pro Lys Lys Asp Val
1 5
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ES5.2D8的靶
<400> 18
Gly Leu Trp Leu Arg Phe Asp
1 5
<210> 19
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
Met Pro Val Lys Gly Gly Thr Lys Cys Ile Lys Tyr Leu Leu Phe Gly
1 5 10 15
Phe Asn Phe Ile Phe Trp Leu Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile Gly
20 25 30
Leu Trp Leu Arg Phe Asp Ser Gln Thr Lys Ser Ile Phe Glu Gln Glu
35 40 45
Thr Asn Asn Asn Asn Ser Ser Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Ile Leu Ile
50 55 60
Gly Ala Gly Ala Leu Met Met Leu Val Gly Phe Leu Gly Cys Cys Gly
65 70 75 80
Ala Val Gln Glu Ser Gln Cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe Leu
85 90 95
Leu Val Ile Phe Ala Ile Glu Ile Ala Ala Ala Ile Trp Gly Tyr Ser
100 105 110
His Lys Asp Glu Val Ile Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp Thr
115 120 125
Tyr Asn Lys Leu Lys Thr Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu Lys
130 135 140
Ala Ile His Tyr Ala Leu Asn Cys Cys Gly Leu Ala Gly Gly Val Glu
145 150 155 160
Gln Phe Ile Ser Asp Ile Cys Pro Lys Lys Asp Val Leu Glu Thr Phe
165 170 175
Thr Val Lys Ser Cys Pro Asp Ala Ile Lys Glu Val Phe Asp Asn Lys
180 185 190
Phe His Ile Ile Gly Ala Val Gly Ile Gly Ile Ala Val Val Met Ile
195 200 205
Phe Gly Met Ile Phe Ser Met Ile Leu Cys Cys Ala Ile Arg Arg Asn
210 215 220
Arg Glu Met Val
225
<210> 20
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3x FLAG-标签
<400> 20
Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr
1 5 10 15
Lys Asp Asp Asp Asp Lys
20
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体 CDR1 重链
<400> 21
Asp Tyr Ala Met Tyr
1 5
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体 CDR3 重链
<400> 22
Ala Val Ser Gly Tyr Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体 CDR3 重链
<400> 23
Ala Val Ser Gly Tyr Tyr Pro Tyr Phe His Tyr
1 5 10
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体 CDR3 重链
<400> 24
Ala Val Ser Gly Tyr Phe Pro Tyr Phe His Tyr
1 5 10
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体 CDR2 轻链
<400> 25
Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser
1 5
<210> 26
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体 重链
<400> 26
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Val Ser Gly Tyr Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体 重链
<400> 27
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Val Ser Gly Tyr Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体 重链
<400> 28
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Val Ser Gly Tyr Phe Pro Tyr Phe His Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 29
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体 重链
<400> 29
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Val Ser Gly Tyr Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体 重链
<400> 30
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Val Ser Gly Tyr Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体 重链
<400> 31
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Val Ser Gly Tyr Phe Pro Tyr Phe His Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体 轻链
<400> 32
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Thr Thr Pro Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 33
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3X FLAG 标签
<400> 33
Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr
1 5 10 15
Lys Asp Asp Asp Asp Lys
20
<210> 34
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分选酶HIS 标签
<400> 34
Leu Pro Glu Thr Gly Gly His His His His His His
1 5 10
<210> 35
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD9的m4 区域
<400> 35
Pro Lys Lys Asp Val Leu Glu Thr Phe Thr Val Lys Ser
1 5 10
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 生物素部分
<220>
<221> DISULFID
<222> (1)..(17)
<400> 36
Cys Ser Pro Lys Lys Asp Val Leu Glu Thr Phe Thr Val Lys Ser Ser
1 5 10 15
Cys
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 37
tgcatctgta tccagcgcca 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 38
ctcagggatg taagctgact 20
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 39
caccaagggc ccatcggtct tc 22
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 40
tcattacccg gagacagg 18
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 41
ccatggagtt gggactgagc 20
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 42
caccatggar ytkkgrctbh gc 22
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 43
gtccaccttg gtgttgctgg gctt 24
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 44
ctgctgaggg agtagagtcc 20
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 45
ggtgtgcacg ccgctggtca g 21
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 46
gtgtccagtg tgaagtgcag g 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 47
gggataataa ccactcacgg c 21
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 48
gtagggataa taaccactca c 21
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 49
gtcaaagtag ggataataac 20
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 50
ccagtagtca aagtaggg 18
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 51
accatggtgt tgcagaccca g 21
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 52
tyyctsytsc tytggatctc tg 22
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 53
acactctccc ctgttgaagc tctt 24
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 54
cagtctccag actccctgt 19
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 55
ggccgaaggt ggaaggagta g 21
<210> 56
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 56
gtcccttggc cgaaggtgga ag 22
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 57
tgtcccttgg ccgaaggtgg 20
<210> 58
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AT14-012 FW1 重链
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(90)
<400> 58
gaa gtg cag gtg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggc agg 48
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttt gat 90
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp
20 25 30
<210> 59
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 59
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp
20 25 30
<210> 60
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AT14-012 FW2 重链
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(42)
<400> 60
tgg gtc cgg caa gct cca ggg aag ggc ctg gag tgg gtc tca 42
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10
<210> 61
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 61
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10
<210> 62
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AT14-012 FW3 重链
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(96)
<400> 62
cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tcc ctg tat ctg caa 48
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
ctg aac agt ctg aga gct gag gac acg gcc ttc tat tac tgt gca aaa 96
Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys Ala Lys
20 25 30
<210> 63
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 63
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys Ala Lys
20 25 30
<210> 64
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AT14-012 FW4 重链
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(33)
<400> 64
tgg ggc cag gga att ttg gtc acc gtc tcc tca 33
Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 65
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 65
Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 66
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AT14-012 FW1 轻链
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(69)
<400> 66
gac atc gtg atg acc cag tct cca gac tcc ctg tct gtg tct ctg ggc 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
gag agg gcc acc atc aac tgc 69
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys
20
<210> 67
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 67
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys
20
<210> 68
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AT14-012 FW2 轻链
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(45)
<400> 68
tgg tac cag cag aaa cca gga cag cct cct aag ctg ctc att tac 45
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 69
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 69
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 70
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AT14-012 FW3 轻链
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(96)
<400> 70
ggg gtc cct gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc act 48
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
ctc acc atc agc agc ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tat tac tgt 96
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 71
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 71
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 72
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AT14-012 FW4 轻链
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(36)
<400> 72
tcc acc ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa 36
Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 73
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 73
Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 74
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> m3 区域
<400> 74
Cys Gly Leu Ala Gly Gly Val Glu Gln Phe Ile Ser Asp Ile Cys
1 5 10 15
<210> 75
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A14-012 表位
<400> 75
Cys Pro Lys Lys Asp Val Leu Glu Thr Phe Thr Val Lys Ser Cys
1 5 10 15
<210> 76
<211> 206
<212> PRT
<213> 智人
<400> 76
Leu Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile Gly Leu Trp Leu Arg Phe Asp
1 5 10 15
Ser Gln Thr Lys Ser Ile Phe Glu Gln Glu Thr Asn Asn Asn Asn Ser
20 25 30
Ser Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Ile Leu Ile Gly Ala Gly Ala Leu Met
35 40 45
Met Leu Val Gly Phe Leu Gly Cys Cys Gly Ala Val Gln Glu Ser Gln
50 55 60
Cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe Leu Leu Val Ile Phe Ala Ile
65 70 75 80
Glu Ile Ala Ala Ala Ile Trp Gly Tyr Ser His Lys Asp Glu Val Ile
85 90 95
Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp Thr Tyr Asn Lys Leu Lys Thr
100 105 110
Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu Lys Ala Ile His Tyr Ala Leu
115 120 125
Asn Cys Cys Gly Leu Ala Gly Gly Val Glu Gln Phe Ile Ser Asp Ile
130 135 140
Cys Pro Lys Lys Asp Val Leu Glu Thr Phe Thr Val Lys Ser Cys Pro
145 150 155 160
Asp Ala Ile Lys Glu Val Phe Asp Asn Lys Phe His Ile Ile Gly Ala
165 170 175
Val Gly Ile Gly Ile Ala Val Val Met Ile Phe Gly Met Ile Phe Ser
180 185 190
Met Ile Leu Cys Cys Ala Ile Arg Arg Asn Arg Glu Met Val
195 200 205
<210> 77
<211> 206
<212> PRT
<213> 大猩猩
<400> 77
Leu Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile Gly Leu Trp Leu Arg Phe Asp
1 5 10 15
Ser Gln Thr Lys Ser Ile Phe Glu Gln Glu Thr Asn Asn Asn Asn Ser
20 25 30
Ser Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Ile Leu Ile Gly Ala Gly Ala Leu Met
35 40 45
Met Leu Val Gly Phe Leu Gly Cys Cys Gly Ala Val Gln Glu Ser Gln
50 55 60
Cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe Leu Leu Val Ile Phe Ala Ile
65 70 75 80
Glu Ile Ala Ala Ala Ile Trp Gly Tyr Ser His Lys Asp Glu Val Ile
85 90 95
Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp Thr Tyr Asn Lys Leu Lys Thr
100 105 110
Lys Asp Glu Leu Gln Arg Glu Thr Leu Lys Ala Ile His Tyr Ala Leu
115 120 125
Asn Cys Cys Gly Leu Ala Gly Gly Val Glu Gln Phe Ile Ser Asp Ile
130 135 140
Cys Pro Lys Lys Asp Val Leu Glu Thr Phe Thr Val Lys Ser Cys Pro
145 150 155 160
Asp Ala Ile Lys Glu Val Phe Asp Asn Lys Phe His Ile Ile Gly Ala
165 170 175
Val Gly Ile Gly Ile Ala Val Val Met Ile Phe Gly Met Ile Phe Ser
180 185 190
Met Ile Leu Cys Cys Ala Ile Arg Arg Asn Arg Glu Met Val
195 200 205
<210> 78
<211> 206
<212> PRT
<213> 婆罗洲猩猩
<400> 78
Leu Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile Gly Leu Trp Leu Arg Phe Asp
1 5 10 15
Ser Gln Thr Lys Ser Ile Phe Glu Gln Glu Thr Asn Asn Asn Asn Ser
20 25 30
Ser Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Ile Leu Ile Gly Ala Gly Ala Leu Met
35 40 45
Met Leu Val Gly Phe Leu Gly Cys Cys Gly Ala Val Gln Glu Ser Gln
50 55 60
Cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe Leu Leu Val Ile Phe Ala Ile
65 70 75 80
Glu Ile Ala Ala Ala Ile Trp Gly Tyr Ser His Lys Asp Glu Val Ile
85 90 95
Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp Thr Tyr Asn Lys Leu Lys Thr
100 105 110
Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu Lys Ala Ile His Tyr Ala Leu
115 120 125
Asn Cys Cys Gly Leu Val Gly Gly Val Glu Gln Phe Ile Ser Asp Ile
130 135 140
Cys Pro Lys Lys Asp Gly Leu Glu Thr Phe Thr Val Lys Ser Cys Pro
145 150 155 160
Asp Ala Ile Lys Glu Val Phe Asp Asn Lys Phe His Ile Ile Gly Ala
165 170 175
Val Gly Ile Gly Ile Ala Val Val Met Ile Phe Gly Met Ile Phe Ser
180 185 190
Met Ile Leu Cys Cys Ala Ile Arg Arg Asn Arg Glu Met Val
195 200 205
<210> 79
<211> 206
<212> PRT
<213> 黑猩猩
<400> 79
Leu Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile Gly Leu Trp Leu Arg Phe Asp
1 5 10 15
Ser Gln Thr Lys Ser Ile Phe Glu Gln Glu Thr Asn Asn Asn Asn Ser
20 25 30
Ser Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Ile Leu Ile Gly Ala Gly Ala Leu Met
35 40 45
Met Leu Val Gly Phe Leu Gly Cys Cys Gly Ala Val Gln Glu Ser Gln
50 55 60
Cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe Leu Leu Val Ile Phe Ala Ile
65 70 75 80
Glu Ile Ala Ala Ala Ile Trp Gly Tyr Ser His Lys Asp Glu Val Ile
85 90 95
Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp Thr Tyr Asn Lys Leu Lys Thr
100 105 110
Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu Lys Ala Ile His Tyr Ala Leu
115 120 125
Asn Cys Cys Gly Leu Ala Gly Gly Val Glu Gln Phe Ile Ser Asp Ile
130 135 140
Cys Pro Lys Lys Asp Gly Leu Glu Thr Phe Thr Val Lys Ser Cys Pro
145 150 155 160
Asp Ala Ile Lys Glu Val Phe Asp Asn Lys Phe His Ile Ile Gly Ala
165 170 175
Val Gly Ile Gly Ile Ala Val Val Met Ile Phe Gly Met Ile Phe Ser
180 185 190
Met Ile Leu Cys Cys Ala Ile Arg Arg Asn Arg Glu Met Val
195 200 205
<210> 80
<211> 206
<212> PRT
<213> 猕猴
<400> 80
Leu Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile Gly Leu Trp Leu Arg Phe Asp
1 5 10 15
Ser Gln Thr Lys Ser Ile Phe Glu Gln Glu Thr Asn Asn Asn Asn Ser
20 25 30
Ser Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Ile Leu Ile Gly Ala Gly Ala Leu Met
35 40 45
Met Leu Val Gly Phe Leu Gly Cys Cys Gly Ala Val Gln Glu Ser Gln
50 55 60
Cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe Leu Leu Val Ile Phe Ala Ile
65 70 75 80
Glu Ile Ala Ala Ala Ile Trp Gly Tyr Ser His Lys Asp Glu Val Ile
85 90 95
Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp Thr Tyr Asn Lys Leu Lys Thr
100 105 110
Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu Lys Ala Ile His Tyr Ala Leu
115 120 125
Asp Cys Cys Gly Leu Ala Gly Gly Val Glu Gln Phe Ile Ser Asp Ile
130 135 140
Cys Pro Lys Lys Asp Val Leu Glu Thr Leu Thr Ile Lys Ser Cys Pro
145 150 155 160
Asp Ala Ile Lys Glu Val Phe Asp Asn Lys Phe His Ile Ile Gly Ala
165 170 175
Val Gly Ile Gly Ile Ala Val Val Met Ile Phe Gly Met Ile Phe Ser
180 185 190
Met Ile Leu Cys Cys Ala Ile Arg Arg Asn Arg Glu Met Val
195 200 205
<210> 81
<211> 206
<212> PRT
<213> 狒狒
<400> 81
Leu Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile Gly Leu Trp Leu Arg Phe Asp
1 5 10 15
Ser Gln Thr Lys Ser Ile Phe Glu Gln Glu Thr Asn Asn Asn Asn Ser
20 25 30
Ser Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Ile Leu Ile Gly Ala Gly Ala Leu Met
35 40 45
Met Leu Val Gly Phe Leu Gly Cys Cys Gly Ala Val Gln Glu Ser Gln
50 55 60
Cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe Leu Leu Val Ile Phe Ala Ile
65 70 75 80
Glu Ile Ala Ala Ala Ile Trp Gly Tyr Ser His Lys Asp Glu Val Ile
85 90 95
Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp Thr Tyr Asn Lys Leu Lys Thr
100 105 110
Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu Lys Ala Ile His Tyr Ala Leu
115 120 125
Asp Cys Cys Gly Leu Ala Gly Ala Val Glu Gln Phe Ile Ser Asp Ile
130 135 140
Cys Pro Lys Lys Asp Val Leu Glu Thr Phe Thr Ile Lys Pro Cys Pro
145 150 155 160
Ala Ala Ile Lys Glu Val Phe Asp Asn Lys Phe His Ile Ile Gly Ala
165 170 175
Val Gly Ile Gly Ile Ala Val Val Met Ile Phe Gly Met Ile Phe Ser
180 185 190
Met Ile Leu Cys Cys Ala Ile Arg Arg Asn Arg Glu Met Val
195 200 205
<210> 82
<211> 206
<212> PRT
<213> 家兔
<400> 82
Leu Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile Gly Leu Trp Leu Arg Phe Asp
1 5 10 15
Ser Gln Thr Lys Ser Ile Phe Glu Gln Asp Lys Asn Asn Asn Asn Ser
20 25 30
Ser Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Ile Leu Ile Gly Ala Gly Ala Leu Met
35 40 45
Met Leu Val Gly Phe Leu Gly Cys Cys Gly Ala Val Gln Glu Ser Gln
50 55 60
Cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe Leu Leu Val Ile Phe Ala Ile
65 70 75 80
Glu Ile Ala Ala Ala Ile Trp Gly Tyr Ser His Lys Asp Glu Val Ile
85 90 95
Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp Thr Tyr Asn Lys Leu Lys Asn
100 105 110
Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu Lys Ala Ile His Tyr Ala Leu
115 120 125
Asp Cys Cys Gly Met Ala Gly Gly Val Glu Gln Phe Ile Ser Asp Ile
130 135 140
Cys Pro Lys Lys Asp Ile Leu Glu Ser Ile Gln Val Lys Ser Cys Pro
145 150 155 160
Glu Ala Ile Lys Glu Val Phe Asp Asn Lys Phe His Val Ile Gly Ala
165 170 175
Val Gly Ile Gly Ile Ala Val Val Met Ile Phe Gly Met Ile Phe Ser
180 185 190
Met Ile Leu Cys Cys Ala Ile Arg Arg Ser Arg Glu Met Val
195 200 205
<210> 83
<211> 206
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 83
Leu Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile Gly Leu Trp Leu Arg Phe Asp
1 5 10 15
Ser Gln Thr Lys Ser Ile Phe Glu Gln Glu Thr Asn Asn Asn His Ser
20 25 30
Ser Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Ile Leu Ile Gly Ala Gly Ala Leu Met
35 40 45
Met Leu Val Gly Phe Leu Gly Cys Cys Gly Ala Val Gln Glu Ser Gln
50 55 60
Cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe Leu Leu Val Ile Phe Ala Ile
65 70 75 80
Glu Ile Ala Ala Ala Val Trp Gly Tyr Thr His Lys Asp Glu Val Ile
85 90 95
Lys Glu Leu Gln Glu Phe Tyr Lys Asp Thr Tyr Gln Lys Leu Arg Ser
100 105 110
Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu Lys Ala Ile His Met Ala Leu
115 120 125
Asp Cys Cys Gly Ile Ala Gly Pro Leu Glu Gln Phe Ile Ser Asp Thr
130 135 140
Cys Pro Lys Lys Gln Leu Leu Glu Ser Phe Gln Val Lys Pro Cys Pro
145 150 155 160
Glu Ala Ile Ser Glu Val Phe Asn Asn Lys Phe His Ile Ile Gly Ala
165 170 175
Val Gly Ile Gly Ile Ala Val Val Met Ile Phe Gly Met Ile Phe Ser
180 185 190
Met Ile Leu Cys Cys Ala Ile Arg Arg Ser Arg Glu Met Val
195 200 205
<210> 84
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H40Y
<400> 84
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Val Ser Gly Tyr Tyr Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 85
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Y112F
<400> 85
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Val Ser Gly Tyr Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 86
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H40Y-Y112F
<400> 86
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Val Ser Gly Tyr Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 87
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D116H
<400> 87
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Val Ser Gly Tyr Tyr Pro Tyr Phe His Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 88
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T29N
<400> 88
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Val Ser Gly Tyr Tyr Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 89
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D116H-T29N
<400> 89
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Val Ser Gly Tyr Tyr Pro Tyr Phe His Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 90
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H40Y-Y112F-D116H-T29N
<400> 90
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Val Ser Gly Tyr Phe Pro Tyr Phe His Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 91
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G110D
<400> 91
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Val Ser Asp Tyr Tyr Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 92
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体 IgG
<400> 92
Pro Arg Tyr Leu Thr Val Ser Asn Met Lys Gln Ile Arg Phe
1 5 10
<210> 93
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 93
Pro Arg Tyr Val Thr Val Ser Asn Met Lys Gln Ile Arg Phe
1 5 10
<210> 94
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 94
Pro Arg Phe Leu Thr Val Ser Asn Met Lys Gln Ile Arg Phe
1 5 10
<210> 95
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 95
Pro Arg Tyr Leu Thr Val Ser Lys Met Lys Gln Ile Arg Phe
1 5 10
<210> 96
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 96
Pro Arg Tyr Leu Thr Val Asn Asn Met Lys Gln Ile Arg Phe
1 5 10
<210> 97
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 97
Pro Arg Tyr Leu Thr Val Ser Asn Met Lys Glu Ile Arg Phe
1 5 10
<210> 98
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 98
Pro Arg Tyr Leu Thr Val Ser Asn Val Arg Glu Val Arg Phe
1 5 10
<210> 99
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 99
Leu Arg Tyr Leu Thr Val Asn Asn Met Lys Gln Ile Arg Tyr
1 5 10
<210> 100
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 100
Leu Arg Tyr Leu Thr Val Asn Lys Met Lys Gln Ile Arg Tyr
1 5 10
<210> 101
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 101
Leu Arg Tyr Leu Ala Val Asn Asn Met Lys Gln Ile Arg Tyr
1 5 10
<210> 102
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 102
Pro Arg Tyr Leu Thr Met Ser Lys Val Lys Gln Ile His Tyr
1 5 10
<210> 103
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig 变体
<400> 103
Pro Trp Tyr Leu Thr Met Ser Lys Val Lys Gln Ile His Tyr
1 5 10

Claims (60)

1.一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分，其特异于CD9，其中所述抗体或其功能部分包含：
-重链CDR1序列DYAMH；以及
-重链CDR2序列GISWNSGSIVYADSVKG；以及
-重链CDR3序列AVSGYYPYFDY或AVSGYFPYFDY或AVSGYYPYFHY；以及
-轻链CDR1序列KSSQSVLYSSNNKNYLG；以及
-轻链CDR2序列WASTRES；以及
-轻链CDR3序列QQYYTTP；
或
-重链CDR1序列DYAMH；以及
-重链CDR2序列GISWNSGSIVYADSVKG；以及
-重链CDR3序列AVSGYYPYFDY；以及
-轻链CDR1序列KSSQSVLYSSNNKNYLG；以及
-轻链CDR2序列WASIRES；以及
-轻链CDR3序列QQYYTTP；
或
-重链CDR1序列DYAMY；以及
-重链CDR2序列GISWNSGSIVYADSVKG；以及
-重链CDR3序列AVSGYYPYFDY或AVSGYFPYFDY或AVSGYFPYFHY；以及
-轻链CDR1序列KSSQSVLYSSNNKNYLG；以及
-轻链CDR2序列WASTRES；以及
-轻链CDR3序列QQYYTTP，
并且其中，所述抗体的功能部分能够与所述抗体结合相同的抗原。
2.根据权利要求1所述的分离的、合成的或重组的抗体或功能部分，其包含：
-重链CDR1序列DYAMH；以及
-重链CDR2序列GISWNSGSIVYADSVKG；以及
-重链CDR3序列AVSGYYPYFDY；以及
-轻链CDR1序列KSSQSVLYSSNNKNYLG；以及
-轻链CDR2序列WASTRES；以及
-轻链CDR3序列QQYYTTP。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或功能部分，其包含重链可变区序列，所述重链可变区序列与序列EVQVVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQLNSLRAEDTAFYYCAKAVSGYYPYFDYWGQGILVTVSS具有至少80%的序列同一性。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或功能部分，其包含轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与序列DIVMTQSPDSLSVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLGWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPSTFGQGTRLEIK具有至少80%的序列同一性。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或功能部分，其包含：
-重链可变区序列EVQVVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQLNSLRAEDTAFYYCAKAVSGYYPYFDYWGQGILVTVSS或EVQVVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMYWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQLNSLRAEDTAFYYCAKAVSGYFPYFDYWGQGILVTVSS或EVQVVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQLNSLRAEDTAFYYCAKAVSGYFPYFDYWGQGILVTVSS或EVQVVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMYWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQLNSLRAEDTAFYYCAKAVSGYFPYFHYWGQGILVTVSS或
EVQVVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFNFDDYAMYWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQLNSLRAEDTAFYYCAKAVSGYFPYFHYWGQGILVTVSS或
EVQVVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMYWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQLNSLRAEDTAFYYCAKAVSGYYPYFDYWGQGILVTVSS或
EVQVVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQLNSLRAEDTAFYYCAKAVSGYYPYFHYWGQGILVTVSS或
EVQVVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFNFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQLNSLRAEDTAFYYCAKAVSGYYPYFDYWGQGILVTVSS或
EVQVVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFNFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQLNSLRAEDTAFYYCAKAVSGYYPYFHYWGQGILVTVSS和/或
-轻链可变区序列DIVMTQSPDSLSVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLGWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPSTFGQGTRLEIK或DIVMTQSPDSLSVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLGWYQQKPGQPPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPSTFGQGTRLEIK。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或功能部分，其为人抗体或其功能部分。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或功能部分，其能够结合黑素瘤细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞和食道癌细胞。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体或功能部分，其中所述抗体具有IgG同种型。
9.根据权利要求8所述的抗体或功能部分，其中所述抗体具有IgG1或IgG3同种型。
10.根据权利要求8或9所述的抗体或功能部分，其包含氨基酸位置345处的精氨酸。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或功能部分，其偶联到另一化合物。
12.根据权利要求11所述的抗体或功能部分，其中所述另一化合物为可检测的标签、化学治疗药物、毒性部分、免疫调节分子、另一种CD9特异性结合化合物、或放射性化合物。
13.一种具有至少15个核苷酸的长度的分离的、合成的或重组的核酸分子、或其功能等同物，其编码根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或功能部分的至少所述重链CDR 1-3和所述轻链CDR 1-3序列，其中，所述功能等同物是包含非天然核苷酸、修饰核苷酸和/或表现出与天然核苷酸相同的功能的非核苷酸构建块的链。
14.根据权利要求13所述的核酸分子或功能等同物，其编码根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或功能部分的至少所述重链可变区序列和/或所述轻链可变区序列。
15.根据权利要求13或14所述的核酸分子或功能等同物，其包含与序列gaa gtg caggtg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggc agg tcc ctg aga ctc tcc tgtgca gcc tct gga ttc acc ttt gat gat tat gcc atg cac tgg gtc cgg caa gct ccaggg aag ggc ctg gag tgg gtc tca ggt att agt tgg aat agt ggt agc ata gtc tatgcg gac tct gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tcc ctgtat ctg caa ctg aac agt ctg aga gct gag gac acg gcc ttc tat tac tgt gca aaagcc gtg agt ggt tat tat ccc tac ttt gac tac tgg ggc cag gga att ttg gtc accgtc tcc tca具有至少80%的序列同一性的序列，和/或包含与序列gac atc gtg atg acccag tct cca gac tcc ctg tct gtg tct ctg ggc gag agg gcc acc atc aac tgc aagtcc agc cag agt gtt tta tac agc tcc aac aat aag aac tac tta ggt tgg tac cagcag aaa cca gga cag cct cct aag ctg ctc att tac tgg gca tct acc cgg gaa tccggg gtc cct gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc act ctc acc atcagc agc ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tat tac tgt cag caa tat tat act actcct tcc acc ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa具有至少80%的序列同一性的序列。
16.一种核酸分子或其功能等同物，其编码根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或功能部分，其中，所述功能等同物是包含非天然核苷酸、修饰核苷酸和/或表现出与天然核苷酸相同的功能的非核苷酸构建块的链。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的核酸分子，其包含cDNA、肽核酸（PNA）、锁核酸（LNA）、或DNA/RNA螺旋。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的核酸分子，其经密码子优化以在非人宿主细胞中表达。
19.一种载体，其包含根据权利要求13至18中任一项所述的核酸分子或功能等同物。
20.一种分离的或重组的细胞，其包含根据权利要求13至18中任一项所述的核酸分子或功能等同物或根据权利要求19所述的载体。
21.一种组合物，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或功能部分、或根据权利要求13至18中任一项所述的核酸分子或功能等同物、或根据权利要求19所述的载体、或根据权利要求20所述的细胞。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述组合物为药物组合物，其还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
23.一种成套试剂盒，其包含权利要求1至12中任一项所述的抗体或功能部分，根据权利要求13至18中任一项所述的核酸分子或功能等同物，根据权利要求19所述的载体或根据权利要求20所述的细胞，以及能够用于治疗和/或预防与表达CD9的细胞相关的病症的治疗剂。
24.根据权利要求23所述的成套试剂盒，其中所述病症是CD9阳性癌症。
25.根据权利要求23或24所述的成套试剂盒，其中所述治疗剂为补体调控蛋白或能够刺激C3转化酶形成或能够抵抗C3转化酶形成的抑制的试剂，或CD55阻断抗体、CD46阻断抗体或CD59阻断抗体，或针对另一补体调控蛋白的抗体，或特异于共抑制T细胞分子的阻断抗体，或针对突变的BRAF的小分子，或另一化学疗法试剂。
26.根据权利要求25所述的成套试剂盒，其中所述治疗剂为CD55阻断抗体。
27.根据权利要求25所述的成套试剂盒，其中所述特异于共抑制T细胞分子的阻断抗体选自：抗-CTLA4抗体、抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体、抗-PD-L2抗体、抗-SIRPα抗体、抗-TIM3抗体、抗-LAG3抗体、抗-CD276抗体、抗-CD272抗体、抗-KIR抗体、抗-A2AR抗体、抗-VISTA抗体和抗-IDO抗体。
28.根据权利要求27所述的成套试剂盒，其中所述特异于共抑制T细胞分子的阻断抗体为PD1阻断抗体或PDL1阻断抗体。
29.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或功能部分、或根据权利要求13至18中任一项所述的核酸分子或功能等同物、或根据权利要求19所述的载体、或根据权利要求20所述的细胞，其用作药剂或预防剂。
30.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或功能部分，或根据权利要求13至18中任一项所述的核酸分子或功能等同物，或根据权利要求19所述的载体，或根据权利要求20所述的细胞，其用于至少部分地治疗或预防与表达CD9的细胞相关的病症的方法中。
31.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或功能部分，其用于诊断与表达CD9的细胞相关的病症。
32.根据权利要求30或31用于所述用途的抗体或功能部分或核酸分子或功能等同物或载体或细胞，其中所述病症选自CD9阳性癌症、骨质疏松、关节炎、肺部炎症、COPD、结肠炎、与先天淋巴细胞相关的病症、病毒感染、细菌感染、CMV视网膜炎、口腔念珠菌病、血小板无力症和白喉。
33.根据权利要求32用于所述用途的抗体或功能部分或核酸分子或功能等同物或载体或细胞，其中所述CD9阳性癌症选自黑素瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、食道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、鳞状细胞癌、AML、多发性骨髓瘤、胃癌、肝癌、脑癌、卡波西肉瘤、粘液表皮样癌、绒毛膜癌、纤维肉瘤、宫颈癌、神经胶质瘤、腺癌和膀胱癌。
34.根据权利要求32用于所述用途的抗体或功能部分或核酸分子或功能等同物或载体或细胞，其中，所述CD9阳性癌症选自肺腺癌、非小细胞肺癌和小细胞肺癌。
35.根据权利要求31至34中任一项用于所述用途的抗体或功能部分或核酸分子或功能等同物或载体或细胞，由此，所述抗体或功能部分或核酸分子或功能等同物或载体或细胞与能够用于治疗和/或预防与表达CD9的细胞相关的病症的治疗剂组合。
36.根据权利要求35用于所述用途的抗体或功能部分或核酸分子或功能等同物或载体或细胞，其中所述与表达CD9的细胞相关的病症为CD9阳性癌症。
37.根据权利要求36用于所述用途的抗体或功能部分或核酸分子或功能等同物或载体或细胞，其中所述治疗剂是补体调控蛋白或能够刺激C3转化酶形成或能够抵抗C3转化酶形成的抑制的试剂或CD55阻断抗体、CD46阻断抗体或CD59阻断抗体，或针对另一补体调控蛋白的抗体，或特异于共抑制T细胞分子的阻断抗体，或针对突变的BRAF的小分子，或另一化学疗法试剂。
38.根据权利要求37用于所述用途的抗体或功能部分或核酸分子或功能等同物或载体或细胞，其中所述特异于共抑制T细胞分子的阻断抗体选自抗-CTLA4抗体、抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体、抗-PD-L2抗体、抗-SIRPα抗体、抗-TIM3抗体、抗-LAG3抗体、抗-CD276抗体、抗-CD272抗体、抗-KIR抗体、抗-A2AR抗体、抗-VISTA抗体和抗-IDO抗体。
39.根据权利要求38用于所述用途的抗体或功能部分或核酸分子或功能等同物或载体或细胞，其中所述特异于共抑制T细胞分子的阻断抗体为PD1阻断抗体或PDL1阻断抗体。
40.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或功能部分在制备用于确定样品是否包含表达CD9的细胞的组合物中的用途。
41.根据权利要求40所述的用途，其中，所述组合物用于确定样品是否包含表达CD9的肿瘤细胞。
42.一种用于制备根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或功能部分的方法，所述方法包括提供具有根据权利要求13至19中任一项所述的核酸分子或功能等同物或载体的细胞，以及使所述细胞翻译所述核酸分子或功能等同物或载体，从而生产根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或功能部分。
43.根据权利要求42所述的方法，所述方法还包括收获、纯化和/或分离根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或功能部分。
44.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或功能部分，或根据权利要求13至18中任一项所述的核酸分子或功能等同物，或根据权利要求19所述的载体，或根据权利要求20所述的细胞，或根据权利要求21或22所述的组合物在制备用于至少部分地治疗和/或预防与表达CD9的细胞相关的病症的药物中的用途。
45.根据权利要求44所述的用途，其中所述病症选自：CD9阳性癌症、骨质疏松、关节炎、肺部炎症、COPD、结肠炎、与先天淋巴细胞相关的病症、病毒感染、细菌感染、CMV视网膜炎、口腔念珠菌病、血小板无力症和白喉。
46.根据权利要求45所述的用途，其中所述CD9阳性癌症选自黑素瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、食道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、鳞状细胞癌、AML、多发性骨髓瘤、肝癌、脑癌、卡波西肉瘤、粘液表皮样癌、绒毛膜癌、纤维肉瘤、宫颈癌、神经胶质瘤、腺癌和膀胱癌。
47.根据权利要求45所述的用途，其中，所述CD9阳性癌症选自肺腺癌、非小细胞肺癌和小细胞肺癌。
48.根据权利要求44至47中任一项所述的用途，其中，所述抗体或功能部分或核酸分子或功能等同物或载体或细胞与能够用于治疗和/或预防与表达CD9的细胞相关的病症的治疗剂组合。
49.根据权利要求48所述的用途，其中所述病症是CD9阳性癌症。
50.根据权利要求48或49所述的用途，其中所述治疗剂为补体调控蛋白或能够刺激C3转化酶形成或能够抵抗C3转化酶形成的抑制的试剂、CD55阻断抗体、CD46阻断抗体或CD59阻断抗体，或针对另一补体调控蛋白的抗体，或特异于共抑制T细胞分子的阻断抗体，或针对突变的BRAF的小分子，或另一化学疗法试剂。
51.根据权利要求50所述的用途，其中所述特异于共抑制T细胞分子的阻断抗体选自：抗-CTLA4抗体、抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体、抗-PD-L2抗体、抗-SIRPα抗体、抗-TIM3抗体、抗-LAG3抗体、抗-CD276抗体、抗-CD272抗体、抗-KIR抗体、抗-A2AR抗体、抗-VISTA抗体和抗-IDO抗体。
52.根据权利要求51所述的用途，其中所述特异于共抑制T细胞分子的阻断抗体为PD1阻断抗体或PDL1阻断抗体。
53.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体、或根据权利要求29至39中任一项用于所述用途的抗体，其中所述抗体为抗体AT14-012或其功能部分，其中所述抗体AT14-012包括：
-重链CDR1序列DYAMH；以及
-重链CDR2序列GISWNSGSIVYADSVKG；以及
-重链CDR3序列AVSGYYPYFDY；以及
-轻链CDR1序列KSSQSVLYSSNNKNYLG；以及
-轻链CDR2序列WASTRES；以及
-轻链CDR3序列QQYYTTP。
54.根据权利要求40、41和44至52中任一项所述的用途、或根据权利要求42或43的方法，其中所述抗体为抗体AT14-012或其功能部分，其中所述抗体AT14-012包括：
-重链CDR1序列DYAMH；以及
-重链CDR2序列GISWNSGSIVYADSVKG；以及
-重链CDR3序列AVSGYYPYFDY；以及
-轻链CDR1序列KSSQSVLYSSNNKNYLG；以及
-轻链CDR2序列WASTRES；以及
-轻链CDR3序列QQYYTTP。
55.长度至多为60个氨基酸残基的CD9肽、或编码所述肽的核酸分子或功能等同物、或含有所述核酸分子的载体用于结合和/或检测根据权利要求1至12中任一项所述抗体、或其功能部分的用途，其中，所述肽包括至少6个氨基酸残基，所述至少6个氨基酸残基与位于如SEQ ID NO: 19所示的CD9氨基酸的位置169-176内的至少6个氨基酸残基一致，
其中，所述功能等同物是包含非天然核苷酸、修饰核苷酸和/或表现出与天然核苷酸相同的功能的非核苷酸构建块的链。
56.合成的或重组的抗体或其功能部分，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的抗体的Fab片段以及CD55阻断抗体、CD46阻断抗体或CD59阻断抗体、抗-CTLA4抗体、抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体、抗-PD-L2抗体、抗-SIRPα抗体、抗-TIM3抗体、抗-LAG3抗体、抗-CD276抗体、抗-CD272抗体、抗-KIR抗体、抗-A2AR抗体、抗-VISTA抗体或抗-IDO抗体的Fab片段，
其中，所述抗体的功能部分能够与所述抗体结合相同的抗原。
57.根据权利要求56所述的合成的或重组的抗体或其功能部分，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的抗体的Fab片段以及抗-PD-1抗体或抗-PD-L1抗体的Fab片段。
58.一种CAR T细胞，其包含根据权利要求1至12中任一项所述抗体或功能部分的重链可变结构域。
59.一种抗体-药物缀合物，其包含根据权利要求1至12中任一项所述抗体或功能部分，其中，所述抗体或功能部分偶联到治疗部分。
60.一种双特异性或多特异性结合化合物，其包含根据权利要求1至12中任一项所述抗体或功能部分的至少所述重链CDR 1-3和所述轻链CDR 1-3序列，及免疫调节分子。
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