JP3405739B2 - モノクローナル抗体、ポリペプチド及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は癌転移抑制作用を持つモ
ノクローナル抗体に関する。本発明の抗体は、ヒト癌た
とえば肺癌およびグリア芽細胞腫の転移抑制作用を示
し、癌の予防、治療に使用することが可能である。ま
た、本発明はポリペプチドおよびその製造法に関する。
さらに詳しくは、本発明は癌細胞の運動能に関与するポ
リペプチドに関するものであり、当該ポリペプチドは、
癌細胞、特に肺癌、グリア芽細胞腫およびその他の転移
性癌の転移抑制に使用することが可能である。

【０００２】

【従来の技術】近年、癌による死亡は年々増加している
が、その一方で癌の治療法の開発も急速に進み種類によ
ってはその治療法が確立されつつあるものもある。特
に、ケーラーとミルスタインのモノクローナル抗体作成
に関する発表［Koehler, G. andMilstein, C.,ネイチャ
ー(Nature), 256, 495(1975)］以来、多くの抗癌抗体が
開発され、癌治療薬および診断薬として応用されてい
る。癌治療においてこれらの抗体は、正常組織に損傷を
与えることなく癌細胞に特異的に結合し、これを排除ま
たは損傷させる、いわゆる抗体ミサイル療法に用いら
れ、白血病やリンパ腫などの血液関連の癌ではある程度
の成果を上げている。

【０００３】しかしながら、癌の転移に対しては、現
在、ほとんど有効な予防および治療法が見出されていな
い。転移に関与する要因として細胞表面分子、細胞骨
格、プロテアーゼなどが想定され、それらのうち、詳細
が明らかになったものもある。しかし、転移が非常に複
雑なプロセスを経て成立するため、その全容を解明する
には程遠い。現状では転移を抑制する薬剤の開発には癌
転移の in vitro 実験モデル系を使用するのが最も効率
的であると考えられる。その様な系としてケモタキシス
チャンバー（chemotaxis chamber）を用いて、孔径５〜
８μｍの均一な穴のあいたフィルター(Nucleopore filt
er；ヌクレオポアメンブレンブィルターなど)を通過す
る細胞数を測定する方法が広く用いられている。この系
を用いて見いだされた癌細胞の転移、例えばその促進に
関与する因子として、autocrine motility factor(AMF)
[プロシージングス オブ ナショナル アカデミー
サイエンス ユー エス エー（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA）， ８３， ３３０２−３３０６ （１９８
６）］及び ケモタクティックファクター（chemotacti
c factor）[医学のあゆみ, 150, 805-806 (1989)］が報
告されている。 この様な実験系で癌細胞の運動能を抑制
する薬剤を創製することができれば癌の転移抑制薬剤と
して極めて有用であると考えられる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】癌の治療において、特
定の癌に対する有効な治療法はいくつか確立されてきて
いる。しかし、癌転移の阻止は困難であり、有効な予防
および治療法の確立が期待されているが、現在そのよう
な方法は皆無である。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らはかかる技術
的背景のもとに、癌細胞に特異的に結合するモノクロー
ナル抗体の中には、抗原が癌細胞の運動能に関与するも
のであり、これに結合することにより癌の運動性を抑制
する抗体が含まれているものと想定し、癌細胞の運動能
を調べる系で前記のケモタキシスチャンバーを用いてモ
ノクローナル抗体 のスクリーニングを行い、目的にか
なう癌細胞の運動能を抑制するモノクローナル抗体を見
出した。本抗体は癌細胞表面の蛋白質に特異的に結合
し、癌細胞の運動能を抑制する。従って、本抗体によっ
て認識される蛋白質は癌細胞の運動能に非常に重要な役
割を担っているものと推定される。このような蛋白質あ
るいはそのペプチド断片は癌の転移抑制薬剤として極め
て有用であると考え、本発明者らは本モノクローナル抗
体が認識するペプチドのアミノ酸配列を決定するため遺
伝子工学の手法を駆使し、抗原をコードするｃＤＮＡを
単離し、さらに、該ｃＤＮＡを含有するプラスミドを構
築し、該プラスミドで形質転換された形質転換体を作製
して、該形質転換体培養物中より目的のペプチドを取得
することにより本発明を完成した。すなわち本願は、次
の（１）〜（７）の発明を含むものである。 （１）ヒト癌細胞の運動能を抑制する抗ヒト癌モノクロ
ーナル抗体である。詳しくは、本発明の抗体はヒト癌細
胞の運動能に関与する蛋白質を認識抗原とし、ヒト癌細
胞としては特にヒト肺癌細胞およびヒトグリア芽細胞腫
に特異性を有するモノクローナルなＩｇＧ好ましくはＩ
ｇＧ₁抗体である。 （２）配列番号１のアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ド〔以下、Ｍと略記することがある〕、本ポリペプチド
は上記（１）の抗体により認識され得る。 （３）配列番号１のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列を
有し、癌細胞の運動能を抑制するポリペプチド、このポ
リペプチドとしては、配列番号１のアミノ酸配列の部分
アミノ酸配列を有し、癌細胞の運動能抑制作用を示すも
のであればいかなるものであってもよい。例えば、アミ
ノ酸残基番号３５から６０，１１３から１４２，１３１
から１６６，１６３から１９１等の領域の配列を有する
ポリペプチドが挙げられる。該ポリペプチドは、レセプ
ター機能を担っている部位、細胞膜上および細胞外で他
の蛋白質と相互作用している部位のいずれを選択しても
よい。（４）Ｍをコードする塩基配列を含有する組み換
えＤＮＡ。 （５）上記(４)のＤＮＡを含有するベクター。 （６）上記（５）のベクターで形質転換された形質転換
体。 （７）上記（４）のＤＮＡを含有するベクターで形質転
換された形質転換体を培養し、培養物中にＭを生成蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とするＭの製造法。 上記の組み換えＤＮＡとしては配列番号１のアミノ酸配
列をコードする塩基配列を含有するものであればいかな
るものであってもよいが、例えば配列番号２の塩基配列
を含有するＤＮＡが好ましい。

【０００６】本発明の抗体は、癌の治療、特に癌の転移
予防において、 本抗体単独または癌細胞の接着を阻害作
用を有する物質等、作用メカニズムの異なる転移抑制物
質と組み合わせて使用することができる。また、本発明
の抗体に適当な抗腫瘍活性を有する物質、例えばメトト
レキサート、ダウノマイシン、ビンクリスチンやシスプ
ラチンなどの抗癌化学療法剤、あるいは緑膿菌外毒素
Ａ，リシン，アブリン，ジフテリア毒素，ネオカルチノ
スタチンなどの毒素蛋白、さらには腫瘍壊死因子，リン
ホトキシン，インターフェロンなどのサイカトキシンと
結合させ、いわゆるミサイル療法剤として癌治療に用い
ることができる。この場合、本発明の抗体の作用を抑制
しない抗腫瘍活性物質を用いることにより、本発明の抗
体は癌の転移を抑制しつつ細胞を特異的に死滅させうる
点で従来のミサイル療法剤より癌治療において有利であ
る。

【０００７】本発明の抗体は、自体公知の方法によって
得られる抗ヒト癌抗体産生ハイブリドーマから得られる
抗ヒト癌抗体より、癌細胞の運動能抑制活性を指標とし
てスクリーニングすることにより得られる。このような
抗ヒト癌抗体産生ハイブリドーマとしては、ヒト癌細胞
と特異的に結合しうる抗体を産生するものであればいず
れでもよく、例えば抗ヒト・トランスフェリン・レセプ
ター（以下、hＴfＲと略記することがある）ＭoＡb産生
マウスハイブリドーマ２２Ｃ６［ＩＦＯ ５０１７２，
ＦＥＲＭ ＢＰ−２０５４］［特開平２−７９９７０号
公報参照］あるいは抗ヒト腎癌ＭoＡb産生マウスハイブ
リドーマＲＣＳ−１［ＩＦＯ ５０１８４，ＦＥＲＭ
ＢＰ−２３３３］［ＷＯ９１−０９１３４公開公報参
照］などが挙げられる。

【０００８】これらの抗体産生ハイブリドーマの作製に
あたっては、通常のハイブリドーマ作製法が用いられる
［G. Koehlerら：ネーチャー（Nature），２５６，４９
５(１９７５)］。例えば癌細胞を常法に従い動物に免疫
し、得られる抗体産生細胞を 骨髄腫細胞などと融合さ
せる方法が用いられる。免疫に用いられる癌細胞として
は例えば、腎癌（AM-RC-3, AM-RC-6, AM-RC-7, SK-RC-
1, SK-RC-9, SK-RC-18），膀胱癌（T-24，KK-47, MGH-U
-1)，前立腺癌（DU-145)，胃癌（NUGC-2, NUGC-3，NUGC
-4, MKN-28, KATO-III, MRK-1)，腸癌（SW-403, SW-62
0, SW-1116, SW-1222, CaOV-4, HT-29)，子宮頚癌（ME-
180)，メラノーマ（SK-MEL-33, SK-MEL-37)，乳癌（MCF
-7)，グリオーマ（MG-178)，肺癌（Luci-10, Calu-6，P
C-10，ADLC-DA, SBC-3, SCLC-SA, Luci-6, CADO-LC3, O
KADA, QG-56)，Ｔ細胞白血病（HUT-78，CCRF-CEM, HPB-
ALL, HSB-2, HUT-102, RPMI-8402, P12/Ichikawa, MT-
1,MT-2)，Ｂ細胞白血病（Raji, Daudi,BALL-1, RPMI-17
88, Ly-16)，ヌル細胞白血病（NALL-1, NALM-6, NALM-1
8, KOPN-K, P30/Ohkubo)，骨髄腫性白血病（HL-60）な
どが挙げられる。

【０００９】また、実際の癌患者、例えば肺癌患者の癌
組織より樹立された癌細胞、例えばＭＡＣ８細胞を用い
ることもできる。さらに、本発明抗体の認識する細胞表
面抗原を免疫抗原として用いることにより、本発明抗体
の生産量の向上を期待することができる。このような癌
細胞表面抗原の識別には従来の蛍光抗体法に加え、近
年、発達してきたＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選択装置）
を用いるのが一般的になっている。また、用いる癌細胞
が付着性の細胞の場合、細胞は通常５ｍＭ ＥＤＴＡを
含むＰＢＳを用いて細胞縣濁液を調製する。目的により
トリプシンやコラゲーナーゼなども使用しうる。これら
の方法は例えば、実験書〔続生化学実験講座５免疫生化
学研究法 １２２頁東京化学同人］記載の方法等を用い
て行いえる。

【００１０】免疫動物としては、例えば哺乳動物（例、
ヒト，マウス，ラット，モルモット，ネコ，イヌ，サ
ル，ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ハムスターなど），鳥類
（例、ニワトリ，ガチョウ，アヒルなど）などが挙げら
れ、なかでもマウス，ラット，ウサギなどが好ましく、
ＭoＡb製造の場合は特にマウスが好ましい。免疫動物に
誘導される抗体産生細胞としては、抗体を産生する細胞
であれば脾臓，リンパ節，末梢血リンパ球などいずれ由
来のものでもよいが、特に脾臓細胞が好都合に用いられ
る。これらの抗体産生細胞、例えばマウスの場合、４−
１０週令のマウスに癌細胞を免疫して、脾細胞を調製す
る。免疫の方法は、通常、リン酸塩緩衝液（以下、ＰＢ
Ｓと略記することがある）で洗浄した生細胞を少量のＰ
ＢＳに懸濁して１回１０⁶〜１０⁸個／０.１ｍｌ好まし
くは１０⁷個／０.１ｍｌをマウス背部，腹 部の皮下あ
るいは腹腔内に投与する。その後、２週間おきに細胞を
２〜５回同様の方法で投与する。最終免疫については、
静脈内投与をおこない、投与後３〜４日目のマウスから
脾細胞を通常の方法に従って調製することができる。

【００１１】この抗体産生細胞は増殖性の細胞と融合し
てハイブリドーマとすることにより、安定的に抗体を産
生することが可能になるが、融合相手の細胞としては特
に骨髄腫細胞（例、ＮＳ−１，Ｐ３−Ｘ６３−ＡgＵ
Ｉ，Ｘ４５，ＳＰ２，Ｘ６８−Ａg８など）が好都合に
用いられる。なかでも、特にＭＯＰＣ２１（ＢＡＬＢ/
ｃマウス）由来の骨髄腫細胞、Ｘ６８−Ａｇ８ および
その改良株が好ましく用いられる。モノクローナル抗体
を作製する場合、これら改良株あるいは他の骨髄腫由来
の細胞株の中からどれかを選んで使用すると、この種の
細胞株は８−アザグアニン耐性であり、ヒポキサンチン
・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを欠くた
め、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チ
ミジン含有培地）では成育できず、融合後のハイブリド
ーマの選択に有利である。

【００１２】細胞融合は公知の方法に従って実施され、
融合剤として、例えばポリエチレングリコール（以下、
ＰＥＧと略記することがある），センダイウイルスな
ど、特に好ましくはＰＥＧが用いられる。ＰＥＧとして
は、平均分子量１０００〜６０００のポリエチレングリ
コールが良く、特に好ましくはＰＥＧ４０００が用いら
れ、濃度は１０〜８０％好ましくは４０〜５０％の範囲
で用いる。細胞融合は抗体産生細胞と骨髄腫細胞をＲＰ
ＭＩ１６４０培地で洗い、通常２：１〜１０：１の比率
で混合し、室温で７００×ｇ，５分間遠心して細胞ペレ
ットを得る。細胞ペレットを３７℃の恒温槽で温めなが
らほぐし、予め温めておいたＰＥＧ溶液を徐々に加えな
がら良く混ぜる。通常、ＰＥＧ量は１０⁸個細胞当たり
１ｍｌ加えられるが、個々のケースで増減しても良い。
ついで、予め温めておいた培地を徐々に滴下、混和し、
ＰＥＧ濃度を下げる。通常は１０分位の時間をかけ１〜
３０ｍｌの培地を加える。室温で遠心して細胞を集め、
１０％ウシ胎児血清（以下、ＦＣＳと略記することがあ
る）を含む培地で脾細胞として１〜２×１０⁶／ｍｌの
細胞濃度で９６穴プレートに１００μｌずつ分注する。
一夜放置後、ＨＡＴおよび１０％ ＦＣＳを含む培地
（ＨＡＴ培地）１００μｌを加える。この操作を省略す
るため細胞融合後、細胞をＨＡＴ培地に懸濁してまいて
も良い。２〜３週間の間に数回の培地交換を行う。培地
交換の方法としては通常プレートの各穴から培地１００
〜２００μｌを除き、新鮮なＨＡＴ培地１００〜２００
μｌを加える。この間、ハイブリドーマの出現が認めら
れれば、出来るだけ早く適当なスクリーニング系を用
い、目的とする抗体を産生しているハイブリドーマの成
育しているウェルを検出する。得られたハイブリドーマ
は直ちに適当な方法でクローニングを行う。

【００１３】このような抗癌細胞抗体産生ハイブリドー
マのスクリーニングには、公知の種々の方法が使用でき
るが、例えば癌細胞への指示赤血球の吸着でみる混合血
球凝集反応（以下、ＭＨＡと略記することがある），癌
細胞に結合した抗体に補体を介して赤血球が粘着する現
象をみる免疫粘着反応，蛍光標識した第２抗体（通常、
抗免疫グロブリン抗体）で癌細胞を染色し蛍光分析する
免疫蛍光法（以下、ＩＦと略記することがある）あるい
はマイクロプレートに粘着した癌細胞例えば肺癌特異的
モノクローナル抗体のスクリーニングには肺癌細胞株、
例えばＡ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １８５）あるいはＭ
ＡＣ８（肺癌細胞株）などへの結合を酵素免疫測定法
（以下、ＥＬＩＳＡと略記することがある）でみるCell
−ＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。抗体活性陽性のハイ
ブリドーマは直ちにクローニングに供されるが、通常こ
れは限界希釈法などで容易に実施される。クローン化さ
れたハイブリドーマの培養上清については、上記の方法
でその抗体価を測定し、安定的に力価の高い抗体を産生
するハイブリドーマを選択し、さらに、癌細胞の運動能
を抑制する抗体のスクリーニングを例えば、前記のヌク
レオポアメンブレンブィルターを用いた modified Boyd
en chamber assay [J.Immunol. Methods, 33,239-247(1
980)]あるいは市販の Transwell plate (Costar社）を
用いて行う。このスクリーニングに使用するフィルター
の孔径は実験条件に応じて例えば５μｍあるいは８μｍ
のものを選べば良い。また、使用する癌細胞はメラノー
マ、グリオーマ細胞等がよく用いられるが、他の癌細胞
株から適当な細胞をスクリーニングし使用してもよい。
例えば肺癌細胞からスクリーニングしたＭＡＣ１０細胞
などを使用することができる。この方法により癌細胞に
対して強い抑制効果を示す抗体を産生するハイブリドー
マを選択することにより、目的とするモノクローナルな
ハイブリドーマを取得することができる。

【００１４】該抗ヒト癌細胞モノクローナル抗体の生成
および蓄積は、本発明のハイブリドーマを通常液体培
地、好ましくは無血清培地中もしくはヒト以外の温血動
物（通常はマウス）の腹腔内で培養し実施するが、 とり
わけ高純度の抗体が必要な場合、無血清培地を使用する
ことが望ましい。以下にそれらの培養の例を挙げる。

【００１５】液体培地としては、例えば動物細胞培養用
基礎培地［例えば、イスコフ培地とハムＦ１２培地の等
量混合培地（Ｉ・Ｈ培地）やＲＰＭ１−１６４０培地な
ど］に牛胎児血清などを添加したものあるいはＧＩＴ培
地（和光純薬工業株式会社）（特開昭６０−１４５０８
８号公報参照）などが挙げられる。培養は通常約３〜６
０日間、好ましくは約５〜１０日間、約３０〜３８℃、
好ましくは約３７℃で実施される。マウス腹腔内への移
植については、１匹当り約２×１０⁵〜５×１０⁷個，好
ましくは約１〜５×１０⁶個の抗体産生ハイブリドーマ
を腹腔内に移入し、約１０〜３５日間の飼育で十分量の
抗体含有腹水液３〜１０ｍｌが得られる。

【００１６】液体培地あるいは腹水液中の抗体の精製に
ついては、公知の生化学的手法を組み合わせて用いるこ
とによりできる。例えば、該抗体含有液を遠心分離後、
上清液を塩析する（通常は硫酸アンモニウムあるいは硫
酸ナトリウムを用いる）。得られた蛋白沈殿物を適当な
緩衝液に溶解し透析後カラムクロマトグラフィー（ＤＥ
ＡＥイオン交換カラム，ヒドロキシアパタイトカラム，
ゲルろ過カラム，プロテインＡカラム，プロテインＧカ
ラムなど），イムノアフィニティークロマトグラフィー
などに供し、目的とする抗体を分離し、精製することが
できる。以上のような分離および精製操作により、例え
ば５００ｍｌの液体培地から蛋白重量比で９０％以上の
純度の抗癌細胞ＭoＡbを約５〜３０ｍｇ得ることができ
る。また５０ｍｌの腹水液からは同様の抗体が１０〜２
００mg得られる。特に、プロテインＡあるいはＧカラム
を用いたクロマトグラフィーにゲルろ過カラム担体、Ｄ
ＥＡＥイオン交換カラム担体、ヒドロキシアパタイトな
どを用いたクロマトグラフィーを組み合わせることによ
りさらに高純度の抗体を得ることができる。これらの精
製抗体標品においては、異種蛋白の含有量は約０．１％
以下であり、医薬としてヒトに投与する場合に好都合で
ある。

【００１７】以上のようにして得られたＭoＡbを蛋白分
解酵素（パパイン，ペプシンなど）処理ならびに還元剤
処理などにより、癌細胞に対する結合能を保持したまま
Ｆab，Ｆab′あるいはＦ(ab′)₂ 断片を得ることがで
き、本発明のＭoＡbと同様の目的で用いられる。またこ
れらのハイブリドーマがマウスＩgＧ ＭoＡbを産生する
場合には、該抗癌細胞ＭoＡbの抗原認識部位を含む可変
領域をコードするＤＮＡを取得し、これに遺伝子操作技
術［Steplewski, Z. ら：プロシーディングス・オブ・
ナショナル・アカデミー・サイエンス，ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），８５，４８５２（19
88）］を用いてヒトＩgＧの定常領域コード する遺伝子
を結合させ、マウス−ヒトキメラ抗体を作製することも
できる。かかるキメラ抗体はヒトへの投与に際し、抗原
性が小さいため有利に用いられる。 本発明の方法によ
り製造される抗癌細胞ＭoＡbは、例えば、メンブレンフ
ィルターなどによるろ過除菌操作後にそれ自体あるいは
適宜の薬理学的に許容されうる担体，賦形剤，希釈剤な
どと混合し、注射剤などとして製剤化することができ
る。このようなＭoＡb製剤は、特に抗癌剤として、それ
自体の癌転移抑制効果のみならず、しかるべき抗癌剤を
結合させた形、いわゆるミサイル療法剤としても期待さ
れている。また、他の抗ヒト癌抗体同様ヒト癌細胞、特
にヒト肺癌細胞およびヒトグリア芽細胞腫等の検出に利
用できる。さらに、ヒト癌細胞の運動能に関与する本発
明のＭのスクリーニング、精製等において有用である。
本発明のＭは、後述のように自体公知の遺伝子工学的技
術の組み合わせにより得ることができる。

【００１８】すなわち、本発明におけるＭをコードする
塩基配列を有するＤＮＡを含有する発現型ベクターは、
例えば、（i）適当なｃＤＮＡライブラリーを使いプロ
トブロットイム ノスクリーニングシステムにより目的
とするＤＮＡを含有するファージを単離し、(ii)そのフ
ァージから目的とするクローン化ＤＮＡを切り出し、(i
ii)該クローン化ＤＮＡをビークル中のプロモーターの
下流に連結することにより製造することが出来る。ベク
ターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３
２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草
菌由来プラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＢ５，ｐＣ
１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳ
Ｈ１５）あるいはファージなどのバクテリオファージお
よびレトロウイルス，ワクシニアウイルスなどの動物ウ
イルスなどが挙げられる。該遺伝子はその５′末端に翻
訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３′末端には
翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ，ＴＧＡまたはＴＡＧを
有していてもよい。さらに該遺伝子を発現させるにはそ
の上流にプロモーターを接続する。本発明で用いられる
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対
応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよ
い。

【００１９】例えば、形質転換する際の宿主が大腸菌で
ある場合は、Ｔ７プロモーター，trp プロモーター，la
cプロモーター，recプロモーター，λＰ_Lプロモータ
ー，lppプロモーターなどが、宿主が枯草菌である場合
は、ＳＰ０１プロモーター，ＳＰ０２プロモーター，pe
nＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨ
Ｏ５ プロモーター，ＰＧＫプロモーター，ＧＡＰプロ
モーター，ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。とりわ
け宿主が大腸菌でプロモーターがtrpプロモーターまた
はλＰ_Lプロモーターであることが好ましい。宿主が動
物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター，
レトロウイルスのプロモーターなどが挙げられ、とりわ
けＳＶ４０由来のプロモーターが好ましい。

【００２０】このようにして作製されたＤＮＡを含有す
るベクターを用いて、形質転換体を製造する。宿主とし
ては、大腸菌，枯草菌，放線菌などの原核生物や酵母，
カビ，動物細胞などの真核生物が挙げられる。上記大腸
菌，枯草菌の具体例としては、たとえば、Escherichia
co li Ｋ１２ＤＨ１〔プロシーディングス オブ ナシ
ョナル アカデミー オブ サイエンス ユー・エス・
エー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）, ６０，１６０
（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ヌクレイック アシッズ
リサーチ（Nucl. Acids, Res.）, ９，３０９（１９
８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル オブ モルキュラ
ー バイオロジー（J. Mol. Biol.）, １２０，５１７
（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔J. Mol. Biol., ４１，
４ ５９（１９６９）〕およびＣ６００〔ジェネティク
ス（Genetics）, ３９，４４０（１９５４）〕などが挙
げられる。上記枯草菌としては、たとえば Bacillus su
btilis ＭＩ１１４〔ジーン（Gene）, ２４，２５５
（１９８３）〕，２０７−２１〔ジャーナル オブ バ
イオケミストリー（J. Biochem.）, ９５，８７（１９
８４）〕などが挙げられる。上記酵母の具体例として
は、たとえば Saccharomyces cerevi siae ＡＨ２２，
ＡＨ２２Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄなどが
挙げられる。上記動物細胞の具体例としては、たとえ
ば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖero，チャイニーズハムス
ター細胞ＣＨＯ，マウスＬ細胞などが挙げられる。上記
大腸菌を形質転換するには、たとえば Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, ６ ９，２１１０（１９７２）や Gene, １
７，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行わ
れる。枯草菌を形質転換するには、たとえばモレキュラ
ー アンド ジェネラル ジェネティクス（Molec. Ge
n. Genet.）, １６８，１１１（１９７９）などに記載
の方法に従って行われる。酵母を形質転換するには、た
とえば Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ７５，１９２９
（１９７８）に記載の方法に従って行われる。動物細胞
を形質転換するには、たとえばヴィロロジー（Virolog
y）, ５２，４５６（１９７３）に記載の方法に従って
行われる。このようにして、ＭをコードするＤＮＡを含
有するベクターで形質転換された形質転換体が得られ
る。

【００２１】宿主が大腸菌，枯草菌，放線菌，酵母また
はカビである形質転換体を培養する際、培養に使用され
る培地としては液体培地が適当であり、その中には該形
質転換体の成育に必要な炭素源，窒素源，無機物その他
が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグルコ
ース，デキストリン，可溶性澱粉またはショ糖など、窒
素源としては、たとえばアンモニウム塩類，硝酸塩類，
コーンスティープ・リカー，ペプトン，カゼイン，肉エ
キス，大豆粕またはバレイショ抽出液などの無機または
有機物質，無機物としては塩化カルシウム，リン酸二水
素ナトリウムまたは塩化マグネシウムなどが挙げられ
る。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。宿主が大腸菌の
場合、用いる培地は、たとえばグルコース，カザミノ酸
を含むＭ９培地〔Miller, J., エクスペリメンツ イン
モレキュラー ジェネティクス（Exp. Mol. Genet.,
p.４３１），Cold Spring Harbor Laboratory, New Yor
k, １９７２〕が好ましい。培養は通常約１４〜４３℃
で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加え
ることもできる。宿主が枯草菌の場合、培養は通常約３
０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要により通気や撹
拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体
を培養する際、培地としては、たとえば Burkholder 最
小培地〔 Bostian, K. L. ら，Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, ７７，４５０５（１９８０）〕が挙げられる。培
地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通
常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じ
て通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換
体を培養する際、培地としては、たとえば約５〜２０％
のＦＢＳを含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science）,
１２２，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔 Virol
ogy, ８，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ１６４０培
地〔ジャーナル オブ ザ アメリカン メディカル
アソシェーション（J. Am. Med. Assoc.）, １９９，５
１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシーディングス
オブ ザ ソサイエティ フォア エクペリメンタル
バイオロジー アンド メディシン（Proc. Soc. Exp.
Biol. Med.）, ７３，１（１９５０）〕などが挙げられ
る。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約
３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて
通気や撹拌を加える。

【００２２】本発明の製造法によりＭ蛋白質は培養物中
に生成蓄積されるが、採取は細胞内または細胞外のいず
れであってもよい。全分子型Ｍは主に細胞内で生成する
が、常法によりたとえば適当なリーダーシークエンスを
つけて融合蛋白として分泌させることができる。細胞内
Ｍを培養物から抽出するに際しては、たとえば細胞内か
ら培養後公知の方法で細胞を集め、塩酸グアニジンや尿
素などの蛋白変性剤を含む緩衝液やトライントＸ−１０
０などの界面活性剤を含む緩衝液中に細胞を懸濁させた
のち、遠心分離によりＭを含む上澄液を得る方法、ある
いは超音波処理，リゾチームなどの酵素処理や凍結融解
法によって細胞を破壊したのち、遠心分離によりＭを含
む上澄液を得る方法などを適宜用い得る。これらの上澄
み液や細胞外に生成、蓄積したＭを分離精製するには自
体公知の分離精製法を適切に組み合わせて実施すればよ
い。これらの公知の分離精製法としては、塩析や溶媒沈
殿法などの溶解度の差を利用する法、透析法、限外ろ過
法、ゲルろ過法およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、
アフィティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を
利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの
疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等
電点の差を利用する方法などが挙げられる。特にＭは本
発明のモノクローナル抗体、例えば後述の実施例で得ら
れたＭ３１−１５により認識されうるので、該モノクロ
ーナル抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラ
フィーが該蛋白質の精製に極めて有効である。

【００２３】一方、本発明のＭおよびその部分ペプチド
は化学合成することもでき、たとえばペプチド自動合成
装置によって合成することが出来る。この基本的な合成
過程等は R.B.Merrifield 〔アドバンス イン エンザ
イモロジー（Advances inEnzymology）32、221-296(19
69)〕の方法に準じている。この方法は、カルボキシル
末端のアミノ酸を樹脂担体に共有結合させておき、α−
アミノ基の保護基の除去、保護アミノ酸の縮合を順次繰
り返して、アミノ末端に向けてペプチド鎖を延長させ目
的のアミノ酸配列を有するペプチド樹脂を得ることをそ
の原理としている。各アミノ酸の縮合やα−アミノ基の
保護基の除去等は、ほぼ同一の条件でなされ、中間体の
精製も行わない為、合成に際しては一般に高度な熟練は
要求されない。しかもこの方法は迅速であり、種々のペ
プチドを合成するに際し、非常に便利な方法である。こ
うして得られた保護ペプチド樹脂を、例えば無水フッ化
水素、トリフルオロメタンスルホン酸もしくはトリフル
オロ酢酸と種々の添加物の共存下に反応させる事によ
り、ペプチドの樹脂からの脱離と全保護基の除去を一段
階で行うことが出来る。得られたペプチド粗製物は、ペ
プチドまたは蛋白質を精製する公知の手段で精製するこ
とが出来る。例えばゲルろ過、陽イオン交換樹脂もしく
は陰イオン交換樹脂を用いるイオン交換クロマトグラフ
ィ−、さらには疎水クロマトグラフィ−、分配吸着クロ
マトグラフィ−等、種々の原理によるカラムクロマトグ
ラフィ−や高速液体クロマトグラフィ−が挙げられる。
このようにして得られた本発明のポリペプチドは種々の
塩の形で得られる。塩としては、例えば無機酸や、蟻
酸、酢酸、酒石酸、クエン酸などの有機酸との塩、もし
くはナトリウムやアンモニアなどの無機塩基や、トリエ
チルアミン、エチルアミン、メチルアミン等の有機塩基
との塩が挙げられる。このようにして得られる本発明の
ポリペプチドは、癌などの治療薬として用いることがで
きる。本発明のポリペプチドを医薬として用いるには、
そのまま粉末として、または他の薬理学的に許容されう
る担体、賦形剤または希釈剤とともに医薬組成物（例、
注射剤、錠剤、カプセル剤、液剤、軟膏）として、温血
動物（例、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサ
ギ、犬、ネコ）に対して非経口的または経口的に安全に
投与することができる。注射剤の製剤化は、たとえば生
理食塩水またはブドウ糖やその他の補助薬を含む水溶液
を用い、常法に従って行なわれる。錠剤、カプセル剤等
の医薬組成物も常法に従って調製しうる。本発明のポリ
ペプチドを上記した医薬として用いる場合には、たとえ
ば上記した温血動物に、投与ルート、症状などを考慮し
て、１日量約１μｇないし１ｍｇ／ｋｇ中から適当量を
選んで投与される。

【００２４】なお、本願明細書や図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Commi
sion on Biochemical Nomenclature による略号あるい
は当該分野における慣用略号に基づくものであり、その
例を次に挙げる。またアミノ酸に関して光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ−体を示すものと
する。また特にことわらない限り配列の左から右への方
向は、アミノ酸配列ではＮ末端からＣ末端への方向を、
塩基配列では５′末端から３′末端への方向をそれぞれ
表す。なお、本発明のＭにおいてはそのアミノ酸配列の
一部（たとえば５％程度まで）が修飾（付加、除去、そ
の他のアミノ酸への置換など）されていてもいい。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：２′−デオキシアデニル酸残基 Ｔ ：チミジル酸残基 Ｇ ：２′−デオキシグアニジル酸残基 Ｃ ：２′−デオキシシチジル酸残基 ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーＲＮＡ ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＦＢＳ ：ウシ胎児血清 ＧｌｙまたはＧ ：グリシン ＡｌａまたはＡ ：アラニン ＶａｌまたはＶ ：バリン ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン ＩｌｅまたはＩ ：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ ：セリン ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン ＣｙｓまたはＣ ：システイン ＭｅｔまたはＭ ：メチオニン ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸 ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ ：リジン ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ ：フェニールアラニン ＴｙｒまたはＹ ：チロシン ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン ＰｒｏまたはＰ ：プロリン ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン

【００２５】

【実施例】以下に参考例，実施例および試験例を挙げて
本発明を具体的に説明するが、これらが本発明の範囲を
制限するものではないことは言うまでもない。なお、参
考例および実施例に開示するハイブリドーマおよび形質
転換体は、以下のとおり財団法人発酵研究所（ＩＦＯ；
大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号）およびブタ
ペスト条約に基づいて通商産業省微生物工業技術研究所
（ＦＲＩ；茨城県つくば市東１丁目１番３号）にそれぞ
れ寄託されている。 ───────────────────────────────── ＩＦＯ ＦＲＩ 名 称 （ＩＦＯ Ｎｏ．） (FERM BP No.) ───────────────────────────────── マウスハイブリドーマ ５０３２４ ３３４０ Ｍ３１−１５ (1991.4.2) (1991.4.9) Escherichia coli １５１６５ ３３５７ ＤＨ５αＦ'ＩＱ/pTB1352 (1991.4.9) (1991.4.15) ハムスターフィブロブラスト ５０３６５ ３７４６ ＣＨＯ／Ｍ−１ (1992.1.31) (1992.2.13) Escherichia coli １５２５９ ３７４５ ＤＨ１／pTB1442 (1992.2.5) (1992.2.10) ───────────────────────────────── 表中（ ）内は寄託日を示す。

【００２６】参考例１ ＭＡＣ８細胞の樹立 ヒト肺癌患者より摘出した癌組織片をリン酸緩衝液（Ｐ
ＢＳ）（１３７mＭ ＮaＣl，２.７mＭ ＫＣｌ，８.１m
Ｍ Ｎa₂ＨＰＯ₄，１.５mＭ ＫＨ₂ＰＯ₄； ｐＨ７.４）
で洗ったのち、はさみで１〜２mm角に細切した。得られ
た細片をヌ ードマウスの皮下に移植し１〜２週間後に
腫瘍の増殖のみられたヌードマウスから腫瘍を摘出し、
ＰＢＳで洗ったのちはさみで１〜２mm角に細切した。つ
いで０．２５％トリプシンを含むＰＢＳで１０分間消化
した。最初の消化液は捨て２度目，３度目の消化液を集
め、遠心（７００×ｇ，５分間）により細胞を１０％Ｆ
ＢＳを含ＲＰＭＩ１６４０培地で洗ったのち同培地にて
培養しヒト肺癌細胞株ＭＡＣ８を樹立した。ついで樹立
した細胞株は、限度希釈法によるクローニングに付し
た。

【００２７】参考例２ 抗癌抗体のＥＬＩＳＡ 参考例１で樹立した肺癌細胞株ＭＡＣ８を４×１０⁵個
／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ１６４０−１０％ＦＢＳ培地に
懸濁し１００μｌずつ９６穴のマイクロプレートにま
き、３７℃のＣＯ₂インキュベーターで一晩培養した。
翌日プレートを ５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．
４）で３回洗った後、プレートの各穴に被検培養上清１
００μｌを加え３７℃で１時間加温した。プレートを４
回洗った後、ビオチン化ヤギ抗マウスイムノグロブリン
と１時間反応させた。プレートを４回洗った後、アビジ
ンビオチン化パーオキシダーゼ（Vectastatin）を加え
１時 間反応させた。プレートを４回洗った後、オルト
フェニレンジアミン溶液（１ｍｇ／ｍｌ，０.５μｌ過
酸化水素水，５.１ｍｇクエン酸，１８.４ｍｇ Ｎａ₂
ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ／ｍｌ）５０μｌを加え１０分間発
色させた。２Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄１００μｌを加え、９６穴マ
イクロプレート用吸光光度計を用い４５ ０ｎｍの吸光
度を測定した。

【００２８】実施例１ モノクローナル抗体の製造 （１）マウス脾細胞の調製 参考例１で得られたＭＡＣ８細胞のＰＢＳ懸濁液（１×
１０⁷個／０.２ｍｌ／マウス）を Ｂａｌｂ/ｃ マウス
（雌８週令）の腹腔内に投与し、２、３、４および７週
間後に追加免疫した。７週間後の免疫は静脈内投与し
た。最終免疫３日後のマウスから脾臓を取り出し、無菌
的に脾細胞懸濁液を調製した。 （２）細胞融合 （１）で得たマウス脾細胞懸濁液（２×１０⁸個）にマ
ウスミエローマ細胞株 ＳＰ２懸濁液（５×１０⁷個）を
混ぜ７００×ｇで５分間遠心し細胞ペレットを得た。細
胞ペレットに１ｍｌの５０％ポリエチレングリコール４
０００溶液（Sigma Chemical Island，ＮＹ）を２分間
にわたり混和しながら徐々に滴下した。引き続き２分間
隔で各々１，１.５，２，３，４，５ ｍｌのＲＰＭＩ
１６４０培地を順次加え、ポリエチレングリコール濃度
を徐々に下げた。７００×ｇ，５分間遠心して細胞を集
め、ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を洗ったのち細胞を１
０％ＦＢＳ／ＨＡＴを添加したＲＰＭＩ１６４０培地に
懸濁（１０⁷個／ｍｌ）し、９６ 穴プレートの各穴に１
００μｌずつまいた。２，５，１０日後に培地の半量を
新鮮なＨＡＴ培地に交換し、２１日目に培養上清１００
μｌを取り、参考例２に記載のＥＬＩＳＡにより抗体の
スクリーニングを行った。 （３）限度希釈法 前記（２）でスクリーニングしたハイブリドーマをＨＡ
Ｔ培地で培養し、細胞数を５個／ｍｌに希釈し９６穴の
組織培養用プレートに１００μｌずつ分注し培養した。
単一コロニーで増殖の認められたウェルの培養液の抗体
産生能を参考例２に記載のＥＬＩＳＡに従い調べ、単一
クローン細胞を得た。 （４）癌細胞運動能抑制抗体のスクリーニング Transwell plateの下室部に前記（３）で得たハイブリ
ドーマの培養上清０.６ｍｌを加え、ヌクレオポアメン
ブレンフィルター（孔径５μｍ）の上に肺癌細胞株ＭＡ
Ｃ１０の懸濁液（５×１０⁵／ｍｌ；ＲＰＭＩ１６４０
−１０％Ｆ ＢＳ）０.１ｍｌを入れＣＯ₂インキューベ
ーターで３７℃、１６時間培養した。ヌクレオポアメン
ブレンフィルターを通過し、プレートの底に沈んだ細胞
数を位相差顕微鏡を用いて計測した。前記（３）で得た
ハイブリドーマ１３５個をスクリーニングし、強い抑制
活性を持つマウスハイブリドーマ（Ｍ３１−１５）を選
びだした。 （５）抗体の調製 ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、１０週令）５匹の腹腔に０.
１ｍｌのプリスタン（ミネラルオイル；和光純薬）を投
与し、２週間後ハイブリドーマＭ３１−１５の懸濁液
（２×１０⁷個／ｍｌ）０.５ｍｌを各々のマウスの腹腔
に投与した。１４日後マウスより腹水を回収し、１５０
０ｒｐｍ、１０分遠心して細胞を除き、さらに１８００
０ｒｐｍ、６０分遠心し、次いでガラスフィルター（ワ
ットマンＧＦ／Ｃ）およびマイレクスＧＶ（０.２２μ
ｍ，ミリポア）フィルターを通し、濾 過 滅菌して腹水
２８.５ｍｌを得た。腹水からのＩｇＧ抗体の精製には
ＭＡＰＳＩＩキット（プロテインＡカラム；バイオラド
製）をもちいた。腹水０.５ｍｌに binding buffer ０.
５ｍｌを加え、混合液０.５ｍｌをプロティンＡカラム
（Affiprep；３０×４.６ｍｍ）に吸着させ、バリアン
社製高速液体クロマトグラフィーを用い以下の溶出プロ
グラムに従って溶出を行った。 溶出溶媒Ａ：binding buffer；溶出溶媒Ｂ：ＰＢＳ
〔８.１ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄，１.５ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄，
１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２.７ｍＭ ＫＣｌ（ｐＨ７.
４）〕；溶出溶媒Ｃ：elution buffer； 溶出プログラ
ム：０分 １００％Ａ；３分 １００％ Ａ；３.０１
分 １００％ Ｂ；１５分 １００％ Ｂ；１５.０１
分 １００％ Ｃ；２０分 １００％ Ｃ；２０.０１
分 １００％Ｂ；溶出速度：０.８ｍｌ／ｍｉｎ；検出
波長：２８０ｎｍ；ループ：１ｍｌカラムから溶出され
たＩｇＧ抗体は直ちにＰＢＳに対する透析を行い、次い
でマイレクスＧＶフィルター（ミリポア社）を通して濾
過滅菌し、精製マウス抗ヒト癌抗体Ｍ３１−１５（Ｉｇ
Ｇ₁）０.４ｍｇを得た。

【００２９】実施例２ モノクローナル抗体の特異性 Ｍ３１−１５抗体の癌細胞に対する結合性はＦＡＣＳｔ
ａｒ（Becton Dickinson）を用いて測定を行った。付着
細胞株は０.１２５％トリプシンを含むＰＢＳ／０.０２
％ＥＤＴＡ溶液ではがしＲＰＭＩ１６４０−１０％ＦＢ
Ｓ培地で洗った後、細胞を１×１０⁶個／ｍｌの濃度で
０℃，１時間保温した。精製Ｍ３１−１５抗体（終濃度
１μｇ／ｍｌ）を加え０℃で１時間反応させた。細胞を
ＰＢＳ−０.１％ ＮaＮ₃で３回洗ったのちＦＩＴＣ−
標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（２０倍希釈）１０
０μｌで０℃，３０分間反応させた。ＰＢＳ−０.１％
ＮaＮ₃で洗った後、細胞を２ｍｌのＰＢＳ−０.１％Ｎa
Ｎ₃に懸濁し、ＦＡＣＳｔａｒを用いて解析した。Ｍ３
１−１５抗体は、肝癌細胞、一部のリンパ系癌細胞を除
きほとんどの癌細胞に結合した〔表１〕。

【表１】 細胞株 染色例 陽性 ────────────────────────── 肺癌 ４ ４ 胃癌 ２ ２ 膵癌 ２ ２ 乳癌 ２ ２ 肝癌 ２ ０ 結腸癌 １ １ 子宮頚癌 １ １ 類表皮癌 １ １ メラノーマ １ １ グリオーマ １ １ リンパ系癌細胞 ９ ４ 繊維芽細胞 ４ ２ ──────────────────────────

【００３０】実施例３ Ｍ３１−１５抗体の不溶化 実施例１−（５）に記載の方法に準じて得た精製モノク
ローナル抗体０.４８ｍｇを１Ｌの０.１Ｍ ＮａＨＣＯ₃
（ｐＨ ８.４）に対して一晩透析した。ＡｆｆｉＧｅｌ
１０（バイオラド社）２ｍｌを使用説明書に従って洗
い、抗体と４℃で２４時間反応させてＭ３１−１５抗体
を不溶化したのち、ゲルを０.１Ｍ トリス緩衝液（ｐ
Ｈ ８.１）１０ｍｌで洗い、同バッファー中で４℃, ３
日間放置し、残存する活性基をブロックしたのち、ゲル
をＰＢＳで洗った。コントロールゲルとして抗体を含ま
ないバッファーを用い同様の処理をしたゲルを調製し
た。

【００３１】実施例４ 不溶化Ｍ３１−１５抗体の抗原
結合活性の確認 ＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞をＲＰＭＩ１６４０−１０％
ＦＣＳ培地を用いてローラボトル（コーニング２５２４
０）で培養した。細胞をスクレイパーではがし０.１Ｍ
トリス緩衝液（ｐＨ ８.１）で２回洗ったのち１％ ト
ライトン Ｘ１１４／０.１Ｍ トリス／１０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ／０.２ｍＭ ｐ-ＡＰＭＳＦ（(p-amidinophenyl)meth
anesulfonyl fluoride hydrochloride；和光純薬）／
（２Ｕ／ｍｌ）Ｔｒａｓｙｌｏｌ（ｐＨ８.１）２ｍｌ
を加え氷中で１ ０分間可溶化した。遠心上清（１５０
００ｒｐｍ，１０分）を３７℃で１０分間加温し、室温
で３０００ｒｐｍ，１０分間遠心した。上層を捨て下層
に０.１Ｍ トリス緩衝液（ｐＨ ８.１）２ｍｌを加え、
室温で１０分間遠心した。下層に１％ ＣＨＡＰＳ(3-
〔〔3-cholamidopropyl〕dimethylammonio〕-1-propans
ulfonat;Boehringer Mannheim)／０.１Ｍ トリス（ｐ
Ｈ ８.１）０.５ｍｌを加え４℃で１５０００ｒｐｍ，
３０分遠心し上清約０.９ｍｌを得た。上清５μｌをエ
ッペンドルフチューブにとり、ＰＢＳ １５μｌ，実施
例３で得られたＭ３１−１５抗体結合ＡｆｆｉＧｅｌ
１０ 約１０μｌを加え室温で１時間反応させた。３０
００ｒｐｍ，１０分遠心し、上清をマイクロシリンジで
回収しＳＤＳ−ＰＡＧＥついでウェスタンブロットに付
した。ゲルに結合した抗原は１０％ ＳＤＳ ５μｌ，１
％ ＤＴＴ ５μｌ泳動用バッブァー１０μｌを加え沸騰
水中で５分間加熱し溶出した。抗原はコントロールゲル
ではゲルに結合せず上清に回収されたが、Ｍ３１−１５
抗体結合ゲルの場合、上清には残らず全てゲルに吸着し
た〔図１〕。

【００３２】試験例１ モノクロ−ナル抗体Ｍ３１−１
５によるin vivo転移の抑制 フラスコに培養したＭＡＣ８細胞をトリプシンではがし
たのち１０％ ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地で１回、
ついでＲＰＭＩ１６４０で２回洗ったのち２あるいは６
×１０⁵個をＢＡＬＢ/ｃ ｎｕ/ｎｕマウスに尾静脈から
ｉｖ投与した。参考例１で得られたモノクロ−ナル抗体
Ｍ３１−１５の転移抑制効果を見るため、癌細胞投与３
時間後Ｍ３１−１５、５０μgを尾静脈からｉｖ投与し
た。３カ月後肺に転移した癌細胞のコロニ−数を数え
た。結果を〔表２〕に示す。抗体投与により転移コロニ
−数に顕著な減少が認められた。

【表２】 ──────────────────────────── 転移陽性例／例数 平均コロニ−数 ──────────────────────────── 抗体非投与群 ６／７ ５４.４ 抗体投与群 ３／４ １.８ ────────────────────────────

【００３３】 試験例２ 精製Ｍ３１−１５抗体による運動能の抑制 （１）ＭＡＣ１０細胞の運動能の抑制 ＭＡＣ１０細胞は培養フラスコから０.０１％ＥＤＴＡ
を含むＰＢＳではがしＲＰＭＩ１６４０−１０％ＦＣＳ
培地で洗った後、５×１０⁵／ｍｌの濃度に懸濁した。T
raswell plate（Costar）の下室にＲＰＭＩ１６４０−
１０％ ＦＣＳ培地および精製Ｍ３１−１５抗体（０−
１０μｇ）０．６ｍｌを加え、上室に０.１ｍｌのＭＡ
Ｃ１０細胞懸濁液を加え、３７℃で１６時間培養した。
メンブレンを通過して下室の培地中に遊走した細胞を集
め、遠心により濃縮し、９６穴マイクロプレートに移し
て位相差顕微鏡により細胞数を計測した。〔図２〕に示
す様に抗体濃度０.１μｇ／ｍｌで５０％の運動能の抑
制が見られた。 （２）Ｔ９８Ｇ細胞の運動能の抑制 Ｔ９８Ｇ細胞をＭＥＭ−１０％ＦＣＳ（１％非必須アミ
ノ酸および１％ピルビン酸ナトリウムを添加）培地を用
い７５ｃｍ フラスコ（コーニング２５１１０）で培養
した。細胞が密に単層を形成したのち培地を捨て、血清
を含まない上記培地で２回洗ったのち３ｍｌの培地を加
え３７℃で２４時間培養した。培養上清を集め、１５０
０ｒｐｍ，５分の遠心により細胞を除きケモタクティッ
クファクター（chemotactic factor）を得た。マイクロ
ケモタキシスチャンバー（アカデミカ）の下室に粗ケモ
タクティックファクターおよび精製抗体（０−１μｇ／
ｍｌ）の混液３０μｌを入れ、孔径８μｍのヌクレオポ
アメンブレン（ＰＶＰＦ）を乗せ上室にＴ９８Ｇ細胞懸
濁液２.５× １０⁴／５０μｌを加え３７℃で４時間培
養した。メンブレン上面の細胞を除き、メンブレンを通
過し、メンブレン下面に接着している細胞をＤｉｆｆ−
Ｑｕｉｃｋ（ミドリ十字）で染色した。４０倍の対物レ
ンズを用い０.２５ｍｍ四方の２視野の細胞数を計測し
た。結果は〔表３〕に示すとおりであった。本抗体は
０.１μｇ／ｍｌの濃度でＴ９８Ｇ細胞の運動能を５０
％以上阻害した。

【表３】 ケモタクティックファクター Ｍ３１−１５抗体 遊走細胞数 （μｇ／ｍｌ） − − ０ ＋ − １２８ ＋ ０.１ ４２ ＋ ０.５ ６ ＋ １.０ ４ ─────────────────────────────────

【００３４】試験例３ 不溶化Ｍ３１−１５抗体による
ケモタクティックファクターの吸収実施例３で得たゲル
約２０μｌをスパッテルでエッペンドルフチューブ（３
８１０）にとり、試験例２−２）で得た粗ケモタクティ
ックファクター ０.４ｍｌを加え室温で１時間反応させ
た。３０００ｒｐｍ，１０分遠心し、上清の抑制活性を
試験例２−２）に記載の方法に従って測定した。ただ
し、ケモタクティックファクターの濃 度は全て２倍希
釈で使用した。その結果、ケモタクティックファクター
は吸収されなかった〔表４〕。

【表４】 ケモタクティックファクター 抗体−A ffiＧｅｌ１０＊ 遊走 細胞数 − − ０ ＋ − １９４ ＋ ＭＥＭとインキュベート １５２ ＋ ＋ ５２ ＋ コントロールゲル ９５ ＊：抗体−ＡｆｆｉＧｅｌ １０(またはコントロールゲ
ル）をケモタクティックファクター（またはＭＥＭ）と
室温で１時間インキュベートした上清を使用した。

【００３５】実施例５ Ｍ３１−１５抗体の認識する抗
原の同定 ＭＩＡ ＰａＣａ−２（膵臓癌細胞）、ＨＥＬ（赤白血
病細胞）、ＺＲ−７５−３０（乳癌細胞）、ＭＡＣ１０
（肺癌細胞）、ＡＺ５２１（胃癌細胞）をファルコン社
製ディツシュ（３００３）上に単層培養し、細胞を０.
１Ｍ トリス（ｐＨ８.１）で２回洗浄後スクレイパー
（Costar，３０１０）で集め、 遠心により洗ったのち
細胞を１％ ＣＨＡＰＳ／０.１Ｍ トリス／１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ／０.２ｍＭ ｐ−ＡＰＭＳＦ／Ｔｒａｓｙｌｏｌ
（２Ｕ／ｍｌ） １００μｌを加え０℃で２時間可溶化
した。１５０００ｒｐｍ，３０分の遠心上清各２０μｌ
を Laemmli のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ゲル濃度１２％）［N
ature Lond., 227, 680-685(1970)］にかけ、ウェスタ
ンブロット法により抗原を検出した。〔図３〕に示すよ
うに全ての癌細胞で分子量２５０００の主バンドおよび
２８０００の副バンドが認められた。

【００３６】実施例６ ＭをコードするｃＤＮＡのクロ
ーニング λgt11のcＤＮＡライブラリー（Human Breast Carcinom
a cＤＮＡライブラリー，CLONTECH Lab. Inc.)を同ライ
ブラリーキット添付の大腸菌Ｙ１０９０に感染させたの
ち、Ｌブロスの軟寒天プレートにまいた。プラークが出
現し始めた時に、ＩＰＴＧ(Isopropylthiogalactoside)
を含むニトロセルロース膜をプレートの上にのせ、 ３.
５時間インキュベーションした。次にニトロセルロース
膜をはずし、ＴＢＳＴ緩衝液（１０ｍＭ トリス，１５
０ｍＭ ＮａＣｌ，０.０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０，ｐＨ
８.０）で洗浄し、つづいて２０％ ＦＢＳ溶液に３０
分間つけた。この様に処理したニトロセルロース膜をＭ
３１−１５抗体（２μｇ／ｍｌ）および大腸菌抽出液
（１ｍｇ／ｍｌ）を含むＴＢＳＴに浸し室温で５０分間
反応させた。該膜をＴＢＳＴ緩衝液で３回洗った後、ア
ルカリホスファターゼー標識抗マウスＩｇＧ抗体（５０
００倍希釈）と３０分間反応させ、ＴＢＳＴで３回洗浄
したのち基質（Nitro-bluetetrazalium and 5-bromo-4
chloro-3-indoyl phosphate）を用いて発色させた。 １
×１０⁶ｐｆｕ（プラーク形成単位）のフアージから１
４個の陽性クローンを選び出した。これら１４個のクロ
ーンを上記の方法に準じて再スクリーニングした結果、
１個のクローンが再度陽性を示したので、該クローンを
陽性として選択した。

【００３７】実施例７ プラスミドｐＴＢ１３５２を含
む形質転換体の作製 選択した陽性クローンを大腸菌Ｙ１０９０に感染させた
のち、Ｌブロスの軟寒天培地にまき３７℃で１６時間培
養後、軟寒天より約１０⁹ｐｆｕのファージを抽出し
た。このようにして得たファージよりQIAGEN＞lambda＜
kit（DIAGEN ＧmbＨ）を用いてＤＮＡを精製した。精
製したＤＮＡを制限酵素ＥcoＲＩで消化し得られたＤＮ
Ａ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてプラスミドｐＵ
Ｃ１１８（宝酒造）のＥcoＲＩ部位に挿入し、プラスミ
ドｐＴＢ１３５２を構築した。得られたｐＴＢ１３５２
を大腸菌ＤＨ５αＦ'ＩＱ^TMにトランスフェクトし形質
転換体 Escherichia coli ＤＨ５αＦ'ＩＱ^TM／ｐＴＢ
１３５２を得た。

【００３８】実施例８ ＤＮＡの塩基配列決定 実施例７で得られた形質転換体にヘルパーファージＫＯ
・７を感染させたのち、２×ＹＴ培地（１.６％Bacto-tr
yptone, １％ Yeast extract, ０.５％ＮaＣl）中で３
７℃，１６時間培養後、この培養上清よりＰＥＧ♯６０
００沈殿，フェノール抽出エタノール沈殿法により１本
鎖ＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡの塩基配列をα−
³²Ｐ−ｄＣＴＰ（〜８００Ｃi／ｍｍｏｌｅ，アマシャ
ム），シー ケナーゼＶer. ２.５キット（Ｕ.Ｂ.Ｃ.）
を用いてcＤＮＡ部分の配列を決定し た。決定された塩
基配列およびその配列より推定されるアミノ酸配列を
〔図４〕〜〔図９〕および配列番号３に示した。

【００３９】実施例９ ｐＴＢ１３５２の遺伝子マップ
の作製 実施例７で得た形質転換体を２×ＹＴ培地で３７℃，１
６時間培養し得た形質転換体よりQIAGEN＞plasmid＜kit
を用い２本鎖ＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡを制
限酵素 ＳacＩ, ＫpnＩ, ＳmaＩ, ＢamＨＩ, ＸbaＩ,
ＳalＩ，ＰstＩ，ＳphＩおよびＨindIIIで消化し、消化
物を１％アガロースゲル電気泳動によって解析した。そ
の結果、ＸbaＩで２カ所ＳphＩで１カ所の切断部位があ
ることが判った。次にＸbaＩ−ＥcoＲＩおよびＳphＩ−
ＥcoＲＩの二重切断を行い、〔図１０〕に示した遺伝子
マップを完成した。

【００４０】実施例１０ 動物細胞発現用プラスミドの
構築 公知のプラスミドｐＴＢ３９９〔特開昭６０−６３２８
２号公報実施例１(v)〕を制限酵素ＥcoＲＩで切断し、
ＤＮＡポリメラ−ゼ(クレノウフラグメント)を用いて末
端を平滑化した後、公知の方法に従って、５’末端をり
ん酸化したＢglIIリンカ−(ＣＡＧＡＴＣＴＧ)を結合さ
せた。ＢglIIで切断後、アガロ−スゲル電気泳動により
３．９KbのＤＮＡ断片を分離精製し、このＤＮＡ断片を
Ｔ４ＤＮＡリガ−ゼ反応により環状化してA-MuLV LTR領
域、スプライス領域およびpolyＡ付加領域を含むプラス
ミドｐＴＢ１３０８を構築した。ついでこのプラスミド
ｐＴＢ１３０８を制限酵素ＥcoＲＩで開裂し、一方、実
施例７で得たプラスミドｐＴＢ１３５２から制限酵素Ｅ
coＲＩ で切断後アガロ−スゲル電気泳動で分離調製し
たＭ遺伝子断片(１．１Kb)を混ぜＴ４ＤＮＡリガ−ゼ反
応によりプラスミドｐＴＢ１３０８/Ｍを構築した。同
様に公知のプラスミドｐＴＢ３４８〔特開昭６０−６３
２８２号公報実施例１(v)〕を制限酵素ＳalＩおよびHin
dIIIで開裂し、一方、上で得たプラスミドｐＴＢ１３０
８/Ｍ から制限酵素ＳalＩおよびＨindIIIで切断後アガ
ロ−スゲル電気泳動で分離調製したＭ遺伝子、A-MuLV L
TR領域、スプライス領域および polyＡ付加領域を含む
ＤＮＡ断片(２.７Kb)を混ぜ、Ｔ４ＤＮＡリガ−ゼ反応
によりＭ発現用プラスミドｐＴＢ１４４２〔図１１〕を
構築した。得られたプラスミドｐＴＢ１４４２を大腸菌
ＤＨ１にトランスフェクトした形質転換体 Escherichia
coli ＤＨ１／pTB1442を得た。

【００４１】実施例１１ ｐＴＢ１４４２の発現および
トランスホ−マントの取得 i) ＣＨＯ細胞 ハムスタ−ＤＨＦＲ~ＣＨＯ細胞(以下、ＣＨＯ細胞と略
記する)〔Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220
(1980)〕を５％ ＦＢＳ/ハムＦ１２培地を用いファルコ
ンシャ−レ(径６cm;BECTON DECKINSON、CA)で培養した。
グラハムの方法〔Virology, 52, 456-467 (1973)〕に準
じてＣＨＯ細胞にプラスミドｐＴＢ１４４２(シャ−レ
当たり１０μg)をトランスフェクトした。２日後、培地
を１０％透析ＦＢＳ/プロリン(３５μｇ/ｍｌ)/ダルベ
ッコ改変ＭＥＭ培地に変え、２週間後にＤＨＦＲ⁺にな
って増殖したコロニ−を得た。Ｍが発現しているかどう
かの確認は実施例３に記載した方法に準じて行った。結
果を〔図１２〕に示す。 ii) ＭＡＣ１０細胞
ＭＡＣ１０細胞へのトランスフェクシヨンには電気穿孔
法〔エンボ ジャーナル（EMBO J.）, 1, 841 (1982)〕
を用いた。即ち、ＭＡＣ１０細胞５×１０⁶個にプラス
ミドｐＴＢ１４４２, ２０μｇをｐＲｃ/ＣＭＶ(Invitr
ogen、CA) ２μｇと混ぜトランスフェクトし、１０％
ＦＢＳ/ＲＰＭＩ１６４０培地で２.５×１０⁵/ｍｌの濃
度に希 釈し９６穴プレ−トの各穴に100μlずつまい
た。選択培地としてＧ４１８（シグマ社) １ｍｇ/ｍｌ
を含む１０％ ＦＢＳ/ＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
約２−３週間後にＧ418耐性 コロニ−１７株を得た。

【００４２】実施例１２ ドットプロット法によるＭの
定量 i)細胞の可溶化 実施例１１で得られた細胞を直経10cmのシャ−レに培養
し、ＰＢＳ ２ｍｌついで０.１Ｍトリス緩衝液(ｐＨ
８.１)１ｍｌで洗い、０.１Ｍトリス緩衝液 ０.５ｍｌ
を加えてセルスクラッパ−(Costar)を用いて細胞をエッ
ペンドルフチュ−ブ3810に集めた。シャ−レに残った細
胞は、さらに０.５ｍｌの０.１Ｍ トリス緩衝液で集め
た。細胞に１％ ＣＨＡＰＳ／０.１Ｍ トリス ｐＨ ８.
１/１０ｍＭ ＥＤＴＡ/０.２ｍＭ ｐ−ＡＰＭＳＦ/ｔｒ
ａｓｙｌｏｌ(２ Ｕ/ｍｌ) ５０μｌを加え０℃，３０
分間可溶化し、遠心上清を用いた。 ii)ドットプロット法による定量 上記i)で得た抽出液あるいはその希釈液１μlをニトロ
セルロ−ス膜(BIO-RAD;Richmond、CA)にスポットし、風
乾後２％ ＦＢＳを含むＴＢＳ(２０ｍＭトリス/５００
ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ ７.５)に一晩浸した。つい
でモノクロ−ナル抗体、Ｍ３１−１５(１μｇ/ｍｌ)を
含む１％ ゼラチン/ＴＢＳ と３７℃，１時間反応させ
た。膜を０.０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ(ＴＴ
ＢＳ)で１０分間２回、ＴＢＳで１回洗った後、ＨＲＰ
標識抗マウス抗体(１０００培希釈)を含む１％ ゼラチ
ン/ＴＢＳと３７℃１時間反応させた。膜をＴＴＢＳで
１０分間２ 回、ＴＢＳで１回洗った後、発色液（ＨＲ
Ｐ color development reagent(BIO-RAD) ２０ｍｇ/メ
タノール ６.６ｍｌ/過酸化水素水 ２０μｌ/ＴＢＳ ３
３.４ｍｌ）に浸し１０分間発色させた。膜は蒸留水で
充分に洗った後風乾した。ＭＡＣ１０細胞の抽出液を１
０ユニット(Ｕ)/ｍｌとして表した。〔表５〕にＭを含
むプラスミドｐＴＢ１４４２を発現させて得られたＭＡ
Ｃ１０細胞のクロ−ンの抽出液の測定結果を示す。蛋白
質の定量はＢＣＡ Protein Assay Reagent(PIERCE、Roc
kford、Illynois)を用いて行った。

【表５】 ────────────────────────── Ｍ(U/ml) 蛋白量(mg/ml) U/mg ────────────────────────── MAC10 10 10 1.0 クロ-ン 1 60 19 3.2 クロ-ン 4 20 19 1.1 クロ-ン 7 10 11 0.9 クロ-ン 9 40 17 2.4 クロ-ン 11 10 9.6 1.0 ──────────────────────────

【００４３】実施例１３ Ｍフラグメントペプチドの合
成と精製 Ｍのフラグメントペプチドの合成はメリフィ−ルドらに
より開発されたペプチドの固相合成法〔R.B.Merrifiel
d, アドバンス イン エンザイモロジー（Advances in
Enzymology） 32、221-296(1969)〕の変法に準じて行
われ、自動ペプチド合成基430A(アプライドバイオシス
テムズ社)を用いた。保護ペプチド−樹脂の合成はアプ
ライドバイオシステムズ社指定のプロトコ−ルを用い
た。保護アミノ酸−pオキシメチルフェニルアセトアミ
ドメチル樹脂(ポリスチレン−１％ジビニルベンゼン)を
出発材料とし、これに逐次保護アミノ酸を縮合させた。
縮合時に各アミノ酸のα−アミノ基を保護するために
は、三級ブチルオキシカルボニル(ＢＯＣ)基を用いた。
側鎖の官能基保護は次のように行った。セリンとスレオ
ニン のヒドロキシル基はO−ベンジルエ−テルとして、
チロシンのヒドロキシル基は ｐ−ブロモベンジルオキ
シカルボニルエステルとして、グルタミン酸およびアス
パラギン酸のカルボキシル基はベンジルエステルとし
て、ヒスチジンのイミダゾ−ル窒素はベンジルオキシメ
チルによって、リジンの側鎖アミノ基は２−クロルベン
ジルオキシカルボニルで、アルギニンのグアニジン官能
基はｐ−トルエンスルホニル基で、トリプトファンのイ
ンド−ルイミンはホルミル基でそれぞれ保護した。全て
のアミノ酸は、アプライド・バイオシステムズジャパン
社又はバチェム・ケミカルズから入手した。樹脂上に全
てのアミノ酸を縮合した後、保護ペプチド樹脂を合成機
から取りだし、乾燥した。ペプチド樹脂(１g)を、ｐ−
クレゾ−ル(１ｍｌ)、1,2-エタンジチオ−ル(１ｍｌ)、
2−メルカプトピリジン(１００ｍｇ)を含んだ無水フッ
化水素(８ｍｌ)と、０℃で２時間反応させた。反応終了
後、フッ化水素を留去し、残留物をジエチルエ−テルで
洗浄し、大部分の混合試薬を除去した。ペプチドをトリ
フルオロ酢酸(１０ｍｌ)で抽出し、ろ過により樹脂を除
いた。ろ液を濃縮後エ−テルを加え、生じた沈殿を遠心
分離して集め、沈殿物を更に３回エ−テルで洗浄した。
得られた粉末標品を更に逆相高速液体クロマトグラフィ
−で精製した〔カラムＹＭＣ A−303 ODS(4.6×250m
m）;溶出溶媒Ａ、０.１％ トリフルオロ酢酸−９９.９
％ 水；溶出溶 媒Ｂ、０.１％ トリフルオロ酢酸−９
９.９％ アセトニトリル；溶出濃度勾配プログラム、０
分(８０％ Ａ＋２０％ Ｂ)−３０分(５０％ Ａ＋５０％
Ｂ)(但し必要ならば他の溶出プログ ラムを用いること
もある)溶出速度、１ｍｌ/分；検出波長 ２３０または
２８０ｎｍ〕。純粋な目的物を含むピ−ク画分を集めて
バイオラッドＡＧＩ×８(酢酸型、1.８×５ｃｍ)のカラ
ムに通し、洗液も集めアセトニトリルを留去した後、凍
結乾燥した。このようにして得たペプチドのアミノ酸分
析結果を〔表６〕に示す。また、これらのペプチドのア
ミノ酸配列ならびに逆相高速液体クロマトグラフィ−に
おける保持時間を以下に示す。

【表６】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ペプチド ────────────────── 1 2 3 4 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 実側値(理論値) Ａｓｐ 4.0(4) 2.0(2) 5.1(5) 5.0(5) Ｔｈｒ 2.6(3) 0.9(1) 1.9(2) 2.5(3) Ｓｅｒ 0.9(1) 1.9(2) 3.3(4) Ｇｌｕ 7.1(7) 4.2(4) 2.1(2) 4.0(4) Ｐｒｏ 2.1(2) Gly 3.0(3) 1.1(1) Ａｌａ 3.0(3) 1.1(1) 1/2Ｃｙｓ 2.8(3) 1.8(2) Ｖａｌ 1.6(2) 1.0(1) 2.9(3) 1.0(1) Ｉｌｅ 0.7(1) 2.8(3) 1.9(2) 0.9(1) Ｌｅｕ 2.0(2) 3.0(3) 1.0(1) Ｔｙｒ 1.9(2) 1.0(1) 2.0(2) Ｐｈｅ 1.0(1) 1.0(1) 2.0(2) 3.0(3) Ｌｙｓ 5.7(6) 1.0(1) 4.9(5) 0.9(1) Ｈｉｓ 0.9(1) Ａｒｇ 0.9(1) 1.0(1) 0.9(1) ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ６規定塩酸で減圧封管中、１１０℃、２４時間加水分解
後アミノ酸分析に付した。ただし、Ｃｙｓは過蟻酸酸化
後システイン酸として定量した。 ペプチド１：Lys-Asp-Glu-Val-Ile-Lys-Glu-Val-Gln-Gl
u-Phe-Tyr-Lys-Asp-Thr-Tyr-Asn-Lys-Leu-Lys-Thr-Lys-
Asp-Glu-Pro-Gln-Arg-Glu-Thr-Leu 保持時間：19.0分〔0分(74%A+26%B)−30分(59%A+41%B),
0.7ml/分〕 〔配列番号１のアミノ酸残基番号113〜142の配列〕 ペプチド２：Gln-Arg-Glu-Thr-Leu-Lys-Ala-Ile-His-Ty
r-Ala-Leu-Asn-Cys-Cys-Gly-Leu-Ala-Gly-Gly-Val-Glu-
Gln-Phe-Ile-Ser-Asp-Ile-Cys 保持時間：28.2分 〔配列番号１のアミノ酸残基番
号131〜166の配列〕 ペプチド３：Ser-Asp-Ile-Cys-Pro-Lys-Lys-Asp-Val-Le
u-Glu-Thr-Phe-Thr-Val-Lys-Ser-Cys-Pro-Asp-Ala-Ile-
Lys-Glu-Val-Phe-Asp-Asn-Lys- 保持時間：16.0分 〔配列番号１のアミノ酸残基番
号163〜191の配列〕 ペプチド４：Arg-Phe-Asp-Ser-Gln-Thr-Lys-Ser-Ile-Ph
e-Glu-Gln-Glu-Thr-Asn-Asn-Asn-Asn-Ser-Ser-Phe-Tyr-
Thr-Gly-Val-Tyr 保持時間：24.3分[0.7ml/分][配列番号１のアミノ酸残
基番号35〜60の配列〕 ペプチド１，３は１ｍｇ/ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解
し、ペプチド２は５％酢酸に溶解し、ＲＰＭＩ１６４０
培地で希釈し以下の実験に用いた。

【００４４】試験例４ Ｍフラグメントペプチドによる
癌細胞の運動能の抑制 ＭＡＣ１０細胞は培養フラスコから０.０１％ ＥＤＴＡ
および０.１２５％ トリプシンを含むＰＢＳではがし、
１０％ ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０ついでＲＰＭＩ１６
４０培地で２回洗った後、５×10⁵/ｍｌの濃度（ＦＢＳ
濃度 ０.０５％）に懸濁した。Transwell plate(Corsta
r;Cambridge、MA)の下室に実施例１３で得られたペプチ
ド２および３(１０−１０００ｎｇ/ｍｌ)を含む０.１％
ＦＢＳ/ＲＰＭＩ１６４０培地 ０.６ｍｌを加え、上室
に０.１ｍｌのＭＡＣ１０細胞懸濁液を加え、３７℃で
１６時間培養した。メンブレンを通過して下室の培地中
に遊走した細胞を位相差顕微鏡により細胞数を計測し
た。〔図１３〕に示す様にペプチド２および３に濃度依
存的に抑制活性が認められた。

【００４５】試験例５ Ｍ発現による運動能の変化 i) ＣＨＯ細胞クロ−ン 実施例１１で得られたＣＨＯ細胞のクロ−ンについて、
試験例４に記載の方法を用いて測定した運動能の値を
〔図１４〕に示す。親株(ＣＨＯ)に比べてＭの発現した
クロ−ンでは著しい運動能の低下が認められた。 ii) ＭＡＣ１０細胞クロ−ン 実施例１１で得られたＭＡＣ１０クロ−ンのうちいくつ
かについて、試験例４に記載の方法を用いて測定した運
動能の値を実施例１２で得たＭの発現量と併せて〔表
７〕示す。Ｍの過剰発現により運動能の低下が認められ
た。

【表７】 ────────────────────────────── 遊走細胞数 Ｍ ───────────── (U/mg) 実験１ 実験２ ────────────────────────────── ＭＡＣ１０ 208±23(100%) 235±33(100%) 1.0 クローン1 83±10( 40%) 102±23( 42%) 3.2 クローン4 205±10( 99%) 188±27( 80%) 1.1 クローン9 73±23( 35%) 150±18( 64%) 2.4 ────────────────────────────── ｎ=３ ±SD

【００４６】

【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は癌細胞、
特に肺癌細胞およびグリア芽腫細胞の運動能を抑制す
る、極めて優れた性質を有する。本発明のポリペプチド
Ｍは種々のヒト癌細胞表面に存在し、癌細胞の運動能に
関与する重要な役割を果たしている。従って本発明のモ
ノクローナル抗体、ペプチドあるいはそのペプチド断片
はいずれも癌細胞の転移を抑制する薬剤として非常に有
効である。

【００４７】

【配列表】配列番号（SEQ ID NO)：1 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：227 配列の型(SEQUENCE TYPE)：amino acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：protein 配列： Pro Val Lys Gly Gly Thr Lys Cys Ile Lys Tyr Leu Leu Phe Gly Phe 1 5 10 15 Asn Phe Ile Phe Trp Leu Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile Gly Leu 20 25 30 Trp Leu Arg Phe Asp Ser Gln Thr Lys Ser Ile Phe Glu Gln Glu Thr 35 40 45 Asn Asn Asn Asn Ser Ser Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Ile Leu Ile Gly 50 55 60 Ala Gly Ala Leu Met Met Leu Val Gly Phe Leu Gly Cys Cys Gly Ala 65 70 75 80 Val Gln Glu Ser Gln Cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe Leu Leu 85 90 95 Val Ile Phe Ala Ile Glu Ile Ala Ala Ala Ile Trp Gly Tyr Ser His 100 105 110 Lys Asp Glu Val Ile Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp Thr Tyr 115 120 125 Asn Lys Leu Lys Thr Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu Lys Ala 130 135 140 Ile His Tyr Ala Leu Asn Cys Cys Gly Leu Ala Gly Gly Val Glu Gln 145 150 155 160 Phe Ile Ser Asp Ile Cys Pro Lys Lys Asp Val Leu Glu Thr Phe Thr 165 170 175 Val Lys Ser Cys Pro Asp Ala Ile Lys Glu Val Phe Asp Asn Lys Phe 180 185 190 His Ile Ile Gly Ala Val Gly Ile Gly Ile Ala Val Val Met Ile Phe 195 200 205 Gly Met Ile Phe Ser Met Ile Leu Cys Cys Ala Ile Arg Arg Asn Arg 210 215 220 Glu Met Val 225 227

【００４８】配列番号（SEQ ID NO)：2 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：682 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：double トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：cDNA to genomic RNA ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：Noアンチセンス (ANTI-SENCE)：No 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：human 細胞の種類(CELL TYPE)：breast carcinoma セルライン(CELL LINE）：ZR-75-1 配列: ATGCCGGTCA AAGGAGGCAC CAAGTGCATC AAATACCTGC TGTTCGGATT TAACTTCATC 60 TTCTGGCTTG CCGGGATTGC TGTCCTTGCC ATTGGACTAT GGCTCCGATT CGACTCTCAG 120 ACCAAGAGCA TCTTCGAGCA AGAAACTAAT AATAATAATT CCAGCTTCTA CACAGGAGTC 180 TATATTCTGA TCGGAGCCGG CGCCCTCATG ATGCTGGTGG GCTTCCTGGG CTGCTGCGGG 240 GCTGTGCAGG AGTCCCAGTG CATGCTGGGA CTGTTCTTCG GCTTCCTCTT GGTGATATTC 300 GCCATTGAAA TAGCTGCGGC CATCTGGGGA TATTCCCACA AGGATGAGGT GATTAAGGAA 360 GTCCAGGAGT TTTACAAGGA CACCTACAAC AAGCTGAAAA CCAAGGATGA GCCCCAGCGG 420 GAAACGCTGA AAGCCATCCA CTATGCGTTG AACTGCTGTG GTTTGGCTGG GGGCGTGGAA 480 CAGTTTATCT CAGACATCTG CCCCAAGAAG GACGTACTCG AAACCTTCAC CGTGAAGTCC 540 TGTCCTGATG CCATCAAAGA GGTCTTCGAC AATAAATTCC ACATCATCGG CGCAGTGGGC 600 ATCGGCATTG CCGTGGTCAT GATATTTGGC ATGATCTTCA GTATGATCTT GTGCTGTGCT 660 ATCCGCAGGA ACCGCGAGAT GGTCTAG 687

【００４９】配列番号（SEQ ID NO)：3 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：1120 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：double トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：cDNA to genomic RNA ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：No アンチセンス(ANTI-SENCE)：No 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：ｈｕｍａｎ 細胞の種類（ＣＥＬＬ ＴＹＰＥ）：breast carcinoma セルライン(CELL LINE）：ZR-75-1 配列の特徴（FEATURE)115..795 E Mat peptide 配列: GACCAGCCTA CAGCCGCCTG CATCTGTATC CAGCGCCAGG TCCTGCCAGT CCCAGCTGCG 60 CGCGCCCCCC AGTCCCGCAC CCGTTCGGCC CAGGCTAAGT TAGCCCTCAC C ATG CCG １
１７
Ｍｅｔ Ｐｒｏ
１ ＧＴＣ ＡＡＡ ＧＧＡ ＧＧＣ ＡＣＣ ＡＡＧ ＴＧＣ ＡＴＣ ＡＡＡ
ＴＡＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＴＴＣ ＧＧＡ ＴＴＴ ＡＡＣ １６５ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｙｓ
Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｓｎ ５ １０
１５ ＴＴＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＴＧＧ ＣＴＴ ＧＣＣ ＧＧＧ ＡＴＴ ＧＣＴ
ＧＴＣ ＣＴＴ ＧＣＣ ＡＴＴ ＧＧＡ ＣＴＡ ＴＧＧ ２１３ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｌａ
Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｒｐ ２０ ２５
３０ ＣＴＣ ＣＧＡ ＴＴＣ ＧＡＣ ＴＣＴ ＣＡＧ ＡＣＣ ＡＡＧ ＡＧＣ
ＡＴＣ ＴＴＣ ＧＡＧ ＣＡＡ ＧＡＡ ＡＣＴ ＡＡＴ ２６１ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ
Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ ３５ ４０
４５ ＡＡＴ ＡＡＴ ＡＡＴ ＴＣＣ ＡＧＣ ＴＴＣ ＴＡＣ ＡＣＡ ＧＧＡ
ＧＴＣ ＴＡＴ ＡＴＴ ＣＴＧ ＡＴＣ ＧＧＡ ＧＣＣ ３０９ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｌａ ５０ ５５
６０ ６５ ＧＧＣ ＧＣＣ ＣＴＣ ＡＴＧ ＡＴＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＧＣ ＴＴＣ
ＣＴＧ ＧＧＣ ＴＧＣ ＴＧＣ ＧＧＧ ＧＣＴ ＧＴＧ ３５７ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ ７０
７５ ８０ ＣＡＧ ＧＡＧ ＴＣＣ ＣＡＧ ＴＧＣ ＡＴＧ ＣＴＧ ＧＧＡ ＣＴＧ
ＴＴＣ ＴＴＣ ＧＧＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＴＴＧ ＧＴＧ ４０５ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ
Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ ８５ ９０
９５ ＡＴＡ ＴＴＣ ＧＣＣ ＡＴＴ ＧＡＡ ＡＴＡ ＧＣＴ ＧＣＧ ＧＣＣ
ＡＴＣ ＴＧＧ ＧＧＡ ＴＡＴ ＴＣＣ ＣＡＣ ＡＡＧ ４５３ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ
Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｙｓ １００ １０５
１１０ ＧＡＴ ＧＡＧ ＧＴＧ ＡＴＴ ＡＡＧ ＧＡＡ ＧＴＣ ＣＡＧ ＧＡＧ
ＴＴＴ ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＡＣ ＡＣＣ ＴＡＣ ＡＡＣ ５０１ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｕ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｓｎ １１５ １２０
１２５ ＡＡＧ ＣＴＧ ＡＡＡ ＡＣＣ ＡＡＧ ＧＡＴ ＧＡＧ ＣＣＣ ＣＡＧ
ＣＧＧ ＧＡＡ ＡＣＧ ＣＴＧ ＡＡＡ ＧＣＣ ＡＴＣ ５４９ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ
Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ １３０ １３５
１４０ １４５ ＣＡＣ ＴＡＴ ＧＣＧ ＴＴＧ ＡＡＣ ＴＧＣ ＴＧＴ ＧＧＴ ＴＴＧ
ＧＣＴ ＧＧＧ ＧＧＣ ＧＴＧ ＧＡＡ ＣＡＧ ＴＴＴ ５９７ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｐｈｅ １５０
１５５ １６０ ＡＴＣ ＴＣＡ ＧＡＣ ＡＴＣ ＴＧＣ ＣＣＣ ＡＡＧ ＡＡＧ ＧＡＣ
ＧＴＡ ＣＴＣ ＧＡＡ ＡＣＣ ＴＴＣ ＡＣＣ ＧＴＧ ６４５ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ
Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ １６５ １７０
１７５ ＡＡＧ ＴＣＣ ＴＧＴ ＣＣＴ ＧＡＴ ＧＣＣ ＡＴＣ ＡＡＡ ＧＡＧ
ＧＴＣ ＴＴＣ ＧＡＣ ＡＡＴ ＡＡＡ ＴＴＣ ＣＡＣ ６９３ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ
Ｖａｌ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｈｉｓ １８０ １８５
１９０ ＡＴＣ ＡＴＣ ＧＧＣ ＧＣＡ ＧＴＧ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＧＣ ＡＴＴ
ＧＣＣ ＧＴＧ ＧＴＣ ＡＴＧ ＡＴＡ ＴＴＴ ＧＧＣ ７４１ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ
Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｙ １９５ ２００
２０５ ＡＴＧ ＡＴＣ ＴＴＣ ＡＧＴ ＡＴＧ ＡＴＣ ＴＴＧ ＴＧＣ ＴＧＴ
ＧＣＴ ＡＴＣ ＣＧＣ ＡＧＧ ＡＡＣ ＣＧＣ ＧＡＧ ７８９ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｃｙｓ
Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｇｌｕ ２１０ ２１５
２２０ ２２５ ＡＴＧ ＧＴＣ ＴＡＧＡＧＴＣＡＧＣ ＴＴＡＣＡＴＣＣＣＴ ＧＡＧＣＡＧ
ＧＡＡＡ ＧＴＴＴＡＣＣＣＡＴ ＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴ ８４５ Ｍｅｔ Ｖａｌ
ＧＧＧＡＴＴＴＴＴＴ ＧＴＴＴＧＴＴＴＧＴ ＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴ ＴＴＧ
ＴＴＧＴＴＴＧ ＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴ ＴＴＴＴＧＣＣＡＣＴ ９０５ ＡＡＴＴＴＴＡＧＴＡ ＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣ ＡＴＴＧＣＴＡＧＡＴ ＡＡＡ
ＡＧＣＴＧＡＡ ＧＴＴＡＣＴＴＴＡＴ ＧＴＴＴＧＴＣＴＴＴ ９６５ ＴＡＡＴＧＣＴＴＣＡ ＴＴＣＡＡＴＡＴＴＧ ＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧ ＴＴＧ
ＡＧＣＧＧＧＧ ＧＧＴＴＴＧＧＴＴＴ ＧＣＴＴＴＧＧＴＴＴ １０２５ ＡＴＡＴＴＴＴＴＴＣ ＡＧＴＴＧＴＴＴＧＴ ＴＴＴＴＧＣＴＴＧＴ ＴＡＴ
ＡＴＴＡＡＧＣ ＡＧＡＡＡＴＣＣＴＧ ＣＡＡＴＧＡＡＡＧＧ １０８５ ＴＡＣＴＡＴＡＴＴＴ ＧＣＴＡＧＡＣＴＣＴ ＡＧＡＣＡＡＧＡＴＡ ＴＴＧ
ＴＡ １１２０

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例４に於けるウェスタンブロット分析の結
果を示した図である。

【図２】試験例２に於ける本発明の精製抗体によるＭＡ
Ｃ１０細胞の運動能の抑制結果を示した図である。

【図３】実施例５に於けるウェスタンブロット分析の結
果を示した図である。

【図４】実施例２で得られた陽性クローンのｃＤＮＡの
塩基配列およびその配列より推測されるアミノ酸配列を
示す。

【図５】実施例２で得られた陽性クローンのｃＤＮＡの
塩基配列およびその配列より推測されるアミノ酸配列を
示す。

【図６】実施例２で得られた陽性クローンのｃＤＮＡの
塩基配列およびその配列より推測されるアミノ酸配列を
示す。

【図７】実施例２で得られた陽性クローンのｃＤＮＡの
塩基配列およびその配列より推測されるアミノ酸配列を
示す。

【図８】実施例２で得られた陽性クローンのｃＤＮＡの
塩基配列およびその配列より推測されるアミノ酸配列を
示す。

【図９】実施例２で得られた陽性クローンのｃＤＮＡの
塩基配列およびその配列より推測されるアミノ酸配列を
示す。

【図１０】実施例２に於て構築したｐＴＢ１３５２の遺
伝子マップ

【図１１】実施例５に於て構築したＭ発現用プラスミド
ｐＴＢ１４４２の制限酵素地図を示した図である。

【図１２】実施例６に於けるＣＨＯ（ｄｈｆｒ￣）細胞
およびそのＭ発現クロ−ンのFACStar解析図である。

【図１３】試験例１に於けるＭフラグメントペプチドに
よるＭＡＣ１０細胞の運動能の抑制結果を示した図であ
る。

【図１４】試験例２に於けるＣＨＯ(dhfr~)細胞および
そのＭ発現クロ−ンの運動能を示した図である。

【符号の説明】

１ 図２においてコンロールゲル（上清）、図３におい
て分子量マーカーを示す。 ２ 図２においてコンロールゲル（ＳＤＳ溶出液）を図
３において、ＭＩＡＰaＣa−２を示す。 ３ 図２において抗体−ＡｆｆｉＧｅｌ １０（上清）
を図３において、ＭＡＣ１０を示す。 ４ 図２において抗体−ＡｆｆｉＧｅｌ １０（ＳＤＳ
溶出液）、図３においてＨＥＬを示す。 ５ 図２において分子量マーカー、図３においてＡＺ５
２１を示す。 ６ ＺＲ−７５−３０

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:91 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 三宅 正幸 京都府京都市伏見区醍醐大畑町76 (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，1991年 ４月 ２日，30［13］，ｐ．3328−3334 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｃｅａｒｃｈ, 1990年，50［15］，ｐ．4485−4496 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＢＩＯＳＩＳ−ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (20)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１のアミノ酸配列からなるポリ
   ペプチドを認識し、ヒト癌細胞の運動能を抑制する抗ヒ
   ト癌モノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 ヒト癌細胞が、ヒト肺癌細胞である請求
   項１記載のモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 ヒト癌細胞が、ヒトグリア芽細胞腫であ
   る請求項１記載のモノクローナル抗体。
4. 【請求項４】 配列番号１のアミノ酸残基番号１３１〜
   １６６または１６３〜１９１の配列からなり、かつ癌細
   胞の運動能抑制作用を示すポリペプチド。
5. 【請求項５】 配列番号１のアミノ酸配列からなるポリ
   ペプチド。
6. 【請求項６】 配列番号１のアミノ酸配列をコードする
   塩基配列を含有する組み換えＤＮＡ。
7. 【請求項７】 請求項６記載の組み換えＤＮＡを含有す
   るベクター。
8. 【請求項８】 請求項７記載のベクターで形質転換され
   た形質転換体。
9. 【請求項９】 配列番号１のアミノ酸配列をコードする
   塩基配列を含有するベクターで形質転換された形質転換
   体を培養し、培養物中に該アミノ酸配列を含有するポリ
   ペプチドを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴
   とする該ポリペプチドの製造法。
10. 【請求項１０】 請求項１記載のモノクローナル抗体を
    含有してなる癌転移抑制剤。
11. 【請求項１１】 請求項４または５記載のポリペプチド
    を含有してなる癌転移抑制剤。
12. 【請求項１２】 Ｍ３１−１５で表示される請求項１記
    載のモノクローナル抗体（ＦＥＲＭ ＢＰ−３３４
    ９）。
13. 【請求項１３】 請求項１２記載のモノクローナル抗体
    を産生するマウスハイブリドーマＭ３１−１５（ＦＥＲ
    Ｍ ＢＰ−３３４９）。
14. 【請求項１４】 配列番号１のアミノ酸残基番号１３１
    〜１６６または１６３〜１９１の配列からなるポリペプ
    チド。
15. 【請求項１５】 配列番号１のアミノ酸残基番号１３１
    〜１６６または１６ ３〜１９１の配列をコードする塩基
    配列を含有する組み換えＤＮＡ。
16. 【請求項１６】 請求項１５記載の組み換えＤＮＡを含
    有するベクター。
17. 【請求項１７】 請求項１６記載のベクターで形質転換
    された形質転換体。
18. 【請求項１８】 配列番号１のアミノ酸残基番号１３１
    〜１６６または１６３〜１９１の配列からなるポリペプ
    チドをコードする塩基配列を含有するベクターで形質転
    換された形質転換体を培養し、培養物中に該アミノ酸配
    列を含有するポリペプチドを生成蓄積せしめ、これを採
    取することを特徴とする該ポリペプチドの製造法。
19. 【請求項１９】 請求項１２記載のモノクローナル抗体
    を含有してなる癌転移抑制剤。
20. 【請求項２０】 請求項１４記載のポリペプチドを含有
    してなる癌転移抑制剤。