JPH07132084A - Ｈｅｒ４ヒト受容体チロシンキナーゼ - Google Patents
Ｈｅｒ４ヒト受容体チロシンキナーゼInfo
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- JPH07132084A JPH07132084A JP5317374A JP31737493A JPH07132084A JP H07132084 A JPH07132084 A JP H07132084A JP 5317374 A JP5317374 A JP 5317374A JP 31737493 A JP31737493 A JP 31737493A JP H07132084 A JPH07132084 A JP H07132084A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/4756—Neuregulins, i.e. p185erbB2 ligands, glial growth factor, heregulin, ARIA, neu differentiation factor
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ＨＥＲ４／ｐ１８０erbB4 （ＨＥＲ４）ヒト
受容体チロシンキナーゼに関連する組換えポリヌクレオ
チド及び対応するポリペプチドを提供する。 【構成】 ＨＥＲ４／ｐ１８０erbB4 と呼ぶ表皮生育因
子受容体に関連するヌクレオチド配列及びアミノ酸配列
は、配列番号：１及び２に示す通りである。本発明は、
ＨＥＲ４をコードするポリヌクレオチド、そのポリペプ
チド、そのエピトープを認識する抗ＨＥＲ４抗体、ＨＥ
Ｒ４と相互作用するリガンド、更にはこのＨＥＲ４と関
連する診断及び、治療的使用に関する。
受容体チロシンキナーゼに関連する組換えポリヌクレオ
チド及び対応するポリペプチドを提供する。 【構成】 ＨＥＲ４／ｐ１８０erbB4 と呼ぶ表皮生育因
子受容体に関連するヌクレオチド配列及びアミノ酸配列
は、配列番号：１及び２に示す通りである。本発明は、
ＨＥＲ４をコードするポリヌクレオチド、そのポリペプ
チド、そのエピトープを認識する抗ＨＥＲ４抗体、ＨＥ
Ｒ４と相互作用するリガンド、更にはこのＨＥＲ４と関
連する診断及び、治療的使用に関する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、一般にＨＥＲ４／ｐ１
８０erbB4 （「ＨＥＲ４」）と呼ばれる表皮生育因子受
容体に関連する新規な受容体チロシンキナーゼ、および
ＨＥＲ４誘導またはＨＥＲ４関連生物学的成分からなる
新規な診断または治療組成物に関する。本発明は、部分
的にはヒトＨＥＲ４、その完全なヌクレオチドコード配
列、およびＨＥＲ４受容体蛋白質の機能的特性の本出願
人の発見に基くものである。更に詳しくは、この発明
は、例えばＨＥＲ４をコードするポリヌクレオチド分
子、ＨＥＲ４ポリペプチド、ＨＥＲ４ポリペプチドのエ
ピトープを認識する抗ＨＥＲ４抗体、ＨＥＲ４と相互作
用するリガンド、並びに基本的にこの種の分子に基く診
断および治療組成物および方法を含むＨＥＲ４の生物学
に関する。幾つかのヒトのガンや神経および筋肉起源の
ある種の組織におけるＨＥＲ４の発現の観点から、本発
明は、有効な生物学的治療を設計し得る枠組みを提供す
るものである。部分的にはこの発明の種々の観点および
その特定の態様を特に示す実験例により、本発明を後に
詳細に説明する。
８０erbB4 （「ＨＥＲ４」）と呼ばれる表皮生育因子受
容体に関連する新規な受容体チロシンキナーゼ、および
ＨＥＲ４誘導またはＨＥＲ４関連生物学的成分からなる
新規な診断または治療組成物に関する。本発明は、部分
的にはヒトＨＥＲ４、その完全なヌクレオチドコード配
列、およびＨＥＲ４受容体蛋白質の機能的特性の本出願
人の発見に基くものである。更に詳しくは、この発明
は、例えばＨＥＲ４をコードするポリヌクレオチド分
子、ＨＥＲ４ポリペプチド、ＨＥＲ４ポリペプチドのエ
ピトープを認識する抗ＨＥＲ４抗体、ＨＥＲ４と相互作
用するリガンド、並びに基本的にこの種の分子に基く診
断および治療組成物および方法を含むＨＥＲ４の生物学
に関する。幾つかのヒトのガンや神経および筋肉起源の
ある種の組織におけるＨＥＲ４の発現の観点から、本発
明は、有効な生物学的治療を設計し得る枠組みを提供す
るものである。部分的にはこの発明の種々の観点および
その特定の態様を特に示す実験例により、本発明を後に
詳細に説明する。
【０００２】
【従来の技術】実質的に全ての組織形態の細胞が、固有
のチロシンキナーゼ活性を有する膜横断受容体分子を発
現し、これを介して種々の生育および分化因子により所
定範囲の生物学的効果が媒介される（アーロンソン、１
９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１１４６−５２の総
説）。この群の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に包
含されるものには、ポリペプチド生育因子のための受容
体、例えば表皮生育因子（ＥＧＦ）、インシュリン、血
小板誘導生育因子（ＰＤＧＦ）、ニューロトロフィン
（すなわちＮＧＦ）および繊維芽細胞生育因子（ＥＧ
Ｆ）がある。最近、幾つかの先に特徴付けられた受容体
についてのリガンドが同定されたが、これに含まれるの
はｃ−ｋｉｔ（スチール因子）、ｍｅｔ（肝細胞生育因
子）、ｔｒｋ（神経生育因子）のリガンドである（それ
ぞれズセボら、１９９０，Ｃｅｌｌ ６３：１９５−２
０１、ボタルドら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５
１：８０２−０４、カプランら、１９９１，Ｎａｔｕｒ
ｅ ３５０：１５８−１６０を参照）。また、可溶性因
子ＮＤＦ、またはヘレグリン−アルファ（ＨＲＧ−α）
が、ＨＥＲ４に高度に関連する受容体であるＨＥＲ２の
リガンドとして同定された（ウェンら、１９９２，Ｃｅ
ｌｌ ６９：５５９−７２、ホルメスら、１９９２，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２６５：１２０５−１０）。しかしなが
ら、現在、多数の単離されかつ／または特徴付けられた
受容体チロシンキナーゼについてのリガンドがなお同定
されておらず、これにはｅｐｈ、ｅｃｋ、ｅｌｋ、ｒｅ
ｔおよびＨＥＲ３受容体についてのものが含まれる。
のチロシンキナーゼ活性を有する膜横断受容体分子を発
現し、これを介して種々の生育および分化因子により所
定範囲の生物学的効果が媒介される（アーロンソン、１
９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１１４６−５２の総
説）。この群の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に包
含されるものには、ポリペプチド生育因子のための受容
体、例えば表皮生育因子（ＥＧＦ）、インシュリン、血
小板誘導生育因子（ＰＤＧＦ）、ニューロトロフィン
（すなわちＮＧＦ）および繊維芽細胞生育因子（ＥＧ
Ｆ）がある。最近、幾つかの先に特徴付けられた受容体
についてのリガンドが同定されたが、これに含まれるの
はｃ−ｋｉｔ（スチール因子）、ｍｅｔ（肝細胞生育因
子）、ｔｒｋ（神経生育因子）のリガンドである（それ
ぞれズセボら、１９９０，Ｃｅｌｌ ６３：１９５−２
０１、ボタルドら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５
１：８０２−０４、カプランら、１９９１，Ｎａｔｕｒ
ｅ ３５０：１５８−１６０を参照）。また、可溶性因
子ＮＤＦ、またはヘレグリン−アルファ（ＨＲＧ−α）
が、ＨＥＲ４に高度に関連する受容体であるＨＥＲ２の
リガンドとして同定された（ウェンら、１９９２，Ｃｅ
ｌｌ ６９：５５９−７２、ホルメスら、１９９２，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２６５：１２０５−１０）。しかしなが
ら、現在、多数の単離されかつ／または特徴付けられた
受容体チロシンキナーゼについてのリガンドがなお同定
されておらず、これにはｅｐｈ、ｅｃｋ、ｅｌｋ、ｒｅ
ｔおよびＨＥＲ３受容体についてのものが含まれる。
【０００３】種々のヒト悪性疾患と生育因子受容体チロ
シンキナーゼシグナル経路の遺伝的異常との間の生物学
的関係が存在することが知られている。最も注目すべき
この種の関係の中には、受容体チロシンキナーゼのＥＧ
Ｆ受容体（ＥＧＦＲ）系統群が含まれる（アーロンソ
ン、前記参照）。３つのヒトＥＧＦＲ系統群の構成員が
すでに同定されており、当業者に知られている：ＥＧＦ
Ｒ、ＨＥＲ２／ｐ１８５erbB2 およびＨＥＲ３／ｐ１６
０erbB3 である（それぞれウルリッチら、１９８４，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３０９：４１８−２５、コウセンスら、１
９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１１３２−３９、お
よびプロウマンら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：４９０５−０９を
参照）。他の種に由来するＥＧＲＦ関連分子も同定され
ている。他のＥＧＦＲ系統群の構成員の完全なヌクレオ
チドコード配列も他の生物から決定されており、これに
はショウジョウバエＥＧＦＲ（「ＤＥＲ」：リブネー・
イーら、１９８５，Ｃｅｌｌ ４０：５９９−６０
７）、線虫類ＥＧＦＲ（「ｌｅｔ−２３」：アロイアン
・アール・ブイら、１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：
６９３−６９８）、ニワトリＥＧＦＲ（「ＣＥＲ」：ラ
ックス・アイら、１９８８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．８：１９７０−１９７８）、ラットＥＧＦＲ（ペッ
チ・エル・エーら、１９９０，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１０：２９７３−２９８２）、ラットＨＥＲ２／
ｎｅｕ（バーグマン・シー・アイら、１９８６，Ｎａｔ
ｕｒｅ，３１９：２２６−２３０）および魚類から単離
されキシホホラス（Xiphophorus ）メラノーマ関連キナ
ーゼと命名された新規な構成員（「Ｘｍｒｋ」：ウィッ
トブロット・ジェイら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４
２：４１５−４２１）が含まれる。また、ＰＣＲ技術に
より、新規な受容体をコードし得るか、公知の受容体の
種特異的相同体を表し得る他の短いＤＮＡ断片が単離さ
れるに至っている。最近の例の１つに、ＥＧＦＲ系統群
に最も関連する５４のアミノ酸をコードする断片である
ｔｙｒｏ−２の単離がある（ライ・シーとレムケ・ジ
ー、１９９１，Ｎｅｕｒｏｎ ６：６９１−７０４）。
シンキナーゼシグナル経路の遺伝的異常との間の生物学
的関係が存在することが知られている。最も注目すべき
この種の関係の中には、受容体チロシンキナーゼのＥＧ
Ｆ受容体（ＥＧＦＲ）系統群が含まれる（アーロンソ
ン、前記参照）。３つのヒトＥＧＦＲ系統群の構成員が
すでに同定されており、当業者に知られている：ＥＧＦ
Ｒ、ＨＥＲ２／ｐ１８５erbB2 およびＨＥＲ３／ｐ１６
０erbB3 である（それぞれウルリッチら、１９８４，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３０９：４１８−２５、コウセンスら、１
９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１１３２−３９、お
よびプロウマンら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：４９０５−０９を
参照）。他の種に由来するＥＧＲＦ関連分子も同定され
ている。他のＥＧＦＲ系統群の構成員の完全なヌクレオ
チドコード配列も他の生物から決定されており、これに
はショウジョウバエＥＧＦＲ（「ＤＥＲ」：リブネー・
イーら、１９８５，Ｃｅｌｌ ４０：５９９−６０
７）、線虫類ＥＧＦＲ（「ｌｅｔ−２３」：アロイアン
・アール・ブイら、１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：
６９３−６９８）、ニワトリＥＧＦＲ（「ＣＥＲ」：ラ
ックス・アイら、１９８８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．８：１９７０−１９７８）、ラットＥＧＦＲ（ペッ
チ・エル・エーら、１９９０，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１０：２９７３−２９８２）、ラットＨＥＲ２／
ｎｅｕ（バーグマン・シー・アイら、１９８６，Ｎａｔ
ｕｒｅ，３１９：２２６−２３０）および魚類から単離
されキシホホラス（Xiphophorus ）メラノーマ関連キナ
ーゼと命名された新規な構成員（「Ｘｍｒｋ」：ウィッ
トブロット・ジェイら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４
２：４１５−４２１）が含まれる。また、ＰＣＲ技術に
より、新規な受容体をコードし得るか、公知の受容体の
種特異的相同体を表し得る他の短いＤＮＡ断片が単離さ
れるに至っている。最近の例の１つに、ＥＧＦＲ系統群
に最も関連する５４のアミノ酸をコードする断片である
ｔｙｒｏ−２の単離がある（ライ・シーとレムケ・ジ
ー、１９９１，Ｎｅｕｒｏｎ ６：６９１−７０４）。
【０００４】ＥＧＦＲ系統群受容体の過剰発現は、多様
な侵攻性ヒト上皮カルシノーマにおいてしばしば観察さ
れる。特に、ＥＧＦＲの増加した発現は、胸部、膀胱、
肺および胃の更に侵攻性のカルシノーマに随伴するもの
である（例えば、ニールら、１９８５，Ｌａｎｃｅｔ
１：３６６−６８、サインスブリーら、１９８７，Ｌａ
ｎｃｅｔ １：１３９８−１４０２、ヤスイら、１９８
８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４１：２１１−１７、
ビールら、１９８７，Ｃａｎｃｅｒ ５５：５１３−１
６を参照）。また、ＨＥＲ２の増幅および過剰発現は、
広範な種類のヒト悪性疾患、特に胸部および卵巣カルシ
ノーマに随伴し、これについてはＨＥＲ２過剰発現と不
十分な臨床予後および／または増加した再発の蓋然性と
の間の強い相関が確立されている（例えば、スラモン
ら、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：１７７−８
２、および１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：７０７
−１２を参照）。ＨＥＲ２の過剰発現は他のヒトカルシ
ノーマにも相関しており、これには胃、子宮内膜、唾液
腺、膀胱および肺のカルシノーマが含まれる（ヨコタ
ら、１９８６，Ｌａｎｃｅｔ １：７６５−６７、フク
シゲら、１９８６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：
９５５−５８、ヨネムラら、１９９１，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．５１：１０３４、ウェイナーら、１９９０，Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：４２１−２５、ゲウリン
ら、１９８８，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓ．３：２１−
３１、センバら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：６４９７−６５０
１、ザウら、１９９０，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．
３：３５４−５７、マカーンら、１９９０，Ｃａｎｃｅ
ｒ ６５：８８−９２）。最も最近では、ＨＥＲ２過剰
発現と胃カルシノーマとの間の潜在的な関連が報告され
ている（ジャエンら、１９９２，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１８：４７４−７
９）。最後に、最近記載されたＨＥＲ３受容体の増幅し
た発現が、広範な種類のヒトアデノカルシノーマで観察
されている（ポーラーら、１９９２，Ｊ．Ｐａｔｈ、印
刷中、クラウセら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：９１９３−９７、
ヨーロッパ特許出願第９１３０１７３７号、公開９．
４．９１，ＥＰ４４４９６１）。
な侵攻性ヒト上皮カルシノーマにおいてしばしば観察さ
れる。特に、ＥＧＦＲの増加した発現は、胸部、膀胱、
肺および胃の更に侵攻性のカルシノーマに随伴するもの
である（例えば、ニールら、１９８５，Ｌａｎｃｅｔ
１：３６６−６８、サインスブリーら、１９８７，Ｌａ
ｎｃｅｔ １：１３９８−１４０２、ヤスイら、１９８
８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４１：２１１−１７、
ビールら、１９８７，Ｃａｎｃｅｒ ５５：５１３−１
６を参照）。また、ＨＥＲ２の増幅および過剰発現は、
広範な種類のヒト悪性疾患、特に胸部および卵巣カルシ
ノーマに随伴し、これについてはＨＥＲ２過剰発現と不
十分な臨床予後および／または増加した再発の蓋然性と
の間の強い相関が確立されている（例えば、スラモン
ら、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：１７７−８
２、および１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：７０７
−１２を参照）。ＨＥＲ２の過剰発現は他のヒトカルシ
ノーマにも相関しており、これには胃、子宮内膜、唾液
腺、膀胱および肺のカルシノーマが含まれる（ヨコタ
ら、１９８６，Ｌａｎｃｅｔ １：７６５−６７、フク
シゲら、１９８６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：
９５５−５８、ヨネムラら、１９９１，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．５１：１０３４、ウェイナーら、１９９０，Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：４２１−２５、ゲウリン
ら、１９８８，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓ．３：２１−
３１、センバら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：６４９７−６５０
１、ザウら、１９９０，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．
３：３５４−５７、マカーンら、１９９０，Ｃａｎｃｅ
ｒ ６５：８８−９２）。最も最近では、ＨＥＲ２過剰
発現と胃カルシノーマとの間の潜在的な関連が報告され
ている（ジャエンら、１９９２，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１８：４７４−７
９）。最後に、最近記載されたＨＥＲ３受容体の増幅し
た発現が、広範な種類のヒトアデノカルシノーマで観察
されている（ポーラーら、１９９２，Ｊ．Ｐａｔｈ、印
刷中、クラウセら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：９１９３−９７、
ヨーロッパ特許出願第９１３０１７３７号、公開９．
４．９１，ＥＰ４４４９６１）。
【０００５】ＥＧＦＲに特異的に結合し得る幾つかの構
造的に関連した可溶性ポリペプチドが同定され特徴付け
られているが、これにはＥＧＦ、形質転換生育因子−ア
ルファ（ＴＧＦ−α）、アンフィレグリン（ＡＲ）、ヘ
パリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）、およびワクシニア
ウイルス生育因子（ＶＧＦ）が含まれる（それぞれサバ
ゲら、１９７２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４７：７
６１２−２１、マルカードら、１９８４，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２２３：１０７９−８２、ショヤブら、１９８９，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１０７４−７６、ヒガシヤマ
ら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：９３６−３
９、トワードジクら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：５３００−０４
を参照）。ＥＧＦＲ系統群の受容体の間の密接な構造的
関連性にも拘らず、これらのリガンドがＨＥＲ２または
ＨＥＲ３と相互作用することは決定的には示されていな
い。最近、幾つかのグループがＨＥＲ２についての特異
的なリガンドの同定を報告した。ｇｐ３０のようなこれ
らのリガンドの幾つか（ルプら、１９９０，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４９：１５５２−５５、バカスら、１９９２，
Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｉａｔｉｏｎ ３：４０１−１１）はＥＧＦＲおよびＨ
ＥＲ２の両者と相互作用するが、他のものはＨＥＲ２に
特異的に結合すると報告されている（ウェンら、１９９
２，Ｃｅｌｌ ６９：５５９−７２、ペレスら、１９９
２，Ｃｅｌｌ ６９：２０５−１６、ホルメスら、１９
９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１２０５−１０、ルプ
ら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：２２８７−９１、フアングら、
１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１１５０
８−１２１）。これらのリガンドの内で最も特徴付けら
れたものは、ｒａｓ形質転換Ｒａｔ１−ＥＪ細胞から精
製されクローン化されたｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）（ウ
ェンら、ペレスら、前記）、およびヒトＭＤＡ−ＭＢ２
３１細胞から精製されクローン化されたヘレグリン（Ｈ
ＲＦ−α、−β１、−β２、−β３）である（ホルメス
ら、前記）。ＮＤＦおよびＨＲＧ−αは９３％の配列同
一性を共有し、同一蛋白質のラットおよびヒト相同体で
あると考えられる。これらの蛋白質の両者は類似した大
きさであり（４４〜４５ｋＤａ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５
３細胞中でＨＥＲ２のチロシンリン酸化を増加させ（Ｅ
ＧＦ受容体はそうではない）、ヒト胸部ガン細胞上での
交差結合の検討においてＨＥＲ２に結合すると報告され
ている。また、ＮＤＦは、ヒト乳房腫瘍細胞の乳生産生
育停止細胞への分化を誘導することが示されているのに
対し、ヘレグリン系統群は、培養ヒト胸部ガン細胞モノ
レイヤーの増殖を刺激することが報告されている。
造的に関連した可溶性ポリペプチドが同定され特徴付け
られているが、これにはＥＧＦ、形質転換生育因子−ア
ルファ（ＴＧＦ−α）、アンフィレグリン（ＡＲ）、ヘ
パリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）、およびワクシニア
ウイルス生育因子（ＶＧＦ）が含まれる（それぞれサバ
ゲら、１９７２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４７：７
６１２−２１、マルカードら、１９８４，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２２３：１０７９−８２、ショヤブら、１９８９，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１０７４−７６、ヒガシヤマ
ら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：９３６−３
９、トワードジクら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：５３００−０４
を参照）。ＥＧＦＲ系統群の受容体の間の密接な構造的
関連性にも拘らず、これらのリガンドがＨＥＲ２または
ＨＥＲ３と相互作用することは決定的には示されていな
い。最近、幾つかのグループがＨＥＲ２についての特異
的なリガンドの同定を報告した。ｇｐ３０のようなこれ
らのリガンドの幾つか（ルプら、１９９０，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４９：１５５２−５５、バカスら、１９９２，
Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｉａｔｉｏｎ ３：４０１−１１）はＥＧＦＲおよびＨ
ＥＲ２の両者と相互作用するが、他のものはＨＥＲ２に
特異的に結合すると報告されている（ウェンら、１９９
２，Ｃｅｌｌ ６９：５５９−７２、ペレスら、１９９
２，Ｃｅｌｌ ６９：２０５−１６、ホルメスら、１９
９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１２０５−１０、ルプ
ら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：２２８７−９１、フアングら、
１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１１５０
８−１２１）。これらのリガンドの内で最も特徴付けら
れたものは、ｒａｓ形質転換Ｒａｔ１−ＥＪ細胞から精
製されクローン化されたｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）（ウ
ェンら、ペレスら、前記）、およびヒトＭＤＡ−ＭＢ２
３１細胞から精製されクローン化されたヘレグリン（Ｈ
ＲＦ−α、−β１、−β２、−β３）である（ホルメス
ら、前記）。ＮＤＦおよびＨＲＧ−αは９３％の配列同
一性を共有し、同一蛋白質のラットおよびヒト相同体で
あると考えられる。これらの蛋白質の両者は類似した大
きさであり（４４〜４５ｋＤａ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５
３細胞中でＨＥＲ２のチロシンリン酸化を増加させ（Ｅ
ＧＦ受容体はそうではない）、ヒト胸部ガン細胞上での
交差結合の検討においてＨＥＲ２に結合すると報告され
ている。また、ＮＤＦは、ヒト乳房腫瘍細胞の乳生産生
育停止細胞への分化を誘導することが示されているのに
対し、ヘレグリン系統群は、培養ヒト胸部ガン細胞モノ
レイヤーの増殖を刺激することが報告されている。
【０００６】受容体ポリペプチドがリガンド結合に応答
して制御シグナルを形質導入する手段は完全には理解さ
れておらず、集中的な検討主題であり続けている。しか
しながら、このプロセスの重要な構成要素は明らかにさ
れており、これには細胞表面受容体のこれによるリン酸
化がシグナル形質導入において基本的な役割を担うとい
う理解が含まれる。シグナル過程におけるリン酸化の関
与に加えて、受容体二量体化および受容体クロストーク
の細胞内現象が、リガンド結合が結果的な細胞応答の引
金となる回路の一次構成要素として機能する。膜横断受
容体チロシンキナーゼへのリガンド結合により受容体二
量体化が誘導され、隣接する細胞質ドメインの相互作用
を介してキナーゼ機能の活性化に至る。受容体クロスト
ークは、例えば他方のキナーゼ活性の関与する機構によ
る一方の受容体の活性化により媒介される２以上の近接
する受容体分子間の細胞内通信を指す。この種の現象の
特に関連する１つの例はＥＧＦＲへのＥＧＦの結合であ
り、この結果ＥＧＦＲキナーゼドメインの活性化および
ＨＥＲ２の交差リン酸化が与えられる（コカイら、１９
８９，Ｃｅｌｌ ５８：２８７−９２、ステーンら、１
９８８，ＥＭＢＯＪ．７：９９５−１００１、キング
ら、１９８９，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ４：１３−１８）。
して制御シグナルを形質導入する手段は完全には理解さ
れておらず、集中的な検討主題であり続けている。しか
しながら、このプロセスの重要な構成要素は明らかにさ
れており、これには細胞表面受容体のこれによるリン酸
化がシグナル形質導入において基本的な役割を担うとい
う理解が含まれる。シグナル過程におけるリン酸化の関
与に加えて、受容体二量体化および受容体クロストーク
の細胞内現象が、リガンド結合が結果的な細胞応答の引
金となる回路の一次構成要素として機能する。膜横断受
容体チロシンキナーゼへのリガンド結合により受容体二
量体化が誘導され、隣接する細胞質ドメインの相互作用
を介してキナーゼ機能の活性化に至る。受容体クロスト
ークは、例えば他方のキナーゼ活性の関与する機構によ
る一方の受容体の活性化により媒介される２以上の近接
する受容体分子間の細胞内通信を指す。この種の現象の
特に関連する１つの例はＥＧＦＲへのＥＧＦの結合であ
り、この結果ＥＧＦＲキナーゼドメインの活性化および
ＨＥＲ２の交差リン酸化が与えられる（コカイら、１９
８９，Ｃｅｌｌ ５８：２８７−９２、ステーンら、１
９８８，ＥＭＢＯＪ．７：９９５−１００１、キング
ら、１９８９，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ４：１３−１８）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】ＨＥＲ４は、受容体チ
ロシンキナーゼのＥＧＦＲ系統群の第４の構成員であ
り、恐らく正常な細胞機能の制御のみならず、ある種の
ヒトガンに随伴する正常な生育調節の喪失にも関与す
る。この関連において、ＨＥＲ４は、胸部のアデノカル
シノーマのような上皮起源のある種のカルシノーマに密
接に関連すると考えられる。かくして、その発見および
ＨＥＲ４コード配列の解明は、この細胞表面受容体の異
常発現および／または機能が関与するヒトガンの診断お
よび処置に至る多数の新規なアプローチを開くものであ
る。
ロシンキナーゼのＥＧＦＲ系統群の第４の構成員であ
り、恐らく正常な細胞機能の制御のみならず、ある種の
ヒトガンに随伴する正常な生育調節の喪失にも関与す
る。この関連において、ＨＥＲ４は、胸部のアデノカル
シノーマのような上皮起源のある種のカルシノーマに密
接に関連すると考えられる。かくして、その発見および
ＨＥＲ４コード配列の解明は、この細胞表面受容体の異
常発現および／または機能が関与するヒトガンの診断お
よび処置に至る多数の新規なアプローチを開くものであ
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】この発明の基本型ＨＥＲ
４ポリペプチドをコードする完全なヌクレオチド配列を
ここに開示するが、これは後記するこの発明の幾つかの
一般的な観点の基礎を与えるものである。よって、この
発明は、ＨＥＲ４ポリヌクレオチド分子の製造および使
用に直接関連する態様を包含する。更に、この発明によ
れば、後続するセクションにおいて開示し特徴付ける基
本型ＨＥＲ４ポリペプチドのようなＨＥＲ４ポリペプチ
ドが提供される。基本型ＨＥＲ４分子とほぼ等価な構造
的特徴を共有するポリペプチドも、この発明の範囲内に
包含される。更に、この発明は、ある種の細胞の表面上
で発現したＨＥＲ４と相互作用し、これによりその生育
および／または分化に影響を与えるポリペプチドを包含
する。またこの発明は抗ＨＥＲ４抗体にも向けられてお
り、これらは限定されるものではないが、この発明によ
り提供されるヒトガン診断および治療に対する新規な生
物学的アプローチの構成要素としてこれらを使用するこ
とを含む多様な用途を有する。
４ポリペプチドをコードする完全なヌクレオチド配列を
ここに開示するが、これは後記するこの発明の幾つかの
一般的な観点の基礎を与えるものである。よって、この
発明は、ＨＥＲ４ポリヌクレオチド分子の製造および使
用に直接関連する態様を包含する。更に、この発明によ
れば、後続するセクションにおいて開示し特徴付ける基
本型ＨＥＲ４ポリペプチドのようなＨＥＲ４ポリペプチ
ドが提供される。基本型ＨＥＲ４分子とほぼ等価な構造
的特徴を共有するポリペプチドも、この発明の範囲内に
包含される。更に、この発明は、ある種の細胞の表面上
で発現したＨＥＲ４と相互作用し、これによりその生育
および／または分化に影響を与えるポリペプチドを包含
する。またこの発明は抗ＨＥＲ４抗体にも向けられてお
り、これらは限定されるものではないが、この発明によ
り提供されるヒトガン診断および治療に対する新規な生
物学的アプローチの構成要素としてこれらを使用するこ
とを含む多様な用途を有する。
【０００９】また、この発明は、ＨＥＲ４とＨＥＲ２と
の間の見かけの機能的関連性を突き止めたことにも関
し、この発明の治療的観点には、この関連性についての
本出願人の予備的な理解に基くものが包含される。本出
願人のデータは、ヘテロ二量体形成または受容体クロス
トークによってＨＥＲ４がＨＥＲ２と相互作用し、この
種の相互作用はＨＥＲ４受容体が細胞の挙動に対する効
果を媒介する際の１つの機構であると考えられることを
強く示唆する。相互因果関係は、ＨＥＲ２活性化はある
種の状況においてはＨＥＲ４により媒介されるというも
のである。本発明は、ＨＥＲ４／ｐ１８０erbB4 （「Ｈ
ＥＲ４」）、受容体チロシンキナーゼのヒトＥＧＦ受容
体（ＨＥＲ）／ｎｅｕ下位系統群の密接に関連するが別
個の構成員、並びにＨＥＲ４コードポリヌクレオチド
（例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセン
スＲＮＡ等）、ＨＥＲ４ポリヌクレオチドコード配列か
らの成熟および前駆体形態のＨＥＲ４の製造、組換えＨ
ＥＲ４発現ベクター、ＨＥＲ４アナログおよび誘導体、
抗ＨＥＲ４抗体、ＨＥＲ４リガンド、並びにヒト腫瘍学
および神経生物学の分野におけるＨＥＲ４ポリヌクレオ
チド、ポリペプチド、リガンドおよび抗体の診断および
治療的使用に向けられたものである。
の間の見かけの機能的関連性を突き止めたことにも関
し、この発明の治療的観点には、この関連性についての
本出願人の予備的な理解に基くものが包含される。本出
願人のデータは、ヘテロ二量体形成または受容体クロス
トークによってＨＥＲ４がＨＥＲ２と相互作用し、この
種の相互作用はＨＥＲ４受容体が細胞の挙動に対する効
果を媒介する際の１つの機構であると考えられることを
強く示唆する。相互因果関係は、ＨＥＲ２活性化はある
種の状況においてはＨＥＲ４により媒介されるというも
のである。本発明は、ＨＥＲ４／ｐ１８０erbB4 （「Ｈ
ＥＲ４」）、受容体チロシンキナーゼのヒトＥＧＦ受容
体（ＨＥＲ）／ｎｅｕ下位系統群の密接に関連するが別
個の構成員、並びにＨＥＲ４コードポリヌクレオチド
（例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセン
スＲＮＡ等）、ＨＥＲ４ポリヌクレオチドコード配列か
らの成熟および前駆体形態のＨＥＲ４の製造、組換えＨ
ＥＲ４発現ベクター、ＨＥＲ４アナログおよび誘導体、
抗ＨＥＲ４抗体、ＨＥＲ４リガンド、並びにヒト腫瘍学
および神経生物学の分野におけるＨＥＲ４ポリヌクレオ
チド、ポリペプチド、リガンドおよび抗体の診断および
治療的使用に向けられたものである。
【００１０】この発明は、潜在的に細胞内受容体クロス
トークまたは受容体二量体化を介して、ＨＥＲ２のＨＥ
Ｒ４媒介リン酸化に関与するＨＥＲ４およびＨＥＲ２受
容体間の見かけの機能的関連性も明らかにする。これに
関連して、この発明は、ＨＥＲ２のＨＥＲ４媒介リン酸
化を含むと考えられる胸部カルシノーマ細胞の細胞分化
を誘導し得るＨＥＲ４リガンドも提供するものである。
更に、本出願人のデータは、文献に報告されているよう
にＨＥＲ２のみを介するのではなく、これに代えてＨＥ
Ｒ４との直接相互作用によって、またはＨＥＲ２／ＨＥ
Ｒ４複合体との相互作用を介して、ＮＤＦ／ＨＲＧ−α
がある種の細胞に対する生物学的効果を媒介することの
証拠を与える。ＨＥＲ２およびＨＥＲ４の両者を発現す
る細胞系統では、ＨＥＲ４に対するＮＤＦの結合は、こ
れらの２つの関連する受容体のヘテロ二量体形成によ
り、または細胞内受容体クロストークによりＨＥＲ２を
刺激することができる。他に示さない限り、本発明の実
施は、当業界で公知の分子生物学および分子クローン
化、微生物学、免疫学および組換えＤＮＡの標準的な技
術を利用するものである。この種の技術は文献全般に記
載され説明されており、例えばマニアティスら、分子ク
ローン化；実験室マニュアル（第２版、１９８９）のよ
うなより理解し易い多数の出版物に認めることができ
る。
トークまたは受容体二量体化を介して、ＨＥＲ２のＨＥ
Ｒ４媒介リン酸化に関与するＨＥＲ４およびＨＥＲ２受
容体間の見かけの機能的関連性も明らかにする。これに
関連して、この発明は、ＨＥＲ２のＨＥＲ４媒介リン酸
化を含むと考えられる胸部カルシノーマ細胞の細胞分化
を誘導し得るＨＥＲ４リガンドも提供するものである。
更に、本出願人のデータは、文献に報告されているよう
にＨＥＲ２のみを介するのではなく、これに代えてＨＥ
Ｒ４との直接相互作用によって、またはＨＥＲ２／ＨＥ
Ｒ４複合体との相互作用を介して、ＮＤＦ／ＨＲＧ−α
がある種の細胞に対する生物学的効果を媒介することの
証拠を与える。ＨＥＲ２およびＨＥＲ４の両者を発現す
る細胞系統では、ＨＥＲ４に対するＮＤＦの結合は、こ
れらの２つの関連する受容体のヘテロ二量体形成によ
り、または細胞内受容体クロストークによりＨＥＲ２を
刺激することができる。他に示さない限り、本発明の実
施は、当業界で公知の分子生物学および分子クローン
化、微生物学、免疫学および組換えＤＮＡの標準的な技
術を利用するものである。この種の技術は文献全般に記
載され説明されており、例えばマニアティスら、分子ク
ローン化；実験室マニュアル（第２版、１９８９）のよ
うなより理解し易い多数の出版物に認めることができ
る。
【００１１】５．１．ＨＥＲ４ポリヌクレオチド 本発明の１つの観点は、図１〜２に示す基本型ＨＥＲ４
ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド、こ
れに関連するか相補的であるポリヌクレオチドを含むＨ
ＥＲ４ポリヌクレオチド、およびこの種の組換えポリヌ
クレオチドを組込む組換えベクターおよび細胞系統に向
けられている。ここで使用するように「組換えポリヌク
レオチド」という用語は、その起源または操作によっ
て、天然では随伴しているポリヌクレオチドの全ゆる部
分に随伴せず、天然で結合しているもの以外のポリヌク
レオチドに結合され得るゲノム、ｃＤＮＡ、合成または
半合成起源のポリヌクレオチドを指し、リボヌクレオチ
ド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ
またはこれらの組合せの一本鎖または二本鎖重合体を含
むものである。この用語は、限定されるものではない
が、放射性活性および化学的標識、メチル化、キャッ
プ、ヌクレオチド内修飾、例えば荷電した結合（例えば
ホスホロトチオエート、ホスホロジトチオエート等）お
よび荷電しない結合（例えばメチルホスホネート、ホス
ホトリエステル、ホスホアミダイト、カーバマイト
等）、並びにペンダント部分、挿入体（intercalcator
）、キレート体、アルキル体等を含むものを含む当業
界で公知の種々の修飾体も包含する。関連するポリヌク
レオチドは、約２００ヌクレオチド以上の連接鎖を有
し、図１〜２に開示したヌクレオチド配列内のヌクレオ
チドの対応する配列に対して少なくとも約８０％の相同
性を共有するものである。この種のＨＥＲ４ポリヌクレ
オチドおよびベクターの幾つかの特定の態様は、後記す
る実施例セクション６および７に記載する。
ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド、こ
れに関連するか相補的であるポリヌクレオチドを含むＨ
ＥＲ４ポリヌクレオチド、およびこの種の組換えポリヌ
クレオチドを組込む組換えベクターおよび細胞系統に向
けられている。ここで使用するように「組換えポリヌク
レオチド」という用語は、その起源または操作によっ
て、天然では随伴しているポリヌクレオチドの全ゆる部
分に随伴せず、天然で結合しているもの以外のポリヌク
レオチドに結合され得るゲノム、ｃＤＮＡ、合成または
半合成起源のポリヌクレオチドを指し、リボヌクレオチ
ド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ
またはこれらの組合せの一本鎖または二本鎖重合体を含
むものである。この用語は、限定されるものではない
が、放射性活性および化学的標識、メチル化、キャッ
プ、ヌクレオチド内修飾、例えば荷電した結合（例えば
ホスホロトチオエート、ホスホロジトチオエート等）お
よび荷電しない結合（例えばメチルホスホネート、ホス
ホトリエステル、ホスホアミダイト、カーバマイト
等）、並びにペンダント部分、挿入体（intercalcator
）、キレート体、アルキル体等を含むものを含む当業
界で公知の種々の修飾体も包含する。関連するポリヌク
レオチドは、約２００ヌクレオチド以上の連接鎖を有
し、図１〜２に開示したヌクレオチド配列内のヌクレオ
チドの対応する配列に対して少なくとも約８０％の相同
性を共有するものである。この種のＨＥＲ４ポリヌクレ
オチドおよびベクターの幾つかの特定の態様は、後記す
る実施例セクション６および７に記載する。
【００１２】ＨＥＲ４ポリヌクレオチドは、分子クロー
ン化および化学合成方法を含む当業界で公知の多様な一
般的技術を使用して取得することができる。この発明の
基本型ＨＥＲ４ポリペプチド（図１〜２）並びに幾つか
のＨＥＲ４ポリペプチド変種をコードするｃＤＮＡの分
子クローン化の１つの方法は、後記するセクション６．
に例として記載する。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３お
よびＸｍｒｋの配列の保存された領域を使用して縮退オ
リゴヌクレオチドプライマーの選択を図り、その後これ
を使用してＨＥＲ４を単離する。これらの配列の多くが
アミノ酸同一性の延長された領域を有するため、短いＰ
ＣＲ断片が独特の分子を表すのか、単にＥＧＦＲ、ＨＥ
Ｒ２またはＨＥＲ３の種特異的対応部分なのかを決定す
るのは困難である。しばしば１つの蛋白質についての種
の相異は、２つの別個の蛋白質についての種内の相異程
に大きい。例えば、魚類ＸｍｒｋはヒトＥＧＦＲに対し
て４７／５５（８５％）のアミノ酸同一性の領域を有
し、これが魚類ＥＧＦＲであろうことを示唆するが、こ
の領域中のＸｍｒｋと同一のアミノ酸配列を有する他の
クローンを単離すると（５７／５７）、その隣接配列中
でヒトＥＧＦＲに対する更に高い相同性を示し（９２％
アミノ酸相同性）、これによりＸｍｒｋではなくこれが
魚類ＥＧＦＲであることが示唆される（ウイットブロッ
ト・ジェイら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４１
５−４２１）。
ン化および化学合成方法を含む当業界で公知の多様な一
般的技術を使用して取得することができる。この発明の
基本型ＨＥＲ４ポリペプチド（図１〜２）並びに幾つか
のＨＥＲ４ポリペプチド変種をコードするｃＤＮＡの分
子クローン化の１つの方法は、後記するセクション６．
に例として記載する。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３お
よびＸｍｒｋの配列の保存された領域を使用して縮退オ
リゴヌクレオチドプライマーの選択を図り、その後これ
を使用してＨＥＲ４を単離する。これらの配列の多くが
アミノ酸同一性の延長された領域を有するため、短いＰ
ＣＲ断片が独特の分子を表すのか、単にＥＧＦＲ、ＨＥ
Ｒ２またはＨＥＲ３の種特異的対応部分なのかを決定す
るのは困難である。しばしば１つの蛋白質についての種
の相異は、２つの別個の蛋白質についての種内の相異程
に大きい。例えば、魚類ＸｍｒｋはヒトＥＧＦＲに対し
て４７／５５（８５％）のアミノ酸同一性の領域を有
し、これが魚類ＥＧＦＲであろうことを示唆するが、こ
の領域中のＸｍｒｋと同一のアミノ酸配列を有する他の
クローンを単離すると（５７／５７）、その隣接配列中
でヒトＥＧＦＲに対する更に高い相同性を示し（９２％
アミノ酸相同性）、これによりＸｍｒｋではなくこれが
魚類ＥＧＦＲであることが示唆される（ウイットブロッ
ト・ジェイら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４１
５−４２１）。
【００１３】後記するセクション６．に記載するよう
に、ネズミＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ２およびｅｒｂＢ３に対
応するゲノム断片を単離することにより、ネズミＨＥＲ
４／ｅｒｂＢ４ＰＣＲ断片が実際に独特の遺伝子であ
り、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３のネズミ相同体
ではないことを確認する必要があった。これらのクロー
ンの配列分析により、この断片はＥＧＦＲ系統群の新規
な構成員であることが確認された。注目すべきことに、
ネズミクローンの領域はヒトＨＥＲ２に対する６０／６
４アミノ酸同一性の鎖を有していたが、同一の種（マウ
ス）由来の他のＥＧＦＲ相同体のアミノ酸およびＤＮＡ
配列との比較により、これは新規な転写体をコードする
ことが確かに確立された。ＨＥＲ４ポリヌクレオチド
は、ＨＥＲ４様活性を生成しかつ／またはＨＥＲ４コー
ドｍＲＮＡを発現する多様な細胞供給源から取得するこ
とができる。この関連において、本出願人はＨＥＲ４ポ
リヌクレオチドのための多数の適切なヒト細胞供給源を
同定したが、これには限定されるものではないが、脳、
小脳、下垂体、心臓、骨格筋、および多様な胸部カルシ
ノーマ細胞系統（セクション６．、後記参照）が包含さ
れる。
に、ネズミＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ２およびｅｒｂＢ３に対
応するゲノム断片を単離することにより、ネズミＨＥＲ
４／ｅｒｂＢ４ＰＣＲ断片が実際に独特の遺伝子であ
り、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３のネズミ相同体
ではないことを確認する必要があった。これらのクロー
ンの配列分析により、この断片はＥＧＦＲ系統群の新規
な構成員であることが確認された。注目すべきことに、
ネズミクローンの領域はヒトＨＥＲ２に対する６０／６
４アミノ酸同一性の鎖を有していたが、同一の種（マウ
ス）由来の他のＥＧＦＲ相同体のアミノ酸およびＤＮＡ
配列との比較により、これは新規な転写体をコードする
ことが確かに確立された。ＨＥＲ４ポリヌクレオチド
は、ＨＥＲ４様活性を生成しかつ／またはＨＥＲ４コー
ドｍＲＮＡを発現する多様な細胞供給源から取得するこ
とができる。この関連において、本出願人はＨＥＲ４ポ
リヌクレオチドのための多数の適切なヒト細胞供給源を
同定したが、これには限定されるものではないが、脳、
小脳、下垂体、心臓、骨格筋、および多様な胸部カルシ
ノーマ細胞系統（セクション６．、後記参照）が包含さ
れる。
【００１４】例えば、この種の細胞供給源から単離精製
されたＲＮＡからのｃＤＮＡクローン化により、または
ゲノムクローン化により、ＨＥＲ４ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを取得することができる。クロ
ーンのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーは当業界で周
知の技術を使用して調製することができ、ＨＥＲ４遺伝
子のいずれかの部分に実質的に相補的なヌクレオチドプ
ローブを用いて特定のＨＥＲ４コードＤＮＡについて検
索することができる。種々のＰＣＲクローン化技術を使
用してこの発明のＨＥＲ４ポリヌクレオチドを取得する
こともできる。ＨＥＲ４ポリヌクレオチドの単離に適切
な多数のＰＣＲクローン化手順が文献に報告されている
（例えば、ＰＣＲ手順：方法および応用の指針、イニス
ら編、アカデミック・プレス１９９０を参照することが
できる）。
されたＲＮＡからのｃＤＮＡクローン化により、または
ゲノムクローン化により、ＨＥＲ４ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを取得することができる。クロ
ーンのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーは当業界で周
知の技術を使用して調製することができ、ＨＥＲ４遺伝
子のいずれかの部分に実質的に相補的なヌクレオチドプ
ローブを用いて特定のＨＥＲ４コードＤＮＡについて検
索することができる。種々のＰＣＲクローン化技術を使
用してこの発明のＨＥＲ４ポリヌクレオチドを取得する
こともできる。ＨＥＲ４ポリヌクレオチドの単離に適切
な多数のＰＣＲクローン化手順が文献に報告されている
（例えば、ＰＣＲ手順：方法および応用の指針、イニス
ら編、アカデミック・プレス１９９０を参照することが
できる）。
【００１５】発現ベクターの構成のため、所望のＨＥＲ
４の全コード領域を含むポリヌクレオチドを全長のクロ
ーンとして単離するか、または２以上のポリヌクレオチ
ドを互いに接合することにより調製することができる。
その他、ＨＥＲ４コードＤＮＡは、当業界で標準的な技
術を使用して化学合成により全部または一部を合成する
ことができる。ヌクレオチドコード配列の固有の縮退の
ため、所望のＨＥＲ４ポリヌクレオチドをコードする全
ゆるポリヌクレオチドを組換え発現のために使用するこ
とができる。よって、例えば、図１〜２に示すこの発明
の基本型ＨＥＲ４をコードするヌクレオチド配列は、同
じＨＥＲ４生成物が得られるようにヌクレオチドを置換
することにより改変することができる。
４の全コード領域を含むポリヌクレオチドを全長のクロ
ーンとして単離するか、または２以上のポリヌクレオチ
ドを互いに接合することにより調製することができる。
その他、ＨＥＲ４コードＤＮＡは、当業界で標準的な技
術を使用して化学合成により全部または一部を合成する
ことができる。ヌクレオチドコード配列の固有の縮退の
ため、所望のＨＥＲ４ポリヌクレオチドをコードする全
ゆるポリヌクレオチドを組換え発現のために使用するこ
とができる。よって、例えば、図１〜２に示すこの発明
の基本型ＨＥＲ４をコードするヌクレオチド配列は、同
じＨＥＲ４生成物が得られるようにヌクレオチドを置換
することにより改変することができる。
【００１６】またこの発明は、この発明のＨＥＲ４ポリ
ヌクレオチドの多数の有用な応用も提供するものであ
り、これには限定されるものではないが、ＨＥＲ４を検
出しかつ／またはクローン化するＨＥＲ４発現ベクタ
ー、プライマーおよびプローブの調製および診断試薬に
おけるその使用が包含される。ＨＥＲ４ポリヌクレオチ
ドに基く診断法には、ＨＥＲ４ポリヌクレオチドを適宜
プライマーまたはプローブとして利用する当業界で公知
の種々のハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ検定が包
含される。この発明の１つの特定の観点は、ＰＣＲ反応
においてｃＤＮＡ合成を起動し得る一対のプライマーか
らなるＰＣＲキットに関し、この場合それぞれのプライ
マーをこの発明のＨＥＲ４ポリヌクレオチドとする。こ
の種のキットは、異常なＨＥＲ４発現を特徴とするある
種のヒトガンの診断に有用たり得る。例えば、ある種の
ヒトカルシノーマは、胸部のヒトカルシノーマのよう
に、その正常な細胞対応部分と比較してＨＥＲ４を過剰
発現し得る。よって、胸部組織におけるＨＥＲ４過剰発
現ｍＲＮＡの検出は、新生組織形成を示すものとなり得
る。その他、関連する態様では、例えばそれぞれＨＥＲ
２およびＨＥＲ４遺伝子中の分岐配列から誘導した一組
のＰＣＲプライマー対からなるキットのような、ＨＥＲ
２およびＨＥＲ４ｍＲＮＡの両者を検出し得るポリヌク
レオチド基材検定キットにより、ＨＥＲ２の過剰発現ま
たはＨＥＲ４の発現または過剰発現を特徴とするヒトカ
ルシノーマを診断することができる。
ヌクレオチドの多数の有用な応用も提供するものであ
り、これには限定されるものではないが、ＨＥＲ４を検
出しかつ／またはクローン化するＨＥＲ４発現ベクタ
ー、プライマーおよびプローブの調製および診断試薬に
おけるその使用が包含される。ＨＥＲ４ポリヌクレオチ
ドに基く診断法には、ＨＥＲ４ポリヌクレオチドを適宜
プライマーまたはプローブとして利用する当業界で公知
の種々のハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ検定が包
含される。この発明の１つの特定の観点は、ＰＣＲ反応
においてｃＤＮＡ合成を起動し得る一対のプライマーか
らなるＰＣＲキットに関し、この場合それぞれのプライ
マーをこの発明のＨＥＲ４ポリヌクレオチドとする。こ
の種のキットは、異常なＨＥＲ４発現を特徴とするある
種のヒトガンの診断に有用たり得る。例えば、ある種の
ヒトカルシノーマは、胸部のヒトカルシノーマのよう
に、その正常な細胞対応部分と比較してＨＥＲ４を過剰
発現し得る。よって、胸部組織におけるＨＥＲ４過剰発
現ｍＲＮＡの検出は、新生組織形成を示すものとなり得
る。その他、関連する態様では、例えばそれぞれＨＥＲ
２およびＨＥＲ４遺伝子中の分岐配列から誘導した一組
のＰＣＲプライマー対からなるキットのような、ＨＥＲ
２およびＨＥＲ４ｍＲＮＡの両者を検出し得るポリヌク
レオチド基材検定キットにより、ＨＥＲ２の過剰発現ま
たはＨＥＲ４の発現または過剰発現を特徴とするヒトカ
ルシノーマを診断することができる。
【００１７】５．２．ＨＥＲ４ポリペプチド この発明の他の観点は、ここに提供する基本型ＨＥＲ４
ポリペプチド並びに基本型ＨＥＲ４分子のアミノ酸配列
から誘導されるか、または実質的な相同性を有するポリ
ペプチドを含むＨＥＲ４ポリペプチドに向けられてい
る。この文脈における「ポリペプチド」という用語は、
合成または組換え手段により調製されたか、または天然
の供給源から単離されたポリペプチドを指す。この文脈
における「実質的に相同」という用語は、基本型ＨＥＲ
４一次構造（図１〜２）における対応する連接アミノ酸
配列に対して約９０％を越えるアミノ酸相同性を共有す
る約８０以上のアミノ酸のポリペプチドを指す。「基本
型ＨＥＲ４」という用語は、図１〜２に示す前駆体また
は成熟ＨＥＲ４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
指し、ここに同様に提供するコンセンサスｃＤＮＡヌク
レオチド配列により、または同一のアミノ酸配列をコー
ドするいずれかのポリヌクレオチド配列によりコードさ
れるものである。
ポリペプチド並びに基本型ＨＥＲ４分子のアミノ酸配列
から誘導されるか、または実質的な相同性を有するポリ
ペプチドを含むＨＥＲ４ポリペプチドに向けられてい
る。この文脈における「ポリペプチド」という用語は、
合成または組換え手段により調製されたか、または天然
の供給源から単離されたポリペプチドを指す。この文脈
における「実質的に相同」という用語は、基本型ＨＥＲ
４一次構造（図１〜２）における対応する連接アミノ酸
配列に対して約９０％を越えるアミノ酸相同性を共有す
る約８０以上のアミノ酸のポリペプチドを指す。「基本
型ＨＥＲ４」という用語は、図１〜２に示す前駆体また
は成熟ＨＥＲ４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
指し、ここに同様に提供するコンセンサスｃＤＮＡヌク
レオチド配列により、または同一のアミノ酸配列をコー
ドするいずれかのポリヌクレオチド配列によりコードさ
れるものである。
【００１８】この発明のＨＥＲ４ポリペプチドは、図１
〜２に示す基本型ＨＥＲ４の配列に対して、結果的にサ
イレント変化となり従って生物活性生成物を製造するア
ミノ酸残基の欠失、付加または置換を含むことができ
る。この種のアミノ酸置換は、関与する残基の極性、荷
電、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の
性状の類似性に基いて行うことができる。例えば、陰性
に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン
酸を含み、陽性に荷電したアミノ酸はリジンおよびアル
ギニンを含み、類似する親水性値を有する荷電していな
い極性頭部基または非極性頭部基のアミノ酸は次のもの
を含む：ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、
アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオ
ニン、フェニルアラニン、チロシン。
〜２に示す基本型ＨＥＲ４の配列に対して、結果的にサ
イレント変化となり従って生物活性生成物を製造するア
ミノ酸残基の欠失、付加または置換を含むことができ
る。この種のアミノ酸置換は、関与する残基の極性、荷
電、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の
性状の類似性に基いて行うことができる。例えば、陰性
に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン
酸を含み、陽性に荷電したアミノ酸はリジンおよびアル
ギニンを含み、類似する親水性値を有する荷電していな
い極性頭部基または非極性頭部基のアミノ酸は次のもの
を含む：ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、
アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオ
ニン、フェニルアラニン、チロシン。
【００１９】図１〜２に示すＨＥＲ４ポリペプチドは、
受容体チロシンキナーゼのＥＧＦＲ系統群（ハンクス
ら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４２−５２）
を特徴付ける基本的な構造的特徴の全てを有するもので
ある。前駆体は、蛋白質を６２５アミノ酸の細胞外リガ
ンド結合ドメインと６３３アミノ酸のＣ末端細胞質ドメ
インとに二分する膜横断領域に特徴的な２６アミノ酸の
単一の疎水性鎖を含む。リガンド結合ドメインは、２つ
のシステインに富む領域（ＩＩ：残基１８６〜３３４、
およびＩＶ：残基４９６〜６３３）およびリガンド結合
の特異性を特定し得る２つの隣接ドメイン（Ｉ：残基２
９〜１８５、およびＩＩＩ：残基３３５〜４９５）（ラ
ックスら、１９８８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
８：１９７０−７８）を含む４つのサブドメイン（Ｉ〜
ＩＶ）に更に分割することができる。ＨＥＲ４の細胞外
ドメインはＨＥＲ３に最も類似しており、この場合ＨＥ
Ｒ４のドメインＩＩ〜ＩＶは、ＨＥＲ３のそれぞれのド
メインに対して５６〜６７％の同一性を共有する。これ
に対して、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の同じ領域はＨＥＲ
４に対してそれぞれ４３〜５１％および３４〜４６％の
相同性を示す（図８〜９）。
受容体チロシンキナーゼのＥＧＦＲ系統群（ハンクス
ら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４２−５２）
を特徴付ける基本的な構造的特徴の全てを有するもので
ある。前駆体は、蛋白質を６２５アミノ酸の細胞外リガ
ンド結合ドメインと６３３アミノ酸のＣ末端細胞質ドメ
インとに二分する膜横断領域に特徴的な２６アミノ酸の
単一の疎水性鎖を含む。リガンド結合ドメインは、２つ
のシステインに富む領域（ＩＩ：残基１８６〜３３４、
およびＩＶ：残基４９６〜６３３）およびリガンド結合
の特異性を特定し得る２つの隣接ドメイン（Ｉ：残基２
９〜１８５、およびＩＩＩ：残基３３５〜４９５）（ラ
ックスら、１９８８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
８：１９７０−７８）を含む４つのサブドメイン（Ｉ〜
ＩＶ）に更に分割することができる。ＨＥＲ４の細胞外
ドメインはＨＥＲ３に最も類似しており、この場合ＨＥ
Ｒ４のドメインＩＩ〜ＩＶは、ＨＥＲ３のそれぞれのド
メインに対して５６〜６７％の同一性を共有する。これ
に対して、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の同じ領域はＨＥＲ
４に対してそれぞれ４３〜５１％および３４〜４６％の
相同性を示す（図８〜９）。
【００２０】ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の４つの細胞外サ
ブドメインは３９〜５０％の相同性を共有する。またＨ
ＥＲ４は、ＨＥＲ２部分がドメインＩＶの第４のシステ
インを欠失する以外は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥ
Ｒ３の細胞外部分に存在する５０のシステインの全てを
も保存する。ＨＥＲ４には１１の潜在的なＮ結合グルコ
シル化部位があり、ＥＧＦＲにおける１２の潜在的部位
の内の４つ、ＨＥＲ２における８部位の内の３つ、およ
びＨＥＲ３における１０部位の内の４つが保存されてい
る。ＨＥＲ４の膜横断ドメインに後続するのは、３７ア
ミノ酸の細胞質膜近接領域である。この領域はＥＧＦＲ
と最も高程度の相同性を共有し（７３％アミノ酸同一
性）、図１〜２の配列においてアミノ酸残基番号６７９
（セリン）および６９９（スレオニン）に２つのコンセ
ンサス蛋白質キナーゼＣリン酸化部位を含み、その後者
はＥＧＦＲおよびＨＥＲ２中に存在する。注目すべきこ
とに、ＨＥＲ４はＥＧＦＲのＴｈｒ６５４に類似する部
位を欠失する。ＥＧＦＲにおけるこの残基のリン酸化
は、リガンド誘導内在化をブロックし、その膜横断シグ
ナル化において重要な役割を果たすと考えられる（リン
ベーら、１９８８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：
２３０２−０８）。またＨＥＲ４は、ＨＥＲ２のＴｈｒ
６９４に類似するＴｈｒ６９２も含む。このスレオニン
はＥＧＦＲおよびＨＥＲ３中には存在せず、ＨＥＲ２キ
ナーゼの細胞分裂促進および形質転換活性に対する細胞
型特異性に関与することが提唱されている（ジフィオレ
ら、１９９２，ＥＭＢＯ Ｊ．１１：３９２７−３
３）。ＨＥＲ４の膜近接領域はアミノ酸番号６９９（ス
レオニン）のＭＡＰキナーゼコンセンサスリン酸化部位
も含むが、ＥＧＦ刺激に応答してＭＡＰキナーゼにより
リン酸化されるＥＧＦＲのＴｈｒ６９９に相同の位置で
ある（タカシマら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：２５２０−２
５）。
ブドメインは３９〜５０％の相同性を共有する。またＨ
ＥＲ４は、ＨＥＲ２部分がドメインＩＶの第４のシステ
インを欠失する以外は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥ
Ｒ３の細胞外部分に存在する５０のシステインの全てを
も保存する。ＨＥＲ４には１１の潜在的なＮ結合グルコ
シル化部位があり、ＥＧＦＲにおける１２の潜在的部位
の内の４つ、ＨＥＲ２における８部位の内の３つ、およ
びＨＥＲ３における１０部位の内の４つが保存されてい
る。ＨＥＲ４の膜横断ドメインに後続するのは、３７ア
ミノ酸の細胞質膜近接領域である。この領域はＥＧＦＲ
と最も高程度の相同性を共有し（７３％アミノ酸同一
性）、図１〜２の配列においてアミノ酸残基番号６７９
（セリン）および６９９（スレオニン）に２つのコンセ
ンサス蛋白質キナーゼＣリン酸化部位を含み、その後者
はＥＧＦＲおよびＨＥＲ２中に存在する。注目すべきこ
とに、ＨＥＲ４はＥＧＦＲのＴｈｒ６５４に類似する部
位を欠失する。ＥＧＦＲにおけるこの残基のリン酸化
は、リガンド誘導内在化をブロックし、その膜横断シグ
ナル化において重要な役割を果たすと考えられる（リン
ベーら、１９８８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：
２３０２−０８）。またＨＥＲ４は、ＨＥＲ２のＴｈｒ
６９４に類似するＴｈｒ６９２も含む。このスレオニン
はＥＧＦＲおよびＨＥＲ３中には存在せず、ＨＥＲ２キ
ナーゼの細胞分裂促進および形質転換活性に対する細胞
型特異性に関与することが提唱されている（ジフィオレ
ら、１９９２，ＥＭＢＯ Ｊ．１１：３９２７−３
３）。ＨＥＲ４の膜近接領域はアミノ酸番号６９９（ス
レオニン）のＭＡＰキナーゼコンセンサスリン酸化部位
も含むが、ＥＧＦ刺激に応答してＭＡＰキナーゼにより
リン酸化されるＥＧＦＲのＴｈｒ６９９に相同の位置で
ある（タカシマら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：２５２０−２
５）。
【００２１】ＨＥＲ４の残余の細胞質部分は、２７６ア
ミノ酸チロシンキナーゼドメイン、ＥＧＦＲのリガンド
誘導内在化に必要なドメインに相同の３８アミノ酸の酸
性ヘリックス構造（チェンら、１９８９，Ｃｅｌｌ ５
９：３３−４３）、および他のＥＧＦＲ関連蛋白質の自
己リン酸化ドメインに特徴的な１８のチロシン残基を含
む２８２アミノ酸の領域（図８〜９）よりなる。２７６
アミノ酸のチロシンキナーゼドメインは、チロシンキナ
ーゼの診断的構造形態の全てを保存し、ＥＧＲＲ（７９
％同一性）およびＨＥＲ２（７７％同一性）の触媒性ド
メインに最も関連するが、ＨＥＲ３（６３％同一性）に
対しては程度は低い。この同じ領域において、ＥＧＦＲ
およびＨＥＲ２は８３％の同一性を共有する。種々の保
存された構造的形態の例には次のものが含まれる：リン
酸転移反応に関与すると予測される遠位リジン残基を有
するＡＴＰ結合形態（ＧＸＧＸＸＧ）（配列番号：１
１）（ハンクスら、１９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：
４２−５２、フンターとコパー、酵素第１７巻（ボイヤ
ーとクレブス編）中第１９１〜２４６頁（アカデミック
プレス、１９８６））、チロシンキナーゼ特異的サイン
配列（ＤＬＡＡＲＮ（配列番号：１２）およびＰＩＫＷ
ＭＡ（配列番号：１３））およびＴｙｒ８７５（第８〜
９図）、多くのチロシンキナーゼにおいてしばしば自己
リン酸化部位として働く残基（フンターとコパー、前
記）、および公知の蛋白質キナーゼ全てにおいて高度に
または完全に保存された約１５残基（プロウマンら、１
９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．８７：４９０５−０９、ハンクスら、前記）。
ＨＥＲ４のＣ末端２８２アミノ酸は、ＨＥＲ２（２７
％）およびＥＧＦＲ（１９％）に対して限定された相同
性を有する。しかしながら、それぞれのＥＧＦＲ系統群
受容体のＣ末端ドメインはプロリンに富み、一般にチロ
シン残基を中心として２〜７アミノ酸の鎖を保存してい
る。これらの残基は、Ｔｙｒ１０６８、Ｔｙｒ１０８
６、Ｔｙｒ１１４８およびＴｙｒ１１７３にＥＧＦＲの
主要なチロシン自己リン酸化部位を含む（図８〜９、黒
三角、マルゴリスら、１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６４：１０６６７−７１）。
ミノ酸チロシンキナーゼドメイン、ＥＧＦＲのリガンド
誘導内在化に必要なドメインに相同の３８アミノ酸の酸
性ヘリックス構造（チェンら、１９８９，Ｃｅｌｌ ５
９：３３−４３）、および他のＥＧＦＲ関連蛋白質の自
己リン酸化ドメインに特徴的な１８のチロシン残基を含
む２８２アミノ酸の領域（図８〜９）よりなる。２７６
アミノ酸のチロシンキナーゼドメインは、チロシンキナ
ーゼの診断的構造形態の全てを保存し、ＥＧＲＲ（７９
％同一性）およびＨＥＲ２（７７％同一性）の触媒性ド
メインに最も関連するが、ＨＥＲ３（６３％同一性）に
対しては程度は低い。この同じ領域において、ＥＧＦＲ
およびＨＥＲ２は８３％の同一性を共有する。種々の保
存された構造的形態の例には次のものが含まれる：リン
酸転移反応に関与すると予測される遠位リジン残基を有
するＡＴＰ結合形態（ＧＸＧＸＸＧ）（配列番号：１
１）（ハンクスら、１９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：
４２−５２、フンターとコパー、酵素第１７巻（ボイヤ
ーとクレブス編）中第１９１〜２４６頁（アカデミック
プレス、１９８６））、チロシンキナーゼ特異的サイン
配列（ＤＬＡＡＲＮ（配列番号：１２）およびＰＩＫＷ
ＭＡ（配列番号：１３））およびＴｙｒ８７５（第８〜
９図）、多くのチロシンキナーゼにおいてしばしば自己
リン酸化部位として働く残基（フンターとコパー、前
記）、および公知の蛋白質キナーゼ全てにおいて高度に
または完全に保存された約１５残基（プロウマンら、１
９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．８７：４９０５−０９、ハンクスら、前記）。
ＨＥＲ４のＣ末端２８２アミノ酸は、ＨＥＲ２（２７
％）およびＥＧＦＲ（１９％）に対して限定された相同
性を有する。しかしながら、それぞれのＥＧＦＲ系統群
受容体のＣ末端ドメインはプロリンに富み、一般にチロ
シン残基を中心として２〜７アミノ酸の鎖を保存してい
る。これらの残基は、Ｔｙｒ１０６８、Ｔｙｒ１０８
６、Ｔｙｒ１１４８およびＴｙｒ１１７３にＥＧＦＲの
主要なチロシン自己リン酸化部位を含む（図８〜９、黒
三角、マルゴリスら、１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６４：１０６６７−７１）。
【００２２】５．３．ＨＥＲ４ポリペプチドの組換え合
成 この発明のＨＥＲ４ポリペプチドは、所望のＨＥＲ４ポ
リペプチドをコードするＤＮＡのクローン化および発現
により製造することができる。この種のＤＮＡは、当業
界で周知であって多数の許容し得る宿主生物での使用に
適切な多数の発現ベクターに融合または成熟形態で連結
することができ、分泌を可能とするシグナル配列を含む
ものとし得る。原核および真核宿主発現系の両者を、組
換えＨＥＲ４ポリペプチドの製造に用いることができ
る。例えば、基本型ＨＥＲ４前駆体コード配列またはそ
の機能的等価物を、前駆体を正確にプロセシングし得る
宿主細胞中で使用することができる。その他、成熟ＨＥ
Ｒ４のコード配列を使用し、成熟ＨＥＲ４分子を直接発
現させることができる。ＨＥＲ４前駆体コード配列の機
能的等価物には、適切な宿主細胞内で発現した場合に、
ＨＥＲ４の合成、プロセシングおよび／または放出を指
向し得る全ゆるＤＮＡ配列が包含される。ＤＮＡ技術を
使用するＨＥＲ４ポリペプチドの製造は、説明の目的の
ために４工程のプロセスに分割することができる：
（１）所望のＨＥＲ４ポリペプチドをコードするＤＮＡ
の単離または生成、（２）所望のＨＥＲ４ポリペプチド
の合成を指向し得る発現ベクターの構成、（３）ＨＥＲ
４コード配列を複製しかつ発現しかつ／または初発生成
物をプロセシングして所望のＨＥＲ４ポリペプチドを製
造し得る適切な宿主細胞の形質移入または形質転換、お
よび（４）所望のＨＥＲ４生成物の同定および精製。
成 この発明のＨＥＲ４ポリペプチドは、所望のＨＥＲ４ポ
リペプチドをコードするＤＮＡのクローン化および発現
により製造することができる。この種のＤＮＡは、当業
界で周知であって多数の許容し得る宿主生物での使用に
適切な多数の発現ベクターに融合または成熟形態で連結
することができ、分泌を可能とするシグナル配列を含む
ものとし得る。原核および真核宿主発現系の両者を、組
換えＨＥＲ４ポリペプチドの製造に用いることができ
る。例えば、基本型ＨＥＲ４前駆体コード配列またはそ
の機能的等価物を、前駆体を正確にプロセシングし得る
宿主細胞中で使用することができる。その他、成熟ＨＥ
Ｒ４のコード配列を使用し、成熟ＨＥＲ４分子を直接発
現させることができる。ＨＥＲ４前駆体コード配列の機
能的等価物には、適切な宿主細胞内で発現した場合に、
ＨＥＲ４の合成、プロセシングおよび／または放出を指
向し得る全ゆるＤＮＡ配列が包含される。ＤＮＡ技術を
使用するＨＥＲ４ポリペプチドの製造は、説明の目的の
ために４工程のプロセスに分割することができる：
（１）所望のＨＥＲ４ポリペプチドをコードするＤＮＡ
の単離または生成、（２）所望のＨＥＲ４ポリペプチド
の合成を指向し得る発現ベクターの構成、（３）ＨＥＲ
４コード配列を複製しかつ発現しかつ／または初発生成
物をプロセシングして所望のＨＥＲ４ポリペプチドを製
造し得る適切な宿主細胞の形質移入または形質転換、お
よび（４）所望のＨＥＲ４生成物の同定および精製。
【００２３】５．３．１．ＨＥＲ４コードＤＮＡの単離
または生成 ＨＥＲ４コードＤＮＡまたはその機能的等価物を使用
し、所望のＨＥＲ４ポリペプチド生成物の発現を指向し
得る組換え発現ベクターを構成することができる。特定
の態様では、基本型ＨＥＲ４ポリペプチド（図１〜
２）、またはその断片もしくは機能的等価物をコードす
るＤＮＡを使用し、適切な宿主細胞中で組換えＨＥＲ４
生成物の発現を指向し得る組換え分子を生成することが
できる。ＨＥＲ４コードヌクレオチド配列は、ＨＥＲ４
様活性を生成しかつ／またはＨＥＲ４コードｍＲＮＡを
発現する多様な細胞供給源から取得することができる。
例えば、ＨＥＲ４コードｃＤＮＡは、後記するセクショ
ン６．に記載するように胸部アデノカルシノーマ細胞系
統ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ１３１）か
ら取得することができる。更に、多数のヒト細胞供給源
がＨＥＲ４ｃＤＮＡを取得するのに適切であり、これに
は限定されるものではないが、種々の類表皮種および胸
部カルシノーマ細胞並びに正常な心臓、腎臓および脳細
胞（セクション６．２．３．、後記参照）が含まれる。
または生成 ＨＥＲ４コードＤＮＡまたはその機能的等価物を使用
し、所望のＨＥＲ４ポリペプチド生成物の発現を指向し
得る組換え発現ベクターを構成することができる。特定
の態様では、基本型ＨＥＲ４ポリペプチド（図１〜
２）、またはその断片もしくは機能的等価物をコードす
るＤＮＡを使用し、適切な宿主細胞中で組換えＨＥＲ４
生成物の発現を指向し得る組換え分子を生成することが
できる。ＨＥＲ４コードヌクレオチド配列は、ＨＥＲ４
様活性を生成しかつ／またはＨＥＲ４コードｍＲＮＡを
発現する多様な細胞供給源から取得することができる。
例えば、ＨＥＲ４コードｃＤＮＡは、後記するセクショ
ン６．に記載するように胸部アデノカルシノーマ細胞系
統ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ１３１）か
ら取得することができる。更に、多数のヒト細胞供給源
がＨＥＲ４ｃＤＮＡを取得するのに適切であり、これに
は限定されるものではないが、種々の類表皮種および胸
部カルシノーマ細胞並びに正常な心臓、腎臓および脳細
胞（セクション６．２．３．、後記参照）が含まれる。
【００２４】ＨＥＲ４コード配列は、この種の細胞供給
源から単離精製したｍＲＮＡからの分子クローン化によ
り、またはゲノムクローン化により取得することができ
る。クローンのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーは、
当業界で周知の技術を使用して調製することができ、Ｈ
ＥＲ４遺伝子のいずれかの部分に実質的に相補的なヌク
レオチドプローブを用いて特定のＨＥＲ４コードＤＮＡ
について検索することができる。その他、適切なオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用い、ｃＤＮＡまたはゲノム
ＤＮＡをＰＣＲクローン化の鋳型として使用することが
できる。全長のクローン、すなわち所望のＨＥＲ４の全
コード領域を含むものを、構成する発現ベクターについ
て選択することができ、または重複するｃＤＮＡを互い
に連結して完全なコード配列を形成することができる。
その他、ＨＥＲ４コードＤＮＡは、当業界で標準的な技
術を使用して全部または一部化学合成により合成するこ
とができる。
源から単離精製したｍＲＮＡからの分子クローン化によ
り、またはゲノムクローン化により取得することができ
る。クローンのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーは、
当業界で周知の技術を使用して調製することができ、Ｈ
ＥＲ４遺伝子のいずれかの部分に実質的に相補的なヌク
レオチドプローブを用いて特定のＨＥＲ４コードＤＮＡ
について検索することができる。その他、適切なオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用い、ｃＤＮＡまたはゲノム
ＤＮＡをＰＣＲクローン化の鋳型として使用することが
できる。全長のクローン、すなわち所望のＨＥＲ４の全
コード領域を含むものを、構成する発現ベクターについ
て選択することができ、または重複するｃＤＮＡを互い
に連結して完全なコード配列を形成することができる。
その他、ＨＥＲ４コードＤＮＡは、当業界で標準的な技
術を使用して全部または一部化学合成により合成するこ
とができる。
【００２５】５．３．２．ＨＥＲ４発現ベクターの構成 ＨＥＲポリペプチドの組換え発現につき、当業者は種々
の発現ベクター／宿主系を同等に十分に利用することが
できる。この種の系には、限定されるものではないが、
微生物、例えば所望のＨＥＲ４コード配列を含む組換え
バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコ
スミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌、
所望のＨＥＲ４コード配列を含む組換え酵母発現ベクタ
ーにより形質転換された酵母、所望のＨＥＲ４コード配
列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロ
ウイルス）が感染した昆虫細胞系、所望のＨＥＲ４コー
ド配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばカリ
フラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウ
イルス、ＴＭＶ）が感染したか組換えプラスミド発現ベ
クター（例えばＴｉプラスミド）により形質転換された
植物細胞系、または安定に増幅されたか（例えばＣＨＯ
／ｄｈｆｒ、ＣＨＯ／グルタミン合成酵素）または二重
微小染色体中で不安定に増幅された（例えばネズミ細胞
系統）ＨＥＲ４ＤＮＡの多重コピーを含むように操作さ
れた細胞系統を含む組換えウイルス発現ベクター（例え
ばアデノウイルス、ワクシニアウイルス）が感染した動
物細胞系が包含される。
の発現ベクター／宿主系を同等に十分に利用することが
できる。この種の系には、限定されるものではないが、
微生物、例えば所望のＨＥＲ４コード配列を含む組換え
バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコ
スミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌、
所望のＨＥＲ４コード配列を含む組換え酵母発現ベクタ
ーにより形質転換された酵母、所望のＨＥＲ４コード配
列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロ
ウイルス）が感染した昆虫細胞系、所望のＨＥＲ４コー
ド配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばカリ
フラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウ
イルス、ＴＭＶ）が感染したか組換えプラスミド発現ベ
クター（例えばＴｉプラスミド）により形質転換された
植物細胞系、または安定に増幅されたか（例えばＣＨＯ
／ｄｈｆｒ、ＣＨＯ／グルタミン合成酵素）または二重
微小染色体中で不安定に増幅された（例えばネズミ細胞
系統）ＨＥＲ４ＤＮＡの多重コピーを含むように操作さ
れた細胞系統を含む組換えウイルス発現ベクター（例え
ばアデノウイルス、ワクシニアウイルス）が感染した動
物細胞系が包含される。
【００２６】これらのベクターの発現要素は、その長さ
および特異性において変動する。利用する宿主／ベクタ
ー系に依存して、多数の適切な転写および翻訳要素のい
ずれも使用することができる。例えば、動物細胞系にク
ローン化する場合、哺乳動物細胞のゲノムから（例えば
マウスメタロチオネインプロモーター）またはこれらの
細胞中で生育するウイルスから（例えばワクシニアウイ
ルス７．５Ｋプロモーターまたはモロニーネズミ肉腫ウ
イルス長末端リピート）単離したプロモーターを使用す
ることができる。組換えＤＮＡまたは合成技術により製
造したプロモーターを使用し、挿入した配列の転写を与
えることもできる。挿入した蛋白質コード配列の十分な
翻訳には、特定の開始シグナルも必要である。これらの
シグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が包含
される。それ自体の開始コドンおよび隣接配列を含む全
ＨＥＲ４遺伝子を適切な発現ベクターに挿入する場合、
更なる翻訳調節シグナルは必要としなくてもよい。しか
しながら、コード配列の一部のみを挿入する場合は、Ａ
ＴＧ開始コドンを含む外来の翻訳調節シグナルを与えな
ければならない。更に、開始コドンは、全挿入物の翻訳
を確実にするため、ＨＥＲ４コード配列のリーディング
フレームと相が合っていなければならない。これらの外
来の翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然および
合成の両者の多様な起源のものとすることができる。発
現の効率は、翻訳アテニュエーション配列、エンハンサ
ー要素等を取入れることにより増強することができる。
および特異性において変動する。利用する宿主／ベクタ
ー系に依存して、多数の適切な転写および翻訳要素のい
ずれも使用することができる。例えば、動物細胞系にク
ローン化する場合、哺乳動物細胞のゲノムから（例えば
マウスメタロチオネインプロモーター）またはこれらの
細胞中で生育するウイルスから（例えばワクシニアウイ
ルス７．５Ｋプロモーターまたはモロニーネズミ肉腫ウ
イルス長末端リピート）単離したプロモーターを使用す
ることができる。組換えＤＮＡまたは合成技術により製
造したプロモーターを使用し、挿入した配列の転写を与
えることもできる。挿入した蛋白質コード配列の十分な
翻訳には、特定の開始シグナルも必要である。これらの
シグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が包含
される。それ自体の開始コドンおよび隣接配列を含む全
ＨＥＲ４遺伝子を適切な発現ベクターに挿入する場合、
更なる翻訳調節シグナルは必要としなくてもよい。しか
しながら、コード配列の一部のみを挿入する場合は、Ａ
ＴＧ開始コドンを含む外来の翻訳調節シグナルを与えな
ければならない。更に、開始コドンは、全挿入物の翻訳
を確実にするため、ＨＥＲ４コード配列のリーディング
フレームと相が合っていなければならない。これらの外
来の翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然および
合成の両者の多様な起源のものとすることができる。発
現の効率は、翻訳アテニュエーション配列、エンハンサ
ー要素等を取入れることにより増強することができる。
【００２７】例えば、発現ベクターとしてアデノウイル
スを使用する場合、アデノウイルス転写／翻訳調節複合
体、例えば後期プロモーターおよび３部からなるリーダ
ー配列に所望のＨＥＲ４コード配列を連結することがで
きる。その後試験管内または生体内組換えにより、この
キメラ遺伝子をアデノウイルスゲノムに挿入することが
できる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅ３
またはＥ４）への挿入の結果、感染した宿主中で生存可
能でありＨＥＲ４を発現し得る組換えウイルスが与えら
れることとなる。同様に、ワクシニア７．５Ｋプロモー
ターも使用することができる。ＨＥＲ４を発現させるの
に使用し得る他の発現系は昆虫の系である。この種の系
の１つでは、オートグラファ・カリホルニカ（Autograp
ha californica）核ポリヒドロシスウイルス（ＡｃＮＰ
Ｖ）を、外来遺伝子を発現させるベクターとして使用す
る。このウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ（Spod
optera frugiperda ）細胞中で生育する。ＨＥＲ４コー
ド配列をウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺
伝子）にクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター（例え
ばポリヘドリンプロモーター）の調節下に置くことがで
きる。ＨＥＲ４コード配列を成功裡に挿入すると、結果
的にポリヘドリン遺伝子が不活性化し、非収蔵組換えウ
イルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードさ
れる蛋白質性コートを欠失するウイルス）が製造される
こととなる。その後これらの組換えウイルスを使用して
スポドプテラ・フルギペルダ細胞に感染させ、この中で
挿入した遺伝子を発現させる。更に他の手法は、両栄養
性パッケージング細胞系統中で調製したレトロウイルス
ベクターを使用するものであり、これにより多数の細胞
種類で効率的な発現が可能となる。この方法により、挿
入した蛋白質コード配列の細胞型特異的プロセシング、
制御または機能を評価することができる。
スを使用する場合、アデノウイルス転写／翻訳調節複合
体、例えば後期プロモーターおよび３部からなるリーダ
ー配列に所望のＨＥＲ４コード配列を連結することがで
きる。その後試験管内または生体内組換えにより、この
キメラ遺伝子をアデノウイルスゲノムに挿入することが
できる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅ３
またはＥ４）への挿入の結果、感染した宿主中で生存可
能でありＨＥＲ４を発現し得る組換えウイルスが与えら
れることとなる。同様に、ワクシニア７．５Ｋプロモー
ターも使用することができる。ＨＥＲ４を発現させるの
に使用し得る他の発現系は昆虫の系である。この種の系
の１つでは、オートグラファ・カリホルニカ（Autograp
ha californica）核ポリヒドロシスウイルス（ＡｃＮＰ
Ｖ）を、外来遺伝子を発現させるベクターとして使用す
る。このウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ（Spod
optera frugiperda ）細胞中で生育する。ＨＥＲ４コー
ド配列をウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺
伝子）にクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター（例え
ばポリヘドリンプロモーター）の調節下に置くことがで
きる。ＨＥＲ４コード配列を成功裡に挿入すると、結果
的にポリヘドリン遺伝子が不活性化し、非収蔵組換えウ
イルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードさ
れる蛋白質性コートを欠失するウイルス）が製造される
こととなる。その後これらの組換えウイルスを使用して
スポドプテラ・フルギペルダ細胞に感染させ、この中で
挿入した遺伝子を発現させる。更に他の手法は、両栄養
性パッケージング細胞系統中で調製したレトロウイルス
ベクターを使用するものであり、これにより多数の細胞
種類で効率的な発現が可能となる。この方法により、挿
入した蛋白質コード配列の細胞型特異的プロセシング、
制御または機能を評価することができる。
【００２８】更に、挿入した配列の発現を変調させる
か、所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾またはプロセ
シングする宿主細胞株を選択することができる。ある種
のインデューサーの存在下である種のプロモートからの
発現を高めることができる（例えばメタロチオネインプ
ロモーターについて亜鉛およびカドミウムイオン）。し
たがって、組換えＨＥＲ４ポリペプチドの発現を調節す
ることができる。これは、クローン化した外来遺伝子の
蛋白質産物が宿主細胞にとって致死的である場合に重要
である。更に、蛋白質産物の修飾（例えばリン酸化）お
よびプロセシング（例えば開裂）は、蛋白質の機能につ
いて重要である。異なる宿主細胞は、蛋白質の翻訳後プ
ロセシングおよび修飾について特徴および特異的な機構
を有する。適切な細胞系統または宿主系を選択し、発現
した外来蛋白質の正しい修飾およびプロセシングを確実
にすることができる。
か、所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾またはプロセ
シングする宿主細胞株を選択することができる。ある種
のインデューサーの存在下である種のプロモートからの
発現を高めることができる（例えばメタロチオネインプ
ロモーターについて亜鉛およびカドミウムイオン）。し
たがって、組換えＨＥＲ４ポリペプチドの発現を調節す
ることができる。これは、クローン化した外来遺伝子の
蛋白質産物が宿主細胞にとって致死的である場合に重要
である。更に、蛋白質産物の修飾（例えばリン酸化）お
よびプロセシング（例えば開裂）は、蛋白質の機能につ
いて重要である。異なる宿主細胞は、蛋白質の翻訳後プ
ロセシングおよび修飾について特徴および特異的な機構
を有する。適切な細胞系統または宿主系を選択し、発現
した外来蛋白質の正しい修飾およびプロセシングを確実
にすることができる。
【００２９】５．３．３．ＨＥＲ４遺伝子産物を発現す
る形質転換体 組換えコード配列を含み、所望のＨＥＲ４ポリペプチド
生成物を発現する宿主細胞は、少なくとも４つの一般的
な手法により同定することができる：（ａ）ＤＮＡ−Ｄ
ＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−アンチセンスＲＮ
Ａハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子
機能の存在または非存在、（ｃ）宿主細胞中でのＨＥＲ
４ｍＲＮＡ転写体の発現により測定した転写のレベルの
評価、および（ｄ）免疫検定により、および最終的には
その生物学的活性により測定したＨＥＲ４生成物の検
出。第１の手法では、例えば、ＨＥＲ４コード配列に相
同のポリヌクレオチドからなるＰＣＲ反応のためのハイ
ブリダイゼーションプローブおよび／またはプライマー
を使用するＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによ
り、発現ベクターに挿入したＨＥＲ４コード配列の存在
を検出することができる。
る形質転換体 組換えコード配列を含み、所望のＨＥＲ４ポリペプチド
生成物を発現する宿主細胞は、少なくとも４つの一般的
な手法により同定することができる：（ａ）ＤＮＡ−Ｄ
ＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−アンチセンスＲＮ
Ａハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子
機能の存在または非存在、（ｃ）宿主細胞中でのＨＥＲ
４ｍＲＮＡ転写体の発現により測定した転写のレベルの
評価、および（ｄ）免疫検定により、および最終的には
その生物学的活性により測定したＨＥＲ４生成物の検
出。第１の手法では、例えば、ＨＥＲ４コード配列に相
同のポリヌクレオチドからなるＰＣＲ反応のためのハイ
ブリダイゼーションプローブおよび／またはプライマー
を使用するＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによ
り、発現ベクターに挿入したＨＥＲ４コード配列の存在
を検出することができる。
【００３０】第２の手法では、ある種の「マーカー」遺
伝子機能（例えばチミジンキナーゼ活性、抗生物質に対
する耐性、メトトレキセート（ＭＴＸ）に対する耐性、
メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）に対する耐性、形
質転換表現型、バキュロウイルスにおける収蔵体形成
等）の存在または非存在に基き、組換え発現ベクター／
宿主系を同定し選択することができる。例えば、ＨＥＲ
４コード配列をベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入
した場合、マーカー遺伝子機能の非存在によりそのコー
ド配列を含む組換え体を同定することができる。その
他、ＨＥＲ４コード配列の発現を調節するのに使用する
同一または異なるプロモーターの調節下に、ＨＥＲ４配
列と直列にマーカー遺伝子を配置することができる。誘
導または選択に応答したマーカーの発現は、ＨＥＲ４コ
ード配列の発現を示す。ここに例として記載する特定の
態様では、選択可能マーカーとしてグルタミン合成酵素
を組込むＨＥＲ４発現ベクターを構成して使用し、ＣＨ
Ｏ細胞に形質移入し、ＣＨＯ細胞中でのＨＥＲ４の増幅
した発現を、ＭＳＸの増加する濃度による選択により得
るものとする。
伝子機能（例えばチミジンキナーゼ活性、抗生物質に対
する耐性、メトトレキセート（ＭＴＸ）に対する耐性、
メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）に対する耐性、形
質転換表現型、バキュロウイルスにおける収蔵体形成
等）の存在または非存在に基き、組換え発現ベクター／
宿主系を同定し選択することができる。例えば、ＨＥＲ
４コード配列をベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入
した場合、マーカー遺伝子機能の非存在によりそのコー
ド配列を含む組換え体を同定することができる。その
他、ＨＥＲ４コード配列の発現を調節するのに使用する
同一または異なるプロモーターの調節下に、ＨＥＲ４配
列と直列にマーカー遺伝子を配置することができる。誘
導または選択に応答したマーカーの発現は、ＨＥＲ４コ
ード配列の発現を示す。ここに例として記載する特定の
態様では、選択可能マーカーとしてグルタミン合成酵素
を組込むＨＥＲ４発現ベクターを構成して使用し、ＣＨ
Ｏ細胞に形質移入し、ＣＨＯ細胞中でのＨＥＲ４の増幅
した発現を、ＭＳＸの増加する濃度による選択により得
るものとする。
【００３１】第３の手法では、ＨＥＲ４コード領域につ
いての転写活性をハイブリダイゼーション検定により評
価することができる。例えば、ＨＥＲ４コード配列また
はその特定の部分に相同のプローブを使用するノーザン
ブロットにより、ポリアデニル化ＲＮＡを単離して分析
することができる。その他、宿主細胞の全核酸を抽出
し、この種のプローブに対するハイブリダイゼーション
について検定することができる。第４の手法では、ＨＥ
Ｒ４の発現を、例えばウエスタンブロット、放射性免疫
沈殿のような免疫検定、酵素連結免疫検定等により免疫
学的に評価することができる。その他、生物学的に活性
な生成物を検出することによりＨＥＲ４の発現を評価す
ることができる。宿主細胞が遺伝子産物を分泌する場
合、形質移入宿主培養細胞から得た細胞を含有しない培
地を、ＨＥＲ４活性について検定することができる。遺
伝子産物が分泌されない場合、この種の活性について細
胞溶解物を検定することができる。いずれの場合も、Ｈ
ＥＲ４に対するリガンド結合、ＨＥＲ４リン酸化、また
はＨＥＲ４の他の生物活性を測定する検定を使用するこ
とができる。
いての転写活性をハイブリダイゼーション検定により評
価することができる。例えば、ＨＥＲ４コード配列また
はその特定の部分に相同のプローブを使用するノーザン
ブロットにより、ポリアデニル化ＲＮＡを単離して分析
することができる。その他、宿主細胞の全核酸を抽出
し、この種のプローブに対するハイブリダイゼーション
について検定することができる。第４の手法では、ＨＥ
Ｒ４の発現を、例えばウエスタンブロット、放射性免疫
沈殿のような免疫検定、酵素連結免疫検定等により免疫
学的に評価することができる。その他、生物学的に活性
な生成物を検出することによりＨＥＲ４の発現を評価す
ることができる。宿主細胞が遺伝子産物を分泌する場
合、形質移入宿主培養細胞から得た細胞を含有しない培
地を、ＨＥＲ４活性について検定することができる。遺
伝子産物が分泌されない場合、この種の活性について細
胞溶解物を検定することができる。いずれの場合も、Ｈ
ＥＲ４に対するリガンド結合、ＨＥＲ４リン酸化、また
はＨＥＲ４の他の生物活性を測定する検定を使用するこ
とができる。
【００３２】５．４．抗ＨＥＲ４抗体 この発明は、ＨＥＲ４ポリペプチドのエピトープを認識
するポリクローナルおよびモノクローナル抗体にも向け
られている。抗ＨＥＲ４抗体は、腫瘍学の分野における
多様な有用な用途を有することが期待され、その幾つか
を一般的に以下に記載する。抗ＨＥＲ４抗体の種々の使
用の更に詳細かつ特定の説明は、後続するセクションお
よびサブセクションに示す。簡略には、抗ＨＥＲ４抗体
は、培養細胞、組織サンプルおよび生体内におけるＨＥ
Ｒ４ポリペプチド発現の検出および定量に使用すること
ができる。ＨＥＲ４のこの種の免疫学的検出は、例え
ば、異常または減衰したＨＥＲ４発現および／または機
能を特徴とする新生組織の予後を同定、モニターまた補
助するのに使用することができる。更に、ＨＥＲ４構造
の異なる部分由来のエピトープを認識するモノクローナ
ル抗体を使用し、素朴なＨＥＲ４および種々の下位構成
要素および／または分子の変異形態を検出しかつ／また
は識別することができる。抗ＨＥＲ４抗体調製物は、特
定のヒトガンを有効に処置し得る有用な生物変調剤とし
て考えることもできる。抗ＨＥＲ４抗体の種々の診断お
よび治療的有用性に加えて、多数の工業的および研究用
途が当業者に明らかであり、これには例えばＨＥＲ４ポ
リペプチドの精製のための親和性試薬として、またＨＥ
Ｒ４の生合成、代謝および生物学的機能を解明するため
の免疫学的プローブとして、抗ＨＥＲ４抗体を使用する
ことが包含される。
するポリクローナルおよびモノクローナル抗体にも向け
られている。抗ＨＥＲ４抗体は、腫瘍学の分野における
多様な有用な用途を有することが期待され、その幾つか
を一般的に以下に記載する。抗ＨＥＲ４抗体の種々の使
用の更に詳細かつ特定の説明は、後続するセクションお
よびサブセクションに示す。簡略には、抗ＨＥＲ４抗体
は、培養細胞、組織サンプルおよび生体内におけるＨＥ
Ｒ４ポリペプチド発現の検出および定量に使用すること
ができる。ＨＥＲ４のこの種の免疫学的検出は、例え
ば、異常または減衰したＨＥＲ４発現および／または機
能を特徴とする新生組織の予後を同定、モニターまた補
助するのに使用することができる。更に、ＨＥＲ４構造
の異なる部分由来のエピトープを認識するモノクローナ
ル抗体を使用し、素朴なＨＥＲ４および種々の下位構成
要素および／または分子の変異形態を検出しかつ／また
は識別することができる。抗ＨＥＲ４抗体調製物は、特
定のヒトガンを有効に処置し得る有用な生物変調剤とし
て考えることもできる。抗ＨＥＲ４抗体の種々の診断お
よび治療的有用性に加えて、多数の工業的および研究用
途が当業者に明らかであり、これには例えばＨＥＲ４ポ
リペプチドの精製のための親和性試薬として、またＨＥ
Ｒ４の生合成、代謝および生物学的機能を解明するため
の免疫学的プローブとして、抗ＨＥＲ４抗体を使用する
ことが包含される。
【００３３】抗ＨＥＲ４抗体は、ＨＥＲ４によって直接
または間接に媒介される細胞機能および挙動に影響を与
えるのに有用たり得る。例として、抗ＨＥＲ４抗体を用
いるＨＥＲ４の生物学的活性の変調は、ＨＥＲ２活性化
に影響を与え、この結果としてＨＥＲ２により生成され
る細胞内シグナルを変調し得る。これに関連して、抗Ｈ
ＥＲ４抗体は、ＨＥＲ２のリガンド誘導ＨＥＲ４媒介活
性化を有効にブロックするのに有用たり得て、これによ
りＨＥＲ２の生物学的活性に影響を与えるものである。
逆に、ＨＥＲ４リガンドとして作用し得る抗ＨＥＲ４抗
体は、ＨＥＲ４の生物学的活性の引金を引きかつ／また
はＨＥＲ２の生物学的活性に対するリガンド誘導ＨＥＲ
４媒介効果を開始させるのに使用することができ、この
結果分化、生育阻害等の細胞応答が与えられる。更に、
細胞毒性化合物と接合させた抗ＨＥＲ４抗体を使用し、
選択的にこの種の化合物の標的を、ＨＥＲ４を発現する
腫瘍細胞とすることができ、この結果として腫瘍細胞の
死亡および腫瘍の減少または根絶を得ることができる。
特定の態様では、ＨＥＲ４に結合してこの種の細胞中に
内在化する能力を有する毒物接合抗体を、標的化した細
胞毒性効果を図るべく全身投与する。放射性核種および
毒素接合抗ＨＥＲ４抗体の調製および使用は、セクショ
ン５．５．、後記で更に説明する。
または間接に媒介される細胞機能および挙動に影響を与
えるのに有用たり得る。例として、抗ＨＥＲ４抗体を用
いるＨＥＲ４の生物学的活性の変調は、ＨＥＲ２活性化
に影響を与え、この結果としてＨＥＲ２により生成され
る細胞内シグナルを変調し得る。これに関連して、抗Ｈ
ＥＲ４抗体は、ＨＥＲ２のリガンド誘導ＨＥＲ４媒介活
性化を有効にブロックするのに有用たり得て、これによ
りＨＥＲ２の生物学的活性に影響を与えるものである。
逆に、ＨＥＲ４リガンドとして作用し得る抗ＨＥＲ４抗
体は、ＨＥＲ４の生物学的活性の引金を引きかつ／また
はＨＥＲ２の生物学的活性に対するリガンド誘導ＨＥＲ
４媒介効果を開始させるのに使用することができ、この
結果分化、生育阻害等の細胞応答が与えられる。更に、
細胞毒性化合物と接合させた抗ＨＥＲ４抗体を使用し、
選択的にこの種の化合物の標的を、ＨＥＲ４を発現する
腫瘍細胞とすることができ、この結果として腫瘍細胞の
死亡および腫瘍の減少または根絶を得ることができる。
特定の態様では、ＨＥＲ４に結合してこの種の細胞中に
内在化する能力を有する毒物接合抗体を、標的化した細
胞毒性効果を図るべく全身投与する。放射性核種および
毒素接合抗ＨＥＲ４抗体の調製および使用は、セクショ
ン５．５．、後記で更に説明する。
【００３４】ＨＥＲ２の過剰発現は幾つかのヒトガンに
随伴する。本出願人のデータは、ＨＥＲ４は、ＨＥＲ２
の過剰発現が存在するある種のヒトカルシノーマで発現
されることを示す。したがって、抗ＨＥＲ４抗体は、限
定されるものではないが胸部アデノカルシノーマ細胞を
含む、ＨＥＲ４発現と組合せてＨＥＲ２を過剰発現する
細胞に対して生育および分化制御効果を有し得る。よっ
て、この発明は、ＨＥＲ４受容体に結合してＨＥＲ２ま
たはＨＥＲ２−ＨＥＲ４機能性を変調することができ、
これにより標的細胞の応答に影響を与える抗体を包含す
る。ＨＥＲ２の生物学的活性のＨＥＲ４媒介制御が関与
するガンの処置を図るべく、これらの２つの受容体の間
の細胞内分子相互作用に選択的かつ特異的に影響を与え
得る薬剤を、内在化する抗ＨＥＲ４抗体と接合すること
ができる。この種の薬剤の特異性の結果、胸部ガン細胞
のようなＨＥＲ２およびＨＥＲ４を同時発現する細胞に
おいてのみ生物学的効果が与えられ得る。
随伴する。本出願人のデータは、ＨＥＲ４は、ＨＥＲ２
の過剰発現が存在するある種のヒトカルシノーマで発現
されることを示す。したがって、抗ＨＥＲ４抗体は、限
定されるものではないが胸部アデノカルシノーマ細胞を
含む、ＨＥＲ４発現と組合せてＨＥＲ２を過剰発現する
細胞に対して生育および分化制御効果を有し得る。よっ
て、この発明は、ＨＥＲ４受容体に結合してＨＥＲ２ま
たはＨＥＲ２−ＨＥＲ４機能性を変調することができ、
これにより標的細胞の応答に影響を与える抗体を包含す
る。ＨＥＲ２の生物学的活性のＨＥＲ４媒介制御が関与
するガンの処置を図るべく、これらの２つの受容体の間
の細胞内分子相互作用に選択的かつ特異的に影響を与え
得る薬剤を、内在化する抗ＨＥＲ４抗体と接合すること
ができる。この種の薬剤の特異性の結果、胸部ガン細胞
のようなＨＥＲ２およびＨＥＲ４を同時発現する細胞に
おいてのみ生物学的効果が与えられ得る。
【００３５】ＨＥＲ４のエピトープに対するポリクロー
ナル抗体の製造のために、当業界で公知の種々の手順を
使用することができる。ポリクローナル抗体の製造のた
め、ＨＥＲ４ポリペプチド調製物の１回以上の注射によ
る免疫化による抗ＨＥＲ４抗体の生成に多数の宿主動物
を利用することができ、これには限定されるものではな
いが、ウサギ、マウス、ラット等が包含される。宿主の
種に応じて種々のアジュバントを使用して宿主動物にお
ける免疫学的応答を増加させることができ、これには限
定されるものではないが、フロインド（完全または不完
全）、ミネラルゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面
活性剤、例えばリソレシチン、プルロニックポリオー
ル、ポリアニオン、オイルエマルジョン、スカシ貝ヘモ
シアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用な
ヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（カルメット・ゲラン
ウシ型結核菌）およびコリネバクテリウム・パルブムが
包含される。
ナル抗体の製造のために、当業界で公知の種々の手順を
使用することができる。ポリクローナル抗体の製造のた
め、ＨＥＲ４ポリペプチド調製物の１回以上の注射によ
る免疫化による抗ＨＥＲ４抗体の生成に多数の宿主動物
を利用することができ、これには限定されるものではな
いが、ウサギ、マウス、ラット等が包含される。宿主の
種に応じて種々のアジュバントを使用して宿主動物にお
ける免疫学的応答を増加させることができ、これには限
定されるものではないが、フロインド（完全または不完
全）、ミネラルゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面
活性剤、例えばリソレシチン、プルロニックポリオー
ル、ポリアニオン、オイルエマルジョン、スカシ貝ヘモ
シアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用な
ヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（カルメット・ゲラン
ウシ型結核菌）およびコリネバクテリウム・パルブムが
包含される。
【００３６】継続的な培養細胞系統により抗体分子の生
産を与えるいずれかの技術を使用することにより、ＨＥ
Ｒ４のエピトープに対するモノクローナル抗体を調製す
ることができる。これらには、限定されるものではない
が、コーラーとミルステインにより最初に記載されたハ
イブリドーマ技術（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，
４９５−４９７）、並びにより最近のヒトＢ細胞ハイブ
リドーマ技術（コスボルら、１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２）およびＥＢＶハイブリ
ドーマ技術（コールら、１９８５、モノクローナル抗体
とガン治療、アラン・アール・リス社、第７７〜９６
頁）が包含される。更に、適切な生物学的活性のヒト抗
体分子由来の遺伝子と共に適切な抗原特異性のマウス抗
体分子由来の遺伝子を接合することにより、「キメラ抗
体」を製造するために開発された技術を使用することが
できる（モリソンら、１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５、ニュー
バーガーら、１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４
−６０８、タケダら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１
４：４５２−４５４）。その他、一本鎖抗体の製造のた
めに記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８
号）を採用し、ＨＥＲ４特異的一本鎖抗体を製造するこ
とができる。
産を与えるいずれかの技術を使用することにより、ＨＥ
Ｒ４のエピトープに対するモノクローナル抗体を調製す
ることができる。これらには、限定されるものではない
が、コーラーとミルステインにより最初に記載されたハ
イブリドーマ技術（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，
４９５−４９７）、並びにより最近のヒトＢ細胞ハイブ
リドーマ技術（コスボルら、１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２）およびＥＢＶハイブリ
ドーマ技術（コールら、１９８５、モノクローナル抗体
とガン治療、アラン・アール・リス社、第７７〜９６
頁）が包含される。更に、適切な生物学的活性のヒト抗
体分子由来の遺伝子と共に適切な抗原特異性のマウス抗
体分子由来の遺伝子を接合することにより、「キメラ抗
体」を製造するために開発された技術を使用することが
できる（モリソンら、１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５、ニュー
バーガーら、１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４
−６０８、タケダら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１
４：４５２−４５４）。その他、一本鎖抗体の製造のた
めに記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８
号）を採用し、ＨＥＲ４特異的一本鎖抗体を製造するこ
とができる。
【００３７】抗ＨＥＲ４モノクローナル抗体の組換えヒ
トまたはヒト化変種は、ヒト治療用途のための好適な態
様である。ヒト化した抗体は文献中の手順に従って調製
することができる（例えばジョーンズら、１９８６，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３２１：５２２−２５、レイヒマンら、１
９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−２７、ベルホ
イエンら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３
４−３６）。ヒト化した抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体
の製造のために最近記載された「遺伝子保存変異誘発」
戦略も、ヒト化した抗ＨＥＲ４抗体の製造に用いること
ができる（カーターら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５−
８９）。その他、重および軽領域の無作為の組合せの組
換えファージライブラリーを生成する技術を使用し、組
換え抗ＨＥＲ４抗体を調製することができる（例えばフ
セら、１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−
８１）。
トまたはヒト化変種は、ヒト治療用途のための好適な態
様である。ヒト化した抗体は文献中の手順に従って調製
することができる（例えばジョーンズら、１９８６，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３２１：５２２−２５、レイヒマンら、１
９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−２７、ベルホ
イエンら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３
４−３６）。ヒト化した抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体
の製造のために最近記載された「遺伝子保存変異誘発」
戦略も、ヒト化した抗ＨＥＲ４抗体の製造に用いること
ができる（カーターら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５−
８９）。その他、重および軽領域の無作為の組合せの組
換えファージライブラリーを生成する技術を使用し、組
換え抗ＨＥＲ４抗体を調製することができる（例えばフ
セら、１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−
８１）。
【００３８】例として、ＨＥＲ４を選択的に過剰発現す
る細胞（例えばＡＴＣＣに寄託したようなＣＨＯ／ＨＥ
Ｒ４ ２１−２細胞）を用いるか、または部分的に精製
した組換えＨＥＲ４ポリペプチドを用いてマウスを免疫
化することにより、抗ＨＥＲ４モノクローナル抗体を生
成することができる。１つの態様では、全長のＨＥＲ４
ポリペプチド（図１〜２）をバキュロウイルスの系で発
現させることができ、組換え細胞の膜画分を使用してマ
ウスを免疫化する。その後ＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞（例え
ばＡＴＣＣに寄託したようなＣＨＯ ＨＥＲ４ ２１−
２細胞）上でハイブリドーマを検索し、ＨＥＲ４の細胞
外ドメインと反応性のモノクローナル抗体を同定する。
この種のモノクローナル抗体は、ＮＤＦ、またはＨｅｐ
Ｇ２分化因子、ＨＥＲ４に対する結合をブロックするそ
の能力、結合して細胞表面上に定置して止まるか、また
はＨＥＲ４を発現する細胞内に内在化するその能力、お
よびＨＥＲ４チロシン自己リン酸化を直接上方制御また
は下方制御しかつ／または細胞生育または分化の変調に
帰着するＨＥＲ４媒介シグナルを直接誘導するその能力
について評価することができる。この関連において、Ｈ
ＥＲ２に向けられたモノクローナル抗体Ｎ２８およびＮ
２９は、高い親和力でＨＥＲ２に特異的に結合する。し
かしながら、モノクローナルＮ２９の結合は、結果的に
無胸腺マウスにおいて受容体内在化および下方制御、形
態分化、およびＨＥＲ２発現腫瘍細胞の阻害を与える。
る細胞（例えばＡＴＣＣに寄託したようなＣＨＯ／ＨＥ
Ｒ４ ２１−２細胞）を用いるか、または部分的に精製
した組換えＨＥＲ４ポリペプチドを用いてマウスを免疫
化することにより、抗ＨＥＲ４モノクローナル抗体を生
成することができる。１つの態様では、全長のＨＥＲ４
ポリペプチド（図１〜２）をバキュロウイルスの系で発
現させることができ、組換え細胞の膜画分を使用してマ
ウスを免疫化する。その後ＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞（例え
ばＡＴＣＣに寄託したようなＣＨＯ ＨＥＲ４ ２１−
２細胞）上でハイブリドーマを検索し、ＨＥＲ４の細胞
外ドメインと反応性のモノクローナル抗体を同定する。
この種のモノクローナル抗体は、ＮＤＦ、またはＨｅｐ
Ｇ２分化因子、ＨＥＲ４に対する結合をブロックするそ
の能力、結合して細胞表面上に定置して止まるか、また
はＨＥＲ４を発現する細胞内に内在化するその能力、お
よびＨＥＲ４チロシン自己リン酸化を直接上方制御また
は下方制御しかつ／または細胞生育または分化の変調に
帰着するＨＥＲ４媒介シグナルを直接誘導するその能力
について評価することができる。この関連において、Ｈ
ＥＲ２に向けられたモノクローナル抗体Ｎ２８およびＮ
２９は、高い親和力でＨＥＲ２に特異的に結合する。し
かしながら、モノクローナルＮ２９の結合は、結果的に
無胸腺マウスにおいて受容体内在化および下方制御、形
態分化、およびＨＥＲ２発現腫瘍細胞の阻害を与える。
【００３９】これに対し、ＨＥＲ２発現細胞に対するモ
ノクローナルＮ２８の結合は、結果的に試験管内および
生体内の両者において自己リン酸化の刺激、および腫瘍
細胞生育の促進を与える（バクスら、１９９２，Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：２５８０−８９、スタンコブス
キーら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：８６９１−９５）。更に他の
態様では、可溶性組換えＨＥＲ４−免疫グロブリン（Ｈ
ＥＲ４−Ｉｇ）融合蛋白質を発現させ、蛋白質Ａアフィ
ニティカラムにより生成する。この種のＨＥＲ４−Ｉｇ
融合蛋白質のアミノ酸配列を図１７に示す。その後可溶
性ＨＥＲ４−Ｉｇ融合蛋白質を使用し、抗体結合部位の
可変ドメインの全ての利用可能な組合せがライブラリー
中のファージの表面上に与えられるように設計したファ
ージライブラリーを検索することができる。ＨＥＲ４−
Ｉｇ融合蛋白質を特異的に認識するファージから組換え
抗ＨＥＲ４抗体を増やすことができる。公知の技術によ
り、分子のイディオタイプを含む抗体断片を生成するこ
とができる。例えば、この種の断片には、限定されるも
のではないが、無傷の抗体分子のペプシン消化により製
造することができるＦ（ａｂ′）2 断片、Ｆ（ａｂ′）
2 断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成す
ることができるＦａｂ′断片、およびパパインおよび還
元剤を用いて抗体分子を処理することにより生成するこ
とができる２つのＦａｂ断片が包含される。その他、Ｆ
ａｂ発現ライブラリーを構成し（フセら、１９８９，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１）、ＨＥＲ
４蛋白質に対する所望の特異性を有するモノクローナル
Ｆａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能とすることがで
きる。
ノクローナルＮ２８の結合は、結果的に試験管内および
生体内の両者において自己リン酸化の刺激、および腫瘍
細胞生育の促進を与える（バクスら、１９９２，Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：２５８０−８９、スタンコブス
キーら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：８６９１−９５）。更に他の
態様では、可溶性組換えＨＥＲ４−免疫グロブリン（Ｈ
ＥＲ４−Ｉｇ）融合蛋白質を発現させ、蛋白質Ａアフィ
ニティカラムにより生成する。この種のＨＥＲ４−Ｉｇ
融合蛋白質のアミノ酸配列を図１７に示す。その後可溶
性ＨＥＲ４−Ｉｇ融合蛋白質を使用し、抗体結合部位の
可変ドメインの全ての利用可能な組合せがライブラリー
中のファージの表面上に与えられるように設計したファ
ージライブラリーを検索することができる。ＨＥＲ４−
Ｉｇ融合蛋白質を特異的に認識するファージから組換え
抗ＨＥＲ４抗体を増やすことができる。公知の技術によ
り、分子のイディオタイプを含む抗体断片を生成するこ
とができる。例えば、この種の断片には、限定されるも
のではないが、無傷の抗体分子のペプシン消化により製
造することができるＦ（ａｂ′）2 断片、Ｆ（ａｂ′）
2 断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成す
ることができるＦａｂ′断片、およびパパインおよび還
元剤を用いて抗体分子を処理することにより生成するこ
とができる２つのＦａｂ断片が包含される。その他、Ｆ
ａｂ発現ライブラリーを構成し（フセら、１９８９，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１）、ＨＥＲ
４蛋白質に対する所望の特異性を有するモノクローナル
Ｆａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能とすることがで
きる。
【００４０】５．５．診断方法 この発明は、ヒト新生組織の状況、詳しくは上皮起源の
カルシノーマ、更に詳しくはヒト胸部カルシノーマの検
出にも関する。１つの態様では、適切なハイブリダイゼ
ーションまたはＰＣＲ形式の検定を使用し、血液、血清
または組織生検サンプルのようなヒト生物学的サンプル
中のＨＥＲ４ｍＲＮＡレベルの定量的検出のために、図
１〜２に示すコンセンサスＨＥＲ４ｃＤＮＡ配列の一部
に対応するオリゴマーを使用し、新生組織形成を示すも
のとして異常に高いレベルのＨＥＲ４を発現する細胞ま
たは組織の検出を図る。関連する態様では、適切なＨＥ
Ｒ２配列を使用し、ＨＥＲ４ｍＲＮＡの検出をＨＥＲ２
ｍＲＮＡ過剰発現の検出と組合せ、ＨＥＲ２とＨＥＲ４
との間の機能的関連性が存在し得る新生組織形成を同定
することができる。
カルシノーマ、更に詳しくはヒト胸部カルシノーマの検
出にも関する。１つの態様では、適切なハイブリダイゼ
ーションまたはＰＣＲ形式の検定を使用し、血液、血清
または組織生検サンプルのようなヒト生物学的サンプル
中のＨＥＲ４ｍＲＮＡレベルの定量的検出のために、図
１〜２に示すコンセンサスＨＥＲ４ｃＤＮＡ配列の一部
に対応するオリゴマーを使用し、新生組織形成を示すも
のとして異常に高いレベルのＨＥＲ４を発現する細胞ま
たは組織の検出を図る。関連する態様では、適切なＨＥ
Ｒ２配列を使用し、ＨＥＲ４ｍＲＮＡの検出をＨＥＲ２
ｍＲＮＡ過剰発現の検出と組合せ、ＨＥＲ２とＨＥＲ４
との間の機能的関連性が存在し得る新生組織形成を同定
することができる。
【００４１】他の態様では、当業界で周知の多様な免疫
検定形式を使用し、標識した抗ＨＥＲ４抗体または抗体
誘導体を使用して生物学的サンプル中のＨＥＲ４の存在
を検出すると共に、その場での診断放射性免疫画像形成
に使用することができる。現在の診断および表示技術で
は、転移性腫瘍についての体の包括的な走査は日常的に
は得られない。よって、例えば蛍光性、化学発光性およ
び放射性分子により標識した抗ＨＥＲ４抗体により、こ
の制限を克服することができる。好適な態様では、ＨＥ
Ｒ４のエピトープに特異的であるが、他のＥＧＦＲ系統
群の構成員とは有意に交差反応しないモノクローナル抗
体にガンマ放射診断放射性核種を付着させる。標識した
抗体をその後患者に全身的に注射し、ガンマカメラを使
用してＨＥＲ４分子の分布および密度について全身画像
形成を行い、その後必要に応じてコンピューター化断層
撮影を使用する局在化画像形成または磁気共鳴画像形成
を行い、状況を確認しかつ／または評価する。好適な診
断放射性核種には、限定されるものではないが、テクネ
チウム−９９ｍ、インジウム−１１１、ヨウ素−１２３
およびヨウ素−１３１が包含される。組換え抗体−メタ
ロチオネインキメラ（Ａｂ−ＭＴｓ）を先に記載された
ように生成することができる（ダスら、１９９２，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８
９：９７４９−５３）。メタロチオネインのキレート機
能によりこの種のＡｂ−ＭＴｓにテクニチウム−９９ｍ
を負荷することができ、化学的に接合したキレート剤を
越える利点を与え得る。特に、高度に保存されたメタロ
チオニン構造は、結果的に最小の免疫原性を与え得る。
検定形式を使用し、標識した抗ＨＥＲ４抗体または抗体
誘導体を使用して生物学的サンプル中のＨＥＲ４の存在
を検出すると共に、その場での診断放射性免疫画像形成
に使用することができる。現在の診断および表示技術で
は、転移性腫瘍についての体の包括的な走査は日常的に
は得られない。よって、例えば蛍光性、化学発光性およ
び放射性分子により標識した抗ＨＥＲ４抗体により、こ
の制限を克服することができる。好適な態様では、ＨＥ
Ｒ４のエピトープに特異的であるが、他のＥＧＦＲ系統
群の構成員とは有意に交差反応しないモノクローナル抗
体にガンマ放射診断放射性核種を付着させる。標識した
抗体をその後患者に全身的に注射し、ガンマカメラを使
用してＨＥＲ４分子の分布および密度について全身画像
形成を行い、その後必要に応じてコンピューター化断層
撮影を使用する局在化画像形成または磁気共鳴画像形成
を行い、状況を確認しかつ／または評価する。好適な診
断放射性核種には、限定されるものではないが、テクネ
チウム−９９ｍ、インジウム−１１１、ヨウ素−１２３
およびヨウ素−１３１が包含される。組換え抗体−メタ
ロチオネインキメラ（Ａｂ−ＭＴｓ）を先に記載された
ように生成することができる（ダスら、１９９２，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８
９：９７４９−５３）。メタロチオネインのキレート機
能によりこの種のＡｂ−ＭＴｓにテクニチウム−９９ｍ
を負荷することができ、化学的に接合したキレート剤を
越える利点を与え得る。特に、高度に保存されたメタロ
チオニン構造は、結果的に最小の免疫原性を与え得る。
【００４２】５．６．標的化ガン治療 この発明は、限定されるものではないが、ヒト胸部カル
シノーマおよびＨＥＲ４を過剰発現するかまたはＨＥＲ
４の発現と組合せてＨＥＲ２を過剰発現する他の新生組
織を含む、ＨＥＲ４の異常発現および／または機能が関
与するヒトガンおよびＨＥＲ２の過剰発現がＨＥＲ４の
近接した発現と組合せられたガンの処置方法にも向けら
れている。この発明のガン治療方法は、一般に非接合、
毒物または放射性核種接合ＨＥＲ４抗体、リガンド、お
よびその誘導体または断片を用いる処置に基く。１つの
特定の態様では、転移性胸部ガンのようなＨＥＲ２およ
び／またはＨＥＲ４を過剰発現するある種のガンの全身
性および標的化した治療のために、正常な組織および器
官に対して最小の毒性でこの種のＨＥＲ４抗体を使用す
ることができる。重要なことには、この関連において、
抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体は、ＨＥＲ２を過剰発現
するヒト腫瘍細胞の生育を阻害することが示されている
（バクスら、１９９２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：
２５８０−８９）。接合した抗体治療に加えて、ＨＥＲ
４を介するＮＤＦシグナル化の変調により、ＨＥＲ４活
性化についてスーパーアゴニストとして作用するＨＥＲ
４中和性モノクローナル抗体、ＮＤＦ／ＨＥＲ４アンタ
ゴニスト、モノクローナル抗体またはリガンド、または
ヘテロ二量体形成を破壊するかＨＥＲ２基質のＨＥＲ媒
介リン酸化をブロックすることによりＨＥＲ２とＨＥＲ
４との間の相互作用をブロックする薬剤を使用し、ある
種の胸部ガン細胞のようなＨＥＲ２を過剰発現する細胞
の生育および分化に影響を与える手段を提供することが
できる。
シノーマおよびＨＥＲ４を過剰発現するかまたはＨＥＲ
４の発現と組合せてＨＥＲ２を過剰発現する他の新生組
織を含む、ＨＥＲ４の異常発現および／または機能が関
与するヒトガンおよびＨＥＲ２の過剰発現がＨＥＲ４の
近接した発現と組合せられたガンの処置方法にも向けら
れている。この発明のガン治療方法は、一般に非接合、
毒物または放射性核種接合ＨＥＲ４抗体、リガンド、お
よびその誘導体または断片を用いる処置に基く。１つの
特定の態様では、転移性胸部ガンのようなＨＥＲ２およ
び／またはＨＥＲ４を過剰発現するある種のガンの全身
性および標的化した治療のために、正常な組織および器
官に対して最小の毒性でこの種のＨＥＲ４抗体を使用す
ることができる。重要なことには、この関連において、
抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体は、ＨＥＲ２を過剰発現
するヒト腫瘍細胞の生育を阻害することが示されている
（バクスら、１９９２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：
２５８０−８９）。接合した抗体治療に加えて、ＨＥＲ
４を介するＮＤＦシグナル化の変調により、ＨＥＲ４活
性化についてスーパーアゴニストとして作用するＨＥＲ
４中和性モノクローナル抗体、ＮＤＦ／ＨＥＲ４アンタ
ゴニスト、モノクローナル抗体またはリガンド、または
ヘテロ二量体形成を破壊するかＨＥＲ２基質のＨＥＲ媒
介リン酸化をブロックすることによりＨＥＲ２とＨＥＲ
４との間の相互作用をブロックする薬剤を使用し、ある
種の胸部ガン細胞のようなＨＥＲ２を過剰発現する細胞
の生育および分化に影響を与える手段を提供することが
できる。
【００４３】標的化免疫毒物媒介ガン治療のため、植物
および細菌毒素のような種々の薬物または毒物を抗ＨＥ
Ｒ４抗体およびその断片に接合することができる。例え
ば、当業界で公知の方法を使用し、リシニス・コミュニ
ス（Ricinis communis）植物由来の細胞毒素であるリシ
ンを抗ＨＥＲ４抗体に接合することができる（例えばブ
ラケイら、１９８８，Ｐｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ ４
５：５０−９０、マルシュとネビレ、１９８８，Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１４０：３６７４−７８）。一旦リシン
が細胞の細胞質内のものとなれば、６０Ｓリボソームサ
ブユニットを不活性化することにより、そのＡ鎖が蛋白
質合成を阻害する（メイら、１９８９，ＥＭＢＯ Ｊ．
８：３０１−０８）。したがってリシンの免疫毒素は極
めて細胞毒性である。しかしながら、Ｂ鎖は実質的に全
ての細胞表面受容体に結合することができるため、リシ
ン免疫毒素は理想的に特異的なものではなく、リシンＡ
鎖単独で作製した免疫毒素が増加した特異性を有する。
リシンＡ鎖の組換えまたは脱グリコシル化形態は、結果
的に免疫毒素の改良された生存率（すなわち、循環系か
らのより遅いクラアランス）を与え得る。リシンＡ鎖を
抗体に接合する方法は公知である（例えばビテラとトル
ペ、細胞生物学セミナー中、第４７〜５８頁、サウンダ
ース、フィラデルフィア、１９９１）。免疫毒素の処方
に使用し得る更なる毒素には、限定されるものではない
が、ダウノルビシン、メトトレキセート、リボソーム阻
害剤（例えばトリコサンチン、トリコキリン、ゲロニ
ン、サポリン、モルモルジンおよびアメリカヤマゴボウ
抗ウイルス蛋白質）および種々の細菌毒素（例えばシュ
ードモナスのエンドトキシン）が包含される。標的化ガ
ン治療のための免疫毒素は、結果的に標的ガン細胞との
抗体相互作用を与え得る全ゆる経路により投与すること
ができ、これには全身投与および腫瘍の部位への直接注
射が含まれる。抗ＨＥＲ４抗体を使用する標的化放射性
治療について、標識化のための好適な放射性核種にはア
ルファ、ベータおよびオージェ電子放射体が含まれる。
アルファ放射体の例にはアスタチン２１１およびビスマ
ス２１２が含まれ、ベータ放射体にはヨウ素１３１、レ
ニウム１８８、銅６７およびイットリウム９０が含ま
れ、ヨウ素１２５はオージェ電子放射体の例である。
および細菌毒素のような種々の薬物または毒物を抗ＨＥ
Ｒ４抗体およびその断片に接合することができる。例え
ば、当業界で公知の方法を使用し、リシニス・コミュニ
ス（Ricinis communis）植物由来の細胞毒素であるリシ
ンを抗ＨＥＲ４抗体に接合することができる（例えばブ
ラケイら、１９８８，Ｐｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ ４
５：５０−９０、マルシュとネビレ、１９８８，Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１４０：３６７４−７８）。一旦リシン
が細胞の細胞質内のものとなれば、６０Ｓリボソームサ
ブユニットを不活性化することにより、そのＡ鎖が蛋白
質合成を阻害する（メイら、１９８９，ＥＭＢＯ Ｊ．
８：３０１−０８）。したがってリシンの免疫毒素は極
めて細胞毒性である。しかしながら、Ｂ鎖は実質的に全
ての細胞表面受容体に結合することができるため、リシ
ン免疫毒素は理想的に特異的なものではなく、リシンＡ
鎖単独で作製した免疫毒素が増加した特異性を有する。
リシンＡ鎖の組換えまたは脱グリコシル化形態は、結果
的に免疫毒素の改良された生存率（すなわち、循環系か
らのより遅いクラアランス）を与え得る。リシンＡ鎖を
抗体に接合する方法は公知である（例えばビテラとトル
ペ、細胞生物学セミナー中、第４７〜５８頁、サウンダ
ース、フィラデルフィア、１９９１）。免疫毒素の処方
に使用し得る更なる毒素には、限定されるものではない
が、ダウノルビシン、メトトレキセート、リボソーム阻
害剤（例えばトリコサンチン、トリコキリン、ゲロニ
ン、サポリン、モルモルジンおよびアメリカヤマゴボウ
抗ウイルス蛋白質）および種々の細菌毒素（例えばシュ
ードモナスのエンドトキシン）が包含される。標的化ガ
ン治療のための免疫毒素は、結果的に標的ガン細胞との
抗体相互作用を与え得る全ゆる経路により投与すること
ができ、これには全身投与および腫瘍の部位への直接注
射が含まれる。抗ＨＥＲ４抗体を使用する標的化放射性
治療について、標識化のための好適な放射性核種にはア
ルファ、ベータおよびオージェ電子放射体が含まれる。
アルファ放射体の例にはアスタチン２１１およびビスマ
ス２１２が含まれ、ベータ放射体にはヨウ素１３１、レ
ニウム１８８、銅６７およびイットリウム９０が含ま
れ、ヨウ素１２５はオージェ電子放射体の例である。
【００４４】５．７．ＨＥＲ４リガンドの同定のための
検定 後記するセクション７．に記載する適切な発現ベクター
を用いる多様な親細胞型の形質移入により、ＥＧＦＲ系
統群の単一の構成員を過剰発現する細胞系統を生成する
ことができる。候補リガンドまたは部分的に精製した調
製物をこの種の細胞に施し、受容体結合および／または
活性化について検定することができる。例えば、ＨＥＲ
４発現プラスミドにより形質移入し、検出可能なＥＧＦ
Ｒ、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３を欠失するＣＨＯ−ＫＩ細
胞系統を使用し、ＨＥＲ４特異的リガンドを検索するこ
とができる。この種の細胞系統の特定の態様は後記する
セクション７．で説明するが、既にＡＴＣＣに寄託され
たものである（ＣＨＯ／ＨＥＲ４ ２１−２）。ＨＥＲ
４自己リン酸化、ＤＮＡ合成の刺激、形態分化の誘導、
培養培地中の血清または生育因子の要求性の緩和、およ
び標識した精製生育因子の直接結合の検出によりリガン
ドを同定することができる。またこの発明は、ＨＥＲ４
受容体により媒介される生物学的活性に影響を与える能
力に基いてＨＥＲ４リガンドの潜在的なアナログを試験
する生物検定にも関する。
検定 後記するセクション７．に記載する適切な発現ベクター
を用いる多様な親細胞型の形質移入により、ＥＧＦＲ系
統群の単一の構成員を過剰発現する細胞系統を生成する
ことができる。候補リガンドまたは部分的に精製した調
製物をこの種の細胞に施し、受容体結合および／または
活性化について検定することができる。例えば、ＨＥＲ
４発現プラスミドにより形質移入し、検出可能なＥＧＦ
Ｒ、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３を欠失するＣＨＯ−ＫＩ細
胞系統を使用し、ＨＥＲ４特異的リガンドを検索するこ
とができる。この種の細胞系統の特定の態様は後記する
セクション７．で説明するが、既にＡＴＣＣに寄託され
たものである（ＣＨＯ／ＨＥＲ４ ２１−２）。ＨＥＲ
４自己リン酸化、ＤＮＡ合成の刺激、形態分化の誘導、
培養培地中の血清または生育因子の要求性の緩和、およ
び標識した精製生育因子の直接結合の検出によりリガン
ドを同定することができる。またこの発明は、ＨＥＲ４
受容体により媒介される生物学的活性に影響を与える能
力に基いてＨＥＲ４リガンドの潜在的なアナログを試験
する生物検定にも関する。
【００４５】５．８．ＨＥＲ４アナログ ＨＥＲ４に関連する誘導体、アナログおよびペプチドの
製造および使用も企図し、この発明の範囲内のものであ
る。この種の誘導体、アナログおよびペプチドを使用
し、ＨＥＲ４特異的リガンドの結合について元のＨＥＲ
４と競合させることができ、これによりＨＥＲ４シグナ
ル導入および機能を阻害する。ＨＥＲ４機能の阻害は幾
つかの応用において利用することができ、これには限定
されるものではないが、ＨＥＲ４の生物学的活性が関与
するガンの処置が含まれる。特定の態様では、図１〜２
に示すＨＥＲ４ヌクレオチドコード配列の一連の欠失変
異体を構成して分析し、ＨＥＲ４リガンドの結合のため
の最小のアミノ酸配列要求を決定することができる。Ｈ
ＥＲ４コード配列の欠失変異体は当業界で公知の方法を
使用して構成することができ、これには限定されるもの
ではないが、ヌクレアーゼおよび／または制限酵素、部
位指向性変異誘発技術、ＰＣＲ等の使用が含まれる。発
現した変異ポリペプチドは、ＨＥＲ４リガンドに結合す
るその能力について検定することができる。その後所望
のＨＥＲ４アナログをコードするＤＮＡ配列を適切な発
現ベクターにクローン化し、細菌または真核細胞中での
過剰発現を図る。限定されるものではないが、イオン交
換クロマトグラフィまたはＨＥＲ４リガンドまたは抗体
を使用するアフィニティクロマトグラフィを含む多数の
方法で、細胞抽出物からペプチドを精製することができ
る。その他、固相技術によりポリペプチドを合成するこ
とができ、その後樹脂からの開裂および高性能液体クロ
マトグラフィによる精製を行う。
製造および使用も企図し、この発明の範囲内のものであ
る。この種の誘導体、アナログおよびペプチドを使用
し、ＨＥＲ４特異的リガンドの結合について元のＨＥＲ
４と競合させることができ、これによりＨＥＲ４シグナ
ル導入および機能を阻害する。ＨＥＲ４機能の阻害は幾
つかの応用において利用することができ、これには限定
されるものではないが、ＨＥＲ４の生物学的活性が関与
するガンの処置が含まれる。特定の態様では、図１〜２
に示すＨＥＲ４ヌクレオチドコード配列の一連の欠失変
異体を構成して分析し、ＨＥＲ４リガンドの結合のため
の最小のアミノ酸配列要求を決定することができる。Ｈ
ＥＲ４コード配列の欠失変異体は当業界で公知の方法を
使用して構成することができ、これには限定されるもの
ではないが、ヌクレアーゼおよび／または制限酵素、部
位指向性変異誘発技術、ＰＣＲ等の使用が含まれる。発
現した変異ポリペプチドは、ＨＥＲ４リガンドに結合す
るその能力について検定することができる。その後所望
のＨＥＲ４アナログをコードするＤＮＡ配列を適切な発
現ベクターにクローン化し、細菌または真核細胞中での
過剰発現を図る。限定されるものではないが、イオン交
換クロマトグラフィまたはＨＥＲ４リガンドまたは抗体
を使用するアフィニティクロマトグラフィを含む多数の
方法で、細胞抽出物からペプチドを精製することができ
る。その他、固相技術によりポリペプチドを合成するこ
とができ、その後樹脂からの開裂および高性能液体クロ
マトグラフィによる精製を行う。
【００４６】
６．実施例：ＨＥＲ４をコードするｃＤＮＡの単離 ＥＧＦＲおよび関連する蛋白質、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３お
よびＸｍｒｋは、そのチロシンキナーゼドメインにおい
て広範なアミノ酸相同性を示す（カプランら、１９９
１，Ｎａｔｕｒｅ ３５０：１５８−１６０、ウェン
ら、１９９２，Ｃｅｌｌ ６９：５５９−７２、ホルメ
スら、１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１２０５−
１０、ヒライら、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：
１７１７−２０）。また、これらの触媒性ドメインをコ
ードするゲノム領域内には、エクソン−イントロン境界
の厳密な保存がある（ウェンら、前記、リンドバーグと
フンター、１９９０，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１
０：６３１６−２４、および未発表の観察）。これらの
４つの蛋白質のキナーゼドメイン由来の単一のエクソン
または隣接するエクソンによりコードされる保存された
アミノ酸に基き、縮退オリゴヌクレオチドプライマーを
設計した。これらのプライマーをポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）で使用し、ネズミＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ２およ
びｅｒｂＢ３に対応するゲノム断片を単離した。更に、
高度に関連するＤＮＡ断片（ＭＥＲ４と呼ぶ）を、これ
らの他の遺伝子とは別個のものとして同定した。類似す
る戦略を使用し、胸部ガン細胞系統、ＭＤＡ−ＭＢ−４
５３からＭＥＲ４のヒト相同体に対応するｃＤＮＡクロ
ーンを取得した。この断片をプローブとして使用し、幾
つかの胸部ガン細胞系統およびヒト心臓が、ＥＧＦＲ関
連転写体の豊富な供給源であることを突き止めた。ヒト
心臓およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を使用してｃＤＮ
Ａライブラリーを構成し、ＨＥＲ４／ｅｒｂＢ４の完全
なオープンリーディングフレームに渡る重複するクロー
ンを単離した。
よびＸｍｒｋは、そのチロシンキナーゼドメインにおい
て広範なアミノ酸相同性を示す（カプランら、１９９
１，Ｎａｔｕｒｅ ３５０：１５８−１６０、ウェン
ら、１９９２，Ｃｅｌｌ ６９：５５９−７２、ホルメ
スら、１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１２０５−
１０、ヒライら、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：
１７１７−２０）。また、これらの触媒性ドメインをコ
ードするゲノム領域内には、エクソン−イントロン境界
の厳密な保存がある（ウェンら、前記、リンドバーグと
フンター、１９９０，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１
０：６３１６−２４、および未発表の観察）。これらの
４つの蛋白質のキナーゼドメイン由来の単一のエクソン
または隣接するエクソンによりコードされる保存された
アミノ酸に基き、縮退オリゴヌクレオチドプライマーを
設計した。これらのプライマーをポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）で使用し、ネズミＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ２およ
びｅｒｂＢ３に対応するゲノム断片を単離した。更に、
高度に関連するＤＮＡ断片（ＭＥＲ４と呼ぶ）を、これ
らの他の遺伝子とは別個のものとして同定した。類似す
る戦略を使用し、胸部ガン細胞系統、ＭＤＡ−ＭＢ−４
５３からＭＥＲ４のヒト相同体に対応するｃＤＮＡクロ
ーンを取得した。この断片をプローブとして使用し、幾
つかの胸部ガン細胞系統およびヒト心臓が、ＥＧＦＲ関
連転写体の豊富な供給源であることを突き止めた。ヒト
心臓およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を使用してｃＤＮ
Ａライブラリーを構成し、ＨＥＲ４／ｅｒｂＢ４の完全
なオープンリーディングフレームに渡る重複するクロー
ンを単離した。
【００４７】６．１．材料および方法 ６．１．１．分子クローン化 ＥＧＦＲ系統群の構成員（表１）由来の保存された配列
に基き、縮退オリゴヌクレオチドの幾つかのプールを合
成した。表１において配列を以下のように表示する。 （１）５′−ＡＣＮＧＴＮＴＧＧＧＡＲＹＴＮＡＹＨＡ
Ｃ−３′配列番号：１４ （２）５′−ＣＡＹＧＴＮＡＡＲＡＴＨＡＣＮＧＡＹＴ
ＴＹＧＧ−３′配列番号：１５ （３）５′−ＧＡＣＧＡＡＴＴＣＣＮＡＴＨＡＡＲＴＧ
ＧＡＴＧＧＣ−３′配列番号：１６ （４）５′−ＡＣＡＹＴＴＮＡＲＤＡＴＤＡＴＣＡＴＲ
ＴＡＮＡＣ−３′配列番号：１７ （５）５′−ＡＡＮＧＴＣＡＴＮＡＲＹＴＣＣＣＡ−
３′配列番号：１８ （６）５′−ＴＣＣＡＧＮＧＣＧＡＴＣＣＡＹＴＴＤＡ
ＴＮＧＧ−３′配列番号：１９ （７）５′−ＧＧＲＴＣＤＡＴＣＡＴＣＣＡＲＣＣＴ−
３′配列番号：２０ （８）５′−ＣＴＧＣＴＧＴＣＡＧＣＡＴＣＧＡＴＣＡ
Ｔ−３′配列番号：２１ （９）ＴＵＷＥＬＭＴ 配列番号：２２ （１０）ＨＵＫＩＴＤＦＧ 配列番号：２３ （１１）ＰＩＫＷＭＡ 配列番号：１３ （１２）ＶＹＭＩＩＬＫ 配列番号：２４ （１３）ＷＥＬＭＴＦ 配列番号：２５ （１４）ＰＩＫＷＭＡＬＥ 配列番号：２６ （１５）ＣＷＭＩＤＰ 配列番号：２７ 全ゲノムＤＮＡを準融合性ネズミＫ１７３５メラノーマ
細胞から単離し、これらのオリゴヌクレオチドプライマ
ーと共に４０サイクルのＰＣＲ増幅において鋳型として
使用した。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル上で解析し、
ヒトＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のキナーゼドメイン由来の
32Ｐ標識プローブとハイブリダイズさせた。別個のＤＮ
Ａバンドを単離し、配列分析のためにサブクローン化し
た。ＰＣＲ増幅におけるプライマーとして縮退オリゴヌ
クレオチドＨ４ＶＷＥＬＭおよびＨ４ＶＹＭＩＩＬを使
用し（プロウマンら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：４５０５−０
９）、ネズミｅｒｂＢ４に対応する１４４ヌクレオチド
の挿入物を含む１つのクローン（ＭＥＲ４−８５）を同
定した。この32Ｐ標識挿入物を使用し、ネズミｅｒｂＢ
４遺伝子の２つのエクソンを含むと認められたネズミＴ
細胞ゲノムライブラリー（ストラタジーン、ラ・ジョ
ラ、ＣＡ）から１７キロベースの断片を単離した。ｅｒ
ｂＢ４エクソンのＤＮＡ配列に基いて特異的オリゴヌク
レオチド（４Ｍ３０７０）を合成し、一本鎖ＭＤＡ−Ｍ
Ｂ−４５３ｃＤＮＡの鋳型上で縮退５′オリゴヌクレオ
チド（Ｈ４ＰＩＫＷＭＡ）と共にＰＣＲ手順で使用し
た。この反応により、ヒトＨＥＲ４に対応する２６０ヌ
クレオチドの断片（ｐＭＤＡＰＩＫ）が生成した。オリ
ゴ（ｄＴ）および特異的プライムしたＭＤＡ−ＭＢ４５
３およびヒト心臓ＲＮＡ（プロウマンら、前記、プロウ
マンら、１９９０，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１
０：１９６９−８１）から、ラムダＺＡＰＩＩ（ストラ
タジーン）中でｃＤＮＡライブラリーを構成した。ｐＭ
ＤＡＰＩＫ由来の32Ｐ標識挿入物によりライブラリーを
プローブ処理することにより、ＨＥＲ４特異的クローン
を単離した。ＨＥＲ４の５′部分のクローン化を完成さ
せるため、ＰＣＲ戦略を使用してｃＤＮＡ末端の迅速な
増幅を可能とした（プロウマンら、前記、フローマン
ら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８９９８−９００２）。オリゴ
ヌクレオチドプライマーと共にＴ７ポリメラーゼを使用
し、両者の鎖について全てのｃＤＮＡクローンおよび幾
つかのＰＣＲ生成クローンを配列決定した（タボルとリ
チャードソン、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：４７６７−７１）。
に基き、縮退オリゴヌクレオチドの幾つかのプールを合
成した。表１において配列を以下のように表示する。 （１）５′−ＡＣＮＧＴＮＴＧＧＧＡＲＹＴＮＡＹＨＡ
Ｃ−３′配列番号：１４ （２）５′−ＣＡＹＧＴＮＡＡＲＡＴＨＡＣＮＧＡＹＴ
ＴＹＧＧ−３′配列番号：１５ （３）５′−ＧＡＣＧＡＡＴＴＣＣＮＡＴＨＡＡＲＴＧ
ＧＡＴＧＧＣ−３′配列番号：１６ （４）５′−ＡＣＡＹＴＴＮＡＲＤＡＴＤＡＴＣＡＴＲ
ＴＡＮＡＣ−３′配列番号：１７ （５）５′−ＡＡＮＧＴＣＡＴＮＡＲＹＴＣＣＣＡ−
３′配列番号：１８ （６）５′−ＴＣＣＡＧＮＧＣＧＡＴＣＣＡＹＴＴＤＡ
ＴＮＧＧ−３′配列番号：１９ （７）５′−ＧＧＲＴＣＤＡＴＣＡＴＣＣＡＲＣＣＴ−
３′配列番号：２０ （８）５′−ＣＴＧＣＴＧＴＣＡＧＣＡＴＣＧＡＴＣＡ
Ｔ−３′配列番号：２１ （９）ＴＵＷＥＬＭＴ 配列番号：２２ （１０）ＨＵＫＩＴＤＦＧ 配列番号：２３ （１１）ＰＩＫＷＭＡ 配列番号：１３ （１２）ＶＹＭＩＩＬＫ 配列番号：２４ （１３）ＷＥＬＭＴＦ 配列番号：２５ （１４）ＰＩＫＷＭＡＬＥ 配列番号：２６ （１５）ＣＷＭＩＤＰ 配列番号：２７ 全ゲノムＤＮＡを準融合性ネズミＫ１７３５メラノーマ
細胞から単離し、これらのオリゴヌクレオチドプライマ
ーと共に４０サイクルのＰＣＲ増幅において鋳型として
使用した。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル上で解析し、
ヒトＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のキナーゼドメイン由来の
32Ｐ標識プローブとハイブリダイズさせた。別個のＤＮ
Ａバンドを単離し、配列分析のためにサブクローン化し
た。ＰＣＲ増幅におけるプライマーとして縮退オリゴヌ
クレオチドＨ４ＶＷＥＬＭおよびＨ４ＶＹＭＩＩＬを使
用し（プロウマンら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：４５０５−０
９）、ネズミｅｒｂＢ４に対応する１４４ヌクレオチド
の挿入物を含む１つのクローン（ＭＥＲ４−８５）を同
定した。この32Ｐ標識挿入物を使用し、ネズミｅｒｂＢ
４遺伝子の２つのエクソンを含むと認められたネズミＴ
細胞ゲノムライブラリー（ストラタジーン、ラ・ジョ
ラ、ＣＡ）から１７キロベースの断片を単離した。ｅｒ
ｂＢ４エクソンのＤＮＡ配列に基いて特異的オリゴヌク
レオチド（４Ｍ３０７０）を合成し、一本鎖ＭＤＡ−Ｍ
Ｂ−４５３ｃＤＮＡの鋳型上で縮退５′オリゴヌクレオ
チド（Ｈ４ＰＩＫＷＭＡ）と共にＰＣＲ手順で使用し
た。この反応により、ヒトＨＥＲ４に対応する２６０ヌ
クレオチドの断片（ｐＭＤＡＰＩＫ）が生成した。オリ
ゴ（ｄＴ）および特異的プライムしたＭＤＡ−ＭＢ４５
３およびヒト心臓ＲＮＡ（プロウマンら、前記、プロウ
マンら、１９９０，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１
０：１９６９−８１）から、ラムダＺＡＰＩＩ（ストラ
タジーン）中でｃＤＮＡライブラリーを構成した。ｐＭ
ＤＡＰＩＫ由来の32Ｐ標識挿入物によりライブラリーを
プローブ処理することにより、ＨＥＲ４特異的クローン
を単離した。ＨＥＲ４の５′部分のクローン化を完成さ
せるため、ＰＣＲ戦略を使用してｃＤＮＡ末端の迅速な
増幅を可能とした（プロウマンら、前記、フローマン
ら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８９９８−９００２）。オリゴ
ヌクレオチドプライマーと共にＴ７ポリメラーゼを使用
し、両者の鎖について全てのｃＤＮＡクローンおよび幾
つかのＰＣＲ生成クローンを配列決定した（タボルとリ
チャードソン、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：４７６７−７１）。
【００４８】
【表１】
【００４９】６．１．２．ノーザンブロット分析 それぞれ線状化したプラスミドｐＨｔ１Ｂ１．６（ヌク
レオチド３０９８で開始する８００ｂｐのＨＥＲ４断片
を含む）およびｐ５′Ｈ４Ｅ７（ＨＥＲ４配列の５′末
端から１ｋｂの断片を含む）から、３′および５′ＨＥ
Ｒ４特異的［α32Ｐ］ＵＴＰ標識アンチセンスＲＮＡプ
ローブを合成した。組織分布分析（後記するセクション
６．２．２．）のため、ノーザンブロット（クロンテッ
ク、パロ・アルト、ＣＡ）は、ナイロン膜に固定化した
８つのヒト組織サンプルからのレーン当り２μｇのポリ
（Ａ）＋ｍＲＮＡを含むものとした。ＲＮＡハイブリダ
イゼーション混合物（５０％ホルムアミド、５×ＳＳ
Ｃ、０．５％ＳＤＳ、１０×デンハード溶液、１００μ
ｇ／ｍｌ変性ニシン精子ＤＮＡ、１００μｇ／ｍｌｔＲ
ＮＡ、および１０μｇ／ｍｌポリアデノシン）中でフィ
ルターを６０℃で数時間予備ハイブリダイズし、１〜
１．５×１０6 ｃｐｍ／ｍｌの32Ｐ標識アンチセンスＲ
ＮＡプローブを用い、同じ緩衝液中で６０℃で一夜ハイ
ブリダイズした。フィルターを０．１×ＳＳＣ／０．１
％ＳＤＳ中、６５℃で洗浄し、ホスホリメイガー（phos
phorimager）（モレキュラー・ダイナミクス、サニーベ
ール、ＣＡ）上で一夜露呈した。
レオチド３０９８で開始する８００ｂｐのＨＥＲ４断片
を含む）およびｐ５′Ｈ４Ｅ７（ＨＥＲ４配列の５′末
端から１ｋｂの断片を含む）から、３′および５′ＨＥ
Ｒ４特異的［α32Ｐ］ＵＴＰ標識アンチセンスＲＮＡプ
ローブを合成した。組織分布分析（後記するセクション
６．２．２．）のため、ノーザンブロット（クロンテッ
ク、パロ・アルト、ＣＡ）は、ナイロン膜に固定化した
８つのヒト組織サンプルからのレーン当り２μｇのポリ
（Ａ）＋ｍＲＮＡを含むものとした。ＲＮＡハイブリダ
イゼーション混合物（５０％ホルムアミド、５×ＳＳ
Ｃ、０．５％ＳＤＳ、１０×デンハード溶液、１００μ
ｇ／ｍｌ変性ニシン精子ＤＮＡ、１００μｇ／ｍｌｔＲ
ＮＡ、および１０μｇ／ｍｌポリアデノシン）中でフィ
ルターを６０℃で数時間予備ハイブリダイズし、１〜
１．５×１０6 ｃｐｍ／ｍｌの32Ｐ標識アンチセンスＲ
ＮＡプローブを用い、同じ緩衝液中で６０℃で一夜ハイ
ブリダイズした。フィルターを０．１×ＳＳＣ／０．１
％ＳＤＳ中、６５℃で洗浄し、ホスホリメイガー（phos
phorimager）（モレキュラー・ダイナミクス、サニーベ
ール、ＣＡ）上で一夜露呈した。
【００５０】６．１．３．ＨＥＲ４の準定量的ＰＣＲ検
出 多様なヒト細胞系統、新鮮な凍結組織および一次腫瘍か
らＲＮＡを単離した。その３′末端にＴ17トラックを含
むオリゴヌクレオチド（ＸＳＣＴ１７：５′ＧＡＣＴＣ
ＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴ−３′）（配列番号：２８）を用いて起動す
ることにより、１０μｇのそれぞれのＲＮＡから一本鎖
ｃＤＮＡを合成した。その後、２つのＨＥＲ４特異的オ
リゴヌクレオチド：４Ｈ２６７４：５′−ＧＡＡＧＡＡ
ＡＧＡＣＧＡＣＴＣＧＴＴＣＡＴＣＧＧ−３′（配列番
号：２９）および４Ｈ２９６５：５′−ＧＡＣＣＡＴＧ
ＡＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＧＴＣＡＡＴＡ−３′（配列番
号：３０）を用いる３５サイクルのＰＣＲ反応で、１％
または５％のそれぞれの一本鎖鋳型調製物を使用した。
反応生成物を２％アガロースゲル上で電気泳動し、臭化
エチジウムで染色し、ＵＶライトボックス上で写真撮影
した。２９１ｂｐＨＥＲ４特異的バンドの相対強度は、
それぞれのサンプルについて表２に示すように見積もら
れた。
出 多様なヒト細胞系統、新鮮な凍結組織および一次腫瘍か
らＲＮＡを単離した。その３′末端にＴ17トラックを含
むオリゴヌクレオチド（ＸＳＣＴ１７：５′ＧＡＣＴＣ
ＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴ−３′）（配列番号：２８）を用いて起動す
ることにより、１０μｇのそれぞれのＲＮＡから一本鎖
ｃＤＮＡを合成した。その後、２つのＨＥＲ４特異的オ
リゴヌクレオチド：４Ｈ２６７４：５′−ＧＡＡＧＡＡ
ＡＧＡＣＧＡＣＴＣＧＴＴＣＡＴＣＧＧ−３′（配列番
号：２９）および４Ｈ２９６５：５′−ＧＡＣＣＡＴＧ
ＡＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＧＴＣＡＡＴＡ−３′（配列番
号：３０）を用いる３５サイクルのＰＣＲ反応で、１％
または５％のそれぞれの一本鎖鋳型調製物を使用した。
反応生成物を２％アガロースゲル上で電気泳動し、臭化
エチジウムで染色し、ＵＶライトボックス上で写真撮影
した。２９１ｂｐＨＥＲ４特異的バンドの相対強度は、
それぞれのサンプルについて表２に示すように見積もら
れた。
【００５１】６．２．１．ＨＥＲ４をコードするｃＤＮ
Ａクローンの配列分析 前記セクション６．１．１．に概説した方法によるＰＣ
Ｒクローン化により、ＨＥＲ４コードおよび非コードヌ
クレオチド配列の一部をコードするｃＤＮＡクローンを
単離した。これらのｃＤＮＡから組立てられる完全なＨ
ＥＲ４ヌクレオチド配列を図１〜２に示すが、１３０８
アミノ酸のポリペプチドをコードする単一のオープンリ
ーディングフレームを含むものである。ＨＥＲ４コード
領域は、３３ヌクレオチドの５′非翻訳領域および１５
１７ヌクレオチドの３′非翻訳領域が隣接し、ポリ
（Ａ）尾部で終端する。図１〜２に示すアミノ酸配列の
位置番号１で、２５アミノ酸の疎水性シグナル配列がコ
ンセンサス開始メチオニンに後続する。このシグナル配
列に関し、成熟ＨＥＲ４ポリペプチドは、図１〜２に示
す配列のアミノ酸残基番号２６（Ｇｌｎ）で開始し、そ
の後に配列中の次の１２８３アミノ酸が続くと考えられ
る。よって、この発明の基本型成熟ＨＥＲ４は１２８４
アミノ酸のポリペプチドであり、１４４，２６０ダルト
ンの計算されたＭｒおよび図１〜２の残基２６〜１３０
９に対応するアミノ酸配列を有する。ＨＥＲ４ヌクレオ
チドおよび演繹されたアミノ酸配列（図１〜２）と利用
可能なＤＮＡおよび蛋白質配列データベースとの比較に
より、ＨＥＲ４ヌクレオチド配列は独特であることが示
され、ＨＥＲ２に対する６０／６４アミノ酸同一性およ
びラットＥＧＦＲ相同体の断片、ｔｙｒｏ−２に対する
５４／５４アミノ酸同一性が明らかとなった。
Ａクローンの配列分析 前記セクション６．１．１．に概説した方法によるＰＣ
Ｒクローン化により、ＨＥＲ４コードおよび非コードヌ
クレオチド配列の一部をコードするｃＤＮＡクローンを
単離した。これらのｃＤＮＡから組立てられる完全なＨ
ＥＲ４ヌクレオチド配列を図１〜２に示すが、１３０８
アミノ酸のポリペプチドをコードする単一のオープンリ
ーディングフレームを含むものである。ＨＥＲ４コード
領域は、３３ヌクレオチドの５′非翻訳領域および１５
１７ヌクレオチドの３′非翻訳領域が隣接し、ポリ
（Ａ）尾部で終端する。図１〜２に示すアミノ酸配列の
位置番号１で、２５アミノ酸の疎水性シグナル配列がコ
ンセンサス開始メチオニンに後続する。このシグナル配
列に関し、成熟ＨＥＲ４ポリペプチドは、図１〜２に示
す配列のアミノ酸残基番号２６（Ｇｌｎ）で開始し、そ
の後に配列中の次の１２８３アミノ酸が続くと考えられ
る。よって、この発明の基本型成熟ＨＥＲ４は１２８４
アミノ酸のポリペプチドであり、１４４，２６０ダルト
ンの計算されたＭｒおよび図１〜２の残基２６〜１３０
９に対応するアミノ酸配列を有する。ＨＥＲ４ヌクレオ
チドおよび演繹されたアミノ酸配列（図１〜２）と利用
可能なＤＮＡおよび蛋白質配列データベースとの比較に
より、ＨＥＲ４ヌクレオチド配列は独特であることが示
され、ＨＥＲ２に対する６０／６４アミノ酸同一性およ
びラットＥＧＦＲ相同体の断片、ｔｙｒｏ−２に対する
５４／５４アミノ酸同一性が明らかとなった。
【００５２】６．２．２．関連するｃＤＮＡの配列分析 基本型ＨＥＲ４ポリペプチド（図１〜２）に関連するポ
リペプチドをコードする幾つかのｃＤＮＡもＭＤＡ−Ｍ
Ｂ−４５３ｃＤＮＡライブラリーから単離したが、２つ
の形態を含んでいた。ｃＤＮＡの第１の代替型は、ヌク
レオチド３１６８（図１〜２の配列のアミノ酸位置１０
４５のＡｒｇをコードする）までコンセンサスＨＥＲ４
ヌクレオチド配列と同一であったが、その後明らかに関
連のない配列に突然分岐する（図３〜４、図６）。この
残基の下流でオープンリーディングフレームが更に１３
アミノ酸続いた後に停止コドンに達し、２ｋｂの３′非
翻訳配列およびポリ（Ａ）尾部が後続する。このｃＤＮ
Ａは、基本型ＨＥＲ４の欠失したＣ末端自己リン酸化ド
メインを有するＨＥＲ４変種に帰着すると予測され得
る。
リペプチドをコードする幾つかのｃＤＮＡもＭＤＡ−Ｍ
Ｂ−４５３ｃＤＮＡライブラリーから単離したが、２つ
の形態を含んでいた。ｃＤＮＡの第１の代替型は、ヌク
レオチド３１６８（図１〜２の配列のアミノ酸位置１０
４５のＡｒｇをコードする）までコンセンサスＨＥＲ４
ヌクレオチド配列と同一であったが、その後明らかに関
連のない配列に突然分岐する（図３〜４、図６）。この
残基の下流でオープンリーディングフレームが更に１３
アミノ酸続いた後に停止コドンに達し、２ｋｂの３′非
翻訳配列およびポリ（Ａ）尾部が後続する。このｃＤＮ
Ａは、基本型ＨＥＲ４の欠失したＣ末端自己リン酸化ド
メインを有するＨＥＲ４変種に帰着すると予測され得
る。
【００５３】第２の型のｃＤＮＡは、それぞれＨＥＲ４
コンセンサスと同一の３′配列を有する４つの独立した
クローンとして単離されたが、この後でヌクレオチド２
３３５（図１〜２の配列のアミノ酸位置７６８のＧｌｕ
をコードする）の５′側で分岐し、更に１１４〜１５４
ヌクレオチドだけ上流に続く（図５、図７）。ヌクレオ
チド２３３５は、ＨＥＲ２遺伝子におけるイントロン−
エクソン接合の正確な位置であり（コウセンスら、１９
８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１１３２−３９、セン
バら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：６４９７−６５０１）、これら
のｃＤＮＡが、隣接するイントロン内の隠性プロモータ
ーから開始したｍＲＮＡから誘導され得たことを示唆す
る。これらの５′裁頭転写体は、図１〜２のＨＥＲ４ｃ
ＤＮＡ配列のものと同一のオープンリーディングフレー
ムを含み、図１〜２のアミノ酸位置７７２のＭｅｔのコ
ドンにより開始するものである。これらのｃＤＮＡは、
ＨＥＲ４キナーゼのＡＴＰ結合ドメインの直ぐ下流で開
始する細胞質ＨＥＲ４変種ポリペプチドをコードすると
予測され得る。
コンセンサスと同一の３′配列を有する４つの独立した
クローンとして単離されたが、この後でヌクレオチド２
３３５（図１〜２の配列のアミノ酸位置７６８のＧｌｕ
をコードする）の５′側で分岐し、更に１１４〜１５４
ヌクレオチドだけ上流に続く（図５、図７）。ヌクレオ
チド２３３５は、ＨＥＲ２遺伝子におけるイントロン−
エクソン接合の正確な位置であり（コウセンスら、１９
８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１１３２−３９、セン
バら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：６４９７−６５０１）、これら
のｃＤＮＡが、隣接するイントロン内の隠性プロモータ
ーから開始したｍＲＮＡから誘導され得たことを示唆す
る。これらの５′裁頭転写体は、図１〜２のＨＥＲ４ｃ
ＤＮＡ配列のものと同一のオープンリーディングフレー
ムを含み、図１〜２のアミノ酸位置７７２のＭｅｔのコ
ドンにより開始するものである。これらのｃＤＮＡは、
ＨＥＲ４キナーゼのＡＴＰ結合ドメインの直ぐ下流で開
始する細胞質ＨＥＲ４変種ポリペプチドをコードすると
予測され得る。
【００５４】６．２．３．ＨＥＲ４発現のヒト組織分布 ヒト組織サンプルからのポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡのノーザ
ンブロットと、前記セクション６．１．２．に記載した
自己リン酸化ドメインをコードするＨＥＲ４の３′末端
に対するアンチセンスＲＮＡプローブとをハイブリダイ
ズさせた。約６ｋｂのＨＥＲ４ｍＲＮＡ転写体が同定さ
れ、心臓および骨格筋中に最も豊富であることが認めら
れた（図１１Ａ）。約１５ｋｂより大きいｍＲＮＡが脳
中に検出され、より低いレベルで心臓、骨格筋、腎臓お
よび膵臓組織サンプル中にも検出された。同ブロットを
剥離し、同一の手順を使用して細胞外ドメインコード領
域内のＨＥＲ４の５′末端からのプローブと再ハイブリ
ダイズさせた。このハイブリダイゼーションにより１５
ｋｂのＨＥＲ４ｍＲＮＡ分子種の分布が確認され、心
臓、骨格筋、腎臓および膵臓組織サンプル中に（図１１
Ｂ）、またより弱いシグナルで肺、肝臓および胎盤中に
６．５ｋｂのｍＲＮＡ分子種が検出された。更に、膵
臓、肺、脳および骨格筋組織サンプル中に、１．７〜
２．６ｋｂの少量の転写体も検出された。異なる大きさ
のＲＮＡ転写体の意義は知られていない。
ンブロットと、前記セクション６．１．２．に記載した
自己リン酸化ドメインをコードするＨＥＲ４の３′末端
に対するアンチセンスＲＮＡプローブとをハイブリダイ
ズさせた。約６ｋｂのＨＥＲ４ｍＲＮＡ転写体が同定さ
れ、心臓および骨格筋中に最も豊富であることが認めら
れた（図１１Ａ）。約１５ｋｂより大きいｍＲＮＡが脳
中に検出され、より低いレベルで心臓、骨格筋、腎臓お
よび膵臓組織サンプル中にも検出された。同ブロットを
剥離し、同一の手順を使用して細胞外ドメインコード領
域内のＨＥＲ４の５′末端からのプローブと再ハイブリ
ダイズさせた。このハイブリダイゼーションにより１５
ｋｂのＨＥＲ４ｍＲＮＡ分子種の分布が確認され、心
臓、骨格筋、腎臓および膵臓組織サンプル中に（図１１
Ｂ）、またより弱いシグナルで肺、肝臓および胎盤中に
６．５ｋｂのｍＲＮＡ分子種が検出された。更に、膵
臓、肺、脳および骨格筋組織サンプル中に、１．７〜
２．６ｋｂの少量の転写体も検出された。異なる大きさ
のＲＮＡ転写体の意義は知られていない。
【００５５】前記セクション６．１．３．に記載した準
定量的ＰＣＲ検定を使用し、ＨＥＲ４ｍＲＮＡの存在に
ついて種々のヒト組織も検査した。一次腫瘍サンプルお
よび新生組織細胞系統（直ぐ後のセクション６．２．
４．）に対する検定の結果と共に、結果を表２に示す。
これらの結果は、選択したＲＮＡサンプルについてのノ
ーザンおよび溶液ハイブリダイゼーション分析結果と良
く相関する。ＨＥＲ４転写体発現の最高のレベルは、心
臓、腎臓および脳組織サンプルにおいて認められた。更
に、高レベルのＨＥＲ４ｍＲＮＡ発現が、上皮小体、小
脳、下垂体、脾臓、精巣および胸部組織サンプルにおい
て認められた。低発現レベルは、胸腺、肺、唾液腺およ
び膵臓組織サンプルにおいて認められた。最後に、低い
かまたは陰性の発現が、肝臓、前立腺、卵巣、副腎、結
腸、十二指腸、表皮および骨髄サンプルにおいて観察さ
れた。
定量的ＰＣＲ検定を使用し、ＨＥＲ４ｍＲＮＡの存在に
ついて種々のヒト組織も検査した。一次腫瘍サンプルお
よび新生組織細胞系統（直ぐ後のセクション６．２．
４．）に対する検定の結果と共に、結果を表２に示す。
これらの結果は、選択したＲＮＡサンプルについてのノ
ーザンおよび溶液ハイブリダイゼーション分析結果と良
く相関する。ＨＥＲ４転写体発現の最高のレベルは、心
臓、腎臓および脳組織サンプルにおいて認められた。更
に、高レベルのＨＥＲ４ｍＲＮＡ発現が、上皮小体、小
脳、下垂体、脾臓、精巣および胸部組織サンプルにおい
て認められた。低発現レベルは、胸腺、肺、唾液腺およ
び膵臓組織サンプルにおいて認められた。最後に、低い
かまたは陰性の発現が、肝臓、前立腺、卵巣、副腎、結
腸、十二指腸、表皮および骨髄サンプルにおいて観察さ
れた。
【００５６】６．２．４．一次腫瘍および新生組織起源
の種々の細胞系統でのＨＥＲ４ｍＲＮＡ発現 ＨＥＲ４キナーゼドメイン中の配列からのプライマーを
使用し、幾つかの一次腫瘍および異なる新生組織起源の
多数の細胞系統におけるＨＥＲ４ｍＲＮＡ発現の様子
を、準定量的ＰＣＲ検定（前記セクション６．１．
３．）により決定した。結果は表２に含めるものとす
る。この分析により、４つのヒト乳房アデノカルシノー
マ細胞系統（Ｔ−４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＢＴ
−４７４およびＨ３３９６）中で、および神経ブラスト
ーマ（ＳＫ−Ｎ−ＭＣ）および膵臓カルシノーマ（Ｈｓ
７６６Ｔ）細胞系統中でＨＥＲ４ＲＮＡの最高の発現が
検出された。３つの更なる乳房カルシノーマ細胞系統中
で中程度の発現が検出された（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−Ｍ
Ｂ−３３０、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１）。低いかまたは検
出不能の発現は、胸部（ＭＤＢ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ
−ＭＢ−１５７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＳＫ−ＢＲ−
３）、腎臓（Ｃａｋｉ−１、Ｃａｋｉ−２、Ｇ−４０
１）、肝臓（ＳＫ−ＨＥＰ−１、ＨｅｐＧ２）、膵臓
（ＰＡＮＣ−１、ＡｓＰＣ−１、Ｃａｐａｎ−１）、結
腸（ＨＴ−２９）、頸部（ＣａＳｋｉ）、陰門（Ａ−４
１）、卵巣（ＰＡ−１、Ｃａｏｖ−３）、メラノーマ
（ＳＫ−ＭＥＬ−２８）のカルシノーマから誘導された
他の細胞系統、または多様な白血病細胞系統において認
められた。最後に、高レベルの発現が、ビルムス（腎
臓）および胸部カルシノーマ一次腫瘍サンプルにおいて
観察された。
の種々の細胞系統でのＨＥＲ４ｍＲＮＡ発現 ＨＥＲ４キナーゼドメイン中の配列からのプライマーを
使用し、幾つかの一次腫瘍および異なる新生組織起源の
多数の細胞系統におけるＨＥＲ４ｍＲＮＡ発現の様子
を、準定量的ＰＣＲ検定（前記セクション６．１．
３．）により決定した。結果は表２に含めるものとす
る。この分析により、４つのヒト乳房アデノカルシノー
マ細胞系統（Ｔ−４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＢＴ
−４７４およびＨ３３９６）中で、および神経ブラスト
ーマ（ＳＫ−Ｎ−ＭＣ）および膵臓カルシノーマ（Ｈｓ
７６６Ｔ）細胞系統中でＨＥＲ４ＲＮＡの最高の発現が
検出された。３つの更なる乳房カルシノーマ細胞系統中
で中程度の発現が検出された（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−Ｍ
Ｂ−３３０、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１）。低いかまたは検
出不能の発現は、胸部（ＭＤＢ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ
−ＭＢ−１５７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＳＫ−ＢＲ−
３）、腎臓（Ｃａｋｉ−１、Ｃａｋｉ−２、Ｇ−４０
１）、肝臓（ＳＫ−ＨＥＰ−１、ＨｅｐＧ２）、膵臓
（ＰＡＮＣ−１、ＡｓＰＣ−１、Ｃａｐａｎ−１）、結
腸（ＨＴ−２９）、頸部（ＣａＳｋｉ）、陰門（Ａ−４
１）、卵巣（ＰＡ−１、Ｃａｏｖ−３）、メラノーマ
（ＳＫ−ＭＥＬ−２８）のカルシノーマから誘導された
他の細胞系統、または多様な白血病細胞系統において認
められた。最後に、高レベルの発現が、ビルムス（腎
臓）および胸部カルシノーマ一次腫瘍サンプルにおいて
観察された。
【００５７】
【表２】
【００５８】７．実施例：ＨＥＲ４の組換え発現 ７．１．材料および方法 ７．１．１．ＣＨＯ−ＫＩ細胞および培養条件 ＣＨＯ−ＫＩ細胞はＡＴＣＣから取得した（受託番号Ｃ
ＣＬ６１）。これらの細胞は、免疫ブロット、チロシン
リン酸化、および35Ｓ標識免疫沈殿分析による検出可能
なＥＧＦＲ、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３のいずれも欠失し
ている。１０％透析ウシ胎児血清を補填し増加する濃度
のメチオニンスルホキシミンでグルタミンを含有しない
グラスゴウの改変イーグル培地（ＧＭＥＭ−Ｓ、ギブ
コ）中で、ＨＥＲ４を発現する形質移入された細胞コロ
ニーを選択した（ベビントン、１９９１，方法：Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙの手引２：１３
６−１４５アカデミック・プレス）。
ＣＬ６１）。これらの細胞は、免疫ブロット、チロシン
リン酸化、および35Ｓ標識免疫沈殿分析による検出可能
なＥＧＦＲ、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３のいずれも欠失し
ている。１０％透析ウシ胎児血清を補填し増加する濃度
のメチオニンスルホキシミンでグルタミンを含有しない
グラスゴウの改変イーグル培地（ＧＭＥＭ−Ｓ、ギブ
コ）中で、ＨＥＲ４を発現する形質移入された細胞コロ
ニーを選択した（ベビントン、１９９１，方法：Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙの手引２：１３
６−１４５アカデミック・プレス）。
【００５９】７．１．２．発現ベクターの構成および形
質移入 基本型ＨＥＲ４の完全な４キロベースコード配列を再構
成し、サイトメガロウイルス即時初期プロモーター（ベ
ビントン、前記）の調節下にグルタミン合成酵素発現ベ
クター、ｐＥＥ１４に挿入し、ＨＥＲ４発現ベクターｐ
ＥＥＨＥＲ４を生成した。この構成体（ｐＥＥＨＥＲ
４）をＭｌｕＩにより線状化し、標準的な技術を使用す
るリン酸カルシウム沈殿によりＣＨＯ−ＫＩ細胞に形質
移入した。最初の耐性コロニーの選択のため、ベビント
ン、前記に記載されたように１０％透析ウシ胎児血清お
よび２５μＭの初発濃度のメチオニンスルホキシミン
（Ｌ−ＭＳＸ）を補填したＧＭＥＭ−Ｓよりなる選択培
地上に細胞を配置した。２週間後、単離したコロニーを
４８穴のプレートに移し、直ぐ次に記載するようにＨＥ
Ｒ４発現免疫検定に供した。より高い濃度のＭＳＸを使
用する後続する選択の繰返しにより、最高濃度のＭＳＸ
に耐える細胞コロニーを単離した。種々の濃度のＭＳＸ
で選択した多数のＣＨＯ／ＨＥＲ４クローンをこの様式
で単離した。
質移入 基本型ＨＥＲ４の完全な４キロベースコード配列を再構
成し、サイトメガロウイルス即時初期プロモーター（ベ
ビントン、前記）の調節下にグルタミン合成酵素発現ベ
クター、ｐＥＥ１４に挿入し、ＨＥＲ４発現ベクターｐ
ＥＥＨＥＲ４を生成した。この構成体（ｐＥＥＨＥＲ
４）をＭｌｕＩにより線状化し、標準的な技術を使用す
るリン酸カルシウム沈殿によりＣＨＯ−ＫＩ細胞に形質
移入した。最初の耐性コロニーの選択のため、ベビント
ン、前記に記載されたように１０％透析ウシ胎児血清お
よび２５μＭの初発濃度のメチオニンスルホキシミン
（Ｌ−ＭＳＸ）を補填したＧＭＥＭ−Ｓよりなる選択培
地上に細胞を配置した。２週間後、単離したコロニーを
４８穴のプレートに移し、直ぐ次に記載するようにＨＥ
Ｒ４発現免疫検定に供した。より高い濃度のＭＳＸを使
用する後続する選択の繰返しにより、最高濃度のＭＳＸ
に耐える細胞コロニーを単離した。種々の濃度のＭＳＸ
で選択した多数のＣＨＯ／ＨＥＲ４クローンをこの様式
で単離した。
【００６０】７．１．３．ＨＥＲ４発現免疫検定 融合細胞モノレイヤーを４℃で低張溶解緩衝液（１０ｍ
ＭトリスｐＨ７．４、１ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＭｇＣ
ｌ2 ）に掻き取り、ダウンス（dounce）ホモゲナイズ処
理を３０ストローク行い、３５００×ｇ、５分の遠心分
離により細胞残渣を除去した。１００，０００×ｇ、２
０分の遠心分離により膜画分を集め、２−メルカプトエ
タノールと共に加熱ラエムリサンプル緩衝液にペレット
を再懸濁した。同時にＨＥＲ４配列（残基９２７〜９４
５）と同一であるＨＥＲ２キナーゼドメインの１９アミ
ノ酸領域、またはＨＥＲ４のＣ末端付近の領域を有する
７連続残基の鎖を共有するＨＥＲ２のＣ末端１４残基に
対して生成したＨＥＲ２免疫試薬を使用し、可溶化細胞
または膜調製物に対する免疫ブロット分析によりＨＥＲ
４ポリペプチドの発現を検出した。更なる増幅におい
て、ＰＹ２０抗ホスホチロシン抗体（ＩＣＮバイオケミ
カルズ）を用いる免疫ブロット分析により、可溶化した
細胞抽出物からＨＥＲ４を検出したが、恐らく異常に高
い受容体密度に起因する受容体凝集によるＨＥＲ４の自
己活性化および自己リン酸化を反映するものである。更
に詳しくは、ブロット中で１：５００に希釈した125 Ｉ
ヤギ抗マウスＩｇＦ（ａｂ′）２（アマシャム、ＵＫ）
を第２の抗体として使用し、ブロット（ＰＢＳ中の２．
５％ドライミルク、０．２％ＮＰ４０）中で１：５０に
希釈したＨＥＲ２に対する一次ネズミモノクローナル抗
体（Ｎｅｕ−Ａｂ３、オンコジーン・サイエンス）を用
いる免疫ブロット処理により発現を検出した。また、Ｈ
ＥＲ２残基９２９〜９４７に対するヒツジポリクローナ
ル抗ペプチド抗体（ケンブリッジ・リサーチ・バイオケ
ミカルズ、バレーストリーム、ＮＹ）をブロット中で
１：１００に希釈した一次免疫試薬として使用し、第２
の抗体としてブロット中で１：２００に希釈した125 Ｉ
蛋白質Ｇ（アマシャム）を用いた。フィルターをブロッ
トで洗浄し、ホスホリメイガー（モレキュラー・ダイナ
ミクス）上で一夜露呈した。
ＭトリスｐＨ７．４、１ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＭｇＣ
ｌ2 ）に掻き取り、ダウンス（dounce）ホモゲナイズ処
理を３０ストローク行い、３５００×ｇ、５分の遠心分
離により細胞残渣を除去した。１００，０００×ｇ、２
０分の遠心分離により膜画分を集め、２−メルカプトエ
タノールと共に加熱ラエムリサンプル緩衝液にペレット
を再懸濁した。同時にＨＥＲ４配列（残基９２７〜９４
５）と同一であるＨＥＲ２キナーゼドメインの１９アミ
ノ酸領域、またはＨＥＲ４のＣ末端付近の領域を有する
７連続残基の鎖を共有するＨＥＲ２のＣ末端１４残基に
対して生成したＨＥＲ２免疫試薬を使用し、可溶化細胞
または膜調製物に対する免疫ブロット分析によりＨＥＲ
４ポリペプチドの発現を検出した。更なる増幅におい
て、ＰＹ２０抗ホスホチロシン抗体（ＩＣＮバイオケミ
カルズ）を用いる免疫ブロット分析により、可溶化した
細胞抽出物からＨＥＲ４を検出したが、恐らく異常に高
い受容体密度に起因する受容体凝集によるＨＥＲ４の自
己活性化および自己リン酸化を反映するものである。更
に詳しくは、ブロット中で１：５００に希釈した125 Ｉ
ヤギ抗マウスＩｇＦ（ａｂ′）２（アマシャム、ＵＫ）
を第２の抗体として使用し、ブロット（ＰＢＳ中の２．
５％ドライミルク、０．２％ＮＰ４０）中で１：５０に
希釈したＨＥＲ２に対する一次ネズミモノクローナル抗
体（Ｎｅｕ−Ａｂ３、オンコジーン・サイエンス）を用
いる免疫ブロット処理により発現を検出した。また、Ｈ
ＥＲ２残基９２９〜９４７に対するヒツジポリクローナ
ル抗ペプチド抗体（ケンブリッジ・リサーチ・バイオケ
ミカルズ、バレーストリーム、ＮＹ）をブロット中で
１：１００に希釈した一次免疫試薬として使用し、第２
の抗体としてブロット中で１：２００に希釈した125 Ｉ
蛋白質Ｇ（アマシャム）を用いた。フィルターをブロッ
トで洗浄し、ホスホリメイガー（モレキュラー・ダイナ
ミクス）上で一夜露呈した。
【００６１】７．２．結果 セクション７．１．、以下参照、前記に概説した増加す
る濃度のメチオニンスルホキシミンを含む培地中での増
幅した発現について、完全なヒト基本型ＨＥＲ４ポリペ
プチドをコードするベクターにより形質移入したＣＨＯ
−ＫＩ細胞を選択した。セクション７．１．３．、前記
に記載した免疫検定を使用し、ＨＥＲ４の発現を評価し
た。ＨＥＲ４を安定に発現する幾つかの形質移入ＣＨＯ
−ＫＩ細胞クローンを単離した。１つの特定のクロー
ン、ＣＨＯ／ＨＥＲ４ ２１−２は、２５０μＭＭＳＸ
を補填した培地中で選択したものであり、高レベルのＨ
ＥＲ４を発現する。ＣＨＯ／ＨＥＲ４ ２１−２細胞は
ＡＴＣＣに寄託した。ＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞中で発現し
た組換えＨＥＲ４は、１８０，０００の見かけのＭｒ
（ＨＥＲ２より僅かに小さい）で移動したのに対し、親
ＣＨＯ細胞は交差反応バンドを示さなかった（図１２
Ａ）。更に、ＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞では１３０ｋＤａの
バンドも検出され、恐らく１８０ｋＤａの成熟蛋白質の
縮退生成物を示す。ＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞を使用し、Ｈ
ＥＲ４チロシンキナーゼのリガンド特異的結合および自
己リン酸化を同定した（セクション９．参照、以下参
照、後記）。
る濃度のメチオニンスルホキシミンを含む培地中での増
幅した発現について、完全なヒト基本型ＨＥＲ４ポリペ
プチドをコードするベクターにより形質移入したＣＨＯ
−ＫＩ細胞を選択した。セクション７．１．３．、前記
に記載した免疫検定を使用し、ＨＥＲ４の発現を評価し
た。ＨＥＲ４を安定に発現する幾つかの形質移入ＣＨＯ
−ＫＩ細胞クローンを単離した。１つの特定のクロー
ン、ＣＨＯ／ＨＥＲ４ ２１−２は、２５０μＭＭＳＸ
を補填した培地中で選択したものであり、高レベルのＨ
ＥＲ４を発現する。ＣＨＯ／ＨＥＲ４ ２１−２細胞は
ＡＴＣＣに寄託した。ＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞中で発現し
た組換えＨＥＲ４は、１８０，０００の見かけのＭｒ
（ＨＥＲ２より僅かに小さい）で移動したのに対し、親
ＣＨＯ細胞は交差反応バンドを示さなかった（図１２
Ａ）。更に、ＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞では１３０ｋＤａの
バンドも検出され、恐らく１８０ｋＤａの成熟蛋白質の
縮退生成物を示す。ＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞を使用し、Ｈ
ＥＲ４チロシンキナーゼのリガンド特異的結合および自
己リン酸化を同定した（セクション９．参照、以下参
照、後記）。
【００６２】８．実施例：ＥＧＦＲ系統群のリガンドを
検出する検定 ８．１．細胞系統 以下のセクション８．２．に記載するチロシンキナーゼ
刺激検定で使用するため、それぞれヒトＥＧＦＲ系統群
の単一の構成員を発現する４つの組換え細胞系統の一団
を生成した。細胞系統ＣＨＯ／ＨＥＲ４ ３は、前記し
たセクション７．１．２に記載したように生成した。ｄ
ｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞中でのジヒドロ葉酸還元酵素誘導
遺伝子増幅により、ＣＨＯ／ＨＥＲ２細胞（クローン１
〜２５００）を選択して高レベルの組換えヒトｐ１８５
erbT2 を発現させた。ｐＳＶ２ＤＨＦＲ由来の発現カセ
ット（ＳＶ４０初期プロモーターにより駆動されるネズ
ミｄｈｆｒｃＤＮＡを含む）をｐＣＤＭ８ベクターの独
特のＢａｍＨＩ部位に挿入した修飾ｐＣＤＭ８（インビ
トロゲン、サンジェゴ、ＣＡ）発現ベクター（シードと
アルフォ、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：３３６５−６９）に全長の
ＨＥＲ２コード配列を挿入することにより、ＨＥＲ２発
現プラスミド、ｃＤＮｅｕを生成した。この構成体は、
ＣＭＶ即時初期プロモーターからＨＥＲ２発現を駆動す
る。
検出する検定 ８．１．細胞系統 以下のセクション８．２．に記載するチロシンキナーゼ
刺激検定で使用するため、それぞれヒトＥＧＦＲ系統群
の単一の構成員を発現する４つの組換え細胞系統の一団
を生成した。細胞系統ＣＨＯ／ＨＥＲ４ ３は、前記し
たセクション７．１．２に記載したように生成した。ｄ
ｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞中でのジヒドロ葉酸還元酵素誘導
遺伝子増幅により、ＣＨＯ／ＨＥＲ２細胞（クローン１
〜２５００）を選択して高レベルの組換えヒトｐ１８５
erbT2 を発現させた。ｐＳＶ２ＤＨＦＲ由来の発現カセ
ット（ＳＶ４０初期プロモーターにより駆動されるネズ
ミｄｈｆｒｃＤＮＡを含む）をｐＣＤＭ８ベクターの独
特のＢａｍＨＩ部位に挿入した修飾ｐＣＤＭ８（インビ
トロゲン、サンジェゴ、ＣＡ）発現ベクター（シードと
アルフォ、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：３３６５−６９）に全長の
ＨＥＲ２コード配列を挿入することにより、ＨＥＲ２発
現プラスミド、ｃＤＮｅｕを生成した。この構成体は、
ＣＭＶ即時初期プロモーターからＨＥＲ２発現を駆動す
る。
【００６３】ヘシング−ジーン・クング博士（ケース・
ウエスタン・リバース大学、クリーブランド、ＯＨ）か
らＮＲＨＥＲ５細胞（ベルら、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ１４０８−１０）を取得した。このネズミ細胞系統
は、ヒトＥＧＦＲを担持するレトロウイルスのストック
を感染させたＮＲ６細胞からクローン的に単離されたも
のであり、細胞当り約１０6 のヒトＥＧＦＲを有すると
認められた。ｐ１６０erbB3 の高レベル発現のため、細
胞系統２９３／ＨＥＲ３を選択した。親細胞系統、２９
３ヒト胎児腎臓細胞は、アデノウイルスＥｌａを構成的
に発現し、低レベルのＥＧＦＲ発現を有する。線状化し
たｃＨＥＲ３（プロウマンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：４９０５−０９）
およびｐＭＣｌｎｅｏＰｏｌｙＡ（ヘルペスシンプレッ
クスのチミジンキナーゼプロモーターを有するネオマイ
シン選択性マーカー、ストラタジーン）の同時形質移入
により、５００μｇ／ｍｌＧ４１８を含むＤＭＥＭ／Ｆ
１２培地中で選択し、この系統を確立した。
ウエスタン・リバース大学、クリーブランド、ＯＨ）か
らＮＲＨＥＲ５細胞（ベルら、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ１４０８−１０）を取得した。このネズミ細胞系統
は、ヒトＥＧＦＲを担持するレトロウイルスのストック
を感染させたＮＲ６細胞からクローン的に単離されたも
のであり、細胞当り約１０6 のヒトＥＧＦＲを有すると
認められた。ｐ１６０erbB3 の高レベル発現のため、細
胞系統２９３／ＨＥＲ３を選択した。親細胞系統、２９
３ヒト胎児腎臓細胞は、アデノウイルスＥｌａを構成的
に発現し、低レベルのＥＧＦＲ発現を有する。線状化し
たｃＨＥＲ３（プロウマンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：４９０５−０９）
およびｐＭＣｌｎｅｏＰｏｌｙＡ（ヘルペスシンプレッ
クスのチミジンキナーゼプロモーターを有するネオマイ
シン選択性マーカー、ストラタジーン）の同時形質移入
により、５００μｇ／ｍｌＧ４１８を含むＤＭＥＭ／Ｆ
１２培地中で選択し、この系統を確立した。
【００６４】８．２．チロシンキナーゼ刺激検定 ６穴組織培養プレート（ファルコン）中で細胞をプレー
ト処理し、３７℃で１８〜２４時間付着させた。検定の
前に、少なくとも１時間血清を含まない培地に対して細
胞を変化させた。その後、以下のセクション７．３に示
す量のリガンド調製物と共に３７℃で５分間細胞モノレ
イヤーをインキュベートした。その後ＰＢＳにより細胞
を洗浄し、ホスファターゼ阻害剤を含む０．５ｍｌのＰ
ＢＳＴＤＳ（１０ｍＭＮａＨＰＯ４、７．２５、１５０
ｍＭＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、０．５％デオ
キシコール酸、０．１％ＳＤＳ、０．２％アジ化ナトリ
ウム、１ｍＭＮａＦ、１ｍＭＥＧＴＡ、４ｍＭオルトバ
ナジウム酸ナトリウム、１％アプロチニン、５μｇ／ｍ
ｌロイペプチン）を用いて氷上で可溶化した。細胞残渣
を遠心分離（１２０００×ｇ、１５分、４℃）により除
去し、ＣＨＯ／ＨＥＲ４および２９３／ＨＥＲ３細胞に
ついてホスホチロシンに対する１μｇのネズミモノクロ
ーナル抗体（ＰＹ２０、ＩＣＮバイオケミカルズ、クリ
ーブランド、オハイオ）、またはＣＨＯ／ＨＥＲ２細胞
についてＨＥＲ２に対する１μｇのネズミモノクローナ
ル抗体（Ｎｅｕ−Ａｂ３、オンコジーン・サイエン
ス）、またはＮＲＨＥＲ５細胞についてヒトＥＧＦＲに
対する１μｇのネズミモノクローナル抗体ＥＧＦＲ−１
（アマシャム）を用い、清澄化した上澄を反応させた。
４℃での１時間のインキュベートの後、抗マウスＩｇＧ
−アガロース（ＰＹ２０およびＮｅｕ−Ａｂ３抗体につ
いて）または蛋白質Ａ−セファロース（ＥＧＦＲ−Ｒ１
抗体について）の１：１スラリー（ＰＢＳＴＤＳ中）の
３０μｌを添加し、更に３０分間インキュベートを続け
た。ＰＢＳＴＤＳ中でビーズを３回洗浄し、還元性７％
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により複
合体を解析した。ゲルをニトロセルロースに移し、ＴＮ
ＥＴ（１０ｍＭトリスｐＨ７．４、７５ｍＭＮａＣｌ、
０．１％ツイーン２０、１ｍＭＥＤＴＡ）中でブロック
した。ＴＮＥＴ中で１：１０００に希釈したＰＹ２０抗
ホスホチロシン抗体を一次抗体として使用し、その後Ｔ
ＮＥＴ中で１：５００に希釈した125 Ｉヤギ抗マウスＩ
ｇＦ（ａｂ′）２を用いた。ブロットをＴＮＥＴで洗浄
し、ホスホリメイガー（モレキュラー・ダイナミクス）
上で露呈した。
ト処理し、３７℃で１８〜２４時間付着させた。検定の
前に、少なくとも１時間血清を含まない培地に対して細
胞を変化させた。その後、以下のセクション７．３に示
す量のリガンド調製物と共に３７℃で５分間細胞モノレ
イヤーをインキュベートした。その後ＰＢＳにより細胞
を洗浄し、ホスファターゼ阻害剤を含む０．５ｍｌのＰ
ＢＳＴＤＳ（１０ｍＭＮａＨＰＯ４、７．２５、１５０
ｍＭＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、０．５％デオ
キシコール酸、０．１％ＳＤＳ、０．２％アジ化ナトリ
ウム、１ｍＭＮａＦ、１ｍＭＥＧＴＡ、４ｍＭオルトバ
ナジウム酸ナトリウム、１％アプロチニン、５μｇ／ｍ
ｌロイペプチン）を用いて氷上で可溶化した。細胞残渣
を遠心分離（１２０００×ｇ、１５分、４℃）により除
去し、ＣＨＯ／ＨＥＲ４および２９３／ＨＥＲ３細胞に
ついてホスホチロシンに対する１μｇのネズミモノクロ
ーナル抗体（ＰＹ２０、ＩＣＮバイオケミカルズ、クリ
ーブランド、オハイオ）、またはＣＨＯ／ＨＥＲ２細胞
についてＨＥＲ２に対する１μｇのネズミモノクローナ
ル抗体（Ｎｅｕ−Ａｂ３、オンコジーン・サイエン
ス）、またはＮＲＨＥＲ５細胞についてヒトＥＧＦＲに
対する１μｇのネズミモノクローナル抗体ＥＧＦＲ−１
（アマシャム）を用い、清澄化した上澄を反応させた。
４℃での１時間のインキュベートの後、抗マウスＩｇＧ
−アガロース（ＰＹ２０およびＮｅｕ−Ａｂ３抗体につ
いて）または蛋白質Ａ−セファロース（ＥＧＦＲ−Ｒ１
抗体について）の１：１スラリー（ＰＢＳＴＤＳ中）の
３０μｌを添加し、更に３０分間インキュベートを続け
た。ＰＢＳＴＤＳ中でビーズを３回洗浄し、還元性７％
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により複
合体を解析した。ゲルをニトロセルロースに移し、ＴＮ
ＥＴ（１０ｍＭトリスｐＨ７．４、７５ｍＭＮａＣｌ、
０．１％ツイーン２０、１ｍＭＥＤＴＡ）中でブロック
した。ＴＮＥＴ中で１：１０００に希釈したＰＹ２０抗
ホスホチロシン抗体を一次抗体として使用し、その後Ｔ
ＮＥＴ中で１：５００に希釈した125 Ｉヤギ抗マウスＩ
ｇＦ（ａｂ′）２を用いた。ブロットをＴＮＥＴで洗浄
し、ホスホリメイガー（モレキュラー・ダイナミクス）
上で露呈した。
【００６５】８．３．結果 前記セクション８．２．に記載したチロシンリン酸化刺
激検定を使用し、組換えＣＨＯ細胞中で発現した４つの
ＥＧＦＲ系統群受容体のそれぞれのチロシンリン酸化を
刺激するその能力について、幾つかのＥＧＦ系統群の構
成員ポリペプチドおよびリガンド調製物を試験した。４
つの組換え細胞系統のそれぞれについて試験した特定の
調製物および検定で得られた結果を以下の表に示し、こ
れらの結果の幾つかのオートラジオグラフを図１３に示
す。
激検定を使用し、組換えＣＨＯ細胞中で発現した４つの
ＥＧＦＲ系統群受容体のそれぞれのチロシンリン酸化を
刺激するその能力について、幾つかのＥＧＦ系統群の構
成員ポリペプチドおよびリガンド調製物を試験した。４
つの組換え細胞系統のそれぞれについて試験した特定の
調製物および検定で得られた結果を以下の表に示し、こ
れらの結果の幾つかのオートラジオグラフを図１３に示
す。
【００６６】
【表３】
【００６７】結果は、その生育制御シグナルを一部ＥＧ
ＦＲとの相互作用を介して媒介する４つの関連するリガ
ンドであるＥＧＦ、ＡＲ、ＴＧＦ−αおよびＨＢ−ＥＧ
Ｆは、組換えＮＩＨ３Ｔ３細胞中で発現したＥＧＦＲの
チロシンリン酸化を刺激することができたが（ＥＧＲに
ついて、図１３Ｃ、レーン２参照）、組換えＣＨＯまた
は２９３細胞中で発現したＨＥＲ４、ＨＥＲ２またはＨ
ＥＲ３はそうではないことを示す（図１３Ａ、Ｂ、Ｄ、
レーン２および３）。更に、以下により詳細に論ずるよ
うに、検定では、ＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞単独中で発現し
たＨＥＲ４のチロシンリン酸化を特異的に刺激し得るＨ
ＥＲ４リガンドとして、ＨｅｐＧ２誘導調製物（画分１
７）が同定された。
ＦＲとの相互作用を介して媒介する４つの関連するリガ
ンドであるＥＧＦ、ＡＲ、ＴＧＦ−αおよびＨＢ−ＥＧ
Ｆは、組換えＮＩＨ３Ｔ３細胞中で発現したＥＧＦＲの
チロシンリン酸化を刺激することができたが（ＥＧＲに
ついて、図１３Ｃ、レーン２参照）、組換えＣＨＯまた
は２９３細胞中で発現したＨＥＲ４、ＨＥＲ２またはＨ
ＥＲ３はそうではないことを示す（図１３Ａ、Ｂ、Ｄ、
レーン２および３）。更に、以下により詳細に論ずるよ
うに、検定では、ＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞単独中で発現し
たＨＥＲ４のチロシンリン酸化を特異的に刺激し得るＨ
ＥＲ４リガンドとして、ＨｅｐＧ２誘導調製物（画分１
７）が同定された。
【００６８】９．実施例：ＨＥＲ４リガンドの単離 ９．１．材料および方法 ９．１．１．細胞分化検定 ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４に特異的なリガンド
の同定のためには、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞の受容体
発現の様子が、形態分化誘導活性についての優れた指針
を与える。この細胞系統はＨＥＲ２およびＨＥＲ３を発
現することが知られているが、検出可能なＥＧＦＲは含
まない。準定量的ＰＣＲ分析（表３）の結果は、ＭＤＡ
−ＭＢ−４５３細胞におけるＨＥＲ４の高レベル発現を
示した。更に、この発明の基本型ＨＥＲ４ポリペプチド
をコードするｃＤＮＡは、この細胞系統から最初に単離
したものである（セクション６．、前記）。５％ＦＢＳ
および１×必須アミノ酸を補填した５０ｍｌのＤＭＥＭ
中でＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（７５００／穴）を生育
させた。９６穴プレートに２４時間細胞を付着させた。
前記培地中でサンプルを希釈し、５０ｍｌの最終容量の
細胞モノレイヤーに添加し、更に３日間インキュベート
を続けた。その後形態変化について倒立光学顕微鏡によ
り細胞を検査した。
の同定のためには、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞の受容体
発現の様子が、形態分化誘導活性についての優れた指針
を与える。この細胞系統はＨＥＲ２およびＨＥＲ３を発
現することが知られているが、検出可能なＥＧＦＲは含
まない。準定量的ＰＣＲ分析（表３）の結果は、ＭＤＡ
−ＭＢ−４５３細胞におけるＨＥＲ４の高レベル発現を
示した。更に、この発明の基本型ＨＥＲ４ポリペプチド
をコードするｃＤＮＡは、この細胞系統から最初に単離
したものである（セクション６．、前記）。５％ＦＢＳ
および１×必須アミノ酸を補填した５０ｍｌのＤＭＥＭ
中でＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（７５００／穴）を生育
させた。９６穴プレートに２４時間細胞を付着させた。
前記培地中でサンプルを希釈し、５０ｍｌの最終容量の
細胞モノレイヤーに添加し、更に３日間インキュベート
を続けた。その後形態変化について倒立光学顕微鏡によ
り細胞を検査した。
【００６９】９．１．２．供給源細胞 一団の培養ヒトガン細胞からの血清を含まない培地を、
ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞上で生育制御活性について検
索した。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞の劇的な形態分化を
誘導した因子の供給源として、ヒト肝カルシノーマ細胞
系統、ＨｅｐＧ２を同定した。 ９．１．３．ＨＥＲ４リガンドの精製 ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞における形態変化を誘導する
カラム画分をモニターする精製手順全般で、後記するセ
クション１０．１．１．に記載する細胞分化検定を使用
した。馴化培地の大規模な製造のため、Ｎｕｎｃ細胞フ
ァクトリーを使用し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ
Ｍ中でＨｅｐＧ２を培養した。約７０％融合で細胞を洗
浄し、その後血清を含まないＤＭＥＭを用いてインキュ
ベートした。馴化培地（ＨｅｐＧ２−ＣＭ）を３日後に
集め、血清を含有しない新鮮な培地を細胞に添加した。
細胞ファクトリー当り更に２回のＨｅｐＧ２−ＣＭの回
収物を集めた。培地を遠心分離し、５００ｍＭＰＭＳＦ
の存在下に−２０℃で保存した。
ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞上で生育制御活性について検
索した。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞の劇的な形態分化を
誘導した因子の供給源として、ヒト肝カルシノーマ細胞
系統、ＨｅｐＧ２を同定した。 ９．１．３．ＨＥＲ４リガンドの精製 ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞における形態変化を誘導する
カラム画分をモニターする精製手順全般で、後記するセ
クション１０．１．１．に記載する細胞分化検定を使用
した。馴化培地の大規模な製造のため、Ｎｕｎｃ細胞フ
ァクトリーを使用し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ
Ｍ中でＨｅｐＧ２を培養した。約７０％融合で細胞を洗
浄し、その後血清を含まないＤＭＥＭを用いてインキュ
ベートした。馴化培地（ＨｅｐＧ２−ＣＭ）を３日後に
集め、血清を含有しない新鮮な培地を細胞に添加した。
細胞ファクトリー当り更に２回のＨｅｐＧ２−ＣＭの回
収物を集めた。培地を遠心分離し、５００ｍＭＰＭＳＦ
の存在下に−２０℃で保存した。
【００７０】アミコンの限外ろ過装置（１０，０００分
子量遮断膜）を使用して１０リットルのＨｅｐＧ２−Ｃ
Ｍを１６倍に濃縮し、２０％および６０％硫酸アンモニ
ウムを用いる順次の沈殿に供した。１５，０００×ｇで
の遠心分離の後、ＰＢＳに対して上澄を十分に透析し、
ＰＢＳにより予備平衡化したＤＥＡＥセファロース（フ
ァルマシア）カラムを通過させた。その後流れて通過し
た画分を、ＰＢＳにより予備平衡化した４ｍｌのヘパリ
ン−アクリル（バイオラド）カラムに装填した。分化誘
導活性は、０．４〜０．８ＭのＮａＣｌでヘパリンカラ
ムから溶出した。活性なヘパリン画分をプールし、２．
０Ｍ硫酸アンモニウムとし、１２，０００×ｇで５分間
遠心分離し、得られた上澄をフェニル５ＰＷカラム（８
×７５ｍｍ、ウォーターズ）に装填した。０．１ＭＮａ
２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４中の２．０Ｍ硫酸アンモニウム
から０．１ＭＮａ２ＨＰＯ４に増加する勾配を用い、結
合した蛋白質を溶出させた。ＰＹ２０を一次抗体として
使用し、西洋ワサビペルオキシダーゼ接合ヤギＦ（ａ
ｂ′）2 抗マウスＩｇ（キャペル）および化学蛍光を検
出のために使用した以外は、主として記載されたように
（ウェンら、１９９２，Ｃｅｌｌ ６９：５５９−７
２）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞のチロシンリン酸化に
ついて透析した画分を検定した。モレキュラー・ダイナ
ミクスのパーソナル密度計を使用し、リン酸化シグナル
を分析した。
子量遮断膜）を使用して１０リットルのＨｅｐＧ２−Ｃ
Ｍを１６倍に濃縮し、２０％および６０％硫酸アンモニ
ウムを用いる順次の沈殿に供した。１５，０００×ｇで
の遠心分離の後、ＰＢＳに対して上澄を十分に透析し、
ＰＢＳにより予備平衡化したＤＥＡＥセファロース（フ
ァルマシア）カラムを通過させた。その後流れて通過し
た画分を、ＰＢＳにより予備平衡化した４ｍｌのヘパリ
ン−アクリル（バイオラド）カラムに装填した。分化誘
導活性は、０．４〜０．８ＭのＮａＣｌでヘパリンカラ
ムから溶出した。活性なヘパリン画分をプールし、２．
０Ｍ硫酸アンモニウムとし、１２，０００×ｇで５分間
遠心分離し、得られた上澄をフェニル５ＰＷカラム（８
×７５ｍｍ、ウォーターズ）に装填した。０．１ＭＮａ
２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４中の２．０Ｍ硫酸アンモニウム
から０．１ＭＮａ２ＨＰＯ４に増加する勾配を用い、結
合した蛋白質を溶出させた。ＰＹ２０を一次抗体として
使用し、西洋ワサビペルオキシダーゼ接合ヤギＦ（ａ
ｂ′）2 抗マウスＩｇ（キャペル）および化学蛍光を検
出のために使用した以外は、主として記載されたように
（ウェンら、１９９２，Ｃｅｌｌ ６９：５５９−７
２）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞のチロシンリン酸化に
ついて透析した画分を検定した。モレキュラー・ダイナ
ミクスのパーソナル密度計を使用し、リン酸化シグナル
を分析した。
【００７１】９．２．結果 準精製ＨｅｐＧ２誘導因子は、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３に
おける分化を誘導する能力を示した（図１４）。図１４
に示す顕微鏡写真を参照すると、未処理のＭＤＡ−ＭＢ
−４５３は穏やかな付着性であり、丸い形態を示す（図
１４Ａ）。これに対して、準精製ＨｅｐＧ２誘導因子の
添加により、これらの細胞が誘導され、より大きい核お
よび増加した細胞質を有する顕著に平坦な形態を示す
（図１４Ｂおよび１４Ｃ）。このＨｅｐＧ２誘導因子調
製物はヘパリンにも結合するが、これは活性を精製する
ために利用した特性である。更なる精製に際し、Ｈｅｐ
Ｇ２誘導因子は、１．０Ｍ硫酸アンモニウムでフェニル
疎水性相互作用カラムから溶出することが分った（画分
１６および１８）。図１４Ｄは、フェニルカラムの溶出
の様子を示す。フェニルカラム画分のチロシンリン酸化
検定により、ヒト胸部カルシノーマ細胞の分化を誘導す
ると認められた同じ画分が、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞
における１８５Ｋ蛋白質のチロシンリン酸化も刺激でき
ることが明らかとなった（図１４Ｅ）。特に、密度計分
析により測定したものとして（図１４Ｆ）、画分１６
は、刺激されていない細胞で観察されるベースラインシ
グナルと比較し、リン酸化シグナルの４．５倍の増加を
誘導した。
おける分化を誘導する能力を示した（図１４）。図１４
に示す顕微鏡写真を参照すると、未処理のＭＤＡ−ＭＢ
−４５３は穏やかな付着性であり、丸い形態を示す（図
１４Ａ）。これに対して、準精製ＨｅｐＧ２誘導因子の
添加により、これらの細胞が誘導され、より大きい核お
よび増加した細胞質を有する顕著に平坦な形態を示す
（図１４Ｂおよび１４Ｃ）。このＨｅｐＧ２誘導因子調
製物はヘパリンにも結合するが、これは活性を精製する
ために利用した特性である。更なる精製に際し、Ｈｅｐ
Ｇ２誘導因子は、１．０Ｍ硫酸アンモニウムでフェニル
疎水性相互作用カラムから溶出することが分った（画分
１６および１８）。図１４Ｄは、フェニルカラムの溶出
の様子を示す。フェニルカラム画分のチロシンリン酸化
検定により、ヒト胸部カルシノーマ細胞の分化を誘導す
ると認められた同じ画分が、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞
における１８５Ｋ蛋白質のチロシンリン酸化も刺激でき
ることが明らかとなった（図１４Ｅ）。特に、密度計分
析により測定したものとして（図１４Ｆ）、画分１６
は、刺激されていない細胞で観察されるベースラインシ
グナルと比較し、リン酸化シグナルの４．５倍の増加を
誘導した。
【００７２】それぞれＥＧＦＲ系統群の単一の構成員を
過剰発現する細胞系統の一団（セクション９．１．、前
記）に対してもフェニル画分を試験した。画分１７は、
ＨＥＲ２、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３のリン酸化に直接影
響を与えることなく（図１３Ｂ、１３Ｃおよび１３Ｄ、
レーン４）、ＨＥＲ４キナーゼの有意かつ特異的な活性
化を誘導した。隣接する画分１４を対照として使用した
が、ＥＧＦＲ系統群の受容体のいずれのリン酸化にも効
果はなかった（図１３Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、レーン５）。画
分１７に存在する因子の更なる精製および分析により、
これはＮＤＦおよびＨＲＧとほぼ同じ大きさの４０〜４
５ｋＤａの糖蛋白質であることが示される。ＨｅｐＧ２
誘導因子も、これがＮＲ５細胞中のＥＧＦＲではなくＭ
ＤＡ−ＭＢ−４５３細胞中のＨＥＲ２／ｐ１８５のチロ
シンリン酸化を刺激し、ＨＥＲ２過剰発現ヒト胸部ガン
細胞の形態分化を誘導する限りにおいて、ＮＤＦおよび
ＨＲＧに類似する機能的性質を有する。
過剰発現する細胞系統の一団（セクション９．１．、前
記）に対してもフェニル画分を試験した。画分１７は、
ＨＥＲ２、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３のリン酸化に直接影
響を与えることなく（図１３Ｂ、１３Ｃおよび１３Ｄ、
レーン４）、ＨＥＲ４キナーゼの有意かつ特異的な活性
化を誘導した。隣接する画分１４を対照として使用した
が、ＥＧＦＲ系統群の受容体のいずれのリン酸化にも効
果はなかった（図１３Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、レーン５）。画
分１７に存在する因子の更なる精製および分析により、
これはＮＤＦおよびＨＲＧとほぼ同じ大きさの４０〜４
５ｋＤａの糖蛋白質であることが示される。ＨｅｐＧ２
誘導因子も、これがＮＲ５細胞中のＥＧＦＲではなくＭ
ＤＡ−ＭＢ−４５３細胞中のＨＥＲ２／ｐ１８５のチロ
シンリン酸化を刺激し、ＨＥＲ２過剰発現ヒト胸部ガン
細胞の形態分化を誘導する限りにおいて、ＮＤＦおよび
ＨＲＧに類似する機能的性質を有する。
【００７３】最近、幾つかのグループが、ＮＤＦおよび
ＨＲＧ−αを含むＨＥＲ２の特異的リガンドの同定を報
告している（前記従来の技術参照）。これらの分子に対
して、ここに記載するＨｅｐＧ２誘導因子は、ＣＨＯ／
ＨＥＲ２細胞中ではＨＥＲ２のリン酸化を刺激しない
が、ＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞中ではＨＥＲ４のリン酸化を
実際に刺激する。これらの発見は、ＨＥＲ２およびＨＥ
Ｒ３を過剰発現することが知られている細胞系統である
ＭＤＡ−ＭＤ−４５３細胞のリン酸化を刺激するＨｅｐ
Ｇ２誘導因子の能力およびＨＥＲ４をクローン化した供
給源の観点から興味深い。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２は相
乗的に作用することが示されたため、ＨＥＲ４も他のＥ
ＧＦＲ系統群の構成員と相互作用し得ることが考えられ
る。これに関連して、これらの結果は、ＮＤＦがＭＤＡ
−ＭＢ−４５３細胞中でＨＥＲ４に結合し得る結果、Ｈ
ＥＲ２の活性化が与えられることを示唆する。直ぐ次の
セクション１０．に記載した結果は、ＮＤＦはＨＥＲ４
と直接相互作用し、この結果ＨＥＲ２の活性化が与えら
れることの証拠を提供する。
ＨＲＧ−αを含むＨＥＲ２の特異的リガンドの同定を報
告している（前記従来の技術参照）。これらの分子に対
して、ここに記載するＨｅｐＧ２誘導因子は、ＣＨＯ／
ＨＥＲ２細胞中ではＨＥＲ２のリン酸化を刺激しない
が、ＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞中ではＨＥＲ４のリン酸化を
実際に刺激する。これらの発見は、ＨＥＲ２およびＨＥ
Ｒ３を過剰発現することが知られている細胞系統である
ＭＤＡ−ＭＤ−４５３細胞のリン酸化を刺激するＨｅｐ
Ｇ２誘導因子の能力およびＨＥＲ４をクローン化した供
給源の観点から興味深い。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２は相
乗的に作用することが示されたため、ＨＥＲ４も他のＥ
ＧＦＲ系統群の構成員と相互作用し得ることが考えられ
る。これに関連して、これらの結果は、ＮＤＦがＭＤＡ
−ＭＢ−４５３細胞中でＨＥＲ４に結合し得る結果、Ｈ
ＥＲ２の活性化が与えられることを示唆する。直ぐ次の
セクション１０．に記載した結果は、ＮＤＦはＨＥＲ４
と直接相互作用し、この結果ＨＥＲ２の活性化が与えら
れることの証拠を提供する。
【００７４】１０．実施例：ＨＥＲ２の組換えＮＤＦ誘
導ＨＥＲ４媒介リン酸化 組換えＮＤＦをＣＯＳ細胞中で発現させ、主としてＥＧ
ＦＲ系統群の他の公知の構成員、特にＥＧＦＲおよびＨ
ＥＲ２のない検定系でＨＥＲ４に対するその活性を試験
した。全長のラットＮＤＦｃＤＮＡを正常なラット腎臓
ＲＮＡから単離し、ｃＤＭ８に基く発現ベクターに挿入
してｃＮＤＦ１．６を生成した。この構成体はＣＯＳ細
胞中で遷移的に発現し、前記セクション８．２．に記載
したチロシンキナーゼ刺激検定を使用し、馴化した細胞
上澄をＮＤＦ活性について試験した。ｃＮＤＦ１．６形
質移入細胞からの上澄は、擬性形質移入ＣＯＳ培地と比
較し、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞中でチロシンリン酸化
を上方制御した（図１５Ａ）。リン酸化は、ＮＤＦに対
する添加の後１０〜１５分でピークに達した。ＥＧＦＲ
（ＮＲ５細胞）、ＨＥＲ２（ＣＨＯ／ＨＥＲ２ １−２
５００細胞）およびＨＥＲ４（ＣＨＯ／ＨＥＲ４ ２１
−２細胞）をリン酸化する能力についても、粗製ＮＤＦ
上澄を試験した。ＮＤＦ調製物はＥＧＦＲまたはＨＥＲ
２含有細胞のリン酸化に効果はなかったが、１５分のイ
ンキュベートの後にＨＥＲ４のチロシンリン酸化におい
て２．４〜４倍の増加を誘導した（図１５Ｂ参照）。こ
れらの発見は、ＨＥＲ２に対する直接結合を介するので
はなく、これに代えてＨＥＲ４との直接相互作用によっ
て、ＮＤＦ／ＨＲＧ−αがその効果を媒介することの予
備的な証拠を与える。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞および
他の胸部カルシノーマ細胞のようなＨＥＲ２およびＨＥ
Ｒ４の両者を発現する細胞系統では、これらの２つの関
連する膜横断受容体のヘテロ二量体形成により、または
細胞内クロストークにより、ＨＥＲ４に対するＮＤＦの
結合がＨＥＲ２を刺激する可能性がある。ＮＤＦとＨＥ
Ｒ４との間の直接相互作用の正式な証拠には、ＣＨＯ／
ＨＥＲ４に対する125 Ｉ−ＮＤＦの交差結合およびその
結合特性の詳細な分析が必要であろう。
導ＨＥＲ４媒介リン酸化 組換えＮＤＦをＣＯＳ細胞中で発現させ、主としてＥＧ
ＦＲ系統群の他の公知の構成員、特にＥＧＦＲおよびＨ
ＥＲ２のない検定系でＨＥＲ４に対するその活性を試験
した。全長のラットＮＤＦｃＤＮＡを正常なラット腎臓
ＲＮＡから単離し、ｃＤＭ８に基く発現ベクターに挿入
してｃＮＤＦ１．６を生成した。この構成体はＣＯＳ細
胞中で遷移的に発現し、前記セクション８．２．に記載
したチロシンキナーゼ刺激検定を使用し、馴化した細胞
上澄をＮＤＦ活性について試験した。ｃＮＤＦ１．６形
質移入細胞からの上澄は、擬性形質移入ＣＯＳ培地と比
較し、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞中でチロシンリン酸化
を上方制御した（図１５Ａ）。リン酸化は、ＮＤＦに対
する添加の後１０〜１５分でピークに達した。ＥＧＦＲ
（ＮＲ５細胞）、ＨＥＲ２（ＣＨＯ／ＨＥＲ２ １−２
５００細胞）およびＨＥＲ４（ＣＨＯ／ＨＥＲ４ ２１
−２細胞）をリン酸化する能力についても、粗製ＮＤＦ
上澄を試験した。ＮＤＦ調製物はＥＧＦＲまたはＨＥＲ
２含有細胞のリン酸化に効果はなかったが、１５分のイ
ンキュベートの後にＨＥＲ４のチロシンリン酸化におい
て２．４〜４倍の増加を誘導した（図１５Ｂ参照）。こ
れらの発見は、ＨＥＲ２に対する直接結合を介するので
はなく、これに代えてＨＥＲ４との直接相互作用によっ
て、ＮＤＦ／ＨＲＧ−αがその効果を媒介することの予
備的な証拠を与える。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞および
他の胸部カルシノーマ細胞のようなＨＥＲ２およびＨＥ
Ｒ４の両者を発現する細胞系統では、これらの２つの関
連する膜横断受容体のヘテロ二量体形成により、または
細胞内クロストークにより、ＨＥＲ４に対するＮＤＦの
結合がＨＥＲ２を刺激する可能性がある。ＮＤＦとＨＥ
Ｒ４との間の直接相互作用の正式な証拠には、ＣＨＯ／
ＨＥＲ４に対する125 Ｉ−ＮＤＦの交差結合およびその
結合特性の詳細な分析が必要であろう。
【００７５】１１．実施例：ＨＥＲ４遺伝子の染色体マ
ッピング 遺伝子の５′部分に対応するＨＥＲ４ｃＤＮＡプローブ
（ヌクレオチド位置３４〜１３０３）を、ＨＥＲ４遺伝
子のその場でのハイブリダイゼーションマッピングのた
めに使用した。（マースら、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：７４００
−０４）に記載されたように、２．６×１０7 ｃｐｍ／
μｇの比活性に3 Ｈにより標識したＨＥＲ４プローブを
使用し、２つの正常なオス供与体のリンパ球からのメタ
相染色体に対するその場でのハイブリダイゼーションを
行った。最終プローブ濃度は、ハイブリダイゼーション
混合物の０．０５μｇ／μｌとした。スライドは１か月
露呈した。Ｑ結合により染色体を同定した。
ッピング 遺伝子の５′部分に対応するＨＥＲ４ｃＤＮＡプローブ
（ヌクレオチド位置３４〜１３０３）を、ＨＥＲ４遺伝
子のその場でのハイブリダイゼーションマッピングのた
めに使用した。（マースら、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：７４００
−０４）に記載されたように、２．６×１０7 ｃｐｍ／
μｇの比活性に3 Ｈにより標識したＨＥＲ４プローブを
使用し、２つの正常なオス供与体のリンパ球からのメタ
相染色体に対するその場でのハイブリダイゼーションを
行った。最終プローブ濃度は、ハイブリダイゼーション
混合物の０．０５μｇ／μｌとした。スライドは１か月
露呈した。Ｑ結合により染色体を同定した。
【００７６】１１．２．結果 オートラジオグラフ細粒体を有する合計５８のメタ相細
胞を検査した。記録した１２４のハイブリダイゼーショ
ン部位の内、３８（３１％）が、染色体２の長アームの
遠位位置に位置していた（図１６）。最大数の細粒体
（２１細粒体）はバンドｑ３３に位置し、有意な数の細
粒体がバンドｑ３４（１０細粒体）およびｑ３５（７細
粒体）にあった。他のヒト染色体に対しては有意なハイ
ブリダイゼーションは検出されなかった。
胞を検査した。記録した１２４のハイブリダイゼーショ
ン部位の内、３８（３１％）が、染色体２の長アームの
遠位位置に位置していた（図１６）。最大数の細粒体
（２１細粒体）はバンドｑ３３に位置し、有意な数の細
粒体がバンドｑ３４（１０細粒体）およびｑ３５（７細
粒体）にあった。他のヒト染色体に対しては有意なハイ
ブリダイゼーションは検出されなかった。
【００７７】１２．微生物および細胞の寄託 次の微生物および細胞系統をアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションに寄託し、次の受託番号を受け
た： 微生物 プラスミド 受託番号 大腸菌ＳＣＳ−１ ｐＢＳＨＥＲ４Ｙ ６９１３１ （完全なヒトＨＥＲ４コード配列を含む） 細胞系統 ＣＨＯ／ＨＥＲ４ ２１−２ ＣＲＬ １１２０５ 本発明は、寄託した微生物および細胞系統またはここに
記載した態様によって範囲において限定されるものでは
なく、これらはこの発明の１つの観点の単に説明として
意図するものであり、その機能的に等価な全ゆるものは
この発明の範囲内である。実際、ここに示し説明したも
のに加えて、この発明の種々の改変が、前記した説明か
ら当業者に明らかとなろう。この種の改変は、記載した
特許請求の範囲の範囲内に該当することを意図する。ポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドについて与えた全て
の塩基対およびアミノ酸残基番号および大きさは概略的
なものであり、説明の目的のために使用したものであ
る。
チャー・コレクションに寄託し、次の受託番号を受け
た： 微生物 プラスミド 受託番号 大腸菌ＳＣＳ−１ ｐＢＳＨＥＲ４Ｙ ６９１３１ （完全なヒトＨＥＲ４コード配列を含む） 細胞系統 ＣＨＯ／ＨＥＲ４ ２１−２ ＣＲＬ １１２０５ 本発明は、寄託した微生物および細胞系統またはここに
記載した態様によって範囲において限定されるものでは
なく、これらはこの発明の１つの観点の単に説明として
意図するものであり、その機能的に等価な全ゆるものは
この発明の範囲内である。実際、ここに示し説明したも
のに加えて、この発明の種々の改変が、前記した説明か
ら当業者に明らかとなろう。この種の改変は、記載した
特許請求の範囲の範囲内に該当することを意図する。ポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドについて与えた全て
の塩基対およびアミノ酸残基番号および大きさは概略的
なものであり、説明の目的のために使用したものであ
る。
【００７８】配 列 表 （１）一般情報 (i) 発明者：グレゴリー・ディー・プラウマン、ジー
ン・マイケル・クロウスコウ、モハメド・ショーヤブ (ii) 発明の名称：HER4ヒト受容体チロシンキナーゼ (iii) 配列の数：３０ (iv) 連絡住所 (A) 連絡先：ペニー・アンド・エドモンズ (B) 通り：１１５５アベニュー・オブ・ザ・アメリカズ (C) 都市：ニュー・ヨーク (D) 州：ニュー・ヨーク州 (E) 国：アメリカ合衆国 (F) ジップコード：１００３６−２７１１ (v) コンピューター読取り可能形式 (A) 媒体の型：フロッピーディスク (B) コンピューター：IBM PC 互換性 (C) オペレーティング・システム：PC-DOS/MS-DOS (D) ソフトウェア：PatentIn Release #1.0 、Version
#1.25 (vi) 最新出願データ (A) 出願番号：US 07/981,165 (B) 出願日：1992年11月24日 (C) 分類： (vii) 代理人／エージェント情報 (A) 名前：エス・レスリー・ミスロック (B) 登録番号：18,872 (C) 参照／ドケット番号：5624-186 (viii)通信情報 (A) 電話：(212)790-9090 (B) テレファックス：(212)869-8864/9741 (C) テレックス：66141 PENNIE
ン・マイケル・クロウスコウ、モハメド・ショーヤブ (ii) 発明の名称：HER4ヒト受容体チロシンキナーゼ (iii) 配列の数：３０ (iv) 連絡住所 (A) 連絡先：ペニー・アンド・エドモンズ (B) 通り：１１５５アベニュー・オブ・ザ・アメリカズ (C) 都市：ニュー・ヨーク (D) 州：ニュー・ヨーク州 (E) 国：アメリカ合衆国 (F) ジップコード：１００３６−２７１１ (v) コンピューター読取り可能形式 (A) 媒体の型：フロッピーディスク (B) コンピューター：IBM PC 互換性 (C) オペレーティング・システム：PC-DOS/MS-DOS (D) ソフトウェア：PatentIn Release #1.0 、Version
#1.25 (vi) 最新出願データ (A) 出願番号：US 07/981,165 (B) 出願日：1992年11月24日 (C) 分類： (vii) 代理人／エージェント情報 (A) 名前：エス・レスリー・ミスロック (B) 登録番号：18,872 (C) 参照／ドケット番号：5624-186 (viii)通信情報 (A) 電話：(212)790-9090 (B) テレファックス：(212)869-8864/9741 (C) テレックス：66141 PENNIE
【００７９】（２）配列番号：１の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：５５０１塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類： Genomic DNA (ix) 配列の特徴 (A) 名称／キー：CDS (B) 位置：34..3961 (xi) 配列番号 １
【００８０】
【表４】
【００８１】
【表５】
【００８２】
【表６】
【００８３】
【表７】
【００８４】
【表８】
【００８５】
【表９】
【００８６】
【表１０】
【００８７】（２）配列番号：２の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：１３０８アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：蛋白質 (xi) 配列番号 ２
【００８８】
【表１１】
【００８９】
【表１２】
【００９０】
【表１３】
【００９１】
【表１４】
【００９２】
【表１５】
【００９３】（２）配列番号：３の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：５５５５塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類： Genomic DNA (ix) 配列の特徴 (A) 名称／キー：CDS (B) 位置：34..3210 (xi) 配列番号 ３
【００９４】
【表１６】
【００９５】
【表１７】
【００９６】
【表１８】
【００９７】
【表１９】
【００９８】
【表２０】
【００９９】
【表２１】
【０１００】（２）配列番号：４の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：１０５８アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：蛋白質 (xi) 配列番号 ４
【０１０１】
【表２２】
【０１０２】
【表２３】
【０１０３】
【表２４】
【０１０４】
【表２５】
【０１０５】（２）配列番号：５の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：３３２１塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類： Genomic DNA (ix) 配列の特徴 (A) 名称／キー：CDS (B) 位置：156..1782 (xi) 配列番号 ５
【０１０６】
【表２６】
【０１０７】
【表２７】
【０１０８】
【表２８】
【０１０９】
【表２９】
【０１１０】（２）配列番号：６の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：５４１アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：蛋白質 (xi) 配列番号 ６
【０１１１】
【表３０】
【０１１２】
【表３１】
【０１１３】（２）配列番号：７の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：１２１０アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：不明 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類：蛋白質 (xi) 配列番号 ７
【０１１４】
【表３２】
【０１１５】
【表３３】
【０１１６】
【表３４】
【０１１７】
【表３５】
【０１１８】（２）配列番号：８の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：１２５５アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：不明 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類：蛋白質 (xi) 配列番号 ８
【０１１９】
【表３６】
【０１２０】
【表３７】
【０１２１】
【表３８】
【０１２２】
【表３９】
【０１２３】（２）配列番号：９の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：１３４２アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：不明 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類：蛋白質 (xi) 配列番号 ９
【０１２４】
【表４０】
【０１２５】
【表４１】
【０１２６】
【表４２】
【０１２７】
【表４３】
【０１２８】
【表４４】
【０１２９】（２）配列番号：１０の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：９１１アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：不明 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類：蛋白質 (xi) 配列番号 １０
【０１３０】
【表４５】
【０１３１】
【表４６】
【０１３２】
【表４７】
【０１３３】
【表４８】
【０１３４】（２）配列番号：１１の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：６アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：不明 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類：ペプチド (xi) 配列番号 １１ Gly Xaa Gly Xaa Xaa Gly 1 5
【０１３５】（２）配列番号：１２の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：６アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：不明 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類：ペプチド (xi) 配列番号 １２ Asp Leu Ala Ala Arg Asn 1 5
【０１３６】（２）配列番号：１３の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：６アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：不明 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類：ペプチド (xi) 配列番号 １３ Pro Ile Lys Trp Met Ala 1 5
【０１３７】（２）配列番号：１４の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：２０塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類： Genomic DNA (xi) 配列番号 １４ ACNGTNTGGG ARYTNAYHAC
【０１３８】（２）配列番号：１５の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：２３塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類： Genomic DNA (xi) 配列番号 １５ CAYGTNAARA THACNGAYTT YGG
【０１３９】（２）配列番号：１６の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：２５塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類： Genomic DNA (xi) 配列番号 １６ GACGAATTCC NATHAARTGG ATGGC
【０１４０】（２）配列番号：１７の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：２４塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類： Genomic DNA (xi) 配列番号 １７ ACAYTTNARD ATDATCATRT ANAC
【０１４１】（２）配列番号：１８の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：１７塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類： Genomic DNA (xi) 配列番号 １８ AANGTCATNA RYTCCCA
【０１４２】（２）配列番号：１９の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：２３塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類： Genomic DNA (xi) 配列番号 １９ TCCAGNGCGA TCCAYTTDAT NGG
【０１４３】（２）配列番号：２０の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：１８塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類： Genomic DNA (xi) 配列番号 ２０ GGRTCDATCA TCCARCCT
【０１４４】（２）配列番号：２１の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：２０塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類： Genomic DNA (xi) 配列番号 ２１ CTGCTGTCAG CATCGATCAT
【０１４５】（２）配列番号：２２の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：７アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：不明 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類：ペプチド (xi) 配列番号 ２２ Thr Val Trp Glu Leu Met Thr 1 5
【０１４６】（２）配列番号：２３の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：８アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：不明 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類：ペプチド (xi) 配列番号 ２３ His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly 1 5
【０１４７】（２）配列番号：２４の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：７アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：不明 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類：ペプチド (xi) 配列番号 ２４ Val Tyr Met Ile Ile Leu Lys 1 5
【０１４８】（２）配列番号：２５の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：６アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：不明 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類：ペプチド (xi) 配列番号 ２５ Trp Glu Leu Met Thr Phe 1 5
【０１４９】（２）配列番号：２６の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：８アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：不明 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類：ペプチド (xi) 配列番号 ２６ Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu 1 5
【０１５０】（２）配列番号：２７の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：６アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：不明 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類：ペプチド (xi) 配列番号 ２７ Cys Trp Met Ile Asp Pro 1 5
【０１５１】（２）配列番号：２８の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：３５塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類： Genomic DNA (xi) 配列番号 ２８ GACTCGAGTC GACATCGATT TTTTTTTTTT TTTTT
【０１５２】（２）配列番号：２９の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：２４塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類： Genomic DNA (xi) 配列番号 ２９ GAAGAAAGAC GACTCGTTCA TCGG
【０１５３】（２）配列番号：３０の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：２５塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類： Genomic DNA (xi) 配列番号 ３０ GACCATGACC ATGTAAACGT CAATA
【図１】ＨＥＲ４のヌクレオチド配列（配列番号：１）
および演繹されたアミノ酸配列（配列番号：２）（１３
０８アミノ酸残基）。ヌクレオチドは左側に番号付け
し、アミノ酸はその配列の上に番号付けする。
および演繹されたアミノ酸配列（配列番号：２）（１３
０８アミノ酸残基）。ヌクレオチドは左側に番号付け
し、アミノ酸はその配列の上に番号付けする。
【図２】ＨＥＲ４のヌクレオチド配列（配列番号：１）
および演繹されたアミノ酸配列（配列番号：２）（１３
０８アミノ酸残基）。ヌクレオチドは左側に番号付け
し、アミノ酸はその配列の上に番号付けする。
および演繹されたアミノ酸配列（配列番号：２）（１３
０８アミノ酸残基）。ヌクレオチドは左側に番号付け
し、アミノ酸はその配列の上に番号付けする。
【図３】ＨＥＲ４変種をコードするｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列（配列番号：３）および演繹されたアミノ酸配
列（配列番号：４）。他の３′末端を有し、自己リン酸
化ドメインを有さないＨＥＲ４。この配列は、ヌクレオ
チド３１６８までは図１〜２に示すＨＥＲ４のものと同
一であるが、そこで配列は分岐し、１３アミノ酸後にオ
ープンリーディングフレームは停止し、その後に延在し
た独特の３′非翻訳領域が続く。
チド配列（配列番号：３）および演繹されたアミノ酸配
列（配列番号：４）。他の３′末端を有し、自己リン酸
化ドメインを有さないＨＥＲ４。この配列は、ヌクレオ
チド３１６８までは図１〜２に示すＨＥＲ４のものと同
一であるが、そこで配列は分岐し、１３アミノ酸後にオ
ープンリーディングフレームは停止し、その後に延在し
た独特の３′非翻訳領域が続く。
【図４】ＨＥＲ４変種をコードするｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列（配列番号：３）および演繹されたアミノ酸配
列（配列番号：４）。他の３′末端を有し、自己リン酸
化ドメインを有さないＨＥＲ４。この配列は、ヌクレオ
チド３１６８までは図１〜２に示すＨＥＲ４のものと同
一であるが、そこで配列は分岐し、１３アミノ酸後にオ
ープンリーディングフレームは停止し、その後に延在し
た独特の３′非翻訳領域が続く。
チド配列（配列番号：３）および演繹されたアミノ酸配
列（配列番号：４）。他の３′末端を有し、自己リン酸
化ドメインを有さないＨＥＲ４。この配列は、ヌクレオ
チド３１６８までは図１〜２に示すＨＥＲ４のものと同
一であるが、そこで配列は分岐し、１３アミノ酸後にオ
ープンリーディングフレームは停止し、その後に延在し
た独特の３′非翻訳領域が続く。
【図５】ＨＥＲ４変種をコードするｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列（配列番号：５）および演繹されたアミノ酸配
列（配列番号：６）。Ｎ末端裁頭としたＨＥＲ４。この
配列はＨＥＲ４配列の３′部分を含み、この場合裁頭配
列のヌクレオチド位置１５６が、図１〜２に示す完全な
ＨＥＲ４配列の位置２３３５に並ぶ（ＨＥＲ４キナーゼ
のＡＴＰ結合部位をコードする領域の直ぐ下流）。裁頭
配列の最初の１５５ヌクレオチドはＨＥＲ４から独特で
あり、ＨＥＲ４遺伝子のイントロン内の隠性プロモータ
ーから誘導された転写体の５′非翻訳領域を表す可能性
がある（セクション６．２．２．、前記）。
チド配列（配列番号：５）および演繹されたアミノ酸配
列（配列番号：６）。Ｎ末端裁頭としたＨＥＲ４。この
配列はＨＥＲ４配列の３′部分を含み、この場合裁頭配
列のヌクレオチド位置１５６が、図１〜２に示す完全な
ＨＥＲ４配列の位置２３３５に並ぶ（ＨＥＲ４キナーゼ
のＡＴＰ結合部位をコードする領域の直ぐ下流）。裁頭
配列の最初の１５５ヌクレオチドはＨＥＲ４から独特で
あり、ＨＥＲ４遺伝子のイントロン内の隠性プロモータ
ーから誘導された転写体の５′非翻訳領域を表す可能性
がある（セクション６．２．２．、前記）。
【図６】図１〜２に示した全長のＨＥＲ４受容体と並べ
た変種形態のヒトＨＥＲ４の演繹されたアミノ酸配列。
１文字コードを使用して配列を示し、右側に番号を付
け、完全なＨＥＲ４配列を上とし変種配列を下とする。
並べた残基の間のコロンにより同一の残基を示す。他の
３′末端を有し、自己リン酸化ドメインを欠失するＨＥ
Ｒ４（配列番号：４）。この配列は、アミノ酸１０４５
までは図１〜２に示すＨＥＲ４（配列番号：２）のもの
と同一であるが、そこで配列は分岐し、停止コドンに達
する前に１３アミノ酸が続く。
た変種形態のヒトＨＥＲ４の演繹されたアミノ酸配列。
１文字コードを使用して配列を示し、右側に番号を付
け、完全なＨＥＲ４配列を上とし変種配列を下とする。
並べた残基の間のコロンにより同一の残基を示す。他の
３′末端を有し、自己リン酸化ドメインを欠失するＨＥ
Ｒ４（配列番号：４）。この配列は、アミノ酸１０４５
までは図１〜２に示すＨＥＲ４（配列番号：２）のもの
と同一であるが、そこで配列は分岐し、停止コドンに達
する前に１３アミノ酸が続く。
【図７】図１〜２に示した全長のＨＥＲ４受容体と並べ
た変種形態のヒトＨＥＲ４の演繹されたアミノ酸配列。
１文字コードを使用して配列を示し、右側に番号を付
け、完全なＨＥＲ４配列を上とし変種配列を下とする。
並べた残基の間のコロンにより同一の残基を示す。Ｎ末
端裁頭としたＨＥＲ４（配列番号：６）。この配列は、
アミノ酸７６８で開始する図１〜２に示すＨＥＲ４（配
列番号：２）の３′部分と同一である（セクション６．
２．２．、前記）。
た変種形態のヒトＨＥＲ４の演繹されたアミノ酸配列。
１文字コードを使用して配列を示し、右側に番号を付
け、完全なＨＥＲ４配列を上とし変種配列を下とする。
並べた残基の間のコロンにより同一の残基を示す。Ｎ末
端裁頭としたＨＥＲ４（配列番号：６）。この配列は、
アミノ酸７６８で開始する図１〜２に示すＨＥＲ４（配
列番号：２）の３′部分と同一である（セクション６．
２．２．、前記）。
【図８】ヒトＨＥＲ４（配列番号：２）の演繹されたア
ミノ酸配列および他のヒトＥＧＦＲ系統群の構成員と並
べたもの（ＥＧＦＲ（配列番号：７）；ＨＥＲ２（配列
番号：８）；ＨＥＲ３（配列番号：９））。１文字コー
ドを使用して配列を示し、左側に番号を付ける。同一の
残基をドットにより示し、至適に並べるために空隙を入
れ、システイン残基をアステリスクでマークし、Ｎ結合
グリコシル化部位をプラス（＋）で示す。潜在的な蛋白
質キナーゼＣリン酸化部位は矢印により示す（ＨＥＲ４
アミノ酸位置６７９、６８５および６９９）。予測され
るＡＴＰ結合部位を４つの丸十字で示し、Ｃ末端チロシ
ンを白三角で示し、ＥＧＦＲにおける主要リン酸化部位
により保存されたＨＥＲ４中のチロシンを黒三角で示
す。予測される細胞外ドメインは、位置２５の矢印によ
りマークしたシグナル配列の境界から、アミノ酸位置６
５０〜６７５に上線を付した疎水性膜横断ドメインに延
在する。種々のサブドメインを右側に標識を付した：
Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ＝細胞外サブドメイン（ド
メインＩＩおよびＩＶはシステインに富む）、ＴＭ＝膜
横断ドメイン、ＴＫ＝チロシンキナーゼドメイン。ドメ
インＩ、ＩＩＩ、ＴＫを箱で囲む。
ミノ酸配列および他のヒトＥＧＦＲ系統群の構成員と並
べたもの（ＥＧＦＲ（配列番号：７）；ＨＥＲ２（配列
番号：８）；ＨＥＲ３（配列番号：９））。１文字コー
ドを使用して配列を示し、左側に番号を付ける。同一の
残基をドットにより示し、至適に並べるために空隙を入
れ、システイン残基をアステリスクでマークし、Ｎ結合
グリコシル化部位をプラス（＋）で示す。潜在的な蛋白
質キナーゼＣリン酸化部位は矢印により示す（ＨＥＲ４
アミノ酸位置６７９、６８５および６９９）。予測され
るＡＴＰ結合部位を４つの丸十字で示し、Ｃ末端チロシ
ンを白三角で示し、ＥＧＦＲにおける主要リン酸化部位
により保存されたＨＥＲ４中のチロシンを黒三角で示
す。予測される細胞外ドメインは、位置２５の矢印によ
りマークしたシグナル配列の境界から、アミノ酸位置６
５０〜６７５に上線を付した疎水性膜横断ドメインに延
在する。種々のサブドメインを右側に標識を付した：
Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ＝細胞外サブドメイン（ド
メインＩＩおよびＩＶはシステインに富む）、ＴＭ＝膜
横断ドメイン、ＴＫ＝チロシンキナーゼドメイン。ドメ
インＩ、ＩＩＩ、ＴＫを箱で囲む。
【図９】ヒトＨＥＲ４（配列番号：２）の演繹されたア
ミノ酸配列および他のヒトＥＧＦＲ系統群の構成員と並
べたもの（ＥＧＦＲ（配列番号：７）；ＨＥＲ２（配列
番号：８）；ＨＥＲ３（配列番号：９））。１文字コー
ドを使用して配列を示し、左側に番号を付ける。同一の
残基をドットにより示し、至適に並べるために空隙を入
れ、システイン残基をアステリスクでマークし、Ｎ結合
グリコシル化部位をプラス（＋）で示す。潜在的な蛋白
質キナーゼＣリン酸化部位は矢印により示す（ＨＥＲ４
アミノ酸位置６７９、６８５および６９９）。予測され
るＡＴＰ結合部位を４つの丸十字で示し、Ｃ末端チロシ
ンを白三角で示し、ＥＧＦＲにおける主要リン酸化部位
により保存されたＨＥＲ４中のチロシンを黒三角で示
す。予測される細胞外ドメインは、位置２５の矢印によ
りマークしたシグナル配列の境界から、アミノ酸位置６
５０〜６７５に上線を付した疎水性膜横断ドメインに延
在する。種々のサブドメインを右側に標識を付した：
Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ＝細胞外サブドメイン（ド
メインＩＩおよびＩＶはシステインに富む）、ＴＭ＝膜
横断ドメイン、ＴＫ＝チロシンキナーゼドメイン。ドメ
インＩ、ＩＩＩ、ＴＫを箱で囲む。
ミノ酸配列および他のヒトＥＧＦＲ系統群の構成員と並
べたもの（ＥＧＦＲ（配列番号：７）；ＨＥＲ２（配列
番号：８）；ＨＥＲ３（配列番号：９））。１文字コー
ドを使用して配列を示し、左側に番号を付ける。同一の
残基をドットにより示し、至適に並べるために空隙を入
れ、システイン残基をアステリスクでマークし、Ｎ結合
グリコシル化部位をプラス（＋）で示す。潜在的な蛋白
質キナーゼＣリン酸化部位は矢印により示す（ＨＥＲ４
アミノ酸位置６７９、６８５および６９９）。予測され
るＡＴＰ結合部位を４つの丸十字で示し、Ｃ末端チロシ
ンを白三角で示し、ＥＧＦＲにおける主要リン酸化部位
により保存されたＨＥＲ４中のチロシンを黒三角で示
す。予測される細胞外ドメインは、位置２５の矢印によ
りマークしたシグナル配列の境界から、アミノ酸位置６
５０〜６７５に上線を付した疎水性膜横断ドメインに延
在する。種々のサブドメインを右側に標識を付した：
Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ＝細胞外サブドメイン（ド
メインＩＩおよびＩＶはシステインに富む）、ＴＭ＝膜
横断ドメイン、ＴＫ＝チロシンキナーゼドメイン。ドメ
インＩ、ＩＩＩ、ＴＫを箱で囲む。
【図１０】ＨＥＲ４（１３０８アミノ酸）、ＥＧＦＲ
（１２１０アミノ酸）、ＨＥＲ２（１２５５アミノ酸）
およびＨＥＲ３（１３４２アミノ酸）についての蛋白質
ドメインの比較（Ｂ）と並べたＨＥＲ４の親水性疎水性
の様子（Ａ）。シグナルペプチドは点刻した箱により表
し、システインに富む細胞外サブドメインは斜線を付
し、膜横断ドメインは塗り潰し、細胞質チロシンキナー
ゼドメインは点刻する。ＨＥＲ４と他のＥＧＦＲ系統群
の構成員との間のパーセントアミノ酸配列の同一性を示
す。Ｓｉｇはシグナルペプチド、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよ
びＩＶは細胞外ドメイン、ＴＭは膜横断ドメイン、ＪＭ
は膜近接ドメイン、ＣａＩｎはカルシウム流入および内
在化ドメイン、３′ＵＴＲは３′非翻訳領域である。
（１２１０アミノ酸）、ＨＥＲ２（１２５５アミノ酸）
およびＨＥＲ３（１３４２アミノ酸）についての蛋白質
ドメインの比較（Ｂ）と並べたＨＥＲ４の親水性疎水性
の様子（Ａ）。シグナルペプチドは点刻した箱により表
し、システインに富む細胞外サブドメインは斜線を付
し、膜横断ドメインは塗り潰し、細胞質チロシンキナー
ゼドメインは点刻する。ＨＥＲ４と他のＥＧＦＲ系統群
の構成員との間のパーセントアミノ酸配列の同一性を示
す。Ｓｉｇはシグナルペプチド、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよ
びＩＶは細胞外ドメイン、ＴＭは膜横断ドメイン、ＪＭ
は膜近接ドメイン、ＣａＩｎはカルシウム流入および内
在化ドメイン、３′ＵＴＲは３′非翻訳領域である。
【図１１】３′自己リン酸化ドメイン（Ａ）および５′
細胞外ドメイン（Ｂ）（セクション６．２．３．、前記
参照）由来のＨＥＲ４プローブにハイブリダイズしたヒ
ト組織由来のｍＲＮＡのノーザンブロット分析。ＲＮＡ
の大きさマーカー（キロベースで）を左側に示す。レー
ン１〜８は、それぞれ膵臓、腎臓、骨格筋、肝臓、肺、
胎盤、脳および心臓由来の２μｇのポリ（Ａ）＋ｍＲＮ
Ａを示す。
細胞外ドメイン（Ｂ）（セクション６．２．３．、前記
参照）由来のＨＥＲ４プローブにハイブリダイズしたヒ
ト組織由来のｍＲＮＡのノーザンブロット分析。ＲＮＡ
の大きさマーカー（キロベースで）を左側に示す。レー
ン１〜８は、それぞれ膵臓、腎臓、骨格筋、肝臓、肺、
胎盤、脳および心臓由来の２μｇのポリ（Ａ）＋ｍＲＮ
Ａを示す。
【図１２】セクション７．１．３．、前記に概説した手
順によりＣＨＯ−ＫＩ細胞中で安定に発現した組換えＨ
ＥＲ４の免疫ブロット分析。組換えＨＥＲ４を発現する
ＣＨＯ−ＫＩ細胞由来の膜調製物を７％ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロースに移し
た。（Ａ）ＨＥＲ４と交差反応するＨＥＲ２のＣ末端に
対するモノクローナル抗体（Ａｂ３、オンコジーン・サ
イエンス、ユニオンダーレ、ＮＹ）または（Ｂ）ＨＥＲ
２およびＨＥＲ４の共通エピトープに対するヒツジ抗ペ
プチドポリクローナル抗体とブロットとをハイブリダイ
ズさせた。レーン１は親ＣＨＯ−ＫＩ細胞、レーン２〜
４はそれぞれＣＨＯ−ＫＩ／ＨＥＲ４細胞クローン６、
２１および３である。１８０ｋＤａのＨＥＲ４蛋白質お
よび１３０ｋＤａの交差反応分子種を銘記すべきであ
る。予備染色した高分子量マーカー（バイオラド、リッ
チモンド、ＣＡ）のキロダルトンの大きさを左側に示
す。
順によりＣＨＯ−ＫＩ細胞中で安定に発現した組換えＨ
ＥＲ４の免疫ブロット分析。組換えＨＥＲ４を発現する
ＣＨＯ−ＫＩ細胞由来の膜調製物を７％ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロースに移し
た。（Ａ）ＨＥＲ４と交差反応するＨＥＲ２のＣ末端に
対するモノクローナル抗体（Ａｂ３、オンコジーン・サ
イエンス、ユニオンダーレ、ＮＹ）または（Ｂ）ＨＥＲ
２およびＨＥＲ４の共通エピトープに対するヒツジ抗ペ
プチドポリクローナル抗体とブロットとをハイブリダイ
ズさせた。レーン１は親ＣＨＯ−ＫＩ細胞、レーン２〜
４はそれぞれＣＨＯ−ＫＩ／ＨＥＲ４細胞クローン６、
２１および３である。１８０ｋＤａのＨＥＲ４蛋白質お
よび１３０ｋＤａの交差反応分子種を銘記すべきであ
る。予備染色した高分子量マーカー（バイオラド、リッ
チモンド、ＣＡ）のキロダルトンの大きさを左側に示
す。
【図１３】胸部ガン分化因子（セクション８．、前記参
照）によるＨＥＲ４チロシンキナーゼの特異的活性化。
それぞれＥＧＦＲ系統群のチロシンキナーゼ受容体（Ｅ
ＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４）の単一の
構成員を過剰発現するよう操作した４つの組換え細胞系
統を、セクション７．１．２および８．１．、前記に記
載した方法により調製した。４つの組換え細胞系統のそ
れぞれからの細胞を種々のリガンド調製物により刺激
し、セクション８．２．、前記に記載した検定を使用し
て受容体チロシンリン酸化について検定した。（Ａ）は
ＣＨＯ／ＨＥＲ４＃３細胞、（Ｂ）はＣＨＯ／ＨＥＲ２
細胞、（Ｃ）はＮＲＨＥＲ５細胞、および（Ｄ）は２９
３／ＨＥＲ３細胞である。細胞は、レーン１：緩衝液対
照、レーン２：１００ｎｇ／ｍｌＥＧＦ、レーン３：２
００ｎｇ／ｍｌアンフィレグリン、レーン４：１０μｌ
フェニルカラム画分１７（セクション９、前記）、レー
ン５：１０μｌフェニルカラム画分１４（セクション
９、前記、また以下の図１４の説明参照）により刺激し
た。予備染色した分子量マーカーの大きさ（キロダルト
ンで）をそれぞれのパネルの左側に標識した。それぞれ
の系のリン酸化した受容体は、２２１ｋＤａマーカーの
直ぐ下に移動する。ゲルの底部のバンドは外来性であ
り、二次抗体と免疫沈殿で使用した抗体との反応による
ものである。
照）によるＨＥＲ４チロシンキナーゼの特異的活性化。
それぞれＥＧＦＲ系統群のチロシンキナーゼ受容体（Ｅ
ＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４）の単一の
構成員を過剰発現するよう操作した４つの組換え細胞系
統を、セクション７．１．２および８．１．、前記に記
載した方法により調製した。４つの組換え細胞系統のそ
れぞれからの細胞を種々のリガンド調製物により刺激
し、セクション８．２．、前記に記載した検定を使用し
て受容体チロシンリン酸化について検定した。（Ａ）は
ＣＨＯ／ＨＥＲ４＃３細胞、（Ｂ）はＣＨＯ／ＨＥＲ２
細胞、（Ｃ）はＮＲＨＥＲ５細胞、および（Ｄ）は２９
３／ＨＥＲ３細胞である。細胞は、レーン１：緩衝液対
照、レーン２：１００ｎｇ／ｍｌＥＧＦ、レーン３：２
００ｎｇ／ｍｌアンフィレグリン、レーン４：１０μｌ
フェニルカラム画分１７（セクション９、前記）、レー
ン５：１０μｌフェニルカラム画分１４（セクション
９、前記、また以下の図１４の説明参照）により刺激し
た。予備染色した分子量マーカーの大きさ（キロダルト
ンで）をそれぞれのパネルの左側に標識した。それぞれ
の系のリン酸化した受容体は、２２１ｋＤａマーカーの
直ぐ下に移動する。ゲルの底部のバンドは外来性であ
り、二次抗体と免疫沈殿で使用した抗体との反応による
ものである。
【図１４】ＨｅｐＧ２細胞の馴化培地から精製したＭＤ
Ａ−ＭＢ−４５３細胞分化活性の生物学的および生化学
的性質（セクション９．、前記）。形態分化の誘導
（Ａ、ＢおよびＣ）。ＨｅｐＧ２細胞からの馴化培地を
硫酸アンモニウム分画に供し、その後ＰＢＳに対する透
析を行った。この材料の希釈物を示した蛋白質濃度でＭ
ＤＡ−ＭＢ４５３モノレイヤーに添加した。（Ａ）は対
照、（Ｂ）は穴当り８０ｎｇ、（Ｃ）は穴当り２．０μ
ｇである。（Ｄ）は２３０ｎｍ吸光度でモニターしたフ
ェニル−５ＰＷカラム溶出の様子。（Ｅ）は次のリガン
ド調製物を用いたＭＤＡ−ＭＢ−４５３チロシン自己リ
ン酸化の刺激：なし（因子を添加しない対照）、ＴＧＦ
−α（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＭ（穴当り２μｌおよび１
０μｌで試験した１６倍濃縮ＨｅｐＧ２馴化培地）、画
分（フェニルカラム画分１３〜２０、穴当り１０μ
ｌ）。（Ｆ）は（Ｅ）に示すリン酸化シグナルの濃度計
分析。
Ａ−ＭＢ−４５３細胞分化活性の生物学的および生化学
的性質（セクション９．、前記）。形態分化の誘導
（Ａ、ＢおよびＣ）。ＨｅｐＧ２細胞からの馴化培地を
硫酸アンモニウム分画に供し、その後ＰＢＳに対する透
析を行った。この材料の希釈物を示した蛋白質濃度でＭ
ＤＡ−ＭＢ４５３モノレイヤーに添加した。（Ａ）は対
照、（Ｂ）は穴当り８０ｎｇ、（Ｃ）は穴当り２．０μ
ｇである。（Ｄ）は２３０ｎｍ吸光度でモニターしたフ
ェニル−５ＰＷカラム溶出の様子。（Ｅ）は次のリガン
ド調製物を用いたＭＤＡ−ＭＢ−４５３チロシン自己リ
ン酸化の刺激：なし（因子を添加しない対照）、ＴＧＦ
−α（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＭ（穴当り２μｌおよび１
０μｌで試験した１６倍濃縮ＨｅｐＧ２馴化培地）、画
分（フェニルカラム画分１３〜２０、穴当り１０μ
ｌ）。（Ｆ）は（Ｅ）に示すリン酸化シグナルの濃度計
分析。
【図１５】（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（レーン
１：擬性形質移入ＣＯＳ細胞上澄、レーン２：ＮＤＦ形
質移入ＣＯＳ細胞上澄）および（Ｂ）ＣＨＯ／ＨＥＲ４
２１−２細胞（レーン１および２：擬性形質移入ＣＯ
Ｓ細胞上澄、レーン３および４：ＮＤＦ形質移入ＣＯＳ
細胞上澄）のＮＤＦ誘導チロシンリン酸化。セクション
１０．、前記を参照することができる。チロシンリン酸
化は、セクション８．２．、前記に記載したチロシンキ
ナーゼ刺激検定により決定した。
１：擬性形質移入ＣＯＳ細胞上澄、レーン２：ＮＤＦ形
質移入ＣＯＳ細胞上澄）および（Ｂ）ＣＨＯ／ＨＥＲ４
２１−２細胞（レーン１および２：擬性形質移入ＣＯ
Ｓ細胞上澄、レーン３および４：ＮＤＦ形質移入ＣＯＳ
細胞上澄）のＮＤＦ誘導チロシンリン酸化。セクション
１０．、前記を参照することができる。チロシンリン酸
化は、セクション８．２．、前記に記載したチロシンキ
ナーゼ刺激検定により決定した。
【図１６】ヒト染色体２バンドｑ３３に対するＨＥＲ４
遺伝子の領域配置。（Ａ）はヒト染色体上の１２４のハ
イブリダイゼーションの部位の分布である。（Ｂ）は染
色体２の線図上のオートラジオグラフ細粒体の分布であ
る。
遺伝子の領域配置。（Ａ）はヒト染色体上の１２４のハ
イブリダイゼーションの部位の分布である。（Ｂ）は染
色体２の線図上のオートラジオグラフ細粒体の分布であ
る。
【図１７】ＨＥＲ４−Ｉｇ融合蛋白質のアミノ酸配列
（配列番号：１０）（セクション５．４．、前記）。
（配列番号：１０）（セクション５．４．、前記）。
ＣＭ １６倍濃縮ＨｅｐＧ２馴化培地
【手続補正書】
【提出日】平成６年６月１０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＥＲ４のヌクレオチド配列（配列番号：１）
および演繹されたアミノ酸配列（配列番号：２）（１３
０８アミノ酸残基）。ヌクレオチドは左側に番号付け
し、アミノ酸はその配列の上に番号付けする。
および演繹されたアミノ酸配列（配列番号：２）（１３
０８アミノ酸残基）。ヌクレオチドは左側に番号付け
し、アミノ酸はその配列の上に番号付けする。
【図２】ＨＥＲ４のヌクレオチド配列（配列番号：１）
および演繹されたアミノ酸配列（配列番号：２）（１３
０８アミノ酸残基）。ヌクレオチドは左側に番号付け
し、アミノ酸はその配列の上に番号付けする。
および演繹されたアミノ酸配列（配列番号：２）（１３
０８アミノ酸残基）。ヌクレオチドは左側に番号付け
し、アミノ酸はその配列の上に番号付けする。
【図３】ＨＥＲ４変種をコードするｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列（配列番号：３）および演繹されたアミノ酸配
列（配列番号：４）。他の３′末端を有し、自己リン酸
化ドメインを有さないＨＥＲ４。この配列は、ヌクレオ
チド３１６８までは図１〜２に示すＨＥＲ４のものと同
一であるが、そこで配列は分岐し、１３アミノ酸後にオ
ープンリーディングフレームは停止し、その後に延在し
た独特の３′非翻訳領域が続く。
チド配列（配列番号：３）および演繹されたアミノ酸配
列（配列番号：４）。他の３′末端を有し、自己リン酸
化ドメインを有さないＨＥＲ４。この配列は、ヌクレオ
チド３１６８までは図１〜２に示すＨＥＲ４のものと同
一であるが、そこで配列は分岐し、１３アミノ酸後にオ
ープンリーディングフレームは停止し、その後に延在し
た独特の３′非翻訳領域が続く。
【図４】ＨＥＲ４変種をコードするｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列（配列番号：３）および演繹されたアミノ酸配
列（配列番号：４）。他の３′末端を有し、自己リン酸
化ドメインを有さないＨＥＲ４。この配列は、ヌクレオ
チド３１６８までは図１〜２に示すＨＥＲ４のものと同
一であるが、そこで配列は分岐し、１３アミノ酸後にオ
ープンリーディングフレームは停止し、その後に延在し
た独特の３′非翻訳領域が続く。
チド配列（配列番号：３）および演繹されたアミノ酸配
列（配列番号：４）。他の３′末端を有し、自己リン酸
化ドメインを有さないＨＥＲ４。この配列は、ヌクレオ
チド３１６８までは図１〜２に示すＨＥＲ４のものと同
一であるが、そこで配列は分岐し、１３アミノ酸後にオ
ープンリーディングフレームは停止し、その後に延在し
た独特の３′非翻訳領域が続く。
【図５】ＨＥＲ４変種をコードするｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列（配列番号：５）および演繹されたアミノ酸配
列（配列番号：６）。Ｎ末端裁頭としたＨＥＲ４。この
配列はＨＥＲ４配列の３′部分を含み、この場合裁頭配
列のヌクレオチド位置１５６が、図１〜２に示す完全な
ＨＥＲ４配列の位置２３３５に並ぶ（ＨＥＲ４キナーゼ
のＡＴＰ結合部位をコードする領域の直ぐ下流）。裁頭
配列の最初の１５５ヌクレオチドはＨＥＲ４から独特で
あり、ＨＥＲ４遺伝子のイントロン内の隠性プロモータ
ーから誘導された転写体の５′非翻訳領域を表す可能性
がある（セクション６．２．２．、前記）。
チド配列（配列番号：５）および演繹されたアミノ酸配
列（配列番号：６）。Ｎ末端裁頭としたＨＥＲ４。この
配列はＨＥＲ４配列の３′部分を含み、この場合裁頭配
列のヌクレオチド位置１５６が、図１〜２に示す完全な
ＨＥＲ４配列の位置２３３５に並ぶ（ＨＥＲ４キナーゼ
のＡＴＰ結合部位をコードする領域の直ぐ下流）。裁頭
配列の最初の１５５ヌクレオチドはＨＥＲ４から独特で
あり、ＨＥＲ４遺伝子のイントロン内の隠性プロモータ
ーから誘導された転写体の５′非翻訳領域を表す可能性
がある（セクション６．２．２．、前記）。
【図６】図１〜２に示した全長のＨＥＲ４受容体と並べ
た変種形態のヒトＨＥＲ４の演繹されたアミノ酸配列。
１文字コードを使用して配列を示し、右側に番号を付
け、完全なＨＥＲ４配列を上とし変種配列を下とする。
並べた残基の間のコロンにより同一の残基を示す。他の
３′末端を有し、自己リン酸化ドメインを欠失するＨＥ
Ｒ４（配列番号：４）。この配列は、アミノ酸１０４５
までは図１〜２に示すＨＥＲ４（配列番号：２）のもの
と同一であるが、そこで配列は分岐し、停止コドンに達
する前に１３アミノ酸が続く。
た変種形態のヒトＨＥＲ４の演繹されたアミノ酸配列。
１文字コードを使用して配列を示し、右側に番号を付
け、完全なＨＥＲ４配列を上とし変種配列を下とする。
並べた残基の間のコロンにより同一の残基を示す。他の
３′末端を有し、自己リン酸化ドメインを欠失するＨＥ
Ｒ４（配列番号：４）。この配列は、アミノ酸１０４５
までは図１〜２に示すＨＥＲ４（配列番号：２）のもの
と同一であるが、そこで配列は分岐し、停止コドンに達
する前に１３アミノ酸が続く。
【図７】図１〜２に示した全長のＨＥＲ４受容体と並べ
た変種形態のヒトＨＥＲ４の演繹されたアミノ酸配列。
１文字コードを使用して配列を示し、右側に番号を付
け、完全なＨＥＲ４配列を上とし変種配列を下とする。
並べた残基の間のコロンにより同一の残基を示す。Ｎ末
端裁頭としたＨＥＲ４（配列番号：６）。この配列は、
アミノ酸７６８で開始する図１〜２に示すＨＥＲ４（配
列番号：２）の３′部分と同一である（セクション６．
２．２．、前記）。
た変種形態のヒトＨＥＲ４の演繹されたアミノ酸配列。
１文字コードを使用して配列を示し、右側に番号を付
け、完全なＨＥＲ４配列を上とし変種配列を下とする。
並べた残基の間のコロンにより同一の残基を示す。Ｎ末
端裁頭としたＨＥＲ４（配列番号：６）。この配列は、
アミノ酸７６８で開始する図１〜２に示すＨＥＲ４（配
列番号：２）の３′部分と同一である（セクション６．
２．２．、前記）。
【図８】ヒトＨＥＲ４（配列番号：２）の演繹されたア
ミノ酸配列および他のヒトＥＧＦＲ系統群の構成員と並
べたもの（ＥＧＦＲ（配列番号：７）；ＨＥＲ２（配列
番号：８）；ＨＥＲ３（配列番号：９））。１文字コー
ドを使用して配列を示し、左側に番号を付ける。同一の
残基をドットにより示し、至適に並べるために空隙を入
れ、システイン残基をアステリスクでマークし、Ｎ結合
グリコシル化部位をプラス（＋）で示す。潜在的な蛋白
質キナーゼＣリン酸化部位は矢印により示す（ＨＥＲ４
アミノ酸位置６７９、６８５および６９９）。予測され
るＡＴＰ結合部位を４つの丸十字で示し、Ｃ末端チロシ
ンを白三角で示し、ＥＧＦＲにおける主要リン酸化部位
により保存されたＨＥＲ４中のチロシンを黒三角で示
す。予測される細胞外ドメインは、位置２５の矢印によ
りマークしたシグナル配列の境界から、アミノ酸位置６
５０〜６７５に上線を付した疎水性膜横断ドメインに延
在する。種々のサブドメインを右側に標識を付した：
Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ＝細胞外サブドメイン（ド
メインＩＩおよびＩＶはシステインに富む）、ＴＭ＝膜
横断ドメイン、ＴＫ＝チロシンキナーゼドメイン。ドメ
インＩ、ＩＩＩ、ＴＫを箱で囲む。
ミノ酸配列および他のヒトＥＧＦＲ系統群の構成員と並
べたもの（ＥＧＦＲ（配列番号：７）；ＨＥＲ２（配列
番号：８）；ＨＥＲ３（配列番号：９））。１文字コー
ドを使用して配列を示し、左側に番号を付ける。同一の
残基をドットにより示し、至適に並べるために空隙を入
れ、システイン残基をアステリスクでマークし、Ｎ結合
グリコシル化部位をプラス（＋）で示す。潜在的な蛋白
質キナーゼＣリン酸化部位は矢印により示す（ＨＥＲ４
アミノ酸位置６７９、６８５および６９９）。予測され
るＡＴＰ結合部位を４つの丸十字で示し、Ｃ末端チロシ
ンを白三角で示し、ＥＧＦＲにおける主要リン酸化部位
により保存されたＨＥＲ４中のチロシンを黒三角で示
す。予測される細胞外ドメインは、位置２５の矢印によ
りマークしたシグナル配列の境界から、アミノ酸位置６
５０〜６７５に上線を付した疎水性膜横断ドメインに延
在する。種々のサブドメインを右側に標識を付した：
Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ＝細胞外サブドメイン（ド
メインＩＩおよびＩＶはシステインに富む）、ＴＭ＝膜
横断ドメイン、ＴＫ＝チロシンキナーゼドメイン。ドメ
インＩ、ＩＩＩ、ＴＫを箱で囲む。
【図９】ヒトＨＥＲ４（配列番号：２）の演繹されたア
ミノ酸配列および他のヒトＥＧＦＲ系統群の構成員と並
べたもの（ＥＧＦＲ（配列番号：７）；ＨＥＲ２（配列
番号：８）；ＨＥＲ３（配列番号：９））。１文字コー
ドを使用して配列を示し、左側に番号を付ける。同一の
残基をドットにより示し、至適に並べるために空隙を入
れ、システイン残基をアステリスクでマークし、Ｎ結合
グリコシル化部位をプラス（＋）で示す。潜在的な蛋白
質キナーゼＣリン酸化部位は矢印により示す（ＨＥＲ４
アミノ酸位置６７９、６８５および６９９）。予測され
るＡＴＰ結合部位を４つの丸十字で示し、Ｃ末端チロシ
ンを白三角で示し、ＥＧＦＲにおける主要リン酸化部位
により保存されたＨＥＲ４中のチロシンを黒三角で示
す。予測される細胞外ドメインは、位置２５の矢印によ
りマークしたシグナル配列の境界から、アミノ酸位置６
５０〜６７５に上線を付した疎水性膜横断ドメインに延
在する。種々のサブドメインを右側に標識を付した：
Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ＝細胞外サブドメイン（ド
メインＩＩおよびＩＶはシステインに富む）、ＴＭ＝膜
横断ドメイン、ＴＫ＝チロシンキナーゼドメイン。ドメ
インＩ、ＩＩＩ、ＴＫを箱で囲む。
ミノ酸配列および他のヒトＥＧＦＲ系統群の構成員と並
べたもの（ＥＧＦＲ（配列番号：７）；ＨＥＲ２（配列
番号：８）；ＨＥＲ３（配列番号：９））。１文字コー
ドを使用して配列を示し、左側に番号を付ける。同一の
残基をドットにより示し、至適に並べるために空隙を入
れ、システイン残基をアステリスクでマークし、Ｎ結合
グリコシル化部位をプラス（＋）で示す。潜在的な蛋白
質キナーゼＣリン酸化部位は矢印により示す（ＨＥＲ４
アミノ酸位置６７９、６８５および６９９）。予測され
るＡＴＰ結合部位を４つの丸十字で示し、Ｃ末端チロシ
ンを白三角で示し、ＥＧＦＲにおける主要リン酸化部位
により保存されたＨＥＲ４中のチロシンを黒三角で示
す。予測される細胞外ドメインは、位置２５の矢印によ
りマークしたシグナル配列の境界から、アミノ酸位置６
５０〜６７５に上線を付した疎水性膜横断ドメインに延
在する。種々のサブドメインを右側に標識を付した：
Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ＝細胞外サブドメイン（ド
メインＩＩおよびＩＶはシステインに富む）、ＴＭ＝膜
横断ドメイン、ＴＫ＝チロシンキナーゼドメイン。ドメ
インＩ、ＩＩＩ、ＴＫを箱で囲む。
【図１０】ＨＥＲ４（１３０８アミノ酸）、ＥＧＦＲ
（１２１０アミノ酸）、ＨＥＲ２（１２５５アミノ酸）
およびＨＥＲ３（１３４２アミノ酸）についての蛋白質
ドメインの比較（Ｂ）と並べたＨＥＲ４の親水性疎水性
の様子（Ａ）。シグナルペプチドは点刻した箱により表
し、システインに富む細胞外サブドメインは斜線を付
し、膜横断ドメインは塗り潰し、細胞質チロシンキナー
ゼドメインは点刻する。ＨＥＲ４と他のＥＧＦＲ系統群
の構成員との間のパーセントアミノ酸配列の同一性を示
す。Ｓｉｇはシグナルペプチド、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよ
びＩＶは細胞外ドメイン、ＴＭは膜横断ドメイン、ＪＭ
は膜近接ドメイン、ＣａＩｎはカルシウム流入および内
在化ドメイン、３′ＵＴＲは３′非翻訳領域である。
（１２１０アミノ酸）、ＨＥＲ２（１２５５アミノ酸）
およびＨＥＲ３（１３４２アミノ酸）についての蛋白質
ドメインの比較（Ｂ）と並べたＨＥＲ４の親水性疎水性
の様子（Ａ）。シグナルペプチドは点刻した箱により表
し、システインに富む細胞外サブドメインは斜線を付
し、膜横断ドメインは塗り潰し、細胞質チロシンキナー
ゼドメインは点刻する。ＨＥＲ４と他のＥＧＦＲ系統群
の構成員との間のパーセントアミノ酸配列の同一性を示
す。Ｓｉｇはシグナルペプチド、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよ
びＩＶは細胞外ドメイン、ＴＭは膜横断ドメイン、ＪＭ
は膜近接ドメイン、ＣａＩｎはカルシウム流入および内
在化ドメイン、３′ＵＴＲは３′非翻訳領域である。
【図１１】３′自己リン酸化ドメイン（Ａ）および５′
細胞外ドメイン（Ｂ）（セクション６．２．３．、前記
参照）由来のＨＥＲ４プローブにハイブリダイズしたヒ
ト組織由来のｍＲＮＡのノーザンブロット分析の電気泳
動を示す写真。ＲＮＡの大きさマーカー（キロベース
で）を左側に示す。レーン１〜８は、それぞれ膵臓、腎
臓、骨格筋、肝臓、肺、胎盤、脳および心臓由来の２μ
ｇのポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを示す。
細胞外ドメイン（Ｂ）（セクション６．２．３．、前記
参照）由来のＨＥＲ４プローブにハイブリダイズしたヒ
ト組織由来のｍＲＮＡのノーザンブロット分析の電気泳
動を示す写真。ＲＮＡの大きさマーカー（キロベース
で）を左側に示す。レーン１〜８は、それぞれ膵臓、腎
臓、骨格筋、肝臓、肺、胎盤、脳および心臓由来の２μ
ｇのポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを示す。
【図１２】セクション７．１．３．、前記に概説した手
順によりＣＨＯ−ＫＩ細胞中で安定に発現した組換えＨ
ＥＲ４の免疫ブロット分析の電気泳動を示す写真。組換
えＨＥＲ４を発現するＣＨＯ−ＫＩ細胞由来の膜調製物
を７％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニト
ロセルロースに移した。（Ａ）ＨＥＲ４と交差反応する
ＨＥＲ２のＣ末端に対するモノクローナル抗体（Ａｂ
３、オンコジーン・サイエンス、ユニオンダーレ、Ｎ
Ｙ）または（Ｂ）ＨＥＲ２およびＨＥＲ４の共通エピト
ープに対するヒツジ抗ペプチドポリクローナル抗体とブ
ロットとをハイブリダイズさせた。レーン１は親ＣＨＯ
−ＫＩ細胞、レーン２〜４はそれぞれＣＨＯ−ＫＩ／Ｈ
ＥＲ４細胞クローン６、２１および３である。１８０ｋ
ＤａのＨＥＲ４蛋白質および１３０ｋＤａの交差反応分
子種を銘記すべきである。予備染色した高分子量マーカ
ー （バイオラド、リッチモンド、ＣＡ）のキロダルト
ンの大きさを左側に示す。
順によりＣＨＯ−ＫＩ細胞中で安定に発現した組換えＨ
ＥＲ４の免疫ブロット分析の電気泳動を示す写真。組換
えＨＥＲ４を発現するＣＨＯ−ＫＩ細胞由来の膜調製物
を７％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニト
ロセルロースに移した。（Ａ）ＨＥＲ４と交差反応する
ＨＥＲ２のＣ末端に対するモノクローナル抗体（Ａｂ
３、オンコジーン・サイエンス、ユニオンダーレ、Ｎ
Ｙ）または（Ｂ）ＨＥＲ２およびＨＥＲ４の共通エピト
ープに対するヒツジ抗ペプチドポリクローナル抗体とブ
ロットとをハイブリダイズさせた。レーン１は親ＣＨＯ
−ＫＩ細胞、レーン２〜４はそれぞれＣＨＯ−ＫＩ／Ｈ
ＥＲ４細胞クローン６、２１および３である。１８０ｋ
ＤａのＨＥＲ４蛋白質および１３０ｋＤａの交差反応分
子種を銘記すべきである。予備染色した高分子量マーカ
ー （バイオラド、リッチモンド、ＣＡ）のキロダルト
ンの大きさを左側に示す。
【図１３】胸部ガン分化因子（セクション８．、前記参
照）によるＨＥＲ４チロシンキナーゼの特異的活性化を
示す電気泳動の写真。それぞれＥＧＦＲ系統群のチロシ
ンキナーゼ受容体（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およ
びＨＥＲ４）の単一の構成員を過剰発現するよう操作し
た４つの組換え細胞系統を、セクション７．１．２およ
び８．１．、前記に記載した方法により調製した。４つ
の組換え細胞系統のそれぞれからの細胞を種々のリガン
ド調製物により刺激し、セクション８．２．、前記に記
載した検定を使用して受容体チロシンリン酸化について
検定した。（Ａ）はＣＨＯ／ＨＥＲ４＃３細胞、（Ｂ）
はＣＨＯ／ＨＥＲ２細胞、（Ｃ）はＮＲＨＥＲ５細胞、
および（Ｄ）は２９３／ＨＥＲ３細胞である。細胞は、
レーン１：緩衝液対照、レーン２：１００ｎｇ／ｍｌＥ
ＧＦ、レーン３：２００ｎｇ／ｍｌアンフィレグリン、
レーン４：１０μｌフェニルカラム画分１７（セクショ
ン９、前記）、レーン５：１０μｌフェニルカラム画分
１４（セクション９、前記、また以下の図１４の説明参
照）により刺激した。予備染色した分子量マーカーの大
きさ（キロダルトンで）をそれぞれのパネルの左側に標
識した。それぞれの系のリン酸化した受容体は、２２１
ｋＤａマーカーの直ぐ下に移動する。ゲルの底部のバン
ドは外来性であり、二次抗体と免疫沈殿で使用した抗体
との反応によるものである。
照）によるＨＥＲ４チロシンキナーゼの特異的活性化を
示す電気泳動の写真。それぞれＥＧＦＲ系統群のチロシ
ンキナーゼ受容体（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およ
びＨＥＲ４）の単一の構成員を過剰発現するよう操作し
た４つの組換え細胞系統を、セクション７．１．２およ
び８．１．、前記に記載した方法により調製した。４つ
の組換え細胞系統のそれぞれからの細胞を種々のリガン
ド調製物により刺激し、セクション８．２．、前記に記
載した検定を使用して受容体チロシンリン酸化について
検定した。（Ａ）はＣＨＯ／ＨＥＲ４＃３細胞、（Ｂ）
はＣＨＯ／ＨＥＲ２細胞、（Ｃ）はＮＲＨＥＲ５細胞、
および（Ｄ）は２９３／ＨＥＲ３細胞である。細胞は、
レーン１：緩衝液対照、レーン２：１００ｎｇ／ｍｌＥ
ＧＦ、レーン３：２００ｎｇ／ｍｌアンフィレグリン、
レーン４：１０μｌフェニルカラム画分１７（セクショ
ン９、前記）、レーン５：１０μｌフェニルカラム画分
１４（セクション９、前記、また以下の図１４の説明参
照）により刺激した。予備染色した分子量マーカーの大
きさ（キロダルトンで）をそれぞれのパネルの左側に標
識した。それぞれの系のリン酸化した受容体は、２２１
ｋＤａマーカーの直ぐ下に移動する。ゲルの底部のバン
ドは外来性であり、二次抗体と免疫沈殿で使用した抗体
との反応によるものである。
【図１４】ＨｅｐＧ２細胞の馴化培地から精製したＭＤ
Ａ−ＭＢ−４５３細胞分化活性の生物学的および生化学
的性質を示す細胞に関する生物の形態を示す写真（セク
ション９．、前記）。形態分化の誘導（Ａ、Ｂおよび
Ｃ）。ＨｅｐＧ２細胞からの馴化培地を硫酸アンモニウ
ム分画に供し、その後ＰＢＳに対する透析を行った。こ
の材料の希釈物を示した蛋白質濃度でＭＤＡ−ＭＢ４５
３モノレイヤーに添加した。（Ａ）は対照、（Ｂ）は穴
当り８０ｎｇ、（Ｃ）は穴当り２．０μｇである。
（Ｄ）は２３０ｎｍ吸光度でモニターしたフェニル−５
ＰＷカラム溶出の様子。（Ｅ）は次のリガンド調製物を
用いたＭＤＡ−ＭＢ−４５３チロシン自己リン酸化の刺
激：なし（因子を添加しない対照）、ＴＧＦ−α（５０
ｎｇ／ｍｌ）、ＣＭ（穴当り２μｌおよび１０μｌで試
験した１６倍濃縮ＨｅｐＧ２馴化培地）、画分（フェニ
ルカラム画分１３〜２０、穴当り１０μｌ）。（Ｆ）は
（Ｅ）に示すリン酸化シグナルの濃度計分析。
Ａ−ＭＢ−４５３細胞分化活性の生物学的および生化学
的性質を示す細胞に関する生物の形態を示す写真（セク
ション９．、前記）。形態分化の誘導（Ａ、Ｂおよび
Ｃ）。ＨｅｐＧ２細胞からの馴化培地を硫酸アンモニウ
ム分画に供し、その後ＰＢＳに対する透析を行った。こ
の材料の希釈物を示した蛋白質濃度でＭＤＡ−ＭＢ４５
３モノレイヤーに添加した。（Ａ）は対照、（Ｂ）は穴
当り８０ｎｇ、（Ｃ）は穴当り２．０μｇである。
（Ｄ）は２３０ｎｍ吸光度でモニターしたフェニル−５
ＰＷカラム溶出の様子。（Ｅ）は次のリガンド調製物を
用いたＭＤＡ−ＭＢ−４５３チロシン自己リン酸化の刺
激：なし（因子を添加しない対照）、ＴＧＦ−α（５０
ｎｇ／ｍｌ）、ＣＭ（穴当り２μｌおよび１０μｌで試
験した１６倍濃縮ＨｅｐＧ２馴化培地）、画分（フェニ
ルカラム画分１３〜２０、穴当り１０μｌ）。（Ｆ）は
（Ｅ）に示すリン酸化シグナルの濃度計分析。
【図１５】（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（レーン
１：擬性形質移入ＣＯＳ細胞上澄、レーン２：ＮＤＦ形
質移入ＣＯＳ細胞上澄）および（Ｂ）ＣＨＯ／ＨＥＲ４
２１−２細胞（レーン１および２：擬性形質移入ＣＯ
Ｓ細胞上澄、レーン３および４：ＮＤＦ形質移入ＣＯＳ
細胞上澄）のＮＤＦ誘導チロシンリン酸化に関する電気
泳動の写真。セクション１０．、前記を参照することが
できる。チロシンリン酸化は、セクション８．２．、前
記に記載したチロシンキナーゼ刺激検定により決定し
た。
１：擬性形質移入ＣＯＳ細胞上澄、レーン２：ＮＤＦ形
質移入ＣＯＳ細胞上澄）および（Ｂ）ＣＨＯ／ＨＥＲ４
２１−２細胞（レーン１および２：擬性形質移入ＣＯ
Ｓ細胞上澄、レーン３および４：ＮＤＦ形質移入ＣＯＳ
細胞上澄）のＮＤＦ誘導チロシンリン酸化に関する電気
泳動の写真。セクション１０．、前記を参照することが
できる。チロシンリン酸化は、セクション８．２．、前
記に記載したチロシンキナーゼ刺激検定により決定し
た。
【図１６】ヒト染色体２バンドｑ３３に対するＨＥＲ４
遺伝子の領域配置。（Ａ）はヒト染色体上の１２４のハ
イブリダイゼーションの部位の分布である。（Ｂ）は染
色体２の線図上のオートラジオグラフ細粒体の分布であ
る。
遺伝子の領域配置。（Ａ）はヒト染色体上の１２４のハ
イブリダイゼーションの部位の分布である。（Ｂ）は染
色体２の線図上のオートラジオグラフ細粒体の分布であ
る。
【図１７】ＨＥＲ４−Ｉｇ融合蛋白質のアミノ酸配列
（配列番号：１０）（セクション５．４．、前記）。
（配列番号：１０）（セクション５．４．、前記）。
【符号の説明】 ＣＭ １６倍濃縮ＨｅｐＧ２馴化培地
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 16/28 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ //(Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジーン マイケル クロウスコウ アメリカ合衆国 ワシントン州 98199 シアトル ウェスト ヴィューモント ウ ェイ ウェスト 3034 (72)発明者 モハメド ショーヤブ アメリカ合衆国 ワシントン州 98199 シアトル ウェストモント ウェイ ウェ スト 2405
Claims (44)
- 【請求項１】 図１〜２に示すＨＥＲ４ヌクレオチド配
列の連接部分またはその相補体に対して８０％を越える
相同性を有する少なくとも約２００ヌクレオチドの配列
を有する組換えポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 図１〜２に示すＨＥＲ４アミノ酸配列内
の少なくとも約７０の連接アミノ酸をコードするヌクレ
オチドの配列を有する組換えポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 図１〜２に示すＨＥＲ４ヌクレオチドコ
ード配列またはその相補体内の少なくとも約２００ヌク
レオチドの連接配列を有する組換えポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 図１〜２に示すＨＥＲ４ヌクレオチドコ
ード配列またはその相補体を有する組換えポリヌクレオ
チド。 - 【請求項５】 ＤＮＡポリヌクレオチドである請求項
１、２、３または４記載の組換えポリヌクレオチド。 - 【請求項６】 ＲＮＡポリヌクレオチドである請求項
１、２、３または４記載の組換えポリヌクレオチド。 - 【請求項７】 検出可能な標識を付加した請求項１、
２、３または４記載の組換えポリヌクレオチドを有する
検定キット。 - 【請求項８】 ＰＣＲ反応でｃＤＮＡ合成を起動し得る
一対のプライマーを含み、それぞれのプライマーが請求
項５記載のポリヌクレオチドであるポリメラーゼ連鎖反
応キット（ＰＣＲ）。 - 【請求項９】 前記プライマーがハイブリダイズするヌ
クレオチド配列を含まずかつそれらの間のＨＥＲ４遺伝
子の領域にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドプロ
ーブを更に含む請求項８記載のＰＣＲキット。 - 【請求項１０】図１〜２に示すＨＥＲ４アミノ酸配列の
連接部分に対して９０％を越える相同性を有する少なく
とも約８０アミノ酸の配列からなるポリペプチド。 - 【請求項１１】図１〜２のアミノ酸残基１〜１３０８に
示すアミノ酸配列を含むＨＥＲ４ポリペプチド。 - 【請求項１２】図１〜２のアミノ酸残基２６〜１３０８
に示すアミノ酸配列を含むＨＥＲ４ポリペプチド。 - 【請求項１３】図１〜２のアミノ酸残基１〜１０４５に
示すアミノ酸配列を含むＨＥＲ４ポリペプチド。 - 【請求項１４】図１〜２のアミノ酸残基２６〜１０４５
に示すアミノ酸配列からなるＨＥＲ４ポリペプチド。 - 【請求項１５】図３〜４に示すアミノ酸配列を含むＨＥ
Ｒ４ポリペプチド。 - 【請求項１６】図１〜２のアミノ酸残基７７２〜１３０
８に示すアミノ酸配列を含むＨＥＲ４ポリペプチド。 - 【請求項１７】図５に示すアミノ酸配列を含むＨＥＲ４
ポリペプチド。 - 【請求項１８】可溶性ポリペプチドとヒトＨＥＲ４との
相互作用を阻害し得る抗体。 - 【請求項１９】可溶性ポリペプチドがヘレグリンである
請求項１８記載の抗体。 - 【請求項２０】ＨＥＲ４チロシン自己リン酸化を刺激し
得る抗体。 - 【請求項２１】細胞中でＨＥＲ４媒介シグナルを誘導し
得る抗体であって、このシグナルが結果的に細胞の生育
の変調または分化を与える抗体。 - 【請求項２２】ＡＴＣＣに寄託したＣＨＯ／ＨＥＲ４
２１−２細胞中で発現したＨＥＲ４のＨｅｐＧ２画分１
７刺激チロシンリン酸化を阻害し得る抗体。 - 【請求項２３】ヒトＨＥＲ４に免疫特異的に結合する抗
体。 - 【請求項２４】ＨＥＲ４への結合の後に細胞表面上に存
する請求項２３記載の抗体。 - 【請求項２５】ＨＥＲ４への結合の後に細胞内に内在化
される請求項２３記載の抗体。 - 【請求項２６】ＡＴＣＣに寄託したＣＨＯ／ＨＥＲ４
２１−２細胞中で発現したヒトＨＥＲ４に免疫特異的に
結合する抗体。 - 【請求項２７】ＨＥＲ４生物学的活性を中和する請求項
２３記載の抗体。 - 【請求項２８】薬物または毒物と接合した請求項２３記
載の抗体。 - 【請求項２９】放射性標識した請求項２３記載の抗体。
- 【請求項３０】ＡＴＣＣに寄託したプラスミドｐＢＳＨ
ＥＲ４Ｙ。 - 【請求項３１】請求項１０、１１、１２、１３、１４、
１５、１６または１７記載のポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列を含む組換えベクター。 - 【請求項３２】請求項３１記載の組換えベクターにより
形質転換された宿主細胞。 - 【請求項３３】コード配列が、これにより形質移入した
宿主細胞中でコード配列の発現を指向し得る調節配列に
機能的に結合した請求項１０、１１、１２、１３、１
４、１５、１６または１７記載のポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列からなる組換えベクター。 - 【請求項３４】請求項３３記載の組換えベクターにより
形質移入した宿主細胞。 - 【請求項３５】ＡＴＣＣに寄託した細胞系統ＣＨＯ／Ｈ
ＥＲ４ ２１−２。 - 【請求項３６】（ａ）ＨＥＲ４を過剰発現するよう操作
した細胞にサンプルを施し、 （ｂ）ＨＥＲ４により媒介される活性に影響を与えるリ
ガンドの能力を検出することを含むサンプル中のＨＥＲ
４リガンドの存在を検出する方法。 - 【請求項３７】前記細胞が、ＡＴＣＣに寄託したＣＨＯ
／ＨＥＲ４ ２１−２細胞である請求項３６記載の方
法。 - 【請求項３８】検出する活性がＨＥＲ４チロシンリン酸
化である請求項３６記載の方法。 - 【請求項３９】検出する活性が形態分化である請求項３
６記載の方法。 - 【請求項４０】ＨＥＲ４に結合し、ＨＥＲ４のチロシン
リン酸化を刺激し、ＨＥＲ４により媒介される生物学的
活性に影響を与えるポリペプチドを含むＨＥＲ４のリガ
ンド。 - 【請求項４１】培養ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞に添加し
た場合に形態分化を誘導し得る請求項４０記載のリガン
ド。 - 【請求項４２】培養ＨｅｐＧ２細胞馴化培地から得られ
た請求項４０記載のリガンド。 - 【請求項４３】（ａ）請求項２３または２６記載の抗体
を用意し、 （ｂ）ＨＥＲ４に対する抗体の結合を可能とする条件下
で生物学的サンプルと抗体とをインキュベートし、 （ｃ）ＨＥＲ４−抗体複合体として存在する抗体の量を
決定する、ことを含むＨＥＲ４を検出する免疫検定方
法。 - 【請求項４４】請求項２３または２６記載の抗体または
その活性断片と薬物または毒物とを接合させ、接合体が
ＨＥＲ４に結合するように処方物、投与量および投与の
経路を使用することにより、得られた接合体を個体に対
して配送することからなる、ＨＥＲ４を発現する細胞に
対する薬物または毒物の生体内配送方法。 【０００１】
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US98116592A | 1992-11-24 | 1992-11-24 | |
| US07/981165 | 1992-11-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07132084A true JPH07132084A (ja) | 1995-05-23 |
Family
ID=25528166
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5317374A Pending JPH07132084A (ja) | 1992-11-24 | 1993-11-24 | Ｈｅｒ４ヒト受容体チロシンキナーゼ |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0599274A1 (ja) |
| JP (1) | JPH07132084A (ja) |
| AU (1) | AU676502B2 (ja) |
| CA (1) | CA2103323A1 (ja) |
| FI (1) | FI935175A (ja) |
| IL (1) | IL107661A0 (ja) |
| MX (1) | MX9307317A (ja) |
| NO (1) | NO934163L (ja) |
Cited By (3)
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