TW202306996A

TW202306996A - 一種能與人eta和人cd3結合的雙特異性抗體及其應用

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Publication number: TW202306996A
Application number: TW111122210A
Authority: TW
Inventors: 成張; 章華; 宋豔瑞; 書謙景
Original assignee: 中國大陸商鴻運華寧（杭州）生物醫藥有限公司
Priority date: 2021-06-17
Filing date: 2022-06-15
Publication date: 2023-02-16
Also published as: WO2022262733A1; CN115490770A

Abstract

本發明係關於一種能與人ETA及人CD3結合的雙特異性抗體及其應用。本文提供了一種抗體，特定言之一種能夠同時與人ETA及人CD3結合的雙特異性抗體，還提供了其用於治療癌症之方法，特定言之治療ETA高表現的卵巢癌之方法。

Description

一種能與人ETA和人CD3結合的雙特異性抗體及其應用

本文提供了一種抗體，特定言之一種能夠同時與人ETA及人CD3結合的雙特異性抗體，還提供了其用於治療癌症之方法，特定言之治療ETA高表現的卵巢癌之方法。

內皮素受體A (ETA)係一種G蛋白偶聯受體(GPCR)，係哺乳動物的兩種最常見內皮素受體(ETR)之一，ETA在多種細胞類型中有表現(Kowalczyk等人，2015，Arch. Immunol. Ther. Exp. 63:41-52)，可以介導ET-1引起的多重作用，包括引起血管緊張、促發炎、促纖維化、促細胞分裂增殖等作用(Hynynen及Khalil，2006，Recent Pat Cardiovasc Drug Discov. 1: 95-108)。因為其與心血管系統的密切關係，目前已有幾個小分子ETR抑制劑藉由阻斷ET-1/ETA信號路徑來治療肺動脈高壓(Vatter及Seifert，2006，Cardiovasc Drug Rev. 24:63-76.；Catanzaro等人，2014，Ann. Pharmacother. 48: 538-47；Stieger等人，2007，Drug Metab. Dispos. 35:1400-7)。而針對ETA的抑制性抗體亦正處於臨床開發(Zhang等人，2019，J Pharmacol Exp Ther. 370:54-61)。

ET-1信號路徑進一步被發現與很多病理狀態相關，包括癌症(Rosanò及Bagnato，2016，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 310:R469-75)。ET-1在細胞增殖、血管新生、上皮間充質轉化、腫瘤細胞浸潤、遷移等步驟均發揮了促進作用，並且在多種腫瘤類型中，ETA均被發現作為主要的內皮素類型呈現高表現的狀態，其中包括卵巢癌、食管癌、前列腺癌、甲狀腺癌、直腸癌等(Bagnato等人，2013，Nat. Rev. Cancer 13:637-51)。儘管如此，以ET-1/ETA信號路徑為主要目標來干涉腫瘤生長，無論係單藥或與化療藥聯用時，小分子ETR抑制劑均未引起十分積極的臨床療效(Bagnato等人，2013，Nat. Rev. Cancer 13:637-51；Kefford等人，2010，Mol Cancer 9:69)，提示ET-1信號在腫瘤生長過程中起到重要但非決定性的作用。在使用ETR抗體(Zhang等人，2019，J Pharmacol Exp Ther 370:54-61)進行抑制腫瘤細胞生長的活體內外實驗中，吾人亦未得到十分正面的腫瘤抑制效果，進一步確認了ET-1信號路徑抑制劑在治療ETA高表現的腫瘤上的有限效果。

在T細胞表面的T細胞受體(TCR)及CD3分子形成的複合物在活化T細胞及免疫細胞間的信號遞呈起了關鍵作用。該複合物係由TCRαβ或者TCRδγ，與CD3δ，CD3γ，CD3ε，CD3η或CD3ζ共同結合組成。目前處於公共領域並已經得到普遍應用的CD3抗體均係針對ε次單元的抗體，可能係因為其作為由不同次單元組成的CD3的共有次單元有關。CD3ε代表性抗體有OKT3 (Norman, 1995，The Drug Monit. 17:615-20)，UCHT-1 (Wright等人，2000，WO2000041474)等。OKT3成為了雙特異性抗體藥物博納吐單抗(Blinatumonab)的組成部分，其包含了scFv形式的OKT3，能夠藉由CD3來活化T細胞殺傷目標細胞(Hoffman等人，2007，Mol. Immunol. 44:1935-43)。博納吐單抗的結構係一個原核系統表現的單鏈抗體(scFv)串聯結構，其有分子量小，活性高的優勢，但亦存在半衰期短，表現率低等劣勢。本文將ETA及CD3兩個目標相結合，創造了能夠同時識別ETA高表現腫瘤細胞及T細胞的雙特異性抗體，將應用於各類具備ETA高表現特徵腫瘤的免疫治療。本文的ETA及CD3雙特異性抗體採取了基於IgG-scFv融合的結構設計，由一個完整的IgG分子及在其輕鏈、重鏈N端或者C端融合表現兩個scFv共同組成。IgG的Fab臂及scFv能識別不同抗原，賦予了該分子雙特異性抗體的特徵。

卵巢癌係女性中惡性程度及發生幾率均很高的腫瘤，在藉由手術及化療治療的患者中，80%會出現復發，復發診斷後的5年生存率為50%。抗體藥阿瓦斯汀(Avastin)，在單獨使用及化療聯用上顯示了一定的治療效果，但卵巢癌的發生率及死亡率依然在逐年上漲，顯示了該癌種依然缺乏切實有效的治療手段。然而，在上皮性卵巢癌細胞中ETA的表現明顯提高(Anggorowati等人，2018，Iran J Med Sci，43:286-95)，而且ET-1引起的細胞信號在上皮-間充質轉化中發揮了重要作用。若藉由針對ETA的雙抗來治療卵巢癌，既可以阻斷癌細胞中的ET-1信號，同時可以精準介導免疫細胞對癌細胞的殺傷。

綜上所述，ETA在各類腫瘤中均出現了高表現的現象，係一個廣泛存在的腫瘤標誌物。卵巢癌係一種ETA高表現癌種，並且目前仍然缺乏十分有效的靶向治療手段。本文結合腫瘤中ETA的高表現及CD3陽性T細胞雙特異性技術發明了一種嶄新的卵巢癌治療方法。

本文提供了一種新式的雙特異性抗體。該抗體具有能夠與人ETA及人CD3特異性結合的能力。該雙特異性抗體可介導T細胞毒性依賴的針對各種具有ETA高表現腫瘤細胞的免疫殺傷反應。該雙特異性抗體可用於製備治療各種具有ETA高表現的腫瘤的藥物。

在一個實施方案中，本文所提供的雙特異性抗體係一種能夠與人ETA及人CD3結合的雙特異性抗體，其結構特徵在於：上述雙特異性抗體包含單鏈抗體域(scFv域)、免疫球蛋白G域(IgG)及域間肽連接子序列(Link ₁)，此三者藉由以下方式中之一種融合形成： a. 藉由域間肽連接子序列將scFv之羧基端及IgG輕鏈之胺基端連接：N'-scFv-Link ₁-V _L-C _L-C'； b. 藉由域間肽連接子序列將scFv之胺基端及IgG輕鏈之羧基端連接：N'-V _L-C _L-Link ₁-scFv-C'； c. 藉由域間肽連接子序列將scFv之羧基端及IgG重鏈之胺基端連接：N'-scFv-Link ₁-V _H-C _H1-C _H2-C _H3-C'；及 d. 藉由域間肽連接子序列將scFv之胺基端及IgG重鏈之羧基端連接：N'-V _H-C _H1-C _H2-C _H3-Link ₁-scFv-C'；其中：N'代表多肽鏈之胺基端，C'代表多肽鏈之羧基端，scFv代表單鏈抗體域，IgG代表免疫球蛋白G域，V _L代表IgG域之輕鏈可變區，C _L代表IgG域之輕鏈恆定區，V _H代表IgG域之重鏈可變區，C _H1代表IgG域之重鏈恆定區1，C _H2代表IgG域之重鏈恆定區2，C _H3代表IgG域之重鏈恆定區3，及Link ₁代表域間肽連接子。

在一個實施方案中，在本文所提供的雙特異性抗體中，上述域間肽連接子(Link ₁)之序列選自以下序列之一：SEQ NO ID: 1、SEQ NO ID: 2、SEQ NO ID: 3、SEQ NO ID: 4、SEQ NO ID: 5及SEQ NO ID: 28。

在一個實施方案中，在本文所提供的雙特異性抗體中，上述scFv域包含輕鏈可變區、重鏈可變區及域內肽連接子序列，此三者藉由以下方式中之一種組合形成scFv域： a. 藉由域內肽連接子序列將輕鏈可變區之羧基端及重鏈可變區之胺基端連接：N'-V _SL-Link ₂-V _SH-C'順序排列；及 b. 藉由域內肽連接子序列將重鏈可變區之羧基端及輕鏈可變區之胺基端連接：N'-V _SH-Link ₂-V _SL-C'順序排列；其中：N'代表多肽鏈之胺基端，C'代表多肽鏈之羧基端，V _SL代表scFv域之輕鏈可變區，V _SH代表scFv域之重鏈可變區，及Link ₂代表域內肽連接子。

在一個實施方案中，在本文所提供的雙特異性抗體中，上述域間內肽連接子(Link ₂)之序列選自以下序列之一：SEQ NO ID: 6、SEQ NO ID: 7、SEQ NO ID: 8、SEQ NO ID: 9、及SEQ NO ID: 10。

在一個實施方案中，在本文所提供的雙特異性抗體中，上述scFv域包含以下方案之一的胺基酸序列： a. scFv域之輕鏈可變區序列選自以下序列之一：SEQ NO ID: 11、SEQ NO ID: 13、SEQ NO ID: 15及SEQ NO ID: 17； b. scFv域之重鏈可變區序列選自以下序列之一：SEQ NO ID: 12、SEQ NO ID: 14、SEQ NO ID: 16、及SEQ NO ID: 18；及 c. (a)之輕鏈可變區序列及(b)之重鏈可變區序列之組合。

在一個實施方案中，在本文所提供的雙特異性抗體中，上述抗體的scFv域包含以下方案之一的胺基酸序列組合方式：SEQ NO ID: 11與SEQ NO ID: 12之組合(L1H1)、SEQ NO ID: 13與SEQ NO ID: 14之組合(L2L2)、SEQ NO ID: 15與SEQ NO ID: 16之組合(L3H3)、SEQ NO ID: 17與SEQ NO ID: 18之組合(L4H4)、及SEQ NO ID: 19與SEQ NO ID: 20之組合(L5H5)。

在一個實施方案中，在本文所提供的雙特異性抗體中，上述抗體的IgG域包含以下方案之一的胺基酸序列： d. IgG域之輕鏈可變區序列選自以下序列：SEQ NO ID: 19 e. IgG域之重鏈可變區序列選自以下序列：SEQ NO ID: 20及 f. (a)之輕鏈可變區序列及(b)之重鏈可變區序列之組合。

在一個實施方案中，在本文所提供的雙特異性抗體中，上述抗體的IgG域包含以下方案之一的胺基酸序列組合方式：SEQ NO ID: 11與SEQ NO ID: 12之組合(L1H1)、SEQ NO ID: 13與SEQ NO ID: 14之組合(L2L2)、SEQ NO ID: 15與SEQ NO ID: 16之組合(L3H3)、及SEQ NO ID: 17與SEQ NO ID: 18之組合(L4H4)、及SEQ NO ID: 19與SEQ NO ID: 20之組合(L5H5)。

在一個實施方案中，在本文所提供的雙特異性抗體中，上述scFv域包含以下方案之一的胺基酸序列： a. scFv域之輕鏈可變區序列選自以下序列：SEQ NO ID: 19； b. scFv域之重鏈可變區序列選自以下序列：SEQ NO ID: 20及 c. (a)之輕鏈可變區序列及(b)之重鏈可變區序列之組合。

在一個實施方案中，在本文所提供的雙特異性抗體中，上述抗體的IgG域包含以下方案之一的胺基酸序列： b. IgG域之輕鏈可變區序列選自以下序列之一：SEQ NO ID: 11、SEQ NO ID: 13、SEQ NO ID: 15、及SEQ NO ID: 17； d. IgG域之重鏈可變區序列選自以下序列之一：SEQ NO ID: 12、SEQ NO ID: 14、SEQ NO ID: 16、及SEQ NO ID: 18；及 e. (a)之輕鏈可變區序列及(b)之重鏈可變區序列之組合。

在一個實施方案中，在本文所提供的雙特異性抗體中，其中上述抗體的IgG域包含以下方案之一的胺基酸序列組合方式：SEQ NO ID: 11與SEQ NO ID: 12之組合(L1H1)、SEQ NO ID: 13與SEQ NO ID: 14之組合(L2L2)、SEQ NO ID: 15與SEQ NO ID: 16之組合(L3H3)、SEQ NO ID: 17與SEQ NO ID: 18之組合(L4H4)、及SEQ NO ID: 19與SEQ NO ID: 20之組合(L5H5)。

在一個實施方案中，在本文所提供的雙特異性抗體中，上述抗體的IgG分子進一步包含以下方案之一的胺基酸序列： a. 選自以下序列之一的輕鏈恆定區胺基酸序列：SEQ NO ID: 21、SEQ NO ID: 22及SEQ NO ID: 27； b. 選自以下序列之一的重鏈恆定區胺基酸序列：SEQ NO ID: 23、SEQ NO ID: 24、SEQ NO ID: 25及SEQ NO ID: 26； c. (a)之輕鏈恆定區序列及(b)之重鏈恆定區序列之組合。

在一個實施方案中，本文所提供的雙特異性抗體係一種能夠與人ETA及人CD3結合的雙特異性抗體。

在一個實施方案中，本文所提供的雙特異性抗體係鼠源抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單株抗體、重組抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體、或IgG4抗體。

在一個實施方案中，本文提供了一種多核苷酸，其編碼本文所提供的雙特異性抗體。

在一個實施方案中，本文提供了一種載體，其包含本文所提供的多核苷酸。

在一個實施方案中，本文提供了一種宿主細胞，其包含本文所提供的載體。在一個實施方案中，本文提供了一種醫藥組合物，其包含與醫藥學上可接受之載體混合的本文所提供的雙特異性抗體。

在一個實施方案中，本文提供了本文所述之雙特異性抗體在製備用於預防或治療具有ETA高表現特徵之癌症藥物之用途。

在一個實施方案中，本文所述之具有ETA高表現之癌症係卵巢癌。

在一個實施方案中，本文所述之具有ETA高表現之癌症係乳腺癌。

在一個實施方案中，本文所述之具有ETA高表現之癌症係黑色素癌。

在其他的實施方案中，本文所述之具有ETA高表現之癌症包含但不僅限於食管癌、肺癌、頭頸癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌等。

定義除非另外指明，本文使用標準的單字母或三字母縮寫表明多聚核苷酸及多肽序列。多肽序列之胺基端(N')在左羧基端(C')在右，單鏈核酸序列及雙鏈核酸序列的上游鏈的5'端在左而其3'端在右。多肽的具體部分可由胺基酸殘基編號表示，例如胺基酸80至130，或由該位點的實際殘基表示例如Lys80至Lys130或K80至K130。亦可藉由解釋其與參比序列的差異來描述具體的多肽或多聚核苷酸序列。

除非本文另外定義，與本文相關的科學及技術術語應具有一般技術者所理解的含義。進一步，除非上下文另有要求，單數術語應包括複數並且複數含義術語應包括單數含義。通常，與本文所述之細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質核酸化學以及雜交相關的命名法及技術為此項技術中熟知及經常使用的。本文之方法及技術通常根據此項技術中已知的習知方法以及本說明書引用及討論的各種普通及更具體的參考文獻所描述的進行，除非另外說明。參見，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates(1992)，以及Harlow及Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990)，均以引用形式並於本文。酶反應及純化技術根據操作說明進行，如此項技術中通常完成或本文所述。與本文描述的分析化學、合成有機化學及醫學及藥學化學相關的術語以及實驗操作及技術均為此項技術中熟知及普遍使用者。標準技術可用於化學合成、化學分析、藥物製備、製劑及給藥以及患者的治療。

術語「肽」、「多肽」及「蛋白」均指包含兩個或多個藉由肽鍵相互連接之胺基酸的分子。此等術語涵蓋例如天然及人工蛋白、蛋白片段及蛋白序列的多肽類似物(例如突變蛋白、變異體及融合蛋白)。

如本文使用的術語「多肽片段」指與對應的全長蛋白相比具有胺基端及/或羧基端缺失的多肽。片段長度可為例如至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、70、80、90、100、150或200個胺基酸。片段長度可為例如最多1000、750、500、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、14、13、12、11或10個胺基酸。片段可在其一端或兩端進一步包含一或多個附加胺基酸，例如，來自不同天然蛋白質之胺基酸序列(例如，Fc或白胺酸拉鏈域)或人工胺基酸序列(例如，人工連接子序列)。

本文所述之多肽包括以任何原因及經任何方法修飾的多肽，例如，以：(1)降低蛋白水解敏感性，(2)降低氧化敏感性，(3)改變形成蛋白複合物的親和性，(4)改變結合親和性以及(4)賦予或修飾其他物理化學或功能性質。類似物包含多肽的突變蛋白。例如，可在天然序列(例如在形成分子內接觸的域之外的多肽部分)中進行單個或多個胺基酸替換(例如，保守胺基酸替換)。「保守胺基酸替換」為不顯著改變母體序列結構特性者(例如，替換胺基酸不應破壞母體序列中出現的螺旋或干擾其他賦予母體序列特性或對其功能係必須的二級結構類型)。領域公認的多肽二級及三級結構的實例描述於Proteins, Structures and Molecular Principles(Creighton編輯，W.H. Freeman and Company(1984))；Introduction to Protein Structure(Branden及Tooze編輯, Garland Publishing (1991))；及Thornton等人，1991，Nature 354:105-106，均以引用形式並於本文。

本文亦包含抗體的非肽類似物。非肽類似物普遍用於提供與模板肽具有相似性質的藥物。此等非肽化學物類型被稱作「模擬肽(peptide mimetic)」或「擬肽(peptidomimetic)」。Fauchere，1986，Adv. Drug Res. 15:29-69；Veber及Freidinger，1985，Trends Neurosci. 8:392-396；Evans等人，1987，J．Med. Chem. 30:1229-1239，均以引用形式並於本文。與治療用肽結構相似的模擬肽可用於產生相等的治療或預防效果。通常，擬肽與範例多肽的結構相似(亦即具有期望生物化學性質或藥理學活性的多肽)，例如人類抗體，但是具有一或多個視情況經選自-CH ₂NH-、-CH ₂S-、-CH ₂-CH ₂-、-CH=CH-(順式及反式)、-COCH ₂-、-CH(OH)CH ₂-、及-CH ₂SO-的連接藉由此項技術中熟知之方法取代的肽連接。用相同類型的D-胺基酸系統取代一致序列的一或多個胺基酸(例如，D-離胺酸取代L-離胺酸)亦可用於生成更穩定的肽。此外，可藉由此項技術中已知之方法(Rizo及Gierasch，1992，Annu. Rev. Biochem. 61:387-418)，以引用形式並於本文)例如藉由添加可形成將肽環化的分子間二硫鍵的內部半胱胺酸殘基生成包含一致序列或基本相同的一致序列變異體的拘束肽(constrained peptide)。

多肽的「變異體」包含相對於另一多肽序列在胺基酸序列中插入、缺失及/或替換了一或多個胺基酸殘基之胺基酸序列。

多肽的「衍生物」為經化學修飾的多肽(例如，抗體)，例如藉由與其他化學部分例如聚乙二醇、白蛋白(例如人血清白蛋白)結合、磷酸化及糖基化。

術語「域」為生物大分子中具有特異結構、獨立功能的區域，其具有相當的結構獨立性，有在同類型生物大分子中完整、重複出現的特性，本文中特別指肽、多肽或者蛋白中此類區域，例如輕鏈可變區(V _L)域，單鏈抗體(scFv)域。小的域可以組合形成更大的域，例如單鏈抗體域由輕鏈可變區域及重鏈可變區(V _H)域藉由肽連接子序列組合形成。

術語「次單元」為一個由超過一條多肽組成的蛋白質或者蛋白複合物所包含的其中一個具有獨立序列及三級結構的域或結構組分，例如完整的人CD3分子包含CD3γ，CD3ε及CD3δ三種次單元。

術語「抗體」為包含與抗原結合部分並視情況為允許抗原結合部分採取促進該抗體與該抗原結合的構型的支架或框架部分的蛋白，亦即包括除包含兩個全長重鏈及兩個全長輕鏈的抗體外的其衍生物，變異體、片段、突變蛋白及融合蛋白，例如本文的雙特異性抗體。抗體的實例包括抗體、抗體片段(例如抗體的抗原結合部分)、抗體衍生物及抗體類似物。該抗體可包含例如可選擇的蛋白支架或具有移植CDR或CDR衍生物的人工支架。該支架包括但不限於包含被引入的例如以穩定化該抗體的三維結構的抗體衍生支架以及包含例如生物相容性多聚體的全合成支架。參見，例如，Korndorfer等人，2003，Proteins: Structure，Function and Bioinformatics 53:121-129；Roque等人，2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654。此外，可使用模擬肽抗體(「PAM」)以及基於模擬抗體的支架，其如支架一樣利用纖維蛋白連接素。

抗體可具有例如天然免疫球蛋白的結構。「免疫球蛋白」為四聚體分子。在天然的免疫球蛋白中，各四聚體由兩個相同的多肽鏈對組成，各對具有一個「輕」(約25 kDa)及一個「重」鏈(約50-70 kDa)。各鏈之胺基端包括約100至110或更多胺基酸的可變區域，主要與抗原識別相關。各鏈之羧基端部分確定了主要與效應器作用相關的恆定區。人之輕鏈分為κ及λ輕鏈。重鏈為γ，並確定了抗體為IgG。在輕鏈及重鏈中，可變及恆定區由約12或更多個胺基酸的「J」區連接，重鏈亦包括約10多個胺基酸的「D」區。參見，Fundamental Immunology第7章(Paul編輯，第2版，Raven Press，1989) (其完整內容以引用形式並於本文用於任何目的)。各輕/重鏈對的可變區形成抗體結合位點，此類一個完整的免疫球蛋白具有兩個結合位點。

天然免疫球蛋白鏈顯示出由三個高度可變區連接的相對保守骨架區(FR)的相同基本結構，亦被稱作互補決定區或CDR。自N端至C端，輕及重鏈均包含域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。各域胺基酸的分配與Kabat等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國衛生與人群服務部(US Dept. of Health and Human Services), PHS，NIH，NIH出版物第91-3242號，1991中的定義一致。

單鏈抗體(scFv)為其中的V _L及V _H區由肽連接子(合成之胺基酸殘基序列)連接以形成連續蛋白質的抗體，其中該肽連接子足夠長以允許該蛋白鏈摺疊回自身並形成單價抗原結合位點(參見，例如，Bird等人，1988，Science 242:423-26及Huston等人，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83)。

可使用Kabat等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版, 美國衛生與人群服務部, PHS, NIH, NIH出版物第91-3242號，1991中描述之方法鑑定給定抗體的互補決定區(CDR)及骨架區(FR)。可向分子中共價或非共價併入一或多個CDR使其成為抗體。抗體可以較大多肽鏈併入一或多個CDR。可將一或多個CDR共價連接至另一多肽鏈，或非共價併入一或多個CDR。CDR允許抗體與具體的相關抗原特異性結合。

抗體可有一或多個結合位點。若多於一個結合位點，該結合位點可與另一個具有相同或不同的特異性。例如，天然人免疫球蛋白G通常具有兩個相同的結合位點，而「雙特異性」或「雙功能」抗體可以具有兩個或更多個的結合位點，並且此等位點分屬於兩種具有不同特異性的結合位點，例如本文的T細胞雙特異性抗體具有四個結合位點，其中兩個位點識別CD3陽性的T細胞，剩餘兩個位點結合ETA陽性的腫瘤細胞。術語「T細胞雙特異性抗體」或「雙特異性抗體」為能夠識別T細胞及一個額外目標的雙特異性抗體。

術語「鼠源抗體」包括具有一或多個來源於小鼠免疫球蛋白序列的可變區及恆定區的所有抗體。

術語「人源化抗體」係將小鼠抗體分子的互補決定區序列移植至人抗體可變區框架中而製成的抗體。

「抗原結合域」、「抗原結合區」或「抗原結合位點」為包含與抗原相互作用之胺基酸殘基(或其他部分)並有助於抗體對抗原的特異性及親和力的抗體的部分。對與其抗原特異性結合的抗體而言，此將包括至少部分的至少一個其CDR域。

「表位」為與抗體(例如，藉由抗體)結合的分子部分。表位可包含分子的非連續部分(例如，在多肽中，在多肽的一級序列中不連續之胺基酸殘基在該多肽的三級及四級結構中相互足夠接近以致於被一個抗體結合)。

兩個多聚核苷酸或兩個多肽序列的「相同百分比」由使用GAP電腦程式(GCG Wisconsin Package；version 10.3 (Accelrys，San Diego，CA)的一部分)使用其預設參數比較序列測定。

術語「多聚核苷酸」、「寡聚核苷酸」及「核酸」可在全文中交替使用並包括DNA分子(例如，cDNA或基因體DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸類似物(例如，肽核酸及非天然核苷酸類似物)生成的DNA或RNA類似物及其雜交體。核酸分子可為單鏈或雙鏈。在一個實施方案中，本文的核酸分子包含編碼本文的抗體或其片段、衍生物、突變蛋白或變異體連續的開讀框。

若其序列可反向平行排列，則兩個單鏈多聚核苷酸係相互「互補的」，此類一個多聚核苷酸中的各核苷酸與另一多聚核苷酸中的互補核苷酸相反，不會引入空隙並且各序列的5'或3'端沒有未配對的核苷酸。若兩個多聚核苷酸可在中等嚴格條件下相互雜交，則一個多聚核苷酸與另一多聚核苷酸「互補」。因此，一個多聚核苷酸可與另一多聚核苷酸互補，但並不係其互補序列。

「載體」為可用於將與其相連的另一核酸引入細胞的核酸。載體的一種類型為「質體」，其指可連接附加核酸區段的線性或環狀雙鏈DNA分子。載體的另一類型為病毒載體(例如，複製缺陷逆轉錄病毒、腺病毒及腺病毒伴隨病毒)，其中可將附加DNA區段引入病毒基因體。某些載體可在其被引入的宿主細胞中自主複製(例如，包含細菌複製起點的細菌載體以及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非游離型哺乳動物載體)在引入宿主細胞時整合入宿主細胞的基因體中並因此與宿主基因體一起複製。「表現載體」為可引導所選多聚核苷酸表現的載體類型。

若調控序列影響核苷酸序列的表現(例如，表現量、時間或位點)，則核苷酸序列與調控序列「可操作地相連」。「調控序列」為可影響與其可操作相連的核酸的表現(例如，表現量、時間或位點)的核酸。調控基因，例如，直接對受調控核酸發揮作用或藉由一或多個其他分子(例如，與調控序列及/或核酸結合的多聚核苷酸)的作用。調控序列的實例包括啟動子、強化子及其他表現控制元件(例如，多腺苷酸化信號)。調控序列的進一步實例描述於例如Goeddel，1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 第185卷, Academic Press, San Diego，CA及Baron等人, 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06。

「宿主細胞」為用於表現核酸例如本文的核酸的細胞。宿主細胞可為原核生物，例如大腸桿菌，或者其可為真核生物，例如單細胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物細胞(例如菸草或番茄植物細胞)、動物細胞(例如，人細胞、猴細胞、倉鼠細胞、大鼠細胞、小鼠細胞或昆蟲細胞)或雜交瘤。通常，宿主細胞為可用多肽編碼核酸轉化或轉染的培養細胞，其可接著在宿主細胞中表現。短語「重組宿主細胞」可用於表述用預期表現的核酸轉化或轉染的宿主細胞。宿主細胞亦可為包含該核酸但是不以期望量表現的細胞，除非向該宿主細胞引入了調控序列這樣其與核酸可操作地相連。應理解的係術語宿主細胞不僅指具體的個體細胞亦指該細胞的子代或可能的子代。由於例如突變或環境影響後續世代會出現某些修飾，該子代事實上可能與母體細胞不同但是仍然屬於本文使用的術語範圍。

CD3 T細胞表面的分化簇3(CD3)係T細胞受體的輔受體，協助細胞毒性T細胞的活化。哺乳動物T細胞的CD3分子由四個次單元(一個γ次單元，一個δ次單元及兩個ε次單元)共同組成。本文的T細胞雙特異性抗體主要藉由針對ε次單元的特異性來結合CD3分子陽性的T細胞，但其他次單元亦有可能參與抗體表位的形成。

小鼠、獼猴及人的CD3ε之胺基酸序列在Uniprot蛋白資料庫(UniProt, Consortium. 「UniProt: a hub for protein information.」. Nucleic acids research. 43)中的寄存編號如下：小鼠CD3ε寄存編號：P22646；獼猴CD3ε寄存編號：H9FCI9；人CD3ε寄存編號：P07766。

ETA ETA屬於7-跨膜受體家族的A亞家族，其藉由異源三聚體鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(G蛋白)與一或多個胞內信號傳導途徑偶聯(Jelinek等人，1993, Science 259: 1614-1616，Segre等人, 1993, Trends Endocrinol. Metab. 4:309-314。如本文所使用「內皮素受體A」及「ETA」可交替使用。

ETA之胺基酸序列在Uniprot蛋白資料庫(UniProt, Consortium)中的寄存編號如下：小鼠ETA寄存編號：Q61614；大鼠ETA寄存編號：P26684；恆河猴ETA寄存編號：F7HSF3；人ETA寄存編號：P25101。

雙特異性抗體本文所涉及的抗體屬於T細胞依賴的雙特異型抗體，能夠特異性地識別腫瘤細胞表面高表現的ETA及T細胞表面的CD3。投與時能夠招募T細胞攻擊ETA高表現的腫瘤細胞，起到治療包括但不侷限於卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、食管癌、前列腺癌、甲狀腺癌、直腸癌、肺癌、胃癌等腫瘤。此類雙特異性抗體所引起的細胞殺傷不主要依賴於IgG分子的Fc片段所介導的細胞毒性或者補體作用，並且比傳統抗體起效更快，活性更高，用量更少。

雙特異性抗體具有各種不同的分子構造，且具有各自的優缺點。具有代表性的三功能抗體(Triomab)及BiTE形式的抗體已有卡妥索單抗(Catumaxomab)及貝林妥歐單抗(Blinatumomab)被批准上市，分別用於惡性腹水及B-ALL的治療，後者還正嘗試用於NHL的治療。但前者因為使用大鼠/小鼠嵌合抗體的構造免疫源性很高，且製備得率很低，而後者使用單鏈抗體串聯的分子形式因而具有活體內半衰期短，產率低及生產製程複雜等缺點。

本文所涉及的雙特異性抗體蛋白質選用新的構造形式，在一個實施方案中，此等雙特異性抗體由一個完整的抗人ETA的IgG分子及兩個相同的抗人CD3的scFv形式的域組成。在一個實施方案中，此等雙特異性抗體由一個完整的抗人CD3 IgG分子及兩個相同的抗ETA的scFv形式的域組成。兩個scFv域藉由可撓性肽連接子序列與IgG分子之輕鏈或者重鏈之胺基端(N')或者羧基端(C')進行融合表現。此類分子設計係基於對IgG分子的優秀性質加以最大保留的意願。作為融合蛋白質的一個融合組件，IgG分子已經被證明可以在保留其自身的親和力的同時有效提高整個融合蛋白質的穩定性及活體內半衰期(CN 105854000 A)。同時，基於Protein A對IgG分子的高親和力而建立的IgG製備製程流程已經非常成熟及平台化，藉助於IgG分子，吾人可以用類似於傳統抗體的純化製程來製備此等雙特異性抗體，降低製程成本。再者，得益於其分子構造及保守之序列，IgG係一個低免疫源性的分子，而本文涉及的雙特異性抗體蛋白質雖然進行了分子構造上的人為改造，卻大體上仍然係基於IgG分子的，有利於減少因為分子構造過度變更帶來的穩定性及免疫源性上的不確定性。

基於以上的考慮，吾人設計了本文涉及的雙特異性抗體，一種由scFv搭配IgG分子形成的T細胞雙特異性抗體。其IgG分子部分可以選自以下不同的抗體形式之一：鼠源抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單株抗體、重組抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體、IgG4抗體等的不同形式，並且可以包含此項技術中已知的任何恆定區。輕鏈恆定區可為例如κ或λ型輕鏈恆定區，例如人的κ或λ型輕鏈恆定區(SEQ NO.21、SEQ NO.22及SEQ NO ID: 27)。重鏈恆定區為γ型重鏈恆定區，例如人γ型重鏈恆定區(SEQ NO. ID 23、SEQ NO. ID 24、SEQ NO. ID 25及SEQ NO. ID 26)。在一個實施方案中，該輕鏈或重鏈恆定區為天然恆定區的片段、衍生物、變異體或突變蛋白。亦可應用重組DNA技術。可在該操作中應用編碼具體抗體的DNA，例如編碼期望同種型的抗體恆定域的DNA。亦可參見Lanitto等人，2002，Methods Mol. Biol. 178:303-16。而與IgG分子組合形成本文雙特異性抗體的scFv域不包含有任何恆定區，其由輕鏈可變區域、重鏈可變區域由肽連接子胺基酸序列連接而成，三者的排列方式選自以下的一種： a. 以N'-Vs _L-Link ₂-Vs _H-C'順序排列；及 b. 以N'-Vs _H-Link ₂-Vs _L-C'順序排列；其中：Vs _L為scFv域之輕鏈可變區胺基酸序列，Vs _H為scFv域之重鏈可變區胺基酸序列，N'代表多肽鏈之胺基端，C'代表多肽鏈之羧基端，Link ₂為域內肽連接子胺基酸序列，序列選自：SEQ NO ID: 6、SEQ NO ID: 7、SEQ NO ID: 8、SEQ NO ID: 9、SEQ NO ID: 10。吾人選擇scFv域來提供針對第二個抗原的親和力的原因係其保留了與IgG可變區(Fab)相類似的結構，並且單鏈的構造易於及IgG分子進行融合表現。該scFv域與IgG的進行融合表現後將形成對稱的結構，亦即IgG分子的兩條輕鏈或兩條重鏈均連接一個scFv域，其鏈接方式按照以下的方式中的其中一種進行： a. 藉由肽連接子將scFv之羧基端及IgG輕鏈之胺基端鏈接：N'-scFv-Link ₁-V _L-C _L-C'； b. 藉由肽連接子將scFv之胺基端及IgG輕鏈之羧基端鏈接：N'-V _L-C _L-Link ₁-scFv-C'； c. 藉由肽連接子將scFv之羧基端及IgG重鏈之胺基端鏈接：N'-scFv-Link ₁-V _H-C _H1-C _H2-C _H3-C'；及 d. 藉由肽連接子將scFv之胺基端及IgG重鏈之羧基端鏈接：N'-V _H-C _H1-C _H2-C _H3-Link ₁-scFv-C'；其中：scFv為單鏈抗體可變區片段，V _H為IgG域重鏈可變區，C _L為IgG域輕鏈恆定區域，C _H1為IgG域重鏈恆定區域1，C _H2為IgG域重鏈恆定區域2，C _H3為IgG域重鏈恆定區域3，N'代表多肽鏈之胺基端，C'代表多肽鏈之羧基端。Link ₁為域間肽連接子序列，序列選自：SEQ NO ID: 1、SEQ NO ID: 2、SEQ NO ID: 3、SEQ NO ID: 4、SEQ NO ID: 5、SEQ NO ID: 28。

如上所述之本文的雙特異性抗體共有四個結合位點及兩種不同特異性，分別來自於IgG分子及scFv域，並按照以下的方式之一進行分配： a. IgG分子識別ETA；scFv域識別CD3； b. IgG分子識別CD3；scFv域識別ETA。

針對人ETA的特異性來自L5H5抗體純系，其對人ETA的親和力在10 ^-9/M以上，更高的親和力會帶來更優秀的細胞殺傷活性。針對人CD3的特異性來自選自包括OKT3、UCHT-1等的抗體純系，其對CD3的親和力要求比較低，且親和力並不宜過高，以免引起免疫風暴。以上所述之擁有不同特異性的IgG域或者scFv域可藉由不同的輕重鏈可變區之組合方式來表示，例如選用L1H1組合的IgG域代表該IgG域選用L1之輕鏈可變區搭配H1之重鏈可變區組合形成。

本文所涉及到的不同輕重鏈可變區胺基酸序列如下表總結：

L1	DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLEIKR (SEQ ID NO. 11)
L2	QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYXQQWSSNPFTFGSGTKLEIN (SEQ ID NO. 13) X= C or S
L3	EAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO. 15)
L4	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITR (SEQ ID NO. 17)
L5	EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQNIGTSIHWYQQKPDQSPKLLIKYASKSISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQHSYSFPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO. 19)
H1	EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO. 12)
H2	QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO. 14)
H3	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 16)
H4	QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISTDKSKSTAFLQMDSLRPEDTAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO. 18)
H5	QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLTTSGLGVAWIRQPPGKALEWLAHIWSDGDTRYYPALKNRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHMKDDSLYFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 20)

數個針對T細胞的抗體，如OKT3，TGN1412均會引起人體的細胞激素釋放症候群(Cytokine release syndrome)，而過度的釋放被稱作細胞激素風暴(Cytokine storm)，係一種可能危及生命的急性輸液反應。因此，規避投與此等雙特異性抗體投與時的細胞激素風暴尤為重要。可以藉由兩個態樣來減少該風險：第一，因為T細胞係細胞激素釋放的主要貢獻者，因此限制針對CD3的抗體的親和力係降低細胞激素釋放的一個重要態樣，本文中的抗體針對CD3的親和力必須處於足夠的招募T細胞活性及刺激細胞激素釋放之間的平衡區域。第二，藉由劑量或者半衰期控制來減少其持續刺激T細胞的強度及時長。

抗體類藥物的免疫源性係開發階段非常重要的考慮項，IgG分子得益於其結構及序列的保守性，係一個低免疫源性的分子，本文的雙特異性抗體在結構上基於IgG的經典分子結構設計而成，其IgG部分無需累述，其兩個scFv域亦擁有接近IgG可變區的分子結構，此類設計減少了因為分子結構過度人為化引入結構性的新免疫位點的風險。但是，在構建此分子時，無論係在組成scFv域或者連接scFv及IgG域時，肽連接子序列係必須要添加的人為序列部分。為儘可能地減少引入的結構不確定性，同時保持IgG及scFv兩者的自由度，肽連接子部分較佳富含甘胺酸及絲胺酸之序列。因為甘胺酸及絲胺酸帶有較小的側鏈，使肽連接子序列具有相當的靈活性，減少了scFv及IgG域之間相對位置的剛性，使兩者可以自由地與各自的目標結合。同時，甘胺酸及絲胺酸交替出現避免過度重複向雙特異性抗體中引入不必要的免疫源性。較佳肽連接子長度，平衡結構可撓度及免疫源性很重要，所以本文優先選擇了以下的幾個肽連接子序列用於scFv及IgG域的連接：SEQ NO ID: 1、SEQ NO ID: 2、SEQ NO ID: 3、SEQ NO ID: 4、SEQ NO ID: 5、SEQ NO ID: 28；以及scFv的構建：SEQ NO ID: 6、SEQ NO ID: 7、SEQ NO ID: 8、SEQ NO ID: 9、SEQ NO ID: 10。

本文中，編碼scFv的DNA與上述IgG域之輕鏈或重鏈DNA藉由編碼肽連接子序列的DNA連接成融合輕鏈或融合重鏈DNA，同時在輕鏈DNA的5'末端還將引入編碼信號引導肽的DNA來形成基因，並可以此基因基礎連接scFv及IgG序列。本文藉由基因合成之方法得到scFv之序列，並藉由PCR之方法將其與編碼肽連接子序列的DNA相連接。本文亦係藉由基因合成之方法得到上述IgG域之輕鏈可變區及重鏈可變區DNA序列，並與特定抗體亞型的恆定區DNA相連接組成得到完整的IgG輕鏈及重鏈的DNA序列。野生型抗體亞型的恆定區DNA可以藉由自特定的庫選殖得到並作為序列最佳化的基礎。在此所述之用於表現雙特異性抗體的基因，藉由選殖方式放入表現載體中用於雙特異性抗體的產生及表現。在表現過程中，輕鏈及重鏈表現載體搭配後，用共轉染或者轉化的方式將帶有其基因的DNA引入宿主細胞中，並用最佳化適應誘導啟動子，選擇轉化子或者擴增編碼所希望序列的基因的培養基在適宜的pH、溫度中培養。DNA引入方式選用普遍使用的CaPO ₄、電穿孔及PEI等方式。將此等載體引入大腸桿菌、酵母或哺乳動物為基礎的表現系統後可使用此等方法生產大量本文所述之雙特異性抗體。

適於表現此處所述載體中核酸的合適宿主細胞包括高等真核細胞，哺乳動物宿主細胞株表現的實例包括了中國倉鼠卵巢細胞株(CHO)及人胚胎腎臟細胞(HEK293或者懸浮培養的HEK293細胞株)，位於輕鏈N末端的信號引導肽指導雙特異性抗體的自哺乳動物宿主細胞株中之分泌。用於表現及選殖的載體上帶有能夠使載體在宿主細胞中不斷複製的選擇標記，用於篩選有能力吸收編碼雙特異性抗體的核酸的細胞並且帶有與雙特異性抗體編碼序列有效連接並指導mRNA合成的啟動子。其中一個實例係用帶有抗生素抗性以及B型肝炎病毒及猿病毒啟動子(SV40)的載體較佳穩定表現雙特異性抗體的CHO宿主細胞。

熟習此項技術者應理解的係一些蛋白質，例如抗體，可能進行多種轉錄後修飾。此等修飾的類型及程度取決於用於表現該蛋白的宿主細胞株以及培養條件。該類修飾包括糖基化作用、甲硫胺酸氧化、二酮哌𠯤形成、天冬胺酸異構化及天冬醯胺脫醯胺作用的變化。由於羧肽酶的作用頻繁修飾導致羧端鹼性殘基(例如離胺酸或精胺酸)的丟失(如Harris，1995，Journal of Chromatography 705:129-134中所述)。

可藉由多種已確立的技術分離及純化單株抗體。該類分離技術包括使用蛋白A-瓊脂糖的親和層析法、分子排阻層析法及離子交換層析法，參見，例如，Coligan第2.7.1-2.7.12頁及第2.9.1-2.9.3頁；Baines等人，「Purification of Immunoglobulin G(IgG),」Methods in Molecular Biology，第10卷，第79-104頁(The Humana Press，Inc.，1992)。可使用基於抗體的特殊性質(例如，重鏈或輕鏈同種型、結合特異性等)篩選的適當配基藉由親和層析法純化單株抗體。固定化於固體載體的適當配基的實例包括蛋白A、蛋白G、抗恆定區(輕鏈或重鏈)抗體、抗獨特型抗體以及TGF-p結合蛋白或其片段或變異體。本文在宿主細胞株表現雙特異型抗體蛋白質後，用親和層析之方法將其分泌在細胞培養上清液中的部分純化。本文中的實例包括用蛋白A/蛋白G的親和層析管柱捕獲融合有全長抗體的雙特異性抗體，然後用低pH將其自層析管柱料上溶離後再收集。溫和的溶離條件有助於防止蛋白的變性。

可使用抗體結合位點中央的互補決定區(CDR)的分子進化分離親和性增加的抗體，例如對c-erbB-2親和性增加的抗體，如Schier等人，1996，J．Mol. Biol. 263:551-567所述。當需要提高根據本文所述之雙特異性抗體的針對其某一個目標的親和性時，可藉由多種親和成熟方案包括維持CDR (Yang等人，1995，J．Mol. Biol. 254:392-403)、鏈替換(Marks等人，1992，Bio/Technology 10:779-783)、使用大腸桿菌的突變株(Low等人，1996，J．Mol. Biol. 250:350-368)、DNA重排(Patten等人，1997，Curr. Opin. Biotechnol. 8:724-733)、噬菌體展示(Thompson等人，1996，J．Mol. Biol. 256:7-88)以及其他PCR技術(Crameri等人，1998，Nature 391：288-291)。所有此等親和力成熟方法討論於Vaughan等人，1998，Nature Biotechnology 16:535-539中。

可以用一或多種賦形劑調配本文的雙特異性抗體。本文的雙特異性抗體可以與可藥用的緩衝液、經調節提供可接受的穩定性的pH、以及可投與(例如非經腸投與)的pH組合。視情況，可以添加一或多種可藥用的抗微生物劑。間甲酚及苯酚係較佳的可藥用抗微生物劑。可以添加一或多種可藥用鹽溶液以調節離子強度或張力。可以添加一或多種賦形劑以進一步調節製劑的等張性。甘油係等張性調節賦形劑的實例。可藥用意謂適於投與人類或其他動物，因此不含有毒性成分或不希望的污染物，並且不干擾其中活性化合物的活性。

可以以溶液製劑或能夠用合適的稀釋劑重構的凍乾粉調配本文的雙特異性抗體。凍乾劑型係其中雙特異性抗體穩定的一種劑型，具有或不具有重構產品在預期的使用貨架期內保持pH的緩衝能力。包含在此討論的雙特異性抗體的溶液在凍乾前較佳係等張的，使之重構後能夠形成等張溶液。

本文的雙特異性抗體的可藥用鹽溶液形式在本文範圍內。常用於形成酸加成鹽的酸為無機酸，例如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、磷酸等，以及有機酸，例如對甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、對溴苯基一磺酸、碳酸、琥珀酸、檸檬酸、苯甲酸、乙酸等。較佳的酸加成鹽係與無機酸，例如鹽酸及氫溴酸形成的鹽。

鹼加成鹽包括自無機鹼，例如銨、鹼或鹼土金屬氫氧化物衍生的彼等鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽等。在製備本文的鹽溶液中有用的此類鹼因此包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、碳酸鉀等。

核酸及宿主細胞本文亦提供分離的核酸分子，該核酸分子包含例如編碼全部或部分抗體的多聚核苷酸，例如本文所述之雙特異性抗體的一條鏈或兩條鏈，或其片段、衍生物、突變蛋白或變異體；足以用作雜交探針的多聚核苷酸；PCR引子或用於鑑定、分析、突變或擴增編碼多肽的多聚核苷酸的定序引子；用於抑制多聚核苷酸表現的反義核酸以及其互補序列。該核酸可為任何長度。例如其長度可為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1000、1500、3000、5000或更多個核苷酸，及/或包含一或多個附加序列，例如調控序列，及/或係較大核酸例如載體的一部分。該核酸可為單鏈或雙鏈並包含RNA及/或DNA核苷酸以及其人工變異體(例如，肽核酸)。熟練的技術人員可理解由於遺傳密碼的簡併性，本文揭示的各多肽序列可由更多數量的其他核酸序列編碼。

本文進一步提供在具體雜交條件下與其他核酸(例如，包含任何A-1/A-2的核苷酸序列的核酸)雜交的核酸。雜交核酸之方法為此項技術中熟知。參見，例如，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Son(1989)，6.3.1-6.3.6。如本文定義，例如，中等嚴格條件使用包含5X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)的預洗溶液、0.5% SDS、1.0 mM EDTA (pH 8.0)、約50%甲醯胺的雜交緩衝液、6X SSC及55℃的雜交溫度(或其他相似的雜交溶液，例如包含約50%甲醯胺，以42℃雜交)，並且溶離條件為60℃，使用0.5X SSC、0.1% SDS。嚴格雜交條件在6X SSC中於45℃雜交，然後於68℃在0.1X SSC、0.2% SDS中洗滌一或多次。此外，熟習此項技術者可操作雜交及/或洗滌條件以增加或降低雜交嚴格度這樣包含相互之間至少65、70、75、80、85、90、95、98或99%同源的核苷酸序列的核酸通常仍可以相互雜交。影響雜交條件選擇的基本參數及設計適當條件的指導列於例如Sambrook，Fritsch及Maniatis，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press，第9及11章；Current Protocols in Molecular Biology，1995，Ausubel等編輯，John Wiley&Sons，Inc.，第2.10及6.3-6.4節)並可由一般技術者基於例如DNA的長度及/或鹼基組成輕鬆確定。可藉由突變在核酸中引入變化，藉此導致其編碼的多肽(例如，抗原結合蛋白)胺基酸序列的變化。可使用此項技術中已知的任何技術引入突變。在一個態樣，可以使用例如定點誘變方案改變一或多個具體胺基酸殘基。在另一態樣，亦可以使用例如隨機誘變方案改變一或多個隨機選擇的殘基。無論其如何生成，可表現突變多肽並篩選期望性質。該突變可在數量上或性質上改變生物學活性。量變的實例包括增加、降低或消除該活性。質變的實例包括改變抗體的抗原特異性。亦可將突變引入核酸而不顯著改變其編碼多肽的生物學活性。例如，可進行引起非必需胺基酸殘基處胺基酸替換的核苷酸替換。

在另一態樣，本文提供包含編碼本文多肽或其部分的核酸的載體。載體的實例包括但是不限於質體、病毒載體、非游離基因哺乳動物載體及表現載體，例如重組表現載體。

本文的重組表現載體可包含適於該核酸在宿主細胞中表現的形式的本文編碼雙特異性抗體的核酸。該重組表現載體包括一或多個調控序列，基於用於表現的宿主細胞進行篩選，其與該預表現的核酸序列可操作性相連。調控序列包括引導核苷酸序列在多個種類宿主細胞中組成型表現的(例如，SV40早期基因強化子、勞斯氏肉瘤病毒啟動子及細胞巨化病毒啟動子)，引導僅在某些宿主細胞中核苷酸序列的表現的(例如，組織特異調控序列，參見Voss等人，1986，Trends Biochem. Sci．11:287，Maniatis等人，1987，Science 236:1237，其完整內容以引用形式並於本文)以及引導核苷酸序列響應具體處理或條件的誘導型表現的(例如，哺乳動物細胞中的金屬硫堇啟動子及原核及真核系統二者中的四環黴素反應(tet-sesponsive)啟動子及/或鏈黴素反應啟動子(同前))。熟習此項技術者應理解表現載體的設計取決於例如用於轉化的宿主細胞的選擇、所需蛋白表現量等因素。本文的表現載體可引入宿主細胞，藉此生產由本文所述核酸編碼的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽。

在另一態樣，本文提供可引入本文表現載體的宿主細胞。宿主細胞可為任何原核或真核細胞。原核宿主細胞包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如大腸桿菌或桿菌。更高級的真核細胞包括昆蟲細胞、酵母細胞以及哺乳動物源的確立細胞株。適當哺乳動物宿主細胞株的實例包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或其衍生物例如Veggie CHO及在無血清培養基中生長的相關細胞株(參見Rasmussen等人，1998，Cytotechnology 28:31)或CHO株DXB-11，其缺失DHFR(參見Urlaub等人，1980，Proc. Natl. Acad, Sci. USA 77:4216-20)。其他CHO細胞株包括CHO-K1 (ATCC #CCL-61)、EM9 (ATCC #CRL-1861)，及UV20 (ATCC# CRL-1862)，其他宿主細胞包括猴腎細胞的COS-7株(ATCC #CRL-1651) (參見Gluzman等人，1981，Cell 23:175)、L細胞、C127細胞、3T3細胞(ATCC CCL-163)，AM-1/D細胞(描述於美國專利第6210924號)、HeLa細胞、BHK (ATCC CRL-10)細胞株、來源於非洲綠猴腎細胞株CV1的CV1/EBNA細胞株(ATCC CCL-70) (參見McMahan等人，1991，EMBO J．10:2821)、人胚腎細胞例如293，293 EBNA或MSR 293、人上皮A431細胞、人C010205細胞、其他經轉化靈長動物細胞株、正常二倍體細胞、來源於初生組織活體外培養物的細胞株、初移植體、HL-60、U937、HaK或Jurkat細胞。用於細菌、真菌、酵母及哺乳細胞宿主的適當選殖及表現載體描述於Pouwels等人(Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, 1985)。

可藉由傳統轉化或轉染技術將載體DNA引入原核或真核細胞中。對於穩定的哺乳動物轉染而言，取決於使用的表現載體及轉染技術，已知只有一小部分細胞可將外源DNA整合入其基因體中。為了鑑定及篩選此等整合子，通常將編碼篩選標記(例如抗生素抗性)的基因與所關注基因一起引入宿主細胞。較佳的篩選標記包括可賦予藥物(如G418、潮黴素及胺甲喋呤)抗性的彼等。在其他方法中可藉由藥物篩選鑑別包含被引入核酸的穩定轉染細胞(例如，整合了篩選基因的細胞可存活，而其他細胞則死亡)。

可在提高多肽表現的條件下培養已轉化細胞，可藉由習知蛋白純化方法回收多肽。一種該純化方法描述於下文實施例。欲用於本文的多肽包括基本同源的重組哺乳動物細胞表現的雙特異性抗體，其基本不含污染性內源材料。

適應症 ET-1信號在很多癌症當中呈現促腫瘤的作用，表現在以下幾個態樣：1.與腫瘤細胞的逃逸、增殖相關，ET-1抑制劑及促凋亡化療藥物聯用呈現了不強但確定的作用；2.與腫瘤細胞與微環境接觸相關；3.與腫瘤細胞的上皮間充質轉化相關；4.與腫瘤細胞遷移相關；5.與腫瘤中免疫細胞失效相關。在所有以上態樣中，ETA均主導或者參與了此等作用的實現，並且在很多腫瘤細胞中呈現高表現的態勢。其中在4上，ETA-β-抑制蛋白(ETA-β-arrestin)的信號路徑起了決定性作用。本文使用的係ETA抑制性抗體及CD3抗體之組合，既能自細胞功能上阻斷ETA的促腫瘤信號，同時亦可以介導T細胞殺傷腫瘤細胞。因此自此邏輯上，只要係ETA高表現的腫瘤類型均將係本發明的雙特異性抗體的適應症。但根據ETA的高表現程度以及β-抑制蛋白的信號放大程度，吾人認為卵巢癌，乳腺癌，黑色素瘤，食管癌，肺癌等幾個癌種係最為顯著的，因此亦係本發明的主要適應症。但其他具有ETA高表現的腫瘤細胞依然可以係本發明的雙特異性抗體的潛在目標。

治療方法在一態樣，治療個體之方法，包括給予治療劑量的本文提供的雙特異性抗體。本文中，術語「個體」指哺乳動物，包括人類，可與術語「患者」交替使用。術語「治療」包括減輕或預防至少一種症狀或病症的其他態樣，或者減輕疾病嚴重性，等等。本文的雙特異性抗體不需要產生完全治癒的效果，或根除疾病的所有症狀或表現，即可構成有效治療劑。如相關領域所公認，作為治療劑的藥物可減少給定疾病狀態的嚴重程度，但不需消除疾病的所有表現即可被認為係有效的治療劑。相似地，預防給藥治療不需在預防症狀出現上完全有效即可構成有效預防劑。只減少疾病的影響(例如，藉由減少其症狀的數量或嚴重度，或藉由提高另一治療效果，或藉由產生另一有效作用)，或者減少個體中疾病發生或加重的可能性就已經足夠。本文的一個實施方案涉及包含以足以誘導反應具體病症嚴重性的指示劑高於基線水準的持續改善的量及時間給予患者抗體之方法。

如相關領域所理解，將包含本文的抗體的醫藥組合物以對適應症恰當的方式給予病人。醫藥組合物可採用任意適當技術包括但不限於非經腸、局部或吸入給藥。若係注射，可藉由例如關節內、靜脈內、肌肉內、損傷區內、腹膜內或皮下途徑，以快速注射或連續輸注給予醫藥組合物。可考慮例如在疾病或損傷部位局部給藥，如透皮給藥及埋植劑持續釋放給藥。吸入給藥包括例如鼻腔或口腔吸入、採用噴霧劑、以氣霧劑形式吸入抗體等等。其他選擇包括口腔製劑包括片劑、糖漿劑或錠劑。

以包含一或多個其他組分例如生理學上可接受載體、輔料或稀釋劑之組合物形式給予本文的抗體係有利的。組合物可視情況額外包含一或多個如下所述之生理學活性劑。在多個具體實施方案中，組合物包含除一或多個本文的T細胞雙特異性抗體之外的一個、兩個、三個、四個、五個或六個生理學活性劑。

在一個實施方案中，醫藥組合物包含本文的雙特異性抗體以及一或多個選自以下的物質：pH適合於抗體的緩衝液、抗氧化劑例如抗壞血酸、低分子量多肽(例如含少於10個胺基酸的多肽)、蛋白質、胺基酸、糖例如糊精、錯合物例如EDTA、麩胱甘肽、穩定劑及輔料。根據適當工業標準，亦可加入防腐劑。可使用適當輔料溶液作為稀釋劑將組合物調配成凍乾粉末。適當組分在所用劑量及濃度下對接受者無毒。可用於醫藥處方組分的進一步實例見Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版(1980)及20版(2000)，Mack Publishing Company提供醫學從業人員使用的套組，其包括一或多種本文的抗體以及治療本文討論任何病症的標籤或其他說明。在一個實施方案中，套組包括以上述組合物形式裝在一或多個管型瓶中的一或多種抗體的無菌製劑。

給藥劑量及頻率可根據以下因素而改變：給藥途徑、所用具體抗體、所治疾病的性質及嚴重度、症狀為急性還是慢性以及患者的體積及總體症狀。可藉由此項技術中熟知之方法確定適當劑量，例如在臨床試驗中包括劑量放大研究。

本文所述之雙特異性抗體可在例如一段時間內按規律間隔給藥一或多次。對於治療慢性症狀，長期治療通常最有效。但是，對於治療急性症狀，短期給藥例如自一週至六週就已足夠。通常，給予人類抗體直至患者表現出所選體徵或指示劑高於基線水準的醫學相關改善度為止。

本文提供的治療方案的一個實例包括以適當劑量一週一次靜脈、皮下或腹腔注射抗體來治療相關適應症。可持續每週或每月給予抗體直至達到所需結果例如病人症狀消退。可按需要重新治療，或者，可選擇地，給予維持劑量。

本文方法及組合物的具體實施方案涉及使用例如一個本文的雙特異性抗體、兩個或更多個本文的雙特異性抗體、本文的雙特異性抗體及其他非本文的抗體、或者本文的雙特異性抗體及活體外培養的各類型細胞(例如活體外培養的CIK細胞)等不同情形。在進一步的實施方案中，單獨或與其他用於治療使患者痛苦的症狀的藥劑組合給予抗體，此等藥劑的實例包括蛋白質以及非蛋白質藥物。當聯合給予多種藥物時，如此項技術中所熟知其劑量應相應調整。「聯合給藥」組合療法不限於同時給藥，亦包括在涉及給予患者至少一種其他治療劑的療程中至少給予一次抗原及蛋白的治療方案。

在另一態樣，本文提供製備治療相關適應症的藥劑之方法，其包含投與本文所述雙特異性抗體與醫藥學上可接受之輔料中的混合物。藥劑製備方法如上所述。可以藉由具有普通技能的內科醫生已知有效的任意途徑投與本文的雙特異性抗體。周邊非經腸屬於其中一種此類方法。醫學文獻中通常將非經腸投與理解為藉由消毒注射器或一些其他機械裝置例如注射泵向機體注射劑型。周邊非經腸可以包括靜脈內、肌內、皮下及腹膜內投與途徑。本文的雙特異性抗體亦可以進行經口、直腸、經鼻或下呼吸道途徑投與，其係非腸胃外途徑。此等非腸胃外途徑中，較佳下呼吸道途徑及經口途徑。

具體實施方式下面藉由具體實施例，並結合附圖，對本文的技術方案作進一步的具體說明。

本文中，若非特指，所採用的原料及設備等均可自市場購得或係此項技術中常用的。下述實施例中之方法，如無特別說明，均為此項技術中的習知方法。

步驟一：雙特異性抗體的輕重鏈基因合成及次選殖編碼IgG分子抗體輕重鏈的可變區DNA序列以及編碼scFv域的DNA序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。運用重疊PCR之方法，將IgG抗體輕鏈或者重鏈的可變區與scFv域DNA序列藉由多肽連接子DNA序列連接，形成的完整的編碼融合後輕重鏈的DNA序列兩端藉由設計酶切位點Nhe1及Not1，連接至已裝入人輕鏈或者重鏈恆定區表現載體PTM5中。上述DNA序列的完整性藉由定序驗證後，該PTM5質體可與對應的未融合輕鏈或者重鏈質體組合用於轉染。

步驟二：在懸浮HEK293或者CHO宿主細胞株中短暫表現雙特異性抗體接種懸浮HEK293或者CHO表現細胞株至轉瓶中，經過37℃、24 h旋轉培養後被用於轉染。轉染過程中使用聚乙烯亞胺(PEI)作為轉染介質，將其與DNA混合後加入至細胞培養中。PEI及DNA的混合較佳配比為1:1至5:1。細胞在接受PEI與DNA混合物後繼續37℃旋轉培養超過96 h以表現抗原結合蛋白，其間向細胞培養物中加入0.5%的胰蛋白腖作為表現需要之胺基酸源，最後收集細胞上清液用於雙特異性抗體的純化分離。

步驟三：自細胞培養上清液中的純化及製備雙特異性抗體將細胞培養離心去除其中細胞，其上清液經過偶聯蛋白A配基的親和層析管柱後，用pH 2.5-3.5的溶離液將表現的雙特異性抗體自層析管柱上溶離。溶離管中預置中和緩衝液及時中和溶離液的低pH值。溶離後收集的蛋白質溶液對PBS透析。

步驟四：中/高表現ETA的相關細胞株構建將攜帶ETA及EGFP基因的質體使用電轉儀轉入Raji細胞，用含300 μg/ml潮黴素B的完全培養基加壓篩選後，藉由有限稀釋法挑選得到高表現ETA (同時表現EGFP)的Raji-ETA-EGFP單株細胞株。

將攜帶ETA基因的質體使用脂染胺3000轉入A2780細胞，用含0.6 μg/ml嘌呤黴素的完全培養基加壓篩選後，藉由有限稀釋法挑選得到高表現ETA的A2780-ETA單株細胞株。

將攜帶ETA及EGFP基因的質體使用脂染胺3000轉入CHO細胞，用含300 μg/ml潮黴素B的完全培養基加壓篩選後，藉由有限稀釋法挑選得到高表現ETA (同時表現EGFP)的CHO-ETA-EGFP單株細胞株。

步驟五：流式細胞儀分析鑑定(FACS)雙特異性抗體與高表現ETA的CHO細胞的結合收集10 ⁵個CHO-ETA-EGFP細胞於1.5 mL EP管，1500 rpm離心5 min，棄上清液，陰性對照樣本用流動式加載緩衝液200 μl (PBS，2% FBS)重懸。陽性處理組細胞每管加200 μl，共15 μg抗體上清液，4℃培育60 min；1500 rpm離心5 min，棄上清液，用流動式加載緩衝液洗一次，再離心，重懸，每孔加入1:200稀釋的抗人類IgG Fc二級抗體, PE (life REF: H10104) 200 μl，4℃避光培育30 min；離心，棄上清液，再用流動式加載緩衝液洗一次，離心，最後用流動式加載緩衝液重懸，上機偵測。

收集10 ⁵個A2780-ETA細胞於1.5 mL EP管，1500 rpm離心5 min，棄上清液，陰性對照樣本用流動式加載緩衝液200 μl (PBS，2% FBS)重懸。陽性處理組細胞每管加200 μl，共20 μg抗體上清液，4℃培育60 min；1500 rpm離心5 min，棄上清液，用流動式加載緩衝液洗一次，再離心，重懸，每孔加入1:200稀釋的抗人類IgG Fc二級抗體, PE (life REF: H10104) 200 μl，4℃避光培育30 min；離心，棄上清液，再用流動式加載緩衝液洗一次，離心，最後用流動式加載緩衝液重懸，上機偵測。

步驟六：流式細胞儀分析鑑定(FACS)雙特異性抗體與Jurkat細胞的結合收集10 ⁵個Jurkat細胞於1.5 mL EP管，1500 rpm離心5 min，棄上清液，陰性對照樣本用流動式加載緩衝液200 μl (PBS，2% FBS)重懸。陽性處理組細胞每管加200 μl，共7 μg抗體上清液，4℃培育60 min；1500 rpm離心5 min，棄上清液，用流動式加載緩衝液洗一次，再離心，重懸，每孔加入1:200稀釋的抗人類IgG Fc二級抗體, PE (life REF: H10104)200 μl，4℃避光培育30 min；離心，棄上清液，再用流動式加載緩衝液洗一次，離心，最後用流動式加載緩衝液重懸，上機偵測。

步驟七：用於細胞殺傷活性偵測的CIK/PBMC細胞的培養及製備購買人PBMC細胞，用CIK細胞啟動培養液(無血清X-Vivo細胞培養液+1000 U/mL IFN-γ)將每份新分離的PBMC細胞補滿30 mL，加至75 cm ²培養瓶中，置於飽和濕度、37℃、5.0% CO ₂培養箱培養。培養24小時後，加入CIK細胞刺激因子混合液1 mL(無血清X-Vivo細胞培養液+50 ng/mL CD3單株抗體、300 U/mL IL-2、100 U/mL IL-1α)，繼續置於飽和濕度、37℃、5.0% CO ₂培養箱內培養。接下來的步驟根據CIK細胞的生長情況決定補液(無血清X-Vivo培養液+300 U/mL IL-2±2%自體血漿)、分瓶的事宜，基本上要維持細胞在1-2×10 ⁶的濃度左右生長。最後用流式細胞儀偵測製備的CIK細胞表面抗原CD3的表現情況。

步驟八：雙特異性抗體的細胞殺傷活性測定取對數期Raji-ETA-EGFP細胞，在96孔細胞培養盤鋪入50 μl的細胞懸液(2×10 ⁴/孔)，將抗體調配成不同工作濃度的溶液(起始濃度為480 ng/ml，6倍稀釋11個藥物濃度點，第12個點為完全培養基對照孔)，每孔加入50 μl，每個藥物濃度三個平行複孔，室溫培育15 min。以10:1的效應目標比每孔加入100 μl CIK細胞(2×10 ⁵/孔)，置於37℃，5% CO ₂培養箱中培育24 h。將上述處理的細胞轉入流式細胞儀讀盤專用U96孔盤中，1500 rpm離心5min去上清液，每孔加入200 μl含2% FBS的PBS重懸，流式細胞儀讀盤，每孔讀取細胞數設置為50000個(收集CIK與Raji-ETa-EGFP-17#活細胞總數)。以給藥濃度為橫座標，收集的50000個總細胞中存活Raji-ETA-EGFP細胞(綠光分群)為縱座標，使用Graphpad軟體進行四參數擬合得到EC50值；或以給藥濃度為橫座標，對Raji-ETA-EGFP細胞的殺傷率為縱座標使用Graphpad軟體進行四參數擬合得到EC50值。

取對數期A2780-ETA細胞，在96孔細胞培養盤鋪入50 μl的細胞懸液(2×10 ³/孔)，將抗體調配成不同工作濃度的溶液(起始濃度為1000ng/ml，前4個點10倍稀釋，後6個點5倍稀釋，Max及Min孔完全培養基)，每孔加入50 μl，每個藥物濃度三個平行複孔，室溫培育15 min。以10:1的效應目標比每孔加入100 μl CIK細胞(2×10 ⁴/孔)，置於37℃，5% CO ₂培養箱中培育24 h。在Max孔中加入10 μl 1%的Triton X-100，混勻，裂解10 min，離心1000 rpm，5 min，取上清液20 μl/孔至96孔白盤加80 μl水補至100 μl，再加100 μl Nanoluc受質用酶標儀(Molecular Device, SpectraMax L)讀取螢光強度值。根據公式細胞殺傷率%=(RLU _樣品-RLU _Min)/(RLU _Max-RLU _Min)*100計算細胞殺傷效果，以給藥濃度為橫座標，對A2780-ETA細胞的殺傷率為縱座標使用Graphpad軟體進行四參數擬合得到EC50值。

步驟九：NCG小鼠的免疫重建實驗訂購30隻NCG小鼠，將三個不同供體PBMC按照5×10 ⁶及1×10 ⁷個/0.2 mL的量尾靜脈注射至小鼠體內。分別於注射後7、14、21、28、35及42天採集小鼠全血，流式細胞儀偵測血液中CD3、CD8、CD45等免疫重構指標的情況。每週2次對小鼠的體重進行量測，並每天監測動物的健康狀況及死亡情況。選取注射2週後大部分小鼠的CD45+%達至10%以上，且後期監測結果穩定的PBMC供體用於後續藥效學研究。

步驟十：雙特異性抗體對人B淋巴細胞瘤Raji及Raji-ETa異種移植腫瘤模型的活體內藥效學研究 108隻NCG小鼠，按5×10 ⁶個/0.2 mL的量尾靜脈注射PBMC；在PBMC注射七天後，將1×10 ⁷個/0.2 mL的Raji-ETa及Raji細胞於右上背皮下各接種96隻(18隻空白+78隻注射PBMC)及44隻(14隻空白+30隻注射PBMC)。

腫瘤細胞接種後第7天，平均腫瘤體積達至150±50 mm ³左右且CD45+%達至10%以上進行分組給藥，共分8組，按照每兩天一次尾靜脈注射的頻率，0.2 mL/20 g的給藥體積，共給藥6次。空白組及媒劑組給予空白製劑，實驗組按照0.2 mg/kg、1 mg/kg及5 mg/kg的劑量分別給予雙特異性抗體。每天監測動物的健康狀況及死亡情況，例行檢查包括觀察腫瘤細胞對動物日常行為表現的影響如毛髮，行為活動(癱瘓等)，攝食攝水量，體重變化(每週量測2次體重)，外觀體徵或其他不正常情況。實驗中每三天用游標卡尺量測腫瘤直徑。腫瘤體積的計算公式為：V = 0.5a×b ²，a及b分別表示腫瘤的長徑及短徑。實驗結束時，剝瘤、稱重及拍照。化合物的抑瘤療效用相對腫瘤增殖率T/C (%)及腫瘤生長抑制率IR (%)評價，反映腫瘤生長抑制情況。

步驟十一：雙特異性抗體對人卵巢癌細胞A2780-ETa異種移植腫瘤模型的活體內藥效學研究 108隻NCG小鼠，按5×10 ⁶個/0.2 mL的量尾靜脈注射PBMC；在PBMC注射七天後，將1×10 ⁷個/0.1 mL的A2780-ETa細胞於右上背皮下接種108隻。

腫瘤細胞接種後第7天，平均腫瘤體積達至150±50 mm ³左右且CD45+%達至10%以上進行分組給藥，共分6組，按照每週兩次尾靜脈注射的頻率，0.2 mL/20 g的給藥體積，共給藥6次(化學療劑按照每週一次尾靜脈注射的頻率，共給藥3次)。媒劑組給予空白製劑，實驗組按照0.008 mg/kg、0.04 mg/kg及0.2 mg/kg的劑量分別給予雙特異性抗體，藥物聯用按照40 mg/kg+10 mg/kg，0.04 mg/kg+40 mg/kg+10 mg/kg的劑量分別給予雙特異性抗體及化學療劑。每天監測動物的健康狀況及死亡情況，例行檢查包括觀察腫瘤細胞對動物日常行為表現的影響如毛髮，行為活動(癱瘓等)，攝食攝水量，體重變化(每週量測2次體重)，外觀體徵或其他不正常情況。實驗中每三天用游標卡尺量測腫瘤直徑。腫瘤體積的計算公式為：V = 0.5a×b ²，a及b分別表示腫瘤的長徑及短徑。實驗結束時，剝瘤、稱重及拍照。化合物的抑瘤療效用相對腫瘤增殖率T/C (%)及腫瘤生長抑制率IR (%)評價，反映腫瘤生長抑制情況。

以上所述之實施例僅係本文的一種較佳的方案，並非對本文作任何形式上的限制，在不超出申請專利範圍所記載的技術方案的前提下還有其他的變體及改型。

以上實施例的結果顯示，本文的雙特異性抗體，以αETA (L5H5，SEQ NO ID: 19 + SEQ NO ID: 20)/αCD3 (L3H3，SEQ NO ID: 15 + SEQ NO ID: 16)為例，該雙特異性抗體包含一個完整αETA的IgG域及兩個相同αCD3的scFv域，每個αCD3的scFv域之胺基端由一個域間連接子連接αETA的IgG域輕鏈之羧基端，能夠在哺乳細胞表現系統如HEK293或CHO中表現，分子量大小符合預期(圖1)。此等雙特異性抗體具有與人ETA及人CD3結合的能力。圖2、圖3及圖4(實驗步驟五及六)同樣藉由以αETA (L5H5，SEQ NO ID: 19 + SEQ NO ID: 20)/αCD3 (L3H3，SEQ NO ID: 15 + SEQ NO ID: 16)為例，顯示了本文的雙特異性抗體能與CHO-ETA (圖2)、A2780-ETA (圖3)及Jurkat (圖4)細胞結合(EC50分別為2.54 nM、2.37 nM及10.65 nM)，其中CHO-ETA係高表現ETA的細胞株，A2780-ETA係高表現ETA的人卵巢癌細胞株，Jurkat係一個人白血病T細胞，其細胞表面表現了人CD3分子。然後吾人藉由實驗步驟八提供之方法，偵測了αETA/αCD3雙特異性抗體介導的CIK細胞對腫瘤細胞的活體外殺傷試驗。CIK細胞為細胞激素誘導的殺傷型T細胞，其誘導及擴大培養如步驟七中所述，其細胞表面高表現了人CD3分子。Raji-ETA-M及Raji-ETA-H分別為中表現ETA及高表現ETA的Raji細胞，A2780-ETA為高表現ETA的A2780細胞，其構建如步驟四所述。將CIK細胞與腫瘤細胞混合培養，加入不同濃度本文提供的αETA/αCD3雙特異性抗體後，CIK細胞對腫瘤細胞造成殺傷效果。如圖5及圖6所示，在E:T為10:1的情況下，αETA/αCD3雙特異性抗體的半殺傷濃度分別為63.42 ng/mL (Raji)、0.013 ng/mL (Raji-ETA-M)、0.027 ng/mL (Raji-ETA-H)、0.202 ng/mL(A2780-ETA)，其細胞殺傷能力與ETA的表現顯著相關聯。在接下來的實驗中，在一個活體內藥效實驗中，NCG小鼠按照步驟十及步驟十一進行PBMC免疫重構，並將Raji、Raji-ETA-H及A27800-ETa細胞藉由皮下注射接種於免疫重構的NCG小鼠體內，以此小鼠模型偵測αETA/αCD3雙特異性抗體的抗腫瘤生長的能力。如圖7所示，Raji-ETA-H經0.2 mg/kg、1 mg/kg或5 mg/kg αETA/αCD3雙特異性抗體隔天給藥一次的治療後，腫瘤生長得到顯著抑制，其相對腫瘤增殖率分別為37.9%、38.4%及28.3% (P＜0.05)。如圖8所示，Raji細胞本身經5 mg/kg αETA/αCD3雙特異性抗體隔天給藥一次的治療後，其相對腫瘤增殖率為69.5%，與溶劑組相比，無統計學差異(P＞0.05)。如圖9所示，不同濃度αETA/αCD3雙特異性抗體注射能顯著抑制A2780-ETa細胞的生長，表現出良好的劑量效應，且在中劑量時與化學療劑聯用呈現出良好的協同效應。綜上所述，本文的雙特異性抗體分子穩定，並在活體外及活體內均顯示了優越的T細胞依賴性的針對表現ETA的腫瘤細胞的殺傷效果。

圖1：顯示了αETA (L5H5，SEQ NO ID: 19 + SEQ NO ID: 20)/αCD3 (L2H2，SEQ NO ID: 13 + SEQ NO ID: 14)雙特異性抗體的SDS-PAGE圖。#1泳道代表標準蛋白，分子量如圖所示。#2泳道為αETA/αCD3雙特異性抗體，結果顯示其分子量為55Kd左右。圖2：顯示了流動式細胞測量術(FACS)偵測重組表現的αETA (L5H5，SEQ NO ID: 19 + SEQ NO ID: 20)/αCD3 (L3H3，SEQ NO ID: 15 + SEQ NO ID: 16)雙特異性抗體與CHO-ETA細胞的特異性結合曲線。該曲線顯示該αETA/αCD3雙特異型抗體很好地保留αETA針對ETA的親和力。圖3：顯示了流動式細胞測量術(FACS)偵測重組表現的αETA (L5H5，SEQ NO ID: 19 + SEQ NO ID: 20)/αCD3 (L3H3，SEQ NO ID: 15 + SEQ NO ID: 16)雙特異性抗體與A2780-ETA細胞的特異性結合曲線。該曲線顯示該αETA/αCD3雙特異型抗體很好地保留αETA針對ETA的親和力。圖4：顯示了流動式細胞測量術(FACS)偵測重組表現的αETA (L5H5，SEQ NO ID: 19 + SEQ NO ID: 20)/αCD3 (L3H3，SEQ NO ID: 15 + SEQ NO ID: 16)雙特異性抗體與Jurkat細胞的特異性結合曲線，該曲線顯示該αETA/αCD3雙特異型抗體很好地保留αCD3針對CD3的親和力。圖5：顯示了不同濃度的αETA (L5H5，SEQ NO ID: 19 + SEQ NO ID: 20)/αCD3 (L3H3，SEQ NO ID: 15 + SEQ NO ID: 16)雙特異性抗體介導下的CIK對Raji-ETA腫瘤細胞的殺傷曲線，E:T為10:1。Y軸代表細胞殺傷率，X軸代表了抗體的濃度。該結果提示了在E:T為10:1的情況下，CIK對Raji-ETA的殺傷力隨著抗體濃度上升而提昇，成正相關。圖6：顯示了不同濃度的αETA (L5H5，SEQ NO ID: 19 + SEQ NO ID: 20)/αCD3 (L3H3，SEQ NO ID: 15 + SEQ NO ID: 16)雙特異性抗體介導下的CIK對A2780-ETA細胞的殺傷曲線，E:T為10:1。Y軸代表細胞殺傷率，X軸代表了抗體的濃度。該結果提示了在E:T為10:1的情況下，CIK對A2780-ETA細胞的殺傷力隨著抗體濃度上升而提昇，成正相關。圖7：顯示了免疫重建後的NCG小鼠在接受了Raji-ETA腫瘤細胞皮下接種後，在不同的實驗條件下的各自的腫瘤生長情況：空白注射(PBS) (實線)；溶劑對照注射(點線)；0.2 mg/kg的αETA (L5H5，SEQ NO ID: 19 + SEQ NO ID: 20)/αCD3 (L3H3，SEQ NO ID: 15 + SEQ NO ID: 16)雙特異性抗體注射(長虛線)；1 mg/kg的αETA/αCD3雙特異性抗體注射(點虛線)；5 mg/kg的αETA/αCD3雙特異性抗體注射(短虛線)。各組的注射週期均為自荷瘤鼠分組日(第0天)進行第一次注射，之後每兩天注射一次，共六次。結果顯示了不同濃度αETA/αCD3雙特異性抗體注射顯著抑制了Raji-ETA腫瘤細胞的生長。圖8：顯示了免疫重建後的NCG小鼠在接受了Raji腫瘤細胞皮下接種後，在不同的實驗條件下的各自的腫瘤生長情況：空白注射(PBS) (實線)；溶劑對照注射(短虛線)；5 mg/kg的αETA/αCD3雙特異性抗體注射(長虛線)。各組的注射週期均為自荷瘤鼠分組日(第0天)進行第一次注射，之後每兩天注射一次，共六次。結果顯示了不同濃度αETA/αCD3雙特異性抗體注射未能抑制Raji細胞的生長。圖9：顯示了免疫重建後的NCG小鼠在接受了A2780-ETa腫瘤細胞皮下接種後，在不同的實驗條件下的各自的腫瘤生長情況：溶劑對照注射(圓實線)；0.008 mg/kg的αETA/αCD3雙特異性抗體注射(圓虛線)；0.04 mg/kg的αETA/αCD3雙特異性抗體注射(三角實線)；0.2 mg/kg的αETA/αCD3雙特異性抗體注射(三角虛線)；40 mg/kg的卡鉑及10 mg/kg的紫杉醇注射(方框實線)；0.04 mg/kg的αETA/αCD3雙特異性抗體、40 mg/kg的卡鉑及10 mg/kg的紫杉醇注射(方框實線)。各組的注射週期均為自荷瘤鼠分組日(第0天)進行第一次注射，之後每週注射兩次，共六次。結果顯示不同濃度αETA/αCD3雙特異性抗體注射能顯著抑制A2780-ETa細胞的生長，表現出良好的劑量效應，且在中劑量時與化學療劑聯用呈現出良好的協同效應(方框虛線)。


          <![CDATA[<110>  中國大陸商鴻運華寧（杭州）生物醫藥有限公司(GMAX BIOPHARM LLC)]]>
          <![CDATA[<120>  一種能與人ETA和人CD3結合的雙特異性抗體及其應用]]>
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          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
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          Gly Ser Ala Thr Gly Ser 
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          Gly Ser Ala Thr Gly Ser 
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          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  122]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小鼠]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120         
          <![CDATA[<210>  13]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小鼠]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  可突變位置]]>
          <![CDATA[<222>  (87)..(87)]]>
          <![CDATA[<223>  第87位之Xaa可以係Cys或Ser]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 
                      20                  25                  30          
          Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 
                  35                  40                  45              
          Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Xaa Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn 
                      100                 105     
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  119]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小鼠]]>
          <![CDATA[<400>  ]]>14
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 
                  115                 
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  109]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Glu Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 
                  35                  40                  45              
          Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 
                          85                  90                  95      
          Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  125]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 
                      100                 105                 110         
          Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125 
          <![CDATA[<210>  1]]>7
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 
                      20                  25                  30          
          Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 
                  35                  40                  45              
          Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  119]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 
                  115                 
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 
          1               5                   10                  15      
          Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Lys Tyr Ala Ser Lys Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Tyr Ser Phe Pro Trp 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  120]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Gly Leu Gly Val Ala Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 
                  35                  40                  45              
          Trp Leu Ala His Ile Trp Ser Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Tyr Pro Ala 
              50                  55                  60                  
          Leu Lys Asn Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 
          65                  70                  75                  80  
          Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 
                          85                  90                  95      
          Cys Ala His Met Lys Asp Asp Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 
                      20                  25                  30          
          Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 
                  35                  40                  45              
          Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 
              50                  55                  60                  
          Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 
                          85                  90                  95      
          Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  106]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 
          1               5                   10                  15      
          Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 
                      20                  25                  30          
          Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 
                  35                  40                  45              
          Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 
              50                  55                  60                  
          Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 
                          85                  90                  95      
          Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 
                      100                 105     
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  330]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  可突變位置]]>
          <![CDATA[<222>  (116)..(116)]]>
          <![CDATA[<223>  第116位之Xaa可以係Glu或Pro]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  可突變位置]]>
          <![CDATA[<222>  (117)..(117)]]>
          <![CDATA[<223>  第117位之Xaa可以係Leu或Val]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  可突變位置]]>
          <![CDATA[<222>  (118)..(118)]]>
          <![CDATA[<223>  第118位之Xaa可以係Leu或Ala]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  可突變位置]]>
          <![CDATA[<222>  (133)..(133)]]>
          <![CDATA[<223>  第133位之Xaa可以係Gln或者Thr]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  可突變位置]]>
          <![CDATA[<222>  (180)..(180)]]>
          <![CDATA[<223>  第180位之Xaa可以係Asn或者Ala]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  可突變位置]]>
          <![CDATA[<222>  (216)..(216)]]>
          <![CDATA[<223>  第216位之Xaa可以係Glu或者Ala]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  可突變位置]]>
          <![CDATA[<222>  (311)..(311)]]>
          <![CDATA[<223>  第311位之Xaa可以係Met或者Leu]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  可突變位置]]>
          <![CDATA[<222>  (330)..(330)]]>
          <![CDATA[<223>  第330位之Xaa可以係Lys或者缺失]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
                  115                 120                 125             
          Lys Pro Lys Asp Xaa Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
              130                 135                 140                 
          Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 
                          165                 170                 175     
          Glu Gln Tyr Xaa Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 
                      180                 185                 190         
          His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Xaa Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 
              210                 215                 220                 
          Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
                          245                 250                 255     
          Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
                      260                 265                 270         
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
                  275                 280                 285             
          Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
              290                 295                 300                 
          Val Phe Ser Cys Ser Val Xaa His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa 
                          325                 330 
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  326]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  可突變位置]]>
          <![CDATA[<222>  (147)..(147)]]>
          <![CDATA[<223>  第147位之Xaa可以係His或Gln；]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  可突變位置]]>
          <![CDATA[<222>  (176)..(176)]]>
          <![CDATA[<223>  第176位之Xaa可以係Asn或Ala；]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  可突變位置]]>
          <![CDATA[<222>  (188)..(188)]]>
          <![CDATA[<223>  第188位之Xaa可以係Val或Leu；]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  可突變位置]]>
          <![CDATA[<222>  (209)..(209)]]>
          <![CDATA[<223>  第209位之Xaa可以係Ala或Ser；]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  可突變位置]]>
          <![CDATA[<222>  (210)..(210)]]>
          <![CDATA[<223>  第210位之Xaa可以係Pro或Ser；]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  可突變位置]]>
          <![CDATA[<222>  (326)..(326)]]>
          <![CDATA[<223>  第326位之Xaa可以係Lys或者缺失]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 
                      100                 105                 110         
          Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 
                  115                 120                 125             
          Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 
              130                 135                 140                 
          Val Ser Xaa Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Xaa 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Xaa His Gln Asp Trp 
                      180                 185                 190         
          Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 
                  195                 200                 205             
          Xaa Xaa Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 
              210                 215                 220                 
          Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 
                          245                 250                 255     
          Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 
                      260                 265                 270         
          Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 
                  275                 280                 285             
          Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 
              290                 295                 300                 
          Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Leu Ser Pro Gly Xaa 
                          325       
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  327]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  可突變位置]]>
          <![CDATA[<222>  (327)..(327)]]>
          <![CDATA[<223]]>>  第327位之Xaa可以係Lys或者缺失]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;400&gt;  25]]&gt;
          <br/><![CDATA[Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 
                      100                 105                 110         
          Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 
                  115                 120                 125             
          Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 
              130                 135                 140                 
          Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 
                          165                 170                 175     
          Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 
                      180                 185                 190         
          Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 
              210                 215                 220                 
          Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 
                          245                 250                 255     
          Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 
                      260                 265                 270         
          Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 
                  275                 280                 285             
          Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 
              290                 295                 300                 
          Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Ser Leu Ser Leu Gly Xaa 
                          325         
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  326]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 
                      100                 105                 110         
          Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 
                  115                 120                 125             
          Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 
              130                 135                 140                 
          Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 
                          165                 170                 175     
          Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 
                      180                 185                 190         
          Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 
              210                 215                 220                 
          Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 
                          245                 250                 255     
          Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 
                      260                 265                 270         
          Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 
                  275                 280                 285             
          Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 
              290                 295                 300                 
          Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Ser Leu Ser Leu Gly 
                          325      
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 
                      20                  25                  30          
          Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 
                  35                  40                  45              
          Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 
              50                  55                  60                  
          Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 
                          85                  90                  95      
          Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Ala Gly Glu Cys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ala Ser Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Gly Ser Ala Thr Gly Ser 
                      20

Claims

一種能夠與人ETA及人CD3結合的雙特異性抗體，其結構特徵在於：上述雙特異性抗體包含兩個單鏈抗體域(scFv域)、一個完整的免疫球蛋白G域(IgG)及兩個域間肽連接子序列(Link ₁)，此三者藉由以下方式中之一種融合形成上述雙特異性抗體： a. 藉由域間肽連接子序列將scFv之羧基端及IgG輕鏈之胺基端連接：N'-scFv-Link ₁-V _L-C _L-C'； b. 藉由域間肽連接子序列將scFv之胺基端及IgG輕鏈之羧基端連接：N'-V _L-C _L-Link ₁-scFv-C'； c. 藉由域間肽連接子序列將scFv之羧基端及IgG重鏈之胺基端連接：N'-scFv-Link ₁-V _H-C _H1-C _H2-C _H3-C'；及 d. 藉由域間肽連接子序列將scFv之胺基端及IgG重鏈之羧基端連接：N'-V _H-C _H1-C _H2-C _H3-Link ₁-scFv-C'；其中：N'代表多肽鏈之胺基端，C'代表多肽鏈之羧基端，scFv代表單鏈抗體域，IgG代表免疫球蛋白G域，V _L代表免疫球蛋白G域之輕鏈可變區，C _L代表免疫球蛋白G域之輕鏈恆定區，V _H代表免疫球蛋白G域之重鏈可變區，C _H1代表免疫球蛋白G域之重鏈恆定區1，C _H2代表免疫球蛋白G域之重鏈恆定區2，C _H3代表免疫球蛋白G域之重鏈恆定區3，及Link ₁代表域間肽連接子。
如請求項1之雙特異性抗體，其中上述域間肽連接子(Link ₁)之序列選自以下序列之一：SEQ NO ID: 1、SEQ NO ID: 2、SEQ NO ID: 3、SEQ NO ID: 4、SEQ NO ID: 5及SEQ NO ID: 28。
如請求項1或2之雙特異性抗體，其中上述scFv域包含輕鏈可變區、重鏈可變區及域內肽連接子序列，此三者藉由以下方式中之一種組合形成scFv域： a. 藉由域內肽連接子序列將輕鏈可變區之羧基端及重鏈可變區之胺基端連接：N'-V _SL-Link ₂-V _SH-C'；及 b. 藉由域內肽連接子序列將重鏈可變區之羧基端及輕鏈可變區之胺基端連接：N'-V _SH-Link ₂-V _SL-C'；其中：N'代表多肽鏈之胺基端，C'代表多肽鏈之羧基端，V _SL代表scFv域之輕鏈可變區，V _SH代表scFv域之重鏈可變區，及Link ₂代表域內肽連接子。
如請求項3之雙特異性抗體，其中上述域內肽連接子(Link ₂)之序列選自以下序列之一：SEQ NO ID: 6、SEQ NO ID: 7、SEQ NO ID: 8、SEQ NO ID: 9、及SEQ NO ID: 10。
如請求項1至4中任一項之雙特異性抗體，其中上述scFv域包含以下方案之一的胺基酸序列： a. scFv域之輕鏈可變區序列選自以下序列之一：SEQ NO ID: 11、SEQ NO ID: 13、SEQ NO ID: 15及SEQ NO ID: 17； b. scFv域之重鏈可變區序列選自以下序列之一：SEQ NO ID: 12、SEQ NO ID: 14、SEQ NO ID: 16、及SEQ NO ID: 18；及 c. (a)之輕鏈可變區序列及(b)之重鏈可變區序列之組合。
如請求項5之雙特異性抗體，其中上述抗體的scFv域包含以下方案之一的胺基酸序列組合方式：SEQ NO ID: 11與SEQ NO ID: 12之組合(L1H1)、SEQ NO ID: 13與SEQ NO ID: 14之組合(L2L2)、SEQ NO ID: 15與SEQ NO ID: 16之組合(L3H3)、及SEQ NO ID: 17與SEQ NO ID: 18之組合(L4H4)。
如請求項1至6中任一項之雙特異性抗體，其中上述抗體的IgG域包含以下方案之一的胺基酸序列： a. IgG域之輕鏈可變區序列選自以下序列：SEQ NO ID: 19； b. IgG域之重鏈可變區序列選自以下序列：SEQ NO ID: 20及 c. (a)之輕鏈可變區序列及(b)之重鏈可變區序列之組合。
如請求項7之雙特異性抗體，其中上述抗體的IgG域包含以下方案之胺基酸序列組合方式：SEQ NO ID: 19與SEQ NO ID: 20之組合(L5H5)。
如請求項1至8中任一項之雙特異性抗體，其中上述scFv域包含以下方案之一的胺基酸序列： a. scFv域之輕鏈可變區序列選自以下序列：SEQ NO ID: 19； b. scFv域之重鏈可變區序列選自以下序列：SEQ NO ID: 20及 c. (a)之輕鏈可變區序列及(b)之重鏈可變區序列之組合。
如請求項9之雙特異性抗體，其中上述抗體的scFv域包含以下方案之胺基酸序列組合方式：SEQ NO ID: 19與SEQ NO ID: 20之組合(L5H5)。
如請求項1至10中任一項之雙特異性抗體，其中上述抗體的IgG域包含以下方案之一的胺基酸序列： a. IgG域之輕鏈可變區序列選自以下序列之一：SEQ NO ID: 11、SEQ NO ID: 13、SEQ NO ID: 15、及SEQ NO ID: 17； b. IgG域之重鏈可變區序列選自以下序列之一：SEQ NO ID: 12、SEQ NO ID: 14、SEQ NO ID: 16、及SEQ NO ID: 18；及 c. (a)之輕鏈可變區序列及(b)之重鏈可變區序列之組合。
如請求項11之雙特異性抗體，其中上述抗體的IgG域包含以下方案之一的胺基酸序列組合方式：SEQ NO ID: 11與SEQ NO ID: 12之組合(L1H1)、SEQ NO ID: 13與SEQ NO ID: 14之組合(L2L2)、SEQ NO ID: 15與SEQ NO ID: 16之組合(L3H3)、及SEQ NO ID: 17與SEQ NO ID: 18之組合(L4H4)。
如請求項1至12中任一項之雙特異性抗體，其中上述抗體的抗體蛋白質序列包含： a. IgG域之輕鏈可變區序列：SEQ NO ID: 19； b. IgG域之重鏈可變區序列：SEQ NO ID: 20； c. scFv域之輕鏈可變區序列：SEQ NO ID: 15； d. scFv域之重鏈可變區序列：SEQ NO ID: 16。
如請求項1至13中任一項之雙特異性抗體，其中上述抗體蛋白質的IgG分子進一步包含以下方案之一的胺基酸序列： a. 選自以下序列之一的輕鏈恆定區胺基酸序列：SEQ NO ID: 21、SEQ NO ID: 22及SEQ NO ID: 27； b. 選自以下序列之一的重鏈恆定區胺基酸序列：SEQ NO ID: 23、SEQ NO ID: 24、SEQ NO ID: 25及SEQ NO ID: 26； c. (a)之輕鏈恆定區序列及(b)之重鏈恆定區序列之組合。
如請求項1至14中任一項之雙特異性抗體，其中上述雙特異性抗體係一種能夠與人ETA及人CD3結合的雙特異性抗體。
如請求項1至15中任一項之雙特異性抗體，其中上述雙特異性抗體係鼠源抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單株抗體、重組抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體、或IgG4抗體。
一種多核苷酸，其編碼如請求項1至16中任一項之雙特異性抗體。
一種載體，其包含如請求項17之多核苷酸。
一種宿主細胞，其包含如請求項18之載體。
一種醫藥組合物，其包含與醫藥學上可接受之載體混合的如請求項1至16中任一項之雙特異性抗體。
一種如請求項1至16中任一項之雙特異性抗體在製備用於預防或治療具有ETA高表現特徵之癌症的藥物中之用途。
一種如請求項1至16中任一項之雙特異性抗體在製備用於預防或治療具有ETA高表現卵巢癌的藥物中之用途。
一種如請求項1至16中任一項之雙特異性抗體在製備用於預防或治療具有ETA高表現乳腺癌的藥物中之用途。
一種如請求項1至16中任一項之雙特異性抗體在製備用於預防或治療具有ETA高表現黑色素瘤的藥物中之用途。
一種如請求項1至16中任一項之雙特異性抗體在製備用於預防或治療具有ETA高表現特徵之癌症的藥物中之用途，其中上述癌症包含但不僅限於食管癌、肺癌、頭頸癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌等。