CN109306013A - 抗cd20抗原的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种抗CD20抗原的嵌合抗原受体及其应用。抗CD20抗原的嵌合抗原受体，其特征在于，由识别CD20抗原的多肽(scFv)，铰链区，跨膜区和胞内信号域依次连接组成；所述识别CD20抗原的多肽(scFv)的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。本发明提供的抗CD20抗原的嵌合抗原受体在免疫细胞中表达后，可以有效的清除表达CD20抗原的肿瘤靶细胞，能维持靶向CD20分子通过结合细胞表面的CD20分子达到杀灭B淋巴细胞的效果并且能够加强CAR‑T的增殖和杀伤肿瘤的能力，并且对抗原阴性的细胞无毒副作用，能够用于肿瘤的靶向治疗。

Description

抗CD20抗原的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及抗CD20抗原的嵌合抗原受体及其应用，还涉及包含抗CD20抗原的嵌合抗原受体的慢病毒载体和应用。
背景技术
慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)是一种成熟B淋巴细胞克隆增殖性肿瘤，以淋巴细胞在外周血、骨髓、脾脏和淋巴结聚集为特征。许多高危患者治疗时容易复发、并且治疗存在一定的困难。
非霍奇金淋巴瘤(NHL)是具有很强异质性的一组独立疾病的总称，在常见恶性肿瘤排位中在前10位以内。目前发病率在不同年龄阶段呈明显上升的趋势。
CD20抗原是一种B细胞分化抗原，仅位于前B细胞和成熟B细胞，它在95％以上的B细胞性淋巴瘤中表达，而在造血干细胞、血浆细胞和其他正常组织中不表达，成为治疗淋巴细胞肿瘤的理想靶点。目前临床上常用利妥昔与一线化疗药联合的方式治疗非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病。利妥昔单抗是靶向CD20分子通过结合细胞表面的CD20分子达到杀灭B淋巴细胞的单克隆抗体。虽然利妥昔单抗是治疗非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病的非常有效的药物，然而大多数患者经过药物治疗后依然会复发，因此临床上亟需新型药物进一步改善临床治疗效果，特别是老年患者、并发症较多的患者和细胞遗传学特征不良的患者，更加需要新型药物改善疗效。
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)是模拟TCR功能的人工受体，包括一个肿瘤相关抗原结合区、一个胞外间隔区、一个跨膜区和一个胞内信号区。胞内信号域通常为CD3ζ链或FcRγ，或与一种或多种共刺激分子相连，如4-1BB(CD137)，CD28，ICOS(CD278)。肿瘤细胞表面的抗原(受体)与嵌合抗原受体的单链抗体(配体)结合时，通过铰链区和跨膜区将信号传递至胞内，胞内信号域将信号转化为活化信号，激活效应细胞，效应细胞增殖、产生细胞因子从而杀伤肿瘤细胞。
利妥昔虽然能够一定效果的清除表达CD20的B淋巴细胞，但是其在体内半衰期短，药物需求量大，并且很多患者最终会产生耐药。是否可以利用利妥昔靶向CD20阳性血液病的特异性，对利妥昔单抗的多肽结构进行嵌合抗原受体(CAR)改造，得到安全有效的靶向CD20的CAR-T细胞目前并未有研究报道，而是否利妥昔是组合识别CD20单抗中最佳的组合CAR的多肽也需要进一步验证。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗CD20抗原的嵌合抗原受体，本发明抗CD20抗原的嵌合抗原受体能够更稳定的表达于T淋巴细胞，能更好的清除表达CD20抗原的肿瘤靶细胞。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
抗CD20抗原的嵌合抗原受体，其特征在于，由识别CD20抗原的多肽(scFv)，铰链区，跨膜区和胞内信号域依次连接组成；所述识别CD20抗原的多肽(scFv)的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
所述识别CD20抗原的多肽(scFv)的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示或将所述识别CD20抗原的多肽(scFv)经过改造后得到的氨基酸序列。所述识别CD20抗原的多肽(scFv)的改造方法为将识别CD20抗原的多肽(scFv)的CDR植入人源框架的可变区，再通过多位或单位随机突变的方式获得识别CD20的人源化多肽。
单链抗体(Single-chain variable fragment(scFv))是由抗体的可变区(VH和VL区)通过15-20个氨基酸的短肽(Linker)连接而成，scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性，并具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。
Linker连接单链抗体重链和轻链的的方式为VH-Linker-VL或者VL-Linker-VH两种方式。Linker的选择可能会影响单链抗体的稳定性以及聚集度。前最常用的Linker为以氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)连接形成的GGGGS为单位，一个或多个单位连接形成，发明人通过前期探索发现本专利所述抗CD20抗原的单链抗体(ScFv)以VL-Linker-VH连接方式连接能够更好的保持单链抗体的稳定性。所述Linker氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示。
所述的嵌合抗原受体需要逾越两个技术障碍，一是寻找更稳定有效的识别CD20抗原的scFV，二是寻找最佳的CAR的组合方案。
进行嵌合抗原受体改造的原因是目前一线的治疗非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病均采用利妥昔与一线化疗药联合的方式进行。利妥昔虽然能够消灭表达CD20的B淋巴细胞，但是其在体内半衰期短，药物需求量大，并且很多患者最终会产生耐药。利用利妥昔靶向CD20阳性血液病的特异性，对利妥昔单抗的多肽结构进行嵌合抗原受体(CAR)改造，以制备新型药物进一步改善临床治疗效果，特别是老年患者、并发症较多的患者和细胞遗传学特征不良的患者，更加需要新型药物改善疗效。
本发明提供了利妥昔的新的改造方案和应用。利妥昔是否适合改造为CAR，是否有比利妥昔更适合的抗体的scFV可以构建CAR以及如何构建最优的CAR的组合方式，是一个难题。发明人团队在未有更有效的技术提示的情况下通过一系列改造试验再经过不同的组合方式构建CAR(嵌合抗原受体)进行筛选，选择了三种针对CD20的单克隆抗体分别设计改造为单链抗体(scFV)分别命名为R-scFV，A-scFV，U-scFV，其中R-scFV即为利妥昔改造的单链抗体，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示；利用改造的scFV进行CAR的组合，分别命名CD20R，CD20A，CD20U，筛选出利妥昔来源的R-scFV组合的CAR能够更好的发挥功能；进一步利用利妥昔来源的R-scFV与多种CAR的组合方式结合，确认最佳的CD20-CAR组合。
所述R-scFV的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述A-scFV的核酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述U-scFV的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
针对R-scFV进一步进行了人源化改造获得了4条人源化改造多肽：20C1、20C2、20C3、20C4，这四条多肽相较于利妥昔人源化程度高，稳定性好，用于CAR组合或者其他针对CD20靶点的治疗更有优势。
所述人源化多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.20所示。所述人源化多肽的核酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.7所示。
进一步，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示。
进一步，所述跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示。
进一步，所述胞内信号域为CD28和/或CD137和/或CD3；所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:25，所述CD137的氨基酸序列如SEQ ID NO:26，所述CD3的氨基酸序列如SEQ IDNO:27。
作为一种优选，所述人源化多肽组合的抗CD20的嵌合抗原受体氨基酸序列由如SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.20与SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27序列依次串联而成。
作为一种优选，所述人源化多肽组合的抗CD20的嵌合抗原受体氨基酸序列由如SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.20与SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27序列依次串联而成。
作为一种优选，所述人源化多肽组合的抗CD20的嵌合抗原受体氨基酸序列由如SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.20与SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27序列依次串联而成。
作为一种优选，所述人源化多肽组合的抗CD20的嵌合抗原受体氨基酸序列由如SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.20与SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:25和SEQ ID NO:27序列依次串联而成。
作为一种优选，所述人源化多肽组合的抗CD20的嵌合抗原受体氨基酸序列由如SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.20与SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27序列依次串联而成。
作为一种优选，所述人源化多肽组合的抗CD20的嵌合抗原受体氨基酸序列由如SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.20与SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27序列依次串联而成。
嵌合抗原受体细胞较单纯的抗体更具有治疗优势：(1)放大效应：CAR-T细胞在体内被激活后除了通过scFV区产生类似抗体的作用外，还会通过胞内信号将刺激作用层层放大进而达到更有效的清除肿瘤的作用；(2)耐受性好：因为更接近于体内天然的对抗肿瘤的方式，被转染的T细胞来源于病人自身，产生的耐药性远低于抗体治疗。
筛选最佳的嵌合抗原受体组合的方法，是保持抗原识别序列不变，对铰链区，跨膜区以及包内信号域进行随机组合；或者是保持铰链区，跨膜区以及包内信号域不变，筛选不同的抗原识别序列(scFV)。方法的结果存在随机性，只有在配置得当的情况下，其亲和力才有可能和原有小鼠抗体的亲和力相当。
进一步，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列由SEQ ID NO.14、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27序列依次串联而成。
本部分保护的CAR的组合方式，经过测试之后，可以起到稳定表达于病人来源的T淋巴细胞，并且具有更好的清除肿瘤细胞的能力。
本发明的目的之二在于提供一种所述的嵌合抗原受体的慢病毒载体的制备方法，包括以下步骤：
1)合成抗CD20抗原的嵌合抗原受体的嵌合抗原受体的基因序列：合成依次含前导肽、抗人抗CD20抗原的不同的单链抗体(ScFv)、铰链区、跨膜区和胞内信号域；所述铰链区核酸序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:8、跨膜区核酸序列如SEQ ID NO:10或31、胞内信号域核酸序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；
2)构建表达嵌合抗原受体的慢病毒载体：设计引物，正向引物的核苷酸序列如SEQID NO:29所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示，以所述嵌合抗原受体的序列为模板进行PCR扩增，得DNA片段；
将所述DNA片段的基因序列用限制性内切酶NheI和SalI双酶切，同时用限制性内切酶NheI和SalI酶切慢病毒表达载体pCDH-CAG，然后将酶切后的目的片段和慢病毒表达载体片段通过T4连接酶进行连接，获得表达嵌合抗原受体的慢病毒载体。
进一步，所述的制备方法在步骤2)之后，包装并纯化所述慢病毒载体。
本发明的目的之三在于提供一种所述的制备方法所得的慢病毒载体。
在所述的方法下得到所述的慢病毒载体，这样的慢病毒载体的阳性表达率高，在病人细胞培养过程中很稳定。用所述慢病毒载体感染的T细胞，这样的T细胞具备杀伤靶细胞的功能。
本发明的目的还在于提供一种所述的慢病毒载体感染的T细胞。
本发明的目的还在于提供一种所述的T细胞在用于制备B细胞淋巴瘤的药物中的应用。
进一步，所述B细胞淋巴瘤的细胞或组织能够表达CD20。
进一步，所述B细胞淋巴瘤包括非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。
另外，回到发明的起源端，本发明的目的还在于提供一种所述识别CD20抗原的多肽(scFv)的氨基酸序列在用于制备治疗B细胞淋巴瘤的药物中的应用。所述识别CD20抗原的多肽(scFv)的氨基酸序列如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18或SEQ IDNO:19或SEQ ID NO:20所示。
进一步，所述的B细胞淋巴瘤的细胞能够表达CD20。
本发明的目的还在于提供一种所述识别CD20抗原的多肽(scFv)的氨基酸序列在用于制备精准捕获能够表达CD20的B细胞淋巴瘤细胞的载体中的应用。所述识别CD20抗原的多肽(scFv)的氨基酸序列如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18或SEQ IDNO:19或SEQ ID NO:20所示。
本发明的目的还在于提供一种如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列在制备CAR-T骨架中的抗原识别域的应用。
总的来说，本发明所述的嵌合抗原受体在免疫细胞中表达后，不仅能维持靶向CD20分子通过结合细胞表面的CD20分子达到杀灭B淋巴细胞效果并且能够加强CAR-T的增殖和杀伤肿瘤的能力，并且对抗原阴性的细胞无毒副作用，能够用于肿瘤的靶向治疗。
本发明的有益效果在于：
1)本发明提供的抗CD20抗原的嵌合抗原受体在免疫细胞中表达后，可以有效的清除表达CD20抗原的肿瘤靶细胞，能维持靶向CD20分子通过结合细胞表面的CD20分子达到杀灭B淋巴细胞的效果并且能够加强CAR-T的增殖和杀伤肿瘤的能力，并且对抗原阴性的细胞无毒副作用，能够用于肿瘤的靶向治疗。
2)本发明提供的通过改造的嵌合抗原受体人源化程度高，可以有效地降低CAR的免疫原性，增强CAR-T在体内的持续和安全性，降低肿瘤的复发几率。
附图说明
图1为不同CD20-CAR结构图。
图2为不同肿瘤细胞CD20表达图。
图3为不同CAR-T细胞杀伤能力检测。
图4为不同CAR-T细胞杀伤靶细胞后细胞因子释放。
图5为人源化多肽表达检测。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本部分实验通过对“现有技术”中的三种不同的单克隆抗体(表位肽不同)进行单链抗体的改造，将改造的单链抗体用于制备嵌合抗原受体，并对嵌合抗原受体进行功能验证试验。通过本部分的实验得出结论：虽然理论上“单链抗体”可以用于制备嵌合抗原受体，但实际并不是每一单链抗体都可以用于制备嵌合抗原受体。这需要发明人付出创造性的劳动，才能在众多的改造的单链抗体中找到具有预料不到的效果的产品。
实施例1含有CD20scFV的嵌合抗原受体病毒的构建
为了构建更有效的针对CD20的嵌合抗原受体我们利用三株鼠源抗体构建其scFV设计了CD20R，CD20A，CD20U以及CD20R3-8h，CD20R2-8h，CD20R3-G4h，CD20R2-G4h七组CAR结构，如图1所示。
1合成含有不同scFV的靶向CD20的嵌合抗原受体的基因序列
合成依次含抗人CD20抗原的不同的单链抗体ScFv，IgG4或人CD8铰链区(又称hinge区)、CD28跨膜区(简称为TM)，CD28和/或CD137和CD3共刺激信号组合而成的嵌合抗原受体，其结构如图1所示。
2构建表达嵌合抗原受体的慢病毒载体
设计如下引物，并将其由南京金斯瑞生物科技公司合成，具体引物如下：
引物1：5’-atcgctagcatggccctgccagtgaccgcc-3’，下划线为NheI限制性内切酶位点；
引物2：5’-ccaggtcgacttagcgagggggcagggcctg-3’，下划线为SalI限制性内切酶位点。
然后以上述所示序列为引物，上述合成的各嵌合抗原受体序列为模板进行PCR扩增，反应体系按KOD FX NEO DNA聚合酶(购自TOYOBO公司)说明书加样，将扩增产物回收获得嵌合抗原受体DNA片段，将DNA回收片段送南京金斯瑞生物科技公司测序。
分别用限制性内切酶NheI和SalI(购自Thermo公司)双酶切克隆获得的编码嵌合抗原受体的基因序列和慢病毒表达载体pCDH-CAG(购至addgene Plasmid)，酶切反应按说明书进行。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后进行DNA片段回收，然后将目的片段和载体片段通过T4连接酶(购自Promega公司)进行连接，获得表达嵌合抗原受体的慢病毒载体。大肠杆菌表达后用质粒抽提试剂盒(Invitrogen公司)抽提质粒，具体方法见说明书。
3慢病毒的包装
本实施例包装慢病毒采用磷酸钙法，具体步骤见分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)。
4慢病毒的纯化
将病毒上清收集后，3000r/min离心10min；上清过滤并移至新的50ml离心管；根据病毒上清量，分别加入PEG6000和4M NaCl，再用医用盐水定容至PEG6000终浓度为8.5％，NaCl终浓度为0.3M，定溶后于4℃冰箱静置90min；然后于4℃、5000r/min条件下离心30min，弃尽上清，200μl培养基重悬病毒，分装，-80℃保存备用。制得病毒分别命名为：
CD20R，CD20A，CD20U以及CD20R3-8h，CD20R2-8h，CD20R3-G4h，CD20R2-G4h
5慢病毒滴度测定
1)病毒感染293T细胞：感染前将293T细胞以铺24孔板中，向每孔细胞中加入1μl聚凝胺(Polybrene)溶液，然后将1μl和9μl稀释后的病毒液分别加到293T细胞中，24h后用新鲜培养基换液，感染72h后于1000r/min条件下离心5min以收集细胞，抽提基因组。
2)抽提基因组：基因组抽提试剂盒为QIAamp DNA Blood Mini Kit购于Qiagen公司(货号511004)，按试剂盒说明书操作。
3)qRT-PCR测定病毒滴度：反应体系如下：Premix Ex TaqTM II(2×)10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，抽提的基因组1μl，RNase-Free dH2O 7μl。然后按如下程序进行扩增：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，反应结束后，用分析软件分析数据，根据标准曲线计算病毒滴度。计算结果显示，病毒滴度为1×108TU/ml。
实施例2不同肿瘤细胞CD20表达
培养至10天的肿瘤细胞Raji-Luc，Ramos-Luc，K562-Luc分别收集到10ml离心管，300g/min，离心5min，弃尽上清以收集细胞；用含有体积分数1％胎牛血清的PBS溶液重悬细胞，将收集的细胞分装，每管100μl，向每管细胞中加入5μl的PE-CD20抗体(BD公司)，4℃孵育30min，PBS溶液洗涤2次，上流式细胞仪进行检测。
结果如图2所示，Raji-Luc和Ramos-Luc为高表达CD20阳性细胞，K562-Luc为CD20阴性细胞，不表达CD20。
实施例3 CAR转染T细胞能力以及CAR-T细胞杀伤能力检测
一、CD20-CAR转染T淋巴细胞能力检测
1人外周血单核细胞的分离
用加有抗凝剂的采血管采集外周血约60ml，分装于50ml离心管，加入7.5ml羟乙基淀粉稀释；室温自然沉降约30min，收集上层血浆离心；然后用生理盐水重悬沉淀，按体积比为1:1加到淋巴细胞分离液上，梯度离心；离心后，取第二层白色淋巴细胞层，并用生理盐水洗涤2次，获得PBMC细胞，加入含有10％FBS的RPMI 1640完全培养基培养。
2慢病毒载体感染T淋巴细胞
步骤1获得的单个核细胞PBMC，第1天加入抗CD3单克隆抗体活化；前3天进行慢病毒感染；加入5MOI对应的慢病毒载体，未感染的T淋巴细胞作为空白对照；24h后将培养基更换为含有500IU/ml重组人IL-2的RPMI 1640完全培养基，继续培养10-20天。
在培养过程中对培养至10天的已感染病毒的T细胞，300g/min，离心5min，弃尽上清以收集细胞；用含有体积分数1％胎牛血清的PBS溶液重悬细胞，并将细胞调整密度为1×106个/ml；将收集的细胞分装最终标记Protein-L，4℃孵育30min，PBS溶液洗涤2次，上流式细胞仪进行检测CD20-CAR在T淋巴细胞表达阳性率。
除CD20U转染T淋巴细胞阳性率低，其他CD20-CAR均可以较好的表达于T细胞表面。实验结果如表1统计：
表1：CD20-CAR转染T细胞能力统计
CD4(％) CD8(％) PL(％)(10d) 细胞活力(％)
CD20R 39.3 60.7 68.21 96
CD20A 27.4 72.6 70.68 88
CD20U 52.2 47.8 5.39 90
CD20R3-8h 31.50 68.50 68.21 83
CD20R2-8h 18.75 81.15 72.90 89
CD20R3-G4h 33.48 66.52 76.24 90
CD20R2-G4h 19.45 80.55 54.17 92
con 22.18 77.82 0.49 95
二、病毒感染CAR-T细胞对肿瘤细胞杀伤能力的影响
96孔板铺板，标记有萤火虫荧光素酶表达CD20的肿瘤细胞(Raji-Luc或Ramos-Luc)1*104每孔铺板，以效靶比5:1或1:1或1:16铺效应细胞(CAR-T细胞)，37度细胞培养箱分别共培养后检测CD20-CAR-T细胞对靶细胞的杀伤能力。结果如图3A所示：效靶比1:1时CD20R对肿瘤细胞具有高的杀伤活性；图3B所示：效靶比5：1和效靶比1:1杀伤6小时CD20R3-8h具有更好的杀伤活性和特异性；图3C所示为低效靶比1:16时不同时间CD20-CAR-T细胞杀伤高表达CD20肿瘤细胞的能力，结果显示低效靶比长期情况下CD20R3-G4h具有更好的杀伤活性和特异性，表2为图3C杀伤结果的统计数据。
表2：CD20-CAR-T细胞低效靶比不同时间点杀伤能力统计
CD20R3-8h CD20R2-8h CD20R3-G4h CD20R2-G4h
24h 16.32％ 9.86％ 8.98％ 6.53％
48h 30.27％ 28.42％ 28.49％ 24.47％
72h 53.30％ 52.84％ 66.02％ 33.39％
实施例4不同CAR-T细胞杀伤靶细胞后细胞因子释放
细胞因子IFN-γ检测使用BD公司ELISA试剂盒进行。检测试剂盒货号：555142，生产批号6266958，具体步骤见试剂盒说明书。
细胞因子IL-2检测试剂盒：Human IL-2ELISA，EBioscience，试剂盒货号：88702588，生产批号：4315964，具体步骤见试剂盒说明书。
测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加终止液后15分钟以内进行。
结果如图4A显示CD20R3-8h被靶细胞激活后有高的IFN-g分泌，如图4B显示CD20R3-G4h被靶细胞激活后有高的IL-2分泌。
实施例5 CD20-CAR-T细胞在无外源细胞因子刺激下被表达CD20靶细胞激活后T细胞亚群的比例
培养11天的CD20-CAR-T细胞300g/min，离心5min，弃尽上清后用1ml PBS重悬，重复本步骤两次后，标记CD3，CD4，CD8，CD45RA，CD62L(BD公司)以及Protein-L(北京义翘神州公司)的流式检测抗体四度孵育30分钟，PBS洗涤3次，再加入AF647标记的小鼠抗Protein-L抗体(南京金斯瑞公司)，四度孵育30分钟PBS洗涤两次，200ul PBS重悬标记好的细胞后进行流式检测结果表3所示。
表3：CAR-T细胞活化增殖表型检测
实施例6人源化抗CD20单链抗体表达检测
1)人源化单链抗体设计：改造多肽的方法，是通过检索人源框架库获得与鼠源框架相似度在60％以上的框架序列，将鼠源CDR(可变区)植入人源框架的可变区形成人源化抗体，再通过多位或单位定点突变的方式对人源化FR区(恒定区)进行突变以影响人源化抗体的稳定性和抗原识别活性。
2)携带人源化单链抗体慢病毒载体构建：参见实施例1。
3)获得稳定表达抗CD20单链抗体的细胞株命所产生的抗CD20单链抗体命名为20C。
4)Western blot检测20C的表达。
结果如图5所示：获得的人源化抗CD20单链抗体能够被检测到。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
<110> 重庆精准生物技术有限公司
<120> 抗CD20抗原的嵌合抗原受体及其应用
<160> 31
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 738
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> R-scFV
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atgacctgcc gggccagcag cagcgtgagc tacatccact ggttccagca gaagcccggc 120
agcagcccca agccctggat ctacgccacc agcaacctgg ccagcggcgt gcccgtgcgg 180
ttcagcggca gcggcagcgg caccagctac agcctgacca tcagccgggt ggaggccgag 240
gacgccgcca cctactactg ccagcagtgg accagcaacc cccccacctt cggcggcggc 300
accaagctgg agatcaagcg gggctcaact agcgggtccg gaaaaccagg ctctggggaa 360
ggaagtacaa agggacaggt gcagctgcag cagcccggcg ccgagctggt gaagcccggc 420
gccagcgtga agatgagctg caaggccagc ggctacacct tcaccagcta caacatgcac 480
tgggtgaagc agacccccgg ccggggcctg gagtggatcg gcgccatcta ccccggcaac 540
ggcgacacca gctacaacca gaagttcaag ggcaaggcca ccctgaccgc cgacaagagc 600
agcagcaccg cctacatgca gctgagcagc ctgaccagcg aggacagcgc cgtgtactac 660
tgcgcccgga gcacctacta cggcggcgac tggtacttca acgtgtgggg cgccggcacc 720
accgtgaccg tgagcgcc 738
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<212> DNA
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<223> A-scFV
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gacattcagc tgacccagtc tccagcaatc ctttctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60
atgacttgca gggccagctc aagtttaagt ttcatgcact ggtaccagca gaagccagga 120
tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcacagt ggaggctgaa 240
gatgctgcct cttatttctg ccatcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 300
accaagctgg agatcagctc gggctcaact agcgggtccg gaaaaccagg ctctggggaa 360
ggaagtacaa agggagacgt catgggggtg gattctgggg gaggcttagt gcagcctgga 420
gggtcccgga aactctcctg tgcagcccct ggattcactt tcagtagctt tgggatgcac 480
tgggttcgtc aggctccaga gaaggggttg gagtgggtcg catacattag tagtcccagt 540
agtaccctcc actatgcaga cagagtgaag ggccgattca ccatctccag agacaatccc 600
aagaacaccc tgttcctgca aatgaaacta ccctcactat gctatggact actggggcca 660
agggaccacg ttcaccgtct cctcaaa 687
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<212> DNA
<213> Artificial
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atgacttgca gggccagcct gtctgcatct ccaggggaga aggtcacaat gacttgcagg 120
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ttcagtggca gtgggtctgg gacttcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240
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tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 480
gtaaaacaga cacctggtcg gggcctggaa tggattggag ctatttatcc cggaaatggt 540
gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 600
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gcaagatcga cttactacgg cggtgactgg tacttcaatg tctggggcgc agggaccacg 720
gtcaccgtct ctgca 735
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cagccgccga aaccgtggat ttatgcgacc agcaacctgg cgagcggcgt gccggtgcgc 180
tttagcggca gcggcagcgg caccgatttt accctgaaaa ttagccgcgt ggaagcggaa 240
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acccgcctgg aaattaaagg ctccacatct ggaagcggca agcctggatc tggagaggga 360
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gataccagct atgcgcagaa atttaaaggc aaagtgacca ttaccgcgga taaaagcagc 600
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tttagcggca gcggcagcgg caccagctat accctgaaaa ttagccgcgt ggaagcggaa 240
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gccaagggcc agcctcggga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcca agaggagatg 420
accaagaatc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 480
gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540
gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc aggctgaccg tggacaagag ccggtggcag 600
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> A-scFV
<400> 15
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro
5 10 15
Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser
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Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro
35 40 45
Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg
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Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
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Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Pro
140 145 150
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala
155 160 165
Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Pro Ser
170 175 180
Ser Thr Leu His Tyr Ala Asp Arg Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
185 190 195
Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Lys Leu
200 205 210
Pro Ser Leu Cys Tyr Gly Leu Leu Gly Pro Arg Asp His Val His
215 220 225
Arg Leu Leu Lys
<210> 16
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> U-scFV
<400> 16
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro
5 10 15
Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Leu Ser Ala Ser
20 25 30
Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Pro Lys Pro
35 40 45
Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
65 70 75
Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
80 85 90
Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
95 100 105
Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly
110 115 120
Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu
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Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly
140 145 150
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro
155 160 165
Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly
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Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr
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Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu
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Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr
215 220 225
Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr
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Val Thr Val Ser Ala
245
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<213> Artificial
<220>
<223> 20C1
<400> 17
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro
5 10 15
Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
20 25 30
Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Pro
35 40 45
Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
80 85 90
Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile
95 100 105
Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly
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185 190 195
Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
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Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr
215 220 225
Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr
230 235 240
Val Thr Val Ser Ala
245
<210> 18
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 20C2
<400> 18
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro
5 10 15
Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
20 25 30
Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Pro
35 40 45
Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
80 85 90
Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
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Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly
110 115 120
Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
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Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly
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185 190 195
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230 235 240
Val Thr Val Ser Ala
245
<210> 19
<211>245
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 20C3
<400> 19
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro
5 10 15
Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
20 25 30
Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
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Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile
95 100 105
Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly
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Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
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Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly
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Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
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Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr
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245
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<213> Artificial
<220>
<223> 20C4
<400> 20
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro
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Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
20 25 30
Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu
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Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
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Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
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Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile
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Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Pro Gly Ala Gly Leu
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Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
155 160 165
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly
170 175 180
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Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr
215 220 225
Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr
230 235 240
Val Thr Val Ser Ala
245
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<212> PRT
<213>
<220>
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Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
5 10 15
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
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Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
35 40 45
Cys Asp
<210> 22
<211> 229
<212> PRT
<213>
<220>
<223> Ig4 hinge
<400> 22
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Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
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Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
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140 145 150
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155 160 165
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
170 175 180
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
185 190 195
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
200 205 210
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
215 220 225
Ser Leu Gly Lys
<210> 23
<211> 27
<212> PRT
<213>
<220>
<223> CD28TM
<400> 23
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
5 10 15
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 24
<211> 24
<212> PRT
<213>
<220>
<223> CD8TM
<400> 24
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
5 10 15
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 25
<211> 68
<212> PRT
<213>
<220>
<223> CD28
<400> 25
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
5 10 15
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys
20 25 30
Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
35 40 45
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
50 55 60
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
65
<210> 26
<211> 44
<212> PRT
<213>
<220>
<223> CD137
<400> 26
Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
5 10 15
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
20 25 30
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
35 40
<210> 27
<211> 111
<212> PRT
<213>
<220>
<223> CD3
<400> 27
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
20 25 30
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
35 40 45
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
50 55 60
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
65 70 75
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
80 85 90
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
95 100 105
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
110
<210> 28
<211> 18
<212> PRT
<213>
<220>
<223> Linker
<400> 28
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
5 10 15
Thr Lys Gly
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223>正向引物
<400> 29
aggctagcat gggatggagc tgtatcat 28
<210> 30
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 反向引物
<400> 30
gattgtcgac ttagcgaggg ggcagggcct gcatgtga 38
<210> 31
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD8TM
<400> 31
gaattcttct gggtgctggt cgtggtgggt ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtg 60
acagtggcct tcatcatctt ttgggtg 87

Claims (16)

1.抗CD20抗原的嵌合抗原受体，其特征在于，由识别CD20抗原的多肽(scFv)，铰链区，跨膜区和胞内信号域依次连接组成；所述识别CD20抗原的多肽(scFv)的氨基酸序列如SEQID NO.14所示或将所述识别CD20抗原的多肽(scFv)经过改造后得到的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区的氨基酸序列如SEQID NO:21或SEQ ID NO:22所示。
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜区的氨基酸序列如SEQID NO:23或SEQ ID NO:24所示。
4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号域为CD28和/或CD137和/或CD3；所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:25，所述CD137的氨基酸序列如SEQID NO:26，所述CD3的氨基酸序列如SEQ ID NO:27。
5.根据权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列由SEQ ID NO.14、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27序列依次串联而成。
6.权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体的慢病毒载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)合成抗CD20抗原的嵌合抗原受体的嵌合抗原受体的基因序列：合成依次含前导肽、抗人抗CD20抗原的不同的单链抗体(ScFv)、铰链区、跨膜区和胞内信号域；所述铰链区核酸序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:8、跨膜区核酸序列如SEQ ID NO:10或31、胞内信号域核酸序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；
2)构建表达嵌合抗原受体的慢病毒载体：设计引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:29所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示，以所述嵌合抗原受体的序列为模板进行PCR扩增，得DNA片段；
将所述DNA片段的基因序列用限制性内切酶NheI和SalI双酶切，同时用限制性内切酶NheI和SalI酶切慢病毒表达载体pCDH-CAG，然后将酶切后的目的片段和慢病毒表达载体片段通过T4连接酶进行连接，获得表达嵌合抗原受体的慢病毒载体。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)之后，包装并纯化所述慢病毒载体。
8.权利要求7所述的制备方法所得的慢病毒载体。
9.权利要求8所述的慢病毒载体感染的T细胞。
10.权利要求9所述的T细胞在用于制备B细胞淋巴瘤的药物中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述B细胞淋巴瘤的细胞或组织能够表达CD20。
12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述B细胞淋巴瘤包括非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。
13.权利要求1所述识别CD20抗原的多肽(scFv)的氨基酸序列在用于制备治疗B细胞淋巴瘤的药物中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述的B细胞淋巴瘤的细胞能够表达CD20。
15.权利要求1所述识别CD20抗原的多肽(scFv)的氨基酸序列在用于制备精准捕获能够表达CD20的B细胞淋巴瘤细胞的载体中的应用。
16.如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列在制备CAR-T骨架中的抗原识别域的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112521508A (zh) * 2020-12-29 2021-03-19 北京广未生物科技有限公司 一种cd20抗体及其治疗癌症的应用
CN112852730A (zh) * 2021-02-01 2021-05-28 河南省遗传资源细胞库有限公司 一种基于car技术的cart-20细胞扩增培养方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104910279A (zh) * 2015-06-05 2015-09-16 重庆倍思益生物科技有限公司 靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其制备方法和应用
CN105153315A (zh) * 2015-10-09 2015-12-16 重庆倍思益生物科技有限公司 免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体及其应用
CN105949325A (zh) * 2016-07-08 2016-09-21 重庆精准生物技术有限公司 包含cd27胞内结构域的嵌合抗原受体、慢病毒载体及其应用
CN106397608A (zh) * 2016-10-19 2017-02-15 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） Cd20特异性嵌合抗原受体及其应用
WO2017062628A1 (en) * 2015-10-06 2017-04-13 City Of Hope Chimeric antigen receptors targeted to psca
CN106793780A (zh) * 2014-06-06 2017-05-31 蓝鸟生物公司 改善的t细胞组合物

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106793780A (zh) * 2014-06-06 2017-05-31 蓝鸟生物公司 改善的t细胞组合物
CN104910279A (zh) * 2015-06-05 2015-09-16 重庆倍思益生物科技有限公司 靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其制备方法和应用
WO2017062628A1 (en) * 2015-10-06 2017-04-13 City Of Hope Chimeric antigen receptors targeted to psca
CN105153315A (zh) * 2015-10-09 2015-12-16 重庆倍思益生物科技有限公司 免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体及其应用
CN105949325A (zh) * 2016-07-08 2016-09-21 重庆精准生物技术有限公司 包含cd27胞内结构域的嵌合抗原受体、慢病毒载体及其应用
CN106397608A (zh) * 2016-10-19 2017-02-15 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） Cd20特异性嵌合抗原受体及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GREGORY A. RUFENER等: "Preserved Activity of CD20-Specific Chimeric Antigen Receptor xpressing T cells in the Presence of Rituximab", 《CANCER IMMUNOL RES.》 *
张巍等: "嵌合抗原受体 T 细胞治疗原发性肿瘤的优势与研究进展", 《天津医药》 *
沈倍奋: "肿瘤抗体治疗的历史回顾与展望", 《中国药理学与毒理学杂志》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112521508A (zh) * 2020-12-29 2021-03-19 北京广未生物科技有限公司 一种cd20抗体及其治疗癌症的应用
CN112521508B (zh) * 2020-12-29 2021-08-03 郴州宾泽医学检验有限公司 一种cd20抗体及其治疗癌症的应用
CN112852730A (zh) * 2021-02-01 2021-05-28 河南省遗传资源细胞库有限公司 一种基于car技术的cart-20细胞扩增培养方法

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