CN108048404A

CN108048404A - 一种新型抗肿瘤nk细胞及其制备方法和应用

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Publication number: CN108048404A
Application number: CN201711298786.XA
Authority: CN
Inventors: 朱武凌; 路臣桂; 张会勇; 李冬贝; 郭长江; 李明凤; 夏文姣; 王晓银; 吕探宇
Original assignee: Xinxiang Medical University
Current assignee: Xinxiang Medical University
Priority date: 2017-12-08
Filing date: 2017-12-08
Publication date: 2018-05-18
Anticipated expiration: 2037-12-08
Also published as: CN108048404B

Abstract

本发明公开了一种新型抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用。该抗肿瘤NK细胞为经嵌合共刺激转换受体改造的NK细胞；所述的嵌合共刺激转换受体由PD‑1胞外段、NKG2D跨膜及胞内段，以及共刺激分子41BB胞内段组成。本发明所述的抗肿瘤NK细胞，采用嵌合共刺激转换受体对NK细胞进行改造，能够提高NK细胞的抗肿瘤治疗效果，实现对实体瘤的特异性识别和杀伤，并且不会引起机体过激的免疫应答反应。

Description

一种新型抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体的说，涉及一种新型的抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，肿瘤免疫细胞治疗因其显著的疗效而在肿瘤治疗中备受瞩目，特别是基于嵌合抗原受体改造的T细胞(CAR-T)，在血液系统恶性肿瘤的临床治疗展现出良好的靶向性、杀伤力和持久性，使之成为肿瘤免疫治疗领域最令人信服的突破。然而，尽管CAR-T技术研发不断取得进步，但依然面临着诸多挑战，主要障碍之一为CAR-T虽然具备强大的杀死癌细胞的能力，但其本身所引起的过强免疫应答反应潜在威胁患者生命。并且无论CAR-T或是TCR-T(T细胞受体嵌合型T细胞)等免疫细胞技术，迄今为止对实体瘤的治疗鲜有奏效，而治疗实体瘤恰是抗肿瘤的真正主战场。因此，如何克服CAR-T技术的弊端以及如何能赋予免疫细胞对实体瘤细胞的精准识别与特异杀伤，成为免疫细胞治疗亟待解决的问题。

NK细胞(自然杀伤细胞)是机体重要的免疫细胞，约占健康人外周血淋巴细胞总数的10％。NK细胞在实体瘤发生发展的早期免疫反应和免疫监视过程中发挥重要作用，为机体抵抗肿瘤的第一道防线，利用NK细胞进行临床治疗已有较长历史。与T细胞相比，NK细胞具有许多自身的免疫特性和优势：一是NK细胞具有不受HLA(人白细胞抗原)限制的非特异性肿瘤细胞杀伤作用，主要通过表面细胞毒受体，触发穿孔素和颗粒酶的释放，产生细胞毒因子和TNF(肿瘤坏死因子)等细胞因子，而不产生IL-2等细胞因子，避免造成致死性细胞因子风暴；二是NK细胞还可通过CD16与抗体Fc片段结合，诱发ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用)的特异性杀伤作用；三是NK细胞的杀伤作用具有连续性，可从一个目标移向另一个目标，杀死多达7～10个肿瘤细胞，而T细胞缺乏这种连续杀伤性；四是NK细胞寿命短暂，发挥功效后很快会消失，无需考虑类似CAR-T细胞需要自杀基因来限制其持久副作用。由于这些有利因素，NK细胞用于患者治疗时有效并且安全。

免疫检查点是指一类免疫抑制性分子，通过共抑制或共刺激信号一系列途径来调节免疫细胞活性，防止过度免疫激活和确保自身耐受，从而避免正常组织损伤和破坏。PD-1(程序性细胞死亡蛋白-1)是其中一个主要的抑制分子，它具有一个ITSM(免疫受体酪氨酸转换基序)结构，在与配体PD-L1结合后能够磷酸化并引发胞内SHP-2酪氨酸磷酸酶，从而引发抗原受体复合体的去磷酸化。因此，由PD-1/PD-L1介导免疫负调控机制可以抑制MHC-TCR信号通路的激活，控制T细胞和NK细胞的增殖、细胞因子分泌或对同类抗原的应答反应。大量研究证据表明，PD-1主要表达于活化的免疫细胞表面，其配体PD-L1在正常组织中表达有限，但在大部分实体瘤细胞和免疫抑制细胞的表达显著增加，肿瘤利用PD-1/PD-L1负调控机制实现对抗肿瘤免疫反应的逃逸。因此，阻断这条免疫抑制信号通路成为实体瘤免疫治疗是一个重要路径。

目前多项临床前研究和临床试验均指出，采用PD-L1或PD-1阻断抗体来增强癌症患者的抗肿瘤免疫应答可作为一种新型的肿瘤免疫治疗手段，并能够获得持续性的临床应答。更有意义的是，研究发现利用PD-1细胞外段和CD28跨膜段及胞内段，构建一个嵌合共刺激开关受体，将其引入针对实体瘤靶抗原的CAR-T细胞，相比现在单独使用PD-1抗体治疗或CAR-T细胞治疗，都有更好的效果。还有研究表明，联合使用PD-1抗体和41BB(CD137)抗体，对治疗小鼠黑色素瘤模型和结肠癌模型具有很好的效果，显著抑制肿瘤生长。事实上41BB与PD-1都是一个需要诱导才会表达的蛋白，当41BB抗体与41BBL配体结合，可激活T细胞和NK细胞的活化、增殖及其它功能。NK细胞的免疫监视功能取决于表面抑制性受体和活化性受体所传递信号的整合。NK细胞受体NKG2D是活化性受体之一，NKG2D的单独活化足以刺激NK细胞的活化增殖，并能克服抑制性受体的强势信号，嵌合共刺激受体联合NKG2D增强了NK细胞的活性及对肿瘤细胞的杀伤效应。

发明内容

基于此，本发明的目的在于，提供一种新型的抗肿瘤NK细胞，其采用嵌合共刺激转换受体对NK细胞进行改造，能够提高NK细胞的抗肿瘤治疗效果，实现对实体瘤的特异性识别和杀伤，并且不会引起机体过激的免疫应答反应。

本发明的另一个目的在于，提供所述抗肿瘤NK细胞的制备方法。

本发明的再一个目的在于，提供所述抗肿瘤NK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种抗肿瘤NK细胞，其为经嵌合共刺激转换受体(Chimeric CostimulationConverting Receptor，CCCR)改造的NK细胞。

进一步地，所述的嵌合共刺激转换受体(CCCR)由PD-1胞外段(21-170aa)、NKG2D跨膜及胞内段(44-132aa)，以及共刺激分子41BB胞内段(214-255aa)组成。

进一步地，所述嵌合共刺激转换受体(CCCR)的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

进一步地，所述PD-1胞外段的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

进一步地，所述NKG2D跨膜及胞内段的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示。

进一步地，所述共刺激分子41BB胞内段的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示。

本发明设计了嵌合共刺激转换受体(CCCR)，其分子模块构建采用NKG2D跨膜及胞内段(44-132aa)以及共刺激分子4-1BB胞内段(214-255aa)替换了PD-1受体的胞内抑制信号域，只保留PD-1分子的胞外域(21-170aa)。当CCCR的PD-1胞外信号域识别到肿瘤细胞上的PD-L1分子时，信号下传，一方面经由跨膜区的NKG2D同源二聚体与DAP10(NKG2D的配体之一)双二聚体结合而成的六聚体结构(NKG2D-DAP10复合体)，其中DAP10作为衔接蛋白招募Pi3K的p85亚基和Grb2-Vav1复合体，进而引发下游蛋白(如SLP-76与PLC-γ2)的酪氨酸磷酸化，使得激活信号持续下传，引起完全的钙释放和细胞毒性，从而激活NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。另一方面，PD-1/PD-L1识别信号经NKG2D传递到共刺激分子41BB(CD137)胞内段时，41BB通过招募TRAF1-3蛋白将共刺激信号由多条常见信号途径，如Pi3K/AKT、IKK/NF-κB、JNK等向下游传递，促进颗粒酶B、穿孔素和FasL基因的表达，从而提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力，尤其是41BB与DAP10在下游信号通路Pi3K/AKT上可能发生重叠，这种信号的叠加作用将进一步增强NK细胞抗肿瘤活性。综上，本发明利用CCCR这一嵌合分子模块发挥信号转换“开关”作用，从而逆转PD-1/PD-L1免疫负调控机制，即把PD-1/PD-L1负调控信号转变成触发NKG2D活化性受体通路的正向激活信号，并在41BB协同作用下，大大增强NK细胞抗肿瘤治疗的效果。

经实验证明，本发明获得的抗肿瘤NK细胞，与未改造的NK细胞相比，其CD56、CD16表型的表达并未发生特异性改变，细胞增殖速度亦未发生改变，且嵌合共刺激转换受体能够在细胞中稳定表达，其肿瘤细胞靶向性、肿瘤细胞杀伤力均更强；与嵌合抗原受体改造T细胞(CAR-T)相比，其免疫原性低，可以进行异体回输，且对正常细胞的伤害小，不会引起机体过激的免疫应答反应，并能实现对实体瘤细胞的精准识别与特异杀伤，治疗范围更广；而与嵌合抗原受体改造NK细胞(CAR-NK)相比，其可通过PD-1/PD-L1通路来识别肿瘤细胞，对肿瘤细胞的靶向作用更具广谱性，不会局限于一种或几种特异性抗原靶标。

本发明所述的抗肿瘤NK细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)合成嵌合共刺激转换受体编码基因：设计特异性引物，分别对PD-1胞外段、NKG2D跨膜及胞内段、共刺激分子41BB胞内段的编码基因进行PCR扩增，所得扩增产物进行顺序连接，得到所述的嵌合共刺激转换受体编码基因(即PD1-NKG2D-41BB基因)；

2)构建重组慢病毒载体：将嵌合共刺激转换受体编码基因(PD1-NKG2D-41BB基因)克隆到慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP上，得到所述的重组慢病毒载体(即重组载体PD1-NKG2D-41BB-pCDH)；

3)慢病毒的包装：将所述的重组慢病毒载体(重组载体PD1-NKG2D-41BB-pCDH)以及辅助载体pSPAX2、PMD2G转染感受态细胞，获得所述的慢病毒；

4)慢病毒侵染NK细胞：将所述的慢病毒加入NK细胞进行培养，得到稳定表达所述嵌合共刺激转换受体的抗肿瘤NK细胞(即CCCR-NK细胞)。

本发明的制备方法，通过慢病毒侵染NK细胞的方式，将所述的嵌合共刺激转换受体编码基因导入NK细胞内，得到能够稳定表达嵌合共刺激转换受体的NK细胞株。本发明采用慢病毒载体进行转染，具有转染效率高，容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等优点，并能实现目的基因稳定的长期表达。此外，本发明采用pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP作为慢病毒载体，其以CMV作为目的基因的启动子，启动子作用强；并且含有绿色荧光蛋白GFP基因，通过GFP的表达有助于后续对细胞进行荧光显微镜、流式细胞术等观察检测。

本发明所述的抗肿瘤NK细胞，能够用于制备抗肿瘤药物，实现对肿瘤细胞，特别是实体瘤细胞的靶向特异性治疗。

附图说明

图1为重组慢病毒载体PD1-NKG2D-41BB-pCDH结构示意图；

图2为慢病毒转染293T细胞的检测结果图，其中，a为倒置显微镜观察图，b为荧光显微镜观察图；

图3为慢病毒侵染NK92细胞的检测结果图，其中，虚线为NK92细胞，实线为CCCR-NK92细胞；

图4为CCCR-NK92细胞与亲本NK92细胞中PD-1表达的检测结果图；

图5为CCCR-NK92细胞与亲本NK92细胞中CD16、CD56表型表达的检测结果图；

图6为CCCR-NK92细胞与亲本NK92细胞的增殖率检测结果图；

图7为EMT6细胞中PD-L1表达的检测结果图；

图8为H1299细胞中PD-L1表达的检测结果图；

图9为CCCR-NK92细胞与亲本NK92细胞的细胞毒性检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例一：合成嵌合共刺激转换受体编码基因

通过全基因合成的方法，合成了含有450bp的PD-1胞外段(21-170aa)、270bp的NKG2D跨膜及胞内段(44-132aa)，以及126bp的共刺激分子41BB胞内段(214-255aa)，将其串联在一起，得到PD1-NKG2D-41BB基因片段。

1、引物设计

PD1-NKG2D-41BB为含有849bp的DNA分子。每60bp为一个片段，每两个片段间要有10bp相重叠，如1-60bp为片段1，50-110bp为片段2，100-160bp为片段3，以此类推。在片段1的5’端设计上游引物，命名为F₁；在片段2的3’端设计下游引物，命名为R₁；在片段3的5’端设计上游引物，命名为F₂；在片段4的3’端设计下游引物，命名为R₂，以此类推。PD1-NKG2D-41BB基因共有9对上下游引物，分别为：

F1：5’-ATGAAACGGGGCAGAAAG-3’

R1：5’-TCTTCTTCTGGAAATCGG-3’

F2：5’-CAGAAGAAGAAGAAGGAG-3’

R2：5’-CTTCTTCAGATCCAAGTT-3’

F3：5’-TCTGAAGAAGAGTGATTT-3’

R3：5’-CAGCGATGAAGCAGCAGA-3’

F4：5’-TTCATCGCTGTAGCCATG-3’

R4：5’-AAGAACCATCCGGGAATT-3’

F5：5’-GATGGTTCTTAGACTCCC-3’

R5：5’-GTTGGAGAAGCTGCAGGT-3’

F6：5’-CTTCTCCAACACATCGGA-3’

R6：5’-CCTGGCCGGGCTGGCTGC-3’

F7：5’-CCCGGCCAGGACTGCCGC-3’

R7：5’-GCCCCACAGAGGTAGGTG-3’

F8：5’-TCTGTGGGGCCATCTCCC-3’

R8：5’-GGGGCTGGGGTGGGCTGT-3’

F9：5’-CCCCAGCCCCTCACCCAG-3’

R9：5’-TTACACCAGGGTTTGGAA-3’

2、PCR扩增

PCR反应体系如下(50μL)：

PCR反应条件如下：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，28个循环，最后72℃延伸10分钟，4℃终止反应。

实施例二：构建重组慢病毒载体

将实施例一得到的PD1-NKG2D-41BB基因片段克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP慢病毒载体上，如图1所示。采用限制性内切酶XbaI和EcoR I，分别酶切pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP慢病毒载体及PD1-NKG2D-41BB基因片段，得到酶切后线性化的pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP慢病毒载体以及酶切后的PD1-NKG2D-41BB基因片段，采用T4DNA连接酶体系，在16℃下孵育过夜。然后转化感受态细胞，筛选阳性菌落，提取阳性菌落的质粒，得到PD1-NKG2D-41BB-pCDH表达载体。

1、双酶切pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP慢病毒载体

酶切反应体系如下(100μl)：

酶切反应条件：在37℃下反应3小时。

2、双酶切PD1-NKG2D-41BB基因片段

酶切反应体系如下(100μl)：

酶切反应条件：在37℃下反应3小时。

3、连接pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP慢病毒载体与PD1-NKG2D-41BB基因片段连接反应体系如下(10μl)：

连接反应条件：16℃孵育过夜。

实施例三：慢病毒的包装

1、慢病毒包装质粒及目的质粒的提取

1.1质粒转化

分别取1支100μL的Stbl3感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)，以及2支100μL的大肠杆菌TOP10感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)；将1μg目的质粒PD1-NKG2D-41BB-pCDH加入Stbl3感受态细胞中，并将各1μg的慢病毒包装辅助质粒pSPAX2、PMD2G，分别加入100μL的大肠杆菌TOP10感受态细胞中，经充分混匀后，分别置于冰上孵育30分钟，然后立即于42℃水浴锅中热击90秒，再于冰浴中放置2分钟。然后分别加入800μL的LB培养基，充分混匀后，置于37℃恒温振荡培养箱中，以100rpm/min振荡培养1小时。

培养结束后，各取200μL菌液，分别涂布在三个LB固态培养基上(含浓度为50μg/mL的氨苄青霉素溶液，按照1∶1000的比例加入)，目的质粒PD1-NKG2D-41BB-pCDH与包装质粒pSPAX2、PMD2G均为氨苄青霉素抗性。正置30分钟后，倒置，于37℃恒温培养箱中培养12小时。

1.2质粒提取

分别挑取上述LB固态培养基中的单克隆菌落，接种于5mL的LB培养基中(含5μL浓度为50μg/mL的氨苄青霉素溶液)，置于37℃摇床，以220rpm/min恒温振荡培养12小时。然后各取200μL菌液，分别接种于200mL的LB培养基中(含200μL浓度为50μg/mL的氨苄青霉素溶液)，置于37℃摇床，以220rpm/min恒温振荡培养12～16小时。

采用OMEGA无内毒素质粒大量提取试剂盒(购自美国Omega生物技术公司，产品型号为D6926-03)进行质粒抽提，采用Nanodrop超微量分光光度计分别测定目的质粒、包装质粒的浓度和纯度，然后置于-20℃冰箱保存。目的质粒PD1-NKG2D-41BB-pCDH的浓度为1047ng/μL，包装质粒pSPAX2的浓度为1223ng/μL，包装质粒PMD2G的浓度为763ng/μL。

2、慢病毒的包装

293T细胞的准备：取3×10⁶个293T细胞接种于75cm²的细胞培养瓶中，于37℃培养过夜，待细胞密度达到60％～80％时，更换10mL新鲜的含有6％胎牛血清、不含青霉素与链霉素的DMEM培养基，继续置于37℃培养箱中培养1小时。

采用磷酸钙试剂盒(购自碧云天生物技术研究所，产品型号为C0508)进行慢病毒包装，具体步骤如下：

1)将10μg目的质粒PD1-NKG2D-41BB-pCDH、7.5μg包装质粒pSPAX2、2.5μg包装质粒PMD2G加入1.5mL的EP管中，混匀；

2)将782μL的CaCl₂溶液(试剂盒提供)加入步骤1)的EP管中，吹打混匀；

3)另取一个1.5mL的EP管中，加入782μL的BBS平衡盐溶液(试剂盒提供)；

4)将步骤2)得到的CaCl₂溶液，逐滴加入步骤3)的BBS平衡盐溶液中，吹打混匀后，于室温孵育30分钟，可见浑浊，但无白色沉淀生成；

5)将步骤4)得到的混合液加入293T细胞中，混匀后，置于37℃培养箱中培养8～10小时，然后去除上清，用PBS磷酸盐缓冲液洗涤，更换15mL新鲜的含有10％胎牛血清的DMEM培养基，继续培养48小时；

6)培养结束后，于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达强度，以检测转染效率(如图2所示)，收集细胞上清液，即为所获得的第一批慢病毒，然后加入12mL新鲜的含有10％胎牛血清的DMEM培养基，继续培养72小时，培养结束后，收集细胞上清液，此为所获得的第二批慢病毒；

7)将收集得到的慢病毒上清液，以3500g离心10分钟，以去除细胞碎片。

3、慢病毒的浓缩

将过滤好的慢病毒上清液，转移至无菌超滤管中，以3500g离心，直至浓缩为500μL；将浓缩得到的慢病毒原液，分装于冻存管中，于-80℃保存，避免反复冻融。

4、慢病毒滴度的测定

采用qPCR慢病毒滴度检测试剂盒(购自爱必梦生物科技有限公司，产品型号为LV900)进行慢病毒滴度的测定，具体步骤如下：

1)样品准备：取上述浓缩得到的慢病毒原液；

2)病毒裂解液制备：吸取2μL慢病毒原液，加入18μL病毒裂解缓冲液(试剂盒提供)，于室温孵育3分钟；

3)qRT-PCR检测：采用qRT-PCR检测仪(德国罗氏医学仪器公司)，按照表1的反应体系以及表2的反应程序，测定慢病毒滴度。检测结果显示，所得慢病毒滴度为1×10⁸。

慢病毒滴度计算公式：病毒滴度＝5×10⁷/2^{3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1)}

Ctx＝实验组平均值；Ct1＝STD1阳性对照组平均值；Ct2＝STD2阳性对照组平均值。

表1qRT-PCR检测反应体系

备注：2×qPCR MasterMix、STD1、STD2、Reagent-mix均为试剂盒提供；每组设置3个副孔。阳性对照STD1、STD2为标准品，阴性对照NTC为不加样本的对照品，确保体系中的其它组分不受病毒类似物的污染，保证结果的准确性。

表2qRT-PCR检测反应程序

实施例四：慢病毒侵染NK细胞

取NK92细胞培养基：为含有12.5％胎牛血清(以色列Biological Industries公司，货号为04-001-1ACS)、12.5％马血清(美国赛默飞世尔公司，货号为26050088)、100U/ml的白介素2(北京义翘神州生物技术有限公司，货号为11848-HNAY1-20)的α-MEM培养基(美国GE公司，货号为SH30265.01)。

取NK92细胞接种于24孔细胞培养板中，接种浓度为3×10⁵个/孔，分别加入实施例三得到的慢病毒原液(感染复数＝150)，并加入终浓度为8μg/mL的聚凝胺，混匀后，置于37℃培养箱中培养10小时，然后离心，去除慢病毒上清液，更换新鲜的α-MEM培养基，继续培养。侵染培养48小时、72小时后，分别在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达，以检测慢病毒侵染效果(如图3所示)。侵染培养5天后，即获得嵌合共刺激转换受体PD1-NKG2D-41BB改造的NK92细胞(即CCCR-NK92细胞)。

实施例五：目的基因PD-1表达的检测

1、细胞准备

分别取实施例四获得的慢病毒侵染NK92细胞(即CCCR-NK92细胞)和亲本NK92细胞，细胞数为1×10⁶，用含1％胎牛血清的PBS缓冲液(洗涤缓冲液)洗涤后，再用100μL洗涤缓冲液重悬细胞，得到细胞悬液。

2、抗体孵育

分别向CCCR-NK92细胞悬液和亲本NK92细胞悬液，加入别藻蓝蛋白(APC)标记的小鼠抗人PD-1单抗(购自美国BD公司，产品型号为558694)20μL，冰上避光孵育30分钟后，用洗涤缓冲液洗涤两次，以300g离心5分钟，去除上清，然后加入400μL PBS缓冲液重悬细胞。

3、上机检测

用流式细胞仪分别对CCCR-NK92细胞悬液和亲本NK92细胞悬液进行检测分析，结果如图4所示，横坐标表示GFP荧光强度(对数值)，纵坐标表示PD1-APC红色荧光强度(对数值)。检测结果表明，CCCR-NK92细胞中PD-1的表达率为57.4％，而亲本NK92细胞中PD-1几乎不表达。

实施例六：NK92细胞表型的分析

1、细胞准备

2、抗体孵育

1)CD16的检测：分别向CCCR-NK92细胞悬液和亲本NK92细胞悬液，加入APC标记的小鼠抗人CD16单抗(购自美国Biolegend公司，产品型号为302012)10μL，冰上避光孵育30分钟后，用洗涤缓冲液洗涤两次，以300g离心5分钟，去除上清，然后加入400μL PBS缓冲液重悬细胞。

2)CD56的检测：分别向CCCR-NK92细胞悬液和亲本NK92细胞悬液，加入APC标记的小鼠抗人CD56单抗(购自美国BD公司，产品型号为555518)20μL，冰上避光孵育30分钟后，用洗涤缓冲液洗涤两次，以300g离心5分钟，去除上清，然后加入400μL PBS缓冲液重悬细胞。

3、上机检测

用流式细胞仪分别对CCCR-NK92细胞悬液和亲本NK92细胞悬液进行检测分析，结果如图5所示，横坐标表示GFP荧光强度(对数值)，纵坐标表示CD16-APC或CD56-APC荧光强度(对数值)。检测结果表明，亲本NK92细胞与CCCR-NK92细胞中，CD16均不表达，而CD56均有表达，证明本发明的制备方法并未改变NK92细胞本身的表型。

实施例七：NK92细胞增殖水平的检测

分别取实施例四获得的慢病毒侵染NK92细胞(即CCCR-NK92细胞)和亲本NK92细胞，分别接种于96孔细胞培养板中，接种浓度为2×10⁴个细胞/孔，每种细胞设置3个副孔。以同样的铺板原则，接种3个96孔板，分别标记板①、板②、板③。

培养24小时后，取出板①；培养48小时后，取出板②；培养72小时后，取出板③，分别向每孔加入10μL的CCK-8溶液(购自MCE中国，产品型号为HY-K0301-100T)，注意不要产生气泡。加入CCK-8溶液后，将96孔板置于37℃培养箱中孵育2.5小时。然后用酶标仪在450nm波长处测定吸光度，比较CCCR-NK92细胞与亲本NK92细胞的增殖水平，检测结果如图6所示。检测结果表明，与亲本NK92细胞相比，CCCR-NK92细胞的增殖水平并无差异性变化，证明本发明的制备方法并未影响NK92细胞的增殖速率。

实施例八：构建稳定过表达PD-L1的EMT6细胞株

1、确定潮霉素筛选浓度

取对数生长期的小鼠乳腺癌细胞株EMT6，接种于24孔细胞培养板，接种浓度为8×10⁴个细胞/孔，待细胞贴壁后，梯度加入潮霉素，浓度分别为300、400、500、600、700、800、900ng/mL，置于5％CO₂、37℃培养箱中培养，每2天更换DMEM完全培养基1次，并对细胞生长情况进行观察。培养14天后，观察每孔细胞死亡情况，将全部杀死细胞的最小浓度确定为最终药物筛选浓度。实验结果显示，EMT6细胞对潮霉素的最佳筛选浓度为700ng/mL。

2、PD-L1质粒转染EMT6细胞

将EMT6细胞接种于24孔细胞培养板中，接种浓度为8×10⁴个细胞/孔，置于5％CO₂、37℃培养箱中培养，待细胞融合度达70％～90％时，将PD-L1质粒(购自北京义翘神州生物科技有限公司，产品型号为HG10084-ACG)转染EMT6细胞，按照Lipofectamine^TM 3000转染试剂盒(购自Invitrogen公司，产品型号为L3000015)的说明书进行转染，培养6小时后，更换含血清的DMEM完全培养基继续培养。实验中，同时设置转染空载体组作为对照。

3、筛选稳定转染细胞株

EMT6细胞经转染48小时后，以700ng/mL的潮霉素药物浓度进行筛选，每隔1～2天更换含有潮霉素的DMEM完全培养基。约7天后，细胞出现大量死亡，待未转染组细胞全部被杀死后继续筛选，转染组可见耐药克隆形成。将耐药克隆消化，用有限稀释法稀释至96孔板中，保证每孔1个细胞，继续加药筛选，两周后在显微镜下挑选阳性单克隆细胞株，接种至24孔板加药扩大培养；24孔板长满后，转到6孔板继续扩大培养，培养期间药物浓度不变，最终获得3株稳定转染的EMT6单克隆细胞株。选取1株过表达PD-L1的EMT6细胞株进行后续实验。

4、靶细胞PD-L1表达的检测

分别取EMT6细胞和H1299肺癌细胞，细胞数为1×10⁶，用含1％胎牛血清的PBS缓冲液(洗涤缓冲液)洗涤后，再用100μL洗涤缓冲液重悬细胞，得到细胞悬液。

分别向EMT6细胞悬液和H1299细胞悬液，加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的小鼠抗人PD-L1单抗(购自美国BD公司，产品型号为558065)20μL，冰上避光孵育30分钟后，用洗涤缓冲液洗涤两次，以300g离心5分钟，去除上清，然后加入400μL PBS缓冲液重悬细胞。

用流式细胞仪分别对EMT6细胞和H1299细胞进行检测分析，结果如图7和图8所示。检测结果表明，过表达PD-L1的EMT6细胞株中，PD-L1(GFP标记)的阳性率约为71.8％；H1299肺癌细胞株中，PD-L1(GFP标记)的阳性率约为56％。

实施例九：体外细胞毒性实验

1、实验设计

根据不同的效应细胞(CCCR-NK92细胞和亲本NK-92细胞)、靶细胞(EMT6细胞和H1299肺癌细胞)，设置4个实验组，按照下表所示，每组效靶比均设置为0.5:1、2.5:1、5:1。同时设置背景空白对照孔(无细胞的培养液孔)、靶细胞对照孔、效应细胞对照孔、样品最大酶活性对照孔(未加效应细胞处理的用于后续裂解的靶细胞孔)，每孔总体积为200μL。

组别	效应细胞	靶细胞
			1	亲本NK-92细胞	EMT6细胞
2	CCCR-NK92细胞	EMT6细胞
			3	亲本NK-92细胞	H1299肺癌细胞
4	CCCR-NK92细胞	H1299肺癌细胞

2、乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测

本实验采用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(购自碧云天生物技术研究所，产品型号为C0016)进行检测。

取对数生长期的EMT6细胞、H1299肺癌细胞作为靶细胞，分别接种于96孔细胞培养板，接种浓度为5×10⁴个细胞/孔，每种细胞设置3个副孔，置于5％CO₂、37℃培养箱中，培养过夜。每组按照0.5:1、2.5:1、5:1的效靶比，将效应细胞与靶细胞置于5％CO₂、37℃培养箱中共孵育5小时。在预定的时间检测点前1小时(即效应细胞与靶细胞共孵育4小时后)，从细胞培养箱中取出96孔板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂，加入量为原有培养液体积的10％，即20μL。加入LDH释放试剂后，反复吹打混匀，然后将96孔板继续放入5％CO₂、37℃培养箱中培养。达到共孵育时间后，将96孔板取出，用多孔板离心机以400g离心5分钟。分别取各孔的上清液120μL，转移到新的96孔板(命名为板①)相应的孔中，随即进行如下的样品测定。

样品测定步骤如下：向板①各孔中分别加入60μL LDH检测工作液(试剂盒提供)，吹打混匀，将板①置于100rpm摇床上，于室温下避光孵育30分钟，然后用酶标仪在490nm波长处测定吸光度，所测得的各孔吸光度值均应减去背景空白对照孔的吸光度值，检测结果如图9所示。

细胞毒性(％)＝(实验组-效应细胞对照孔-靶细胞对照孔)/(样品最大酶活性对照孔-靶细胞对照孔)×100。

检测结果表明，在不同的效靶比例下，CCCR-NK92的细胞毒性均高于亲本NK92，而在效靶比为5:1的比例下，CCCR-NK92的细胞毒性更是亲本NK92的3～4倍。证明本发明获得的CCCR-NK92细胞，其细胞毒性大大增强。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 新乡医学院

<120> 一种新型抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 849

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta 60

caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga 120

tgtgaactga tggggtggat tcgtggtcgg aggtctcgac acagctggga gatgagtgaa 180

tttcataatt ataacttgga tctgaagaag agtgattttt caacacgatg gcaaaagcaa 240

agatgtccag tagtcaaaag caaatgtaga gaaaatgcat ctccattttt tttctgctgc 300

ttcatcgctg tagccatggg aatccgtttc attattatgg tagcaatatg gagtgctgta 360

ttcctaaact cattattcaa ccaagaagtt caaattcccg gatggttctt agactcccca 420

gacaggccct ggaacccccc caccttcttc ccagccctgc tcgtggtgac cgaaggggac 480

aacgccacct tcacctgcag cttctccaac acatcggaga gcttcgtgct aaactggtac 540

cgcatgagcc ccagcaacca gacggacaag ctggccgcct tccccgagga ccgcagccag 600

cccggccagg actgccgctt ccgtgtcaca caactgccca acgggcgtga cttccacatg 660

agcgtggtca gggcccggcg caatgacagc ggcacctacc tctgtggggc catctccctg 720

gcccccaagg cgcagatcaa agagagcctg cgggcagagc tcagggtgac agagagaagg 780

gcagaagtgc ccacagccca ccccagcccc tcacccaggc cagccggcca gttccaaacc 840

ctggtgtaa 849

<210> 2

<211> 282

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Leu Ala Gly Ala Leu Leu Leu Leu Thr Ile Pro Leu Gly Pro Pro

1 5 10 15

Met Ala Pro Val Gly Thr Thr Gly Gly Gly Ala Gly Cys Ser Cys Ala

20 25 30

Pro Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu Met Gly Thr Ile Ala

35 40 45

Gly Ala Ala Ser Ala His Ser Thr Gly Met Ser Gly Pro His Ala Thr

50 55 60

Ala Leu Ala Leu Leu Leu Ser Ala Pro Ser Thr Ala Thr Gly Leu Gly

65 70 75 80

Ala Cys Pro Val Val Leu Ser Leu Cys Ala Gly Ala Ala Ser Pro Pro

85 90 95

Pro Pro Cys Cys Pro Ile Ala Val Ala Met Gly Ile Ala Pro Ile Ile

100 105 110

Met Val Ala Ile Thr Ser Ala Val Pro Leu Ala Ser Leu Pro Ala Gly

115 120 125

Gly Val Gly Ile Pro Gly Thr Pro Leu Ala Ser Pro Ala Ala Pro Thr

130 135 140

Ala Pro Pro Thr Pro Pro Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Gly Gly Ala

145 150 155 160

Ala Ala Thr Pro Thr Cys Ser Pro Ser Ala Thr Ser Gly Ser Pro Val

165 170 175

Leu Ala Thr Thr Ala Met Ser Pro Ser Ala Gly Thr Ala Leu Leu Ala

180 185 190

Ala Pro Pro Gly Ala Ala Ser Gly Pro Gly Gly Ala Cys Ala Pro Ala

195 200 205

Val Thr Gly Leu Pro Ala Gly Ala Ala Pro His Met Ser Val Val Ala

210 215 220

Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Thr Thr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

225 230 235 240

Ala Pro Leu Ala Gly Ile Leu Gly Ser Leu Ala Ala Gly Leu Ala Val

245 250 255

Thr Gly Ala Ala Ala Gly Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

260 265 270

Ala Pro Ala Gly Gly Pro Gly Thr Leu Val

275 280

<210> 3

<211> 447

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggatggttct tagactcccc agacaggccc tggaaccccc ccaccttctt cccagccctg 60

ctcgtggtga ccgaagggga caacgccacc ttcacctgca gcttctccaa cacatcggag 120

agcttcgtgc taaactggta ccgcatgagc cccagcaacc agacggacaa gctggccgcc 180

ttccccgagg accgcagcca gcccggccag gactgccgct tccgtgtcac acaactgccc 240

aacgggcgtg acttccacat gagcgtggtc agggcccggc gcaatgacag cggcacctac 300

ctctgtgggg ccatctccct ggcccccaag gcgcagatca aagagagcct gcgggcagag 360

ctcagggtga cagagagaag ggcagaagtg cccacagccc accccagccc ctcacccagg 420

ccagccggcc agttccaaac cctggtg 447

<210> 4

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Thr Pro Leu Ala Ser Pro Ala Ala Pro Thr Ala Pro Pro Thr Pro

1 5 10 15

Pro Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Pro Thr

20 25 30

Cys Ser Pro Ser Ala Thr Ser Gly Ser Pro Val Leu Ala Thr Thr Ala

35 40 45

Met Ser Pro Ser Ala Gly Thr Ala Leu Leu Ala Ala Pro Pro Gly Ala

50 55 60

Ala Ser Gly Pro Gly Gly Ala Cys Ala Pro Ala Val Thr Gly Leu Pro

65 70 75 80

Ala Gly Ala Ala Pro His Met Ser Val Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala

85 90 95

Ser Gly Thr Thr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Leu Ala Gly

100 105 110

Ile Leu Gly Ser Leu Ala Ala Gly Leu Ala Val Thr Gly Ala Ala Ala

115 120 125

Gly Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Ala Pro Ala Gly Gly

130 135 140

Pro Gly Thr Leu Val

145

<210> 5

<211> 270

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggggtgga ttcgtggtcg gaggtctcga cacagctggg agatgagtga atttcataat 60

tataacttgg atctgaagaa gagtgatttt tcaacacgat ggcaaaagca aagatgtcca 120

gtagtcaaaa gcaaatgtag agaaaatgca tctccatttt ttttctgctg cttcatcgct 180

gtagccatgg gaatccgttt cattattatg gtagcaatat ggagtgctgt attcctaaac 240

tcattattca accaagaagt tcaaattccc 270

<210> 6

<211> 90

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Gly Thr Ile Ala Gly Ala Ala Ser Ala His Ser Thr Gly Met Ser

1 5 10 15

Gly Pro His Ala Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Ser Ala Pro Ser Thr

20 25 30

Ala Thr Gly Leu Gly Ala Cys Pro Val Val Leu Ser Leu Cys Ala Gly

35 40 45

Ala Ala Ser Pro Pro Pro Pro Cys Cys Pro Ile Ala Val Ala Met Gly

50 55 60

Ile Ala Pro Ile Ile Met Val Ala Ile Thr Ser Ala Val Pro Leu Ala

65 70 75 80

Ser Leu Pro Ala Gly Gly Val Gly Ile Pro

85 90

<210> 7

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 8

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Leu Ala Gly Ala Leu Leu Leu Leu Thr Ile Pro Leu Gly Pro Pro Met

1 5 10 15

Ala Pro Val Gly Thr Thr Gly Gly Gly Ala Gly Cys Ser Cys Ala Pro

20 25 30

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu

35 40

Claims

1.一种抗肿瘤NK细胞，其特征在于：其为经嵌合共刺激转换受体改造的NK细胞；所述的嵌合共刺激转换受体由PD-1胞外段、NKG2D跨膜及胞内段，以及共刺激分子41BB胞内段组成。

2.根据权利要求1所述的抗肿瘤NK细胞，其特征在于：所述嵌合共刺激转换受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的抗肿瘤NK细胞，其特征在于：所述PD-1胞外段的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

4.根据权利要求1所述的抗肿瘤NK细胞，其特征在于：所述NKG2D跨膜及胞内段的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示。

5.根据权利要求1所述的抗肿瘤NK细胞，其特征在于：所述共刺激分子41BB胞内段的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示。

6.权利要求1所述的抗肿瘤NK细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)合成嵌合共刺激转换受体编码基因；

2)构建重组慢病毒载体；

3)慢病毒的包装；

4)慢病毒侵染NK细胞。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)合成嵌合共刺激转换受体编码基因：设计特异性引物，分别对PD-1胞外段、NKG2D跨膜及胞内段、共刺激分子41BB胞内段的编码基因进行PCR扩增，所得扩增产物进行顺序连接，得到所述的嵌合共刺激转换受体编码基因；

2)构建重组慢病毒载体：将嵌合共刺激转换受体编码基因克隆到慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP上，得到所述的重组慢病毒载体；

3)慢病毒的包装：将所述的重组慢病毒载体以及辅助载体pSPAX2、PMD2G转染感受态细胞，获得所述的慢病毒；

4)慢病毒侵染NK细胞：将所述的慢病毒加入NK细胞进行培养，得到稳定表达所述嵌合共刺激转换受体的抗肿瘤NK细胞。

8.权利要求1所述的抗肿瘤NK细胞，在制备抗肿瘤药物中的应用。