WO2016159440A1 - 활성화 b 세포를 이용한 항원 특이적 세포 독성 t 세포 제조 방법 및 그 용도 - Google Patents

활성화 b 세포를 이용한 항원 특이적 세포 독성 t 세포 제조 방법 및 그 용도 Download PDF

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강형진
윤선옥
강창율
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서울대학교산학협력단
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    • C12N2710/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present application is in the field of immune cell therapy.
  • the treatment using cells is a field of regenerative medicine using stem cells, and the other is a field for treating cancer and virus infection using immune cells.
  • immunocytotherapy using cytotoxic T cells was conducted using melanoma model (Rosenberg SA et al., Nat Rev Cancer 8 (4): 299-308, 2008) and hematopoietic stem cell transplantation model ( Heslop HE et al., New Engl J Med 331: 679-680, 1994).
  • hematopoietic stem cell transplantation is a treatment that can cure various diseases, but it is not yet a complete treatment, but recurrence of original disease such as leukemia, failure of engraftment, toxicity related to high-dose chemotherapy, infection associated with GVHD and immunosuppression It is pointed out as the cause of this failure.
  • Ad5f35-pp65 with CMV Cytomegalovirus antigen.pp65
  • CMV Cytomegalovirus antigen.pp65
  • LCL Epstein-Barr virus-transformed lymphoblastoid cells
  • the technology for activating cytotoxic T cells in vitro and administering them to humans is used not only for viral diseases but also for various diseases to treat various infections, cancers and immune diseases. Can be used for treatment.
  • An antigen-specific cytotoxic T cell production method for use in immune cell therapy and its use are provided.
  • a method for providing human peripheral blood mononuclear cells Separating the peripheral blood mononuclear cells into B cells and remaining mononuclear cells except for the B cells;
  • the B cells are alpha-galactosyl ceramide, alpha-glucuronosyl ceramide, phosphatidylinositol tetramannoside, isoglobotrihexylceramide, ganglioside GD3, phosphatidylcholine, beta-galactosyl ceramide, lipophos Any one selected from the group consisting of poglycans, glycoinositol phospholipids, beta-anomer galactosyl ceramides and analogues of alpha-galactosyl ceramides, and alpha-anomer galactosyl ceramides, and bacterial lipid antigens Activating by treating with a reaction modulator; Delivering a nucleic acid or peptid
  • the antigen can be delivered to the cells using a variety of methods known in the art, for example, reference may be made to those described in the Examples herein.
  • the present application also provides an immune cell therapy comprising the cells according to the present application, in one embodiment the immune cell therapy according to the present application can be used in conjunction with other existing immunotherapeutic agents.
  • B-cells activated with alpha-galactosylceramide instead of dendritic cells (DC), which are disadvantageous in terms of cost and production time due to the use of cytokines, It was used to produce antigen specific cytotoxic T cells, which can be useful for the treatment of viral infections and other infections and cancer.
  • DC dendritic cells
  • T cell 1 is a T cell according to the present invention producing cytotoxic T cells specific for viruses such as CMV, EBV, Adenovirus, etc. using B-cells activated with alpha-galactosylceramide according to an embodiment of the present application as antigen presenting cells. It is a schematic of the cell activation method.
  • FIG. 2 is a schematic of a method for producing antigen specific cytotoxic T cells using two activated B cells according to one embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 3a and Figure 3b is a result of measuring the antigen-specific IFN-gamma secreted by ELISPOT produced in the cytotoxic T cells produced herein
  • T cells of Figure 3a is a nucleic acid encoding the antigen of Example 2-1
  • the delivered B cells, the T cells of FIG. 3B, were cultured using B cells delivered with peptides acting as antigens as in Example 2-2.
  • Figure 4 is a cytotoxicity test results using the cytotoxic T cells prepared herein.
  • FIG. 5 shows the results of measuring cytotoxic T cell amplification results when compared to the one-time use of activated B cells.
  • the red line is the result of adding IL-15 to both the first and second stimuli
  • the green line is the addition of IL-4 and IL-7 to the second stimulus.
  • 8A-8C are cleavage maps of plasmids used in the production of antigen specific cytotoxic T cells according to the present disclosure.
  • the present application is an antigen presenting cell for the production of antigen specific cytotoxic T cells for use in immunocytotherapy, in place of alpha-galactosyl instead of dendritic cells (DC), which is disadvantageous in terms of cost and duration due to the use of cytokines. It is based on the discovery that ceramide-activated B cells can be used to produce antigen specific cytotoxic T cells in vitro.
  • the present disclosure is directed to a method of producing antigen specific cytotoxic T cells in vitro.
  • the method according to the present invention comprises the steps of providing human peripheral blood mononuclear cells; 1 separating the peripheral blood mononuclear cells into B cells and remaining mononuclear cells except for the B cells; 2 the B cells are alpha-galactosyl ceramide, alpha-glucuronosyl ceramide, phosphatidylinositol tetramannoside, isoglobotrihexylceramide, ganglioside GD3, phosphatidylcholine, beta-galactosyl ceramide, lipo Any one selected from the group consisting of phosphoglycans, glycinositol phospholipids, beta-anomer galactosyl ceramides and analogues of alpha-galactosyl ceramides, and alpha-anomer galactosyl ceramides, and bacterial lipid antigens Activating by treating with a biological response modifier; 3 delivering a nucleic
  • PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cells
  • B cells B cells, T cells, macrophages, natural killer cells, lymphocytes, and monosites. will be.
  • the PBMC is used to separate the mononuclear cells except B cells and B cells, the latter is called a reaction cell. Isolation of PBMCs from blood and methods for isolating B cells and remaining mononuclear cells other than the same from PBMCs are known, and for example, the methods described in the Examples herein can be referred to.
  • Human peripheral blood mononuclear cells in the method according to the invention include those that are autologous or allogeneic.
  • the cells obtained by taking blood from the subject and then treating it in vitro by the method according to the invention can be injected into the same subject.
  • B cells are activated with a Biological Response Modifier. That is, the bioreactive modulator is for activating B cells, in particular in one embodiment alpha-galactosyl ceramide is used.
  • the antigen-specific T cell amplification was markedly increased in the second culture when compared to the primary culture of the activated B cells and the reactive cells to which the antigen was delivered.
  • cytokines may be added in the first or second culture step, in particular the secondary culture step.
  • the type of cytokine is not limited, and includes IL-15, IL-2, IL-4, IL-7 or IL-9, and may be used at a concentration of about 10-100 ng / ml.
  • Antigens expressed in B cells in the methods according to the present invention in nature include peptides, lipopolysaccharides, polysaccharides, glycoproteins or polynucleotides.
  • Antigens expressed in B cells in the method according to the present invention are antigens derived from pathogens or cancer-associated antigens, including pathogenic bacteria, viruses and parasites in functional terms.
  • viral antigens are used, which viral antigens are referred to as Epstein-Barr virus (EBV) antigens (E1dGALMP2 Mol Ther. 2013 Nov; 21 (11): 2113-21, immediate early protein BZLF1 ), Cytomegalovirus (CMV) antigens (pp65, IE1), Adenovirus (Adv) antigens (HEXON, PENTON), influenza virus antigens, human papilloma virus (HPV) Antigen (glycoprotein), vesicular stomatitis virus antigen (vesicular stomatitis virus glycoprotein), hepatitis virus antigen (hepatitis A (HAV), B (HBV), C (HCV), D (HDV)) And (G (HGV) antigen) (core antigen and surface antigen), respiratory synctytial virus (RSV) antigen, herpes simplex virus antigen, human immunodeficiency virus (HIV) Antigens (GP-
  • EBV
  • the antigen is delivered to the cell in the form of a nucleic acid or peptide or protein.
  • the vector used for delivery of the nucleic acid is a plasmid vector, which is delivered to the nucleus of B cells via a nucleation method, and those as described in the Examples herein can be used.
  • the antigens used in the methods herein are EBV, CMV and Adv antigens, which are pCK-pp65-IRES-IE1, pCK prepared by the cleavage maps disclosed in FIGS. 8A-8C and the methods described in the Examples herein, respectively.
  • -E1dGALMP2-IRES-BZLF1 and pCK-HEXON-IRES-PENTON plasmid vectors are delivered.
  • the cancer antigen comprises but is not limited to a cancer-causing protein comprising MAGE1, AFP, CEA, or tyrosinase, or a tumor specific antigen comprising telomerase, BCR-ABL, or RHAMM-R3
  • the antigen peptide may be used as the antigen.
  • a transfected activated The B cell and the reactive cell concentration are used at a ratio of about 1:20 to 1: 1, in particular 1:10.
  • the method according to the invention is an antigen presenting cell for the production of the antigen-specific cytotoxic T cells introduced, for example alpha-gal instead of dendritic cells (DC), which is disadvantageous in terms of cost and production time due to the use of cytokines.
  • B cells activated with lactosylceramides can be used to produce high-efficiency antigen specific cytotoxic T cells faster and at lower cost. Comparing the method according to the present application with the existing method is as follows.
  • the administration of antiviral drugs is a standard treatment for the treatment of viral infections, but there are many cases where there is no cure for a specific virus, and even if it is expensive, the drug itself is toxic, the effect may be temporary, and the drug is resistant. There are many problems such as not being treated.
  • treatment with the antigen-specific cytotoxic T cells of the present application is capable of restoring antiviral immunity, which is the underlying etiology for patients to become virally infected.
  • the cells obtained by taking blood from the subject and then treating it in vitro by the method according to the invention can be injected into the same subject.
  • the present disclosure also provides cytotoxic T cells specific for the antigen, as described above, derived from B cells loaded with bioresponsive modulators and expressing pathogenic bacteria, viral antigens, or cancer related antigens. It relates to an immune cell therapy comprising.
  • cell therapy or “immune cell therapy” refers to the ability of a cell to reproduce and / or screen living autologous, allogenic cells in vitro or otherwise to restore cell tissue and function.
  • the immune cell therapy according to the present application may further comprise other immunotherapeutic agents.
  • Cell therapy according to the present invention is to include autologous cell therapy, allogeneic cell therapy.
  • the cell therapeutic agent according to the present invention is isolated from the cells and then subjected to the necessary manipulations on the isolated cells using the method according to the above-described method to produce cytotoxic T cells in vitro and then administering them, for example antiviral.
  • Immune cells can be produced and administered in vitro and can be used, for example, by methods described in Lindwald et al. (1989, Arch. Neurol. 46: 615-31) or Douglas Kondziolka, Pittsburgh, 1998. have.
  • the treatment with the antigen-specific cytotoxic T cells of the present application can restore the antiviral immunity, which is the underlying etiology for the patient to be infected with the virus, and especially for the treatment of infection, viral infection in immunosuppressed state after organ transplantation Can be used for
  • the route of administration of the cell therapeutic agent or pharmaceutical composition comprising the cells according to the present application can be administered via any general route as long as it can reach the desired tissue.
  • Parenteral administration for example, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration may be, but is not limited thereto.
  • Therapeutic agents or compositions according to the invention may be formulated in a suitable form with the pharmaceutically acceptable carriers generally used.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, water, suitable oils, saline, carriers for parenteral administration such as aqueous glucose and glycols, and the like, and may further include stabilizers and preservatives.
  • Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
  • composition for cell therapy according to the present invention if necessary according to the administration method or dosage form, suspensions, dissolution aids, stabilizers, isotonic agents, preservatives, adsorption agents, surfactants, diluents, excipients, pH adjusters, analgesics , Buffers, antioxidants, and the like may be appropriately included.
  • Pharmaceutically acceptable carriers and formulations suitable for the present invention including those exemplified above, are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition.
  • the cell therapy composition of the present invention is in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by those skilled in the art. It can be made or prepared by incorporating into a multi-dose container.
  • the composition may also be administered by any device in which the cell therapy agent can migrate to the target cell.
  • the cell therapy composition of the present invention may include a therapeutically effective amount of cell therapy for the treatment of a disease.
  • the term 'therapeutically effective amount' means an amount of an active ingredient or pharmaceutical composition that induces a biological or medical response in a tissue system, animal or human, as thought by a researcher, veterinarian, physician or other clinical person, Amounts that induce alleviation of the symptoms of the disease or disorder. It will be apparent to those skilled in the art that the cell therapy agent included in the composition of the present invention will vary depending on the desired effect.
  • the optimal cell therapy content can be readily determined by one skilled in the art and includes the type of disease, the severity of the disease, the amount of other components contained in the composition, the type of formulation, and the age, weight, general health, sex and diet of the patient. It can be adjusted according to various factors including the time of administration, the route of administration and the rate of secretion of the composition, the duration of treatment, and the drugs used simultaneously.
  • the cell therapy agent is administered into the blood vessel by injection.
  • Dosage can be adjusted as appropriate.
  • the number of administrations may be one or two or more times within the range of clinically acceptable side effects, and may be administered to one or more than two sites for the administration site.
  • the same dosage as that of humans per kg or the volume ratio (for example, average value) of the ischemic organs (heart, etc.) between the animal and the human being of interest may be adjusted. Equivalent amounts may be administered.
  • Examples of the animal to be treated according to the present invention include humans and mammals for other purposes, and specifically include humans, monkeys, mice, rats, rabbits, sheep, cattle, dogs, horses, pigs, and the like. do.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • Ficoll-paqueTM plus GE Healthcare
  • B-cell isolation kit II (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) was used according to the manufacturer's method for anti-CD2, anti-CD14, anti-CD16, anti-CD36, anti- B cells were negatively isolated using CD43 and anti-CD235a. Purity of the isolated cells was confirmed using a flow cytometer (FACSCanto TM II, BD bioscience), the purity was confirmed as more than 95%. The isolated cells were a-GalCer treated or stored frozen in RPMI with 10% FBS.
  • B cells were activated as follows and nuclear-transferred into antigen-coding plasmids, which were then used as stimulating cells.
  • B cells isolated as described above were activated by treating 1x10 ⁇ 6 cells / ml of 10% RPMI medium with 1 ⁇ g / ml of alpha-galactosyl ceramide at 37 ° C. for about 16 hours.
  • Plasmids encoding the antigens of EBV, CMV and Adv were pCK-IE1-IRES-pp65 (IE1, pp65), pCK-E1dGALMP2-IRES-BZLF1 (E1dGALMP2, BZLF1) and pCK-HEXON-IRES-PENTON® (HEXON, The antigenic sites of PENTON) were cloned into pCK-IRES (Viromed, South Korea) vectors to construct the following vectors encoding two antigens of EBV, CMV and Adv, respectively: pCK-IE1-IRES-pp65, pCK-E1dGALMP2- IRES-BZLF1 and pCK-HEXON-IRES-PENTON.
  • the plasmid prepared as described above was delivered to the activated B cells prepared in Example 1 using the AMAXA Nucleofection system according to the manufacturer's method.
  • 1-5 ⁇ g of plasmid DNA was nucleated to 1-5 ⁇ 10 6 activated B cells, which were then incubated for 12-18 hours in a wet 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
  • Peptide JPT, Germany
  • a peptide library of CMV antigens PP65, IE1 and EBV antigens LMP2, BZLF1, and Adenovirus antigens HEXON and PENTON was dissolved in PBS and used as 1 ⁇ g / test.
  • Activated B cells and pepmix 1 ⁇ g prepared as described above were mixed and incubated for 1-2 hours in a humidified 37 °C, 5% CO 2 incubator. After culturing, the cells were cultured in the same manner as the mononuclear cells remaining after the B cells in the same manner as in the B cells nucleated with the plasmid.
  • the mononuclear cells remaining after B cell separation as described in Example 1 are reactive cells, and B cells to which nucleated B cells and antigen polypeptides are delivered as in Examples 2-1 and 2-2, respectively.
  • the reaction cells and stimulation cells were cultured in RPMI 1640 medium containing 45% Click 'medium (Irvine Scientific, CA, USA), 2mmol / L Glutamax TM -I and 10% FBS, harvested and re-stimulated on the 7th day of culture. . From day 7, IL-15 was incubated with 50ng / ml. Antigen specific immune responses were measured after two stimuli.
  • the first stimulation was performed by mixing the remaining reaction cells and the concentration of nuclear transferred B cells at a ratio of 10: 1 after 7 days of cell separation, and culturing without changing medium for 7 days.
  • the cells were harvested at 7 days and newly activated nuclear B was transferred.
  • the cells were mixed again and cultured at a ratio of 10: 1, and IL-15 was added at a concentration of 50ng / ml. Every 2-3 days thereafter, the medium was changed at the level of 30-40%.
  • Induced cytotoxic T cells were confirmed by flow cytometry.
  • Flow cytometry harvested cells washed, resuspended in DPBS, and incubated in various dark-binding antibodies (CD3, CD4, CD8, CD56, CD45RA and CD62L) (BD Pharmingen) in a 4 ° C. refrigerator for 15 minutes in the dark. It was. Cells were then washed and resuspended and analyzed by FACSCanto TM II (BD bioscience).
  • FACSCanto TM II BD bioscience.
  • CD45RA + CD62L + which represents NAIVE CELL
  • CD45RA-CD62L + which was CENTRAL MEMORY
  • CD45RA-CD62L- which was EFFECTOR MEMORY
  • IFN- ⁇ interferon-gamma
  • Example 3 Cells secreting interferon-gamma (IFN- ⁇ ) from the cytotoxic T cells induced in Example 3 were measured using the ELISTPOT Assay Kit (BD bioscience, San Diego, Calif.) According to the manufacturer's method.
  • antigen-presenting cells were used as mononuclear cells of the same donor, and antigen was used as a peptide library, a peptide library consisting of 15 amino acids overlapping 11 amino acids produced by JPT Technologies (Berlin, Germany). The results are described in FIG. As shown here, cytotoxic T cells secreted interferon gamma specific to each viral antigen.
  • each antigen prepared in Example 2 was stimulated twice with treated B cells, and then autologous mononuclear cells treated with the pepmix of Example 4 were used as target cells.
  • Use CytoTox96 ® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay ( Promega, USA) according to the kit method of the manufacturer to measure the antigen fusion (lysis).
  • the kit measures Lactate Dehydrogenase (LDH), a stable cellular enzyme secreted when cells are fused, and the specific percentage of lysis is calculated as follows.
  • LDH Lactate Dehydrogenase
  • % Specific fusion [(Experimental release-Effector Spontaneous release-Target Spontaneous release) / (Target Maximum release-Target Spontaneous release)] x 100.
  • the results are described in FIG.
  • target cells having respective antigens of CMV, EBV and Adv are effectively killed by cytotoxic T cells induced for two weeks.
  • reaction cells mononuclear cells remaining after B cell separation as described in Example 1 were used as reaction cells, and nucleated B cells of Example 2 were used as stimulating cells.
  • the reaction cells and stimulation cells were cultured in RPMI 1640 medium containing 45% Click 'medium (Irvine Scientific, CA, USA), 2mmol / L Glutamax TM -I and 10% FBS, harvested and re-stimulated on the 7th day of culture. .
  • Cell counts were measured after two stimuli.
  • IL-15 (7day) group was incubated with 50ng / ml of IL-15 from the 7th day of the second stimulation day, and IL-15 (0day) group was added with 50ng / ml of L-15 from the first stimulation day of the day. Incubated.
  • IL-4 / 7 group was cultured with the addition of IL-4 1000U / ml and IL-7 10ng / ml from the 7th day of the second stimulation.
  • the first stimulation was performed by mixing the remaining reaction cells and the concentration of nuclear transferred B cells at a ratio of 10: 1 after 7 days of cell separation, and culturing without changing medium for 7 days.
  • the cells were mixed again and cultured at a ratio of 10: 1, and each cytokine was added at the same concentration. Every 2-3 days thereafter, the medium was changed at the level of 30-40%. The results are described in FIG. 6.
  • interferon-gamma IFN- ⁇
  • ELISTPOT assay kit BD bioscience, San Diego, CA
  • antigen-presenting cells were used as mononuclear cells of the same donor, and antigen was used as a peptide library, a peptide library consisting of 15 amino acids overlapping 11 amino acids produced by JPT Technologies (Berlin, Germany).
  • JPT Technologies JPT Technologies (Berlin, Germany).
  • FIG. As shown here, cytotoxic T cells secreted interferon gamma specific to each viral antigen. The results are described in FIG.
  • the results of FIG. 6 showed that T cell amplification was significantly increased when stimulated twice compared to once stimulated with activated B cells. After stimulation for 7 days, the cells were collected and measured, indicating that the number of cells decreased. This may be due to the killing of non-specific T cells or other non-T cells.
  • the cell amplification is best performed by the group in which IL-15 is added during the first stimulation and the second stimulation.
  • the group showed the best results, which is believed to be due to the efficient increase of antigen-specific educated T cells upon cytokine treatment at day 7 at the start of the two stimuli.
  • the addition of IL-15 from the first stimulus increases NK cells, which is judged to be due to the proliferation of cytokines by cells that are not specific for the antigen (results not shown).

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Abstract

본원은 생물반응조절제가 적제되고 바이러스 항원을 발현하는 B 세포를 이용한 체외 항원 특이적 세포독성 T 세포 제조 방법 및 그 용도를 개시한다. 본원에 따른 방법에 의해 제조된 세포독성 T 세포는 감염치료 및 암 치료 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

활성화 B 세포를 이용한 항원 특이적 세포 독성 T 세포 제조 방법 및 그 용도
본원은 면역세포치료 기술분야이다.
현재 세포를 이용한 치료는 크게 줄기세포를 이용한 재생의학 분야이고, 다른 하나는 면역세포를 이용한 암 및 바이러스 감염 등을 치료하는 분야이다. 이 중 세포 독성 T 세포를 활용한 면역세포치료는 멜라노마를 모델로 하는 연구 (Rosenberg SA et al., Nat Rev Cancer 8(4):299-308, 2008)와 조혈모세포이식을 모델로 하는 연구 (Heslop HE et al., New Engl J Med 331:679-680, 1994)가 주를 이루고 있다.
이 중, 조혈모세포이식은 여러 질환을 완치 시킬 수 있는 치료법이나 아직까지 완전한 치료법은 아니며, 백혈병 등 원 질환의 재발, 생착의 실패, 고용량 항암치료에 관련된 독성, GVHD 및 면역억제에 동반된 감염 등이 실패의 원인으로 지목되고 있다.
특히 이식 후 면역억제상태에서의 감염은 중요한 문제이고 이중에서도 바이러스 감염은 적절한 치료가 어려운 경우가 많다 (Leen AM et al., Br J Hematol 143(2):169-179, 2008; Leen AM et al., Expert Opin Biol Ther 10(3):337-51, 2010). 최근 비혈연공여자(unrelated donor, cord blood, haploidentical donor)로부터의 이식이 증가하며 좀더 강력한 면역억제제를 사용하는 경우가 많아지고 GVHD 치료에 새로운 면역억제제가 사용되기 시작하며 바이러스 감염 진단법의 발달과 더불어 성공적인 이식을 위해서 바이러스 감염의 해결이 점점 더 중요한 문제로 대두되고 있다 (Boeckh M et al., Pediatr Transplant 9:48-54, 2005; Bruno B et al., Biol Blood Marrow Transplant 9(5):341-52, 2003; Fischer SA et al., Transplantation 86(10):1327-39, 2008; Leen AM et al., Br J Haematol 128(2):135-44, 2005; Peck AJ et al., Blood 110(5):1681-8, 2007; Zerr DM et al., Clin Infect Dis 40(7):932-40, 2005). 최근 보고된 국내의 비혈연이식의 결과에서도 바이러스 감염 특히 EBV, cytomegalovirus(CMV) 등의 관련 사망이 가장 중요한 이식 실패의 원인이었으며 전체 환자의 약 10%가 이로 인하여 사망하였다 (Kang HJ et al., Ann Hematol 89(10):1035-44, 2010; Kang HJ et al., Biol Blood Marrow Transplant 16(11):1582-8 2010).
현재 개발된 다중 항바이러스 면역세포치료는 아데노바이러스 벡터에 CMV (Cytomegalovirus antigen. pp65)를 삽입한 Ad5f35-pp65를 공여자의 단핵구에 도입하여 T 세포를 활성화 한 후에 다시 Ad5f35-pp65를 LCL (Epstein-Barr virus-transformed lymphoblastoid cell)에 도입하나, 이는 T 세포를 활성화 하는 방법을 사용하는데 효과적이기는 하지만 향후 여러 바이러스 질환 및 다수의 환자에게 적용하기에는 높은 생산비용, 복잡한 생산공정, 10주 이상의 긴 생산기간 등의 문제점이 있다.
이와 같은 복잡하고 비효율적인 생산방법을 극복하기 위해서 여러 가지 노력이 시도되었으며, 다루기 어려운 아데노바이러스 벡터 대신에 플라스미드 벡터를 사용하고, 2) APC (Antigen Presenting Cell)로 수지상세포를 사용하며 핵전달(nucleofection) 방법으로 플라스미드를 수지상세포에 전달하며 새로운 사이토카인의 조합(IL-7: 10 ng/ml, IL-4: 1,000 U/ml)과 생물반응기를 사용하여 T세포 배양효율을 높이는 기술을 통해 생산공정을 간결하게 하고, 생산비용 및 생산기간을 단축하였다 (Leen AM et al., Expert Opin Biol Ther 10(3):337-51, 2010).
하지만 면역세포를 활성화시키기 위하여 수지상세포를 사용하는 것 자체도 시간과 비용이 많이 필요하기에 보다 간결한 면역세포치료기술의 개발이 필요하다.
체외에서 세포독성 T세포를 활성화 시켜 사람에게 투여하는 기술은 바이러스 질환 뿐 아니라 여러 기타 감염과 암, 면역질환을 치료하는 다양한 질환에 사용되고 있기에 개발된 보다 간결한 면역세포치료제 생산기술은 여러 질환의 면역세포치료에 사용 될 수 있다.
면역세포치료에 사용되는 항원 특이적 세포독성 T 세포생산 방법 및 그 용도를 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 인간 말초혈액단핵세포를 제공하는 단계; 상기 말초혈액단핵세포를 B 세포 및 상기 B 세포를 제외한 나머지 단핵 세포로 분리하는 단계; 상기 B 세포를 알파-갈락토실세라마이드, 알파-글루쿠로노실세라마이드, 포스파티딜이노시톨테트라만노사이드, 이소글로보트리헥소실세라마이드, 갱글리오사이드 GD3, 포스파티딜콜린, 베타-갈락토실세라마이드, 리포포스포글리칸, 글리코이노시톨 포스포리피드, 알파-갈락토실세라마이드의 유사체인 베타-아노머 갈락토실세라마이드 및 알파-아노머 갈락토실세라마이드, 및 박테리아 지질 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 생체반응조절물질로 처리하여 활성화하는 단계; 상기 활성화된 B 세포에 항원을 코딩하는 핵산 또는 펩타이드를 전달하는 단계; 상기 항원이 전달된 활성화된 B 세포와 상기 B 세포를 제외한 나머지 단핵 세포를 혼합하여 1차 배양하는 단계; 및 상기 1차 배양 후에, 상기 항원이 전달된 활성화된 B 세포를 추가로 혼합하여 2차 배양하는 단계를 포함하며, 상기 배양에 의해 체외에서 상기 항원 특이적 T 세포가 생성된다.
본원에 따른 방법에서 상기 항원은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 세포에 전달될 수 있으며, 예를 들면 본원 실시예에 기재된 것을 참조할 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 세포를 포함하는 면역 세포치료제를 제공하며, 일 구현예에서 본원에 따른 면역세포치료제는 기존의 기타 면역치료제와 함께 사용될 수 있다.
항원 특이적 세포독성 T 세포의 생산을 위해 항원제시세포로서, 사이토카인 사용으로 인한 고비용 및 생산기간 면에서 불리한 수지상세포 (Dendritic cell, DC) 대신에 알파-갈락토실세라미드로 활성화된 B 세포를 사용하여 항원 특이적 세포독성 T 세포를 생산하였으며, 이는 바이러스 감염 및 기타 감염과 암 등의 치료 등에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본원의 일 구현예에 따른 알파-갈락토실세라미드로 활성화된 B 세포를 항원제시세포로 사용하여 CMV, EBV, Adenovirus 등의 바이러스에 특이적인 세포독성 T 세포를 생산하는 본원에 따른 T 세포 활성화 방법을 도식화한 것이다.
도 2는 본원의 일 구현예에 따른 활성화된 B 세포를 2회 사용하여 항원 특이적인 세포독성 T 세포를 생산하는 방법을 도식화한 것이다.
도 3a 및 도 3b은 본원에서 제조된 세포독성 T 세포에서 항원 특이적으로 분비되는 IFN-gamma를 ELISPOT로 측정한 결과로, 도 3a의 T 세포는 실시예 2-1의 항원을 코딩하는 핵산이 전달된 B 세포, 도 3b의 T 세포는 실시예 2-2와 같인 항원으로 작용하는 펩타이드가 전달된 B 세포를 이용하여 배양된 것이다.
도 4는 본원에서 제조된 세포독성 T 세포를 이용한 세포독성 실험결과이다.
도 5는 활성화된 B 세포를 2회 사용한 경우, 1회 사용한 것과 비교하여 세포독성 T 세포 증폭 결과를 측정한 결과이다.
도 6은 활성화된 B 세포를 이용한 세포독성 T 세포 생산에 있어, 첨가한 사이토카인의 종류, 시기 및 농도에 따른 T 세포 증폭 결과를 측정한 결과로, 청색선은 IL-15를 두 번째 자극시에 첨가한 결과이고, 적색선은 IL-15을 첫 번째 및 두 번째 자극 시 모두에 첨가한 결과이고, 녹색선은 IL-4 및 IL-7를 두 번째 자극시 첨가한 것이다.
도 7은 도 6의 조건으로 처리한 후 ELISPOT로 분석한 결과이다.
도 8a 내지 8c는 본원에 따른 항원특이적 세포독성 T 세포의 생산에 사용된 플라즈미드의 개열지도이다.
본원은 면역세포치료에 사용되는 항원 특이적 세포독성 T 세포의 생산을 위해 항원제시세포로서, 사이토카인 사용으로 인한 고비용 및 기간 면에서 불리한 수지상세포 (Dendritic cell, DC) 대신에 알파-갈락토실세라미드로 활성화된 B 세포를 사용하여 체외에서 항원 특이적 세포독성 T 세포를 생산할 수 있다는 발견에 근거한 것이다.
따라서 한 양태에서 본원은 체외에서 항원 특이적 세포독성 T 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본원에 따른 방법은 인간 말초혈액단핵세포를 제공하는 단계; ① 상기 말초혈액단핵세포로를 B 세포와 상기 B세포를 제외한 나머지 단핵 세포로 분리하는 단계; ② 상기 B 세포를 알파-갈락토실세라마이드, 알파-글루쿠로노실세라마이드, 포스파티딜이노시톨테트라만노사이드, 이소글로보트리헥소실세라마이드, 갱글리오사이드 GD3, 포스파티딜콜린, 베타-갈락토실세라마이드, 리포포스포글리칸, 글리코이노시톨 포스포리피드, 알파-갈락토실세라마이드의 유사체인 베타-아노머 갈락토실세라마이드 및 알파-아노머 갈락토실세라마이드, 및 박테리아 지질 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 생체반응조절물질로 처리하여 활성화하는 단계; ③ 상기 활성화된 B 세포에 특정 항원을 코딩하는 핵산 또는 펩타이드를 전달하는 단계; ④ 상기 항원이 전달된 활성화된 B 세포와 상기 B세포를 제외한 나머지 단핵 세포인 반응세포를 혼합하여 1차 배양하는 단계; 및 상기 1차 배양 후에, 상기 항원이 전달된 활성화된 B 세포를 추가로 혼합하여 2차 배양하는 단계를 포함하며, 상기 배양에 의해 체외에서 항원 특이적 T 세포가 생성된다.
본원에서 말초혈액단핵세포 (Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC)는 혈액에 존재하는 세포로 다양한 면역세포 예를 들면, B 세포, T 세포, 대식세포, 자연살해세포, 림프구, 및 모노사이트 등을 포함하는 것이다.
본원에 따른 방법에서는 PBMC를 B 세포와 B 세포를 제외한 나머지 단핵세포로 분리하여 사용되며, 후자는 반응세포로 칭한다. 혈액으로부터 PBMC의 분리 그리고 PBMC로부터 B 세포 및 이를 제외한 나머지 단핵세포인 반응세포를 분리하는 방법은 공지되어 있으며, 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방법을 참고할 수 있다.
본원에 따른 방법에서 인간 말초혈액단핵세포는 자가 또는 동종인 것을 포함한다. 일 구현예에서는 대상체로부터 혈액을 채취한 후 이를 본원에 따른 방법에 의해 인비트로에서 처리하여 수득한 세포를 동일한 대상체에게 주입할 수 있다.
본원에 따른 방법에서 B 세포는 생체반응조절물질(Biological Response Modifier)로 활성화된다. 즉, 생체반응조절물질은 B 세포를 활성화하기 위한 것으로, 특히 일 구현예에서는 알파-갈락토실세라마이드가 사용된다.
본원에 따른 방법에서 항원이 전달된 활성화된 B 세포와 반응세포를 1차 배양한 것과 비교하여 2차 배양한 경우 항원 특이적 T 세포 증폭이 현저하게 증가하는 것으로 나타났다.
본원에 따른 방법에서는 1차 또는 2차 배양 단계, 특히 2차 배양단계에서 사이토카인이 추가될 수 있다. 사이토카인의 종류는 한정되지 않으며, IL-15, IL-2, IL-4, IL-7 또는 IL-9를 포함하며, 약 10~100ng/ml의 농도로 사용될 수 있다.
본원에 따른 방법에서 B 세포에서 발현되는 항원은 화학적 측면에서 성질상 펩티드, 지질다당류, 다당류, 당단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 따른 방법에서 B 세포에서 발현되는 항원은 기능적 측면에서 병원성 세균, 바이러스 및 기생충을 포함하는 병원체 유래의 항원 또는 암관련 항원이다.
일 구현예에서는 특히 바이러스 항원이 사용되며, 상기 바이러스 항원은 앱스테인바 바이러스 (Epstein-Barr virus, EBV) 항원 (E1dGALMP2 Mol Ther. 2013 Nov;21(11):2113-21 참조, immediate early protein BZLF1), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 항원 (pp65, IE1), 아데노바이러스 (Adenovirus, Adv) 항원 (HEXON, PENTON), 인플루엔자 바이러스(influenza virus) 항원, 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus, HPV) 항원 (glycoprotein), 소수포성 입안염 바이러스(vesicular stomatitis virus) 항원(vesicular stomatitis virus glycoprotein), 간염(hepatitis)바이러스 항원(hepatitis A(HAV), B(HBV), C(HCV), D(HDV) 및 G(HGV) 항원)(core antigen and surface antigen), 호흡기 다핵체 바이러스(respiratory synctytial virus, RSV) 항원, 허피스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 항원, 인간면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 항원(GP-120, GP-160, p18, Tat, Gag, Pol, Env) 및 그의 조합으로 이루어진 군 등으로부터 선택된다.
본원에 따른 방법에서 상기 항원은 핵산 또는 펩타이드 또는 단백질의 형태로 세포에 전달된다. 일 구현에에서 핵산의 전달에 사용되는 벡터는 플라스미드 벡터이며, 핵전달이입 방법을 통해, B 세포의 핵에 전달되며, 본원 실시예에 기재된 것과 같은 것이 사용될 수 있다.
일 구현예에서 본원의 방법에 사용되는 항원은 EBV, CMV 및 Adv 항원이며, 이는 각각 도 8a 내지 8c에 개시된 개열지도 및 본원의 실시예에 기재된 방법으로 제조된 pCK-pp65-IRES-IE1, pCK-E1dGALMP2-IRES-BZLF1 및 pCK-HEXON-IRES-PENTON 플라스미드 벡터를 통해 전달된다.
다른 구현예에서 암 항원은 MAGE1, AFP, CEA, 또는 타이로시나제를 포함하는 암유발단백질, 또는 텔로머라제, BCR-ABL, 또는 RHAMM-R3를 포함하는 종양특이적 항원을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니며 또한 항원 펩티드 등을 항원으로 사용할 수 있다.
본원에 따른 방법에서 핵전달이입된 B 세포와 B 세포를 제외한 나머지 단핵 세포를 함께 배양하여 상기 B 세포에서 발현하는 항원에 특이적인 세포 독성 T 세포를 생산하며, 일 구현예에서 전달이입된 활성화된 B 세포와 상기 반응세포 농도는 약 1: 20 내지 1: 1, 특히 1:10의 비율로 사용된다.
본원에 따른 방법은 도입된 항원 특이적 세포독성 T 세포의 생산을 위해 항원제시세포로서, 사이토카인 사용으로 인한 고비용 및 생산기간 면에서 불리한 수지상세포 (Dendritic cell, DC) 대신에 일예로 알파-갈락토실세라미드로 활성화된 B 세포를 사용하여 보다 신속하고, 저렴한 비용으로 효과가 높은 항원 특이적 세포독성 T 세포를 생산할 수 있다. 본원에 따른 방법을 기존의 방법과 비교하면 다음과 같다.
Figure PCTKR2015005075-appb-I000001
현재 바이러스 감염의 치료로 항바이러스제의 투여가 표준 치료로 되어있는데 특정 바이러스에 대한 치료약이 없는 경우가 많고, 있다 하더라도 비용이 높고 약제자체의 독성이 있으며, 효과가 일시적일 수 있으며, 약제에 내성이 있어 치료가 안 되는 등의 많은 문제가 있다. 이와 비교하여 본원의 항원 특이적 세포독성 T 세포를 이용한 치료는 환자가 바이러스감염이 되는 근본적인 병인인 항바이러스 면역력을 회복시킬 수 있는 것이다. 일 구현예에서는 대상체로부터 혈액을 채취한 후 이를 본원에 따른 방법에 의해 인비트로에서 처리하여 수득한 세포를 동일한 대상체에게 주입할 수 있다.
이런 측면에서 다른 양태에서 본원은 또한 상술한 바와 같이, 생체반응조절물질이 적제되고 병원성 세균, 바이러스 항원, 또는 암관련항원을 발현하는 B 세포로 유도된, 상기 항원에 특이적인 세포독성 T 세포를 포함하는 면역 세포치료제에 관한 것이다.
본원에서‘세포치료제’또는 ‘면역 세포치료제“라 함은 ‘세포의 조직과 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic) 세포를 체외에서 증식·선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품 (생물학적제제등의 허가 및 심사에 관한 규정 (식약청고시))이다.
일 구현예에서, 본원에 따른 면역 세포치료제는 기타 면역치료제를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 따른 세포 치료제는 자가세포치료제, 동종유래세포치료제를 포함하는 것이다.
본원에 따른 세포 치료제는 세포를 분리한 후 앞서 기술된 본원에 따른 방법을 이용하여, 분리된 세포에 필요한 조작을 가하여, 체외에서 세포독성 T 세포를 생산한 후 이를 투여하며, 예를 들면 항바이러스 면역세포를 체외에서 생산하여 투여될 수 있으며, 예를 들어 린드발 등 (1989, Arch. Neurol. 46: 615-31) 또는 더글라스콘치올카 (Douglas Kondziolka, Pittsburgh, 1998) 에 기재된 방법을 이용할 수 있다.
일 구현예에서 본원의 항원특이적 세포독성 T 세포를 이용한 치료는 환자가 바이러스감염이 되는 근본적인 병인인 항바이러스 면역력을 회복시킬 수 있으며, 특히 감염치료, 장기이식 후 면역억제 상태의 바이러스 감염의 치료에 사용될 수 있다.
본원에 따른 세포 치료제 또는 세포를 포함하는 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여될　수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 따른 치료제 또는 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 세포치료용 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 세포치료용 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
또한 상기 조성물은 세포치료제가 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 본 발명의 세포치료제 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다. 용어 ‘치료적으로 유효한 양’은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 세포치료제는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다.
그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서 세포치료제는 주사로 혈관으로 투여된다.
상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개 부위 또는 2개 부위 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg 당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 허혈기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 말초혈액단핵세포로부터 B 세포의 분리 및 B 세포 활성화
인간 말초 혈액은 건강한 공여자로부터 수득하였다. 이어 말초혈액으로부터 Ficoll-paqueTM plus(GE Healthcare)를 제조자의 방법대로 사용하여 밀도구배 원심분리로 말초혈액단핵세포(PBMC)를 분리하였다.
이어 밀도 구배 후, B cell isolation kit II(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)을 제조자의 방법대로 사용하여 마그네틱 마이크로 비드에 결합된 anti-CD2, anti-CD14, anti-CD16, anti-CD36, anti-CD43 및 anti-CD235a를 사용하여 음성선택적으로 B세포를 분리하였다. 분리된 세포의 순도는 유세포분석기 (FACSCantoTMII, BD bioscience)를 사용하여 확인하였으며, 순도는 95% 이상으로 확인되었다. 분리된 세포는 10% FBS가 포함된 RPMI에서 a-GalCer 처리되거나 사용시까지 냉동보관하였다.
분리된 B 세포는 다음과 같이 활성화하여 항원코딩 플라스미드로 핵전달된 후, 자극세포로 사용되었으며, B 세포 분리 후 남은 단핵세포는 반응세포로 사용되었다. 상기와 같이 분리된 B 세포는 10% RPMI 배지의 1x10^6 cells/ml 의 세포를 1μg/ml의 알파-갈락토실세라미드로 37℃에서 약 16시간 처리하여 활성화 하였다.
실시예 2. 항원 전달
실시예 2-1 항원을 코딩하는 플라스미드 제작 및 핵전달 (nucleofection)
EBV, CMV 및 Adv의 각 항원을 코딩하고 있는 플라스미드로 pCK-IE1-IRES-pp65 (IE1, pp65), pCK-E1dGALMP2-IRES-BZLF1 (E1dGALMP2, BZLF1) 및 pCK-HEXON-IRES-PENTON　(HEXON, PENTON)의 항원 부위를 pCK-IRES(바이로메드, 대한민국) 벡터로 클로닝하여 각각 EBV, CMV 및 Adv 의 항원을 두 개씩 코딩하는 다음의 벡터를 제작하였다: pCK-IE1-IRES-pp65, pCK-E1dGALMP2-IRES-BZLF1 및 pCK-HEXON-IRES-PENTON.
상기와 같이 제작한 플라스미드를 실시예 1에서 준비한 활성화된 B 세포에 AMAXA Nucleofection system을 제조사의 방법대로 사용하여 전달하였다. 요약하면 1-5x10^6 개의 활성화된 B 세포에 1-5μg의 플라스미드 DNA를 핵전달하고, 이어, 이를 습윤된 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 12-18시간동안 배양하였다.
실시예 2-2 항원 폴리펩타이드로 전달
CMV항원인 PP65, IE1와 EBV 항원인 LMP2, BZLF1, 그리고 Adenovirus 항원인 HEXON, PENTON 의 펩타이드 라이브러리인 pepmix (JPT, Germany) 를 PBS로 녹여 1μg/test로 사용하였다. 활성화된 B세포와 상기와 같이 준비한 pepmix 1μg을 섞어 습윤된 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 1-2시간동안 배양하였다. 배양후 플라스미드로 핵전달된 B세포에서와 동일하게 B 세포후 남은 단핵세포와 같은 방법으로 배양하였다.
실시예 3. 세포독성 T 세포 생산
이를 위해 실시예 1에 기재된 바와 같은 B 세포 분리 후 남은 단핵세포는 반응 세포로, 그리고 실시예 2-1 및 2-2에서와 같이 핵전달된 B 세포 및 항원 폴리펩타이드가 전달된 B 세포를 각각 자극 세포로 사용하였다. 상기 반응세포와 자극세포는 45% Click’배지(Irvine Scientific, CA, USA), 2mmol/L GlutamaxTM-I 그리고 10% FBS이 포함된 RPMI 1640 배지에서 배양하였으며, 배양 7일째 수확하여 재자극 하였다. 7일째부터 IL-15를 50ng/ml로 첨가하여 배양하였다. 2번 자극 후에 항원 특이적 면역 반응을 측정하였다.
구체적으로 첫 번째 자극은 B 세포 분리 후 남은 반응세포와 핵전달된 B세포의 농도를 10:1 비율로 혼합하여 7일간 배지 교체 없이 배양하였고 7일째에 세포들을 수거하고 새로 핵전달된 활성화된 B세포와 10:1의 비율로 다시 혼합하여 배양하였으며, 이때 IL-15가 50ng/ml 농도로 첨가 되었다. 이후 2-3일마다 배지를 30-40% 수준에서 교체하였다.
유도된 세포독성 T 세포는 유세포분석으로 확인하였다. 유세포분석은 세포들을 수확하고, 세척하고, DPBS에 재현탁 한 후, 이를 다양한 형광결합 항체 (CD3, CD4, CD8, CD56, CD45RA and CD62L)(BD Pharmingen)와 암실에서 15분간 4℃ 냉장고에서 배양하였다. 이어 세포들을 세척하고 재현탁 후, FACSCantoTMII(BD bioscience)로 분석하였다. 분석 결과 CD4와 CD8 T 세포가 80%이상으로 대부분의 population을 차지하였고 NKT세포는 5% 미만으로 확인되었다. NAIVE CELL을 나타내는 CD45RA+CD62L+는 감소되었고, CENTRAL MEMORY인 CD45RA-CD62L+와 EFFECTOR MEMORY인 CD45RA-CD62L-는 증가하였다.
실시예 4. Enzyme-linked immunospot (ELISPOT) 분석
실시예 3에서 유도된 세포독성 T 세포로부터 인터페론 감마 (interferron-gamma,IFN-γ)를 분비하는 세포를 ELISTPOT 분석 키트(BD bioscience, San Diego, CA)를 제조사의 방법대로 사용하여 측정하였다. 상기 분석에서 항원제시세포는 동일 공여자의 단핵세포를 사용하였으며, 항원은 JPT Technologies(Berlin, Germany)에서 생산된 11개의 아미노산이 겹치는 15개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 라이브러리인 펩믹스를 사용하였다. 결과는 도 3에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 세포독성 T 세포는 각 바이러스 항원에 특이적으로 인터페론 감마를 분비하였다.
실시예 5. 세포독성 분석
이를 위해 실시예 2에서 제조된 각 항원이 처리된 B 세포로 2차례 자극한 후, 실시예 4의 펩믹스로 처리된 자가 단핵세포를 표적세포로 사용하였다. CytoTox96®Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, USA) 키트를 제조자의 방법대로 사용하여 항원 융해(lysis)를 측정하였다. 상기 키트는 세포가 융해될 때 분비되는 안정적인 세포성효소인 LDH(Lactate Dehydrogenase)를 측정하며 특이적 융해 퍼센트는 다음과 같은 식으로 계산된다.
특이적 융해 퍼센트(%) = [(Experimental release - Effector Spontaneous release - Target Spontaneous release) / (Target Maximum release - Target Spontaneous release)] x 100. 결과는 도 4에 기재되어 있다. 이에 기재된 바와 같이 CMV, EBV, Adv의 각 항원을 가진 표적 세포가 2주간 유도된 세포독성 T세포에 의해 효과적으로 살해된다.
실시예 6. 자극 횟수 및 사이토카인 처리에 따른 T 세포 증폭결과
이를 위해 실시예 1에 기재된 바와 같은 B 세포 분리 후 남은 단핵세포는 반응 세포로, 그리고 실시예 2의 핵전달된 B 세포는 자극 세포로 사용하였다. 상기 반응세포와 자극세포는 45% Click’배지(Irvine Scientific, CA, USA), 2mmol/L GlutamaxTM-I 그리고 10% FBS이 포함된 RPMI 1640 배지에서 배양하였으며, 배양 7일째 수확하여 재자극 하였다. 2번 자극 후에 세포수를 측정하였다. IL-15(7day) 그룹은 두 번째 자극일인 7일째부터 IL-15를 50ng/ml로 첨가하여 배양하였으며 IL-15(0day) 그룹은 첫 번째 자극일부터 L-15를 50ng/ml로 첨가하여 배양하였다. IL-4/7그룹은 두 번째 자극일 인 7일째부터 IL-4 1000U/ml, IL-7 10ng/ml을 동시에 첨가하여 배양하였다.
구체적으로 첫 번째 자극은 B 세포 분리 후 남은 반응세포와 핵전달된 B세포의 농도를 10:1 비율로 혼합하여 7일간 배지 교체 없이 배양하였고 7일째에 세포들을 수거하고 새로 핵전달된 활성화된 B 세포와 10:1의 비율로 다시 혼합하여 배양하였으며, 이때 각 사이토카인이 동일한 농도로 첨가 되었다. 이후 2-3일마다 배지를 30-40% 수준에서 교체하였다. 결과는 도 6에 기재되어 있다.
이어 도 6에서 유도된 세포독성 T 세포로부터 인터페론 감마 (interferron-gamma,IFN-γ)를 분비하는 세포를 ELISTPOT 분석 키트(BD bioscience, San Diego, CA)를 제조사의 방법대로 사용하여 측정하였다. 상기 분석에서 항원제시세포는 동일 공여자의 단핵세포를 사용하였으며, 항원은 JPT Technologies(Berlin, Germany)에서 생산된 11개의 아미노산이 겹치는 15개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 라이브러리인 펩믹스를 사용하였다. 결과는 도 7에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 세포독성 T 세포는 각 바이러스 항원에 특이적으로 인터페론 감마를 분비하였다. 결과는 도 7에 기재되어 있다.
도 6 및 7에 나타난 바와 같이 도 6의 결과 활성화된 B 세포로 1회 자극한 것과 비교하여 2회 자극한 경우에 T 세포 증폭이 현저하게 증가한 것으로 나타났다. 7일동안 자극후 세포를 수거하여 계측한 결과 세포수가 줄어드는 양상을 나타내며, 이는 이 기간에는 항원에 비특이적인 T 세포나 T 세포외의 다른 단핵세포들은 사멸하기 때문인 것으로 판단된다.
또한 도 6의 결과에서 세포 증폭은 IL-15를 첫 번째 자극과 두 번째 자극시 첨가한 그룹이 가장 좋지만, 도 7에 나타난 바와 같이 ELISPOT 과 세포사멸 분석에서는 IL-15를 두 번째 자극시 첨가한 그룹이 가장 우수한 결과를 나타냈으며, 이는 2회 자극 개시시인 7일째에 사이토카인 처리시에 항원 특이적으로 교육된 T 세포가 효율적으로 증가되기 때문인 것으로 판단된다. 또한 FACS로 세포 집단을 확인한 결과 IL-15를 첫 번째 자극부터 첨가하면 NK 세포가 증가되며, 이는 항원에 비특이적인 세포가 사이토카인에 의해 증식되는 결과 때문으로 판단된다 (결과는 나타내지 않음).
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (11)

  1. 인간 말초혈액단핵세포를 제공하는 단계;
    상기 말초혈액단핵세포를 B 세포와 상기 B 세포를 제외한 나머지 단핵세포로 분리하는 단계;
    상기 B 세포를 알파-갈락토실세라마이드, 알파-글루쿠로노실세라마이드, 포스파티딜이노시톨테트라만노사이드, 이소글로보트리헥소실세라마이드, 갱글리오사이드 GD3, 포스파티딜콜린, 베타-갈락토실세라마이드, 리포포스포글리칸, 글리코이노시톨 포스포리피드, 알파-갈락토실세라마이드의 유사체인 베타-아노머 갈락토실세라마이드 및 알파-아노머 갈락토실세라마이드 및 박테리아 지질 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 생체반응조절물질로 처리하여, 활성화하는 단계;
    상기 활성화된 B 세포에 항원을 코딩하는 핵산 또는 펩타이드를 전달하는 단계; 및
    상기 항원이 전달된 활성화된 B 세포와 상기 B 세포를 제외한 나머지 단핵 세포를 혼합하여 1차 배양하는 단계;
    상기 1차 배양 후에, 상기 항원이 전달된 활성화된 B 세포를 추가로 혼합하여 2차 배양하는 단계를 포함하며, 상기 배양에 의해 체외에서 상기 항원 특이적 T 세포가 생성되는, 항원 특이적 세포독성 T 세포를 생산하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 1차 또는 2차 배양 단계에서 사이토카인을 추가하는 것인, 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 사이토카인은 IL-15, IL-2, IL-4, IL-7 또는 IL-9인, 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 사이토카인은 10~100ng/ml으로 처리되는 것인, 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 특정 항원은 병원성 세균, 바이러스 및 기생충을 포함하는 병원체 유래의 항원, 또는 암 항원인 것인, 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 바이러스 항원은 E1dGALMP2 또는 BZLF1를 포함하는 앱스테인바 바이러스 (Epstein-Barr virus, EBV) 항원, pp65 또는 IE1를 포함하는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 항원, HEXON 또는 PENTON를 포함하는 아데노바이러스 (Adenovirus, Adv) 항원, 인플루엔자 바이러스(influenza virus) 항원, 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus, HPV)의 항원, 소수포성 입안염 바이러스 항원, 코어항원 또는 표면 항원을 포함하는 H형, B형, C형, D형, 또는 G형 간염 바이러스 항원, 호흡기 다핵체 바이러스 항원, 허피스 심플렉스 바이러스 항원, 및 GP-120, GP-160, p18, Tat, Gag, Pol 또는 Env를 포함하는 인간면역결핍 바이러스 항원 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 항원은 EBV, CMV 또는 Adv 항원이며, 상기 항원은 각각 도 4, 5 및 6에 표시된 개열지도로 표시되는 pCK-IE1-IRES-pp65, pCK-E1dGALMP2-IRES-BZLF1 및 pCK-HEXON-IRES-PENTON 플라스미드 벡터에 의해 코딩되는 것인, 방법.
  8. 제 5 항에 있어서,
    상기 암 항원은 MAGE1(Melanoma Associated Antigen), AFP (Alpha Feto Protein) CEA (Carcinoembryonic Antige), 또는 타이로시나제 (Tyrosinase)를 포함하는 암유발단백질, 또는 텔로머라제 (Telomerase), BCR-ABL(Abelson-Break point cluster), 또는 RHAMM-R3 (Receptor for hyaluronic acid-mediated motility)를 포함하는 종양특이적 항원 또는 돌연변이 종양항원인, 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 항원이 전달된 활성화된 B 세포와 상기 단핵구 세포 농도는 1:20 내지 1:1의 비율인, 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 인간 말초혈액단핵세포는 자가 또는 동종인, 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따라 제조된 세포를 포함하는 면역 세포치료제.
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