WO2006090886A1

WO2006090886A1 - 血管内皮前駆細胞分化動態解析方法

Info

Publication number: WO2006090886A1
Application number: PCT/JP2006/303817
Authority: WO
Inventors: Takayuki Asahara; Haruchika Masuda
Original assignee: Foundation For Biomedical Research And Innovation; Tokai University Educational System
Priority date: 2005-02-23
Filing date: 2006-02-22
Publication date: 2006-08-31
Also published as: JPWO2006090886A1; EP1860196A4; EP1860196A1

Abstract

本発明は、再現性が良いＥＰＣコロニーの形成方法、患者体内でのＥＰＣ分化動態の解析方法を提供する。より詳細には、本発明は、血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地で血液血管芽細胞を培養し、血管内皮前駆細胞コロニー形成の様式を評価することを含む、血管内皮前駆細胞分化動態の解析方法；血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地で血液血管芽細胞を培養することを含む、血管内皮前駆細胞コロニー形成方法；血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地；並びに当該半固形培地の作製用キットなどを提供する。

Description

明細書

血管内皮前駆細胞分化動態解析方法技術分野

本発明は、血管内皮前駆細胞分化動態の解析方法、その為のキット等に関する。背景技術

糖尿病、高血圧症、高脂血症、肥満等の生活習慣病は血管障害の危険因子であり、最終的には閉塞性動脈硬化症（Arteriosclerosis obliterans； A S O) 、心筋梗塞、腎不全などの臓器不全を引き起こす。これらの生活習慣病の患者数は極めて多く、血管治療は現代医療の最重要課題と言っても過言ではない。例えば下肢壊疽を引き起こす閉塞性動脈硬化症では、下腿切断を余儀なくされる例が少なくない。それら虚血状態に陥った組織 ' fl蔵器の治療法としては、カテーテルによる血管拡張術、静脈グラフトを用いて血行を外科的に再建する方法などが行われてきた力重度の患者には有効な手段となりえていない。

近年、新しい治療法として血管新生療法が行われつつある。血管新生療法には大きく分けて遺伝子治療と細胞移植法がある。遺伝子治療では血管内皮細胞増殖因子 (Vascular endothelial growth factor； V E G F ) 、肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor； H G F ) のプラスミドを虚血病変部位に注入し、血流の改善を図る方法が報告されている。一方、細胞移植法では血管内皮細胞に分化し得る血管内皮前駆細胞（Endothelial progenitor cell；以下、 E P Cとも略する）の移植法として、骨髄由来単核球移植療法、顆粒球コ口ニー刺激因子（Granulocyte colony stimulating factor； G - C S F )投与による末梢血動員 C D 3 4血管幹細胞移植療法が臨床応用されている。し力しながら、患者病態、治療効果を把握する上で末梢血中の E P C分化動態を評価する方法は未だ確立されていない。

一般に細胞移植法においては、虚血部位で E P Cが効率的に血管形成するように、またインビトロでの細胞増幅を効率的に行うためには、移植に用レヽる細胞懸濁液 (この細胞懸濁液には E P Cへ分化し得る細胞が含まれている）の E P C形成能を予め知る必要がある。また、細胞移植後の患者体内での E P C分化動態を解析することは、患者病態、治療効果を把握する上で重要である。現在のところ、赤血球、 T—リンパ球、 B—リンパ球、単球 Zマクロファージ、顆粒球、巨核球等へ分化し得る造血幹細胞のコロニー形成能を測定する方法として、メチルセルロース培地を用いた方法が用レヽられてレヽる (Atsushi Hirao, Yoicni Takaue et al. , Journal of Clinical Apheresis 10： 17-22 (1999) ) E P Cのコロニー形成能をアツセィする方法は知られていない。発明の開示

本発明は、患者体内での E P C分化動態を解析し得る方法並びにその為のキット等の提供を目的とする。

本発明者らは、上記課題に鑑み、 E P Cがコロニーを形成し得る培養条件を検討し、特定の生理活性物質を含有する半固形培地を用いることによって、再現性よく E P C のコロニーを形成させることに成功した。さらに、当該コロニー形成において分化度の異なる大小 2種類のコ口ニーが形成され、その発現を追跡することにより患者体内での E P C分化動態を解析することができることを見出して本発明を完成するに至つた。

即ち、本発明は下記の通りである：

〔 1〕血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地で血液血管芽細胞を培養し、血管内皮前駆細胞コ口ニー形成の様式を評価することを含む、血管内皮前駆細胞分化動態の解析方法；

〔2〕血液血管芽細胞が、骨髄、臍帯血又は末梢血由来である、上記〔1〕の方法；〔3〕血液血管芽細胞が単核球である、上記〔1〕の方法；

〔 4〕血液血管芽細胞が、 C D 3 4陽性およぴまたは C D 1 3 3陽性である、上記〔1〕の方法；

〔5〕血液血管芽細胞が、血液血管芽細胞を動員可能な物質により動員されたものである、上記〔1〕の方法；

〔6〕血液血管芽細胞を動員可能な物質が顆粒球コロニー刺激因子である、上記〔5〕の方法；

〔7〕血液血管芽細胞がヒト由来である、上記〔1〕の方法；

〔8〕半固形培地が、メチルセルロース培地、マトリゲル、コラーゲンゲル及びメビオールゲルからなる群より選ばれる、上記〔1〕の方法；

〔9〕該半固形培地が、幹細胞因子、インターロイキン 3、インスリン様成長因子および上皮細胞増殖因子からなる群より選ばれる 1以上の因子をさらに含有する、上記

〔 1〕の方法；

〔1 0〕該半固形培地が、血清および Zまたはへパリンをさらに含有する、上記〔9〕の方法；

〔1 1〕血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地で血液血管芽細胞を培養し、血管内皮前駆細胞コロニーの出現を確認することを含む、血管内皮前駆細胞コロニー形成方法；

〔1 2〕血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地；

〔1 3〕血管内皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子および半固形培地（血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子の双方または一方は、半固形培地に添加されていない形態で提供される）を含む、血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地の作製用キット。

本発明の E P C分化動態の解析方法は、より効率的な E P C移植療法を可能にする。すなわち患者に移植する血液血管芽細胞の血液系細胞コロニーアツセィどともに E P Cコロニーアッセィが実施でき、それによつて治療効果を予想、 ·把握することが可能となる。さらに分化度の異なる E P Cのコロニーの発現状況を知ることにより、患者の病態を知ることができる。図面の簡単な説明図 1は、メチルセルロース培地を用いた E PCコロニーアツセィ法の概要を示す。試料となる血液血管芽細胞が、臍帯血由来の単核球である場合を一例として示す。図 2は、本発明の E P Cコロユーァッセィ過程で出現する内皮細胞様小細胞コ口二一と内皮細胞様大細胞コ口ニーを位相差顕微鏡で観察した結果を示す。試料となる血液血管芽細胞力臍帯血由来の単核球である場合を一例に示す。臍帯血由来の単核球を本発明のメチルセルロース培地に播種し培養 14〜183において細胞サイズの異なる 2種類の E PCコロニーが出現した。

図 3は、臍帯血 CD 1 33陽性細胞由来の EPCコロニーを a c LDL-D i I及び UEA— 1レクチン一 F I TCで二重染色した結果を示す。 a、 c、 eは大細胞コ口エーを、 b、 d、 f は小細胞コロニーを、 a及ぴ bは位相差像、 c及び dは a c L DL-D i Iによる染色像を、 e及び f は UEA— 1レクチン一 F I TCによる染色像を示す。両コロユーともに a c LDL-D i I及ぴ UEA— 1レクチン _F I TC に染色され、 EPCとしての特徴を示した。

図 4は、 G— C S Fによる動員 C D 34陽性細胞移植 A S O患者における末梢血を用いた E P Cコロニーアツセィのタイムスケジュールを示す。

図 5は、メチルセルロース培地を用いた E PCコロニーアツセィ法の概要を示す。試料となる血液血管芽細胞が、末梢血由来の単核球である場合を一例として示す。図 6は、 A SO患者（症例 1) における、末梢血中の CD 34細胞動員目的の G— C S F投与時、ならびに CD 34陽性細胞の移植時における末梢血中の単核球数及ぴ CD 34陽性細胞数を示す。 MN C：単核球、 CD 34+ : CD34陽性

図 7は、 A SO患者（症例 1) における、末梢血中の CD 34細胞動員目的の G_ C S F投与時、ならびに CD 34陽性細胞の移植時における末梢血の E P Cコロニー形成能（小細胞コロニー、大細胞コロニー）を示す。 MNC：単核球、 CFU：コ口ニー形成単位、 CD 34 + T X ： CD 34 +細胞移植

図 8は、 ASO患者（症例 2) における、末梢血中の CD 34細胞動員目的の G— C S F投与時、ならびに CD 34陽性細胞の移植時における末梢血中の単核球数及び CD 34陽性細胞数を示す。 MN C：単核球、 CD 34+ : CD 34陽性、 C D 3 4 + Tx ： CD 34+細胞移植

図 9は、 AS〇患者（症例 2) における、末梢血中の CD 34細胞動員目的の G— C S F投与時、ならびに CD 34陽性細胞の移植時における末梢血の E P Cコロニー形成能（小細胞コ口-一、大細胞コロニー）を示す。 MNC：単核球、 CFU：コ口ニー形成単位、 CD 34 + Tx ： CD 34 +細胞移植

図 10は、 A SO患者（症例 3) における、末梢血中の CD 34細胞動員目的の G — C S F投与時、ならびに CD 34陽性細胞の移植時における末梢血中の単核球数及ぴ C D 34陽性細胞数を示す。 MN C：単核球、 CD 34+ : CD 34陽性、 C D 34 + T X ： CD 34 +細胞移植

図 1 1は、 A SO患者（症例 3) における、末梢血中の CD 34細胞動員目的の G — C S F投与時、ならびに CD 34陽性細胞の移植時における末梢血の E P Cコ口- 一形成能（小細胞コロニー、大細胞コロニー）を示す。 MNC :単核球、 CFU : コ口ニー形成単位、 CD 34 + T X ： CD 34 +細胞移植発明を実施するための最良の形態

本発明は、血管内皮前駆細胞分化動態の解析方法を提供する。本発明の解析方法は、例えば、血管内皮細胞増殖因子及び/又は塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地で血液血管芽細胞を培養し、血管内皮前駆細胞コ口ニー形成の様式を評価することを含む。

本発明で用いられる「血液血管芽細胞」とは、血液系細胞及び血管内皮細胞両方の前駆細胞であって、血液幹細胞、血液前駆細胞を経て血液系細胞（例えば、赤血球、 T一リンパ球、 B—リンパ球、単球/マクロファージ、顆粒球、巨核球）になり得、また、 E P Cを経て血管内皮細胞になり得る未分化な細胞であれば特に限定されない。血液血管芽細胞としては、被験対象の骨髄、臍帯血又は末梢血由来の細胞を使用できる。血液血管芽細胞はまた、単核球であり得る。

血液血管芽細胞はさらに、 CD 34及び/又は CD 133陽性であり得る。従って、血液血管芽細胞として、 CD 34陽性及び/又は CD 133陽性細胞のみ予め選別して用いることもまた好ましい。 CD 34陽 1·生及ぴ Z又は CD 1 33陽性細胞の選別は、当分野で通常行われている細胞選別の手法が用いられ、具体的には CD 34抗原及び Z又は CD 1 33抗原に特異的な親和性を有する物質を用いた磁気細胞分離法（MA CS) 、蛍光細胞分離法（FACS) 等が挙げられる。

CD 34抗原あるいは CD 1 33抗原に特異的な親和性を有する物質としては例えばこれらの蛋白質に特異的親和性を有する抗体又はその断片が挙げられ、その特異的親和性とは抗原■抗体反応により該蛋白質を特異的に認識し、結合する能力のことである。該抗体又はその断片は、当該蛋白質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びそれらの機能的断片のいずれであってもよい。これらの抗体あるいはその機能的断片は、通常当分野で行なわれている方法によつて製せられる。例えばポリクローナル抗体を用!、る場合であれば、該蛋白質をマウスやゥサギといった動物の背部皮下あるいは腹腔内あるいは静脈等に注射して免疫し、抗体価が上昇するのを待った後に抗血清を採取する方法が挙げられ、またモノクローナル抗体を用いる場合であれば、常法に従いハイブリドーマを作製して、その分泌液を採取する方法が挙げられる。抗体断片を製造する方法としてはクローユングした抗体遺伝子断片を微生物等に発現させる方法がよく用いられている。当該抗体、抗体断片等の純度は、当該蛋白質との特異的親和性を保持している限り、特に限定されない。これらの抗体又はその断片は、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。

血液血管芽細胞はまた、血液血管芽細胞を動員可能な物質により動員されたものであり得る。血液血管芽細胞を動員可能な物質としては、例えば、 G— CSF、 SDF — 1、エストロゲン、 VEGF、 GM_CSF、アンジォポイエチン 1及び 2、 HG F、スタチン類（s t a t i n s) 、エリスロポエチンが挙げられるが、なかでも G 一 CSFが好ましい。この場合、血液血管芽細胞を動員可能な物質の被験対象への投与により得られる、血液血管芽細胞を動員しておいた体液成分（例えば、末梢血）の形態で、血液血管芽細胞が提供されてもよい。血液血管芽細胞を動員可能な物質の被験対象への投与回数、投与期間、投与量は用いる物質の種類によっても異なり、血液血管芽細胞を動員可能である限り特に限定されないが、 G— CS Fの場合であれば、投与回数については、例えば通常 1日 1回〜 3回、好ましくは 2回であり、投与期間については、例えば約 3〜 7日間、好ましくは約 4〜 6日間、より好ましくは 5日間であり、投与量については、約 2〜50/^gZkgZ日、好ましくは約 5〜20/x g Zk g/日、より好ましくは約 10 μ gZk g/日である。

血液血管芽細胞はさらに、血液血管芽細胞を動員可能な物質により動員された血液血管芽細胞を移植された被験対象から採取されるものであってもよい。

本発明において被験対象は、 E P C分化動態を解析することが求められている動物であって、ヒトを含む哺乳動物一般を意味する力臨床応用という本発明の目的に鑑みれば、被験対象は好ましくはヒトである。また、マウス、ラット、ィヌ、ネコ、ゥサギ、ゥシ、プタ、ャギ、ヒッジ、ゥマ、サル等の哺乳動物での使用も好ましい。本発明で用いられる半固形培地は、血管内皮前駆細胞コロニー形成を可能とするものである限り特に限定されないが、例えば、造血幹細胞等の未分化細胞の増殖用培地などとして知られている半固形培地を使用できる。このような半固形培地としては、例えば、メチルセルロース培地、マトリゲル、コラーゲンゲル、メビオールゲルなどが挙げられる。半固形培地としてメチルセルロース培地を用いる場合、培地中のメチルセルロス濃度は特に限定されるものではないが、例えば約 0. 5〜5%、好ましくは約 0. 7〜3%、より好ましくは約 1%で用いられる。

本発明で用いられる血管内皮細胞増殖因子（VEGF) は、 E PCに特異的に作用する増殖因子であり、主に血管周囲の細胞で産生されることが知られている。選択的スプライシングによってサイズの異なる数種の V E G Fタンパク質が産生されるが、本発明で用いる V EGFは EPCのコロニー形成を可能にする限りいずれのタイプの VEGFでもよい。好ましくは VEGF ₁₆₅である。 V E G Fの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中の VEGFの濃度は、用いる VEGFの種類によっても異なり、血管内皮前駆細胞コロニー形成に適切である限り特に限定されないが、ヒト糸且換え VEGF ₆₅の場合であれば、例えば約 5〜500 n g/mL 好ましくは約 20〜； 1 00 n g/mL_N より好ましくは約 50 n gZmLである。

本発明で用いられる塩基性線維芽細胞増殖因子（b FGF) は、約 1 8 kD a、等電点 9. 0の一本鎖ペプチドであり、血管新生、種々の細胞増殖促進、分化誘導等の機能を有することが知られている。本発明で用いる b FGFの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中の b FGFの濃度は、用いる b FGFの種類によっても異なり、血管内皮前駆細胞コロニー形成に適切である限り特に限定されないが、ヒト糸且換え b FGFを用いる場合であれば、例えば約 5〜500 n g Zm L、好ましくは約 20〜； L O O n g /m L、より好ましくは約 50 n g / mLでめる。

本発明で用いられる半固形培地は、血管内皮前駆細胞コロニーをより効率的に形成させるという観点から、上記 VEGF及び Z又は b FGFに加え、幹細胞因子（S C F) 、インターロイキン 3 ( I L- 3) 、インスリン様成長因子 ( I GF) 及び上皮細胞増殖因子（EGF) 力らなる群より選ばれる 1又は 2以上の因子、好ましくは 3 以上の因子、より好ましくは全ての因子をさらに含有することが好ましい。従って、本発明の方法で用いられる半固形培地は、 VEGF及ぴ Z又は b FGFに加え、例えば、 a) SCF、 b) I L— 3、 c) I GF、 d) EGF、 e) SCFと I L— 3との組合せ、 f ) S CFと I GFとの組合せ、 g) SCFと EGFとの組合せ、 h ) I L— 3と I GFとの糸且合せ、 i ) I L— 3と EGFとの組合せ、 j ) I G Fと E G F との組合せ、 k) S CF、 I L— 3及ぴ I GFの組合せ、 1 ) S CF、 I L— 3及び EGFの糸且合せ、 m) SCF、 I G F及び E G Fの組合せ、 n) I L— 3、 I GF及び EGFの組合せ、あるいは。） S CF、 I L_ 3、 I G F及び E G Fの組合せを含むものであり得る。

幹細胞因子（S CF) は、 248個のアミノ酸からなる分子量約 30, 000の糖タンパク質である。選択的スプライシングにより可溶型と膜結合型が存在する力本発明で用いる S CFは E PCのコロニー形成を可能にする限りいずれのタイプの S CFでもよい。好ましくは可溶型である。 SCFの由来等は特に限定されなレ、が、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中の S CFの濃度は、用いる S C Fの種類によっても異なり、血管内皮前駆細胞コロニーをより効率的に形成できる限り特に限定されないが、ヒト糸且換え SCFの場合であれば、約 10〜1 000 n g /mL、好ましくは約 50〜 500 n g/mL より好ましくは約 100 n g/mL である。

インターロイキン 3 ( I L- 3) は、造血幹細胞や各種血球系列の前駆細胞に作用し、その増殖、分化を促進するサイトカインとして知られている。ヒトで 1 5 2残基、マウスで 1 6 6残基のアミノ酸から成る力、糖鎖の修飾によって見かけ上 28， 00 0の分子量を有する。本発明で用いる I L— 3はコロニー形成を目的とする E PCの由来に応じて適宜選択されるが、ヒトの E PCのコロニー形成に用いる場合には、ヒト I L一 3が好ましく、安定した供給が見込まれる組換え体が特に好ましい。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中の I L一 3の濃度は、用いる I L— 3の種類によっても異なり、血管内皮前駆細胞コ口エーをより効率的に形成できる限り特に限定されないが、ヒト組换え I L— 3を用いる場合であれば、約 1〜500 n g/mL、好ましくは約 5〜 1 00 n g/mL, より好ましくは約 20 n g/mLである。

インスリン様成長因子（I GF) は、ソマトメジンとも称される、プロインスリンに類似した一次構造をもつ分子量約 7000のポリぺプチドで互いに類似した I G F— I及び I GF_ I Iの 2種類が存在することが知られている。ともに類似した作用を有し、インビトロでは様々な細胞の増殖を促進することが知られている。本発明で用いる I GFは E PCのコロニー形成を可能にする限りいずれのタイプの I GF でもよい。好ましくは I GF— Iである。 I GFの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中の I GFの濃度は、用いる I G Fの種類によっても異なり、血管内皮前駆細胞コロニーをより効率的に形成できる限り特に限定されないが、ヒト糸且換え I GF— Iを用いる場合であれば、約 5〜50 0 n g/mL_N好ましくは約 20〜： L 00 n g/mL, より好ましくは約 50 n gZ mLである。

上皮細胞増殖因子（EGF)は、上皮細胞の分化'増殖を促進させる作用を有する、アミノ酸 53個のタンパク質であり、糖鎖は結合していないことが知られている。約 6 kD aで 3ケ所のジスルフィド結合を有する。本発明で用いる EG Fの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中の EG Fの濃度は、用いる EGFの種類によっても異なり、血管内皮前駆細胞コロニーをより効率的に形成できる限り特に限定されないが、ヒト組換え EGFを用いる場合であれば、約 5〜500 n g/mL、好ましくは約 20〜： L 00 n g/mL、より好ましくは約 50 n g/mLである。

本発明で用いられる半固形培地は、血管内皮前駆細胞コロニーをさらにより効率的に形成させるという観点から、上記 VEGF及び b FGF、並びに SCF、 I L一 3、 I GF及び EG Fからなる群より選ばれる 1又は 2以上の因子に加え、血清及び/又はへパリンをさらに含有することが好ましい。

血清が使用される場合、その由来等は特に限定されないが、培地に添加されることから比較的使用量が多いことが予想される。従って、商業的に入手可能なゥシ、ゥマ、ヒト等の血清（例えば、胎児血清）が用いられる。より好ましくはゥシ胎児血清（F CS) である。当該血清は非働化して用いることが好ましい。半固形培地中の血清の濃度は、用いる血清の種類によっても異なり、血管内皮前駆細胞コロニーをさらにより効率的に形成できる限り特に限定されないが、 FCSの場合であれば、約 10〜5 0 °/₀、好ましくは約 15〜 4◦ %、より好ましくは約 30 %である。

へパリンは、 D—グノレクロン酸、あるいは L—ィズロン酸のいずれかを含むゥロン酸残基と、 D—グルコサミンとの二糖体の繰り返し構造を骨格に持つダルコサミノグリカンである。へパリンは哺乳類の小腸や肺に多く存在し、市販品はブタの腸由来の抽出物が多く、その分子量は 7， 000〜25， 000程度である。本発明で用いるへパリンは動物組織由来のものであってもよいし、 E PCのコロニー形成を可能にする限り、化学的、物理的に分解された低分子化へパリンであってもよレ、。例えば、プタ腸由来へパリンが使用される。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中のへパリンの濃度は、用いるへパリンの種類によっても異なり、血管内皮前駆細胞コロニーをさらにより効率的に形成できる限り特に限定されないが、プタ腸由来へパリンの場合であれば、約 0. 2〜10UZmL、好ましくは約 l〜5UZmL、より好ましくは約 2U/mLである。

本発明において梟も好ましく用いられ得る半固形培地は、約 50 n g/mLの血管内皮細胞増殖因子、約 50 n g/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子、並びに約 100 n gZmLの幹細胞因子、約 20 n g /m Lのインターロイキン 3、約 50 n g/m Lの上皮細胞増殖因子、約 50 n g Zm Lのインスリン様成長因子、及ぴ約 30 %の血清、約 2 UZinLのへパリンを含有する半固形培地である。

上記した各生理活性物質は半固形培地で所定の濃度に溶解する力あるいはあらかじめ各生理活性物質の濃縮液（ストック溶液）を調製し、半固形培地で所定の濃度に希釈することによって本発明の、 E PC分化動態解析用の半固形培地を調製できる。例えば市販の半固形培地に必要な生理活性物質を所定の濃度となるよう溶解した後、濾過滅菌等により滅菌するか、あるいは濾過滅菌等により滅菌したストツク溶液を無菌的に市販の半固形培地に添加、希釈することによって本発明の生理活性物質含有半固形培地を調製できる。濾過滅菌は当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができ、例えば 0.22 μπιや 0.45 ;umのミリポアフィルタ一等を用いて行う。上述した生理活性物質を含有する半固形培地での血液血管芽細胞の培養は、血液血管芽細胞を含有する細胞懸濁液を、上記の生理活性物質含有半固形培地に添加することにより行われる。細胞懸濁液としてはまた、血液血管芽細胞を含有する体液自体 (例えば、骨髄液、臍帯血、末梢血）を用いることもできる。血液血管芽細胞の培養条件は、コロニー形成が可能であれば特に限定されず、通常当分野で実施される条件で実施することができる。通常、 5%C0₂雰囲気下、 37°Cで通常 10日以上、例えば 14〜 18 S間又はそれ以上培養する。コ口ニーの形成は目視で確認することができるが、得られるコロニーが本当に E PCで構成されているか否かは、例えば、ァセチノレ化 LDL (a c LDL) の取り込み能や UE A— 1レクチンとの結合能、 VE—力ドヘリン、 KDR、 vWFの発現（例えば、 RT— PCRにより、あるいは蛍光免疫組織化学的方法により）等を確認することによって行われ得る。例えば D i Iで標識したァセチル化 LD L (a c LDL— D i I )及び F I TC標識した UEA_ 1レクチン（UEA— 1レクチン一 F I TC) でコロニーを二重染色した場合に、 EPCであれば共に染色される。

E P Cコロニー形成の様式の評価は、コロニーを形成する細胞サイズに基づいて行われ得る。実施例で後述するが、本発明において E PCコロニーを形成させる際、細胞サイズの異なる 2種類の E P Cコロニーが出現する。このような 2種類のサイズの E P Cコロニーが出現するのは血液血管芽細胞を半固形培地上に播種してから通常 10日以上、例えば 14〜18日経過した時点であるので、本発明において E PCのコロニーを形成させるには例えば 1 ：〜 18日間培養される。形成される 2種類のコ口-一のうち、大きい細胞で構成されるコロニー（以下内皮細胞様大細胞コロニー； CFU— La r g e c e l l l i k e E C、大細胞コロニーともいう）は直径約 20〜50 mの細胞を主に含み、小さい細胞で構成されるコロニー（以下内皮細胞様小細胞コロニー； CFU— sma 1 1 c e l l l i k e EC、小細胞コロニーともいう）は直径約 2 Ομπι以下（例えば約 10〜2 O/ m)の細胞を主に含む。ここで「主に」とはコロニーを構成する細胞集団の約 30。好ましくは約 50 %、特に好ましくは約 70 %が、直径約 20〜 50 μ mの細胞（大細胞コ口ニーの場合）あるいは直径 20 / m以下の細胞（小細胞コロニーの場合）であることを意味する。被験対象から経時的に骨髄液、臍帯血あるいは末梢血等を採取し、採取した試料について EPCコロニーアツセィを行うと、動員後のコロニー出現迄に要する時間が、大細胞コロニーと小細胞コロニーとでは異なっていることが判明している。大細胞コ口ニーは小細胞コロニーにやや遅れて出現する。即ち、分化段階の異なる E P Cが存在することが示唆される。早い段階で出現する内皮細胞様小細胞は早期分化段階の E P Cと言え、また遅い段階で出現する内皮細胞様大細胞は晩期分化段階の E P Cであると言える。本発明の解析方法では、上述の通りコロニーを形成する細胞サイズの差異に基づき分化度の異なる E P Cが区別可能であり、従って E P C分化動態を解析することが可能となる。

本発明はまた、血管内皮細胞増殖因子及び Z又は塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地で血液血管芽細胞を培養することを含む、血管内皮前駆細胞コロニー形成方法を提供する。本発明のコロニー形成方法は、血管内皮前駆細胞コロニーの出現を確認することをさらに含むことができる。

本発明はさらに、上述した因子を含有する半固形培地、及びこの半固形培地を含む血管内皮前駆細胞分化動態の解析用試薬を提供する。

本発明はまた、 VEGF、 b FGFおよぴ半固形培地を含むキットを提供する。本発明のキットは、 VEGFおよび b FGFの双方または一方が、半固形培地から隔離された形態（例えば、異なる容器中に格納された形態）で提供される。このようなキットとしては、例えば、 a) VEGF, b FGFおよび半固形培地のいずれもが異なる容器中に格納された形態、 b) VEGFを含む半固形培地および b FGFが異なる容器中に格納された形態、 c) b FGFを含む半固形培地および VEGFが異なる容器中に格納された形態が挙げられる。また、 SCF、 I L一 3、 I GF及び EGFからなる群より選ばれる 1又は 2以上の因子、並びに血清及び又はへパリンが、半固形培地から隔離された形態で、又は半固形培地中に添加された形態で提供されてもよレ、。本発明のキットは、例えば本発明の半固形培地の作製に有用であり得る。

本発明のキットはさらに、血液血管芽細胞を動員可能な物質、および血液血管芽細胞の細胞表面マー力一に特異的な親和性を有する物質からなる群より選ばれる少なくとも 1つの構成要素を含んでいてもよい。血液血管芽細胞を動員可能な物質、血液血管芽細胞の細胞表面マーカーは、上述の通りである。かかるキットは、本発明の角军析方法に好適に用いられ得る。

以下実施例を示して本発明をさらに詳しく説明する力実施例は本発明の説明のために記載するものであり、本発明を何ら限定するものではない。実施例

実施例 1 ：メチルセルロース培地を用いた EPCコロニーアツセィ法（臍帯血）実験プロトコルを図 1に示す。

( 1 ) 生理活性物質含有メチルセルロース培地の作製

メチノレセノレロース培地（H 4236， S t em C e l l T e c. ) を用いて表 1に示す組成に基づいて生理活性物質含有メチルセルロース培地を作製した。即ち、表 1に示す各成分を所定の濃度となるようにメチルセルロース培地に無菌的に添加した。表 1

表 1中、「h」はヒト由来であることを、「r」は遺伝子工学的に製造された糸且換え体であることを示す。それ以外の各略語は上述の通りである。 (2) EPCコロニーアツセィ

血液血管芽細胞を含有する細胞懸濁液としては臍帯血由来の単核球を含有する細胞懸濁液を用いた。先ず、採血した血液を H i s t o p a q u e - 10 7 7上に重層し、密度勾配遠心分離法にて単核球を分離した。分離した単核球を PB S— EDTA で洗浄し、血小板除去後の単核球を採取し、緩衝液中に懸濁して細胞懸濁液を調製した。

次いで、細胞懸濁液を抗 CD 1 3 3抗体を用いた MACSに付して CD 1 3 3陽性細胞を回収した。詳細には、 CD 133陽性細胞単離キット（M i 1 i t e n y i B i o t e c社製、カタ口グ N o . 130— 050— 801) を用いて、添付文書のプ口トコノレに準じて行った。

得られた CD 133陽性細胞を上記（1) で作製した生理活性物質含有メチルセルロース培地11111^ぁたり 1000個の濃度で35111111径の？ 1" 1 111 & 1" 1 & T i s s u e Cu l t u r e d i s h (BD F a l c o n)に播種し、 37 °C、 5 % C0₂存在下にて 18日間培養した。その後メチルセルロース培地を除去し、非付着性の細胞を P B Sで洗い流した。培養皿に付着した細胞のコ口ニーを観察したところ個々の細胞サイズの異なる 2種類の EPCコロニーが出現していた。小さレ、細胞のコロニーを内皮細胞小細胞コロニー（C FU— s m a 1 1 c e l l l i k e E C) と、大きい細胞のコロニーを内皮細胞大細胞コロニー (CFU- l a r g e c e l l l i k e EC) と便宜上称する。図 2は各コロエーの位相差顕微鏡による観察像である。これらのコロニーを a c LDL-D i I及び UEA_ 1レクチン一 F I TCで二重染色した。詳細には、メチルセルロース除去後、 EGM— MV添加 EB M— 2 ( 5 % F C S培地）（C l o n e t i c s社， S i n g l e q u o t sキット）を lmL加えた。次いで、 &。 0しー01 1を10 L加え、 3時間培養した。 PBSにて 2回洗浄後、上記培地及び F I TClIli-UEA 1レクチン（S i gma 社製）を◦. 2 gZmLの濃度になるように培地に加え、 3時間培養した。 2回洗浄後、培地を交換し、蛍光顕微鏡で観察した。

結果を図 3に示す。両コロニーともに、 a c LDL-D i I及び UEA— 1レクチンー F I TCに染色され、 E PCとしての特徴を示した。

メチルセルロース培地にて出現した小細胞 E P Cコロニーを採取し、内皮細胞培養用培地（EGM—MV添カ卩 EBM— 2 (5%FCS培地））を用い 37°C、 5%CO ₂存在下にて 36時間培養した。培養後、内皮細胞系の細胞表面抗原である VEカドヘリンあるいは KDR抗原の発現、ならびに血球系の細胞表面抗原である CD 45抗原の発現について調べた。結果、 VE力ドヘリンゃ KDR抗原を発現している細胞が認められた。実施例 2 ：メチルセルロース培地を用いた E P Cコロニーアツセィ法（末梢血）

G— CSFによる動員 CD 34陽性細胞移植 A SO患者 3症例を対象に、本発明の E P Cコロエーアツセィ法を用いて、末梢血中の CD 34細胞動員目的の G— C S F 投与や細胞移植時における末梢血中の E P Cの動態評価を行った。実験プロトコルを図 4及ぴ図 5に示す。生理活性物質含有メチルセルロース培地としては実施例 1で作製したものと同じ培地を用いた。本実施例では血液血管芽細胞を含有する細胞懸濁液としては、上述の通り G— C S Fによる動員 C D 34陽性細胞移植 A S O患者から採取した末梢血（単核球を含む）を用いた。この末梢血に対しては特に MACSによる細胞選別は行わず、細胞懸濁液を直接ァッセィにかけた。 G— C S Fによる動員は 1 日 2回、 1回あたり患者の体重 1 k gあたり 5 μ gの G— C S F (キリンビール（株）製）を皮下投与した。 G— CSF投与は 5日間行った（5日目は 1回のみ投与）。経時的に患者から末梢血を採取し単核球を分離した。得られた末梢血由来単核球を生理活性物質含有メチルセルロース培地 lmLあたり 2X 10⁵個の濃度で 35mm 径の P r ima r i a T i s s u e Cu l t u r e d i s h (B D F a l c o n) に播種し、 37°C、 5%C0₂存在下にて 18日間培養した。その後メチルセルロース培地を除去し、非付着性の細胞を PB Sで洗い流した。培養皿に付着した細胞のコロニーを観察したところ実施例 1と同様サイズの異なる 2種類の E PCコロニーが出現していた。各コロニーについて実施例 1と同様にして a c LDL-D i I 及び UEA— 1レクチン一 F I TCで二重染色を行ったところいずれも共染色された。

以下、症例毎に、末梢血中の CD 34細胞動員目的の G— C S F投与時、ならびに CD 34陽性細胞の移植時における末梢血中の単核球数、 CD 34陽性細胞数及び E PCコロエー形成能（小細胞コロニー、大細胞コロニー）についての結果を示す。単核球数及び C D 34陽性細胞数の測定は、へモサイトメ一ターに細胞懸濁液を入れ、光学顕微鏡にて目算することにより行った。 E PCコロニー形成能については本発明の E P Cコロニー形成方法及ぴコ口ニーの形成能を評価する為の方法に従って行った。

症例 1 (78歳、男性）

末梢血 1 m Lあたりの単核球の数及び末梢血 ImLあたりの CD 34陽性細胞の数を図 6に、 2 X 10⁵個の末梢血単核球を本発明の E PCコロニーアツセィに付した場合に形成されるコロニーの数及び末梢血 1 m Lあたりの形成されるコロニーの数をそれぞれ小細胞コロニー、大細胞コロニー及び全 E P Cコロニー別に測定した結果を図 7に示す。

症例 1において、末梢血単核球及び C D 34陽性細胞は G— CS Fの投与により増力 Dした。さらに、 E P Cコロニー形成能は、 2X 10⁵個の末梢血単核球あたり、また末梢血 ImLあたり G— CSFの投与とともに増加した。

症例 2 (72歳、男性）

末梢血 1 m Lあたりの単核球の数及ぴ末梢血 ImLあたりの CD 34陽性細胞の数を図 8に、 2 X 10⁵個の末梢血単核球を本発明の E PCコロニーアツセィに付した場合に形成されるコロニーの数及び末梢血 1 m Lあたりの形成されるコロニーの数をそれぞれ小細胞コロエー、大細胞コロニー及び全 E P Cコロニー別に測定した結果を図 9に示す。

症例 2においても、末梢血単核球及び C D 34陽性細胞は G— C S Fの投与により増加した。さらに、 E PCコロニー形成能は、 2X 10⁵個の末梢血単核球あたり、また末梢血 ImLあたり G— CSFの投与とともに増加した。

症例 3 ( 68歳、男性）

末梢血 1 m Lあたりの単核球の数及び末梢血 ImLあたりの CD 34陽性細胞の数を図 10に、 2X 10⁵個の末梢血単核球を本発明の E PCコロニーアツセィに付した場合に形成されるコロニーの数及び末梢血 1 mLあたりの形成されるコロニーの数をそれぞれ小細胞コロニー、大細胞コロニー及び全 E P Cコロニー別に測定した結果を図 1 1に示す。

症例 3においても、末梢血単核球及び C D 34陽性細胞は G— CSFの投与により増加した。さらに、 E PCコロニー形成能は、 2 X 10⁵個の末梢血単核球あたり、また末梢血 lmLあたり G— CSFの投与とともに増加した。

以上の結果から、本発明の E PCコロニーアツセィ法が、臨床的に患者末梢血中の E P C分化動態の把握に有用であることがわかった。産業上の利用可能性

本発明の E P C分化動態の解析方法は、より効率的な E P C移植療法を可能にする。すなわち患者に移植する血液血管芽細胞の血液系細胞コロニーアツセィとともに E P Cコロニーアッセィが実施でき、それによつて治療効果を予想 ·把握することが可能となる。さらに分化度の異なる E PCのコロニーの発現状況を知ることにより、患者の病態を知ることができる。本出願は、日本で出願された特願 2005-047422 (出願日： 2005年 2 月 23日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲

1 .血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地で血液血管芽細胞を培養し、血管内皮前駆細胞コ口ニー形成の様式を評価することを含む、血管内皮前駆細胞分化動態の解析方法。

2 . 血液血管芽細胞が、骨髄、臍帯血又は末梢血由来である、請求項 1記載の方法。

3 . 血液血管芽細胞が単核球である、請求項 1記載の方法。

4 . 血液血管芽細胞が、 C D 3 4陽性および Zまたは C D 1 3 3陽性である、請求項 1記載の方法。

5 . 血液血管芽細胞が、血液血管芽細胞を動員可能な物質により動員されたものである、請求項 1記載の方法。

6 . 血液血管芽細胞を動員可能な物質が顆粒球コロニー刺激因子である、請求項 5記載の方法。

7 . 血液血管芽細胞がヒト由来である、請求項 1記載の方法。

8 . 半固形培地が、メチルセルロース培地、マトリゲル、コラーゲンゲル及びメビォールゲルからなる群より選ばれる、請求項 1記載の方法。

9 . 該半固形培地が、幹細胞因子、インターロイキン 3、インスリン様成長因子および上皮細胞増殖因子からなる群より選ばれる 1以上の因子をさらに含有する、請求項 1記載の方法。

1 0 . 該半固形培地が、血清および Zまたはへパリンをさらに含有する、請求項 9記載の方法。

1 1 .血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地で血液血管芽細胞を培養することを含む、血管内皮前駆細胞コ口ニー形成方法。

1 2 .血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地。

1 3 . 血管内皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子および半固形培地（血管内皮細胞増殖因子おょぴ塩基性線維芽細胞増殖因子の双方または一方は、半固形培地に添加されていない形態で提供される）を含む、血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地の作製用キット(