JPWO2014171486A1 - 培地組成物及び当該培地組成物を用いた赤血球の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
例えば、多能性幹細胞であるES細胞或いはiPS細胞から赤血球を誘導する方法(特許文献1、非特許文献4、5)、或いは末梢血、胎児肝臓、骨髄若しくは臍帯血由来のCD34陽性細胞から赤血球を誘導する方法(非特許文献3、6)が開発されている。また、多能性幹細胞から赤血球前駆細胞株を樹立し、当該細胞から赤血球を大量に調製する技術の検討も行われている(非特許文献7)。しかしながら、これらの培養法は、赤血球を短時間かつ高効率に生産させることが困難であり、特に脱核過程の効率化が課題となっている(特許文献2)。更に、核を有する赤血球前駆細胞を輸血することによる癌化の懸念も赤血球の生体外増幅において問題となっている。
(1)造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞を赤血球に分化させる際に用いられる、多糖類を含む培地添加剤。
(2)前記多糖類が、アニオン性官能基を有する、(1)に記載の添加剤。
(3)前記多糖類のアニオン性官能基が、カルボキシル基、スルホ基及びリン酸基からなる群から選択される少なくとも1種である、(2)に記載の添加剤。
(4)前記多糖類が、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、キサンタンガム、カラギーナン、ダイユータンガム、アルギン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ラムナン硫酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも1種である、(3)に記載の添加剤。
(5)前記多糖類が、脱アシル化ジェランガムまたはその塩である、(4)に記載の添加剤。
(6)(1)乃至(5)のいずれかに記載の添加剤を含有してなる赤血球分化用の培地組成物。
(7)SCF、IL−3、IL−6、IL−11、FL、TPO及びEPOからなる群から選択される1又は2以上の因子を更に含む、(6)に記載の培地組成物。
(8)造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞から赤血球を製造する方法であって、(1)乃至(5)のいずれかに記載の添加剤の存在下、或いは(6)又は(7)に記載の培地組成物中で、造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞を培養することを特徴とする、方法。
(9)造血幹細胞の赤血球又はその前駆細胞への分化を誘導する方法であって、(1)乃至(5)のいずれかに記載の添加剤の存在下、或いは(6)又は(7)に記載の培地組成物中で、造血幹細胞を培養することを特徴とする、方法。
(10)造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞、並びに(6)又は(7)に記載の培地組成物を含む、造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の培養調製物。
本明細書において用いる用語につき、以下の通り定義する。
培地に添加される増殖因子としては、トランスフォーミング成長因子−α(TGF−α)、トランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)、マクロファージ炎症蛋白質−1α(MIP−1α)、上皮細胞増殖因子(EGF)、線維芽細胞増殖因子−1、2、3、4、5、6、7、8、又は9(FGF−1、2、3、4、5、6、7、8、9)、神経細胞増殖因子(NGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、白血病阻止因子(LIF)、プロテアーゼネキシンI、プロテアーゼネキシンII、血小板由来成長因子(PDGF)、コリン作動性分化因子(CDF)、各種ケモカイン、Notchリガンド(Delta1など)、Wnt蛋白質、アンジオポエチン様蛋白質2、3、5または7(Angpt2、3、5、7)、インスリン様成長因子(IGF)、インスリン様成長因子結合蛋白質(IGFBP)、プレイオトロフィン(Pleiotrophin)などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子の例としては、コラーゲンI乃至XIX、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン−1乃至12、ニトジェン、テネイシン、トロンボスポンジン、フォンビルブランド(von Willebrand)因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、E−セレクチン、P−セレクチン、L−セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ−D−リジン、ポリ−L−リジン、キチン、キトサン、セファロース、ヒアルロン酸、アルギン酸ゲル、各種ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。
本発明に用いる特定化合物の例としては、特に制限されるものではないが、高分子化合物が挙げられ、好ましくはアニオン性の官能基を有する高分子化合物が挙げられる。
アニオン性の官能基としては、カルボン酸、スルホン酸、リン酸及びそれらの塩が挙げられ、カルボン酸またはその塩が好ましい。
本発明に用いる高分子化合物は、前記アニオン性の官能基の群より1種又は2種以上から構成されるものを使用できる。
脱アシル化ジェランガムから調製される本発明の培地組成物の粘度は、8mPa・s以下であり、好ましくは4mPa・s以下であり、細胞または組織の回収のしやすさの点を考慮すると、より好ましくは2mPa・s以下である。
そして、脱アシル化ジェランガムの場合、市販のもの、例えば、三晶株式会社製「KELCAOGEL(シーピー・ケルコ社の登録商標)CG−LA」、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル(シーピー・ケルコ社の登録商標)」等を使用することができる。
なお該濃度は、以下の式で算出できる。
濃度(%)=特定化合物の重量(g)/培地組成物の容量(ml)×100
なお該濃度は、以下の式で算出できる。
濃度(%)=特定化合物の重量(g)/培地組成物の容量(ml)×100
CO2インキュベーターにおけるCO2の濃度(%)は、雰囲気中のCO2の体積%で示した。また、PBSはリン酸緩衝生理食塩水(シグマアルドリッチジャパン社製)を意味し、FBSは牛胎児血清(Biological Industries社製)を意味する。また、(w/v)は、1体積あたりの重量を表わす。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG−LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli−Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて最終濃度100ng/mLのSCF(和光純薬工業社製)、最終濃度20ng/mLのIL−3(和光純薬工業社製)及び最終濃度1ユニット/mLのEPO(田辺三菱製薬社製)を添加したStemSpanSFEM(ステムセルテクノロジー社製)に終濃度0.015%或いは0.030%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、Lonza社より購入したヒト臍帯血のCD34陽性細胞を、10000細胞/1mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、24ウエルプレート(コーニング社製)のウェルに1ウェル当たり1mLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にCD34陽性細胞を懸濁したものを分注した。
Claims (10)
- 造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞を赤血球に分化させる際に用いられる、多糖類を含む培地添加剤。
- 前記多糖類が、アニオン性官能基を有する、請求項1に記載の添加剤。
- 前記多糖類のアニオン性官能基が、カルボキシル基、スルホ基及びリン酸基からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項2に記載の添加剤。
- 前記多糖類が、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、キサンタンガム、カラギーナン、ダイユータンガム、アルギン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ラムナン硫酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項3に記載の添加剤。
- 前記多糖類が、脱アシル化ジェランガムまたはその塩である、請求項4に記載の添加剤。
- 請求項1乃至5のいずれか1項に記載の添加剤を含有してなる赤血球分化用の培地組成物。
- SCF、IL−3、IL−6、IL−11、FL、TPO及びEPOからなる群から選択される1又は2以上の因子を更に含む、請求項6に記載の培地組成物。
- 造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞から赤血球を製造する方法であって、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の添加剤の存在下、或いは請求項6又は7に記載の培地組成物中で、造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞を培養することを特徴とする、方法。
- 造血幹細胞の赤血球又はその前駆細胞への分化を誘導する方法であって、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の添加剤の存在下、或いは請求項6又は7に記載の培地組成物中で、造血幹細胞を培養することを特徴とする、方法。
- 造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞、並びに請求項6又は7に記載の培地組成物を含む、造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の培養調製物。
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