JP2023521037A - 養子細胞移植の強化 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ミトコンドリアが強化された幹細胞および免疫細胞、それらの組成物、ならびに治療的使用に関するものである。TIFF2023521037000002.tif84128

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2020年4月3日に出願された米国仮出願第63／005，167号の優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
発明の属する技術分野
本発明は、生物医学の分野に関し、特に、癌、感染症及び自己免疫疾患の治療に有用な方法に関するものである。特に、本発明は、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞、CAR-NK細胞、CAR-マクロファージ、好中球、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、ガンマデルタT細胞などのミトコンドリア強化免疫エフェクター細胞を用いた治療法に向けられるが、これらに限定されるものではない。本発明は、癌、感染症および自己免疫疾患の治療に使用するためのミトコンドリア強化幹細胞または免疫細胞に向けられている。本発明は、より高い代謝活性やより高い生存率、特に腫瘍に敵対する微小環境においてより高い生存率を有する免疫細胞または幹細胞の生成につながる細胞技術の有効性を高めることに関するものである。本発明は、細胞傷害性エフェクター細胞のより高い割合の生成、およびこうして生成されたキラー細胞のより高い細胞溶解活性の提供を導く細胞技術の有効性の向上に関する。ミトコンドリア移植は、自己免疫疾患や移植された臓器・組織の拒絶反応を治療するための免疫抑制性制御T細胞の改善された拡張および強化された活性のために使用することもできる。ミトコンドリア移植はまた、自己免疫疾患および移植された臓器または組織の拒絶反応の治療のための制御性T細胞の免疫抑制活性の改善のために使用することができる。
背景
がんと自己免疫には共通の起源があるが、相反する方向に働く強力な力を発揮している。どちらの病気も、身体の免疫システムの障害に起因している。癌は、免疫系が欠陥のある細胞や変質した細胞を認識・攻撃する役割を果たせず、細胞の分裂と増殖を許してしまうために発症することが多い。逆に、大腸炎や狼瘡のような病気につながる自己免疫、誤った免疫反応は、免疫系が誤って健康な細胞を攻撃したときに起こる。心臓、脳、神経、筋肉、結合組織、皮膚、目、肺、腎臓、消化管、血球、血管など、身体のほぼすべての部分が免疫系の標的となり得る。免疫系が標的とする体の部位によって異なることを考えると、幅広い自己免疫疾患が存在する。一般的な自己免疫疾患には、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、自己免疫性血管炎、重症筋無力症、悪性貧血、橋本病、1型糖尿病、炎症性腸疾患（IBS）、自己免疫性アジソン病、グレーブ病、シェーグレン症候群、乾癬およびセリアック病などが含まれる。現在までに、米国自己免疫関連疾患協会（AARDA）は100以上の自己免疫疾患を分類しており、米国で三番目に多い疾患タイプとなっている。実際、自己免疫疾患は世界人口の5～10％が罹患しており、特に女性は男性の2～10倍も自己免疫疾患に罹患する可能性が高いと言われている。ほとんどの疾患は年齢に関係なく発症しますが、小児期や青年期（1型糖尿病など）、成人中期（重症筋無力症、多発性硬化症など）、高齢者（関節リウマチ、原発性全身性血管炎など）に主に発症する疾患もある。
がんは先進国の主要な死因の一つでもあり、2019年には米国だけで170万人以上のがんが診断されると予想されている。この数字から、様々な癌に起因する予測死亡者数は60万人を超える（Seigel et al, CA Cancer J Clin. 2019； 69（1):7-34)。世界保健機関（WHO）によると、がんは世界の死因のトップであり、2018年の推定死亡者数は960万人を占める。最も多いがんは、肺がん（209万件）、乳がん（209万件）、大腸がん（180万件）、前立腺がん（128万件）、皮膚がん（非黒色腫、104万件）、胃がん（103万件）である。がんによる死亡で最も多いのは、肺がん（死亡176万人）、大腸がん（死亡862万人）、胃がん（死亡783万人）、肝臓がん（死亡782万人）、乳がん（死亡627万人）である。
2つの大きなカテゴリーに分類されるT細胞は、自己に対する異常な反応から体を守る一方で、病原体や腫瘍に対する特異的かつ長期的な免疫を確保するために協力して働いている。第一のサブセットは、エフェクターT細胞や活性化抗原特異的T細胞から構成され、病原体や腫瘍を排除する。制御性T（Treg）細胞は第二のサブセットを構成し、自己に対する免疫反応を防ぐために機能する。エフェクターT細胞応答は一般に強力であるが、感染症や腫瘍のサブセットでは、T細胞の制御を回避するために多種多様なエスケープ機構を発達させてきた。同様に、1型糖尿病などの自己免疫疾患の発生率は、Treg細胞が異常な免疫反応を防ぐのに必ずしも成功するとは限らないことを強調している。さらに、臓器移植においては、Treg細胞はしばしば、命を救う組織を免疫拒絶反応から守ることができない。
免疫系は、免疫反応と免疫寛容のバランスを調整するために、T細胞活性化受容体（アクセル）と抑制性受容体（ブレーキ）によって送られるシグナル伝達経路のネットワークを通じて、正常に保たれている。主要組織適合性複合体（MHC）分子は、腫瘍細胞の異常タンパク質の監視に重要な役割を果たす。Tリンパ球の表面にあるT細胞受容体（TCR）は、MHCと複合したこれらの異常タンパク質に由来する抗原性ペプチド断片を認識する。正常な免疫反応の間、主要なMHC/ペプチド抗原提示の文脈で、これらの抗原のTCRへの結合は、T細胞の活性化や癌細胞のT細胞による認識につながる細胞内の変化を開始する。
癌患者において、T細胞は通常、（i）抗原性に乏しいため、（ii）形質転換された細胞が表現型的に異物でないため、（iii）癌に関連した一般的な免疫抑制状態のため、同系統の形質転換細胞に対してほとんど反応を示さない。したがって、腫瘍に対する十分な免疫応答は、少なくとも化学療法剤で治療された患者では、ほとんど観察されていない。
このような免疫系の欠陥に対抗するために、最近、複数の形態の養子細胞移植（ACT）が開発された。最も顕著な例としては、ノバルティス社が、患者自身のT細胞に4-1BBコスティミュレーションドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）を再プログラムする個別化療法であるKYMRIAH（登録商標）（Tisagenlecleucel）を最初のがん治療薬として市場に投入したことが挙げられる。生体外で作製した自己の抗原特異的T細胞を移植するACTは、ウイルス感染症やがんの治療戦略として期待されている。養子免疫療法に用いられるT細胞は、抗原特異的T細胞の増殖、あるいは遺伝子工学によるT細胞のリダイレクションのいずれかによって生成することができる。ACTは、癌、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、免疫不全を含む様々な疾患を治療するための可能性をまだ実現していない。
キメラ抗原受容体（CAR）は、抗体由来の抗原結合ドメインを有するCARのように、場合によってはMHC抗原提示、例えばMCH I抗原提示を必要とせずに、T細胞などの免疫細胞に抗原特異性を伝えるために設計された人工受容体である。CARは、(i） 腫瘍細胞の表面に発現した腫瘍抗原の免疫認識；(ii） 溶菌装置の活性化を制御するシグナル伝達イベントの能動的な促進および伝播のような二重機能を持つ膜貫通型キメラ分子である。このシステムは、エクスノボ活性化機構の「リプログラムT細胞」を提供し、腫瘍細胞によって獲得された寛容を解除し、ヒト白血球抗原（HLA）／MHCを介した抗原認識の制限を回避することができ、細胞免疫療法のより一層の普及のための障壁の一つを乗り越えることができるようになる。
キメラ抗原受容体発現T（CAR-T）細胞は、がん治療をはじめとする様々な治療法に利用することができる。例えば、CAR-T細胞の養子移入は、ある種の血液悪性腫瘍の治療に有効な治療法である。抗CD19 CAR-T細胞の使用は、再発したB細胞性急性リンパ芽球性白血病（B-ALL）、慢性リンパ性白血病（B-CLL）、非ホジキンリンパ腫（NHL）を患う子どもおよび成人において一貫して高い抗腫瘍効果を示し、異なる臨床試験において完全寛解率は70～94％である。しかし、これらの患者では、抗腫瘍活性は、しばしば毒性（すなわち、重度のサイトカイン放出症候群および神経毒性）を伴う強固なCAR-T細胞注入後の拡大を伴っており、一方、CAR-T増殖および持続性の低い患者は、持続的寛解の割合が減少している。したがって、CAR-T細胞の効力と安全性のバランスを取りながら、CAR-T細胞の増殖と注入後の持続性を実証するCAR-T細胞療法が必要とされている。
CAR-T細胞療法は、特定の患者集団において有効性を示していますが、固形がんの患者など他の集団においては、CAR-T細胞療法は限定的な活性しか示していない。固形癌に導入されたCAR-T細胞は、T細胞疲弊と呼ばれる現象によって働かなくなることがある。これは、多くの慢性感染症や癌の際に生じるT細胞の機能不全の状態である。一般に、エフェクター機能が乏しく、抑制性受容体の発現が持続し、機能的エフェクターあるいはメモリーT細胞とは異なる転写状態であることが特徴である。疲弊は、感染症や腫瘍の最適な制御を妨げる可能性がある。疲弊の進行に伴い、CD8+ T細胞はエフェクター機能を階層的に失う可能性がある：すなわち、IL-2の産生、高い増殖能、生体外での細胞溶解活性がまず失われ、次いでTNFα、IFNγ、βケモカイン、脱顆粒の産生に機能障害が起こり、疲弊の最末期には、これらの細胞は物理的に削除され、おそらく過剰刺激により死滅すると考えられる。
T細胞の枯渇に関して、人工T細胞療法には機能的な課題がある。まず、患者から採取したT細胞を腫瘍の微小環境にさらすと、疲弊した表現型を獲得し、末端分化が進行する可能性がある。腫瘍微小環境における抑制性受容体（例えば、プログラム細胞死タンパク質-1、PD-1）のアップレギュレーションは、T細胞の機能を有意に阻害することが示され、機能が損なわれたT細胞から製造されるCAR-T細胞は、腫瘍細胞においてより低い効果を示す可能性があることが示唆されている。さらに、T細胞の内在性TCRは、CAR-T細胞の持続性に悪影響を及ぼす可能性がある。TCR特異性の異なるT細胞にCARを導入した場合、TCR抗原が存在すると、T細胞の疲弊とアポトーシスによりCD8+ CAR-T細胞の効果が失われることが示されている。最後に、CARからのいくつかのシグナル伝達は、CARの抗原非依存性クラスタリングによって引き起こされる緊張性CAR CD3ζリン酸化が、CAR-T細胞の早期疲弊を強制するという意味で、T細胞の分化と疲弊を増加させる可能性がある。したがって、T細胞の免疫疲弊を軽減または排除するCAR-T細胞療法が必要とされている。
免疫系障害のもう一つの原因は、加齢に伴うナイーブT細胞の免疫学的多様性が低下し、老化エフェクター細胞が増加することである。これは、高齢者において、より高い病気への感受性をもたらし、潜在的に悪性腫瘍の進行を促進する。多くの国では、人口動態の変化に伴い、若年層に比べて高齢層が過大に増加している。T細胞の老化は、多様性を制限することにより、生涯に渡る免疫保護や効果的なワクチン接種を阻害する。T細胞の構成は、未分化なナイーブT細胞から、決定されたメモリーT細胞、さらに老化したT細胞へと移行する。老化したT細胞は、CD27やCD28などの共刺激分子を失う一方で、キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーG（KLRG-1）やCD57を発現する傾向がある。さらに、老化細胞には機能不全のミトコンドリアが蓄積し、酸化的リン酸化効率が低下し、活性酸素の産生が増加する。また、いくつかの固形癌では、老化したCD8+CD28- T細胞の蓄積が観察され、老化したT細胞の抑制活性が免疫回避の戦略として利用されていることが示唆されている。さらに，CD28-CD57+PD-1+ T細胞の数の多さは，自家幹細胞移植（ASCT）後の多発性骨髄腫（MM）患者の早期再発と関連していた。また、患者の老化したT細胞や疲弊したT細胞は、T細胞免疫療法にマイナスの影響を与える。したがって、T細胞の老化に対処するCAR-T細胞療法が必要とされている。
ロイカフェレーシスは、T細胞のサブセットを含む単核細胞（MNC）を対象患者から採取するプロセスであり、閉ループ、連続または断続的な採取システムによる持続的な血流と、遠心分離が含まれる。このため、末梢血アクセスが悪い進行期の悪性腫瘍の患者さんでは困難である。また、化学療法や放射線療法はリンパ球数を減少させ、細胞毒性療法を何サイクルも経た再発・難治性の患者からは、より少ないT細胞しか採取できないことが分かっている。
従って、本発明の基礎となる技術的課題は、腫瘍関連、より具体的には癌関連のT細胞の消耗を抑制するとともに、消耗し老化したCAR-T細胞の機能、例えば細胞生存や標的特異的細胞毒性を回復させるための新しい治療薬および治療戦略を提供することである。さらに、活性化したTリンパ球は、静止しているTリンパ球に比べて何倍ものエネルギーを必要とする。このエネルギーは主に、増殖、分化、代謝活動、様々なエフェクター機構（例えばサイトカイン産生など）に使われる。したがって、Tリンパ球の活性化時には、代謝の急激な増加が必要である。前記技術的課題の解決は、特許請求の範囲において特徴付けられる実施形態を提供することによって達成される。
概要
本開示は、免疫細胞を増強又は拡大することができる、生存呼吸コンピテントミトコンドリアなどのミトコンドリアを含むエンハンサー（複数可）によって増強された免疫細胞又は免疫細胞の組成物を含む組成物を提供する。さらに、免疫細胞または免疫細胞の集団を増強または拡大することができる生存可能な呼吸コンピテントミトコンドリアを含むエンハンサー（複数可）によって増強された免疫細胞または免疫細胞の組成物を含む組成物を提供する。免疫細胞は、キメラ抗原受容体（「CAR」）又は人工T細胞受容体（「TCR」）サブユニットを発現する免疫細胞、例えばCAR-T細胞、CAR-NK細胞、CAR-マクロファージ、好中球、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、γ-ΔT細胞、並びに免疫抑制Treg細胞等を含むが、それらに限定されるわけではない。本明細書はさらに、CAR-T細胞または他の操作または増殖されたインビトロ自然免疫細胞、例えば腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、ナチュラルキラー（NK）細胞、単球、マクロファージまたは好中球を含み、外因性ミトコンドリア、例えば外因性の生存可能な呼吸コンペテントのミトコンドラによって増強される、医薬組成物を含む組成物を提供する。外因性ミトコンドリアは、自己由来、自家由来など、異なる供給源を持つことができる。それらは、新鮮に単離されたものであってもよいし、以前に単離され、その後使用まで保存されたものであってもよい。ミトコンドリアの供給源は、組織、血液、より具体的には血液中を循環している細胞、または培養細胞など、異なる性質のものであってもよい。記載された方法は、少なくとも部分的に、単離されたミトコンドリア自体、ならびに治療剤、診断剤や画像化剤に連結された単離されたミトコンドリアが、インビトロおよびインビボの両方の標的細胞に送達され得るという発見に基づくものである。
本明細書で提供されるのは、単離された生存可能なミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞と比較して、ヒト免疫細胞の生存、活性、またはそれらの組み合わせを増強するのに有効な量で薬学的に許容できる担体に配合された、単離生菌ミトコンドリアを含む医薬組成物である。
いくつかの態様において、ミトコンドリアは、真核細胞ミトコンドリアを含んでなる。いくつかの態様において、ミトコンドリアは、ヒト細胞株由来である。いくつかの態様において、ミトコンドリアは、健常なドナーに由来する。いくつかの態様において、ミトコンドリアは患者由来である。いくつかの態様において、患者は、癌患者である。いくつかの他の態様において、患者は、自己免疫疾患に罹患している患者である。いくつかの他の態様では、患者は移植された患者である。いくつかの他の態様では、患者は、感染性および／または炎症性疾患に罹患している患者である。
いくつかの態様において、生存可能なミトコンドリアは、薬学的に許容される担体中に配合される前に、以下に記載される単離方法の1つを使用して以前に単離され、各方法は以下のステップ（複数可）を含んでいる。いくつかの態様において、薬学的に許容される担体中に製剤化される前の生存ミトコンドリアは、以下に記載される単離方法の一つを使用することにより以前に単離されており、各方法は以下の工程を含む：(i）スブチリシンAを使用して培養細胞、組織または器官からミトコンドリアを単離し培養細胞、組織または臓器からサブチリシンAを用いてミトコンドリアを単離すること；または（ii）1つ以上のフィルターを通してミトコンドリアを濾過しミトコンドリアを1つまたは複数のフィルターでろ過すること；または（i）スブチリシンAを使用して培養細胞、組織または器官からミトコンドリアを単離し培養細胞、組織または臓器からサブチリシンAを用いてミトコンドリアを単離すること、続いて（ii）1つ以上のフィルターを通してミトコンドリアを濾過し。ミトコンドリアを1つまたは複数のフィルターでろ過すること。
いくつかの態様において、薬学的に許容される担体は、ヒト免疫細胞への送達のために製剤化される。いくつかの態様において、薬学的に許容される担体は、ヒトの組織や器官への送達のために製剤化される。いくつかの態様において、ヒト免疫細胞は自己由来である。いくつかの態様において、ヒト免疫細胞は同種異系である。いくつかの態様において、ヒト免疫細胞は、CD8 T細胞またはCD4 T細胞、特にCD8細胞などのT細胞である。いくつかの態様では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体（「CAR」）および／または人工T細胞受容体（「TCR」）サブユニットまたはそれらの組合せを含んでなる。
いくつかの態様において、先の実施形態のいずれか1つに記載の組成物は、単離生菌生存可能なミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞に対して、ヒト免疫細胞の基礎酸素消費率（OCR）を増強しするために、および／または有効な量やヒト免疫細胞の最大酸素消費率（OCR）を増強するのに有効な量で、薬学的に許容される担体に配合された、単離生菌生存可能なミトコンドリアを含む。
いくつかの態様において、先の実施形態のいずれか1つの組成物は、単離生存可能なミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞に対してヒト免疫細胞の拡張を増強するのに有効な量で薬学的に許容される担体に配合された単離生存可能なミトコンドリアを含んでいる。
いくつかの態様において、先の実施形態のいずれか1つに記載の組成物は、単離生存可能なミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞に対してヒト免疫細胞の代謝活性を増強するのに有効な量で薬学的に許容される担体中に製剤化された単離生存可能なミトコンドリアを含んでいる。
いくつかの態様において、先の実施形態のいずれか1つに記載の組成物は、単離生存可能なミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞に対して細胞の消耗を減らすことによってヒト免疫細胞の生存を高めるのに有効な量で薬学的に許容される担体中に製剤化処方された単離生存可能なミトコンドリアを含んでいる。
また、本明細書において提供されるのは、外因性ミトコンドリアを含むヒト幹細胞または免疫細胞であり、任意に、外因性ミトコンドリアは、免疫細胞の生存、活性、またはそれらの組み合わせを増強するために有効な量で、ヒト幹細胞またはヒト免疫細胞中に存在するものである。
いくつかの態様において、幹細胞は胚性幹細胞である。いくつかの態様において、幹細胞は、人工多能性幹細胞である。いくつかの態様において、免疫細胞は、多能性幹細胞由来の免疫細胞である。いくつかの態様において、免疫細胞は、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、制御性T細胞、記憶性T細胞などのTリンパ球である。いくつかの態様において、Tリンパ球は、CD8 T細胞である。いくつかの態様では、Tリンパ球は、CD4 T細胞またはTreg細胞である。いくつかの態様では、免疫細胞は、ナチュラルキラー（NK）細胞である。いくつかの態様において、免疫細胞は、粘膜関連不変性T細胞である。いくつかの態様において、免疫細胞は、ガンマデルタT細胞である。いくつかの態様において、免疫細胞は、単球またはマクロファージである。いくつかの態様において、免疫細胞は、好中球である。いくつかの態様では、免疫細胞はBリンパ球である。
いくつかの態様において、幹細胞または免疫細胞は、キメラ抗原受容体（「CAR」）や人工T細胞受容体（「TCR」）サブユニットを含んでいる。いくつかの態様において、幹細胞または免疫細胞は、CARまたは人工TCRサブユニットをコードするDNA、二本鎖RNA、一本鎖mRNA、および円形RNAベクターからなる群より選択される外来ポリヌクレオチドを含み、任意に、外来ポリヌクレオチドが幹細胞または免疫細胞のゲノムに統合される。
いくつかの態様において、CARは、a.抗原結合ドメイン；b.スペーサードメイン；c.膜貫通ドメイン；d.任意に、コスティミュレーションドメイン；およびe.細胞内シグナル伝達ドメイン、任意に、細胞内シグナル伝達ドメインが、細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含んでいる。いくつかの態様において、CARは、a.第一の抗原に特異的な抗原結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、およびコスティミュレーションドメインや細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含む第一のCAR；b.切断可能ドメイン；およびc.第2の抗原に特異的な抗原結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、およびコスティミュレーションドメインや細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含む第2のCARを含んでいる。
いくつかの態様において、コスティミュレーションドメインは、CD28、4-1BB、OX40、CD27、ICOS、GITR、CD40、CD2、SLAM、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様において、細胞内T細胞シグナル伝達ドメインは、CD3ζ（ゼータ）、OX40、CD27、ICOS、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様において、スペーサードメインは、CH2-CH3、CD28、CD8、またはそれらの組合せから選択される。
いくつかの態様において、CARは、少なくとも2つの異なる抗原にに対して特異的な抗原結合ドメインを含む多特異的CARである。いくつかの態様において、人工TCRは、TCRα（α）、TCRβ（β）、TCRγ（γ）、およびTCRδ（δ）サブユニットからなる群から選択される1つまたは複数のサブユニットを含んでいる。いくつかの態様において、CARまたは人工TCRサブユニットは、細胞表面上に存在する。
いくつかの態様において、幹細胞または免疫細胞は、同種異系幹細胞または自家幹細胞または免疫細胞である。いくつかの態様において、免疫細胞は、間葉系幹細胞または人工多能性幹細胞（iPSC）を含む幹細胞から産生される。
いくつかの態様において、幹細胞または免疫細胞は、標的細胞に対する増殖および細胞溶解活性が増強されている。
いくつかの態様において、免疫細胞は、外来性ミトコンドリアを含んでいないヒト免疫細胞と比較して、増強された細胞溶解活性を有する。
いくつかの態様において、免疫細胞は、外来性ミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞と比較して、増強された基礎酸素消費率（OCR）および／またはや最大酸素消費率（OCR）を有する。
いくつかの態様において、免疫細胞は、外来性ミトコンドリアを含んでいないヒト免疫細胞と比較して、増強された代謝活性を有する。
いくつかの態様において、免疫は、外来性ミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞と比較して、増強された膨張活性を有する。
いくつかの態様において、免疫細胞は、強化された生存を有し、生存は、外因性ミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞と比較して、ヒト免疫細胞の消耗を減少させることによって強化される。
いくつかの態様において、進行中の実施形態のいずれかのヒト幹細胞または免疫細胞は、癌、感染症、炎症性疾患または自己免疫疾患を治療するためのものである。
また、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載された幹細胞または免疫細胞のいずれかをそれぞれ含む、幹細胞または免疫細胞の集団が提供される。である。いくつかの態様において、免疫細胞の集団は、NK細胞、ナチュラルキラーT細胞（NKT細胞）、マクロファージ、アルファ／ベータT細胞、ガンマ／デルタT細胞、Treg細胞、好中球またはそれらの組み合わせから構成される。いくつかの態様において、免疫細胞の集団は、CD3＋T細胞、CD4＋T細胞、もしくはCD8＋T細胞、またはそれらの組合せを含む。
いくつかの態様において、CARまたは人工TCRサブユニットは、レンチウイルスまたはアデノウイルスまたはレトロウイルスなどのウイルス、ナノ粒子、またはターゲティング部位に作動可能に接続されたナノ粒子を用いて幹細胞または免疫細胞に導入される。いくつかの態様において、CARや人工TCRサブユニットをコードする外来性ポリヌクレオチドは、インビトロで幹細胞または免疫細胞に導入される。
いくつかの態様において、集団は、それを必要とするヒト対象において癌を治療するのに有効な量で、医薬組成物中に製剤化される。いくつかの態様において、集団は、それを必要とするヒト被験体において自己免疫疾患を治療するのに有効な量で医薬組成物中に製剤化される。いくつかの態様において、集団は、それを必要とするヒト対象において感染症を治療するのに有効な量で、医薬組成物中に製剤化される。いくつかの態様において、集団は、それを必要とするヒト対象における炎症性疾患を治療するのに有効な量で、医薬組成物中に製剤化される。いくつかの態様において、集団は、それを必要とするヒト対象において移植片対宿主病（GvHD）を治療するために有効な量で医薬組成物中に製剤化される。
いくつかの態様において、免疫細胞の集団は、外来性ミトコンドリアを欠く免疫細胞の同等の集団よりも効果的に、および／またはより長く腫瘍細胞を殺す。いくつかの態様において、自己免疫疾患の場合のようななどの集団の免疫細胞の異常な免疫応答は、外因性ミトコンドリアを欠く免疫細胞の同等の集団の応答と比較すると、よりマイルド（より少ない）であり、および／またはや完全に存在しない。欠落している。
いくつかの態様において、幹細胞または免疫細胞の集団は、群から選択される抗原に特異的な抗原結合ドメインを含むCARまたは人工TCRサブユニットを含んでなる：B細胞成熟抗原（BCMA、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー17、TNFRSF17としても知られる）、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1（CD2サブセット1、CRACC、SLAMF7、CD319、および19A24とも呼ばれる）、C型レクチン様分子-1（CLL-1またはCLECL1）、CD33、EGFRvIII（上皮成長因子受容体変異体）、ガングリオシド G2（GD2）、ガングリオシド GD3, Tn抗原（Tn AgまたはGalNAca-Ser/Thr）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、Fms-Likeチロシンキナーゼ3 （FLT3)、腫瘍関連糖蛋白質72（TAG72）、CD38、CD44v6、カルチノエンプロイー抗原（CEA）、上皮細胞接着分子（EpCAM）、B7H3（CD276）、KIT（CD117）、インターロイキン13受容体サブユニットα2（IL-13Ra2またはCD213A2）；メソセリン、インターロイキン11受容体α（IL-11Ra）、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、プロテアーゼセリン21（TestisinまたはPRSS21）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ルイスY抗原、CD24、プレートレット由来増殖因子受容体β（PDGFR-β）；ステージ特異的胚性抗原-4（SSEA-4）；CD20；葉酸受容体α；受容体チロシン-プロテインキナーゼ ERBB2（Her2/neu）；ムチン1、関連する細胞表面（MUC1）; 上皮成長因子受容体（EGFR）；神経細胞接着分子（NCAM）；プロスターゼ；前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）；伸長因子2変異体（ELF2M）；エフリンB2；線維芽細胞活性化タンパク質α（FAP）；インシュリン様成長因子1受容体（IGF-I受容体）、炭酸脱水素酵素IX（CAIX）；プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット、ベータタイプ、9（LMP2）；糖タンパク質100（gp100）；ブレークポイントクラスター領域（BCR）とAbelsonマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ1（Abl）からなる癌遺伝子融合タンパク質（bcr-abl）；チロシナーゼ；エフリンタイプA受容体2（EphA2）；フコースGM1；シアリルルイス接着分子（sLe）; ガングリオシドGM3 （aNeu5Ac（2-3）bDG alp（1-4）bDGlcp（1-1）Cer); トランスグルタミナーゼ5 （TGS5); 高分子量-メラノーマ関連抗原 （HMWMAA); o-アセチル-GD2ガングリオシド（OAcGD2）；葉酸受容体β；腫瘍内皮マーカー1（TEM1／CD248）；腫瘍内皮マーカー7関連（TEM7R）；クラウディン6（CLDN6）。甲状腺刺激ホルモン受容体（TSHR）；Gタンパク質共役型受容体クラスCグループ5、メンバーD（GPRC5D）；X染色体オープンリーディングフレーム61（CXORF61）；CD97；CD179a；未分化リンパ腫キナーゼ（ALK）；ポリシアル酸；胎盤特異的1（PLAC1）；グロボ糖セラミドの六糖部分（グロボ）；。乳腺分化抗原 （NY-BR-1); ウロプラキン2 （UPK2); A型肝炎ウイルス細胞受容体1 （HAVCR1); アドレナリン受容体β3 （ADRB3); パネキシン3 （PANX3); Gタンパク質共役受容体20 （GPR20); リンパ球抗原6複合体、ローカスK 9 （LY6K); 嗅覚受容体51 E 2 （OR 51 E 2);TCRガンマ代替リーディングフレームタンパク質 （TARP);ウィルムス腫瘍蛋白 （WT 1);癌/精巣抗原1 （NY-ESO-1);癌/精巣抗原2 （LAGE-la);黒色腫関連抗原1 （MAGE-A 1);ETS染色体12 pに位置する転座変異遺伝子6 （ETV 6-AML);精子タンパク質17 （SPA 17); X抗原ファミリー、メンバー1A（XAGE1）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体2（Tie 2）；メラノーマ癌精巣抗原-1（MAD-CT-1）；メラノーマ癌精巣抗原-2（MAD-CT-2）；Fos関連抗原1；腫瘍タンパク質p53（p53）；p53突然変異体；プロステイン；生き残り；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原-1（PCTA-1またはガレクチン8）、T細胞によって認識されるメラノーマ抗原1（MelanAまたはMART1）、ラット肉腫（Ras）変異体、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）、肉腫転座ブレークポイント、アポトーシスのメラノーマ阻害剤（ML-IAP）、ERG（膜貫通型プロテアーゼ・セリン2（TMPRSS2）ETS融合遺伝子）；N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV（NA17）；ペアボックスタンパク質Pax-3（PAX3）；アンドロゲン受容体；サイクリンB1；v-myc鳥類骨髄球腫症ウイルス腫瘍遺伝子神経芽腫由来ホモログ（MYCN）；RasホモログファミリーメンバーC（RhoC）；チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP-2）；チトクロームP450 1B1（CYP1B1）；CCCTC結合因子（亜鉛フィンガータンパク質）様（BORISまたはインプリンティング部位の制御因子の兄弟）、T細胞によって認識される扁平上皮がん抗原3 （SART 3)；ペアードボックス蛋白質Pax-5 （PAX 5)；プロアクロシン結合タンパク質sp 32 （OY-TES 1)；リンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ（LCK)；Aキナーゼアンカー蛋白質4（AKAP-4）；滑膜肉腫、Xブレークポイント2（SSX2）；先進糖化産物受容体（RAGE-1）；腎ユビキタス1（RU1）；腎ユビキタス2（RU2）；レグマイン；ヒト乳頭腫ウイルスE6（HPV E6）； ヒト乳頭腫ウイルスE7（HPV E7）；腸カルボキシル・エステラーゼ；熱ショックタンパク質70-2変異体（mut hsp 70-2);CD 79 a；CD 79 b；CD 72；白血球関連免疫グロブリン様受容体1 （LAIR 1)；IgA受容体のFcフラグメント （FCARまたはCD 89)；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2 （LILRA 2)；CD 300分子様ファミリーメンバーf （CD 300 LF)；C型レクチンドメインファミリー12メンバーA（CLEC12A）；骨髄間質細胞抗原2（BST2）；EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2（EMR2）；リンパ球抗原75 （LY75)；グリピカン3 （GPC3)；Fcレセプター様5 （FCRL5)；免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド1（IGLL1）。いくつかの態様において、幹細胞または免疫細胞の集団は、第1、第2、第3または第4世代のCARを含んでいる。
また、本明細書において提供されるのは、幹細胞または免疫細胞の集団を増強する方法であって、任意選択で、幹細胞または免疫細胞がCARまたは人工TCRサブユニットを発現し、以下のステップを含む： a. リンパ球の活性化を促進することができる特異的な活性化レセプターアゴニスト抗体を用いて、無細胞培地において幹細胞または免疫細胞を活性化すること； b. 幹細胞または免疫細胞を、単離された生存可能なミトコンドリアを含む組成物に曝露し、それによって幹細胞または免疫細胞の集団を拡大すること；およびc．幹細胞または免疫細胞を、CARまたは人工TCRサブユニットをコードする外来ポリヌクレオチドで形質転換すること。いくつかの態様において、本方法は、ステップa.を代替的に含み、コーティングされたCD3/CD28ビーズを用いた無細胞培地中で、任意にIL-2などの組み換えインターロイキンの存在下で幹細胞または免疫細胞をインビトロで活性化することを含む。いくつかの態様において、本方法は、代替的に、ステップb.幹細胞または免疫細胞を、分離ミトコンドリアを含む組成物に曝露し、それによって代謝活性もしくは生存またはそれらの組合せを増強することを含んでいる。
いくつかの態様において、幹細胞または免疫細胞は、以下の群から選択される生体試料に由来する：血液および生物学的由来の他の液体試料、固体組織試料、それに由来する細胞およびその子孫の組織培養、生体試料からの単離細胞。いくつかの態様において、特異的リンパ球活性化受容体アゴニストは、細胞模倣無細胞支持体にコンジュゲートされている。いくつかの態様において、細胞模倣支持体は常磁性ビーズである。
いくつかの態様において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはハイブリッドベクターに由来するものである。
また、本明細書に提供されるのは、先の実施形態のいずれか1つに記載の幹細胞もしくは免疫細胞、または幹細胞もしくは免疫細胞の集団を含む、癌、感染症、炎症性疾患または自己免疫疾患を治療するための医薬組成物である。特に、本明細書において、先の実施形態のいずれか1つの幹細胞若しくは免疫細胞、又は幹細胞もしくは免疫細胞の集団を含んでなる、癌を治療するための医薬組成物が提供される。特に、幹細胞もしくは免疫細胞、又は先の実施形態のいずれか1つの幹細胞若しくは免疫細胞の集団を含む、自己免疫疾患を治療するための医薬組成物が、本明細書に提供される。
組成物が可溶性状態で調製される、先行する実施形態のいずれか1つに記載の医薬組成物。いくつかの態様において、幹細胞または免疫細胞は、生存可能な真核細胞から産生される。いくつかの態様において、幹細胞または免疫体は、インビトロまたはエクスビボで産生される。いくつかの態様において、幹細胞または免疫細胞は、自家細胞移植または同種細胞移植の方法によって産生される。
いくつかの態様において、同系統細胞移植の方法は、以下を備える：a.ドナーから生存血液のサンプルを得ること；b.ステップ（a）で得られた血液サンプルから幹細胞または免疫細胞を分離すること；c.CARまたは人工TCRサブユニットをコードする1つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドで免疫細胞を形質転換すること；d. 任意に、幹細胞または免疫細胞を、先の実施形態のいずれか1つの小分子と接触させること；およびe. 改変した幹細胞または免疫細胞をそれを必要としている被験者に投与すること。
いくつかの態様において、自己細胞移植の方法は、以下を備える：a.必要な対象から採取された生存可能な血液のサンプルを入手すること；b.ステップ（a）で得られた血液サンプルから幹細胞または免疫細胞を分離すること；c.CARまたは人工TCRサブユニットをコードする1つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドで免疫細胞を形質転換すること；d.任意で、幹細胞または免疫細胞を先の実施の形態いずれか1項の低分子と接触させること；そしてe.改変された免疫細胞を被験者に再導入すること（例えば、再融合すること）。
いくつかの態様において、医薬組成物は、それを必要とするヒト被験体において癌を治療するのに有効な量で投与される。いくつかの態様において、医薬組成物は、それを必要とするヒト被験体において感染症を治療するのに有効な量で投与される。いくつかの態様において、医薬組成物は、それを必要とするヒト被験体において炎症性疾患を治療するのに有効な量で投与される。いくつかの態様において、医薬組成物は、それを必要とするヒト被験体において自己免疫疾患を治療するのに有効な量で投与される。
また、本明細書において提供されるのは、先行する実施形態のいずれか1つに記載の幹細胞もしくは免疫細胞、または幹細胞もしくは免疫細胞の集団を対象に投与することを含む、それを必要とする対象を治療する方法である。いくつかの態様において、幹細胞または免疫細胞の活性は、先行する組成物のいずれかの医薬組成物を構成するミトコンドリアのインビボ共投与によってブーストされる。例えば、単離生存可能ミトコンドリア、特に単離生存可能呼吸能力ミトコンドリアを、単離生存可能ミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞に対してヒト免疫細胞の生存や活性を増強するのに有効な量で薬学的に許容できる担体に製剤化してなる医薬組成物、または、免疫細胞を含む組成物であって、任意に、医薬組成物の共同投与が幹細胞または免疫細胞の投与の前、同時、や後に行われる組成物である。いくつかの態様において、医薬組成物は、患者への静脈内注入によって免疫細胞と共投与される。
また、本明細書では、幹細胞もしくは免疫細胞、または幹細胞もしくは免疫細胞の集団、および単離生存可能なミトコンドリアを共投与することを含む、それを必要とする対象の治療方法であって、任意選択的に、単離生存可能なミトコンドリアが、先行する組成物のいずれかの医薬組成物中に含まれる方法が提供される。例えば、単離生存可能ミトコンドリア、特に単離生存可能呼吸能力ミトコンドリアを、単離生存可能ミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞に対してヒト免疫細胞の生存や活性を増強するのに有効な量で薬学的に許容できる担体に製剤化してなる医薬組成物、外来性ミトコンドリアを含んでなる免疫細胞を含んでなる組成物である。いくつかの態様において、単離生存可能ミトコンドリアの共投与は、幹細胞または免疫細胞の投与の前、同時、や後に行われる。
いくつかの態様において、対象は、以下の群から選択される癌を有する：急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、肺胞横紋筋肉腫、膀胱癌（例えば、膀胱癌）、骨癌、脳癌（例えば、, 膠芽腫）、乳がん、肛門・肛門管・直腸がん、眼球がん、肝内胆管がん、関節がん、首・胆嚢・胸膜がん、鼻・鼻腔・中耳がん、口腔の癌、外陰部の癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性癌、大腸癌、食道癌、子宮頸癌、線維肉腫、胃腸カルチノイド腫瘍、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌）、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、白血病、液状腫瘍、肝臓癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌、肺腺癌）、リンパ腫、中皮腫、肥満細胞腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、B型慢性リンパ性白血病、ヘアリーセル白血病、バーキットリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、腹膜・軟骨・腸間膜癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、皮膚癌、小腸癌、軟部組織癌、固形癌、滑膜肉腫、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、及び尿管癌である。
組織または培養細胞からミトコンドリアを単離するための1つの例示的プロトコルの概略図。 フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡を使用して決定されたミトコンドリアの用量依存的な統合。図. 2A フローサイトメトリーによる統合されたミトコンドリアのMitotracker Red CMXRosのMFI。図. 2B フローサイトメトリーによる統合型ミトコンドリアのミトトラッカーグリーンFMのMFI。図. 2Cフローサイトメトリーによる移植CD8+T細胞ミトトラッカーレッドCMXRos+のパーセンテージ。図. 2D蛍光顕微鏡による統合されたミトコンドリアのミトトラッカーレッドCMXRosのシグナル。フローサイトメトリーと蛍光顕微鏡で見たCD8+ T細胞に組み込まれたミトコンドリア活性と染色したミトコンドリアの質量は、処理したCD8+ T細胞で用量依存的に著しく増加することが示された。活性化後18日目の5つの異なるドナーからのCD8+ T細胞を、外因性ミトコンドリアで処理し、ミトコンドリア移植後4時間後に分析した。QubitTM Protein Assayを使用して測定した1μg、5μg、10μg、20μg、30μgのミトコンドリアの用量レベルは、100万個のT細胞に投与された。データは、4つの独立した実験（フローサイトメトリー）および2つの独立した実験（蛍光顕微鏡）の代表的なもので、5人のドナー（フローサイトメトリー）および1人の代表ドナー（蛍光顕微鏡）の平均±SDとして表示されている。*p < 0.05； **p < 0.01； ***p < 0.001； ****p < 0.0001。 図2Aの説明を参照。 図2Aの説明を参照。 図2Aの説明を参照。 ミトコンドリア移植によるCD8+ T細胞の全体的な拡大。CD8+ T細胞へのミトコンドリア移植は、細胞増殖を促進することが示された。CD8+ T細胞の全体的な拡大。データは2つのプールされた独立した実験の代表であり、平均±SDで示される（プールされた時点ごとに1グループあたり6人のドナー：移植後24時間、48時間、72時間、140時間、各時点における対照群と比較した倍率変化で表される）。活性化後12日目と18日目の間の安静時CD8+ T細胞は、ミトコンドリア移植後24時間、48時間、72時間、140時間後に解析された。 *p < 0.05； **p < 0.01； ***p < 0.001； ****p < 0.0001.である。 処理されたCD8+ T細胞は、基礎および最大酸素消費速度の増加を示す。ミトコンドリア移植は、CD8+ T細胞における基底および最大酸素消費率（OCR）を増加させる。図. 4A 基礎OCR（pmol/min)。図. 4B 最大呼吸（FCCP処理時のOCR-基底OCR）（pmol／分）。図. 4C フォールド変更基本OCR。図. 4D 最大呼吸曲線変化 （FCCP上のOCR-治療基礎OCR） 。データは3つの独立した実験の代表であり、2人のドナーの平均±SDとして示されている（グループごと、ドナーごとに7～11の技術的複製）。*p < 0.05； **p < 0.01； ***p < 0.001； ****p < 0.0001である。 処理したCD8+ T細胞と未処理のCD8+ T細胞におけるミトコンドリア・フィットネスの評価。CD8+T細胞へのミトコンドリア移植は、ミトコンドリア・フィットネスを高めることが示された。図. 5A ミトトラッカーレッドCMXRosのMFI。図. 5B ミトトラッカーグリーンFMのMFI。図. 5C ミトコンドリア活性の倍率変化。図. 5D ミトコンドリア質量の倍率変化。図. 5E Mitotracker Red CMXRosのMitotracker Green FMに対する比率。 データは3つの独立した実験をプールしたものを代表するもので、平均±SDで表示されている（各グループ6～11テクニカルレプリケート）。活性化後11日目から17日目までの1人のドナーからのCD8+T細胞が、ミトコンドリア移植後24時間後に分析された。*p < 0.05； **p < 0.01； ***p < 0.001； ****p < 0.0001。 図5Aの説明を参照。 図5Aの説明を参照。 図5Aの説明を参照。 図5Aの説明を参照。 ミトコンドリア移植はT細胞の疲弊を軽減する。図. 6A 1回または4回刺激したT細胞のLAG-3のMFI。図. 6B 1回または4回刺激したT細胞のTIM-3のMFI。図. 6C LAG-3のMFI。図. 6D TIM-3のMFI。図. 6E LAG-3の倍率変化。図. 6F TIM-3の倍率変化。図. 6G 刺激後の枯渇していないCD8+T細胞の割合。データは1回の実験を表し、1人の健康なドナー（4つの技術的複製）からの平均±SDとして提示されている。 *p < 0.05； **p < 0.01； ***p < 0.001； ****p < 0.0001。 図6Aの説明を参照。 図6Aの説明を参照。 図6Aの説明を参照。 図6Aの説明を参照。 図6Aの説明を参照。 図6Aの説明を参照。
統計解析： すべての検定はGraphPad Prism ソフトウェア（La Jolla, CA）を用いて実施した。すべてのデータは平均値＋SDで示した。データの正規性はShapiro-Wilk検定で検定した。対になっていない2つのグループ間の比較は、パラメトリックな学生のT検定またはノンパラメトリックなMann-Whitney検定で行った。正規分布に従わない対の2群間の比較は、ノンパラメトリックなWilcoxonの符号付順位検定で行った。多重比較のために、パラメトリック一元配置分散分析（ANOVA）またはノンパラメトリックKrustal-Wallis検定を行った（Dunnの多重比較検定で補正）。 p < 0.05は、統計的に有意であるとみなした（*p < 0.05； **p < 0.01； ***p < 0.001； ****p < 0.0001 ）。
詳細説明
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記及び他の科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有することが意図される。場合によっては、一般に理解されている意味を有する用語は、明確化のため、及び／又はすぐに参照できるように本明細書に定義されており、そのような定義を本明細書に含めることは、当技術分野で一般に理解されていることとの相違を表すと必ずしも解釈されるべきではない。本明細書に記載または参照される技術および手順は、一般によく理解され、当業者によって従来の方法論を用いて一般的に採用されるものであり、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning： A Laboratory Manual 4th ed.（2012）Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NYに記載されている、広く利用されている分子クローニング方法論が挙げられる。適宜、市販のキットおよび試薬の使用を含む手順は、特に断らない限り、一般に、製造者が定義したプロトコルおよび条件に従って実施される。
本明細書で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形の参照語を含む。用語「含む」、「など」は、特に明記しない限り、制限なく含むことを伝えることを意図している。
本明細書で使用される場合、用語「含む」はまた、特に他に示されない限り、言及された要素から「なる」及び「から本質的になる」実施形態を具体的に含む。
用語「約」は、指示された値及びその値を上回る範囲及び下回る範囲を示し、包含する。特定の実施形態において、用語「約」は、指定された値±10％、±5％、または±1％を示す。特定の実施形態では、該当する場合、用語「約」は、指定された値（複数可）±その値（複数可）の1つの標準偏差を示す。
用語「単離された」は、自然の状態または環境から変更または除去されたことを意味する。例えば、生きている動物または細胞中に自然に存在する核酸またはペプチドは 「分離」されていないが、同じ核酸またはペプチドをその自然の状態の共存物質から部分的にまたは完全に分離したものは「分離」されている本明細書で使用する場合、用語「単離されたミトコンドリア」は、無関係な真核細胞物質を含まない生存可能なミトコンドリアを意味する。単離されたミトコンドリアは、実質的に精製された形態で存在することができ、または例えば、外因性宿主細胞などの非自然的な環境において存在することができる。
用語「生存可能なミトコンドリア」は、本明細書を通じて、生存可能なミトコンドリア、すなわち、活性で機能し、呼吸が可能なミトコンドリアを説明するために使用される。
本明細書で使用されるように、用語「移植」は、器官、組織、細胞の塊、個々の細胞、または細胞小器官をレシピエントに移植するプロセスを記述するための一般的な用語として本明細書全体を通して使用される。「細胞移植」という用語は、少なくとも1つの細胞、例えば、本明細書に記載される強化された免疫細胞をレシピエントに移植するプロセスを記述するための一般的な用語として、本明細書全体を通して使用される。この用語は、輸血を含む、当技術分野で知られている移植の全てのカテゴリーを含む。移植は、部位及びドナーとレシピエントとの間の遺伝的関係によって分類される。この用語は、例えば、自家移植（患者の1つの場所から同じ被験者の同じ場所または別の場所への細胞または組織の除去および移植）、同種移植（同じ種のメンバー間の移植）、および異種移植（異なる種のメンバー間の移植）を含む。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合で共有結合したアミノ酸残基からなる化合物を意味する。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2個のアミノ酸を含む必要があり、タンパク質またはペプチド配列を構成することができるアミノ酸の最大数は特に制限されない。ポリペプチドには、2個以上のアミノ酸がペプチド結合によって互いに結合してなる任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書で使用される場合、この用語は、例えば、ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとして当技術分野で一般的にも言及される短い鎖と、一般にタンパク質として当技術分野で言及される長い鎖の両方を指し、これらのタンパク質には多くの種類が存在する。「ポリペプチド」には、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変種、修飾ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質等が含まれる。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、またはそれらの組合せを含む。
用語「抗体」は、本明細書において最も広い意味で使用され、抗原またはエピトープに特異的に結合する1つ以上の抗原結合ドメインを含むある種の免疫グロブリン分子を含む。また、この用語は、非免疫グロブリン抗原結合タンパク質分子、いわゆる抗体模倣品も含む。抗体は、具体的には、インタクトな抗体（例えば、インタクトな免疫グロブリンG、IgG）、抗体断片（例えば、Fab断片、単鎖Fv（scFv）、単一ドメイン抗体、VH, VL, VHH、NAR、タンデムscFv、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、DARTs、tandAbs、ミニボディ、単一ドメイン抗体（ 例、キャメロイドVHH）、当業者に知られている他の抗体断片またはフォーマット）、および抗体模倣物（例えば、アドネクチン、アフィボディ、アフィリン、アンチカリン、アビマー、DARPins、ノッティンなど）である。抗体は、単特異性、二特異性及び多特異性であり得る。
「抗原結合ドメイン」とは、抗体またはT細胞受容体のうち、可変ドメインを介して抗原またはエピトープに特異的に結合できる部分を意味する。抗原結合ドメインの一例は、抗体重鎖及び軽鎖の可変ドメインであるVH及びVLがそれぞれ界面によって形成される抗原結合ドメインである。抗原結合ドメインの別の例は、抗体模倣物質から特定のループを多様化することによって形成される抗原結合ドメインである。抗原結合ドメインの別の例は、TCRの可変ドメイン、例えばCDRを含むTCRドメイン、例えばαCDR1、αCDR2、αCDR3、βCDR1、βCDR2、及びβCDR3などである。
本明細書で使用する場合、「可変ドメイン」は、組換え事象から生じる可変ヌクレオチド配列を指し、例えば、活性化T細胞などのT細胞からのT細胞受容体（TCR）配列のV、J、やD領域を含むことができ、又は、抗体のV、J、やD領域を含むことができる。用語「抗原結合フラグメント」は、すなわち可変ドメインおよび超可変ループ、いわゆる相補性決定領域（CDR）を含む抗体またはTCR、またはその組換え変異体の少なくとも一部分を指し、抗原およびその定義されたエピトープなどの標的への抗原結合フラグメントの認識および特異的結合を付与するのに十分である。抗原結合断片の例としては、Fab、Fab'、F（ab'）2、およびFv断片、単鎖（sc）Fv（「scFv」）抗体断片、線状抗体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。単一ドメイン抗体（略称「sdAb」）（VLまたはVHのいずれか）、ラクダ科VHHドメイン（ナノボディ）、抗体断片から生成した多特異抗体、およびTCR断片が挙げられる。例示的な抗体及び抗体断片の形式は、Brinkmannら（MABS、2017年、第9巻、第2号、182-212）に詳細に記載されており、その教示のすべてについて参照により本明細書に組み込まれる。
用語「scFv」は、抗体重鎖（VH）の可変断片がそのC末端で抗体軽鎖（VL）の可変断片のN末端と柔軟なペプチドリンカーを介して連結されてなる融合タンパク質をいい、単一のポリペプチド鎖として発現可能であり、そのscFvはその由来となる無傷の抗体の特異性を保持する。
ScFvの文脈で使用される「リンカー」及び「柔軟なポリペプチドリンカー」という用語は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を一緒に連結するために、単独又は組み合わせて使用されるグリシン及び／又はセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを意味する。一実施形態では、可撓性ポリペプチドリンカーは、Gly／Serリンカーであり、アミノ酸配列（Gly-Gly-Gly-Ser）nからなり、nは1以上の正整数である。例えば、n＝1、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5、n＝6、n＝7、n＝8、n＝9及びn＝10である。一実施形態において、可撓性ポリペプチドリンカーは、（Gly4Ser）3または（Gly4Ser）4を含むが、これらに限定されるわけではない。別の実施形態では、リンカーは、（Gly2Ser）、（GlySer）または（Gly3Ser）の複数回の繰り返しを含む。また、本発明の範囲内に含まれるのは、WO2012／138475（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるリンカーである。
抗体に関する「重鎖可変領域」又は「VH」（又は、ラクダの単一ドメイン抗体、例えば、ナノボディの場合には、「VHH」）は、フレームワーク領域（FR）として知られるフランキングストレッチ間に介在する3つのCDRを含む重鎖の断片を指し、これらのフレームワーク領域は一般にCDRより保存されており、CDRを支持する足場を形成している。
指定されない限り、本明細書で使用される場合、scFvは、VL及びVH可変領域をいずれかの順序で有してよく、例えば、ポリペプチドのN末端及びC末端に関して、scFvはVL-linker-VHからなるか又はVH-linker-VLからなる可能性がある。
用語「抗体重鎖」は、自然界に存在するコンフォメーションで抗体分子に存在する2種類のポリペプチド鎖のうち、より大きなものを指し、典型的には抗体が属する免疫グロブリンクラスを決定するものである。
「抗体軽鎖」という用語は、自然発生的なコンフォメーションで抗体分子に存在する2種類のポリペプチド鎖のうち、小さい方の鎖を指する。カッパ（「κ」）およびラムダ（「λ」）軽鎖は、2つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指する。
用語「組換え抗体」は、例えば、細菌、酵母、植物または哺乳類細胞によって発現される抗体のような、組換えDNA技術を使用して生成される抗体を意味する。この用語はまた、抗体をコードするDNA分子の合成によって生成された抗体であって、そのDNA分子が抗体タンパク質、または抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、そのDNAまたはアミノ酸配列が、当該技術分野において入手でありかつ周知の組換えDNAまたはアミノ酸配列技術を使用して得られた抗体を意味すると解釈されるべきである。
「抗原」または「Ag」という用語は、抗体によって特異的に結合することが可能な分子、または抗原が抗原提示細胞（APC）によって処理されるとき、例えば、その他の免疫応答を誘発する分子を指す。この免疫応答は、抗体産生、または特定の免疫学的に有能な細胞の活性化のいずれか、あるいは両方を含むことができる。
当業者であれば、実質的にすべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が、抗原として機能し得ることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えDNAまたはゲノムDNAに由来することができる。当業者は、免疫反応を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列からなる任意のDNAが、したがって、この用語が本明細書で使用されるように「抗原」をコードしていることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が、遺伝子の全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はないことを理解するであろう。本開示は、1つ以上の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含むが、これに限定されないこと、およびこれらのヌクレオチド配列は、所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードするために種々の組み合わせで配列されることが容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原は「遺伝子」によってコードされている必要は全くないことを理解できるだろう。抗原が化学合成によって生成され得ることは容易に明らかである。また、生体試料に由来するものであってもよいし、ポリペプチド以外の高分子、例えば、脂質または炭水化物であってもよい。このような生体試料としては、組織試料、腫瘍試料、細胞または他の生体成分を含む液体が含まれ得るが、これらに限定されない。
用語「抗腫瘍効果」は、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、余命の延長、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存率の減少、または癌状態に伴う様々な生理症状の改善など、種々の手段により発現させることができる生物学的効果をいうが、これに限られない。また、「抗腫瘍効果」は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の、腫瘍の発生をそもそも予防する能力によって発現され得る。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を有する完全ヒト定常ドメイン（例えば、Cκ又はCλ、CH1, CH2, CH3）及び可変ドメイン（VH, VL）を含む、免疫グロブリンである。ほとんどの場合、ヒト化抗体、TCR、およびその抗原結合断片は、レシピエントのCDRからの残基が、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、または非ヒト霊長類抗体などの非ヒト種（ドナー抗体またはTCR）のCDRからの残基で完全にまたは部分的に置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体、TCR、または抗原結合断片）であり、所望の特異性、アフィニティー、および機能活性（ブロック型受容体リガンド相互作用）を有している。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体結合活性を回復するために、ヒト免疫グロブリンのVH又はVLフレームワーク領域（FR）のいくつかの残基が、対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体／TCR／抗原結合フラグメントは、レシピエント抗体にも輸入CDRまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体、TCR、または抗原結合フラグメントの性能をさらに洗練し、最適化することができる。一般に、ヒト化抗体またはその抗体断片は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、CDR領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域のすべてまたはかなりの部分がヒト免疫グロブリン配列のものであるだろう。ヒト化抗体又は抗体フラグメントはまた、免疫グロブリン定数領域（Fc）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含むことができる。さらなる詳細については、Jones et al.、Nature、1986、321：522-525；Riechmann et al.、Nature、1988、332：323-329；およびPresta、Currを参照してください。オプション。構造体。Biol., 1992, 2：593-596、各々、参照することによりその全体が組み込まれる。
「ヒト抗体」または「ヒトTCR」は、ヒトまたはヒト細胞によって産生される抗体のものに対応するアミノ酸配列を有するもの、またはヒト抗体もしくはTCRレパートリーまたはヒト抗体／TCRコード化配列（例えば、ヒト源から得られるかまたはde novo設計）を利用する非ヒト源に由来するものである。ヒト抗体およびTCRは、それぞれヒト化抗体およびTCRを特に除外する。
抗体、TCR、またはその抗原結合断片の標的分子への結合に関して、特定の抗原（例えば、ポリペプチド標的）または特定の抗原上のエピトープに対する「結合」、「特異的結合」、「特異的に結合」、「選択的に結合」、「選択的」という用語は、非特異的または非選択的相互作用（例えば、非標的分子との）と測定可能なほど異なる結合を意味している。特異的結合は、例えば、標的分子への結合を測定し、それを非標的分子への結合と比較することによって測定することができる。また、特異的結合は、標的分子上で認識されるエピトープを模倣したコントロール分子との競合によって決定することができる。その場合、抗体、TCR、またはその抗原結合断片の標的分子への結合が、コントロール分子によって競合的に阻害される場合、特異的結合が示される。本明細書で使用する特異的結合は、KD値が10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、又は10-10M未満である親和性を指すことができる。親和性は、表面プラズモン共鳴（SPR）技術（例えば、BIACORE（登録商標））または生体層干渉法（例えば、FORTEBIO（登録商標））など、本明細書に記載されるものを含む当該術分野で既知の一般的な方法によって測定され得る。
用語「自家」は、後にその個体に再導入される個体と同じ個体に由来するあらゆる材料を指す。
用語「同種異系」とは、導入される個体と同じ種または異なる患者の異なる動物に由来する材料を指す。2つ以上の個体は、1つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、互いに同質であると言われる。いくつかの態様において、同じ種の個体からの同種材料は、抗原的に相互作用するために、遺伝的に十分に異なっていてもよい。
用語「異種材料」は、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
用語「治療する」（および「治療する」または「治療」などのその変形）は、それを必要とする対象における疾患または状態の自然経過を変える試みにおける臨床介入を指す。治療は、予防のためと臨床病態の経過中の両方に行うことができる。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の防止、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後の改善が含まれる。
本明細書で使用する場合、「治療上有効な量」とは、組成物が投与される個体に対して有益な効果を提供するか、さもなければ有害な非有益事象を低減するのに十分な組成物またはその活性成分の量である。本明細書において「治療上有効な量」とは、それが投与される1つ以上の所望のまたは望ましい（例えば、有益な）効果をもたらす量を意味し、そのような投与は所定の期間にわたって1回または複数回行われる。正確な投与量は、当業者であれば既知の技術を用いて確認可能であろう（例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms（vols.1-3, 1992）；Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding（1999）；and Pickar, Dosage Calculations （1999）など参照）。
本明細書で使用される場合、用語「キメラ抗原受容体」または「CAR」は、刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列（ 「一次信号ドメイン」ともいう）に融合した抗原結合部位を含み、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたは「ITAM」として知られているシグナル伝達モチーフを含むことができる様々なポリペプチドから得られる組換えポリペプチド（ 例えば、少なくとも抗原結合ドメインまたはその抗原結合フラグメントを有するポリペプチド）のことをいう。本発明において特に使用されるITAM含有一次細胞質シグナル伝達配列の例には、CD3ζ（ゼータ）、FcRγ（ガンマ）、FcRβ（ベータ）、CD3γ、CD3δ（デルタ）、CD3ε（イプシロン）、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278（「ICOS」としても知られている）及びCD66d由来のものが含まれるが、それだけに制限されるわけではない。CARは、典型的には、抗体型特異性またはTCR型特異性を有するTリンパ球などの人工免疫細胞を提供し、T細胞におけるシグナル伝達後にIL-2の産生および標的細胞の溶解を含むエフェクター細胞の機能の一部または全部を活性化させるものである。
本明細書に記載のCARの抗原結合ドメインまたはその抗原結合断片は、例えば、抗原結合ドメインが、例えば、単一ドメイン抗体断片（sdAb）または重鎖抗体（HCAb）、単一鎖Fv抗体（scFv）、天然由来、または合成、などの連続したポリペプチド鎖の一部として発現し、抗原に結合する場合、種々の形態で存在することができる。本明細書に記載のCARの抗原結合ドメイン又はその抗原結合断片は、本明細書に記載の抗体形式又は抗体断片形式のいずれかを含むことができる。本明細書に記載されるCARの抗原結合ドメイン又はその抗原結合フラグメントは、キメラ又は人工T細胞受容体（TCR）を含むがこれに限定されない、抗体由来ではない配列を含むことができる。これらのキメラ／人工TCRは、標的抗原を認識するポリペプチド配列を含んでいてもよく、ここで、認識配列は、例えば、TCRまたはscFvに由来する認識配列であってもよいが、これらに限定されるものではない。細胞内ドメインポリペプチドは、T細胞を活性化するために作用するものである。キメラ／人工TCRは、例えば、Gross, G., and Eshhar, Z., FASEB Journal 6：3370- 3378 （1992), and Zhang, Y., et al., PLOS Pathogens 6： 1-13 （2010）に記載されている。
「CAR-T細胞」は、本明細書に開示された方法に従って形質導入されたT細胞であり、CAR遺伝子、例えば、ゲノムにランダムに組み込まれるか、CCR5およびAAVS1遺伝子座に、またはT細胞受容体α一定（TRAC）遺伝子座に意図的に組み込まれたものを発現するものである。いくつかの実施形態では、T細胞は、CD4＋T細胞、CD8＋T細胞、又はCD4＋／CD8＋T細胞である。いくつかの実施形態では、T細胞は、制御性T細胞である。いくつかの実施形態では、T細胞は、被験体を基準として、自己由来、同種異系、または異種異系である。
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、哺乳動物対象を意味する。例示的な対象には、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ラクダ、ヤギ、ウサギ、及びヒツジが含まれる。特定の実施形態では、被験体は、ヒトである。「患者」は、疾患、障害、または状態に罹患しているか、またはそうでなければ本明細書で提供される組成物および方法を必要とする危険にさらされている対象である。
本明細書で使用される場合、「予防する」とは、患者における疾患又は状態、例えば、腫瘍形成の予防を意味する。例えば、腫瘍又は他の形態の癌を発症する危険性のある個体が、本発明の方法で治療され、後に腫瘍又は他の形態の癌を発症しない場合、その個体において、その疾患は、少なくとも一定期間にわたって予防されたことになる。
本明細書で使用するように、用語「CD19」、Bリンパ球抗原CD19、CD19分子（Cluster of Differentiation 19）、Bリンパ球表面抗原B4、T細胞表面抗原Leu-12およびCVID3は、ヒトでは遺伝子CD19によりコードされる膜貫通タンパク質である。ヒトでは、CD19は、形質細胞を除くすべてのB系列細胞、および濾胞樹状細胞に発現している。CD19は、ヒトのB細胞において2つの主要な役割を担っている。細胞質シグナル伝達タンパク質を膜にリクルートするアダプタータンパク質として働き、CD19/CD21複合体内でB細胞受容体シグナル伝達経路の閾値を低下させる。すべてのB細胞に存在することから、Bリンパ球の発達、リンパ腫診断のバイオマーカーであり、白血病やリンパ腫の免疫療法の標的として利用することができる。
「添付文書」とは、治療薬または診断薬の市販パッケージ（キット等）に慣用的に含まれる説明書で、そのような治療薬または診断薬の使用に関する適応症、使用方法、用法、用量、投与、併用療法、禁忌や警告に関する情報を含むものを指す。
本明細書で使用される「細胞障害性薬剤」という用語は、細胞機能を阻害もしくは阻止し、および／または細胞死もしくは破壊を引き起こす物質を意味する。
「化学療法剤」とは、癌の治療に有用な化学化合物を指す。化学療法剤には、癌の成長を促進し得るホルモンの作用を調節、低減、遮断、または阻害するように作用する「抗ホルモン剤」または「内分泌治療薬」が含まれる。
「腫瘍」という用語は、悪性か良性かにかかわらず、すべての新生物細胞の成長および増殖、ならびにすべての前がんおよびがん性の細胞および組織を指す。用語「癌」、「癌性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」および「腫瘍」は、本明細書で言及される場合、相互に排他的でない。用語「細胞増殖性障害」及び「増殖性障害」は、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を指す。いくつかの実施形態では、細胞増殖性障害は、癌である。いくつかの態様において、腫瘍は固形腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、血液学的悪性腫瘍（血液腫瘍）である。
用語「医薬組成物」は、活性成分の生物学的活性を可能にし、や被験者の治療に有効であるようにそこに含まれる生物学的実体（例、細胞）の生存能力を維持または改善するような形態であり、医薬組成物に提供される量では対象に受け入れがたいほど有毒な追加の成分を含まない調製物を指す。
用語「薬学的に許容される担体」は、医薬投与に適合する生理食塩水、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水、クレブス緩衝液、チロデ溶液、造影剤、又はオムニパック、又はこれらの混合物である。用語「薬学的に許容される担体」は、滅菌ミトコンドリア緩衝液（300mMスクロース；10mM K+-HEPES（カリウム緩衝（4-（2-ヒドロキシエチル）-l-ピペラジンエタンスルホン酸、pH 7.2）；1mM K+-EGTA、（カリウム緩衝エチレングリコール四酢酸、pH 8.0） ）もまた含む。この用語は、さらに、呼吸緩衝液（250mMスクロース、2mM KH2PO4、10mM MgCh、20mM K-15 HEPES Buffer（pH 7.2）、および0.5mM K-EGTA（pH 8.0）) を含む。この用語はさらに、T細胞培地、例えばRPMI 1640培地GlutaMAXTM Supplement 500ml（サーモフィッシャー、61870010）を含む。
用語「調節する」および「調節」は、言及された変数を減少または抑制すること、あるいは代わりに活性化または増加させることを指す。
「増加」及び「活性化」という用語は、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、87％、90％、95％、98％、99％、100％、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、6. 5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、またはそれ以上のリクツ変量を有するものである。
用語「減少する」および「阻害する」は、引用された変数における10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、またはより多くの減少を意味する。
用語「アゴナイズ」は、受容体の活性化に関連する生物学的応答を誘発するための受容体シグナリングの活性化を指す。「アゴニスト」とは、受容体に結合し、受容体をアゴナイズする物質である。
用語「アンタゴナイズ」とは、受容体の活性化に関連する生物学的反応を抑制するために、受容体のシグナル伝達を阻害することを指す。「アンタゴニスト」は、受容体に結合して拮抗する物質である。
エフェクターT細胞」という用語は、Tヘルパー（すなわち、CD4＋）細胞および細胞傷害性（すなわち、CD8＋）T細胞を含む。CD4+エフェクターT細胞は、通常、プラズマ細胞およびメモリーB細胞へのB細胞の成熟、細胞傷害性T細胞およびマクロファージの活性化を含む、いくつかの免疫学的プロセスの発達に寄与する。CD8+エフェクターT細胞は、通常、ウイルスに感染した細胞や腫瘍細胞を破壊する。エフェクターT細胞に関する追加情報については、参照によりその全体が組み込まれるSeder and Ahmed, 2003を参照する。
「制御性T細胞」または「Treg」という用語は、例えば、エフェクターT細胞を抑制することによって免疫寛容を制御する細胞を含む。いくつかの態様において、制御性T細胞は、CD4＋CD25＋Foxp3＋表現型を有する。いくつかの態様において、制御性T細胞は、CD8＋CD25＋表現型を有する。Nocentini et al., Brを参照する。J. Pharmacol., 2012, 165：2089-2099、制御性T細胞に関する追加情報については、その全体が参照により組み込まれている。
「樹状細胞」とは、ナイーブT細胞を活性化し、B細胞の成長及び分化を刺激することができる専門的な抗原提示細胞を指す。
用語 「[対象]の発現に関連する疾患」 は、［対象］の発現に関連する疾患、または［対象］を発現する細胞に関連する状態を含み、例えば、癌または悪性腫瘍または前癌状態などの増殖性疾患を含むが、これらに限定されるものではない。ある局面では、癌は中皮腫である。ある局面では、癌は膵臓癌である。ある局面では、癌は卵巣癌である。ある局面では、癌は胃癌である。ある局面では、癌は肺癌である。ある局面では、癌は子宮内膜癌である。[対象]の発現に関連する非癌関連の適応症としては、例えば、自己免疫疾患、（例えば、ループス、関節リウマチ、大腸炎）、炎症性疾患（アレルギー及び喘息）、及び移植が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体または抗体フラグメントの結合特性に有意に影響しない、または変化させないアミノ酸修飾を指す。このような保存的な改変には、アミノ酸の置換、付加および欠失が含まれる。改変は、部位特異的変異誘発やPCR媒介変異誘発など、当技術分野で知られる標準的な技術によって、本発明の抗体または抗体断片に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば, アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）である。したがって、本発明のCAR内の1つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置換することができ、変更されたCARは、本明細書に記載される機能アッセイを使用して試験することができる。
「刺激」という用語は、インビトロのときに刺激ドメイン又は刺激分子（例えば、CAR又はTCR／CD3複合体）とその同族リガンド又は抗原非依存性CD3／CD28ビーズとの結合により誘導される一次応答を指し、それにより、TCR／CD3複合体を介したシグナル伝達などのシグナル伝達イベントを仲介するが、これらに限定されるものではない。刺激は、特定の分子の発現の変化、および／または細胞骨格構造の再編成などを媒介することができる。
「刺激分子」又は「刺激ドメイン」という用語は、T細胞又は操作された免疫細胞（例、CARを発現するように操作された免疫細胞）によって発現される分子またはその一部であって、T細胞シグナル伝達経路などのシグナル伝達経路の少なくともいくつかの側面について刺激的な方法でTCR／CAR複合体の一次活性化を制御する一次細胞質シグナル伝達配列（複数可）を提供するものをいう。ある局面では、一次シグナルは、例えば、TCR/CD3複合体とペプチドを担持したMHC分子との結合によって開始され、増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されないT細胞応答の媒介につながるものである。ある局面では、一次シグナルは、例えば、CAR（例、抗体フラグメントまたはキメラTCR）がその同族抗原またはエピトープに結合することによって開始される。
「抗原提示細胞」または「APC」という用語は、主要組織適合性複合体（MHC）と複合化した外来抗原を表面に表示する付属細胞（例えば、B細胞、樹状細胞など）のような免疫系細胞を意味する。T細胞は、T細胞受容体（TCR）を用いて、これらの複合体を認識することができる。APCは通常、抗原を処理してT細胞に提示するが、前処理された抗原ペプチドを「搭載」している場合もある。
本明細書で使用する「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、TCRまたはCARを発現するT細胞のエフェクター機能などの免疫エフェクター機能を促進するシグナルの生成に関与する分子の細胞内部分を指す。免疫エフェクター機能の例として、例えば、CAR発現T細胞では、細胞溶解活性及びサイトカインの分泌を含むTヘルパー細胞活性が含まれる。実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞質シグナル伝達配列からなり得る。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインには、一次刺激、又は抗原依存性シミュレーションを担う分子に由来するものが含まれる。実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、コスティミュレイトリー細胞内ドメインを構成することができる。例示的なコスティミュレイトリー細胞内シグナル伝達ドメインには、コスティミュレイトリーシグナル、又は抗原非依存性刺激に責任を負う分子から誘導されるものを含む。
「コスティミュレーション分子」という用語は、コスティミュレーションリガンドと特異的に結合し、それによってT細胞によるコスティミュレーション応答（例えば、増殖など）を媒介するT細胞上の同族結合パートナーを指す（ただし、これらに限定されるものではない）。コスティミュレイトリー分子とは、抗原受容体やそのリガンド以外の細胞表面分子で、効率的な免疫反応に必要とされる可能性のある分子である。コスティミュレイトリー分子には、MHCクラスI分子、BTLA、Tollリガンド受容体、ならびにDAP10、DAP12、CD30、LIGHT、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1（CD11a/CD18）および4-1BB（CD137）などがあるが、それらに限定されるわけではない。コスティミュレーション細胞内シグナル伝達ドメインは、コスティミュレーション分子の細胞内部分とすることができる。コスティミュレイトリー分子は、以下のようなタンパク質ファミリーで表現することができる：TNF受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（SLAMタンパク質）、および活性化NK細胞受容体。このような分子の例としては、CD27、CD28、4-1BB（CD137）、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3およびCD83と特異的に結合するリガンド等を挙げることができる。細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体、すなわちネイティブな細胞内シグナル伝達ドメイン全体、またはその機能的断片から構成され得る。用語「4-1BB」は、GenBank Acc.として提供されるアミノ酸配列を有するTNFRスーパーファミリーのメンバーを意味する。番号。AAA62478.2、または非ヒト種、例えばマウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基で、「4-1BBコスティミュレーションドメイン」は、GenBank Acc.のアミノ酸残基214-255として定義される。番号。AAA62478.2のアミノ酸残基、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの同等の残基である。
用語「コード化」は、遺伝子、cDNA、またはmRNAなどのポリヌクレオチドにおける特定のヌクレオチドの配列が、定義されたヌクレオチド配列（例えば、rRNA、tRNAおよびmRNA）または定義されたアミノ酸配列のいずれかを有する生物学的プロセスにおける他の高分子および高分子の合成のテンプレートとして機能する固有の性質、およびその結果として生じる生物学的性質を意味する。したがって、遺伝子、cDNA、またはRNAは、その遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳が細胞または他の生物系においてタンパク質を産生する場合、タンパク質をコードすることになる。mRNAの塩基配列と同一であり、通常、配列表に記載されているコード鎖と遺伝子またはcDNAの転写の鋳型として使用される非コード鎖の両方を、その遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の生成物をコードすると呼ぶことができる。
特に指定のない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いに縮退しており、かつ同一のアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質またはRNAをコードするフレーズヌクレオチド配列は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がいくつかのバージョンで1つまたは複数のイントロンを含むことができる程度にイントロンを含むこともできる。
「内因性」という用語は、生物、細胞、組織またはシステムからの、またはその内部で産生される任意の材料を指す。
「外来性」という用語は、生物、細胞、組織、またはシステムの外部から導入された、または生成された任意の材料を指す。患者の場合、「外来性」という用語は、患者由来、ドナー由来、細胞培養由来を指すことがある。例えば、患者の筋肉組織から単離され、その後、患者に対して自己由来であってもよいし、自己由来であってもよい免疫細胞の集団に導入されたミトコンドリアは、外因性であるとみなされる。用語「外来性ミトコンドリア」は、自家源、同種源、や異種源から単離された任意のミトコンドリアを指し、その源泉の性質は、組織、血液、または培養細胞のものである可能性がある。
用語「発現」は、プロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を指す。
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、転写可能な遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターを意味する。ある場合には、RNA分子は、次に、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。また、アンチセンス分子やリボザイムを製造する場合などには、これらの配列は翻訳されない。発現ベクターは、発現に十分なシス作用因子からなり、発現のための他の要素は、宿主細胞またはインビトロ発現系で供給することができる。発現ベクターには、コスミド、プラスミド（例えば、裸またはリポソームに含まれる）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含む当技術分野で既知のすべてのものが含まれ、それは組換えポリヌクレオチドを取り込むものである。
本明細書で使用する場合、用語「発現構築物」または「トランスジーン」は、核酸コード配列の一部または全部が転写可能である遺伝子産物をコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝子コンストラクトがベクターに挿入され得るものとして定義される。転写物はタンパク質に翻訳されるが、そうである必要はない。特定の実施形態では、発現は、遺伝子の転写と、mRNAの遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の実施形態では、発現は、関心のある遺伝子をコードする核酸の転写のみを含む。「治療用コンストラクト」という用語は、発現コンストラクト又はトランスジーンを指すために使用されることもある。発現コンストラクトまたはトランスジーンは、例えば、癌などの過増殖性疾患または障害を治療するための療法として使用することができ、したがって、発現コンストラクトまたはトランスジーンは、治療用コンストラクトまたは予防用コンストラクトである。疾患、障害または状態に関して本明細書で使用される場合、用語「治療」、「処置」、「治療する」、または「治療する」は、予防や療法を指す。
用語「レンチウイルス」は、レトロウイルス科の属を意味する。レンチウイルスは、非分裂性の細胞に感染することができるという点で、レトロウイルスの中でもユニークであり、宿主細胞のDNAに大量の遺伝情報を送り込むことができるため、遺伝子導入ベクターの最も効率的な方法の一つである。HIV、SIV、FIVはすべてレンチウイルスの例である。
用語「レンチウイルスベクター」は、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指し、特にMilone et al., Molに提供されているような自己不活性化レンチウイルスベクターを含む。Ther．17（8): 1453-1464 （2009)。臨床で使用され得るレンチウイルスベクターの他の例としては、例えば、Oxford BioMedicaからのLENTIVECTOR（商標）遺伝子送達技術、LentigenからのLENTIMAX（商標）ベクターシステム、などが挙げられるが、これらに限定されない。非臨床型のレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者には既知であろう。
用語「相同」または「同一性」は、2つの高分子分子間、例えば、2つの核酸分子間、例えば、2つのDNA分子または2つのRNA分子間、または2つのポリペプチド分子間のサブユニット配列同一性を意味する。つの分子の両方のサブユニット位置が同じモノマーサブユニットによって占められている場合；例えば、2つのDNA分子のそれぞれの位置がアデニンによって占められている場合、それらはその位置において相同または同一である。2つの配列間の相同性は、マッチングまたは相同な位置の数の直接関数である。例えば、2つの配列中の位置の半分（例えば、長さが10サブユニットのポリマー中の5つの位置）が相同であれば、2つの配列は50％相同である、位置の90％（例えば、10のうちの9）が、一致または相同であれば、2つの配列は90％相同である。
本発明の文脈では、一般的に存在する核酸塩基について以下の略語を使用する。「A」はアデノシンを、「C」はシチジンを、「G」はグアノシンを、「T」はチミジンを、「U」はウリジンを指す。
用語「作動可能に連結された」または「転写制御」は、後者の発現をもたらす調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結を意味する。例えば、第1の核酸配列は、第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的関係に置かれるとき、第2の核酸配列と作動可能に連結される。例えば、プロモーターがコーディング配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターはコーディング配列と作動可能に連結される。作動可能に連結されたDNA配列は、互いに連続していることができ、例えば、2つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合、同じリーディングフレームにある。
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下（s.c.）、静脈内（i.v.）、筋肉内（i.m.）、鼻内または胸骨内注射、腫瘍内、または注入技法が含まれる。
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）およびそのポリマーを指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然由来のヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。特に断らない限り、特定の核酸配列は、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された変異体（例えば、縮退コドン置換）、アレル、オルソログ、SNP、および相補配列も暗黙的に包含している。具体的には、選択された1つ以上の（または全ての）コドンの3位が混合塩基やデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって縮退コドン置換が達成され得る（Batzerら、Nucleic Acid Res. 19：5081 （1991); Ohtsukaら、J.Biol）。Chem. 260：2605-2608 （1985)；およびRossoliniら、Mol.細胞。Probes 8：91-98 （1994))。本明細書で使用されるポリヌクレオチドには、限定されないが、組換え手段、すなわち通常のクローニング技術およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）等を用いた、組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニング、ならびに合成手段によって得られる、当該技術分野で利用可能なあらゆる核酸配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、ポリヌクレオチドには、当該技術分野において周知の方法により、ヌクレオチド、またはヌクレオシドの変異が含まれるが、これらに限定されるものではない。核酸は、1つまたは複数のポリヌクレオチドから構成されてもよい。
用語「プロモーター」は、細胞の転写機械、または導入された合成機械によって認識されるDNA配列を指し、ポリヌクレオチド配列の特定の転写を開始させることができる。
用語「プロモーター／調節配列」は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に使用することができる核酸配列のことを指す。ある実施態様では、この配列はコアプロモーター配列であってよく、他の実施態様では、この配列は、遺伝子産物の発現に必要な、エンハンサー配列及び他の調節要素を含んでいてよい。プロモーター／調節配列は、例えば、遺伝子産物を組織特異的に発現させるものであってもよい。
「構成的プロモーター」とは、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結したとき、その遺伝子産物が細胞のほとんどまたはすべての生理的条件下で遺伝子産物を細胞内で生産されるようにするヌクレオチド配列を意味する。
「誘導性プロモーター」とは、遺伝子産物をコードする、または指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結したとき、そのプロモーターに対応する誘導剤が細胞内に存在する場合にのみ、その遺伝子産物を実質的に細胞内で生産させるヌクレオチド配列のことである。
「組織特異的プロモーター」とは、遺伝子をコードするまたは遺伝子によって指定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結されたとき、細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ、遺伝子産物を細胞内で実質的に生産させるヌクレオチド配列のことを指す。
本明細書で使用する5'-キャップ（RNAキャップ、RNA 7-メチルグアノシンキャップまたはRNA m7Gキャップとも呼ばれる）は、転写開始直後に真核生物メッセンジャーRNAの「前」または5'-エンドに付加された修飾グアニンヌクレオチドである。5'キャップは末端基からなり、最初に転写されるヌクレオチドに結合している。キャップはリボソームが認識し、RNAから保護するために重要である。キャップの付加は転写と連動しており、それぞれが他方に影響を与えるような共転写で行われる。転写開始直後、合成されるmRNAの5'末端は、RNAポリメラーゼに付随するキャップ合成複合体に結合する。この酵素複合体は、mRNAのキャッピングに必要と思われる化学反応を触媒する。合成は多段階の生化学反応として進行する。キャッピング部位は、安定性や翻訳効率など、mRNAの機能性を調節するために調節することができる。
本明細書で使用する「インビボRNA転写物」は、インビボで合成されたRNA、好ましくはmRNAを指す。一般に、試験管内転写RNAは、試験管内転写ベクターから生成される。試験管内転写ベクターは、試験管内転写RNAを生成するために使用される鋳型を含んでいる。
本明細書で使用されるように、「ポリ（A）」は、mRNAにポリアデニル化によって付着した一連のアデノシンである。一過性発現のための構築物の好ましい実施形態では、ポリ（A）は50～5000、好ましくは64より大きく、より好ましくは100より大きく、最も好ましくは300または400より大きい。ポリ（A）配列は、局在化、安定性、または翻訳の効率などのmRNAの機能性を調節するために、化学的または酵素的に修飾することができる。
本明細書で使用する「ポリアデニル化」とは、メッセンジャーRNA分子にポリアデニル部分またはその修飾バリアントを共有結合させることを意味する。真核生物では、ほとんどのメッセンジャーRNA（mRNA）分子が3'末端でポリアデニル化されている。3'ポリ（A）テールとは、酵素であるポリアデニレートポリメラーゼの作用により、プレmRNAに付加されるアデニンヌクレオチドの長い配列（多くの場合数百個）のことである。高等真核生物では、ポリ（A）テールは、特定の配列であるポリアデニレーションシグナルを含む転写産物に付加される。ポリ（A）テールとそれに結合するタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からmRNAを保護するのに役立つ。ポリアデニレーションは、転写の終了、核からのmRNAの排出、翻訳にも重要である。ポリアデニレーションは、DNAがRNAに転写された直後に核で起こりますが、その後、細胞質でも起こる可能性がある。転写が終了すると、RNAポリメラーゼに付随するエンドヌクレアーゼ複合体の働きにより、mRNA鎖が切断される。切断部位は通常、切断部位の近くにAAUAAAという塩基配列が存在することで特徴づけられる。mRNAが切断された後、アデノシン残基が切断部位の遊離3'末端に付加される。
本明細書において、「一過性」とは、数時間、数日または数週間の期間、統合されていないトランスジーンが発現することをいい、発現の期間は、宿主細胞においてゲノムに統合されているかまたは安定なプラスミドレプリコン内に含まれている場合の遺伝子の発現の期間より短い。
「シグナル伝達経路」とは、細胞のある部分から別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす様々なシグナル伝達分子間の生化学的な関係を指す言葉である。「細胞表面受容体」という語は、信号を受信し、細胞の膜を越えて信号を伝達することができる分子および分子の複合体を含む。
用語「対象」は、免疫応答が惹起され得る生体（例えば、哺乳類、ヒト）を含むことを意図している。
「実質的に精製された」細胞という用語は、他の細胞種を本質的に含まない細胞を意味する。また、実質的に精製された細胞とは、天然に存在する状態で通常関連している他の細胞種から分離された細胞を指す。ある実施態様では、実質的に精製された細胞の集団は、細胞の均質な集団を意味する。他の実施態様では、この用語は、単に、それらが自然な状態で関連付けられている細胞から分離された細胞を指す。いくつかの局面では、細胞はインビボで培養される。他の局面では、細胞はインビボで培養されない。
本明細書で使用される「治療的」という用語は、治療を意味する。治療効果は、疾患状態の軽減、抑制、寛解、または根絶によって得られる。
本明細書で使用される「予防」という用語は、疾患又は疾患状態の予防又は保護処置を意味する。
本発明の文脈では、「腫瘍抗原」は、特定の過増殖性障害に共通する抗原を意味する。特定の局面では、本発明の過増殖性障害抗原は、原発性または転移性のメラノーマ、中皮腫、腎細胞癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓、子宮内膜、および胃癌を含むがこれらに限らない癌から得られるものである。
いくつかの実施態様において、疾患は、標的化およびテーラーメイドの特定癌リストからなる群から選択される癌であり、以下を含むことができる：中皮腫、乳頭状漿液性卵巣腺癌、明細胞卵巣癌、混合ミュラー卵巣癌、子宮内膜粘液性卵巣癌、悪性胸膜疾患、膵臓腺癌、管状膵臓腺癌。子宮漿液性癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食道腺癌、大腸腺癌、乳腺癌、標的発現に関連する疾患、及びこれらの任意の組み合わせ。
用語「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質転換された」は、外来性の核酸が宿主細胞内に転送または導入されるプロセスを指す。トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質転換された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換または形質転換された細胞である。細胞には、一次対象細胞及びその子孫が含まれる。
「T細胞疲弊」及び「疲弊したT細胞」という用語は、低応答性T細胞又は「機能不全」T細胞のいずれかを指す。
用語「細胞の生存、活性、又はそれらの組み合わせを強化する」、又は「細胞の生存又は活性、又はそれらの組み合わせを強化する」は、2つの細胞の特徴のうちの1つ又は両方の細胞の特徴を強化することを意味する。「活性」という用語は、ある抗原を発現している標的細胞に対する細胞傷害活性などの細胞エフェクター機能であって、その抗原に特異的なTCRによって検出されるもの、あるいはサイトカイン産生を意味する。さらに、代謝活性、増殖能力および拡大・分裂能力、消耗に抵抗する能力、および抑制活性を指す。
範囲：本開示全体を通じて、本開示の様々な態様は、範囲形式で提示することができる。範囲形式での説明は、単に便宜上及び簡潔さのためであり、本開示の範囲に対する柔軟性のない限定と解釈されるべきではないことを理解すべきである。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値と同様に、すべての可能なサブ範囲を具体的に開示したものと見なされるべきである。例えば、1から6までのような範囲の記述は、1から3まで、1から4まで、1から5まで、2から4まで、2から6まで、3から6までのような下位範囲、および、例えば、1、2、2・7、3、4、5、5・3、6などのその範囲内の個々の数値を具体的に開示したとみなされるべきものである。別の例として、95～99％の同一性のような範囲は、95％、96％、97％、98％または99％の同一性を持つものを含み、96～99％、96～98％、96～97％、97～99％、98～99％の同一性などの小範囲を含みる。このことは、範囲の広さに関係なく適用される。
増強された免疫細胞及びそれに関連する組成物
本開示は、細胞（例、幹細胞や免疫細胞、例えば、αβT細胞、γδT細胞、Treg細胞、CAR-T細胞、例えばCD4 CAR-T細胞またはCD8 CAR-T細胞、NK細胞、CAR-NK細胞、NK T細胞、マクロファージ、CAR-マクロファージ、好中球、CAR-好中球等）を含み、細胞が外因性ミトコンドリアを構成要素としている組成物が企図される。外来性ミトコンドリアは、自家ミトコンドリア、同種ミトコンドリア、異種ミトコンドリア、カプセル化ミトコンドリア、または遺伝子改変された自家もしくは同種ミトコンドリアであってよい。
したがって、本明細書で提供されるのは、ヒト免疫細胞の生存、活性、またはそれらの組み合わせを増強するために、有効な量で薬学的に許容される担体中に配合された単離生存ミトコンドリアを含む薬学的組成物である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞に対してヒト免疫細胞の基底OCRまたは最大OCRを増強するのに有効な量で薬学的に許容される担体中に処方された単離生存性ミトコンドリアを含んでなる。いくつかの実施形態では、ヒト免疫細胞の基底OCR又は最大OCRの増強は、1.1倍～100倍の間、例えば1.1～99、1.1～90、1.1～80、1.1～70、1.1～60、1.1～50、1.1～40、1.1～30、1.1～20、1.1～10、1.1～5、1.1～2、1.1～1.8、1.1～1.5、1.2～99、1.2～90、1.2～80、1.2～70、1. 2～60、1.2～50、1.2～20、1.2～10、1.2～5、1.2～2.5、1.3～90、1.3～80、1.3～70、1.3～50、1.3～40、1.3～30、1.3～20、1.3～10、1.3～5、1.3～1.5、1.4～100、1.4～95、1.4～90、1.4～80、1.4～70、1.4～60、1.4～50、 1.4～30、1.4～25、1.4～20、1.4～10、 1.4 ～ 5、 1.4 ～ 3、 1.4 ～ 2.5, 1.5～99、1.5～95、1.5～90、1.5～80、1.5～70、1.5～60、1.5～50、1.5～40、1.5～30、1.5～20、1.5～10、1.5～5、1.5～2.5、2～99、2～90、2～80、2～70、2～60、2～50、2～40、2～35、2～30、2～20、2～10、2～5、2～4、2～2.5、3～99、3～90、3～80、3～70、3～60、3～50、3～40、3～30、3～25、3～20、3～10、4～99、4～80、4～70、4～60、4～50、4～55、4～25、4～20、4～15、4～10、5～100、5～80、5～50、5～30、5～20、5～10、5.5～9、5.5～7、10～90、10～50、10～20、20～100、20～50、25～40、20～35、30～100、30～50、40～100、40～70、40～60、40～50、50～100、50～90、50～80、50～70、55～65、60～80、75～90、75～100、80～90、80～85、85～100の間の範囲（倍数で表される）である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単離生菌ミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞に対してヒト免疫細胞の膨張を増強するのに有効な量で薬学的に許容される担体中に配合された単離生菌ミトコンドリアを含んでいる。いくつかの実施形態では、ヒト免疫細胞拡大の増強は、1.1～20倍、例えば1.1～1.5、1.1～2.0、1.1～3.0、1.1～5.0、1.1～10、1.1～15、1.1～20、1.3～1.5、1.3～2.0、1.3～3.0、1.3～5.0、1.3～10、1.3～15、1.3～20、1.5～2.5。 0、1.5～3.0、1.5～5.0、1.5～10、1.5～15、1.5～20、2.0～3.0、2.0～5.0、2.0～10、 2.0 ～15、 2.0 ～20、 3.0 ～5.0, 3.0～10, 3.0 ～15、 3.0 ～20, 4.0 ～5.0, 4.0. 0～10, 4.0～15, 4.0～20, 5.0～10, 5.0～15, 5.0～20, 6.0～10, 6.0～15, 6.0～20, 7.0～10, 7.0～15, 7.0～20, 8.0～10, 8.0～15, 8.0～20, 9.0～10, 9.0～10. 0 15、9.0～20、10～15、10～20、11～15、11～20、12～15、12～20、13～15、13～20、14～15、14～20、15～20、16～20、17～20、18～20、19～20倍の範囲（倍数で表される）にある。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単離ミトコンドリアを含まないヒト細胞に対してヒト免疫細胞の代謝活性を増強するのに有効な量の薬学的に許容される担体中に配合された単離生存ミトコンドリアを含んでいる。いくつかの実施形態では、代謝活性の増強は、1.1倍～100倍、例えば1.1～99、1.1～90、1.1～80、1.1～70、1.1～60、1.1～50、1.1～40、1.1～30、1.1～20、1.1～10、1.1～5、1.1～2、1.1～1.8、1.1～1.5、1.2～99、1.2～90、1.2～80、1.2～70、1. 2～60、1.2～50、1.2～20、1.2～10、1.2～5、1.2～2.5、1.3～90、1.3～80、1.3～70、1.3～50、1.3～40、1.3～30、1.3～20、1.3～10、1.3～5、1.3～1.5、1.4～100、1.4～95、1.4～90、1.4～80、1.4～70、1.4～60、1.4～50、 1.4～30、1.4～25、1.4～20、1.4～10、 1.4 ～ 5、 1.4 ～ 3、 1.4 ～ 2.5, 1.5～99、1.5～95、1.5～90、1.5～80、1.5～70、1.5～60、1.5～50、1.5～40、1.5～30、1.5～20、1.5～10、1.5～5、1.5～2.5、2～99、2～90、2～80、2～70、2～60、2～50、2～40、2～35、2～30、2～20、2～10、2～5、2～4、2～2.5、3～99、3～90、3～80、3～70、3～60、3～50、3～40、3～30、3～25、3～20、3～10、4～99、4～80、4～70、4～60、4～50、4～55、4～25、4～20、4～15、4～10、5～100、5～80、5～50、5～30、5～20、5～10、5.5～9、5.5～7、10～90、10～50、10～20、20～100、20～50、25～40、20～35、30～100、30～50、40～100、40～70、40～60、40～50、50～100、50～90、50～80、50～70、55～65、60～80、75～90、75～100、80～90、80～85、85～100の間の範囲（倍数で表される）である。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、単離ミトコンドリアを含まないヒト細胞に対して細胞の消耗を低減することによってヒト免疫生存率を高めるのに有効な量の薬学的に許容される担体中に配合された単離生存ミトコンドリアを含んでいる。いくつかの実施形態では、細胞疲弊の低減は、0.5％～100％の範囲、例えば 0.5％～1.5％、0.5％～2.0％、0.5％～3.0％、0.5％～5.0％、0.5～10％、0.5～15％、0.5～20％、0.5～30％、0.5～40％、0.5～50％、0.5～60％、0.5～70％、0. 5%～70%、0.5%～80%、0.5%～90%、0.5%～100%、1.5% ～ 2.0%、1.5% ～ 3.0%、1.5% ～ 5.0%、1.5% ～ 10%、1.5% ～ 15%、1.5% ～ 20%、1.5% ～ 30%、1.5% ～ 40%、1.5% ～50%、1.5%～60%、1.5%～70%、1.5%～80%、1.5%～90%、1.5%～100%、2.0% ～ 3.0%、2.0% ～ 5.0%、2.0% ～ 10%、2.0% ～ 15%、2.0% ～ 20%、2.0% ～ 30%、2.0% ～ 40%、2.0% ～ 50%、2.0% ～60%、2.0%～70%、2.0%～80%、2.0%～90%、2.0%～100%、5.0% ～ 10%、5.0% ～ 15%、5.0% ～ 20%、5.0% ～ 30%、5.0% ～ 40%、5.0% ～ 50%、5.0% ～ 60%、5.0% ～ 70%、5.0% ～80%、5.0%～90%、5.0%～100%、10%～15%、10%～20%、10%～30%、10%～40%、10%～50%、10%～60%、10%～70%、10%～80%、10%～90%、10%～100%、20%～30%、20%～40%、20%～50%、20%～60%、20%～70%、20%～80%、20% ～ 90%、20% ～ 100%、30% ～ 40%、30% ～ 50%、30% ～ 60%、30% ～ 70%、30% ～ 80%、30% ～ 90%、30% 100%、40%～50%、40%～60%、40%～70%、40%～80%、40%～90%、40%～100%、50%～60%、50%～70%、50%～80%、50%～90%、60%～70%、60%～80%、60%～90%、70%～100%、80%～90%、80%～90%、80%～100である。
したがって、本明細書では、自家ミトコンドリア、同種ミトコンドリア、遺伝子操作ミトコンドリア、およびリポソームによってカプセル化されたミトコンドリアまたは特定の薬剤に結合したミトコンドリアなど（これらに限らない）の外来ミトコンドリアを含むヒト免疫細胞の集団も提供される。これらの細胞は、抗腫瘍活性を有する当該技術分野で既知の任意のエフェクター細胞、または自己免疫を防止することができる免疫抑制免疫細胞のいずれかであることができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、αβT細胞、γδT細胞、Treg細胞、NK細胞、NK T細胞、マクロファージ、又は好中球を含むことができるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、細胞は、多能性幹細胞（胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞）及び多能性幹細胞由来の免疫細胞、例えばナチュラルキラー細胞、マクロファージ及びリンパ系細胞、特にT細胞が挙げられるが、これらに限定されない。多能性幹細胞から免疫細胞（T細胞、NK細胞、及びマクロファージ等）を生成するための好適なプロセスの例は、に記載されている。
いくつかの実施形態では、外来性ミトコンドリアを含む幹細胞又は免疫細胞は、本明細書に記載のCAR形式のいずれかなどのキメラ抗原受容体（CAR）を発現するように操作された、例のような、操作された細胞である。CARは、典型的には、抗原結合部位（例えば、抗原結合ドメイン又はその抗原結合断片）、膜貫通成分、及び抗原結合部位がその同族リガンドを結合することに応答して免疫細胞を活性化するように選択された一次細胞質シグナル伝達配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体（CAR）の基本的な構成要素は、以下のものを含む：(1） 腫瘍特異的モノクローナル抗体の可変重鎖（(VH）及び軽鎖（VL）は、T細胞受容体複合体からのCD3ζ鎖とインフレームで融合される。(2） VH及びVLは、一般に、柔軟なグリシン-セリンリンカーを用いて結合し、スペーサー（例えば、CD8a stalk又は CH2-CH3 一定ドメイン）により膜貫通ドメインに結合して、scFvが腫瘍抗原と容易に相互作用できるように細胞表面から離れるように伸展させる。いくつかの実施形態では、外来性ミトコンドリアを含む人工免疫細胞は、CAR-幹細胞、CAR-T細胞、CAR-NK細胞、CAR-NK T細胞、CAR-マクロファージ、又はCAR-好中球である。いくつかの実施形態では、ヒト幹細胞又は免疫細胞は、外来性ミトコンドリアを含み、外来性ミトコンドリアは、免疫細胞の生存、免疫細胞の基礎OCR、免疫細胞の代謝活性、免疫細胞の拡張又はそれらの組み合わせを増強するのに有効な量で、ヒト幹細胞中又はヒト免疫細胞中に存在する。
いくつかの実施形態では、外来性ミトコンドリアを含む免疫細胞の細胞基底または最大OCRの増強は、1.1倍～100倍、例えば1.1～100、1.1～99、1.1～90、1.1～80、1.1～70、1.1～60、1.1～50、1.1～40、1.1～30、1.1～20、1.1～10、1.1～5、1.1～2、1.1～1.8、1.1～1.5、1.2～99、1.2～90、1.2～80、1.2～70、1. 2～60、1.2～50、1.2～20、1.2～10、1.2～5、1.2～2.5、1.3～90、1.3～80、1.3～70、1.3～50、1.3～40、1.3～30、1.3～20、1.3～10、1.3～5、1.3～1.5、1.4～100、1.4～95、1.4～90、1.4～80、1.4～70、1.4～60、1.4～50、 1.4～30、1.4～25、1.4～20、1.4～10、 1.4 ～ 5、 1.4 ～ 3、 1.4 ～ 2.5, 1.5～99、1.5～95、1.5～90、1.5～80、1.5～70、1.5～60、1.5～50、1.5～40、1.5～30、1.5～20、1.5～10、1.5～5、1.5～2.5、2～99、2～90、2～80、2～70、2～60、2～50、2～40、2～35、2～30、2～20、2～10、2～5、2～4、2～2.5、3～99、3～90、3～80、3～70、3～60、3～50、3～40、3～30、3～25、3～20、3～10、4～99、4～80、4～70、4～60、4～50、4～55、4～25、4～20、4～15、4～10、5～100、5～80、5～50、5～30、5～20、5～10、5.5～9、5.5～7、10～90、10～50、10～20、20～100、20～50、25～40、20～35、30～100、30～50、40～100、40～70、40～60、40～50、50～100、50～90、50～80、50～70、55～65、60～80、75～90、75～100、80～90、80～85、85～100の間の範囲（倍数で表される）である。
いくつかの実施形態では、外来性ミトコンドリアを含む免疫細胞の細胞拡大の増強は、1.1～20倍、例えば1.1～1.5、1.1～2.0、1.1～3.0、1.1～5.0、1.1～10、1.1～15、1.1～20、1.3～1.5、1.3～2.0、1.3～3.0、1.3～5.0、1.3～10、1.3～15、1.3～20、1.5～2.5。 0、1.5～3.0、1.5～5.0、1.5～10、1.5～15、1.5～20、2.0～3.0、2.0～5.0、2.0～10、 2.0 ～15、 2.0 ～20、 3.0 ～5.0, 3.0～10, 3.0 ～15、 3.0 ～20, 4.0 ～5.0, 4.0. 0～10, 4.0～15, 4.0～20, 5.0～10, 5.0～15, 5.0～20, 6.0～10, 6.0～15, 6.0～20, 7.0～10, 7.0～15, 7.0～20, 8.0～10, 8.0～15, 8.0～20, 9.0～10, 9.0～10. 0 15、9.0～20、10～15、10～20、11～15、11～20、12～15、12～20、13～15、13～20、14～15、14～20、15～20、16～20、17～20、18～20、19～20の間の範囲（倍数で表される）である。
いくつかの実施形態では、外来性ミトコンドリアを含む免疫細胞の細胞代謝活性の増強は、1.1倍から100倍の間の範囲（倍数で表される）、例えば1.1～99、1.1～90、1.1～80、1.1～70、1.1～60、1.1～50、1.1～40、1.1～30、1.1～20、1.1～10、1.1～5、1.1～2、1.1～1.8、1.1～1.5、1.2～99、1.2～90、1.2～80、1.2～70、1. 2～60、1.2～50、1.2～20、1.2～10、1.2～5、1.2～2.5、1.3～90、1.3～80、1.3～70、1.3～50、1.3～40、1.3～30、1.3～20、1.3～10、1.3～5、1.3～1.5、1.4～100、1.4～95、1.4～90、1.4～80、1.4～70、1.4～60、1.4～50、 1.4～30、1.4～25、1.4～20、1.4～10、 1.4 ～ 5、 1.4 ～ 3、 1.4 ～ 2.5, 1.5～99、1.5～95、1.5～90、1.5～80、1.5～70、1.5～60、1.5～50、1.5～40、1.5～30、1.5～20、1.5～10、1.5～5、1.5～2.5、2～99、2～90、2～80、2～70、2～60、2～50、2～40、2～35、2～30、2～20、2～10、2～5、2～4、2～2.5、3～99、3～90、3～80、3～70、3～60、3～50、3～40、3～30、3～25、3～20、3～10、4～99、4～80、4～70、4～60、4～50、4～55、4～25、4～20、4～15、4～10、5～100、5～80、5～50、5～30、5～20、5～10、5.5～9、5.5～7、10～90、10～50、10～20、20～100、20～50、25～40、20～35、30～100、30～50、40～100、40～70、40～60、40～50、50～100、50～90、50～80、50～70、55～65、60～80、75～90、75～100、80～90、80～85、85～100の範囲である。
いくつかの実施形態では、外来性ミトコンドリアを含む免疫細胞の消耗を低減することによる細胞生存率の向上は、細胞消耗の低減が0.5％～100％の範囲、例えば0.5％～1.5％、0.5％～2.0％、0.5％～3.0％、0.5％～5.0％、0.5～10％、0.5～15％、0.5～20％、0.5～30％、0.5～40％、0.5～50％、0.5～60％、0.5～70％、0. 5%～70%、0.5%～80%、0.5%～90%、0.5%～100%、1.5% ～ 2.0%、1.5% ～ 3.0%、1.5% ～ 5.0%、1.5% ～ 10%、1.5% ～ 15%、1.5% ～ 20%、1.5% ～ 30%、1.5% ～ 40%、1.5% ～50%、1.5%～60%、1.5%～70%、1.5%～80%、1.5%～90%、1.5%～100%、2.0% ～ 3.0%、2.0% ～ 5.0%、2.0% ～ 10%、2.0% ～ 15%、2.0% ～ 20%、2.0% ～ 30%、2.0% ～ 40%、2.0% ～ 50%、2.0% ～60%、2.0%～70%、2.0%～80%、2.0%～90%、2.0%～100%、5.0% ～ 10%、5.0% ～ 15%、5.0% ～ 20%、5.0% ～ 30%、5.0% ～ 40%、5.0% ～ 50%、5.0% ～ 60%、5.0% ～ 70%、5.0% ～80%、5.0%～90%、5.0%～100%、10%～15%、10%～20%、10%～30%、10%～40%、10%～50%、10%～60%、10%～70%、10%～80%、10%～90%、10%～100%、20%～30%、20%～40%、20%～50%、20%～60%、20%～70%、20%～80%、20% ～ 90%、20% ～ 100%、30% ～ 40%、30% ～ 50%、30% ～ 60%、30% ～ 70%、30% ～ 80%、30% ～ 90%、30% 100%、40%～50%、40%～60%、40%～70%、40%～80%、40%～90%、40%～100%、50%～60%、50%～70%、50%～80%、50%～90%、60%～70%、60%～80%、60%～90%、70%～100%、80%～90%、80%～90%、80%～100%の範囲にあるようなものである。
T細胞
一実施形態において、外来性ミトコンドリアを含む、またはそれによって増強された免疫細胞は、リンパ球と呼ばれる白血球群に属するT細胞（Tリンパ球とも呼ばれる）である。リンパ球は一般に、細胞媒介性免疫に関与している。「T細胞」の「T」は、胸腺に由来する、あるいは胸腺の影響を受けて成熟した細胞を指す。T細胞は、B細胞やナチュラルキラー（NK）細胞などの他のリンパ球と、細胞表面に提示された抗原を認識するT細胞受容体（TCR）と呼ばれる細胞表面タンパク質の存在によって区別される。典型的な免疫反応では、MHC抗原提示のもとで、これらの抗原がT細胞受容体に結合すると、T細胞の活性化につながる細胞内変化が開始される。
T細胞はT細胞受容体（TCR）により、αβT細胞とγδT細胞に分けられる。TCR2を持つαβT細胞は、主に細胞免疫と免疫制御を司り、TCR1を持つγδT細胞は、局所微小環境における免疫恒常性の維持に加えて、創傷治癒、障害または変質した上皮細胞の除去、過剰な炎症の抑制に重要な機能を果たしている。αβT細胞とγδT細胞は、自己免疫疾患、腫瘍、血管疾患において異なる役割を担っている。αβT細胞は末梢血単核細胞（PBMC）の65-75％を占め、γδT細胞は10％未満である。これらはCD4とCD8の異なる表面マーカーを発現しており、例えばαβT細胞では60%がCD4陽性、30%がCD8陽性、両者の陽性率は1%未満である。
本明細書で使用する「活性化T細胞」という用語は、例えばクラスIまたはクラスII主要組織適合性（MHC）マーカーの文脈で提示されるような抗原決定基の認識によって免疫応答（例えば、活性化T細胞のクローン拡大）を生じるように刺激されたT細胞のことを指す。T細胞は、抗原決定基、サイトカインやリンパカイン、ならびに分化クラスタ細胞表面タンパク質（例えば、CD3、CD4、CD8、およびそれらの組み合わせ）の存在により活性化される。差動タンパク質のクラスターを発現する細胞は、しばしば、T細胞の表面におけるそのタンパク質の発現が「陽性」であると言われる（例えば、CD3、CD4、またはCD8の発現に対して陽性の細胞は、CD3+, CD4+またはCD8+として言及される）。CD3及びCD4タンパク質は、T細胞におけるシグナル伝達において直接的及び／又は間接的に関与し得る細胞表面受容体又は共受容体である。
いくつかの実施形態では、外来性ミトコンドリアを含み、及び／又はそれによって増強される免疫細胞は、CAR-T細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、CAR-T細胞集団は、例えば、CD8、CD4、CD3、CD34などの特定のマーカー、受容体、または細胞表面糖タンパク質を発現する細胞型の少なくとも20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％、から成るように選択、または濃縮、もしくは精製されている。
いくつかの実施形態では、CAR-T細胞集団は、CD4+及びCD8+T細胞を含む。いくつかの実施形態では、CAR-T細胞集団は、少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％又は99％のCD8+ T細胞から成るように濃縮されている。いくつかの実施形態では、CAR-T細胞集団は、少なくとも80％のCD8+ T細胞からなるように濃縮されている。いくつかの実施形態では、CAR-T細胞集団は、少なくとも90％のCD8+ T細胞からなるように濃縮されている。したがって、いくつかの実施形態では、組成物中に、遺伝的に修飾されたCD8+T細胞よりも遺伝的に修飾されたCD4+ T T細胞が多いすなわちCD4+［2］細胞のCD8+細胞に対する比が1未満、例えば、0.9未満、0.8未満、0.7未満、0.6未満、又は0.5未満である。
濃縮された免疫細胞集団
いくつかの実施形態では、外因性ミトコンドリアを含む、またはそれによって増強された濃縮細胞集団が提供され、濃縮細胞集団は、1つまたは複数の細胞型の指定比率またはパーセントを含むように選択されたものである。「細胞集団」または「修飾細胞集団」によって、2つ以上の細胞などの細胞の集団が意味される。細胞集団は、同じ種類の細胞からなる均質なものであってもよいし、それぞれが同じマーカーを含んでいてもよいし、不均質なものであってもよい。いくつかの例では、細胞集団は、対象から得られた試料に由来し、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、又は任意の組織から調製された細胞からなる。いくつかの例では、細胞集団は核酸と接触しており、核酸は、例えば、キメラ抗原受容体、誘導性キメラプロアポトーシスポリペプチド、または例えば、キメラ骨髄分化一次応答88（MyD88）または切断型MyD88およびCD40ポリペプチドなどのコスティミュレイションポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどの異種ポリヌクレオチドから構成されている。いくつかの例では、細胞集団及び改変細胞集団は、異種ポリヌクレオチドを構成する核酸と接触させた元の細胞の子孫である。細胞集団は、例えば、CD8、CD4、CD3、CD34などの特定のマーカー、受容体、または細胞表面糖タンパク質を発現する細胞タイプの少なくとも20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％、から成るように選択、または濃縮、または精製されうる。いかなる理論にも限定されることを意図することなく、いくつかの実施形態では、CD4+T細胞に対するCD8+の増加した比率を得るためにT細胞集団を濃縮することは、CAR-T細胞関連サイトカイン放出症候群及び神経毒性のレベルを低下させる可能性がある。
キメラ抗原受容体修飾免疫細胞（例えば、CAR T細胞）の有効性は、典型的には、養子移入後のインビボでの増殖に依存する。CAR-Tの膨張を改善するための追加の遺伝子増強は、治療効果を改善する可能性があるが、CAR-Tの毒性を増加させる危険性がある。CAR-T細胞、コスティミュレーションポリペプチドを発現するCAR-T細胞、およびMyD88、またはMyD88-CD40キメラ蛋白質を構成的にまたは誘導性多量化領域の制御下で発現するCAR-T細胞は、腫瘍の除去に有効であるが、急性サイトカイン関連毒性を誘発する可能性がある。細胞毒性の可能性は、被験者に投与され得るCAR-T細胞の投与量を減少させる可能性がある。例のセクションは、ミトコンドリア移植が、より良性の安全性プロファイルを有するCAR-T細胞につながる可能性があることを示している。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、外来性ミトコンドリアを含まない免疫細胞よりも免疫療法適用において毒性が低い、CAR T細胞などの外来性ミトコンドリアを含む、またはそれによって増強された免疫細胞である。
患者の血液からTリンパ球を採取し、T細胞を濃縮する
外来性ミトコンドリアにより増強されたT細胞やCARを発現するように操作されたT細胞などのT細胞は、任意の健康なドナーに由来することができる。ドナーは一般に成人（少なくとも18歳）であろうが、子供もT細胞ドナーとして適している。ドナーからT細胞を得るための好適なプロセスの一例は、に記載されている。一般に、T細胞はドナーから得られ、遺伝子組換えと選択を受け、その後レシピエント被験者に投与されることができる。T細胞の有用な供給源は、ドナーの末梢血である。末梢血サンプルは、一般に白血球を濃縮したサンプルを提供するために、白血球洗浄にかけられる。この濃縮試料（「ロイコパック」とも呼ばれる）は、単球、リンパ球、血小板、血漿、赤血球を含む様々な血液細胞で構成されうる。赤血球、血小板、単球、腫瘍細胞などの夾雑物を除去するには、一般に当該技術分野で知られた方法を用いて必要とされる多面的なアプローチが必要である。ロイコパックは、静脈穿刺やバフィーコート製品と比較して、通常、高濃度の細胞を含んでいる。
再発癌の患者はT細胞数が少ない場合があり、そのため十分な自己T細胞の収集が困難である。この問題は、健康なドナーから採取した同種Tリンパ球を用いるなど、当技術分野で既知の方法によって克服することができる。
修飾細胞集団における細胞型の選択、濃縮、又は精製は、任意の適切な方法によって達成され得る。いくつかの実施形態では、CD8+及びCD4+ T細胞の比率は、フローサイトメトリーによって決定されてもよい。いくつかの例では、MACsカラムが使用されてもよい。いくつかの例では、修飾細胞集団は、対象への投与前に凍結及び解凍され、生存細胞は、対象への投与前に特定の細胞型の割合又は比率について試験される。T細胞は、導入又はトランスフェクションに続いて、磁気選択（MACSカラム）により精製CD4+ 及びCD8+ T細胞へと分離される。組成物は、CD4+ および CD8+ T細胞を含んでもよく、理想的には、組成物内の遺伝子改変CCD3+ T細胞の集団は、CD4+細胞およびCD8+ 細胞の双方を含む。ロイコパックにおけるCD4+ 細胞とCD8+細胞の比は典型的には2以上であるが、いくつかの実施形態では、本発明の組成物における遺伝子組換えCD4+ 細胞と遺伝子組換えCD8+細胞の比は2未満、例えば、1.5未満である。いくつかの実施形態では、組成物中に、遺伝的に修飾されたCD4+T細胞よりも多くの遺伝的に修飾されたCD8+T細胞があり、すなわち、 CD4+細胞対CD8+ 細胞の比は1未満例えば0.9未満、0.8未満、0.7未満、0.6未満、又は0.5未満である。したがって、ドナー細胞から開始して遺伝子組換えT細胞を製造する全体的な手順は、CD4+T細胞に対してCD8+細胞T細胞を濃縮するように設計されている。いくつかの実施形態では、遺伝子改変T細胞の60％以上がCD8+T細胞であり、いくつかの実施形態では、遺伝子改変T細胞の65％以上がCD8+T細胞である。遺伝学的に修飾されたCD3+T細胞の集団内で、いくつかの実施形態では、CD8+T細胞のパーセントは、55～75％の間、例えば、55％～65％、55％～70％、56～71％、63～73％、60～70％、59～74％、65～71％、又は65～75％である。一部の実施形態では、例えば、CD4+ T細胞に対するCD8+の比率が、例えば、3：2、7：3、4：1、9：1、19：1、又は39：1以上であるような、ある細胞型と別の細胞の比率を構成するよう選択、又は濃縮、又は精製されている、細胞集団が提供される。いくつかの実施形態では、修飾細胞集団は、少なくとも20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95、96、97、98、または99％のCD8+T細胞を含むように選択、または濃縮、もしくは精製されている。いくつかの実施形態では、CD4+ T細胞に対するCD8+の比率は、4対1、又は9対1以上である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコスティミュレイションポリペプチドを含む遺伝子改変CD3+ T細胞の集団について、CD8+T細胞のパーセントは55～75％、例えば55～65％、55～70％、56～71％、59～74％、63～73％、60～70％、60～75％、65～75％、又は65～71％である。いくつかの実施形態では、CD8+対CD4+T細胞の比率は、3：2、7：3、4：1、9：1、19：1、又は39：1以上である。いくつかの実施形態では、コスティミュレーションポリペプチドを含む改変細胞集団は、少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95、96、97、98、又は99％、CD8+ T細胞からなるよう選択、強化、又は精製されている。いくつかの実施形態では、CD4+ T細胞に対するCD8+の比率は、4対1、又は9対1以上である。コスティミュレーションポリペプチドは、CD27、ICOS、RANK、TRANCE、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、MyD88、又はCD40などの1つ又は複数のコスティミュレーションシグナリング領域を含むことができる。コスティミュレーションポリペプチドは、CD27、ICOS、RANK、TRANCE、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、MyD88、又はCD40によって活性化されるシグナル伝達経路を活性化する1又は複数のコスティミュレーションシグナリング領域からなることが可能である。コスティミュレイトリーポリペプチドは、誘導可能又は構成的に活性化され得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも80％、85％、90％、95、96、97、98、または99％、がCD8+T細胞である誘導性プロアポトーシスポリペプチドを含むCAR-T細胞集団を備える組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、誘導性プロアポトーシスポリペプチドを含む修飾細胞集団は、少なくとも80％のCD8+T細胞である。いくつかの実施形態では、改変された細胞集団は、少なくとも、誘導可能なプロアポトーシスポリペプチド90％CD8+ T細胞からなるものである。
いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも80％、85％、90％、95、96、97、98、又は99％、がCD8+T細胞であるコスティミュレーションポリペプチド及び誘導性プロアポトーシスポリペプチドを含むCAR-T細胞集団を含む、組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、コスティミュレイションポリペプチド及び誘導性プロアポトーシスポリペプチドを含む修飾細胞集団は、少なくとも80％のCD8+T細胞である。いくつかの実施形態では、コスティミュレイションポリペプチド及び誘導性プロアポトーシスポリペプチドを含む修飾細胞集団は、少なくとも90%のCD8+T細胞である。
本開示によれば、例えば、自家ミトコンドリア、同種ミトコンドリア、異種ミトコンドリア、カプセル化ミトコンドリア、または適切な遺伝子改変を有する自家ミトコンドリアを含むミトコンドリア調製物は、遺伝子改変（例、CAR遺伝子の導入）を行う前、それと同時、またはその後に濃縮T細胞に送達されてもよい。
ミトコンドリア
本発明は、少なくとも部分的に、単離されたミトコンドリアを、細胞培養に加えることによって、あるいは患者の組織または組織につながる血管に注入することによって、培養細胞または患者の組織に送達する（移植するともいう）ことができるという発見に基づくものである。
ミトコンドリアは、目的の細胞にエキソビボで送達され得る。関心のある細胞には、本明細書に記載の免疫細胞のいずれか、幹細胞やそれから分化した細胞、培養細胞、以前に操作された免疫細胞（例えば、CAR T細胞)、またはさらに操作される（例えば、CARまたは人工TCRを発現する）細胞や培養（例えば、分化、活性化、処理、または培養）される細胞が含まれるが、それらに限定されるものではない。ミトコンドリアは、Lipofectin（登録商標）などの合成リポソームを使用したリポソーム媒介移入によってエキソビボで送達することができる（Shi et al.,2008）。「線維芽細胞へのミトコンドリア移入：培養細胞への標識ミトコンドリアのリポソーム媒介移入」とEthnは述べている。Dis. 18： S1-43）。ミトコンドリアは、細胞、例えば、本明細書に記載される免疫細胞のいずれかと、ミトコンドリアとの、2～24時間の期間にわたる共インキュベーション（すなわち、共培養）によって、エキソビボで送達することができる。理論に束縛されることをものではないが、移植されたミトコンドリアは、アクチン依存性経路によって内在化される。心筋細胞において以前に示されたようなミトコンドリア内在化は、1時間の共インキュベーション後に起こり得る。
ミトコンドリアはまた、標的領域への直接注射によって、または器官特異的脈管構造もしくは組織特異的脈管構造（例えば、被験体の冠状動脈、被験体の肺動脈、被験体の肝門脈、被験体の大膵動脈、被験体の腎動脈、または被験体の前立腺動脈）を介した送達によって、器官または組織に送達され得る。後者の場合、ミトコンドリアは下流の器官または組織に保持される。`例えば、冠状動脈を通して投与される場合、ミトコンドリアは、ほぼ排他的に心臓に送達されるが（Shinet al.、2019、「ミトコンドリアの冠動脈内投与による心筋保護：虚血心筋における安全性と有効性」、JACC：基礎から応用まで Vol.4、No.8、2019)、ミトコンドリアは、肺動脈を通して肺に送達され得るか、または腎動脈を通した送達によって腎臓に送達され得る。ミトコンドリアの直接注入は、注入されたミトコンドリアの局所集中を可能にする。注射のために使用されるミトコンドリアの数は、標的器官または組織のサイズならびに意図される使用に依存して変化し得る。ミトコンドリアを呼吸緩衝液に懸濁し、例えば28-32ゲージ針を有するツベルクリンシリンジを使用して様々な部位に注射することができる。
インビボでのミトコンドリア移植は、自己または異種ミトコンドリアのいずれかを単回または連続注入を使用して行うことができ、直接的または間接的、急性または慢性の同種反応、同種認識、損傷関連分子パターン分子が存在しない。
理論に束縛されることなく、生存可能で呼吸能力のあるミトコンドリアはエンドサイトーシスによって虚血組織と非虚血組織の両方に取り込まれる。
熟練した開業医は、比較的単純な医療手順を使用して、種々の目的のために患者の組織および/または細胞にミトコンドリアを局所的および/または一般的に分配し得える。ナノ粒子を含むいくつかの従来の治療レジメンと比較して、ミトコンドリアは毒性がなく、いかなる実質的な有害な免疫または自己免疫応答も引き起こさないことがさらに注目される。
いかなる理論にも束縛されることを意図しないが、注入されたミトコンドリアは、最初に内皮に接着することによって、毛細血管壁を通って血管外遊出すると考えられる。それらが動脈に注射または注入された後、ミトコンドリアは、血管の内皮を通過し、エンドソームアクチン依存性内在化プロセスを介して組織細胞によって取り込まれ得る。
生体内のミトコンドリア移植は、本明細書で提供される外因性ミトコンドリアと共に、本明細書に記載される関心のある細胞のいずれかの共投与を含むことができる。いくつかの実施形態では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞は、患者における疾患を処置するために、目的の細胞の所望の治療効果を促進または増強するために同時投与される。関心のある細胞には、本明細書に記載の免疫細胞、幹細胞やそれから分化した細胞、培養細胞、以前に操作された免疫細胞（例えば、CAR T細胞)、またはさらに操作される（例えば、CARもしくは人工TCRを発現するように）細胞のいずれかが含まれるが、これらに限定されるものではない。外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞が異なる薬学的組成物中に含まれる実施形態では、外因性ミトコンドリアの投与は、目的の細胞の投与の前に、それと同時に、および/またはその後に起こり得る。一部の態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに約1カ月以内に行われる。一部の態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに約1週間以内に行われる。いくつかの態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに約5、4、3または2日以内に行われる。一部の態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに約1日以内に行われる。一部の態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに約12時間以内に行われる。一部の態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに約6時間以内に行われる。いくつかの態様において、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに約3時間以内に行われる。一部の態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに約2時間以内に行われる。一部の態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに約1時間以内に行われる。一部の態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに約30分以内に行われる。一部の態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに約15分以内に行われる。一部の態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに数分以内に行われる。いくつかの態様において、外因性ミトコンドリアおよび関心対象の細胞の共投与は、外因性ミトコンドリアや関心対象の細胞の反復投与を含む。
ミトコンドリアの単離
現在記載されている方法で使用するためのミトコンドリアは、任意のソース、例えば、培養細胞または組織から分離されたものから単離または提供され得る。例示的な細胞としては、筋肉組織細胞、心臓線維芽細胞、HeLa細胞、前立腺癌細胞、酵母、とりわけ、それらの任意の混合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。例示的な組織としては、肝臓組織、骨格筋、心臓、脳、および脂肪組織が挙げられるが、これらに限定されない。ミトコンドリアは、自家供給源、同種供給源、および/または異種供給源の細胞または組織（例えば、生検材料）から単離することができる。いくつかの例において、ミトコンドリアは、遺伝子改変を有する細胞（例えば、改変mtDNAまたは改変核DNAを有する細胞）から単離される。
ミトコンドリアは、当業者に公知の任意の手段によって細胞または組織から単離することができる。一例では、組織試料または細胞試料を収集し、次いでホモジナイズする。ホモジナイゼーション後、ミトコンドリアを反復遠心分離によって単離する。あるいは、細胞ホモジネートをナイロンメッシュフィルターを通して濾過することができる。ミトコンドリアを単離する典型的な方法は、例えば、McCully JD、Cowan DB、Pacak CA、Toumpoulis IK、Dayalan H と Levitsky S、「再灌流初期に単離したミトコンドリアを注入することによる心筋保護効果」、Am J Physiol 296,H94-H105に記載されている。PMC2637784（2009）；フレッツァ、C、チポラット、S、＆スコラーノ、L、「オルガネラの分離：マウス肝臓、筋肉および培養フィロブラストからの機能的ミトコンドリア」、ネイチャープロトコル、2（2）、287-295（2007）；および「ミトコンドリアを分離する製品および方法」と題するPCT出願（PCT／US2015／03584；WO 20151920）；これらはそれぞれ参照により取り込まれるものとする。
ミトコンドリア（例えば、治療に使用されるミトコンドリアまたは薬学的組成物に含まれるミトコンドリア）は、自己供給源、同種供給源、または異種供給源の細胞または組織から単離され得る。いくつかの例では、ミトコンドリアは、対象の培養細胞または組織から収集され、これらのミトコンドリアは、同じ対象（自己）に投与して戻される。いくつかの他の場合において、ミトコンドリアは、第2の被験体の培養細胞（例えば、ヒト心臓線維芽細胞）または組織から収集され、これらのミトコンドリアは、第1の被験体（同種異系）に投与される。いくつかの場合において、ミトコンドリアは、異なる種（例えば、マウス、ブタ、および酵母)(異種）由来の培養細胞または組織から収集される。
本明細書に記載される方法のある特定の実施形態では、ミトコンドリアは、異なる供給源を有することができ、例えば、外因性ミトコンドリアは、自己由来、自家由来、同種由来、または異種由来であり得る。ある特定の実施形態では、ミトコンドリアは新たに単離されている（組織生検試料を採取した後120分以内)。いくつかの実施形態では、ミトコンドリアは単離され、その後使用まで保存されている。ある特定の実施形態では、自家ミトコンドリアは、外因性mtDNAを有し得る。いくつかの実施形態において、ミトコンドリアは、対象の第一度近親者由来である。いくつかの実施形態において、ミトコンドリアはカプセル化されている。
いくつかの態様において、記載される方法は、投与前に細胞から単離されたミトコンドリアを収集する工程を含む。単離されたミトコンドリアは、目的の細胞、例えば、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞のいずれかに移植することができ、または関心のある細胞による治療と連動して対象に投与することができる。
本開示では、外因性ミトコンドリアを免疫細胞に移植して、それらの生存、活性またはそれらの組合せを増強し、養子細胞移入（EACT）の結果をもたらす。あるいは、またはさらに、ミトコンドリアは、ACTまたはEACTの送達と組み合わせて患者に導入され、その結果、ACTまたはEACTの有効性または安全性が増加する。
発現構築物の操作
いくつかの態様において、外因性ミトコンドリアを含むかまたはそれによって増強される免疫細胞は、CARを発現するように操作されるなど、操作される。本発明のキメラ抗原受容体、キメラシグナル伝達ポリペプチド、および誘導性安全スイッチを発現する発現構築物が本明細書において提供される。
本明細書中で使用される場合、用語「cDNA」は、鋳型としてメッセンジャーRNA（mRNA）を使用して調製されたDNAをいうことが意図される。ゲノムDNAまたはゲノム、非または部分的に処理されたRNAテンプレートから重合されたDNAとは対照的に、cDNAを使用する利点は、cDNAが主に対応するタンパク質のコード化配列を含むということである。非コード領域が最適な発現のために必要とされる場合、またはイントロンなどの非コード領域がアンチセンス戦略において標的化される場合など、完全なまたは部分的なゲノム配列が使用される場合がある。
ある特定の例では、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドは、第2のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同じベクター、例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターなどに含まれる。この第2のポリペプチドは、例えば、キメラシグナル伝達ポリペプチド、本明細書中で議論されるような誘導性カスパーゼポリペプチド、またはマーカーポリペプチドであり得る。これらの例において、構築物は、2Aポリペプチドによって連結された2つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸に作動可能に連結された1つのプロモーターを用いて設計され得る。この例において、第1および第2のポリペプチドは、翻訳の間に分離され、2つのポリペプチドを生じるか、または漏出性2Aを含む例において、1つまたは2つのポリペプチドのいずれかを生じる。他の例において、2つのポリペプチドは、同じベクターから別々に発現され得、ここで、ポリペプチドのうちの1つをコードするポリヌクレオチドを含む各核酸は、別々のプロモーターに作動可能に連結される。さらに他の例では、1つのプロモーターが2つのポリヌクレオチドに作動可能に連結されて、2つの別個のRNA転写物、したがって2つのポリペプチドの産生を指示してもよい。一例では、プロモーターは双方向性であってもよく、コード領域は反対方向5'-3'であってもいい。したがって、本明細書で考察される発現構築物は、少なくとも1つ、または少なくとも2つのプロモーターを含み得る。
一部の実施形態では、核酸構築物、例えば、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体のいずれかは、ウイルスベクター内に含有される。特定の態様において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。ある特定の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、細胞は、ウイルスベクターを古い生体で接触させ、いくつかの実施形態において、細胞は、ウイルスベクターを生体内で接触させることが理解される。従って、発現構築物は、ベクター（例えば、ウイルスベクターまたはプラスミド）に挿入され得る。提供される方法のステップは、任意の適切な方法を使用して実施されてもよい。これらの方法は、限定されないが、本明細書中に記載される、細胞に核酸を形質導入、形質転換、または他の方法で提供する方法を含む。
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、機能的タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードする単位として定義されるu。理解されるように、この機能的用語は、ゲノム配列、cDNA配列、ならびにタンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質および/または変異体を発現するか、または発現するように適合されたより小さな操作された遺伝子セグメントを含む。
「機能保存的変異体」は、タンパク質または酵素の全体的な立体構造および機能を変化させることなく所与のアミノ酸残基が変化しているタンパク質または酵素であり、極性または非極性の特徴、サイズ、形状および電荷を含む類似の特性を有するものによるアミノ酸の置換が挙げられるが、これらに限定されない。一般に知られている遺伝的にコードされていないアミノ酸の多くに対する保存的アミノ酸置換は、当技術分野において周知である。他の非コードアミノ酸の保存的置換は、遺伝的にコードされたアミノ酸の特性と比較したそれらの物理的特性に基づいて決定することができる。
保存されていると示されるアミノ酸以外のアミノ酸は、タンパク質または酵素において異なり得、その結果、類似の機能の任意の2つのタンパク質間のパーセントタンパク質またはアミノ酸配列類似性は変動し得、アライメントスキームに従って決定されるように、例えば、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、および少なくとも95%であり得る。本明細書で言及するように、「配列類似性」は、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列が関連する程度を意味する。2つの配列間の類似性の程度は、パーセント配列同一性や保存に基づき得る。本明細書において「配列同一性」とは、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列が不変である程度を意味する。「配列アラインメント」は、類似性の程度を評価する目的で、最大レベルの同一性（およびアミノ酸配列の場合、保存性）を達成するために2つ以上の配列を整列させるプロセスを意味する。配列を整列させ、類似性/同一性を評価するための多数の方法、例えば、類似性がMEGALIGNアルゴリズムに基づくクラスター法、ならびにBLASTN、BLASTP、およびFASTAなどが当技術分野で公知である。これらのプログラムのいずれかを使用する場合、最も高い配列類似性をもたらす設定が選択され得る。本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」は、遺伝子の特異的転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるDNA配列として定義される。いくつかの実施形態において、プロモーターは、発生的に調節されるプロモーターでる。本明細書中で使用される場合、用語「転写制御下」、「作動可能に連結された」、または「作動可能に連結された」とは、プロモーターが、遺伝子のRNAポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を制御するために、核酸との関係で正しい位置および配向にあるとして定義される。いくつかの例において、1つ以上のポリペプチドは、「作動可能に連結されている」と言われる。一般に、「作動可能に連結された」という用語は、プロモーター配列が第2の配列に機能的に連結されており、プロモーター配列が第2の配列に対応するDNAの転写を開始および媒介することを示すことを意味する。
目的のポリヌクレオチド配列の発現を制御するために使用される特定のプロモーターは、それが標的細胞におけるポリヌクレオチドの発現を指向し得る限り、重要であるとは考えられない。従って、ヒト細胞が標的化される場合、ポリヌクレオチド配列コード領域は、例えば、ヒト細胞において発現され得るプロモーターに隣接して、そしてその制御下に配置され得る。このようなプロモーターは、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターのいずれかを含み得る。プロモーターは、本明細書で提供されるCARおよび他のポリペプチドを発現させるために使用されるベクターに適切なものが選択され得る。
種々の実施形態において、例えば、発現ベクターがレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）である場合、適切なプロモーターの例は、Murine Moloney白血病ウイルス（MMLV）プロモーターである。レンチウイルスは、非分裂性の細胞に感染することができるという点で、レトロウイルスの中でもユニークであり、宿主細胞のDNAに大量の遺伝情報を送り込むことができるため、遺伝子導入ベクターの最も効率的な方法の一つである。HIV、SIV、FIVはすべてレンチウイルスの例である。レンチウイルスベクターは、Milone et al.,Mol.に提供されるような自己不活性化レンチウイルスベクターを含むことができる。Ther．17（8): 1453-1464 （2009)。診療所で使用され得るレンチウイルスベクターの他の例としては、Oxford BiomedicaからのLENTIVECTOR（商標）遺伝子送達技術、LentigenからのLENTIMAX（商標）ベクター系などが挙げられるが、これらに限定されない。非臨床型のレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者には既知であろう。
他の実施形態において、プロモーターは、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）最初期遺伝子プロモーター、シミアンウイルス40（SV40）初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（RSV）末端反復配列であってもよく、β-アクチン、ラットインスリンプロモーターおよびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼを使用して、目的のコード配列の高レベル発現を得ることができる。目的のコード配列の発現を達成するために当該分野で周知である他のウイルスプロモーターまたは哺乳動物細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターの使用は、発現のレベルが所定の目的のために十分であるという条件で、同様に企図される。周知の特性を有するプロモーターを使用することによって、トランスフェクションまたは形質転換後の目的のタンパク質の発現のレベルおよびパターンを最適化することができる。
プロモーターおよび他の調節エレメントは、それらが所望の細胞または組織において機能するように選択される。さらに、プロモーターのこのリストは、網羅的または限定的であると解釈されるべきではない；他のプロモーターは、本明細書中に開示されるプロモーターおよび方法と組み合わせて使用される。
本明細書で考察される核酸は、1つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、1つまたは複数のポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドの5'または3'に位置する、または5'-から3'の順序で位置すると記載され得る。これらの文脈における参照5'-から3'は、例えば、第1のポリヌクレオチドが第2のポリヌクレオチドの5'に位置し、非可解リンカーポリペプチドをコードする第3のポリヌクレオチドと接続される、核酸中のポリヌクレオチドのコード領域の方向を指すと理解される。翻訳産物は、第1のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、第1、第3および第2のポリヌクレオチドの翻訳産物からなるより大きなポリペプチドのアミノ末端側に位置することになるであろう。
CAR遺伝子などの発現コンストラクトは、ウイルスを介した統合などによってゲノムにランダムに組み込むことができ、あるいはCCR5およびAAVS1遺伝子座、またはT細胞受容体α定数（TRAC）遺伝子座を含むがこれに限定されないT細胞ゲノムなどの免疫細胞ゲノムの特定部位に意図的に統合することができる。標的統合には、核酸を利用したゲノム編集システムなどの遺伝子編集ツールを用いることができ、CRISPR/Cas9（クラスタ化された正規インタースペース短パリンドロミック反復配列）システム、ZFN（亜鉛フィンガー型ヌクレアーゼ）、TALEN（転写活性化因子類似エフェクターヌクレアーゼ）などを含む。
コスティミュレーション
いくつかの実施形態では、外来性ミトコンドリアを含む、又はそれによって増強される免疫細胞は、CAR-T細胞などの、コスティミュレーションポリペプチドを含むCARを発現するように操作された免疫細胞である。いくつかの実施形態では、外来性ミトコンドリアを含む、又はそれによって増強される免疫細胞は、コスティミュレーションポリペプチドを含むCAR-T細胞である。CARは、CD28、4-1BB、OX40、ICOSおよびDAP10を含むがこれらに限定されないT細胞コスティミュレーション分子の細胞質部分に由来するものなどのコスティミュレーションドメインを含むように操作することができる（例えば、Carpenito et al. （2009）Proc Natl Acad Sci U.S.A. 106：3360-3365；Finney et al.（1998）J Immunol 161：2791-2797； Hombach et al.（1998）J Immunol 161：2791-2797；Hombach et al.（2001）を参照）。J Immunol 167：6123-6131； Maher et al. （2002） Nat Biotechnol 20：70-75； Imai et al. （2004） Leukemia 18：676-684； Wang et al. （2007） Hum Gene Ther 18：712-725; Zhao et al. （2009） J Immunol 183：5563-5574; Milone et al. （2009） Mol Ther 17： 1453-1464; Yvon et al. （2009） Clin Cancer Res 15：5852-5860） により、CAR-T細胞が標的抗原との係合時に適切なコスティミュレーションを受けることができるようになる。コスティミュレーション分子には、CD28や4-1BB（CD137）などがあり、腫瘍の認識後、NF-κBの活性化をもたらすシグナルカスケードを開始し、T細胞の増殖と細胞生存を促進させることができる。難治性急性リンパ芽球性白血病（ALL）の治療のためにCD28または4-1BBシグナルドメインを有する抗CD19 CARを用いて実施された臨床試験では、養子移入後に著しいT細胞の持続、拡大および連続した腫瘍殺傷が実証された（Kalos et al. （2011）Sci Transl Med 3：95ra73； Porter et al.（2011）N Engl J Med 365：725-733； Brentjens et al.（2013）Sci Transl Med 5：177ra38 ）。第三世代CAR-T細胞は、CD28修飾CARに、OX40や4-1BBといった腫瘍壊死因子（TNF）ファミリータンパク質からのシグナル伝達分子を追加している（Finney HM, et al.）。J イムノル172： 104-13, 2004； ゲダン S, et al., 血液, 2014）。
第2世代、第3世代のCAR-T細胞の中には、高度に活性化されたT細胞によるサイトカインストームや腫瘍崩壊症候群により、患者の死亡に関与しているものがある。一態様において、外因性ミトコンドリアの送達を通じて免疫細胞を増強する本明細書に記載の発明は、CAR-T細胞療法の細胞毒性効果を低減しつつ、キメラ抗原受容体発現T細胞を増強および維持するためのコスティミュレイションポリペプチドを含むCAR-T細胞を含む組成物および方法に関する。
本発明のコスティミュレイトリーポリペプチドは、誘導的に活性化されるものであっても、構成的に活性化されるものであってもよい。コスティミュレーションポリペプチドは、CD27、ICOS、RANK、TRANCE、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、MyD88、又はCD40等の1又は複数のコスティミュレーション信号伝達領域又は例えばその細胞質領域からなることが可能である。コスティミュレーションポリペプチドは、CD27、ICOS、RANK、TRANCE、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、MyD88、又はCD40によって活性化されるシグナル伝達経路を活性化する1又は複数の適切なコスティミュレーションシーナリング領域を含むことができる。コスティミュレーションポリペプチドには、腫瘍壊死因子受容体（TNFR）ファミリー（すなわち、CD40、RANK/TRANCE-R、OX40、4-1BB）およびCD28ファミリーメンバー（CD28、ICOS）のNF-κB経路、Akt経路および／またはp38経路を活性化する任意の分子またはポリペプチドが含まれる。つ以上のコスティミュレーションポリペプチド又はコスティミュレーションポリペプチド細胞質領域が、本明細書で議論される改変T細胞において発現されてもよい。
いくつかの実施形態では、コスティミュレーションポリペプチドを含むCAR-T細胞集団は、例えば、CD8、CD4、CD3、CD34などの特定のマーカー、受容体、または細胞表面糖タンパク質を発現する細胞型の少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、または99％を含むように選択、または濃縮、または精製されている。
いくつかの実施形態において、コスティミュレーションポリペプチドを含むCAR-T細胞集団は、CD4＋及びCD8＋T細胞を含む。いくつかの実施形態では、コスティミュレーションポリペプチドを含むCAR-T細胞集団は、少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、又は99％のCD8＋T細胞からなるように濃縮されている。いくつかの実施形態では、コスティミュレーションポリペプチドを含むCAR-T細胞集団は、少なくとも80％のCD8＋T細胞からなるように濃縮される。いくつかの実施形態では、コスティミュレーションポリペプチドを含むCAR-T細胞集団は、少なくとも90%のCD8＋T細胞からなるように濃縮される。したがって、いくつかの実施形態では、組成物中に遺伝子組換えCD4＋T細胞よりも多くの遺伝子組換えCD8＋T細胞が存在するすなわち、CD4＋細胞対CD8＋細胞の比は1未満例えば0.9未満、0.8未満、0.7未満、0.6未満、又は0.5未満である。
第二世代CAR T細胞は、CD3ζによる転写因子NFAT（シグナル1）とCD28や4-1BBによるNF-κB（シグナル2）の活性化を通じて、T細胞の生存と増殖を支援するIL-2を産生することが主要な機能の一つとなっている。
同様にNF-κBを活性化する他の分子も、CAR分子内でCD3ζ鎖と対になる可能性がある。1つのアプローチは、もともと樹状細胞（DC）ワクチンのアジュバントとして開発されたT細胞コスティミュレーション分子を用いる（Narayanan et al. （2011）J Clin Invest 121：1524-1534； Kemnade et al.（2012）Mol Ther 20（7):1462-1471 ）。DCの完全な活性化またはライセンスには、通常、Toll様受容体（TLR）シグナルが関与している。TLRシグナル伝達では、TLRの細胞質TLR/IL-1ドメイン（TIRドメインと呼ばれる）が二量化し、例えば骨髄分化一次反応タンパク質（MyD88）のような細胞質アダプタータンパク質の動員や会合につながる。MyD88は、自然免疫反応と適応免疫反応において中心的な役割を果たす細胞質アダプタータンパク質である。インターロイキン-1やToll様受容体（TLR）のシグナル伝達経路に不可欠なシグナル伝達物質として機能するタンパク質である。これらの経路は、多くの炎症性遺伝子の活性化を制御している。TLRシグナルはまた、腫瘍壊死因子受容体（TNFR）ファミリーのメンバーであるCD40の発現をアップレギュレートし、プライミングされたCD4+T細胞上のCD40リガンド（CD154またはCD40L）と相互作用する。CD40は、適応免疫応答の重要な部分であり、同族体であるCD40Lとの結合によりAPCの活性化を助け、より強力なCTL応答を極性化する。CD40/CD154シグナル伝達系は、T細胞機能およびB細胞/T細胞相互作用において重要な構成要素である。CD40シグナルは、CD40ホモダイマーの形成とTNFR関連因子（TRAF）との相互作用によって進行し、CD40の細胞質ドメインへのTRAFのリクルートメントによって行われ、NF-κB、JNK、AKT経路などのいくつかの二次シグナルを含むT細胞の活性化を引き起こする。
MyD88またはMyD88-CD40融合キメラポリペプチドを用いた刺激は、生存や増殖の利点とは別に、CAR修飾細胞にさらなる機能を与える可能性がある。MyD88シグナル伝達は、一般にTh1およびTh17応答の両方にとって重要であり、IL-1を介して作用して、CD4+ T細胞を制御性T細胞（Treg）主導の阻害に対して不応性とする（例えば、Schenten et al.（2014）Immunity 40：78-90を参照）。さらに、Ras、PI3KおよびプロテインキナーゼCを介したCD8+ T細胞におけるCD40シグナル伝達は、CD4+ CD25+Treg細胞を溶解する細胞障害性メディエーターグランザイムおよびパーフォリンのNF-κB依存性の誘導をもたらす（Martin et al.（2010）J Immunol 184：5510-5518）。このように、MyD88とCD40の共活性化により、CAR-T細胞はTreg細胞の免疫抑制効果に対して抵抗性を示すと考えられ、この機能は固形がんや他の種類のがんの治療において決定的に重要であると考えられる。CAR-T細胞などCARを導入した細胞のコスティミュレーションの一つのアプローチとして、MyD88のシグナル伝達要素の融合タンパク質（MCと称する）を発現させる方法がある。
いくつかの実施形態では、誘導可能なキメラシグナリングポリペプチドは、例えば、4-1BBおよびCD28などの2つのコスティミュレーションポリペプチド細胞質シグナリング領域、またはCD27、ICOS、RANK、TRANCE、CD28、4-1BB、OX40、DAP10からなる群より選択される1つ、もしくは2以上のコスティミュレーションポリペプチド細胞質シグナリング領域から構成される。いくつかの実施形態では、CAR-T細胞などのCAR改変細胞は、誘導性キメラシグナリングポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチド及びCARをコードする第2のポリヌクレオチドをコードする核酸を含んでいる。いくつかの実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、第2のポリヌクレオチドの5'に配置される。いくつかの実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、第2のポリヌクレオチドの3'に配置される。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドをコードする第3のポリヌクレオチドが、第1および第2のポリヌクレオチドの間に配置される。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、2Aポリペプチドであり、翻訳の間、または翻訳の後に、第1および第2のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを分離することができる。
ベクター
いくつかの実施形態では、外来性ミトコンドリア（例えば、自家、同種ミトコンドリア、異種ミトコンドリア、カプセル化ミトコンドリア、または適切な遺伝子修飾を受けた自家ミトコンドリアとして）からなる、またはそれによって増強される免疫細胞の集団は、DNA、二本鎖RNA、一本鎖mRNA、または円形RNAベクターから産生されるCARまたは人工TCRサブユニットを含んでいる。本明細書で提供されるベクターは、領域の位置や順序を変えたり、ある領域を別の領域に置き換えたりするために、当技術分野で知られている方法を用いて修正することができることが理解される。例えば、キメラシグナリングポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、例えば、CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE、及びDAP10からなる群から選択されるものなどの1つ、又は2以上の共刺激ポリペプチド細胞質シグナリング領域を種々の順序で配置してなるキメラシグナリングポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。また、CARをコードするポリヌクレオチドは、抗原結合ドメインを同一または異なる標的特異性を有するものに置換したり、膜貫通領域を異なる膜貫通領域に置換したり、ストークポリペプチドを付加するなどの改変を行うことも可能である。マーカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリペプチドの1つの中に含まれてもよいし、1つのポリペプチドとは別個に含まれてもよい。安全スイッチをコードするポリペプチドをさらにコードするポリヌクレオチドが追加されてもよいし、リンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドや非コードポリヌクレオチドまたはスペーサーが追加されてもよいし、5'-から3'のポリヌクレオチドの順序が変わってもよい。
ベクターは、例えば、BCMA、CD123、CD20、CD22、CD30、CD33、EGFR、EGFRvIII、GD2、Her2、メソセリン、MUC1、MUC16、NKG2D、NY-EFO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1などのような1以上の標的抗原に特異的な抗原結合ドメインを、例えばCAR構築物の一部としてもコードすることが可能である。また、本明細書で説明するように、各ポリペプチド領域を適切に置換してベクターを改変することもできる。
ベクターは、例えば、CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、RANK、TRANCE、およびDAP10からなる群から選択されるものなどの1つ、または2つ以上の共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域を含むCAR構築物の一部として、共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域をコードすることが可能である。共刺激ポリペプチドは、本明細書で提供されるアミノ酸配列を含んでいてもよいが、これに限定されず、欠失または切断を含む機能的保存性変異を含んでいてもよく、本明細書で提供されるアミノ酸配列と70%、75%、80%、85%、90%、95%または100%同一なアミノ酸配列からなるものであってよい。ベクターは、例えば、CAR構築物の一部として、CARポリペプチドと共刺激ポリペプチドとの間のリンカーをコード化することができる。
例えば、本明細書で提供される核酸は、CARのCD3ζ部分をコードするポリヌクレオチドのコスティミュレーションポリペプチドシグナリング領域3'を含んでよく、ここで2つのポリヌクレオチドはリンカーをコードするポリヌクレオチドにより分離されている。いくつかの実施形態では、2つのポリヌクレオチドは、例えば、約5～20アミノ酸、または例えば、約6～10アミノ酸を有するリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによって分離されてもよい。
T細胞（例えば、CAR T細胞）などの工学的免疫細胞は、誘導性自殺遺伝子または自殺スイッチとしても知られる安全スイッチを発現してもよく、この安全スイッチは、所望の場合、例えば移植片対宿主病（GVHD）が発症した場合など、工学的免疫細胞をインビボで撲滅するために使用することが可能である。いくつかの例では、キメラ抗原受容体を発現する工学的免疫細胞は、オンターゲット腫瘍外毒性などの有害事象を誘発する患者に提供される。治療上、CAR改変細胞を用いた治療中に、患者さんが何らかの否定的な症状を経験する可能性がある。これらの治療法は、健康な組織を非特異的に攻撃することもあり、有害事象を引き起こすケースもある。いくつかの例では、治療用人工免疫細胞は、もはや必要とされないかもしれないし、治療が特定の時間のために意図されている、例えば、治療用人工免疫細胞は、腫瘍細胞、または腫瘍サイズを減少させるために働くかもしれないし、もはや必要とされないかもしれない。したがって、いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞が、誘導性カスパーゼ-9ポリペプチドなどの安全スイッチをも発現する、核酸、細胞、及び方法が提供される。当該分野で公知の他の自殺スイッチ系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されません：(a）非毒性プロドラッグガンシクロビル（GCV）をGCV三リン酸に変え、DNA複製を停止することによって細胞死を導く、単純ヘルペスウイルス（HSV)-tk、(b）iCasp9は、低分子AP1903に結合し得、二量体化を生じ得、内因性アポトーシス経路を活性化する、および（c）形質導入されたiNKT細胞において発現される標的化可能な表面抗原（例えば、CD20および短縮型EGFR)、関連モノクローナル抗体の投与後に補体/抗体依存性細胞傷害（CDC/ADCC）を介して改変された細胞を効率的に排除することを可能にする。例えば、人工免疫細胞の数を減らす必要がある場合、誘導性リガンドを患者に投与し、それによって人工免疫細胞のアポトーシスを誘導することができる。これらのスイッチは、操作された免疫細胞を根絶したいときに供給され、細胞死を引き起こす（例えば、壊死やアポトーシスを誘発する）薬理学的薬剤などのトリガーに反応する。これらの薬剤は毒性遺伝子産物の発現させることができるが、操作された免疫細胞が薬剤に反応して毒性形態に切り替わるタンパク質をすでに発現していれば、より迅速な反応が得られる。
選択可能なマーカー
特定の実施形態では、発現構築物は、発現構築物中にマーカーを含むことにより、その発現が試験管内または生体内で同定される核酸構築物を含む。このようなマーカーは、細胞に識別可能な変化を与え、発現コンストラクトを含む細胞を容易に識別できるようにするものである。通常、薬剤選択マーカーを含めることで、クローニングや形質転換体の選択を補助することができる。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシン、ヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（tk）のような酵素が採用される。細胞外の非シグナルドメインや様々なタンパク質（CD34、CD19、LNGFRなど）を含む免疫学的表面マーカーも採用でき、磁気または蛍光抗体によるソーティングのための直接的な方法を可能にする。採用する選択マーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現できるものであれば、特に重要視されることはない。選択マーカーのさらなる例としては、例えば、GFP、EGFP、β-galまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）のようなレポーターを挙げることができる。特定の実施形態では、例えばCD19のようなマーカータンパク質は、例えば免疫磁気選択などのように、輸血用細胞の選択に使用される。本明細書で議論するように、CD19マーカーは、抗CD19抗体、または例えば、CD19に結合するscFv、TCR、または他の抗原認識部分と区別される。
特定の実施形態では、マーカーポリペプチドは、誘導性キメラ刺激分子に連結される。例えば、マーカーポリペプチドは、例えば、切断可能な2A様配列などのポリペプチド配列を介して誘導性キメラ刺激分子に連結されてもよい。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド、例えば、発現ベクターによってコードされるCARを含んで、細胞の選別を補助してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキメラ抗原受容体又はキメラ刺激分子を発現するために使用される発現ベクターは、16アミノ酸のCD34最小エピトープをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。本明細書の例で提供される特定の実施形態などのいくつかの実施形態では、CD34最小エピトープがCD8ストークのアミノ末端位置に組み込まれる。
リンカーポリペプチド
リンカーポリペプチドとしては、例えば、切断可能なリンカーポリペプチドと非切断可能なリンカーポリペプチドが挙げられる。非切断性ポリペプチドとしては、例えば、コスティミュレーションポリペプチド細胞質シグナル伝達領域とキメラ抗原受容体のITAM部分（例えば、CD3ζ）との間に作動可能に連結され得る任意のポリペプチドが挙げられ得る。リンカーポリペプチドとしては、例えば、約2～約30個のアミノ酸からなるもの（例えば、フリン切断部位またはグリシン-セリンリンカー、例えば（GGGGS）n）などが挙げられる。いくつかの実施形態において、リンカーポリペプチドは、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30アミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、約18～22個のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、20個のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、集団内の改変細胞に外来性の酵素、例えば、リンカーをコードするポリヌクレオチドと同時または異なる時期に、トランスフェクションまたは形質導入によって細胞に導入されるポリヌクレオチドによってコードされる酵素によって切断されるリンカーが含まれる。いくつかの実施形態では、開裂可能なリンカーは、例えば、細胞内で天然に発現する酵素、及び例えばリゾチームなどの細胞にネイティブなポリヌクレオチドによってコードされる酵素など、集団内の修飾細胞に内在する酵素によって開裂されるリンカーを含む。
2Aペプチドボンドスキップ配列
2A自己切断ペプチド、または2Aペプチド、または「ペプチド結合スキップ」2A配列は、例えば、口蹄疫ウイルス、馬鼻炎Aウイルス、トーサ・アシグナウイルスなどを含む多くの異なるウイルスから誘導される。2Aペプチドは、18-22aa長のペプチドのクラスであり、細胞内で組換えタンパク質の切断を誘発することができる。このような配列がシストロン内に配置されると、分離されるはずの2つのポリペプチドの間で、リボソームがペプチド結合をスキップしているように見えるのである。例えば、トーサ・アシグナウイルス 2A配列の場合、カルボキシ末端のGlyとProのアミノ酸残基間のペプチド結合「P-G-P」は省略される。これは、例えば、誘導性キメラプロアポトーシスポリペプチドとキメラ抗原受容体、あるいは、例えば、マーカーポリペプチドと誘導性キメラプロアポトーシスポリペプチドのように2～3種類のポリペプチドを残すことができる。この配列を使用する場合、2A配列に先行するポリペプチドは、2A配列におけるGly残基および任意の上流残基を含むカルボキシ末端に追加のアミノ酸を有することになる場合がある。2A配列の3'にコードされるペプチドは、Pro残基および2A配列に続く下流の残基を含むアミノ末端に追加のアミノ酸を有して終わることができる。いくつかの実施形態では、開裂可能なリンカーは、ブタテスコウイルス-1（P2A）に由来する2Aポリペプチドである。いくつかの実施形態では、2A共役配列は、2A様配列である。いくつかの実施形態では、2A共役配列は、T2A（トーサ・アシグナウイルス2A）、F2A（口蹄疫ウイルス2A）、P2A（豚テスコウイルス-1 2A）、BmCPV 2A（cytoplasmic polyhedrosisウイルス2A）BmIFV 2A（flacherie virus of B. mori 2A）、またはE2A（馬鼻炎A型ウイルス2A）である。いくつかの実施形態では、2A共翻訳配列は、T2A-GSG、F2A-GSG、P2A-GSG、またはE2A-GSGである。いくつかの実施形態では、2A共役配列は、T2A、P2A及びF2Aからなる群から選択される。切断可能なリンカー」とは、例えば、ペプチドスキップのような非酵素的手段、または酵素的手段を含む、任意の手段によってリンカーが切断されることを意味する（Donnelly, ML 2001, J. Gen）。Virol. 82：1013-25）。
2A類似配列は、翻訳中にポリペプチドの一部が分離せず、翻訳後も1つの長いポリペプチドとして残る「リーキー」な場合がある。リンカーが漏れる原因として、短い2A配列が時折、リボソームスキップを促進する必要な構造（「2Aフォールド」）に折れない場合があるという説がある。このような場合、リボソームはプロリンのペプチド結合を見逃すことがなく、その結果、融合タンパク質となりる。リークネスを低減し、融合タンパク質の数を減らすために、2Aポリペプチドのアミノ末端側にGSG（または類似の）リンカーを付加することができる；GSGリンカーは、新しく翻訳されたポリペプチドの二次構造が自発的に折り畳まれ、「2Aフォールド」が破壊されるのを阻止する
治療への応用
本明細書で提供される外因性ミトコンドリアで増強された免疫細胞（例えば、自己ミトコンドリア、同種異系ミトコンドリア、異種ミトコンドリア、カプセル化ミトコンドリアまたは遺伝子改変を有するミトコンドリアが移植された免疫細胞）は、標的が関与する任意の疾患または状態の処置に有用であり得る。もし、この出願が免疫細胞の一般的な応用（バインダー特異的ではない）を開示しているならば、標的細胞分子として「腫瘍関連抗原」（「TAA」）を使用することができる。いくつかの実施形態において、疾患又は状態は、養子細胞療法による治療から利益を得ることができる疾患又は状態である。いくつかの実施形態では、疾患又は状態は腫瘍である。いくつかの実施形態では、疾患又は状態は細胞増殖性障害である。いくつかの実施形態では、疾患又は状態は癌である。いくつかの実施形態では、疾患又は状態はウイルス感染症である。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される外因性ミトコンドリアで強化された免疫細胞、例えば、外因性ミトコンドリアを生体外で以前に移植した免疫細胞の有効量を対象に投与することによって、それを必要とする対象における疾患または状態を治療する方法である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、有効量の免疫細胞を、本明細書で提供される外来ミトコンドリアと共に対象に共投与することによって、それを必要とする対象における疾患又は状態を治療する方法である。いくつかの態様において、疾患または状態は癌である。いくつかの態様において、疾患または状態はウイルス感染症である。
本明細書で提供される外来性ミトコンドリアで強化された免疫細胞で、任意の適切な癌を治療することができる。例示的な適切な癌としては、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ALL)、急性骨髄性白血病（AML)、副腎皮質腫瘍、肛門癌、虫垂癌、アストロサイトーマ、基底細胞腫、脳腫瘍、胆管癌、膀胱癌、骨肉腫、乳癌、気管支腫瘍、原発不明癌、心臓腫瘍、子宮頚癌、脊索腫、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、管癌、胎生期腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、エスシオ神経芽細胞腫、線維性組織球腫、ユーイング肉腫、眼癌、胚細胞性腫瘍、胆のう癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、グリオーム、頭頸部癌、肝細胞癌、組織球増殖症、ホジキンリンパ種（HL)、下咽頭癌、眼球内黒色腫、膵島細胞腺腫、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、口唇癌および口腔癌、肝臓癌、非浸潤性小葉癌、肺癌、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、メラノーマ、メルケル細胞腫、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮頸部癌、NUT遺伝子を含む正中線路癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、鼻腔・副鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫（NHL）、非小細胞肺癌（NSCLC）、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂・尿管癌、網膜芽細胞腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺癌、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌（SCLC）、小腸癌、軟部肉腫、脊髄腫瘍、胃癌、T細胞リンパ腫、類円形腫、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、膣癌、外陰部癌、ウィルムス腫瘍が含まれる。
併用療法
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される外因性ミトコンドリアで強化されたT細胞又はCAR T細胞などの免疫細胞は、少なくとも1つの追加の治療薬とともに投与される。外因性ミトコンドリアで強化された免疫細胞は、外因性ミトコンドリアを生体外であらかじめ移植した免疫細胞、または外因性ミトコンドリアを生体内の免疫細胞に移植するように外因性ミトコンドリアと共投与した免疫細胞を含むことができる。本明細書で提供される外因性ミトコンドリアで強化された免疫細胞には、任意の適切な追加の治療剤が投与され得る。いくつかの態様において、追加の治療剤は、放射線、細胞毒性剤、化学療法剤、静注剤、抗ホルモン剤、EGFR阻害剤、免疫賦活剤、抗血管新生剤、及びそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、免疫賦活剤を含む。
いくつかの実施形態では、免疫賦活剤は、免疫細胞の抑制性受容体のシグナル伝達を遮断する薬剤、又はそのリガンドである。
いくつかの態様において、阻害性受容体またはリガンドは、細胞傷害性Tリンパ球関連蛋白4（CTLA-4、CD152としても知られる)、プログラム細胞死蛋白1（PD-1またはCD279)、プログラム死リガンド1（PD-L1またはCD274)、形質転換成長因子β（TGFβ)、リンパ球活性化遺伝子3（LAG-3、CD223)、Tim-3（A型肝炎ウイルス細胞受容体2またはHAVCR2またはCD366)、ニューリチン、BおよびTリンパ球アテニュエーター（BTLAまたはCD272)、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIRs)、およびそれらの組合せから選択される。いくつかの態様において、薬剤は、抗PD-1抗体（例えば、ペムブロリズマブまたはニボルマブ）、および抗PD-L1抗体（例えば、アテゾリズマブ）、抗CTLA-4抗体（例えば、, イピリムマブ）、抗TIM3抗体、カルチノエンバリアン抗原関連細胞接着分子1（CECAM-1、CD66aでもある）および5（CEACAM-5、CD66eでもある）、vset免疫制御受容体（VISRまたはVISTAでもある）、白血球関連免疫グロブリン様受容体1（LAIR1またはCD305とも）、CD160、ナチュラルキラー細胞受容体2B4（CD244またはSLAMF4とも）、およびそれらの組合せから選択される。いくつかの態様において、薬剤はペンブロリズマブである。いくつかの態様において、薬剤はニボルマブである。いくつかの態様において、薬剤はアテゾリズマブである。
いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、PD-1とPD-L1との間の相互作用を阻害する薬剤である。いくつかの態様において、PD-1とPD-L1との相互作用を阻害する追加の治療剤は、抗体、ペプチド模倣体及び低分子化合物から選択される。いくつかの態様において、PD-1とPD-L1との間の相互作用を阻害する追加の治療剤は、ペンブロリズマブ（Keytruda（商標))、ニボルマブ（Opdivo（商標))、アテゾリズマブ（Tecentriq（商標))、アベルマブ（Bavencio（商標))、ピジリズマブ、デュルバルマブ、BMS-936559、スルファモノメトキシン1、およびスルファメチゾール2から選択される。いくつかの実施形態では、PD-1とPD-L1との間の相互作用を阻害する追加の治療薬は、例えば、参照によりその全体が組み込まれるWeinmann et al. に記載されているように、そのような活性を有することが当技術分野で知られている任意の治療薬である。いくつかの実施形態において、PD-1とPD-L1との間の相互作用を阻害する薬剤は、本明細書に提供される抗体と同じ医薬組成物中に製剤化される。いくつかの実施形態では、PD-1とPD-L1との間の相互作用を阻害する薬剤は、本明細書で提供される抗体とは異なる医薬組成物に配合される。いくつかの実施形態では、PD-1とPD-L1との間の相互作用を阻害する薬剤は、本明細書で提供される抗体の投与前に投与される。いくつかの実施形態では、PD-1とPD-L1との間の相互作用を阻害する薬剤は、本明細書に提供される抗体の投与の後に投与される。いくつかの実施形態では、PD-1とPD-L1との相互作用を阻害する薬剤は、本明細書で提供される抗体と同時期に投与されるが、薬剤及び抗体は、別々の医薬組成物中に投与される。
いくつかの実施形態では、免疫賦活剤は、免疫細胞の共刺激性受容体のアゴニストである。いくつかの態様において、共刺激受容体は、GITR、OX40、ICOS、LAG-2、CD27、CD28、4-1BB、CD40、STING、toll様受容体、RIG-1、及びNOD様受容体から選択される。いくつかの実施形態では、アゴニストは、抗体である。
いくつかの実施形態では、免疫賦活剤は、アルギナーゼ、インドールアミン-2 3-ジオキシゲナーゼ、又はアデノシンA2A受容体の活性を調節する。
いくつかの実施形態では、免疫賦活剤は、サイトカインである。いくつかの態様において、サイトカインは、IL-2、IL-5、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、及びそれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様において、サイトカインはIL-2である。
いくつかの実施形態では、免疫賦活剤は、オンコリティックウイルスである。いくつかの態様において、オンコリティックウイルスは、単純ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、アデノウイルス、ニューカッスル病ウイルス（NDV）、ワクシニアウイルス、及びマラバウイルスから選択される。
追加の治療薬のさらなる例としては、タキサン系薬剤（例えば、パクリタキセルまたはドセタキセル）；白金系薬剤（例えば、カルボプラチン、オキサリプラチン、やシスプラチン）；トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、, イリノテカン、トポテカン、エトポシド、やミトキサントロン）；フォリン酸（例えば、ロイコボリン）；またはヌクレオシド代謝阻害剤（例えば、フルオロウラシル、カペシタビン、やゲムシタビン）などが挙げられる。いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、フォリン酸、5-フルオロウラシル、やオキサリプラチンである。いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、5-フルオロウラシル及びイリノテカンである。いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、タキサン系薬剤及び白金系薬剤である。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、パクリタキセル及びカルボプラチンである。いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、ペメトレキセドである。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、EGFR、RAF又はMEK標的剤などの標的治療剤である。
追加の治療薬は、任意の適切な手段で投与することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される医薬、及び追加の治療薬は、同じ医薬組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体、及び追加の治療薬は、異なる医薬組成物に含まれる。
本明細書で提供される抗体及び追加の治療剤が異なる医薬組成物に含まれる実施形態では、抗体の投与は、追加の治療剤の投与の前、同時、や後に行われ得る。いくつかの態様において、本明細書で提供される抗体、及び追加の治療剤の投与は、互いに約1ヶ月以内に行われる。いくつかの態様において、本明細書で提供される抗体、及び追加の治療剤の投与は、互いに約1週間以内に行われる。いくつかの態様において、本明細書で提供される抗体、及び追加の治療剤の投与は、互いに約1日以内に行われる。いくつかの態様において、本明細書で提供される抗体、及び追加の治療剤の投与は、互いに約12時間以内に行われる。いくつかの態様において、本明細書で提供される抗体、及び追加の治療剤の投与は、互いに約1時間以内に行われる。
使用方法本
明細書は、単離ミトコンドリアまたは単離ミトコンドリアの医薬組成物を、生体外で患者または同種ドナーの細胞に送達する方法、および／または生体内で患者の組織に送達する方法を提供するものである。理論に束縛されることを望まないが、ミトコンドリアはアクチン依存性のエンドサイトーシスを通じて組織細胞または培養細胞によって取り込まれ、それによって薬学的組成物を細胞に直接送達する方法が提供される。非限定的な例示的な例では、ミトコンドリアは、例えば、2～24時間の期間にわたって培養液中でミトコンドリア（107／ウェル）と細胞（50，000／ウェル）の共インキュベーションによって標的免疫細胞に移植される。当業者は、生体外の免疫細胞または生体内の患者の組織に投与されるミトコンドリアの用量は、生存率、効力、活性、生存、耐久性や毒性の最適化など、標的免疫細胞または細胞を強化するという観点で意図された結果に基づいて変化し得ることを認識することができる。ミトコンドリアを免疫細胞に生体外で送達する場合、例えば、共培養によって、ミトコンドリアの投与量は、標的細胞あたり0.2ミトコンドリアから5000ミトコンドリアの間であってよい。ミトコンドリアを生体内、患者の組織に送達する場合、1mLあたり1個から107個のミトコンドリアが送達される可能性がある。
本開示は、増強された免疫細胞（αβT細胞、γδT細胞、Treg細胞、CAR-T細胞、NK細胞、CAR-NK細胞、NK T細胞、マクロファージ、CAR-マクロファージ、好中球、CAR-好中球など）を含む組成物であって、細胞が、外因性ミトコンドリアを含むか、または外因性ミトコンドリアによって増強され、外因性ミトコンドリアは、自己ミトコンドリア、同種異系ミトコンドリア、異種ミトコンドリア、カプセル化ミトコンドリア、または遺伝子改変を有する自家ミトコンドリアであり得る組成物を企図する。これらの細胞は、抗腫瘍活性を有する当該技術分野で既知の任意のエフェクター細胞、または自己免疫を防止することができる免疫抑制免疫細胞のいずれかであることができる。したがって、本明細書は、外因性ミトコンドリアを含むかもしくはそれによって増強される免疫細胞、または外因性ミトコンドリアを含むかもしくはそれによって増強される免疫細胞の医薬組成物を、患者の細胞や組織または同種異系ドナーに由来する細胞に送達する方法を提供する。外因性ミトコンドリアを含むか、または外因性ミトコンドリアによって増強された免疫細胞は、種々の形態の癌、腫瘍および自己免疫疾患を含むがこれらに限定されない種々の疾患を処置するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、CAR T細胞の調製は、以下のステップを含み得る：
1. 白血球除去によって患者の血液からTリンパ球を収集する。
2. 密度勾配遠心分離、水簸、および免疫磁気ビーズ選択によるT細胞の濃縮。
3. エレクトロポレーション、レトロウイルス/レンチウイルス形質導入、またはヌクレアーゼ媒介ゲノム編集(例えば、標的細胞のゲノムへのCAR遺伝子の導入)を使用する遺伝子改変。
4. 当技術分野で公知の方法を使用した人工抗原提示系(抗CD 8/抗CD 28免疫磁気ビーズ/LV-APC)によるポリクローナル活性化によるCAR-T細胞の活性化および増殖。
一般に、一貫性は、cGMP（現行の適正製造基準）に従った原材料とプロトコルの標準化およびバリデーションによって達成される。
5. 品質保証 - 生存率、表現型、グラム染色、エンドトキシン、細菌、真菌、マイコプラズマの汚染物質について、FDAガイドラインに基づき、当業界で知られた方法で検査することである。
6. 製剤と投与 - 当業界で知られている方法を用いて、臨床的に規定された投与量と投与経路の試験を行いる。
治療用細胞の保存、包装、輸送、受領、投与は一般的に製品の安定性とCoCを維持する必要がある。
特定の実施形態では、ミトコンドリア製剤は、（1）遺伝子改変（例えば、CAR遺伝子の導入）が行われる前、（2）それと同時、または（3）その後に免疫細胞へ送達される。特定の実施形態において、ミトコンドリア調製物は、生体外遺伝子改変を含む方法などにおいて、生体外遺伝子改変（例えば、CAR遺伝子の導入）を行う前に、（2）同時に、又は（3）後に、免疫細胞に生体外で送達される。特定の実施形態では、ミトコンドリア調製物は、生体内遺伝子改変（例えば、CAR遺伝子の導入）が行われる前に、免疫細胞に生体外で送達される（例えば、生体内ウイルス媒介性遺伝子改変）。理論にとらわれることなく、ステップ（1）は、免疫不全のがん患者から採取した自己T細胞（疲弊したT細胞や老化したT細胞）を再生するために、典型的に重要である。ミトコンドリアは、0.2：1～5000：1の間の比率、例えば0.2：1、0.5：1、1：1、10：1、50：1、100：1、200：1、500：1、1000：1または5000：1で生体外細胞とコインキュベートすることが可能である。
CAR-T細胞などの免疫細胞の活性を生体内で高めるために、ミトコンドリアを免疫細胞と一緒に患者さんの体内に送り込むこともできる（4）。特定の実施形態では、ミトコンドリア製剤は、（1）生体内遺伝子改変（例えば、CAR遺伝子の導入）が行われる前、（2）それと同時、または（3）（例えば生体内ウイルス媒介遺伝子改変の後に）免疫細胞へ生体内で送達される。特定の実施形態では、ミトコンドリア製剤は、生体外遺伝子改変（例えば、CAR遺伝子の導入）が行われた後、生体内で免疫細胞に送達される。本発明の特定の実施形態では、CAR-T細胞または他の免疫細胞は全身（静脈）注入を介して送達される一方、ミトコンドリアは（5）腫瘍内注入、（6）臓器内注入、（7）組織内注入、または（8）臓器特異的または組織特異的血管系を通じて送達される。
事例
以下に、本発明の方法および組成物の例を挙げる。本明細書で提供される一般的な説明から、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解される。
事例1a：組織試料または培養細胞からのミトコンドリアの単離
組織サンプルや培養細胞からミトコンドリアを単離する実験を行った。
準備
インタクトで生存可能な呼吸活性のあるミトコンドリアを単離するために、以下の溶液を調製した。本法によりミトコンドリアをうまく単離するためには、ミトコンドリアの生存率を維持するために溶液や組織試料を氷上に保つ必要がある。氷上で維持した場合でも、単離したミトコンドリアは時間の経過とともに機能活性の低下を示す（Olson et al.、J Biol Chem 242：325-332、1967）。以下のソリューションは、可能であれば事前に準備しておくとよい：
- 1 M K-HEPES ストック液（KOH で pH を 7.2 に調整する）
- 0.5 M K-EGTA ストック液（KOH で pH を 8.0 に調整する）
- 1 M KH2PO4 株式ソリューション
- 1 M MgCl2 株式ソリューション
- ホモジナイジングバッファー（pH7.2）。300 mMスクロース、10 mM K-HEPES、1 mM K-EGTA4℃で保存
- 呼吸緩衝液：250 mMスクロース、2 mM KH2PO4、10 mM MgCl2、20 mM K-HEPES バッファ（pH7.2） および 0.5 mM K-EGTA（pH8.0）.4℃で保存
- 10×PBS 原液：80g の NaCl、2g の KCl、14.4g の Na2HPO4、および 2.4g の KH2PO4 を 1L の複式蒸留 H2O（pH7.4 ）に溶解した。
- 1×PBS は、1L の複式蒸留H2Oに 100mL の 10×PBS をピペッティングして調製しました。Subtilisin A Stock は、Subtilisin A 4 mg を 1.5 mL のマイクロフュージチューブに秤量し、調製した。使用するまで 20℃で保存。
組織からのミトコンドリアの単離
組織解離と差分ろ過を用いたミトコンドリアの単離の手順ステップをまとめたスキームを図1に示す。骨格筋から採取した2本の6 mm 生検サンプルパンチを、gentleMACS C チューブ （ミルテニ・バイオテック、 サマーヴィル, MA） に入れた5 mLのホモジナイジングバッファに移し、gentleMACS（商標） 解離器 （ミルテニ・バイオテック） の1分間のホモジナイズプログラムでサンプルを均質化させた。サブチリシン Aストック溶液（250 μL）をgentleMACS Cチューブ内のホモジネートに添加し、氷上で10分間インキュベートした。ホモジネートを750×gで4分間遠心分離した（オプション工程として）。その後、ホモジネートを氷上で50 mLコニカル遠心管に入れ、あらかじめ湿らせた40 μmメッシュフィルターで濾過した。濾液は、氷上の50 mLコニカル遠心分離機で、あらかじめ湿らせた新しい40 μmメッシュフィルターを通して再度濾過した。濾液は、氷上で50 mLの円錐形遠心管に入れ、あらかじめ湿らせた新しい10 μmメッシュフィルターで再度濾過した。濾液は、氷上で50 mLコニカル遠心管に入れ、あらかじめ湿らせた新しい6 μmメッシュフィルターで再度濾過した。得られた濾液は直ちに使用するか、遠心分離により濃縮した。濃縮の場合、ろ液を 1.5 mL のマイクロフュージチューブに移し、9000 ×g で 10 分間、4℃で遠心分離を行った。上清を除去し、ミトコンドリアを含むペレットを再懸濁し、1 mL の 呼吸緩衝液で合流させた。
培養細胞からのミトコンドリアの単離
また、培養細胞、例えばヒト心筋線維芽細胞（HCF）細胞株（サイエンセル・リサーチ・ラボラトリーズ（サイエンセル・リサーチ・ラボラトリーズのカリフォルニア州カールズバッドから入手）からミトコンドリアを単離した。
ヒト心筋線維芽細胞（HCF）細胞の培養
ヒト心臓線維芽細胞（HCF）は，ウシ胎児血清，線維芽細胞増殖サプリメント-2，および抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）溶液を含む線維芽細胞培地-2で，供給者の指示に従って維持した（ScienCell）．細胞は単層として37℃、5% CO2の加湿雰囲気で維持し、80%コンフルエントに達した時点で継代した。
ヒト心筋線維芽細胞（HCF）細胞の調製
コンフルエント80％の2本のフラスコ（T150）からのHCF細胞を、PBSで1回洗浄した。その後、供給元の指示に従い、トリプシンを用いて細胞を剥離した（サイエンセル・リサーチ・ラボラトリーズのカリフォルニア州カールズバッド）。供給元の指示に従い、トリプシン中和溶液を加えて反応を停止させた（サイエンセル・リサーチ・ラボラトリーズのカリフォルニア州カールズバッド）。50mlの遠沈管に細胞を集め、1000rpm（190×g）で5分間遠心分離を行った。上清を捨て、1×PBSでの洗浄を計3回行った。
HCFとは異なる培養細胞の調製は、製造元の指示に従って行う必要がある。注目すべきは、ミトコンドリアの供給源となる細胞は、付着性、半付着性、浮遊性のいずれであってもよいということである。
ミトコンドリアの単離手順は、生検サンプルではなくヒト線維芽細胞を使用したことを除いて、組織サンプルからのミトコンドリアを単離する手順と本質的に同じであった。
あるいは、遠心分離を繰り返すことでミトコンドリアを単離することも可能である。簡単に言うと、トリプシン処理で細胞を集め、PBSに懸濁し、遠心分離（5分、250 ×g） を2回行った。ミトコンドリアの単離手順は、4℃または氷上で実施した。遠心分離した細胞をミトコンドリア分離バッファー（320 mM sucrose, 5 mM Tris-HCl, pH 7.4, 2 mM EGTA）に再懸濁し、Dounceホモジナイザーでホモジナイズした。3000×g、5分間の遠心分離を2回行い、核と細胞破片を除去し、上清を回収した（オプションステップ）。上清を 12,000 ×g で 10 分間遠心し、ミトコンドリアペレットをミトコンドリア分離バッファーに再懸 濁した。ミトコンドリア濃度はBradfordアッセイで測定した。
ミトコンドリア数
生存可能なミトコンドリア数は、単離したミトコンドリアのアリコート（10μL）をミトトラッカーオレンジ CMTMRos（5μmol/L； サーモフィッシャーサイエンティフィック）で標識することにより決定した。標識されたミトコンドリアのアリコートをスライドにスポットし、63×C-apochromat対物レンズを備えた回転ディスク共焦点顕微鏡を用いてカウントした（1.2W Korr/0.17NA, Zeiss）。ミトコンドリアはミトコンドリア特異的色素ミトフルーグリーン （サーモフィッシャーサイエンティフィック）で対比染色した。未染色の細胞や組織を用いて自家蛍光やバックグラウンド蛍光を測定するために適切な波長が選択された。簡単に説明すると、1 μL の標識されたミトコンドリアを顕微鏡スライドに載せ、蓋をした。ミトコンドリア数は、MetaMorph Imaging Analysisソフトウェアを用いて、標本領域全体をカバーする低倍率（×10）で測定した。
事例1b：培養細胞からのミトコンドリアの単離
培養細胞からミトコンドリアを単離する実験を行った。
準備
インタクトで生存可能な呼吸活性のあるミトコンドリアを単離するために、以下の溶液を調製した。本法によりミトコンドリアをうまく単離するためには、ミトコンドリアの生存率を維持するために溶液や組織試料を氷上に保つ必要がある。氷上で維持した場合でも、単離したミトコンドリアは時間の経過とともに機能活性の低下を示す（Olson et al.、J Biol Chem 242：325-332、1967）。以下のソリューションは、可能であれば事前に準備しておくとよい：
- 1 M K-HEPES ストック液（KOH で pH を 7.2 に調整する）。
- 0.5 M K-EGTA ストック液（KOH で pH を 8.0 に調整する）。
- ホモジナイジングバッファー（pH7.2）。300 mMスクロース、10 mM K-HEPES、1 mM K-EGTA。4℃で保存。
- 1x PBS (サーモフィッシャー、10010031)
- サブチリシン A 2 mg を 1.5 mL のマイクロフュージチューブに秤量し、サブチリシンA株 を調製した。使用するまで 20℃で保存。ホモジナイジングバッファーで2mg/mlに調製する。
ヒト心筋線維芽細胞（HCF）細胞の培養
ヒト心臓線維芽細胞（HCF）（サイエンセル・リサーチ・ラボラトリーズのカリフォルニア州カールズバッドから入手）を、90％コンフルエンスに達したときに細胞を継代したことだけが異なるが、事例1aに記載したように、培養した。
HCFとは異なる培養細胞の調製は、製造元の指示に従って行う必要がある。注目すべきは、ミトコンドリアの供給源となる細胞は、付着性、半付着性、浮遊性のいずれであってもよいということである。
CD8+ 細胞におけるミトコンドリアの用量依存的な取り込みについて検討して、染色した外来ミトコンドリアを CD8+ T 細胞に 100 万 CD8+ T 細胞あたり 1μg から 30μg の間で投与量を変化させて移植した。CD8+ T 細胞は、上記のように5人の異なるドナーの血液から抽出し、その後、各ドナーについて別々に培養した。ヒト心筋線維芽細胞から外来ミトコンドリアを単離し、事例4b.1に記載したように、ミトトラッカーレッドCMXRosおよびミトトラッカーグリーンFMで染色した。その後、各ドナーのCD8+ T 細胞に、染色した外来ミトコンドリアを、最終容量200μl中、CD8+ T細胞100万個あたり1μg、5μg、10μg、20μg、30μgの用量で処理した。培養4時間後に、Mitotracker Red CMXRosとMitotracker Green FMの発現を、FACSLyric （BD Biosciences） を用いたフローサイトメトリー、およびキーエンス顕微鏡 （BZ-X810） を用いた蛍光顕微鏡により、製造元の指示に従い評価した。図2に示すように、処理したCD8+ T細胞において、ミトトラッカーレッドCMXRosおよびミトトラッカーグリーンFMの明確な用量依存的発現が見られる。CD8+ T 細胞の移植効率は、用量依存的に向上する。ミトコンドリア活性、ミトコンドリア質量ともに、外来ミトコンドリアを投与しなかったCD8+ T細胞と比較して、処理細胞では有意に増加した。10μgのミトコンドリアからスタートした場合、ミトコンドリア活性、ミトコンドリア質量ともに有意に増加することが示された。また、培養細胞、例えばヒト心筋線維芽細胞（HCF）細胞からもミトコンドリアを単離した。HCF細胞の調製は、事例1aの方法に準じて行った。次に、各フラスコからの HCF 細胞を、gentleMACS C Tube （ミルテニ・バイオテック、 サマーヴィル, MA） に入れた 5 mL の ホモジナイジングバッファ に移し、サンプルを gentleMACS（商標） 解離器 （ミルテニ・バイオテック） の1分間のホモジナイズプログラムで均質化させた。サブチリシン Aストック溶液（250 μL）をgentleMACS Cチューブ内のホモジネートに添加し、氷上で10分間インキュベートした。ホモジネートを氷上で50 mL円錐形遠心管に入れ、あらかじめ湿らせた40 μmメッシュフィルターでろ過した。濾液は、氷上の50 mLコニカル遠心分離機で、あらかじめ湿らせた新しい40 μmメッシュフィルターを通して再度濾過した。濾液は、氷上で50 mLの円錐形遠心管に入れ、あらかじめ湿らせた新しい10 μmメッシュフィルターで再度濾過した。オプションとして，濾液を新しいプレウェッター5μmメッシュフィルターで再度濾過し，50mLコニカル遠心管に入れ，氷上で保管した。得られた濾液は直ちに使用するか、遠心分離により濃縮した。濃縮の場合は，ろ液を1.5 mLマイクロフュージチューブに移し，9500 x g，4° Cで5分間遠心分離し，同じ遠心分離速度で3回洗浄を行った。
単離したミトコンドリアの定量化
単離したミトコンドリアを事例1bのホモジナイジングバッファーに懸濁し、使用するまで氷上に置いておいた。投与量を変化させた場合のミトコンドリア量は、Qubit（商標） 蛍光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック／インビトロジェン）を用い、Qubit（商標） プロテインアッセイキットの製造元の指示に従って測定した。タンパク質濃度測定のため、ミトコンドリアをPBS（サーモフィッシャー、 10010031）に再懸濁させた。ミトコンドリアの投与量は、μgで表されるタンパク質含量で見積もった。
事例2：T細胞の単離、活性化および培養
CD8+T細胞は、健康なドナーのバフィーコートから分離した。末梢血単核細胞（PBMC）は，フィコールパックプラス（Cytiva, 17144002）を用いた密度勾配遠心分離により，製造者の指示に従って回収した。EasySep（商標） Human CD8+ T Cell Isolation Kit （Stemcell, 17953） とThe Big Easy" EasySep（商標） Magnet （Stemcell, 18001） を用いてPBMCからヒトCD8+ T細胞を採取した。単離したCD8+ T細胞を、100U/mlの組換えヒトIL-2 （ペプロテック, 200-02） の存在下で、Dynabeads ヒトT-アクチベーターCD3/CD28 （サーモフィッシャー, 111.32D） で、1対1の割合で活性化させた。CD8+T細胞は、RPMI1640培地GlutaMAXTM サプリメント 500ml （サーモフィッシャー、 61870010） で培養し、1% L-glutamine （サーモフィッシャー, 25030024), 1% ペニシリンーストレプトマイシン （10'000U/mL, ギブコ, 15140122), 1% 非必須アミノ酸（NEAA, サーモフィッシャー, 11140050), 1% ピルビン酸ナトリウム （サーモフィッシャー, 11360070), 10% ピルビン酸ナトリウムおよび0. 1％2β-メルカプトエタノール（Gibco、31350-010）。CD8+ T細胞は0.5 百万細胞/mLでプレーティングし、細胞が2 百万細胞/mLのコンフルエントに達したとき、または培地が黄色に変わったときに分割した。
事例3：T細胞の移植
CD8+T細胞は、ミトコンドリア移植の24時間前に24ウェルプレートに0.5 百万細胞/mLで植え付けた。ミトコンドリアが分離された時点で、CD8+ T 細胞を回収し、1500 rpm （430 x g） で 5 分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を新しいT細胞培地に1 百万細胞/100μLの濃度で再懸濁させた。T細胞培地は、事例2の下に記載した。
移植したCD8+T細胞は、24ウェルプレートの各ウェルに200μLのT細胞培地中で、CD8+T細胞100万個あたり10μgから100μgの範囲のタンパク質で分離したミトコンドリアと4時間インキュベートした。外来ミトコンドリアとCD8+T細胞の共培養の4時間後に、1.8mlの新鮮なT細胞培地を各ウェルに添加した。
事例 4a: ミトコンドリアの標識化と内在化
単離したミトコンドリアを pHrodo 赤色粒子ラベル （ライフテクノロジーズ社（ニューヨーク州グランドアイランド） で4℃、10分間標識し、呼吸緩衝液 （250 mM スクロース、 2 mM KH2PO4, 10 mM MgCl2, 20 mM K+-HEPES 緩衝液、 pH 7.2, 0.5 mM K+-EGTA, pH 8.0, 5 mM グルタミン酸塩, 5 mM リンゴ酸、 8 mM コハク酸、 1 mM ADP） で4回洗浄した後、pH8℃で10分間に呼吸緩衝液（pH8℃、4 mM MGO、3mM MGO、2.1mM）を用いて洗浄しする。標識されたミトコンドリアは新鮮な呼吸緩衝液に再懸濁され、最後の洗浄上清は保存される。標識されたミトコンドリアは、単離T細胞と共培養される。各時点の終了時に、培地を除去し、細胞を1×PBSで4回洗浄し、200μLの新鮮な培地を各ウェルに加えた。対照細胞は、最後のpHrodo洗浄と共培養した。ミトコンドリア内在化はImageJ 1.48ソフトを使用して決定している。
ATP測定法
ATP含有量は、ATPliteルミネセンスATP検出アッセイシステム （Perkin Elmer, Waltham, MA）を用いて測定する。蛍光色素はミトコンドリア機能を阻害する可能性があるため、すべてのアッセイは蛍光色素を含まない状態で実施される。
この結果は、ミトコンドリアと共培養したT細胞が時間依存的に内在化されることを実証している。内包されたミトコンドリアは、コントロールと比較して、T細胞のATP量を有意に増加させた。
事例4b：ミトコンドリアの標識化と内在化
事例4b.1 - 単離したミトコンドリアを染色したT細胞の移植
CD8+T細胞は、ミトコンドリア移植の24時間前に24ウェルプレートに0.5 百万細胞/mLで植え付けた。ミトコンドリアは、事例1bに記載の手順に従って単離した。次に、ミトコンドリアを、事例1bのホモジナイジングバッファー中、200nMのミトトラッカーレッド CMXRos （サーモフィッシャー, M7512） およびミトトラッカーグリーン FM （サーモフィッシャー、M7514） で37℃で10～15分染色した。染色したミトコンドリアを事例1bのHomogenizing Bufferで9500×g、4℃、5分間で3回洗浄し、最後の洗浄の上清をコントロールとして保存した。CD8+ T細胞を回収し、1500 rpm （430 x g）で5分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を新しいT細胞培地に1 百万細胞/100μLで再懸濁した。T細胞培地は、事例2の下に記載した。染色したミトコンドリアを（直ちに）T細胞に加え、24ウェルプレートの1ウェルあたり200μLの最終量とした。染色したミトコンドリアの最後の洗浄液を、コントロールの非移植CD8+T細胞と等量で加えた。染色したミトコンドリアの集積度は、移植後5分から24時間までのフローサイトメトリー（例えば、FACSLyric（BD Biosciences）で取得したデータ）または蛍光顕微鏡（キーエンス社の顕微鏡、BZ-X810）により評価した。外来ミトコンドリアと CD8+ T 細胞を 4 時間以上共培養した場合は、1.8mlの新鮮なT細胞培地を1ウェルに添加した。
例4b.2 - ミトコンドリア移植後の染色
移植したCD8+T細胞は、24ウェルプレートの各ウェルに200μLのT細胞培地中で、CD8+T細胞100万個あたり10μgから100μgの範囲のタンパク質で分離したミトコンドリアと4時間インキュベートした。外来ミトコンドリアとCD8+T細胞の共培養の4時間後に、1.8mlの新鮮なT細胞培地を各ウェルに添加した。移植した細胞について、24時間後のミトコンドリア呼吸量および細胞質量を評価した。色素ミトトラッカーレッド CMXRos （サーモフィッシャー、 M7512）とミトトラッカーグリーン FM （サーモフィッシャー、 M7514）は、RPMI1640培地で最終濃度100nMに希釈し、フェノールレッドを含まず（サーモフィッシャー、11835030）、1% ペニシリン・スレプトミシーn （10'000U/mL, ギブコ, 15140122), 5% 牛胎児血清で補足した。CD8+ T細胞1 兆あたり100μlを添加し、37℃で15分間染色を行った。その後、FACS 緩衝液 （1x PBS （サーモフィッシャー、 10010031), 2% FBS, 1% EDTA 0.5M （シグマ・アルドリッチ、 E6758)) で1500 rpm （430 x g), 5分で2回細胞を洗浄した。上清を捨て、CD8+ T細胞を300μLのFACSバッファに再懸濁し、FACS装置（FACSLyric, BD Biosciences）で取得した。
事例5：外来性ミトコンドリアのT細胞への移植
健康なドナーから分離したCD8+ T細胞にに移植し、その後培養した場合の外来性ミトコンドリアの取り込みとその用量依存性を調べるために、2つの実験設定が採用された。1つ目はフローサイトメトリーによる実験、2つ目は蛍光顕微鏡による実験である。
手順
(i) T細胞の分離、活性化、培養は、事例2に記載したように行った。
(ii) ミトコンドリアの単離 ヒト心筋線維芽細胞からミトコンドリアを単離した
（HCF）を、先に事例1bに記載したように使用した。単離したミトコンドリアを事例1bのホモジナイジングバッファーに懸濁し、使用するまで氷上に置いておいた。投与量を変化させた場合のミトコンドリア量は、QubitTM 蛍光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック／インビトロジェン）を用いて、QubitTM プロテインアッセイキットを使用し、メーカーの説明書に従って測定した。ミトコンドリアの投与量は、μgで表されるタンパク質含量で推定される。染色した単離ミトコンドリアを用いたT細胞移植は、記載の方法で行った例4b.1。染色したミトコンドリアの集積度は、フローサイトメトリー（例：FACSLyric（BD Biosciences）で取得したデータ）、および移植後5分から24時間までの蛍光顕微鏡（Keyence microscope, BZ-X810）により評価した。
結果
(i) フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡によるミトコンドリアの用量依存的な集積の確認
CD8+ 細胞におけるミトコンドリアの用量依存的な取り込みについて検討して、染色した外来ミトコンドリアを CD8+ T 細胞に 100 万 CD8+ T 細胞あたり 1μg から 30μg の間で投与量を変化させて移植した。CD8+ T 細胞は、上記のように5人の異なるドナーの血液から抽出し、その後、各ドナーについて別々に培養した。ヒト心筋線維芽細胞から外来ミトコンドリアを単離し、事例4b.1に記載したように、ミトトラッカーレッドCMXRosおよびミトトラッカーグリーンFMで染色した。その後、各ドナーのCD8+ T 細胞に、染色した外来ミトコンドリアを、最終容量200μl中、CD8+ T細胞100万個あたり1μg、5μg、10μg、20μg、30μgの用量で処理した。培養4時間後に、Mitotracker Red CMXRosとMitotracker Green FMの発現を、FACSLyric （BD Biosciences） を用いたフローサイトメトリー、およびキーエンス顕微鏡 （BZ-X810） を用いた蛍光顕微鏡により、製造元の指示に従い評価した。図2に示すように、処理したCD8+ T細胞において、ミトトラッカーレッドCMXRosおよびミトトラッカーグリーンFMの明確な用量依存的発現が見られる。CD8+ T 細胞の移植効率は、用量依存的に向上する。ミトコンドリア活性、ミトコンドリア質量ともに、外来ミトコンドリアを投与しなかったCD8+ T細胞と比較して、処理細胞では有意に増加した。10μgのミトコンドリアからスタートした場合、ミトコンドリア活性、ミトコンドリア質量ともに有意に増加することが示された。
事例6：T細胞への外来性ミトコンドリアの移植による増殖性の改善
外因性ミトコンドリアの移植がCD8+T細胞の増殖能に与える影響を評価する実験を行った。具体的には、ミトコンドリア移植後24時間、48時間、72時間、140時間後にT細胞の膨張を評価した。細胞をTrypan Blue solution 0.4% （ThermoFisher, 15250061） で希釈し、生細胞（白）をカウントし、死細胞（青）は解析から除外した。各ドナーについて、30μgのミトコンドリアを投与した対照群と処理群の細胞数の各時点における倍率変化を算出した。外因性ミトコンドリアを移植したCD8+T細胞では、全体的に増殖が促進されることが示された。
手順
(i) 事例2に記載のT細胞の分離、活性化および培養
(ii) 事例1bに記載のミトコンドリア単離ミトコンドリアの単離は無菌状態で行い、全体の膨張率を測定した。
(iii) ミトコンドリア移植：CD8+ T細胞は、ミトコンドリア移植の24時間前に24ウェルプレートに0.5 百万細胞/mLで植え付けた。ミトコンドリアは、事例1bに先に記載したように、ヒト心筋線維芽細胞から単離した。ミトコンドリアが分離された時点で、CD8+ T 細胞を回収し、1500 rpm （430 x g） で 5 分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を新しいT細胞培地に1 百万細胞/100μLの濃度で再懸濁させた。ミトコンドリアは、24ウェルプレートの1ウェルあたり200μLとなるようT細胞に添加した。培養4時間後、新しいT細胞用培地を1.8mLずつ添加した。T細胞培地は、事例2に記載した。T細胞処理用のミトコンドリアは30μgでした。
結果：移植されたCD8+ T細胞の増殖が促進された。
図3に描かれているように、ヒト心筋線維芽細胞由来の外来ミトコンドリアでCD8+ T細胞を処理すると、増殖が有意に改善された。
事例7：ミトコンドリア移植によるCD8+T細胞活性-ポテンシャルへの影響の評価
ミトコンドリア移植が標的細胞のエネルギー代謝と活性ポテンシャルに与える影響を評価するために、ミトストレス試験（アジレントシーホース, P/N 103015-100）を行い、FCCP曝露時の基礎酸素消費率（OCR）と最大OCRを計測した。FCCP（トリフルオロメトキシ-カルボニルシアニド-フェニルヒドラゾン；カルボニルシアニド-4-(トリフルオロメトキシ)-フェニルヒドラゾン） は、ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化を強力に阻害し、電気化学勾配を阻害してATP合成を阻害する物質である。Seahorse XFe96 Analyzer（Vigilant社製）を使用した。
手順
(i) T細胞の分離、活性化および培養は、事例2に記載したように行った。
(ii) ミトコンドリアの単離 事例1bに記載の手順に従い、ヒト心筋線維芽細胞（HCF）からミトコンドリアを単離した。
(iii) 単離したミトコンドリアの定量 ミトコンドリアの投与量は、事例1bに記載の手順に従い、μgで表されるタンパク質含量で推定した。
(iv) 事例3の手順によるT細胞移植。30μgのミトコンドリアをCD8++T細胞に移植した。
(v) 細胞代謝の評価のためのSeahorseアッセイ。移植されたCD8+ T細胞は、供給元の説明書に従ってSeahorse XFe96 Analyzerで分析した（Agilent）。T細胞は、移植の24時間前に0.5 百万細胞/mLでプレーティングし、T細胞100万個あたり30μgの単離ミトコンドリアを添加した。移植4時間後に、組換えIL-2を100U/mL添加した新鮮なT細胞培地を24ウェルプレートの1ウェルに添加した。カートリッジ （Agilent Seahorse, P/N 102416-100） に 250μL の超純水を加え、オーブン （VWR, 390-0384） で 37°C で一晩インキュベートした。アッセイ当日、カートリッジの水和に使用した超純水を250μLのキャリブレート液（Agilent Seahorse, P/N 102416-100）に交換した。細胞培養用マイクロプレート（Agilent Seahorse, P/N 102416-100）のウェルに、PBSで1/50に希釈した50μLのCell-Tak （Corning, 354241）を4℃で一晩コートした。移植後24時間、CD8+ T細胞を200 x gで5分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を数え、Seahorse XF RPMI pH7に再懸濁した。 4（Agilent Seahorse、P/N 103576-100）に10mMグルコース（Agilent Seahorse、103577-100）、2mMグルタミン（Agilent Seahorse、103579-100）および1mMピルビン酸（Agilent Seahorse、103578-100）補足した。細胞培養プレートをPBSで1回洗浄し、CD8+ T細胞を300'000細胞/50μLでプレーティングした。プレートを100 x gで5分間無制限に遠心し、温めたSeahorse XF RPMI pH7.4添加培地を1ウェルあたり130μL加え、37℃、オーブンで1時間培養した。Seahorse XF Mito Stress kit（Agilent Seahorse, P/N 103015-100）の薬剤は、供給元の説明書に従って調製した。オリゴマイシン2μM、FCCP1.5μM、ロテノン/アンチマイシンA0.5μMの最終濃度でカートリッジを充填し、Seahorse XFe96マシンにロードしてキャリブレーションを可能にした。移植したT細胞が入った細胞培養プレートをSeahorse XFe96マシンにセットし、XP細胞Mito Stress Testプログラムを選択した。
結果：処理したCD8+ T細胞は、基礎および最大酸素消費率の増加を示す
シーホース社のXFe96は、CD8+ T細胞の酸素消費率を、ベースライン、オリゴマイシン処理、FCCP処理で経時的に測定するプログラムである。基礎から応用まで Vol.4の基礎酸素消費率はミトコンドリア呼吸を測定し（Gerritje J. W. et al., 免疫学に現在プロトコル 3.16B-1-3.16B 2016年4月14日）、FCCPに対する細胞の反応から、細胞の最大酸素消費能活性度について結論を導き出すことが可能である。図4Aおよび図4Cに示されるように、基礎酸素消費率は、外因性ミトコンドリアで処理されたCD8+T細胞において著しく増強されている。同様に、FCCPへの曝露時の細胞の酸素消費率は、CD8+T細胞へのミトコンドリア移植により著しく増加する-図4Bおよび図4Dに図示されている。
事例8：CD8+ T細胞への外来性ミトコンドリアの移植によるエネルギー代謝の改善
CD8+T細胞に外来ミトコンドリアを移植することによる機能的影響を評価するための実験が行われた。処理した細胞のミトコンドリア・フィットネスは、移植後24時間目に評価した。ミトコンドリア活性と質量は、フローサイトメトリー（例えば、FACSLyric（BD Biosciences））により、それぞれMitotracker Red CMXRos（ThermoFisher、M7512）およびMitotracker Green FM（ThermoFisher、M7514）によって平均蛍光強度で測定した。ミトトラッカーグリーン FMに対するミトトラッカーレッド CMXRosの比率は、CD8+ T細胞内のミトコンドリア質量あたりのミトコンドリア活性を計算し、ミトコンドリア適合性の指標として確立されている（Pendergrass et al.、サイトメトリー部 A 61A：162-169 （2004))。平均蛍光強度はフローサイトメトリー（例：FACSLyric（BD Biosciences））により測定した。CD8+ T細胞を外因性ミトコンドリアで処理することにより、ミトコンドリア体力が向上することが示された。
手順
(i) 事例2に記載のT細胞の分離、活性化および培養
(ii) 事例1bに記載のミトコンドリア単離
(iii) ミトコンドリア移植とミトコンドリア移植後の染色：事例4b.2に記載の手順で行った。
結果 CD8+T細胞におけるミトコンドリアフィットネスの向上
図5Aおよび図5Cに描かれているように、ヒト心筋線維芽細胞由来の外因性ミトコンドリアでCD8+ T細胞を処理すると、ミトコンドリア活性が著しく改善された。一方、外来性ミトコンドリアで処理したCD8+ T細胞では、ミトコンドリア量が有意に減少した図5Bおよび図5D。ミトトラッカーレッドCMXRosの平均蛍光強度とミトトラッカーグリーンFMとの比で組み合わせると、外因性ミトコンドリアで処理したCD8+ T細胞におけるミトコンドリアフィットネスの増強が明らかになった図5E。さらに、ミトコンドリア体力（ミトコンドリア質量に対するミトコンドリア活性の比率）の向上は用量依存的であり、治療群間で有意差があることが示された。
事例9：CD8+T細胞の疲弊に対するミトコンドリア移植の影響評価
CD8+T細胞に外来ミトコンドリアを移植することで、どの程度までT細胞の疲弊を緩和できるかを調べる実験を行った。
手順
(i) 健康なドナーからCD8+ T細胞を分離し、培養した。単離工程については、事例2で説明する。
(ii) CD8+ T細胞は、CD3/CD28ビーズ刺激（サーモフィッシャー、111.32D）を繰り返し、試験管内で人為的に消耗させた。T細胞活性化後3日目に、The Big Easy" EasySep（商標） Magnet （Stemcell, 18001） を用いてCD3/CD28ビーズを除去し、新しいCD3/CD28ビーズをCD8+ T細胞に1対1の割合で添加した。このステップを2日おきに3回連続で繰り返した。T細胞は、供給者の指示に従って、抗ヒトLAG-3 PE/シアニン7（Biolegend、369310）および抗ヒトTIM-3 APC（Biolegend、345012）を用いて、消耗の典型的な兆候に関して経時的に分析した。細胞のサンプルはFACSバッファーで2回洗浄し、300μlに再懸濁した後、フローサイトメーター（FACSLyric, BD Biosciences）で取得した。Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 （ThermoFisher, 111.32D） でCD8+ T細胞を4回刺激したところ、1回だけビーズ刺激を受けたCD8+ T細胞に比べ、T細胞疲弊のマーカーであるLAG-3とTIM-3の発現が過剰になることが示された。腫瘍床での連続的なTCR刺激から救出されたがん患者からのCD8+T細胞を模擬的に採取するため、活性化後10日目に、培養T細胞からCD3/CD28ビーズを除去した。T細胞は活性化後11日目にミトコンドリアを移植し、24時間後にCD8+T細胞をビーズで再刺激し、ACTによる患者への再注入を模倣した。再刺激から48時間後にCD8+ T細胞を採取し、その疲弊表現型をフローサイトメトリー（例えば、FACSLyric（BD Biosciences））により評価した。その後、外因性ミトコンドリアで処理したCD8+ T細胞では、疲弊マーカーの発現が有意に減少した。その結果、ミトコンドリア移植は用量依存的にT細胞の疲弊を緩和する効果があることが確認された。
(iii) T細胞の分離、活性化および培養は、対照細胞について事例2に記載したように行った。事例2に記載の細胞の単離および活性化は、上記段落（ii）に記載の細胞の疲弊に先立って行われた。 ミトコンドリア移植後24時間、移植後72時間の消耗マーカーを測定する前に、CD8+ T細胞の最終的な再刺激を実施した。
(iv) ミトコンドリアの単離：ミトコンドリアを、事例1bに先に記載したように、ヒト心筋線維芽細胞から単離した。単離したミトコンドリアを事例1bのHomogenizing Bufferに懸濁し、使用するまで氷上で保存した。投与量を変化させた場合のミトコンドリア量は、Qubit 蛍光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック／インビトロジェン）を用いて、Qubit プロテインアッセイキットを用い、メーカーの説明書に従い測定した。タンパク質濃度測定のため、ミトコンドリアをPBS（サーモフィッシャー、 10010031）に再懸濁させた。ミトコンドリアの投与量は、μgで表されるタンパク質含量で推定される。
(v) ミトコンドリア移植。CD8+T細胞は、ミトコンドリア移植の24時間前に24ウェルプレートに0.5 百万細胞/mLで植え付けた。ミトコンドリアが分離された時点で、CD8+ T 細胞を回収し、1500 rpm （430 x g） で 5 分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を新しいT細胞培地に1 百万細胞/100μLの濃度で再懸濁させた。ミトコンドリアは、24ウェルプレートの1ウェルあたり200μLとなるようにT細胞に添加した。T細胞に処理するミトコンドリアの量は、10μgから100μgの間で変化させた。ミトコンドリアはCD8+T細胞と共培養し、72時間後に疲弊度パラメータを測定した。
結果 ミトコンドリア移植による疲弊の緩和
1回の刺激のみを受けたLAG-3およびTIM-3はCD8+ T細胞と比較して、4回の刺激にさらされたCD8+ T細胞で図6Aおよび 図6Bに描かれているように過剰発現していた。上記のように、 CD8+ T 細胞1 Millionあたり10μg、30μg、100μgのタンパク質量でミトコンドリアを疲弊したCD8 T細胞に移植した。その後、CD3/CD28ビーズで1対1の割合で細胞を再刺激した。再刺激から48時間後、FACSlyric（BD Biosciences）を採用したフローサイトメトリーにより、メーカーの指示に従い、抗ヒトLAG-3（Biolegend、369310）および抗ヒトTIM-3（Biolegend、345012）を用いて排卵マーカーの発現量を評価した。図6（C-F）に示すように、LAG-3およびTIM-3が有意に減少しており、細胞の疲弊状態が改善されていることが示唆された。この改善は、生体内でがんが誘発する免疫抑制機構に対する耐性が高くなることを予測させるものであると考えられる。表示されたように、発現の差は有意でした。さらに、図6Gに描かれているように、非消耗細胞-すなわち、TIM-3もLAG-3も発現しない CD8+ T 細胞-の割合は、30μgおよび100μgのミトコンドリアの投与量レベルで、有意に増加する。この結果から、外因性ミトコンドリアをT細胞に移植することで、T細胞の疲弊が用量依存的に緩和されることが確認された。
事例10：ミトコンドリア移植に伴う試験管内で誘導されたTreg細胞活性の影響
手順
CD4+T細胞は、健康なドナーのバフィーコートから分離される。末梢血単核細胞（PBMC）は、製造元の指示に従い、Ficoll Paque plus（cytiva, 17144002）を用いた密度勾配遠心分離により採取する。EasySep（商標） Human naive CD4+ T Cell Isolation Kit （Stemcell, 19555） と The Big Easy" EasySep（商標） Magnet （Stemcell, 18001） を用いてPBMCからヒトCD4+ T細胞を採取する。単離したナイーブCD4+ T細胞を、100U/mLの組換えヒトIL-2 （Peprotech, 200-02） の存在下で、Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 （ThermoFisher, 111.32D） で、1対1の割合で活性化している。ナイーブT細胞は、2mM L-アラニル-L-グルタミン（ThermoFisher. 35050061）を添加した無血清X-Vivo 15培地（Lonza, BE02-060F）中で培養される。Treg分化は、培養液に5ng/mLのTGF-β1 （R&D システム, 240-B-002） とDMSOに溶解した10nMのATRA （シグマ・アルドリッチ, R2625） を加えることにより誘導する （Schmidt et al., 「IL-2、TGF-β、レチノイン酸、ラパマイシン、酪酸の組み合わせによるヒトCD4+Foxp3+制御性T細胞誘導プロトコルの比較解析」、 PLOS ONE, 2016). 培養後6日、誘導-トレグ（iTreg）は、製造者の指示に従って、真核ヒトTregフローキット（バイオレジェンド, 320027）を使用して、CD4、CD25、FOXP3の発現を分析する。 iTreg細胞には、細胞100万あたり10μg～100μgの範囲で様々な量のミトコンドリアが移植されている。ITregの抑制機能は、事例2に記載したように、培養T細胞にミトコンドリアを移植した際に評価される。
結果
ミトコンドリアを移植すると、iTregは培養T細胞に対してより強力な抑制機能を示すなど、活性が向上する。
事例11：T細胞の再刺激と増強
ミトコンドリアとの共培養（増強）がT細胞の再刺激・増殖促進などに与える影響を調べている。CD8+T細胞は、再刺激や増強、そのような成長促進を経ても細胞傷害性を維持する。増殖速度の低下が認められる場合には、再刺激／増強が必要な場合がある。
再刺激実験では、96ウェル組織培養プレートの各ウェルに、5×104個の精製T細胞を100-200μLの培地で添加する。細胞は、2mM L-グルタミン、10% FCS/FBS、100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシンを含む上級RPMI Medium 1640でインキュベートされる。あるいは、100 U/mL ペニシリン／ストレプトマイシン を含む Cancer Stem Premium（商標） （ProMab Biotechnologies、カリフォルニア州リッチモンド） を使用することも可能である。ミトコンドリアを細胞に添加し（106-107/well）、37℃の加湿CO2インキュベーターで1-24時間インキュベートする。T細胞活性化には、2μLの予め洗浄し再懸濁したCD3/CD28 Macrobeads（商標） （ProMab）をビーズ対細胞の比率が1：1になるように添加する。活性化されたT細胞は採取され、そのままさらなる分析に使用される。
ミトコンドリアとの共培養により、再刺激および増強後のCD8+T細胞の増殖が改善された。
事例12：ミトコンドリア移植によるCAR-T細胞の殺傷能力の向上
ミトコンドリア移植がCAR-T細胞の殺傷能力に与える影響を評価するために、FACSベースの殺傷アッセイを移植後24時間実施する。CAR-T細胞（CD19-41BB-CD3z、PMC746）はProMab Biotechnologies（Richemond, CA 94806）より購入。アポトーシスの初期メーカー、アポトーシスへの移行中、アポトーシスを発現している標的細胞の割合をそれぞれ測定すること。Annexin V+、AnnexinV+/PI+またはPI+のパーセンテージを評価する。CAR-T細胞は、移植の有無にかかわらず、エフェクターとターゲットの比率が5対1になるように植え付ける。CAR-T細胞は、CD19を発現するBリンパ芽細胞株である標的細胞Daudi（ATCC CCL-213）と4時間コインキュベーションする。共インキュベーション後、細胞を回収し、抗ヒトCD8 PerCP-Cy5.5（Stemcell、60022 PS）および抗ヒトCD3 APC（Stemcell、60011 AZ）を用いて4℃で20分間染色する。FACS緩衝液で洗浄した後、細胞をアネキシンV FITC（Biolegend、640914）およびヨウ化プロピジウム（PI、Biolegend、640914）を用いて、供給業者の指示に従って室温で15分間染色し、FACSLyric（BD Biosciences）で取得する。
手順
(i) CAR-T細胞の培養は、事例2に記載したように行う。
(ii) ミトコンドリアの単離。ミトコンドリアは、事例1bに記載の手順に従って、ヒト心臓線維芽細胞（HCF）から単離される。
(iii) 単離したミトコンドリアの定量 ミトコンドリアの投与量は、事例1bに記載の手順に従い、μgで表されるタンパク質含量で推定される。（iv）事例3の手順によるCAR-T細胞移植。30μgまたは100μgのミトコンドリアをCAR-T細胞に移植する。
ミトコンドリア移植はCAR-T細胞の殺傷能力を高める。移植CAR-T細胞との共培養により、アポトーシス初期マーカー、アポトーシス移行期マーカー、アポトーシス後期マーカーを発現する標的細胞の割合が増加する。
事例13：CAR-T細胞の培養および標識化
ヒト抗CD19scFv-FLAG-CD28-CD3ζ（ProMab）T細胞（CAR T細胞）は、IL-2（10ng/mL, BioLegend, Dedham, MA）を添加した完全X-Vivo 10（Lonza, Morristown, NJ）培地で5×105 細胞/mLの濃度で培養している。CD4+ およびCD8+ サブセットを同定するために、1×105 個のCAR-T細胞をペレット化し、抗ヒトCD4 FITC（Miltenyi Biotec）および抗ヒトCD8 Alexa Fluor 647（BD Biosciences, Billerica, MA）を含む100μLのPBSに再懸濁させる。標識反応は室温、暗黒下で15分間インキュベートされる。その後、細胞をPBSで2回、10% FBS （v/v； ゼンバイオ、リサーチ・トライアングル NC） を含む完全RMPI培地 （サーモフィッシャーサイエンティフィック） で1回リンスする。Raji細胞（ATCC、Manassas、VA）は、ヴィブラント DiD（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で製造者の指示に従い標識している。簡単に説明すると、Raji細胞を5 μL/mLのVybrant DiD溶液を含む無血清RPMIに1 × 106細胞/mLの密度で再懸濁し、37℃で20分インキュベートする。その後、標識された細胞を完全なRMPI培地で3回洗浄し、使用前に4 ℃で保存する。
外因性ミトコンドリアで強化されたCAR Tサンプルを調製するために、96ウェル組織培養プレートの各ウェルに100～200μLの培地でCAR T細胞を添加する。IL-2（10ng/mL、BioLegend）を添加した完全なX-Vivo 10（Lonza）培地中でインキュベートする。ミトコンドリアを細胞に添加し（106-107/well）、37℃の加湿CO2インキュベーターで1-24時間インキュベートする。
事例14：標的腫瘍細胞によるCAR-T細胞の刺激
CAR T細胞のミトコンドリアとの共培養（増強）が腫瘍モデルにおけるCAR T細胞刺激に与える影響を探る。
上記のように外来性ミトコンドリアで強化したCAR-T細胞と、Raji細胞（5×104個/mL濃度）を、丸底ウェルプレートまたは平底プレートで6時間インキュベートする。培養後、共培養細胞を回収し、1000rpm （190 x g）で遠心分離し、残骸や死細胞を除去する。その後、MagCellect （R&D Systems, Minneapolis, MN） を用いたB細胞選択プロトコルを用いて、ポジティブセレクションによりRaji細胞を共培養から分離する。簡単に言えば、CAR-T．Raji細胞共培養を遠心分離し、細胞ペレットを無血清RPMI培地に再懸濁し、抗CD19ビオチン化抗体（BioLegend社）で標識する。製造元のプロトコールに従い、MagCellect Streptavidin Ferrofluid を溶液に加え、製品マニュアルに従って推奨時間インキュベートする。抗CD19ビオチン化Raji細胞に結合したStreptavidin Ferrofluidビーズを磁石で試験管側に集め、CAR-T細胞をピペッティングして反応外に出す。この手順を2回繰り返し、ほとんどのRaji細胞が分離されるようにする。単離したCAR-T細胞をマイクロウェルアレイ装置に加え、mRNAを捕捉し、トランスクリプトームシーケンスを行う。非刺激CAR-T細胞（5×104 細胞/mL）を単独で6時間インキュベートした後、シングルセルRNAシーケンス（scRNA-seq）に供している。
ミトコンドリアで強化したCAR-T細胞は、非強化またはコントロールのCAR-T細胞と比較して、標的細胞と共培養すると、IL-2とIFN-γの両方のmRNA、およびTNF-αとグランザイムBをより高レベルで産生することがわかった。一方、抗原陰性細胞との共培養では、サイトカインmRNAの産生はほとんどない。
事例15：ミトコンドリア移植により、標的細胞存在下でCAR-T細胞の増殖が促進された例
CAR T細胞とミトコンドリアとの共培養（エンハンスメント）が、抗原特異的刺激に対するCAR T細胞の増殖に与える影響について検討した。
抗原特異的な増殖を測定するために、EdU（5-エチニル-2'-デオキシウリジン）を、上記のように外来性ミトコンドリアで強化したCAR-T細胞に、インキュベーション終了点の1時間前に最終濃度10μMとなるように添加した。2-4時間インキュベートした後、300 g、5分間、4℃で遠心分離することにより細胞を回収する。細胞ペレットは、Human Fc blockとともに室温で10分間インキュベートする。細胞表面の染色には、40μLのフローサイトメトリー増殖パネル（CD3、CD4、CD8、アイソタイプコントロール；使用量は使用するコンジュゲートに依存）を加え、4℃、暗所で30分間インキュベートする。細胞は4％パラホルムアルデヒドで15分間室温で固定され、その後Triton X-100ベースの透過化バッファーで広範囲に洗浄される。Click-iT（登録商標） EdU reaction cocktailは、メーカーの説明書に従って調製する。100 μLの透過化バッファーと100 μLのClick-iT（登録商標） EdU reaction cocktailを細胞ペレットに添加する。この混合物をピペッティングして均一な懸濁液にした後、4℃（許容範囲2～8℃）、暗所で30分間インキュベートする。測定された%EdU+ 細胞は、活発に増殖し、DNAを合成している細胞集団であることを示す。
トータルセルラーDNAの染色には、サンプルを透過化バッファーで一度洗浄する。フローサイトメトリーデータ取得の15分前に、DNA染色液（1～20倍希釈、透過化バッファー使用）を細胞に添加する。インキュベーション期間後、200μLの透過化バッファーを細胞に加え、その後、Becton Dickinson （BD） FACSVerse（商標）, BD LSRFORTESSA（商標）, BD FACSCantoTM, BD FACSCaliburTM, BDTM LSR II または ACEA NovoCyte（商標） フローサイトメーターで、FACSuite（商標）、FACSDiva（商標） または NovoExpress（商標）ソフトウェアのいずれかをそれぞれ使用して細胞を分析する。
ミトコンドリアで強化されたCAR-T細胞は、非強化CAR-T細胞やコントロールCAR-T細胞と比較して、標的細胞と共培養した場合に、より高い細胞増殖レベルを実証する。一方、抗原陰性細胞との共培養では、CAR-T細胞の増殖はほとんど見られない。
事例16：サイトカイン放出解析
CAR T細胞とミトコンドリアの共培養（エンハンスメント）が、抗原特異的刺激に応答するCAR T細胞のサイトカイン産生に及ぼす影響について検討した。
上記のように外因性ミトコンドリアで強化された、またはされていないCAR-T細胞を調製し、上記のように刺激する。サイトメトリックビーズアレイヒトTh1/Th2/Th17キット（BD Biosciences）を用いて、各サンプルのIL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNFα, IFN-γ, IL-17A のタンパク質レベルを測定する。サイトカイン標準品は、製造元の指示に従い、凍結乾燥したヒトTh1/Th2/Th17サイトカインを連続希釈して調製したものである。フローサイトメトリーにより、サイトカインレベルを検出する。
ミトコンドリアで強化されたCAR-T細胞は、非強化CAR-T細胞やコントロールCAR-T細胞と比較して、標的細胞と共培養した場合に高いサイトカインレベルを産生する。一方、抗原陰性細胞との共培養では、サイトカインはほとんど生成されない。
事例17：ミトコンドリア移植によるCAR-T細胞の細胞傷害性活性の向上
CAR T細胞とミトコンドリアの共培養（エンハンスメント）が、腫瘍モデルにおけるCAR T細胞の細胞傷害活性に及ぼす影響について検討したものである。
標準的な条件で培養したCD19+ Raji標的細胞を遠心分離で回収し、2回洗浄した後、RPMI-1640培地に再懸濁する。2.5 × 106細胞 を含む1 mL に、カルセイン-AM （ライフテクノロジー） を最終濃度10 μMになるように混合し、37 ℃で30分間インキュベートした。標的細胞をRPMI-1640/10%ウシ胎児血清（FBS）で3回洗浄し、細胞密度を3×105細胞/mLに調整する。Human anti-CD19scFv-FLAG-CD28-CD3ζ （Promab） T細胞は、IL-2 （10 ng/ml, BioLegend） を添加した完全X-Vivo 10 （Lonza） 培地で5×105 細胞/mL の濃度で培養している。CAR-T細胞はペレット化され、新鮮な培地に6×106細胞/mLの密度で再懸濁される。50μLのターゲットと異なる量のエフェクターCAR-T細胞（上記のように調製した外来ミトコンドリアを含むか含まない）を96ウェルマイクロタイタープレートの同じウェルで混合することにより、エフェクター対ターゲット（E：T）細胞比の範囲を提供し、プレートを37℃で4時間インキュベートする。3時間45分のインキュベーション後、20 μL 0.9% Triton X-100をコントロールウェルに加え、標的細胞を完全に溶解させる（maximal lysisと呼ばれる）。各サンプルの上清100 μLを黒のマイクロタイタープレートに移し、Tecan M200プレートリーダーを用いて蛍光（励起：488 nm、発光：518 nm）を記録する。各実験は4重で行われる。CAR-T細胞を含まないサンプルの蛍光強度をバックグラウンドとして差し引き、抗体を持つサンプルの特異的溶解の割合を算出する。ED50値（エフェクター細胞の50％最大殺傷に至る有効量）を決定するために、ソフトウェアプログラムPRISM（GraphPad、San Diego、CA）を用いて、非線形回帰分析および3パラメータフィットモデル「log [agonist] vs. response」によって用量反応曲線をする。
あるいは、貫通 LDH細胞毒性測定キット （サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて細胞毒性を評価する。エフェクター細胞とターゲット細胞は、1：1、5：1、10：1の3つの比率で混合される。標的細胞とエフェクター細胞は、最終濃度7 × 105 細胞/mLの完全RPMI培地中で6時間インキュベートされる。LDHの放出量は、製造元の指示に従い、上清で測定される。付属の10×ライシスバッファーで標的細胞をインキュベートすることにより、LDHの最大放出量を得ることができる。標的細胞の細胞毒性は、以下の式で算出する：細胞毒性％＝100×［（CAR-T：標的細胞 CAR-T細胞単独標的細胞単独）／（最大標的細胞溶解標的細胞単独溶解バッファーなし）］。
ミトコンドリアで強化されたCAR-T細胞は、非強化CAR-T細胞やコントロールCAR-T細胞と比較して、標的細胞と共培養した場合に高い細胞毒性（低いED50 値）を示すことが確認された。一方、抗原陰性細胞との共培養では、ほとんど細胞は死滅しない。
事例18：ミトコンドリア移植によるCAR-T細胞の生体内における抗腫瘍活性の向上
抗CD19 CAR-T構築物（抗CD19scFv-FLAG-CD28-CD3ζ、プロマブ）を発現するヒトT細胞を、外因性ミトコンドリアで強化するかしないか、B細胞リンパ腫のマウス異種移植モデルで評価したものである。
リンパ腫モデル
9週齢の雌性NOD/SCIDマウス（非肥満性糖尿病；T細胞、マクロファージおよびNK細胞の欠損；Taconic社、デンマーク）にヒトバーキットリンパ腫CD19+Raji細胞（2.5×106 個/マウス）を皮下（s.c. ）注射する。腫瘍の大きさが60-100mm3に達した時点で、動物を治療群に無作為に割り付ける。腫瘍の大きさが等しい1群5-8匹のマウスを治療に選ぶ。模擬T細胞、抗CD19 CAR-T細胞、ミトコンドリア強化抗CD19 CAR-T細胞、107個のi.v.注射を受けた。ノギスのような器具で腫瘍の大きさを二次元的に測定する。個々の腫瘍体積（V）は、V=0.56×（縦＋横）2という式で算出される。腫瘍体積が1,500mm3という人道的エンドポイントに達した時点で、動物を頸椎脱臼により犠牲にする。カプランマイヤー生存プロットはソフトウェアプログラムPRISM（GraphPad）を用いて作成し、生存曲線はlog-rank（Mantel-Cox）検定を用いて比較した。
白血病モデル
ジャクソン・ラボラトリーズから購入した8週齢の雄のNSG（NOD/SCID ガンママウス；T細胞、B細胞およびNK細胞の欠損）マウスを滅菌ケージに入れ、ビバリウムで飼育している。Raji/Luc-GFP細胞（106個）を100 μL PBSに溶解し、インシュリン注射器を用いて側尾静脈からi.v.注入する（日0とする）。6日目にルシフェラーゼ活性を生物発光イメージングで測定し、腫瘍の負担を評価する。7日目に、1007個のモック導入T細胞、抗CD19 CAR-T細胞、またはミトコンドリア強化抗CD19 CAR-T細胞を100 μL PBSで調製し、インシュリン注射器を用いてi.v.注射する。腫瘍の進行は、IVISイメージングシステムを用いたバイオルミネッセンスイメージングによってモニターされる。60日目に生存マウスを安楽死させ、脾臓および骨髄細胞を採取し、総量2mLのフローサイトメトリー（FACS）バッファー（PBS、2％FCS添加）に再懸濁させる。その後、200マイクロリットルの細胞懸濁液をPE-抗huCD3抗体およびAPC-抗huCD45抗体で標識し、フローサイトメトリーで解析して、ヒトT細胞の割合を決定する。
ミトコンドリアで強化されたCAR-T細胞は、強化されていないCAR-T細胞やコントロールのCAR-T細胞と比較して、治療したマウスにおいて高い抗腫瘍活性（生存期間中央値の延長）を示した。
参照による組み込み
本明細書で引用したすべての特許および非特許文献の開示内容は、それぞれすべての目的のために参照により全体が組み込まれるものとする。
他の実施形態
上記の開示は、独立した有用性を有する複数の異なる発明を包含する場合がある。これらの発明は、それぞれ好ましい形態で開示されているが、多数の変形が可能であるため、ここに開示および図示されているようなその具体的な実施形態は、限定的な意味において考慮されるべきものではない。本発明の主題は、本明細書に開示された様々な要素、特徴、機能、や特性のすべての新規かつ非自明な組み合わせおよび下位の組み合わせを含むものである。以下の特許請求の範囲では、新規かつ非自明とみなされる特定の組み合わせおよび下位の組み合わせが特に指摘されている。特徴、機能、要素、や特性の他の組み合わせおよび下位組み合わせで具体化された発明は、本出願、本出願から優先権を主張する出願、または関連出願で請求される場合がある。このような請求項も、異なる発明を対象とするか、同一の発明を対象とするか、また、元の請求項と比較して、範囲が広いか、狭いか、等しいか、異なるかを問わず、本開示の発明の対象に含まれるものとみなされる。

Claims (84)

  1. 単離された生存ミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞と比較して、ヒト免疫細胞の生存、活性、またはそれらの組み合わせを増強するのに有効な量で、薬学的に許容される担体中に製剤化された、単離された生存ミトコンドリア
    を含む、医薬組成物。
  2. 前記ミトコンドリアが、真核細胞のミトコンドリアを含む、請求項1に記載の組成物。
  3. 前記ミトコンドリアが、ヒト細胞株に由来する、請求項1または2に記載の組成物。
  4. 前記ミトコンドリアが、健常ドナーに由来する、請求項1または2に記載の組成物。
  5. 前記ミトコンドリアが、患者に由来する、請求項1または2に記載の組成物。
  6. 前記患者が、癌患者である、請求項5に記載の組成物。
  7. 前記薬学的に許容される担体が、ヒト免疫細胞への送達のために製剤化されている、請求項1～6のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記ヒト免疫細胞が、自己由来である、請求項7に記載の組成物。
  9. 前記ヒト免疫細胞が、同種異系である、請求項7に記載の組成物。
  10. 前記ヒト免疫細胞が、T細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記ヒト免疫細胞が、CD8 T細胞またはCD4 T細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記免疫細胞が、キメラ抗原受容体（「CAR」）もしくは人工T細胞受容体（「TCR」）サブユニットまたはそれらの組み合わせを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 単離された生存ミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞の基礎酸素消費率（OCR）と比較して、ヒト免疫細胞の基礎酸素消費率（OCR）を向上させるのに有効な量で、薬学的に許容される担体中で製剤化された、単離された生存ミトコンドリア
    を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 単離された生存ミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞と比較して、ヒト免疫細胞の最大酸素消費率（OCR）を向上させるのに有効な量で、薬学的に許容される担体中で製剤化された、単離された生存ミトコンドリア
    を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 単離された生存ミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞と比較して、ヒト免疫細胞の拡大を増強するのに有効な量で、薬学的に許容される担体中で製剤化された、単離された生存ミトコンドリア
    を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 単離された生存ミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞と比較して、ヒト免疫細胞の代謝活性を増強するのに有効な量で、薬学的に許容される担体中で製剤化された、単離された生存ミトコンドリア
    を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  17. ヒト免疫細胞の生存を増強するのに有効な量で、薬学的に許容される担体中で製剤化された、単離された生存ミトコンドリア
    を含み、
    単離された生存ミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞と比較して、細胞の消耗を低減することによって前記生存が増強されている、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 外来性ミトコンドリアを含むヒト幹細胞または免疫細胞であって、
    前記外来性ミトコンドリアが、免疫細胞の生存、活性、またはそれらの組み合わせを増強するのに有効な量で、前記ヒト幹細胞またはヒト免疫細胞中に存在する、
    ヒト幹細胞または免疫細胞。
  19. 前記幹細胞が、胚性幹細胞である、請求項18に記載のヒト幹細胞。
  20. 前記幹細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項18に記載のヒト幹細胞。
  21. 前記免疫細胞が、多能性幹細胞由来の免疫細胞である、請求項18に記載のヒト免疫細胞。
  22. 前記免疫細胞が、Tリンパ球である、請求項18または21に記載のヒト免疫細胞。
  23. 前記Tリンパ球が、CD8 T細胞である、請求項22に記載のヒト免疫細胞。
  24. 前記Tリンパ球が、CD4 T細胞またはTreg細胞である、請求項22に記載のヒト免疫細胞。
  25. 前記免疫細胞が、ナチュラルキラー（NK）細胞である、請求項18または21に記載のヒト免疫細胞。
  26. 前記免疫細胞が、単球またはマクロファージである、請求項18または21に記載のヒト免疫細胞。
  27. 前記免疫細胞が、好中球である、請求項18または21に記載のヒト免疫細胞。
  28. 前記免疫細胞が、Bリンパ球である、請求項18または21に記載のヒト免疫細胞。
  29. 前記幹細胞または免疫細胞が、キメラ抗原受容体（「CAR」）および／または人工T細胞受容体（「TCR」）サブユニットを含む、請求項18～28のいずれか一項に記載のヒト幹細胞または免疫細胞。
  30. 前記幹細胞または免疫細胞が、
    CARまたは人工TCRサブユニットをコードするDNA、二本鎖RNA、一本鎖mRNA、および環状RNAベクターからなる群より選択される外来性ポリヌクレオチド
    を含み、
    任意で、前記外来性ポリヌクレオチドが、前記幹細胞または免疫細胞のゲノムに組み込まれている、
    請求項29に記載のヒト幹細胞または免疫細胞。
  31. 前記CARが、以下：
    a.抗原結合ドメイン；
    b.スペーサードメイン；
    c.膜貫通ドメイン；
    d.任意で、コスティミュレイトリードメイン；および
    e.細胞内シグナル伝達ドメインであって、任意で、細胞内T細胞シグナル伝達ドメインである、前記細胞内シグナル伝達ドメイン
    を含む、請求項29または30に記載の幹細胞または免疫細胞。
  32. 前記CARが、以下：
    a.第1の抗原に特異的な抗原結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、およびコスティミュレイトリードメインおよび／または細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン
    を含む、第1のCAR；
    b.切断可能なドメイン；ならびに
    c.第2の抗原に特異的な抗原結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、およびコスティミュレイトリードメインおよび／または細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン
    を含む、第2のCAR
    を含む、請求項29または30に記載の幹細胞または免疫細胞。
  33. 前記コスティミュレイトリードメインが、CD28、4-1BB、OX40、CD27、ICOS、GITR、CD40、CD2、SLAM、およびそれらの組み合わせの群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の幹細胞または免疫細胞。
  34. 前記細胞内T細胞シグナル伝達ドメインが、CD3ζ（ゼータ）、OX40、CD27、ICOS、およびそれらの組み合わせから選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の幹細胞または免疫細胞。
  35. 前記スペーサードメインが、CH2-CH3、CD28、CD8、またはそれらの組み合わせから選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の幹細胞または免疫細胞。
  36. 前記CARが、少なくとも2つの異なる抗原に特異的な抗原結合ドメインを含む多特異的CARである、前記請求項のいずれか一項に記載の幹細胞または免疫細胞。
  37. 前記人工TCRが、TCRα（アルファ）、TCRβ（ベータ）、TCRγ（ガンマ）、およびTCRδ（デルタ）サブユニットからなる群より選択される1つまたは複数のサブユニットを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の幹細胞または免疫細胞。
  38. 前記CARまたは人工TCRサブユニットが、細胞表面上に存在する、前記請求項のいずれか一項に記載の幹細胞または免疫細胞。
  39. 前記幹細胞または免疫細胞が、同種または自己由来の幹細胞または免疫細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載の幹細胞または免疫細胞。
  40. 前記免疫細胞が、または間葉系幹細胞または人工多能性幹細胞（iPSC）を含む幹細胞から産生される、前記請求項のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  41. 前記幹細胞が、標的細胞に対する増殖および細胞溶解活性が増強されている、請求項18～20、および、請求項29～39のいずれか一項に記載の幹細胞。
  42. 外来性ミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞と比較して、前記免疫細胞が、細胞溶解活性が増強されている、請求項18、および、請求項21～40のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  43. 外来性ミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞と比較して、前記免疫細胞が、基礎酸素消費率（OCR）が向上している、請求項18、および、請求項21～40のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  44. 外来性ミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞と比較して、前記免疫細胞が、最大酸素消費率（OCR）が向上している、請求項18、および、請求項21～40のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  45. 外来性ミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞と比較して、前記免疫細胞が、代謝活性が増強されている、請求項18、および、請求項21～40のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  46. 外来性ミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞と比較して、前記免疫細胞が、拡大活性が増強されている、請求項18、および、請求項21～40のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  47. 前記免疫細胞が、生存が増強されており、
    外来性ミトコンドリアを含まないヒト免疫細胞と比較して、免疫細胞の消耗を低減することによって前記生存が増強されている、請求項18、および、請求項21～40のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  48. 癌、感染症、炎症性疾患または自己免疫疾患を治療するための、進行請求項のいずれか一項に記載のヒト幹細胞または免疫細胞。
  49. 請求項18～48のいずれか一項に記載の幹細胞または免疫細胞をそれぞれ含む、幹細胞または免疫細胞の集団。
  50. 免疫細胞の前記集団が、NK細胞、NKT細胞、マクロファージ、α／βT細胞、γ／δT細胞、Treg細胞、好中球またはそれらの組み合わせを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。
  51. 免疫細胞の前記集団が、CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、もしくはCD8+ T細胞、またはそれらの組み合わせを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。
  52. 前記CARまたは人工TCRサブユニットが、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスナノ粒子、またはターゲティング部位に作動可能に接続されたナノ粒子を用いて幹細胞または免疫細胞に導入される、前記請求項のいずれか一項に記載の幹細胞または免疫細胞の集団。
  53. 前記CARおよび／または人工TCRサブユニットをコードする外来性ポリヌクレオチドが、インビトロで幹細胞または免疫細胞に導入される、前記請求項のいずれか一項に記載の幹細胞または免疫細胞の集団。
  54. その必要のあるヒト対象において癌を治療するのに有効な量で前記集団が医薬組成物中に製剤化されている、前記請求項のいずれか一項に記載の幹細胞または免疫細胞の集団。
  55. 免疫細胞の前記集団が、外来性ミトコンドリアを欠く同等の免疫細胞の集団よりも効果的に、かつ／またはより長く腫瘍細胞を殺傷する、前記請求項のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。
  56. 幹細胞または免疫細胞の前記集団が、以下の群：
    B細胞成熟抗原（BCMA、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー17、TNFRSF17としても知られる)、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1（CD2サブセット1、CRACC、SLAMF7、CD319、および19A24とも呼ばれる)、C型レクチン様分子-1（CLL-1またはCLECL 1)、CD33、上皮成長因子受容体バリアントIII（EGFRvIII)、ガングリオシドG2（GD2)、ガングリオシドGD3、Tn抗原（Tn AgまたはGalNAca-Ser/Thr)、前立腺特異的膜抗原（PSMA)、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1)、Fms様チロシンキナーゼ3（FLT3)、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72)、CD38、CD44v6、癌胎児性抗原（CEA)、上皮細胞接着分子（EpCAM)、B7H3（CD276)、KIT（CD117)、インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2（IL-13 Rα2またはCD213A2);メソテリン、インターロイキン11受容体アルファ（IL-11Ra)、前立腺幹細胞抗原（PSCA)、プロテアーゼセリン21（TestisinまたはPRSS21)、血管内皮成長因子受容体2（VEGFR2)、ルイスY抗原、CD24、血小板由来成長因子受容体ベータ（PDGFR-ベータ)；ステージ特異的胚性抗原-4（SSEA-4)；CD20；葉酸受容体アルファ；受容体チロシン-タンパク質キナーゼERBB2（Her2/neu)；ムチン1、細胞表面関連（MUC1)；上皮成長因子受容体（EGFR)；神経細胞接着分子（NCAM);プロスターゼ；前立腺酸性ホスファターゼ（PAP);伸長因子2変異（ELF2M)；エフリンB2；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（FAP)；インスリン様成長因子1受容体（IGF-I受容体)、炭酸脱水酵素IX（CAIX)；プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、ベータ型、9（LMP2)；糖タンパク質100（gp100)；切断点クラスター領域からなる癌遺伝子融合タンパク質（BCR）およびAbelsonマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ1（Abl)(bcr-abl)；チロシナーゼ；エフリンタイプA受容体2（EphA2)；フコシルGM1；シアリルルイス接着分子（sLE)；ガングリオシドGM3（aNeu5Ac（2-3）bDG alp（1-4）bDGlcp（1-1）Cer)；トランスグルタミナーゼ5（TGS5);高分子量メラノーマ関連抗原（HMWMAA)；o-アセチル-GD 2ガングリオシド（OAcGD2)；葉酸受容体β；腫瘍内皮マーカー1（TEM1/CD248)；腫瘍内皮マーカー7関連（TEM7R)；クローディン6（CLDN6)；甲状腺刺激ホルモン受容体（TSHR)；Gタンパク共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D)；染色体Xオープンリーディングフレーム61（CXORF61)；CD97；CD179a；未分化リンパ腫キナーゼ（ALK)；ポリシアル酸；胎盤特異的1（PLAC1)；globoHグリコセラミド（GloboH）の六糖部分；乳腺分化抗原（NY-BR-1);ウロプラキン2（UPK2)；A型肝炎ウイルス細胞受容体1（HAVCR1)；アドレナリン受容体β3（ADRB3)；パネキシン3(PANX3)；Gタンパク質共役受容体20 （GPR20); リンパ球抗原6複合体、ローカスK 9 （LY6K); 嗅覚受容体51 E 2 （OR 51 E 2);TCRガンマ代替リーディングフレームタンパク質 （TARP);ウィルムス腫瘍タンパク質（WT 1);癌/精巣抗原1 （NY-ESO-1);癌/精巣抗原2 （LAGE-la); メラノーマ関連抗原1 （MAGE-A 1);染色体12 pに位置するETS転座バリアント遺伝子6 （ETV 6-AML);精子タンパク質17 （SPA 17); X抗原ファミリー、メンバー1A（XAGE1）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体2（Tie 2）；メラノーマ癌精巣抗原-1（MAD-CT-1）；メラノーマ癌精巣抗原-2（MAD-CT-2）；Fos関連抗原1；腫瘍タンパク質p53（p53）；p53突然変異体；プロステイン；サバイビング；テロメラーゼ；前立腺癌腫腫瘍抗原-1（PCTA-1またはガレクチン8）、T細胞によって認識されるメラノーマ抗原1（MelanAまたはMART1）、ラット肉腫（Ras）変異体、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）、肉腫転座ブレークポイント、メラノーマアポトーシスインヒビター（ML-IAP)；ERG（トランスメンブランプロテアーゼ、セリン2（TMPRSS2）ETS融合遺伝子)；N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV（NA17);ペアードボックスプロテインPax-3（PAX3)；アンドロゲン受容体；サイクリンB1；v-mycトリ骨髄球腫症ウイルスオンコジーン神経芽細胞腫由来ホモログ（MYCN)；RasホモログファミリーメンバーC（RhoC)；チロシナーゼ関連プロテイン2（TRP-2)；シトクロムP450 1B1（CYP1B1)；CCCTC結合因子（ジンクフィンガープロテイン）様（BORISまたはインプリンティング部位の調節因子の同類)、T細胞によって認識される扁平上皮細胞癌腫抗原3（SART3)；ペアードボックスプロテインPax-5（PAX5)；プロアクロシン結合プロテインsp32（OY-TES1)；リンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ（LCK)；キナーゼアンカープロテイン4（AKAP-4)；滑膜肉腫、Xブレークポイント2（SSX2)；高度糖化最終産物受容体（RAGE-1)；腎ユビキタス1（RU1)；腎ユビキタス2（RU2)；レグマイン；ヒト乳頭腫ウイルスE6(HPV E6)；ヒト乳頭腫ウイルスE7(HPV E7)；腸管カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質70-2変異体（mut hsp70-2）；CD79a；CD79b；CD72；白血球関連免疫グロブリン様受容体1（LAIR1）；IgA受容体Fcフラグメント（FCARまたはCD89）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2（LILRA2）；CD300分子様ファミリーメンバーf（CD300LF）；C型レクチンドメインファミリー12メンバーA（CLEC12A)；骨髄間質細胞抗原2（BST2）；EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2（EMR2）；リンパ球抗原75（LY75）；グリピカン3（GPC3）；Fc受容体様5（FCRL5）；および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド1（IGLL1）
    から選択される抗原に特異的な抗原結合ドメインを含むCARまたは人工TCRサブユニットを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の幹細胞または免疫細胞の集団。
  57. 以下のステップを含む、幹細胞または免疫細胞の集団を増強する方法：
    a.リンパ球の活性化を促進することができる特異的活性化受容体アゴニスト抗体を用いて、インビトロで無細胞培地中で幹細胞または免疫細胞を活性化すること；
    b.単離された生存ミトコンドリアを含む組成物に前記幹細胞または免疫細胞を曝露し、それによって幹細胞または免疫細胞の前記集団を拡大させること；および
    c.前記幹細胞または免疫細胞に、CARまたは人工TCRサブユニットをコードする外来性ポリヌクレオチドを導入すること。
  58. 幹細胞または免疫細胞の前記集団が、ステップa.～c.の前に、CARまたは人工TCRサブユニットを発現している、請求項57に記載の方法。
  59. 前記ステップb.が、
    単離された生存ミトコンドリアを含む組成物に前記免疫細胞を曝露し、それによって幹細胞または免疫細胞の前記集団の代謝活性を増強すること
    を含む、請求項57または58に記載の方法。
  60. 前記ステップb.が、
    単離された生存ミトコンドリアを含む組成物に前記免疫細胞を曝露し、それによって幹細胞または免疫細胞の前記集団の生存を増強すること
    を含む、請求項57または58に記載の方法。
  61. 前記幹細胞または免疫細胞が、以下の群：
    血液およびその他の生体起源の液体試料、固体組織試料、そこから由来する細胞およびその子孫の組織培養物、生体試料からの単離細胞
    から選択される生体試料に由来する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記特異的リンパ球活性化受容体アゴニストが、細胞模倣無細胞支持体にコンジュゲートされている、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記細胞模倣支持体が、常磁性ビーズである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記ベクターが、ウイルスベクターである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはハイブリッドベクターに由来する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記請求項のいずれか一項に記載の幹細胞もしくは免疫細胞、または幹細胞もしくは免疫細胞の集団を含む、癌、感染症、炎症性疾患、または自己免疫疾患を治療するための医薬組成物。
  67. 前記組成物が、可溶状態で調製される、前記請求項のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  68. 前記幹細胞または免疫細胞が、生存真核細胞から産生される、前記請求項のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  69. 前記幹細胞または免疫細胞が、自己細胞移植または同種細胞移植の方法によって製造される、前記請求項のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  70. 同種細胞移植の方法が、以下を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の医薬組成物：
    a.ドナーから生存血液試料を得ること；
    b.ステップ（a）で得られた血液試料から、幹細胞または免疫細胞を分離すること；
    c.CARまたは人工TCRサブユニットをコードする1つまたは複数の外来性ポリヌクレオチドで、前記免疫細胞に形質導入すること；
    d.任意で、前記幹細胞または免疫細胞を、前記請求項のいずれか一項に記載の小分子と接触させること；および
    e.改変された前記幹細胞または免疫細胞を、その必要のある対象に投与すること。
  71. 自己細胞移植の方法が、以下を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の医薬組成物：
    a.必要な対象から採取した生存血液試料を得ること；
    b.ステップ（a）で得られた血液試料から、幹細胞または免疫細胞を分離すること；
    c.CARまたは人工TCRサブユニットをコードする1つまたは複数の外来性ポリヌクレオチドで、前記免疫細胞に形質導入すること；
    d.任意で、前記幹細胞または免疫細胞を、前記請求項のいずれか一項に記載の小分子と接触させること；および
    e.改変された前記免疫細胞を対象に再導入すること。
  72. その必要のあるヒト対象において癌を治療するのに有効な量の、前記請求項のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  73. 前記請求項のいずれか一項に記載の幹細胞もしくは免疫細胞、または幹細胞もしくは免疫細胞の集団を対象に投与することを含む、その必要のある対象を治療する方法。
  74. 前記幹細胞または免疫細胞の活性が、請求項1～17のいずれか一項に記載のミトコンドリアを含む医薬組成物のインビボ共投与によってブーストされ、
    任意で、医薬組成物の前記共投与が、前記幹細胞または免疫細胞の投与の前に、前記幹細胞または免疫細胞の投与と同時に、および／または前記幹細胞または免疫細胞の投与の後に行われる、
    請求項73に記載の治療方法。
  75. 前記医薬組成物が、患者への静脈内注入によって前記免疫細胞と共投与される、請求項73または74に記載の治療方法。
  76. 前記医薬組成物が、腫瘍内注射により前記免疫細胞と共投与される、請求項73または74に記載の治療方法。
  77. 前記医薬組成物が、臓器内注射により、または臓器特異的血管系を介して免疫細胞と共投与される、請求項73または74に記載の治療方法。
  78. 幹細胞もしくは免疫細胞、または幹細胞もしくは免疫細胞の集団、および単離された生存ミトコンドリアを共投与することを含む、その必要のある対象の治療方法であって、
    任意で、単離された生存ミトコンドリアが、請求項1～17のいずれか一項に記載の医薬組成物に含まれる、
    方法。
  79. 前記単離された生存ミトコンドリアの共投与が、前記幹細胞または免疫細胞の投与の前に、前記幹細胞または免疫細胞の投与と同時に、および／または前記幹細胞または免疫細胞の投与の後に行われる、請求項73に記載の方法。
  80. 対象が、以下の群：
    急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、胞巣状横紋筋肉腫、膀胱癌（例えば、膀胱の癌腫）、骨癌、脳癌（例えば、膠芽腫）、乳癌、肛門、肛門管、または肛門直腸の癌、眼球の癌、肝内胆管癌、関節癌、首、胆嚢、または胸膜の癌、鼻、鼻腔、または中耳の癌、口腔の癌、外陰部の癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性癌、大腸癌、食道癌、子宮頸癌、線維肉腫、胃腸カルチノイド腫瘍、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌）、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、白血病、液状腫瘍、肝臓癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌、および肺腺癌）、リンパ腫、中皮腫、肥満細胞腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、B型慢性リンパ性白血病、ヘアリーセル白血病、バーキットリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、腹膜網、および腸間膜の癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟部組織癌、固形腫瘍、滑膜肉腫、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、ならびに尿管癌
    から選択される癌を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の対象の治療方法。
  81. 薬学的に許容される担体中で製剤化される前の前記生存ミトコンドリアが、以下のステップ：
    (i)培養細胞、組織または臓器からサブチリシンAを用いることによってミトコンドリアを単離すること
    を含む単離方法を用いることによって予め単離されている、請求項1～17のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  82. 薬学的に許容される担体中で製剤化される前の前記生存ミトコンドリアが、以下のステップ：
    (i)ミトコンドリアを1つまたは複数のフィルターを通して濾過すること；または
    (i)培養細胞、組織または臓器からサブチリシンAを用いることによってミトコンドリアを単離すること、その後、
    (ii)前記ミトコンドリアを1つまたは複数のフィルターを通して濾過すること
    を含む単離方法を用いることによって予め単離されている、請求項1～17のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  83. 請求項18～48のいずれか一項に記載の外来性ミトコンドリアを含むヒト幹細胞または免疫細胞であって、
    前記ミトコンドリアが、前記ヒト幹細胞または免疫細胞に移植される前に、以下のステップ：
    (i)培養細胞、組織または臓器からサブチリシンAを用いることによってミトコンドリアを単離すること
    を含む単離方法を用いることによって予め単離されている、ヒト幹細胞または免疫細胞。
  84. 請求項18～48のいずれか一項に記載の外来性ミトコンドリアを含むヒト幹細胞または免疫細胞であって、
    前記ミトコンドリアが、前記ヒト幹細胞または免疫細胞に移植される前に、以下のステップ：
    (i)ミトコンドリアを1つまたは複数のフィルターを通して濾過すること；または
    (i)培養細胞、組織または臓器からサブチリシンAを用いることによってミトコンドリアを単離すること、その後、
    (ii)前記ミトコンドリアを1つまたは複数のフィルターを通して濾過すること
    を含む単離方法を用いることによって予め単離されている、ヒト幹細胞または免疫細胞。
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