CN116082523A - 一种靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及一种靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体及其应用。本发明以Claudin18.2蛋白为靶点，制备靶向Claudin18.2的纳米抗体，并进一步获得人源化纳米抗体，构建二代CAR质粒载体，通过分离T细胞，用编码CAR的慢病毒载体进行编程，从而获得一种表达靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，经试验验证，其能够特异性识别和清除Claudin18.2阳性肿瘤细胞，特别适用于胃癌的治疗，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及一种靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
胃癌是全球癌症相关死亡的第三大原因，每年约有100万新确诊病例。尽管手术技术进步很大，化疗方案也有很大改进，但晚期胃癌患者的5年生存率约为5％-20％，中位总生存期(OS)约为10个月。大部分胃癌患者确诊时，病情已经进入中晚期，手术后效果极不理想，且预后极差，是临床上极为棘手的恶性肿瘤。因此，迫切需要开发延长治疗胃癌患者生命的策略。
细胞间紧密连接是一种跨膜蛋白复合体，紧密连接的稳定需要几种不同蛋白的协调活动来维持，而Claudin蛋白是保证紧密连接渗透性具有特异性的主要蛋白。迄今在哺乳动物中已发现27个Claudin家族成员。Claudin蛋白家族分子量为20～27KD，结构中包括4个跨膜区域、两个细胞外环和一个细胞内环，其N端和C末端在胞浆内。两个细胞外环使其成为理想的抗体靶点。Claudin蛋白是构成紧密连接结构的骨架蛋白，位于相临细胞间隙顶侧，其分布具有组织器官特异性，功能主要为细胞间粘附、维持细胞极性、调节细胞旁通透性及参与细胞增殖、分化调节。Claudin18蛋白分子量约为26KD，Claudin18基因具有2个不同的第一外显子，可以通过选择性剪切使Claudin蛋白变成具有不同特性的Claudin亚型：Claudin18.1和Claudin18.2。Claudin18.1和Claudin18.2的第一胞外结构域之间虽然只有八个氨基酸的差异，但表达分布却不同，Claudin18.1在正常肺和胃的上皮中选择性表达，Claudin18.2只在短暂分化的胃上皮细胞上表达，在任何其他正常人器官中完全检测不到，但是Claudin18.2在多种恶性肿瘤中有显著上调，包括80％的胃肠道腺瘤、60％的胰腺肿瘤、30％食道癌以及25％非小细胞肺癌。在肿瘤中，细胞间的紧密连接遭到破坏，Claudin18.2无法发挥其正常功能。生存分析表明，胃癌中Claudin18表达减少与晚期患者的预后差有关，认为Claudin18表达减少是胃癌患者预后不佳的因素。因此，Claudin18.2是一个合适的肿瘤治疗靶标。
Ganymed Pharmaceuticals AG已开发出针对CLDN18.2的IgG1嵌合抗体IMAB362。IMAB362以高亲和力和特异性识别CLDN18.2的第一胞外结构域(ECD1)。IMAB362不与任何其它密蛋白家族成员结合，包括紧密相关的密蛋白18剪接变体1(CLDN18.1)。IMAB362表现出精确的肿瘤细胞特异性，并且组合了四中独立的高度有效的作用机制。靶标结合后，IMAB362通过ADCC、CDC、诱导通过肿瘤细胞表面上的靶标交联诱导的凋亡以及直接一直增殖来介导细胞杀伤。因此，IMAB362有效裂解CLDN18.2阳性细胞，包括体外和体内的人胃癌细胞系。具有CLDN18.2阳性癌细胞系的小鼠具有生存益处，并且当用IMAB362处理时，多至40％的小鼠表现出其肿瘤的退化。
细胞治疗是一种新兴的、具有显著疗效的疾病治疗模式。本领域技术人员一直致力于开发新的细胞免疫疗法，以提高细胞免疫疗法的效果，并降低其副作用。表达嵌合抗原受体的T细胞在治疗恶性血液病方面表现出了显著的疗效，为肿瘤治疗提供了广阔的前景。嵌合抗原受体T细胞(简称CART或CAR-T)是从患者体内分离出T细胞，在体外利用嵌合抗原受体(CAR)修饰T细胞，使其能够特异性识别癌细胞，然后再将改造后的CART细胞扩增、回输至患者体内，达到治疗肿瘤的效果。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提供一种靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体及其应用。本发明以Claudin18.2蛋白为靶点，制备靶向Claudin18.2的纳米抗体，并进一步获得人源化纳米抗体，构建二代CAR质粒载体，通过分离T细胞，用编码CAR的慢病毒载体进行编程，从而获得一种表达靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，经试验验证，其能够特异性识别和清除Claudin18.2阳性肿瘤细胞，特别适用于胃癌的治疗。基于上述研究成果，从而完成本发明。
为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体，其至少包含抗原结合域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中，所述抗原结合域含有抗Claudin18.2单域抗体；
其中，所述抗Claudin18.2单域抗体的氨基酸序列选自：
a1)如SEQ ID NO.3、5、7、14、16、18、20、22、24所示的氨基酸序列；或，
a2)与SEQ ID NO.3、5、7、14、16、18、20、22、24任一项序列具有≥80％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO.3、5、7、14、16、18、20、22、24所示的序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列；该氨基酸序列仍然具有能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合Claudin18.2和诱导T细胞信号传导功能。
本发明的第二个方面，提供一种多聚核苷酸，其能编码如第一方面所述的嵌合抗原受体。
本发明的第三个方面，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含第二方面所述的核苷酸。
本发明的第四个方面，提供一种工程化的免疫细胞，所述免疫细胞为T细胞，具体的，所述T细胞是由上述靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。所述T细胞为CAR-T细胞。本发明所采用的针对Claudin18.2的CAR-T技术，是一种综合肿瘤单克隆抗体的免疫治疗和肿瘤的过继免疫治疗优点的靶向治疗技术。本发明为Claudin18.2表达相关肿瘤特别是胃癌的CAR-T治疗提供了新的治疗手段。
本发明的第五个方面，提供第一方面所述嵌合抗原受体、第二方面所述核苷酸、第三方面所述的重组表达载体、第四方面所述T细胞在如下任意一种或多种中的应用：
b1)制备嵌合抗原受体T细胞或免疫细胞；
b2)制备肿瘤治疗药物。
本发明的第六个方面，提供一种肿瘤治疗药物，所述肿瘤治疗药物其活性成分至少包含第四方面所述T细胞。
本发明的第七个方面，提供一种肿瘤治疗的方法，所述方法包括：所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量上述T细胞或药物。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案通过对大量Claudin18.2的表达抗体进行筛选，获得一系列新的抗Claudin18.2抗体，并提供了包含嵌合抗原受体的Claudin18.2 CAR-T细胞的制备方法及其应用，经试验证明，其对Claudin18.2表达相关肿瘤特别是胃癌具有良好的治疗效果。
此外，上述嵌合抗原受体是基于羊驼的单域抗体(VHH)进行的设计，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位(只有15KDa)，其具有分子量小，CDR3区较长，成环向外延伸等特点，同时其还可以识别常规抗体无识别抗原表位，兼具稳定性好，对人的免疫原性弱等优势，增强CAR-T在体内的持续和安全性，降低肿瘤的复发几率，具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中pLVX-CMV-Claudin18.2-Hygro质粒载体图谱；
图2为本发明实施例中使用Vector NTI进行序列分析；
图3为本发明实施例中克隆33-A12、33-E11、33-E10与目的蛋白的结合图；
图4为本发明实施例中不同靶向Claudin18.2 CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性图；
图5为本发明实施例中Claudin18.2 CART对NCI-N87-Luc-huClaudin18.1和NCI-N87-Luc-muClaudin18的交叉反应毒性图。
图6为本发明实施例中靶向Claudin18.2 CAR-T细胞的动物体内抗肿瘤活性结果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“抗体”或“免疫球蛋白”在本文中无论是指重链抗体还是指常规四链抗体，均用作一般术语以包括全长抗体、其单个的链以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原结合域或片段，分别例如VHH结构域或VH/VL结构域)。此外，本文所用的术语“序列”(如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“单一可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解释。
术语(多肽或蛋白的)“结构域”是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分维持其三级结构。一般而言，结构域负责蛋白的单个的功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转移至其他蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或结构域的功能。
术语“单(结构)域抗体(VHH)”是指包含本领域及下文中分别称为“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”的免疫球蛋白结构域，其中所述框架区由本领域及下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”间隔开。因此，单域抗体(VHH)的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。单域抗体(VHH)因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。
术语“单结构域抗体”、“单域抗体”、“重链单域抗体”、“VHH结构域”、“VHH”、“VHH抗体片段”以及“VHH抗体”可互换使用。
两个多肽序列之间的“序列一致性(sequence identity)”指示序列之间相同氨基酸的百分比。“序列一致性”指示相同氨基酸取代的氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列一致性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列一致性通常使用序列分析软件来测量。例如，可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定相同性。
术语“亲和力”理论上通过完整抗体和抗原间的平衡缔合来定义。本文中亲和力可以通过KD值(解离常数)或其它测定方式进行评估或测定。
本发明中，“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，驯养的动物(例如母牛、羊、猫、犬和马)、灵长类(例如人和非人灵长类如猴)、家兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。优选地，所述个体或受试者是人。
术语“药物组合物”指其形式使得其中含有的活性成分的生物学活性有效，且不含对会接受该组合物施用的受试者有不可接受的毒性的其他成分的制剂。
术语“治疗/预防”(及其语法变体)指试图改变治疗个体中疾病的自然进程，并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、降低疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的形成或延缓病症的进展。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体，其至少包含抗原结合域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中，所述抗原结合域含有抗Claudin18.2单域抗体；
其中，所述抗Claudin18.2单域抗体的氨基酸序列选自：
a1)如SEQ ID NO.3、5、7、14、16、18、20、22、24所示的氨基酸序列；或，
a2)与SEQ ID NO.3、5、7、14、16、18、20、22、24任一项序列具有≥80％(优选如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，进一步优选如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列，或与SEQ ID NO.3、5、7、14、16、18、20、22、24所示的序列相比具有一个或多个(如1个、3个或5个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；该氨基酸序列仍然具有能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合Claudin18.2和诱导T细胞信号传导功能。
本发明中通过对大量Claudin18.2抗体进行筛选，从而获得上述抗Claudin18.2单域抗体，通过其结合在嵌合抗原受体的抗原结合域，从而能够显著提高嵌合抗原受体的治疗效果；并进一步对抗Claudin18.2单域抗体进行人源化处理，从而获得的CAR-T细胞具有更佳的抗肿瘤靶向性，且具有更高的安全性，提高治疗效果。
本发明的一个或多个实施方式中，所述跨膜结构域为CD8跨膜结构域和/或CD28跨膜结构域；
优选为CD8跨膜结构域，所述CD8跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明的一个或多个实施方式中，所述胞内结构域还可以包括胞内共刺激信号传导域和/或CD3ζ信号传导域。
本发明的一个或多个实施方式中，所述共刺激信号传导结构域包括但不限于人4-1BB胞内区、人CD28胞内区、人CD27胞内区、人CD30胞内区、人CD40胞内区或人OX40胞内区中的任意一种或多种的组合，优选为人CD28胞内区；所述人CD28胞内区的核苷酸序列如SEQID NO.26所示。
所述CD3ζ信号传导域其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
本发明的一个或多个实施方式中，所述抗原结合域和跨膜结构域可通过铰链区进行连接，所述铰链区可以包含IgG1铰链区和/或CD8铰链区；进一步的，所述铰链区为CD8铰链区，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
所述嵌合抗原受体还可以包括信号肽，本领域技术人员可以根据需要选择本领域常规的信号肽，本发明的一个或多个实施方式中，所述信号肽优选为CD8α信号肽；所述CD8α信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明的一个或多个实施方式中，所述嵌合抗原受体包括CD8α信号肽、结合Claudin18.2抗原的上述抗原结合域、CD8铰链区、CD8跨膜结构域、人CD28共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域串联而成。
本发明的一个或多个实施方式中，一种多聚核苷酸，所述多聚核苷酸能够编码如上所述的嵌合抗原受体。
本发明的一个或多个实施方式中，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含第二方面所述的核苷酸。
根据本发明，所述重组表达载体是由上述多聚核苷酸与表达载体进行有效连接获得，所述表达载体可以选自：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合；进一步的，所述表达载体包括病毒载体，如慢病毒、腺病毒、AAV病毒、逆转录病毒、或其组合。在本发明的一个具体实施方式中，所述表达载体使用的慢病毒载体，其构建方法可采用现有已知方法进行，在实施例中具有详细说明，在此不再赘述。
本发明的一个或多个实施方式中，提供工程化的免疫细胞，所述免疫细胞为T细胞，所述T细胞是由上述靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。具体的，所述T细胞为CAR-T细胞。本发明所采用的针对Claudin18.2的CAR-T技术，是一种综合肿瘤单克隆抗体的免疫治疗和肿瘤的过继免疫治疗优点的靶向治疗技术。本发明为Claudin18.2阳性肿瘤特别是胃癌的CAR-T治疗提供了新的治疗手段。
所述T细胞可以含有上述靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体、或者含有上述多聚核苷酸或上述重组表达载体。本发明的一个或多个实施方式中，所述T细胞具体可以为采用如上所述的靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体通过其编码的多聚核苷酸序列转染至T细胞中表达获得。
本发明的一个或多个实施方式中，所述转染的方式为可通过重组表达载体转染到T细胞，优选为通过病毒载体(包括慢病毒载体)转染到T细胞。
本发明中，所述T细胞具有良好的靶向杀伤作用，同时能够释放相关免疫因子(如IFN-γ、IL-2)，从而具备低毒性高免疫杀伤反应性质。
本发明的一个或多个实施方式中，提供第一方面所述嵌合抗原受体、第二方面所述核苷酸、第三方面所述的重组表达载体、第四方面所述T细胞在如下任意一种或多种中的应用：
b1)制备嵌合抗原受体T细胞或免疫细胞；
b2)制备肿瘤防治药物。
其中，所述肿瘤为与Claudin18.2的表达相关的肿瘤疾病，包括但不限于胃癌、肠癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌和肺腺癌等，优选为胃癌。
本发明的一个或多个实施方式中，提供一种肿瘤治疗药物，所述肿瘤治疗药物其活性成分至少包含上述T细胞。
所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。
所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
所述药物还可包括可药用载体。所述可药用载体的递送载剂可为脂质体、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肽、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、无机(包括金属)颗粒、以及细菌或病毒(例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒)、噬菌体、黏粒或质粒载体等，在此不做具体限定。
本发明的一个或多个实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
本发明的一个或多个实施方式中，提供一种肿瘤治疗的方法，所述方法包括：
所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量上述T细胞或药物。
所述肿瘤为与Claudin18.2的表达相关的肿瘤疾病，包括但不限于胃癌、肠癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌和肺腺癌等，优选为胃癌。
所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。所述“治疗有效量”是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。必须认识到，本发明所述活性成分的最佳给药剂量和间隔是由其性质和诸如给药的形式、路径和部位以及所治疗的特定哺乳动物等外部条件决定的，而这一最佳给药剂量可用常规的技术确定。同时也必须认识到，最佳的疗程，即同时化合物在额定的时间内每日的剂量，可用本领域内公知的方法确定。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
实施例
1.Claudin18.2表达细胞株的制备
(1)Claudin18.2表达质粒的构建
体外合成人Claudin 18.2蛋白全长Met1-Val261(SEQ ID NO:1)基因(SEQ IDNO.2，将该基因插入pLVX-CMV-Hygro载体，构建形成pLVX-CMV-Claudin18.2-Hygro质粒载体。图谱见图1。
(2)Claudin18.2蛋白表达病毒包装。
a.转染前一天，接种3×105/ml HEK293T细胞于10cm培养皿。
b.转染当天，HEK293T细胞汇合度达到70％左右,吸弃原有培养基，用PBS洗一遍，加入9mlDMEM不完全培养，置于37℃、5％ CO2培养箱，待用
C.准备PEI-DNA复合物：取1mL DMEM至一个1.5ml无菌离心管中，分别加入7.5μgClaudin18.2_huFc质粒、5.7μg pGP、3.75μg pVSVG，移液枪上下吹打充分混匀后，加入50.75μL 1μg/μL PEI，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10-15min。
d.转染：将上述DNA-PEI复合物逐滴加入到一个10cm培养皿中，“米”字型轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5％ CO2培养箱，培养6～8h后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基(DMEM+10％ FBS)。将培养皿置于37℃、5％ CO2培养箱，培养48h。
e.首次收毒：收集培养皿中的培养液至50mL无菌离心管中，置于4℃待用。沿培养皿边缘小心的加入10mL新鲜的完全培养基[DMEM+10％ FBS]，将培养皿置于37℃、5％ CO2培养箱，继续培养24h。将收集的病毒液。
d.二次收毒：收集培养皿中的培养液至首次收毒的50mL无菌离心管中，于4℃，6000x g过夜离心16h。
f.吸弃离心后上清，加入300ulPBS重悬，形成Claudin18.2病毒液。
(3)病毒感染CHO-S构建表达Claudin18.2细胞株。
a.用CHO GROW CD1将CHO-S细胞密度调整为1×106/ml，接种于6孔板。
b.将Claudin18.2病毒液逐滴滴加到6孔板内，混匀，置于37℃、5％ CO2、130rpm震荡培养箱中培养。
c.24h后，收集六孔板内细胞培养液，200xg、25℃离心5min。
d.离心结束后，吸弃上清，加入2mL含有Hygromycine的CHO GROW CD1，重悬后转移至6孔板，置于37℃、5％CO2、130rpm摇床上培养箱中培养进行筛选(注意设置一个空白CHO-S细胞对照组)。筛选期间维持细胞密度1×106/ml。
f.对照孔内的细胞基本死亡，筛选结束。将CHO-S-Claudin18.2细胞株扩大培养。
2.使用噬菌体展示文库筛选针对Claudin18.2特异的VHH抗体
(1)使用CHO-S-Claudin18.2细胞株免疫羊驼，皮下多点免疫，取外周血测定抗体效价，免疫血清与Claudin18.2重组蛋白可以结合，且随着免疫血清的梯度稀释，OD值成梯度变化，符合建库要求，安排构建噬菌体展示库。
(2)采集免疫羊驼的外周血，提取RNA，制备cDNA样品后，PCR克隆VHH抗体编码基因，构建噬菌体展示库，(库容量1.04x109，空载率0％，随机挑取17个单克隆进行测序，使用Vector NTI进行序列分析，结果显示各单克隆序列差异大，库多样性较好。(图2)
(3)使用Claudin18.2重组蛋白抗原进行固相淘选，进行2-4轮的噬菌体淘选实验，每轮结束后计算input和output值，在第2轮开始对获取的单克隆噬菌体进行Phage ELISA。
a.用CBS按1μg/mL浓度包被Claudin18.2重组蛋白抗原，4℃过夜。
b.弃去抗原，用3％ MPBS室温封闭2h，此为Sample板；同时用MPBS封闭一块空白ELISA板，此为Negative control板。
c.弃去MPBS，用0.05％ PBST洗涤4次；用0.01％ PBST 1:1稀释单克隆噬菌体上清，每孔100μL，4℃孵育1h。
d.弃去一抗，用0.05％PBST洗涤5次；用0.05％的PBST按1:3000稀释anti-M13antibody-HRP，每孔100μL，4℃孵育1h。
f.弃去二抗，PBST洗涤5次；TMB 37℃显色15min，硫酸酸终止反应，读取OD450。g.计算S/N值，挑选比值较大的样品进行Sanger测序。
h.获取候选单域抗体的核酸及氨基酸序列信息，进行序列比对，挑选CDR区域氨基酸序列不同的候选抗体。在候选抗体序列的N端和C端分别通过Overlap PCR引入CMV启动子、信号肽及hu IgG1 Fc标签，将纯化PCR产物瞬时转染293F细胞，收集培养基上清。
I.复苏1×106个处于对数生长期的CHO-S-Claudin18.2重组细胞株、CHO-S-Claudin18.1重组细胞株，400xg，4℃离心5min。CHO-S细胞株作为阴性对照组。弃上清后加入上述100uL培养基上清，4℃孵育30min后，加入1mL PBS洗涤细胞3次，然后用100uL PBS重悬细胞，加入5uL PE标记的Anti human IgG抗体，室温避光孵育30分钟后，加入1mL PBS洗涤三次，最后用500uL PBS重悬细胞。通过流式细胞仪初步确定候选抗体与目的蛋白的结合情况。KLST-18.2及IMAB362是Claudin18.2阳性对照抗体。结果显示，三个克隆Claudin18.2抗体与CHO-S、CHO-S-Claudin18.1均不结合，而与CHO-S-Claudin18.2高亲和力结合，三个克隆都是Claudin18.2的特异性抗体。克隆号分别为3A12、3E11、3E10。(图3)
3A12的VHH氨基酸序列如(SEQ ID NO:3)所示，基因序列如(SEQ ID NO:4)；3E11的VHH氨基酸序列如(SEQ ID NO:5)所示，基因序列如(SEQ ID NO:6)；3E10的VHH氨基酸序列如(SEQ ID NO:7)所示，基因序列如(SEQ IDNO:8)。
J.采用氨基偶联的方案将Claudin18.2抗原偶联至BiaCore T200芯片上，使用3A12/3E11/3E10-VHH抗体作为流动相对单域抗体分别进行亲和力测定，其亲和力均达到nM级别。
3.单域抗体人源化设计
采用CDR&SDR Grafting及Back mutation对3A12-VHH/3E11-VHH和3E10-VHH进行人源化。3A12-HM1人源化后氨基酸序列如(SEQ ID NO:14)所示，3A12-HM1人源化后核酸序列如(SEQ ID NO:15)所示；3A12-HM2人源化后氨基酸序列如(SEQ ID NO:16)所示，3A12-HM2人源化后核酸序列如(SEQ ID NO:17)所示；3E11-HM1人源化后氨基酸序列如(SEQ IDNO:18)所示，3E11-HM1人源化后核酸序列如(SEQ ID NO:19)所示；3E11-HM2人源化后氨基酸序列如(SEQ ID NO:20)所示，3E11-HM2人源化后核酸序列如(SEQ ID NO:21)所示；3E10-HM1人源化后氨基酸序列如(SEQ ID NO:22)所示，3E10-HM1人源化后核酸序列如(SEQ IDNO:23)所示；3E10-HM2人源化后氨基酸序列如(SEQ ID NO:24)所示，3E10-HM2人源化后核酸序列如(SEQ ID NO:25)所示。
4.CAR-T细胞的制备和抗肿瘤活性研究
将人源化后抗体序列进行CAR-T细胞制备和抗肿瘤活性研究。
(1)靶向Claudin18.2嵌合抗原受体慢病毒表达载体构建
以pCDH-EF1a质粒为载体，构建表达Claudin18.2抗体的二代嵌合抗原受体的慢病毒质粒。包括pCDH-EF1a-3A12-HM1-BBZ、pCDH-EF1a-3A12-HM2-BBZ、pCDH-EF1a-3E11-HM1-BBZ、pCDH-EF1a-3E11-HM2-BBZ、pCDH-EF1a-3E10-HM1-BBZ、pCDH-EF1a-3E10-HM2-BBZ、pCDH-EF1a-3A12-HM1-28Z、pCDH-EF1a-3A12-HM2-28Z、pCDH-EF1a-3E11-HM1-28Z、pCDH-EF1a-3E11-HM2-28Z、pCDH-EF1a-3E10-HM1-28Z、pCDH-EF1a-3E10-HM2-28Z(共计12种，与下文靶向Claidin18.2的CART细胞一一对应)，和已经进入临床II期的同类CART产品的抗体序列hu8E5。
3A12-HM1-BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:9)、3A12-HM1-VHH(SEQ ID NO:15)、CD8铰链区(SEQ ID NO:10)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:11)和胞内信号传导结构域4-1BB(SEQ ID NO:12)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:13)组成。
3A12-HM2-BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:9)、3A12-HM2-VHH(SEQ ID NO:17)、CD8铰链区(SEQ ID NO:10)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:11)和胞内信号传导结构域4-1BB(SEQ ID NO:12)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:13)组成。
3E11-HM1-BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:9)、3E11-HM1-VHH(SEQ ID NO:19)、CD8铰链区(SEQ ID NO:10)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:11)和胞内信号传导结构域4-1BB(SEQ ID NO:12)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:13)组成。
3E11-HM2-BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:9)、3E11-HM1-VHH(SEQ ID NO:21)、CD8铰链区(SEQ ID NO:10)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:11)和胞内信号传导结构域4-1BB(SEQ ID NO:12)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:13)组成。
3E10-HM1-BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:9)、3E10-HM1-VHH(SEQ ID NO:23)、CD8铰链区(SEQ ID NO:10)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:11)和胞内信号传导结构域4-1BB(SEQ ID NO:12)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:13)组成。
3E10-HM2-BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:9)、3E10-HM1-VHH(SEQ ID NO:25)、CD8铰链区(SEQ ID NO:10)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:11)和胞内信号传导结构域4-1BB(SEQ ID NO:12)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:13)组成。
3A12-HM1-28Z核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:9)、3A12-HM1-VHH(SEQ ID NO:15)、CD8铰链区(SEQ ID NO:10)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:11)和胞内信号传导结构域CD28(SEQ ID NO:26)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:13)组成。
3A12-HM2-28Z核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:9)、3A12-HM2-VHH(SEQ ID NO:17)、CD8铰链区(SEQ ID NO:10)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:11)和胞内信号传导结构域CD28(SEQ ID NO:26)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:13)组成。
3E11-HM1-28Z核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:9)、3E11-HM1-VHH(SEQ ID NO:19)、CD8铰链区(SEQ IDNO:10)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:11)和胞内信号传导结构域CD28(SEQ ID NO:26)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ IDNO:13)组成。
3E11-HM2-28Z核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:9)、3E11-HM1-VHH(SEQ ID NO:21)、CD8铰链区(SEQ IDNO:10)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:11)和胞内信号传导结构域CD28(SEQ ID NO:26)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ IDNO:13)组成。
3E10-HM1-28Z核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:9)、3E10-HM1-VHH(SEQ ID NO:23)、CD8铰链区(SEQ IDNO:10)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:11)和胞内信号传导结构域CD28(SEQ ID NO:26)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ IDNO:13)组成。
3E10-HM2-28Z核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:9)、3E10-HM1-VHH(SEQ ID NO:25)、CD8铰链区(SEQ IDNO:10)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:11)和胞内信号传导结构域CD28(SEQ ID NO:26)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ IDNO:13)组成。
上述所有质粒经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，得到转染级别质粒，用于HEK293F悬浮细胞慢病毒包装实验。
(2)靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体慢病毒制备
重组表达载体包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或质粒等，我们所使用的原始重组表达载体为慢病毒载体。
a.用FreeStyle 293培养基将HEK293F细胞密度调整为4.5×106cells/mL，体积为包装体积的90％。暂置37.0℃大容量50振幅CO2叠加式恒温振荡器培养备用。
b.配制质粒/PEI复合物：准备2个无菌离心管，分别加入5％包装体积的FreeStyle293培养基。向第一支离心管中依次加入一定比例的pLP1、pLP2、pLP/VSVG和pCDH-EF1a-CAR质粒，质粒总量180μg/100mL包装体积，轻轻混匀，室温孵育5min。向另一支离心管中加入PEI溶液，PEI用量(μg)＝质粒总量(μg)*3，轻轻混匀，室温孵育5min。
c.将上述孵育后的PEI稀释液加入到质粒稀释液中，并迅速充分混匀，垂直层流洁净工作台内室温孵育约12min。
d.转染：取出上述准备好的HEK293F细胞，边轻摇边加入制备好的质粒/PEI复合物，混匀，37.0℃、130rpm、振幅50.0mm、5.0％CO2培养过夜。
e.转染后约16-18h。加入OPM-CHO PFF06，体积为转染体系的10％，混匀，37.0℃、130rpm、振幅50.0mm、5.0％CO2培养过夜。
f.转染后约48h。3000×g、22.0℃离心15min，收集上清液病毒，用0.65μm针头滤器过滤。
g.核酸酶消化。按100U/mL向上述病毒液添加Super Nuclease溶液，上下颠倒5～8次混匀，4℃过夜处理约16h。
h.6000×g、4℃过夜离心约16h，弃上清。用1％包装体积DPBS(含10％人血白蛋白)重悬。取50ul病毒液检测感染滴度，剩余全部分装后置于-80℃储存。
i.将不同稀释梯度的病毒液感染293T细胞，48h后，用流式细胞术检测被感染的阳性细胞率，并换算为病毒液的感染滴度，以便后续转导T细胞。
(3)CAR-T细胞的制备
本实施例使用的宿主细胞为人外周血T细胞或含有T细胞的细胞群。
a.外周血T细胞分离
将5mL抗凝血样品转移至一个15mL无菌离心管，离心力800×g、离心降速设为最低，将血样室温离心20min。吸弃血清层，向下层的红色外周血细胞层加入等体积的生理盐水，混匀。
向一个新的15mL离心管中加入5mL淋巴细胞分离液，然后将生理盐水稀释后的血样沿管壁缓慢添加至淋巴细胞分离试剂的上层，离心力800×g，转速下降速度设为最低，室温离心30min。吸取白色单核细胞层吸至一个新的15mL无菌离心管中，加入等体积的生理盐水，混匀。离心力800×g，离心5min。吸弃上清，加入5mL生理盐水，混匀，取部分细胞悬液进行计数，流式细胞检测CD3+T细胞比例。
根据Dynabeads与CD3+T细胞数目比例为1:1，分离T细胞，取部分细胞悬液计数。
b.T细胞激活
加入T细胞生长培养基(含X-Vivo 15培养基、300IU/mL白介素2、10ng/mL白介素7、5ng/mL白介素15、5ng/mL白介素21)，调整T细胞密度1E6/mL。将细胞置于37℃、5％ CO2培养箱中培养40h。
c.T细胞培转导
从-80℃冰箱中，取出慢病毒，冰上解冻。从培养箱中取出激活的T细胞，向培养器皿中加入polybrene至终浓度为6μg/mL，加入病毒液(MOI约50)，充分混匀，使用封口膜将培养器皿密封，800×g室温离心1h。
离心后，将培养器皿于37℃、5％ CO2的培养箱中，继续培养24h。
400×g离心10min，弃掉含有病毒的培养基上清，用新鲜T细胞生长培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的培养器皿中，继续培养。维持细胞密度在1-2x106/mL。
培养4天后，取部分细胞用流式细胞仪检测T细胞表面CAR分子的表达。离心收集制备的CAR-T细胞和NC-T细胞(对照组)，PBS洗涤一次后弃上清，加入Claudin18.2-huFc蛋白孵育30min；用PBS洗涤两次后弃上清，加入PE anti-human IgGFc抗体避光孵育30min；用PBS洗涤两次后弃上清，重悬，最后流式细胞仪检测流式细胞仪检测CAR阳性的T细胞比例。上述12种靶向Claidin18.2 CAR分子的表达效率依次为：80.549％、86.784％、80.068％、82.236％、73.931％、58.159％、70.857％、60.477％、71.685％、67.009％、71.280％、40.569％，而hu8E5 CAR分子的表达效率为19.470％。总体看，CAR分子表达效率均较高。
(4)靶向Claudin18.2 CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性
通过细胞毒实验判断Claudin18.2 CART细胞的抗肿瘤活性。
a.过表达Claudin18.2的NCI-N87-Claudin18.2-Luc胃癌细胞作为靶细胞，用RPMI1640完全培养基调整靶细胞密度为5*105个/mL，然后100μL/孔，96孔板，即5*104个/孔。
b.上述13种CAR-T细胞和Control-T为效应细胞，同时用X-Vivo 15培养基分别调整至合适密度，实验组按照一定效应细胞：靶细胞的比例分别加入靶细胞孔内，100μL/孔。同时设置对照组为不加效应细胞组，即靶细胞萤光释放最大孔。每个比例设2个复孔。
c.放置37℃、5％ CO2培养箱中培养18h。
d.根据板布局，每孔转移100uL细胞悬液至全白酶标板，每孔加入100uL D-luciferin，混匀，全程避光操作，且动作要迅速，静置5min。用多功能酶标仪生物发光信号检测系统进行检测。细胞毒性计算公式为：％细胞毒性＝[(对照组-实验组)/对照组]*100，结果显示均有显著的抗肿瘤活性。
由图4可知，CAR-CD28胞内刺激阈均比CAR-4-1BB胞内刺激阈的肿瘤杀伤活性要好，在E:T为1:1时，能够裂解95％以上的肿瘤细胞。将Claudin18.2-CAR07至CAR12的CART细胞给NSG小鼠尾静脉注射，每天观察小鼠一般症状，共30天，其中Claudin18.2-CAR08和Claudin18.2-CAR11组小鼠存活情况比较客观，将Claudin18.2-CAR08和Claudin18.2-CAR11进行动物体内抗肿瘤效果评价。
Claudin18.2 CART对NCI-N87-Luc-huClaudin18.1和NCI-N87-Luc-muClaudin18的交叉反应毒性
a.NCI-N87-Luc-huClaudin18.1和NCI-N87-Luc-muClaudin18作为靶细胞，用RPMI1640完全培养基调整靶细胞密度为5*105个/mL，然后100μL/孔，96孔板，即5*104个/孔。
b.Claudin18.2-CAR08和Claudin18.2-CAR11细胞和Control-T为效应细胞，同时用X-Vivo 15培养基分别调整至合适密度，实验组按照一定效应细胞：靶细胞的比例(3:1/1:1/1:3)分别加入靶细胞孔内，100μL/孔。同时设置对照组为不加效应细胞组，即靶细胞萤光释放最大孔。每个比例设2个复孔。
c.放置37℃、5％ CO2培养箱中培养18h。
d.根据板布局，每孔转移100uL细胞悬液至全白酶标板，每孔加入100uL D-luciferin，混匀，全程避光操作，且动作要迅速，静置5min。用多功能酶标仪生物发光信号检测系统进行检测。细胞毒性计算公式为：％细胞毒性＝[(对照组-实验组)/对照组]*100，结果显示Claudin18.2-CAR08和Claudin18.2-CAR11对
NCI-N87-Luc-huClaudin18.1和NCI-N87-Luc-muClaudin18均无抗肿瘤活性，即Claudin18.2-CAR08和Claudin18.2-CAR11的抗体序列均不能识别huClaudin18.1及muClaudin18，说明与人体表达huClaudin18.1组织的交叉反应毒性低，以及在小鼠体内进行CART药效评价时可避免出现其他组织脱靶毒性。
Claudin18.2 CART与NCI-N87-Claudin18.2-Luc靶细胞共培养后IFN-γ分泌检测
a.NCI-N87-Claudin18.2-Luc细胞作为靶细胞(含Claudin18.2靶蛋白)，用RPMI1640完全培养基调整密度为5*105/mL，然后100μL/孔，96孔板，即5*104个/孔。
b.Claudin18.2-CAR08、Claudin18.2-CAR11和Control-T(对照组)为效应细胞，同时用RPMI1640完全培养基分别调整至2.5×106/mL，加入靶细胞孔内，100μL/孔，设3个复孔。
c.放置37℃、5％ CO2培养箱中培养18h。
d.准备ELISA板，并进行包被、封闭。
包被capture antibody：使用PBS稀释capture antibody至2μg/mL，96孔ELISA板，100μL/孔。4℃孵育过夜。
封闭：先用PBST洗板三次，再使用1％BSA-PBS室温封闭1h，300μL/孔。
e.将96孔细胞板置于离心机，800×g，室温离心5min，收集培养上清。
f.加样品：先用PBST洗板三次，再分别加入收集的培养上清和标准品【9.38pg/mL-600pg/mL】，100μL/孔，室温孵育2h。
g.加detection antibody：先用PBST洗板三次，再使用PBS稀释detectionantibody至125ng/mL，100μL/孔，室温孵育2h。
h.加Streptavidin-HRP B：先用PBST洗板三次，再使用PBS将Streptavidin-HRP B稀释40倍，100μL/孔，室温孵育20min，注意避光。
i.加显色液：先用PBST洗板三次，再加入显色液，100μL/孔，室温孵育20min，注意避光。
g.终止反应：加入2M H2SO4，50μL/孔，注意避光。
k.检测：用多功能酶标仪读取OD450，参考波长540nm.
分析数据，CAR-T组比UTD组明显增高，说明CAR-T在表达Claudin18.2的肿瘤细胞刺激下，能够分泌大量IFN-γ。
Claudin18.2 CART与NCI-N87-Claudin18.2-Luc靶细胞共培养后IL-2释放情况
a.NCI-N87-Claudin18.2-Luc细胞作为靶细胞(含Claudin18.2靶蛋白)，用RPMI1640完全培养基调整密度为5×105/mL，然后100μL/孔，96孔板，即5×104个/孔。
b.Claudin18.2-CAR08、Claudin18.2-CAR11和Control-T(对照组)为效应细胞，同时用RPMI1640完全培养基分别调整至2.5×106/mL，加入靶细胞孔内，100μL/孔，每个比例设3个复孔。
c.放置37℃、5％ CO2培养箱中培养18h。
d.准备ELISA板，并进行包被、封闭。
包被capture antibody：PBS稀释capture antibody至4μg/mL，96孔ELISA板，100μL/孔。4℃孵育过夜。
封闭：先用PBST洗板三次，再使用1％BSA-PBS室温封闭1h，300μL/孔。
e.将96孔细胞板置于离心机，800×g，室温离心5min，收集培养上清。
f.加样品：先用PBST洗板三次，再分别加入收集的培养上清和标准品【15.6pg/mL-1000pg/mL】，100μL/孔，室温孵育2h。
g.加detection antibody：先用PBST洗板三次，再使用PBS稀释detectionantibody至100ng/mL，100μL/孔，室温孵育2h。
h.加Streptavidin-HRP B：先用PBST洗板三次，再使用PBS将Streptavidin-HRP B稀释40倍，100μL/孔，室温孵育20min，注意避光。
i.加显色液：先用PBST洗板三次，再加入显色液，100μL/孔，室温孵育20min，注意避光。
g.终止反应：加入2M H2SO4，50μL/孔，注意避光。
k.检测：用多功能酶标仪读取OD450，参考波长540nm.
分析数据，CAR-T组比UTD组明显增高，说明CAR-T在表达Claudin18.2的肿瘤细胞刺激下，能够分泌大量IL-2。
靶向Claudin18.2 CAR-T细胞的动物体内抗肿瘤活性
NSG小鼠在NOD-SCID的基础上敲除Il2rg基因，是一种严重免疫缺陷小鼠，缺失成熟T、B、NK细胞，是人源化小鼠、异种移植、免疫重建的重要载体；对于研究人类造血干细胞、肿瘤发生与治疗、免疫缺陷疾病与体内免疫机制研究都具有重要意义。是目前国际公认的免疫缺陷程度较高、较适合人源细胞或组织移植的工具小鼠。
a.收获对数生长期的NCI-N87-CLDN18.2-Luc细胞，用PBS重悬细胞，调整细胞密度为2×107/mL，将其与Matrigel基质胶1:1(v:v)混合。以200ul/只体积，接种于6～8周龄雄性NSG小鼠右侧前腋皮下，以建立胶质瘤异种移植小鼠模型。
b.每天观察小鼠的健康状况及成瘤情况，约7天后瘤体积达到130mm3左右。
c.将小鼠平均分9组，每组5只。每只小鼠尾静脉注射CART细胞，进行单次治疗。
d.给药后，每天观察小鼠一般症状，实验终末安乐死处死小鼠并进行解剖。每隔2-3天测量NCI-N87-CLDN18.2-Luc移植瘤体积的大小，记录每组小鼠瘤体积的变化和存活情况，并绘制瘤体积随时间的生长曲线和小鼠体重变化曲线。结果显示与溶媒对照组或非工程化T细胞Control T对照组相比，用抗Claudin18.2 CAR-T细胞治疗的荷瘤小鼠具有显著的肿瘤清除效果，动物体重平稳，甚至随着生长时间的延长有所增加。Claudin18.2-CAR08和Claudin18.2-CAR10对NCI-N87-CLDN18.2-Luc移植瘤小鼠的治疗效果均具有一定的剂量依赖关系，随着注射剂量的增大，抗肿瘤效果越明显，包括抑瘤率高、肿瘤清除时间靠前，尤其是Claudin18.2-CAR08的8×106治疗组，在治疗后第10天，NCI-N87-CLDN18.2-Luc移植瘤已经基本被清除，而CAR-hu8E5-28z的10×106治疗组，在治疗后第12天，NCI-N87-CLDN18.2-Luc移植瘤基本被清除。Claudin18.2-CAR11的2×106治疗组，在治疗后第14天，NCI-N87-CLDN18.2-Luc移植瘤基本被清除。综合考虑，选择Claudin18.2-CAR08继续进行后续临床前安全性研究和人体临床试验。
组别 治疗剂量 NSG小鼠数量(只)
溶媒对照组 - 5
Contro1-T - 5
CAR-hu8E5-28z <![CDATA[10×10<sup>6</sup>]]> 5
Claudin18.2-CAR08 <![CDATA[2×10<sup>6</sup>]]> 5
Claudin18.2-CAR08 <![CDATA[4×10<sup>6</sup>]]> 5
Claudin18.2-CAR08 <![CDATA[8×10<sup>6</sup>]]> 5
Claudin18.2-CAR11 <![CDATA[2×10<sup>6</sup>]]> 5
Claudin18.2-CAR11 <![CDATA[4×10<sup>6</sup>]]> 5
Claudin18.2-CAR11 <![CDATA[8×10<sup>6</sup>]]> 5
实施例中涉及的氨基酸及核苷酸序列：
(1)Claudin18.2蛋白序列
MAVTACQGLGFVVSLIGIAGIIAATCMDQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGLWRSCVRESSGFTECRGYFTLLGLPAMLQAVRALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFANMLVTNFWMSTANMYTGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVSYHASGHSVAYKPGGFKASTGFGSNTKNKKIYDGGARTEDEVQSYPSKHDYV
(2)Claudin18.2核酸序列
ATGGCCGTGACAGCCTGTCAAGGACTGGGCTTTGTGGTGTCCCTGATCGGAATCGCCGGCATCATTGCCGCCACCTGTATGGACCAGTGGTCTACCCAGGACCTGTACAACAACCCTGTGACCGCCGTGTTCAACTACCAAGGCCTGTGGCGGTCTTGCGTGCGGGAAAGCTCTGGCTTCACAGAGTGCAGAGGCTACTTCACCCTGCTGGGACTGCCTGCTATGCTGCAGGCTGTTAGAGCCCTGATGATCGTGGGCATTGTGCTGGGAGCCATCGGCCTGCTGGTGTCCATTTTCGCCCTGAAGTGCATCCGGATCGGCAGCATGGAAGATAGCGCCAAGGCCAACATGACCCTGACCAGCGGCATCATGTTCATCGTGTCCGGCCTGTGTGCCATTGCTGGCGTGTCCGTGTTCGCCAATATGCTCGTGACCAACTTCTGGATGAGCACCGCCAACATGTACACCGGCATGGGCGGAATGGTGCAGACCGTGCAGACACGGTACACATTTGGCGCCGCTCTGTTTGTCGGATGGGTTGCAGGCGGACTGACACTGATTGGCGGCGTGATGATGTGTATCGCCTGCAGAGGACTGGCCCCTGAGGAAACAAACTACAAGGCCGTGTCCTACCACGCCAGCGGACACTCTGTGGCTTACAAGCCTGGCGGCTTTAAGGCCAGCACAGGCTTCGGCAGCAACACCAAGAACAAGAAGATCTACGACGGCGGAGCCCGGACCGAGGATGAGGTTCAGAGCTACCCTAGCAAGCACGACTACGTG
(3)3A12-VHH氨基酸序列
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSDYNMGWFRQAPGKEREFVAGITWSGSIRDYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAANRLAMHRGLNYDYWGQGTQVAVSS
(4)3A12-VHH核酸序列
CAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCAGAACCTTCAGCGACTACAATATGGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGCAAAGAGAGAGAGTTCGTCGCCGGAATCACTTGGAGCGGCAGCATCAGAGATTACGCCGAGAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCTGAGGACACCGCCATCTACTACTGCGCCGCCAATAGACTGGCCATGCACAGAGGCCTGAACTACGACTATTGGGGCCAGGGAACACAGGTGGCCGTTAGCTCT
(5)3E11-VHH氨基酸序列
AVQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFMINNMGWYRQAPGKQRELVAAITRGGSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNVNDTMPWRLQNDYWGQGTQVTVSS
(6)3E11-VHH核酸序列
GCTGTGCAGCTGGTTGATTCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCCGGATCTTCATGATCAACAACATGGGCTGGTACAGACAGGCCCCTGGCAAGCAGAGAGAACTGGTTGCCGCCATCACAAGAGGCGGCAGCACAGATTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAGCAGCCTGAAGCCTGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCAACGTGAACGACACCATGCCTTGGCGGCTGCAGAACGATTATTGGGGCCAGGGCACCCAAGTGACCGTGTCATCT
(7)3E10-VHH氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGNIVSINYMGWFRQAPGKQRDLVAYITNGGSANYADSVKGRFTISKGAAKNTVYLQMNSLKPDDTAVYYCHASSVITTASLWGTDYWGQGTQVTVSS
(8)3E10-VHH核酸序列
GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCAACATCGTGTCCATCAACTACATGGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGCAAGCAGAGAGATCTGGTCGCCTACATCACCAATGGCGGCAGCGCCAATTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTAAGGGCGCTGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCTGACGACACCGCCGTGTACTACTGTCACGCCAGCAGCGTGATCACCACAGCTTCTCTGTGGGGCACCGATTATTGGGGCCAGGGCACACAAGTGACCGTGTCTAGT
(9)CD8α信号肽核酸序列
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCC
(10)CD8铰链区核酸序列
ACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGAT
(11)CD8跨膜区核酸序列ATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGT
(12)4-1BB核酸序列
AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTG
(13)CD3ξ核酸序列
CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
(14)3A12-HM1氨基酸序列
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSDYNMGWFRQAPGKEREFVAGITWSGSIRDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAANRLAMHRGLNYDYWGQGTLVTVSS
(15)3A12-HM1核酸序列
CAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCAGAACCTTCAGCGACTACAATATGGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGCAAAGAGAGAGAGTTCGTCGCCGGAATCACTTGGAGCGGCAGCATCAGAGACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCGCTAATAGACTGGCCATGCACCGGGGCCTGAACTACGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTTTCTTCT
(16)3A12-HM2氨基酸序列
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSDYNMGWFRQAPGKGLEFVAGITWSGSIRDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAANRLAMHRGLNYDYWGQGTLVTVSS
(17)3A12-HM2核酸序列
CAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCAGAACCTTCAGCGACTACAATATGGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAATTTGTGGCCGGAATCACTTGGAGCGGCAGCATCAGAGACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCGCTAATAGACTGGCCATGCACCGGGGCCTGAACTACGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTTTCTTCT
(18)3E11-HM1氨基酸序列
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFMINNMGWYRQAPGKQRELVAAITRGGSTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCNVNDTMPWRLQNDYWGQGTLVTVSS
(19)3E11-HM1核酸序列
CAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCCGGATCTTCATGATCAACAACATGGGCTGGTACAGACAGGCCCCTGGCAAGCAGAGAGAACTGGTTGCCGCCATCACAAGAGGCGGCAGCACAGATTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCAACGTGAACGACACCATGCCTTGGCGGCTGCAGAACGATTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTGTCATCT
(20)3E11-HM2氨基酸序列
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFMINNMGWYRQAPGKGLELVAAITRGGSTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCNVNDTMPWRLQNDYWGQGTLVTVSS
(21)3E11-HM2核酸序列
CAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCCGGATCTTCATGATCAACAACATGGGCTGGTACAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAACTGGTGGCCGCTATCACAAGAGGCGGCAGCACAGATTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCAACGTGAACGACACCATGCCTTGGCGGCTGCAGAACGATTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTGTCATCT
(22)3E10-HM1氨基酸序列
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGNIVSINYMGWFRQAPGKQRDLVAYITNGGSANYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCHASSVITTASLWGTDYWGQGTLVTVSS
(23)3E10-HM1核酸序列
CAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCAACATCGTGTCCATCAACTACATGGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGCAAGCAGAGAGATCTGGTCGCCTACATCACCAATGGCGGCAGCGCCAATTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTCACGCCAGCAGCGTGATCACCACCGCTTCTCTGTGGGGCACAGATTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTGTCATCT
(24)3E10-HM2氨基酸序列
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGNIVSINYMGWFRQAPGKGLDLVAYITNGGSANYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCHASSVITTASLWGTDYWGQGTLVTVSS
(25)3E10-HM2核酸序列
CAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCAACATCGTGTCCATCAACTACATGGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGATCTGGTGGCCTACATCACCAATGGCGGCAGCGCCAATTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTCACGCCAGCAGCGTGATCACCACCGCTTCTCTGTGGGGCACAGATTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTGTCATCT
(26)CD28核酸序列
CGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCAACCAGAAAGCACTATCAGCCTTACGCTCCTCCTCGGGACTTCGCCGCCTATAGATCT
本发明未尽事宜为公知技术。

Claims (10)

1.一种靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体，其至少包含抗原结合域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其特征在于，所述抗原结合域含有抗Claudin18.2单域抗体；
其中，所述抗Claudin18.2单域抗体的氨基酸序列选自：
a1)如SEQ ID NO.3、5、7、14、16、18、20、22、24所示的氨基酸序列；或，
a2)与SEQ ID NO.3、5、7、14、16、18、20、22、24任一项序列具有≥80％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO.3、5、7、14、16、18、20、22、24任一项所示的序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列；且仍然具有能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合Claudin18.2和诱导T细胞信号传导功能。
2.如权利要求1所述的靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域为CD8跨膜结构域和/或CD28跨膜结构域；
所述CD8跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
3.如权利要求1所述的靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内结构域包括胞内共刺激信号传导域和/或CD3ζ信号传导域；
所述共刺激信号传导结构域包括但不限于人4-1BB胞内区、人CD28胞内区、人CD27胞内区、人CD30胞内区、人CD40胞内区或人OX40胞内区中的任意一种或多种的组合，优选为人CD28胞内区；所述人CD28胞内区的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示；
所述CD3ζ信号传导域其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
4.如权利要求1所述的靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原结合域和跨膜结构域通过铰链区进行连接，所述铰链区包含IgG1铰链区和/或CD8铰链区；所述铰链区为CD8铰链区，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
5.如权利要求1所述的靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括CD8α信号肽；所述CD8α信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
6.一种多聚核苷酸，其特征在于，所述多聚核苷酸能够编码权利要求1-5任一项所述嵌合抗原受体。
7.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求6所述的核苷酸。
8.一种工程化的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞为T细胞，所述T细胞是由权利要求1-5任一项所述嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。
9.权利要求1-5任一项所述嵌合抗原受体、权利要求6所述核苷酸、权利要求7所述重组表达载体、权利要求8所述T细胞在如下任意一种或多种中的应用：
b1)制备嵌合抗原受体T细胞或免疫细胞；
b2)制备肿瘤治疗药物；
其中，所述肿瘤为与Claudin18.2的表达相关的肿瘤疾病，包括胃癌、肠癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌和肺腺癌等，进一步为胃癌。
10.一种肿瘤治疗药物，其特征在于，所述肿瘤治疗药物其活性成分至少包含权利要求8所述T细胞；进一步的，所述药物还可以包含药物非活性成分，所述药物非活性成分是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂。
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