CN117551199A - 一种Claudin18.2纳米抗体的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纳米抗体制备技术领域，具体为一种Claudin18.2纳米抗体的制备方法及其应用。Claudin18.2靶点与肿瘤的发生密切相关，且在胃癌、胰腺癌等多种消化道癌种中异常表达的情况尤为明显，因此学术界将其作为癌症临床治疗的新靶点。本发明利用双峰驼制备Claudin18.2纳米抗体，并成功筛选出高亲和力，且在分子量上比全长抗体小很多的纳米抗体，能够有效识别和结合肿瘤细胞膜表面的Claudin18.2，在CAR‑T/CAR‑NK细胞疗法上的应用上非常有优势。

Description

一种Claudin18.2纳米抗体的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及纳米抗体制备技术领域，具体为一种Claudin18.2纳米抗体的制备方法及其应用。
背景技术
Claudin18.2(CLDN18.2)是Claudin蛋白质家族的一员，位于细胞膜表面，正常情况下仅低水平表达于胃粘膜分化上皮细胞，但在病理状态下，Claudin18.2在多种肿瘤中有的表达显著上调，包括80％的胃肠道腺瘤、60％的胰腺肿瘤。此外，CLDN 18.2活化还可见于食管癌、卵巢癌和肺腺癌中，因此是具有潜力治疗癌症的热门靶点。
靶向Claudin 18.2靶点的药品类型涉及单克隆抗体、双特异性抗体、CAR-T以及ADC，几乎包含了当下主要的生物创新药形式，尤以单克隆抗体在研数量最多。以Claudin18.2为靶点制备特异性抗体以及CAR-T/NK细胞疗法是当前研究的热点。因此，亟需一种可以快速筛选、快速产出高亲和力的Claudin18.2抗体的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Claudin18.2纳米抗体的制备方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种Claudin18.2纳米抗体，所述Claudin18.2纳米抗体为2F、10B、11C、12B中的任意一种，其中：
2F的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
10B的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
11C的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
12B的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
前述的一种Claudin18.2纳米抗体，
2F的DNA序列如SEQ ID NO.5所示；
10B的DNA序列如SEQ ID NO.6所示；
11C的DNA序列如SEQ ID NO.7所示；
12B的DNA序列如SEQ ID NO.8所示。
前述的任意一种Claudin18.2纳米抗体的抗原结合部分。
一种表达载体，其表达包含前述任意一项所述的一种Claudin18.2纳米抗体，所述表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体，RNA载体、质粒中的任一种。
一种宿主细胞，其包含前述的表达载体。
一种药物组合物，包括前述任意一项所述的一种Claudin18.2纳米抗体、表达载体或宿主细胞，以及至少一种药学上可接受的载体。
一种CAR-NK细胞，包括前述任意一项所述的一种Claudin18.2纳米抗体作为抗原结合区的CAR表达载体。
优选的，所述的CAR表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体，RNA载体、质粒中的任一种。
优选的，前述的药物组合物或CAR-NK细胞在制备用于诊断Claudin18.2相关疾病的试剂盒中的用途，所述疾病为Claudin18.2表达相关的肿瘤、慢性炎性疾病、免疫疾病和感染性疾病。
优选的，前述的药物组合物或CAR-NK细胞在制备恶性肿瘤药物中的应用，所述恶性肿瘤为表达Claudin18.2的消化道恶性肿瘤。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：本发明基于Claudin18.2靶点在胃癌、胰腺癌、食管癌等多种癌种中异常表达这一客观事实，将其作为癌症临床治疗的新靶点。本发明先利用双峰驼制备Claudin18.2纳米抗体，筛选的高亲和力纳米抗体在分子量上比全长抗体小了很多，能够有效阻断识别和结合肿瘤细胞膜表面的Claudin18.2，在预防或治疗肿瘤或/和癌症的药物领域具有价值，尤其在CAR-T/NK细胞疗法的应用中具有优势。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1骆驼免疫Claudin18.2抗原后血清滴度检测；
图2骆驼cDNA一轮PCR产物电泳图；
图3骆驼VHH二轮PCR产物电泳图；
图4骆驼VHH噬菌体展示库一轮淘筛克隆数检测；
图5第一轮Elisa结果，上板为Claudin18.2抗原包被结合噬菌体的结果，下板为脱脂奶粉对照；
图6第二轮Elisa结果，上板为脱脂奶粉对照，下板为Claudin18.2抗原包被结合噬菌体的结果；
图7 4种Claudin18.2纳米抗体的SDS-PAGE图；
图8利用流式的筛选结果；
图9 4种Claudin18.2纳米抗体与K562-clon-18.2的结合能力；
图10 4种Claudin18.2纳米抗体的亲和力ELISA检测结果；
图11AHC芯片特异性捕获11C、12B原理示意图；
图12 96孔板加样图；
图13 96孔板芯片位置图；
图14为11C与Claudin18.2 VLP的亲和力图；
图15为12B与Claudin18.2 VLP的亲和力图；
图16为靶向Claudin18.2的CAR表达慢病毒载体示意图；
图17CD107a脱颗粒实验图；
图18荧光素酶标记的细胞杀伤实验结果图；
图19RTCA实验结果图；
图20荷瘤小鼠皮下肿瘤包块的体积增长曲线；
图21荷瘤小鼠皮下肿瘤标本的比较。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中，主要材料的来源为：Claudin18.2抗原(恺佧生物，货号CLD-HE1822)；VHH特异性二抗(金斯瑞，#A01861)；pCANTAB-5E(Pharmacia，#PDS27-9401-01)；M13KO7辅助噬菌体(赛默飞Thermo，#18311019)；Fusion PCR模板构建法中用到的PCR试剂盒厂家：南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：P222-01；ProteinFactory Rxn反应体系，厂家：康码(上海)生物科技有限公司，货号：hyd1210000；CLDN18.2(Uniprot，#P56856-2)；AHC芯片，厂家：Sartorius，货号：18-0004；Protein transport inhibitor(BD，Cat：#554724)，PE-cy7 anti-hCD107a抗体(Biolegend，Cat：#328618)；E-plate 16板(Agilent，型号：#5469830001)；抗CD3 MicroBeads(Miltenyi，货号130-050-101)。
实施例：
一、抗体库的构建
1)选择Claudin18.2抗原作为激活VHH抗体的抗原标准品。
2)选择健康的2头双峰驼进行免疫，免疫方案如下步骤：
A、初次免疫，免疫前采血5mL，作为阴性血清；完全弗氏佐剂与抗原1：1混合，抗原用量0.5mg/骆驼，乳化后皮下多点注射；接种后，采集5mL外周血，检测免疫反应。
B、2周后进行第二次免疫，抗原与不完全弗氏佐剂1：1混合，乳化后皮下多点注射；抗原用量0.2mg/骆驼，接种后，采集5mL外周血，检测免疫反应。
C、2周后进行第三次免疫，抗原与不完全弗氏佐剂1：1混合，乳化后皮下多点注射；抗原用量0.2mg/骆驼，接种后，采集5mL外周血，检测免疫反应，测定抗体效价。
D、2周后进行第四次免疫，抗原与不完全弗氏佐剂1：1混合，乳化后皮下多点注射；抗原用量0.2mg/骆驼，接种后，采集5mL外周血，检测免疫反应，测定抗体效价。
E、2周后进行第五次免疫，抗原与不完全弗氏佐剂1：1混合，乳化后皮下多点注射；抗原用量0.2mg/骆驼，接种后，采集50mL外周血，检测免疫反应，测定抗体效价，用于纳米抗体库构建。
3)如上面步骤所示采集骆驼血清，通过ELISA的方法，采用骆驼VHH特异性二抗测定抗原免疫效价。
检测结果如图1所示：当血清稀释4000倍后，自第二次免疫后，其抗Claudin18.2的抗体OD值均高于初次免疫，说明免疫有效。并且第五次免疫后的血清稀释10000倍后OD值仍然高于初次免疫，说明多次免疫后针对该抗原的抗体滴度逐步提升。
4)分离淋巴细胞。当免疫5次后，采全血200mL，使用percoll密度离心法将淋巴细胞分离。并采用TRIZOL裂解淋巴细胞并收集RNA并逆转录成cDNA，用cDNA采用巢式PCR方法，进行两轮PCR扩增抗体重链可变区VHH基因片段；第一轮PCR扩增，回收500-750bp PCR条带(图2)。以回收的完整重链抗体及其重链可变区的基因片段为模板，用VHH二轮引物经第二轮PCR扩增，得到VHH目的基因，VHH目的基因位于250-500bp之间(图3)。
5)VHH片段转入TG1感受态细胞。将上述得到的VHH片段连接到pCANTAB-5E噬菌体展示载体质粒，电转化至TG1感受态细胞中，然后将感受态细胞涂布平板并计数。
二、噬菌体库淘筛
1)从-80℃冰箱中取出筛选Claudin18.2抗原，冰上放置解冻；
2)将抗原包被免疫管，4℃缓慢旋转过夜，同时平行包被5％脱脂奶粉(milk)作对照；
3)将过夜包被的免疫管中的液体弃掉，加入2mL PBS缓冲液室温清洗免疫管3次，每次旋转5分钟；
4)加入2mL 5％脱脂奶粉，室温旋转封闭2小时；
5)将封闭后的免疫管中液体丢弃，并加入1mL PBS缓冲液室温清洗免疫管3次，每次旋转5分钟；
6)弃掉免疫管中的清洗液，加入2ml PBS缓冲液，加入(步骤一、抗体库的构建)制备的噬菌体文库1mL，室温旋转孵育1小时；
7)将免疫管内液体弃掉，加入2mLPBST(1×PBS加0.1％Tween20，下同)缓冲液室温清洗免疫管9次；
8)将免疫管内液体弃掉，尽量去除残余液体，加入500μL Gly-HCl洗脱液，室温旋转洗脱8分钟；
9)加入500μL Tris-HCl中和缓冲液中和，将免疫管中的溶液转移至新的1.5mL离心管中。即为第一轮筛选噬菌体洗脱液；
10)取第一轮噬菌体洗脱液侵染TG1菌株，在1.5mL离心管中进行104及105两个梯度稀释(如图4)，进行平板计数。统计板上可以明显区分单菌落的稀释度的单菌落数量。通过克隆计数计算淘筛效率；
11)重复上述步骤进行第二轮淘筛。
三、Phage ELISA
1)挑取单克隆培养，OD到0.5时加入M13KO7辅助噬菌体，25℃培养过夜，离心收集上清；
2)将Claudin18.2抗原包被酶标板(1ng/μL，100μL/孔)，4℃包被过夜；
3)弃包被液，PBST洗涤3次，每孔加入300μL 5％脱脂牛奶，37℃封闭1小时，PBST洗涤3次，每孔加入100μL噬菌体培养菌液上清，孵育1小时；
4)PBST洗涤5次，加入辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体(用PBS按1：10000稀释)，100μL/孔，孵育1小时；
5)PBST洗板6次，加入TMB显色液显色，100μL/孔，37℃，7分钟，加入终止液终止反应，50μL/孔，于450nm下测光密度。
结果如图5和图6所示，空白板为加入牛奶的对照板，无显色反应表明没有特异性结合抗体；有显色板为加入噬菌体培养液上清后，发生显色反应的为特异性结合抗体克隆。
四、利用cell-free系统表达抗Claudin18.2纳米抗体(Claudin18.2nb)
4.1Fusion PCR模板构建法
1)5'seq,3'seq,Target ORF三片段制备
A.5'seq制备引物(使用终浓度为10μM)
D2P_1.08e_F：GGTGATGTCGGCGATATAGG
GSG-8HIS_R：ACCAGAACCGTGGTGGTGG
以pD2P质粒为模板(终浓度为10ng/μL)，常规PCR扩增5'seq片段；
B.3'seq制备引物(不含eGFP，使用浓度为10μM)
D2P_3'UTR_F：TAAATAAGGATTAATTACTTGGATGCC
D2P_1.08e_R：TTATTGCTCAGCGGTGGC
A,B的PCR反应条件：
C.Claudin18.2制备引物(使用终浓度为10μM)
F：ATCACCACCACCATCACGGGAGCGGCATGGCGGCCCAGCCGGCCATGGCA
R：GGCATCCAAGTAATTAATCCTTATTTACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTT
(步骤二、噬菌体库淘筛)获得的单克隆质粒作为模板
PCR反应条件：
2)5'seq,3'seq,Target ORF三片段PCR Fusion
PCR反应体系(50μL)：5'seq、3'seq及Target ORF片段的纯化产物各2μL，利用如下引物进行Fusion PCR扩增反应(使用终浓度为10μM)：
D2P_1.08e_F：GGTGATGTCGGCGATATAGG
D2P_1.08e_R：TTATTGCTCAGCGGTGGC
PCR反应条件：
4.2蛋白表达
Fusion PCR模板以1/45v/v加入至加水溶解的ProteinFactory Rxn反应体系，混匀并调整总反应体系为10mL。将上述反应液置于一次性摇瓶中混匀，透气膜封口或盖上盖子(不可完全封闭)，30℃，220rpm摇床上反应过夜。
4.3 His-Monster Beads磁珠纯化法
1)细胞裂解：1.5mL蛋白质工厂反应液，4℃4000rpm离心3分钟，收集上清；
2)结合：取1000μL His标签磁珠，用5mL结合缓冲液洗涤两次，磁吸收集磁珠，备用。向上述上清液中加入洗涤好的His标签磁珠，充分震荡30秒，置于4℃旋转混合1小时；
3)洗涤：将孵育后的样品，磁吸收集磁珠，吸弃上清；再加入1000μL洗涤缓冲液，充分震荡30秒，磁吸收集磁珠，吸弃上清，重复Wash共5次；
4)洗脱：向磁珠中加入500μL洗脱缓冲液，用枪头吸吹至混匀，静置1分钟后，磁吸磁珠，收集洗脱上清，即为目标蛋白，重复5-8次。
注：a.结合缓冲液：20mM Tris盐酸，500mM氯化钠，pH8.0；
b.洗涤缓冲液：20mM Tris盐酸，500mM氯化钠，20mM咪唑，pH8.0；
c.洗脱缓冲液：20mM Tris盐酸，500mM氯化钠，250mM咪唑，pH8.0。
五、流式筛选与K562-CLDN18.2高结合的抗Claudin18.2纳米抗体
1)获取CLDN18.2的氨基酸序列后，通过基因合成(金斯瑞生物科技)DNA片段克隆至慢病毒表达质粒，制备慢病毒后感染K562细胞获得过表达CLDN18.2的K562-CLDN18.2细胞；细胞计数重悬，密度为1×104/50μL；
2)50μL的细胞悬液中加入不同的抗Claudin18.2纳米抗体，4℃下共孵育30分钟；
3)加入Myc-Tag(9B11)Mouse mAb(1：400)，4℃下共孵育30分钟；
4)加入2mL PBS，400g离心5分钟；
5)100μl PBS重悬细胞，流式上机。以不加Claudin18.2为阴性对照。
结论：结果如图12所示，最终筛选出4种Claudin18.2纳米抗体，分别为2F，10B，11C，12B。
2F的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAGSGYVYPYYCMGWFRQAPGKERERVASIDRAGSQSYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMGSLEPEDTAMYYCATDLGDGLWYSGCGTYRYWGQGTQVTVSS；
10B的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：
EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASEQTYNRYCMGWFRQAPGKEREGVADINWRGIPNYSDSVKGRFTISQDHAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAARRGLPVVGCYDEYNIWGQGTQVTVSS；
11C的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：
DVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGAIYMRNYMAWFRQVPGKEREGVAGISASSGRTYYDDSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYFCAADPFQVMIDTMRYWGQGTQVTVSS；
12B的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：
EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAVSGYTYNLKYMGWFRQAPGKEREPVAFIYLGGDNQYYAPSVKDRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPDDTAMYYCAATTALLFLAQTSSWNYWGQGTQVTVSS。
2F的DNA序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGGCTCTGGATACGTGTACCCTTACTACTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGAGGGTCGCGTCTATTGATCGTGCTGGTAGTCAAAGTTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAGATAACGCCAAGAATACTCTGTATCTGCAAATGGGCAGCCTGGAACCTGAGGACACTGCTATGTACTATTGTGCGACAGATTTGGGTGATGGTCTGTGGTATTCGGGGTGTGGTACGTATCGCTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA；
10B的DNA序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCCGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGAACAGACTTACAATAGATATTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGATATTAATTGGCGTGGTATCCCAAACTACTCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGATCATGCCAAGAACACCCTATATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGATACTGCTATGTACTACTGTGCGGCTAGGCGCGGCCTGCCTGTTGTTGGGTGCTACGATGAGTATAACATCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA；
11C的DNA序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：
GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAGCCATCTACATGCGCAACTACATGGCCTGGTTCCGCCAGGTTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGGTATTAGTGCGAGTAGTGGACGCACATACTATGACGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTTCTGTGCGGCTGACCCTTTTCAAGTGATGATAGACACCATGAGGTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA；
12B的DNA序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGA
CTCTCCTGTGCAGTCTCTGGGTACACCTACAATCTCAAATACATGGGCTGGTTCCGTCAG
GCTCCAGGGAAGGAGCGCGAACCAGTCGCATTTATTTATCTTGGTGGAGATAATCAATAT
TATGCCCCCTCCGTGAAGGACCGATTCACCATCTCCCAAGACAACGCCAAGAACACGG
TGTATCTACAAATGAACAGCCTGAAACCTGACGACACTGCCATGTACTATTGTGCGGCG
ACCACTGCGCTGCTGTTCCTAGCACAAACTTCTTCCTGGAACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。
六、流式检测4种Claudin18.2纳米抗体与K562-CLDN18.2的结合能力
1)K562-CLDN18.2细胞，计数，重悬细胞，使之密度为2×104/50μL；
2)50μL的细胞悬液中加入不同浓度的4种Claudin18.2纳米抗体蛋白(50μL)，4℃下共孵育30分钟；
3)加入Myc-Tag(9B11)Mouse mAb(1：400)，4℃下共孵育30分钟；
4)加入2mL PBS，400g离心5分钟；
5)100μL PBS重悬细胞，流式上机。以不加Claudin18.2纳米抗体为阴性对照。
结果如图9所示，2F、10B、11C和12B抗体均可有效特异性结合表达Claudin18.2的K562细胞。
七、ELISA检测4种Claudin18.2纳米抗体的亲和力
1)将Claudin18.2抗原包被酶标板(100ng/mL，100μL/孔)，4℃包被过夜；
2)弃包被液，TBST洗涤3次，每孔加入100μL5％BSA，4℃封闭3小时；
3)TBST洗涤3次，每孔加入Claudin18.2纳米抗体-12B，4℃孵育2小时；
4)TBST洗涤5次，加入辣根过氧化物酶标记的抗Myc抗体(用TBST按1：1000稀释)，100μL/孔，4℃孵育1小时；
5)TBST洗板5次，加入TMB显色液显色，100μL/孔，室温，30分钟；
6)加入终止液终止反应，50μL/孔，于450nm下测光密度。
结果：如图10所示，Claudin18.2纳米抗体-12B与Claudin18.2抗原均有较好的结合能力八、抗Claudin18.2纳米抗体亲和力检测
1)因为11C、12B带Fc标签，可以通过AHC芯片特异性捕获11C、12B，信号达后5nm后，与Claudin18.2 VLP进行结合。原理示意如图11所示；
2)将11C、12B用SD buffer稀释至5ug/mL，固化300秒；
3)将Claudin18.2 VLP用SD buffer进行稀释，稀释至1μM，然后对半稀释共5个浓度梯度，即1μM、0.5μM、0.25μM、0.125μM、0.0625μM；
4)将样品按照图12顺序加入96孔板中，其中：
1、11列加入SD buffer(A1到F1孔、A11到F11孔)；
2、3列依次加入稀释好的11C、12B；
4列依次加入稀释好的Claudin18.2 VLP，浓度由高到低，其中F4加入SD buffer用于0浓度扣除；
12列加入甘氨酸·HCl用于芯片再生；
5)程序的设定如下表1所示；
表1
步骤 程序 描述 时间(s)
1 Baseline Baseline 60
2 Loading Loading 300
3 Baseline Baseline 60
4 Association Association 200
5 Dissociation Dissociation 300
6 Custom Custom 3
7 Custom Custom 3
8 Custom Custom 3
9 Custom Custom 3
10 Baseline Baseline 60
11 Loading Loading 300
12 Baseline Baseline 60
13 Association Association 200
14 Dissociation Dissociation 300
15 Custom Custom 3
16 Custom Custom 3
17 Custom Custom 3
18 Custom Custom 3
6)芯片位置按照图13所示；
该实验中共使用6根芯片，放置在第4列中。在实验开始前10分钟对芯片进行润湿。润湿缓冲为SD buffer。
表2
2种Claudin18.2纳米抗体与Claudin18.2 VLP的亲和力结果如图14、图15和上表2所示，11C、12B与Claudin18.2 VLP均有结合，11C与Claudin18.2 VLP亲和力为3.36E-08，12B与Claudin18.2 VLP亲和力为3.97E-08。
九、基于Claudin18.2纳米抗体11C和12B制备CAR-NK细胞
我们构建了11C或12B作为抗原结合区的CAR表达慢病毒质粒。Zolbetuximab(IMAB362)是人鼠嵌合抗Claudin18.2单克隆抗体，目前已进入III期临床试验。我们获取IMAB362的氨基酸序列(www.kegg.jp/entry/D11527)，将其scFv(表示为“362”)作为抗原结合区的CAR作为识别Claudin18.2的阳性对照。这些载体表达CAR之外还同时表达IL-15用于提高NK细胞的体内驻留能力，以及NGFR用于检测CAR表达。靶向Claudin18.2的CAR表达慢病毒载体示意图如图16所示。
首先通过在HEK293T细胞中包装获得慢病毒载体颗粒，感染脐带血来源的NK细胞制备CAR-NK细胞。具体步骤如下：
1、脐带血单个核细胞的获取和冻存
首先从脐带血中分离获得NK细胞，去除CD3阳性T细胞，步骤如下：
1)稀释脐带血：根据脐带血的体积，按照脐带血：生理盐水＝1：3稀释混匀；
2)Ficoll分离：50mL离心管中加入20mL的Ficoll分离液，将25mL稀释后的脐带血缓慢加入Ficoll分离液上层，保持界面清晰，800g，20分钟；
3)获取单个核细胞：离心结束后可看到明显的白膜层细胞，弃掉血浆，将白膜层细胞转移至新的离心管中；
4)磁珠法去除T细胞：得到的脐带血单个核细胞洗涤两遍(400g，5分钟)，根据细胞计数，在1×107总细胞中加入20μL抗CD3 MicroBeads混匀后4℃孵育15分钟；洗涤两遍后，用500μL的Buffer重悬细胞(最大细胞标记数＜1×108)，缓慢流过置于分离架上LS柱；3mL的Buffer洗涤LS柱两遍，收集的细胞悬液洗涤两遍；细胞悬液离心，计数，取部分细胞流式检测CD56和CD3的表达；
5)冻存：以上获取的已去除T细胞的脐带血单个核细胞冻存于-80℃液氮罐中。
2、慢病毒载体的制备
制备用于感染NK表达CAR分子的慢病毒载体，步骤如下：
1)293T细胞汇合度为80-90％时进行转染，转染前2小时更换包装病毒用培养基(10％FBS Opti-MEM)；
2)四质粒包装系统制备慢病毒，包括三个辅助质粒及CAR表达慢病毒质粒，加入Lipo2000等转染试剂制备转染试剂混合物；
3)混匀后室温孵育15-25分钟，沿侧壁加入293T细胞中；
4)48小时后收集病毒上清；
5)将上清液进行0.45μM孔径过滤后，使用超速离心的方法进行浓缩
6)使用NK-92MI细胞株进行慢病毒功能滴度检测，测得功能滴度结果在1×107～1×108TU/mL范围内，可进行后续的实验。
3、CAR-NK细胞的制备
1)第0天，复苏脐带血的单个核细胞并计数；
2)按单个核细胞：滋养细胞(过表达CD137L和膜IL-21的K562细胞)数量2：1的比例加入滋养细胞，培养基为AIM-V+10％FBS+100IU/mL IL-2；
3)培养5天，按MOI 5加入慢病毒，同时加入助转剂鱼精蛋白10μg/mL；混匀后将培养平底板在1200g，37℃离心90分钟；
4)离心结束后放入培养箱中培养4小时后进行细胞换液，弃去病毒液，换新鲜的NK细胞培养基；
5)第7天，通过流式细胞术分析CD56+NK细胞比例以及CAR表达情况的分析；按照NK细胞：滋养细胞数量1：3的比例，加入滋养细胞继续培养；
6)第12天，获得增殖后的CAR-NK进行后续的功能研究实验。
十、CAR-NK细胞靶向杀伤Claudin18.2阳性肿瘤细胞的体外功能验证
我们首先制备了过表达Claudin18.2的胃癌细胞系AGS和MKN-45作为靶细胞，使用CAR-NK进行CD107a脱颗粒实验(图17)、荧光素酶标记的细胞杀伤实验(图18)和RTCA实验(图19)验证11C或12B来源CAR-NK细胞对Claudin18.2细胞的特异性杀伤。
CD107a脱颗粒实验
1)靶细胞铺板：收集对数生长期的肿瘤细胞AGS或MKN-45，离心后计数，按每孔1E5个细胞加入96孔U底板中；
2)效应细胞铺板：收集CAR-NK细胞，将CAR％比例调成一致，总NK细胞数量也调整一致，按每孔1E5个细胞加入96孔U底板中与靶细胞共培养4-6小时；每孔按总体积的1：2000加入Protein transport inhibitor，1：500加入PE-cy7 anti-hCD107a抗体；
3)细胞混合物用FACS buffer洗涤两遍，加入流式抗体如NGFR等抗体避光4℃染色20分钟；
4)用FACS buffer洗涤两遍后，重悬后在流式细胞仪检测。
结果如图17所示，流式细胞术检测提示11C或12B来源的CAR-NK细胞(NGFR阳性细胞)接触靶细胞AGS或MKN-45后，显著进行CD107脱颗粒反应。
荧光素酶标记的细胞杀伤实验
1)靶细胞铺板：收集对数生长期的肿瘤细胞AGS或MKN-45，稳定转入Claudin18.2和荧光素酶，离心后计数，1E4个靶细胞铺板；
2)收集各CAR-NK细胞，流式测CAR％，调整各个分组的CAR％和NK细胞总数一致；
3)计算铺板所需的CAR-NK细胞数，并对不同效靶比所需的CAR-NK细胞重悬后铺板；设置阳性对照(Kmax，用Triton 100)和阴性对照(Kmin，培养基)；
4)每孔的细胞混合物轻轻混匀，放入培养箱中孵育4-6h后，离心洗涤两遍后加入0.5mM荧光素酶底物，37℃避光孵育10分钟；酶标仪选择化学发光模式读取数据K；
5)计算杀伤效率％＝(Kmin-K)/(Kmin-Kmax)×100％。
结果如图18所示，比较CBNK，11C纳米抗体来源的CAR-NK细胞(11C-84315L)在不同的效靶比条件下，均显示出对表达Claudin18.2的AGS或者MKN-45细胞显著增强的杀伤能力。
RTCA实验
1)E-plate 16板每个孔中加入50mL培养基，测定基线值，确保每个孔的光学密度(OD)值相同；
2)每个孔铺入10000个MKN-45细胞；
3)E-plate 16板的每个孔中加入150μL培养基，放入xCELLigence RTCA仪中，检测细胞的OD值；
4)当OD值增长到约1.0时，将CAR-NK细胞离心后细胞密度调整为10000/mL；
5)中断RTCA实验，按分组在每个孔中加入200uL经调整密度的CAR-NK细胞；
6)将E-plate 16板放回RTCA仪器上，继续检测OD值，以评估CAR-NK细胞对靶细胞的特异性杀伤功能。
结果如图19所示，11C纳米抗体来源的CAR-NK细胞(11C-84315L)在1：3或1：6的效靶比条件下，可以显著杀伤表达Claudin18.2的MKN-45细胞。
十一、小鼠移植瘤模型验证CAR-NK细胞的体内抗肿瘤功能
我们使用11C纳米抗体来源的CAR-NK细胞(11C-84315L)，用于治疗表达Claudin18.2的MKN-45移植NSG小鼠。实验显示，和多次注射的对照NK细胞相比，11C-84315L对胃癌细胞有明显的杀伤作用(图20)。
1)收集对数生长期的MKN-45胃癌细胞株，按每只小鼠1.5E6细胞，在重度免疫缺陷NSG小鼠进行肋部皮下注射；
2)每周进行2次皮下成瘤观察和测量，10天后评估成瘤情况并进行随机分组，具体分组如下：
(a)PBS组：只注射PBS溶液，每周注射1次，连续3周(4只动物)；
(b)CBNK组：注射普通的对照NK细胞，每周注射1次，连续3周(4只动物)；
(c)11C-84315L组：注射11C纳米抗体来源并表达IL15的CAR-NK细胞，注射1次(4只动物)；
3)每周2次使用游标卡尺测量皮下肿瘤包块的长度(L)和宽度(W)，通过V＝(W^2×L)/2计算体积。评估肿瘤进展情况，在肿块大于1000mm3时处死小鼠，剥出皮下肿块进行比较，如图21所示，使用11C纳米抗体来源的CAR-NK细胞(11C-84315L)处理小鼠后，比较PBS或CBNK组，可以显著抑制MKN-45胃癌细胞在小鼠体内的生长。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种Claudin18.2纳米抗体，其特征在于，所述Claudin18.2纳米抗体为2F、10B、11C、12B中的任意一种，其中：
2F的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
10B的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
11C的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
12B的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的一种Claudin18.2纳米抗体，其特征在于：
2F的DNA序列如SEQ ID NO.5所示；
10B的DNA序列如SEQ ID NO.6所示；
11C的DNA序列如SEQ ID NO.7所示；
12B的DNA序列如SEQ ID NO.8所示。
3.如权利要求1～2中任意一项所述的一种Claudin18.2纳米抗体的抗原结合部分。
4.一种表达载体，其表达包含权利要求1～2中任意一项所述的一种Claudin18.2纳米抗体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体，RNA载体、质粒中的任一种。
5.一种宿主细胞，其特征在于，其包含权利要求4所述的表达载体。
6.一种药物组合物，其特征在于：包括权利要求1～2中任意一项所述的一种Claudin18.2纳米抗体或权利要求4所述的表达载体、或权利要求5所述的宿主细胞，以及至少一种药学上可接受的载体。
7.一种CAR-NK细胞，其特征在于，包括权利要求1～2中任意一项所述的一种Claudin18.2纳米抗体作为抗原结合区的CAR表达载体。
8.根据权利要求7所述的一种CAR-NK细胞，其特征在于，所述的CAR表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体，RNA载体、质粒中的任一种。
9.权利要求6所述的药物组合物或权利要求7所述的CAR-NK细胞在制备用于诊断Claudin18.2相关疾病的试剂盒中的用途，所述疾病为Claudin18.2表达相关的肿瘤、慢性炎性疾病、免疫疾病和感染性疾病。
10.权利要求6所述的药物组合物或权利要求7所述的CAR-NK细胞在制备恶性肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述恶性肿瘤为表达Claudin18.2的消化道恶性肿瘤。
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