KR100476342B1

KR100476342B1 - 에스트로겐 수용체 α 유전자와 전사 공역인자 유전자가도입된 효모 이중-하이브리드 시스템을 이용한 내분비계장애물질의 검출 방법

Info

Publication number: KR100476342B1
Application number: KR10-2002-0066727A
Authority: KR
Inventors: 류재천; 이행석
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2002-10-31
Filing date: 2002-10-31
Publication date: 2005-03-17
Also published as: KR20040039082A

Abstract

본 발명은 효모를 이용한 인간의 내분비계 장애활성을 가지는 화학물질의 검출 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 리간드(ligand)에 의존적으로 표적유전자(target gene)의 전사(transcription)를 활성화시키는 기능을 하는 핵 내 수용체 호르몬의 특징을 이용하여 내분비계 장애활성을 가지는 화학물질(estrogenic chemicals)을 검출하는 방법에 관한 것으로서, 인간 유래의 에스트로겐 수용체 α와 전사 공역인자(co-activator)를 효모에 도입하여 이중-하이브리드 시스템(two-hybrid system)을 발현시키고, 염색체 상에 도입시킨 리포터 유전자의 발현을 모니터하여 에스트로겐 수용체의 리간드 의존적인 전사 활성화를 측정함으로써 내분비계 장애활성을 가지는 에스트로겐 유사물질을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하면 포유동물이나 어류 등을 사용하지 않고도 환경에 존재하는 다수의 화학물질에 대하여 사람 또는 동물의 내분비계에 영향을 미치는 특정 화학물질을 보다 간편하고 신속한 생물학적 방법으로 검출할 수 있다.

Description

에스트로겐 수용체 α 유전자와 전사 공역인자 유전자가 도입된 효모 이중-하이브리드 시스템을 이용한 내분비계 장애물질의 검출 방법{Method for detecting endocrine disruptors using yeast two-hybrid system containing hERα gene and co-activator gene}

본 발명은 효모를 이용한 인간의 내분비계장애 활성을 가지는 화학물질의 검출 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 리간드에 의존적으로 표적유전자의 전사를 활성화시키는 기능을 하는 핵 내 수용체의 특징을 이용하여 내분비계 장애활성을 가지는 화학물질을 검출하는 방법에 관한 것이다.

내분비계장애물질(Endocrine Distruptors, EDs)은 생체내 호르몬 작용에 영향을 미치고, 내분비계 장애를 일으키는 외인성 화학물질이다. 이들은 호르몬 수용체의 결합부위를 점령함으로써 생체내 호르몬과 동일하게 작용하거나, 호르몬과 경합(competition)함으로써 그 작용을 방해하고, 또는 호르몬의 합성이나 사이토크롬(cytochrome) P450 등의 대사효소 작용을 방해하여 그 농도를 변화시키는 것으로 알려져 있다. 특히, 이들 내분비계장애물질은 여러 호르몬 중 성호르몬에 의한 체내 조절계의 혼란을 야기하여 야생생물 및 인간의 생식에 악영향을 미쳐 심각한 문제로 대두되고 있다. 현재, 일상생활에서 접하는 여러 화학물질들이 EDs로 분류되고 있는데, 이들의 영향력이 기존의 일반 독성과 같이 개체의 죽음으로 끝나는 것이 아닌 종의 멸종이라는 점에서 인간뿐만 아니라 야생생물에 대하여도 그 심각성이 매우 크다.

EDs가 주로 결합하는 것으로 알려진 핵 내 호르몬 수용체는 스테로이드 호르몬과 결합하여 그들 표적 유전자의 전사를 조절한다. 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER)는 핵내 수용체(nuclear receptor) 수퍼패밀리(superfamily)에 속하며(Mangelsdorf D. J. et al., Cell 83, 835, 1995), 배 발생기에는 다양한 생물학적 기능을 조절하고, 그 이후에는 생리학적인 조절 기능을 하는 것으로 알려져 있다. ER은 A/B, C, D, 및 E/F의 6개 영역(domain)으로 이루어져 있다. E 영역은 에스트로겐 결합 영역(estrogen binding domain), C 영역은 DNA 결합 영역(DNA binding domain)이며, 핵 이행 신호 영역(nuclear localization signal domain), 열 충격 단백질 90(heat shock protein 90, hsp 90) 결합 영역(binding domain), 이량체 형성 영역, 전사 활성화 인자(transcription activating factor, AF)의 기능을 하는 것으로써 N 말단 (A/B 영역)에 존재하는 AF-1 및 C 말단(E/F 영역)에 존재하는 AF-2로 특정되어 있다(Mangelsdorf, D. J. et al., Cell 83, 835, 1995; Tsai, M. J. et al., Annu. Rev. Biochem. 63, 451, 1994; Barettino, D. et al., EMBO J. 13, 3039, 1994; Durand, B. et al., EMBO J. 13, 5370, 1994; Kumar, V. et al., Cell 51, 941, 1987).

전사 공역인자(co-activator)는 호르몬과 수용체의 결합에 의한 수용체의 입체구조 변화를 식별하여 정보를 기본 전사 장치에 전달하는 기능을 하는데, 단백질 인자로서 새로운 종류가 계속적으로 발견되어 왔으며, 전사를 활성화하는 인자이기 때문에 전사 공역인자(co-activator)로 불려지고 있다(Voegel, J. J., et al., EMBO J. 15, 3667, 1996; Horwitz, K. B. et al., Mol. Endocrinol. 10, 1167, 1997). 이들은 리간드 의존적으로 수용체와 상호 작용하여, 그 신호를 기본 전사 장치에 전달하는 것으로 추측된다. 현재, 동정된 전사 공역인자로는 분자량이 약 160 kDa으로 기능이 비교적 유사한 TIF-2(transcriptional intermediate factor-2) 및 AIB-1(amplified in breast cancer-1) 단백질이 잘 알려져 있다(Onate, S. A. et al., Science 270, 1354, 1995; Anzick, S. L. et al., Science 277, 965, 1997; Voegel, J. J., et al., EMBO J. 15, 3667, 1996). 이들 TIF-2 및 ABA-1 단백질은 아미노산 수준에서 45%의 상동성을 나타낸다. 이들은 bHLH 영역(basic helix-loop-helix domain), PAS(Per/Arnt/Sim)영역, 그리고 세린(serine) 및 트레오닌(threonine)이 다수 존재하는 영역(S/T rich domain)을 가지고 있다. 또한, TIF-2의 C 말단에는 글루타민(glutamine)이 풍부한 영역(Q-rich domain)이 존재하는 반면, AIB-1에는 상기 Q-rich 영역 뿐만 아니라 폴리글루타민 영역(polyglutamine tract)이 존재한다(Anzick, S. L. et al., Science 277, 965, 1997; Paulo, H. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 8479, 1997). 이 밖에도 핵 내 수용체(nuclear receptor)와 상호 작용하는 LXXLL 모티브(L=류신, X=불특정 아미노산)가 AIB-1 및 TIF-2에 각각 3개가 포함되어 있으며, 리간드에 의존적으로 핵 내 수용체의 E 영역과 전사 공역인자의 LXXLL 모티브가 직접 상호 작용하는 것으로 생각된다.

인류는 1,500만 종류에 달하는 화학물질을 합성 또는 동정해 왔다. 그리고, 현재 약 10만 종류의 화학물질이 상업적으로 이용되고 있다. 이들 화학물질 중에 유기염소화합물, 공업용화합물, 농약류, 유기취소(bromine) 화합물, 중금속 및 유기금속, 식물 및 합성 에스트로겐 등을 포함한 수십종의 화합물이 EDs로 생각되거나 혹은 의심되고 있다. 그러나, 대부분의 다른 화합물에 대해서는 그들이 내분비계 장애 활성을 가지고 있는지에 대한 충분한 검증 자료가 없어 이들 화학물질의 내분비계 장애 활성을 평가하기 위하여 신속하고도 간편한 검출계의 확립이 중요하다.

이에, 본 발명자들은 리간드에 의존적으로 핵 내 수용체가 표적 유전자의 전사를 활성화하는 원리를 이용한 에스트로겐 유사 화학물질(EDs)의 검출 방법을 구축하기 위하여, 인간 유래의 에스트로겐 수용체 α (hERα)의 리간드 결합 영역(ligand binding domain, LBD) 또는 전장(full-length)과 GAL4 DNA 결합 영역(GAL4 DNA binding domain, GAL4 DBD)과의 융합 단백질, 그리고 GAL4 전사 활성화 영역(GAL4 transcription activating domain, GAL4 TAD)과 전사 공역인자와의 융합 단백질을 리포터 유전자군(UASGAL4-TATA-lacZ)이 삽입된 효모에서 발현시켜, 각종 화학물질의 에스트로겐 유사 활성(내분비계장애 활성)을 측정하고 분석할 수 있는 이중-하이브리드 시스템을 구축함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 환경에 존재하는 다수의 화학물질 중, 사람 또는 동물의 내분비계에 영향을 미치는 특정 화학물질, 특히 에스트로겐 유사 화학물질(EDs)을 핵 내 수용체가 리간드에 의존적으로 표적 유전자의 전사를 활성화하는 원리를 이용하여, 에스트로겐 수용체와 전사 공역인자(co-activator)의 유전자에 의한 이중-하이브리드 시스템(two-hybrid system)을 효모에 도입하여 내분비계장애 활성을 가지는 것으로 의심되는 특정 화학물질의 일정 농도하에서 발현시키고, 이의 발현에 의하여 조절되는 리포터 유전자의 발현 정도를 모니터하여, 에스트로겐 수용체 α의 리간드 의존적인 전사 활성화 정도를 측정함으로써 내분비계장애 활성을 가지는 에스트로겐 유사물질을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 효모 이중-하이브리드 시스템(two-hybrid system)을 이용한 내분비계 장애활성을 가지는 화학물질의 검출 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 인간 에스트로겐 수용체 α(human estrogen receptor α, hERα) 유전자의 전장 또는 이의 일부 유전자 및 전사 공역인자(co-activator)의 유전자를 효모 내에서 발현시키기 위한 발현벡터 및 이들이 도입된 효모 형질전환체를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 효모 이중-하이브리드 시스템(two-hybrid system)을 이용한 내분비계 장애 활성을 가지는 화학물질의 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 화학물질의 검출 방법은

1) 에스트로겐 수용체 α 유전자 및 전사 공역인자 유전자가 도입된 효모의 이중-하이브리드 시스템에 검출하고자 하는 화학 물질을 처리하는 단계; 및

2) 효모의 염색체 상에 도입시킨 리포터 유전자의 발현정도를 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명자들은 효모 전사 인자 GAL4의 DNA 결합 영역에 내분비계 호르몬의 수용체 유전자를 융합시키고, GAL4 전사 활성화 영역에 전사 공역인자를 융합시켜, 이들의 발현에 의해 리포터 유전자의 발현이 조절되는 효모의 이중-하이브리드 시스템을 구축하였다. 이러한 효모의 이중-하이브리드 시스템에 내분비계장애 활성을 가지는 화학물질을 처리하게 되면 이에 의존적으로 리포터 유전자의 발현이 조절되므로 처리한 화학물질의 내분비계장애 활성을 측정할 수 있다.

효모의 이중-하이브리드 시스템은 두 종류의 융합 단백질을 사용하는 것이 가장 중요하다. 효모의 GAL4와 같은 많은 전사 인자들은 두 개의 물리적으로 분리 가능한 모듈 영역, 즉 DNA 결합 영역과 전사 활성화 영역으로 구성되어 있다. GAL4의 DNA 결합 영역에 내분비계 호르몬의 수용체 유전자, 바람직하게는 인간 유래의 에스트로겐 수용체 α (hERα) 유전자의 전장(full-length) 또는 이의 리간드 결합 영역(ligand binding domain, LBD)을 포함한 일부 유전자를 융합시키고, GAL4 전사 활성화 영역에는 전사 공역인자, 바람직하게는 TIF2(transcriptional intermediate factor-2)를 융합시킨다. GAL4 활성이 효모내에서 단백질간의 결합에 의해 재구성 (reconstitution)되면 CYC1 프로모터하의 lacZ 리포터 유전자가 발현되고 β-갈락토시다제 활성을 측정할 수 있다. 이 때, 상기 GAL4의 DNA 결합 영역에 융합된 내분비계 호르몬의 수용체는 내분비계장애 활성을 가지는 화학물질을 처리하게 되면 서로 결합하여 구조 변화가 일어나고, 전사를 활성화 시키는 인자인 전사 공역인자와 상호작용하여 GAL4 DBD가 특이한 UASGAL4(GAL4 Upstream Activating Sequence)의 염기배열에 결합함으로써, 그 신호가 기본 전사장치에 전달되어 리포터 유전자의 전사가 활성화되는 메카니즘에 의하여 내분비계장애 활성을 가지는 화학물질을 검출할 수 있다(도 9 참조).

또한, 본 발명은 인간 에스트로겐 수용체 α(hERα) 유전자의 전장 또는 이의 일부 유전자 및 전사 공역인자의 유전자를 효모 내에서 발현시키기 위한 발현벡터 및 이들이 도입된 효모 형질전환체를 제공한다.

구체적으로, 본 발명자들은 보다 효율적인 내분비계장애 활성을 가지는 화학물질의 검출 방법을 구축하기 위하여 다양한 이중-하이브리드 시스템이 작용하는 효모의 형질전환체를 제조하였다. 이를 위하여 발현벡터를 제조하였는데 먼저, 표적 단백질과의 융합 단백질 제작을 위해 일반적으로 사용되는 플라스미드인 pGBT9(clontech)의 효모 GAL4의 DNA 결합 영역(GAL4 DNA binding domain, GAL4 DBD)에 hERα LBD 또는 hERα의 전장 cDNA를 삽입시켜 'GAL4 DBD-hERα LBD' 또는 'GAL4 DBD-hERα full-length' 제조하였다. 또한, pGAD10 (clontech)의 GAL4 전사 활성화 영역(GAL4 Transcriptional Activity Domain, GAL4 TAD)에 전사 공역인자인 TIF2 유전자를 삽입하여 'GAL4 TAD-TIF2' 제조하였다. 상기 각각의 발현벡터는 효모, 바람직하게는 GAL4의 DBD가 특이하게 결합하는 UASGAL4의 하류에 CYC1 프로모터(TATA) 및 lacZ 유전자를 포함하는 리포터 유전자를 염색체 상에 삽입시킨 효모 사카로마이시스 세레비세(Saccaromyces cerevisiae) YRG-2(MATa ura3-52, his-200, ade2-101, lys-801, trp1-901, leu2-3, 112, gal4-542, GAL80-538, LYS::UASGAL1-TATAGAL1-HIS3, URA3::UASGAL4 17mers(X3)-TATACYC1- lacZ) (Stratagene)에 각각의 발현백벡터를 도입시켜 형질전환체를 제조하였다. 제조한 효모 형질전환체는 hERα LBD+TIF2와 hERαfull-length+TIF2가 있으며, 이중 hERα full-length+TIF2는 2002년 10월 4일자로 한국 미생물 보존 센터에 기탁하였다(수탁번호: KCCM 10431).

본 발명자들은 상기에서 제조한 효모 형질전환체에 기존에 내분비계 장애물질로 알려진 화학물질을 처리하여 그 유용성을 검증하였다. 리포터 유전자인 lacZ 유전자가 발현되면 β-갈락토시다제를 생성하는데 이 β-갈락토시다제는 기질인 ONPG(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)를 분해하여 황색의 ONP(ο-nitrophenol)을 생성하게 된다. 상기 ONP를 정량함으로써 β-갈락토시다제의 활성을 측정할 수 있으며, 이는 곧 처리한 화학물질의 내분비계장애 활성 정도를 의미한다.

먼저 효모 형질전환체는 SD 선택배지에서 배양하여 집균한 후, Z-완충용액(60 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl, 1 mM MgSO₄ 및 35 mM β-mercaptoethanol)에 현탁하고, 균체를 파괴, 분리한 뒤, 그 상등액을 효소액으로 사용한다. 처리할 화학물질은 유기용매인 DMSO에 녹여 배양시 첨가한다. 효소액 농도의 정량은 Bio-Rad의 단백질 분석 시약을 이용하여 595 nm에서 흡광도 값을 측정함으로써 수행한다.

β-갈락토시다제의 활성을 측정하기 위해서는 먼저 효소액을 Z-완충용액으로 희석하고, 여기에 ONPG 용액을 가하여 30℃에서 보온한 뒤, 반응액이 엷은 노란색으로 변하는 시점에서 1M 의 Na₂CO₃ 용액을 첨가한다.

흡광도 측정조건에 의한 ONP의 몰(mol) 흡광계수를 21300 M^-1㎝^-1으로 하고, 1 유니트(unit)를 1 분동안 1X10^-3 μ㏖의 ONP를 생산하는 효소량으로 정의한다. 모든 실험은 최저 3 회 이상 반복 수행하고, 측정치로부터 표준편차를 구하여 재현성을 확인하였다. 단백질 1 mg에 해당하는 유니트의 수는 하기의 식을 이용하여 계산하였다.

이중-하이브리드 시스템을 이용한 β-갈락토시다제의 활성 실험에서는 처리한 내분비계 장애물질, 즉 천연 및 합성 스테로이드 호르몬이나 살충제 및 산업용 화학물질에 대하여 거의 모두 장애활성이 검출되는 것을 확인하였다. 또한 hERα LBD와 TIF2의 이중-하이브리드 시스템보다 hERα 전장과 TIF2의 이중-하이브리드 시스템을 도입한 효모에서 내분비계 장애 활성 측정의 민감도가 높게 나타났다. 즉 hERα 전장과 TIF2의 이중-하이브리드 시스템을 도입한 효모에서는 저농도로 처리하여도 높은 β-갈락토시다제의 활성이 검출된다.

이중-하이브리드 시스템은 전사 공역인자를 도입함으로써 포유동물 세포와 효모간 전사도구의 차이를 극복하여 보다 포유류에 가까운 조건에서 각종 화학물질에 대한 내분비계장애 활성을 가진 화합물을 분석할 수 있는 새로운 시스템이다.

내분비계장애 활성을 나타낸 모든 화학물질들의 리포터 유전자 발현을 위한 필요 농도는 다르지만 이들의 상대적인 내분비계장애 활성 수치는 다른 검출방법(MCF-7 증식 시험법(E-SCREEN assay), 수용체 결합 시험(Receptor binding assay), 리포터 유전자 발현 검출법(Recepter gene expression assay))에 의하여 조사된 내분비계장애 활성의 수치와 거의 일치한다(Soto, A.M., et al., J. Steroid Biochem. 23, 87, 1985; Soto, A.M, et al., Environ. Health Perspect. 103(suppl 7), 113, 1995; Waller C.L, et al., Res. Toxicol. 9, 1240, 1996; Kuiper G.G, et al., Endocrinology 139, 4252, 1998; Metzger, D., et al., Nature 334,31, 1988; McDonnell, D.P., et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 39, 291, 1991). 다수의 화학물질은 천연 호르몬에 비하여 약한 내분비계 장애활성을 가진다. 또한 효모 배양액에 첨가하는 화학물질의 농도를 높이면 β-갈락토시다제 활성은 상승하지만 일단 최대치에 도달하면 그 이상의 농도에서는 역으로 활성이 감소된다. 이는 고농도의 세포독성 및 길항제(antagonist)의 작용 때문으로 생각된다. 따라서 특정 화학 물질에 대한 내분비계 장애 활성을 측정할 경우 단계적으로 농도를 바꾸면서 조사할 필요가 있으나, 본 발명의 검출 방법은 광범위한 내분비계장애 작용을 가진 물질에 대하여 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 발현 벡터의 제조

<1-1> pGAL4 DBD-hERα LBD의 제조

먼저, 'pGAL4 DBD-hERαLBD'는 GAL4의 DNA결합 영역(GAL4 DNA binding domain, GAL4 DBD)과 표적 단백질과의 융합 단백질 제작을 위해 사용되는 플라스미드 pGBT9(clontech)의 제한 효소 EcoRI과 SalI 부위에, hERα LBD 의 311번 아미노산에서 595번 아미노산까지를 포함하고 있는 hERα LBD cDNA의 EcoRI과 SalI 단편을 삽입시켰다(도 1). 상기 단편의 염기배열 해석은 ABI PRISMTM 310 유전자 분석기(genetic analyzer)를 이용하여 확인하였다.

<1-2> pGAL4 DBD-hERα full-length의 제조

hERα의 전장을 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 증폭시키기 위하여, 플라스미드 pSGI-hERα(Sasagawa S.I. et al., Analy. Biochem. 289, 295, 2000)를 주형(template)으로 사용하였다. PCR에 이용한 시발체(primer)는 서열번호 1로 기재되는 'hERα 전장 forward/EcoRI' 시발체와 서열번호 2로 기재되는 'hERα 전장 reverse/SalI' 시발체이다. 반응조건은 98℃에서 5 초, 55℃에서 30초, 72℃에서 90초로 총 25회 수행하였다. 증폭된 DNA 단편은 제한효소 EcoRI 및 SalI으로 절단하여 pBluscript Ⅱ SK+에 클로닝하고, ABI PRISMTM 310 유전자 분석기(genetic analyzer)를 이용하여 염기배열을 확인하였다. 상기의 DNA 단편은 다시 제한효소 EcoRI과 SalI으로 절단하고, pGBT9의 동일한 제한효소 부위로 클로닝하여 효모의 hERα의 전장과 GAL4 DBD의 융합 단백질을 발현시키기 위한 'pGAL4 DBD-hERα full-length'를 제조하였다(도 2).

<1-3> pGAL4 TAD-TIF2의 제조

GAL4의 전사 활성화 영역(GAL4 Transcriptional Activity Domain, GAL4 TAD)과 여러 가지 단백질과의 융합단백질을 제조하기 위하여, 플라스미드 pGAD10(Clontech)의 제한효소 EcoRI 부위에, TIF-2의 670번 아미노산부터 1750번 아미노산까지를 포함하는 TIF-2 cDNA EcoRI 단편을 삽입하여 'pGAL4 TAD-TIF2'를 제조하였다(도 3).

<실시예 2> 효모 형질전환체의 제조

UASGAL4의 하류에 CYC1 프로모터(TATA) 및 lacZ 유전자를 포함하는 리포터 유전자군을 염색체 상에 삽입시킨 효모 사카로마이시스 세레비세(Saccaromyces cerevisiae) YRG-2(MATa ura3-52, his-200, ade2-101, lys-801, trp1-901, leu2-3, 112, gal4-542, GAL80-538, LYS::UASGAL1-TATAGAL1-HIS3, URA3::UASGAL4 17mers(X3)-TATACYC1 -lacZ)(Stratagene)에 상기 실시예 1에서 제조한 발현벡터를 초산리튬법(Daniel et al., Methods in Enzymol. 194, 182, 1991)을 이용하여 도입시켜 형질전환체를 제조하였다. 제조한 효모 형질전환체는 hERα LBD+TIF2, hERα+TIF2로 각각 명명하였고, 이중 hERα+TIF2는 2002년 10월 4일자로 한국 미생물 보존 센터에 기탁하였다(수탁번호: KCCM 10431).

<실시예 3> β-갈락토시다제의 활성 측정

먼저, 효모 형질전환체를 2 ㎖의 SD 선택배지에서 30℃로 24 시간 전배양하고 이를 다시 9.7 ㎖의 SD 배지에 2 % 식균하였다. 여기에 에스트로겐 유사 활성을 측정하고자 하는 화학물질을 유기용매인 DMSO에 녹여 100 ㎕ 첨가하여 배양하는데, 이 때 여성 호르몬인 에스트로겐 17β-에스트라디올(estradiol, E2) 및 DMSO를 첨가한 것도 동시에 배양하여 양성대조군 및 음성 대조군으로 사용하였다. 배양 조건은 30℃에서 11 시간동안 300 rpm으로 진동 배양하였다. 집균 후, 균체를 냉각수로 세정하고, 1 ㎖의 Z-완충용액(60 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl, 1 mM MgSO₄ 및 35 mM β-mercaptoethanol)에 현탁한 뒤, 글래스 비드(glass beads)를 첨가하였다. 1 분 동안 진탕한 후, 1 분 이상 얼음에 냉각시키는 과정을 3회 이상 실시하여 균체를 파괴하고, 원심분리기를 이용하여 글래스 비드와 비파괴 균체를 분리한 뒤, 그 상등액을 효소액으로 사용하였다. 효소액 농도의 정량은 Bio-Rad의 단백질 분석 시약을 이용하여 595 nm에서 흡광도값을 측정함으로써 수행하였으며, BSA(Bovine Serum Albumin)를 단백질 정량의 스탠다드(standard)로 사용하였다.

β-갈락토시다제의 활성을 측정하기 위하여, 먼저 효소액 200 ㎕를 Z-완충용액으로 희석하여 500 ㎕로 만들고, 여기에 다시 4 ㎎/㎖의 농도인 ONPG 용액을 100 ㎕ 가하여 30℃에서 보온한 뒤, 반응액이 엷은 노란색으로 변하는 시점에서 1 M Na₂CO₃ 용액을 첨가 β-갈락토시다제의 활성을 측정하였다.

흡광도 측정조건에 의한 ONP의 몰(mol) 흡광계수를 21300 M^-1㎝^-1으로 하고, 1 유니트(unit)를 1 분동안 1X10^-3 μ㏖의 ONP를 생산하는 효소량으로 정의한다. 모든 실험은 최저 3 회 이상 반복 수행하고, 측정치로부터 표준편차를 구하여 재형성을 확인하였다. 단백질 1 mg에 해당하는 유니트의 수를 하기의 식을 이용하여 계산하였다.

<실시예 4> hERα와 전사 공역인자 TIF2를 이용한 이중-하이브리드 시스템에서의 내분비계장애 활성 측정

<4-1> hERα와 전사 공역인자 TIF2를 이용한 이중-하이브리드 시스템에서 E2에 대한 β-갈락토시다제의 기본 활성 측정

상기 실시예 2에서 얻은 각 형질전환체를 리간드 E2의 농도가 1×10^-12 내지 1×10^-4 M로 포함된 SD 배지에서 배양하고, 세포 추출액을 조제하여 β-갈락토시다 제의 활성을 측정하였다. 먼저, 전사공역인자 TIF2에 두 종류의 hERα(hERα LBD와 hERα full-length)에 의한 이중-하이브리드 시스템을 동시에 발현시킨 효모에서는 E2에 의존적으로 리포터 유전자인 lacZ의 전사가 활성화되어 β-갈락토시다제의 활성이 검출되었다(도 4). 전사 공역인자 TIF2의 전사 활성화 능력의 차이에 대하여 검토한 결과, 형질전환체 hERα LBD와 TIF2는 E2 10^-6 M 농도에서 높은 전사 활성화 능력을 나타내는 반면, hERα 전장과 TIF2는 10^-9 M의 낮은 농도에서는 매우 높은 전사 활성화 능력을 나타내었다.

<4-2> hERα LBD와 TIF2의 효모 이중-하이브리드 시스템을 이용한 내분비계 장애 활성 측정

<4-2-1> 천연 및 합성 스테로이드 호르몬

천연 및 합성 호르몬에 대하여는 다음과 같다(도 5). 여성호르몬 E2를 리간드로 한 경우, 10^-6 M의 농도에서 리포터 유전자가 가장 높은 발현 정도를 보였다. 합성 호르몬인 DES는 10^-9 M의 농도에서 E2 보다 현저히 높은 활성이 검출되었다. 남성호르몬인 테스토스테론은 본 시스템에서 거의 리포터 유전자의 전사 활성화를 나타내지 않았다. 또한, 식물호르몬인 쿰에스트롤 및 제니스테인은 10-5 M 및 10^-4 M 이상의 고농도에서 내분비계장애 활성을 나타냈다.

<4-2-2> 살충제 및 산업용 화학물질

살충제인 p,p'-DDT, 공업용 화합물인 BPA, 4-NP 및 4-tert-OP는 내분비계 장애활성을 나타내었지만 TeCBT(tetrachlorobyphenyl, PCB류)는 활성을 나타내지 않았다(도 6). 알킬페놀 화합물인 4-NP(4-Nonylphenol)와 4-tert-OP(4-tert- Octylphenol) 은 10^-5 M에서 높은 활성을 보였으며, p,p'-DDT 및 BPA는 각각 10^-4 M 및 10^-3 M에서 높은 내분비계장애 활성을 나타냈다.

<4-3> hERα 전장과 TIF2의 효모 이중-하이브리드 시스템을 이용한 내분비계장애 활성 측정

<4-3-1> 천연 및 합성 스테로이드 호르몬

전사 공역인자 TIF2를 이용한 시스템에서 내분비계장애물질의 검출을 실시했다. 천연 및 합성 호르몬에 대하여는, 여성호르몬 E2를 리간드로 한 경우, 10^-9 M의 낮은 농도에서 리포터 유전자가 가장 높은 발현 정도를 보였다(도 7). DES의 경우 10^-13 M에서도 활성이 검출되고, 10^-9 M에서는 같은 농도의 E2 활성치와 동일한 정도의 β-갈락토시다제 활성을 나타냈다. 에스트론은 10^-8 M에서, 쿰에스트롤 및 제니스테인은 각각 10^-5 M 및 10^-4 M에서 에스트로겐 활성을 나타냈다. 테스토스테론은 10^-4 M의 높은 농도에서 높은 활성을 나타냈다.

<4-2-2> 살충제 및 산업용 화학물질

살충제 및 농약류, 공업용 화합물등 사용한 모든 화학물질은 내분비계장애 활성이 높게 나타났다. 그렇지만, hERα LBD와 TIF2의 효모 이중-하이브리드 시스템을 이용한 경우 TeCBT(tetrachlorobyphenyl, PCB 류)는 활성을 나타내지 않았으며, 활성 또한 낮았다(도 6). 도 8에 나타난 바와 같이 BPA, 4-NP 및 4-tert-OP는 10^-5 M에서, γ-HCH, DDT 및 2,4-D 는 10^-4 M에서 높은 내분비계 장애 활성을 나타냈다(도 8).

결국, 본 발명의 이중-하이브리드 시스템을 이용한 효모의 형질전환체는 다양한 화학물질에 대하여 내분비계 장애 활성을 의미하는 β-갈락토시다제의 활성을 나타내었으며, 특히 hERα의 전장을 도입한 효모의 형질전환체는 그 민감도가 더욱 높아 검출 시스템으로서 유용하게 이용할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 hER α 전장 또는 hERα LBD와 GAL4 DBD와의 융합 단백질 및 GAL4 TAD와 전사 공역인자 TIF2와의 융합 단백질을 효모 사카로마이시스 세레비세(S. cerevisiae)에서 동시에 발현시킨 이중-하이브리드 시스템에서는 hER이 리간드와 결합하여 구조변화가 일어나고, 전사를 활성화시키는 인자인 전사 공역인자와 상호 작용하여 GAL4 DBD에 대한 특이한 염기배열인 UASGAL4(GAL4 Upstream Activating Sequence) 에 결합함으로써 그 신호가 기본 전사장치에 전달되어 리포터 유전자의 전사가 활성화되는 것으로 생각된다(도 9). 이중-하이브리드 시스템은 전사 공역인자를 도입함으로써 포유동물 세포와 효모간 전사도구의 차이를 극복하여 보다 포유류에 가까운 조건에서 각종 화학물질에 대한 내분비계장애 활성을 가진 화합물을 분석할 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 효모의 이중-하이브리드 시스템(two-hybrid system)을 이용한 내분비계 장애물질의 검출방법은 포유동물이나 어류 등을 사용하지 않고도 환경에 존재하는 다수의 화학물질에 대하여 사람 또는 동물의 내분비계에 영향을 미치는 특정 화학물질을 보다 간편하고 신속한 생물학적 방법으로 검출할 수 있다.

도 1은 GAL4의 DNA결합 영역(GAL4 DNA binding domain, GAL4 DBD)과 에스트로겐 수용체 α 리간드 결합영역(human estrogen receptor α ligand binding domain, hERα LBD)의 융합 단백질 발현을 위하여 제조한 발현벡터 'pGAL4 DBD-hER α LBD'를 나타낸 것이고,

도 2는 hERα의 전장(full-length)과 GAL4 DBD의 융합 단백질을 발현시키기 위하여 제조한 'pGAL4 DBD-hERα full-length'를 나타낸 것이고,

도 3은 GAL4 전사 활성화 영역(GAL4 Transcriptional Activation Domain, GAL4 TAD)과 전사 공역인자 TIF2의 융합단백질 발현을 위하여 제조한 발현벡터 'pGAL4 TAD-TIF2'를 나타낸 것이고,

도 4는 hERα LBD 및 전사 공역인자 TIF2와 hERα 전장 및 전사 공역인자 TIF2 가 각각 도입된 효모의 이중-하이브리드 시스템에서의 E2 첨가시 β-갈락토시다제의 활성을 나타낸 그래프이고,

도 5는 hERα LBD 및 전사 공역인자 TIF2가 도입된 효모의 이중-하이브리드 시스템에서 천연 및 합성 호르몬의 첨가시 β-갈락토시다제의 활성을 나타낸 그래프이고,

도 6은 hERα LBD 및 전사 공역인자 TIF2가 도입된 효모의 이중-하이브리드 시스템에서 살충제, 공업용 화학물질 또는 알킬페놀(alkylphenol)의 첨가시 β-갈락토시다제의 활성을 나타낸 그래프이고,

도 7은 hERα 전장 및 전사 공역인자 TIF2가 도입된 효모의 이중-하이브리드 시스템에서 천연 및 합성 호르몬의 첨가시 β-갈락토시다제의 활성을 나타낸 그래프이고,

도 8은 hERα 전장 및 전사 공역인자 TIF2가 도입된 효모의 이중-하이브리드 시스템에서 살충제, 공업용 화학물질의 첨가시 β-갈락토시다제의 활성을 나타낸 그래프이고,

도 9는 hERα 전장 또는 hERα LBD 및 전사 공역인자 TIF2를 포함하는 효모의 이중-하이브리드 시스템에서 내분비계장애 활성을 가지는 화학물질의 검출 메카니즘을 나타낸 모식도이다.

<110> LEE, Haeng-Seog CHO, eun-min <120> Method for detecting endocrine disruptors using yeast two-hybrid system containing hERα gene and co-activator gene <130> 2p-08-13B <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 gaattcatga ccatgaccct ccacacc 27 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gtcgacgcca gggagctctc agac 24

Claims

1) 효모 전사활성인자의 DNA 결합 도메인과 에스트로겐 수용체 α 전장(hERα full length)의 융합단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 효모 전사활성인자의 전사활성 도메인과 TIF2(transcriptional intermediate factor-2)의 융합단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 효모의 이중-하이브리드 시스템에 검출하고자 하는 화학 물질을 처리하는 단계; 및

2) 효모의 염색체 상에 도입시킨 리포터 유전자의 발현정도를 측정하는 단계를 포함하는 효모의 이중-하이브리드 시스템을 이용한 내분비계장애 활성을 가지는 화학물질의 검출방법.

제 1항에 있어서, 내분비계장애 활성을 가지는 화학물질은 에스트로겐 유사 물질인 것을 특징으로 하는 검출방법.

제 1항에 있어서, 효모는 사카로마이시스 세레비세인 것을 특징으로 하는 검출 방법.

제 1항에 있어서, 효모의 이중-하이브리드 시스템은 효모의 GAL4 전사 인자의 DNA 결합 영역 하류에 내분비계 호르몬의 수용체 유전자를 융합시키고, 전사 활성화 영역 하류에 전사 공역인자를 융합시켜 이의 발현에 의하여 리포터 유전자의 발현 정도가 조절되는 것을 특징으로 하는 검출 방법.

삭제

제 4항에 있어서, 리포터 유전자는 β-갈락토시다제(β-galatosidase)인 것을 특징으로 하는 검출 방법.

제 4항에 있어서, 효모의 전사 활성인자는 GAL4인 것을 특징으로 하는 검출방법.

효모 전사활성인자의 DNA 결합 도메인과 인간 에스트로겐 수용체 α 전장의 융합단백질을 코딩하는 유전자를 발현시키며, 도 2에 기재된 개열지도를 갖는 발현벡터 pGAL4 DBD-hERα full-length.

삭제

효모의 GAL4 DNA 결합 도메인(GAL4 DBD)과 인간 에스트로겐 수용체 α 전장의 융합 단백질 및 효모의 GAL4 전사 활성 도메인(GAL4 TAD)과 TIF2의 융합 단백질을 염색체 상에 리포터 유전자(UASGAL4-TATA-lacZ)를 삽입시킨 효모에서 발현되도록 제조한 효모 형질전환체.

제 12항에 있어서, 수탁번호 KCCM 10431인 것을 특징으로 하는 효모 형질전환체.

제 10항의 발현벡터로 형질전환된 효모 형질전환체.