KR100478283B1

KR100478283B1 - 에스트로겐 수용체 β 유전자가 도입된 효모이중-하이브리드 시스템을 이용한 내분비계 장애물질의검출 방법

Info

Publication number: KR100478283B1
Application number: KR10-2002-0059472A
Authority: KR
Inventors: 이행석; 조은민
Original assignee: 이행석; 조은민
Priority date: 2002-09-30
Filing date: 2002-09-30
Publication date: 2005-03-22
Also published as: KR20040028321A

Abstract

본 발명은 효모를 이용한 인간의 내분비계 장애활성을 가지는 화학물질의 검출 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 리간드(ligand)에 의존적으로 표적유전자(target gene)의 전사(transcription)를 활성화시키는 기능을 하는 핵 내 수용체의 특징을 이용하여 내분비계 장애활성을 가지는 화학물질(estrogenic chemicals)을 검출하는 방법에 관한 것으로서 인간 유래의 에스트로겐 수용체 β와 전사 공역인자(co-activator)를 효모의 이중-하이브리드 시스템(two-hybrid system)에 도입하여 발현시키고, 염색체 상에 도입시킨 리포터 유전자의 발현을 모니터하여 에스트로겐 수용체의 리간드 의존적인 전사 활성화를 측정함으로써 내분비계 장애활성을 가지는 에스트로겐 유사물질을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하면 포유동물이나 어류 등을 사용하지 않고도 환경에 존재하는 다수의 화학물질에 대하여 사람 또는 동물의 내분비계에 영향을 미치는 특정 화학물질을 보다 간편하고 신속한 생물학적 방법으로 검출할 수 있다.

Description

에스트로겐 수용체 β 유전자가 도입된 효모 이중-하이브리드 시스템을 이용한 내분비계 장애물질의 검출 방법{Method for detecting endocrine disruptors using yeast two-hybrid system containing hERβ gene}

본 발명은 효모를 이용한 인간의 내분비계 장애활성을 가지는 화학물질의 검출 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 리간드(ligand)에 의존적으로 표적유전자(target gene)의 전사(transcription)를 활성화시키는 기능을 하는 핵 내 수용체의 특징을 이용하여 내분비계 장애활성을 가지는 화학물질(estrogenic chemicals)을 검출하는 방법에 관한 것이다.

내분비계 장애물질(Endocrine Distruptors, EDs)은 생체내 호르몬 작용에 영향을 미치고, 내분비계 장애를 일으키는 외인성 화학물질이다. 이들은 호르몬 수용체의 결합부위를 점령함으로써 생체내 호르몬과 동일하게 작용하거나, 호르몬과 경합(competition)함으로써 그 작용을 방해하고, 또는 호르몬의 합성이나 사이토크롬(cytochrome) P450 등의 대사효소 작용을 방해하여 그 농도를 변화시키는 것으로 알려져 있다. 특히, 이들 내분비계 장애물질은 여러 호르몬 중 성호르몬에 의한 체내 조절계의 혼란을 야기하여 야생생물 및 인간의 생식에 악영향을 미쳐 심각한 문제로 대두되고 있다. 현재, 일상생활에서 접하는 여러 화학물질들이 EDs로 분류되고 있는데, 이들의 영향력이 기존의 일반 독성과 같이 개체의 죽음으로 끝나는 것이 아닌 종의 멸종이라는 점에서 인간뿐만 아니라 야생생물에 대하여도 그 심각성이 매우 크다.

EDs가 주로 결합하는 것으로 알려진 핵 내 호르몬 수용체는 스테로이드 호르몬과 결합하여 그들 표적 유전자의 전사를 조절한다. 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER)는 핵내 수용체(nuclear receptor) 수퍼패밀리(superfamily)에 속하며(Mangelsdorf D. J. et al., Cell 83, 835, 1995), 배 발생기에는 다양한 생물학적 기능을 조절하고, 그 이후에는 생리학적인 조절 기능을 하는 것으로 알려져 있다. ER은 A/B, C, D, 및 E/F의 6개 도메인(domain)으로 이루어져 있다. E 도메인은 에스트로겐 결합 도메인(estrogen binding domain), C 도메인은 DNA 결합 도메인(DNA binding domain)이며, 핵 이행 신호 도메인(nuclear localization signal domain), 열 충격 단백질 90 결합 도메인(hsp 90 binding domain), 이량체 형성 도메인, 전사 활성화 인자(transcription activating factor, AF)의 기능을 하는 AF-1 도메인(A/B 도메인) 및 AF-2 도메인(E/F 도메인)으로 특정되어 있다(Mangelsdorf, D. J. et al., Cell 83, 835, 1995; Tsai, M. J. et al., Annu. Rev. Biochem. 63, 451, 1994; Barettino, D. et al., EMBO J. 13, 3039, 1994; Durand, B. et al., EMBO J. 13, 5370, 1994; Kumar, V. et al., Cell 51, 941, 1987).

또한, ER은 제 6 염색체 상에만 존재하는 것으로 알려져 있었는데(ERα), 제 14 염색체 상에 별도의 ER(ERβ)이 발견됨으로써 2개의 서브타입(subtype)이 존재하는 것으로 밝혀졌다(Kuiper, G. G. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5925, 1996). 인간의 ERα와 ERβ의 아미노산 구조를 비교해 보면 ERβ에서는 A/B 도메인이 짧으며, 아미노산 수준에서 C 도메인은 96%, E 도메인은 50%, A/B 도메인은 30%의 유사성을 나타낸다. ERβ는 ERα와 같이 표적 유전자(target gene)의 프로모터(promoter) 상류에 있는 에스트로겐 반응 인자 서열(estrogen response element sequence, EREs)에 결합하여 전사를 활성화하는 점에서는 동일하지만(Kuiper, G. G. et al., Endocrinology 138, 863, 1997; Pace, p. et al., J. Biol. Chem. 272, 25832, 1997; Tremblay, G. B. et al., Mol. Endocrinol. 63, 353, 1997), ER이 발현되고 있는 조직, 호르몬 등의 리간드에 대한 기질 특이성, 친화력(affinity), 보충적인 역할을 하는 전사 공역인자(co-activator)의 종류 등에 있어서는 서로 다른 것으로 보고되고 있다(Pettersson, K. et al., J. Annu., Rev. Physiol. 63, 165, 2001).

전사 공역인자(co-activator)는 호르몬과 수용체의 결합에 의한 수용체의 입체구조 변화를 식별하여 정보를 기본 전사 장치에 전달하는 기능을 하는데, 단백질 인자로서 새로운 종류가 계속적으로 발견되어 왔으며, 전사를 활성화하는 인자이기 때문에 전사 공역인자(co-activator)로 불려지고 있다(Voegel, J. J., et al., EMBO J. 15, 3667, 1996; Horwitz, K. B. et al., Mol. Endocrinol. 10, 1167, 1997). 이들은 리간드 의존적으로 수용체와 상호작용하여, 그 신호를 기본 전사 장치에 전달하는 것으로 추측된다. 현재, 동정된 전사 공역인자 중 분자량이 약 160 kDa으로 기능이 비교적 유사한 SRC1(steroid Receptor Co-activator-1), TIF2(Transcriptional intermediate Factor-2) 및 AIB1(Amplified In Breast cancer-1)의 SRC1 패밀리(family) 단백질이 잘 알려져 있다(Onate, S. A. et al., Science 270, 1354, 1995; Anzick, S. L. et al., Science 277, 965, 1997; Voegel, J. J., et al., EMBO J. 15, 3667, 1996). 이들 SRC1, TIF2 및 ABA1은 서로 높은 상동성을 가지고 있다. 아미노산 수준에서 AIB1과 SRC1은 33%, TIF2와 AIB1은 45%, SRC1과 TIF2는 59% 상동성을 나타낸다. 이들은 bHLH 도메인(basic helix-loop-helix domain) , PAS(Per/Arnt/Sim) 도메인, 그리고 세린(serine) 및 트레오닌(threonine)이 다수 존재하는 도메인(S/T rich domain)을 가지고 있다. 또한, SRC1과 TIF2의 C 말단에는 글루타민(glutamine)이 풍부한 도메인(Q-rich domain)이 존재하는 반면, AIB1에는 상기 Q-rich 도메인 뿐만 아니라 폴리글루타민 영역(polyglutamine tract)이 존재한다(Anzick, S. L. et al., Science 277, 965, 1997; Paulo, H. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 8479, 1997). 이 밖에도 핵내 수용체(nuclear receptor)와 상호작용하는 LXXLL 모티브(L=류신, X=불특정 아미노산)가 AIB1 및 TIF2에는 3개, SRC1에는 4개가 포함되어 있으며, 리간드에 대하여 의존적으로 핵내 수용체의 E 도메인과 전사 공역인자의 LXXLL 모티브가 직접 상호작용하는 것으로 생각된다.

인류는 1,500만 종류에 달하는 화학물질을 합성 또는 동정해 왔다. 그리고, 현재 약 10만 종류의 화학물질이 상업적으로 이용되고 있다. 이들 화학물질 중에 유기염소화합물, 공업용화합물, 농약류, 유기취소(bromine) 화합물, 중금속 및 유기금속, 식물 및 합성 에스트로겐 등을 포함한 수십종의 화합물이 EDs로 생각되거나 혹은 의심되고 있다. 그러나, 대부분의 다른 화합물에 대해서는 그들이 내분비계 장애 활성을 가지고 있는지에 대한 충분한 검증 자료가 없어 이들 화학물질의 내분비계 장애 활성을 평가하기 위하여 신속하고 간편한 검출계의 확립이 중요하다.

이에, 본 발명자들은 리간드에 의존적으로 핵내 수용체가 표적 유전자의 전사를 활성화하는 원리를 이용한 에스트로겐 유사 화학물질(EDs)의 검출 방법을 구축하기 위하여, 인간 유래의 에스트로겐 수용체 β(hERβ)의 리간드 결합 도메인(ligand binding domain, LBD)과 GAL4 DNA 결합 도메인(GAL4 DNA binding domain, GAL4 DBD)과의 융합 단백질, 그리고 GAL4 전사 활성 도메인(GAL4 transcription activating domain, GAL4 TAD)과 SRC1 또는 TIF2 전사 공역인자와의 융합 단백질을 리포터 유전자(UAS_GAL4-TATA-lacZ)가 삽입된 효모에서 발현시켜, 각종 화학물질의 에스트로겐 활성을 측정하고 분석할 수 있는 이중-하이브리드 시스템을 구축함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 환경에 존재하는 다수의 화학물질 중, 사람 또는 동물의 내분비계에 영향을 미치는 특정 화학물질, 특히 에스트로겐 유사 화학물질(EDs)을 핵내 수용체가 리간드에 의존적으로 표적 유전자의 전사를 활성화하는 원리를 이용하여, 핵 내 수용체와 전사 공역인자(co-activator)의 유전자를 효모의 이중-하이브리드 시스템(two-hybrid system)에 도입하여 내분비계 장애활성을 가지는 것으로 의심되는 특정 화학물질의 일정 농도하에서 발현시키고, 이의 발현에 의하여 조절되는 리포터 유전자의 발현 정도를 모니터하여, 에스트로겐 수용체 β의 리간드 의존적인 전사 활성화를 측정함으로써 내분비계 장애활성을 가지는 에스트로겐 유사물질을 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 효모 이중-하이브리드 시스템(two-hybrid system)을 이용한 내분비계 장애활성을 가지는 화학물질의 검출 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 인간 유래의 에스트로겐 수용체β(human estrogen receptor, hER)의 리간드 결합 도메인(ligand binding domain, LBD)을 포함하는 유전자 및 전사 공역인자(co-activator)의 유전자를 효모 내에서 발현시키기 위한 발현벡터 및 이들이 도입된 효모 형질전환체를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 효모 이중-하이브리드 시스템(two-hybrid system)을 이용한 내분비계 장애활성을 가지는 화학물질의 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 화학물질의 검출 방법은

1) 에스트로겐 수용체 β 유전자 및 전사 공역인자의 유전자가 도입된 효모의 이중 하이브리드 시스템에 검출하고자 하는 화학 물질을 처리하는 단계; 및

2) 효모의 염색체 상에 도입시킨 리포터 유전자의 발현정도를 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명자들은 효모의 GAL4 전사 인자의 DNA 결합 도메인에 내분비계 호르몬의 수용체 유전자를 융합시키고, GAL4 전사 인자의 활성 도메인에 전사 공역인자(co-activator)를 융합시켜, 이들의 발현에 의해 리포터 유전자의 발현이 조절되는 효모의 이중-하이브리드 시스템을 구축하였다. 이러한 효모의 이중-하이브리드 시스템에 내분비계 장애활성을 가지는 화학물질을 처리하게 되면 이에 의존적으로 리포터 유전자의 발현이 조절되므로 처리한 화학물질의 내분비계 장애활성을 측정할 수 있다.

효모의 이중-하이브리드 시스템은 두 종류의 융합 단백질을 사용하는 것이 가장 중요하다. 효모의 GAL4와 같은 많은 전사 인자들은 두 개의 물리적으로 분리가능한 모듈 도메인, 즉 DNA 결합 도메인과 전사 활성 도메인으로 구성되어 있다. GAL4의 DNA-결합 도메인에 내분비계 호르몬의 수용체 유전자, 바람직하게는 인간 유래의 에스트로겐 수용체 β(human estrogen receptor β, hERβ)의 리간드 결합 도메인(ligand binding domain, LBD)을 포함하는 유전자를 융합시키고, GAL4 전사 활성 도메인에 전사 공역인자, 바람직하게는 SRC1(steroid receptor co-activator-1) 또는 TIF2(transcriptional intermediate factor-2)를 융합시킨다. GAL4 활성이 단백질간의 결합에 의해 재구성(reconstitution)되면 GAL4-프로모터 하의 리포터 유전자 lacZ가 발현되어 산물인 β-갈락토시다제 활성을 측정할 수 있다. 이 때, 상기 GAL4의 DNA 결합 도메인에 융합된 내분비계 호르몬의 수용체는 내분비계 장애활성을 가지는 화학물질을 처리하게 되면 서로 결합하여 구조변화가 일어나고, 전사를 활성화시키는 인자인 전사 공역인자와 상호작용하여 GAL4 DBD가 특이한 UAS_GAL4(GAL4 Upstream Activating Sequence) 염기서열에 결합함으로써 그 신호가 기본 전사장치에 전달되어, 리포터 유전자의 전사가 활성화되는 메카니즘에 의하여 내분비계 장애활성을 가지는 화학물질을 검출할 수 있다(도 10 참조).

또한, 본 발명은 인간 유래의 에스트로겐 수용체 β(human estrogen receptor β, hERβ)의 리간드 결합 도메인(ligand binding domain, LBD)을 포함하는 유전자 및 전사 공역인자(co-activator)의 유전자를 발현시키기 위한 발현벡터 및 이들이 도입된 효모 형질전환체를 제공한다.

구체적으로 본 발명자들은 보다 효율적인 내분비계 장애활성을 가지는 화학물질의 검출 방법을 구축하기 위하여 다양한 이중-하이브리드 시스템이 작용하는 효모의 형질 전환체를 제조하였다. 이를 위하여 발현벡터를 제조하였는데 먼저, 표적 단백질과의 융합 단백질 제작을 위해 사용되는 일반적으로 사용되는 플라스미드인 pGBT9(clontech)의 효모 GAL4의 DNA결합 영역(GAL4 DNA binding domain, GAL4 DBD)에 hERβ의 cDNA를 삽입시켜 'pGAL4 DBD-hERβLBD'를 제조하였다. 또한, pGAD10(clontech)의 GAL4 전사 활성화 영역(GAL4 Transcriptional Activity Domain, GAL4 TAD)에 전사 공역인자인 SRC1 또는 TIF2 유전자를 삽입하여 'pGAL4 TAD-SRC1'과 'pGAL4 TAD-TIF2'를 제조하였다. 상기 각각의 발현벡터는 효모, 바람직하게는 GAL4 DBD가 특이하게 결합하는 UAS_GAL4의 하류에 CYC1 프로모터(TATA) 및 lacZ 유전자를 포함하는 리포터 유전자를 염색체 상에 삽입시킨 효모 사카로마이시스 세레비세(Saccaromyces cerevisiae) YRG-2(MATa ura3-52, his-200, ade2-101, lys-801, trp1-901, leu2-3, 112, gal4-542, GAL80-538, LYS::UASGAL1-TATAGAL1-HIS3, URA3::UASGAL4 17mers(X3)-TATACYC1-lacZ)(Stratagene)에 각각의 발현벡터를 도입시켜 형질전환체를 제조하였다. 본 발명자들은 제조한 효모 형질전환체 hERβLBD+SRC1 및 hERβ LBD+TIF2 중에서 hERβLBD+SRC1을 2002년 9월 26일자로 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호 : KCCM-10428).

본 발명자들은 상기에서 제조한 효모 형질전환체에 기존에 내분비계 장애물질로 알려진 화학물질을 처리하여 그 유용성을 검증하였다. 리포터 유전자인 lacZ 유전자가 발현되면 β-갈락토시다제를 생성하는데 이 β-갈락토시다제는 기질인 ONPG(ο-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)를 분해하여 황색의 ONP(ο-nitrophenol)을 생성하게 된다. 상기 ONP를 정량함으로써 β-갈락토시다제의 활성을 측정할 수 있으며, 이는 곧 처리한 화학물질의 내분비계 장애 활성 정도를 의미한다.

먼저 효모 형질전환체는 SD 선택배지에서 배양하여 집균한 후, Z-완충용액(60 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl, 1 mM MgSO₄ 및 35 mM β-mercaptoethanol)에 현탁하고, 균체를 파괴, 분리한 뒤, 그 상등액을 효소액으로 사용한다. 처리할 화학물질은 유기용매인 DMSO에 녹여 배양시 첨가한다. 효소액 농도의 정량은 Bio-Rad의 단백질 분석 시약을 이용하여 595 nm에서 흡광도값을 측정함으로써 수행한다.

β-갈락토시다제의 활성을 측정하기 위하여는 먼저 효소액을 Z-완충용액으로 희석하고, 여기에 ONPG 용액을 가하여 30℃에서 보온한 뒤, 반응액이 엷은 노란색으로 변하는 시점에서 Na₂CO₃ 용액을 첨가한다.

흡광도 측정조건에 의한 ONP의 몰(mol) 흡광계수를 21,300 M^-1㎝^-1으로 하고, 1 유니트(unit)를 1 분동안 1×10^-3 μ㏖의 ONP를 생산하는 효소량으로 정의한다. 모든 실험은 최저 3 회 이상 반복 수행하고, 측정치로부터 표준편차를 구하여 재현성을 확인하였다. 단백질 1 mg에 해당하는 유니트의 수는 하기의 식을 이용하여 계산하였다.

본 발명의 이중-하이브리드 시스템을 이용한 β-갈락토시다제의 활성 실험에서는 처리한 내분비계 장애물질, 즉 천연 및 합성 스테로이드 호르몬이나 살충제 및 산업용 화학물질에 대하여 거의 모두 장애활성이 검출되는 것을 확인하였으며, 특히, hERβ LBD 및 SRC1이 도입된 이중-하이브리드 시스템에서 저농도의 리간드를 처리하여도 매우 높은 전사 활성을 나타내었다.

이러한 이중-하이브리드 시스템은 전사 공역인자를 도입함으로써 포유동물 세포와 효모간 전사도구의 차이를 극복하여 보다 포유류에 가까운 조건에서 각종 화학물질에 대한 내분비계 장애활성을 가진 화합물을 분석할 수 있는 새로운 시스템이다.

내분비계 장애 활성을 나타낸 모든 화학물질들의 리포터 유전자 발현을 위한 필요 농도는 다르지만 이들의 상대적인 내분비계 장애 활성 수치는 다른 검출방법에 의하여 조사된 내분비계 장애 활성의 수치와 거의 일치한다. 예를 들면 살충제인 p,p'-DDT, p,p'-DDE 및 p,p'-DDD의 경우, 본 발명에서는 p,p'-DDT만이 10 ^-4 M에서 다른 농약물질보다 높은 β-갈락토시다제 활성을 나타냈을 뿐 그 대사물인 p,p'-DDE와 p,p'-DDD에 대해서는 활성이 거의 나타나지 않았다. 이전의 실험에서도 p,p'-DDT만이 여성 유방암 세포(MCF-7)를 이용하여 ER에 대한 에스트라디올(E₂)과의 경합작용에 의한 내분비계 활성을 가지며, SD 레트(rat)의 전립선 조직을 이용한 실험에서 p,p'-DDT, p,p'-DDE 및 p,p'-DDD가 모두 테스토스테론의 AR(androgen receptor)과의 결합을 장해하는 작용을 하는 것으로 보고되었다(vom Saal, F. S. et al., Toxicol. Lett. 77, 343, 1995; Kelce, W.R. et al., Nature 375, 581, 1995;Kelce, W.R. et al., Nature 375, 581, 1995). 결국, p.p'-DDT는 ER에 결합하지만, 그 대사산물인 p.p'-DDE와 p.p'-DDD는 ER에 결합하지 않고 AR에 대한 항에스트로겐과 같은 기능을 한다. 따라서, 본 발명의 내분비계 장애 활성의 상대적 수치는 이전에 다른 방법에 의하여 보고된 사실과 일치한다고 할 수 있다.

다수의 화학물질은 천연 호르몬에 비하여 약한 내분비계 장애활성을 가진다. 또한 효모 배양액에 첨가하는 화학물질의 농도를 높이면 β-갈락토시다제 활성은 상승하지만 일단 최대치에 도달하면 그 이상의 농도에서는 역으로 활성이 감소된다. 이는 고농도의 세포독성 및 길항 작용(antagonist)때문으로 생각된다. 따라서 특정 화학 물질에 대한 내분비계 장애 활성을 측정할 경우 단계적으로 농도를 바꾸면서 조사할 필요가 있으나, 본 발명의 검출 방법은 광범위한 내분비계 장애작용을 가진 물질에 대하여 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 발현 벡터의 제조

<1-1> pGAL4 DBD-hERβ LBD의 제조

먼저, 'pGAL4 DBD-hERβ LBD'는 GAL4의 DNA결합 영역(GAL4 DNA binding domain, GAL4 DBD)과 표적 단백질과의 융합 단백질 제작을 위해 사용되는 플라스미드 pGBT9(clontech)의 제한효소 BamHI 및 SalI 부위에 hERβ LBD의 213번 아미노산에서 477번 아미노산까지를 포함하고 있는 hERβ LBD cDNA의 BamHI 및 SalI 단편을 삽입하였다(도 1). 상기 단편의 염기배열 해석은 ABI PRISMTM 310 유전자 분석기(genetic analyzer)를 이용하여 확인하였다.

<1-2> pGAL4 TAD-SRC1과 pGAL4 TAD-TIF2의 제조

GAL4의 전사 활성화 영역(GAL4 Transcriptional Activity Domain, GAL4 TAD)과 여러 가지 단백질과의 융합단백질을 제조하기 위하여, 플라스미드 pGAD10(Clontech)의 제한효소 EcoRI 부위에 SRC1의 231번 아미노산부터 1094번 아미노산까지를 포함하는 SRC1 cDNA EcoRI 단편 및 TIF2의 670번 아미노산부터 1750번 아미노산까지를 포함하는 TIF2 cDNA EcoRI 단편을 각각 삽입하여 'pGAL4 TAD-SRC1'과 'pGAL4 TAD-TIF2'를 제조하였다(도 2 및 도 3).

<실시예 2> 효모 형질전환체의 제조

UAS_GAL4의 하류에 CYC1 프로모터(TATA) 및 lacZ 유전자를 포함하는 리포터 유전자를 염색체 상에 삽입시킨 효모 사카로마이시스 세레비세(Saccaromyces cerevisiae) YRG-2(MATa ura3-52, his-200, ade2-101, lys-801, trp1-901, leu2-3, 112, gal4-542, GAL80-538, LYS::UASGAL1-TATAGAL1-HIS3, URA3::UASGAL4 17mers(X3)-TATACYC1-lacZ)(Stratagene)에 상기 실시예 1에서 제조한 발현벡터를 초산리튬법(Daniel et al., Methods in Enzymol. 194, 182, 1991)을 이용하여 도입시켜 형질전환체를 제조하였다. 그 결과, 본 발명자들은 효모 형질전환체 hERβLBD+SRC1 및 hERβ LBD+TIF2를 제조하였으며, 그 중에서 hERβLBD+SRC1을 2002년 9월 26일자로 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호 : KCCM-10428).

<실시예 3> β-갈락토시다제의 활성 측정

먼저, 효모 형질전환체를 2 ㎖의 SD 선택배지에서 30℃로 24 시간 전배양하고 이를 다시 9.7 ㎖의 SD 배지에 2% 식균하였다. 여기에 에스트로겐 유사 활성을 측정하고자 하는 화학물질을 유기용매인 DMSO에 녹여 100 ㎕ 첨가하여 배양하는데, 이 때 여성 호르몬인 에스트로겐 17β-에스트라디올(estradiol, E₂) 및 DMSO를 첨가한 것도 동시에 배양하여 양성대조군 및 음성 대조군으로 사용하였다. 배양 조건은 30℃에서 11 시간동안 300 rpm으로 진동 배양하였다. 집균 후, 균체를 냉각수로 세정하고, 1 ㎖의 Z-완충용액(60 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl, 1 mM MgSO₄ 및 35 mM β-mercaptoethanol)에 현탁한 뒤, 글래스 비드(glass beads)를 첨가하였다. 1 분 동안 진탕한 후, 1 분 이상 얼음에 냉각시키는 과정을 3회 이상 실시하여 균체를 파괴하고, 원심분리기를 이용하여 글래스 비드와 비파괴 균체를 분리한 뒤, 그 상등액을 효소액으로 사용하였다. 효소액 농도의 정량은 Bio-Rad의 단백질 분석 시약을 이용하여 595 nm에서 흡광도값을 측정함으로써 수행하였으며, BSA(Bovine Serum Albumin)를 스탠다드(standard)로 사용하였다.

β-갈락토시다제의 활성을 측정하기 위하여, 먼저 효소액 200 ㎕를 Z-완충용액으로 희석하여 500 ㎕로 만들고, 여기에 다시 4 ㎎/㎖의 농도인 ONPG 용액을 100 ㎕ 가하여 30℃에서 보온한 뒤, 반응액이 엷은 노란색으로 변하는 시점에서 1 M Na₂CO₃ 용액을 첨가 β-갈락토시다제의 활성을 측정하였다.

흡광도 측정조건에 의한 ONP의 몰(mol) 흡광계수를 21300 M^-1㎝^-1으로 하고, 1 유니트(unit)를 1 분동안 1×10^-3 μ㏖의 ONP를 생산하는 효소량으로 정의한다. 모든 실험은 최저 3 회 이상 반복 수행하고, 측정치로부터 표준편차를 구하여 재형성을 확인하였다. 단백질 1 mg에 해당하는 유니트의 수를 하기의 식을 이용하여 계산하였다.

<실시예 4> 이중-하이브리드 시스템에서의 내분비계 장애 활성 측정

<4-1> E ₂ 에 대한 β-갈락토시다제의 기본 활성 측정

상기 실시예 2에서 얻은 각 형질전환체를 리간드인 에스트로겐 17β-에스트라디올(estradiol, E₂)의 농도가 1× 10^-11 내지 1 ×10^-4 M로 포함된 SD 배지에서 배양하고, 세포 추출액을 조제하여 β-갈락토시다제의 활성을 측정하였다. 그 결과, E₂에 의존적으로 리포터 유전자인 lacZ의 전사가 활성화되어 β-갈락토시다제의 활성이 검출되었다(도 4). 전반적으로 대부분의 농도에서 SRC1이 TIF2보다 높은 전사 활성화 능력을 나타내었는데, 특히 E₂ 10^-9 M 농도에서는 그 전사 활성화 능력이 매우 높게 나타났다. 결론적으로 hERβ LBD와 SRC1의 조합이 가장 높은 전사활성화 능력을 보인다는 것을 확인할 수 있었다.

<4-2> hERβ LBD와 SRC1의 효모 이중-하이브리드 시스템을 이용한 내분비계 장애 활성 측정

<4-2-1> 천연 및 합성 스테로이드 호르몬

여성 호르몬 E₂를 리간드로 한 경우, 10^-9 M의 매우 낮은 농도에서 높은 β-갈락토시다제의 활성을 얻었다(도 5). 합성 호르몬인 DES(Diethylstilbestrol)도 저농도인 10^-10M에서 내분비계 활성이 검출되었다. 또한, 남성 호르몬인 테스토스테론(testosterone)도 본 발명의 시스템에서는 10^-5 M에서 활성을 나타냈다. 그리고 에스트론(estrone), 식물 호르몬 쿰에스트롤(coumestrol) 및 제니스테인(genistein)은 각각 10^-7 M, 10^-6 M 및 10^-4 M에서 높은 내분비계 장애활성을 나타냈다.

<4-2-2> 살충제 화학물질

제초제인 2,4-D와 2,4,5-T는 본 발명의 검출 방법에 의해서 10^-4 M과 10^-5 M에서 높은 내분비계 장애 작용의 활성을 나타냈다(도 6). 살충제인 p,p'-DDT는 10^-4 M에서 다른 농약물질보다 높은 β-갈락토시다제 활성을 나타냈지만 그 대사물인 p,p'-DDE와 p,p'-DDD에 대해서는 활성이 거의 나타나지 않았다.

이전의 실험에서도 p,p'-DDT는 여성 유방암 세포(MCF-7)를 이용하여 ER에 대한 E₂와의 경합작용에 의한 내분비계 활성을 가지는 것으로 나타났으며, SD 레트(rat)의 전립선 조직을 이용한 실험에서는 p,p'-DDT, p,p'-DDE 및 p,p'-DDD가 모두 테스토스테론의 AR(androgen receptor)과의 결합을 장해하는 작용을 하는 것으로 보고되었다(vom Saal, F. S. et al., Toxicol. Lett. 77, 343, 1995; Kelce, W.R. et al., Nature 375, 581, 1995;Kelce, W.R. et al., Nature 375, 581, 1995). 따라서, 본 발명의 p,p'-DDT, p,p'-DDE 및 p,p'-DDD에 대한 상기 결과는 이전에 보고된 사실과 일치한다고 할 수 있다.

<4-2-3> 알킬페놀 화합물

본 발명의 검출 방법을 이용하여 측정된 알킬페놀 화합물은 모두 높은 내분비계 장애 활성을 나타냈으며, 특히, 4-tert-OP는 10^-6 M에서 높은 활성을 나타냈다. 4-HP는 10^-9 M의 낮은 농도에서도 β-갈락토시다제의 활성이 검출되었다. 알킬페놀 화합물을 리간드로 한 경우의 β-갈락토시다제의 활성은 4-tert-OP>4-HP>4-NP>4-n-NP>4-OP의 순서로 나타났다(도 7). 한편, MCF-7과 ZR-75-1의 여성유방암세포를 이용한 검출법에서는 알킬기의 위치에 따라서 para>meta>ortho의 순으로, 또한 분기형에 따라서 tertiary>secondary>normal에 따라 높은 내분비계 장애 활성을 나타낸다고 보고되고 있다(White, R. et al., Endocrinology 135, 175, 1994).

<4-2-4> 공업용 화학물질

도 8에 나타난 바와 같이 BPA는 10^-5 내지 10^-3 M에서 높은 활성을 나타내고 있다. 염소화합물(페닐류)에 대하여 폴리클로로바이페닐(polychlorobyphenyl)인 TeCBP(2,2',3,4'-tetrachlorobiphenyl)는 본 발명의 이중 하이브리드 시스템에서 내분비계 장애활성을 나타냈지만, ρ-CBP(ρ-chlorobiphenyl)의 경우 매우 약한 활성을 나타냈다. 그러나, TeCBP와 동일하게 염소이온이 4 개 존재하는 TeCHQ(tetrachlorohydroquinone)에 대하여는 내분비계 장애 활성이 나타나지 않았는데, 이는 내분비계 장애활성이 벤젠 고리에 존재하는 염소이온의 수가 아닌 기질특이성에 의해 결정되는 것을 의미한다.

<4-2-5> 다중고리 방향족 탄화수소(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons)

염료 중간체인 α-나프톨(naphthol), β-나프톨(naphthol)은 10^-4M에서 높은 내분비계 장애 활성을 나타냈고, 향료의 원료인 인돌(indole)은 10^-5 M에서 높은 내분비계 장애활성을 나타냈는데, 상기 화합물은 일본 환경성이 발표한 SPEED '98(Japan Environment Agency, 1998)에 표시된 EDs로써 의심되는 화학물질의 리스트에 포함되지 않는 물질로서 본 발명의 검출 방법에 의하여 새롭게 내분비계 장애활성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 의약품 합성에 사용되는 페난트렌(phenanthrene)은 10^-6 M 이상에서 낮은 활성을 보였고, 염료 중간체인 나프탈렌(naphthalene)은 거의 활성을 나타내지 않았다(도 9).

결론적으로, hERβ LBD와 GAL4 DBD와의 융합 단백질 및 GAL4 TAD와 전사 공역인자(SRC1, TIF2)와의 융합 단백질을 효모 사카로마이시스 세레비세(S. cerevisiae)에서 동시에 발현시킨 본 발명의 이중 하이브리드 시스템에서는 hER β가 리간드와 결합하여 구조변화가 일어나고, 전사를 활성화시키는 인자인 전사 공역인자와 상호 작용하여 GAL4 DBD가 특이한 UAS_GAL4(GAL4 Upstream Activating Sequence) 염기서열에 결합함으로써 그 신호가 기본 전사장치에 전달되어 리포터 유전자의 전사가 활성화되는 것으로 생각된다(도 10). 본 발명의 이중 하이브리드 시스템은 전사 공역인자를 도입함으로써 포유동물 세포와 효모간 전사도구의 차이를 극복하여 보다 포유류에 가까운 조건에서 각종 화학물질에 대한 내분비계 장애활성을 가진 화합물을 분석할 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 효모의 이중-하이브리드 시스템(two-hybrid system)을 이용한 내분비계 장애물질의 검출방법은 포유동물이나 어류 등을 사용하지 않고도 환경에 존재하는 다수의 화학물질에 대하여 사람 또는 동물의 내분비계에 영향을 미치는 특정 화학물질을 보다 간편하고 신속한 생물학적 방법으로 검출할 수 있으며, 광범위한 내분비계 장애작용을 가진 물질에 대하여 유용하게 사용할 수 있으며, 특히 hERβ LBD와 SRC1을 이용한 이중 하이브리드 시스템은 저농도의 화학물질에서 보다 높은 내분비계 장애작용의 활성을 검출할 수 있다.

도 1은 GAL4의 DNA결합 영역(GAL4 DNA binding domain, GAL4 DBD)과 에스트로겐 수용체 β 리간드 결합 도메인(hERβ LBD)의 융합 단백질 발현을 위하여 제조한 발현벡터 'pGAL4 DBD-hERβ LBD'를 나타낸 것이고,

도 2는 GAL4의 전사 활성화 영역(GAL4 Transcriptional Activity Domain, GAL4 TAD)과 전사 공역인자 SRC1의 융합단백질 발현을 위하여 제조한 발현벡터 'pGAL4 TAD-SRC1'을 나타낸 것이고,

도 3은 GAL4 TAD와 전사 공역인자 TIF2의 융합단백질 발현을 위하여 제조한 발현벡터 'pGAL4 TAD-TIF2'를 나타낸 것이고,

도 4는 hERβ LBD 및 전사 공역인자 SRC1 또는 TIF2가 도입된 효모의 이중-하이브리드 시스템에서의 에스트로겐 첨가시 β-갈락토시다제의 활성을 나타낸 그래프이고,

도 5는 hERβ LBD 및 전사 공역인자 SRC1이 도입된 효모의 이중-하이브리드 시스템에서 천연 및 합성 호르몬의 첨가시 β-갈락토시다제의 활성을 나타낸 그래프이고,

도 6은 hERβ LBD 및 전사 공역인자 SRC1이 도입된 효모의 이중-하이브리드 시스템에서 살충제 및 그와 관련된 화학물질의 첨가시 β-갈락토시다제의 활성을 나타낸 그래프이고,

도 7은 hERβ LBD 및 전사 공역인자 SRC1이 도입된 효모의 이중-하이브리드 시스템에서 알킬페놀(alkylphenol)의 첨가시 β-갈락토시다제의 활성을 나타낸 그래프이고,

도 8은 hERβ LBD 및 전사 공역인자 SRC1이 도입된 효모의 이중-하이브리드 시스템에서 공업용 화학물질 첨가시 β-갈락토시다제의 활성을 나타낸 그래프이고,

도 9는 hERβ LBD 및 전사 공역인자 SRC1이 도입된 효모의 이중-하이브리드 시스템에서 다중고리 방향족 탄화수소 첨가시 β-갈락토시다제의 활성을 나타낸 그래프이고,

도 10은 hERβ LBD 및 전사 공역인자를 포함하는 효모의 이중-하이브리드 시스템에서 내분비계 장애활성을 가지는 화학물질의 검출 메카니즘을 나타낸 모식도이다.

Claims

1) 효모 전사활성인자의 DNA 결합 도메인과 인간 에스트로겐 수용체 β의 융합단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 효모 전사활성인자의 전사활성 도메인과 SRC1(steroid receptor co-activator 1)의 융합단백질을 코딩하는 유전자가 동시형질전환된 효모의 이중-하이브리드 시스템에 검출하고자 하는 화학 물질을 처리하는 단계; 및

2) 상기 효모의 염색체 상에 도입되고, 상기 효모 전사활성인자에 의하여 발현이 조절되는 리포터 유전자의 발현정도를 측정하는 단계를 포함하는 효모의 이중-하이브리드 시스템을 이용한 내분비계 장애활성을 가지는 화학물질의 검출 방법.

제 1항에 있어서, 내분비계 장애활성을 가지는 화학물질은 에스트로겐 유사 물질인 것을 특징으로 하는 검출방법.

제 1항에 있어서, 효모는 사카로마이시스 세레비세인 것을 특징으로 하는 검출 방법.

삭제

제 1항에 있어서, 에스트로겐 수용체 β는 에스트로겐 수용체 β의 리간드 결합 도메인인 것을 특징으로 하는 검출 방법.

삭제

제 1항에 있어서, 리포터 유전자는 β-갈락토시다제인 것을 특징으로 하는 검출 방법.

제 1항에 있어서, 효모 전사활성인자는 GAL4인 것을 특징으로 하는 검출 방법.

도 1로 기재되는 에스트로겐 수용체 β의 리간드 결합 도메인 및 GAL4의 DNA 결합 도메인의 융합유전자의 발현벡터 pGAL4 DBD-hERβ LBD.

효모의 전사활성인자의 DNA 결합 도메인과 인간 에스트로겐 수용체 β의 리간드 결합 도메인의 융합 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 효모의 전사활성인자의 전사 활성 도메인과 SRC1(steroid receptor co-activator 1)의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 염색체 상에 상기 효모 전사활성인자에 의하여 발현이 조절되는 리포터 유전자가 삽입된 효모에 동시형질전환시켜 제조한 효모 형질전환체.

제 11항에 있어서, 효모의 전사활성인자는 GAL4인 것을 특징으로 하는 효모 형질전환체(수탁번호: KCCM-10428).

삭제

도 2로 기재되는 SRC1(steroid receptor co-activator 1)와 GAL4 전사활성 도메인의 융합단백질을 코딩하는 유전자의 발현벡터 pGAL4 TAD-SRC1.