KR100478285B1

KR100478285B1 - 에스트로겐 수용체 α유전자를 포함하는 단일-하이브리드시스템과 전사 공역인자 ＳＲＣ1 유전자가 도입된 효모이중-하이브리드 시스템을 이용한 내분비계 장애물질의판별방법

Info

Publication number: KR100478285B1
Application number: KR10-2002-0064199A
Authority: KR
Inventors: 이행석; 조은민
Original assignee: 이행석; 조은민
Priority date: 2002-10-21
Filing date: 2002-10-21
Publication date: 2005-03-21
Also published as: KR20040034123A

Abstract

본 발명은 효모 형질전환체를 이용한 내분비계 장애물질의 판별방법에 관한 것으로, 본 발명은 인간 유래의 에스트로겐 수용체 α유전자를 포함하는 단일-하이브리드 시스템과 전사 공역인자 SRC1 유전자가 도입된 형질전환체 효모에서 리포터 유전자를 발현시켜 각종 화학물질의 내분비계 장애 활성을 측정하고 판별할 수 있는 효모 이중-하이브리드 시스템을 이용한 내분비계 장애물질의 판별방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명 이중-하이브리드 시스템은 전사 공역인자를 도입함으로써 포유동물 세포와 효모간 전사도구의 차이를 극복하여 포유동물이나 어류 등을 사용하지 않고도 환경에 존재하는 다수의 화학물질에 대하여 사람 또는 동물의 내분비계에 영향을 미치는 특정 화학물질을 보다 간편하고 신속한 생물학적 방법으로 판별할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

에스트로겐 수용체 α유전자를 포함하는 단일-하이브리드 시스템과 전사 공역인자 ＳＲＣ1 유전자가 도입된 효모 이중-하이브리드 시스템을 이용한 내분비계 장애물질의 판별방법 {Method for discriminating endocrine disruptors using transgenic yeast by two-hybrid system containing hER αgene or co-activator SRC1 gene}

본 발명은 효모 형질전환체를 이용한 내분비계 장애물질의 판별방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 인간 유래의 에스트로겐 수용체 α유전자를 포함하는 단일-하이브리드 시스템과 전사 공역인자 SRC1 유전자가 도입된 형질전환체 효모에서 리포터 유전자를 발현시켜 각종 화학물질의 내분비계 장애 활성을 측정하고 판별할 수 있는 효모 이중-하이브리드 시스템을 이용한 내분비계 장애물질의 판별방법에 관한 것이다.

내분비계 장애물질(Endocrine Distruptors, EDs)은 생체 내 호르몬 작용에 영향을 미치고, 내분비계 장애를 일으키는 외인성 화학물질이다. 이들은 호르몬 수용체의 결합부위를 점령함으로써 생체 내 호르몬과 동일하게 작용하거나, 호르몬과 경합함으로써 그 작용을 방해하고, 또는 호르몬의 합성이나 사이토크롬 P450 등의 대사효소 작용을 방해하여 그 농도를 변화시키는 것으로 알려져 있다. 특히, 이들 내분비계 장애물질은 여러 호르몬 중 성호르몬에 의한 체내 조절계의 혼란을 야기하여 야생생물 및 인간의 생식에 악영향을 미쳐 심각한 문제로 대두되고 있다. 현재, 일상생활에서 접하는 여러 화학물질들이 내분비계 장애물질로 분류되고 있는데, 이들의 영향력이 기존의 일반 독성과 같이 개체의 죽음으로 끝나는 것이 아니라 종의 멸종이라는 점에서 인간뿐만 아니라 야생생물에 대하여도 그 심각성이 매우 크다.

내분비계 장애물질이 주로 결합하는 것으로 알려진 핵 내 호르몬 수용체는 스테로이드 호르몬과 결합하여 그들 표적 유전자의 전사를 조절한다. 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER)는 핵 내 수용체의 수퍼패밀리(superfamily)에 속하며(Mangelsdorf D. J. et al., Cell 83, 835, 1995), 배 발생기에는 다양한 생물학적 기능을 조절하고, 그 이후에는 생리학적인 조절 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 에스트로겐 수용체는 A/B, C, D, 및 E/F의 6개 영역으로 이루어져 있다. E 영역은 에스트로겐 결합영역(estrogen binding domain), C 영역은 DNA 결합영역이며, 핵 이행 신호영역(nuclear localization signal domain), 열 충격 단백질 90(heat shock protein 90, hsp 90) 결합영역, 이량체형성영역, 전사활성화 인자(transcription activating factor, AF)의 기능을 하는 것으로써 N 말단 (A/B 영역)에 존재하는 AF-1 및 C 말단(E/F 영역)에 존재하는 AF-2로 특정되어 있다.

전사 공역인자(co-activator)는 호르몬과 수용체의 결합에 의한 수용체의 입체구조 변화를 식별하여 정보를 기본 전사 장치에 전달하는 기능을 하는데, 단백질 인자로서 새로운 종류가 계속적으로 발견되어 왔으며, 전사를 활성화하는 인자이기 때문에 전사 공역인자로 불려지고 있다. 이들은 리간드 의존적으로 수용체와 상호 작용하여, 그 신호를 기본 전사 장치에 전달하는 것으로 추측된다. 현재, 동정된 전사 공역인자 중 분자량이 약 160 kDa으로 기능이 비교적 유사한 SRC-1(steroid receptor co-activator-1), TIF-2(transcriptional intermediate factor-2) 및 AIB-1(amplified in breast cancer-1)의 SRC1 패밀리 단백질이 잘 알려져 있다. 이들 SRC-1, TIF-2 및 ABA-1은 서로 높은 상동성을 가지고 있다. 아미노산 수준에서 AIB-1과 SRC-1은 33%, TIF-2와 AIB-1은 45%, SRC-1과 TIF-2는 59% 상동성을 나타낸다. 이들은 bHLH 영역(basic helix-loop-helix domain), PAS(Per/Arnt/Sim) 영역, 그리고 세린 및 트레오닌이 다수 존재하는 영역(S/T rich domain)을 가지고 있다. 또한, SRC-1과 TIF-2의 C 말단에는 글루타민이 풍부한 영역(Q-rich domain)이 존재하는 반면, AIB-1에는 상기 Q-rich 영역뿐만 아니라 폴리글루타민 영역(polyglutamine tract)이 존재한다. 이 밖에도 핵 내 수용체와 상호 작용하는 LXXLL 모티브(L = 루이신, X = 불특정 아미노산)가 AIB-1 및 TIF-2에는 3개, SRC-1에는 4개가 포함되어 있으며, 리간드에 의존적으로 핵 내 수용체의 E 영역과 전사 공역인자의 LXXLL 모티브가 직접 상호 작용하는 것으로 생각된다.

인류는 1,500만 종류에 달하는 화학물질을 합성 또는 동정해 왔다. 그리고, 현재 약 10만 종류의 화학물질이 상업적으로 이용되고 있다. 이들 화학물질 중에 유기염소화합물, 공업용화합물, 농약류, 유기취소(bromine) 화합물, 중금속 및 유기금속, 식물 및 합성 에스트로겐 등을 포함한 수십 종의 화합물이 내분비계 장애물질로 생각되거나 혹은 의심되고 있다. 그러나, 대부분의 다른 화합물에 대해서는 그들이 내분비계 장애 활성을 가지고 있는지에 대한 충분한 검증 자료가 없어 이들 화학물질의 내분비계 장애 활성을 평가하기 위하여 신속하고도 간편한 판별시스템의 확립이 중요하다.

따라서, 본 발명의 목적은 리간드에 의존적으로 표적유전자의 전사를 활성화시키는 기능을 하는 핵 내 호르몬 수용체의 특징을 이용하여 내분비계 장애 활성을 가지는 에스트로겐 유사물질을 판별하는 방법을 제공함에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 내분비계장애물질의 판별에 사용되는 이중-하이브리드 시스템의 제작을 위한 인간 유래의 에스트로겐 수용체 α유전자 및 전사 공역인자의 유전자를 효모 내에서 발현시키기 위한 발현벡터 및 이들에 의한 효모 형질전환체를 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 인간 유래의 에스트로겐 수용체 α(hERα)의 리간드 결합영역(LBD) 또는 전장과 GAL4 DNA 결합영역(GAL4 DBD)으로 이루어진 발현벡터를 제작하고, GAL4 전사활성화영역(GAL4 TAD)과 SRC1 전사 공역인자로 이루어진 발현벡터를 제작한 다음, 염색체 상에 리포터 유전자군(UAS _GAL4 -TATA-lacZ)이 삽입된 효모에 상기 단일-하이브리드 시스템들을 단독으로 혹은 함께 도입하고, 상기 단일-하이브리드 시스템 혹은 이중-하이브리드 시스템에 의해 형질전환된 효모를 내분비계 장애 활성을 가지는 것으로 추정되는 특정 화학물질을 일정 농도로 처리한 환경에서 배양하여 상기 리포터 유전자를 발현시키고, 상기 리포터 유전자의 발현정도를 모니터하여 에스트로겐 수용체 α의 리간드 의존적인 전사 활성화 정도를 측정하여 상기 특정 화학물질이 내분비계 장애물질인지를 판별함으로써 달성하였다.

이하, 발명의 구체적인 구성을 상세히 설명을 한다.

본 발명은 인간 유래의 에스트로겐 수용체 α의 유전자를 포함하는 단일-하이브리드 시스템과 SRC1 전사 공역인자를 포함하는 발현벡터를 제작하여 상기 하이브리드 시스템들을 염색체 상에 리포터 유전자 군이 삽입된 효모에 도입하고 형질전환된 효모를 특정 화학물질을 일정 농도로 처리한 환경에서 배양하여 상기 리포터 유전자를 발현시킨 다음 상기 리포터 유전자의 발현정도를 모니터하여 상기 특정 화학물질이 내분비계 장애물질인지를 판별하는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 단일 또는 이중-하이브리드 시스템(one- or two-hybrid system)을 도입하여 형질전환된 효모를 이용하여 특정 화학물질이 내분비계 장애물질인지를 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 내분비계 장애물질의 판별방법은,

인간 유래의 에스트로겐 수용체 α유전자와 GAL4 DNA 결합영역을 포함하는 발현벡터의 제작단계; GAL4 전사활성화영역과 SRC1 전사 공역인자를 포함하는 발현벡터의 제작단계; 염색체 상에 리포터 유전자군 (UASGAL4-TATA-lacZ)이 삽입된 효모 사카로마이시스 세레비세(Saccaromyces cerevisiae) YRG-2에 상기 하이브리드 시스템들을 함께 도입하는 단계; 상기 이중-하이브리드 시스템에 의해 형질전환된 효모를 에스트로겐 유사물질로 추정되는 특정 화학물질을 일정 농도로 처리한 환경에서 배양하여 상기 리포터 유전자를 발현시키는 단계; 및, 상기 리포터 유전자로부터 발현된 β-갈락토시다제의 발현정도를 모니터하여 에스트로겐 수용체 α의 리간드 의존적인 전사 활성화 정도를 측정하여 상기 특정 화학물질이 내분비계 장애물질인지를 판별하는 단계를 포함한다.

본 발명자들은 효모 전사인자 GAL4의 DNA 결합영역에 내분비계 호르몬의 수용체 유전자를 융합시키고, GAL4 전사활성화영역에 전사 공역인자를 융합시켜, 이들의 발현에 의해 리포터 유전자의 발현이 조절되는 효모의 단일-하이브리드 시스템 또는 이중-하이브리드 시스템을 구축하였다. 이러한 효모의 단일 또는 이중-하이브리드 시스템에 내분비계 장애 활성을 가지는 화학물질을 처리하게 되면 이에 의존적으로 리포터 유전자의 발현이 조절되므로 처리한 화학물질의 내분비계 장애 활성을 측정할 수 있다.

이들 판별시스템 중에서 효모의 이중-하이브리드 시스템은 두 종류의 융합 단백질을 사용하는 것이 중요한 특징이다. 효모의 GAL4와 같은 많은 전사인자들은 두 개의 물리적으로 분리 가능한 모듈영역, 즉 DNA 결합영역과 전사활성화영역으로 구성되어 있다. 도 13을 참조하여 설명하자면, GAL4의 DNA 결합영역에 내분비계 호르몬의 수용체 유전자, 바람직하게는 인간 유래의 에스트로겐 수용체 α유전자의 전장 또는 그것의 리간드 결합영역을 포함한 일부 유전자를 융합시키고, GAL4 전사활성화영역에 전사 공역인자, 바람직하게는 SRC1를 융합시킨다. GAL4 활성이 효모 내에서 단백질간의 결합에 의해 재구성되면 CYC1 프로모터하의 lacZ 리포터 유전자가 발현되고 β-갈락토시다제 활성을 측정할 수 있다. 이 때, 상기 GAL4의 DNA 결합영역에 융합된 내분비계 호르몬의 수용체는 내분비계 장애 활성을 가지는 화학물질을 처리하게 되면 서로 결합하여 구조 변화가 일어나고, 전사를 활성화시키는 전사 공역인자와 상호 작용하여 GAL4 DBD가 특이한 UAS _GAL4 (GAL4 Upstream Activating Sequence)의 염기배열에 결합함으로써, 그 신호가 기본 전사장치에 전달되어 리포터 유전자의 전사가 활성화되는 메카니즘에 의하여 내분비계 장애 활성을 가지는 화학물질을 판별할 수 있다.

또한, 본 발명은 인간 에스트로겐 수용체 α유전자의 전장 또는 그것의 일부 유전자 및 전사 공역인자의 유전자를 효모 내에서 발현시키기 위한 발현벡터 및 이들이 도입된 효모 형질전환체를 제공한다.

구체적으로 설명하자면, 본 발명자들은 보다 효율적인 내분비계 장애 활성을 가지는 화학물질의 판별방법을 구축하기 위하여 다양한 단일 또는 이중-하이브리드 시스템이 작용하는 효모의 형질전환체를 제조하였다. 이를 위하여 발현벡터를 제조하였는데 먼저, 표적 단백질과의 융합 단백질 제작을 위해 일반적으로 사용되는 플라스미드인 pGBT9의 효모 GAL4의 DNA 결합영역에 hERαLBD 또는 hERα의 전장 cDNA를 삽입시켜 'GAL4 DBD-hERα LBD' 또는 'GAL4 DBD-hERα full-length' 를 제조하였다. 또한, pGAD10의 GAL4 전사활성화영역(GAL4 Transcriptional Activity Domain, GAL4 TAD)에 전사 공역인자인 SRC1 유전자를 삽입하여 'GAL4 TAD-SRC1' 을 제조하였다. 상기 각각의 발현벡터는 효모, 바람직하게는 GAL4의 DBD가 특이하게 결합하는 UAS _GAL4 의 다운스트림에 CYC1 프로모터(TATA) 및 lacZ 유전자를 포함하는 리포터 유전자를 염색체 상에 삽입시킨 효모 사카로마이시스 세레비세(Saccaromyces cerevisiae) YRG-2(MATa ura3-52, his-200, ade2-101, lys-801, trp1-901, leu2-3, 112, gal4-542, GAL80-538, LYS::UASGAL1-TATAGAL1-HIS3, URA3::UASGAL4 17mers(X3)-TATACYC1-lacZ) (스트라타진사 제품)에 각각의 발현벡터를 도입시켜 형질전환체를 제조하였다. 제조된 효모 형질전환체는 hERαLBD, hERα전장, hERαLBD + SRC1와 hERα전장 + SRC1가 있으며, 이중 hERα전장 + SRC1는 2002년 9월 30일자로 한국 미생물 보존 센터에 수탁번호 KCCM10429로 기탁되었다.

본 발명자들은 상기에서 제조한 효모 형질전환체에 기존에 내분비계 장애물질로 알려진 화학물질을 처리하여 그 유용성을 검증하였다. 리포터 유전자인 lacZ 유전자가 발현되면 β-갈락토시다제를 생성하는데 이 β-갈락토시다제는 기질인 ONPG(o-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside)를 분해하여 황색의 ONP(ο-nitrophenol)을 생성하게 된다. 상기 ONP를 정량함으로써 β-갈락토시다제의 활성을 측정할 수 있으며, 이는 곧 처리한 화학물질의 내분비계 장애 활성 정도를 의미한다.

본 발명자들은 이중-하이브리드 시스템을 구축하기 전에 전사 공역인자가 도입되지 않은 단일-하이브리드 시스템을 이용한 내분비계 장애 활성 실험을 먼저 수행하였다. 하기 실시예에 따르면, hERαLBD와 GAL4 DBD의 융합 단백질을 발현시킨 효모에서는 활성이 검출되지 않았지만 hERα전장과 GAL4 DBD와의 융합 단백질을 발현시킨 단일-하이브리드 시스템은 전사 공역인자가 존재하지 않아도 약하지만 E2에 의존적으로 전사가 활성화됨을 확인할 수 있었다(도 4 참조). 이는 효모 세포 내에서는 hERα 유전자의 LBD 이외의 영역에서 약하지만 기본 전사 인자 군과 어떠한 상호작용이 일어나고, 이에 의해 전사가 활성화되는 것으로 추측된다(도 12 참조).

또한, 실시예에 따르면,이중-하이브리드 시스템을 이용한 β-갈락토시다제의 활성 실험에서는 처리한 내분비계 장애물질, 즉 천연 및 합성 스테로이드 호르몬이나 살충제 및 산업용 화학물질에 대하여 거의 모두 장애 활성이 검출되는 것을 확인하였다. 또한 hERα LBD와 SRC1의 이중-하이브리드 시스템 보다 hERα전장과 SRC1의 이중-하이브리드 시스템을 도입한 효모에서 내분비계 장애 활성 측정의 민감도가 높게 나타났다. 즉 hERα 전장과 SRC1의 이중-하이브리드 시스템을 도입한 효모에서는 저농도로 처리하여도 높은 β-갈락토시다제의 활성이 검출된다.

본 발명의 유리한 특징은, 단일-하이브리드 시스템과 비교하여 이중-하이브리드 시스템은 전사 공역인자를 도입함으로써 포유동물 세포와 효모간 전사도구의 차이를 극복하여 보다 포유류에 가까운 조건에서 각종 화학물질에 대한 내분비계장애 활성을 가진 화합물을 분석할 수 있는 새로운 시스템이다.

상기에서 기술한 본 발명의 내분비계 장애 활성을 나타낸 모든 화학물질들의 리포터 유전자 발현을 위한 필요 농도는 다르지만 이들의 상대적인 내분비계장애 활성 수치는 다른 검출방법(MCF-7 증식 시험법(E-SCREEN assay)), 수용체 결합 시험, 리포터 유전자 발현 검출법에 의하여 조사된 내분비계 장애 활성의 수치와 거의 일치한다(Soto, A.M., et al., J. Steroid Biochem. 23, 87, 1985; Soto, A.M, et al., Environ. Health Perspect. 103(suppl 7), 113, 1995; Waller C.L, et al., Res. Toxicol. 9, 1240, 1996; Kuiper G.G, et al., Endocrinology 139, 4252, 1998; Metzger, D., et al., Nature 334,31, 1988; McDonnell, D.P., et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 39, 291, 1991).

다수의 화학물질은 천연 호르몬에 비하여 약한 내분비계 장애활성을 가진다. 또한 효모 배양액에 첨가하는 화학물질의 농도를 높이면 β-갈락토시다제 활성은 상승하지만 일단 최대치에 도달하면 그 이상의 농도에서는 역으로 활성이 감소된다. 이는 고농도의 세포독성 및 길항제의 작용 때문으로 생각된다. 따라서 특정 화학 물질에 대한 내분비계 장애 활성을 측정할 경우 단계적으로 농도를 바꾸면서 조사할 필요가 있으나, 본 발명의 판별방법은 광범위한 내분비계장애 작용을 가진 물질에 대하여 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1 : 발현 벡터의 제조

제조예 1 : pGAL4 DBD-hERα LBD의 제조

먼저, 'pGAL4 DBD-hERα LBD'는 GAL4의 DNA 결합영역과 표적 단백질과의 융합 단백질 제작을 위해 사용되는 플라스미드 pGBT9(클론테크사 제품)의 제한 효소 EcoRI과 SalI 부위에, 서열목록 서열 3에 기재된 hERα의 311번 아미노산에서 595번 아미노산까지를 포함하고 있는 hERαLBD cDNA의 EcoRI과 SalI 단편을 삽입시켰다(도 1). 상기 단편의 염기배열 해석은 ABI PRISMTM 310 유전자 분석기(genetic analyzer)를 이용하여 확인하였다.

제조예 2 : pGAL4 DBD-hERα full-length의 제조

hERα의 전장을 증폭시키기 위해 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하며 플라스미드 pSGI-hERα를 주형으로 사용하였다. PCR에 사용한 프라이머는 다음과 같다:

hERα전장 forward/EcoRI: 5'-gaattcatgaccatgaccctccacacc-3'

hERα전장 reverse/SalI: 5'-gtcgacgccagggagctctcagac-3'

반응조건은 98℃에서 5초, 55℃에서 30초, 72℃에서 90초로 총 25 사이클을 수행하였다. 증폭된 DNA 단편은 제한효소 EcoRI 및 SalI으로 절단하여 pBluscript Ⅱ SK+에 클로닝하고, ABI PRISMTM 310 유전자 분석기를 이용하여 염기배열을 확인하였다. 상기의 DNA 단편은 다시 제한효소 EcoRI과 SalI으로 절단하고, pGBT9의 동일한 제한효소 부위로 클로닝하여 효모의 hERα의 전장과 GAL4 DBD의 융합 단백질을 발현시키기 위한 'pGAL4 DBD-hERαfull-length'을 제조하였으며, 도 2에 기재되어 있다.

제조예 3 : pGAL4 TAD-SRC1의 제조

GAL4의 전사활성화영역(GAL4 Transcriptional Activity Domain, GAL4 TAD)과 여러 가지 단백질과의 융합단백질을 제조하기 위하여, 플라스미드 pGAD10 (클론테크사 제품)의 제한효소 EcoRI 부위에, SRC-1(GenBank Accession No. U40396)의 231번 아미노산부터 1094번 아미노산까지를 포함하는 SRC-1 cDNA EcoRI 단편을 삽입하여 'pGAL4 TAD-SRC1'를 제조하였으며 도 3에 기재되어 있다.

실시예 2 : 효모 형질전환체의 제조

상기 실시예 1의 제조예 1 내지 3의 방법으로 제작된 발현벡터를 도입하여 효모 형질전환체를 제조하기 위해, UAS _GAL4 의 다운스트림에 CYC1 프로모터(TATA) 및 lacZ 유전자를 포함하는 리포터 유전자군을 염색체 상에 삽입시킨 효모 사카로마이시스 세레비세(Saccaromyces cerevisiae) YRG-2(MATa ura3-52, his-200, ade2-101, lys-801, trp1-901, leu2-3, 112, gal4-542, GAL80-538, LYS::UASGAL1-TATAGAL1-HIS3, URA3::UASGAL4 17mers(X3)-TATACYC1-lacZ)(스트라타진 사에서 구입)에 상기 실시예 1의 제조예 1 내지 3 에서 제조한 발현벡터들을 초산리튬법을 이용하여 도입시켰다. 상기에서 효모 형질전환체로는 hERαLBD, hERα전장, hERα LBD + SRC1와 hERα전장 + SRC1가 있으며, 이중 hERα전장 + SRC1는 2002년 9월 30일자로 한국 미생물 보존 센터에 수탁번호 KCCM10429로 기탁되었다.

실시예 3 : β-갈락토시다제의 활성 측정

상기 실시예 2에서 얻은 효모 형질전환체에서 리포터 유전자를 발현시키기 위해, 효모 형질전환체를 2 mL의 SD 선택배지에서 30℃로 24시간 전 배양하고 이를 다시 9.7 mL의 SD 배지에 2% 식균하였다. 여기에 에스트로겐 유사 활성을 측정하고자 하는 화학물질, 즉, 에스트론, DES, 테스토스테론, 쿠메스트롤, 제니스테인, 4-NP, 4-tert-OP, 비스페놀 A, 2,4-D, 2,4,5-T 및 γ-HCH를 유기용매인 DMSO에 녹여 100 ㎕ 씩 첨가하여 배양하는데, 이 때 여성 호르몬인 에스트로겐 17β-에스트라디올(estradiol, E2) 및 DMSO를 첨가한 것도 동시에 배양하여 양성대조군 및 음성 대조군으로 사용하였다. 배양 조건은 30℃에서 11시간 동안 300 rpm으로 진동 배양하였다. 집균 후, 균체를 냉각수로 세정하고, 1 mL의 Z-완충용액(60 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl, 1 mM MgSO₄및 35 mM β-머캅토에탄올)에 현탁한 뒤, 글래스 비드(glass beads)를 첨가하였다. 1분 동안 진탕한 후, 1분 이상 얼음에 냉각시키는 과정을 3회 이상 실시하여 균체를 파괴하고, 원심분리기를 이용하여 글래스 비드와 비파괴 균체를 분리한 뒤, 그 상등액을 효소액으로 사용하였다. 효소액 농도의 정량은 바이오래드사의 단백질 분석 시약을 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였으며, BSA(Bovine Serum Albumin)를 단백질 정량시 표준시료로 사용하였다.

β-갈락토시다제의 활성을 측정하기 위하여, 먼저 효소액 200 ㎕를 Z-완충용액으로 희석하여 500 ㎕로 만들고, 여기에 다시 4 ㎎/mL의 농도인 ONPG 용액을 100 ㎕ 가하여 30℃에서 보온한 뒤, 반응액이 엷은 노란색으로 변하는 시점에서 1 M Na₂CO₃용액을 첨가하여 의 활성을 측정하였다.

흡광도 측정조건에 의한 ONP의 몰 흡광계수를 21300 M^-1㎝^-1으로 하고, 1 유니트를 1분 동안 1X10^-3 μ㏖의 ONP를 생산하는 효소량으로 정의한다. 모든 실험은 최저 3회 이상 반복 수행하고, 측정치로부터 표준편차를 구하여 재형성을 확인하였다. 단백질 1 mg에 해당하는 유니트의 수를 하기의 식을 이용하여 계산하였다.

β-갈락토시다제 활성(unit/mg 단백질)=

A ₄₂₀ X 10 ^-6 X 반응액량(0.85 mL)

21300 X 반응시간(min) X 사용효소량(0.2 mL) X 단백질 농도(mg/mL)

실시예 4 : hERαLBD 및 hERα전장을 이용한 단일-하이브리드 시스템에서의 내분비계 장애 활성 측정

본 발명자들은 효모의 이중-하이브리드 시스템을 구축하기 전에 전사 공역인자가 도입되지 않은 단일-하이브리드 시스템으로 내분비계장애 물질을 판별하는 실험을 수행하였다. hERαLBD를 도입한 단일-하이브리드 시스템에서는 리간드가 존재함에도 불구하고 리포터 유전자의 발현이 나타나지 않았다. 그러나, 도 4에 나타난 것처럼, hERα전장과 GAL4 DBD와의 융합 단백질을 발현시킨 단일-하이브리드 시스템에서는 리간드 E2에 의존적으로 약하지만 전사가 활성화됨을 확인할 수 있었다. hERα전장을 이용한 단일-하이브리드 시스템에 의한 내분비계 장애물질의 활성에 대하여 조사한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 17β-에스트라디올, DES, 테스토스테론, 쿠메스트롤 및 제니스테인과 같은 천연 및 합성 호르몬은 고농도로 존재할 때 활성이 검출되었다. 또한, 공업용 화합물 및 농약류를 이용한 내분비계 장애활성은 도 6에 나타난 바와 같이 매우 낮은 활성을 나타내었다. p,p'-DDT와 BPA는 각각 10^-4 M 과 10^-3 M에서 활성이 검출되었다.

상기 결과로부터 효모 세포 내에서는 hERα의 LBD 이외의 영역, 추측컨대 AF-1을 담당하는 영역에서 약하지만 기본 전사 인자 군과 어떠한 상호작용이 일어나고, 전사가 미약하나마 활성화됨을 알 수 있었다. 그러나, 상기의 단일-하이브리드 시스템은 다양한 화학물질들에 대하여 내분비계 장애 활성을 검출하기에는 그 민감도가 떨어진다. 이에 본 발명자들은 보다 민감하고 유용한 새로운 이중-하이브리드 시스템을 이용한 검출방법을 구축하여 그 활성을 측정하였다.

실시예 5 : hERαLBD 또는 hERα전장과 전사 공역인자 SRC1를 이용한 이중-하이브리드 시스템에서 E2에 대한 β-갈락토시다제의 기본 활성 측정

상기 실시예 2에서 얻은 각 형질전환체를 리간드 E2의 농도가 1×10^-12 내지 1×10^-4 M로 포함된 SD 배지에서 배양하고, 세포 추출액을 제조하여 β-갈락토시다제의 활성을 측정하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, 두 종류의 hERαLBD 또는 hERα전장과 전사 공역인자 SRC1에 의한 이중-하이브리드 시스템을 동시에 발현시킨 효모에서는 E2에 의존적으로 리포터 유전자인 lacZ의 전사가 활성화되어 β-갈락토시다제의 활성이 검출되었다. 두 hERα(hERαLBD와 hERα전장)의 전사 공역인자 SRC1와의 상호작용에 따른 전사 활성화 능력의 차이에 대하여 검토한 결과, E2 10^-9 M의 농도와 그 이상의 농도에서는 hERα전장이 hERαLBD 보다 높은 전사 활성화 능력을 나타내는 반면, 10^-10 M에서는 같은 전사 활성화 능력을 나타내었다.

실시예 6 : hERαLBD와 전사 공역인자 SRC1를 이용한 이중-하이브리드 시스템에서의 내분비계 장애 활성 측정

실험예 1 : 천연 및 합성 스테로이드 호르몬

인간 유래의 에스트로겐 수용체 α의 리간드 결합영역과 SRC1에 의한 효모 형질전환체를 이용하여 상기 실시예 3의 방법으로 천연 및 합성 스테로이드 호르몬을 실험한 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 여성 호르몬 E2 와 에스트론 및 합성 호르몬인 DES는 각각의 농도에서 높은 활성을 나타냈다. 특히, E2는 10^-10M의 농도에서 β-갈락토시다제 활성이 검출되어 10^-8 M에서 가장 높은 활성을 나타내었다. DES와 에스트론은 10^-8 M의 농도에서 β-갈락토시다제 활성이 검출되었으며 남성호르몬인 테스토스테론의 경우에는 리포터 유전자의 전사 활성화가 거의 나타나지 않았다. 또한, 식물 호르몬(phytoestrogen)인 쿰에스트롤 및 제니스테인은 각각 10^-5M과 10^-4M 이상의 고농도에서 내분비계장애 활성을 나타냈다.

실험예 2: 살충제 및 산업용 화학물질

인간 유래의 에스트로겐 수용체 α의 리간드 결합영역과 SRC1에 의한 효모 형질전환체를 이용하여 상기 실시예 3의 방법으로 살충제 및 산업용 화학물질을 실험한 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 알킬페놀(alkylphenol) 화합물인 4-NP(4-Nonylphenol)와 4-tert-OP(4-tert- Octylphenol)은 10^-5 M에서 높은 활성을 보였다. 폴리카보네이트, 에포키신 및 폴리스틸렌수지의 원료로 이용되고 있는 비스페놀 A(Bisphenol A)와 2,4-D는 각각 10^-4M에서 의심되는 활성을 나타냈지만 2,4,5-T와 γ-HCH에 대해서는 활성이 확인되지 않았다.

결론적으로 본 발명의 hERαLBD 및 전사 공역인자 SRC1를 도입한 이중-하이브리드 시스템은 전사 공역인자 SRC1가 없는 단일-하이브리드 시스템에서는 검출이 불가능했던 내분비계 장애 활성을 가진 화학물질에 대하여, hERαLBD 와 전사 공역인자 SRC1과의 상호작용(도 13 참조)에 의해 리포터 유전자의 전사가 활성화되어 판별이 불가능했던 내분비계 장애 활성을 가진 화학 물질에 대하여 판별이 가능함을 확인할 수 있었다.

실시예 7 : hERα전장과 전사 공역인자 SRC1를 이용한 효모 이중-하이브리드 시스템을 이용한 내분비계 장애 활성 측정

실험예 1 : 천연 및 합성 스테로이드 호르몬

인간 유래의 에스트로겐 수용체 α의 전장과 SRC1에 의한 효모 형질전환체를 이용하여 상기 실시예 3의 방법으로 천연 및 합성 스테로이드 호르몬을 실험한 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 여성 호르몬 E2 와 에스트론 및 합성 호르몬인 DES는 각각의 농도에서 높은 활성을 나타냈다. 특히, E2는 10^-10M의 농도에서 β-갈락토시다제 활성이 검출되어 10^-8 M에서 가장 높은 활성을 나타내었다. DES는 10^-12 M의 매우 낮은 농도에서 β-갈락토시다제 활성이 검출되어 10^-8M에서 E2와 동일한 정도의 활성치를 보였다. 에스트론은 10^-7 M의 농도에서 높은 β-갈락토시다제 활성이 검출되었으며, 에스트론 및 쿰에스트롤은 각각 10^-7 M 및 10^-5M에서 동일한 농도의 E2 활성보다 높은 에스트로겐 활성을 나타내었다. 남성호르몬인 테스토스테론와 제니스테인은 각각 10^-4M에서 리포터 유전자의 높은 전사 활성화가 나타났다. 또한, 식물 호르몬인 쿰에스트롤은 10^-5M의 고농도에서 가장 높은 내분비계 장애 활성을 나타냈다.

실험예 2 : 살충제 및 산업용 화학물질

인간 유래의 에스트로겐 수용체 α의 전장과 SRC1에 의한 효모 형질전환체를 이용하여 상기 실시예 3의 방법으로 살충제 및 산업용 화학물질을 실험한 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 알킬페놀 화합물인 4-NP와 4-tert-OP은 10^-5 M와 10^-4 M에서 높은 활성을 보였다. 비스페놀 A는 10^-5M에서 내분비계 장애 활성을 나타냈다. 농약류 및 살충제인 γ-HCH, DDT, 2,4-D 및 2,4,5-T는 각각 10^-4 M과 10^-6M에서 높은 내분비계 장애 활성을 나타냈다.

결국, 본 발명의 이중-하이브리드 시스템을 이용한 효모의 형질전환체는 다양한 화학물질에 대하여 내분비계 장애 활성을 의미하는 β-갈락토시다제의 활성을 나타내었으며, 특히 hERα의 전장을 도입한 효모의 형질전환체는 그 민감도가 더욱 높아 검출 시스템으로서 유용하게 이용할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 hER a 전장 또는 hERα LBD와 GAL4 DBD와의 융합 단백질 및 GAL4 TAD와 전사 공역인자 SRC1와의 융합 단백질을 효모 사카로마이시스 세레비세에서 동시에 발현시킨 이중-하이브리드 시스템에서는 hER이 리간드와 결합하여 구조변화가 일어나고, 전사를 활성화시키는 인자인 전사 공역인자와 상호 작용하여 GAL4 DBD에 대한 특이한 염기배열인 UAS _GAL4 에 결합함으로써 그 신호가 기본 전사장치에 전달되어 리포터 유전자의 전사가 활성화되는 것으로 생각된다(도 13 및 14 참조). 이중-하이브리드 시스템은 전사 공역인자를 도입함으로써 포유동물 세포와 효모간 전사도구의 차이를 극복하여 보다 포유류에 가까운 조건에서 각종 화학물질에 대한 내분비계 장애 활성을 가진 화합물을 분석할 수 있다.

상기 실시예와 실험예에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 효모의 이중-하이브리드 시스템을 이용하여 특정 화학물질이 내분비계 장애물질인지를 판별하는 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 따라서, 본 발명 이중-하이브리드 시스템은 전사 공역인자를 도입함으로써 포유동물 세포와 효모간 전사도구의 차이를 극복하여포유동물이나 어류 등을 사용하지 않고도 환경에 존재하는 다수의 화학물질에 대하여 사람 또는 동물의 내분비계에 영향을 미치는 특정 화학물질을 보다 간편하고 신속한 생물학적 방법으로 판별하는 데 뛰어난 효과가 있으므로 진단산업상 유용한 발명인 것이다.

도 1은 GAL4의 DNA 결합영역과 에스트로겐 수용체 α리간드 결합영역의 융합 단백질 발현을 위하여 제조한 발현벡터 'pGAL4 DBD-hERαLBD'를 나타낸 것이다.

도 2는 hERα의 전장과 GAL4 DBD의 융합 단백질을 발현시키기 위하여 제조한 발현벡터 'pGAL4 DBD-hERα full-length'를 나타낸 것이다.

도 3은 GAL4의 전사활성화영역과 전사 공역인자 SRC1의 융합단백질의 발현을 위하여 제조한 발현벡터 'pGAL4 TAD-SRC1'을 나타낸 것이다.

도 4는 리간드인 에스트로겐 존재시, hERα LBD 또는 전장을 이용한 효모의 단일 하이브리드 시스템에서의 β-갈락토시다제의 활성을 나타낸 그래프이다.

도 5는 hERα전장을 이용한 효모의 단일 하이브리드 시스템에서 천연 및 합성 호르몬의 첨가 시 β-갈락토시다제의 활성을 나타낸 그래프이다.

도 6은 hERα전장을 이용한 효모의 단일 하이브리드 시스템에서 공업용 화합물 및 농약류의 첨가 시 β-갈락토시다제의 활성을 나타낸 그래프이다.

도 7은 hERαLBD와 전사 공역인자 SRC1 또는 hERα전장과 전사 공역인자 SRC1이 도입된 효모의 이중-하이브리드 시스템에서의 E2 첨가 시 β-갈락토시다제의 활성을 나타낸 그래프이다.

도 8은 hERαLBD 및 전사 공역인자 SRC1이 도입된 효모의 이중-하이브리드 시스템에서 천연 및 합성 호르몬의 첨가 시 β-갈락토시다제의 활성을 나타낸 그래프이다.

도 9는 hERαLBD 및 전사 공역인자 SRC1이 도입된 효모의 이중-하이브리드 시스템에서 살충제, 공업용 화학물질 또는 알킬페놀류의 첨가 시 β-갈락토시다제의 활성을 나타낸 그래프이다.

도 10은 hERα전장 및 전사 공역인자 SRC1이 도입된 효모의 이중-하이브리드 시스템에서 천연 및 합성 호르몬의 첨가 시 β-갈락토시다제의 활성을 나타낸 그래프이다.

도 11은 hERα전장 및 전사 공역인자 SRC1이 도입된 효모의 이중-하이브리드 시스템에서 살충제, 공업용 화학물질의 첨가 시 β-갈락토시다제의 활성을 나타낸 그래프이다.

도 12는 hERα전장을 포함하는 효모의 단일-하이브리드 시스템에서 내분비계장애 활성을 가지는 화학물질의 판별 메카니즘을 나타낸 모식도이다.

도 13은 hERαLBD 및 전사 공역인자 SRC1을 포함하는 효모의 이중-하이브리드 시스템에서 내분비계장애 활성을 가지는 화학물질의 판별 메카니즘을 나타낸 모식도이다.

도 14는 hERα전장 및 전사 공역인자 SRC1를 포함하는 효모의 이중-하이브리드 시스템에서 내분비계장애 활성을 가지는 화학물질의 판별 메카니즘을 나타낸 모식도이다.

<110> LEE, Haeng-Seog <120> Method for detecting endocrine disruptors using yeast two-hybrid system containing hER-alpha gene or SRC1 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 gaattcatga ccatgaccct ccacacc 27 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gtcgacgcca gggagctctc agac 24 <210> 3 <211> 1785 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1785) <400> 3 atg acc atg acc ctc cac acc aaa gca tct ggg atg gcc cta ctg cat 48 Met Thr Met Thr Leu His Thr Lys Ala Ser Gly Met Ala Leu Leu His 1 5 10 15 cag atc caa ggg aac gag ctg gag ccc ctg aac cgt ccg cag ctc aag 96 Gln Ile Gln Gly Asn Glu Leu Glu Pro Leu Asn Arg Pro Gln Leu Lys 20 25 30 atc ccc ctg gag cgg ccc ctg ggc gag gtg tac ctg gac agc agc aag 144 Ile Pro Leu Glu Arg Pro Leu Gly Glu Val Tyr Leu Asp Ser Ser Lys 35 40 45 ccc gcc gtg tac aac tac ccc gag ggc gcc gcc tac gag ttc aac gcc 192 Pro Ala Val Tyr 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864 Asp Gly Glu Gly Arg Gly Glu Val Gly Ser Ala Gly Asp Met Arg Ala 275 280 285 gcc aac ctt tgg cca agc ccg ctc atg atc aaa cgc tct aag aag aac 912 Ala Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Met Ile Lys Arg Ser Lys Lys Asn 290 295 300 agc ctg gcc ttg tcc ctg acg gcc gac cag atg gtc agt gcc ttg ttg 960 Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu 305 310 315 320 gat gct gag ccc ccc ata ctc tat tcc gag tat gat cct acc aga ccc 1008 Asp Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg Pro 325 330 335 ttc agt gaa gct tcg atg atg ggc tta ctg acc aac ctg gca gac agg 1056 Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg 340 345 350 gag ctg gtt cac atg atc aac tgg gcg aag agg gtg cca ggc ttt gtg 1104 Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val 355 360 365 gat ttg acc ctc cat gat cag gtc cac ctt cta gaa tgt gcc tgg cta 1152 Asp Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu 370 375 380 gag atc ctg atg att ggt ctc gtc tgg cgc tcc atg 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Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu 435 440 445 Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser 450 455 460 Thr Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu Asp 465 470 475 480 Lys Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr 485 490 495 Leu Gln Gln Gln His Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser 500 505 510 His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Gly Met Glu His Leu Tyr Ser Met 515 520 525 Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu 530 535 540 Asp Ala His Arg Leu His Ala Pro Thr Ser Arg Gly Gly Ala Ser Val 545 550 555 560 Glu Glu Thr Asp Gln Ser His Leu Ala Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ser 565 570 575 His Ser Leu Gln Lys Tyr Tyr Ile Thr Gly Glu Ala Glu Gly Phe Pro 580 585 590 Ala Thr Val 595 <210> 5 <211> 3423 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (57)..(3239) <400> 5 atatcatcga cagggagcac agtgggcttt ctcctcaaga tgacactaat tctgga 56 atg tca att ccc cga gta aat ccc tcg gtc aat cct agt atc tct cca 104 Met Ser Ile Pro Arg Val Asn Pro Ser Val Asn Pro Ser Ile Ser Pro 1 5 10 15 gct cat ggt gtg gct cgt tca tcc aca ttg cca cca tcc aac agc aac 152 Ala His Gly Val Ala Arg Ser Ser Thr Leu Pro Pro Ser Asn Ser Asn 20 25 30 atg gta tcc acc aga ata aac cgc cag cag agc tca gac ctt cat agc 200 Met Val Ser Thr Arg Ile Asn Arg Gln Gln Ser Ser Asp Leu His Ser 35 40 45 agc agt cat agt aat tct agc aac agc caa gga agt ttc gga tgc tca 248 Ser Ser His Ser Asn Ser Ser Asn Ser Gln Gly Ser Phe Gly Cys Ser 50 55 60 ccc gga agt cag att gta gcc aat gtt gcc tta aac aaa gga cag gcc 296 Pro Gly Ser Gln Ile Val Ala Asn Val Ala Leu Asn Lys Gly Gln Ala 65 70 75 80 agt tca cag agc agt aaa ccc tct tta aac ctc aat aat cct cct atg 344 Ser Ser Gln Ser Ser Lys Pro Ser Leu Asn Leu Asn Asn Pro Pro Met 85 90 95 gaa ggt aca gga ata tcc cta gca cag ttc atg tct cca agg aga cag 392 Glu Gly Thr Gly Ile Ser Leu Ala Gln Phe Met Ser Pro Arg Arg Gln 100 105 110 gtt act tct gga ttg gca aca agg ccc agg atg cca aac aat tcc ttt 440 Val Thr Ser Gly Leu Ala Thr Arg Pro Arg Met Pro Asn Asn Ser Phe 115 120 125 cct cct aat att tcg aca tta agc tct ccc gtt ggc atg aca agt agt 488 Pro Pro Asn Ile Ser Thr Leu Ser Ser Pro Val Gly Met Thr Ser Ser 130 135 140 gcc tgt aat aat aat aac cga tct tat tca aac atc cca gta aca tct 536 Ala Cys Asn Asn Asn Asn Arg Ser Tyr Ser Asn Ile Pro Val Thr Ser 145 150 155 160 tta cag ggt atg aat gaa gga ccc aat aac tcc gtt ggc ttc tct gcc 584 Leu Gln Gly Met Asn Glu Gly Pro Asn Asn Ser Val Gly Phe Ser Ala 165 170 175 agt tct cca gtc ctc agg cag atg agc tca cag aat tca cct agc aga 632 Ser Ser Pro Val Leu Arg Gln Met Ser Ser Gln Asn Ser Pro Ser Arg 180 185 190 tta aat ata caa cca gca aaa gct gag tcc aaa gat aac aaa gag att 680 Leu Asn Ile Gln Pro Ala Lys Ala Glu Ser Lys Asp Asn Lys Glu Ile 195 200 205 gcc tca act tta aat gaa atg att caa tct gac aac agc tct agt gat 728 Ala Ser Thr Leu Asn Glu Met Ile Gln Ser Asp Asn Ser Ser Ser Asp 210 215 220 ggc aaa cct ctg gat tca ggg ctt ctg cat aac aat gac aga ctt tca 776 Gly Lys Pro Leu Asp Ser Gly Leu Leu His Asn Asn Asp Arg Leu Ser 225 230 235 240 gat gga gac agt aaa tac tct caa acc agt cac aaa cta gtg cag ctt 824 Asp Gly Asp Ser Lys Tyr Ser Gln Thr Ser His Lys Leu Val Gln Leu 245 250 255 ttg aca aca act gcc gaa cag cag tta cgg cat gct gat ata gac aca 872 Leu Thr Thr Thr Ala Glu Gln Gln Leu Arg His Ala Asp Ile Asp Thr 260 265 270 agc tgc aaa gat gtc ctg tct tgc aca ggc act tcc aac tct gcc tct 920 Ser Cys Lys Asp Val Leu Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Ser Ala Ser 275 280 285 gct aac tct tca gga ggt tct tgt ccc tct tct cat agc tca ttg aca 968 Ala Asn Ser Ser Gly Gly Ser Cys Pro Ser Ser His Ser Ser Leu Thr 290 295 300 gca cgg cat aaa att cta cac cgg ctc tta cag gag ggt agc ccc tca 1016 Ala Arg His Lys Ile Leu His Arg Leu Leu Gln Glu Gly Ser Pro Ser 305 310 315 320 gat atc acc act ttg tct gtc gag cct gat aaa aag gac agt gca tct 1064 Asp Ile Thr Thr Leu Ser Val Glu Pro Asp Lys Lys Asp Ser Ala Ser 325 330 335 act tct gtg tca gtg act gga cag gta caa gga aac tcc agt ata aaa 1112 Thr Ser Val Ser Val Thr Gly Gln Val Gln Gly Asn Ser Ser Ile Lys 340 345 350 cta gaa ctg gat gct tca aag aaa aaa gaa tca aaa gac cat cag ctc 1160 Leu Glu Leu Asp Ala Ser Lys Lys Lys Glu Ser Lys Asp His Gln Leu 355 360 365 cta cgc tat ctt tta gat aaa gat gag aaa gat tta aga tca act cca 1208 Leu Arg Tyr Leu Leu Asp Lys Asp Glu Lys Asp Leu Arg Ser Thr Pro 370 375 380 aac ctg agc ctg gat gat gta aag gtg aaa gtg gaa aag aaa gaa cag 1256 Asn Leu Ser Leu Asp Asp Val Lys Val Lys Val Glu Lys Lys Glu Gln 385 390 395 400 atg gat cca tgt aat aca aac cca acc cca atg acg aag gcc act cct 1304 Met Asp Pro Cys Asn Thr Asn Pro Thr Pro Met Thr Lys Ala Thr Pro 405 410 415 gag gaa ata aaa ctg gag gcc cag agc cag ttt aca gct gac ctt gac 1352 Glu Glu Ile Lys Leu Glu Ala Gln Ser Gln Phe Thr Ala Asp Leu Asp 420 425 430 cag ttt gat cag tta ctg ccc acg ctg gag aag gca gca cag ttg cca 1400 Gln Phe Asp Gln Leu Leu Pro Thr Leu Glu Lys Ala Ala Gln Leu Pro 435 440 445 ggc tta tgt gag aca gac agg atg gat ggt gcg gtc acc agt gta acc 1448 Gly Leu Cys Glu Thr Asp Arg Met Asp Gly Ala Val Thr Ser Val Thr 450 455 460 atc aaa tcg gag atc ctg cca gct tca ctt cag tcc gcc act gcc aga 1496 Ile Lys Ser Glu Ile Leu Pro Ala Ser Leu Gln Ser Ala Thr Ala Arg 465 470 475 480 ccc act tcc agg ctg aat aga tta cct gag ctg gaa ttg gaa gca att 1544 Pro Thr Ser Arg Leu Asn Arg Leu Pro Glu Leu Glu Leu Glu Ala Ile 485 490 495 gat aac caa ttt gga caa cca gga aca ggc gat cag att cca tgg aca 1592 Asp Asn Gln Phe Gly Gln Pro Gly Thr Gly Asp Gln Ile Pro Trp Thr 500 505 510 aat aat aca gtg aca gct ata aat cag agt aaa tca gaa gac cag tgt 1640 Asn Asn Thr Val Thr Ala Ile Asn Gln Ser Lys Ser Glu Asp Gln Cys 515 520 525 att agc tca caa tta gat gag ctt ctc tgt cca ccc aca aca gta gaa 1688 Ile Ser Ser Gln Leu Asp Glu Leu Leu Cys Pro Pro Thr Thr Val Glu 530 535 540 ggg aga aat gat gag aag gct ctt ctt gaa cag ctg gta tcc ttc ctt 1736 Gly Arg Asn Asp Glu Lys Ala Leu Leu Glu Gln Leu Val Ser Phe Leu 545 550 555 560 agt ggc aaa gat gaa act gag cta gct gaa cta gac aga gct ctg gga 1784 Ser Gly Lys Asp Glu Thr Glu Leu Ala Glu Leu Asp Arg Ala Leu Gly 565 570 575 att gac aaa ctt gtt cag ggg ggt gga tta gat gta tta tca gag aga 1832 Ile Asp Lys Leu Val Gln Gly Gly Gly Leu Asp Val Leu Ser Glu Arg 580 585 590 ttt cca cca caa caa gca acg cca cct ttg atc atg gaa gaa aga ccc 1880 Phe Pro Pro Gln Gln Ala Thr Pro Pro Leu Ile Met Glu Glu Arg Pro 595 600 605 aac ctt tat tcc cag cct tac tct tct cct ttt cct act gcc aat ctc 1928 Asn Leu Tyr Ser Gln Pro Tyr Ser Ser Pro Phe Pro Thr Ala Asn Leu 610 615 620 cct agc cct ttc caa ggc atg gtc agg caa aaa cct tca ctg ggg acg 1976 Pro Ser Pro Phe Gln Gly Met Val Arg Gln Lys Pro Ser Leu Gly Thr 625 630 635 640 atg cct gtt caa gta aca cct ccc cga ggt gct ttt tca cct ggc atg 2024 Met Pro Val Gln Val Thr Pro Pro Arg Gly Ala Phe Ser Pro Gly Met 645 650 655 ggc atg cag ccc agg caa act cta aac aga cct ccg gct gca cct aac 2072 Gly Met Gln Pro Arg Gln Thr Leu Asn Arg Pro Pro Ala Ala Pro Asn 660 665 670 cag ctt cga ctt caa cta cag cag cga tta cag gga caa cag cag ttg 2120 Gln Leu Arg Leu Gln Leu Gln Gln Arg Leu Gln Gly Gln Gln Gln Leu 675 680 685 ata cac caa aat cgg caa gct atc tta aac cag ttt gca gca act gct 2168 Ile His Gln Asn Arg Gln Ala Ile Leu Asn Gln Phe Ala Ala Thr Ala 690 695 700 cct gtt ggc atc aat atg aga tca ggc atg caa cag caa att aca cct 2216 Pro Val Gly Ile Asn Met Arg Ser Gly Met Gln Gln Gln Ile Thr Pro 705 710 715 720 cag cca ccc ctg aat gct caa atg ttg gca caa cgt cag cgg gaa ctg 2264 Gln Pro Pro Leu Asn Ala Gln Met Leu Ala Gln Arg Gln Arg Glu Leu 725 730 735 tac agt caa cag cac cga cag agg cag cta ata cag cag caa aga gcc 2312 Tyr Ser Gln Gln His Arg Gln Arg Gln Leu Ile Gln Gln Gln Arg Ala 740 745 750 atg ctt atg agg cag caa agc ttt ggg aac aac ctc cct ccc tca tct 2360 Met Leu Met Arg Gln Gln Ser Phe Gly Asn Asn Leu Pro Pro Ser Ser 755 760 765 gga cta cca gtt caa acg ggg aac ccc cgt ctt cct cag ggt gct cca 2408 Gly Leu Pro Val Gln Thr Gly Asn Pro Arg Leu Pro Gln Gly Ala Pro 770 775 780 cag caa ttc ccc tat cca cca aac tat ggt aca aat cca gga acc cca 2456 Gln Gln Phe Pro Tyr Pro Pro Asn Tyr Gly Thr Asn Pro Gly Thr Pro 785 790 795 800 cct gct tct acc agc ccg ttt tca caa cta gca gca aat cct gaa gca 2504 Pro Ala Ser Thr Ser Pro Phe Ser Gln Leu Ala Ala Asn Pro Glu Ala 805 810 815 tcc ttg gcc aac cgc aac agc atg gtg agc aga ggc atg aca gga aac 2552 Ser Leu Ala Asn Arg Asn Ser Met Val Ser Arg Gly Met Thr Gly Asn 820 825 830 ata gga gga cag ttt ggc act gga atc aat cct cag atg cag cag aat 2600 Ile Gly Gly Gln Phe Gly Thr Gly Ile Asn Pro Gln Met Gln Gln Asn 835 840 845 gtc ttc cag tat cca gga gca gga atg gtt ccc caa ggt gag gcc aac 2648 Val Phe Gln Tyr Pro Gly Ala Gly Met Val Pro Gln Gly Glu Ala Asn 850 855 860 ttt gct cca tct cta agc cct ggg agc tcc atg gtg ccg atg cca atc 2696 Phe Ala Pro Ser Leu Ser Pro Gly Ser Ser Met Val Pro Met Pro Ile 865 870 875 880 cct cct cct cag agt tct ctg ctc cag caa act cca cct gcc tcc ggg 2744 Pro Pro Pro Gln Ser Ser Leu Leu Gln Gln Thr Pro Pro Ala Ser Gly 885 890 895 tat cag tca cca gac atg aag gcc tgg cag caa gga gcg ata gga aac 2792 Tyr Gln Ser Pro Asp Met Lys Ala Trp Gln Gln Gly Ala Ile Gly Asn 900 905 910 aac aat gtg ttc agt caa gct gtc cag aac cag ccc acg cct gca cag 2840 Asn Asn Val Phe Ser Gln Ala Val Gln Asn Gln Pro Thr Pro Ala Gln 915 920 925 cca gga gta tac aac aac atg agc atc acc gtt tcc atg gca ggt gga 2888 Pro Gly Val Tyr Asn Asn Met Ser Ile Thr Val Ser Met Ala Gly Gly 930 935 940 aat acg aat gtt cag aac atg aac cca atg atg gcc cag atg cag atg 2936 Asn Thr Asn Val Gln Asn Met Asn Pro Met Met Ala Gln Met Gln Met 945 950 955 960 agc tct ttg cag atg cca gga atg aac act gtg tgc cct gag cag ata 2984 Ser Ser Leu Gln Met Pro Gly Met Asn Thr Val Cys Pro Glu Gln Ile 965 970 975 aat gat ccc gca ctg aga cac aca ggc ctc tac tgc aac cag ctc tca 3032 Asn Asp Pro Ala Leu Arg His Thr Gly Leu Tyr Cys Asn Gln Leu Ser 980 985 990 tcc act gac ctt ctc aaa aca gaa gca gat gga acc cag cag gtg caa 3080 Ser Thr Asp Leu Leu Lys Thr Glu Ala Asp Gly Thr Gln Gln Val Gln 995 1000 1005 cag gtt cag gtg ttt gct gac gtc cag tgt aca gtg aat ctg gta ggc 3128 Gln Val Gln Val Phe Ala Asp Val Gln Cys Thr Val Asn Leu Val Gly 1010 1015 1020 ggg gac cct tac ctg aac cag cct ggt cca ctg gga act caa aag ccc 3176 Gly Asp Pro Tyr Leu Asn Gln Pro Gly Pro Leu Gly Thr Gln Lys Pro 1025 1030 1035 1040 acg tca gga cca cag acc ccc cag gcc cag cag aag agc ctc ctt cag 3224 Thr Ser Gly Pro Gln Thr Pro Gln Ala Gln Gln Lys Ser Leu Leu Gln 1045 1050 1055 cag cta ctg act gaa t aaccactttt aaaggaatgt gaaatttaaa taatagacat 3280 Gln Leu Leu Thr Glu 1060 acagagatat acaaatatat tatatatttt tctgagattt ttgatatctc aatctgcagc 3340 cattcttcag gtcgtagcat ttggagcaaa aaaaaaaaaa aaaaatcgat gtcgactcga 3400 cgacactacg gcgacagcaa cgg 3423 <210> 6 <211> 1061 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ser Ile Pro Arg Val Asn Pro Ser Val Asn Pro Ser Ile Ser Pro 1 5 10 15 Ala His Gly Val Ala Arg Ser Ser Thr Leu Pro Pro Ser Asn Ser Asn 20 25 30 Met Val Ser Thr Arg Ile Asn Arg Gln Gln Ser Ser Asp Leu His Ser 35 40 45 Ser Ser His Ser Asn Ser Ser Asn Ser Gln Gly Ser Phe Gly Cys Ser 50 55 60 Pro Gly Ser Gln Ile Val Ala Asn Val Ala Leu Asn Lys Gly Gln Ala 65 70 75 80 Ser Ser Gln Ser Ser Lys Pro Ser Leu Asn Leu Asn Asn Pro Pro Met 85 90 95 Glu Gly Thr Gly Ile Ser Leu Ala Gln Phe Met Ser Pro Arg Arg Gln 100 105 110 Val Thr Ser Gly Leu Ala Thr Arg Pro Arg Met Pro Asn Asn Ser Phe 115 120 125 Pro Pro Asn Ile Ser Thr Leu Ser Ser Pro Val Gly Met Thr Ser Ser 130 135 140 Ala Cys Asn Asn Asn Asn Arg Ser Tyr Ser Asn Ile Pro Val Thr Ser 145 150 155 160 Leu Gln Gly Met Asn Glu Gly Pro Asn Asn Ser Val Gly Phe Ser Ala 165 170 175 Ser Ser Pro Val Leu Arg Gln Met Ser Ser Gln Asn Ser Pro Ser Arg 180 185 190 Leu Asn Ile Gln Pro Ala Lys Ala Glu Ser Lys Asp Asn Lys Glu Ile 195 200 205 Ala Ser Thr Leu Asn Glu Met Ile Gln Ser Asp Asn Ser Ser Ser Asp 210 215 220 Gly Lys Pro Leu Asp Ser Gly Leu Leu His Asn Asn Asp Arg Leu Ser 225 230 235 240 Asp Gly Asp Ser Lys Tyr Ser Gln Thr Ser His Lys Leu Val Gln Leu 245 250 255 Leu Thr Thr Thr Ala Glu Gln Gln Leu Arg His Ala Asp Ile Asp Thr 260 265 270 Ser Cys Lys Asp Val Leu Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Ser Ala Ser 275 280 285 Ala Asn Ser Ser Gly Gly Ser Cys Pro Ser Ser His Ser Ser Leu Thr 290 295 300 Ala Arg His Lys Ile Leu His Arg Leu Leu Gln Glu Gly Ser Pro Ser 305 310 315 320 Asp Ile Thr Thr Leu Ser Val Glu Pro Asp Lys Lys Asp Ser Ala Ser 325 330 335 Thr Ser Val Ser Val Thr Gly Gln Val Gln Gly Asn Ser Ser Ile Lys 340 345 350 Leu Glu Leu Asp Ala Ser Lys Lys Lys Glu Ser Lys Asp His Gln Leu 355 360 365 Leu Arg Tyr Leu Leu Asp Lys Asp Glu Lys Asp Leu Arg Ser Thr Pro 370 375 380 Asn Leu Ser Leu Asp Asp Val Lys Val Lys Val Glu Lys Lys Glu Gln 385 390 395 400 Met Asp Pro Cys Asn Thr Asn Pro Thr Pro Met Thr Lys Ala Thr Pro 405 410 415 Glu Glu Ile Lys Leu Glu Ala Gln Ser Gln Phe Thr Ala Asp Leu Asp 420 425 430 Gln Phe Asp Gln Leu Leu Pro Thr Leu Glu Lys Ala Ala Gln Leu Pro 435 440 445 Gly Leu Cys Glu Thr Asp Arg Met Asp Gly Ala Val Thr Ser Val Thr 450 455 460 Ile Lys Ser Glu Ile Leu Pro Ala Ser Leu Gln Ser Ala Thr Ala Arg 465 470 475 480 Pro Thr Ser Arg Leu Asn Arg Leu Pro Glu Leu Glu Leu Glu Ala Ile 485 490 495 Asp Asn Gln Phe Gly Gln Pro Gly Thr Gly Asp Gln Ile Pro Trp Thr 500 505 510 Asn Asn Thr Val Thr Ala Ile Asn Gln Ser Lys Ser Glu Asp Gln Cys 515 520 525 Ile Ser Ser Gln Leu Asp Glu Leu Leu Cys Pro Pro Thr Thr Val Glu 530 535 540 Gly Arg Asn Asp Glu Lys Ala Leu Leu Glu Gln Leu Val Ser Phe Leu 545 550 555 560 Ser Gly Lys Asp Glu Thr Glu Leu Ala Glu Leu Asp Arg Ala Leu Gly 565 570 575 Ile Asp Lys Leu Val Gln Gly Gly Gly Leu Asp Val Leu Ser Glu Arg 580 585 590 Phe Pro Pro Gln Gln Ala Thr Pro Pro Leu Ile Met Glu Glu Arg Pro 595 600 605 Asn Leu Tyr Ser Gln Pro Tyr Ser Ser Pro Phe Pro Thr Ala Asn Leu 610 615 620 Pro Ser Pro Phe Gln Gly Met Val Arg Gln Lys Pro Ser Leu Gly Thr 625 630 635 640 Met Pro Val Gln Val Thr Pro Pro Arg Gly Ala Phe Ser Pro Gly Met 645 650 655 Gly Met Gln Pro Arg Gln Thr Leu Asn Arg Pro Pro Ala Ala Pro Asn 660 665 670 Gln Leu Arg Leu Gln Leu Gln Gln Arg Leu Gln Gly Gln Gln Gln Leu 675 680 685 Ile His Gln Asn Arg Gln Ala Ile Leu Asn Gln Phe Ala Ala Thr Ala 690 695 700 Pro Val Gly Ile Asn Met Arg Ser Gly Met Gln Gln Gln Ile Thr Pro 705 710 715 720 Gln Pro Pro Leu Asn Ala Gln Met Leu Ala Gln Arg Gln Arg Glu Leu 725 730 735 Tyr Ser Gln Gln His Arg Gln Arg Gln Leu Ile Gln Gln Gln Arg Ala 740 745 750 Met Leu Met Arg Gln Gln Ser Phe Gly Asn Asn Leu Pro Pro Ser Ser 755 760 765 Gly Leu Pro Val Gln Thr Gly Asn Pro Arg Leu Pro Gln Gly Ala Pro 770 775 780 Gln Gln Phe Pro Tyr Pro Pro Asn Tyr Gly Thr Asn Pro Gly Thr Pro 785 790 795 800 Pro Ala Ser Thr Ser Pro Phe Ser Gln Leu Ala Ala Asn Pro Glu Ala 805 810 815 Ser Leu Ala Asn Arg Asn Ser Met Val Ser Arg Gly Met Thr Gly Asn 820 825 830 Ile Gly Gly Gln Phe Gly Thr Gly Ile Asn Pro Gln Met Gln Gln Asn 835 840 845 Val Phe Gln Tyr Pro Gly Ala Gly Met Val Pro Gln Gly Glu Ala Asn 850 855 860 Phe Ala Pro Ser Leu Ser Pro Gly Ser Ser Met Val Pro Met Pro Ile 865 870 875 880 Pro Pro Pro Gln Ser Ser Leu Leu Gln Gln Thr Pro Pro Ala Ser Gly 885 890 895 Tyr Gln Ser Pro Asp Met Lys Ala Trp Gln Gln Gly Ala Ile Gly Asn 900 905 910 Asn Asn Val Phe Ser Gln Ala Val Gln Asn Gln Pro Thr Pro Ala Gln 915 920 925 Pro Gly Val Tyr Asn Asn Met Ser Ile Thr Val Ser Met Ala Gly Gly 930 935 940 Asn Thr Asn Val Gln Asn Met Asn Pro Met Met Ala Gln Met Gln Met 945 950 955 960 Ser Ser Leu Gln Met Pro Gly Met Asn Thr Val Cys Pro Glu Gln Ile 965 970 975 Asn Asp Pro Ala Leu Arg His Thr Gly Leu Tyr Cys Asn Gln Leu Ser 980 985 990 Ser Thr Asp Leu Leu Lys Thr Glu Ala Asp Gly Thr Gln Gln Val Gln 995 1000 1005 Gln Val Gln Val Phe Ala Asp Val Gln Cys Thr Val Asn Leu Val Gly 1010 1015 1020 Gly Asp Pro Tyr Leu Asn Gln Pro Gly Pro Leu Gly Thr Gln Lys Pro 1025 1030 1035 1040 Thr Ser Gly Pro Gln Thr Pro Gln Ala Gln Gln Lys Ser Leu Leu Gln 1045 1050 1055 Gln Leu Leu Thr Glu 1060

Claims

인간 유래의 에스트로겐 수용체 α의 유전자와 GAL4 DNA 결합영역을 포함하는 단일-하이브리드 시스템의 제작단계;

GAL4 전사활성화영역과 전사 공역인자 SRC1(Steroid Receptor Co-activator-1)을 포함하는 발현벡터의 제작단계;

상기 단계에서 제작된 발현벡터들을 염색체 상에 리포터 유전자군 (UAS _GAL4 -TATA-lacZ)이 삽입된 효모 사카로마이시스 세레비세(Saccaromyces cerevisiae) YRG-2에 도입하는 단계;

상기 이중-하이브리드 시스템에 의해 형질전환된 효모를 특정 화학물질을 일정 농도로 처리한 환경에서 배양하여 상기 리포터 유전자를 발현시키는 단계; 및,

상기 리포터 유전자로부터 발현된 β-갈락토시다제의 발현정도를 모니터하고 에스트로겐 수용체 α의 리간드 의존적인 전사 활성화 정도를 측정하여 상기 특정 화학물질이 에스트로겐 유사물질인지를 판별하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 내분비계 장애물질의 판별방법.
플라스미드 pGBT9에 GAL4의 DNA 결합영역(DNA Binding Domain, DBD)과 인간 유래의 에스트로겐 수용체(human Estrogen Receptor, hER) α의 리간드 결합영역(Ligand Binding Domain, LBD)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 도 1의 개열지도로 나타내어지는 벡터 pGAL4 DBD-hERαLBD.
플라스미드 pGBT9에 GAL4의 DNA 결합영역(DNA Binding Domain, DBD)과 인간 유래의 에스트로겐 수용체(human Estrogen Receptor, hER) α의 전장을 포함하는 것을 특징으로 하는, 도 2의 개열지도로 나타내어지는 벡터 pGAL4 DBD-hERα full-length.
플라스미드 pGAD10에 GAL4의 전사활성화영역(Transcriptional Activation Domain, TAD)과 전사 공역인자 SRC1(Steroid Receptor Co-activator-1)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 도 3의 개열지도로 나타내어지는 벡터 pGAL4 TAD-SRC1.
리포터 유전자군(UAS _GAL4 -TATA-lacZ)을 사카로마이시스 세레비세 YRG-2의 염색체 상에 삽입시키고, 제3항의 발현 벡터 pGAL4 DBD-hERαfull-length 및 제4항의 발현 벡터 pGAL4 TAD-SRC1를 초산리튬법을 이용하여 상기 리포터 유전자군이 염색체 상에 삽입된 사카로마이시스 세레비세 YRG-2에 도입시켜 제조됨을 특징으로 하는 효모 형질전환체의 제조방법.
리포터 유전자군(UAS _GAL4 -TATA-lacZ)을 사카로마이시스 세레비세 YRG-2의 염색체 상에 삽입시키고, 제3항의 발현 벡터 pGAL4 DBD-hERαfull-length를 초산리튬법을 이용하여 상기 리포터 유전자군이 염색체 상에 삽입된 사카로마이시스 세레비세 YRG-2에 도입시켜 제조됨을 특징으로 하는 효모 형질전환체의 제조방법.
리포터 유전자군(UAS _GAL4 -TATA-lacZ)을 사카로마이시스 세레비세 YRG-2의 염색체 상에 삽입시키고, 제2항의 발현 벡터 pGAL4 DBD-hERαLBD 및 제4항의 발현 벡터 pGAL4 TAD-SRC1를 초산리튬법을 이용하여 상기 리포터 유전자군이 염색체 상에 삽입된 사카로마이시스 세레비세 YRG-2에 도입시켜 제조됨을 특징으로 하는 효모 형질전환체 제조방법.
리포터 유전자군(UAS _GAL4 -TATA-lacZ)이 염색체 상에 삽입되어 있으며, 제3항의 발현 벡터 pGAL4 DBD-hERαfull-length 및 제4항의 발현 벡터 pGAL4 TAD-SRC1로 형질전환된 사카로마이시스 세레비세(Saccaromyces cerevisiae) KCCM 10429.