MX2011006416A

MX2011006416A - Diacuerpos covalentes y sus usos.

Info

Publication number: MX2011006416A
Application number: MX2011006416A
Authority: MX
Inventors: Leslie S Johnson; Ling Huang
Original assignee: Macrogenics Inc
Priority date: 2008-12-19
Filing date: 2009-12-17
Publication date: 2011-07-12
Also published as: JP6059761B2; HUE043084T2; SI2786762T1; CN106432503A; LT2786762T; IL253751B; JP2012512894A; MX357289B; IL213348A; EP2786762A2; RU2011129794A; EP2786762B1; KR101940059B1; CL2011001449A1; ES2732191T3; IL269454B; CA2745460A1; PL2786762T3; RU2016127552A3; IL213348A0

Abstract

La presente invención está dirigida a moléculas de diacuerpo y sus usos en el tratamiento de una variedad de enfermedades y trastornos, que incluyen trastornos inmunológicos, enfermedad infecciosa, intoxicación, y cánceres. Las moléculas de diacuerpo de la invención comprenden dos cadenas de polipéptido que se asocian para formar al menos dos sitios de unión de epítopo, que pueden reconocer el mismo o diferentes epítopos en el mismo o diferentes antígenos. Adicionalmente, los antígenos pueden formar la misma o diferentes moléculas. Las cadenas de polipéptido individuales de la molécula de diacuerpo pueden covalentemente unirse a través de enlaces covalente de unión no de péptido, tales como, pero no limitándose a el enlace de disulfuro de residuos de cisteína localizados dentro de cada cadena de polipéptido. En modalidades particulares, las moléculas de diacuerpo de la presente invención además comprenden una región Fc, que permite la funcionalidad de tipo anticuerpo para modificarse dentro de la molécula.

Description

DIACUERPOS COVALENTES Y SUS USOS Campo de la Invención La presente invención está dirigida a moléculas de diacuerpo, por el contrario referidas como "reactivos de redireccionamiento de afinidad doble ("DARTS"), y sus usos en el tratamiento de una variedad de enfermedades y trastornos que incluyen trastornos inmunológicos y cánceres . Las moléculas de diacuerpo de la invención comprenden por lo menos dos cadenas de polipéptido que se asocian para formar por lo menos dos sitios de unión de epítopo, que pueden reconocer el mismo o diferentes epítopos. Adicionalmente , los epítopos pueden ser de la misma o diferentes moléculas o localizarse en la misma o diferentes células. Las cadenas de polipéptido individuales de la molécula de diacuerpo pueden covalentemente unirse a través de enlaces covalentes de unión no de péptido, tales como, pero no limitándose a, la unión de disulfuro a residuos de cisteína localizados dentro de cada cadena de polipéptido. En modalidades particulares, las moléculas de diacuerpo de la presente invención además comprenden una región Fe, que permite una funcionalidad de tipo anticuerpo a ser modificada en la molécula.

Antecedentes de la Invención El diseño de diacuerpos covalentes se basa en un constructo Fv de cadena individual (scFv) (Holliger et al.

Ref. 220410 (1993) " 'Diabodies' : Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragmente", Proc . Nati . Acad. Sci . USA 90:6444-6448; incorporada aquí por referencia en su totalidad) . En un IgG no modificado intacto, los dominios VL y VH se localizan en cadenas de polipéptido separadas, es decir, la cadena ligera y la cadena pesada, respectivamente. La interacción de una cadena ligera de anticuerpo y una cadena pesada de anticuerpo y, en particular, la interacción de los dominios VL y VH que forman uno de los sitios de unión de epítopo del anticuerpo. En contraste, el constructo scFv comprende un dominio VL y VH de un anticuerpo contenido en una cadena de polipéptido individual en donde los dominios se separan a través de un enlazador flexible de longitud suficiente para permitir al auto-ensamble de dos dominios en un sitio de unión de epítopo funcional. Cuando el auto-ensamble es imposible debido a un enlazador como una longitud insuficiente (menos de aproximadamente 12 residuos de aminoácido) , dos de los constructos scFv interactúan entre sí para formar una molécula divalente, el VL de una cadena que se asocia con el VH de la otra (revisado en arvin et al. (2005) "J^ecombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies" , Acta Pharmacol . Sin. 26:649-658). Además, la adición de un residuo de cisteína al C-terminal del constructo ha demostrado que permite la unión del disulfuro de las cadenas de polipéptido, estabilizando el dímero resultante sin interferir con las características de unión de la molécula divalente (ver, por ejemplo, Olafsen et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications" , Prot . Engr. Des. Sel. 17:21-27). Además, cuando se seleccionan dominios VL y VH de diferente especificidad, se puede construir no solamente una molécula divalente sino también una biespecífica .

Los diacuerpos bivalentes tienen un amplio intervalo de aplicaciones que incluyen terapia e inmunodiagnóstico . La bivalencia permite una gran flexibilidad en el diseño y la modificación de los diacuerpos en varias aplicaciones, proporcionando una avidez mejorada a antígenos multiméricos , el entrelazamiento de diferentes antígenos, y el direccionamiento dirigido a tipos de células específicos que se basan en la presencia de ambos antígenos objetivo. Debido a su valencia aumentada, los bajos grados de disociación y la rápida depuración de la circulación (para diacuerpos de tamaño pequeño, a o por debajo de -50 kDa) , las moléculas de diacuerpo que se conocen en la técnica también han demostrado particular uso en el campo de formación de imágenes de tumor (Fitzgerald et al. (1997) "Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris" , Protein Eng. 10:1221). De particular importancia es el entrelazamiento de las diferentes células, por ejemplo el entrelazamiento de células T citotóxicas a células tumorales (Staerz et al. (1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells", Nature 314:628-631, y Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody" , Protein Eng. 9:299-305). Los dominios de unión del epítopo del diacuerpo también pueden dirigirse hacia una determinante de la superficie de cualquier célula efecto inmunitario tal como CD3 , CD16, CD32, o CD64, que se expresan en linfocitos T, células aniquiladoras naturales (NK, por sus siglas en inglés) u otras células mononucleares . En muchos estudios, la unión de diacuerpo a las determinantes de la célula efectora (por ejemplo, receptores FCY (FCYR) , también se encuentra que activan la célula efectora (Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody", Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) "Carcinoembryonic Antigen (CEA) -Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusión Proteins" , Cáncer Res. 59:2909-2916). Normalmente, la activación de la célula efectora se direcciona a través de la unión de un anticuerpo de unión a antígeno a una célula efectora a través de la interacción FC-FCYR; de esta forma, a este respecto, las moléculas de diacuerpo de la invención pueden exhibir una funcionalidad de tipo Ig independiente de sí comprenden un dominio Fe (por ejemplo, como se ensaya en cualquier ensayo de función efectora conocido en la técnica o se ejemplifica en la presente (por ejemplo, el ensayo ADCC) ) . A través del entrelazamiento de las células tumorales efectoras, el diacuerpo no solamente pone a la célula efectora dentro de la proximidad con las células tumorales sino conduce a una aniquilación tumoral efectiva (ver, por ejemplo, Cao et al. (2003) "Bispecific Antihody Conjugates In Therapeutics" , Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197, incorporada aquí por referencia en su totalidad) .

RECEPTORES DE CELULA EFECTORA Y SUS PAPEL EN EL SISTEMA INMUNITARIO En la función inmunitaria tradicional la interacción de los complejos de anticuerpo-antígeno con células del sistema inmunitario da como resultado un amplio arreglo de respuestas, en el intervalo de funciones efectoras tales como la citotoxicidad dependiente del anticuerpo, desgranulación de mastocitos, y la fagocitosis para señales inmunomoduladores tales como la regulación de la proliferación de linfocitos y la secreción del anticuerpo. Todas estas interacciones se inician a través de la unión del dominio Fe de los anticuerpos o complejos inmunitarios a receptores de superficie celular especializados en células hematopoyéticas . La diversidad de las respuestas celulares activadas por los anticuerpos y los complejos inmunitarios resulta de la heterogeneidad estructural de los receptores Fe. Los receptores Fe se dividen estructuralmente relacionados con dominios de unión de antígeno que presumiblemente median la señalización intracelular .

Los receptores FCY, miembros de la superfamilia del gen de inmunoglobulina de proteínas, son glicoproteínas de superficie que se unen a la porción Fcy de las moléculas de inmunoglobulina. Cada miembro de la familia reconoce inmunoglobulinas de uno o más isotipos a través de un dominio de reconocimiento en la cadena alfa del receptor Fcy. Los receptores Fcy se definen por su especificidad para subtipos de inmunoglobulina. Los receptores Fcy para IgG son referidos como FcyR, para IgE como FcsR, y para IgA como FcaR. Diferentes células accesorias que llevan receptores Fcy para anticuerpos de diferente isotipo, y el isotipo del anticuerpo determina qué células accesorias se conectarán en una respuesta dada (revisado por Ravetch J.V. et al. (1991) "Fe Receptors" , Annu. Rev. Immunol . 9:457-92; Gerber J.S. et al. (2001) "Stimulatory And Inhibitory Signáis Originating From The Macrophage Fcgamma Receptors" , Microbes and Infection, 3: 131-139; Billadeau D. D. et al. (2002), " ITAMs Versus ITIMs : Striking A Balance During Cell Regulation" , The Journal of Clinical Investigation, 2(109): 161-1681; Ravetch J.V. et al. (2000) "Immune Inhibitory Receptors" , Science, 290: 84-89; Ravetch J.V. et al., (2001) "IgG Fe Receptors", Annu. Rev.

Immunol. 19:275-90; Ravetch J.V. (1994) "Fc Receptors : Rubor Redux" , Cell, 78(4): 553-60). Los diferentes receptores Fcy, las células que los expresan, y su especificidad de isotipo se resumen en la Tabla 1 (adaptada de Immunobiology : The Immune System in Health and Disease, 4a ed. 1999, Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, New York) .

Receptores Fcy Cada miembro de esta familia es una glicoproteína de membrana integral, que procesa los dominios extracelulares relacionados con un grupo C2 de dominios relacionados con la inmunoglobulina, un dominio de extensión de membrana individual y un dominio intracitoplásmico de longitud variable. Existen tres FcyRs conocidos, designados FCYRI(CD64), FcyRII (CD32) , y FCYRIII (CD16) . Los tres receptores están codificados por diferentes genes; sin embargo, la extensa homología entre los tres miembros de la familia sugiere que surgen de un progenitor común quizás a través de la duplicación génica.

FcvRII (CD32) Las proteínas FcyRII son glicoproteínas de membrana integral de 40 kDa que se unen solamente al IgG en complejo debido a la baja afinidad para Ig (106 M"1) . Este receptor es el FcyR más ampliamente expresado, presente en todas las células hematopoyéticas , que incluyen monocitos, macrófagos, células B, células NK, neutrófilos, mastocitos, y plaquetas.

FCYRII tiene solamente dos regiones de tipo inmunoglobulina en su cadena de unión de inmunoglobulina y por lo tanto una mucha más baja afinidad para IgG que FCYRI . Existen tres genes FcyRII humanos (FcyRII -A, FcyRI I -B , FcyRII-C) , todos los cuales se unen a IgG en agregados y complejos inmunitarios .

Las varias diferencias entre los dominios citoplásmicos de FcyRII -A y FcyRII -B crean dos respuestas funcionalmente heterogéneas a la ligación del receptor. La diferencia fundamental es que la isoforma A inicia la señalización intracelular que conduce a la activación celular tal como fagocitosis y ráfaga respiratoria, mientras la isoforma B inicia las señales inhibidoras, por ejemplo, la inhibición de la activación de la célula B.

FcyRIII (CDU) Debido a la heterogeneidad dentro de esta clase, el tamaño de FcyRIII está en el intervalo de entre 40 y 80 kDa en el ratón y el hombre. Los dos genes humanos codifican dos transcriptos, FcyRIIIA, una glicoproteína de membrana integral, y FcyRIIIB, una versión enlaza a glicosilfosfatidil-inositol (GPI) . Un gen de murino codifica un homólogo FcyRIII para FcyRIIIA humano de extensión de membrana. FcyRIII comparte características estructurales con cada uno de los otros dos FcyRs . Al igual que FcyRII, FcyRIII se une a IgG con baja afinidad y contiene los dos dominios de tipo Ig extracelulares correspondientes. FCYRIIIA se expresa en macrófagos , mastocitos y el FcyR solo en células NK. El FCYRIIIB enlazado a GPI actualmente se sabe que se expresa solamente en neutrófilos humanos.

Señalización a través de FcyRs Ambas señales de activación e inhibición se transducen a través de FcyRs después de la ligación. Estas funciones diamétricamente opuestas dan como resultado diferencias estructurales entre las diferentes isoformas del receptor. Dos diferentes dominios dentro de los dominios de señalización citoplásmicos del receptor denominados motivos de activación con base en el inmuno-receptor de tirosina (ITAM) o motivos inhibidores con base en el inmuno-receptor de tirosina (ITIMS) representan las diferentes respuestas. El reclutamiento de diferentes enzimas citoplásmicas para estas estructuras dicta el resultado de las respuestas celulares mediadas por FcyR . Los complejos ITAM que contienen FcyR incluyen FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA, mientras los complejos que contienen ITIM solamente incluyen FcyRIIB.

Los neutrófilos humanos expresan el gen FcyRIIA. El agrupamiento de FcyRIIA a través de complejos inmunitarios o entrelazamiento del anticuerpo específico sirven para agregar ITAM junto con cinasas asociadas con el receptor que facilitan la fosforilación de ITAM. La fosforilación ITAM sirve como un sitio de acoplamiento para la cinasa Syk, la activación de la cual resulta en activación de los sustratos en corriente abajo (por ejemplo, PI3K) . La activación celular conduce a la liberación de mediadores proinflamatorios .

El gen FCYRIIB se expresa en linfocitos B; su dominio extracelular es 96% idéntico a FCYRIIA y se une a los complejos IgG en una forma indistinguible. La presencia de un ITIM en el dominio citoplásmico de FCYRIIB define su subclase inhibidora de FcyR. Recientemente, se establecieron las bases moleculares de esta inhibición. Cuando se co-ligó junto con un FcyR, el ITIM en FcyRIIB se convierte en fosforilado y atrae el dominio SH2 de inositol polifosfato 5'-fosfatasa (SHIP) , que hidroliza los mensajeros de fosfoinositol liberados como una consecuencia de la activación de la tirosina cinasa mediada por FcyR conteniendo ITAM, en consecuencia previniendo el influjo de Ca++ intracelular . De esta forma el entrelazamiento de FcyRIIB obstaculiza la activación de la respuesta para la ligación FcyR e inhibe el grado de reacción celular. La activación de la célula B, la proliferación de la célula B y la secreción del anticuerpo de esta forma se abortan.

TABLA 1. Receptores para las Regiones Fe de Isotipos de Inmunoglobulina Receptor Unión Tipo de célula Efecto de la ligación Estimulación de Macrófagos absorción IgGl Neutrófilos FcyRI (CD64) Activación de ráfaga 108 M"1 Eosinóf los respiratoria Células dendríticas Inducción de Receptor Unión Tipo de célula Efecto de la ligación aniquilación Macróf gos Neutrófilos FcyRII-A IgGl Eosinófilos Absorción de (CD32) 2 X 106 M"1 Células dendríticas Liberación de Gránulo Plaquetas oc Células Langerhan Macrófagos Inhibición de FcyRII -B2 igGi Neutrófilos Absorción de (CD32) 2 x 106 M"1 Eosinófilos Estimulación No absorción FcyRII-Bl igGi Células B Inhibición de (CD32) 2 x 10s M"1 Mastocitos estimulación 0 Células NK Eosinófilos FCYRIII IgGl Inducción de Macrófagos (CD16) 5 X 105 M"1 aniquilación Neutrófilos Mastocitos Mastocitos IgE FcDRI Eosinófilos Secreción de gránulos 1010 M"1 Basófilos 5 Macrófagos FcDRI IgGAl , IgA2 Inducción de absorción Neutrófilos (CD89) 107 M"1 de aniquilación Eosinófilos Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a diacuerpos covalentes y/o moléculas de diacuerpo covalentes y su uso en el tratamiento de una variedad de enfermedades y trastornos que incluyen cáncer, trastornos autoinmunitarios , trastornos de alergia y enfermedades infecciosas causadas por bacterias, hongos o virus. Preferiblemente, el diacuerpo de la presente invención puede unir dos diferentes epítopos en dos diferentes células en donde el primer primer epítopo se expresa en un diferente tipo de célula que el segundo epítopo, de tal forma que el diacuerpo puede poner en contacto dos células.

En una modalidad, la presente invención está dirigida a un diacuerpo biespecífico covalente, cuyo anticuerpo comprende una primera y una segunda cadena de polipéptido, en donde la primera cadena de polipéptido comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítopo, y, opcionalmente, (iii) un tercer dominio que comprende por lo menos un residuo de cisteína, cuyo primero y segundo dominios están covalentemente enlazados de tal forma que el primero y segundo dominios no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; cuya segunda cadena de polipéptido comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2) , (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1) , y, opcionalmente, (iii) un sexto dominio que comprende por lo menos un residuo de cisteína, cuyo cuarto y quinto dominios están covalentemente enlazados de tal forma que el cuarto y quinto dominios no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; y en donde la primera cadena de polipéptido y la segunda cadena de polipéptido están covalentemente enlazadas, en donde el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1) (VH1) que une el primer epítopo; en donde el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2) (VH2) que une el segundo epítopo.

En otra modalidad, la presente invención está dirigida a un diacuerpo biespecífico covalente, cuyo diacuerpo comprende una primera y una segunda cadena de polipéptido, cuya primera cadena de polipéptido comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítopo y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fe o una de sus porciones, cuyo primer y segundo dominios están covalentemente enlazados de tal forma que el primero y segundo dominios no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; cuya segunda cadena de polipéptido comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2) , (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1) , cuyo cuarto y quinto dominios están covalentemente enlazados de tal forma que el tercero y cuarto dominios no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; y en donde la primera cadena de polipéptido y la segunda cadena de polipéptido están covalentemente enlazadas, siempre que el enlace covalente no sea un enlace de péptido; en donde el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1) (VH1) que une el primer epítopo; en donde el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2) (VH2) que une el segundo epítopo.

En ciertos aspectos, la presente invención está dirigida a la molécula de diacuerpo, cuya molécula comprende una primera y una segunda cadena de polipéptido, cuya primera cadena de polipéptido comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítopo y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fe o una de sus porciones, cuyo primer y segundo dominios están covalentemente enlazados de tal forma que el primero y segundo dominios no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; en donde la segunda cadena de polipéptido comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2) , (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VHl) , y (iii) un sexto dominio que comprende por lo menos un residuo de cisteína, cuyo cuarto y quinto dominios están covalentemente enlazados de tal forma que el cuarto y quinto dominios no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; y en donde la primera cadena de polipéptido y la segunda cadena de polipéptido están covalentemente enlazadas, siempre que el enlace covalente no sea un enlace de péptido; en donde el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1) (VHl) que une el primer epítopo; en donde el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2) (VH2) que une el segundo epítopo.

En ciertas modalidades, la presente invención está dirigida a un diacuerpo biespecífico covalente, cuyo diacuerpo es un dímero de moléculas de diacuerpo, cada molécula de diacuerpo comprende una primera y una segunda cadena de polipéptido, cuya primera cadena de polipéptido comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítopo y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fe o una de sus porciones, cuyo primer y segundo dominios están covalentemente enlazados de tal forma que el primero y segundo dominios no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; y cuya segunda cadena de polipéptido comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2) , (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1) , y (iii) un sexto dominio que comprende por lo menos un residuo de cisteína, cuyo cuarto y quinto dominios están covalentemente enlazados de tal forma que el cuarto y quinto dominios no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; y en donde la primera cadena de polipéptido y la segunda cadena de polipéptido de cada molécula de diacuerpo están covalentemente enlazados, siempre que el enlace covalente no sea un enlace de péptido; en donde el primer dominio y el quinto dominio de cada molécula de diacuerpo se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1) (VH1) que une el primer epítopo; en donde el segundo dominio y el cuarto dominio de cada molécula de diacuerpo se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2) (VH2) que une el segundo epítopo.

En aún otras modalidades, la presente invención está dirigida a un diacuerpo tetraespecífico covalente, cuyo diacuerpo es un dímero de moléculas de diacuerpo, la primera molécula de diacuerpo comprende una primera y una segunda cadena de polipéptido, cuya primera cadena de polipéptido comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítopo y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fe o una de sus porciones, cuyo primer y segundo dominios están covalentemente enlazados de tal forma que el primero y segundo dominios no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; y cuya segunda cadena de polipéptido comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1) , y (iii) un sexto dominio que comprende por lo menos un residuo de cisteína, cuyo cuarto y quinto dominios están covalentemente enlazados de tal forma que el cuarto y quinto dominios no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; y en donde la primera cadena de polipéptido y la segunda cadena de polipéptido están covalentemente enlazados, siempre que el enlace covalente no sea un enlace de péptido; en donde el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1) (VH1) que une el primer epítopo; en donde el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2) (VH2) que une el segundo epítopo; y la segunda molécula de diacuerpo comprende una primera y una segunda cadena de polipéptido, cuya primera cadena de polipéptido comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una tercera inmunoglobulina (VL3) específica para un tercer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una cuarta inmunoglobulina (VH4) específica para un cuarto epítopo y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fe o una de sus porciones, cuyo primer y segundo dominios están covalentemente enlazados de tal forma que el primero y segundo dominios no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; y cuya segunda cadena de polipéptido comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la cuarta inmunoglobulina (VL4), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la tercera inmunoglobulina (VH3) , y (iii) un sexto dominio que comprende por lo menos un residuo de cisteína, cuyo cuarto y quinto dominios están covalentemente enlazados de tal forma que el cuarto y quinto dominios no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; y en donde la primera cadena de polipéptido y la segunda cadena de polipéptido están covalentemente enlazados, siempre que el enlace covalente no sea un enlace de péptido; en donde el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL3) (VH3) que une el tercer epítopo; en donde el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL4) (VH4) que une el cuarto epítopo .

En ciertos aspectos de la invención el primer epítopo, el segundo epítopo, y cuando es aplicable, el tercer epítopo y el cuarto epítopo pueden ser iguales . En otros aspectos, el primer epítopo, el segundo epítopo, y cuando es aplicable, el tercer epítopo y el cuarto epítopo pueden cada uno ser diferentes entre sí. En ciertos aspectos de la invención que comprenden un tercer dominio de unión de epítopo, el primer epítopo y el tercer epítopo pueden ser iguales. En ciertos aspectos de la invención que comprenden un cuarto dominio de unión de epítopo, el primer epítopo y el cuarto epítopo pueden ser iguales. En ciertos aspectos de la invención que comprenden un tercer dominio de unión de epítopo, el segundo epítopo y el tercer epítopo pueden ser iguales. En ciertos aspectos de la invención que comprenden un cuarto dominio de unión de epítopo, el segundo epítopo y el cuarto epítopo pueden ser iguales . En aspectos preferidos de la invención, el primer epítopo y el segundo epítopo son diferentes. En aún otros aspectos de la invención que comprenden un el tercer dominio de unión de epítopo y un cuarto dominio de unión de epítopo, el tercer epítopo y el cuarto epítopo pueden ser diferentes. Se entiende que cualquier combinación de lo anterior está abarcada en la presente invención.

En aspectos particulares de la invención, el primer dominio y el quinto dominio del diacuerpo o la molécula de diacuerpo pueden derivarse de la misma inmunoglobulina . En otro aspecto, el segundo dominio y el cuarto dominio del diacuerpo o la molécula de diacuerpo pueden derivarse de la misma inmunoglobulina. En aún otro aspecto, el primer dominio y el quinto dominio del diacuerpo o la molécula de diacuerpo pueden derivarse de una inmunoglobulina diferente. En aún otro aspecto, el segundo dominio y el cuarto dominio del diacuerpo o la molécula de diacuerpo pueden derivarse de una inmunoglobulina diferente. Se entiende que cualquier combinación de lo anterior está abarcada en la presente invención .

En ciertos aspectos de la invención, el enlace covalente entre la primera cadena de polipéptido y la segunda cadena de polipéptido del diacuerpo o la molécula de diacuerpo pueden ser a través de un enlace de disulfuro entre por lo menos un residuo de cisteína en la primera cadena de polipéptido y por lo menos un residuo de cisteína en la segunda cadena de polipéptido. Los residuos de cisteína en la primera o segunda cadena de polipéptidos que son responsables de la unión de disulfuro pueden encontrarse en cualquier lugar en la cadena de polipéptido incluyendo dentro del primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto dominios. En una modalidad específica el residuo de cisteína en la primera cadena de polipéptido se encuentra en el primer dominio y el residuo de cisteína en la segunda cadena de polipéptido se encuentra en el quinto dominio. El primero, segundo, cuarto y quinto dominios corresponden a regiones variables responsables de la unión. En modalidades preferidas, los residuos de cisteína responsables del enlace de disulfuro entre la primera y la segunda cadena de polipéptidos se localizan dentro del tercero y sexto dominios, respectivamente. En un aspecto particular de esta modalidad, el tercer dominio de la primera cadena de polipéptido comprende 6 aminoácidos C-terminal de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEC ID NO: 23) , que pueden codificarse a través de la secuencia de aminoácido (SEC ID NO: 17) . En otro aspecto de esta modalidad, el sexto dominio de la segunda cadena de polipéptido comprende 6 aminoácidos C-terminal de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEC ID NO: 23), que pueden codificarse a través de la secuencia de aminoácido (SEC ID NO: 17) . En aún otro aspecto de esta modalidad, el tercer dominio de la primera cadena de polipéptido comprende la secuencia de aminoácido VEPKSC (SEC ID NO: 77) , derivada del dominio de bisagra de un IgG humano, y que pueden codificarse a través de la secuencia de nucleótido (SEC ID NO: 78) . En otro aspecto de esta modalidad, el sexto dominio de la segunda cadena de polipéptido comprende la secuencia de aminoácido VEPKSC (SEC ID NO: 77) , derivada del dominio de bisagra de un IgG humano, y que pueden codificarse a través de la secuencia de nucleótido (SEC ID NO: 78) . En ciertos aspectos de esta modalidad, el tercer dominio de la primera cadena de polipéptido comprende 6 aminoácidos C-terminal de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEC ID NO: 23) ; y el sexto dominio de la segunda cadena de polipéptido comprende la secuencia de aminoácido VEPKSC (SEC ID NO: 77) . En otros aspectos de esta modalidad, el sexto dominio de la segunda cadena de polipéptido comprende 6 aminoácidos C- terminal de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEC ID NO: 23) ; y el tercer dominio de la primera cadena de polipéptido comprende la secuencia de aminoácido VEPKSC (SEC ID NO: 77) . En aún otros aspectos de esta modalidad, el tercer dominio de la primera cadena de polipéptido comprende 6 aminoácidos C-terminal de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEC ID NO: 23) ; y el sexto dominio de la segunda cadena de polipéptido comprende un dominio de bisagra. En otros aspectos de esta modalidad, el sexto dominio de la segunda cadena de polipéptido comprende 6 aminoácidos C-terminal de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEC ID NO: 23) ; y el tercer dominio de la primera cadena de polipéptido comprende el dominio de bisagra. En aún otros aspectos de esta modalidad, el tercer dominio de la primera cadena de polipéptido comprende 6 aminoácidos C-terminal de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEC ID NO: 23) ; y el sexto dominio de la primera cadena de polipéptido comprende un dominio Fe, o una de sus porciones. En aún otros aspectos de esta modalidad, el sexto dominio de la segunda cadena de polipéptido comprende 6 aminoácidos C-terminal de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEC ID NO: 23) ; y el tercer dominio de la primera cadena de polipéptido comprende un dominio Fe, o una de sus porciones .

En otras modalidades, los residuos de cisteína en el primero o segundo polipéptido que son responsables del enlace de disulfuro pueden localizarse fuera del primero, segundo o tercer dominios en la primera cadena de polipéptido y fuera del cuarto, quinto y sexto dominios en la segunda cadena de polipéptido. En particular, el residuo de cisteína en la primera cadena de polipéptido puede ser N-terminal al primer dominio o pueden ser C-terminal al primer dominio. El residuo de cisteína en la primera cadena de polipéptido puede ser N-terminal al segundo dominio o pueden ser C-terminal al segundo dominio. El residuo de cisteína en la primera cadena de polipéptido puede ser N-terminal al tercer dominio o pueden ser C-terminal al tercer dominio. Además, el residuo de cisteína en la segunda cadena de polipéptido puede ser N-terminal al cuarto dominio o pueden ser C-terminal al cuarto dominio. El residuo de cisteína en la segunda cadena de polipéptido puede ser N-terminal al quinto dominio o puede ser C-terminal al quinto dominio. Por consiguiente, el residuo de cisteína en la segunda cadena de polipéptido puede ser C-terminal al sexto dominio o puede ser N-terminal al sexto dominio. En un aspecto particular, el enlace de disulfuro puede estar entre al menos dos residuos de cisteína en la primera cadena de polipéptido y al menos dos residuos de cisteína en la segunda cadena de polipéptido. En un aspecto particular, en donde el tercer dominio y el sexto dominio no comprenden un dominio Fe, o una de sus porciones, el residuo de cisteína puede estar en el C-terminal de la primera cadena de polipéptido y en el C-terminal de la segunda cadena de polipéptido. Se entiende que cualquier combinación de lo anterior está abarcada en la presente invención.

En modalidades específicas de la invención descritas supra, el diacuerpo covalente de la invención abarca dímeros de moléculas de diacuerpo, en donde cada molécula de diacuerpo comprende una primera y una segunda cadena de polipéptido. En ciertos aspectos de esta modalidad las moléculas de diacuerpo pueden covalentemente enlazarse para formar el dimero, siempre que el. enlace covalente no sea un enlace de péptido. En aspectos preferidos de esta modalidad, el enlace covalente es un enlace de disulfuro entre por lo menos un residuo de cisteína en la primera cadena de polipéptido de cada molécula de diacuerpo del dimero. En aún otros aspectos preferidos de esta invención, el enlace covalente es un enlace de disulfuro entre por lo menos un residuo de cisteína en la primera cadena de polipéptido de cada molécula de diacuerpo que forman el dimero, en donde por lo menos un residuo de cisteína está localizado en el tercer dominio de cada primera cadena de polipéptido .

En ciertos aspectos de la invención, el primer dominio en la primera cadena de polipéptido puede ser N-terminal al segundo dominio o puede ser C-terminal al segundo dominio. El primer dominio en la primera cadena de polipéptido puede ser N-terminal al tercer dominio o puede ser C-terminal al tercer dominio. El segundo dominio en la primera cadena de polipéptido puede ser N-terminal al primer dominio o pueden ser C-terminal al primer dominio. Además, el segundo dominio en la primera cadena de polipéptido puede ser N-terminal al tercer dominio o pueden ser C-terminal al tercer dominio. Por consiguiente, el tercer dominio en la primera cadena de polipéptido puede ser N-terminal al primer dominio o pueden ser C-terminal al primer dominio. El tercer dominio en la primera cadena de polipéptido puede ser N-terminal al segundo dominio o pueden ser C-terminal al segundo dominio. Con respecto a la segunda cadena de polipéptido, el cuarto dominio puede ser N-terminal al quinto dominio o pueden ser C-terminal al quinto dominio. El cuarto dominio puede ser N-terminal al sexto dominio o pueden ser C-terminal al sexto dominio. El quinto dominio en la segunda cadena de polipéptido puede ser N-terminal al cuarto dominio o pueden ser C-terminal al cuarto dominio. El quinto dominio en la segunda cadena de polipéptido puede ser N-terminal al sexto dominio o pueden ser C-terminal al sexto dominio. Por consiguiente el sexto dominio en la segunda cadena de polipéptido puede ser N-terminal al cuarto dominio o puede ser C-terminal al cuarto dominio. El sexto dominio en la segunda cadena de polipéptido puede ser N-terminal al quinto dominio o pueden ser C-terminal al quinto dominio. Se entiende que cualquier combinación de lo anterior está abarcada en la presente invención.

En ciertas modalidades, el primer dominio y el segundo dominio pueden localizarse C-terminal al tercer dominio en la primera cadena de polipéptido; o el primer dominio y el segundo dominio pueden localizarse N-terminal al tercer dominio en la primera cadena de polipéptido. Con respecto a la segunda cadena de polipéptido, el cuarto dominio y el quinto dominio pueden localizarse C-terminal al sexto dominio, o el cuarto dominio y el quinto dominio pueden localizarse N-terminal al sexto dominio. En ciertos aspectos de esta modalidad, la presente invención está dirigida a un diacuerpo biespecífico covalente, cuyo diacuerpo es un dímero de moléculas de diacuerpo, cada molécula de diacuerpo comprende una primera y una segunda cadena de polipéptido, cuya primera cadena de polipéptido comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítopo y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fe o una de sus porciones, cuyo primero y segundo dominios están covalentemente enlazados de tal forma que el primero y segundo dominios no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo y en donde el tercer dominio está localizado N-terminal a ambos, el primer dominio y el segundo dominio; y cuya segunda cadena de polipéptido comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2) , (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VHl) , y (iii) un sexto dominio que comprende por lo menos un residuo de cisteína, cuyo cuarto y quinto dominios están covalentemente enlazados de tal forma que el cuarto y quinto dominios no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; y en donde la primera cadena de polipéptido y la segunda cadena de polipéptido de cada molécula de diacuerpo están covalentemente enlazados, siempre que el enlace covalente no sea un enlace de péptido; en donde el primer dominio y el quinto dominio de cada molécula de diacuerpo se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1) (VHl) que une el primer epítopo; en donde el segundo dominio y el cuarto dominio de cada molécula de diacuerpo se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2) (VH2) que une el segundo epítopo.

En aún otra modalidad, la presente invención está dirigida a un diacuerpo tetraespecífico covalente, cuyo diacuerpo es un dimero de moléculas de diacuerpo, la primera molécula de diacuerpo comprende una primera y una segunda cadena de polipéptido, cuya primera cadena de polipéptido comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítopo y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fe o una de sus porciones, cuyo primero y segundo dominios están covalentemente enlazados de tal forma que el primero y segundo dominios no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo y en donde el tercer dominio está localizado N-terminal a ambos el primer dominio y el segundo dominio; y cuya segunda cadena de polipéptido comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1) , y (iii) un sexto dominio que comprende por lo menos un residuo de cisteína, cuyo cuarto y quinto dominios están covalentemente enlazados de tal forma que el cuarto y quinto dominios no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; y en donde la primera cadena de polipéptido y la segunda cadena de polipéptido están covalentemente enlazados, en donde el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer . sitio de unión (VL1) (VH1) que une el primer epítopo; en donde el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2) (VH2) que une el segundo epítopo; y la segunda molécula de diacuerpo comprende una primera y una segunda cadena de polipéptido, cuya primera cadena de polipéptido comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una tercera inmunoglobulina (VL3) específica para un tercer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una cuarta inmunoglobulina (VH4) específica para un cuarto epítopo y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fe o una de sus porciones, cuyo primero y segundo dominios están covalentemente enlazados de tal forma que el primero y segundo dominios no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo y en donde el tercer dominio está localizado N-terminal a ambos el primer dominio y el segundo dominio; y cuya segunda cadena de polipéptido comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la cuarta inmunoglobulina (VL4), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la tercera inmunoglobulina (VH3) , y (iii) un sexto dominio que comprende por lo menos un residuo de cisteína, cuyo cuarto y quinto dominios están covalentemente enlazados de tal forma que el cuarto y quinto dominios no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; y en donde la primera cadena de polipéptido y la segunda cadena de polipéptido están covalentemente enlazados, siempre que el enlace covalente no sea un enlace de péptido; en donde el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL3) (VH3) que une el tercer epítopo; en donde el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL4) (VH4) que une el cuarto epítopo.

Como se explicó anteriormente, los dominios en las cadenas de polipéptido individuales están covalentemente enlazados. En aspectos específicos, el enlace covalente entre el primero y el segundo dominio, el primero y el tercer dominio, segundo y tercer dominio, el cuarto y el quinto dominio, el cuarto y el sexto dominio, y/o el quinto y el sexto dominios pueden ser un enlace de péptido. En particular, el primera y el segundo dominios, y el cuarto y el quinto dominios pueden separarse por el tercer dominio y el sexto dominio, respectivamente, o a través de residuos de aminoácido adicional, mientras el primero y el segundo, y el cuarto y el quinto dominios no se asocian para formar un sitio de unión. El número de residuos de aminoácido puede ser O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 Ó 9 residuos de aminoácido. En un aspecto preferido, el número de residuos de aminoácido entre los dominios es de 8.

En ciertos aspectos de la invención, los dominios de la primera y segunda cadena de polipéptido comprenden un dominio Fe, es decir, opcionalmente , el tercero y sexto dominios, respectivamente, además pueden comprender un dominio de bisagra de tal forma que el dominio comprende una región Fe de bisagra. En modalidades alternativas, la primera cadena de polipéptido o la segunda cadena de polipéptido pueden comprender un dominio de bisagra sin también comprender un dominio Fe. Las cadenas pesadas, cadenas ligeras, regiones de bisagra, dominios Fe, y/o dominios de bisagra-Fc para utilizarse en la invención pueden derivarse de cualquier tipo de inmunoglobulina incluyendo IgA, IgD, IgE, IgG o IgM. En un aspecto preferido, el tipo de inmunoglobulina es IgG, o cualquiera de sus subtipos, es decir, IgGi, IgG2, IgG3 o IgG4. En otros aspectos, la inmunoglobulina de la cual se derivan las cadenas ligera y pesada está humanizada o quimerizada.

Además, el primer epítopo y el segundo epítopo, y, cuando es aplicable, el tercer epítopo y el cuarto epítopo, al cual el diacuerpo o la molécula de diacuerpo se une pueden ser diferentes epítopos del mismo antígeno o pueden ser diferentes epítopos de diferentes antígenos. Los antígenos pueden ser cualquier molécula de la cual se puede generar un anticuerpo. Por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, toxinas bacterianas, marcadores de superficie celular, marcadores autoinmunitarios , proteínas virales, fármacos, etc. En aspectos particulares, por lo menos un sitio de unión de epítopo del diacuerpo es específico para un antígeno en una célula particular, tal como una célula B, una célula T, una célula fagocítica, una célula aniquiladora natural (NK) o una célula dendrítica.

En ciertos aspectos de la presente modalidad, al menos un sitio de unión de epítopo del diacuerpo o la molécula de diacuerpo es específica para un receptor Fe, cuyo receptor Fe puede ser un receptor Fe de activación o un receptor Fe inhibidor. En aspectos particulares, el receptor Fe es un receptor FCY, y el receptor Fcy es un receptor FcyRI, FCYRII o FCYRIII. En aspectos más preferidos, el receptor FCYRIII es un receptor FcyRIIIA (CD16A) o el receptor FCYRIIIB (CD16B) , y, más preferiblemente, el receptor FCYRIII es el receptor FCYRIIIA (CD16A) . En otro aspecto preferido, el receptor FcyRII es el receptor FcyRIIA (CD32A) o el receptor FcyRIIB (CD32B) , y más preferiblemente el receptor FcyRIIB (CD32B) . En un aspecto más particularmente preferido, un sitio de unión del anticuerpo es específico para CD32B y el otro sitio de unión es específico para CD16A. En una modalidad específica de la invención, al menos un sitio de unión de epítopo del diacuerpo o la molécula de diacuerpo es específico de un receptor Fe de activación y al menos otro sitio específico para el receptor Fe inhibidor. En ciertos aspectos de esta modalidad el receptor Fe de activación es CD32B. En otros aspectos de esta modalidad el receptor Fe de activación es BCR y el receptor Fe inhibidor es CD32B. En aún otros aspectos de esta modalidad, el receptor Fe de activación es IgERI y el receptor Fe inhibidor es CD32B.

En casos en donde un sitio de unión de epítopo es específico para CD16A, los dominios VL y VH pueden ser iguales como o similares a los dominios VL y VH del anticuerpo de ratón 3G8, la secuencia de la cual ha sido clonada y se establece en la presente. En otros casos en donde un sitio de unión de epítopo es específico para CD32A, los dominios VL y VH pueden ser iguales como o similares a los dominios VL y VH del anticuerpo de ratón IV.3. En aún otros casos en donde el sitio de unión de epítopo es específico para CD32B, los dominios VL y VH pueden ser iguales como o similares a los dominios VL y VH del anticuerpo de ratón 2B6, la secuencia del cual ha sido clonado y establecido en la presente. Se entiende que cualquiera de los dominios VL o VH de los anticuerpos 3G8, 2B6 e IV.3 puede utilizarse en cualquier combinación. La presente invención también está dirigida a un diacuerpo específico como la del diacuerpo en donde el primer epítopo es específico para CD32B, y el segundo epítopo es específico para CD16A.

En otros aspectos, un sitio de unión de epítopo puede ser específico para un antígeno patogénico. Como se utiliza en la presente, un antígeno patogénico es un antígeno involucrado en enfermedades patogénicas específicas, que incluyen cáncer, infección y enfermedad autoinmunitaria . De esta forma, el antígeno patogénico puede ser un antígeno de tumor, un antígeno bacteriano, un antígeno viral, o un antígeno autoinmunitario . Los antígenos patogénicos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a lipopolisacáridos, antígenos virales seleccionados del grupo de antígenos virales para el virus de inmunodeficiencia humana, adenovirus, virus sinsticial respiratorio, Virus del Nilo Occidental (por ejemplo, los antígenos E16 y/o E53) del virus de hepatitis, ácidos nucleicos (ADN y A N) y colágeno. Preferiblemente, el antígeno patogénico es un antígeno neutralizante. En un aspecto preferido, en donde un sitio de unión de epítopo es específico para CD16A o CD32A, el otro sitio de unión de epítopo es específico para un antígeno patogénico que excluye antígenos autoinmunitarios . Aún en otro aspecto preferido, en donde un sitio de unión de epítopo es específico para CD32B, el otro sitio de unión de epítopo es específico para cualquier antígeno patogénico. En modalidades específicas, la molécula de diacuerpo de la invención se une a dos diferentes antígenos en la misma célula, por ejemplo, un sitio de unión de antígeno es específico para un receptor Fe de activación mientras el otro es específico para receptor Fe inhibidor. En otras modalidades, la molécula de diacuerpo se une a dos diferentes epítopos neutralizantes virales, por ejemplo, pero no limitado a, E16 y E53 del Virus del Nilo Occidental.

En aún otra modalidad de la presente invención, los diacuerpos de la invención pueden utilizarse para tratar una variedad de enfermedades y trastornos. Por consiguiente, la presente invención está dirigida a un método para tratar una enfermedad o trastorno que comprende administrar a un paciente en la necesidad del mismo una cantidad efectiva de un diacuerpo o molécula de diacuerpo covalente de la invención en donde por lo menos un sitio de unión es específico para un antígeno patogénico, tal como un antígeno expresado en la superficie de una célula cancerígena o en la superficie de una bacteria o virión y por lo menos otro sitio de unión que es específico para el receptor Fe, por ejemplo, CD16A.

En aún otra modalidad, la invención está dirigida a un método para tratar una enfermedad o trastorno que comprenden administrar a un paciente en la necesidad del mismo una cantidad efectiva de un diacuerpo o la molécula de diacuerpo de la invención, en cuyo al menos un sitio de unión es específico para CD32B y al menos otro sitio de unión es específico para CD16A.

En aún otra modalidad, la invención está dirigida a un método para inducir tolerancia inmunitaria a un antígeno patogénico que comprenden administrar a un paciente en la necesidad del mismo una cantidad efectiva de un diacuerpo covalente o molécula de diacuerpo covalente de la invención, en donde al menos un sitio de unión es específico para CD32B y al menos otro sitio de unión es específico para el antígeno patogénico. En aspectos de esta modalidad, el antígeno patogénico puede ser un alérgeno u otra molécula de la cual se desea la tolerancia inmunitaria, tal como una proteína expresada en un tejido trasplantado.

En aún otra modalidad, la presente invención está dirigida a un método para la desintoxicación que comprenden administrar a un paciente en la necesidad de la misma una cantidad efectiva de un diacuerpo covalente o la molécula de diacuerpo de la invención, en donde al menos un sitio de unión es específico para un marcador de superficie celular tal como un Fe y el otro sitio de unión es específico para una toxina bacteriana o para un fármaco. En un aspecto, el marcador de superficie celular no se encuentra en los glóbulos rojos.

DEFINICIONES A menos que se defina lo contrario, todos los términos de la técnica, anotaciones y otros términos científicos o terminología utilizada en la presente pretenden tener los significados comúnmente obtenidos por el experto en la técnica a la cual pertenece esta invención. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos se define en la presente para claridad y/o para fácil referencia, y la inclusión de tales definiciones en la presente no necesariamente deberá construirse para representar una diferencia sustancial sobre lo que se entiende generalmente en la técnica. La práctica de la presente invención utilizará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes) , microbiología, biología celular, bioquímica, química de ácido nucleico, e inmunología, que están dentro de la experiencia en la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura, tal como Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1999, incluyendo suplementos del 2001); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, incluyendo los suplementos del 2001); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición (Sambrook and Russel, 2001) ; PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullís et al., eds . , 1994); The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed. , Stockton Press Y, 1994); Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson, ed. , Academic Press, 1996); Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W. H. Albert, and N. A. Staines, eds., einheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993), Harlow and Lañe Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1999; y Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000) .

Como se utiliza en la presente, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" se refieren a anticuerpos monoclonales , anticuerpos multiespecífieos , anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos sintéticos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos policlonales, anticuerpos camelizados, Fvs de cadena individual (scFv) , fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fvs biespecífieos enlazados a disulfuro (sdFv) , intracuerpos , y anticuerpos anti -idiotípicos (anti-Id) (que incluyen por ejemplo, anticuerpos anti-Id y anti-anti-Id para anticuerpos de la invención) , y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina (es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno) . Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) , clase (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAx e IgA2) o subclase.

Como se utiliza en la presente, los términos "se une inmunoespecíficamente" , "reconoce inmunoespecíficamente" , "se une específicamente" , "reconoce específicamente" y términos análogos se refieren a moléculas que específicamente se unen a un antígeno (por ejemplo, un epítopo o complejo inmunitario) y no se unen específicamente a otra molécula. Una molécula que específicamente se une a un antígeno puede unirse a otros péptidos o polipéptidos con menor afinidad según se determina a través de, por ejemplo, inmunoensayos , BIAcore, u otros ensayos conocidos en la técnica. Preferiblemente, las moléculas que específicamente se unen a un antígeno no reaccionan de manera cruzada con otras proteínas. Las moléculas que específicamente se unen a un antígeno pueden identificarse, por ejemplo, a través de inmunoensayos, BIAcore, u otras técnicas conocidas por el experto en la técnica.

Como se utiliza en la presente, "complejo inmunitario" se refiere a una estructura que forma cuando se une por lo menos otra molécula objetivo y por lo menos un polipéptido que contiene la región Fcy heteróloga a otra para formar un complejo de peso molecular más grande. Los ejemplos de complejos inmunitarios son complejos de antígeno-anticuerpo que pueden ser ya sea solubles en partículas (por ejemplo, un complejo de antígeno/anticuerpo en la superficie celular) .

Como se utiliza en la presente, los términos "cadena pesada", "cadena ligera", "región variable", "región de cadena principal", "domino constante" y similar, tienen su significado ordinario en la técnica inmunológica y se refieren a dominios en inmunoglobulina de existencia natural, y dominios correspondientes de proteínas de unión sintéticas (por ejemplo, recombinante) (por ejemplo, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena individual, anticuerpos quiméricos, etc.). La unidad estructural básica de las inmunoglobulinas de existencia natural (por ejemplo, IgG) es un tetrámero que tiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, usualmente expresadas como una glicoproteína de aproximadamente 150,000 Da. La porción amino-terminal ( "N" ) de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal ("C") de cada cadena define una región constante, con cadenas ligeras que tienen un solo dominio constante y cadenas pesadas que usualmente tienen tres dominios constantes y una región de bisagra. De esta forma, la estructura de las cadenas ligeras de una molécula IgG es VL-CL-c y de estructura de cadenas pesadas IgG es n-VHi-H-CH2-CH3-c (en donde H es la región de bisagra) . Las regiones variables de una molécula IgG consisten de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) , que contienen los residuos en contacto con el antígeno y los segmentos no CDR, referidos como segmentos de cadena principal, en donde en general se mantiene la estructura y se determina en la colocación de los bucles CDR (aunque ciertos residuos de la cadena principal pueden también estar en contacto con el antígeno) . De esta forma, los dominios de VL y VH tienen la estructura n-FRl , CDR1, FR2, CDR2, FR3 , CDR3 , FR4-C.

Cuando se hace referencia a proteínas o anticuerpos de unión (como se define ampliamente en la presente) , la asignación de aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat, las Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md. , 1987 y 1991). Los aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera maduras de inmunoglobulinas se designan a través de la posición de un aminoácido en la cadena. Las numerosas secuencias de aminoácido descritas por Kabat para anticuerpos, identifican una secuencia de consenso de aminoácido para cada subgrupo, y se asignan a un número de residuo para cada aminoácido. El esquema de numeración de Kabat se extiende a anticuerpos no influidos en su compendio a través de la alineación del anticuerpo en cuestión con una de las secuencias de consenso en Kabat a través de la referencia a aminoácidos conservados.

Este método para asignar números de residuos se ha convertido en estándar en el campo y fácilmente identifica aminoácidos en posiciones equivalentes en diferentes anticuerpos, que incluyen variantes quiméricas humanizadas. Por ejemplo, un aminoácido en la posición 50 de una cadena ligera de anticuerpo humano ocupa la posición equivalente para un aminoácido en la posición 50 de la cadena ligera de anticuerpo de ratón.

Como se utiliza en la presente, el término "cadena pesada" se utiliza para definir la cadena pesada de un anticuerpo IgG. En un IgG nativo, intacto, la cadena pesada comprende los dominios de inmunoglobulina VH, CH1, de bisagra, CH2 y CH3. En toda la presente especificación, la numeración de los residuos en una cadena pesada IgG es la del índice EU como en Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991), expresamente incorporada aquí por referencia. El "índice EU como en Kabat" se refiere a la numeración del anticuerpo EU IgGl humano. Los ejemplos de secuencias de aminoácidos que contienen los dominios de bisagra IgGl, CH2 y CH3 se muestran en las Figuras 1A y IB como se describe, Infra. Las Figuras 1A y IB también establecen secuencias de aminoácido de los dominios de bisagra, CH2 y CH3 de las cadenas pesadas de IgG2, IgG3 e IgG4. Las secuencias de aminoácido de los isotipos IgG2 , IgG3 e IgG4 se alinean con la secuencia IgGl colocando el primero y el último y el último residuo de cisteína en las regiones de bisagra respectivas, que forman los enlaces S-S de inter-cadena pesada, en las mismas posiciones. Para la región de bisagra IgG2 e IgG3 , no todos los residuos se enumeran por el índice EU.

La "región de bisagra" o el "dominio de bisagra" generalmente se definen como el alargamiento de Glu216 a Pro230 del IgGl humano. Un ejemplo de la secuencia de aminoácido de la región de bisagra IgGl humano se muestra en la Figura 1A (los residuos de aminoácido en la Figura 1A se enumeran de acuerdo con el sistema de Kabat) . Las regiones de bisagra de otros isotipos IgG pueden alinearse con la secuencia IgGl colocando el primero y el último residuo de cisteína que forman los enlaces S-S inter-cadena pesada en la mismas posiciones como se muestra en la Figura 1A.

Como se utiliza en la presente, el término "región Fe", "dominio Fe" o términos análogos se utilizan para definir la región C-terminal de la cadena pesada IgG. Un ejemplo de la secuencia de aminoácido que contiene el IgGl humano se muestra en la Figura IB. Aunque los límites pueden variar ligeramente, un número de acuerdo con el sistema de Kabat, el dominio Fe se extiende del aminoácido 231 al aminoácido 246 (los residuos de aminoácido en la Figura IB se enumeran de acuerdo con el sistema de Kabat) . La Figura IB también proporciona ejemplos de las secuencias de aminoácido de las regiones Fe de los isotipos IgGl , IgG2 , IgG3, e IgG4.

La región Fe de un IgG comprende dos dominios constantes, CH2 y CH3. El dominio CH2 de una región Fe IgG humana usualmente se extiende de los aminoácidos 231 al aminoácido 341 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (Figura IB) . El dominio CH3 de una región Fe IgG humana usualmente se extiende de los aminoácidos 342 a 447 de acuerdo con el sistema de enumeración de Kabat. El dominio CH2 de la región Fe IgG humana (también referida como dominio "Cy2") es único en que no se empareja cercanamente a otro dominio. Más bien, dos cadenas de carbohidrato ramificadas N-enlazadas se interponen entre dos dominios CH2 de un IgG nativo intacto.

Como se utiliza en la presente los términos "proteína de unión FCYR" , "anticuerpo FCYR" , y "anticuerpo anti-FcyR", se utilizan de manera intercambiable y se refieren a una variedad de proteínas de tipo inmunoglobulina o derivadas de inmunoglobulina. "Proteínas de unión FcyR" unen FcyR a través de una interacción con los dominios VL y/o VH (según diferente de la unión mediada por Fcy) . Los ejemplos de proteínas de unión FcyR incluyen anticuerpos completamente humanos, policlonales , quiméricos y humanizados (por ejemplo, comprenden dos cadenas pesadas y dos ligeras) . Sus fragmentos (por ejemplo, Fab, Fab ' , F(ab')2# Y fragmentos Fv) , anticuerpos bifuncionales o multifuncionales (ver, por ejemplo, Lanzavecchia et al. (1987) "The Use Of Hybrid Hybridomas To Target Human Cytotoxic T Lymphocytes" , Eur. J. Immunol . 17:105-111), anticuerpos de cadena individual (ver, por ejemplo, Bird et al. (1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteins" , Science 242:423-26), proteínas de fusión (por ejemplo, proteínas de fusión de despliegue de fago), "minicuerpo" (ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,837,821) y otras proteínas de unión a antígeno que comprenden un dominio VL y/o VH o uno de sus fragmentos. En un aspecto, la proteína de unión FCYRIIIA es un "anticuerpo tetramérico" es decir, que tiene generalmente la estructura de un IgG de existencia natural y comprende los dominios variable y constante, es decir, dos cadenas ligeras, que comprenden el dominio VL y un dominio constante de cadena ligera y dos cadenas pesadas que comprenden un dominio VH y un dominio de bisagra y constante de cadena pesada.

Como se utiliza en la presente el término "antagonistas FcyR" y términos análogos se refieren a sustancias proteicas y no proteicas, que incluyen moléculas pequeñas que antagonizan por lo menos una actividad biológica de un FcyR, por ejemplo, señalización de bloqueo. Por ejemplo, la molécula de la invención bloquea la señalización bloqueando la unión de IgGs a un FcyR.

Como se utiliza en la presente, el término "derivado" en el contexto de polipéptidos o proteínas se refiere a un polipéptido o proteína que comprende una secuencia de aminoácido que ha sido alterada a través de la introducción de sustituciones, eliminaciones o adiciones de residuos de aminoácido. El término "derivado" como se utiliza en la presente también se refiere a un polipéptido o una proteína que ha sido modificada, es decir, a través de la unión covalente de cualquier tipo de molécula al polipéptido o proteína. Por ejemplo, pero no en forma de limitación, un anticuerpo puede modificarse, por ejemplo, a través de glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización a través de grupos protectores/bloqueo conocidos, división proteolítica, enlace celular a un antígeno u otra proteína, etc. Un polipéptido o proteína derivado puede producirse a través de modificación química utilizando técnicas conocidas por el experto en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a división química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina , etc. Además, un polipéptido o proteína derivado posee una función similar o idéntica a la del polipéptido o proteína de la cual se derivó.

Como se utiliza en la presente, el término "derivado" en el contexto de un derivado no proteico se refiere a una segunda molécula orgánica o inorgánica que se forma con base en la estructura de una primera molécula orgánica o inorgánica. Un derivado de una molécula orgánica incluye, pero no se limita a, una molécula modificada, por ejemplo, a través de la adición o eliminación de un grupo hidroxilo, metilo, etilo, carboxilo o amina. Una molécula orgánica también puede esterificarse , alquilarse y/o fosforilarse .

Como se utiliza en la presente, el término "molécula de diacuerpo" se refiere a un complejo de dos o más cadenas o proteínas de polipéptido, cada una comprendiendo por lo menos un dominio VL y uno VH o uno de sus fragmentos, en donde ambos dominios están comprendidos dentro de una sola cadena de polipéptido. En ciertas modalidades "molécula de diacuerpo" incluye moléculas que comprenden un dominio Fe o un dominio de bisagra-Fc. Tales cadenas polipeptídicas en el complejo pueden iguales o diferentes, es decir, la molécula de diacuerpo puede ser un homo-muítímero o un hetero-multímero. En aspectos específicos, "molécula de diacuerpo" incluye dímeros o tetrámeros o cadenas de polipéptido que contienen tanto el dominio VL o VH. Las cadenas de polipéptido individuales comprenden las proteínas multiméricas que pueden estar covalentemente unidas a por lo menos otro péptido del multímero a través de enlace de disulfuro intercadena.

Como se utiliza en la presente, los términos "trastorno" y "enfermedad" se utilizan de manera intercambiable para referirse a una afección en un sujeto. En particular, el término "enfermedad autoinmunitaria" se utiliza de manera intercambiable con el término "trastorno autoinmunitario" para referirse a una afección en un sujeto caracterizada por daño cerebral, tisular y/o de órgano causada por una reacción inmunológica del sujeto a sus propias células, cultivos y/u órganos. El término "enfermedad inflamatoria" se utiliza de manera intercambiable con el término "trastorno inflamatorio" para referirse a una afección en un sujeto caracterizada por inflamación, preferiblemente inflamación crónica. Un trastorno inmunitario puede o no puede estar asociado con inflamación. Además, la inflamación puede o no puede ser causada por un trastorno autoinmunitario. De esta forma, ciertos trastornos pueden caracterizarse tanto como trastornos autoinmunitarios como inflamatorios .

"Cadenas de polipéptido idénticas" como se utiliza en la presente también se refiere a cadenas de polipéptido que tienen secuencias de aminoácidos casi idénticas, por ejemplo, que incluyen cadenas que tienen una o más diferencias de aminoácido, preferiblemente sustituciones de aminoácido conservadoras, tal como la actividad de dos cadenas de polipéptido no es significativamente diferente.

Como se utiliza en la presente, el término "cáncer" se refiere a un neoplasma o tumor que resulta del crecimiento no controlado anormal de las células. Como se utiliza en la presente, el cáncer explícitamente incluye, leucemias y linfornas. En algunas modalidades, el cáncer se refiere a un tumor maligno, que ha permanecido localizado. En otras modalidades, el cáncer se refiere a un tumor maligno, que ha invadido y destruido las estructuras corporales contiguas y que se ha escondido en un sitio distante. En algunas modalidades, el cáncer está asociado con un antígeno cancerígeno específico.

Como se utiliza en la presente, el término "agente inmuno-regulador" y sus variaciones puede ser un agente que modula un sistema inmunitario hospedero. En ciertas modalidades, un agente inmunomodulador es un agente inmunosupresor . En ciertas otras modalidades, un agente inmuno-regulador es un agente inmunoestimulador . Los agentes inmunomoduladores incluyen, pero no se limitan a, moléculas pequeñas, péptidos, polipéptidos , proteínas de fusión, anticuerpos, moléculas inorgánicas, agentes miméticos y moléculas orgánicas .

Como se utiliza en la presente, el término "epítopo" se refiere a un fragmento de un polipéptido o proteína o una molécula no proteica que tiene actividad antigénica o inmunogénica en un animal, preferiblemente en un mamífero, y más preferiblemente en un humano. Un epítopo que tiene actividad inmunogénica es un fragmento de polipéptido o proteína que es una respuesta de anticuerpo en un animal. Un epítopo que tiene actividad antigénica dentro de un polipéptido o proteína al cual un anticuerpo se une inmunoespecíficamente según se determina por cualquier método bien conocido por el experto en la técnica, por ejemplo, a través de inmunoensayo . Los epítopos antigénicos no necesariamente deben ser inmunogénicos .

Como se utiliza en la presente, el término "fragmento" se refiere a un péptido o polipéptido que comprenden una secuencia de aminoácido de al menos 5 residuos de aminoácido contiguos, al menos 10 residuos de aminoácido contiguos, al menos 15 residuos de aminoácido contiguos, al menos 20 residuos de aminoácido contiguos, al menos 25 residuos de aminoácido contiguos, al menos 40 residuos de aminoácido contiguos, al menos 50 residuos de aminoácido contiguos, al menos 60 residuos de aminoácido contiguos, al menos 70 residuos de aminoácido contiguos, al menos 80 residuos de aminoácido contiguos, al menos 90 residuos de aminoácido contiguos, al menos 100 residuos de aminoácido contiguos, al menos 125 residuos de aminoácido contiguos, al menos 150 residuos de aminoácido contiguos contiguos, al menos 175 residuos de aminoácido contiguos, al menos 200 residuos de aminoácido contiguos, o al menos 250 residuos de aminoácido contiguos de la secuencia de aminoácido de otro polipéptido. En una modalidad específica, un fragmento de un polipéptido retiene por lo menos una función del polipéptido.

Como se utiliza en la presente, el término "ácidos nucleicos" y "secuencias de nucleótido" incluyen moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) , moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) , combinaciones de moléculas de ADN y ARN o moléculas de ADN/ARN híbridas, y análogos de moléculas de ADN o ARN. Tales análogos pueden generarse utilizando, por ejemplo, análogos de nucleótido, que incluyen, pero no se limitan a, inosina o bases tritiladas. Tales análogos también pueden comprender moléculas de ADR o ARN que comprenden cadenas principales modificadas que prestan los atributos benéficos a las moléculas tales como, por ejemplo, resistencia a nucleasa o una habilidad aumentada para las membranas celulares cruzadas. Las secuencias de ácido nucleico o nucleótidos pueden ser monocatenarias , bicatenarias , y pueden contener tanto porciones monocatenarias como bicatenarias, y pueden contener porciones tricatenarias , pero preferiblemente es ADN bicatenario.

Como se utiliza en la presente, una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de un agente terapéutico suficiente para tratar o manejar una enfermedad o trastorno. Una cantidad terapéuticamente efectiva puede referirse a la cantidad del agente terapéutico suficiente para retrasar o minimizar el inicio de la enfermedad, por ejemplo, retrasar o minimizar la extensión del cáncer. Una cantidad terapéuticamente efectiva también puede referirse a la cantidad del agente terapéutico que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o la administración de una enfermedad. Además, una cantidad terapéuticamente efectiva con respecto a un agente terapéutico de la invención significa la cantidad de agente terapéutico solo, o en combinación con otras terapias, que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o administración de una enfermedad.

Como se utiliza en la presente, los términos "agente profiláctico" y "agentes profilácticos" se refieren a cualquier agente (s) que puede utilizarse en la prevención y el trastorno, o la prevención de la recurrencia o extensión de un trastorno. Una cantidad profilácticamente efectiva puede referirse a la cantidad de agente profiláctico suficiente para evitar la recurrencia o la extensión de la enfermedad hiperproliferativa, particularmente cáncer, o la aparición de tal cáncer en un paciente, incluyendo pero no limitándose a los predispuestos a la enfermedad hiperproliferativa, por ejemplo, los genéticamente predispuestos al cáncer o previamente expuestos al carcinógeno. Una cantidad profilácticamente efectiva también puede referirse a la cantidad del agente profiláctico que proporciona un beneficio profiláctico en la prevención de la enfermedad. Además, una cantidad profilácticamente efectiva con respecto a un agente profiláctico de la invención significa la cantidad de agente profiláctico solo, o en combinación con otros agentes, que proporciona un beneficio profiláctico en la prevención de la enfermedad.

Como se utiliza en la presente, los términos "prevenir", "previsión" y "prevención" se refiere a la prevención de la recurrencia o el inicio de uno o más de los síntomas de un trastorno en un sujeto como resultado de la administración de un agente profiláctico o terapéutico.

Como se utiliza en la presente, el término "en combinación" se refiere al uso de más de un agente profiláctico y/o terapéutico. El uso del término "en combinación" no restringe el orden en el cual los agentes profilácticos y/o terapéuticos se administran a un sujeto con un trastorno. Un primer agente profiláctico o terapéutico puede administrarse antes de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas antes), concomítantemente con, o posteriormente (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas después) a la administración de un segundo agente profiláctico o terapéutico a un sujeto con un trastorno .

"Función efectora" como se utiliza en la presente significa un evento bioquímico que resulta de la interacción de una región Fe del anticuerpo con un receptor Fe o un antígeno. Las funciones efectoras incluyen, pero no se limitan a la citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) , fagocitosis mediada por la célula dependiente del anticuerpo (ADCP, por sus siglas en inglés) , y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC, por sus siglas en inglés) . Las funciones efectoras incluyen ambas, las que operan después de la unión de un antígeno y las que operan independientemente de la unión del antígeno.

"Célula efectora" como se utiliza en la presente significa una célula del sistema inmunitario que expresa uno o más receptores Fe y media una o más funciones efectoras. Las células efectoras incluyen pero no se limitan a monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastocitos, plaquetas, células B, linfocitos granulares grandes, células de Langerhans, células aniquiladoras naturales (NK) , y pueden ser de cualquier organismo incluyendo pero no limitándose a humanos, ratones, ratas, conejos y monos.

Como se utiliza en la presente, el término "se une específicamente a un complejo inmunitario" y términos análogos se refieren a moléculas que específicamente se unen a un complejo inmunitario y no se unen específicamente a otra molécula. Una molécula que específicamente se une a un complejo inmunitario puede unirse a otros péptidos o polipéptidos con menor afinidad como se determina a través de por ejemplo, inmunoensayos , BIAcore, u otros ensayos conocidos en la técnica. Preferiblemente, las moléculas que específicamente se unen a un complejo inmunitario no reaccionan de manera recíproca en otras proteínas. Las moléculas que específicamente se unen a un complejo inmunitario pueden identificarse, por ejemplo, a través de inmunoensayos, BIAcore, u otras técnicas conocidas por el experto en la técnica.

Una "proteína de fusión estable" como se utiliza en la presente se refiere a una proteína de fusión que experimenta un nivel mínimo no detectable de degradación durante la producción y/o almacenamiento según se evalúa utilizando ensayos bioquímicos y funcionales comunes conocidos por el experto en la técnica y puede almacenarse durante un periodo de tiempo extendido sin pérdida de la actividad biológica, por ejemplo, la unión a FcyR.

Breve Descripción de las Figuras Figuras 1A-1B. Secuencia de aminoácido de las regiones IgG CH1 de bisagra y Fe humanas.

Se proporcionan las secuencias de aminoácido de los dominios IgGl, IgG2 , IgG3 y bisagra IgG4 (Fig. 1A) y Fe (Fig. IB) . (Dominio de bisagra IgGl (SEC ID NO: 1) ; dominio de bisagra IgG2 (SEC ID NO : 2); dominio de bisagra IgG3 (SEC ID NO: 3); dominio de bisagra IgG4 (SEC ID NO: 4); dominio Fe IgGl (SEC ID NO : 5); dominio Fe IgG2 (SEC ID NO: 6) ; dominio Fe IgG3 (SEC ID NO: 7) ; dominio Fe IgGl (SEC ID NO: 8)) . Los residuos de aminoácido mostrados en las Figuras 1A y IB se enumeran de acuerdo con el sistema de enumeración de Kabat EU. Las secuencias isotipo se alinean con la secuencia IgGl colocando el primero y el último residuos de cisteína de las regiones de bisagra respectivas, que forman los enlaces S-S intercadena pesada, en las mismas posiciones. Para la Figura IB, los residuos en el dominio CH2 se indican por +, mientras los residuos en el dominio CH3 se indican por ~.

Figura 2. Representación esquemática de cadenas de polipéptido de diacuerpos bifuncionales covalentes.

Los polipéptidos de un diacuerpo bifuncional, covalente consisten de un dominio VL de anticuerpo y un dominio VH de anticuerpos separados a través de un corto enlazador de péptido. El enlazador de 8 residuos de aminoácido previene del auto-ensamble de una sola cadena de polipéptido en los constructos scFv, y, más bien predomina la integración entre los dominios VL y VH de diferentes cadenas de polipéptido. Se crearon 4 constructos (cada constructo se describe del amino- terminal ("n"), lado izquierdo del constructo, al carboxi -terminal ("c") , lado derecho de la figura) : constructo (1) (SEC ID NO: 9) comprendiendo, n-el dominio Hu2B6 VL-enlazador (GGGSGGGG (SEC ID NO: 10)) - el dominio VH Hu3G8 - y una secuencia C-terminal (LGGC)-c; constructo (2) (SEC ID NO: 11) comprendiendo n-el dominio VL Hu3G8 - enlazador (GGGSGGGG (SEC ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - y una secuencia C-terminal (LGGC)-c; constructo (3) (SEC ID NO: 12) comprendiendo n-el dominio VL Hu3G8 -enlazador (GGGSGGGG (SEC ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu3G8 - y una secuencia C-terminal (LGGC) -c; constructo (4) (SEC ID NO: 13) comprendiendo n-el dominio VL de Hu2B6 - enlazador (GGGSGGGG (SEC ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - y una secuencia C-terminal (LGGC)-c.

Figura 3. Análisis SDS-PAGE de diacuerpos purificados por afinidad.

Los diacuerpos purificados por afinidad se sometieron a análisis SDS-PAGE bajo condiciones de reducción (carriles 1-3) o no de reducción (carriles 4-6) . Se indican los pesos moleculares aproximados del estándar (entre los carriles 3 y 4) . Carriles 1 y 4, h3G8 CMD; Carriles 2 y 5, h2B6 CMD; y Carriles 3 y 6, h2B6-h3G8 CBD.

Figuras 4A-4B. Análisis SEC de diacuerpos purificados por afinidad.

Los diacuerpos purificados por afinidad se sometieron a análisis SEC. (Figura 4A) Perfil de elución estándar conocido: IgG de longitud completa (-150 kDa), fragmento Fab de IgG (-50 kDa) , y scFv (-30 kDa) ; (Figura 4B) Perfil de elución de h2b6 CMD, h3G8 CMD, y h2B6-h3G8 CBD.

Figura 5. Unión de h2B6-h3G8 CBD a SCD32B y SCD16A.

La unión de h2B6-h3G8 CBD a SCD32B y sCD16A se ensayo en un emparedado ELISA. sCD32B se utilizó como la proteína objetivo. La sonda secundaria fue SCD16A conjugada a HRP. h3G8 CMD, que se une a CD16A, se utilizó como control.

Figuras 6A-6C. Análisis BIACORE de la unión del diacuerpo a sCD16A, SCD32B y SCD32B.

La unión de h2B6-h3G8 CBD, h2B6 CMD y h3G8 CMD a sCD16A, sCD32B, y sCD32A (control negativo) se ensayó a través de análisis SPRs. h3G8 scFv también se probó como un control. (Figura 6A) unión a sCD16 (Figura 6B) unión a SCD32B y (Figura 6C) unión a SCD32A. Los diacuerpos se inyectaron a una concentración de 100 NM, y scFv a una concentración de 200 nM, sobre superficies receptoras a un caudal de 50 ml/min durante 60 segundos.

Figuras 7A-7E. Análisis BIACORE de la unión del diacuerpo a SCD16A y SCD32B.

La unión de h2B6-h3G8 CBD, h2B6 CMD y h3G8 CMD a sCD16A, y SCD32B se ensayó a través de análisis SPR. h3G8 scFv también se ensayó como un control. (Figura 7A) Unión de h3G8 CMD SCD16A (Figura 7B) Unión de h2B6-h3G8 CBD a SCD16A; (Figura 7C) Unión de h3G8 scFv a SCD16A; (Figura 7D) Unión de h2B6 CMD a sCD32B; y (Figura 7E) Unión de h2B6-h3G8 CBD a sCD32B. Los diacuerpos se inyectaron a concentraciones de 6.25-200 nM sobre superficies receptoras a un caudal de 70 ml/min durante 180 segundos.

Figura 8. Descripción esquemática de la interacción de cadenas de polipéptido que comprenden los dominios VL y VH para formar una molécula de diacuerpo biespecífica covalente.

NH2 y COOH representan el amino-terminal y el carboxi-terminal , respectivamente de cada cadena de polipéptido. S representa el residuo de cisteína C-terminal en cada cadena de polipéptido. VL y VH indican el dominio ligero variable y el dominio pesado variable, respectivamente. Las líneas punteadas y quebradas son para distinguir entre dos cadenas de polipéptido y, en particular, representan las porciones enlazadoras de tales cadenas. h2B6 Fv y h3G8 Fv indican un sitio de unión de epítopo específico para CD32B y CD16, respectivamente.

Figura 9. Representación esquemática de cadenas de polipéptido que contienen dominios Fe de diacuerpos biespecífieos covalente.

Representación de constructos de polipéptido de las moléculas de diacuerpo de la invención (cada constructo se describe a partir del amino- terminal ("n") , lado izquierdo del constructo, al carboxi- terminal ("c"), lado derecho de la figura) . Constructo (5) (SEC ID NO: 14) comprendiendo, n-dominio VL Hu2B6 - un primer enlazador (GGGSGGGG (SEC ID NO: 10) ) - el dominio VH de Hu3G8 - un segundo enlazador (LGGC) -y un dominio Fe C-terminal de IgGl-c humano; constructo (6) (SEC ID NO: 15) comprendiendo n-el dominio VL Hu3G8 enlazador (GGGSGGGG (SEC ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - y el segundo enlazador (LGGC) - y un dominio Fe C-terminal de IgGl-c humano; constructo (7) (SEC ID NO: 16) comprendiendo n-el dominio VL Hu2B6 - un primer enlazador (GGGSGGGG (SEC ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu3G8 - y una secuencia C-terminal (LGGCFNRGEC) (SEC ID NO: 17) -c; constructo (8) (SEC ID NO: 18) comprendiendo n-el dominio VL Hu3G8 - enlazador (GGGSGGGG (SEC ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - y el segundo enlazador (LGGC) - y un dominio de bisagra/Fc C-terminal de IgGl humano (con sustitución de aminoácido A215V)-c.

Figura 10. Unión de las moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fe a SCD32B y sCD16A.

La unión de las moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fe para SCD32B y sCD16A se ensayó en un emparedado ELISA. Los diacuerpos ensayados se produjeron a través de 3 sistemas de expresión recombinante : co-transfeccion de pMGX669 y pMGX674, expresando los constructos 1 y 6, respectivamente; co-transfección de pMGX667 y pMGX676, expresión de los constructos 2 y 5, respectivamente; y co-transfección de pMGX674 y p GX676, expresando los constructos 5 y 6, respectivamente. SCD32B se utilizó como la proteína objetivo. La sonda secundaria fue sCD16A conjugada con HRP .

Figura 11. Descripción esquemática de la interacción de dos cadenas de polipéptido cada una comprendiendo un dominio Fe para formar un diacuerpo covalente-bivalente .

NH2 y COOH representan el amino-terminal y el carboxi-terminal respectivamente para cada cadena de polipéptido. S representa al menos un enlace disulfuro entre un residuo de cisteína en la segunda secuencia enlazadora de cada cadena de polipéptido. VL y VH indican el dominio ligero variable y el dominio pesado variable, respectivamente. Las líneas punteadas y quebradas son para distinguir entre dos cadenas de polipéptido y, en particular, representan las primeras porciones del enlazador de tales cadenas. CH2 y CH3 representan los dominios constantes CH2 y CH3 de un dominio Fe. h2B6 Fv y h3G8 Fv indican un sitio de unión específico para CD32B y CD16, respectivamente.

Figura 12. Unión de las moléculas del diacuerpo que comprenden dominios de bisagra/Fc sCD32B y sCD16A.

La unión de las moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fe para SCD32B y sCD16A se ensayaron en un emparedado ELISA. Los diacuerpos ensayados se produjeron a través de 4 sistemas de expresión recombinante : co-transfección de pMGX669 + pMGX674, expresión de los constructos 1 y 6, respectivamente; co-transfección de pMGX669 + pMGX678, expresión de los constructos 2 y 8, respectivamente; co-transfección de pMGX677 + pMGX674, expresión de los constructos 7 y 6, respectivamente; y co-transfección de pMGX677 + pMGX678f expresión de los constructos 7 y 8, respectivamente. sCD32B se utilizó como la proteína objetivo. La sonda secundaria fue SCD16A conjugada con HRP.

Figura 13. Descripción esquemática de la interacción de las cadenas de polipéptido para formar una molécula de diacuerpo tetramérica.

NH2 y COOH representan el amino-terminal y el carboxi-terminal , respectivamente de cada cadena de polipéptido. S representa al menos un enlace de disulfuro entre un residuo de cisteína en la segunda secuencia enlazadora de Fe que lleva una cadena de polipéptido "más pesada" y un residuo de cisteína en la secuencia C-terminal de la cadena de polipéptido "más ligera" que no lleva Fe. VL y VH indican el dominio ligero variable y el dominio pesado variable, respectivamente. Las líneas punteadas y quebradas son para distinguir entre las cadenas de polipéptido y, en particular, representan las primeras porciones enlazadoras de las cadenas más pesadas o el enlazador de las cadenas más ligeras. CH2 y CH3 representan los dominios constantes CH2 y CH3 de un dominio Fe. h2B6 Fv y h3G8 Fv indican un sitio de unión de epítopo específico para CD32B y CD16, respectivamente .

Figura 14. Representación esquemática de cadenas de polipéptido que contienen dominios Fe que forman diacuerpos biespecífieos covalentes.

La representación de los constructos de polipéptido que forman las moléculas de diacuerpo de la invención (cada constructo se describe desde el amino-terminal ( "n" ) , lado izquierdo del constructo, al carboxi -terminal ("c"), lado derecho de la figura) . Constructo (9) (SEC ID NO: 19) comprendiendo n-un dominio de bisagra/Fc del IgGl humano - el dominio VL Hu3G8 - enlazador (GGGSGGGG (SEC ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - enlazador (GGGSGGGG (SEC ID NO: 10)) -y una secuencia-c LGGC C-terminal; constructo (10) (SEC ID NO: 20) comprendiendo n-un dominio Fe del IgGl humano - el dominio VL Hu3G8 - enlazador (GGGSGGGG (SEC ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - enlazador (GGGSGGGG (SEC ID NO: 10)) -y una secuencia-c LGGC C-terminal; constructo (11) (SEC ID NO: 21) comprendiendo n-el dominio VL Hu2B6 (G105C) enlazador (GGGSGGGG (SEC ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu3G8 - y un dominio de bisagra/Fc C-terminal del IgGl humano con la sustitución de aminoácido A215V- C ; constructo (12) (SEC ID NO: 22) comprendiendo n-el dominio VL Hu3G8 - enlazador (GGGSGGGG (SEC ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 (G44C) -y una secuencia-c FNRGEC C-terminal (SEC ID NO: 23) .

Figuras 15A-15B. Análisis SDS-PAGE y Western Blot de afinidad de diacuerpos tetraméricos .

Los diacuerpos producidos a través del sistema de expresión recombinante se co-transfectaron con vectores que expresan los constructos 10 y 1, los constructos 9 y 1, y los constructos 11 y 12 que se sometieron a análisis SDS-PAGE bajo condiciones no de reducción (Figura 15A) y análisis Western Blot utilizando H+L IgGl anti-humano de cabra como la sonda (Figura 15B) . Proteínas en gel de SDS-PAGE que visualizaron con Safestaina Azul Simple (Invitrogen) . Para ambos paneles de Figura 15A y Figura 15B, las moléculas de diacuerpo comprendieron los constructos 10 y 1, los constructos 9 y 11, y los constructos 11 y 12A que están en los carriles 1, 2 y 3, respectivamente.

Figura 16. Unión de moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fe y enlaces de disulfuro inter-cadena modificada para SCD32B y SCD16A.

La unión de las moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fe y enlaces de disulfuro modificados entre las cadenas de polipéptido "más ligero" y "más pesado" para sCD32B y sCD16A se ensayaron en un emparedado ELISA. Los diacuerpos ensayados se produjeron a través de tres sistemas de expresión recombinante : expresión de los constructos 1 y 10, expresión de los constructos 1 y 9, y expresión de los constructos 11 y 12, respectivamente. sCD32B se utilizó como la proteína objetivo. La sonda secundaria fue SCD16A conjugado con HRP. La unión de h3G8 se utilizó como control.

Figura 17. Representación esquemática del precursor de la poliproteína de la molécula de diacuerpo y representación esquemática de las cadenas de polipéptido que contienen los dominios de la cadena ligera Lambda y/o de bisagra .

La representación de los constructos de polipéptido que comprenden las moléculas de diacuerpo de la invención (cada constructo se describe desde el amino-terminal ( "n" ) , lado izquierdo del constructo, al carboxi -terminal ("c"), lado derecho de la figura) . Constructo (13) (SEC ID NO: 95) comprendiendo, n-dominio VL 3G8 - un primer enlazador (GGGSGGGG (SEC ID NO: 10)) - el dominio VH de 2.4G2VH - un segundo enlazador (LGGC) - sitio de reconocimiento de furina (RAKR (SEC ID NO: 93))- dominio VL de 2.4G2 - un tercero enlazador (GGGSGGG (SEC ID NO: 10)- dominio VH de 3G8 - y un dominio LGGC C-terminal; (secuencia de nucleótido que codifica SEC ID NO: 95 es provista en SEC ID NO: 96) . Constructo (14) (SEC ID NO: 97) comprendiendo n-dominio VL 3G8 - un primer enlazador (GGGSGGGG (SEC ID NO: 10)) - el dominio VH de 2.4G2VH - un segundo enlazador (LGGC) - sitio de reconocimiento de furina (RAKR (SEC ID NO: 93))-FMD (Proteasa C3 del Virus de la Enfermedad de Pie y Boca) sitio-dominio VL de 2.4G2- un tercero enlazador (GGGSGGG (SEC ID NO: 10)-dominio VH de 3G8- y un dominio LGGC C-terminal; (secuencia de nucleótido que codifica SEC ID NO: 97 es provista en SEC ID NO: 98) . Constructo (15) (SEC ID NO: 99) comprendiendo n-dominio VL Hu2B6 - un enlazador (GGGSGGGG (SEC ID NO: 10)) -el dominio VH de Hu3G8- y un dominio FNRGEC C-terminal (SEC ID NO: 23) ; (secuencia de nucleótido que codifica SEC ID NO: 99 es provista en SEC ID NO: 100) . Constructo (16) (SEC ID NO: 101) comprendiendo n-dominio VL Hu3G8 - un enlazador (GGGSGGGG (SEC ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6- y un dominio VEPKSC C-terminal (SEC ID NO: 77) ; (secuencia de nucleótido que codifica SEC ID NO: 101 es provista en SEC ID NO: 102) .

Figura 18. Unión de las moléculas de diacuerpo derivadas de una molécula precursora de poliproteína para mCD32B y SCD16A.

La unión de las moléculas de diacuerpo derivadas del constructo 13 de la molécula precursora de poliproteína (SEC ID NO: 95) a murino CD32B (mCD32B) y CD16A soluble (sCD16A) se ensayaron en un emparedado ELISA. mCD32B se utilizó como la proteína objetivo. La sonda secundaria fue sCD16A conjugado con biotina.

La Figura 19. Unión de las moléculas de diacuerpo que comprenden los dominios de cadena Lambda y/o de bisagra para SCD32B y SCD16A.

La unión de las moléculas de diacuerpo que comprenden los dominios derivados del C-terminal del dominio de la cadena ligera lambda humana y/o de bisagra de IgG para sCD32B y sCD16A se ensayaron y compararon con el diacuerpo que comprende los constructos 1 y 2 (Figura 5) en un emparedado ELISA. Los diacuerpos ensayos se produjeron a través de sistemas de expresión recombinante que expresan los constructos 15 y 16 (SEC ID NO: 99 y SEC ID NO: 101, respectivamente) . sCD32B se utilizó como la proteína objetivo. La sonda secundaria fue SCD16A conjugada con HRP. Las barras con pequeños cuadros representan la combinación del constructo 15/16 mientras las barras con cuadros más grandes representan la combinación del constructo 1/2.

Figura 20. Representación esquemática de la unión de DART de 2B6/4420 a CD32B localizado en la superficie de una célula de una molécula y una molécula conjugada con fluoresceína .

El diagrama muestra la flexibilidad del "adaptador universal" del brazo de fluoresceína del DART así como la posibilidad de sustituir otras especificidades del brazo 2B6. Las regiones V se muestran como los cuadros enlazadores GGGSGGGG (SEC ID NO: 10) se muestran como líneas, y el enlace de disulfuro se muestra conectando las dos cadenas. Los constituyentes de una cadena se muestran en azul mientras el otro está en color rosa. N, amino-terminal ; C, carboxi-terminal, FL, fluoresceína, VL, región variable de cadena ligera; y VH, región variable de cadena pesada.

Figuras 21A y 21B. DART 2B6/4420 se une específicamente a moléculas conjugadas con fluoresceína y puede simultáneamente unirse a CD32B.

(Figura 21A) 2B6/4420 ó 2B6/3G8 se unieron a placas de ELISA recubiertas con la proteína FITC-S. La unión y la función del brazo 2B6 se detectó a través de la conexión de CD32B soluble, seguido por un anticuerpo específico para CD32B y un anticuerpo de detección secundario conjugado con HRP. (Figura 21B) 2B6/4420 ó 2B6/3G8 se unieron a placas de ELISA recubiertas con HuIgG o FITC-HuIgG (conjugado con fluoresceína) . La unión se detecto a través de la conexión con un suero policlonal específico para 2B6 Fv seguido por un anticuerpo secundario conjugado con HRP.

Figuras 22A y 22B. Activación de células B purificadas utilizando anticuerpos CD79B anti-humanos .

Las células B purificadas se activaron utilizando concentraciones en aumento de CB3.1-FITC (Figura 22A) o CB3.2-FITC (Figura 22B) conjugados con FITC anticuerpos CD79b anti-humanos y 50 pg/ml del fragmento F(ab')2 de Fe IgG GAM específico (eje x) . Las células B se activaron en la presencia de PBS (barras blancas) o 5 g/ml de cualquiera de OÍFITCOÍCD32BDART (barras negras) o aCD16aCD32BDART (barras grises) . Las reacciones se llevaron a cabo por triplicado y se calcularon las desviaciones estándar.

Figuras 23A y 23B Activación de células B purificadas .

Las células B purificadas de un Segundo donador saludable se activaron como se describe en la Figura 22B. El índice de proliferación se midió en células actividadas en la presencia de CB3.2-FITC conjugado con FITC del anticuerpo anti-CD79b (Figura 23A) y se comparó con el índice de proliferación de células actividadas en la presencia de anticuerpo CB3.2 sin marcar (Figura 23B) .

Figuras 24A-24B. Depleción de célula B de ratón in vivo en ratón transgénico HCD16A/B utilizando MGD261.

Los ratones mCD32-/- hCD16A+ C57B1/6, mCD32-/-hCD32B+ C57B1/6 y mCD32-/- hCD16A+ hCD32B+ C57B1/6 de la colina de reproducción de MacroGenics se inyectaron IV los días 0, 3, 7, 10, 14 y 17 con MGD261 (10, 3, 1 ó 0.3 mg/kg) , o un anticuerpo irrelevante (hE16 10 mg/kg) . La sangre se recolectó en los días -19 (pre-sangrado) , 4, 11, 18, 25 y 32 para análisis FACS . La salud y la actividad de los animales se registraron tres veces a la semana. Fig. 24A: h2B6-3G8 y WNV mAb; Fig. 24B: ratones h2B6-3G8 -hCD16A o -hCD32B y ratones V mAb -hCD16A o - hCD32B.

Figura 25. Depleción de la célula B de ratones in vivo en ratones transgénicos HCD16A/B utilizando 2.4G2-3G8 DB.

Los ratones mCD16-/-, mCD16-/- hCD16A+ C57B1/6, mCD16-/- hCD16B+ y mCD16-/- hCD16A+ hCD16B+ de la colonia de reproducción de MacroGenics se inyectó IP en los días 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16 y 18 con 2.4G2-3G8 DB (75 ug/ratones) , o PBS . La sangre se recolectó los días -10 (pre-sangrado) , 4, 11 y 18 para análisis FACS . La salud y la actividad de los animales se registraron 3 veces por semana.

Figura 26. Demostración de la actividad anti-tumoral de MGD261 utilizando un modelo intravenoso (IV) de la línea celular tumoral humana RAJI .

Se inyectaron 12 ratones mCD16-/-, hCD16A+, RAG1- / - C57B1/6 de 20 semanas de edad de la colonia de reproducción MacroGenics IV en día 0 con 5xl06 células Raj i . En los días 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27 y 30 los ratones también se trataron intraperitonealmente (IP) con 250, 25 ó 2.5ug MGD261 o con PBS (control negativo) . Los ratones después se observaron diariamente y el peso corporal se registró dos veces por semana. Los ratones que desarrollaron parálisis en las patas se sacrificaron.

Figura 27. Expresión DART en un hospedero no mamífero.

Las células BL21DE3 (Novagen) se transformaron con el plásmido pET25b(+) T7-lac+ 3G8/3G8 y se utilizó una colonia resistente a amp para sembrar el cultivo del caldo. Cuando el cultivo alcanzó 0.5 unidades DO600, se agregaron 0.5 mM de IPTG para inducir la expresión. El cultivo se cultivó a 30°C durante 2 horas y se recolectó en medio libre de células.

Figura 28. DART ELISA.

El ELISA de unión h3G8-h3G8 DART se condujo utilizando placas Maxisorp de 96 cavidades. Después de la reacción la placa se lavó con PBS-T tres veces y se desarrolló con 80 µ?/cavidad de sustrato TMB . Después de 5 minutos de incubación, la reacción se detuvo a través de 40 µ?/cavidad de 1% de H2S04. La DO450 nm se leyó utilizando un lector de placas de 96 cavidades y el software SOFTmax. La lectura se gráfico utilizando el software GraphPadPrism 3.03.

Figura 29. Muerte de la célula B humana inducida por DART.

El PBMC humano se incubó durante la noche con moléculas indicadas. La apoptosis se ensayó a través del análisis FACS como el porcentaje de PI+Anexina-V+ población de células B (células CD20+) en la población sin barrera FSC/SSC total .

Figura 30. Constructos DART 8B5-CB3.1. Se produjeron múltiples constructos DART 8B5-CB3.1 para ilustrar la presente invención. El constructo 5 y 6, ó 6 y 7, Ó 8 y 9, Ó 9 y l0, que codificaron plásmidos de expresión se co-transfectaron en células HEK-293 para expresar 8B5-CB3.1 con o sin etiqueta anti-bandera utilizando Lipofectamina 2000 ( Invitrogen) . El medio condicionado se cosecho para cada tres días durante tres veces. El medio acondicionado después se purificó utilizando una columna de afinidad CD32B.

Figura 31. DART 8B5-CB3.1 ELISA.

El ELISA de competencia 8B5-CB3.1 DART/ch8B5 se condujo utilizando placas Maxisorp de 96 cavidades. Después de la reacción, la placa se lavó con PBS-T tres veces y se desarrolló con 80 µ?/cavidad de sustrato T B . Después de 5 minutos de incubación, la reacción se detuvo a través de 40 µ?/cavidad de 1% de H2S04. La DO450 nm se eluyó utilizando un lector de placas de 96 cavidades y el software SOFTmax. La lectura se gráfico utilizando el software GraphPadPrism 3.03.

Figura 32. Ilustración esquemática de la estructura DART tetravalente.

Se ilustra la estructura general de una especie DART producida a través del ensamble de cuatro cadenas de polipéptido. Los cuatro dominios de unión a antígeno de DART de tipo Ig se muestran como elipses en tiras y gris oscuro.

Figura 33. DART tetravalente de tipo Ig.

Se proporciona un esquemático de los sitios de unión de epítopo de un DART tetravalente de tipo Ig.

(A) + (E) = Sitio de unión Epítopo 1 (D) + (B) = Sitio de unión Epítopo 2 (C) + (F) = C-kappa/lambda + 0?? (asociación similar a un lg radicional) bisagra - CH2 - CH3 - se asociará para formar un Fe Figura 34. ELISA de unión a mCD32 -hCD16A.

Se proporciona el resultado de ELISA que demuestra que las especies DART tetravalentes de tipo Ig de los Ejemplos 6-10 se unen al antígeno con una mayor afinidad que el anticuerpo de control (ch-mCD32 mAb) u otras especies DART.

Figuras 35A-35K. Ilustración esquemática de moléculas Ig DART.

Se proporciona un esquemático de moléculas Ig DART. La especificidad se indica a través de la reacción sombreada, de patrón o coloreada en blanco, las regiones constantes se muestran en negro y los enlaces de disulfuro se indican por líneas negras punteadas. El N-terminal de todas las cadenas proteicas se orienta hacia la parte superior de la figura, mientras el C-terminal de todas las cadenas proteicas se orienta hacia la parte inferior de la figura. Las figuras 35A-35E son biespecíf icas y las figuras 35F-35J son triespecíf icas . Las figuras 35A y 35E son tetravalentes. Las figuras 35B, 35C, 35F, 351, y 35J son hexavalentes . Las figuras 35D, 35G, y 35H son octavalentes . Referirse a las Figuras 1A, IB, 2, 9, 14 y 17 y a la Sección 3.1 para descripciones detalladas de los dominios individuales.

Figura 36. Habilidad de unión del diacuerpo bioespecífico HU2B6 4.5-HU3G8 5.1.

Se muestra la habilidad del diacuerpo bioespecífico Hu2B6 4.5-Hu3G8 5.1 (cuadros) para unirse a CD32b y CD16a con relación a los diacuerpos Hu2B6 4.5 o Hu3G8 5.1 (triángulos) .

Figura 37. Esquemático de los derivados DART de E-espiral y K-espiral.

Se ilustra la conformación general de los derivados DART E-espiral y K-espiral.

Figura 38. Configuración de hélice de separadores E-espiral y K-espiral preferidos.

La Figura 38 muestra la configuración de hélice de la secuencia "E-espiral" preferida (EVAALEK) 4 (SEC ID NO: 299) y la secuencia "K-espiral" preferida ( KVAALKE ) 4 (SEC ID NO: 300) .

Figura 39. Derivados DART que contiene Fe E-espiral y K-espiral.

Se ilustra las diferentes especies de derivados DART que contienen Fe E-espiral y K-espiral que pueden formarse a través de intercambio de cadena.

Figura 40. Cromatografía de exclusión de tamaño en derivados E-espiral y/o K-espiral y derivados que contienen Fe E-espiral y/o K-espiral de DARTS h2B6YAhCB3.

Se muestra la cromatografía de exclusión de tamaño en derivados E-espiral y/o K-espiral y derivados que contienen Fe E-espiral y/o K-espiral de DARTS h2B6YAhCB3. Se analizaron cuatro especies de cada molécula; todos tuvieron un E-espiral y un K-espiral: EK (sin región Fe), 2.1 mg; EFc/K (Fe enlazado a E-espiral), 2.7 mgs; E/KFc (Fe enlazado a K-espiral), 1.8 mgs; EFc/KFc (Fe enlazado a K-espiral y E-espiral del mismo DART) , 2.0 mg .

Figura 41. Estructura de moléculas de dímero producidas .

Se muestra la estructura posible de la molécula de dímero producida y explicada en cromatografía de exclusión de tamaño de la Figura 40.

Figura 42. Análisis electroforético en gel de SDS de poliacrilamida de derivados E-espiral y/o K-espiral y derivados que contienen Fe E-espiral y/o K-espiral de DARTS h2B6YAhCB3.

Se muestra los resultados de un análisis electroforético en gel SDS-poliacrilamida de las fracciones obtenidas de la cromatografía de exclusión de tamaño (Figura 40) de derivados de E-espiral y/o K-espiral y de derivados que contienen Fe E-espiral y/o K-espiral de DART h2B6YAhCB3. Carriles de flanqueo: controles marcadores moleculares; Carril 1: EK (sin región Fe); Carril 2: EFc/K, fracción agregada; Carril 3: EFc/K, fracción de monómero; Carril 4: E/KFc, fracción agregada; Carril 5: E/KFc, fracción de monómero; Carril 6: EFc/KFc, fracción agregada; Carril 7 : EFc/KFc, fracción de dímero; Carril 8: EFc/KFc, fracción de monómero .

Figura 43. Análisis ELISA de unión específico.

Se muestra el resultado de un ELISA de unión específico que compara derivados h2B6YAhCB3 DART que contiene Fe E-espiral/K-espiral (EFc/K o E/KFc), DART h2B6YAhCB3 , control y un derivado DART EFc/KFc h2B6YAhCB3.

Figura 44. Habilidad de los derivados de E-espiral y/o K-espiral y derivados que contienen Fe E-espiral y/o K-espiral de DART h2B6YAhCB3 para inhibir la proliferación de la célula T Se muestra la habilidad de los derivados de E-espiral y/o K-espiral y derivados que contienen Fe E-espiral y/o K-espiral de DART h2B6YAhCB3 para inhibir la proliferación de la célula T.

Figura 45. ABD-DART hCD16-hCD32B.

Se muestra un esquemático de una molécula de anticuerpo recombinante , hCD16- hCD32B ABD-DART compuesta del dominio ABD3 de la proteína G de estreptococo fusionada con un DART biespecífico recombinante que es inmuno-reactivo con los antígenos hCD16 y hCD32B.

Figuras 46A-46B. Afinidad de unión de hCD16-hCD32B ABD-DART utilizando ELISA específico doble.

Las placas de ELISA se recubrieron ya sea con antígeno CD16 (Figura 46A) o albúmina de suero humano (Figura 46B) a una concentración de 2 yg/ml . Las concentraciones variables de hCD16-hCD32B ABD-DART (¦) y de control hCD16-hCD32B DART (o) que parten de 2 pg/ml se unieron. El antígeno sCD32B biotinilado se agregó a la placa seguido por Estreptavidina conjugada con HRP para la detección.

Figura 47. Citotoxicidad mediada por PBMC de proteínas DART.

La citotoxicidad mediada por PBMC de proteínas DART. Los ensayos ADCC se llevaron a cabo utilizando líneas de célula B humanas, Daudi como células objetivo incubadas con PBMC como células efectoras. Los ensayos individuales se hicieron por triplicado en una relación de efector-a-obj etivo de 20:1 y una tritación de anticuerpos: hCD16A-hCD32B DART (·) y hCD16A -hCD32B ABD DART (¦) . Citotoxicidad mediada por las células se midió a través del ensayo de liberación LDH. La curva inferior a 10° es hCD16A-hCD32B ABD DART (¦) .

Figura 48. Propiedades farmacocinéticas mejoradas del hCD 16-hCD32B ABD-DART en ratones C57B1/6.

Los ratones (n=3) se inyectaron una sola inyección intravenosa de (A) hCD16- hCD32B ABD-DART (·) y (B) hCD16-hCD32B DART (?) a 5 mg/kg. El suero del ratón se recolectó en varios puntos en el tiempo y las concentraciones de la proteína en el suero se cuantificaron por ELISA. Los cálculos farmacocinéticos se llevaron a cabo utilizando WinNonlin Professional 5.1.

Figuras 49A-49E. Actividad HER2 x TCRb DART en el panel de líneas de células expresando HER2 bajo.

Las moléculas DART que tienen Her2 y los dominios de unión del receptor de célula T (TCR) se ensayaron para su habilidad para mediar la citotoxicidad en múltiples líneas celulares cancerígenas de pecho, cáncer de colon y cáncer de vejiga que habían sido previamente caracterizadas como exhibiendo bajos niveles de expresión HER2 (y de esta forma siendo refractarias a tratamientos con el anticuerpo anti-Her2/neu, Herceptin®. Las líneas celulares cancerígenas de pecho ensayadas son ZR75-1 (HER2 2+) (Figura 49A) , MCF-7 (HER2 1+) (Figura 49B) y MDA-MB468 (HER2 -ve) (Figura 49C) . Las líneas celulares cancerígenas no de pecho ensayadas son HT-29 (línea celular de cáncer de colon) (Figura 49D) y S 780 (línea celular de cáncer de vejiga) (Figura 49E) .

Descripción Detallada de la Invención Cada cadena de polipéptido de la molécula de diacuerpo comprende un dominio VL y un dominio VH, que están covalentemente enlazados de tal forma que los dominios están restringidos del auto-ensamble. La interacción de dos de las cadenas de polipéptido producirá dos empaj eramientos de VL-VH, formando dos sitios de unión de epítopo, es decir, una molécula divalente. Ninguno de los dominios VL o VL está limitado a cualquier posición dentro de la cadena polipéptido, es decir, restringida al amino-terminal (N) o carboxi (C) , y a los dominios restringidos en sus posiciones relativas entre sí, es decir, el domino VL puede ser N-terminal al dominio VH y viceversa. La única restricción es que una cadena de polipéptido complementaria está disponible con el fin de formar un diacuerpo funcional. Cuando los dominios VL y VH se derivan del mismo anticuerpo, las dos cadenas de polipéptido complementarias pueden ser idénticas. Por ejemplo, cuando los dominios de unión se derivan de un anticuerpo específico para el epítopo A (es decir, el dominio de unión se formar de una interacción VLA-VHA) , cada polipéptido dará como resultado la formación de dos sitios de unión VLA-VHA, dando como resultado un anticuerpo monoespecífico bivalente. Cuando los dominios VL y VH se derivan de anticuerpos específicos para diferentes antígenos, la formación de un diacuerpo biespecífico funcional requiere la interacción de dos diferentes cadenas de polipéptido, es decir, la formación de un heterodímero . Por ejemplo, para un diacuerpo biespecífico, una cadena de polipéptido comprenderá VLA y un VLB; la homodimerización de tal cadena dará como resultado la formación de dos sitios de unión VLA-VHB, ya sea no de unión o de una unión impredecible . En contraste, cuando dos cadenas de polipéptido diferentes están libres para interactuar, por ejemplo, en un sistema de expresión recombinante, una comprende VLA y una VHB y la otra comprende VLB y VHA, dos diferentes sitios de unión formarán: VLA-VHA y VLB-VHB. Para todos los pares de cadenas de polipéptido de diacuerpo la posibilidad de una desalineación o una mala unión de las dos cadenas es una posibilidad, es decir, la interacción de los dominio VL-VL o VH-VH; sin embargo, la purificación de los diacuerpos funcionales se maneja fácilmente con base en la inmunoespecificidad del sitio de unión dimerizado apropiadamente utilizando cualquier método con base en afinidad conocido en la técnica o ejemplificado en la presente, por ejemplo, cromatografía por afinidad.

En otras modalidades, una o más de las cadenas de polipéptido del diacuerpo comprenden un dominio Fe. Los dominios Fe en las cadenas polipéptido de las moléculas de diacuerpo preferiblemente dimerizan, dando como resultado la formación de una molécula de diacuerpo que exhibe propiedades de tipo inmunoglobulina, por ejemplo, interacciones Fc-FcyR. Fe que comprende un diacuerpos pueden ser dímeros, por ejemplo, comprendidos de dos cadenas de polipéptido, cada una comprendiendo un dominio VH, un dominio VL y un dominio Fe. La dimerización de tales cadenas de polipéptido da como resultado un diacuerpo divalente que comprende un dominio Fe, a pesar de tener una estructura diferente de la de un anticuerpo divalente no modificado (Figura 11) . Tales moléculas de diacuerpo exhibirán fenotipos alterados con relación a la inmunoglobulina de tipo silvestre, por ejemplo, una vida media en suero alterado, propiedades de unión, etc. En otras modalidades, las moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fe pueden ser tetrámeros. Tales tetrámeros comprenden dos cadenas de polipéptido "más pesada", es decir, una cadena de polipéptido, que comprende un dominio VL, uno VH y uno Fe, y dos cadenas de polipéptido "más ligeras" es decir, una cadena de polipéptido que comprende un VL y VH. Tales cadenas más ligeras y más pesadas interactúan para formar un monómero, y tales monómeros interactúan a través de sus dominios Fe sin emparejar para formar una molécula de tipo Ig. Tal diacuerpo de tipo Ig es tetravalente y puede ser monoespecífico, biespecífico, o tetraespecífico .

Al menos dos sitios de unión de la molécula de diacuerpo pueden reconocer el mismo o diferentes epítopos. Los diferentes epítopos pueden ser de diferentes antígenos o epítopos de diferentes antígenos. En una modalidad, los epítopos son de diferentes células. En otra modalidad, los epítopos son antígenos de superficie celular en la misma célula o virus. Los sitios de unión de epítopos pueden reconocer cualquier antígeno del cual puede generarse un anticuerpo. Por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, toxinas bacterianas, marcadores de superficie celular, marcadores autoinmunitarios , proteínas virales, fármacos, etc. En aspectos particulares, por lo menos un sitio de unión de epítopo del diacuerpo es específico para un antígeno en una célula particular, tal como la célula B o célula T, una célula fagocítica, una célula aniquiladora natural (NK) o una célula dendrítica.

Cada dominio de la cadena de polipéptido del diacuerpo, es decir, el dominio VL, VH y FC pueden separarse a través de un enlazador de péptido. El enlazador de péptido puede ser de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ó 9 aminoácidos. En ciertas modalidades, la secuencia enlazadora del aminoácido es GGGSGGGG (SEC ID NO: 10) codificada por la secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO: 74) .

En ciertas modalidades, cada cadena de polipéptido de la molécula de diacuerpo se modifica para comprender por lo menos un residuo de cisteína que interactuará con una contraparte en por lo menos un residuo de cisteína en una segunda cadena de polipéptido de la invención para formar enlace de disulfuro intercadena. Tales enlaces de disulfuro inter-cadena sirven para estabilizar la molécula del diacuerpo, mejorando la expresión y la recuperación en sistemas recombinantes , dando como resultado una formulación estable consistente así como mejorando estabilidad del producto aislado y/o purificado in vivo. Tal al menos un residuo de cisteína puede introducirse como un solo aminoácido o como parte de una secuencia de aminoácido más grande, por ejemplo, el dominio de bisagra, en cualquier porción de la cadena de polipéptido. En una modalidad específica, el al menos un residuo de cisteína se modifica para ocurrir en el C-terminal de la cadena de polipéptido. En algunas modalidades, el al menos un residuo de cisteína se introduce en la cadena de polipéptido dentro de la secuencia de aminoácido LGGC. En una modalidad específica, el C-terminal de la cadena de polipéptido que comprende la molécula de diacuerpo de la invención comprende la secuencia de aminoácido LGGC. En otra modalidad, el al menos un residuo de cisteína se introduce en el polipéptido dentro de una secuencia de aminoácido que comprende un dominio de bisagra, por ejemplo SEC ID NO: l o SEC ID NO: 4. En una modalidad específica, el C-terminal de una cadena de polipéptido de la molécula de diacuerpo de la invención comprende la secuencia de aminoácido de un dominio de bisagra IgG, por ejemplo SEC ID NO: 1. En otra modalidad, el C-terminal de una cadena de polipéptido de una molécula de diacuerpo de la invención comprende las secuencias de aminoácido VEPKSC (SEC ID NO: 77), que pueden codificarse a través de la secuencia de nucleótido (SEC ID NO: 78) . En otras modalidades, el al menos un residuo de cisteína se introduce en la cadena de polipéptido de la secuencia de aminoácido LGGCFNRGEC (SEC ID NO: 17) , que pueden codificarse a través de la secuencia de nucleótido (SEC ID NO: 76) . En una modalidad específica, el C-terminal de una cadena de polipéptido que comprende el diacuerpo de la invención comprende la secuencia de aminoácido LGGCFNRGEC (SEC ID NO: 17), que pueden codificarse a través de la secuencia de nucleótido (SEC ID NO: 76) . En aún otras modalidades, el al menos un residuo de cisteína se introduce en la cadena de polipéptido dentro de la secuencia de aminoácido FNRGEC (SEC ID NO: 23) , que pueden codificarse a través de la secuencia de nucleótido (SEC ID NO: 75) . En una modalidad específica, el C-terminal de la cadena de polipéptido que comprende el diacuerpo de la invención comprende la secuencia de aminoácido FNRGEC (SEC ID NO: 23) , que pueden codificarse a través de la secuencia de nucleótido (SEC ID NO: 75) .

En ciertas modalidades, la molécula del diacuerpo comprende al menos dos cadenas de polipéptidos , cada una de las cuales comprende la secuencia de aminoácido LGGC y están covalentemente enlazados a través de un enlace de disulfuro entre los residuos de cisteína en las secuencias LGGC. En otra modalidad específica, la molécula del diacuerpo comprende al menos dos cadenas de polipéptidos, una de las cuales comprende la secuencia FNRGEC (SEC ID NO: 23) mientras la otra comprende un dominio de bisagra (conteniendo por lo menos un residuo de cisteína) , en donde al menos dos cadenas de polipéptidos están covalentemente enlazados a través de un enlace de disulfuro entre el residuo de cisteína in FNRGEC (SEC ID NO: 23) y el residuo de cisteína en el dominio de bisagra. En aspectos particulares, el residuo de cisteína responsable del enlace de disulfuro localizado en el dominio de bisagra es Cys-128 (según enumerado de acuerdo con Kabat EU localizado en el dominio de bisagra de una cadena pesada IgG intacta, sin modificar) y el residuo de cisteína en la contraparte en SEC ID NO: 23 es Cys-214 (según enumerado con Kabat EU; localizado en el C-terminal de una cadena ligera IgG intacta, sin modificar) (Elkabetz et al. (2005) "Cysteines In CH1 Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains" , J. Biol . Chem. 280:14402-14412; incorporada aquí por referencia en su totalidad) . En aún otras modalidades, el al menos un residuo de cisteína se modifica para ocurrir en el N-terminal de la cadena de aminoácido. En aún otras modalidad, el al menos un residuo de cisteína se modifica para ocurrir en la porción enlazadora de la cadena de polipéptido de la molécula del diacuerpo. En modalidades adicionales, el dominio VH o VL se modifica para comprender por lo menos una modificación de aminoácido con relación al dominio VL o VL progenitor de tal forma que la modificación de aminoácido comprende una sustitución de un aminoácido progenitor con cisteína.

La invención abarca moléculas de anticuerpo que comprenden un dominio Fe o una de sus porciones (por ejemplo un dominio CH2 , o un dominio CH3) . El dominio Fe o una de sus porciones pueden derivarse de cualquier isotipo o alotipo de inmunoglobulina que incluye, pero no se limita a, IgA, IgD, IgG, IgE e IgM. En modalidades preferidas, el dominio Fe (o una de sus porciones) se deriva de IgG. En modalidades específicas, el isotipo IgG es IgGll, IgG2 , IgG3 o IgG4 o un alotipo del mismo. En una modalidad, la molécula del diacuerpo comprende un dominio Fe, cuyo dominio comprende un dominio CH2 y un dominio CH3 independientemente seleccionado de cualquier isotipo de inmunoglobulina (es decir un dominio Fe que comprende el dominio CH2 derivado de IgG y un dominio CH3 derivado de IgE, o el dominio CH2 derivado de IgGl y un dominio CH3 derivado de IgG2 , etc.). Tal dominio Fe puede modificarse en una cadena de polipéptido que comprende la molécula del diacuerpo de la invención en cualquier posición con relación a otros dominios o porciones de la cadena de polipéptido (por ejemplo, el dominio Fe, o una de sus porciones, puede ser c-terminal para ambos dominios VL y VH del polipéptido de la cadena; puede ser N-terminal para ambos dominios VL y VH; o puede ser N-terminal para un dominio y C-terminal para otro (es decir, entre dos dominios de la cadena de polipéptido) ) .

La presente invención también abarca moléculas que comprenden un dominio de bisagra. El dominio de bisagra se deriva de cualquier isotipo o alotipo de inmunoglobulina incluyendo IgA, IgD, IgG, IgE e IgM. En modalidades preferidas, el dominio de bisagra se deriva de IgG, en donde el isotipo IgG es IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 , o uno de sus alotipos. El dominio de bisagra puede modificarse en una cadena de polipéptido que comprende la molécula de diacuerpo junto con un dominio Fe de tal forma que la molécula de diacuerpo comprende un dominio de bisagra-Fc. En ciertas modalidades, el dominio de bisagra y Fe se seleccionan independientemente de cualquier isotipo de inmunoglobulina conocido en la técnica o ejemplificado en la presente. En otras modalidades el dominio de bisagra y Fe se separan en por lo menos otro dominio de la cadena de polipéptido, por ejemplo, el dominio VL. El dominio de bisagra, u opcionalmente el dominio de bisagra-Fc pueden modificarse en un polipéptido de la invención en cualquier posición con relación a otros dominios o porciones de la polipéptido. En ciertas modalidades, una cadena de polipéptido de la invención comprende un dominio de bisagra, cuyo dominio de bisagra está en el C-terminal de la cadena de polipéptido, en donde la cadena de polipéptido no comprende un dominio Fe. En aún otras modalidades, una cadena de polipéptido de la invención comprende un dominio de bisagra-Fc, cuyo dominio de bisagra-Fc está en el C-terminal de la cadena de polipéptido. En modalidades adicionales una cadena de polipéptido de la invención comprende un dominio de bisagra- Fe, cuyo dominio de bisagra-Fc está en el N-terminal de la cadena de polipéptido.

Como se explicó anteriormente, la invención abarca multímeros de cadena de polipéptidos , cada una de las cadenas de polipéptidos comprende un dominio VH y VL. En ciertos aspectos, las cadenas de polipéptidos en tales multímeros además comprenden un domino Fe. La dimerización de los dominios Fe conduce a la formación de una molécula de diacuerpo que exhibe funcionalidad de tipo inmunoglobulina, es decir, una función mediada por Fe (por ejemplo, la interacción Fc-FcyR, la unión de completo, etc.) . En ciertas modalidades, los dominios VL y VH comprenden cada cadena de polipéptido que tiene la misma especificidad, y tal molécula de diacuerpo es bivalente y monoespecífico . En otras modalidades, los dominios VL y VH comprenden cada cadena de polipéptido que tiene una especificidad diferente y el diacuerpo es bivalente y biespecífico .

En aún otras modalidades, los moléculas de diacuerpo de la invención abarcan tetrámeros de cadena de polipéptidos, cada cadena de polipéptido comprende un domino VH y VL. En ciertas modalidades, dos cadenas de polipéptidos de tetrámeros además comprenden un dominio Fe. El tetrámero por consiguiente está comprendido de dos cadenas de polipéptido "más pesadas" cada una comprendiendo un dominio VL, VH y Fe, y dos cadenas de polipéptido "más ligeras", comprendiendo un domino VL y VH. La interacción de una cadena más pesada y más ligera en un monómero divalente acoplado con dimerización de los monómeros a través de los dominios Fe de las cadenas más pesadas conducirá a la formación de una molécula de tipo inmunoglobulina tetravalente (ejemplificada en el Ejemplo 6.2 y en el Ejemplo 6.3) . En ciertos aspectos los monómeros son iguales, y la molécula de diacuerpo tetravalente es monoespecífica o biespecífica . En otros aspectos los monómeros son diferentes, y la molécula tetravalente es biespecífica o tetraespecífica .

La formación de una molécula de diacuerpo tetraespecífica como se describe supra requiere la interacción de cuatro diferentes cadenas de polipéptido. Tales interacciones son difíciles de lograr con eficiencia dentro de un sistema de producción recombinante de célula individual, debido a las muchas variantes de desemparejamiento de cadena potencial. Una solución para aumentar la probabilidad de desemparejamientos, es modificar las mutaciones de tipo "botones en agujeros" en los pares de cadenas de polipéptido deseadas. Tales mutaciones favorecen la heterodimerización sobre la homodimerización . Por ejemplo, con respecto a las interacciones Fc-Fc, una sustitución-interacciones, una sustitución de aminoácido (preferiblemente una sustitución con un aminoácido que comprende un grupo lateral voluminoso que forma un 'botón' , por ejemplo triptófano) puede introducirse en el dominio CH2 o CH3 de tal forma que la interferencia estérica evitará la interacción con un dominio similarmente mutado y obligará al dominio mutado a emparejarse con un dominio cuya mutación complementaria, o adaptativa ha sido modificada, es decir, 'el orificio' (por ejemplo, una sustitución con glicina). Tales grupos de mutaciones pueden modificarse en cualquier para de cadenas de polipéptidos del par. Los métodos para modificar proteínas para favorecer la heterodimerización sobre la homodimerización son bien conocidos en la técnica, en particular con respecto a la modificación de moléculas de tipo inmunoglobulina, y están abarcados en la presente (ver, por ejemplo, Ridgway et al. (1996) "Knobs-Into- Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization" , Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library" , J. MoL. Biol. 270: 26-35, y Xie et al. (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis", J. Immunol . Methods 296:95-101; cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad) .

La invención también abarca moléculas de diacuerpo que comprenden el dominio Fe variante o el dominio de bisagra-Fc variante (o una de sus porciones) , cuyo dominio Fe variante comprende por lo menos una modificación de aminoácido (por ejemplo sustitución, inserción, eliminación) con relación a un dominio Fe de tipo silvestre comparable o dominio Fe de bisagra (o una de sus porciones) . Las moléculas que comprenden los dominios Fe variantes o los dominio de bisagra-Fc (o una de sus porciones) (por ejemplo, anticuerpos) normalmente tienen fenotipos alterados con relación a las moléculas que comprenden el dominio Fe de tipo silvestre o los dominios de bisagra-Fc o sus porciones. El fenotipo variante puede expresarse como la vida media en suero alterada, estabilidad alterada, susceptibilidad alterada a enzimas celulares o función efectora alterada según se ensaya en un ensayo dependiente NK o dependiente de macrófago. Las variantes de dominio Fe identificadas como función efectora alterada se describen en la Solicitud Internacional WO04/063351, Solicitud de Patente de E.U.A. 2005/0037000 y 2005/0064514, Solicitud Provisional de E.U.A. 60/626,510, presentada el 10 noviembre del 2004, 60/636,663, presentada el 15 de diciembre del 2004, y 60/781,564, presentada el 10 de marzo del 2006, y Solicitud de Patente de E.U.A. 11/271, 140, presentada el 10 de noviembre del 2005, y 11/305,787, presentada el 15 de diciembre del 2005, solicitudes concurrentes de los Inventores, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

Los diacuerpos biespecíficos de la invención pueden simultáneamente unir dos epítopos separados y diferentes. En ciertas modalidades los epítopos son del mismo antígeno. En otras modalidades, los epítopos son de diferentes antígenos. En modalidades preferidas, por lo menos un sitio de unión de epítopo es específico para una determinante expresada en una célula efectora inmunitaria (por ejemplo, CD3 , CD16, CD32, CD64, etc.) que se expresan en linfocitos T, células aniquiladoras naturales (NK) u otras células mononucleares . En una modalidad, la molécula del diacuerpo se une al determinante de la célula efectora y también activa la célula efectora. A este respecto, las moléculas de diacuerpo de la invención pueden exhibir una funcionalidad de tipo Ig independiente de sí además comprenden un dominio Fe (por ejemplo, como se ensaya en cualquier ensayo de función efectora conocido en la técnica o ejemplificado en la presente (por ejemplo, ensayo ADCC) . En ciertas modalidades el diacuerpo biespecífico de la invención se une tanto a un antígeno cancerígeno en una célula de tumor como en un determinante de la célula efectora mientras se activa la célula. En modalidades alternativas, el diacuerpo biespecífico o la molécula del diacuerpo de la invención pueden inhibir la activación de un objetivo, por ejemplo, célula efectora a través de la unión simultánea, y de esta enlazando un receptor de activación e inhibidor en la misma célula (por ejemplo, la unión tanto de CD32A y CD32B, BCR y CD32B, o IgERl y CD32B) como se describe supra (ver, Sección de Antecedentes de la Invención) . En un aspecto más de esta modalidad, el diacuerpo biespecífico puede exhibir propiedades anti -víricas a través de la unión simultánea de dos epítopos neutralizantes en un virus (por ejemplo, epítopos RSV; epítopos WNV tales como E16 y E53) .

En ciertas modalidades, las moléculas de diacuerpo biespecíficas de la invención ofrecen oportunidades únicas para activar tipos de células específicas. Por ejemplo, el diacuerpo biespecífico o la molécula del diacuerpo pueden modificarse para comprender una combinación de sitio de unión de epítopo que reconocen un grupo de antígenos únicos para una célula objetivo o tipo tisular. Adicionalmente, cuando cualquiera o ambos antígenos individuales están bastante separados en común con otros tejidos y/o tipos de células, los dominios de unión de baja habilidad pueden utilizarse para construir el diacuerpo o la molécula del diacuerpo. Tales dominios de unión de baja afinidad serán incapaces de unirse al epítopo o antígeno individual con suficiente avidez para propósitos terapéuticos. Sin embargo, cuando ambos epítopos o antígenos están presentes en una sola célula o tejido objetivo, la avidez del diacuerpo o la molécula del diacuerpo para la célula objetico, con relación a una célula o tejido que expresa solamente uno de los antígenos, aumentará de tal forma que la célula o tejido puede efectivamente activarse a través de la invención. Tal molécula biespecífica puede exhibir una unión mejorada a uno o ambos de sus antígenos objetivo en células que expresan tanto antígenos con relación al diacuerpo monoespecífico o un anticuerpo con una especificidad a solamente uno de los antígenos.

Preferiblemente, las propiedades de unión de los diacuerpos de la invención se caracterizan por ensayos funcionales in vitro para determinar la actividad de unión y/o una o más funciones de la célula efectora del mediador FcyR (mediado a través de interacciones FC-FCYR O a través de la unión inmunoespecífica de una molécula de diacuerpo a un FcyR) (Ver Sección 5.4.2 y 5.4.3). Las afinidades y propiedades de unión de la molécula, por ejemplo, diacuerpos, de la invención para un FcyR puede determinarse utilizando ensayos in vitro (ensayos con base bioquímica o inmunológico) conocidos en la técnica para determinar el dominio-antígeno de unión o las interacciones Fc-FcyR, es decir, la unión específica de un antígeno a un dominio de unión o la unión específica de una región Fe a un FcyR, respectivamente, que incluye pero no se limita al ensayo ELISA, al ensayo de resonancia de plasmón de superficie, ensayos de inmunoprecipitación (Ver Sección 5.4.2). En modalidades más preferidas, las moléculas de la invención tienen similares propiedades de unión en modelos in vivo (tales como los descritos y explicados en la presente) a los ensayos con base in vitro. Sin embargo, la presente invención no excluye las moléculas de la invención que no exhiben el fenotipo deseado en ensayos con base in vitro pero exhiben el fenotipo deseado in vivo.

En algunas modalidades, las moléculas de la invención se modifican para comprender un patrón de glicosilación alterado o una glicoforma alterada con relación a la porción comparable de la molécula de plantilla. Las glicoformas modificadas pueden ser útiles para una variedad de propósitos, que incluyen, pero no se limitan a, la mejora de la función efectora. Las glicoformas modificadas pueden generarse a través de cualquier método conocido por el experto en la técnica, por ejemplo mediante el uso de cepas de expresión modificadas o variantes, a través de la coexpresión con una o más enzimas, por ejemplo, DI N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIll) , a través de la expresión de un diacuerpo de la invención en varios organismos o líneas celulares de varios organismos, o a través de un carbohidrato (s) modificador después que el diacuerpo ha sido expresado y purificado. Los métodos para generar glicoformas modificadas son conocidas en la técnica e incluyen pero no se limitan a los descritos en Umana et al. (1999) "Engineered Glycoforms Of An Antineu oblastoma IgGl With Optimized Antibody-Dependent Cellular Cytotoxic Activity" , Nat . Biotechnol 17:176-180; Davies et al. (2001) "Expression Of GnTIII In A Reco binant Anti-CD20 CHO Production Cell Line : Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In Adcc Through Higher Affinity For Fe Gamma RUI" , Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al. (2002) "Lack Of Fucose On Human IgGl N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RUI And Antibody-Dependent Cellular Toxicity" , J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al. (2003) "The Absence Of Fucose But Not The Presence Of Galactose Or Bisecting N-Acetylglucosamine Of Human IgGl Complex-Type Oligosaccharides Shows The Critical Role Of Enhancing Antibody-Dependent Cellular Cytotoxici ty" , J Biol Chem 278:3466-3473) US 6,602,684; USSN 10/277,370; USSN 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT O 02/311140A1 ; PCT WO 02/30954A1; Potillegent™ technology (Biowa, Inc. Princeton, NJ) ; GlycoMAb™ glycosylation engineering technology (GLYCART biotechnology AG, Zúrich, Suiza) ; cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Ver, por ejemplo, WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki et al. (2004) nFucose Depletion From Human IgGl Oligosaccharide Enhances Binding Enthalpy And Association Rate Entre IgGl And FcGammaRIIIA" , JMB, 336:1239-49 cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

La invención además abarca la incorporación de aminoácidos no naturales para generar los diacuerpos de la invención. Tales métodos son conocidos por el experto en la técnica tales como los que utilizan la maquinaria biosintética natural para permitir la incorporación de aminoácidos no naturales en proteínas, ver, por ejemplo, Wang et al. (2002) "Expanding The Genetic Code" , Chem. Comm. 1:1-11; Wang et al. (2001) "Expanding The Genetic Code Of Escherichia coli" , Science, 292: 498-500; van Hest et al. (2001) "Protein-Based Materials, Toward A New Level Of Structural Control", Chem. Comm. 19: 1897-1904, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Las estrategias alternativas se enfocan en la enzimas responsables de la biosíntesis del amino acil-ARNt, ver, por ejemplo, Tang et al. (2001) "Biosynthesis Of A Highly Stable Coiled-Coil Protein Containing Hexafluoroleucine In An Engineered Bacterial Host" , J. Am. Chem. Soc . 123(44): 11089-11090; Kiick et al. (2001) "Identification Of An Expanded Set Of Translationally Active Methionine Analogues In Escherichia coli", FEBS Lett . 502(1 -2):25-30; cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

En algunas modalidades, la invención abarca métodos para modificar un dominio VL, VH o Fe de una molécula de la invención mediante la adición o eliminación de un sitio de glicosilación . Los métodos para modificar el carbohidrato de las proteínas es bien conocido en la técnica y está abarcado dentro de la invención, ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 6,218,149; EP 0 359 096 Bl; Publicación de E.U.A. No. US 2002/0028486; O 03/035835; Publicación de E.U.A. No. 2003/0115614; Patente de E.U.A. No. 6,218,149; Patente de E.U.A. No. 6,472,511; todas las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

Las moléculas de diacuerpo de la presente invención pueden construirse para comprender un dominio que es un ligando de unión para el receptor del grupo aniquilador natural 2D (NKG2D) . Tales ligandos de unión, y particularmente los que no se expresan en células normales, incluyen la molécula de histocompatibilidad 60 (H60) , el producto del gen-1 inducible tempranamente por el ácido retinoico (RAE-1 ) , y el transcripto 1 de tipo proteína de unión UL16 de murino (MULTl) (Raulet D.H. (2003) "Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands" , Nature Rev. Immunol. 3:781-790; Coudert, J.D. et al. (2005) "Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells", Blood 106:1711-1717) . Los ligandos adicionales reactivos con NKG2D humanos incluyen las moléculas MICA relacionadas con la cadena de la clase I MHC polimórficas y MICB (Diefenbach, A. et al. (1999) "Natural Killer Cells: Stress Out, Turn On, Tune In" , Curr. Biol. 9(22) :R851- R8533; Bauer, S. et al. (1999) "Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA", Science 285 (5428) : 727-729 ; Stephens, H.A. (2001) "MICA and MICB genes: can the enigma de lair polymorphism be resolved?" , Trends Immunol . 22:378-385.

La secuencia de MICA es SEC ID NO: 311: MGLGPVFLLL AGIFPFAPPG AAAEPHSLRY NLTVLSWDGS VQSGFLTEVH LDGQPFLRCD RQKCRAKPQG Q AEDVLGNK T DRETRDLT GNGKDLRMTL AHIKDQKEGL HSLQEIRVCE IHEDNSTRSS QHFYYDGELF LSQNLETKEW TMPQSSRAQT LAMNVRNFLK EDAMKTKTHY HAMHADCLQE LRRYLKSGW LRRTVPPMVN VTRSEASEGN ITVTCRASGF YPWNITLSWR QDGVSLSHDT QQWGDVLPDG NGTYQTWVAT RICQGEEQRF TCYMEHSGNH STHPVPSGKV LVLQSHWQTF HVSAVAAAAI FVIIIFYVRC CKKKTSAAEG PELVSLQVLD QHPVGTSDHR DATQLGFQPL MSDLGSTGST EGA La secuencia de MICB es SEC ID NO: 312: PHSLRYNLMV LSQDGSVQSG FLAEGHLDGQ PFLRYDRQKR RAKPQGQWAE DVLGAKTWDT ETEDLTENGQ DLRRTLTHIK DQKGGLHSLQ EIRVCEIHED SSTRGSRHFY YDGELFLSQN LETQESTVPQ SSRAQTLAMN VTNFWKEDAM KTKTHYRAMQ ADCLQKLQLP PMVNVICSEV SEGNITVTCR ASSFYPRNIT LTWRQDGVSL SHNTQQWGDV LPDGNGTYQT WVATRIRQGE EQRFTCYMEH SGNHGTHPVP SGKALVLQSQ RTDFPYVSAA MPCFVIIII LCVPCCKKKTS AAEGP Los anticuerpos que específicamente se unen al receptor de la célula T incluyen el anticuerpos anti-TCR BMA 031 (Kurrle, R. et al . (1989) nBMA 031 - A TCR-Specific Monoclonal Antibody For Clinical Application" , Transplant Proc. 21(1 Pt 1): 1017-1019; Nashan, B. et al . (1987) "Fine Specificity Of A Panel Of Antibodies Against The TCR/CD3 Complex" , Transplant Proc. 19 (5) :4270-4272 ; Shearman, CW. et al. (1991) "Construction, Expression, And Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies With Specificity For The Human a/ß T Cell", J. Immunol . 146 (3) : 928-935 ; Shearman, CW. et al. (1991) "Construction, Expression And Characterization of Humanized Antibodies Directed Against The Human /ß T Cell Receptor", J. Immunol. 147 ( 12 ): 4366 -4373 ) . Los anticuerpos que específicamente se unen al receptor NKG2D incluyen KYK-2.0 (Kwong, KY et al. (2008) "Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity", J. Mol. Biol. 384:1143-1156; and PCT/US09/54911) .

A través del uso de tal anticuerpo, las células objetivo ahora se redirigen para ser una célula que puede unirse a través de células que arreglan el receptor (N G2D) . El receptor NKG2D se expresa en todas las células aniquiladoras naturales humanas (y otros mamíferos) (Bauer, S. et al. (1999) "Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA" Science 285 (5428) :727-729; Jamieson, A.M. et al. (2002) "The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing" , Immunity 17(1): 19-29) así como las células T CD8+ (Groh, V. et al. (2001) "Costimulation Of CD8afi T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells", Nat . Immunol . 2 (3) : 255-260 ; Jamieson, A.M. et al. (2002) "The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing" Immunity 17(1) : 19-29) .

Alternativamente, las moléculas de diacuerpo de la presente invención pueden construirse para comprender un dominio que es un ligando de unión para el receptor de la célula T ("TCR") . El TCR nativamente se expresa a través de células T CD4+ o CD8+, y permite que tales células reconozcan los péptidos antigénicos que están unidos y se presentan por las proteínas MHC de la clase I o clase II de las células presentadoras de antígeno. El reconocimiento de un complejo pMHC (péptido-MHC) a través de TCR inicia la propagación de una respuesta inmunitaria celular que conduce a la producción de citocinas y la lisis de la célula presentadora de antígeno (ver, por ejemplo, Armstrong, K.M. et al. (2008) "Conformational Changes And Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptide-MHC Complexes" , Biochem. J. 415 (Pt 2): 183-196; Willemsen, R. (2008) nSelection Of Human Antibody Fragmente Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy" , Cytometry A. 73 (11) : 1093-1099 ; Beier, K.C. et al. (2007) " aster Switches Of T-Cell Activation And Differentiation" , Eur. Respir. J. 29:804-812; allone, R. et al. (2005) "Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoim une Diabetes", Am. J. Ther . 12(6) :534-550) .

Al construir tales moléculas de diacuerpo para adicionalmente comprender por lo menos un dominio de unión de epítopo capaz de unirse a, por ejemplo, un receptor presente en la superficie de una célula objetivo, tales moléculas de diacuerpo serán moléculas DART y de esta forma son capaces de unirse a las células objetivo y por lo tanto causar que las células objetivo describen el ligando de unión para el receptor del grupo aniquilador natural 2D (NKG2D) o el TCR (cualquiera que esté presente en el diacuerpo de unión a la célula objetivo) (ver, por ejemplo, Germain, C. et al. (2008) "Redirecting NK Cells Mediated Tumor Cell Lysis By A New Recombinant Bifunctional Protein" , Prot . Engineer. Design Selection 21(11) :665-672) .

Tales diacuerpos pueden utilizarse para redirigir cualquier célula objetivo deseada en una célula que es una lisis de la célula mediada por la célula NK o citotoxicidad mediada por la célula T. En una modalidad, el dominio de unión del epítopo del diacuerpo capaz de unirse a un receptor presente en la superficie de la célula objetivo es un epítopo que se une a un antígeno asociado con tumor para así redirigir las células cancerígenas en sustratos para la lisis celular mediada por la célula NK o la citotoxicidad mediada por la célula T. De particular interés son los antígenos asociados con tumor que es un antígeno de cáncer de pecho, un antígeno de cáncer ovárico, un antígeno de cáncer de próstata, un' antígeno de cáncer cervical, un antígeno de carcinoma pancreático, un antígeno de cáncer de pulmón, un antígeno de cáncer de vejiga, un antígeno de cáncer de colon, un antígeno de cáncer testicular, un antígeno de glioblastoma, un antígeno asociado con una malignidad de las células B, un antígeno asociado con mieloma múltiple, un antígeno asociado con linfoma no de Hodgkins, o un antígeno asociado con leucemia linfocítica crónica.

Los antígenos asociados con tumor adecuados para los cuales el uso incluye A33 (un antígeno de carcinoma colorrectal ; Almqvist, Y. 2006, iVucl Med Biol . Nov; 33 (8) : 991-998); Bl (Egloff, A.M. et al. 2006, Cáncer Res. 66(1) :6-9); BAGE (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2 ( 6 ) : 577 - 84 ) ; beta-catenina (Prange W. et al. 2003 J Pathol . 201 (2) : 250-9) ; CA125 (Bast, R.C. Jr. et al. 2005 Int J" Gynecol Cáncer 15 Suppl 3:274-81); CD5 (Calin, G.A. et al. 2006 Se in Oncol . 33(2): 167-73; CD19 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CD20 (Thomas, D.A. et al. 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5): 1125-36); CD22 (Kreitman, R.J. 2006 AAPS J. 18;8 (3) :E532-51) ; CD23 (Rosati, S. et al. 2005 Curr Top Microbiol Immunol . 5 ; 294 : 91-107) ; CD25 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40 (4 ): 139-48) ; CD27 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91 (9) : 1234-40) ; CD28 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD36 (Ge, Y. 2005 Lab Hematol . 1 l(l):31-7); CD40/CD154 ( essmer, D. et al. 2005 Ann N Y Acad Sci. 1062:51- 60); CD45 (Jurcic, J.G. 2005 Curr Oncol Rep. 7 (5) : 339-46) ; CD56 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD79a/CD79b (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48; Chu, P.G. et al. 2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol . 9(2) :97- 106); CD103 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CDK4 (Lee, Y.M. et al. 2006 Cell Cycle 5 (18) : 2110-4) ; CEA (carcinoembryonic antigen; Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fértil. 34 (7-8) : 638-46 ; Tellez-Avila, F.I. et al. 2005 Rev Invest Clin. 57 (6) : 814-9) ; CTLA4 (Peggs, K.S. et al. 2006 Curr Opin Immunol . 18 (2 ) : 206-13 ) ; EGF-R (receptor del factor de crecimiento epidérmico; Adenis, A. et al. 2003 Bull Cáncer. 90 Spec No:S228-32); Erb (ErbBl; ErbB3 ; ErbB4 ; Zhou, H. et al. 2002 Oncogene 21 (57) : 8732-40; Rimon, E. et al. 2004 Int J Oncol. 24(5): 1325-38); GAGE (GAGE-I; GAGE-2; Akcakanat, A. et al. 2006 Int J Cáncer. 118(1): 123-8); GD2/GD3/GM2 (Livingston, P.O. et al. 2005 Cáncer Immunol Immunother. 54 (10) : 1018-25) ; gplOO (Lotem, M. et al. 2006 J Immunother. 29 (6) : 616-27) ; HER-2/neu (Kumar, Pal S et al. 2006 Semin Oncol. 33 (4 ): 386-91) ; virus de papiloma humano E6/virus de papiloma humano E7 (DiMaio, D. et al. 2006 Adv Virus Res. 66:125-59; KSA (17-1A) (Ragupathi, G. 2005 Cáncer Treat Res. 123:157-80); MAGE (MAGE-I; MAGE-3; (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2 (6) : 577-84) ; MART (Kounalakis, N. et al. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5) :377-82; MUC-I (Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fértil. 34 (7-8) : 638-46) ; MUM-I (Castelli, C. et al. 2000 J Cell Physiol. 182 (3) : 323-31) N-acetilglucosaminiltransferasa (Dennis, J. . 1999 Biochim Biophys Acta. 6 ; 1473 ( 1) : 21-34 ) ; pl5 (Gil, J. et al . 2006 Nat Rev Mol Cell Biol. 7 ( 9) : 667 -77 ) ; PSA (antígeno específico de próstata; Cracco, CM. et al. 2005 Minerva Urol Nefrol. 57(4):301-1 1); PSMA (Ragupathi, G. 2005 Cáncer Treat Res. 123:157-80); sTn (Holmberg, L.A. 2001 Expert Opin Biol Ther.

I (5) : 881-91) ; receptor TNF (receptor TNF-OÍ , receptor TNF-ß; o receptor TNF-?; van Horssen, R. et al. 2006 Oncologist.

II (4) : 397-408 ; Gardnerova, M. et al. 2000 Curr Drug Targets. 1 (4) :327-64) ; o receptor VEGF (O'Dwyer. PJ. 2006 Oncologist. 11 (9) : 992-8) .

Los antígenos asociados con tumor adicionales para tal uso (y publicaciones que describen anticuerpos específicamente reactivos para tales antígenos) incluyen ADAM-9 (Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2006/0172350; Publicación PCT No. O 06/084075); ALCAM (Publicación PCT No. WO 03/093443) ; Carboxipeptidasa M (Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2006/0166291); CD46 (Patente de Estados Unidos No. 7,148,038; Publicación PCT No. WO 03/032814); Citoqueratina 8 (Publicación PCT No. WO 03/024191) ; receptores Efrina (y en particular EphA2 (Patente de Estados Unidos No. 7,569,672; Publicación PCT No. WO 06/084226); Integrina Alfa-V-Beta-6 (Publicación PCT No. WO 03/087340); JAM-3 (Publicación PCT No. WO 06/084078); KID3 (Publicación PCT No. WO 05/028498); KID31 (Publicación PCT No. WO 06/076584); LUCA-2 (Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2006/0172349; Publicación PCT No. WO 06/083852); Oncostatina M (Receptor Beta de oncostatina) (Patente de Estados Unidos No. 7,572,896; Publicación PCT No. WO 06/084092); PIPA (Patente de Estados Unidos No. 7,405,061; Publicación PCT No. WO 04/043239); RAAG10 (Patente de Estados Unidos No. 7,527,969; Publicación PCT No. WO 04/001381) ; R0R1 (Patente de Estados Unidos No. 5,843,749); TES7 (Publicación PCT No. WO 08/066691) ; y el Receptor de Transferrina (Patente de Estados Unidos No. 7,572,895; Publicación PCT No. WO 05/121179).

También de interés son los antígenos específicos para agentes infecciosos particulares, por ejemplo, agentes virales que incluyen, pero no se limitan al virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , el virus de hepatitis B (HBV) , influenza, virus de papiloma humano (HPV) , pies y boca (virus coxsackie) , el virus de rabia, el virus de herpes simple (HSV) , y los agentes causantes de gastroenteritis, incluyendo rotavirus, adenovirus, virus calici, astrovirus y virus Nor alk; agentes bacterianos que incluyen, pero no se limitan a, E. coli, Salmonela thyphimurium, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Hemophilus influenzae, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Micobacteria de tuberculosis y Streptococcus pneumoniae, agentes fúngicos y parásitos tales como Giardi .

Alternativamente, tal epítopo puede unirse a un receptor Fe (por ejemplo, FcyRI o FCYRII) , tal como para por ejemplo, redirigir las células leucémicas monocíclicas agudas en sustratos para la lisis celular mediada por la célula NK.

DOMINIOS DE UNION DEL DIACUERPO Los diacuerpos de la presente invención comprenden dominios de unión a antígeno generalmente derivados de inmunoglobulinas o anticuerpos. Los anticuerpos de los cuales los dominios de unión utilizados en los métodos de la invención se derivan pueden ser de cualquier origen animal incluyendo pájaros y mamíferos (por ejemplo humanos, primates no humanos, de murino, de burro, de oveja, de conejo, de cabra, de conejillo de Indias, de camello, de caballo, o pollo) . Preferiblemente, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales humanos o humanizados. Como se utiliza en la presente, anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácido de la inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de colecciones de inmunoglobulina humana o colecciones de secuencias de colecciones de secuencias de codificación de inmunoglobulina humana sintética o de ratones que expresan anticuerpos de genes humanos .

La invención contempla el uso de cualquier anticuerpo conocido en la técnica para el tratamiento y/o prevención de cáncer, enfermedad autoinmunitarias , enfermedad inflamatoria o enfermedad infecciosa como la fuente de los dominios de unión para los diacuerpos de la invención. Los ejemplos no limitantes de anticuerpos cancerígenos conocidos son provistos en la sección 5.7.1, así como otros anticuerpos específicos para los antígenos objetivos listados y anticuerpos contra los antígenos cancerígenos listados en la sección 5.6.1; los ejemplos no limitantes de anticuerpos conocidos para el tratamiento y/o prevención de enfermedades autoinmunitarias y enfermedad inflamatoria son provistos en sección 5.7.2, así como anticuerpos contra los antígenos objetivos listados en los anticuerpos contra los antígenos listados en la sección 5.6.2; en otras modalidades los anticuerpos contra epítopos asociados con enfermedades infecciosas como se enumeran en la sección 5.6.3 pueden utilizarse. En ciertas modalidades, los anticuerpos comprenden una región Fe variante que comprende una o más modificaciones de aminoácido, que han sido identificadas por los métodos de la invención para tener una función efectora conferida y/o afinidad mejorada para FcyRIIB, y una afinidad disminuida para FCYRIIIA con relación a una molécula comparada que comprende una región Fe de tipo silvestre. Un ejemplo no limitante de los anticuerpos que se utilizan para el tratamiento o prevención de trastornos inflamatorios que pueden modificarse de acuerdo con la invención se presentan en la Tabla 9, y un ejemplo no limitante de los anticuerpos que se utilizan para el tratamiento o prevención del trastorno autoinmunitario se presenta en la Tabla 10.

Para algunos usos, incluyendo el uso in vivo de anticuerpos en humanos y ensayos de detección in vitro, puede ser preferible utilizar diacuerpos con dominios variables derivados de anticuerpos humanos, quiméricos o humanizados. Los dominios variables para anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de sujetos humanos. Los anticuerpos humanos pueden hacerse a través de una variedad de métodos conocidos en la técnica que incluyen métodos de despliegue de fago descritos anteriormente utilizando colecciones de anticuerpo derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Ver también, Patentes de E.U.A. Nos. 4,444,887 y 4,716,111; y Publicación Internacional Nos. O 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, O 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741; cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad .

Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo, una variante de uno de sus fragmentos que es capaz de unirse a un antígeno predeterminado y que comprende una región de cadena principal que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácido de una inmunoglobulina humana y una CDR que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácido de una inmunoglobulina no humana. Un anticuerpo humanizado puede comprender sustancialmente todos de al menos, y típicamente dos, dominios variables en donde todos o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donador) y todos o sustancialmente todas las regiones de cadena principal son la de una secuencia de consenso de inmunog1obu1ina humana .

La cadena principal y las regiones CDR de un anticuerpo humanizado no necesitan corresponder precisamente en las secuencias progenitoras , por ejemplo, la CDR donadora o la cadena principal de consenso puede mutagenizarse a través de infusión, inserción o eliminación de por lo menos un residuo de tal forma que la CDR o el residuo de la cadena principal en el sitio no corresponde ni al consenso ni al anticuerpo donar. Tales mutaciones, sin embargo, preferiblemente no extienden. Usualmente, por lo menos 75% de los residuos del anticuerpo humanizado corresponderán a los de la región de cadena principal progenitora (FR) y la secuencia CDR, por lo general 90%, y más preferiblemente mayor de 95%. Los anticuerpos humanizados pueden producirse utilizando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, injerto CDR (Patente Europea No. EP 239,400; Publicación Internacional No. O 91/09967; y Patentes de E.U.A. Nos. 5,225,539, 5,530,101, and 5,585,089), enchapado o revestimiento (Patentes Europeas Nos. EP 592,106 y EP 519,596; Padlan (1991) nA Possible Procedure For Reducing The Immunogenicity Of Antibody Variable Domains While Preserving Their Ligand-Binding Properties" , Molecular Immunology 28 (4/5) : 489-498 ; Studnicka et al. (1994) "Human-Engineered Monoclonal Antibodies Retain Full Specific Binding Activity By Preserving Non-CDR Complementarity-Modulating Residues" , Protein Engineering 7 (6) : 805-814 ; y Roguska et al. (1994) nHumanization Of Murine Monoclonal Antibodies Through Variable Domain Resurfacing" , Proc Nati Acad Sci USA 91:969-973), reorganización de cadena (Patente de E.U.A. No. 5,565,332), y las técnicas descritas en, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 6,407,213, 5,766,886, 5,585,089, Publicación Internacional No. WO 9317105, Tan et al. (2002) " 'Super humanized' Antibodies: Reduction Of Immunogenic Potential By Complementarity-Determining Región Grafting With Human Germline Sequences: Application To An Anti-CD28" , J. Immunol . 169:1119-25, Caldas et al. (2000) "Design And Synthesis Of Ger line-Based Hemi -Humanized Single-Chain Fv Against The CD 18 Surface Antigen" , Protein Eng. 13:353-60, Morea et al. (2000) "Antibody Modeling: Implications For Engineering And Design" , Methods 20:267-79, Baca et al. (1997) "Antibody Humanization Using Monovalent Phage Display" , J. Biol . Chem. 272:10678-84, Roguska et al. (1996) "A Comparison Of Two Murine Monoclonal Antibodies Humanized By CDR-Grafting And Variable Domain Resurfacing" , Protein Eng. 9:895-904, Couto et al. (1995) "Designing Human Consensúe Antibodies Nith Minimal Positional Templates" , Cáncer Res. 55 (23 Sup) : 5973s-5977s, Couto et al. (1995) "Anti-BA46 Monoclonal Antibody Mc3 : Humanization Using A Novel Positional Consensus And In Vivo And In vitro Characterization" , Cáncer Res. 55:1717-22, Sandhu (1994) "A Rapid Procedure For The Humanization Of Monoclonal Antibodies" , Gene 150:409-10, Pedersen et al. (1994) "Comparison Of Surface Accessible Residues In Human And Murine Immunoglobulin Fv Domains . Implication For Humanization Of Murine Antibodies" , J. Mol. Biol. 235:959-973, Jones et al. (1986) "Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse" , Nature 321:522-525, Riechmann et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy", Nature 332:323-327, and Presta (1992) "Antibody Engineering", Curr. O . Biotech. 3 (4 ) : 394 -398. Por lo general, los residuos de la cadena principal en las regiones de la cadena principal se sustituirán con el residuo correspondiente del anticuerpo donador CDR para alterar, preferiblemente mejorar, la unión del antígeno. Estas sustituciones de cadena principal se identifican a través de métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, a través de la modelación de las interacciones de la CDR y los residuos de cadena principal para identificar residuos de cadena principal importantes para la unión del antígeno y la comparación de secuencia para identificar los residuos de cadena principal inusuales en posiciones particulares. (ver, por ejemplo, Queen et al, Patente de E.U.A. No. 5,585,089; Publicación de E.U.A. Nos. 2004/0049014 y 2003/0229208; Patentes de E.U.A. Nos. 6,350,861; 6,180,370; 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089; y 5,530,101 y Riechmann et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy" , Nature 332:323-327, todas las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad) .

En una modalidad más preferida, el dominio de unión humanizado específicamente se une al mismo epítopo que el anticuerpo de murino donador. Se apreciará por el experto en la técnica que la invención abarca el injerto CDR de anticuerpos en general. De esta forma, los anticuerpos donador y aceptor pueden derivarse de animales de las mismas especies y aún la misma clase o subclase del anticuerpos. Más usualmente, sin embargo, los anticuerpos donar y aceptor se derivan de animales de diferentes especies. Típicamente el anticuerpo donador es un anticuerpo no humano, tal como un mAb de roedor, y un anticuerpo aceptor es un anticuerpo humano .

En algunas modalidades, por lo menos una CDR del anticuerpo donador se injerta en el anticuerpo humano. En otras modalidades, por lo menos dos y preferiblemente las tres CDR de cada una de las regiones variables de cadena pesada y/o ligera se injertan en el anticuerpo humano. Las CDR pueden comprender las CDR de Kabat, las CDR de bucle estructural o una de sus combinaciones. En algunas modalidades, la invención abarca un anticuerpo FcyRIIB humanizado que comprende por lo menos una cadena pesada injertada en CDR y por lo menos una cadena ligera injertada en CDR.

Los diacuerpos utilizados en los métodos de la invención incluyen derivados que se modifican, es decir, a través de la unión covalente de cualquier tipo de molécula al diacuerpo. Por ejemplo, pero no a manera de limitación, los derivados de diacuerpo incluyen diacuerpos que pueden modificarse, por ejemplo, a través de glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización a través de grupos protectores/ de bloqueo conocidos, división proteolítica, enlace a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas pueden llevarse a cabo a través de técnicas conocidas, que incluyen, pero no se limitan a, división química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente , el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual las diferentes porciones del anticuerpo se derivan de diferentes moléculas de inmunoglobulina tales como los anticuerpos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo no humano y una región constante de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos conocidos son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Morrison (1985) "Transfectomas Provide Novel Chimeric Antibodies" , Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) "Chimeric Antibodies" , BioTechniques 4:214-221; Gillies et al. (1989) "High-Level Expression Of Chimeric Antibodies Using Adapted cDNA Variable Región Cassettes" , J. Immunol . Methods 125:191-202; y Patentes de E.U.A. Nos. 6,311,415, 5,807,715, 4,816,567, y 4,816,397, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

Por lo general, los residuos de la cadena principal en las regiones de cadena principal se sustituirán con el residuo correspondiente del anticuerpo donador CDR para alterar, preferiblemente mejorar, la unión del antígeno. Estas sustituciones de cadena principal se identifican a través de métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, a través de la modelación de las interacciones de la CDR y los residuos de la cadena principal para identificar residuos de cadena principal importantes para la unión del antígeno y la comparación de secuencias para identificar el residuo de cadena principal inusual en posiciones particulares. (Ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,585,089; y Riechmann et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy" , Nature 332:323-327, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) .

Los anticuerpos monoclonales de los cuales los dominios de unión de los diacuerpos de la invención pueden prepararse utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica que incluye el uso de hibridoma, recombinante y tecnologías de despliegue de fago, o una combinación de éstas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse utilizando técnicas de hibridoma incluyendo las conocidas y enseñadas en la técnica, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988) ; Hammerling, et al, en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp . 563-681 (Elsevier, N.Y. , 1981) (ambas de las cuales se incorporan por referencia en su totalidad) . El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente no está limitado a anticuerpos producidos a través de la tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo derivado de un solo clon, que incluye cualquier clon eucariota, procariota o de fago, y no el método a través del cual se produce.

Los métodos para producir y clasificar anticuerpos específicos utilizando la tecnología de hibridoma son rutinarios y bien conocidos en la técnica. En un ejemplo no limitante, los ratones pueden inmunizarse con un antígeno de interés o una célula que expresa tal antígeno.

Una vez que se detecta la respuesta inmunitaria, por ejemplo, por ejemplo, los anticuerpos específicos para el antígeno se detectan en el suero de ratón, el bazo del ratón se cosecha y se inflan los esplenocitos . Los esplenocitos después se fusionan a través de técnicas bien conocidas a cualquier célula de mieloma adecuada. Los hibridomas se seleccionan y se clonan a través de la dilución limitante. Los clones de hibridoma después se ensayan a través de métodos conocidos en la técnica para células que secretan anticuerpos capaces de unirse al antígeno. El fluido de los ascitos, generalmente contiene altos niveles de anticuerpos, puede generarse a través a través de la inoculación de los ratones intraperitonealmente con clones de hibridoma positivos. Los antígenos de interés incluyen, pero no se limitan a, antigenos asociados con cánceres provistos en la sección 5.8.1, antígenos asociados con la enfermedad autoinmunitarias y las enfermedades inflamatorias provistas en la sección 5.8.2, antígenos asociados con enfermedades infecciosas provistas en la sección 5.8.3, y de toxinas provistas en la sección 5.8.4.

Los anticuerpos también pueden generarse utilizando métodos de despliegue de fago conocidos en la técnica. En los métodos de despliegue de fago, los dominios del anticuerpo funcional se despliegan en la superficie de las partículas de fago que llevan la secuencia de polinucleótido que los codifica. En una modalidad más particular, tal fago puede utilizarse para desplegar los dominios de unión a antígeno, tales como Fab y Fe, o Fv estabilizado en una unión a disulfuro, expresado de un repertorio o una colección de anticuerpo de combinación (por ejemplo, humano o murino) . La expresión del fago en el dominio de unión del antígeno que se une al antígeno de interés puede seleccionarse o identificarse con antígeno, por ejemplo, utilizando un • antígeno marcado o un antígeno unido o capturado en una superficie sólida o gránulo. El fago utilizado de estos métodos es un fago típicamente filamentoso, que incluye fd y M13. Los dominios de unión del antígeno se expresan como una proteína recombinantemente fusionada a ya sea un gen de fago III o una del gen VIII. Los ejemplos del método de despliegue de fago que pueden utilizarse para que las inmunoglobulinas o sus fragmentos, de la presente invención incluyen los descritos en Brinkmann et al. (1995) "Phage Display Of Disulfide-Stabilized Fv Fragments" , J. Immunol . Methods, 182:41-50; Ames et al. (1995) "Conversión Of Murine Fabs Isolated From A Combinatorial Phage Display Library To Full Length Immunoglobulins" , J. Immunol . ethods, 184:177-186; Kettleborough et al. (1994) "Isolation Of Tumor Cell-Specific Single-Chain Fv From Immunized Mice Using Phage-Antibody Librarles And The Re-Construction Of Nhole Antibodies From These Antibody Fragments", Eur. J. Immunol., 24:952-958; Persic et al. (1997) "An Integrated Vector System For The Eukaryotic Expression Of Antibodies Or Their Fragments After Selection From Phage Display Librarles" , Gene, 187:9-18; Burton et al. (1994) "Human Antibodies From Combinatorial Librarles" , Advances in Immunology, 57:191-280; Solicitud PCT No. PCT/GB91/01134 ; Solicitudes PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/159.82; WO 95/20401; y Patentes de E.U.A. Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 y 5,969,108; cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

La tecnología de despliegue de fago puede utilizarse para aumentar la afinidad de un anticuerpo para su antígeno. Esta técnica sería útil en la obtención de anticuerpos de alta afinidad. La tecnología, referida como maduración de afinidad, utiliza mutagénesis o desplazamiento de CDR y la re-selección utilizando el antígeno cognado para identificar anticuerpos que se unen con una afinidad más alta al antígeno cuando se comparan con el anticuerpo inicial o progenitor (ver, por ejemplo, Glaser et al. (1992) "Dissection Of The Combining Site In A Humanized Anti-Tac Antibody" , J. Immunology 149:2607-2614). Al mutagenizar codones completos en lugar de codones individuales da como resultado un repertorio semi -aleatorio de mutaciones de aminoácido. Las colecciones pueden construirse consistiendo de un grupo de clones variantes cada uno de los cuales difiere en una sola alteración de aminoácido en una sola CDR y que contiene variantes que representan cada sustitución de aminoácido posible para cada residuo de CDR. Los mutantes con una afinidad de unión aumentada para el antígeno pueden clasificarse a través del contacto de los mutantes inmovilizados con el antígeno marcado. Cualquier método de clasificación conocido en la técnica puede utilizarse para identificar anticuerpos mutantes con una avidez aumentada para el antígeno (por ejemplo, ELISA) (ver, Wu et al. (1998) "Stepwise In vitro Affinity Maturation Of Vitaxin, An Alphav Beta3-Specific Humanized mAb" , Proc Nati. Acad Sci. USA 95:6037-6042; Yelton et al. (1995) "Affinity Maturation Of The Br96 Anti -Carcinoma Antibody By Codon-Based Mutagenesis" , J. Immunology 155:1994-2004). El desplazamiento de CDR que distribuye aleatoriamente la cadena ligera también es posible (Ver Schier et al. (1996) "Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-ErbB-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site" , J. Mol. Bio. 263:551-567).

La presente invención también abarca el uso de dominios de unión que comprenden secuencias de aminoácido de cualquiera de los dominios de unión descritos en la presente conocidos en la técnica con mutaciones (por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácido) en la cadena principal o la región CDR. Preferiblemente, las mutaciones en estos dominios de unión mantienen o mejoran la avidez y/o afinidad de los dominios de unión para FCYRIIB al cual se unen inmunoespecíficamente . Las técnicas estándar conocidas por el experto en la técnica (por ejemplo, inmunoensayo) pueden utilizarse para ensayar la afinidad de un anticuerpo para un antígeno particular.

Las técnicas estándar conocidas por el experto en la técnica pueden utilizarse para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótido que codifica un anticuerpo, o uno de sus fragmentos, que incluyen, por ejemplo mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR, que da como resultado las sustituciones de aminoácido. Preferiblemente, los derivados incluyen menos de 15 sustituciones de aminoácido, menos de 10 sustituciones de aminoácido, menos de 5 sustituciones de aminoácido, menos de 4 sustituciones de aminoácido, menos de 3 sustituciones de aminoácido, o menos de 2 sustituciones de aminoácido con relación al anticuerpo original o uno de sus fragmentos. En una modalidad preferida, los derivados tienen sustituciones de aminoácido conservadoras hechas en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales pronosticados.

Diacuerpos que Comprenden Sitios de Unión de Epitopo que se Unen Inmunoespecífic mente a FcyRIIB En una modalidad particular, por lo menos uno de los dominios de unión de los diacuerpos de la invención agoniza por lo menos una actividad de FCYRIIB. En una modalidad de la invención, tal actividad de la inhibición de la señalización mediada por el receptor de la célula B. En otra modalidad, el dominio de unión inhibe la activación de células B, la proliferación de la célula B, la producción del anticuerpo, el influjo de calcio intracelular de las células B, el avance del sitio celular, o la actividad de una o más moléculas de señalización en corriente abajo en la trayectoria de transducción de señal FCYRIIB. En aún otra modalidad, el dominio de unión mejora la fosforilación de FcyRIIB o el reclutamiento de SHIP. En una modalidad más de la invención el dominio de unión inhibe la actividad de la cinasa MAP o el reclutamiento de Akt en la trayectoria de la señalización mediada por el receptor de la célula B. En otra modalidad, el dominio de unión agoniza la inhibición mediada por FcyRIIB es la señalización de FcsRI. En una modalidad particular, tal dominio de unión inhibe la activación de los mastocitos inducidos por Fc RI, la movilización de calcio, la desregulación, la producción de citocina o la liberación de serotonina. En otra modalidad, el dominio de unión de la invención estimula la fosforilación de FCYRIIB, estimula el reclutamiento de SHIP, estimula la fosforilación de SHIP y su asociación con Shc, o inhibe la activación de los medios de la familia de la cinasa MAP (por ejemplo, Erkl , Erk2 , J K, p38, etc.) . En aún otra modalidad, los dominios de unión de la invención mejoran la fosforilación de tirosina de p62dok y su asociación con SHIP y rasGAP. En otra modalidad, los dominios de unión de la invención inhiben la fagocitosis mediada por FcyR en monocitos o macrófagos.

En otra modalidad, los dominios de unión antagonizan por lo menos una actividad de FcyRIIB. En una modalidad, tal actividad es la activación de la señalización mediada por el receptor de la célula B. En una modalidad particular, los dominios de unión mejoran la actividad de la célula B, la proliferación de la célula B, la producción del anticuerpo, el influjo de calcio intracelula , o la actividad de una o más moléculas de señalización en corriente abajo en la trayectoria de su transducción de señal de FcyRIIB. En aún otra modalidad particular, los dominios de unión disminuyen la fosforilación de FcyRIIB o el reclutamiento de SHIP. En una modalidad más de la invención, los dominios de unión mejoran la actividad de cinasa MAP o el reclutamiento Akt en la trayectoria de la señalización mediada por el receptor de la célula B. En otra modalidad, los dominios de unión agonizan la inhibición mediada por FCYRIIB de la señalización de Fc RI. En una modalidad particular, los dominios de unión mejoran la activación de los mastocitos inducidos por FcsRI, la movilización de calcio, la desregulación, la producción de citocina o la liberación de serotonina. En otra modalidad, los dominios de unión inhiben la fosforilación de FcyRIIB, inhiben el reclutamiento de SHIP, inhiben la fosforilación de SHIP y su asociación con Shc, mejoran la activación de los medios de la familia de la cinasa MAP (por ejemplo, Erkl, Erk2 , JNK, p38, etc.). En aún otra modalidad, los dominios de unión inhiben la fosforilación de tirosina de p62dok y su asociación con SHIP y rasGAP. En otra modalidad, los dominios de unión mejoran la fagocitosis mediada por FcyR en monocitos o macrófagos . En otra modalidad, los dominios de unión previenen la fagocitosis, la depuración de partículas opsonizadas a través de macrófagos esplénicos.

En otras modalidades, por lo menos uno de los dominios de unión puede utilizarse para activar los diacuerpos de la invención a células gue expresan FcyRIIB.

En una modalidad particular, uno de los dominios de unión se deriva de un anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6 o 3H7 , que tiene los números de acceso ATCC PTA-4591 y PTA-4592, respectivamente. Los hibridomas que producen los anticuerpos 2B6 y 3H7 han sido depositados con la Colección de Cultivo de Tipo Americano (10801 University Blvd. , Manassas, VA. 20110-2209) el 13 de agosto del 2002 bajo las provisiones del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Propósitos de Procedimientos de Patente, y con número de acceso asignados PTA-4591 (para el hibridoma que produce 2B6) y PTA-4592 (para el hibridoma que produce 3H7) , respectivamente, y se incorporan aquí por referencia. En una modalidad preferida, los dominios de unión son humanos o han sido humanizados, preferiblemente se derivan de una versión humanizada del anticuerpo producidos por el clon 3H7 ó 2B6.

La invención también abarca diacuerpos con dominios de unión de otros anticuerpos, que específicamente se une a FcyRIIB, preferiblemente FcyRIIB humano, más preferiblemente FcyRIIB humano nativo, que se derivan de clones que incluyen pero no se limitan a 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, y 1F2 que tienen los números de acceso ATCC, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, y PTA-5959, respectivamente. Los hibridomas que producen los clones antes identificados se depositaron bajo las provisiones del Tratado de Budapest con la Colección del Cultivo de Tipo Americano (10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209) el 7 de mayo del 2004, y se incorporan aquí por referencia. En modalidades preferidas, los dominios de unión de los anticuerpos descritos anteriormente son humanizados .

En una modalidad específica, los dominios de unión utilizados en los diacuerpos de la presente invención son de un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno (por ejemplo, que comprenden una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) , preferiblemente, las 6 CDR) del anticuerpo producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5 , 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2. En otra modalidad, el dominio de unión se une al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal de ratón producido del clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, ó 1F2 , respectivamente y/o compite con el anticuerpo monoclonal de ratón producido del clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, ó 1F2 según determinado, por ejemplo, en un ensayo ELISA u otro inmunoensayo competitivo apropiado, y también se une a FcyRIIB con una mayor afinidad que el dominio de unión se une a FcyRIIA.

La presente invención también abarca diacuerpos con dominios de unión que comprenden una secuencia de aminoácido de una cadena pesada variable y/o cadena ligera variable que es al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácido de la cadena pesada variable y/o cadena ligera del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, ó 1F2. La presente invención además abarca diacuerpos con dominios de unión que específicamente se unen a FCYRIIB con mayor afinidad que el anticuerpo o uno sus fragmentos se une a FCYRIIA, y que comprende una secuencia de aminoácido de una o más CDR que es al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácido de una o más CDR del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6 , 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, ó 1F2. La determinación del porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácido pueden determinarse a través de cualquier método conocido por el experto en la técnica, incluye búsquedas de proteína BLAST.

La presente invención también abarca el uso de diacuerpos que contienen dominios de unión que específicamente se unen a FCYRIIB con mayor afinidad que los dominios de unión que se unen a FcyRIIA, que se codifican por una secuencia de nucleótido que híbrida la secuencia de nucleótido del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5 , 2E1, 2H9, 2D11, ó 1F2 bajo condiciones severas. En una modalidad preferida, el dominio de unión específicamente se une a FcyRIIB con una mayor afinidad que FcyRIIA, y comprende una cadena ligera variable y/o cadena pesada variable codificada por una secuencia de nucleótido que híbrida bajo condiciones de rigor a la secuencia de nucleótido de la cadena ligera variable y/o cadena pesada variable del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, ó 1F2 bajo condiciones severas. En otra modalidad preferida, los dominios de unión específicamente se unen a FCYRIIB con mayor afinidad que FCYRIIA, y comprenden una o más CDR codificadas por una secuencia de nucleótido que híbrida bajo condiciones severas a la secuencia de nucleótido de una o más CDR del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5 , 2E1, 2H9, 2D11, ó 1F2. Las condiciones de hibridación estrictas incluyen, pero no se limitan a, hibridación para un ADN unido al filtro en 6X de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C seguido por uno o más lavados en 0.2X SSC/0.1% SDS a aproximadamente 50-65 °C, condiciones altamente severas tales como hibridación de AND unido al filtro en 6X SSC a aproximadamente 45 °C seguido por uno o más lavados en 0. IX SSC/0.2% SDS a aproximadamente 60°C, o cualquier otra condición de hibridación severa conocida por el experto en la técnica (ver, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al, eds . 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol . 1, Green Publishing Associates, Inc. and John iley and Sons, Inc., NY, páginas 6.3.1 a 6.3.6 y 2.10.3, incorporada aquí por referencia) .

La presente invención también abarca el uso de dominios de unión que comprende una secuencia de aminoácido de cualquiera de los dominios de unión descritos anteriormente con mutaciones (por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácido) en la cadena principales o regiones CDR. Preferiblemente, las mutaciones en estos dominios de unión mantienen o mejoran la avidez y/o la afinidad de los dominios de unión para FCYRIIB al cual se une inmunoespecíficamente . Las técnicas estándar conocidas por los expertos en la técnica (por ejemplo, inmunoensayos) puede utilizarse para ensayar la afinidad de un anticuerpo para un antígeno particular.

Las técnicas estándar conocidas por el experto en la técnica pueden utilizarse para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótido que codifica un anticuerpo, o uno de sus fragmentos, que incluye, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediado por PCR, que da como resultado las sustituciones de aminoácido. Preferiblemente, los derivados incluyen menos de 15 sustituciones de aminoácido, menos de 10 sustituciones de aminoácido, menos de 5 sustituciones de aminoácido, menos de 4 sustituciones de aminoácido, menos de 3 sustituciones de aminoácido o menos de 2 sustituciones de aminoácido con relación al anticuerpo original o uno de sus fragmentos. En una modalidad preferida, los derivados tienen sustituciones de aminoácido conservadoras hechas en uno o más residuos de aminoácido no esenciales pronosticados.

En modalidades preferidas, los dominios de unión se derivan de anticuerpos humanizados. Un anticuerpo específico FCYRIIB humanizado puede comprender sustancialmente todos y al menos uno y típicamente dos, dominios variables en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de la inmunoglobulina no humana (es decir, el anticuerpo donador) y todas o sustancialmente todas las regiones de cadena principal son las de la secuencia de consenso de inmunoglobulina humana.

Los diacuerpos de la presente invención comprenden dominios variables humanizados específicos para FCYRIIB en donde una o más regiones de una o más CDR de las regiones de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo humano (el anticuerpo receptor) han sido sustituidas por partes análogas de una o más CDR de un anticuerpo monoclonal donador que específicamente se une a FcyRIIB, con una mayor afinidad que FcyRIIA, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal producido el clon 2B6, 3H7, 1D5 , 2E1, 2H9, 2D11, ó 1F2. En otras modalidades, los anticuerpos humanizados se unen al mismo epítopo como 2B6, 3H7 , 1D5 , 2E1, 2H9, 2D11, ó 1F2, respectivamente .

En una modalidad preferida, las regiones CDR del dominio de unión FcyRIIB humanizado se derivan de un anticuerpo de murino específico para FCYRIIB. En algunas modalidades, los anticuerpos humanizados descritos en la presente comprenden alteraciones, que incluyen pero no se limitan a eliminación, inserciones, modificaciones de aminoácido, el anticuerpo aceptor, es decir, las regiones de la cadena principal del dominio variable de cadena humana, pesada y/o ligera que son necesarias para retener la especificad de unión del anticuerpo monoclonal donador. En algunas modalidades, las regiones de cadena principal de los anticuerpos humanizados descritos en la presente no necesariamente consisten de la secuencia de aminoácido precisa de las regiones de cadena principal de una región variable del anticuerpo humano de existencia natural, pero contienen varias alteraciones, que incluyen pero no se limitan a eliminaciones, inserciones, de aminoácido, modificaciones que alteran la propiedad del anticuerpo humanizado, por ejemplo, mejoran las propiedades de unión de una región del anticuerpo humanizado que es específico para ese mismo objetivo que el anticuerpo específico FCYRIIB murino. En modalidades más preferidas, se hacen un número mínimo de alteraciones de la región de cadena principal con el fin de evitar las introducciones a gran escala de residuos de cadena principal no humanos y asegurar una inmunogenicidad mínima del anticuerpo humanizado en humano. El anticuerpo monoclonal donador preferiblemente es un anticuerpo monoclonal producido por los clones 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, ó 1F2.

En una modalidad específica, el dominio de unión abarca dominios variables de un anticuerpo injertado CDR que específicamente se une a FCYRIIB con una mayor afinidad que el anticuerpo que se une a FCYRIIA, en donde el anticuerpo injertado en CDR comprende un dominio de región variable de cadena pesada que comprende residuos de cadena principal del anticuerpo receptor y residuos del anticuerpo monoclonal donador, que específicamente se une a FcyRIIB con una mayor afinidad que el anticuerpo se une a FcyRIIA, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal producido en los clones 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, ó 1F2. En otra modalidad específica, los diacuerpos de la invención comprenden dominios variables de un anticuerpo injertado CDR que específicamente se une a FcyRIIB con una mayor afinidad del anticuerpo que une FcyRIIA, cuando el anticuerpo injertado CDR comprende un dominio de región variable de cadena ligera que comprende residuos de cadena principal del anticuerpo receptor y residuos del anticuerpo monoclonal donador, que específicamente une FcyRIIB con una mayor afinidad que el anticuerpo une FcyRIIA, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal producido de los clones 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, ó 1F2.

Los dominios variables anti-FcyRIIB humanizados utilizados en la invención pueden tener una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de CDR1 (SEC ID NO: 24 o SEC ID NO: 25) y/o CDR2 (SEC ID NO: 26 o SEC ID NO: 27) y/o CDR3 (SEC ID NO: 28 o SEC ID NO: 29) y/o la región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de CDR1 (SEC ID NO: 30 o SEC ID NO: 31) y/o una CDR2 (SEC ID NO: 32, SEC ID NO: 33, SEC ID NO: 34, o SEC ID NO: 35) y/o CDR3 (SEC ID NO: 36 o SEC ID NO: 37) .

En una modalidad específica, el diacuerpo comprende dominios variables de un anticuerpo 2B6 humanizado, en donde la región VH de los segmentos FR del segmento VHl-18 de VH de la línea germinal humana (Matsuda et al. (1998) "The Complete Nucleotide Sequence Of The Human Immunoglobulin Heavy Chain Variable Región Locus" , J. Exp . Med. 188:2151-2162) y JH6 (Ravetch et al. (1981) "Structure Of The Human Immunoglobulin Mu Locus: Characterization Of Embryonic And Rearranged J And D Genes", Cell 27(3 Pt . 2) : 583-91), y una o más regiones CDR de VH 2B6, que tiene las secuencias de aminoácido de SED ID NO:24, SEC ID NO: 26, o SEC ID NO: 28. En una modalidad, el VH 2B6 tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 38. En otra modalidad el dominio VH 2B6 tiene la secuencia de aminoácido de Hu2B6VH, SEC ID NO: 85, y puede codificarse a través de la secuencia de nucleótido de SEC ID NO: 86. En otra modalidad específica, el diacuerpo además comprende una región VL, que consiste de los segmentos FR del segmento VK-A26 VL de la línea germinal humana (Lautner-Rieske et al. (1992) "The Human Immunoglobulin Kappa Locus .

Characterization Of The Duplicated A Regions" , Eur. J. Immunol. 22:1023-1029) y JK4 (Hieter et al. (1982) "Evolution Of Human Immunoglobulin Kappa J Región Genes", J. Biol . Chem. 257:1516-22), y una o más regiones CDR de 2B6VL, que tienen la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 30, SEC ID NO: 32, SEC ID NO: 33, SEC ID NO: 34, y SEC ID NO: 36. En una modalidad, el VL 2B6 VL tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 39; SEC ID NO: 40, o SEC ID NO: 41. En una modalidad específica, el VL 2B6 VL tiene la secuencia de aminoácido de Hu2B6VL, SEC ID NO: 87, y puede codificarse a través de la secuencia de nucleótido provista en SEC ID NO: 88.

En otra modalidad específica, el diacuerpo tiene dominios variables de un anticuerpo 3H7 humanizado, en donde la región VH consiste de los segmentos FR de un segmento VH de la línea germinal humana y las regiones CDR de VH 3H7, que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO. 35. En otra modalidad específica, el anticuerpo 3H7 humanizado además comprende una región VL, que consiste de los segmentos FR de un segmento VL de la línea germinal humana y las regiones CDR de 3H7VL, que tienen la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 42.

En particular, los dominios de unión inmunoespecíficamente se unen a dominios extracelulares de FcyRIIB humano nativo, y comprende (o alternativamente consiste de) secuencias CDR de 2B6, 3H7, 1D5 , 2E1, 2H9, 2D11, ó 1F2, en cualquiera de las siguientes combinaciones: una CDRl VH y una CDRl VL; una CDRl VH y una CDR2 VL; una CDRl VH y una CDR3 VL; una CDR2 VH y una CDRl VL; CDR2 VH y CDR2 VL; una CDR2 VH y una CDR3 VL; una CDR3 VH y una CDRl VH; una CDR3 VH y una CDR2 VL; una CDR3 VH y una CDR3 VL; una CDRl VH1, una CDR2 VH y una CDRl VL; una CDRl VH, una CDR2 VH y una CDR2 VL; una CDRl VH, una CDR2 VH y una CDR3 VL; una CDR2 VH, una CDR3 VH y una CDRl VL, una CDR2 VH, una CDR3 VH y una CDR2 VL; una CDR2 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VL; una CDRl VH, una CDRl VL y una CDR2 VL; una CDRl VH, una CDRl VL y una CDR3 VL; una CDR2 VH, una CDRl VL y una CDR2 VL; una CDR2 VH, una CDRl VL y una CDR3 VL; una CDR3 VH, una CDRl VL y una CDR2 VL; una CDR3 VH, una CDRl VL y una CDR3 VL; una CDRl VH, una CDR2 VH, una CDR3 VH y una CDRl VL; una CDRl VH, una CDR2 VH, una CDR3 VH y una CDR2 VL; una CDRl VH, una CDR2 VH, una CDR3 VH y una CDR3 VL; una CDRl VH, una CDR2 VH, una CDRl VL y una CDR2 VL; una CDRl VH, una CDR2 VH, una CDRl VL y una CDR3 VL; una CDRl VH, una CDR3 VH, una CDRl VL y una CDR2 VL; una CDRl VH, una CDR3 VH, una CDRl VL y una CDR3 VL; una CDR2 VH, una CDR3 VH, una CDRl VL y una CDR2 VL; una CDR2 VH, una CDR3 VH, una CDRl VL y una CDR3 VL; una CDR2 VH, una CDR3 VH, una CDR2 VL y una CDR3 VL; una CDRl VH, una CDR2 VH, una CDR3 VH, una CDR1 VL y una CDR2 VL; una CDR1 VH, una CDR2 VH, una CDR3 VH, una CDR1 VL y una CDR3 VL; una CDR1 VH, una CDR2 VH, una CDR1 VL, una CDR2 VL, y una CDR3 VL; una CDR1 VH, una CDR3 VH, una CDR1 VL, una CDR2 VL, y una CDR3 VL; una CDR2 VH, una CDR3 VH, una CDR1 VL, una CDR2 VL, y una CDR3 VL; o cualquier combinación de éstas de las CDR VH y las CDR VL descritas en la presente.

Los anticuerpos para derivar dominios de unión a ser incluidos en los diacuerpos de la invención además pueden caracterizarse por el mapeo del epítopo, de tal forma que los anticuerpos pueden seleccionarse para tener la mayor especificidad para FcyRIIB comparado con FcyRIIA. Los métodos de mapeo de epítopo de los anticuerpos son bien conocidos en la técnica y están abarcados dentro de los métodos de la invención. En ciertas modalidades las proteínas de fusión que comprenden una o más regiones de FcyRIIB pueden utilizarse el mapeo del epítopo de un anticuerpo de la invención. En una modalidad específica, la proteína de fusión contiene la secuencia de aminoácido de una región de un FcyRIIB fusionado a la porción Fe de IgG2 humano. Cada proteína de fusión además puede comprender sustituciones y/o reemplazos de aminoácido de ciertas regiones del receptor con la región correspondiente de un receptor homólogo, por ejemplo, FcyRIIA, como se muestra en la Tabla 2 siguiente, pMGX125 y pMGX132 contienen el sitio de unión IgG del receptor FcyRIIB, el anterior con el C-terminal de FcyRIIB y el último con el C-terminal de FcyRIIA y pueden utilizarse para diferenciar la unión del C-terminal. Los otros tienen sustituciones FcyRIIA en el sitio de unión IgG y cualquiera del N-terminal FcylIA o FcylIB. Estas moléculas pueden ayudar a determinar la parte de la molécula receptora en donde los anticuerpos se unen.

Tabla 2. Lista de proteínas de fusión que pueden utilizarse para investigar el epítopo de los anticuerpos anti-FcyRIIB monoclonales . Residuos 172 a 180 que pertenecen al sitio de unión IgG de FcyRIIA y B. Los aminoácidos específicos de la secuencia FcyRIIA están en negrillas.

Las proteínas de fusión pueden utilizarse en cualquier ensayo bioquímico para la determinación de la unión de un anticuerpo anti-FcyRIIB de la invención, por ejemplo, un ELISA. En otras modalidades, la confirmación adicional de la especificidad del epítopo puede hacerse mediante el uso de péptidos con residuos específicos remplazados con los de la secuencia FCYRIIA.

Los anticuerpos pueden caracterizarse utilizando ensayos para identificar la función de los anticuerpos de la invención, particularmente la actividad para modular la señalización de FCYRIIB. Por ejemplo, los ensayos de caracterización de la invención pueden medir la fosforilación de los residuos de tirosina en el motivo ITIM de FcyRIIB, o medir la inhibición de la movilización de calcio generado por el receptor de la célula B. Los ensayos de caracterización de la invención pueden ser ensayos con base en célula o ensayos libre de célula.

Ha estado bien establecido en la técnica que la co-agregación de los mastocitos de FcyRIIB con el receptor IgE de alta afinidad, Fc RI, conduce a la inhibición de la desgranulación inducida por el antígeno, la movilización del calcio y la producción de citocina (Metcalfe D. D. et al. (1997) " ast Cells" , Physiol. Rev. 77:1033-1079; Long E.O. (1999) "Regulation Of Immune Responses Through Inhibitory Receptors" , Annu. Rev. Immunol . 17: 875-904). Los detalles moleculares de esta trayectoria de señalización han sido interpretados recientemente (Ott V. L. (2002) "Downstream Of Kinase, p62 (dok) , Is A Mediator Of FcgammalIB Inhibition Of Fe Epsilon RI Signaling" , J. Immunol. 162 (9) : 4430-4439) . Una vez agregados con FceRI, FCYRIIB se fosforilan rápidamente en la tirosina en su motivo ITIM, y después recluta Src con Homología-2 que contiene inositol-5-fosfatasa (SHIP) , un dominio SH2 que contiene inositol polifosfato 5-fosfatasa, que a su vez se fosforila y se asocia con She y p62dok (p62dok es el prototipo de una familia de moléculas adaptadoras, que incluyen dominios de finalización tales como el dominio de homología de plecstrina aminoterminal (dominio H) , un dominio PTB, una región terminal carboxi que contiene motivos PXXP y numerosos sitios de fosforilación (Carpino et al. (1997) "p62 (dok) : A Constitutively Tyrosine - Phosphorylated, GAP-Associated Protein In Chronic Myelogenous Leukemia Progenitor Celia", Cell, 88: 197-204; Yamanshi et al. (1997) " Identification Of The Abl-And rasGAP-Associated 62 kDa Protein As A Docking Protein, Dok" , Cell, 88:205-211) .

Los anticuerpos anti-FcYRIIB para utilizarse en la invención pueden igualmente caracterizarse por la habilidad para modular una o más respuestas mediadas por IgE . Preferiblemente, las líneas celulares que co-expresan el receptor de alta afinidad para IgE y el receptor de baja afinidad para FCYRIIB se utilizarán en la caracterización de los anticuerpos anti-FcYRIIB en la modulación de las respuestas mediadas por IgE. En una modalidad específica, las células de una línea celular de leucemia basofílica de rata (RBL-H23; Barsumian EX. et al. (1981) nIgE-Induced Histamine Reléase From Rat Basophilic Leukemia Cell Lines: Isolation Of Releasing And Nonreleasing Clones", Eur. J. Immunol . 11:317-323, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) se transfectan con FCYRIIB humano de longitud completa se utilizarán. RBL-2H3 es una línea celular de rata bien caracterizada que ha sido utilizada extensivamente para estudiar los mecanismos de señalización siguiendo la activación de la célula mediada por IgE. Cuando se expresan en células RBL-2H3 y se co-agregan con FcsRI, FCYRIIB inhibe la movilización del calcio inducida por FcsRI, la desgranulación y la producción de citocina ( albec et al. (1998) "Fe Epsilon Receptor I-Associated Lyn-Dependent Phosphorylation Of Fe Gamma Receptor HB During Negative Regulation Of Mast Cell Activation" , J. Immunol. 160:1647-1658; Daeron et al. (1995) "Regulation Of High-Affinity IgE Receptor-Mediated Mast Cell Activation By Murine Low-Affinity IgG Receptors" , J. Clin. Invest . 95:577; Ott V. L. (2002) nDownstream Of Kinase, p62 (dok) , Is A Mediator Of FcgammalIB Inhibition Of Fe Epsilon RI Signaling" , J. Immunol. 162 (9) :4430-4439) .

Los anticuerpos para utilizarse en la invención también pueden caracterizarse por la inhibición de la activación de los mastocitos inducida por Fc RI, Por ejemplo, las células de una línea celular de leucemia basofílica de rata (RBL-H23 ; Barsumian EX. et al. (1981) nIgE-Induced Histamine Reléase From Rat Basophilic Leukemia Cell Lines: Isolation Of Releasing And Nonreleasing Clones" , Eur . J. Immunol . 11:317-323) que han sido transfectadas con FCYRIIB se sensibilizan con IgE y se estimulan ya sea con los fragmentos F(ab')2 de IgG anti-ratón de conejo, para agregar Fc RI solo, o con IgG anti-ratón de conejo completo para coagregar FCYRIIB y FceRI. En este sistema, la modulación indirecta de las moléculas de señalización en corriente abajo puede ensayarse después de la adición de los anticuerpos de la invención para sensibilizar y estimular las células. Por ejemplo la fosforilación de tirosina de FcyRIIB y el reclutamiento y fosforilación de SHIP, la activación de los miembros de la familia de cinasa MAP, que incluyen pero no se limitan a Erkl , Erk2 , JNK, o p38; y la fosforilación de tirosina de p62dok y su asociación con SHIP y RasGAP pueden ensayarse .

Un ensayo ilustrativo para determinar la inhibición de la activación de los mastocitos inducidos por FceRI a través de los anticuerpos de la invención puede comprender lo siguiente: transfectar células RBL-H23 con FcyRIIB humano; sensibilizar las células RBL-H23 con IgE; estimular células RBL-H23 con ya sea F(ab' )2 de IgG anti-ratón de conejo (para agregar Fc RI solo y provocar la señalización mediada por FceRI, como un control), o estimular células RBL-H23 con IgG anti-ratón de conejo completo para (para co-agregar FcyRIIB y FceRI, dando como resultado la inhibición de la señalización mediada por FceRI) . Las células que han sido estimuladas con anticuerpos IgG anti-ratón de conejo completos pueden además pre- incubarse con los anticuerpos de la invención. La medición de la actividad dependiente Fc RI de las células que han sido pre- incubadas con los anticuerpos de la invención y las células que no han sido pre- incubadas con los anticuerpos de la invención, y comparar los niveles de la actividad dependiente de FceRI en estas células, indicaría una modulación de la actividad dependiente de Fc RI a través de los anticuerpos de la invención.

El ensayo ilustrativo descrito anteriormente puede ser, por ejemplo, utilizado para identificar anticuerpos que bloquean la unión de ligando (IgG) para el receptor FCYRIIB y antagonizan la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización Fc8RI mediante la prevención de la co-agregación de FcyRIIB y FceRI. Este ensayo igualmente identifica los anticuerpos que mejoran la co-agregación de FcyRIIB y FcsRI y agoniza la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización FcsRI mediante la promoción de la co-agregación de FcyRIIB y FceRI .

En algunas modalidades, los diacuerpos anti-FcyRIIB, que comprenden los dominios de unión de epítopo de los anticuerpos anti-FcyRIIB identificados descritos en la presente o que se conocen en la técnica, de la invención se caracterizan por su habilidad para modular una respuesta mediada por IgE a través del monitoreo y/o medición de la desgranulación de los mastocitos o basófilos, preferiblemente en un ensayo con base en una célula. Preferiblemente, los mastocitos o basófilos para utilizarse en tales ensayos han sido modificados para contener FCYRIIB humano utilizando métodos recombinantes estándar conocidos por el experto en la técnica. En una modalidad específica los anticuerpos anti-FcyRIIB de la invención se caracterizan por su habilidad para modular una respuesta mediada por IgE en un ensayo de liberación ß-hexosaminidasa con base en la célula (enzima contenida en los gránulos) . La liberación de la ß-hexosaminidasa de los mastocitos de basófilos es un evento primario en una condición alérgica aguda e inflamatoria (Aketani et al. (2001) "Correlation Entre Cytosolic Calcium Concentration And Degranulation In RBL-2H3 Cells In The Presence Of Various Concentrations Of Antigen-Specific IgEs" , Immunol. Lett . 75: 185-189; Aketani et al. (2000) "A Screening Method For Antigen-Specific IgE Using Mast Cells Based On Intracellular Calcium Signaling" , Anal. Chem. 72: 2653-2658) . La liberación de otros mediadores inflamatorios que incluyen pero no se limitan a serotonina e histamina pueden ensayarse para medir una respuesta mediada por IgE de acuerdo con los métodos de la invención. Aunque no se pretende estar unido a ningún mecanismo particular de acción, la liberación de los gránulos tales como los que contienen ß-hexosaminidasa de los mastocitos y basófilos es un proceso dependiente de la concentración de calcio intracelular que se inicia a través del entrelazamiento de FCYRIS con el antígeno multivalente .

La habilidad de estudiar mastocitos humanos ha estado limitada por la ausencia de cultivos de mastocitos humanos a largo plazo adecuados. Recientemente dos líneas celulares de mastocitos humanos dependientes del factor celular madre, designados LAD1 y LAD2 , se establecieron de aspirados de médula espinal de un paciente con sarcoma/leucemia mastocitos (Kirshenbaum et al. (2003) "Characterization Of Novel Stem Cell Factor Responsive Human Mast Cell Lines LAD 1 And 2 Established From A Patient With Mast Cell Sarcoma/Leukemia; Activation Following Aggregation Of FcRI Or FcyRI" , Leukemia research, 27:677-82, que se incorporada aquí por referencia en su totalidad) . Ambas líneas celulares han sido descritas para expresar Fc RI y barios marcadores de mastocitos humanos. Las células LAD 1 y 2 pueden utilizarse para evaluar el efecto de los anticuerpos de la invención en respuestas mediadas por IgE. En una modalidad específica, los ensayos de liberación de ß-hexosaminidasa con base en la célula tales como los descritos supra pueden utilizarse en células LAD para determinar cualquier modulación de la respuesta mediada por IgE a través de los anticuerpos anti-FcYRIIB de la invención. En un ensayo ilustrativo, los mastocitos humanos, por ejemplo, LAD 1, se imprimaron con anti-nitrofenol IgE humano quimérico (NP) y se reforzaron con BSA-NP, el antígeno polivalente, y la desgranulación celular se monitoreó mediante la medición de la ß-hexosaminidasa liberada en el sobrenadante (Kirshenbaum et al. (2003) "Characterization Of Novel Stem Cell Factor Responsive Human Mast Cell Lines LAD 1 And 2 Established From A Patient With Mast Cell Sarco a/Leukemia; Activation Following Aggregation Of FcRI Or FcyRI" , Leukemia research, 27:677-82, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) .

En algunas modalidades, si los mastocitos humanos tienen una baja expresión de FcyRIIB endógeno, como se determina utilizando métodos estándar conocidos en la técnica, por ejemplo, tinción FACS, puede ser difícil monitorear y/o detectar las diferencias en la activación de la trayectoria inhibidora mediada por los diacuerpos anti-FcyRIIB de la invención. La invención de esta forma abarca métodos alternativos, a través de los cuales la expresión de FcyRIIB puede regularse de manera ascendente utilizando citocinas y condiciones de cultivo particulares. FcyRIIB ha sido descrita como estando altamente regulada de manera ascendente en líneas celulares de monocitos humanos, por ejemplo, THP1 U937, (Tridandapani et al. (2002) "Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells" , J. Biol . Chem. , 277(7): 5082-5089) y monocitos humanos primarios (Pricop et al. (2001) "Differential Modulation Of Stimulatory And Inhibitory Fe Gamma Receptors On Human Monocytes By Thl And Th2 Cytokines" , J. of Immunol , 166: 531-537) by IL4. La diferenciación de las células U937 con dibutiril cíclico AMP ha sido descrita para aumentar la expresión de FcyRII (Cameron et al. (2002) nDifferentiation Of The Human Monocyte Cell Line, U937, Nith Dijbutyryl Cy die AMP Induces The Expression Of The Inhibitory Fe Receptor, FcgammaRIIB" , Immunology Letters 83, 171-179). De esta forma la expresión de FCYRIIB endógena en mastocitos humanos para utilizarse en los métodos de la invención puede regularse de manera ascendente utilizando citocinas, por ejemplo, IL-4, IL-13, con el fin de mejorar la sensibilidad de la detección.

Los diacuerpos anti -FcyRIIB también pueden ensayarse para la inhibición de la señalización mediada por el receptor de la célula B (BCR) . La señalización mediada por BCR puede incluir por lo menos una o más respuestas biológicas en corriente abajo, tales como la activación y la proliferación de las células B, la producción del anticuerpo, etc. La co-agregación de FcyRIIB y BCR conduce a la inhibición del avance del sitio celular y la supervivencia celular. Además, la co-agregación de FcyRIIB y BCR conduce a la inhibición de la señalización mediada BCR.

Específicamente, la señalización mediada por BCR comprende por lo menos uno o más de lo siguiente: modulación de las moléculas de señalización en corriente abajo (por ejemplo, listado de fosforilación de FCYRIIB, reclutamiento SHIP, y localización Btk y/o PLCy, actividad de cinasa MAP, reclutamiento de Akt (señal anti-apoptótica) , movilización de calcio, avance del sitio celular, y proliferación celular.

Aunque numerosas funciones efectoras de la inhibición de la señalización BCR mediada por FcyRIIB- están mediadas a través SHIP, recientemente se ha demostrado que las células B actividadas por lipopolisacárido (LPS) , de ratones deficientes de SHOP exhiben una inhibición mediada por FcyRIIB significativa de la movilización de calcio, producción Ins ( 1 , 4 , 5 ) P3 , y fosforilación de Erk y Akt (Brauweiler et al. (2001) "Partially Distinct Molecular Mechanisms Medíate Inhibitory FcgammaRIIB Signaling In Resting And Activated B Cells" , Journal of Immunology, 167(1) : 204-211) . Por consiguiente, las células B ex vivo de ratones deficientes SHIP pueden utilizarse para caracterizar los anticuerpos de la invención. Un ensayo ilustrativo para determinar la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización BCR a través de los anticuerpos de la invención puede comprender lo siguiente: aislamiento de células B esplénicas de ratones deficientes SHIP, activación de las células con lipopolisacáridos y estimulación de las células con ya sea F(ab' )2 anti-IgM para agregar BCR o con anti-Ig para co-agregar BCR con FCYRIIB. Las células que han sido estimuladas con anti-IgM intacto para co-agregar BCR con FcyRIIB pueden además pre- incubarse con los anticuerpos de la invención. La actividad de las células dependiente de FcyRIIB puede medirse a través de técnicas estándar conocidas en la técnica. La comparación del nivel de la actividad dependiente de FcyRIIB en las células que han sido pre-incubadas con los anticuerpos y células que no han sido pre-incubadas y comparando los niveles podría indicar una modulación de la actividad dependiente de FcyRIIB a través de los anticuerpos La medición de la actividad dependiente de FcyRIIB puede incluir, por ejemplo, medir la movilización de calcio intracelular a través de citometría de flujo, medir la fosforilación de Akt y/o Erk, medir la acumulación de PI(3,4,5)P3 mediada por BCR, o medir la proliferación de las células B mediada por FcyRIIB.

Los ensayos pueden utilizarse, por ejemplo, para identificar diacuerpos o anticuerpos anti-FcyRIIB para utilizarse en la invención que modulan la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de BCR mediante el bloqueo del sitio de unión del ligando (IgG) para el receptor FcyRIIB y antagonizar la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización BCR evitando la co-agregación de FCYRIIB y BCR. Los ensayos también pueden utilizarse para identificar anticuerpos que mejoran la co-agregación de FCYRIIB y BCR y agonizar la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización BCR.

Los anticuerpos anti -FcyRIIB también pueden ensayarse para la señalización mediada por FcyRII en monocitos/macrófagos humanos. La co-agregación de FcyRIIB con un receptor que lleva el motivo de activación con base en tirosina del inmuno-receptor (ITAM) actúa para regular de manera descendente la fagocitosis mediada por FcyR utilizando SHIP como su efector (Tridandapani et al. (2002) "Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells" , J. Biol . Chem. , 277(7): 5082-5089). La co-agregación de FcyRIIA con FcyRIIB da como resultado la rápida fosforilación de residuo de tirosina en el motivo ITIM de FcyRIIB, conduciendo a una mejora en la fosforilación de SHIP, la asociación de SHIP con Shc, y la fosforilación de proteínas que tienen un peso molecular de 120 y 60-65 kDa. Además, la co-agregación de FcyRIIA con FcyRIIB da como resultado la regulación descendente de la fosforilación de Akt , que es una serina-treonina cinasa que está involucrada en la regulación celular y que sirve para suprimir la apoptosis .

Los diacuerpos anti-FcyRIIB también pueden ensayarse para la inhibición de la fagocitosis mediada por FcyR en mocitos/macrófagos humanos. Por ejemplo, las células de una línea celular de monocitos humanos, THP-1 puede estimularse ya sea con fragmentos Fab del anticuerpo IV.3 monoclonal de ratón contra FcyRII y el anticuerpo anti-ratón de cabra (para agregar FcyRIIA solo) , o con el anticuerpo monoclonal de ratón IV.3 completo y el anticuerpo anti-ratón de cabra (para co-agregar FcyRIIA y FcyRIIB) . En este sistema, la modulación de las moléculas de señalización en corriente abajo, tales como la fosforilación de tirosina de FcyRIIB, fosforilación de SHIP, asociación de SHIP con Shc, fosforilación de Akt, y la fosforilación de proteínas que tienen un peso molecular de 120 y 60-65 kDa pueden ensayarse después de la adición de las moléculas de la invención a las células estimuladas. Además, la eficiencia fagocítica dependiente de FcyRIIB de la línea de células monocíticas puede directamente medirse en la presencia y ausencia de anticuerpos de la invención.

Otro ensayo ilustrativo para determinar la inhibición de la fagocitosis mediada por FcyR en monocitos/macrófagos humanos a través de los anticuerpos de la invención puede comprender lo siguiente: estimular células THP-1 con ya sea Fab del anticuerpo anti-FcyRII de ratón IV.3 y el anticuerpo anti-ratón de cabra (para agregar FcyRIIA solo y provocar la señalización mediada por FcyRIIA) ; o con el anticuerpo anti-FcYRII de ratón y el anticuerpo anti-ratón de cabra (para co-agregar FCYRIIA y FcyRIIB e inhibir la señalización mediada por FcyRIIA. Las células que han sido estimuladas con el anticuerpo anti-FcYRII de ratón y el anticuerpos anti-ratón de cabra además pueden pre- incubarse con las moléculas de la invención. La medición de la actividad dependiente de FcyRIIA de células estimuladas que ha sido pre-incubadas con moléculas de la invención y células que no han sido pre-incubadas con anticuerpos de la invención y comparar los niveles de la actividad dependiente de FcyRIIA en estas células indican una modulación de la actividad dependiente de FcyRIIA a través de los anticuerpos de la invención .

El ensayo ilustrativo descrito puede utilizarse por ejemplo, para identificar dominios de unión que bloquean la unión del ligando del receptor FcyRIIB y antagonizan la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización FcyRIIA previniendo la co-agregación de FcyRIIB y FcyRIIA. Este ensayo igualmente identifica los dominios de unión que mejoran la co-agregación de FcyRIIB y FcyRIIA y agonizan la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de FcyRIIA.

Los dominios de unión FcyRIIB de interés pueden ensayarse mientras comprenden anticuerpos I mediante la medición de la habilidad de la células THP-1 para IgG con fluoresceína de fagocitosis-glóbulos rojos de oveja opsonizados (SRBC) a través de los métodos previamente descritos (Tridandapani et al. (2000) "The Adapter Protein LAT Enhances Fcgamma Receptor-Mediated Signal Transduction In Myeloid Cells" , J. Biol . Chem. 275: 20480-7). Por ejemplo, un ensayo ilustrativo para medir la fagocitosis comprende: tratar las células THP-1 con los anticuerpos de la invención o con un anticuerpo de control que se une a FCYRII, que comprende niveles de actividades de tales células, en donde una diferencia en las actividades de las células (por ejemplo, actividad de rosetas (el número de células THP-1 que se unen al IgG, SRBC recubierto) , actividad de adherencia (el número total de SRBC unido a células THP-1) , y el grado fagocítico) indicaría una modulación de la actividad dependiente de FcyRIIA a través de los anticuerpos de la invención. Este ensayo puede utilizarse para identificar, por ejemplo, anticuerpos que bloquean la unión del ligando del receptor FcyRIIB y antagonizan la inhibición mediada por FcyRIIB de la fagocitosis. Este ensayo también puede identificar anticuerpos que mejoran la inhibición mediada FcyRIIB de la señalización FcyRIIA.

En una modalidad preferida, los dominios de unión modulan la actividad dependiente de FcyRIIB en monocitos/macrófagos humanos en por lo menos una o más de las siguientes formas: modulación de las moléculas de señalización en corriente abajo (modulación de estado de fosforilación de FCYRIIB, modulación de la fosforilación SHIP, modulación de SHIP y asociación Shc , modulación de la fosforilación de Akt, modulación de la fosforilación de proteínas adicionales alrededor de 120 y 60-65 kDa) y la modulación de fagocitosis.

DOMINIOS DE UNION CD16A La siguiente sección explica las proteínas de unión CD16A que pueden utilizarse como fuentes para regiones variables de cadena ligera y pesada para la producción del diacuerpo covalente. En la presente invención, las proteínas de unión CD16A incluyen moléculas que comprenden los dominios VL y VH de los anticuerpos CD16A, cuyos dominios VH y VL se utilizan en la producción de los diacuerpos de la presente invención .

Una variedad de proteínas de unión CD16A puede utilizarse en conexión con la presente invención. Las proteínas de unión CD16A adecuadas incluyen anticuerpos monoclonales humanos o humanizados así como fragmentos de anticuerpos de unión CD16A (por ejemplo, scFv, o anticuerpos de cadena individual, fragmentos Fab, minicuerpos) y otras proteínas de tipo anticuerpo que se unen a CD16A a través de una interacción con el domino de la región variable de cadena ligera, el dominio de la región variable de cadena pesada, o ambas .

En algunas modalidades, la proteína de unión CD16A para utilizarse de acuerdo con la invención comprende un dominio VL y/o VH que tiene una o más CDR con secuencias derivadas de un anticuerpo anti-CD16A no humano, tal como un anticuerpos anti-CD16A de ratón, y una o más regiones de cadena principal que se derivan de las secuencias de cadena principal de una o más inmunoglobulinas humanas. Un número de anticuerpos monoclonales anti-CD16A no humanos, de los cuales las CDR y otras secuencias pueden obtenerse, son conocidas (ver, por ejemplo, Tamm et al. (1996) "The Binding Epitopes Of Human CD16 (Fe gamma RUI) Monoclonal Antibodies . Implications For Ligand Binding" , J. Imm. 157:1576-81; Fleit et al. (1989) p.159; LEUKOCYTE TYPING II: HUMAN MYELOID AND HEMATOPOIETIC CELLS, Reinherz et al, eds . New York: Springer-Verlag; (1986); LEUCOCYTE TYPING III: HITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS McMichael A J, ed., Oxford: Oxford University Press, 1986) ; LEUKOCYTE TYPING IV: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS , Kapp et al., eds . Oxford Univ. Press, Oxford; LEUKOCYTE TYPING V: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Schlossman et al., eds. Oxford Univ. Press, Oxford; LEUKOCYTE TYPING VI: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Kishimoto, ed. Taylor & Francis. Además, como se muestra en los ejemplos, las nuevas proteínas de unión CD16A que reconocen CD16A humano se expresan en células que pueden obtener utilizando métodos bien conocidos para la producción y selección de anticuerpos monoclonales o proteínas de unión relacionadas (por ejemplo, tecnología de hibridoma, despliegue de fago, y similar) . Ver, por ejemplo O'Connell et al. (2002) "Phage Versus Phagemid Librarles For Generation Of Human Monoclonal Antibodies" , J. Mol. Biol. 321:49-56; Hoogenboom et al. (2000) "Natural And Designer Binding Sites Made By Phage Display Technology", Imm. Today 21:371078; Rrebs et al. (2001) "High-Throughput Generation And Engineering Of Recombinant Human Antibodies" , J. Imm. Methods 254:67-84; y otras referencias citadas en la presente. Los anticuerpos monoclonales de la especie no humana pueden quimerizarse o humanizarse utilizando técnicas de humanización de anticuerpo conocidas en la técnica.

Alternativamente, los anticuerpos completamente humanos contra CD16A pueden producirse utilizando animales transgénicos que tienen elementos de un sistema inmunitario humano (ver, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 5,569,825 y 5,545,806), utilizando células sanguíneas periféricas humanas (Casali et al. (1986) nHuman Monoclonals From Antigen-Specific Selection Of B Lymphocytes And Transformation By EBV" , Science 234:476-479), a través de la clasificación de una colección de AND de células B humanas de acuerdo con el protocolo general obtenido a través de Huse et al. (1989) "Generation Of A Large Combinatorial Library Of The Immunoglobulin Repertoire In Phage Lambda" , Science 246:1275-1281, y a través de otros métodos.

En una modalidad preferida, el donador de unión es del anticuerpo 3G8 o una de sus versiones humanizadas, por ejemplo, tales como las descritas en la publicación de la solicitud de patente de E.U.A. 2004/0010124 que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Se contempla que, para algunos propósitos, puede ser ventajoso utilizar proteínas de unión CD16A que se unen al receptor CD16A en el mismo epítopo unido a través de 3G8, o por lo menos lo suficientemente cerca de este epítopo para bloquear la unión a través de 3G8. Los métodos para el mapeo de epítopo y los experimentos de unión competitivos para identificar proteínas de unión con las propiedades de unión deseadas son bien conocidos por el experto en la técnica de inmunología experimental. Ver, por ejemplo, Harlow and La e, citado sup_ra; Stáhli et al. (1983) "Distinction Of Epitopes By Monoclonal Antibodies" , Methods in Enzymology 92:242-253; Kirkland et al. (1986) "Analysis Of The Fine Specificity And Cross-Reactivity Of Monoclonal Anti-Lipid A Antibodies" , J. Immunol . 137:3614-3619; Morel et al. (1988) "Monoclonal Antibodies To Bovine Serum Albumin: Affinity And Specificity Determinations" , Molec. Immunol. 25:7-15; Cheung et al. (1990) "Epitope-Specific Antibody Response To The Surface Antigen Of Duck Hepatitis B Virus In Infected Ducks" , Virology 176:546-552; y Moldenhauer et al. (1990) "Jdentity Of HML-I Antigen On Intestinal Intraepithelial T Cells And Of B-lyl Antigen On Hairy Cell Leukaemia" , Scand. J. Immunol . 32:77-82. Por ejemplo, es posible determinar si dos anticuerpos se unen en el mismo sitio mediante el uso de uno de los anticuerpos para capturar el antígeno en una placa ELISA y después medir la habilidad del segundo anticuerpo para unirse al antígeno capturado. La comparación de los epítopos también puede lograrse a través de la marcación de un primer anticuerpo, directa o indirectamente, con una enzima radionúclidos o fluoróforo, inhibir la habilidad de un segundo anticuerpo no marcado para inhibir la unión del primer anticuerpo al antígeno en las células, en solución, o en fase sólida.

También es posible medir la habilidad de los anticuerpos para bloquear la unión del receptor CD16A a complejos inmunitarios formados en placas ELISA. Tales complejos inmunitarios se forman primero recubriendo la placa con un antígeno tal como fluoresceína, después aplicando un anticuerpo anti-fluoresceína específico a la placa. El complejo inmunitario después sirve como el ligando para los receptor Fe solubles tales como sFcRIIIa. Alternativamente, un complejo inmunitario soluble puede formarse y marcarse, directa o indirectamente, con una enzima, radionúclidos o fluoróforo. La habilidad de los anticuerpos para inhibir la unión de estos complejos inmunitarios marcados para receptores Fe en las células, en solución, en fase sólida puede después medirse.

Las proteínas de unión CD16A de la invención pueden o no pueden comprender una región Fe de inmunoglobuli a humana. Las regiones Fe no están presentes, por ejemplo, en proteínas de unión scFv. Las regiones Fe están presente, por ejemplo, en anticuerpos IgG monoclonales tetraméricos humanos o humanizados. Como se describe supra, en algunas modalidades de la presente invención, las proteínas de unión CD16A incluyen una región Fe que tiene una función efectora alterada, por ejemplo, afinidad reducida para un ligando efecto tal como el receptor Fe o el componentes Cl del complemento comparado con la región Fe sin alterar (por ejemplo, Fe de proteínas IgGl de existencia natural) . En una modalidad, la región Fe no está glicosilada en el aminoácido de la región Fe correspondiente a la posición 297. Tales anticuerpos carecen de la función efectora Fe.

De esta forma, la proteína de unión CD16A puede no exhibir la unión mediada por Fe para un ligando efector tal como un receptor Fe o el componente Cl del complemento debido a la ausencia del dominio Fe en la proteína de unión mientras, en otros casos, la falta de la unión o la función efectora se debe a una alteración en la región constante del anticuerpo .

Proteínas de Unión CD16A que Comprenden Secuencias CDR Similares a una Secuencia CDR mAb 3G8 Las proteínas de unión CD16A también pueden utilizarse en la práctica de la invención que incluyen proteínas que comprenden CDR derivada de (es decir, que tienen una secuencia que es igual a o similar) a las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón 3G8. Los ADNc complementarios codifican las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera del anticuerpo monoclonal 3G8 de ratón, incluyendo las secuencias de codificación CDR, en donde se clonan y secuencian como se describe. El ácido nucleico y las secuencias de proteína de 3G8 son provistas a continuación. El uso de la región variable de ratón y las secuencias CDR, un gran número de anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden regiones determinantes de complementariedad derivadas de CDR 3G8 se producen y sus propiedades se analizan. Para identificar los anticuerpos humanizados que se unen a CD16A con alta afinidad y tienen otras propiedades deseables, las cadenas pesadas y el anticuerpos que comprende la región VH con CDR derivadas de 3G8 se produjeron y combinaron (a través de co-expresión) con cadenas ligeras del anticuerpo que comprenden una región VL con CDR derivadas de 3G8 para producir un anticuerpo tetramérico para análisis. Las propiedades de los anticuerpos tetraméricos resultantes se determinaron como se describe a continuación. Como se describe a continuación, las proteínas de unión CD16A que comprenden CDR 3G8 , tales como las proteínas de anticuerpo humanizadas descritas en la presente, pueden utilizarse de acuerdo con la invención.

REGION VH En un aspecto, la proteína de unión CD16A de la invención puede comprender un dominio variable de cadena pesada en donde por lo menos una CDR (y usualmente tres CDR) tienen la secuencia de una CDR (y más típicamente las tres CDR) de la cadena pesada 3G8 del anticuerpo monoclonal de ratón y para el cual las porciones restantes de la proteína de unión son sustancialmente humanas (derivadas de y sustancialmente similares a la región variable de cadena pesada del anticuerpo o anticuerpos humanos) .

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo 3G8 humanizado o un fragmento de anticuerpo que contiene CDR derivado del anticuerpo 3G8 en una cadena principal sustancialmente humana, pero en la cual por lo menos una de las CDR del dominio variable de cadena pesada difiere en secuencia de la CDR de cadena pesada del anticuerpo 3G8 de ratón correspondiente. Por ejemplo, en una modalidad, la CDR(S) difiere de la secuencia CDR 3G8 en al menos una que tiene una o más sustituciones mostradas conocidas en la técnica que afectan la unión de 3G8 a CD16A, como se conoce en la técnica o como se describe en las Tablas 3 y 4A-4H. Las proteínas de unión CD16 adecuadas pueden comprender 0, 1, 2, 3, 0 4, o más de estas funciones (por lo general tienen de 1 a 4 de estas sustituciones) , y onalmente tienen sustituciones adicionales también.

Tabla 3. Sustitución del Domino VH No. Posición Kabat Región Sustituciones 1 2 FR1 lie 2 5 FR1 Lys 3 10 FR1 Thr 4 30 FR1 Arg 5 34 CDR1 Val 6 50 CDR2 Leu 7 52 CDR2 Phe o Tyr o Asp No. Posición Kabat Región Sustituciones 8 54 CDR2 Asn 9 60 CDR2 Ser 10 62 CDR2 Ser 11 70 FR3 Thr 12 94 FR3 Gln o Lys o Ala o His 13 99 CDR3 Tyr 14 101 CDR3 Asp Tabla 4A. Secuencia VH derivada de VH 3G8* FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 3G8VH A A A A A A A Ch3G8VH A A A A A A B HxC B B B A A A B CxH A A A A B A B HU358VH-1 B A B A B A B HU358VH-2 C A B A B A B HU358VH-3 D A B A B A B Hu358VH-4 B A B A C A B HU358VH-5 B A B A C B B HU358VH-6 B B B A B A B HU358VH-7 B B B A B C B Hu358VH-8 B A B A B B B HU358VH-9 B A B B B B B HU358VH-10 B A B A B A B Hu358VH-ll B A B B B A B HU358VH-12 B A B C B A B HU358VH-13 B A B D B A B HU358VH-14 B A B E B A B HU358VH-15 B A B A D A B HU358VH-16 B A B A E A B HU358VH-17 B A B A F A B FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 HU358VH-18 B A B A G A B HU358VH-19 B A B A C C B Hu358VH-20 B B B C B A B HU358VH-21 B B B C D B B Hu358VH-22 B B B C B C B HU358VH-23 B B B C E C B HU358VH-24 B B B C F C B HU358VH-25 B B B C G C B HU358VH-26 B B B C C C B Hu358VH-27 B B B C E D B HU358VH-28 B B B C F D B Hu358VH-29 B B B C G D B HU358VH-30 B B B C C D B HU358VH-31 E B B C B A B HU358VH-32 E B B H B A B Hu358VH-33 E B B H B A B HU358VH-34 E B B C B C B Hu358VH-35 E B B C C C B Hu358VH-36 E B B H c D B HU358VH-37 E B B H E C B HU358VH-38 E B B F B A B HU358VH-39 E B B I B A B HU358VH-40 E B B G B A B FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 HU358VH-41 I B B J B A B HU358VH-42 E B B C H A B HU358VH-43 E B B C H C B HU358VH-44 E B B c I D B Hu358VH-45 E B B c J D B * Las letras en la Tabla 4A se refieren a secuencias en las Tablas 4B-4H.

Tabla 4B: FR1 A B C D E RESIDUO Q Q Q Q Q 1 V V V V I 2 T T T T T 3 L L L L L 4 K R K R K 5 E E E E E 6 S S S S S 7 G G G G G 8 P P P P P 9 G A A A T 10 I L L L L 11 L V V V V 12 Q K K K 13 P P P P P 14 s T T T T 15 Q Q Q Q Q 16 T T T T T 17 L L L L L 18 S T T T T 19 L L L L L 20 T T T T T 21 C C c C C 22 S T T T T 23 F F F F F 24 S S s S S 25 G G G G G 26 F F F F F 27 S S S S S 28 L L L L L 29 R S S R S 3 0 03 104 105 106 107 SEC ID NO.

SEC ID NO. Secuencia 103 QVTLKESGPGI LQPSQTLSLTCSFSGFSLR 104 QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLS 105 QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLS 106 QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLR 107 QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLS Tabla 4C: CDR1 Tabla 4D: FR2 A B RESIDUO W W 36 I I 37 R 38 Q Q 39 P P 40 S P 41 G G 42 K 43 G A 44 L L 45 E E 46 W W 47 L L 48 A A 49 108 109 SEC ID NO.

Tabla 4E. CDR2 SEC ID NO. Secuencia 112 HIWWDDDKRY PALKS 113 HIYWNDDKRY PALKS 114 HIWWDDDKRYSPSLKS US HIYWDDDKRY PALKS 116 HIWWNDDKRYNPALKS 117 LIDWDDDKRYSPSLKS 118 HIFWDDDKRYSPSLKS 119 LIWWDDDKRYSPSL S 120 HIDWDDD RYSPSLKS 121 LIWWNDDKRYSPSLKS Tabla 4F: FR3 A B C D E F G H I J RESIDUO R R R R R R R R R R 66 L L L L L L L L L L 67 T T T T T T T T T T 68 I I I I I I I I I I 69 s s s s s s s s s s 70 K K K K K K K K K K 71 D D D D D D D D D D 72 T T T T T T T T T T 73 S S s s s S s S S s 74 S K K K K K K K K K 75 N N N N N N N N N N 76 Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q 77 V V V V V V V V V V 78 F V V V V V V V V V 79 L L L L L L L L L L 80 K T T T T T T T T T 81 I M M M M M H H M M 82 A T T T T T T T T T 82A S N N N N N N N N N 82B V M M M M M M M M M 82C D D D D D D D D D D 83 A B C D E F G H I J RESIDUO T P P P P P P P P P 84 A V V V V V V V V V 85 Ú D D D D D D D D D D 86 T T T T T T T T T T 87 A A A A A A A A A A 88 T T T T T T T T T T 89 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 90 y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 91 c c C c C c C c C c 92 A A A A A A A A A A 93 Q R Q T K A H R H Q 94 22 123 124 125 126 127 128 129 130 131 82 SEC ID NO. 32 133 134 135 136 137 138 139 140 141 82A SEC ID NO. 42 143 144 145 146 147 148 149 150 151 82B SEC ID NO. 52 153 154 155 156 157 158 159 160 161 82C SEC ID NO.

SEC ID Secuencia NO. 122 RLTISKDTSSNQVFLKIDTADTATYYCAQ 123 RLTISKDTSKNQWLTMDPVDTATYYCAR 124 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAQ 125 RL ISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAT 126 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAK 127 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAA 128 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAH 129 RLTITKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAR 130 RLTITKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAH 131 RLTITKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAQ 132 RLTISKDTSSNQVFLKADTADTAT YCAQ 133 RLTISKDTSKNQVVLTTDPVDTATYYCAR 134 RLTISKDTSKNQVVLTTDPVDTATYYCAQ 135 RLTISKDTSKNQVVLTTDPVDTATYYCAT 136 RLTISKDTSKNQVVLTTDPVDTATYYCAK 137 RLTISKDTSKNQVVLTTDPVDTATYYCAA 138 RLTISKDTSKNQVVLTTDPVDTATYYCAH 139 RLTITKDTSKNQVVLTTDPVDTATYYCAR 140 RLTITKDTSKNQVVLTTDPVDTATYYCAH 141 RLTITKDTSKNQVVLTTDPVDTATYYCAQ 142 RL ISKDTSSNQVFLKSDTADTATYYCAQ 143 RLTISKDTSKNQ VLTNDPVDTATYYCAR 144 RLTISKDTSKNQVVLTNDPVDTATYYCAQ 145 RLTISKDTSKNQVVLTNDPVDTATYYCAT 146 RLTISKDTSKNQVVLTNDPVDTATYYCAR 147 RLTISKDTSKNQ VLTNDPVDTATYYCAA 148 RLTISKDTSKNQVVLTNDPVDTATYYCAR 149 RLTITKDTSKNQVVLTNDPVDTATYYCAR 150 RLTITKDTSKNQVVLTNDPVDTATYYCAH 151 RLTITKDTSKNQVVLTNDPVDTATYYCAQ 15 RLTISKDTSSNQVFLKVDTADTAT YCAQ 153 RLTISKDTSKNQWLTMDPVDTATYYCAR 154 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAQ 155 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYC T 156 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAK 157 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAA 158 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAH 159 RLTITKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAR 160 RLTITKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAH 161 RLTITKDTSKNQ VLTMDPVDTATYYCAQ Tabla 4G. CDR3 Tabla 4H. FRA SEC Secuencia NO. 166 WGQGTLVTVSA 167 WGQGTLVTVSS En una modalidad, una proteína de unión CD16A puede comprender una secuencia del domino variable de cadena pesada que es igual a o similar a, el dominio VH del constructo Hu3G8VH-l, la secuencia de la cual es provista en SEC ID NO: 68. Por ejemplo, la invención proporciona una proteína de unión CD16A que comprende un dominio VH con la secuencia que (1) difiere del dominio VH de Hu3G8VH-l (SEC ID NO: 68) en cero, uno o más de uno de las sustituciones CDR establecidas en la Tabla 1; (2) difiere del dominio VH de Hu3G8VH-l en cero, una o más de una de las sustituciones de cadena principal establecidas en la Tabla 1; y (3) es al menos aproximadamente 80% idéntica, por lo general al menos aproximadamente 90% y algunas veces al menos aproximadamente 95% idéntica, o aún al menos 98% idéntica a la secuencia Hu3G8VH-l en las posiciones restantes.

Los dominios VH ilustrativos de las proteínas de unión CD16 de la invención tienen la secuencia de 3G8VH, Hu3G8VH-5 y Hu3G8VH-22 (SEC ID NO: 79, SEC ID NO: 69 y SEC ID NO: 70, respectivamente) . Las secuencias de nucleótido ilustrativas que codifican las secuencias de 3G8VH y Hu3G8VH-5 (SEC ID NO: 79 y SEC ID NO: 69, respectivamente) son provistas con SEC ID NO: 80 y SEC ID NO: 81, respectivamente.

El dominio VH puede tener una secuencia que difiere de la de Hu3G8VH-l (SEC ID NO: 68) en al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos 4, al menos 5, o al menos 6 de las sustituciones mostradas en la Tabla 3. Estas sustituciones se cree que resultan en una actividad incrementada para CD16A y/o reduce la inmunogenicidad de la proteína de unión CD16A cuando se administra a humanos. En ciertas modalidades, el grado de identidad de secuencia con el dominio VH Hu3G8VH-l en las posiciones restantes es al menos de aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 98%.

Para ilustración y no limitación, las secuencias de un número de dominios VH de la proteína de unión CD16A se muestran en la Tabla 4. Las cadenas pesadas comprenden estas secuencias fusionadas a una región constante Cyl humana que se co-expresaron con la cadena ligera hu3G8VL-l (descrita a continuación) para formar anticuerpos tetraméricos , y la unión de los anticuerpos a CD16A se midió para evaluar el efecto de las sustituciones de aminoácido comparadas con el dominio VH hu3G8VH-l. Los constructos en donde el dominio VH tiene la secuencia de hu3G8VH-l, 2, 3, 4, 5, 8, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 42, 43, 44 y 45 mostraron una alta unión de afinidad, con los dominios VH hu3G8VH-6 y -40 mostrando la unión intermedia. Las proteínas de unión CD16A que comprenden los dominios VH de hu3G8VH-5 y hu3G8VH-22 (SEC ID NO: 69 y SEC ID NO: 70, respectivamente) se considera que tienen particularmente favorables propiedades de unión.

REGION VL Se condujeron estudios similares para identificar las secuencias del dominio variable de cadena ligera con favorables propiedades de unión. En un aspecto, la invención proporciona una proteína de unión CD16A que contiene un dominio variable de cadena ligera en donde por lo menos una CDR (y usualmente 3 CDR) tienen la secuencia de una CDR (más típicamente las tres CDR) de la cadena ligera del anticuerpo 3G8 monoclonal de ratón y para el cual las porciones restantes de la proteína de unión son sustancialmente humanas (derivadas de y sustancialmente similares a, la región variable de cadena pesada de un anticuerpo o anticuerpos humanos) .

En un aspecto, la invención proporciona un fragmento de una CDR que contiene el anticuerpo 3G8 humanizado derivada el anticuerpo 3G8 en una cadena principal sustancialmente humana, pero en la cual al menos una de las CDR del dominio variable de cadena ligera difiere en secuencia de la CDR de cadena ligera del anticuerpo 3G8 monoclonal de ratón. En una modalidad, las CDR(s) difieren de la secuencia 3G8 en por lo menos teniendo una o más sustituciones de aminoácido en una CDR, tal como, una o más sustituciones mostradas en la Tabla 12 (por ejemplo, arginina en la posición 24 y en CDR1 ; serina en la posición 25 en CDR1; tirosina en la posición 32 en CDR1 ; leucina en la posición 33 en CDR1 ; ácido aspártico, triptófano o serina en la posición 50 en CDR2 ; serina en la posición 53 en CDR2 ; alanina o glutamina en la posición 55 en CDR2 ; treonina en la posición 56 en CDR2 ; serina en la posición 93 in CDR3 ; y/o treonina en la posición 94 en CDR3) . En varias modalidades, el dominio variable puede tener 0, 1, 2, 3, 4, 5, o más de estas sustituciones (y por lo general tiene de 1 a 4 de estas sustituciones) y opcionalmente , puede tener sustituciones adicionales también.

En una modalidad, una proteína de unión CD16A adecuada puede comprender una secuencia del dominio variable de cadena ligera que es igual, o similar a, el dominio VL del constructo Hu3G8VL-l (SEC ID NO: 71) , la secuencia del cual es provista en la Tabla 6. Por ejemplo, la invención proporciona una proteína de unión CD16A que comprende un dominio VL con una secuencia que (1) difiere del dominio VJ de Hu3G8VL-l (SEC ID NO: 71) en cero, una, o más de las sustituciones CDR establecidas en la Tabla 5; (2) difiere del domino VL de Hu3G8VL-2 en cero, una o más de las sustituciones de cadena principal establecidas en la Tabla 5; y (3) es al menos aproximadamente 80% idéntica, por lo general al menos aproximadamente 90%, y algunas veces al menos 95% idéntica, o aún al menos 98% idéntica a la secuencia Hu3G8VL-l VL (SEC ID NO: 71) en las posiciones restantes.

Tabla 5. Sustituciones del Dominio VL 3G8 Tabla 6. Secuencias VL derivadas de VL 3G8* FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 3G8VL A A A A A A A Ch3G8VL A A A A A. A A Hu3G8VL-l B A A A B A B Hu3G8VL-2 B B A A B A B Hu3G8VL-3 B C A A B A B Hu3G8VL-4 B D A A B A B Hu3G8VL-5 B E A A B A B Hu3G8VL-6 B F A A B A B Hu3G8VL-7 B G A A B A B Hu3G8VL-8 B A A B B A B Hu3G8VL-9 B A A C B A B Hu3G8VL-10 B A A D B A B Hu3G8VL-l l B A A E B A B Hu3G8VL-12 B A A F B A B Hu3G8VL-13 B A A G B A B Hu3G8VL-14 B A A A B B B Hu3G8VL-15 B A A A B C B Hu3G8VL-16 B A A A B D B Hu3G8VL-17 B A A A B E B Hu3G8VL-18 B B A D B A B Hu3G8VL-19 B B A D B D B FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 Hu3G8VL-20 B B A D B E B Hu3G8VL-21 B C A D B A B Hu3G8VL-22 B C A D B D B Hu3G8VL-23 B C A D B E B Hu3G8VL-24 B D A D B A B Hu3G8VL-25 B D A D B D B Hu3G8VL-26 B D A D B E B Hu3G8VL-27 B E A D B A B Hu3G8VL-28 B E A D B D B Hu3G8VL-29 B E A D B E B Hu3G8VL-30 B A A D B D B Hu3G8VL-31 B A A D B E B Hu3G8VL-32 B A A H B A B Hu3G8VL-33 B A A I B A B Hu3G8VL-34 B A A J B A B Hu3G8VL-35 B B A H B D B Hu3G8VL-36 B C A H B D B Hu3G8VL-37 B E A H B D B Hu3G8VL-38 B B A I B D B Hu3G8VL-39 B C A I B D B Hu3G8VL-40 B E A I B D B Hu3G8VL-41 B B A J B D B Hu3G8VL-42 B C A J B D B Hu3G8VL-43 B E A J B D B Hu3G8VL-44 B A A K B A B * Las letras en la Tabla 6A se refieren a secuencias en las Tablas 6B-H.

Tabla 6B. FRI Tabla 6C. CDR1 SECID Secuencia NO. 170 KASQDGDSFMN 171 RASQDGDSFMN 172 KSSQDGDSFMN 173 KASQDGDSYMN 174 KASQDGDSFLN 175 KASQDGDSFMA 176 KASQDGDSYLA 177 KASSDGDSFMN 178 RASSDGDSFMN 179 KSSSDGDSFMN 180 KASSDGDSYMN 181 KASSDGDSFLN 182 KASSDGDSFMA 183 KASSDGDSYLA 184 KASVDGDSFMN 185 RASVDGDSFMN 186 KSSVDGDSFMN 187 KASVDGDSYMN 188 KASVDGDSFLN 189 KASVDGDSFMA 190 KASVDGDSYLA 191 KASDDGDSFMN 192 RASDDGDSFMN 193 KSSDDGDSFMN 194 KASDDGDSYMN 195 KASDDGDSFLN 196 KASDDGDSFMA 197 KASDDGDSYLA 198 KASFDGDSFMN 199 RASFDGDSFMN 200 KSSFDGDSFMN 201 KASFDGDSYMN 202 KASFDGDSFLN 203 KASFDGDSFMA 204 KASFDGDSYLA Tabla 6D. FR2 Tabla 6E. CDR2 A B C D E F G H I J K RESIDUO T D W T D D S S s T T 50 T A A T A A A T T T T 51 s S S s S S S S s S s 52 N H N N N N N N N N N 53 L L L L L L L L L L L 54 ? E E E E A Q E Q Q Q 55 S S S T T T S S S S S 54 06 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 SEC ID NO SEC ID Secuencia NO. 206 TTSNLES 207 DASNLES 208 WASNLES 209 TTSNLET 210 DASNLET 211 DASNLAT 212 SASNLQS 213 STSNLES 214 STSNLQS 215 TTSNLQS 16 TTSSLQS Tabla 6F: FR3 A B RESIDUO G G 57 I V 58 P P 59 A D 60 R R 61 A B RESIDUO F F 62 S S 63 A G 64 5 S S 65 G G 66 S S 67 G G 68 T T 69 10 D D 70 F F 71 T T 72 L L 73 N T 74 I I 75 H s 76 SEQ ID SECUENCIA NO, 217 GIPARFSASGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYC 218 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC Tabla 6G: CDR3 SEQ ÍD SECUENCIA NO. 224 FGGGTKLEIK 225 FGQGTKLE'ÍK Los dominios VL ilustrativos de las proteínas de unión CD16 de la invención tienen la secuencia de 3G8VL, HU3G8VL-1 o HU3G8VL-43, (SEC ID NO: 82, SEC ID NO: 71 y SEC ID NO: 72, respectivamente) como se muestra en las Tablas 5 y 6. Las secuencias de nucleótido ilustrativas que codifican 3G8VL (SEC ID NO: 82) y Hu3G8VL-l (SEC ID NO: 71) son provistas en SEC ID NO: 83 y SEC ID NO: 84, respectivamente.

El domino VL puede tener una secuencia que difiere de la de Hu3G8VL-l (SEC ID NO: 71) en cero, uno, o por lo menos dos, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, o al menos 9 de las sustituciones mostradas en la Tabla 2. Estas sustituciones se cree que resultan en una afinidad aumentada para CD16A y/o reducen la inmunogenicidad de la proteína de unión CD16A cuando se administra a humano. En ciertas modalidades, el grado de identidad de secuencia en las posiciones restantes es al menos de aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90% al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 98%.

Para ilustración y no limitación, las secuencias de un número de dominios VL de proteínas de unión CD16A se muestran en la Tabla 6. Las cadenas ligeras comprenden estas secuencias fusionadas a un dominio constante CK humano, que se co-expresan con una cadena pesada Hu3G8VH (descrita anteriormente) para formar anticuerpos tetraméricos , y la unión de los anticuerpos a CD16A se midió para evaluar el efecto de las sustituciones de aminoácido comparadas con el dominio VL Hu3G8VL-l (SEC ID NO: 71) . Los constructos en donde el dominio VL tiene la secuencia de hu3G8VL-l, 2, 3, 4, 5, 10, 16, 18, 19, 21, 22, 24, 27, 28, 32, 33, 34, 35, 36, 37, y 42 mostraron una alta unión de afinidad y hu3G8VL-15, 17, 20, 23, 25, 26, 29, 30, 31, 38, 39, 40 y 41 mostraron proteínas de unión a CD16A de unión intermedias que comprenden los dominios VL de hu3G8VL-l, hu3G8VL-22, y hu3G8VL-43 que se considera que tienen propiedades de unión particularmente favorables (SEC ID NO: 71, SEC ID NO: 73 y SEC ID NO: 72, respectivamente) .

COMBINACION DE LOS DOMINIOS VL Y/O VH Como se conoce en la técnica se describe en cualquier lugar en la presente, las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina pueden recombinantemente expresarse bajo condiciones en donde se asocian para producir un diacuerpo, que pueden combinarse in vitro. De esta forma se apreciará que un domino VL derivado de 3G8 descrito en la presente puede ser un domino VL derivado de 3G8 combinado descrito en la presente para producir un diacuerpo de unión CD16A y todas tales combinaciones se contemplan.

Para ilustración y no para limitación, los ejemplos de diacuerpos CD16A útiles son los que comprenden por lo menos un dominio de VH y por lo menos un dominio VL, en donde el dominio VH es de hu3G8VH-l, hu3G8VH-22 o hu3G8VH-5 (SEC ID NO: 68, SEC ID NO: 70 y SEC ID NO: 69, respectivamente) y el dominio VL es de hu3G8VL-l, hu3G8VL-22 o hu3G8VL-43 (SEC ID NO: 71, SEC ID NO: 73 y SEC ID NO : 41, respectivamente) . En particular, los anticuerpos humanizados que comprenden hu3G8VH-22 (SEC ID NO : 22) y cualquier, hu3G8VL-l, hu3G8VL-22 o hu3G8VL-43 (SEC ID NO: 71, SEC ID NO: 70 y SEC ID NO: 72, respectivamente) , o hu3G8VH-5 (SEC ID NO: 69) y hu3G8VL-l (SEC ID NO: 71) tienen propiedades favorables.

Se apreciará por el experto en la técnica que las secuencias de los dominios VL y VH descritos en la presente además pueden modificarse a través de métodos conocidos tal como maduración por afinidad (ver, Schier et al. (1996) " Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-ErbB-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementar! ty Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site", J. Mol. Biol. 263:551-567; Daugherty et al. (1998) "Antibody Affinity Maturation Using Bacterial Surface Display" , Protein Eng. 11:825-832; Boder et al. (1997) "Yeast Surface Display For Screening Combinatorial Polypeptide Librarles", Nat . Biotechnol. 15:553-557; Boder et al. (2000) "Directed Evolution Of Antibody Fragmente With Monovalent Fe tomolar Antigen-Binding Affinity" , Proc . Nati. Acad. Sci. U.S. A 97:10701-10705; Hudson et al. (2003) "Engineered Antibodies" , Nature Medicine 9:129-39). Por ejemplo, las proteínas de unión CD16A pueden modificarse utilizando técnicas de maduración por afinidad para identificar proteínas con una afinidad aumentada para CD16A y/o afinidad disminuida para CD16B.

Una proteína de unión CD16 ilustrativo es el anticuerpo 3G8 de ratón. La secuencia de aminoácido que comprende los dominios VH y CL de 3G8 humanizado se describen en las Figuras 2, 9, 14 y se establecen en SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO : 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 68, SEC ID NO: 69, SEC ID NO: 70, SEC ID NO : 71 y SEC ID NO: 72.

Diacuerpos que Comprenden Fe o sus Porciones La invención abarca moléculas y diacuerpo que comprenden dominios Fe o sus porciones (por ejemplo, un dominio CH2 o CH3) . En ciertas modalidades, el dominio Fe, o sus porciones, comprende uno o más dominios (s) constante de la región Fe de IgG2, IgG3 o IgG4 (por ejemplo, CH2 o CH3). En otras modalidades, la invención abarca moléculas que comprenden un dominio Fe o una de sus porciones, en donde el dominio Fe o una de sus porciones comprende por lo menos una modificación de aminoácido (por ejemplo, sustitución) con relación al dominio Fe de tipo silvestre comparable o una de sus porciones. Los dominios Fe variables son bien conocidos en la técnica, y se usan principalmente para alterar el fenotipo del anticuerpo que comprende el dominio Fe variante según se ensaya en cualquier actividad de unión o ensayos de función efectora conocidos en la técnica, por ejemplo, ELISA, análisis SPR, o ADCC. Tales dominios Fe variantes, o sus porciones, tienen uso en la presente invención al conferir o modificar la función efectora exhibida por una molécula diacuerpo de la invención que comprende un dominio Fe (o una de sus porciones) como se ensaya funcionalmente , por ejemplo, en un ensayo dependiente de NK o de macrófago. Las variantes de dominio Fe identificadas como que alteran la función efectora se describen en la solicitud internacional WO04/063351, Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U.A. 2005/0037000 y 2005/0064514, Solicitudes Provisionales de E.U.A. 60/626,510, presentada el 10 de noviembre del 2004, 60/636,663, presentada el 15 de diciembre del 2004, y 60/781,564, presentada el 10 de marzo del 2006, y Solicitudes de Patente de E.U.A. 11/271, 140, presentada el 10 de noviembre del 2005, y 11/305,787, presentada el 15 de diciembre del 2005, solicitudes concurrentes de los Inventores, cada una de las cuales se incorpora por referencia en su totalidad.

En otras modalidades, la invención abarca el uso de cualquier variante Fe conocido en la técnica, tales como las descritas en Duncan et al. (1988) "Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fe Receptor On IgG", Nature 332:563-564; Lund et al. (1991) nHuman Fe Gamma RI And Fe Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG", J. Immunol . 147:2657-2662; Lund et al. (1992) "Múltiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fe Gamma RII", Mol. Immunol. 29:53-59; Alegre et al. (1994) "A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo" , Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al. (1995) "Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-lH" , Proc. Nati. Acad. Sci . U S A 92:11980-11984; Jefferis et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fe Gamma Receptors : The Role Of Glycosylation" , Immunol. Lett. 44: 111-117; Lund et al. (1995) "Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recogni ion By Fe Gamma Receptors", FASEB J. 9:115-119; Jefferis et al. (1996) "Modulation Of Fe (Gamma) R And Human Complement Activation By IgGS-Core Oligosaccharide Interactions" , Immunol. Lett. 54:101-104; Lund et al. (1996) "Múltiple Interactions Of lgg With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fe Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains" , J. Immunol. 157:4963-4969; Armour et al. (1999) "Recombinant Human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Tríggeríng Activities" , Eur. J. Immunol . 29:2613-2624; Idusogie et al . (2000) "Mapping Of The C1Q Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgGl Fe", J. Immunol. 164:4178-4184; Reddy et al. (2000) nElimination Of Fe Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human COA" , J. Immunol. 164:1925-1933; Xu et al. (2000) nIn vitro Characterization Of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies" , Cell. Immunol. 200:16-26; Idusogie et al. (2001) "Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement" , J. Immunol. 166:2571-2575; Shields et al. (2001) "Hig Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgGl For Fe gamma RI, Fe gamma RII, Fe gamma RUI, And FcRn And Design Of IgGl Variante With Improved Binding To The Fe gamma R" , J. Biol . Chem. 276:6591-6604; Jefferis et al. (2002) "Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models" , Immunol. Lett. 82:57-65; Presta et al. (2002) nEngineering Therapeutic Antibodies For Improved Function", Biochem. Soc . Trans . 30:487-490); US 5,624,821; US 5,885,573; US 6,194,551; PCT WO 00/42072; PCT WO 99/58572; cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

En ciertas modalidades, la una o más modificaciones a los aminoácidos de la región Fe reducen la afinidad y la avidez de la región Fe y, de esta forma, la molécula del diacuerpo de la invención, para uno o más receptores FcyR. En una modalidad específica, la invención abarca diacuerpos que comprenden una región Fe variante, o una de sus porciones, en donde la región Fe variante comprende al menos una modificación de aminoácido con relación a la región Fe de tipo silvestre, cuya región Fe variante solamente se une a un FcyR, en donde el FcyR es FCYRIIIA. En otra modalidad específica, la invención abarca diacuerpos que comprenden una región Fe variante, o una de sus porciones, en donde la región Fe variante comprende al menos una modificación de aminoácido con relación a la región Fe de tipo silvestre, cuya región Fe variante solamente se une a un FcyR, en donde el FcyR es FcyRIIA. En otra modalidad específica, la invención abarca diacuerpos que comprenden una región Fe variante, o una de sus porciones, en donde la región Fe variante comprende al menos una modificación de aminoácido con relación a la región Fe de tipo silvestre, cuya región Fe variante solamente se une a un FcyR, en donde el FcyR es FcyRIIB. En ciertas modalidades, la invención abarca moléculas que comprenden un dominio Fe variante en donde la variante confiere o media la actividad ADCC aumentada y/o una unión incrementada a FcyRIIA (CD32A) , con relación a una molécula que no comprende un dominio Fe o que comprende un dominio Fe de tipo silvestre, según medido utilizando métodos conocidos por el experto en la técnica y descritos en la presente. En modalidades alternativas, la invención abarca moléculas que comprenden un dominio Fe variante en donde la variante confiere o media la actividad ATCC disminuida (u otra función efectora) y/o una unión incrementada a FCYRIIB (CD32B) , con relación a una molécula que no comprende un dominio CF o que comprende un dominio de tipo silvestre, según medido utilizando métodos conocidos por el experto en la técnica y descritos en la presente.

La invención también abarca el uso de un dominio Fe que comprende dominios o regiones de dos o más isotipos IgG. Como se conoce en la técnica, las modificaciones de aminoácido de la región Fe pueden profundamente afectar la función efectora mediada por Fe y/o la actividad de unión. Sin embargo, estas alteraciones en características funcionales pueden ser además refinadas y/o manipuladas cuando se implementan en el contexto de isotipos IgG seleccionados. Similarmente, las características nativas de Fe isotipo pueden manipularse a través de una o más modificaciones de aminoácido. Los múltiples isotipos IgG (es decir, IgGl, IgG2, IgG3 y IgG4) exhiben diferentes propiedades físicas y funcionales que incluyen la vida media en suero, fijación de complemento, afinidad de unión FcyR y afinidades de función efectora (por ejemplo, ADCC, CDC) debido a las diferencias en las secuencias de aminoácido de sus dominios de bisagra y/o Fe. En ciertas modalidades, la modificación de aminoácido y la región Fe de IgG se seleccionan independientemente con base en sus actividades respectivas, la unión separada y/o función efectora con el fin de modificar un diacuerpo con las características deseadas. En la mayor parte de las modalidades, tales modificaciones de aminoácido y las de las regiones de bisagra/Fc IgG han sido ensayadas de manera separada para la actividad de la unión y/o función efectora como se describe en la presente o se conoce en la técnica en el contexto de un IgGl . En ciertas modalidades, la modificación de aminoácido y la región de bisagra/Fc IgG despliegan una funcionalidad similar, por ejemplo, afinidad aumentada para FCYRIIA, cuando se ensayan de manera separada para la unión de FcyR por la función efectora en el contexto de la molécula diacuerpo u otra molécula que contiene Fe (por ejemplo, e inmunoglobulina) . La combinación de la modificación de aminoácido y la región Fe IgG seleccionada entonces actúan de manera aditiva o, más preferiblemente, sinérgicamente para modificar la funcionalidad en la molécula del diacuerpo de la invención, con relación a la molécula de diacuerpo de la invención que comprende una región Fe de tipo silvestre. En otras modalidades, la modificación de aminoácido y las regiones Fe IgG despliegan funcionalidades opuestas, por ejemplo, afinidad para FcyRIIA, aumentada y disminuida, respectivamente, cuando se ensaya de manera separada para la unión de FcyR y/o la función efectora en el contexto de la molécula de diacuerpo u otra molécula que contiene Fe (por ejemplo, una inmunoglobulina) que comprende una región Fe de tipo silvestre como se describe en la presente o como se en la técnica; la combinación de la modificación de aminoácido "opuesta" y la región IgG seleccionada después actúan para selectivamente templar o reducir una funcionalidad específica en el diacuerpo de la invención con relación a un diacuerpo de la invención que contiene una región Fe o que comprende una región Fe de tipo silvestre del mismo isotipo. Alternativamente, la invención abarca regiones Fe variantes que comprenden combinaciones de modificaciones de aminoácido conocidas en la técnica y regiones IgG seleccionadas que exhiben nuevas propiedades, cuyas propiedades no fueron detectables cuando las modificaciones y/o regiones se ensayaron de manera independiente como se describe en la presente .

Las características funcionales de los múltiples isotipos IgG, y sus dominios, son bien conocidos en la técnica. Las secuencias de aminoácido de IgGl , IgG2, IgG3 e IgG4 se presentan en las Figuras 1A-1B. La selección y/o combinación de dos o más dominios de isotipos IgG específicos para utilizarse en los métodos de la invención pueden basarse en cualquier parámetro conocido de los isotipos progenitores que incluyen afinidad a FcyR (Tabla 7; Flesch et al. (2000) "Functions Of The Fe Receptors For Immunoglobulin G" , J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156; Chappel et al. (1993) "Identification Of A Secondary Fe Gamma RI Binding Site Within A Genetically Engineered Human IgG Antibody" , J. Biol . Chem. 33:25124- 25131; Chappel et al. (1991) "Identification Of The Fe Gamma Receptor Class I Binding Site In Human IgG Through The Use Of Recombinant IgGl/IgG2 Hybrid And Point-Mutated Antibodies" , Proc . Nati. Acad. Sci. USA 88:9036-9040, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad) . Por ejemplo, el uso de regiones o dominios e isotipos IgG que exhiben una unión limitada o ninguna unión a FcyRIIB, por ejemplo, IgG2 o IgG4 , puede encontrar uso particular cuando se desea modificar un diacuerpo para maximizar la unión a un receptor de activación y minimizar la unión a un receptor inhibidor. Similarmente , el uso de regiones o dominios Fe de isotipos IgG se sabe que preferencialmente se unen a Clq o FCYRIIIA, por ejemplo, IgG3 (Bruggemann et al. (1987) "Comparison Of The Effector Functions Of Human Immunoglobulins Using A Matched Set Of Chimeric Antibodies" , J. Ex . Med. 166:1351- 1361), pueden combinarse con modificaciones de aminoácido Fe conocidas en la técnica para mejorar ADCC, para modificar una molécula de diacuerpo tal como la actividad de la función efectora, por ejemplo, activación de complemento o ADCC, se maximiza.

Tabla 7. Características Generales de la unión IgG a FcyR, adaptado de Flesch y Neppert, 1999, J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156 A se une solamente a IgG en complejo CONJUGADOS MOLECULARES Las moléculas de diacuerpo de la invención pueden fusionarse recombinantemente o conjugarse químicamente (incluyendo ambas conjugaciones covalentes y no covalentes) a polipéptidos heterólogos (es decir, un polipéptido no relacionado; o una de sus porciones, preferiblemente al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos del polipéptido para generar las proteínas de fusión. La fusión no necesariamente necesita ser directa, pero puede ocurrir a través de secuencias enlazadoras.

Además, las moléculas de diacuerpo de la invención (es decir, polipéptido) pueden conjugarse a un agente terapéutico o una fracción de fármaco que modifica una respuesta biológica. Como una alternativa para la conjugación directa, debido a los múltiples sitios de unión del epítopo en las moléculas de diacuerpo multivalentes , por ejemplo, tetravalente de la invención, por lo menos una región de unión del diacuerpo puede diseñarse para unirse al agente terapéutico o la fracción de fármaco deseada sin afectar la unión del diacuerpo.

Los agentes terapéuticos de las porciones de fármaco no se construyen como limitantes de los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la fracción de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que procesa una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, resina A, pseudomonas de exotoxina (es decir, PE-40) o la toxina de difteria, resina, gelonina, y la proteína antivírica de hierba carmín, una proteína tal como el factor de necrosis tumoral, interferones que incluyen, pero no se limitan a, o¡-interferón ( IFN-OÍ) , ß-interferón (IFN-ß), factor de crecimiento nervioso (NGF) , factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) , activador de plasminógeno tisular (TPA) , un agente apoptótico (por ejemplo, TNF- , TNF-ß, AIM I como se describe en la Publicación PCT No. WO 97/33899) , AIM II (ver, Publicación PCT No. WO 97/34911) , el ligando Fas, y VEGI (Publicación PCT No. WO 99/23105) , un agente trombótico o un agente anti-angiogénico (por ejemplo, angioestatina o endostatina) , o un modificador de la respuesta biológica tal como, por ejemplo, una linfocina (por ejemplo, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulador de colonia de necrófago de granulocito ("GM-CSF"), y factores estimulador de colonia de granulocito ("G-CSF"), factor estimulador de colonia de macrófago, ("M-CSF" ) , o factor de crecimiento (por ejemplo, la hormona de crecimiento ("GH"); proteasas o ribonucleasas.

Las moléculas de diacuerpo de la invención (es decir, polipéptido) pueden fusionarse a secuencias marcadoras, tales como un péptido para facilitar la purificación. En modalidades preferidas, las secuencias de aminoácido marcadoras es un péptido de hexa-histidina, tal como la etiqueta provista en el vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue , Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Como se describe en Gentz et al. (1989) "Bioassay For Trans Activation Using Purified Human Immunodeficiency Virus TAT-Encoded Protein: Trans-Activation Requires mRNA Synthesis" , Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 86:821-824, por ejemplo, la hexa-histidina proporciona la purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas de péptido útiles para la purificación incluye, pero no se limitan a, la etiqueta hemaglutinina, "HA", que corresponde a un epítopo derivado de la proteína de hemaglutinina de influenza (Wilson et al. (1984) "The Structure of An Antigenic Determinant In A Protein" , Cell, 37:767-778) y a la etiqueta "Bandera" (Knappik et al. (1994) "An Improved Affinity Tag Based On The FLAG Peptide For The Detection And Purification Of Recombinant Antibody Fragments" , Biotechniques , 17(4) :754-761) .

Las proteínas de fusión adicionales pueden generarse a través de técnicas de intercambio de gen, intercambio de motivo, intercambio de exón, y/o intercambio de codón (colectivamente referidas como "intercambio de ADN" ) . El intercambio de ADN puede utilizarse para alterar las actividades de las moléculas de la invención (por ejemplo, los sitios de unión del epítopo con afinidades superiores y menores grados de disociación) . Ver, generalmente, Patentes de E.U.A. Nos. 5,605,793; 5,811,238; 5,830,721; 5,834,252; y 5,837,458, and Patten et al. (1997) "Applications Of DNA Shuffling To Pharmaceuticals And Vaccines" , Curr. Opinión Biotechnol . 8:724-733; Harayama (1998) "Artificial Evolution By DNA Shuffling" , Trends Biotechnol. 16:76-82; Hansson et al . (1999) "Evolution Of Differential Substrate Specificities In Mu Class Glutathione Transferases Probed By DNA Shuffling" , J. Mol. Biol . 287:265-276; y Lorenzo et al. (1998) "PCR-Based Method For The Introduction Of Mutations In Genes Cloned And Expressed In Vaccinia Virus", BioTechniques 24:308-313 (cada una de estas patentes y publicaciones se incorporan aquí por referencia en su totalidad) . Las moléculas de diacuerpo de la invención, o los ácidos nucleicos que codifican las moléculas de la invención, pueden además alterarse al ser sometidos a mutagénesis aleatoria a través de PCR propensa a error, inserción de nucleótido aleatoria u otros métodos antes de la recombinación. Una o más porciones del polinucleótido que codifica una molécula de la invención, pueden recombinarse con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc., de una o más moléculas heterólogas .

La presente invención también abarca moléculas de diacuerpo de la invención conjugadas a o que inmunoespecíficamente reconocen un agente de diagnóstico o terapéutico o cualquier otra molécula para la cual se desea que la vida media en suero se aumente/disminuya y/o se activa hacia un subgrupo particular de célula. Las moléculas de la invención pueden utilizarse diagnósticamente para, por ejemplo, monitorear el desarrollo o el avance de una enfermedad, trastorno o infección como parte de un procedimiento de prueba clínico, por ejemplo, para determinar la eficiencia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse a través del acoplamiento de las moléculas de la invención con una sustancia detectable o a través del reconocimiento inmunoespecífico de las moléculas para sustancias detectables . Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes , materiales radioactivos, metales emisores de positrón, y iones metálicos paramagnéticos no radioactivos. La sustancia detectable puede acoplarse o conjugarse ya sea directamente a las moléculas de la invención o indirectamente, a través de un intermediario (tal como, por ejemplo, un enlazador conocido en la técnica) utilizando técnicas conocidas en la técnica, o la molécula puede reconocer inmoespecíficamente la sustancia detectable: unión inmunoespecífica de la sustancia. Ver, por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 4,741,900, para iones metálicos que pueden conjugarse a anticuerpos para utilizarse como diagnósticos de acuerdo con la presente invención. Tal diagnóstico y detección puede lograrse designando las moléculas para reconocer inmunoespecíficamente la sustancia detectable o a través del acoplamiento de las moléculas de la invención a sustancias detectables que incluyen, pero no se limitan a, varias enzimas, enzimas que incluyen, pero no se limitan a, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinaesterasa; complejos de grupos protésicos tales como, pero no limitándose a, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes tales como, pero no limitándose a, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes tales como, pero no limitándose a luminol ; materiales bioluminiscentes tales como, pero no limitándose a, luciferasa, luciferina, y aecuorina; material radioactivo tal como, pero no limitándose a bismuto (213Bi) , carbón (14C) , cromo (51Cr) , cobalto (57Co) , flúor (18F) , gadolinio (153Gd, 159Gd) , galio (68Ga, 67Ga) , germanio (68Ge) , holmio (166Ho) , indio (115In, 113In, 112In, ^??) , yodo (131I, 1251 , 123I, 121I) , lantanio (140La) , lutetio (177Lu) , manganeso (54Mn) , molibdeno (99Mo) , paladio (103Pd) , fósforo (32P) , praseodinio (14 Pr) , prometió (149Pm) , renio (18SRe, 188Re) , rodio (105Rh) , rutenio (9 Ru) , samario (153Sm) , escandio (47Sc) , selenio (75Se) , estroncio (85Sr) , azufre (35S) , tecnecio (99Tc) , talio (201Ti) , estaño (113Sn, 117Sn) , tritio (3H) , xenón (133Xe) , iterbio (169Yb, 175Yb) , itrio (90Y) , zinc (65Zn) ; metales que usan positrón utilizando varias tomografías de emisión de positrón y iones metálicos paramagnéticos no radioactivos.

Las moléculas de diacuerpo de la invención pueden reconocerse inmunoespecíficamente o pueden conjugarse con la fracción terapéutica tal como una citotoxina (por ejemplo, un agente citostático o citocidal) , un agente terapéutico o un elemento radioactivo (por ejemplo, emisores alfa, emisores gama, etc.). Las citotoxinas o agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que es perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides , procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol , y puromicina y sus análogos u homólogos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina) , agentes de alquilación (por ejemplo, meclortamina, tioepa clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclotosfamida, busulfano, dibromomanitol , estreptozotocina, mitomicina C, y cisdiclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatina) , antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC) , y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina) .

Además, una molécula de diacuerpo de la invención pueden conjugarse o diseñarse para reconocer inmunoespecíficamente fracciones terapéuticas tales como materiales radioactivos o quelatadores monocíclicos útiles para conjugar iones de radiómetal (ver anteriormente para ejemplos de materiales radioactivos) . En ciertas modalidades, el quelatador macrocíclico es ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-?,?' ,?" ,?' " -tetraacético (DOTA) que puede unirse al polipéptido a través de una molécula enlazadora. Tales moléculas enlazadoras son comúnmente conocidas en la técnica y se describen en Denardo et al . (1998) "Comparison Of 1, 4, 7, 10-Tetraazacyclododecane-?,?' ,?",?'" -Tetraacetic Acid (DOTA) -Peptide-ChL6, A Novel Immunoconjugate With Catabolizable Linker, To 2-Iminothiolane-2- [p- (hromoacetamido)benzyl] -DOTA-ChL6 In Breast Cáncer Xenografts" , Clin. Cáncer Res. 4:2483-2490; Peterson et al. (1999) "Enzymatic Cleavage Of Peptide-LinkedRadiolabels Fro Immunoconjugates" , Bioconjug. Chem. 10:553-; y Zimmerman et al, (1999) "A Triglycine Linker Improves Tumor Uptake And Biodistributions Of 67-Cu-Labeled Anti- Neuroblastoma mAb chCEl F (ab) '2 Fragments" , Nucí. Med. Biol . 26:943-950 cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

Las técnicas para conjugar las fracciones terapéuticas a polipéptidos , incluyen, por ejemplo, los dominios Fe, que son bien conocidos; ver, por ejemplo, Arnon et al., ^Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), 1985, pp. 243-56, Alan R. Liss, Inc.); Hellstrom et al, "Antibodies For Drug Delivery" , in Controlled Drug Delivery (2a Ed. ) , Robinson et al. (eds.), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc.); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review" , in Monoclonal Antibodies 184 : Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), 1985, pp. 475-506); nAnalysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), 1985, pp. 303-16, Academic Press; and Thorpe et al. (1982) "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates" , Immunol . Rev., 62 : 119-158.

La molécula de diacuerpo de la invención pude administrarse con o sin una fracción terapéutica conjugada a ella, administrarse sola, o en combinación con un factor (s) citotóxico, y/o citocina(s) para utilizarse como un tratamiento. Cuando se administra sola, por lo menos un epítopo de una molécula de diacuerpo multivalente , por ejemplo tetravalente puede diseñarse para reconocer inmunoespecíricamente un agente terapéutico, por ejemplo, un factor (s) citotóxico y/o citocina(s) que puede administrarse concurrentemente o posteriormente a la molécula de la invención. En esta forma, la molécula de diacuerpo puede activar específicamente el agente terapéutico en una forma similar a la conjugación directa. Alternativamente, una molécula de la invención puede conjugarse a un anticuerpo para formar un anticuerpo heteroconjugado como se describe por Segal in Patente de E.U.A. No. 4,676,980, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Las moléculas de diacuerpo de la invención también pueden unirse a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos o purificación del antígeno objetivo. Los soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno .

Caracterización de la Unión de las Moléculas de Diacuerpo Las moléculas de diacuerpo de la presente invención pueden caracterizarse en una variedad de formas. En particular, las moléculas de la invención pueden ensayarse para la habilidad para unirse inmunoespecíficamente a un antígeno, por ejemplo, Fc IIIA o FcRIIB, o, cuando la molécula comprende un dominio Fe (o una de sus porciones) para la habilidad de exhibir las interacciones FC-FCYR, es decir, la unión específica de un dominio Fe (o una de sus porciones) a FcyR.. Tal ensayo puede llevarse a cabo en solución (por ejemplo, Houghten (1992) "The Use Of Synthetic Peptide Combinatorial Libraries For The Identification Of Bioactive Peptides" , BioTechniques, 13:412-421) , en perlas (Lam (1991) "A New Type Of Synthetic Peptide Library For Identifying Ligand-Binding Activity" , Nature, 354:82-84, en chips (Fodor (1993) "Multiplexed Biochemical Assays With Biological Chips", Nature, 364:555-556) , en bacteria (Patente de E.U.A. No. 5,223,409) , en esporas (Patentes de E.U.A. Nos. 5,571,698; 5,403,484; and 5,223,409) , en plásmidos (Culi et al. (1992) "Screening For Receptor Ligands Using Large Libraries Of Peptides Linked To The C Terminus Of The Lac Repressor" , Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 89:1865-1869) o en fago (Scott et al. (1990) "Searching For Peptide Ligands With An Epitope Library", Science, 249:386-390; Devlin (1990) "Random Peptide Libraries : A Source Of Specific Protein Binding Molecules" , Science, 249:404-406; Cwirla et al. (1990) "Peptides On Phage : A Vast Library Of Peptides For Identifying Ligands", Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382; y Felici (1991) "Selection Of Antibody Ligands From A Large Library Of Oligopeptides Expressed On A Multivalent Exposition Vector", J. Mol. Biol . , 222:301-310) (cada una de estas referencias se incorpora por referencia en la presente en su totalidad) . Las moléculas que se han identificado que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno, por ejemplo, FcyRIIIA, pueden ensayarse para su especificidad y afinidad para el antígeno.

Las moléculas de la invención que han sido modificadas para comprender múltiples dominios de unión de epítopo pueden ensayarse para inmunoespecíficamente unirse a uno o más antígenos (por ejemplo, el antígeno de cáncer y la actividad recíproca con otros antígenos (por ejemplo, FcyR) ) o, cuando la molécula comprende un dominio Fe (o una de sus porciones, para las interacciones Fc-FcyR a través de cualquier método conocido en la técnica. Los inmunoensayos que pueden utilizarse para analizar la unión inmunoespecífica, la reactividad recíproca y las interacciones Fc-FcyR incluyen, pero no se limitan a, sistemas de ensayos competitivos y no competitivos que utilizan técnicas tales como western blots, radioinmunoensayos , ELISA (ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima) , inmunoensayos de "emparedado" , ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación de complemento, ensayos de inmunoradiométricos , inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, para nombrar unos cuantos. Tales ensayos son rutinarios y bien conocidos por la técnica (ver, por ejemplo, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol . 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) .

La afinidad de unión y el grado de desactivación de la interacción del dominio de unión del antígeno o la interacción Fc-FcyR puede determinarse a través de ensayos de unión competitivos. Un ejemplo de un ensayo de unión competitivo es un radioinmunoensayo que comprende la incubación del antígeno marcado, tal como FcyR tetramérico (por ejemplo, 3H o 125I, ver Sección 5.4.1) con una molécula de interés (por ejemplo, las moléculas de la presente invención comprenden múltiples dominios de unión de epítopo en la presencia de cantidades en aumento del epítopo no marcado, tal como FcyR tetramérico (ver Sección 5.4.1), y la detección de la molécula unida al antígeno marcado. La afinidad de la molécula de la presente invención para un antígeno y los grados fuera de unión pueden determinarse de los datos de saturación a través de un análisis Scatchard.

Las afinidades y las propiedades de unión de las moléculas de la invención para un antígeno o FcyR pueden inicialmente determinarse utilizando ensayos in vitro (ensayos bioquímicos o inmunológicos) conocidos en la técnica para el dominio de unión a antígeno o Fc-FcyR, interacciones, que incluyen pero no se limitan al ensayo de ELISA, ensayo de resonancia de plasmón de superficie, ensayos de inmunoprecipitación. Preferiblemente, las propiedades de unión de las moléculas de la invención también se caracterizan por ensayos funcionales in vitro para determinar una o más funciones de la célula efectora mediadora FcyR, como se describe en la Sección 5.4.2. En modalidades más preferidas, las moléculas de la invención tienen similares propiedades de unión en modelos in vivo (tales como las descritas y descritas en la presente) como los ensayos con base in vitro) . Sin embargo, la presente invención no excluye moléculas de la invención que no exhiben el fenotipo deseado en ensayos basados in vitro pero exhiben el fenotipo deseado in vivo.

En algunas modalidades, la clasificación y la identificación de las moléculas comprenden múltiples dominios de unión de epítopo, y, opcionalmente , dominios Fe (o sus porciones) que se hacen a través de ensayos funcionales, preferiblemente en una forma de alto rendimiento. Los ensayos funcionales pueden ser cualquier ensayo conocido en la técnica para la caracterización de una o más de las funciones de la célula efectora mediadas por FcyR tales como las descritas en la presente en las Secciones 5.4.2 y 5.4.3. Los ejemplos no limitantes de funciones de célula efectora que pueden utilizarse de acuerdo con los métodos de la invención, incluyen pero no se limitan a, citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo (ADCC) , fagocitosis dependiente del anticuerpo, fagocitosis, opsonización, opsonofagocitosis , unión de la célula, rosetas, unión Clq, y citotoxicidad mediada por la célula dependiente de complemento .

En una modalidad preferida, el análisis cinético BIAcore se utiliza para determinar los grados de activación y desactivación de la unión de las moléculas de la presente invención a un antígeno o FcyR. El análisis cinético BIAcore comprende analizar la unión y la disociación de un antígeno o FcyR de los chips con moléculas inmovilizadas (por ejemplo, moléculas que comprenden dominios de unión de epítopo o dominios Fe (o sus porciones) respectivamente) en su superficie. El análisis BIAcore se describe en la Sección 5.4.3.

Preferiblemente, la clasificación de la célula actividad con fluorescencia (FACS) , utilizando cualquiera de las técnicas conocidas por el experto en la técnica, se utiliza para un ensayo inmunológico o con base en funcional para caracterizar moléculas de la invención. Los clasificadores de flujo son capaces de rápidamente examinar un gran número de células individuales que han sido unidas, por ejemplo, opsonizadas, a través de las moléculas de la invención (por ejemplo, 10-100 millones de células por hora) (Shapiro et al. (1995) Practical Flow Cytometry) . Adicionalmente , los parámetros específicos utilizados para la optimización del comportamiento del diacuerpo, incluyen pero no se limitan a, concentración del antígeno (es decir, complejo tetramérico FcyR, ver Sección 5.4.1), tiempo de competencia cinético, o severidad FACS, cara una de las cuales puede variar con el fin de seleccionar las moléculas de diacuerpo que comprenden moléculas de la invención que exhiben propiedades de unión específicas, por ejemplo, unión concurrente a múltiples epítopos . Los citómetros de flujo para clasificar y examinar células biológicas son bien conocidos en la técnica. Los citómetros de flujo conocidos se escriben por ejemplo, en Patentes de E.U.A. Nos. 4,347,935; 5,464,581; 5,483,469; 5,602,039; 5,643,796; y 6,211,477; el contenido completo de las cuales se incorpora aquí por referencia. Otros citómetros de flujo conocidos son el sistema FACS Vantage™ fabricado por Becton Dickinson and Company, y el sistema COPAS™ fabricado por Union Biométrica.

La caracterización de la afinidad de unión del antígeno objetivo o la afinidad de unión de Fc-FcyR, y la evaluación del antígeno objetivo o la densidad de FcyR en la superficie celular puede hacerse a través de métodos bien conocidos en la técnica tales como el análisis Scatchard a través del uso de kits a través de las instrucciones del fabricante, tal como Quantum™ Simply Cellular ® (Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN) . El uno o más ensayos funcionales puede ser cualquier ensayo conocido en la técnica para caracterizar una o más funciones de la célula efectora mediada por FCYR como se conoce por el experto en la técnica o se describe en la presente. En modalidades específicas, las moléculas de la invención comprenden múltiples dominios de unión de epítopo y, opcionalmente , un dominio Fe (o una de sus porciones) se ensaya en un ensayo ELISA para la unión a uno o más antígenos objetivo o uno o más FcyRs, por ejemplo, FCYRIIIA, FcyRIIA, FcyRIIA; seguido por uno o más ensayos ADCC. En algunas modalidades, las moléculas de la invención se ensayan además utilizando un ensayo con base en resonancia de plasmón de superficie, por ejemplo, BIAcore. Los ensayos con base en resonancia de plasmón de superficie son bien conocidos en la técnica, y además se explican en la Sección 5.4.3, y se ejemplifican en la presente, por ejemplo, en el Ejemplo 6.1.

En modalidades más preferidas, las moléculas de la invención que comprenden múltiples dominios de unión de epítopo y, opcionalmente, un dominio Fe (o una de sus porciones) además se caracterizan en un modelo animal para la interacción con un antígeno objetivo (por ejemplo, un FcyR) o la interacción Fc-FcyR. Cuando se van a evaluar las interacciones Fc-FcyR, los modelos de animal preferidos para utilizarse en los métodos de la invención son, por ejemplo, los ratones transgénicos que expresan FcyRs, por ejemplo, cualquier modelo de ratón descrito en Patentes de E.U.A. Nos. 5,877,397, y 6,676,927 que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Los ratones transgénicos adicionales para utilizarse en tales métodos incluyen, pero no se limitan a, ratones FcyRIIIA transgénicos desnudos, que llevan FcyRIIIA humanos; ratones FcyRIIIA transgénicos desnudos que llevan FcyRIIA; ratones FcyRIIIA transgénicos desnudos que llevan FcyRlIB humano y FcyRIIIA humano; ratones FcyRIIIA transgénicos desnudos que llevan FcyRIIB humano y FcyRIIA humano; ratones FcyRIIIA y FcyRIIA transgénicos desnudos que llevan FcyRIIIA humano y FcyRIIA y ratones FcyRIIIA, FcyRIIA y FcyRIIB transgénicos desnudos que llevan FcyRIIIA, FcyRIIA y FcyRIIB humano.

ENSAYOS DE UNION QUE COMPRENDEN FCyR La caracterización de unión para FcyR a través de moléculas que comprenden un dominio Fe (o una de sus porciones) y/o que comprenden dominios de unión de epítopo específicos para un FcyR pueden hacerse utilizando cualquier FcyR, que incluye pero no se limita a variantes polimórficas de FcyR. En algunas modalidades, una variante polimórfica de FcyRIIIA se utiliza, que contienen alanina en la 158. En otras modalidades, la caracterización se hace utilizando una variante polimórfica de FcyRIIIA que contiene una valina en la posición 158. FcyRIIIA 158V despliega una mayor afinidad para IgGl de 158F y una actividad ADCC aumentada (ver, por ejemplo, Koene et al. (1997) "Fe gammaRIIIa-158V/F Polymorphism Influences The Binding Of IgG By Natural Killer Cell Fc gammaRIIIa, Independently Of The Fc gammaRIIIa-48L/R/H Phenotype" , Blood, 90:1109-14; u et al . (1997) "A Novel Polymorphism Of Fcgam aRIIIa (CDI 6) Alters Receptor Function And Predisposes To Autoimmune Disease" , J. Clin. Invest. 100: 1059-70, ambas de las cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad) ; este residuo de hecho actúa directamente con la región de bisagra inferior de IgGl como se muestra recientemente por los estudios de co-cristalización de IgGl-FcYRIIIA, ver, por ejemplo, Sondermann et al. (2000) "The 3.2 -A Crystal Structure Of The Human IgGl Fc Fragment-Fc gammaRIII complex", Nature, 406 ( 6793 ): 267-273 , que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Los estudios han demostrado que en algunos casos, los anticuerpos terapéuticos tienen una eficacia mejorada, en pacientes homocigotos FCYRIIIA-158V. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-CD20 humanizado Rituximab fue terapéuticamente más efectivo en pacientes homocigotos FCYRIIIA158V comparado con pacientes homocigotos FCYRIIIA 158F (ver, por ejemplo, Cartron et al. (2002) "Therapeutic Activity Of Humanized Anti-CD20 Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fc Receptor FcgammaRIIIA Gene", Blood, 99(3): 754-758). En otras modalidades, las moléculas terapéuticas que comprenden esta región también ser más efectivas en pacientes heterocigotos para FCYRIIIA-158V y FCYRIIIA-158F, y en pacientes con FCYRIIA-131H. Aunque no se pretende esta unido a través de ningún mecanismo de acción particular, la selección de las moléculas de la invención con alotipos alternativos puede proporcionar variantes que una vez modificadas en diacuerpos terapéuticos serán clínicamente más eficaces para pacientes homocigotos para tal alotipo.

Cualquier ensayo de unión FcyR se desarrollo para determinar la unión de las moléculas de la invención a FcyR, y, en particular, para determinar la unión de los dominios Fe a FcyR. El ensayo permitió la detección y la cuantificación de las interacciones Fc-FcyR, a pesar de la inherente débil afinidad del receptor para este ligando, por ejemplo, en el intervalo micromolar para FcyRIIB y FCYRIIIA. El método se describe con detalle en la Solicitud Internacional WO04/063351 y las Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U.A. 2005/0037000 y 2005/0064514, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad. En resumen, el método involucra la formación de un complejo FcyR que puede utilizarse en cualquier inmunoensayo estándar conocido en la técnica, por ejemplo, FACS, ELISA, resonancia de plasmón de superficie, etc. Adicionalmente , el complejo FcyR tiene una avidez mejorada para una región Fe con relación a un FcyR no un complejo. De acuerdo con la invención, el complejo molecular preferido es un complejo inmunitario tetramérico que comprende: (a) la región soluble de FcyR (por ejemplo, la región soluble de FCYRIIIA, FCYRIIA o FCYRIIB) ; (b) una secuencia AVITAG de 15 aminoácidos biotinilados (AVITAG) operablemente enlazada al C-terminal de la región soluble de FcyR (por ejemplo, la región soluble de FCYRIIIA, FCYRIIA O FCYRIIB) ; y (c) estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE) ; en una relación molar para formar un complejo FCYR tetramérico (preferiblemente en una relación molar de 5:1) . La proteína de fusión se biotinila enzimáticamente, utilizando por ejemplo, la enzima Bir A de E . coli, una ligasa de biotina que específicamente biotinila un residuo de lisina en la secuencia AVITAG del aminoácido 15. Las proteínas FCYR solubles biotiniladas después se mezclan con SA-PE en una relación de FCYR soluble biotinilado de IX SA-PE :5X para formar un complejo FCYR tetramérico.

Los polipéptidos que comprenden regiones FC han demostrado que se unen a complejos FCYR tetraméricos con por lo menos una afinidad mayor de 8 veces que el FcyR no en complejo monomérico. La unión de los polipéptidos que comprende regiones Fe a los complejos FcyR tetraméricos puede determinarse utilizando técnicas estándar conocidas por el experto en la técnica, tales como, por ejemplo, clasificación de célula activada con fluorescencia (FACS) , radioinmunoensayos, ensayos ELISA, etc.

La invención abarca el uso de complejos inmunitarios que comprende moléculas de la invención, y se forman de acuerdo con los métodos descritos anteriormente, para determinar la funcionalidad de las moléculas que comprenden una región Fe en un ensayo con base en célula o libre de célula.

Como cuestión de conveniencia, los reactivos pueden ser provistos en un ensayo, es decir, una combinación de reactivos empacados para ensayar la habilidad de las moléculas que comprenden regiones Fe para unir complejos tetraméricos FcyR. Otras formas de complejos moleculares para utilizarse en la determinación de las interacciones Fc-FcyR también se contemplan para utilizarse en los métodos de la invención, por ejemplo proteínas de fusión formadas como se describe en la Solicitud Provisional de E.U.A. 60/439,709, presentada el 13 de enero del 2003, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

ENSAYOS FUNCIONALES DE MOLECULAS CON CADENAS PESADAS VARIANTES La invención abarca la caracterización de las moléculas de la invención que comprenden múltiples dominios de unión de epítopo y, opcionalmente , dominios Fe (o sus porciones) utilizando ensayos conocidos por el experto en la técnica para identificar la función celular efectora de las moléculas. En particular, la invención abarca la caracterización de las moléculas de la invención para la función de la célula efectora mediada por FcyR.

Adicionalmente, cuando al menos uno de los antígenos objetivos de la molécula de diacuerpo de la invención es un FcyR, la unión de FcyR a través de la molécula de diacuerpo puede servir para activar las trayectorias mediadas por FcyR similares a las actividadas por la unión de FcyR-Fc. De esta forma, cuando al menos un dominio de unión de epítopo de la molécula de diacuerpo reconoce un FcyR, la molécula del diacuerpo puede provocar la función de la célula efectora mediada por FcyR sin contener un dominio Fe (o una de sus porciones), o sin la unión Fc-FcyR concomitante. Los ejemplos de funciones de célula efectora pueden ensayarse de acuerdo con la invención, incluyen pero no se limita a, citotoxicidad mediada por célula dependiente del anticuerpo, fagocitosis, opsonización, opsonofagocitosis , unión Clq, y citotoxicidad mediada por las células dependiente de complemento. Cualquier ensayo a base de célula libre de célula conocido por el experto en la técnica para determinar la actividad de la función de la célula efectora puede utilizarse (para ensayos de célula efectora, ver Perussia et al. (2000) "Assays For Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC) And Reverse ADCC (Redirected Cytotoxicity) In Human Natural Killer Cells" , Methods Mol. Biol . 121:179-92; Baggiolini et al. (1988) "Cellular Models For The Detection And Evaluation Of Drugs That Modulate Human Phagocyte Activity" , Experientia, 44 (10) : 841-848 ; Lehmann et al. (2000) "Phagocytosis : Measurement By Flow Cytometry" , J. Immunol . Methods, 243(1-2): 229-42; Brown (1994) "In vitro Assays Of Phagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes : Receptor Modulation And Signal Transduction" , Methods Cell Biol, 45:147-64; Munn et al . (1990) "Phagocytosis Of Tumor Cells By Human Monocytes Cultured In Recombinant Macrophage Colony-Stimulating Factor", J. Ex . Med. , 172:231-237, Abdul-Majid et al . (2002) "Fe Receptors Are Critical For Autoimmune Inflammatory Damage To The Central Nervous System In Experimental Autoimmune Encephalomyelitis" , Scand. J. Immunol. 55: 70-81; Ding et al. (1998) nTwo Human T Cell Receptors Bind In A Similar Diagonal Mode To The HLA-A2/Tax Peptide Complex Using Different TCR Amino Acids" , Immunity 8:403-411, cada uno de los cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad) .

En una modalidad, las moléculas de la invención pueden ensayarse para fagocitosis mediada por FcyR en mocitos humanos. Alternativamente, la fagocitosis mediada por FcyR de las moléculas de la invención puede ensayarse en otros fagocitos, por ejemplo neutrófilos (leucocitos polimorfonucleares ; PMN) ; monocitos de sangre periférica humana, macrófagos derivados de monocito, que pueden obtenerse utilizando procedimientos estándar conocidos por el experto en la técnica (por ejemplo ver Brown (1994) "Jn vitro Assays Of Phagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes: Receptor Modulation And Signal Transduction" , Methods Cell Biol . , 45: 147-164). En una modalidad, la función de las moléculas de la invención se caracteriza por la medición de la habilidad de las células THP-1 para llevar a cabo la fagocitosis de glóbulos rojos de oveja opsonizados de IgG con fluoresceína (SRBC) a través de métodos previamente descritos (Tridandapani et al. (2000) "The Adapter Protein LAT Enhances Fcgamma Recepto -Mediated Signal Transduction In Myeloid Cells" , J. Biol. Chem. 275: 20480-20487) .

Otro ensayo ilustrativo para determinar la fagocitosis de las moléculas de la invención es un ensayo de opsonofagocitosis dependiente de anticuerpo (ADCP) que puede comprender lo siguiente: recubrir una biopartícula objetivo tal como FITC marcada con Escherichia coli (Molecular Probes) o Staphylococcus aureus-FTTC con (i) el anticuerpo 4-4-20 de tipo silvestre, un anticuerpo para fluoresceína (Ver Bedzyk et al. (1989) "Comparison Of Variable Región Primary Structures Within An Anti -Flúorescein Idiotype Family" , J. Biol. Chem, 264(3): 1565-1569, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) , como el anticuerpo de control para ADCP dependiente de FcyR; o (ii) el anticuerpo 4-4-20 que aloja la mutación de D265A que aniquila la unión de FCYRIII, como un control de fondo para ADCP dependiente de FcyR (iii) un diacuerpo que comprende el dominio de unión de epítopo de 4-4-20 y un dominio Fe y/o un dominio de unión de epítopo específico para FCYRIII; y formar la partícula opsonizada; agregar cualquiera de las partículas opsonizadas descritas (i-iii) para las células efectoras THP-1 (una línea de células monocíticas disponibles de ATCC) a una relación de 1:1, 10:1, 30:1, 60:1, 75:1 ó 100:1 para permitir que ocurra la fagocitosis mediada por FcyR, preferiblemente un clon de la célula y E. coli-FITC/anticuerpo a 37°C durante 1.5 hora; agregar azul tripano después de la incubación (preferiblemente a temperatura ambiente durante 2-3 minutos) a las células para extinguir la fluorescencia de la bacteria que se adhirió en la parte exterior de la superficie celular sin internalizarse; transferir la célula en un regulador de pH FACS (por ejemplo, 0.1%, BSA en PBS, 0.1%, azida de sodio) , analizar la fluorescencia de las células THP1 utilizando FACS (por ejemplo, BD FACS Calibur) . Preferiblemente las células THP-1 utilizadas en el ensayo se analizan a través de FACS para la expresión de FcyR en la superficie celular. Las células THP-1 expresan tanto CD32A como CD64. CD64 es FcyR de alta afinidad que se bloque en la conducción del ensayo ADCP de acuerdo con los métodos de la invención. Las células THP-1 preferiblemente se bloquean con 100 g/ml de IgGl soluble o 10% de suero humano. Para analizar el extracto de ADCP, la compuerta preferiblemente se establece en células THP-1 y se mide la intensidad fluorescente media. La actividad ADCP para mutantes individuales se calcula y se reporta como un valor normalizado para chMab 4-4-20 de tipo silvestre obtenido. Las partículas opsonizadas se agregan a las células THP-1 de tal forma que la relación de las partículas opsonizadas a las células THP-1 es de 30:1 ó 60:1. En modalidades más preferidas, el ensayo ADCP se conduce con controles, tales como E. coli-FITC en medio, E. coli-FITC y las células THP-1 (para servir como actividad ADCP independientemente FcyR), E. coli-FITC, células THP-1 y el anticuerpo 4-4-20 de tipo silvestre (para servir como la actividad ADCP FcyR) , E coli-FITC, células THP-1, 4-4-20 D265A (para servir como el control de fondo para la actividad ADCP dependiente de FcyR) .

En otra modalidad, las moléculas de la invención pueden ensayarse para la actividad ADCC mediada por FcyR en células efectoras, por ejemplo, células aniquiladores naturales, utilizando cualquiera de los métodos estándar conocidos por el experto en la técnica (ver, por ejemplo, Perussia et al. (2000) "Assays For Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC) And Reverse ADCC (Redirected Cytotoxícity) In Human Natural Killer Cells" , Methods Mol. Biol . 121:179-92; Weng et al. (2003) "Two Immunoglobulin G Fragment C Receptor Polymorphisms Independently Predict Response To Rituximab In Patients With Follicular Lymphoma" , J. Clin. Oncol. 21:3940-3947; Ding et al. (1998) "TVo Human T Cell Receptors Bind In A Similar Diagonal Mode To The HLA-A2/Tax Peptide Complex Using Different TCR Amino Acids" , Immunity 8:403-411). Un ensayo ilustrativo para determinar la actividad ADCC de la moléculas de la invención se basa en un ensayo de liberación de 51Cr que comprende: marcación de las células objetivo con [51Cr] Na2Cr04 (esta molécula permeable de membrana celular es comúnmente utilizada para la marcación ya que une las proteínas citoplásmicas y aunque se libera espontáneamente de las células con cinéticos lentos, libera masivamente la siguiente necrosis celular objetivo) ; opsonizar las células objetivo para las moléculas de la invención que comprende cadenas pesadas variables; combinar las células objetivo radiomarcadas opsonizadas con células efectoras en una placa de microtitulación a una relación apropiada de células objetivo a células efectoras; incubar la mezcla de las células durante 16-18 horas a 37°C; recolectar los sobrenadantes; y analizar la radioactividad. La citotoxicidad de las moléculas de la invención después puede determinarse, por ejemplo utilizando la siguiente fórmula: % de lisis = (cpm experimental - fuga objetivo cpm)/(cpm de lisis de detergente - cpm de fuga objetivo) x 100%. Alternativamente, el % de lisis = (ADCC-AICC) /( liberación máxima - liberación espontánea) . La lisis específica puede calcularse utilizando la fórmula: lisis específica = % de lisis con las moléculas de la invención - % de lisis en la ausencia de las moléculas de la invención. Se puede generar una gráfica a través de la proporción de cualquier objetivo variable: célula efectora o concentración del anticuerpo.

Preferiblemente, las células efectoras utilizadas en los ensayos ADCC de la invención son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que preferiblemente se purifican de sangre humana normal, utilizando métodos estándar conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo, utilizando la centrifugación de gradiente de densidad Ficoll-Paque. Las células efectoras preferidas para utilizarse en los métodos de la invención expresan diferentes receptores de activación FcyR. La invención abarca, células efectoras, THP-1, que expresan FCYRI , FCYRIIA y FcyRIIB, y macrófagos y varios derivados de monocito derivados de sangre entera humana que expresa ambas FcyRIHA y FcyRIIB, para determinar si los mutantes del anticuerpo de cadena pesada mostraron una actividad ADCC aumentada y una fagocitosis relacionada con los anticuerpos IgGl de tipo silvestre.

La línea celular de monocitos humanos, THP-1, activa la fagocitosis a través de la expresión del receptor de alta afinidad FcyRI y el receptor de baja afinidad FcyRIIA (Fleit et al. (1991) "The Human Monocyte-Like Cell Line THP-1 Expresses Fe Gamma RI And Fe Gamma RII" , J. Leuk. Biol . 49: 556-565) . Las células THP-1 no expresan constitutivamente FcyRIIA o FcyRIIB. La estimulación de estas células con citocinas afectan el patrón de expresión FcR (Pricop et al. (2001) "Differential Modulation Of Stimulatory And Inhibitory Fe Gamma Receptors On Human Monocytes By Thl And Th2 Cytokines" , J. of Immunol . , 166: 531-537). El crecimiento de las células THP-1 en presencia de citocina IL4 induce la expresión de FCYRIIB y causan la reducción en la expresión de FCYRIIA y FcyRI . La expresión de FcyRIIB también puede mejorarse aumentando la densidad celular (Tridandapani et al. (2002) "Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells" , J. Biol . Chem. , 277(7): 5082-5089). En contraste, se ha reportado que IFNy puede conducir a la expresión de FcyRIIIA (Pearse et al. (1993) "Interferon Gamma-Induced Transcription Of The High-Affinity Fe Receptor For IgG Requires Assembly Of A Complex. That Includes The 91-kDa Subunit Of Transcription Factor ISGF 3", Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 4314-4318). La presencia o ausencia de los receptores de la superficie celular puede determinarse a través de FACS utilizando métodos comunes conocidos por el experto en la técnica. La expresión inducida por la citocina de FcyR en la superficie celular proporciona un sistema para probar ambas la activación y la inhibición en la presencia de FcyRIIB. Si las células THP-1 son incapaces de expresar FcyRIIB la invención también abarca otra línea celular de monocitos humanos, U937. Estas células han demostrado que se diferencian terminalmente macrófagos en la presencia de IFNy y TNF (Koren et al. (1979) "In vitro Activation Of A Human Macrophage-Like Cell Line" , Nature 279: 328-331) .

La aniquilación de la célula tumoral dependiente de FcyR está mediada por macrófago y células NK en modelos de tumor de ratón (Clynes et al. (1998) "Fe Receptors Are Required In Passive And Active Immunity To Melanoma" , Proc . Nat . Acad. Sci. USA 95: 652-656). La invención abarca el uso de monocitos lavados de donadores como células efectoras para analizar la eficiencia de los mutantes Fe para activar la citotoxicidad celular de las células objetivo en ambos ensayos de fagocitosis y ADCC. Los patrones de expresión de FcyRI, FcyRIIIA, y FCYRIIB están afectados por diferentes condiciones de cultivo. La expresión de FcyR de monocitos lavados congelados, monocitos lavados frescos, monocitos mantenidos en 10% de FBS, y monocitos cultivados en FBS + GM-CSF y/o en suero humano puede determinarse utilizando métodos comunes conocidos por el experto en la técnica. Por ejemplo, las células pueden mancharse con anticuerpos específicos FcyR y analizarse a través de FACS para determinar los perfiles FcR. Las condiciones que mejor imitan a expresión FcyR in vivo de macrófago después se utilizan para los métodos de la invención .

En algunas modalidades, la invención abarca el uso de células de ratón especialmente cuando las células de humano con perfiles FcyR adecuados son incapaces de obtenerse. En algunas modalidades, la invención abarca la línea celular de macrófago de ratón RAW264.7 (ATCC) que puede transfectarse con FCYRIIIA humano y transfectantes estables aislados utilizando métodos conocidos en la técnica, ver, por ejemplo, Ralph et al. (1977) "Antibody-Dependent Killing Of Erythrocyte And Tumor Targets By Macrophage-Related Cell Lines: Enhancement By PPD And LPS" , J. Immunol . 119: 950-4). Los transfectantes pueden cuantificarse para la expresión de FcyRIIIA a través de análisis FACS utilizando experimentación de rutina y altas expresiones pueden utilizarse en ensayos ADCC de la invención. En otras modalidades, la invención abarca el aislamiento de macrófago peritoneal de bazo que expresa FcyR humano de ratones transgénicos agénicos tales como los descritos en la presente.

Los linfocitos pueden cosecharse de sangre periférica de donadores (PBM) utilizando un gradiente Ficoll-Paque (Pharmacia) . Dentro de la población mononuclear aislada de células la mayor parte de la actividad de ADCC ocurre a través de células aniquiladoras naturales (NK) que contienen FcyRIIIA pero no FcyRIIB en su superficie. Los resultados con estas células indican la eficacia de los mutantes en la activación del ADCC de la célula NK y establecen los reactivos para probar con monocitos lavados.

Las células objetivo utilizadas en los ensayos ADCC de la invención incluyen, pero no se limitan a, líneas de célula de cáncer de pecho, por ejemplo, con el número acceso SK-BR-3 con el número de acceso HTB-30 (ver, por ejemplo, Tremp et al. (1976) "Human Breast Cáncer In Culture" , Recent Results Cáncer Res. 33-41); B-linfocitos ; células derivadas de linfoma Burkitts, por ejemplo, células Raj i con el número de acceso ATCC CCL-86 (ver, por ejemplo, Epstein et al. (1965) "Characteristics And Mode Of Growth Of Tissue Culture Strain (EBl) Of Human Lymphoblasts From Burkitt's Lymphoma" , J. Nati. Cáncer Inst . 34: 231-240), y células Daudi con número de acceso ATCC CCL-213 (ver, por ejemplo, Klein et al. (1968) "Surface IgM-Kappa Specificity On A Burkitt Lymphoma Cell In Vivo And In Derived Culture Lines", Cáncer Res. 28: 1300- 1310) . Las células objetivo deben reconocerse a través del sitio de unión de antígeno de la molécula de diacuerpo a ser ensayada.

El ensayo ADCC se basa en la habilidad de las células NK para mediar la muerte celular a través de una trayectoria apoptótica. Las células NK median la muerte celular en parte a través del reconocimiento de FCYRIIIA de un dominio Fe IgG unido a un antígeno en la superficie celular. Los ensayos ADCC utilizados de acuerdo con los métodos de la invención pueden ser ensayos con base en radioactivo o ensayos con base en fluorescencia. Los ensayos ADCC utilizando para caracterizar las moléculas de la invención comprenden regiones Fe variantes que comprenden la marcación de las células objetivo, por ejemplo, SK-BR-3, MCF-7, OVC AR3 , Raji, células Daudi, opsonización de células objetivo con un anticuerpo que reconoce en un receptor de la superficie celular de la célula objetivo a través de su sitio de unión a antígeno; combinar las células objetivo opsonizadas marcadas y las células efectoras con una relación apropiada, que puede determinarse a través de su experimentación de rutina; cosechar las células; detectar la etiqueta en el sobrenadante de las células objetivo lisadas, utilizando un esquema de detección apropiado con base en la etiqueta utilizada. Las células objetivo pueden marcarse ya sea con una etiqueta radioactiva o una etiqueta fluorescente, utilizando métodos estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, las etiquetas incluyen, pero no se limitan a, [51Cr] a2Cr04 ; y acetoximetil éster del ligando que mejora la fluorescencia, 2 , 21 : 61 , 2" -terpiridin-6-6" -dicarboxilato (TDA) .

En una modalidad preferida específica, un ensayo fluorométrico resuelto con el tiempo se utiliza para medir la actividad ADCC contra células objetivo que han sido marcadas con acetoximetil éster del ligando mejorador de fluorescencia, 2 , 2 ' : 61 , 2" -terpiridin-6-6" -dicarboxilato (TDA) . Tales ensayos fluorométricos son conocidos en la técnica, por ejemplo, ver Blomberg et al. (1996) "Time- Resolved Fluorometric Assay For Natural Killer Activity Using Target Cells Labelled Nith A Fluorescence Enhancing Ligand" , Journal of Immunological Methods, 193:199-206; que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. En resumen las células objetivo se marcan con la membrana permeable de acetoximetil diéter de TDA (bis (acetoximetil) 2,2' : 6' ,2"-terpiridin-6-6" -dicarboxilato, (BATDA) , que rápidamente se difunde a través de la membrana celular de las viables. La división de las esterasas intracelulares de los grupos y la molécula TDA impermeable de membrana regenerada se atrapan dentro de la célula. Después de la incubación de las células efectoras y objetivo, por ejemplo, durante al menos 2 horas, hasta 3.5 horas, a 37 °C, bajo 5% de C02, el TDA liberado de las células objetivo lisadas se quelata con Eu3+ y la fluorescencia de los quelatos TDA de Europio formados se cuantifica en un fluorómetro resuelto con el tiempo (por ejemplo, Víctor 1420, Perkin Elmer/Wallace) .

En otra modalidad específica, el ensayo ADCC utilizado para caracterizar las moléculas de la invención comprenden múltiples sitios de unión de epítopo y, opcionalmente , un domino Fe (o una de sus porciones) que comprende los siguientes pasos: preferiblemente 4-5xl06 células objetivo (por ejemplo, SK-BR-3, MCF-7, 0VCAR3 , células Raji) que se marcan con bis (acetoximetil ) 2,2' :6 ',2"-terpiridin-t-6" -dicarboxilato (DELFIA BATDA Reagent, Perkin Elmer/Wallac) . Para la eficiente marcación óptima, el número de células objetivo utilizadas en el ensayo ADCC deberían preferiblemente no exceder 5xl06. El reactivo BATDA se agrega a las células y la mezcla se incuba a 37°C preferiblemente bajo 5% de C02, durante al menos 30 minutos. Las células después se lavan con un regulador de pH fisiológico, por ejemplo, PBS con 0.125 mM de sulfinpirazol , y un medio que contiene 0.125 mM de sulfinpirazol . Las células objetivo marcadas después se opsonizan (se recubren) con una molécula de la invención que comprende un dominio de unión de epítopo específico para FCYRIIA y, opcionalmente , un dominio Fe (o una de sus porciones) . En modalidades preferidas, la molécula utilizada en el ensayo ADCC también es específica para el receptor de superficie celular, un antígeno tumoral, o un antígeno cancerígeno. La molécula de diacuerpo de la invención puede específicamente unirse a cualquier antígeno cancerígeno o tumoral, tales como los listados en la sección 5.6.1. Las células objetivo en el ensayo ADCC se seleccionan de acuerdo con los sitios de unión de epítopo modificados en el diacuerpo de la invención, de tal forma que diacuerpo se une al receptor de superficie celular de la célula objetivo específicamente .

Las células objetivo se agregan a las células efectoras, por ejemplo, PBMC, para producir proporciones de efector: objetivo de aproximadamente 1:1, 10:1, 30:1, 50:1, 75:1, ó 100:1. Las células efectoras y objetivo se incuban durante al menos 2 horas, hasta 3.5 horas, a 37°C, bajo 5% de C02. El sobrenadante de las células se cosecha y agrega a una solución de europio ácido (por ejemplo, Solución de Europio DELFIA, Perkin Elmer/Wallac) . La fluorescencia del Europio-TDA quilatado formado se cuantifica en un fluorómetro resuelto con el tiempo (por ejemplo, Victor 1420, Perkin Elmer/Wallac) . La liberación máxima (MR) y la liberación espontánea (SR) se determinan a través de incubación de las células objetivo con 1% de TX-100 y medio solo, respectivamente. La citotoxicidad celular independiente del anticuerpo (AICC) se mide a través de la incubación de células objetivo y efectoras en la ausencia de una molécula de prueba, por ejemplo, el diacuerpo de una invención. Cada ensayo preferiblemente se lleva a cabo por triplicado. La lisis específica porcentaje media se calcula como: Liberación experimental (ADCC) - AICC) / (MR-SR) x 100.

La invención abarca ensayos conocidos en la técnica y ejemplificados en la presente, para caracterizar la unión de Clq y la mediación de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) a través de las moléculas de la invención que comprenden dominios Fe (o sus porciones) . Para determinar la unión de Clq, se lleva a cabo un ensayo ELISA de unión a Clq. Un ensayo ilustrativo puede comprender lo siguiente: placas de ensayo que pueden estar cubiertas durante la noche a 4°C con un polipéptido que comprende una molécula de la invención o un polipéptido de partida (control) en un regulador de pH de control . Las placas después pueden lavarse y bloquearse. Después del lavado se puede agregar una alícuota de Clq humano a cada cavidad e incubarse durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de un lavado más, se pueden agregar 100 ul de anticuerpo conjugado con peroxidasa Clq anti-complemento de oveja a cada cavidad e incubarse durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa puede de nuevo lavarse con regulador de pH de lavado y se pueden agregar 100 ul de OPD (diclorhidrato de O-fenilenodiamina (SIGMA) conteniendo el regulador de pH del sustrato a cada cavidad. La reacción de oxidación, observada por la aparición del color amarillo, puede dejarse avanzar durante 30 minutos y detenerse a través de la adición de 100 ul de 4.5 NH2S04. La absorbencia puede después leerse a (492-405) nm.

Para evaluar la activación complemento, se puede llevar a cabo un ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) , por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al. (1997) "A Non-Radioactive Complement-Dependent Cytotoxicity Assay For Anti-CD20 Monoclonal Antibody" , J. Immunol . Methods 202:163-171, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. En resumen, varias concentraciones de la molécula que comprende un dominio Fe (variante) (o una de sus porciones) y un complemento pueden diluirse con regulador de pH. Las células que expresan el antígeno al cual se une la molécula de diacuerpo pueden diluirse a una densidad de aproximadamente lxlO6 células/ml. Las mezclas de la molécula de diacuerpo que comprenden un dominio Fe (variante) (o una de sus porciones) , complemento humano diluido y células que expresan el antígeno pueden agregarse a una placa de 96 cavidades plana de cultivo tisular y dejarse incubar durante 2 horas a 37 °C y 5% de C02 para facilitar la lisis celular mediada por el complemento. Después pueden agregarse 50 ul de azul alamar (Accumed International) a cada cavidad e incubarse durante la noche a 37 °C. La absorbencia se mide utilizando un fluorómetro de 96 cavidades con excitación a 530 nm y emisión 590 nm. Los resultados pueden expresarse en unidades de fluorescencia relativas (RFU) . Las concentraciones de la muestra pueden calcularse a partir de una curva estándar y la actividad porcentaje según comparada con la molécula no variante, es decir, la molécula que no comprende un dominio Fe o que comprende un dominio Fe no variante, se reportan para la variante de interés.

OTROS ENSAYOS Las moléculas de la invención que comprenden múltiples dominios de unión de epítopo y, opcionalmente, un dominio Fe pueden ensayarse utilizando cualquier ensayo a base de resonancia de plasmón de superficie conocido en la técnica para la caracterización de los parámetros cinéticos de un dominio de unión a antígeno a unión FC-FCYR. Cualquier instrumento SPR comercialmente disponible que incluyen, pero no se limitan a, Instrumentos BIAcore, disponibles de Biacore AB (Uppsala, Suecia) ; instrumentos IAsys disponibles de Affinity Sensors (Franklin, MA.); el sistema IBIS disponible de Windsor Scientific Limited (Berks, UK) , los sistemas SPR-CELLIA disponibles de Nippon Láser and Electronics Lab (Hokkaido, Japón) , y SPR Detector Spreeta disponible de Texas Instruments (Dallas, TX) pueden utilizarse en la presente invención. Para una revisión de la tecnología a base de SPR ver Mullet et al. (2000) "Surface Plasmon Resonance-Based Immunoassays" , Methods 22:77-91; Dong et al. (2002) "Some new aspects in biosensors" , Reviews in Mol. Biotech. 82:303-23; Fivash et al. (1998) "BIAcore For Macromolecular Interaction" , Current Opinión in Biotechnology 9:97-101; Rich et al. (2000) "Advances In Surface Plasmon Resonance Biosensor Analysis" , Current Opinión in Biotechnology 11:54-61; todas las cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Adicionalmente cualquier instrumento SPR y método a base de SPR para medir las interacciones de proteína-proteína descritos en Patentes de E.U.A. NOS. 6,373,577; 6,289,286; 5,322,798; 5,341,215; 6,268,125, todas las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad, se contemplan en los métodos de la invención .

En resumen, los ensayos a base de SPR involucran la inmovilización de un miembro del par de unión en una superficie, y monitorear su interacción con otro miembro del par de unión en soluciones en tiempo real. SPR se basa en la medición del cambio en el índice de refracción del solvente cerca de la superficie que ocurre después de la formación del complejo o disociación. La superficie sobre la cual ocurre la inmovilización en el chip sensor, que está en el corazón de la tecnología SPR, consiste en una superficie de vidrio recubierta con una capa delgada de oro y formar la base para un intervalo de superficies especializadas diseñadas para optimizar la unión de una molécula de superficie. Una variedad de chip sensores está comercialmente disponible especialmente de compañías listadas supra, todas las cuales pueden utilizarse en los métodos de la invención. Los ejemplos de chips sensores incluyen los disponibles de BIAcore AB, Inc., por ejemplo, Sensor Chip CM5 , SA, NTA, y HPA. Una molécula de la invención puede inmovilizarse sobre la superficie de un chip sensor utilizando cualquiera de los métodos de inmovilización y químicos conocidas en la técnica, incluyendo pero no limitándose a, acoplamiento covalente directo a través de grupos amina, acoplamiento covalente directo a través del grupo sulfhidrilo, unión de biotina a avidina recubierto en la superficie, acoplamiento de aldehido a grupos carbohidrato, y unión a través de una etiqueta de histidina con chips NTA.

En algunas modalidades, los parámetros cinéticos de la unión de las moléculas de la invención que comprenden múltiples sitios de unión de epítopo, y opcionalmente , un dominio Fe, a un antígeno o un FcyR pueden determinarse utilizando el instrumento BIAcore (por ejemplo, BIAcore instrument 1000, BIAcore Inc., Piscataway, NJ) . Como se explicó supra, ver Sección 5.4.1, se puede utilizar cualquier FcyR para evaluar la unión de las moléculas de la invención ya sea en donde por lo menos un sitio de unión del epítopo de la molécula de diacuerpo reconoce inmunoespecíficamente un FcyR, y/o en donde la molécula del diacuerpo comprende un dominio Fe (o una de sus porciones) . En una modalidad específica, FcyR es FcyRIIIA, preferiblemente un FcyRIIIA monomérico soluble. Por ejemplo, en una modalidad, el FcyRIIIA monomérico soluble de la región extracelular de FcyRIIIA unido a la secuencia AVITAG enlazada (ver, Solicitud Provisional de E.U.A. No. 60/439,498, presentada el 9 de enero del 2003, y Solicitud Provisional de E.U.A. No. 60/456,041, presentada el 19 de marzo del 2003, que se incorporan aquí por referencia en su totalidad) . En otra modalidad específica, FcyR es FcyRIIB, preferiblemente un FcyRIIB quimérico soluble. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína FcyRIIB quimérica soluble se prepara de acuerdo con la tecnología descrita en la Solicitud Provisional de E.U.A. No. 60/439,709, presentada el 13 de enero del 2003, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

Para todos los ensayos inmunogénicos , el reconocimiento/unión de FcyR a través de una molécula de la invención puede estar afectada por múltiples dominios: en ciertas modalidades, las moléculas de la invención reconocen inmunoespecíficamente FcyR a través de uno de los múltiples dominios de unión del epítopo; en otras modalidades, en donde la molécula de la invención comprende un dominio Fe (o una de sus porciones) la molécula del diacuerpo puede reconocer inmunoespecíficamente FCYR a través de las interacciones Fc-FcyR; en aún otras modalidades en donde la molécula de la invención comprende ambos, un dominio Fe (o una de sus porciones) y un sitio de unión de epítopo que inmunoespecíficamente reconoce el FcyR, la molécula de diacuerpo puede reconocer FcyR a través de uno o ambos el dominio de unión del epítopo y el dominio Fe (o una de sus porciones) . Un ensayo ilustrativo para determinar los parámetros cinéticos de una molécula que comprende múltiples dominios de unión del epítopo y, opcionalmente un dominio el Fe (o una de sus porciones) a un antígeno y/o un FcyR utilizando el instrumento BIAcore comprende lo siguiente: un primer antígeno se inmoviliza en una de las cuatro células de flujo de la superficie de chip sensor, preferiblemente a través de química de acoplamiento de amina de tal forma que 5000 unidades de respuesta (RU) del primer antígeno se inmovilizan en una superficie. Una vez que se separa la superficie adecuada, las moléculas de la invención que inmunoespecíficamente reconocen el primer antígeno se hacen pasar sobre la superficie, preferiblemente a través de inyecciones de un minuto de una solución de 20 yg/ml a 5 µ?/ml de intervalo de flujo. Los niveles de las moléculas de la invención unidas a la superficie de esta etapa típicamente están en el intervalo entre 400 y 700 RU. Enseguida, las series de la invención de un segundo antígeno (por ejemplo, FcyR) o el receptor FcyR en regulador de pH HBS-P (20 mM de HEPES, 150 mM de NaCl , 3mM de EDTA, pH 7.5) se inyectan en la superficie a 100 µ?/min. La regeneración de las moléculas entre las diferentes diluciones del segundo antígeno o receptor se llevan a cabo preferiblemente a través de inyecciones individuales de 5 segundos de 100 mM de NaHC03 pH 9.4; 3M de NaCl . Cualquier técnica de regeneración conocida en la técnica se contempla en el método de la invención.

Una vez que el grupo de datos completo se recolecta, las curvas de unión resultantes se adaptan globalmente utilizando algoritmos de computadora suministrados por fabricante del instrumento SPR, por ejemplo, BIAcore, Inc. (Piscataway, NJ) . Estos algoritmos calculan tanto Kactivado y Kdesactivado/ de los cuales la constante de unión en equilibrio aparente, ¾ se deduce a una protección de dos constantes de velocidad (es decir, desactivado/ activado) · Los tratamientos más detallados de cómo las constantes de velocidad individual se derivan pueden encontrarse en el Libro de Texto de Software BIAevaluaion (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) . El análisis de los datos generados puede hacerse utilizando el método conocido en la técnica. Para una revisión de los varios métodos de interpretación de los datos cinéticos generados ver Myszka (1997) "Kinetic Analysis Of Macromolecular Interactions Using Surface Plasmon Resonance Biosensors" , Current Opinión in Biotechnology 8: 50-7; Fisher et al. (1994) "Surface Plasmon Resonance Based Methods For Measuring The Kinetics And Binding Affinities Of Biomolecular Interactions" , Current Opinión in Biotechnology 5:389-95; O'Shannessy (1994) "Determina ion Of Kinetic Rate And Equilibriu Binding Constante For Macromolecular Interactions : A Critique Of The Surface Plasmon Resonance Literature" , Current Opinión in Biotechnology, 5:65-71; Ch&iken et al. (1992) "Analysis Of Macromolecular Interactions Using Immohilized Ligands" , Analytical Biochemistry, 201:197-210; Morton et al. (1995) "Interpreting Complex Binding Kinetics From Optical Biosensors : A Comparison Of Analysis By Linearization, The Integrated Rate Equation, And Numerical Integration" , Analytical Biochemistry 227: 176-85; O'Shannessy et al., 1996, Analytical Biochemistry 236:275-83; todos las cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad.

En modalidades preferidas, los parámetros cinéticos determinados utilizando análisis SPR, por ejemplo, BIAcore, pueden utilizarse como una medición para pronosticar como una molécula de la invención funcionará en un ensayo funcional, por ejemplo, ADCC. El método ilustrativo para pronosticar la eficacia de una molécula de la invención con base en parámetros cinéticos obtenidos de un análisis SPR puede comprender lo siguiente: determinar los valores Kdesactivados para la unión de una molécula de la invención para FCYRIIIA y FcyRIIB (a través de un dominio de unión de epítopo y/o un dominio Fe (o una de sus porciones)); graficar (1) Reactivado (ps) /Kdesactivado (mut) para FcyRIIIA; (2) Reactivado (mut ) /Kdesactivado (ps) para FcyRIIB contra los datos ADCC. Los números más altos de uno muestran un grado de disociación disminuido para FcyRIIIA y un grado de disociación aumentado para FcyRIIB con relación a tipo silvestre; y poseen una función ADCC mejorada.

METODOS PARA PRODUCIR MOLECULAS DE DIACUERPO DE LA INVENCION Las moléculas de diacuerpo de la presente invención pueden producirse utilizando una variedad de métodos bien conocidos en la técnica, que incluyen la síntesis de la nueva proteína y una expresión recombinante de ácidos nucleicos que codifican las proteínas de unión. Las secuencias de ácido nucleico deseadas pueden producirse a través de métodos recombinantes (por ejemplo, la mutagénesis PCR de una variante preparada anteriormente del polinucleótido deseado) o a través síntesis de ADN de fase sólida. Usualmente los métodos de expresión recombinantes se utilizan. En un aspecto la invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de codificación un VH y/o VL CD16A; en otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica VH y/o VL CD32B. Debido a la degeneración del código genético, una variedad de secuencias de ácido nucleico que codifican cada secuencia de aminoácido de inmunoglobulina, y la presente invención incluye todos los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de unión descritas en la presente.

POLI UCLEOTIDOS QUE CODIFICAN MOLECULAS DE LA INVENCION La presente invención también incluye polinucleótidos que codifican las moléculas de la invención, que incluyen los polipéptidos de anticuerpo. Los polinucleótidos que codifican las moléculas de la invención pueden obtenerse y la secuencia de nucleótido de los polinucleótidos determinarse, a través de cualquier método conocido en la técnica.

Una vez que se determina la secuencia de nucleótido de las moléculas que se identifican a través de los métodos de la invención, la secuencia de nucleótido puede monitorearse utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, en técnicas de ADN recombinante , mutagénesis dirigida al sitio, PCR, etc. (ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; and Ausubel et al, eds . , 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John iley & Sons, NY, ambas incorporadas aquí por referencia en su totalidad) . Para generar, por ejemplo, anticuerpos que tienen diferentes secuencias de aminoácido, por ejemplo, mediante la generación de sustituciones o eliminaciones y/o inserciones de aminoácido .

En una modalidad, las colecciones humanas o cualquier otra colección disponible en la técnica, puede clasificarse a través de técnicas estándar conocidas en la técnica, para clonar los ácidos nucleicos que codifican las moléculas de la invención.

EXPRESION RECOMBINANTE DE MOLECULAS DE LA INVENCION Una vez que la secuencia de ácido nucleico que codifica las moléculas de la invención (es decir, anticuerpo) ha sido obtenida, el vector para la producción de las moléculas puede producirse a través de la tecnología de ADN recombinante utilizando técnicas bien conocidas en la técnica. Los métodos que son bien conocidos por el experto en la técnica pueden utilizarse para construir vectores de expresión que contienen las secuencias de codificación para las moléculas de la invención y señales de control de transcripción y traducción apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinantes in vivo, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. (Ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY and Ausubel et al. eds . , 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY) .

Un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótido de la molécula identificada por los métodos de la invención puede transferirse a una célula hospedera a través de técnicas convencionales (por ejemplo, electroporación, transfección liposómica, y precipitación de fosfato cálcico) y las células transíectadas después se cultivaron a través de técnicas convencionales para producir las moléculas de la invención. En modalidades específicas, la expresión de las moléculas de la invención se regula a través de un promotor específico, constitutivo, o inducible o tisular .

Las células hospederas utilizadas para expresar las moléculas identificadas por los métodos de la invención pueden ser ya sea células bacterianas tales como Escherichia coli, o, preferiblemente células eucariotas, especialmente para la expresión de la molécula de inmunoglobulina recombinante completa. En particular, las células de mamífero, tales como las células de ovario de hámster Chino (CHO) , junto con un vector tal como el elemento promotor del gen temprano intermedio principal del citomegalovirus humano es un sistema de expresión efectivo para inmunoglobulinas (Foecking et al. (1986) "Powerful And Versatile Enhancer-Promoter Unit For Mammalian Expression Vectors" , Gene 45:101-106; Cockett et al. (1990) "High Level Expression Of Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases In Chínese Hámster Ovary Cells Using Glutamine Synthetase Gene Amplification" , Biotechnology 8:662-667).

Una variedad de sistemas de vector de expresión hospederos pueden utilizarse para expresar las moléculas identificadas por los métodos de la invención. Tales sistemas de expresión de hospedero representan vehículos a través de los cuales las secuencias de codificación de las moléculas de la invención pueden producirse y posteriormente purificarse, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias de codificación de nucleótido apropiadas, expresar las moléculas de la invención in situ. Estas incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacteria (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformados con ADN de bacteriófago recombinante , ADN de plásmido o vectores de expresión de ADN cósmico, que contienen secuencias de codificación para las moléculas identificadas por los métodos de la invención; levadura (por ejemplo, Saccharomyces pichia) transformada con vectores de expresión de lavadura recombinantes que contienen secuencias que codifican las moléculas identificadas por el método de la invención; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias de codificación de las moléculas identificadas por los métodos de la invención; sistemas de células de plantas infectadas con vectores de expresión del virus recombinante (por ejemplo, el virus de mosaico de coliflor (CaMV) y el virus de mosaico del tabaco (TMV) o se transforman con vectores de expresión de plásmido recombinante (por ejemplo, de plásmido Ti) que contiene secuencias de codificación de las moléculas identificas por los métodos de la invención; los sistemas de células de mamífero (por ejemplo, COS, CHO, BHK, 293, 293T, células 3T3, células linfocíticas) (ver U.S. 5,807,715), células Per C.6 (células de retina humana desarrolladas por Crucell) que alojan constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de las células del mamífero (por ejemplo, el promotor de metalotioneína) o del virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus el promotor 7.5K del virus de vacuna) .

En sistemas bacterianos, un número de vectores de expresión puede ventajosamente seleccionarse dependiendo del uso previsto para la molécula que se está expresando. Por ejemplo, cuando una gran cantidad de tal proteína se va a producir, para la generación de composiciones farmacéuticas de un anticuerpo, los vectores que inducen la expresión a altos niveles de los productos de proteína de fusión que fácilmente se purifican pueden ser deseables. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión pUR278 (Rüther et al. (1983) "Easy Identification Of cDNA Clones", EMBO J. 2:1791-1794) de E. coli, en el cual la secuencia de codificación del anticuerpo puede ligarse individualmente en el vector en estructura con la región de codificación lac Z de tal forma que se produce la proteína de fusión; vectores pIN (Inouye et al. (1985) "Üp-Promoter Mutations In The lpp Gene Of Escherichia Coli", Nucleic Acids Res. 13:3101-3110; Van Heeke et al. (1989) "Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia Coli", J. Biol . Chem. 24:5503-5509); y similares. Los vectores pGEX también pueden utilizarse para expresar polipéptido foráneos como proteínas de fusión con glutationa S-transíerasa (GST) . En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden fácilmente purificarse de células lisadas a través de la adsorción y la unión a una matriz de perlas de glutationa-agarosa seguida la elusión en la presencia de glutationa libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir trombina o los sitios de división del factor de proteasa Xa de tal forma que el producto de gen objetivo puede liberarse de la fracción GST.

En un sistema de insectos, el virus de polihedrosis nuclear Autograp a californica (AcNPV) se utiliza como un vector para expresar los genes foráneos. El virus se cultiva en células Spodoptera frugiperda . La secuencia de codificación del anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor AcNPV (por ejemplo, el promotor de polihedrina) .

En células hospederas de mamífero, un número de sistemas de expresión a base de virus puede utilizarse. En los casos en donde se utiliza un adenovirus como un vector de expresión, la secuencia de codificación del anticuerpo de interés puede ligarse a un complejo de control de transcripción/traducción del adenovirus, por ejemplo, la secuencia promotora tardía y líder tripartita. Este gen quimérico puede después insertarse en el genoma del adenovirus a través de recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, la región El o E3) dará como resultado el virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de inmunoglobulina en hospederos infectados (ver, por ejemplo, Logan et al., (1984) "Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection" , Proc . Nati. Acad. Sci. USA 81:3655-3659). Las señales de iniciación específicas también pueden requerir la eficiente traducción de las secuencias de codificación del anticuerpo insertado. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG y las secuencias adyacentes. Además, el codón de inicio puede estar en la fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación deseada para asegurar la traducción del inserto completo. Estas señales de control de traducción exógenas y los codones de iniciación pueden ser de una variedad de orígenes, tanto natural como sintética. La eficiencia de la expresión puede mejorarse a través de la inclusión de elementos mej oradores de transcripción apropiados, terminadores de transcripción, etc. (ver Bitter et al. (1987) "Expression And Secretion Vectors For Yeast" , Methods in Enzymol. 153:516-544).

Además, se puede seleccionar una cepa de la célula hospedera que modula la expresión de las secuencias insertadas, que modifica y procesa el producto del gen en una forma específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, separación) de los productos de proteína para ser importante para la función de la proteína. Por ejemplo, en ciertas modalidades, los polipéptidos comprenden una molécula de diacuerpo de la invención . que pueden expresarse como un solo producto de gen (por ejemplo, como una cadena de polipéptido individual, es decir, como un precursor de poliproteína) , requiriendo la separación proteolítica a través de mecanismos celulares nativos o recombinantes para formar los polipéptidos separados de las moléculas de diacuerpo de la invención. La invención de esta forma abarca la modificación de la secuencia de ácido nucleico para codificar una molécula precursora de poliproteína que comprende los polipéptidos de la invención, que incluyen secuencias de codificación capaces de dirigir la separación post-traducción del precursor de poliproteína. La separación post-traducción del precursor de poliproteína da como resultado polipéptidos de la invención. La separación post-traducción de la molécula precursora comprende los polipéptidos de la invención que pueden ocurrir in vivo (es decir, dentro de la células hospedera a través de sistemas/mecanismo de célula nativa recombinante , por ejemplo, separación de furina en el sitio apropiado) , que pueden ocurrir in vi tro (por ejemplo, la incubación de la cadena de polipéptido en una composición que comprende proteasas o peptidasas de actividad conocida y/o en una composición que comprende condiciones o reactivos conocidos para fomentar la acción proteolítica deseada. La purificación y la modificación de proteína recombinante son bien conocidas en la técnica de tal forma que el diseño del precursor de proteína podría incluir el número de modalidades fácilmente apreciadas por el trabajador experto. Cualquier proteasa o peptidasa conocida en la técnica puede utilizarse para la modificación deseada de la molécula precursora, por ejemplo, trombina (que reconoce la secuencia de aminoácido LVPR^GS (SEC ID NO: 89)), o el factor Xa (que reconoce la secuencia de aminoácido I(E/D)GR" (SEC ID NO: 90) (Nagai et al. (1985) "Oxygen Binding Properties Of Human Mutant He oglobins Synthesized In Escherichia Coli" , Proc . Nat . Acad. Sci . USA 82:7252-7255, y revisada por Jenny et al. (2003) "A Critical Review Of The Methods For Cleavage Of Fusión Proteins With Thrombin And Factor Xa", Protein Expr. Purif. 31:1-11, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad) ) , enterocinasa (que reconoce la secuencia de aminoácido DDDDK (SEC ID NO: 91) (Collins-Racie et al. (1995) "Production Of Recombinant Bovine Enterokinase Catalytic Subunit In Escherichia Coli Using The Novel Secretory Fusión Partner DsbA" , Biotechnology 13:982-987 incorporada aquí por referencia en su totalidad) ) , furina (que reconoce la secuencia de aminoácido RXXR* , con una preferencia para RX(K/R)RA (SEC ID NO: 92 y SEC ID NO: 93, respectivamente) (adicional R en la posición P6 parece que mejora la separación) ) , y AcTEV (que reconoce la secuencia de aminoácido ENLYFQ'G (SEC ID NO: 94) (Parks et al. (1994) ".Reléase Of Proteins And Peptides From Fusión Proteins Using A Reco binant Plant Virus Proteinase" , Anal. Biochem. 216:413-417 incorporada aquí por referencia en su totalidad)) y Proteasa C3 del Virus de la Enfermedad de Pies y Boca. Ver, por ejemplo, la Sección 6.4, supra .

Las diferentes células hospederas tienen mecanismos característicos específicos para el procesamiento posttraducción y la modificación de las proteínas y los productos génicos . Las líneas celulares apropiadas de los sistemas hospederos pueden seleccionarse para asegurar la correcta modificación y procesamiento de la proteína foránea expresada. En este punto, las células hospederas eucariotas que poseen la maquinaria celular para el apropiado procesamiento del trascripto primario, glicosilación y fosforilación del producto génico pueden utilizarse. Tales células hospederas de mamífero incluyen pero o se limitan a CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3 , WI38, BT483, HS578T, HTB2, BT20 y T47D, CRL7030 y Hs578Bst.

Para la producción de alto rendimiento, a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que establemente expresan un anticuerpo de la invención pueden modificarse. En lugar de utilizar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales, las células hospederas transformarse con ADN controlado a través de elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotor, mejorador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable . Después de la introducción del ADN foráneo, las células modificadas pueden dejarse cultivar durante 1-2 días en un medio enriquecido, y después cambiarse a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere la resistencia a la selección y permite que las células integren establemente el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar el sitio que a su vez puede clonarse y expandirse en líneas celulares. Este método puede ventajosamente utilizarse para modificar líneas celulares que expresan los anticuerpos de la invención. Tales líneas celulares modificadas pueden particularmente ser útiles en la clasificación y evaluación de compuestos que interactúan directa o indirectamente con las moléculas de la invención.

Se pueden utilizar un número de sistemas de selección, que incluyen pero no se limitan a timidina cinasa del virus de herpes simple genes de ( igler et al. (1977) "Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells" , Cell 11:223-232), fosforibosiltransferasa de hipoxantina-guanina (Szybalska et al. (1992) "Use Of The HPRT Gene And The HAT Selection Technique In DNA-Mediated Transformation Of Ma malian Cells: First Steps Toward Developing Hybridoma Techniques And Gene Therapy" , Bioessays 14:495-500), y fosforibosiltransferasa de adenina (Lowy et al . (1980) "Isolation Of Transforming DNA: Cloning The Hámster aprt Gene", Cell 22: 817- 823) que pueden utilizarse en células tk- , hgprt- o aprt-, respectivamente. También, se puede utilizar la resistencia antimetabolito según las bases de selección de los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al. (1980) "Transformation Of Mammalian Cells With An Amplifiable Dominant-Acting Gene", Proc . Nati. Acad. Sci. USA 77:3567-3570; O'Hare et al. (1981) nTransformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofoíate Reductase" , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 1527-1531); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan et al. (1981) "Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase" , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 2072-2076); neo, que confiere resistencia a aminoglicosida G-418 (Tolstoshev (1993) "Gene Therapy, Concepts, Current Triáis And Future Directions" , Ann. Rev. Pharmacol . Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) "The Basic Science Of Gene Therapy", Science 260:926-932; y Morgan et al. (1993) "Human Gene Therapy", Ann. Rev. Biochem. 62:191-217) e higro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre et al. (1984) "Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells", Gene 30:147-156). Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología de AND recombinante que pueden utilizarse se describen en Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; y en los capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapin et al. (1981) "A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells", J. Mol. Biol . 150:1-14.

Los niveles de expresión de una molécula de la invención puede aumentarse a través de una amplificación de vector (para una revisión, ver Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning. Vol . 3 (Academic Press, New York, 1987) . Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa un anticuerpo es amplificable, el aumento en el nivel del inhibidor presente en el cultivo de la célula hospedera aumentará el número de copias del gen marcador. Ya que la región amplificada está asociada con la secuencia de nucléotido de un polipéptido de la molécula de diacuerpo, la producción del polipéptido también aumentará (Crouse et al. (1983) "Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofoíate Reductase Minigenes" , Mol. Cell. Biol. 3:257-266).

La célula hospedera puede co-transfectarse con dos vectores de expresión de la invención, el primer vector codifica el primer polipéptido de la molécula de diacuerpo y el segundo vector codifica el segundo polipéptido de la molécula de diacuerpo. Los dos vectores pueden contener idénticos marcadores seleccionables que permiten una igual expresión de ambos polipéptidos. Alternativamente, se puede utilizar un solo vector que codifica ambos polipéptidos. Las secuencias de codificación para los polipéptidos de las moléculas de la invención pueden comprender ADNc o ADNc genómico .

Una vez que la molécula de la invención (es decir, diacuerpos) ha sido recombinantemente expresada, puede purificarse a través de cualquier método conocido en la técnica para la purificación de polipéptidos, poliproteínas o diacuerpos (por ejemplo, análogos a los esquemas de purificación del anticuerpo con base en la selectividad del antígeno, por ejemplo, a través de cromatografía (por ejemplo, intercambio de ión, afinidad, particularmente por afinidad para el antígeno específico (opcionalmente después de la selección de la proteína A en donde la molécula de diacuerpo comprende un dominio Fe (o una de sus porciones) ) , y dimensionar la cromatografía de columna) , centrifugación, solubilidad diferencial o a través de cualquier otra técnica estándar para la purificación de polipéptidos, poliproteínas o diacuerpos.

METODO PROFILACTICO Y TERAPEUTICO Las moléculas de la invención son particularmente útiles para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad, trastorno o infección en donde una función de la célula efectora (por ejemplo, ADCC) mediada por FcyR se desea (por ejemplo, cáncer, enfermedad infecciosa) . Como se explica supra, los diacuerpos de la invención pueden exhibir funcionalidad de tipo anticuerpos en la obtención de la función efectora aunque la molécula del diacuerpo no comprende un dominio Fe. Al comprender por lo menos un dominio de unión de epítopo que inmunoespecíficamente reconoce un FcyR, la molécula del diacuerpo puede exhibir unión FcyR y actividad análoga a interacciones Fc-FcyR. Por ejemplo, las moléculas de la invención pueden unir un antígeno de superficie celular y un FcyR (por ejemplo, FcyRIIIA) en una célula efectora inmunitaria (por ejemplo, célula NK) , estimulando la función efectora (por ejemplo, ADCC, CDC, fagocitosis, opsonización, etc.) contra tal célula.

En otras modalidades, la molécula del diacuerpo de la invención comprende un dominio Fe (o una de sus porciones). En tales modalidades, el dominio Fe además puede comprender por lo menos una modificación de aminoácido con relación al dominio Fe de tipo silvestre (o una de sus porciones) y/o puede comprender dominios de uno o más isotipos IgG (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4). Las moléculas de la invención que comprenden dominios Fe variantes pueden exhibir fenotipos conferidos o alterados con relación a las moléculas que comprende un dominio Fe de tipo silvestre tal como una actividad de la función efectora altera o transferida (por ejemplo, como se ensaya en un ensayo dependiente de NK o dependiente de macrófago) . En tales modalidades, las moléculas de la invención con una actividad de la función efectora conferida o alterada son útiles para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad, trastorno o infección en donde una eficacia mejorada de la actividad entre la función efectora es deseada. En ciertas modalidades, las moléculas de diacuerpo de la invención comprenden un dominio Fe (o una de sus porciones) que median la cascada dependiente del complemento. Las variantes del dominio Fe identificadas como que alteran la función efectora se describen en la Solicitud Internacional O 04/063351, Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U.A. 2005/0037000 y 2005/0064514, Solicitudes Provisionales de E.U.A. 60/626,510, presentadas el 10 de noviembre del 2004, 60/636,663, presentada el 15 de diciembre del 2004, y 60/781,564, presentada el 10 de marzo del 2006, y las Solicitudes de Patente de E.U.A. 11/271,140, presentada el 10 de noviembre del 2005, y 11/305,787, presentada el 15 de diciembre del 2005, las solicitudes concurrentes de los Inventores, cada una de las cuales se incorpora por referencia en su totalidad.

La invención abarca métodos y composiciones para el tratamiento, prevención o administración de un cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una o más moléculas que comprenden uno o más sitios de unión de epítopo, y opcionalmente , un dominio Fe (o una de sus porciones) modificado de acuerdo con la invención, cuya molécula además de une al antígeno cancerígeno. Las moléculas de la invención son particularmente útiles para la prevención, inhibición reducción del crecimiento o avance de los tumores primarios, metástasis de células cancerígenas, y enfermedades infecciosas. Aunque no se pretende estar unido a través de un mecanismo de acción particular, las moléculas de la invención median la función efectora que resulta en depuración del tumor, reducción del tumor o una combinación de éstos. En modalidades alternativas, los diacuerpos de la invención median la actividad terapéutica a través del entrelazamiento de los antígenos de superficie celular y/o receptores y apoptosis mejorada o señalización reguladora del crecimiento negativo .

Aunque no se pretende estar unido a través de un mecanismo de acción particular, las moléculas de diacuerpo de la invención exhiben una eficacia terapéutica mejorada con relación a los anticuerpos terapéuticos conocidos en la técnica, en parte, debido a la habilidad del diacuerpo para inmunoespecíficamente a unirse a la célula objetivo que expresa un antígeno particular (por ejemplo, FcyR) a niveles reducidos, por ejemplo, en virtud de la habilidad del diacuerpo para permanecer en la célula objetivo más tiempo debido a una avidez mejorada de la interacción del diacuerpo-epítopo .

Los diacuerpos de la invención con afinidad y avidez mejorada para antígenos (por ejemplo, FcyRs) son particularmente útiles para el tratamiento, prevención o administración de un cáncer, u otra enfermedad o trastorno, en un sujeto, en donde FcyRs se expresan a bajos niveles en las poblaciones de células objetivo. Como se utiliza en la presente invención, la expresión FcyR en células se define en términos de la densidad de tales moléculas por célula según medido utilizando métodos comunes conocidos por el experto en la técnica. Las moléculas de la invención que comprenden múltiples sitios de unión de epítopo y, opcionalmente , y FcyR (o una de sus porciones) preferiblemente también tienen una avidez conferida o mejorada y una afinidad y/o función efectora en las células que expresan una función efectiva, por ejemplo, un antígeno cancerígeno, a una densidad de 30,000 a 20,000 moléculas/célula, a una densidad de 20,000 a 10,000 moléculas/célula, a una densidad de 10,000 moléculas/célula o menos, a una densidad de 5,000 moléculas/célula o menos, o una densidad de 1,000 moléculas/célula o menos. Las moléculas de la invención tienen utilidad particular en el tratamiento, prevención o administración de una enfermedad o trastorno, tal como cáncer, en una sub-pobl ción, en donde el antígeno objetivo se expresa a bajos niveles en la población de la célula obj etivo .

Las moléculas de la invención también pueden ventajosamente utilizarse en combinación con otros agentes terapéuticos conocidos en la técnica para el tratamiento prevención de enfermedades, tales como cáncer, enfermedad autoinmunitaria, trastornos inflamatorios, y enfermedades infecciosas. En una modalidad específica, las moléculas de la invención pueden utilizarse en combinación con anticuerpos monoclonales o quiméricos, linfocinas, o factores de crecimiento hematopoyéticos (tales como, por ejemplo, IL-2, IL-3 y IL-7) , los cuales, por ejemplo, sirven para aumentar el número de actividad de células efectoras que interactúan con las moléculas y, aumentan la respuesta inmunitaria. Las moléculas de la invención también pueden ventajosamente utilizarse en combinación con uno o más fármacos utilizados para tratar una enfermedad, trastorno o infección tal como, por ejemplo, agentes anti-cancerígenos, agentes anti-inflamatorios, o agentes anti-víricos , por ejemplo, como se detalla en Sección 5.7.

CANCERES La invención abarca métodos y composiciones para el tratamiento y prevención en un sujeto que comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una de o más moléculas que comprenden múltiples dominios de unión a epítopo. En algunas modalidades, la invención abarca métodos y composiciones para el tratamiento o prevención de cáncer en un sujeto con un polimorfismo FcyR tales como los homocigotos para alelos FYRIIIA-158V O FCYRIIIA- 158F . En algunas modalidades, la invención abarca modificar por lo menos un dominio de unión de epítopo de la molécula de diacuerpo para inmoespecíficamente unir FcyRIIIA (158F) . En otras modalidades, la invención abarca modificar por lo menos un dominio de unión de epítopo de la molécula de diacuerpo para inmunoespecíficamente unir FcyRIIIA (158V) .

La eficacia de la terapia de anticuerpo monoclonal estándar depende el polimorfismo FcyR del sujeto (Cartron et al. (2002) "Therapeutic Activity Of Humanized Anti-CD20 Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fe Receptor FcRIIIa Gene", Blood 99:754-758; eng et al. (2003) "Two Immunoglobulin G Fragment C Receptor Polymorphisms Independently Predict Response To Rituximab In Patients With Follicular Lymphoma" , J Clin Oncol . 21 (21) : 3940-3947, ambas de las cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad) . Estos receptores se expresan en la superficie de las células efectoras y median ADCC. Los alelos de alta afinidad, de los receptores de activación de baja afinidad, mejoran la habilidad de las células efectoras para mediar ADCC. En contraste para basarse en las interacciones FC-FCYR para efectuar la función efectora, los métodos de la invención abarcan moléculas modificadas para inmunoespecíficamente reconocer los receptores de activación de baja afinidad, permitiendo que las moléculas sean diseñadas para un polimorfismo específico. Alternativa o adicionalmente, la molécula de la invención pueden modificarse para comprender un dominio Fe variante que exhibe una afinidad mejorada a FcyR (con relación a un dominio Fe de tipo silvestre) en células efectoras. Las moléculas modificadas de la invención proporcionan mejores reactivos de inmunoterapia para pacientes independientemente de su polimorfismo FcyR.

Las moléculas de diacuerpo modificadas de acuerdo con la invención se ensayan a través de ADCC utilizando ya sea una línea de un cultivo celular o una célula PMBC derivada de paciente para determinar la habilidad de las mutaciones Fe para mejorar ADCC. El ADCC estándar se lleva cabo utilizando los métodos descritos en la presente. Los linfocitos se cosechan de sangre periférica utilizando un gradiente Ficoll-Paque (Pharmacia) . Las células objetivo, es decir, las líneas de cultivadas o las células derivadas del paciente, se cargan con Europio (PerkinElmer) y se incuban con efectores durante 4 horas a 37 °C. El Europio liberado se detecta utilizando el lector de placas fluorescente (Wallac) . Los datos ADCC resultantes indican la eficacia de las moléculas de la invención para activar la citotoxicidad mediada por la célula NK y establecen que moléculas pueden ensayarse con ambas muestras del paciente y los monocitos lavados. Las moléculas de diacuerpo que muestran un mayor potencial para provocar la actividad de ADCC, estos se ensayan en un ensayo ADCC utilizando PBMCs de pacientes. PBMC de donadores saludables se utilizan como células efectoras.

Por consiguiente, la invención proporciona métodos para prevenir o tratar cáncer caracterizados por un antígeno cancerígeno mediante la modificación de la molécula de diacuerpo para inmunoespecíficamente reconocer el antígeno cancerígeno de tal forma que la molécula del diacuerpo por sí misma es citotóxica (por ejemplo, a través del entrelazamiento de los receptores de superficie que conducen una apoptosis incrementada o la regulación descendente de las señales proliferativas) y/o comprende un dominio Fe, de acuerdo con la invención, y/o media una o más de las funciones efectoras (por ejemplo, ADCC, fagocitosis) . Los diacuerpos que han sido modificados de acuerdo con la invención son útiles para la prevención o el tratamiento de cáncer, ya que tienen una actividad citotóxica (por ejemplo, aniquilación de célula tumoral mejorada y/o mejorada por ejemplo, actividad ADCC o actividad CDC) .

Los cánceres asociados un antígeno cancerígeno pueden tratarse o evitarse a través de la administración de un diacuerpo que une un antígeno cancerígeno y el citotóxico, y/o ha sido modificado de acuerdo con los métodos de la invención para exhibir una función efectora. Por ejemplo, no a manera de limitación, los cánceres asociados con los siguientes antígenos cancerígenos pueden tratarse o prevenirse a través de métodos y composiciones de la invención: antígeno pan-carcinoma KS 1/4 (Pérez et al., (1989) "Isolation And Characterization Of A Cdna Encoding The Ksl/4 Epithelial Carcinoma Marker" , J. Immunol . 142:3662-3667; Móller et al. (1991) "Bispecific-Monoclonal-Antibody-Directed Lysis Of Ovarían Carcinoma Cells By Activated Human T Lymphocytes" , Cáncer Immunol. Immunother. 33 (4) : 210-216) , antígeno de carcinoma ovárico (CA125) (Yu et al. (1991) "Coexpression Of Different Antigenic Markers On Moieties That Bear CA 125 Determinants" , Cáncer Res. 51 (2) : 468-475) , fosfato ácido prostático (Tailor et al. (1990) "Nucleotide Sequence Of Human Prostatic Acid Phosphatase Determined From A Full-Length cDNA Clone", Nucí. Acids Res. 18 ( 16) : 4928) , antígeno específico de próstata (Henttu et al. (1989) "cDNA Coding For The Entire Human Prostate Specific Antigen Shows High Homologies To The Human Tissue Kallikrein Genes" , Biochem. Biophys . Res. Comm. 10 (2) : 903-910 ; Israeli et al . (1993) "Molecular Cloning Of A Complementary DNA Encoding A Prostate-Specific Membrane Antigen" , Cáncer Res. 53:227-230), antígeno p97 asociado con melanoma p97 (Estin et al. (1989) "Tr ansfected Mouse Melanoma Lines That Express Various Levéis Of Human Melanoma-Associated Antigen p97" , J. Nati. Cáncer Instit. 81(6) :445-454), antígeno gp75 de melanoma (Vijayasardahl et al. (1990) "The Melanoma Antigen Gp75 Is The Human Homologue Of The Mouse B (Brown) Locus Gene Product", J. Exp. Med. 171(4): 1375-1380), antígeno de melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA) (Natali et al. (1987) "Immunohistochemical Detection Of Antigen In Human Primary And Metastatic Melanomas By The Monoclonal Antibody 140.240 And Its Possible Prognostic Significance" , Cáncer 59:55-63; Mittelman et al. (1990) "Active Specific Immunotherapy In Patients With Melanoma. A Clinical Trial With Mouse Antiidiotypic Monoclonal Antibodies Elicited With Syngeneic Anti-High-Molecular-Weight-Melanoma-Associated Antigen Monoclonal Antibodies" , J. Clin. Invest. 86:2136-2144)), antígeno de membrana específico de próstata, antígeno carcinoembriónico (CEA) (Foon et al. (1995) "Immime Response To The Carcinoembryonic Antigen In Patients Treated With An Anti-Idiotype Antibody Vaccine" , J. Clin. Invest. 96(1) :334-42) , antígeno de mucino epitelial polimórfico, antígeno de glóbulos de grasa de leche humana, antígenos asociados con tumor colorrectal tales como: CEA, TAG-72 (Yokota et al. (1992) "Rapid Tumor Penetration Of A Single-Chain Fv And Comparison With Other Immunoglobulin Forms" , Cáncer Res. 52:3402-3408), C017-1A (Ragnhammar et al. (1993) "Effect Of Monoclonal Antibody 17- IA And GM-CSFIn Patients With Advanced Colorectal Carcinoma - Long-Lasting, Complete Re issions Can Be Induced" , Int. J. Cáncer 53:751-758); GICA 19-9 (Herlyn et al. (1982) ^Monoclonal Antibody Detection Of A Circulating Tumor-Associated Antigen. I. Presence Of Antigen In Sera Of Patients With Colorectal , Gastric, And Pancreatic Carcinoma", J. Clin. Immunol . 2:135-140), CTA-1 y LEA, antígeno-38.13 CD19 de linfoma de Burkitt (Ghetie et al. (1994) "Anti-CD 19 Inhibits The Growth Of Human B-Cell Tumor Lines In Vitro And Of Daudi Cells In SCID Mice By Inducing Cell Cycle Arrest" , Blood 83:1329- 1336), antígeno CD20 de linfoma B humano (Reff et al. (1994) "Depletion Of B Cells In Vivo By A Chimeric Mouse Human Monoclonal Antibody To CD20" , Blood 83:435-445), CD33 (Sgouros et al. (1993) "Modeling And Dosi etry Of Monoclonal Antibody MI95 (Anti-CD33) In Acute Myelogenous Leukemia" , J. Nucí. Med. 34:422-430), antígenos específicos de melanoma tales como gangliosida GD2 (Saleh et al. (1993) "Generation Of A Human Anti-Idiotypic Antibody T afc Mimics The GD2 Antigen", J. Immunol., 151, 3390-3398), gangliosida GD3 (Shitara et al . (1993) "A Mouse/Human Chimeric Anti- (Ganglioside GD3) Antibody With Enhanced Antitumor Activities" , Cáncer Immunol . Immunother. 36:373-380), gangliosida GM2 (Livingston et al . (1994) "Improved Survival In Stage III Melanoma Patients With GM2 Antibodies : A Randomized Trial Of Adjuvant Vaccination Nith GM2 Ganglioside" , J. Clin. Oncol . 12:1036-1044), gangliosida GM3 (Hoon et al. (1993) "Molecular Cloning Of A Human Monoclonal Antibody Reactive To Ganglioside GM3 Antigen On Human Cancere", Cáncer Res. 53:5244-5250), tipo de trasplante específico de tumor de antígeno de superficie celular (TSTA) tales como los antígenos tumorales inducidos viralmente que incluyen virus tumoral de ADN del antígeno T y antígenos de envoltura de los virus del tumor de ARN, el antígeno-alfa-fetoproteína oncofetal tal como CEA de colon, antígeno oncofetal de tumor de vejiga (Hellstróm et al. (1985) "Monoclonal Antibodies To Cell Surface Antigens Shared By Chemically Induced Mouse Bladder Carcinomas" , Cáncer. Res. 45:2210-2188), antígeno de diferenciación tal como el antígeno de carcinoma de pulmón humano L6 , L20 (Hellstróm et al. (1986) "Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma", Cáncer Res. 46:3917-3923), antígeno de fibrosarcoma , el antígeno-Gp37 de célula T de leucemia humana (Bhattacharya-Chatterj ee et al. (1988) "Idiotype Vaccines Against Human T Cell Leukemia. II. Generation And Characterization Of A Monoclonal Idiotype Cascade (Abl, Ab2, and Ab3)", J. Immunol . 141:1398-1403), neoglicoproteina, esfingolípidos , antígeno de cáncer de pecho tal como EGFR (receptor de factor de crecimiento epidérmico) , el antígeno HER2 (pl8HER2) , mucino epitelial polimórfico (PEM) (Hilkens et al. (1992) "Cell Membrane-Associated Mucins And Their Adhesion-Modulating Property" , Trends in Biochem. Sci . 17:359-363), antígeno APO-1 de linfocito humano maligno (Trauth et al. (1989) "Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis" , Science 245:301-304), antígeno de diferenciación (Feizi (1985) "Demonstration By Monoclonal Antibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteins And Glycolipids Are Onco-Developmental Antigens" , Nature 314:53-57) tal como el antígeno I encontrado en eritrocitos fetales y endoderma primaria, I (Ma) encontrado en adenocarcinomas gástricos, M18 y M39 encontrados en epitelio de pecho, SSEA-1 encontrado en células mieloides, VEP8 , VEP9, Myl, VI -D5, y Di56-22 encontrados en cáncer colorectal, TRA-1-85 (grupo sanguíneo H) , C14 encontrado en adenocarcinoma colónico, F3 encontrado en adenocarcinoma de pulmón, AH6 encontrado en cáncer gástrico, Y hapteno, Ley encontrado en células de carcinoma embrionarias, TL5 (grupo sanguíneo A), receptor EGF encontrado en células A431, series Ei (grupo sanguíneo B) encontrado en cáncer pancreático, FC 10.2 encontrado en células de carcinoma embrionarias, adenocarcinoma gástrico, CO-514 (grupo sanguíneo Lea) encontrado de adenocarcinoma, NS-10 encontrado en adenocarcinomas , CO-43 (grupo sanguíneo Leb) , G49, receptor EGF, (grupo sanguíneo ALeb/Ley) encontrado en adenocarcinoma colónico, 19.9 encontrado en cáncer de colon, mucinas de cáncer gástrico, T5A7 encontrado en células mieloides, R2 encontrado en melanoma, 4.2, GD3, Dl.l, OFA-1, GM2, OFA-2, GD2/ MI: 22: 25: 8 encontrado en células de carcinoma embriónico, y SSEA-3, SSEA-4 encontrado en embriones en la etapa de 4-8 células. En otra modalidad, el antígeno es un receptor de célula T derivado de péptido de un linfoma de célula T cutáneo (ver, Edelson (1998) "Cutaneous T-Cell Lymphoma: A Model For Selective I munothe apy" , Cáncer J Sci Am. 4 : 62-71) .

Los cánceres y trastornos relacionados que pueden tratarse o prevenirse a través de los métodos y composiciones de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: leucemias que incluyen, pero no se limitan a, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemias mielocíticas agudas tales como mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica, leucemias eritroleucemia y síndrome mielodisplásico, leucemias crónicas tales como pero no limitándose a, leucemia milocítica crónica (granulocítica) , leucemia linfocítica crónica, leucemia de célula pilosa; policitemia vera; linfomas tales como pero no limitándose a enfermedad de Hodgkin, enfermedad no de Hodgkin; mielomas múltiples tales como pero no limitándose a mieloma múltiple incandescente, mieloma no secretora, mieloma osteoclerótica, leucemia de célula de plasma, plasmacitoma solitaria y plasmacitoma extramedular; macroglobulinemia de Waldenstróm; gamoplatía monoclonal de significancia no determinada; gamopatía monoclonal benigna; enfermedad de cadena pesada; sarcomas de hueso y tejido conectivo tales como pero no limitándose a sarcoma óseo, osteosarcoma , condrosarcoma, sarcoma de Ewing, tumor celular gigante maligno, fibrosarcoma de hueso, cordoma, sarcoma de periostial, sarcomas de tejido suave, angiosarcoma (hemangiosarcoma) , fibrosarcoma, sarcoma de Kaposi, leiomiosarcoma , liposarcoma, linfangiosarcoma, neurilemoma, rabdomiosarcoma, sarcoma sinovial, tumores cerebrales que incluyen pero no se limitan a, glioma, astrocitoma, glioma madre de cerebro, ependimoma, oligodendroglioma, tumor nonglial, neurinoma acústico, craneofaringioma, meduloblastoma, meningioma, pineocitoma, pineoblastoma, linforna cerebral primario, cáncer de pecho que incluye, pero no se limita a, adenocarcinoma, carcinoma lobular (célula pequeña), carcinoma intraductal, cáncer de pecho medular, cáncer de pecho mucinoso, cáncer de pecho tubular, cáncer de pecho papilar, enfermedad de Paget, y cáncer de pecho inflamatorio; cáncer adrenal, que incluye pero no se limita a, carcinoma feocromocitoma y adenocortical ; cáncer de tiroides tal como, pero no limitándose a cáncer de tiroides papilar o folicular, cáncer de tiroides medular y cáncer de tiroides anaplásico; cáncer de páncreas, incluyendo pero no limitándose a, insulinoma, gastrinoma, glucagonoma, vipoma, tumor secretor de somatostatina , y tumor de célula carcinoide o islote; cánceres de pituitaria, que incluyen pero no se limitan a enfermedad de Cushing, tumor secretor de prolactina, acromegalia y diabetes insipius; cánceres del ojo que incluyen pero no se limitan a melanoma ocular, tal como melanoma del iris, melanoma de coroide y melanoma del cuerpo ciliar, y retinoblastoma; cánceres vaginales, que incluyen pero no se limitan a, carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, y melanoma, cáncer de vulva, que incluyen pero no se limitan a carcinoma de célula escamosa, melanoma, adenocarcinoma, carcinoma de célula basal, sarcoma, y enfermedad de Paget; cáncer cervical que incluye pero no se limitan a, carcinoma de célula escamosa y adenocarcinoma; cánceres uterinos que incluyen pero no se limitan a, carcinoma de endometrio y sarcoma uterino; cánceres ováricos que incluyen pero no se limitan a, carcinoma epitelial ovárico, tumor de la línea limítrofe, tumor de célula de germen y tumor del estroma; cánceres esofágicos que incluyen pero no se limitan a cáncer escamoso, adenocarcinoma, carcinoma cístico adenoide, carcinoma mucoepidermoide , carcinoma adenoescamoso, sarcoma, melanoma, plasmocitoma , carcinoma de verrugas, carcinoma de célula de avena (célula pequeña) , cánceres de estómago que incluyen pero no se limitan a, adenocarcinoma, fungoso (polipoide) , ulceración, de extensión superficial, extensión difusa, linfoma maligno, liposarcoma, fibrosarcoma, y carcinosarcoma ; cánceres de colon, cánceres rectal, cánceres de hígado que incluyen pero no se limitan a carcinoma hepatocelular y hepatoblastoma, cánceres de vesícula biliar, que incluyen pero no se limitan a, adenocarcinoma; colangiocarcinomas que incluyen pero no se limitan a, papilar, nodular y difuso; cánceres de pulmón que incluyen pero no se limitan a cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de célula escamosa (carcinoma epidermoide) , adenocarcinoma, carcinoma de célula grande y cáncer de células pequeñas de pulmón; cánceres testiculares que incluyen pero no se limitan a, tumor germinal, seminoma, anaplásico, clásico (típico) , espermatocítico, no seminoma, carcinoma embrionario, carcinoma de teratoma, coriocarcinoma (tumor del saco de la yema) , cánceres de próstata que incluyen pero no se limitan a adenocarcinoma, leiomiosarcoma y el rabdomiosarcoma ; cánceres orales, cánceres de pene que incluyen pero no se limitan a, carcinoma de célula escamosa; cánceres básales, cánceres de la glándula salival que incluyen pero no se limitan a, adenocarcinoma, carcinoma mucoepidermoideo y carcinoma adenoidcístico ; cánceres de faringe que incluyen pero no se limitan a, cáncer de célula escamosas, y verrugas; cáncer de piel que incluye pero no se limita a, carcinoma de célula basal, carcinoma de células escamosas y melanoma, melanoma de extensión superficial, melanoma nodular, melanoma maligno de lentigo, melanoma lentiginoso acral ; cánceres de riñon que incluyen pero no se limitan a, cáncer de célula renal, adenocarcinoma , hipernefroma, fibrosarcoma , cáncer de célula temporal (pelvis renal y/o útero), tumor de ilms; cánceres de vejiga que incluyen pero no limitan, carcinoma de célula transicional , cáncer de células escamosas, adenocarcinoma, carcinosarcoma . Además, los cánceres incluyen mixosarcoma, sarcoma osteogénico, endoteliosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, mesotelioma, Sinovioma, hemangioblastoma , carcinoma epitelial, cistoadenocarcinoma, carcinoma broncogénico, carcinoma de glándula sudorípara, carcinoma de glándula sebácea, carcinoma papilar y adenocarcinoma papilar (para la revisión de todos los trastornos, ver Fishman et al. (1985) Medicine, 2a Ed. , J.B. Lippincott Co . , Philadelphia ; y Murphy et al. (1997) Informed Decisions: The Complete Book of Cáncer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., Estados Unidos de América).

Por consiguiente, los métodos y composiciones también son útiles en el tratamiento o prevención de una variedad de cánceres u otras enfermedades proliferativas anormales que incluyen (pero no limitan a), las siguientes: carcinoma, que incluye el de vejiga, pecho, colon, riñon, hígado, pulmón, ovario, páncreas, estómago, próstata, cerviz, tiroides y piel; incluyendo carcinoma de células escamosas, tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, que incluye leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linforna de células B, linforna de células T, linforna de Burketts; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, que incluyen leucemia mielagenosa aguda y crónica y leucemia promielocítica ; tumores de origen mesenquimal, que incluyen fibrosarcoma y rabdomioscarcoma ; otros tumores, que incluyen melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico, que incluyen astrocitoma, neuroblastoma, glioma, y schwanomas; tumores de origen mesenquimal, que incluyen fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y osteosarcoma ; y otros tumores, que incluyen melanoma, xenoderma pigmentosa, queratoactantoma, seminoma, cáncer folicular de tiroides y teratocarcinoma. También se contemplan los cánceres causados por aberraciones en la apoptosis que también pueden tratarse por los métodos y composiciones de la Invención. Tales cánceres pueden incluir pero no se limitan a linfornas foliculares, carcinomas con mutaciones p53, tumores dependientes de hormonas de pecho, próstata y ovario, y lesiones precancerígenas tales como poliposis adenomatosa familiar, y síndromes mielodisplásicos .

En modalidades específicas, la malignidad o los cambios disproliferativos (tales como metaplasias y displasias) , o trastornos hiperproliferativos, se tratan o evitan a través de los métodos y composiciones de la invención en el ovario, vejiga, pecho, colon, pulmón, piel, páncreas, y útero. En otras modalidades específicas, sarcoma, melanoma, o leucemia se tratan o se evitan a través métodos y composiciones de la invención .

En una modalidad específica, una molécula de la invención (por ejemplo, un diacuerpo que comprende múltiples dominios de unión de epítopo y, opcionalmente un dominio Fe (o una de sus porciones) ) inhibe o reduce el crecimiento de células cancerígenas en al menos 99%, al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 60%, al menos 50%, al menos 45%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 35%, al menos 30%, al menos 25%, al menos 20%, o al menos 10% con relación al crecimiento de las células cancerígenas en ausencia de la molécula de la invención .

En una modalidad específica, una molécula de la invención (por ejemplo, un diacuerpo que comprende múltiples dominios de unión de epítopo y, opcionalmente un dominio Fe (o una de sus porciones) ) aniquila células o inhibe o reduce el crecimiento de las células cancerígenas en al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 100% mejor que la molécula progenitora.

ENFERMEDAD AUTOINMUNITARIA Y ENFERMEDADES INFLAMATORIAS En algunas enfermedades, las moléculas de la invención comprenden un dominio de unión de epítopo específico para FCYRIIB y/o un dominio Fe variante (o una de sus porciones) , modificado de acuerdo con los métodos de la invención, cuyo dominio Fe exhibe una mayor afinidad para FCYRIIB y una afinidad disminuida para FCYRIIIA y/o FcyRIIA con relación a un dominio Fe de tipo silvestre. Las moléculas de la invención con tales características de unión son útiles en la regulación de la respuesta inmunitaria, por ejemplo, en la inhibición de la respuesta inmunitaria en conexión con enfermedades autoinmunitarias o enfermedades inflamatorias. Aunque no se pretende estar unido a ningún mecanismo de acción en particular, las moléculas de la invención con una afinidad para FcyRIIB y/o que comprenden un dominio Fe con una afinidad aumentada para FcyRIIB y una afinidad disminuida para FcyRIIIA y/o FcyRIIA pueden conducir a la desestimulación de la activación de la respuesta para FcyR y la inhibición de la sensibilidad celular, y de esta forma tiene una eficacia terapéutica para tratar y/o prevenir un trastorno autoinmunitarios .

La invención también proporciona métodos para prevenir, tratar o manejar uno o más síntomas asociados con un trastorno inflamatorio en un sujeto que además comprende, administrar al sujeto una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de uno o más agentes antiinflamatorios. La invención también proporciona métodos para prevenir, tratar o manejar uno o más síntomas asociados con una enfermedad autoinmunitaria que además comprende, administrar al sujeto una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de uno o más agentes inmunomoduladores. Ver la sección 5.7 que proporciona ejemplos no limitantes de agentes anti-inflamatorios y agentes inmunomoduladores.

Los ejemplos de trastornos autoinmunitarios que pueden tratarse durante la administración de las moléculas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido, enfermedad de Addison autoinmunitaria, enfermedades autoinmunitarias de la glándula adrenal, anemia hemolítica autoinmunitarias, hepatitis autoinmunitaria, inflamación de los ovarios y orquitis autoinmunitaria, trombocitopenia autoinmunitaria, enfermedad de Behcet, pénfigo ampuloso, miocardiopatía, dermatitis del celiaco, síndrome de disfunción inmunitaria de fatiga crónica (CFIDS) , polineuropatía desmielizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss , pénfigo de cicatriz, síndrome de CREST, enfermedad de aglutinina fría, enfermedad de Crohn, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis , glomerulonefritis , enfermedad de Graves-Basedow, síndrome de Guillain-Barré , tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, trombocitopenia púrpura idiopática (PTI) , neuropatía IgA, artritis juvenil, liquen plano, lupus eritematoso, enfermedad de Meniere, enfermedad del tejido conectivo mixta, esclerosis múltiple, diabetes mellitus tipo 1 o inmunomediada , miastenia grave, pénfigo vulgaris, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policrondritis , síndromes poliglandulares , polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis , agamaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriática, fenómeno de Raynauld, síndrome de Reiter, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjógren, síndrome de hombre rígido, lupus sistémico eritematoso, lupus eritematoso, arteritis de Takayasu, arteritis temporal, arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis, vasculitis herpetiforme dermatitis, vitíligo, y granulomatosis de Wegener. Los ejemplos de trastornos inflamatorios incluyen, pero no se limitan a, asma, encefalitis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) , trastornos alérgicos, choque séptico, fibrosis pulmonar, espondiloartropatía no diferenciada, artropatía no diferenciada, artritis, osteolisis inflamatoria e inflamación crónica que resulta de infecciones virales o de bacteria crónica. Como se describe en la presente, en la Sección 2.2.2, algunos trastornos autoinmunitarios se asocian con una afección inflamatoria. De esta forma, existe un traslape entre lo que se considera un trastorno autoinmunitario y un trastorno inflamatorio. Por consiguiente, algunos trastornos autoinmunitarios también pueden caracterizarse como trastornos inflamatorios. Los ejemplos de trastornos inflamatorios que pueden prevenirse, tratarse o manejarse de acuerdo con los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, asma, encefalitis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) , trastornos alérgicos, choque séptico, fibrosis pulmonar, espondiloartropatía no diferenciada, artropatía no diferenciada, artritis, osteolisis inflamatoria, e inflamación crónica que resulta de infecciones virales o de bacterias crónicas.

Las moléculas de la invención que comprenden por lo menos un dominio de unión del epítopo específicas para FCYRIIB y/o un dominio FC variante con una afinidad mejorada para FCYRIIB y una afinidad disminuida para FCYRIIIA también pueden utilizarse para reducir la inflamación experimentada por animales, particularmente mamíferos, con trastornos inflamatorios. En una modalidad específica, una molécula de la invención reduce la inflamación en un animal en por lo menos 99%, al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 60%, al menos 50%, al menos 45%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 35%, al menos 30%, al menos 25%, al menos 20%, o al menos 10% con relación a la inflamación con un animal, que no administra la molécula .

Las moléculas de la invención comprenden por menos un dominio de unión de epítopo específico para FCYRIIB y/o un dominio Fe variante con una afinidad mejorada para FCYRIIB y una afinidad disminuida para FcyRIIIA también pueden unirse para prevenir rechazo a trasplante.

ENFERMEDADES INFECCIOSAS La invención también abarca métodos para tratar o prevenir una enfermad infecciosa en un sujeto que comprende administrar una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de una o más moléculas de la invención que comprende por lo menos un dominio de unión de epítopo específico para un agente infeccioso asociado con enfermedad infecciosa. En ciertas modalidades, las moléculas de la invención son tóxicas para el agente infeccioso, mejoran la respuesta inmunitaria contra el agente o mejoran la función efectora contra el agente, con relación a la respuesta inmunitaria en ausencia de la molécula. Las enfermedades infecciosas que pueden tratarse o prevenirse a través de las moléculas de la invención son causadas por agentes infecciosos que incluyen pero no se limitan a, virus, bacterias, hongos, protozoarios , y virus .

Las enfermedades virales que pueden tratarse o prevenirse utilizando las moléculas de la invención junto con los métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, las causadas por hepatitis de tipo A, hepatitis de tipo B, hepatitis de tipo C, influenza, varicela, adenovirus, herpes simple de tipo I (HSV-I) , herpes simple de tipo II (HSV-II) , rinderpest, rinovirus, ecovirus, rotavirus, virus sincitial respiratorio, virus de papiloma, virus de papota, citomegalovirus , equinovirus, arbovirus, huntavirus, virus coxsackie, virus de paperas, virus de sarampión, virus de rubéola, virus de polio, virus de viruela, virus de Epstein Barr, el virus de inmunodeficiencia humana de tipo I (VIH-I), virus de inmunodeficiencia humana de tipo II (VIH-2) , y agentes de enfermedades virales tales como meningitis viral, encefalitis, dengue o viruela.

Las enfermedades bacterianas que pueden tratarse o prevenirse utilizando las moléculas de la invención junto con los métodos de la presente invención, que son causadas por bacteria incluyen, pero no se limitan a, riquetsia de miobacteria, micoplasma, neisseria, S. pneumonía, Borrelia burgdorferi (enfermedad de Lyme) , Bacillus antracis (ántrax) , tétanos, estreptococo, estafilococo, micobacteria, tétanos, tifoidea, cólera, plaga, difteria, clamidia, S. aureus y legionela .

Las enfermedades de protozoarios que pueden tratarse o prevenirse utilizando las moléculas de la invención junto con los métodos de la presente invención, que son causadas por protozoarios incluyen, pero no se limitan a, leishmania, coczidia, trpanosoma o malaria.

Las enfermedades parasíticas que pueden tratarse o prevenirse utilizando las moléculas de la invención junto con los métodos de la presente invención, que son causadas por parásitos que incluyen, pero no se limitan a, clamidia y riquetsia .

De acuerdo con un aspecto de la invención, las moléculas de la invención que comprenden por lo menos un dominio de unión a epítopo específico para un agente infeccioso exhiben una función efectora del anticuerpo hacia el agente, por ejemplo, la proteína patogénica. Los ejemplos de agentes infecciosos incluyen pero no se limitan a (por ejemplo, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecials, Candida albicans, Proteus vulgaris, Staphylococcus viridans, and Pseudomonas aeruginosa) , un patógeno (por ejemplo, papovavirus linfotrópico B (LPV) , Bordetella pertusis; virus de la enfermedad de Borna (BDV) , coronavirus de bovino, virus de coriomeningitis ; virus del dengue; un virus, E. coli, Ebola, Ecovirus 1; Ecovirus-11 (EV) ; endotoxina (LPS) , bacterias entéricas, virus huérfano entérico, enterovirus; virus de leucemia de felino; virus de la enfermedad de pies y boca; virus de leucemia del mono de Gibbon (GALV) ; la bacteria Gram-negativa; Helicobacter pylori, virus de la hepatitis B (HVB) , virus de herpes simple, VIH-1; Citomegalovirus humano; coronavirus humanos; influenza A, B y C; Legionella; Leishmania mexicana, monocitogenes de Listeria, virus del sarampión, meningococo; Morbillivirus , virus de hepatitis del ratón; virus de leucemia murino; virus de herpes gama de murino; retrovirus de murino; virus de hepatitis de ratón coronavirus de murino; Micobacteria aviar-M, gonorrea Neisseria; virus de la enfermedad de Newcastle; parvovirus B19; Plasmodium falciparum; Virus de viruela; Pseudomonas ; rotavirus; Salmonella typhiurium; Shigella, Streptococo; virus 1 linfotrópico de célula T; virus de la vacuna) .

DESINTOXICACION La invención también abarca métodos para desintoxicación en un sujeto expuesto una toxina (por ejemplo, una molécula de fármaco tóxico) que comprende administrar una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de una o más o más moléculas de la invención que comprende por lo menos un dominio de unión de epítopo específico para molécula de fármaco tóxico. En ciertas modalidades, la unión de la unió de la molécula de la invención a la toxina reduce o elimina el efecto fisiológico adverso de tal toxina. En aún otras modalidades, la unión del diacuerpo de la invención a la toxina aumenta o mejora la eliminación, degradación o neutralización de la toxina con relación a la eliminación a la eliminación, degradación o neutralización de la ausencia del diacuerpo. La inmunotoxicoterapia de acuerdo con los métodos de la invención puede utilizarse para tratar sobredosis o la exposición a fármacos incluyendo, pero no limitándose a, digixina, PCP, cocaína, conquicina, y antidepresivos tricíclicos .

TERAPIA DE COMBINACION La invención además abarca la administración de las moléculas de la invención en combinación con terapias conocidas por el experto en la técnica, para el tratamiento o prevención de cáncer, enfermedad autoinmunitaria , enfermedad infecciosa o intoxicación, que incluye pero no se limita a, quimioterapias estándares experimentales actuales, terapias hormonales, terapias biológicas, inmunoterapias , terapias por radiación o cirugía. En algunas modalidades, las moléculas de la invención pueden administrarse en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de uno o más agentes, anticuerpos terapéuticos u otros agentes conocidos en la técnica para el tratamiento y/o prevención de cáncer, enfermedad autoinmunitarias , enfermedad infecciosa o intoxicación .

En ciertas modalidades, una o más de las moléculas de la invención se administran a un mamífero, preferiblemente a un humano, concurrentemente con uno o más de otros agentes terapéuticos útiles para el tratamiento de cáncer. El término "concurrentemente" no está limitado a la administración de agentes profilácticos o terapéuticos a exactamente el mismo tiempo, sino más bien significa que una molécula de la invención y el otro agente se administra a un mamífero en una secuencia y dentro de un intervalo de tiempo de tal forma que la molécula de la invención puede actuar junto con el otro agente para proporcionar un beneficio aumentado que si es administrada de otra forma. Por ejemplo, cada agente profiláctico o terapéutico (por ejemplo, quimioterapia, terapia por radiación, terapia hormonal o terapia biológica) puede administrarse al mismo tiempo o secuencialmente en cualquier orden a diferentes puntos en el tiempo; sin embargo, sino se administra al mismo tiempo, deberá administrarse suficientemente cerca en tiempo para así proporcionar el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Cada agente terapéutico puede administrarse de manera separada, en cualquier forma apropiada y a través de cualquier ruta adecuada. En varias modalidades, los agentes profilácticos o terapéuticos se administran a menos de 1 hora separados , a aproximadamente 1 hora a aproximadamente 2 horas separados, de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas separados, de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas separados, de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas separados, de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 horas separados, de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 7 horas separados, de aproximadamente 7 horas a aproximadamente 8 horas separados, de aproximadamente 8 horas a aproximadamente 9 horas separados, de aproximadamente 9 horas a aproximadamente 10 horas separados, de aproximadamente 10 horas a aproximadamente 11 horas separados, de aproximadamente 11 horas a aproximadamente 12 horas separados, no más de 24 horas 24 horas separados o no más de 48 horas separados. En modalidades preferidas, dos o más componentes se administran dentro de la misma visita del paciente.

En otras modalidades, los agentes profilácticos o terapéuticos se administran de aproximadamente 2 a 4 días separados, de aproximadamente 4 a 6 días separados, de aproximadamente 1 semana separados, de aproximadamente 1 a 2 semanas separados, o más de 2 semanas separados. En modalidades preferidas, los variantes profilácticos o terapéuticos se administran en un marco de tiempo en donde ambos agentes aún están activos. Un experto en la técnica será capaz de determinar tal marco de tiempo mediante la determinación de la vida media de los agentes administrados.

En ciertas modalidades, los agentes profilácticos o terapéuticos de la invención se administran cíclicamente a un sujeto. La terapia cíclica involucra la administración del primer agente durante un periodo de tiempo, seguido por la administración de un segundo agente y/o un tercer agente durante un periodo de tiempo y repetir esta administración secuencial. La terapia cíclica puede reducir el desarrollo de la resistencia a una o más de las terapias, evitar o reducir los efectos secundarios de una de las terapias, y/o mejorar la eficacia del tratamiento.

En ciertas modalidades, los agentes profilácticos o terapéuticos se administran en un ciclo de menos de aproximadamente 3 semanas, de aproximadamente una o dos veces cada dos semanas, de aproximadamente una vez cada 10 días o de aproximadamente una vez cada semana. Un ciclo puede comprender la administración de un agente terapéutico o profiláctico a través de infusión durante aproximadamente 90 minutos cada ciclo, de aproximadamente 1 hora cada ciclo, de aproximadamente 45 minutos cada ciclo. Cada ciclo puede comprender al menos 1 semana de descanso, al menos 2 semanas de descanso, al menos 3 semanas de descanso. El número de ciclo administrados es de 1 a aproximadamente 12 ciclos, más típicamente de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 ciclos, y más típicamente de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 ciclos .

En aún otras modalidades, los agentes terapéuticos y profilácticos de la invención se administran en regímenes de dosificación metronómicos , ya sea a través de infusión continua o administración frecuentes sin periodos de descanso extendidos. Tales administraciones metronómicas pueden involucrar la dosificación a intervalos constantes sin periodos de descanso. Típicamente los agentes terapéuticos, en particular los agentes citotóxicos, se utilizan a dosis más bajas. Típicamente los agentes terapéuticos, en particular los agentes citotóxicos, se utilizan a dosis más bajas. Tales regímenes de dosificación abarcan la administración viable crónica de dosis relativamente bajas durante periodos extendidos de tiempo. En modalidades preferidas, el uso de dosis más bajas puede minimizar los efectos secundarios tóxicos y eliminar los periodos de descanso. En ciertas modalidades, los agentes terapéuticos y profilácticos se suministran a través de infusión a baja dosis crónica o continua en el intervalo de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 2 días, de aproximadamente 1 semana, de aproximadamente 2 semanas, de aproximadamente 3 semanas a aproximadamente 1 mes a aproximadamente 2 meses, de aproximadamente 3 meses, de aproximadamente 4 meses, de aproximadamente 5 meses, de aproximadamente 6 meses. La programación de los regímenes de dosificación puede optimizarse por el oncologo experto.

En otras modalidades, los cursos de tratamiento se administran concurrentemente a un mamífero, es decir, dosis individuales de los terapéuticos que se administran de manera separada aún dentro de un intervalo de tiempo de tal forma que las moléculas de la invención pueden funcionar juntas con el otro agente o agentes. Por ejemplo, un componente puede administrarse una vez por semana en combinación con otros componentes que puede administrar una vez cada dos semanas o una vez cada 3 semanas. En otras palabras los regímenes de dosificación para los terapéuticos se llevan a cabo concurrentemente aún cuando los terapéuticos o no se administran simultáneamente o dentro de la misma visita del paciente .

Cuando se utilizan en combinación con otros agentes profilácticos y/o terapéuticos, las moléculas de la invención y el agente profiláctico y/o terapéutico puede actuar aditivamente o, más preferiblemente, sinérgicamente . En una modalidad, una molécula de la invención se administra concurrentemente con uno o más de otros agentes terapéuticos en la misma composición farmacéutica. En otra modalidad, una molécula de la invención se administra concurrentemente con uno o más agentes terapéuticos en composiciones farmacéuticas separadas. En aún otra modalidad, la molécula de la invención se administra antes de o posterior en la administración de otro agente profiláctico o agente terapéutico. La invención contempla la administración de una molécula de la invención en combinación con otros agentes profilácticos o terapéuticos a través de las mismas o diferentes rutas de administración, por ejemplo oral y parenteral . En ciertas modalidades, cuando una molécula de la invención se administra concurrentemente con otro agente profiláctico o terapéutico que potencialmente produce efectos secundarios adversos que incluyen, pero no se limitan a, toxicidad, el agente profiláctico o terapéutico puede ventajosamente administrarse a una dosis que cae por debajo del umbral en el cual se provoca el efecto secundario adverso .

Las cantidades de dosificación y las frecuencias de administración provistas en la presente están abarcadas por los términos terapéuticamente efectivo y profilácticamente efectivo. La dosis y la frecuencia además típicamente variarán de acuerdo con factores específicos para cada paciente dependiendo de los agentes terapéuticos o profilácticos específicos administrados, la severidad y tipo de cáncer, la ruta de administración así como la edad, peso corporal, respuesta e historial médico pasado del pasado del paciente. Los regímenes adecuados pueden seleccionarse a través de un experto en la técnica considerando tales factores y a través de lo siguiente, por ejemplo, las dosis reportadas en la literatura y recomendadas en Physician's Desk Reference (56a ed., 2002).

AGENTES ANTICANCERIGENOS En una modalidad específica, los métodos de la invención abarcan la administración de una o más moléculas de la invención con uno o más agentes terapéuticos utilizados por tratamiento y/o prevención de cáncer. En una modalidad, los inhibidores de angiogénesis pueden administrarse en combinación con las moléculas de la invención. Los inhibidores de angiogénesis que pueden utilizarse en los métodos y composiciones de la invención incluyen pero no se limitan a: Angiostatina (fragmento de plasminógeno); antitrombina antiangiogénica III; Angioenzima ; ABT-627; Bay 12-9566; Benefina; Bevacizumab; BMS-275291; inhibidor derivado del cartílago (CDI) ; CAI; fragmento complemento CD59; CEP- 7055; Col 3; Combretastatina A-4; Endostatina (fragmento XVIII de colágeno) ; fragmento de Fibronectina ; Gro-beta,- Halofuginona; Heparinasas ,- fragmento de hexasacárido de Heparina; HMV833; gonadotropina coriónica humana (hCG) ; IM-862; Interferón alfa/beta/gama; proteína inducible por Interferón (IP-10); Interleucina- 12 ; Kringle 5 (fragmento de plasminógeno) ; Marimastat; inhibidores de metaloproteinasa (TIMPs) ; 2 -Metoxiestradiol ; MMI 270 (CGS 27023 A); MoAb IMC-ICll; Neovastat ; NM-3; Panzem; PI-88; inhibidor de ribonucleasa de Placenta; inhibidor de activador de Plasminógeno ; factor-4 de plaqueta (PF4) ; Prinomastat; fragmento de 16 kDa de prolactina; proteína relacionada con proliferina (PRP) ; PTK 787/ZK 222594; Retinoides; Solimastat; escualamina; SS 3304; SU5416; SU6668; SU11248; Tetrahidrocortisol-S ; tetratiomolibdato ; talidomida; Trombospondina-1 (TSP-1) ; TNP-470; factor-beta de crecimiento de transformación (TGF-b) ; Vasculostatina ; Vasostatina (fragmento de calreticulina) ; ZD6126; ZD 6474; inhibidores de transfersa farnesilo (FTI) ; y bifosfonatos .

Los agentes anti -cancerígenos que pueden utilizarse en combinación con las moléculas de la invención y las varias modalidades de la invención, incluyen composiciones farmacéuticas y formas de dosificación y kits de la invención, que incluyen, pero no se limitan a: acivicina; aclarubicina; clorhidrato de acodazol; acronina; adozelesina; aldesleucina; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona ; aminoglutetimida ; amsacrina; anastrozol; Antramicina ; asparaginasa; asperlina; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastat; benzodepa; bicalutamida; clorhidrato de bisantreno; bisnafida dimesilato; bizelesina; sulfato de bleomicina; brequinar sódico; bropirimina ; busulfano; cactinomicina ; calusterona; caracemida; carbetimer; carboplatina ; carmustina; clorhidrato de carubicina; carzelesina; cedefingol; clorambucilo ; cirolemicina ; cisplatina; cladribina; crisnatol mesilato; ciclofosfamida; citarab na; dacarbazina; dactinomicina ; clorhidrato de daunorubicina; decitabina; dexormaplatina; dezaguanina; dezaguanina mesilato; diaziquona; docetaxel; doxorubicina ; clorhidrato de doxorubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; clorhidrato de eflornitina; elsamitrucina; enloplatina; enpromato; epipropidina; clorhidrato de epirubicina; erbulozol ; clorhidrato de esorubicina ; estramustina; fosfato sódico de estramustina ; etanidazol; etoposida; fosfato de etoposida; etoprina; clorhidrato d fadrozol; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fosfato de fludarabina; fluorouracilo; flurocitabina; fosquidona; fostriecina sódica; gemcitabina; clorhidrato de gemcitabina; hidroxiurea; clorhidrato de idarubicina; ifosfamida; ilmofosina; interleucina II (que incluye interleucina II, o rIL2 recombínate) , interferón alfa-2a; interferón alfa-2b; interferón alfa-nl ; interferón alfa-n3; interferón beta-la; interferón gamma-Ib; iproplatina ; clorhidrato de irinotecan; acetato de lanreotida; letrozol; acetato de leuprolida; clorhidrato de liarozol; lometrexol sódico; lomustina; clorhidrato de losoxantrona; masoprocol; maitansina; clorhidrato de mecloretamina ; megestrol acetato; melengestrol acetato; melfalano; menogaril; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato sódico; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotano; clorhidrato de mitoxantrona ; ácido micofenólico ; nocodazol; nogalamicina; ormaplatina ; oxisuran; paclitaxel; pegaspargasa; peliomicina; pentamustina; peplomicina sulfato; perfosfamida ; pipobroman; piposulfan; clorhidrato de piroxantrona; plicamicina; plomestano; porfímero sódico; porfiromicina ; prednimustina ; clorhidrato de procarbazina ; puromicina; clorhidrato de puromicina; pirazofurina ; riboprina; rogletimida; safmgol ; clorhidrato de safmgol; semustina; simtrazeno; esparfosfato sódico; esparsomicina ; clorhidrato de espirogermanio ; espiromustina ; espiroplatina; estreptonigrina; estreptozocina ; sulofenur; talisomicina; tecogalan sódico; tegafur; clorhidrato de teloxantrona; temoporfana; teniposida; teroxirona; testolactona ; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina ; toremifen citrato; trestolon acetato; triciribina fosfato; trimetrexato; trimetrexato glucuronato; triptorelina; clorhidrato de tubulozol ; mostaza de uracilo; uredepa; vapreotida verteporfina ; vinblastina sulfato; vincristina sulfato; vindesina; vindesina sulfato; vinepidina sulfato; vinglicinato sulfato; vinleurosina sulfato,- vinorelbina tartrato; vinrosidina sulfato; vinzolidina sulfato; vorozol ; zeniplatina; zinostatina ; clorhidrato de zorubicina. Otros fármacos anticancerígenos incluyen, pero no se limitan a: 20-epi-1,25 dihidroxivitamina D3 ; 5-etiniluracilo; abiraterona; aclarubicina ; acilfulveno ; adecipenol; adozelesina; aldesleucina; antagonistas ALL-TK; altretamina ; ambamustina ; amidox; amifostina; ácido aminolevulínico ; amrubicin; amsacrina; anagrelida; anastrozol; andrografolida ; inhibidores de angiogénesis ; antagonista D; antagonista G; antarelix; proteína-1 morfogenética anti-dorsalizante ; antiandrógeno, carcinoma prostático; antiestrógeno; antineoplastón; oligonucleótidos antisentido; afidicolin glicinato; moduladores del gen de apoptosis; reguladores de apoptosis; ácido apurínico; ara-CDP-DL-PTBA; arginina deaminasa; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatina 1; axinastatina 2; axinastatina 3; azasetron; azatoxina; azatirosina; derivados de baccatina III; balanol; batimastat; antagonistas BCR/ ABL ; benzoclorinas ; benzoilestaurosporina; derivados de beta lactama; beta-aletina; betaclamicina B; ácido betulínico; inhibidor bFGF; bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilespermina ; bisnafida; bistrateno A; bizelesina; breflato; bropirimina; budotitano; butionina sulfoximina; calcipotriol ; calfostina C; derivados de camptotecina; canaripox IL-2; capecitabina; carboxamida-amino-triazol ; carboxiamidotriazol ; CaRest M3 ; CAR 700; inhibidor derivado de cartílago; carzelesina; inhibidores de caseína cinasa (ICOS); castanoespermina ; cecropina B; cetrorelix; clorlns; cloroquinoxalina sulfonamida; cicaprost; cis-porfriña; cladribina; análogos de clomifeno; clotrimazol ; colismicina A; colismicina B; combretastatina A4 ; análogo de combretastatina; conagenina; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina 8; derivados de criptoficina A; curacina A; ciclopentantraquinonas ; cicloplatama ; cipemicina; citarabina ocfosfato; factor citolítico; citostatina ; dacliximab; decitabina; deshidrodidemnina B; deslorelina ; dexametasona ; dexifosfamida ; dexrazoxano; dexverapamil ; diaziquona; didemnina B; didox; dietilnorespermina ; dihidro-5-azacitidina; dihidrotaxol , 9- ; dioxamicina ; difenil espiromustina ; docetaxel; docosanol; dolasetron; doxifluridina ; droloxifeno; dronabinol ; duocarmicina SA; ebselen; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflornitina; elemeno; emitefur; epirubicina; epriesterida ; análogo de estramustina ; agonistas de estrógeno; antagonistas de estrógeno; etanidazol; etoposida fosfato; exemestano; fadrozol ; fazarabina; fenretinida; filgrastima; finasterida; flavopiridol ; flezelastina ; fluasterona; fludarabina; clorhidrato fluorodaunorunicina; forfenimex; formestano; fostriecina; fotemustina; gadolinio texafirina; nitrato de galio; galocitabina ; ganirelix; inhibidores de gelatinasa; gemcitabina ; inhibidores de glutationa; hepsulfam; heregulina; hexametilen bisacetamida ; hipericina; ácido ibandrónico; idarubicina; idoxifen; idramantona; ilmofosina; ilomastat; imidazoacridones ; imiquimod; péptidos inmunoestimulantes ; inhibidor del receptor del factor 1 de crecimiento de tipo insulina; agonistas de interferón; interferones ; interleucinas; iobenguano; iododoxorubicina; ipomeanol, 4-; iroplact; irsogladina; isobengazol; isohomohalicondrina B; itasetrón; j asplaquinolida ; cahalalida F; lamelarina-N triacetato; lanreotida; leinamicina; lenograstima; lentinan sulfato; leptolestatina ; letrozol; factor inhibidor de leucemia; interferón alfa de leucocito; leuprolida+estrógeno-progesterona; leuprorelina; levamisol; liarozol; análogo de poliamina lineal; péptido disacárido lipófilo; compuestos de platino lipófilos; lisoclinamida 7; lobaplatina; lombricina; lometrexol ; lonidamina; losoxantrona; lovastatina; loxoribina; lurtotecan; lutetio texafirina; lisofilina; péptidos líticos; maitansina; manostatina A; marimastat; masoprocol; maspina; inhibidores de matrilisina; inhibidores de matriz de metaloproteinasa ; menogaril; merbarona; meterelina; metioninasa; metoclopramida ; inhibidor MIF; mifepristona ; miltefosina; mirimostim; AR bicatenario mal emparejado; mitoguazona; mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafida; factor de crecimiento de fibroblasto de mitotoxina-saporina ; mitoxantrona ; mofaroteno; molgramostim; anticuerpo monoclonal, gonadotrofina coriónica humana; sk de pared celular de lípido A de monofosforilo-bacteria ,- mopidamol; inhibidor génico resistente a fármaco múltiple; terapia a base del supresor 1 de tumor múltiples; agente anticancerígeno de mostaza; micaperóxido B; extracto de pared celular micobateriano ; miriaporona; N-acetildinalina ; benzamidas N-sustituidas ; nafarelina; nagrestip; naloxona+pentazocina; napavina; nafterpina; nartograstima ; nedaplatina; nemorubicina; ácido neridrónico; endopeptidasa neutral; nilutamida; nisamicina; moduladores de óxido nítrico; antioxidante de nitróxido; nitrulina; 06-bencilguanina ; octreotida; oquicenona; oligonucleótidos ; onapristona; ondansetron; ondansetron; oracina; inductor de citocina oral; ormaplatina; osaterona; oxaliplatina ; oxaunomicina ; paclitaxel; análogos de paclitaxel; derivados de aclitaxel; palauamina; palmitoilrhizoxina ; ácido pamidrónico; panaxitriol; panomifeno; parabactina; pazeliptina; pegaspargasa ; peldesina; pentosan polisulfato sódico; pentostatina; pentrozol; perflubron; perfosfamida ; alcohol perilíco; fenazinomicina ; Fenilacetato; inhibidores de fosfatasa; picibanil; clorhidrato de pilocarpina ; pirarubicina; piritrexim; placetina A; placetina B; inhibidor de activador de plasminógeno; complejo de plationo, complejo de platino-triamina, porfímero sódico; porfiromicina ; prednisona; propil bis-acridona ; prostaglandina J2 ; inhibidores de proteasoma; modulador inmunitario a base de proteína A; inhibidor C de proteína cinasa; inhibidores C de proteína cinasa, microalgal; inhibidores de proteína tirosina fosfatasa; inhibidores de fosforilasa de purina nucleosida; purpurinas; pirazoloacridina ; conjugado de polioxietileno de hemoglobina piridoxilada; antagonistas raf; raltitrexed; ramosetron; inhibidores de farnseil proteína transferasa; inhibidores ras; inhibidor ras-GAP; reteliptina desmetilada; renio Re 186 etidronato; rizoxina; ribozimas; RII retinamida; rogletimida; rohitucina; romurtida; roquinimex; rubiginona Bl; ruboxilo; safmgol; saintopina; SarCNU; sarcofitol A; sargramostima ; miméticos de Sdi 1; semustina; inhibidor 1 derivado de senescencia; oligonucleótidos sentido; inhibidores de transducción de señal; moduladores de transducción de señal; proteína de unión a antígeno de cadena individula; sizofiran; sobuzoxana; borocaptato sódico; fenilacetato sódico; solverol; proteína de unión a somatomedina ; sonermina; ácido esparfósico ; espicamicina D; espiromustina ; esplenopentina; espongistatina 1; escualamina; inhibidor de célula madre; inhibidores de división de célula madre; estipiamida; inhibidores de estromelisina ; sulfmosina; antagonista de péptido intestinal vasoactivo superactivo; suradista; suramina; swainsonina; glicosaminoglicanos sintéticos; talimustina; tamoxifen metyoduro; tauromustina ; tazaroteno; tecogalan sódico; tegafur; telurapirilio ; inhibidores de telomerasa; temoporfm; temozolomida ; teniposida; tetraclorodecaóxido ; tetrazomina; taliblastina ; tiocoralina; trombopoyetina ; mimético de trombopoyetina ; timalfasina; agonista del receptor de timopoyetina ; tymotrinano; hormona estimuladora de tiroides; estaño etil etiopurpurina; tirapazamina; bicloro de titanoceno; topsentina; toremifeno; factor de célula madre totipotente; inhibidores de traducción; tretinoina; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorelina ; tropisetron; turosterida; inhibidores de tirosina cinasa; tirfostinas; inhibidores UBC; ubenimex; factor inhibidor de crecimiento derivado del seno urogenital; antagonistas del receptor de urocinasa; vapreotida; variolina B; terapia génica de eritrocito, sistema vector; velaresol; veramina; verdinas; verteporfina; vinorelbina; vinxaltina; vitaxina; vorozol ; zanoterona; zeniplatina; zilascorb; y zinostatina stimalamer.

Preferred additional anti-cancer drugs are 5 - fluorouracilo y leucovorina. Los fármacos anti-cancerígenos adicionales preferidos son 5-fluorouracilo y leucovorina.

Los ejemplos de anticuerpos terapéuticos que pueden utilizarse en los métodos de la invención incluyen pero no se limitan a ZENAP AX® (daclizumab) (Roche Pharmaceuticals , Suiza) que es un inmunosupresor, el anticuerpo monoclonal anti-CD25 humanizado para la prevención de rechazo al aloinjerto renal agudo; PANOREX™ que es un anticuerpo IgG2a de antígeno de superficie de célula anti-17-?? de murino (Glaxo Wellcome/Centocor) ; BEC2 que es un anticuerpo IgG anti-idiotipo (epítopo GD3) (ImClone System) ; IMC-C225 que es un anticuerpo IgG anti-EGFR quimérico (ImClone System) ; VITAXIN™ que es un anticuerpo de integrina anti-aV^3 humanizado (Applied Molecular Evolution/Medlmmune) ; Smart M195 que es un anticuerpo IgG anti-CD33 humanizado (Protein Design Lab/Kanebo) ; LYMPHOCIDE™ que es un anticuerpos IgG anti-CD22 humanizado (Immunomedics) ICM3 es un anticuerpo anti-ICA3 humanizado (ICOS Pharm) ; IDEC-114 es un anticuerpo anti-CD80 primatizado (IDEC Pharm/Mitsubishi) ; IDEC-131 es un anticuerpo anti-CD40L humanizado (IDEC/Eisai) ; IDEC-151 es un anticuerpo anti-CD4 primatizado (IDEC) ; IDEC- 152 es un anticuerpos anti-CD23 primatizado (IDEC/Seikagaku) ; SMART es un IgG anti-CD3 humanizado (Protein Design Lab); 5G1.1 es un anticuerpo del factor 5 anti-complemento humanizado (C5) (Alexion Pharm) ; D2E7 es un anticuerpo anti-T F- humanizado (CAT/BASF) ; CDP870 es un fragmento anti-T F- Fab humanizado (Celltech) ; IDEC-151 es un anticuerpo IgGl anti-CD4 primatizado (IDEC Pharm/SmithKline Beecham) ; MDX-CD4 es un anticuerpo anti-CD4 IgG humano (Medarex/Eisai/Genmab) ; CDP571 es un anticuerpo anti-TNF-a IgG4 humanizado (Celltech) ; LDP-02 es un anticuerpo anti-a4ß7 humanizado (LeukoSite/Genentech) ; OrthoClone 0 G4? es un anticuerpo IgG anti-CD4 humanizado (Ortho Biotech) ; ATOVA™ es un anticuerpo IgG anti-CD40L humanizado (Biogen) ; ANTEGREN™ es un anticuerpo IgG anti-VLA-4 (Elan) ; y CAT-152 es un anticuerpo anti-TGF- 2 humano (Cambridge Ab Tech) . Otros ejemplos de anticuerpos terapéuticos que pueden utilizarse de acuerdo con la invención se presentan en la Tabla 8.

Tabla 8 : Anticuerpos terapéuticos anticancerígenos Compañia Producto Enfermedad Objetivo Abgenix ABX-EGF Cáncer receptor EGF AltaRex OvaRex Cáncer ovárico antígeno de tumor CA125 BravaRex Cánceres metastáticos antígeno de tumor MUC1 Antisoma Teragin Cáncer ovárico Antígeno PEM (pemtumomabitrio- 90) Therex Cáncer de pecho Antígeno PEM Boehringer Blvatuzumab Cáncer de cabeza y CD 4 Ingelheim cuello Centocor/J&J Panorex Cáncer colorectal 17-lA ReoPro PTCA gp Illb/IIIa ReoPro MI agudo gp Illb/IIIa ReoPro Choque isquémico gp Illb/IIIa Corixa Bexocar NHL CD20 CRC MAb, idiotipico Vacuna de cáncer gP72 Technology 105AD7 colorectal Crucell Anti-EpCAM cáncer Ep-CAM Cytoclonal Cáncer de pulmón Cáncer de pulmón de NA Compañía Producto Enfermedad Objetivo MAb célula no pequeña Genentech Herceptina Cáncer de pecho HER-2 raetastático Herceptina Cáncer de pecho de HER-2 etapa temprana Rituxan NHL de CD20 reincidencia/refractari o de bajo grado o folicular Rituxan NHL intermedio y de CD20 alto grado MAb-VEGF NSCLC, metastático VEGF MAb-VEGF Cáncer colorectal, VEGF metastático AMD Fab Degeneración macular CD18 relacionada con la edad E-26 (2a gen. IgE) Asma alérgica y rinitis IgE IDEC Zevalin (Rituxan + NHL de célula B de bajo CD20 itio-90) grado folicular, reincidente o refractario CD20-positivo, Rituximab-NHL Compañía Producto Enfermedad Objetivo refractario ImClone Cetuximab + Carcinoma colorectal Receptor EGF inotecan refractario Cetuximab + Cáncer de cabeza y cisplatina y cuello recientemente Receptor EGF radiación diagnosticado o recurrente Cetuximab + Carcinoma pancreático Receptor EGF Gemcitabina metastático recientemente diagnosticado Cetuximab + Cáncer de cabeza y Receptor EGF cisplatin + cuello recurrente o 5FU o Taxol metastático Cetuximab + Carcinoma de pulmón de Receptor EGF carboplatina + célula no pequeña paclitaxel recién diagnosticado Cetuximab + Cáncer de cabeza y Receptor EGF Cisplatina cuello (enfermedad local/regional incurable extensiva y metástasis distante) Cetuximab + Carcinoma de cabeza y Receptor EGF radiación cuello localmente Compañía Producto Enfermedad Objetivo avanzado BEC2 + Bacilo de Carcinoma de pulmón de Imita CD3 de Calmette Guerin célula pequeña gangliosida BEC2 + Bacilo Melanoma Mita GD3 de gangliosida Calmette Guerin Cáncer colorectal con Receptor VEGF IMC-1C11 metástasis de hígado ImmunoGen nuC242-DMl Cáncer colorectal nuC242 gástrico y pancreático ImmunoMedics LymphoCide Linfoma no de Hodgkins CD22 LymphoCide Y- 90 Linfoma no de Hodgkins CD22 CEA-Cide Tumores sólidos CEA metastáticos Cide Y- 90 Tumores sólidos CEA metastáticos CEA-Scan (Tc-99m Cáncer colorectal CEA Marcado como (radioimagen) arcitumomab) CEA-Scan (Tc-99m Cáncer pecho CEA Marcado como (radioimagen) arcitumomab) CEA-Scan (Tc-99m Cáncer de pulmón CEA Marcado como (radioimagen) arcitumomab) Compañía Producto Enfermedad Objetivo CEA-Scan (Tc-99m Tumores intraoperativos CEA Marcado como (radioimagen) arcitumomab) LeukoScan (Tc-99m Infección tisular suave CEA Marcado como (radioimagen) sulesomab) LymphoScan Linfomas (radioimagen) CD22 (marcado Tc-99m) AFP-Scan (marcado Cánceres de células 7 AFP Tc-99m gen de hígado Intracel HumaRAD-HN (+ Cáncer de cabeza y NA itio-90) cuello HumaSPECT Formación de imágenes NA coloréeteles Medarex MDX-101 (CTLA-4) Cáncer de próstata y CTLA-4 MDX-210 otros (sobreexpresión Cáncer de próstata HER-2 her-2) Medlmmune MDX-210/MAK Cáncer HER-2 Merck KGaA Vitaxina Cáncer ??ß MAb 425 Varios cánceres Receptor EGF IS-IL-2 Varios cánceres Ep-CAM Millennium Campath Leucemia linfocítica CD52 (alemtuzumab) crónica Compañía Producto Enfermedad Objetivo NeoRx CD20- s reptavidina Linfoma no de Hodgkins CD20 (+biotina- itrio 90) Avidicina Cáncer metastático NA (albúmina + NANRLU13 ) Peregrine Oncolima (+ yodo- Linfoma no de Hodgkins HLA-DR 10 beta 131) Cotara (+ yodo- Glioma maligno no Proteínas 131) amputable asociadas con ADN Pharmacia C215 (+ Cáncer pancreático NA enterotoxina de estafilococo) Corporaton MAb, cáncer de pulmón/riñon Cáncer de pulmón y NA nacolomab riñon tafenatox NA (C242 + Cáncer y pancreático enterotoxina de estafilococo). .

Protein Design Nuvion Malignidades de la CD3 Labs célula T SMART MI95 AML CD33 Compañía Producto Enfermedad Objetivo Titán SMART 1D10 NHL Antígeno HLA-DR CEA Vac Cáncer colorectal, CEA avanzado TriGem Melanoma metastático y GD2-gangliosida cáncer de pulmón de célula pequeña TriAb Cáncer de pecho MUC-1 metastático Trilex CEAVac Cáncer colorectal, CEA avanzado TriGem Melanoma metastático y GD2-gangliosida cáncer de pulmón de célula pequeña TriAb Cáncer de pecho MUC-1 metastático Viventia NovoMAb- Linfoma no de Hodgkins NA Biotech radiomarcado G2 Monopharm C Carcinoma colorectal y Antígeno SK-1 pancreático GlioMab-H (+toxina Glioma, melanoma NA de gelonina) neuroblastoma Xoma Rituxan NHL reincidente CD20 refractario de bajo grado o folicular Compañía Producto En ermedad Objetivo Rituxan NHL intermedio y de CD20 alto grado ING-1 Adenocarcinoma Ep-CAM AGENTES INMUNOMODULADORES Y AGENTES ANTI-INFLAMATORIOS La presente invención proporciona métodos de tratamiento para enfermedades autoinmunitarias y enfermedades inflamatorias que comprenden la administración de las moléculas de la invención junto con otros agentes de tratamiento. Los ejemplos de agentes inmunomoduladores incluyen, pero no se limitan a, metotrexato, ENBREL, REMICADE™, leflunomida, ciclofosfamida, ciclosporina A, y antibióticos de macrólido (por ejemplo, FK506 (tacrolimus) ) , metilprednisolona (MP) , corticosteroides , esteroides, micofenolato mofetilo, rapamicina (sirolimus) , mizoribina, desoxiespergualina, brequinar, malononitriloamindas (por ejemplo, leflunamida) , modulares del receptor de la célula T y moduladores del receptor de citocina.

Los agentes anti-inflamatorios han exhibido éxito en el tratamiento de trastornos inflamatorios y autoinmunitarios y ahora son comunes y es un tratamiento estándar para tales trastornos. Cualquier agente anti-inflamatorio bien conocido por el experto en la técnica puede utilizarse en los métodos de la invención. Los ejemplos no limitantes y agentes anti-inflamatorios incluyen fármacos no esteroide anti-inflamatorios (NSAIDs) , fármacos antiinflamatorios de esteroides, beta-agonistas, agentes anticolinérgicos , y metil xantina. Los ejemplos de NSAIDs incluyen, pero no se limitan a, aspirina, ibuprofeno, celecoxib (CELEBREX™) , diclofenaco (VOLTAREN™) , etodolaco (LODINE™) , fenoprofeno (NALFON™) , indometacina (INDOCIN™), quetoralaco (TORADOL™) , oxaprozina (DAYPRO™) , nabumentona (RELAFEN™) , sulindac (CLINORIL™) , tolmentina (TOLECTIN™) , rofecoxib (VIOXX™) , naproxeno (ALEVE™, NAPROSYN™) , quetoprofeno (ACTRON™) y nabumetona (RELAFEN™) . Tales NSAIDs funcionan a través de la inhibición de una ciclooxigenasa enzima (por ejemplo, COX-1 y/o COX-2) . Los ejemplos de fármacos anti-inflamatorios de esteroides incluye, pero no se limitan a, glucocorticoesteroides, dexametasona (DECADRON™) , cortisona, hidrocortisona, prednisona (DELTASONE™) , prednisolona, triamcinolona, azulfidina, y eicosanoides tales como prostaglandinas , tromboxanos, y leucotrienos .

Un ejemplo no limitante de anticuerpos que pueden utilizarse para el tratamiento o prevención de trastornos inflamatorios junto con las moléculas de la invención se presentan en la Tabla 9, y un ejemplo no limitante de los anticuerpos que pueden utilizarse para el tratamiento o prevención del trastorno inmunitario se presentan en la Tabla 10.

Tabla 9: Anticuerpos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias Nombre del Antigeno Tipo de Isotipo Patrocinadores Indicación Anticuerpo Objetivo Producto 5G1.1 Complemento Humanizado IgG Alexion Pharm Artritis (C5) Inc . eumatoide 5G1.1 Complemento Humanizado IgG Alexion Pharm SLE (C5) Inc . 5G1.1 Complemento Humanizado IgG Alexion Pharm Nefritis (C5) Inc . 5GL1-SC Complemento Humanizado ScFc Alexion Pharm Bypass (C5) Inc . Cardiopulmonar 5GL1-SC Complemento Humanizado ScFc Alexion Pharm Infarto al (C5) Inc . Miocardio 5GL1-SC Complemento Humanizado ScFc Alexion Pharm Angioplastía (C5) Inc .

ABX-CBL CBL Humano Abgenix Inc GvHD ABX-CBL CD147 Murino IgG Abgenix Inc Rechazo al Aloinjerto ABX-IL8 IL-8 Humano IgG2 Abgenix Inc Psoriasis Antegren VLA-4 Humanizado IgG Athena/Elan Esclerosis múltiple Anti-CDlla CDlla Humanizado IgGl Genentech Psoriasis Inc/Xoma Aiiti-CD18 CD18 Humanizado Fac'2 Genentech Inc Infarto al Miocardio Anti-LFAl CD18 Murino Fab' 2 Pasteur Rechazo al Merieux/ Aloinjerto Immunotech Antova CD40L Human zado IgG Biogen Rechazo al Aloinjerto Antova CD40L Humanizado IgG Biogen SLE BTI-322 CD2 Rata IgG Medimmune Inc GvHD, Psoriasis CDP571 TNF-Alfa Humanizado IgG4 Celltech Crohn CDP571 TNF-Alfa Humanizado IgG4 Celltech Artritis Nombre del Antígeno Tipo de Isotipo Patrocinadores Indicación Anticuerpo Objetivo Producto Reumatoide CDP850 Selectina E Humanizado Celltech Psoriasis Corsevin M Fact VII Quimérico Centocor Anticoagulante D2E7 TNF-Alfa Humano CAT/BASF Artritis Reumatoide HU23F2G CD11/18 Humanizado ICOS Pharm Inc Esclerosis múltiple Hu23F2G CD11/18 Humanizado igG ICOS Pharm Inc Infarto IC14 CD14 ICOS Pharm Inc Choque tóxico ICM3 ICAM-3 Humanizado ICOS Pharm Inc Psoriasis IDEC-114 CD80 Primatizado IDEC Pharm/ Psoriasis Mitsubishi IDEC-131 CD40L Humanizado IDEC Pharm/ SLE eisai IDEC-131 CD40L Humanizado IDEC Pharm/ Esclerosis eisai múltiple IDEC-151 CD4 Primatizado IgGl IDEC Pharm/ Artritis Glaxo Reumatoide SmithKline IDEC-152 CD23 Primatizado IDEC Pharm Asma/Alergia Infliximab TNF-Alga Quimérico IgGl Centocor Artritis Reumatoide Infliximab TNF-Alga Quimérico IgGl Centocor Crohn LDP-01 Beta 2- humanizado IgG Millennium Inc Infarto integrina (LeukoSite Inc. ) LDP-01 Beta 2- Humanizado IgG Millennium Inc Rechazo al integrina (LeukoSite Aloinj erto Inc. ) LDP-02 Alpha4beta7 Humanizado Millennium Inc Colitis (LeukoSite Ulcerativa Inc. ) MAK-195F TNF-Alfa Murino Fab'2 Knoll Pharm, Choque Tóxico BASF MDX-33 CD64 (FcR) Humano Medarex/ Trastornos Centeon Hematológicos Autoinmunitari os MDX-CD4 CD4 Humano IgG Medarex/Eisai/ Artritis Nombre del Antígeno Tipo de Isotipo Patrocinadores Indicación Anticuerpo Objetivo Producto Genmab Reumatoide MEDI-507 CD2 Humanizado Medimmune Inc Psoriasis MEDI-507 CD2 Humanizado Medimmune Inc GvHD 0KT4A CD4 Humanizado IgG Ortho Biotech Rechazo al Aloinjerto Orto Clon CD4 Humanizado IgG Ortho Biotech Enfermedad OKT4A Autoinmunitari a Ortoclon/ CD3 Murino mIG2a Ortho Biother Rechazo al anti-CD3 Aloinj erto 0KT3 Reparo/ gpllblla Quimérico Fab Centocor/Lilly Complicaciones Abciximab de angioplastia coronaria rhuMab-E25 IgE Humanizado IgGl Genentech/ Asma/Alergia Novartis/Tanox Biosystems SB-240563 IL5 Humanizado GlaxoSmithKline Asma/Alergia SB-240683 IL-4 Humanizado GlaxoSmithKline Asma/Alergia SCH55700 IL-5 Humanizado Celltech/ Asma/Alergia Schlering Simulect CD25 Quimérico IgGl Norvartis Pharm Rechazo al Aloinjerto SMART a- CD3 Humanizado Protein Design Enfermedad CD3 Lab Autoinmunitari a SMART a- CD3 Humanizado Protein Design Rechazo al CD3 Lab Aloinj erto SMART a- CD3 Humanizado IgG Protein Design Psoriasis CD3 Lab Zenapax CD25 Humanizado IgGl Protein Design Rechazo al Lab/Hoffman-La Aloinjerto Roche Tabla 10: Anticuerpos terapéuticos para tratamiento de trastornos autoinmunitarios Anticuerpo Indicación Antigeno Objetivo ABX-RB2 Anticuerpo para el antígeno CDL en células T, células B y células NK del anticuerpo completamente humano de Xenoratón 5c8 (un Ensayo de la Fase II se CD-40 anticuerpo de detuvieron en octubre de 1999 antígeno anti- que examinaron "los eventos CD-40) adversos" IDEC 131 Lupus sistémico eritematoso Anti-CD40 humanizado (SLE) IDEC 151 Artritis Reumatoide Privatizado; anti-CD40 IDEC 152 Asma Privatizado; anti-CD23 IDEC-507 Psoriasis Privatizado anti-CD80 MEDI-507 Artritis reumatoide, Anti-CD20 esclerosis múltiple Enfermedad de Crohn Psoriasis LDP-02 (anti-b7 Enfermedad inflamatoria del Receptor interina a4b7 en mAb) intestino glóbulos blancos (leucocitos) Enfermedad de Crohn Colitis ulcerativa Anti-Gama Trastornos autoinmunitarios Interferón Anti-Gama Interferón SMART Verteportina Artritis Reumatoide MDX-33 Trastornos sanguíneos Anticuerpo monoclonal contra causados por reacciones receptores FcRI autoinmunitarias Trombocitopenia Púrpura Idiopática (ITP) Anemia hemolítica autoinmunitaria MDX-CD4 Tratar artritis reumatoide y Anticuerpo monoclonal contra otras autoinmunidades la molécula del receptor CD4 Anticuerpo Indicación Antígeno Objetivo VX-497 Trastornos autoinmunitarios Inhibidor de inosina Esclerosis múltiple Monofosfato deshidrogenasa Artritis Reumatoide (enzima necesaria para hacer Enfermedad inflamatoria del nuevo ARN y ADN utilizados en intestino la producción de los Lupus nucleótidos necesarios para la Psoriasis proliferación de linfocitos VX-740 Artritis Reumatoide Inhibidor de ICE Interleucina-1 beta (trayectorias que controlan la conversión de la enzima que conduce a una respuesta inmunitaria agresiva) VX-745 Específico para la Inhibidor de P38MAP cinasa de inflamación involucrada en la la proteína cinasa activada señalización química del por mitógeno inicio de la respuesta inmunitaria y el avance de la inflamación Enbrel TNF objetivo (factor de (etanercept) necrosis tumoral) IL-8 Anticuerpo monoclonal completamente humano contra ILi-8 (interleucina 8) Apogen MP4 Antígeno recombinante que selectivamente destruye la enfermedad asociada con las células C inducen la apoptosis de las células T eliminadas por la muerte celular programada que ya ataca las propias células del cuerpo de células T específicas objetivo de los apógenos AGENTES PARA UTILIZARSE EN EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDAD INFECCIOSA En algunas modalidades, las moléculas de la invención pueden administrarse en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de uno o más agentes terapéuticos adicionales conocidos por experto en la técnica para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad infecciosa. La invención contempla el uso de las moléculas de la invención en combinación con antibióticos conocidos por el experto en la técnica para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad infecciosa. Los antibióticos que pueden utilizarse en combinación con las moléculas de la invención incluyen, pero no se limitan a, macrólido (por ejemplo, tobramicina (Tobi®) ) , una cefalosporina (por ejemplo, cefalexina (Keflex®) , cefradina (Velosef®) , cefuroxima (Ceftin®) , cefprozil (Cefzil®) , cefaclor (Ceclor®) , cefixima (Suprax®) o cefadroxil (Duricef®) ) , una claritromicina (por ejemplo, claritromicina (Biaxin®) ) , una eritromicina (por ejemplo, eritromicina (EMycin®) ) , una penicilina (por ejemplo, penicilina V (V-Cillin K® o Pen Vee K®) ) o una quinolona (por ejemplo, ofloxacina (Floxin®) , ciprofloxacina (Cipro®) o norfloxacina (Noroxin®) ) , antibióticos de aminoglucosida (por ejemplo, apramicina, arbecacina, Bambermicinas, butirosina, dibecacina, neomicina, neomicina, undecilinato, netilmicina, paromomicina , ribostamicina, sisomicina, y espectinomicina) , antibióticos de anfenicol (por ejemplo, azidanfenicol , cloranfenicol , floranfenicol , y tianfenicol) , antibióticos de ansamicina (por ejemplo, rifamida y rifampicina) , carbacefemos (por e emplo, loracarbef ) , carbapenemos (Por ejemplo, biapenem e imipenem) , cefalosporinas (por ejemplo, cefaclor, cefadroxilo, cefamandol, cefatrizina, cefazedona, cefozopran, cefpimizol, cefpiramida, y cefpirome) , cefamicinas (por ejemplo, cefbuperazona , cefmetazol y cefminox) , monobactamas (por ejemplo, aztreonam, carumonam y tigemonam) , oxacefemos (por ejemplo, flomoxef y moxalactam) , penicilinas (por ejemplo, amdinocilina, amdinocilina pivoxilo, amoxicilina, bacampicilina, ácido bencilpenicilínico, bencilpenicilina sódica, epicilina, fenbenicilina, floxacilina, penamcilina, yodhidrato de penetamato, penicilina o-benetamina, penicilina 0, penicilina V, penicilina V benzatina, penicilina V hidrabamina, penimepiciclina y fencihicilina potásica) , lincosamidas (por ejemplo, clindamicina y lincomicina) , anfomicina, bacitracina, capreomicina , colistina, enduracidina, enviomicina, tetraciclinas (por ejemplo, apiciclina, clortetraciclina , clomociclina y demeclociclina) , 2 , 4-diaminopirimidinas (por ejemplo, brodimoprima) , nitrofuranos (por ejemplo, furaltadona, y cloruro de furazolio) , quinolonas y sus análogos (por ejemplo, cinoxacina, clinafloxacina, flumequina, y grepagloxacina) , sulfonamidas (por ejemplo, acetil sulfametoxipirazina , bencilsulf mida , noprilsulfamida , ftalilsulfacetamida , sulfacrisoidina y sulfacitina) , sulfonas (por ejemplo, diatimosulfona, glucosulfona sódica y solasulfona) , cicloserina, mupirocina y tuberina.

En ciertas modalidades, las moléculas de la invención pueden administrarse en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de uno o más agentes antifúngicos . Los agentes antifúngicos pueden utilizarse en combinación con las moléculas de la invención que incluyen pero no se limitan a anfotericina B, itraconazol, quetoconazol , fluconazol, intratecal, flucitosina, miconazol, butoconazol, clotrimazol, nistatina, terconazol, tioconazol, ciclopirox, econazol, haloprogrina , naftifina, terbinafa, undecilenato, y griseofuldina .

En algunas modalidades, las moléculas de la invención pueden administrarse en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de uno o más agentes anti -víricos . Los agentes anti -víricos útiles que pueden utilizarse en combinación con las moléculas de la invención incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de proteasa, inhibidores de transcriptasa inversa de nucleósido, inhibidores de transcriptasa inversa no de nucleósido y análogos de nucleósido. Los ejemplos de agentes antivíricos incluyen pero no se limitan a, zidovudina, aciclovir, gangciclovir, vidarabina, idoxuridina, trifluridina, y ribavirina, así como foscarnet, amantadina, rimantadina, saquinavir, indinavir, amprenavir, lopinavir, ritonavir, los alfa- interferones ; adefovir, clevadina, entecavir, pleconaril .

TERAPIA DE VACUNAS La invención además abarca el uso de composiciones de la invención para inducir una respuesta inmunitaria contra un agente antigénico o inmunogénico, que incluye pero no se limita a antígenos cancerígenos y antígenos de enfermedades infecciosas (ejemplos de los cuales se describen Infra) . Las composiciones de vacunas de la invención comprenden uno o más agentes antigénicos o inmunogénicos de los cuales se desea una respuesta inmunitaria, en donde el uno o más agentes antigénicos o inmunogénicos se recubre con anticuerpo variante de la invención que tiene una afinidad mejorada para FCYRIIIA. Las composiciones de vacuna de la invención son particularmente efectivas al provocar respuestas inmunitarias , preferiblemente una respuesta inmunitaria protectora contra el agente antigénico o inmunogénico.

En algunas modalidades, el agente antigénico o inmunogénico en las composiciones de vacuna de la invención comprende un virus contra el cual se desea una respuesta inmunitaria. Los virus pueden ser recombinantes o quiméricos, preferiblemente son atenuados. La producción de virus recombinante, quimérico y atenuado puede llevarse a cabo utilizando métodos estándar conocidos por el experto en la técnica. La invención abarca una vacuna viral recombinante viva o una vacuna viral recombinante inactivada a ser formulada de acuerdo con la invención. Una vacuna puede ser preferida debido a la multiplicación en el hospedero que conduce a estímulo prolongado de clase similar y magnitud a la que ocurre en infecciones naturales, y por consiguiente, confiere inmunidad sustancial, a largo plazo. La producción de formulación de formulaciones de vacuna de virus recombinantes vivos puede lograrse utilizando métodos convencionales que involucran la coagulación del virus en el cultivo celular o en alantoides de embriones de pollo seguido por purificación.

En una modalidad específica, el virus recombinante es no patogénico al sujeto al cual se administra. A este respecto, el uso de virus genéticamente modificado para propósitos de vacuna puede requerir la presencia de características de atenuación en esta cepa. La introducción de las mutaciones apropiadas (por ejemplo, eliminaciones) en las plantillas utilizadas para la transfección pueden proporcionar nuevos virus con características de atenuación. Por ejemplo, las mutaciones sin sentido específicas que están asociadas con la sensibilidad de la temperatura o a la adaptación al frío pueden hacerse en la eliminación de mutaciones. Estas mutaciones deberán ser más estables que las mutaciones de punto asociadas con mutantes sensibles al frío o a la temperatura y las frecuencias de inversión deberán ser extremadamente bajas. Las tecnologías de ADN recombinante para la modificación de virus recombinante son conocidas en la técnica y están abarcadas en la invención. Por ejemplo, las técnicas para modificar virus de ARN de estructura de cadena negativa son conocidas en la técnica, ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,166,057, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

Alternativamente, los virus quiméricos con características "suicidas" pueden construirse para utilizarse en las formulaciones de vacuna intradérmicas de la invención. Tales virus pasarán solamente a través de unas cuantas rondas de replicación dentro del hospedero. Cuando se utilizan como una vacuna, el virus recombinante pasará a través de un ciclo(s) de replicación limitado e inducen un nivel suficiente de respuesta inmunitaria pero no podrán ir más adelante en el hospedero humano y causar la enfermedad. Alternativamente, el virus inactivado (aniquilado) puede formularse de acuerdo con la invención. Las formulaciones de vacunas inactivadas pueden prepararse utilizando técnicas convencionales para "aniquilar" el virus quimérico. Las vacunas inactivadas están "muertas" en el sentido de que su inefectividad ha sido destruida. Idealmente, la inefectividad del virus se destruye sin afectar su inmunogenicidad. Con el fin de preparar vacunas inactivadas, el virus quimérico pueden cultivarse en un cultivo celular o en alantoides de los embriones de pollo, purificados por ultracentrifugación de zona, inactivados con formaldehído o ß-propiolactona, y agruparse .

En ciertas modalidades, los epítopos completamente foráneos, que incluyen antígenos derivados de otros patógenos virales o no virales pueden modificarse en el virus para utilizarse en las formulaciones de vacuna intradérmicas de la invención. Por ejemplo, los antígenos de virus no relacionados tales como los antígenos de parásitos VIH (gpl60, gpl20, gp41) (por ejemplo, malaria), antígenos bacterianos o fúngicos o antígenos tumorales pueden modificarse en una cepa atenuada.

Virtualmente cualquier secuencia de gen heteróloga puede construirse en los virus quiméricos de la invención para utilizarse en las formulaciones de vacuna intradérmica . Preferiblemente, las secuencias génicas heterólogas son fracciones y péptidos que actúan como modificadores de la respuesta biológica. Preferiblemente, los epítopos que inducen una respuesta inmunitaria protectora para cualquiera de una variedad de patógenos, o antígenos que se unen a anticuerpos neutralizantes pueden expresarse a través de o como parte del virus quimérico. Por ejemplo, las secuencias génicas heterólogas que pueden construirse en virus quiméricos de la invención incluye, pero no se limitan a, neuraminidasa de hemaglutinina de influenza y parainfluenza , y glicoproteínas de fusión tales como los genes HN y F de PIV3. En aún otra modalidad, las secuencias génicas heterólogas pueden modificarse en el virus quimérico que incluye las que codifican proteínas con actividades inmuno-moduladoras. Los ejemplos de proteínas inmuno-modularas incluyen, pero no se limitan a, citocinas, interferón de tipo 1, gama- interferón, factores estimuladores de colonia, interleucina -1, -2, -4, -5, -6, -12, y antagonistas de estos agentes .

En aún otras modalidades, la invención abarca células o virus patogénicos, preferiblemente virus atenuados, que expresan el anticuerpo variante en su superficie.

En modalidades alternativas, las composiciones de vacuna de la invención comprenden un polipéptido de fusión en donde un agente antigénico o inmunogénico está operablemente enlazado a un anticuerpo variante de la invención que tiene una afinidad mejorada para FCYRIIIA. La modificación de los polipéptidos de fusión para utilizarse en las composiciones de vacuna de la invención se lleva a cabo utilizando métodos de tecnología de ADN recombinante de rutina y que están dentro del nivel de la experiencia técnica.

La invención además abarca métodos para inducir la tolerancia de un sujeto a través de la administración de una composición de la invención. Preferiblemente una composición adecuada para inducir la tolerancia en un sujeto comprende un agente antigénico o inmunogénico recubierto con anticuerpo variante de la invención, en donde el anticuerpo variante tiene una mayor afinidad a FCYRIIB. Aunque se pretende estar unido a través de ningún mecanismo de acción particular, tales composiciones son efectivas en la inducción de la tolerancia a través de la activación de la trayectoria inhibidora mediada por FcyRIIB.

COMPOSICIONES Y MÉTODOS DE ADMINISTRACIÓN La invención proporciona métodos y composiciones farmacéuticas que comprenden moléculas de la invención (es decir, dicuerpos) que comprenden múltiples dominios de unión de epítopo y, opcionalmente un dominio Fe (o una de sus porciones) . La invención también proporciona métodos de tratamiento, profilaxis y mejora de uno o más de los síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o infección a través de la administración a un sujeto a una cantidad efectiva de una proteína de fusión o una molécula conjugada de la invención, o una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión o una molécula conjugada de la invención. En un aspecto preferido, un anticuerpo, una proteína de fusión, o una molécula conjugada, se purifica sustancialmente (es decir, sustancialmente libre de sustancia que limitan su efecto o producen efectos secundarios indeseados) . En una modalidad específica, el sujeto es un animal, preferiblemente un mamífero tal como un no primate (por ejemplo, vacas, puercos, caballos, gatos, perros, ratas, etc.) y un primate (por ejemplo, un mono, tal como por ejemplo, un mono cynomolgous y un humano) . En una modalidad preferida, el sujeto es un humano. En aún otra modalidad preferida, el anticuerpo de la invención es de la misma especie que el sujeto .

Se conocen varios sistemas de distribución y pueden utilizarse para administrar una composición que comprende moléculas de la invención, por ejemplo encapsulación en liposomas, micropartículas , microcápsulas , células recombinantes capaces de expresar el anticuerpo o la proteína de fusión, endocitosis mediada por el receptor (ver, por ejemplo, u et al. (1987) "Receptor- Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System", J. Biol . Chem. 262:4429-4432), construcción de ácido nucleico como parte del vector retroviral u otro vector, etc. Los métodos para administrar una molécula de la invención incluyen, pero no se limitan a, administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal , intravenosa y subcutánea), epidural, mucosal (por ejemplo, intranasal y rutas orales) . En una modalidad específica, las moléculas de la invención se administran intramuscularmente , intravenosamente, o subcutáneamente. Las composiciones pueden administrarse a través de cualquier ruta conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección de bolo, a través de absorción a través de epitelio o los forros mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.), y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, la administración pulmonar también puede utilizarse, por ejemplo, a través del uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente en aerosol. Ver, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 6,019,968; 5,985, 320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; y 4,880,078; y Publicaciones de PCT Nos. WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; y WO 99/66903, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

La invención también proporciona que las moléculas de la invención se empaquen en un contenedor herméticamente sellado tal como una ampolla o un saquito que indica la cantidad del anticuerpo. En una modalidad, las moléculas de la invención se suministran como un polvo liofilizado esterizado en seco o concentrado sin agua en un contenedor herméticamente sellado y pueden reconstituirse, por ejemplo, con agua o salina a la concentración apropiada para la administración a un sujeto. Preferiblemente, las moléculas de la invención se suministran como un polvo liofilizado estéril seco en un contendor herméticamente sellado a una dosis unitaria de por lo menos 5 mg, más preferiblemente al menos 10 mg, al menos 15 mg, al menos 25 mg, al menos 35 mg, al menos 45 mg, al menos 50 mg, o al menos 75 mg. Las moléculas liofilizadas de la invención deberán almacenarse a entre 2 y 8°C en su contenedor original y las moléculas deberán administrarse dentro de las 12 horas, preferiblemente dentro de 6 horas, dentro 5 horas, dentro de 3 horas o dentro de 1 hora después de reconstituirse. En una modalidad alternativa, las moléculas de la invención se suministran en forma líquida en un contenedor herméticamente sellado que indica la cantidad y concentración de la molécula, proteína de fusión, o molécula conjugada. Preferiblemente, la forma líquida de las moléculas de la invención se suministran en un contenedor herméticamente sellado a por lo menos 1 mg/ml, más preferiblemente al menos 2.5 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos 8 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/kg, al menos 25 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 100 mg/ml, al menos 150 mg/ml, al menos 200 mg/ml de la moléculas.

La cantidad de la composición de la invención que será efectiva en el tratamiento prevención o mejora de uno o más de los síntomas asociados con un trastorno puede determinar a través de técnicas clínicas estándar. La dosis precisa a ser utilizada en la formulación también dependerá de la ruta de administración, y la seriedad de la afección, y deberá decirse con el juicio del practicante y cada circunstancia del paciente. Las dosis efectivas pueden extrapolarse de las curvas de dosis y de respuestas derivadas de sistemas de prueba de modelos in vitro o en animales.

Para los diacuerpos abarcados por la invención, la dosis administrada a un paciente es típicamente de 0.0001 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente. Preferiblemente, la dosis administrada a un paciente está entre 0.0001 mg/kg y 20 mg/kg, 0.0001 mg/kg y 10 mg/kg, 0.0001 mg/kg y 5 mg/kg, 0.0001 y 2 mg/kg, 0.0001 y 1 mg/kg, 0.0001 mg/kg y 0.75 mg/kg, 0.0001 mg/kg y 0.5 mg/kg, 0.0001 mg/kg a 0.25 mg/kg, 0.0001 a 0.15 mg/kg, 0.0001 a 0.10 mg/kg, 0.001 a 0.5 mg/kg, 0.01 a 0.25 mg/kg o 0.01 a 0.10 mg/kg del peso corporal del paciente. La dosis y la frecuencia de la administración de los diacuerpos de la invención puede reducir o alterarse mejorando la absorción y la penetración tisular de los diacuerpos a través de modificaciones tales, por ejemplo, lipidación.

En una modalidad, la dosis de las moléculas de la invención administrada a un paciente puede ser de 0.01 mg a 1000 mg/día cuando se utiliza como una terapia de un solo agente. En otra modalidad las moléculas de la invención se utilizan en combinación con otras composiciones terapéuticas y la dosis que se administra a un paciente es menor que cuando tales moléculas se utilizan con una terapia de un solo agente .

En una modalidad específica, puede desearse administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente al área en la necesidad de tratamiento; esto puede lograrse a través de, por ejemplo, y no a manera de limitación, infusión local, a través de inyección o por medio de un implante, el implante siendo de material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como las membranas sialásticas, o fibras. Preferiblemente, cuando se administra un molécula de la invención, se debe tener cuidado de utilizar materiales que la molécula no absorba.

En otra modalidad, las composiciones pueden suministrarse en una vesícula, en particular un liposoma (ver, Langer (1990) nNew Methods Of Drug Delivery" , Science 249:1527-1533); Treat et al, in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cáncer, López -Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989); López Berestein, ibid. , pp. 3 17-327; ver generalmente ibid. ) .

En aún otra modalidad, las composiciones pueden suministrarse en un sistema de liberación controlada o de liberación sostenida. Cualquier técnica conocida por el experto en la técnica puede utilizarse para producir formulaciones de liberación sostenida que comprenden una o más moléculas de la invención. Ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 4,526,938; publicación PCT WO 91/05548; publicación PCT WO 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cáncer Xenograft Using A Sustained-Release Gel" , Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions" , PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bF GF Antibody For Cardiovascular Application" , Pro. Int ' 1. Sym . Control. Reí. Bioact . Mater. 24:853-854; y Lam et . al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery" , Proc . Int ' 1. Symp. Control Reí. Bioact. Mater. 24:759-760, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad. En una modalidad, se puede utilizar una bomba en un sistema de liberación controlada (ver Langer, supra; Sefton, (1987) "Implantable Pumps" , CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980) "Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusión Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis" , Surgery 88:507-516; y Saudek et al. (1989) nA Preliminary Trial of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery" , N. Engl . J. Med. 321:574-579). En otra modalidad, se pueden utilizar materiales poliméricos para lograr la liberación controlada de los anticuerpos (ver, por ejemplo Medical Applications of Controlled Reléase, Langer and Wise (eds.), CRC Pres . , Boca Ratón, Florida (1974) ; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), iley, New York (1984); Levy et al. (1985) "Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate" , Science 228: 190-192; During et al . (1989) "Controlled Reléase Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant : In Vivo Characterization" , Ann. Neurol . 25:351-356; Howard et al . (1989) "In racerebral Drug Delivery In Rats With Lesión-Induced Memory Déficits" , J. Neurosurg. 7(1): 105-112); Patente de E.U.A. No. 5,679,377; Patente de E.U.A. No. 5,916,597; Patente de E.U.A. No. 5,912,015; Patente de E.U.A. No. 5,989,463; Patente de E.U.A. No. 5,128,326; Publicación PCT No. O 99/15154; Publicación PCT No. WO 99/20253) . Los ejemplos de polímeros utilizados en formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a, poli (2-hidroxietil metacrilato) , poli (metil metacrilato) , poli (ácido acrílico) , poli (etilen-co-vinil acetato), poli (ácido metacrílico) , poliglicolidas (PLG) , polianhídridos , poli (N-vinil pirrolidona) , poli (alcohol vinílico) , poliacrilamida, poli (etilenglicol) , polilactidas (PLA) , poli (lactida-co-glicolidas) (PLGA) , poliortoésters . En aún modalidad, un sistema de liberación controlada puede colocarse en proximidad al agente terapéutico (por ejemplo, los pulmones) , de esta forma requiriendo solamente una fracción de la dosis sistémica (ver, por ejemplo, Goodson, in Medical Applications of Controlled Reléase, supra, vol . 2, pp . 115-138 (1984)). En otra modalidad, las composiciones poliméricas útiles como implantes de liberación controlada se utilizan de acuerdo con Dunn et al. (Ver U.S. 5,945,155). Este método particular se basa en el efecto terapéutico de la liberación controlada in situ del material bioactivo del sistema polimérico. El implante puede generalmente ocurrir en cualquier lugar dentro del cuerpo del paciente en necesidad del tratamiento terapéutico. En otra modalidad, se utiliza un sistema de distribución sostenido no polimérico, a través del cual un implemento no polimérico en el cuerpo del sujeto se utiliza como el sistema de distribución de fármaco. Después del implante en el cuerpo, el solvente orgánico del implante se disipará, dispersará o lechará de la composición en el fluido tisular circundante, y el material no polimérico se coagulará o precipitará gradualmente para formar una matriz microporosa, sólida (ver, U.S. 5,888,533).

Los sistemas de liberación controlada se explican en la revisión de Langer (1990, "New Methods Of Drug Delivery" , Science 249:1527-1533). Cualquier técnica conocida por el experto en la técnica puede utilizarse para producir formulaciones de liberación sostenida que comprenden uno o más agentes terapéuticos de la invención. Ver, por ejemplo. Patente de E.U.A. No. 4,526,938; Publicación Internacional Nos. WO 91/05548 y WO 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cáncer Xenograft Using A Sustained-Release Gel" , Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions" , PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bF GF Antibody For Cardiovascular Application" , Pro. Int ' 1. Symp. Control. Reí. Bioact. Mater. 24:853-854; y Lam et al. (1997) nMicroencapsulation Of Recombinant Hu anized Monoclonal Antibody For Local Delivery" , Proc . Int 11. Symp. Control Reí. Bioact. Mater. 24:759-760, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

En una modalidad específica en donde la composición de la invención es un ácido nucleico que codifica un diacuerpo de la invención, el ácido nucleico puede administrarse in vivo para promover la expresión de su diacuerpo codificado, a través de la construcción como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrarlo de tal forma que se convierte en intracelular, por ejemplo a través del uso de un vector retroviral (ver, Patente de E.U.A. No. 4,980,286), o a través de inyección directa o a través del uso de un bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont) , o recubriendo con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transíección, o a través de la administración en el enlace a un péptido de tipo homeobox que se conoce que entra al núcleo (Ver, por ejemplo, Joliot et al. (1991) nAntennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis" , Proc . Nati. Acad. Sci. USA 88:1864-1868), etc. Alternativamente, un ácido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de la célula hospedera para la expresión a través de la recombinación homologa .

El tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de moléculas de la invención puede incluir un solo tratamiento o, preferiblemente puede incluir una serie de tratamientos . En un ejemplo preferido, un sujeto se trata con moléculas de la invención en el intervalo de aproximadamente 0.1 a 30 mg/kg del peso corporal, una vez por semana durante entre aproximadamente 1 a 10 semanas, preferiblemente entre 2 a 8 semanas, más preferiblemente entre aproximadamente de 3 a 7 semanas, y aún más preferiblemente durante aproximadamente 4, 5 ó 6 semanas. En otras modalidades, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran una vez al día, dos veces al día o tres veces al día. En otras modalidades, las composiciones farmacéuticas se administran una vez a la semana, dos veces a la semana, una semana sí y otra semana no, una vez al mes, una vez cada seis meses, una vez cada dos meses, dos veces por año o una vez por año. También se apreciará que la dosis efectiva de las moléculas utilizadas para el tratamiento puede aumentar o disminuirse según el transcurso de un tratamiento particular.

COMPOSICIONES FARMACEUTICAS Las composiciones de la invención incluyen composiciones de fármaco en volumen útiles en la fabricación de composiciones farmacéuticas (por ejemplo, composiciones impuras o no estériles) y composiciones farmacéuticas (es decir composiciones que son adecuadas para la administración a un sujeto o paciente) que pueden utilizarse en la preparación de las formas de dosificación unitarias. Tales composiciones comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de un agente profiláctico y/o terapéutico descrito en la presente o una combinación de los agentes y un portador farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, las composiciones de la invención comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de una o más 1 de las moléculas de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

La invención también abarca composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de diacuerpo de la invención y un anticuerpo terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal específico de tumor) que es específico para un antígeno cancerígeno particular, y un portador farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad específica, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del Gobierno Federal o Estatal o listado en la Farmacopea de E . U. A u otra Farmacopea generalmente reconocida para utilizarse en animales, y más particularmente en humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente adyuvante (por ejemplo, adyuvante de Freund (completo o incompleto) , excipiente, o vehículo con el cual se administra el terapéutico. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, que incluyen los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tal como el aceite de cacahuate, aceite de frijol de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí y similares. El agua es el portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra intravenosamente. Las soluciones salinas y las soluciones de dextrosa y glicerol acuosas pueden utilizarse como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, gis, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desgrasada seca, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similar. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes de humectación o emulsión, o agentes reguladores de pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares.

Generalmente, los ingredientes de las composiciones de la invención se ministran ya sea de manera separada o mezclados juntos en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o como un concentrado sin agua en un contenedor herméticamente sellado tal como una ampolla o bolsita que indica la cantidad del agente activo. Cuando las composiciones se van a administrar por infusión, pueden dispensarse con una botella de infusión que contiene agua o salina de grado farmacéutico estéril. Cuando la composición se administra a través de inyección, una ampolla de agua estéril para inyección o salina puede ser provista de tal forma que los ingredientes pueden mezclarse antes de la administración .

Las composiciones de la invención pueden formularse como formas neutrales o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a las formadas con aniones tales como los derivados de ácido clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con cationes tales como los derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, tretietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.

TERAPIA DE GEN En una modalidad específica, los ácidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican las moléculas de la invención se administran para tratar, prevenir o mejorar uno o más de los síntomas asociados con la enfermedad, trastorno o infección, a través de la terapia de gen. Las terapias de gen se refieren a terapia llevada a cabo a través de la administración de un sujeto de un ácido nucleico expresado o es que se puede expresar. En esta modalidad de la invención, los ácidos nucleicos producen su anticuerpo codificado o proteína de fusión que media un efecto terapéutico o profiláctico .

Cualquiera de los métodos para la terapia de gen disponibles en la técnica puede utilizarse de acuerdo con la presente invención. Los métodos ilustrativos se describen a continuación .

Para una revisión general de los métodos de la terapia de gen, ver Goldspiel et al. (1993) "Human Gene Therapy" , Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu et al. (1991) "Delivery Systems For Gene Therapy", Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev (1993,) "Gene Therapy, Concepts, Current Triáis And Future Directions" , Ann. Rev. Pharmacol . Toxicol . 32:573-596; Mulligan (1993) "The Basic Science Of Gene Therapy", Science 260:926-932; and Morgan et al. (1993) "Human Gene Therapy", Ann. Rev. Biochem. 62:191-217. Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología de ADN recombinante que pueden utilizarse se describen en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993) ; y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual. Stockton Press, NY (1990).

En un aspecto preferido, una composición de la invención comprende ácidos nucleicos que codifican un diacuerpo de la invención, los ácidos nucleicos son parte de un vector de expresión que expresan el anticuerpo en un hospedero adecuado. En particular, los ácidos nucleicos tienen promotores, preferiblemente promotores heterólogos, operablemente enlazados a una región de codificación del anticuerpo, el promotor es inducible o constitutivo, y, opcionalmente específico del tejido. En otra modalidad particular, las moléculas de ácido nucleico se utilizan en donde las secuencias de codificación del anticuerpo y cualquier otra secuencia deseada se flanquean por regiones que promueven la recombinación homologa en un sitio deseado en el genoma, de esta forma proporcionando la expresión intracromosómica del ácido nucleico que codifica el anticuerpo ( oller et al. (1989) "Inactivating The Beta 2-Microglobulin Locus In Mouse Embryonic Stem Cells By Homologous Recombination" , Proc . Nati. Acad. Sci . USA 86:8932-8935; y Zijlstra et al. (1989) "Germ-Line Transmission Of A Disrupted Beta 2-Microglobulin Gene Produced By Homologous Recombination In Embryonic Stem Cells", Nature 342:435-438).

En otro aspecto preferido, una composición de la invención comprende ácidos nucleicos que codifican una proteína de fusión, ácidos nucleicos que son parte de un vector de expresión que expresan la proteína de fusión en un hospedero adecuado. En particular, tales ácidos nucleicos tienen promotores, preferiblemente promotores heterólogos, operablemente enlazados a la región de codificación de la proteína fusión, el promotor siendo inducido constitutivo, y opcionalmente específico del tejido. En otra modalidad particular, las moléculas de ácido nucleico se utilizan en donde la secuencia de codificación de una proteína de fusión y cualquier otra secuencia deseada se flanquean por medio de regiones que promueven la recombinación homologa en el sitio deseado en el genoma, de esta forma proporcionando la expresión intracromosómica de la proteína de fusión.

La distribución de los ácidos nucleicos en un sujeto puede ser ya sea directa, en el caso en donde el sujeto se expone directamente al ácido nucleico o a vectores que llevan el ácido nucleico, o indirecta, en cuyo caso, las células primero se transforman con ácidos nucleicos in vitro, después se trasplantan en el sujeto. Estos dos métodos son conocidos, respectivamente, como terapia de gen in vivo o ex vivo .

En una modalidad específica, las secuencias de ácido nucleico se administran directamente in vivo en donde se expresan para producir el producto codificado. Esto puede lograrse a través de cualquier número de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, a través de la construcción de éstos como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolos de tal forma que se hacen intracelulares , por ejemplo, a través de infección utilizando vectores retrovirales defectuosos o atenuados u otros virales (ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 4,980,286), o a través de la inyección directa de ADN desnudo, o a través del uso del bombardeo de micropartículas (por ejemplo, pistola de genes; Biolistic, DuPont) , o recubrimiento con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección, encapsulación en liposomas, micropartículas, o microcápsulas , o a través de la administración de los mismos en acoplamiento con un péptido que se conoce que entra al núcleo, a través de la administración en acoplamiento a un sujeto del antígeno para endocitosis mediada por el receptor (ver, por ejemplo, Wu et al. (1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System", J. Biol . Chem. 262:4429-4432) (que puede utilizarse para tipos celulares objetivo que específicamente expresan los receptores), etc. En otra modalidad, los complejos de ácido nucleico-antígeno pueden formarse en donde el antígeno comprende un péptido viral fusogénico para alterar los endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosómica. En aún otra modalidad, el ácido nucleico puede activarse in vivo para la absorción específica de la célula y la expresión, a través de la activación del receptor específico (ver, por ejemplo Publicaciones PCT WO 92/06180; WO 92/22635; W092/20316; W093/14188; WO 93/20221) .

Alternativamente, el ácido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de la célula hospedera para la expresión, a través de recombinación homologa (Koller et al. (1989) "Inactivating The Beta 2 -Microglobulin Locus In Mouse Embryonic Stem Cells By Homologous Recombination" , Proc . Nati. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; y Zijlstra et al. (1989) nGerm-Line Transmission Oí A Disrupted Beta 2-Microglobulin Gene Produced By Homologous Recombination In Embryonic Stem Cells", Nature 342:435-438).

En una modalidad específica, los vectores virales que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican una molécula de la invención (por ejemplo, un diacuerpo o una proteína de fusión) se utilizan. Por ejemplo, se puede utilizar un vector retroviral (ver Miller et al. (1993) "Use Of Retroviral Vectors For Gene Transfer And Expression" , Meth. Enzymol . 217:581-599). Estos vectores retrovirales contienen los componentes necesarios para el correcto empaque del genoma viral y la integración en el ADN de la célula hospedera. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo o una proteína fusión a ser utilizada en la terapia de gen se clonan en uno o más vectores, que facilitan la distribución de la secuencia de nucleótido en un sujeto. Más detalles acerca de los vectores retrovirales pueden encontrarse en Boesen et al. (1993) "Circumvention Of Chemotherapy-Induced Myelosuppression By Transfer Of The Mdrl Gene", Biotherapy 6:291-302), que describe el uso de un vector retroviral para distribuir el gen mdrl para células madre hematopoyéticas con el fin de hacer las células madre más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en terapia de gen son: Clowes et al. (1994) "Long-Term Biological Response Of Injured Rat Carotid Artery Seeded With Smooth Muscle Cells Expressing Retrovirally Introduced Human Genes", J. Clin. Invest. 93:644-651; Keim et al. (1994) "tfetrovirus- ediated Gene Transduction Into Canine Peripheral Blood Repopulating Cells", Blood 83:1467-1473; Salmons et al. (1993) nTargeting Of Retroviral Vectors For Gene Therapy" , Human Gene Therapy 4:129-141; y Grossman et al. (1993) ". etroviruses ; Delivery Vehicle To The Liver" , Curr. Opin. Genetics and Devel . 3:110-114.

Los adenovirus son otros vectores virales que pueden utilizarse en terapia de gen. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para suministrar o distribuir genes al epitelio respiratorio. Los adenovirus pueden infectar naturalmente el epitelio respiratorio en donde causan una enfermedad ligera. Otros objetivos de los sistemas de distribución con base en adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, las células endoteliales , y los músculos. Los adenovirus tiene la ventaja de ser capaces de infectar células no de división. Kozarsky et al . (1993, "Gene Therapy: Adenovirus Vectors" , Current Opinión in Genetics and Development 3:499-503) presenta una revisión de la terapia de gen basada en adenovirus. Bout et al. (1994, nLung Gene Therapy: In Vivo Adenovirus-Mediated Gene Transfer To Rhesus Monkey Airway Epithelium" , Human Gene Therapy, 5:3-10) demuestra el uso de vectores de adenovirus para transferir genes al epitelio respiratorio de los monos rhesus. Otras instancias del uso de adenovirus en terapia de gen puede encontrarse en Rosenfeld et al. (1991) "Adenovirus-Mediated Transfer Of A Recombinant Alpha 1 -Antitrypsin Gene To The Lung Epithelium In Vivo", Science 252:431-434; Rosenfeld et al. (1992) nIn Vivo Transfer Of The Human Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene To The Airway Epithelium" , Cell 68:143-155; Mastrangeli et al. (1993) "Diversity Of Airway Epithelial Cell Targets For In Vivo Recombinant Adenovirus-Mediated Gene Transfer" , J. Clin. Invest. 91:225-234; PCT Publication W094/12649; y Wang et al. (1995) "A Packaging Cell Line For Propagation Of Recombinant Adenovirus Vectors Containing Two Lethal Gene-Region Deletions" , Gene Therapy 2:775-783. En una modalidad preferida, se utilizan los vectores de adenovirus.

El virus asociado con adeno (AAV) ha sido propuesto para utilizarse en terapia de gen (ver, por ejemplo, Walsh et al. (1993) "Gene Therapy For Human Hemoglobinopathies" , Proc . Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 y Patente de E.U.A. No. 5,436, 146) .

Otro método para terapia de gen involucra la transferencia de un gen a las células en cultivo tisular a través de los métodos tales como electroporación, lipofección, transfección mediada con fosfato cálcico, o infección viral. Usualmente, el método para transferir incluye la transferencia de un marcador seleccionable para las células. Las células después se colocan bajo la selección para aislar las células que han sido absorbidas y están expresando el gen transferido. Estas células después se suministran a un sujeto.

En esta modalidad, el ácido nucleico se introduce en una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Tal introducción puede llevarse a cabo a través de cualquier método conocido en la técnica, que incluye, pero no se limita a, transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector o bacteriófago, que contiene secuencias de ácido nucleico, fusión de célula, transferencia de gen mediado por cromosoma, transferencia de gen mediado por microcélula, fusión de esteroplasto, etc. Se conocen numerosas técnicas en la técnica para la introducción de genes foráneos en las células (ver, por ejemplo, Loeffler et al. (1993) "Gene Transfer Into Primary And Established Mammalian Cell Lines With Lipopolyamine-Coated DNA" , Meth. Enzymol. 217:599-618, Cotten et al. (1993) "Receptor-Mediated Transport Of DNA Into Eukaryotic Cells", Meth. Enzymol. 217:618-644) y pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención, siempre que el desarrollo necesario y las funciones fisiológicas de las células receptoras no se alteren. La técnica deberá proporcionar una transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de tal forma que el ácido nucleico se puede expresar a través de la célula y preferiblemente heredar y expresar a través de su progenie celular .

Las células recombinantes resultantes pueden suministrarse a un sujeto a través de varios métodos conocidos en la técnica. Las células sanguíneas recombinantes (por ejemplo, células madre o progenitoras hematopoyéticas) preferiblemente se administran intravenosamente. La cantidad de células previstas para uso dependen del efecto deseado, el estado del paciente, etc., y puede determinarse por el experto en la técnica.

Las células en las cuales se puede introducir el ácido nucleico para propósitos de terapia de gen abarca cualquier tipo de célula deseada, disponible incluye pero no se limitan a células epiteliales, células endoteliales , queratinocitos , fibroblastos, células musculares, hepatocitos ,- células sanguíneas tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos ; varias células madre o progenitoras , en particular células madre progenitoras hematopoyéticas , por ejemplo, como se obtienen de la médula espinal, de la sangre del cordón umbilical, de la sangre periférica, del hígado fetal, etc.

En una modalidad preferida, la célula utilizada para terapia de gen es autóloga al sujeto.

En una modalidad en donde las células recombinantes se utilizan en la terapia de gen, las secuencias de ácido que codifican un anticuerpo o una proteína de fusión se introducen en las células de tal forma que se pueden expresar a través de las células o su progenie, y la célula recombinante después se administran in vivo para efecto terapéutico. En una modalidad específica, las células madre o progenitoras se utilizan. Cualquier célula madre y/o progenitora que puede aislarse y mantener in Vitro puede potencialmente utilizarse de acuerdo con otra modalidad de la presente invención (ver, por ejemplo, Publicación PCT WO 94/08598; Stemple et al. (1992) "Isolation Of A Stem Cell For Neurons And GHa From The Mammalian Neural Crest" , Cell 71:973-985; Rheinwald (1980) "Serial Cultivation Of Normal Human Epidermal Keratinocytes" , Meth. Cell Bio. 21A: 229-254 ; y Pittelkow et al. (1986) "New Techniques For The In Vitro Culture Of Human Skin Keratinocytes And Perspectives On Their Use For Grafting Of Patients Nith Extensive Burns" , Mayo Clinic Proc. 61:771- 777) .

En una modalidad específica, el ácido nucleico a ser introducido para propósitos de terapia de gen comprende un promotor inducible operablemente enlazado a la región de región de codificación, de tal forma que la expresión del ácido nucleico es controlable controlando la presencia o la ausencia del inductor apropiado de transcripción.

KITS La invención proporciona un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más contenedores rellenos con las moléculas de la invención. Adicionalmente , uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos útiles para el tratamiento de una enfermedad también incluirse en el paquete o kit farmacéutico. La invención también proporciona un paquete o kit farmacéutico que comprende una o más contenedores rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Opcionalmente asociados con tal contendor (s) puede ser un aviso en la forma prescrita a través de una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, cuyo aviso refleja la aprobación a través de la agencia de la fabricación, uso o venta para administración humana.

La presente invención proporciona kits que pueden utilizarse en los métodos anteriores. En una modalidad, un kit comprende una o más moléculas de la invención. En otra modalidad, un kit además comprende uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos útiles para el tratamiento de cáncer, en uno o más contenedores. En otra modalidad, un kit además comprende uno o más anticuerpos citotóxicos que se unen a uno o más antígenos cancerígenos asociados con cáncer. En ciertas modalidades, los otros agentes profilácticos o terapéuticos son un quimioterapéutico . En otras modalidades, el agente profiláctico o terapéutico es un terapéutico biológico u hormonal.

CARACTERIZACION Y DEMOSTRACION DE LA UTILIDAD TERAPEUTICA En varios aspectos de las composiciones farmacéuticas, agentes profilácticos o terapéuticos de la invención preferiblemente se ensayan in vitro, en un sistema de cultivo celular, y en organismo de modelo de animal, tal como un sistema de modelo de animal roedor, para la actividad terapéutica deseada antes del uso en humanos. Por ejemplo, los ensayos que pueden utilizarse para determinar si la administración de una composición farmacéutica específica es deseada, incluyen ensayos de cultivo celular en donde la muestra tisular del paciente crece en cultivo, y se expone a o por el contrario se pone en contacto con una composición farmacéutica de la invención, y el efecto de tal composición sobre la muestra tisular se observa. La muestra tisular puede obtenerse a través de biopsia del paciente. Esta prueba permite la identificación de la molécula (s) profiláctica o terapéutica terapéuticamente más efectiva para cada paciente individual. En varias modalidades, los ensayos in Vitro pueden llevarse a cabo con células representativas de los tipos células involucrados en el trastorno autoinmunitario inflamatorio (por ejemplo, células T) , para determinar si una composición farmacéutica de la invención tiene el efecto deseado sobre tales tipos celulares.

Las combinaciones de agentes profilácticos y/o terapéuticos pueden ensayarse en sistemas de modelos de animales adecuados antes del uso en humanos. Tales sistemas de modelos en animal incluyen, pero no se limitan a, ratas, ratones, pollos, vacas, monos, puercos, perros, conejos, etc. Cualquier sistema de animal bien conocido en la técnica puede utilizarse. En una modalidad específica de la invención, las combinaciones de agentes profilácticos y/o terapéuticos se ensayan en un modelo de sistema de ratón. Tales sistemas de modelo se utilizan ampliamente y son bien conocidos por el experto en la técnica. Los agentes profilácticos y/o terapéuticos pueden administrarse repetidamente. Varios aspectos del procedimiento pueden variar. Tales aspectos incluyen el régimen temporal de administración de los agentes profilácticos y/o terapéuticos, y si tales agentes se administran de manera separa o como una mezcla.

Los modelos en animales preferidos para utilizarse en los métodos de la invención son, por ejemplo, FCYRS humanos que expresan ratones transgénicos en células efectoras de ratón, por ejemplo, cualquier modelo de ratón descrito en U.S. 5,877,396 (que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) puede utilizarse en la presente invención. Los ratones transgénicos para utilizarse en los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, ratones que llevan FCYRIIIA humano; ratones que llevan FcyRIIA humano; ratones que llevan FcyRIIB humano y FcyRIIIA humano; ratones que llevan FcyRIIB humano y FcyRIIA. Humano. Preferiblemente, las mutaciones que muestran los niveles más altos de actividad en los ensayos funcionales descritos anteriormente se ensayarán para utilizarse en estudios en modelos de animales para uso en humanos . Se pueden preparar cantidad de anticuerpos suficientes para utilizarse en modelos de animales utilizando los métodos descritos supra, por ejemplo utilizando sistemas de expresión de mamíferos y métodos de purificación descritos y e emplificados en la presente .

Los modelos de xenoinjerto de ratón pueden utilizarse para examinar la eficacia de los anticuerpos de ratón para generados contra un objetivo específico de tumor con base en la afinidad y especificidad de los dominios de unión del epítopo de la molécula de diacuerpo de la invención y la habilidad de diacuerpo para provocar una respuesta inmunitaria (Wu et al. (2001) "Mouse Models For Multistep Tumorigenesis" , Trends Cell Biol . ll:S2-9) . Los FcyRs humanos que expresan ratones transgénicos en células efectoras de ratón únicos y se adaptan a modelos de animal para probar la eficacia de las interacciones Fc-FcyR humano. Los pares de líneas de ratón transgénicas FCYRIIIA, FCYRIIIB y FcyRIIA generadas en el laboratorio del Dr. Jeffrey Ravetch (a través de un convenio de licencia con Rockefeller U. and Sloan Kettering Cáncer center) puede utilizarse como los enumerados en la Tabla 11 siguiente.

Tabla 11: Cepas de Ratones Cepa antecedente FcR humano Desnudo/CD16A KO Ninguno Desnudo/CD16A KO FcyRIIIA Desnudo/CD16A KO FcyR IIA Desnudo/CD16A KO FcyR IIA y IIIA Desnudo/CD32B KO Ninguno Desnudo/CD32B KO FcyR IIB La actividad anti-inflamatoria de las terapias de combinación de la invención pueden determinarse a través del uso de varios modelos en animales experimentales de artritis inflamatoria conocidos en la técnica y descritas en Crofford L.J. and Wilder R.L., "Arthritis and Autoimmunity in Animáis" , en Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCarty et al. (eds.), Capítulo 30 (Lee and Febiger, 1993). Los modelos en animales experimentales y espontáneos de artritis inflamatoria y enfermedades reumáticas autoinmunitarias también pueden utilizarse para evaluar la actividad anti - inflamatoria de las terapias de combinación de la invención. Los siguientes son algunos ensayos previstos como ejemplos y no por limitación.

Los modelos de animales en principio para artritis o enfermedad inflamatoria conocidos en la técnica y ampliamente utilizados incluyen: modelos de rata con artritis inducida por adyuvante, modelos de rata y ratón con artritis inducida por colágeno y modelos de rata, conejo y hámster con artritis inducida por antígeno, todos descritos en Crofford L.J. and Wilder R.L., "Arthritis and Autoimmunity in Animáis", in Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCarty et al. (eds.), Capítulo 30 (Lee and Febiger, 1993), incorporada aquí por referencia en su totalidad .

La actividad anti- inflamatoria de la terapia de combinación de la invención puede evaluarse utilizando un modelo de rata con artritis inducida por carragenano, La artritis inducida por carragenano también utilizada en conejos, perros y puercos en estudios de artritis crónica o inflamación. La evaluación histomorfométrica cuantitativa se utiliza para determinar la eficacia terapéutica. Los métodos para utilizar tal modelo de artritis inducida por carragenano se describen en Hansra P. et al. (2000) "Carrageenan-induced Arthritis In The Rat" , Inflammation, 24(2): 141-155. También se utilizan comúnmente los modelos en animales con inflamación inducida por zimosano como se conoce y describe en la técnica.

La actividad anti-inflamatoria de las terapias de combinación de la invención también pueden evaluarse a través de la medición de la inhibición del edema de las patas inducidas por carragenano en ratas, utilizando una modificación del método descrito en Winter C. A. et al. (1962) "Carrageenan-induced Edema In Hind Paw Of The Rat As An Assay For Anti-Inflammatory Drugs" Proc . Soc . Exp . Biol Med. 111, 544-547. Este ensayo ha sido utilizado como una clasificación in vivo primaria para la actividad antiinflamatoria de la mayor parte de los NSAIDs, y se considera que pronostica la eficacia humana. La actividad antiinflamatoria de la prueba de los agentes profilácticos o terapéuticos se expresa como el porcentaje de inhibición del aumento en el peso de pata trasera del grupo de prueba con relación al grupo de control dosificado con vehículo.

Adicionalmente , los modelos de animal para enfermedad inflamatoria del intestino también pueden utilizarse para evaluar la eficacia de las terapias de combinación de la invención (Kim et al. (1992) "Experimental Colitis In Animal Models" , Scand. J. Gastroentrol . 27:529-537; Strober (1985) "Animal Models Oí Inflammatory Bowel Disease—An Overview" , Dig. Dis. Sci. 30(12 Supl) : 3S-10S) . La colitis ulcerativa y la enfermedad de Crohn son enfermedades inflamatorias del intestino humanas que pueden inducirse en animales. Los polisacáridos sulfatados incluyen pero no se limita a, amilopectina, carragenano, sulfato de amilopectina , y sulfato de dextrina o irritantes químicos que incluyen pero no se limitan a ácido trinitrobencensulfónico (TNBS) y ácido acético pueden administrarse a animales oralmente para inducir enfermedades inflamatorias del intestino.

Los modelos de animal para trastornos autoinmunitarios también pueden utilizarse para evaluar la eficacia de las terapias de combinación de la invención. Los modelos de animales para trastornos autoinmunitarios tales como diabetes de tipo 1, autoinmunidad tiroidea, lupus sistémico eritematoso, y glomerulonefritis han sido desarrollados (Flanders et al. (1999) "Prevention Of Type 1 Diabetes From Laboratory To Public Health", Autoimmunity 29:235-246; Rasmussen et al. (1999) "Models o Study The Pathogenesis Of Thyroid Autoimmunity" , Biochimie 81:511-515; Foster (1999) "Relevance Of Systemic Lupus Erythematosus Nephritis Animal Models To Human Disease" , Semin. Nephrol . 19:12-24) .

Además, cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica puede utilizarse para evaluar la utilidad profiláctica y/o terapéutica de las terapias de combinación descritas en la presente para enfermedades autoinmunitarias y/o inflamatorias.

La toxicidad y eficacia de los protocolos profilácticos y/o terapéuticos de la presente pueden determinarse a través de procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo para determinar LD50 (la dosis letal a 50% de la población) y ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) . La relación de la dosis entre los efectos tóxico y terapéutico es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación de LD5o/ED5o. Los agentes profilácticos y/o terapéuticos que exhiben altos índices terapéuticos son preferidos. Aunque los agentes profilácticos y/o terapéuticos que exhiben efectos secundarios tóxicos pueden utilizarse, se debe tener cuidado de diseñar un sistema de distribución que activa tales agentes en el sitio del tejido afectado con el fin de minimizar el daño potencial de la células no infectadas, y por lo tanto reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y los estudios animales pueden utilizarse en la formulación de un intervalo de dosificación de los agentes profilácticos y/o terapéuticos para utilizarse en humanos. La dosis de tales agentes se basa principalmente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen ED50 con poca o nada de toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación utilizada y la ruta de administración utilizada. Para cualquier agente utilizado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente a partir de los ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos de animal para lograr un intervalo de concentración en plasma circulante que incluye IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición máxima media de los síntomas) como se determina en el cultivo celular. Tal información puede utilizarse para más precisamente determinar dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, a través de cromatografía líquida de alto rendimiento.

La actividad anti-cancerígena de las terapias utilizadas de acuerdo con la presente invención también puede determinarse a través del uso de varios modelos en animales experimentales para el estudio de cáncer tal como el modelo de ratón SCID o ratones transgénicos o ratones desnudos con xenoinjertos humanos, modelos de animal, tales como hámsters, conejos, etc., conocidos en la técnica y descritos en Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development (1999, eds . Fiebig and Burger) ; Contributions to Oncology (1999, Karger) ; The Nude Mouse in Oncology Research (1991, eds. Boven and Winograd) ; y Anticancer Drug Development Guide (1997 ed. Teicher) , incorporada aquí por referencia en su totalidad.

Los modelos de animales preferidos para determinar la eficacia terapéutica de las moléculas de la invención son los modelos de xenoinjerto del ratón. Las líneas celulares del tumor que pueden utilizarse como una fuente para los tumores de xenoinjerto incluyen pero no se limitan a células SKBR3 y MCF7 , que pueden derivarse de pacientes con adenocarcinoma de pecho. Estas células tienen ambos receptores erbB2 y de prolactina. Las células SKBR3 han sido utilizadas rutinariamente en la técnica como ADCC y modelos de tumor de xenoinjerto. Alternativamente, las células 0VCAR3 derivadas de un adenocarcinoma ovárico humano pueden utilizarse como una fuente de los tumores de xenoinjerto.

Los protocolos y composiciones de la invención preferiblemente se ensayan in vitro, y después in vivo, para la actividad terapéutica o profiláctica deseada, antes del uso en humanos. Los agentes terapéuticos y métodos pueden clasificarse utilizando células de una línea celular de tumor o maligna. Se pueden utilizar muchos ensayos estándar en la técnica para evaluar tal supervivencia y/o crecimiento; por ejemplo, la proliferación celular puede ensayarse para medir la incorporación de 3H-timidina, a través de conteo celular directo, mediante la detección de los cambios en la actividad transcripcional de los genes conocidos tales como proto-oncogenes (por ejemplo, fos, myc) o marcadores del ciclo celular; la viabilidad celular puede evaluarse a través de la tinción con tripano azul, la diferenciación puede evaluarse visualmente con base en cambios en morfología, crecimiento disminuido y/o formación de colonia en agar suave o la formación de red tubular en membrana de basamento tridimensional o la preparación de la matriz extracelular, etc .

Los compuestos para utilizarse en la terapia pueden ensayarse en sistemas de modelos de animales adecuados antes de la prueba en humanos, que incluyen pero no se limitan a, ratas, ratones, pollos, vacas, monos, conejos, hámsters, etc., por ejemplo, los modelos de animal descritos anteriormente. Los compuestos después pueden utilizarse en ensayos clínicos apropiados.

Además, cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica puede utilizarse para evaluar la utilidad profiláctica y/o terapéutica de las terapias de combinación descritas en la presente para el tratamiento o prevención de cáncer, trastorno inflamatorio, o enfermedad autoinmunitarias .

EJEMPLOS DISEÑO Y CARACTERIZACION DE LOS DIACUERPOS BIESPECIFICOS COVALENTES Un diacuerpo covalente monoespecífico y un diacuerpo covalente biespecífico se construyeron para evaluar la producción recombinante , la purificación y las características de unión de cada uno. Las moléculas de diacuerpo purificadas por afinidad después se produjeron a través de los sistemas de expresión recombinantes descritas en la presente que se encuentran a través del análisis SDS-PAGE y SEC para consistir de una sola especie dimérica. Los análisis ELISA y SPR además revelaron que el diacuerpo biespecífico covalente exhibió afinidad para ambos antígenos objetivo y puede unirse a ambos antígenos simultáneamente.

Materiales y Métodos : Construcción y Diseño de Moléculas de Polipéptido: Los vectores de expresión de ácido nucleico se diseñaron para producir cuatro constructos de polipéptido, esquemáticamente representados en la FIG. 2. Constructo 1 (SEC ID NO: 9) comprende el dominio VL del anticuerpo 2B6 humanizado, que reconoce FcyRIIB, y el dominio VH del anticuerpo 3G8 humanizado, que reconoce FCYRIIIA. Constructo 2 (SEC ID NO: 11) que comprende el dominio VL de Hu3G8 y el dominio VH de Hu2B6. Constructo 3 (SEC ID NO: 12) que comprende el dominio VL de Hu3G8 y el dominio VH de Hu3G8. Constructo 4 (SEC ID NO: 13) que comprende el dominio VL de Hu2B6 y el dominio VH de Hu2B6.

PCR y Construcción del Vector de Expresión: Las secuencias de codificación de los dominios VL o VH se amplificaron del ADN de plantilla utilizando los iniciadores progresivo e inverso diseñados de tal forma que los productos de la PCR iniciales contendrían secuencias traslapadas, que permiten que la PCR traslapada genere las secuencias de codificación de los constructos de polipéptido deseados.

Amplificación PCR inicial de ADN de plantilla: Aproximadamente 35 ng de ADN de plantilla, por ejemplo cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo de interés; 1 ul de 10 uM de iniciadores contiguo e inverso; 2.5 ul de lOx regulador de pH pfuUltra (Stratagene, Inc.); 1 ul de 10 mM de dNTP; 1 ul de 2.5 unidades/ul de polimerasa de ADN pfuUltra (Stratagene, Inc.); y agua destilada para un volumen total de 25 ul me mezclaron ligeramente en un tubo de microfuga y se centrifugaron brevemente en una microcentrífuga para recolectar la mezcla de reacción en el fondo del tubo. Las reacciones PCR se llevaron a cabo utilizando el Sistema 9700 PCR GeneAmp (PE Applied Biosystem) y la siguiente configuración: 94°C, 2 minutos; 25 ciclos de 94 C, cada 15 segundos; 58 °C, 30 segundos; y 72 °C, 1 minuto.

El VL de Hu2B6 se amplificó de la cadena ligera de Hu2B6 utilizando los iniciadores progresivo e inverso de SEC ID NO: 55 y SEC ID NO: 56, respectivamente. El VH de Hu2B6 se amplificó de la cadena pesada de Hu2B6 utilizando los iniciadores progresivo e inverso de SEC ID NO: 57 y SEC ID NO: 58, respectivamente. El VL de Hu3G8 se amplificó de la cadena ligera de Hu3G8 utilizando los iniciadores progresivo e inverso de SEC ID NO: 55 y SEC ID NO: 59, respectivamente. El VH de Hu3G8 se amplificó de la cadena pesada de Hu3G8 utilizando los iniciadores progresivo e inverso de SEC ID NO: 60 y SEC ID NO: 61, respectivamente.

Los productos PCR se sometieron a electroforación en 1% de gel de agarosa por 30 minutos a 120 voltios. Los productos PCR de cortaron del gel y se purificaron utilizando el Kit de Extracción MinElute GEL (Qiagen, Inc.).

PCR de Traslape: Los productos PCR iniciales se combinaron como se describe más adelante y amplificaron utilizando las mismas condiciones PCR descritas para la amplificación inicial de ADN de plantilla. Los productos de la PCR de traslape también se purificaron como se describe supra .

La secuencia de ácido nucleico que codifica el constructo 1, SEC ID NO: 9 (mostrado esquemáticamente en la FIG. 2) , se amplificó combinando los productos PCR de las amplificaciones de VL Hu2B6 y VH Hu3G8, y los iniciadores contiguo e inverso de SEC ID NO: 55 y SEC ID NO: 61, respect vamente. La secuencia de ácido nucleico que codifica el constructo 2, SEC ID NO: 11 (mostrado esquemáticamente en la FIG. 2) , se amplificó combinando los productos PCR de las amplificaciones de VL Hu3G8 y VH Hu2B6, y iniciadores contiguo e inverso de SEC ID NO: 55 y SEC ID NO: 58, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico que codifica el constructo 3, SEC ID NO: 12 (mostrado esquemáticamente en la FIG. 2) , se amplificó combinando los productos PCR de las amplificaciones de VL Hu3G8 y VH Hu3G8, y los iniciadores contiguo e inverso de SEC ID NO: 55 y SEC ID NO: 61, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico que codifica el constructo 4, SEC ID NO: 13 (mostrado esquemáticamente en la FIG. 2), se amplificó combinando los productos PCR de las amplificaciones de VL Hu2B6 y VH Hu2B6 , y los iniciadores contiguo e inverso de SEC ID NO: 55 y SEC ID NO: 58, respectivamente .

Los iniciadores progresivos de los dominios VL (es decir, SEC ID NO: 55) e iniciadores inversos de los dominios VH (es decir, SEC ID NO: 58 y SEC ID NO: 61) contuvieron sitios de restricción únicos para permitir la clonación del producto final en un vector de expresión. Los productos PCR traslapados purificador se digirieron con endonucleasas de restricción Nhe I y EcoR I, y se clonaron en el vector de expresión de mamífero pCIneo (Promega, Inc.). Los plásmidos que codifican los constructos se diseñaron como se identifica en la Tabla 12 : Tabla 12. CONSTRUCTOS DE PLASMIDO Expresión del polipéptido/diacuerpo: pMGX0669, que codifica el constructo 1, se co-transfectó con pMGX0667, que codifica el constructo 2, en células HEk-293 utilizando Lipofectamina 2000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen) . La co-transfección de estos dos plásmidos se diseñó para conducir la expresión de un diacuerpo biespecífico covalente (CBD) inmunoespecífico para ambos FcyRIIB y FCYRIIIA (el diacuerpo h2B6-h3G8) . pMGX0666 y pMGX0668, que codifican los constructos 3 y 4, respectivamente, se transfectaron de forma separada en células HEK-293 para la expresión de un diacuerpo monoespecífico covalente (CMD) , inmunoespecífico para FcyRIIIA (diacuerpo h3G8) y FCYRIIB (diacuerpo h2B6) , respectivamente. Después de 3 días en cultivo, los productos secretados se purificaron del medio acondicionado.

Purificaeión ·. Los diacuerpos se capturaron del medio acondicionado utilizando los antígenos relevantes acoplados a Sepharose 4B activada con CNBr. La afinidad de la resina Sepharose se equilibró en 20 mM de Tris/HCl, pH 8.0 antes de la carga. Después de la carga, la resina se lavó con regulador de pH de equilibrio antes de la elución. Los diacuerpos se eluyeron de la resina lavada utilizando 50 mM de Glicina pH 3.0. Los diacuerpos eluidos se neutralizaron inmediatamente con 1M de Tris/HCl pH 8.0 y se concentraron utilizando un concentrador de tipo centrifugación. Los diacuerpos concentrados además de purificaron por cromatografía de exclusión de tamaño utilizando una columna Superdex 200 equilibrada en PBS .

SEC: La cromatografía de exclusión de tamaño se utilizó para analizar el tamaño aproximado y la heterogeneidad de los diacuerpos eluidos de la columna. El análisis SEC se llevó a cabo en una columna GE healthcare Superdex 200HR 10/30 equilibrada con PBS. La comparación con los perfiles de elución de un IgG de longitud completa (-150 kDa) , un fragmento Fab (-50 kDa) y un Fv de cadena individual (-30 kDa) se utilizaron como controles) .

ELISA: La unión de los diacuerpos eluidos y purificados se caracterizó por el ensayo ELISA, como se describe en 5.4.2. Se recubrieron 50 ul/cavidad de una solución de 2 ug/ml de sCD32B-Ig en una placa Maxisorp de 96 cavidades en regulador de pH de Carbonato a 4°C durante la noche. La placa se lavó tres veces con PBS-T (PBS, 0.1% de Tween 20) y se bloqueó mediante 0.5% de BSA en PBS-T por 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se diluyó h2B6-h3G8 CBD, h2B6 CMD, o h3G8 CMD en regulador de pH de bloqueo en una serie de diluciones dobles para generar un intervalo de concentraciones de diacuerpo, de 0.5 g/ml a 0.001 g/ml. La placa después se incubó a temperatura ambiente por 1 hora. Después del lavado con PBS-T tres veces, se agregaron 50 ul/cavidad de 0.2 ug/ml de sCD16A-Biotina a cada cavidad. La placa se volvió a incubar a temperatura ambiente por 1 hora. Después del lavado con PBS-T tres veces, se utilizaron 50 ul/cavidad de una dilución de 1:5000 de estreptavidina conjugada con HRP (Amersham Pharmacia Biotech) para la detección. La HRP-estreptavidina se dejó incubar por 45 minutos a temperatura ambiente. La placa se lavó con PBS-T tres veces y se desarrolló utilizando 80 ul/cavidad de sustrato TMB . Después de 10 minutos de incubación, la reacción HRP-TMB se detuvo por la adición de 40 ul/cavidad de 1% de H2S04. La DO450 nm se leyó utilizando un lector de placas de 96 cavidades y el software SOFTmax, y los resultados se graficaron utilizando el software GraphPadPrism 3.03.

Ensayo BIAcore : Los parámetros cinéticos de la unión de los diacuerpos eluidos y purificados se analizaron utilizando un ensayo BIAcore (BIAcore instrument 1000, BIAcore Inc., Piscataway, N.J.) y software asociado como se describe en la sección 5.4.3.

SCD16A, SCD32B o sCD32A (control negativo) se inmovilizaron en una de las cuatro células de flujo (célula de flujo 2) de la superficie del chip sensor a través de química de acoplamiento de amina (mediante la modificación de grupos carboximetilo con la mezcla de NHS/EDC) de tal forma que se inmovilizaron aproximadamente 1000 unidades de respuesta (RU) de cualquier receptor en la superficie. Después de esto, los ásteres activos sin reaccionar se "taparon" con una inyección de 1M Et-NH2. Una vez que se prepara una superficie adecuada, se hacen pasar diacuerpos específicos covalentes (h2B6-h3G8CBD) o diacuerpos monoespecíficos covalentes (h2B6 CMD o h3G8 CMB) sobre la superficie por medio de inyecciones de 180 segundos de una solución de 6.25-200 nM a una velocidad de flujo de 70 ml/min. h3G8 scFV también se ensayó para comparación.

Una vez que se recolecta el grupo de datos completo, las curvas de unión resultantes se adaptaron globalmente utilizando algoritmos de computadora suministrados por el fabricante, BIAcore, Inc. (Piscataway, NJ) . Estos algoritmos calcularon ambos Kactivado Y desactivado, a partir de los cuales la constante de unión de equilibrio aparente, KD se deduce como una proporción de las dos constantes de velocidad (es decir, KactiVado/Kdesac ivado) · Los tratamientos más detallados de cómo las constantes de velocidad individuales se derivan pueden encontrarse en el Libro de texto del software BIAevaluation (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) .

Las fases de asociación y disociación se adaptaron separadamente. La constante del grado de disociación se obtuvieron para intervalos de 32-34 segundos de la fase de disociación de 180 segundos; la adaptación de la fase de asociación se obtuvo a través del modelo Langmuir 1:1 y la adaptación de la fase se seleccionó sobre la base del criterio Rmax y chi2 para los diacuerpos específicos y scFv; se utilizó la adaptación del analito bivalente para la unión CMD.

Resultados El análisis SDS-PAGE bajo condiciones no de reducción reveló que el producto purificado de los sistemas de expresión h3G8 CMD, h2B6 CMD y h2B6-h3G8 CBD fueron cada uno una sola especie con un peso molecular estimado de aproximadamente 50 kDa (FIG. 3, carriles 4, 5 y 6, respectivamente) . Bajo condiciones de reducción, el producto purificado de cualquiera de los sistemas de expresión CMD corrió como una sola banda (carriles 1 y 2), mientras el producto purificado del sistema h2B6-h3G8 CBD se reveló como siendo 2 proteínas separadas. (FIG. 3, carril 3). Todos los polipéptidos purificados del sistema de expresión y visualizados por SDS-PAGE bajo condiciones de reducción migraron a aproximadamente 28 kDa.

El análisis SEC de cada uno de los productos del sistema de expresión también reveló una sola especie molecular (FIG. 4B) , cada una de las cuales se eluyó a aproximadamente el mismo tiempo como un fragmento Fab de IgG (-50 kDa) (FIG. 4A) . Los resultados indican que la afinidad del producto purificado fue un homodímero covalente homogéneo para el cado del sistema de expresión CMD y un heterodímero covalente homogéneo para el caso del h2B6-h3G8 CBD.

Se utilizó un ensayo de emparedado ELISA para ensayar la unión de h2B6-h3G8 CBD para la especificidad de cualquiera o ambos CD32B y/o CD16A (FIG. 5) . CD32B sirvió como el antígeno objetivo y CD16A se utilizó como la sonda secundaria. La señal positiva en ELIZA reveló que h2B6-h3G8 CBD heterodimérico tuvo una especificidad para ambos antígenos. Una prueba similar de h3G8 CMD (que no debería unirse a CD32B) no mostró señal.

El análisis SPR indicó que h3G8 CMD inmunoespecíficamente reconoció sCD16 pero no sCD32B, que h2B6 CMD inmunoespecíficamente reconoció SCD32B pero no sCD16, y que h2B6-h3G8 CBD inmunoespecíficamente reconoció ambos, sCD16 y sCD32B (FIGS. 6A-6B) . Ninguno de los diacuerpos ensayados se unió al receptor de control, sCD32A ( FIG . 6C) .

El análisis SPR también se utilizó para estimar las constantes cinética y de equilibrio de CMDs y h2B6-h3G8 CBD a SCD16 y/o SCD32B. Los resultados se compararon con las mismas constantes calculadas para h3G8 scFV. Las FIGS. 7A-7E muestran los resultados gráficos del análisis SPR. Los grados de activado y desactivado cinéticos, así como la constante de equilibrio, se calcularon de los resultados descritos en la FIGS. 7A a 7E y se proveen en la Tabla 13.

Tabla 13. Constantes Cinéticas y de Equilibrio Calculadas de los Datos BIAcore.

Acoplados con los resultados del análisis ELISA, los estudios confirman que el heterodímero covalente h2B6-h3G8 retuvo especificidad para ambos CD32B y CD16, y fue capaz de unir ambos antígenos simultáneamente. La molécula se representa esquemáticamente en la FIG. 8.

DISEÑO Y CARACTERIZACION DE DIACUERPOS BIESPECIFICOS COVALENTES QUE COMPRENDEN DOMINIOS Fe En un esfuerzo por crear una molécula de tipo IgG, es decir, que comprende un dominio Fe, uno de los polipéptidos que comprende la la molécula CBD heterodimérica presentada en el Ejemplo 6.1 se modificó para además comprender un dominio Fe (creando una cadena 'más pesada' , y 'más ligera' , análogos de una cadena pesada y ligera del anticuerpo) . La molécula biespecífica heterodimérica entonces contendría un dominio Fe que se dimerizará con una molécula homologa formando una molécula de tipo IgG tetramérica con tetravalencia (es decir, formada por dimerización a través de los dominios Fe de las moléculas biespecíficas heterodiméricas) . De forma interesante, tales moléculas tetraméricas no se detectaron en el medio acondicionado de los sistemas de expresión recombinantes utilizando ensayos funcionales, por ejemplo, ensayando el medio acondicionado para la unión inmunoespecífica a los antígenos objetivo. Más bien, solamente una molécula dimérica, que comprende monómeros que consisten de un dominio VL, VH y Fe, se detectó en tales ensayos funcionales. Para probar si la estabilidad de la estructura tetramérica teórica fue un problema, los polipéptidos que comprenden el dominio Fe se modificaron para además comprender una región de bisagra aunque los polipéptidos que comprenden la cadena 'más ligera' se modificaron para además comprender los 6 aminoácidos C-terminal del dominio constante de la cadena ligera kappa humana. Cuando tales cadenas 'más pesada' y 'más ligera' modificadas se co-expresaron en los sistemas de expresión recombinantes , los ensayos funcionales detectaron las moléculas de diacuerpo que fueron capaces de unir inmunoespecíficamente ambos, los antígenos objetivo y los anticuerpos anti-Fc.

Materiales y Métodos Construcción y Diseño de Moléculas de Polipeptido : Los vectores de expresión de ácido nucleico se diseñaron para producir versiones modificadas de los constructos 1 y 2 presentados en el Ejemplo 6.1. Constructo 5 (SEC ID NO: 14) y 6 (SEC ID NO: 15) , se crearon modificando el constructo 1 y 2, respectivamente para además comprender un dominio Fe. El constructo 7 (SEC ID NO: 16) se creó modificando el constructo 1 para además comprender la secuencia FNRGEC (SEC ID NO: 23) en su C-terminal. El constructo 8 (SEC ID NO: 18) se creó modificando el constructo 2 para además comprender una región de bisagra y el dominio Fe (que comprende la mutación V215A) . La representación esquemática de los constructos 5-8 se muestra en la FIG. 9.

PCR y Construcción del Vector de Expresión: Todos los protocolos de purificación de la PCR y el producto PCR fueron como se describe en el Ejemplo 6.1 Los plásmidos pMGX0669 y pMGX0667 sirvieron como plantillas para las secuencias de codificación de los constructos 1 y 2, respectivamente. Las secuencias de codificación para el dominio Fe HuIgG y/o dominio de bisagra fueron SEC ID NO: 5 o SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 5, respectivamente. Las secuencias de codificación de los ADN de plantilla se amplificaron utilizando los iniciadores progresivo e inverso de tal forma que los productos PCR contendrían secuencias traslapadas, que permiten que la PCR traslapada genere las secuencias de codificación de los productos deseados.

La secuencia de codificación del constructo 1 se amplificó de pMGX0669 utilizando los iniciadores progresivo e inverso de SEC ID NO: 55 y SEC ID NO: 62, respectivamente. La secuencia de codificación del constructo 2 se amplificó de pMGX0667 utilizando los iniciadores progresivo e inverso de SEC ID NO: 55 y SEC ID NO: 63, respectivamente. HuIgG bisagra-Fc se amplificó utilizando los iniciadores progresivo e inverso de SEC ID NO: 65 y SEC ID NO: 66, respectivamente. El constructo 7 (SEC ID NO: 16) se amplificó de pMGX0669 utilizando los iniciadores progresivo e inverso de SEC ID NO: 55 y SEC ID NO: 67.

Traslape PCR. Los productos PCR iniciales se combinaron como se describe más adelante, amplificaron y purificaron y como se describe en el ejemplo 6.1.

La secuencia de ácido nucleico que codifica el constructo 5, SEC ID NO: 14 (mostrado esquemáticamente en la FIG. 9) , se amplificó combinando los productos PCR de las amplificaciones de constructo 1 y HuIgG Fe, e iniciadores contiguo e inverso de SEC ID NO: 55 y SEC ID NO: 64, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico que codifica el constructo 6, SEC ID NO: 15 (mostrado esquemáticamente en la FIG. 9) , se amplificó combinando los productos PCR de las amplificaciones de constructo 2 y HuIgG Fe, e iniciadores contiguo e inverso de SEC ID NO: 55 y SEC ID NO: 66, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico que codifica el constructo 8, SEC ID NO: 18 (mostrado esquemáticamente en la FIG. 9) , se amplificó combinando los productos PCR de las amplificaciones de constructo 2 y HuIgG bisagra-Fc, e iniciadores contiguo e inverso de SEC ID NO: 55 y SEC ID NO: 66, respectivamente .

Los productos finales se clonaron en el vector de expresión de mamífero pCIneo (Promega, Inc.) como se describe previamente. El plásmido que codifica los constructos se diseñó como se identifica en la Tabla 14 : Tabla 14. CONSTRUCTOS DE PLAMIDO Expresión de polipéptido/diacuerpo: Se realizaron cuatro co-transfecciones separadas en células HEK-293 utilizando Lipofectamina 2000, como se describe en la sección 6.1: pMGX0669 y pMGX0674, que codifican los constructos 1 y 6, respectivamente; p GX0667 y pMGX0676, que codifican los constructos 2 y 5, respectivamente; y pMGX0677 y pMGX0678, que codifican los constructos 7 y 8, respectivamente.

La co-transfección de estos plásmidos se diseñó para conducir la expresión de un diacuerpo biespecífico (CBD) de tetravalencia con estructura de tipo IgG, inmunoespecífico para ambos FcyRIIB y FcyRIIIA. También se realizó una co-transfección adicional: pMGX0674 y pMGX0676, que codifican los constructos 6 y 5, respectivamente. Después de tres días en cultivo, el medio acondicionado se cosechó. La cantidad de producto secretado en el medio acondicionado se cuantificó a través de ELISA Fe anti IgG utilizando Fe purificado como un estándar. Las concentraciones del producto en las muestras después se normalizó con base en la cuantificación, y las muestras normalizadas se utilizaron en los ensayos restantes.

ELISA : La unión de moléculas de diacuerpo secretadas en el medio se ensayó a través de un emparedado ELISA como se describe, supra. A menos que se indique, CD32B se utilizó para cubrir la placa, es decir, como la proteína objetivo, y CD16 conjugado con HRP se utilizó como la sonda.

Resultados Se utilizó un ensayo ELISA para ensayar las muestras normalizadas de los sistemas de expresión recombinantes que comprenden los constructos 1 y 6 (pMGX669-pMGX674), los constructos 2 y 5 (pMGX667 -pNGX676 ) y los constructos 5 y 6 (pMGX674 -pMGX676 ) para la expresión de moléculas de diacuerpo capaces de unirse simultáneamente a CD32B y CD16A (FIG. 10) . Los datos de ELISA indicaron que la co-transfección con los constructos 1 y 6 o la co-transfección con los constructos 2 y 5 falló para producir un producto que podría unirse a cualquiera o ambos antígenos (FIG. 10, D y A , respectivamente) . Sin embargo, la co-transfección de los constructos 5 y 6 condujo a la secreción de un producto capaz de unirse a ambos antígenos CD32B y CD16. El producto anterior fue un dímero de los constructos 5 y 6, conteniendo un sitio de unión para cada antígeno con una estructura esquemáticamente descrita en lá FIG. 11.

Con el fin de conducir la formación de una estructura heterotetramérica de tipo IgG, la secuencia de codificación para seis aminoácidos adicionales se acopló al extremo C-terminal del constructo 1, generando el constructo 7 (SEC ID NO: 16 y mostrado esquemáticamente en la FIG. 9) . Los seis aminoácidos adicionales, FNRGEC (SEC ID NO: 23) , se derivaron del extremo C-terminal de la cadena ligera Kappa e interactuaron normalmente con el dominio superior de bisagra de la cadena pesada en una molécula IgG. Un dominio de bisagra después se modificó en el constructo 6, generando el constructo 8 (SEC ID NO: 18 y FIG. 9) . El constructo 8 adicionalmente comprende una mutación de aminoácido en la región de bisagra superior, A215V. Los plásmidos de expresión que codifican el constructo 7 y el constructo 8, pMGX677 y pMGX678, respectivamente, después se co-transíectaron en células HEK-293 y se expresaron como se describe.

Las moléculas de diacuerpo producidas de los sistemas de expresión recombinantes que comprenden los constructos 7 y 8 (pMGX0677 + pMGX0678) , se compararon en un ensayo ELISA para la unión de CD32B y CD16A a moléculas de diacuerpo producidas de los sistemas de expresión que comprenden los constructos 1 y 6 (pMGX669 + pMGX674) , constructos 2 y 8 (pMGX669 + pMGX678) , y constructos 6 y 7 (p GX677 + pMGX674) (FIG. 12) .

Como anteriormente, la molécula producida por el sistema de expresión que comprende los constructos 1 y 6 (pMGX669 + pMGX674) probó ser incapaz de unirse ambos CD32A y CD16A (FIG. 10 y FIG. 12) . En contraste, el producto de la co-expresión de cualquiera de los constructos 7 y 6 (pMGX0677 + pMGX0674) o de la co-expresión de los constructos 7 y 8 (pMGX0677-pMGX0678) fue capaz de unir ambos CD32B y CD16 (FIG. 12) . Se observa que el constructo 7 es análogo al constructo 1, con la excepción de que el constructo 7 comprende la secuencia C-terminal FNRGEC (SEC ID NO: 23) ; y que el constructo 8 es análogo al constructo 6, excepto que el constructo 8 comprende un dominio de bisagra y la mutación A215V. Los datos indican que la adición de 6 aminoácidos extra del C-terminal de la cadena ligera C-kappa (FNRGEC; SEC ID NO: 23) a la cadena 'más ligera' que no lleva Fe, ayudó a estabilizar la formación de las moléculas de diacuerpo, de tipo IgG tetraméricas , independientemente de si la cadena más pesada correspondiente comprende un dominio de bisagra (es decir, pMGX0677 + pMGX0674 y pMGX0677-pMGX0678 , FIG. 12) . La adición del dominio de bisagra al polipéptido 'más pesado' que lleva Fe, sin la adición de FNRGEC (SEC ID NO: 23) secuencia C-terminal para la cadena 'más ligera' correspondiente, aparentemente fue incapaz de efectuar la estabilización similar (es decir, falta de unión por el producto de la co-transfección de los constructos 2 y 8 (pMGX669 + pMGX678) ) . La estructura de la molécula de diacuerpo tetramérica se representa esquemáticamente en la FIG . 13.

EFECTO DEL ORDEN DEL DOMINIO Y ENLACES DE DISULFURO ADICIONALES EN LA FORMACION DEL DIACUERPO DE TIPO IgG TETRAMERICO El efecto de la estabilización adicional entre las cadenas de polipéptido 'más ligera' y 'más pesada' de la molécula de diacuerpo de tipo IgG tetramérica se investigó mediante la sustitución de los residuos seleccionados en las cadenas de polipéptido con cisteínas. Los residuos de cisteína adicionales proporcionan enlaces de disulfuro adicionales entre las cadena 'más pesada' y 'más ligera' . Adicionalmente , el orden del dominio en la actividad de unión se investigó moviendo el dominio Fe o el dominio bisagra-Fc del extremo C-terminal de la cadena de polipéptido del N-terminal . Aunque la actividad de unión de la molécula comprende los enlaces de disulfuro adicionales no se alteró con respecto a moléculas de diacuerpo construidas anteriormente con tales enlaces, la transferencia del dominio Fe o bisagra- Fe al N-terminal de la cadena de polipéptido 'más pesada' comprende la afinidad y/o avidez de unión sorprendentemente mejorada de los diacuerpos de la molécula biespecífica a uno ambos de sus antígenos objetivo.

Materiales y Métodos Construcción y Diseño de Moléculas de Polipéptido : Los vectores de expresión de ácido nucleico se diseñaron para producir versiones modificadas de los constructos 5, 6 y 8 presentada en el Ejemplo 6.2. El constructo 9 (SEC ID NO: 19) y el constructo 10 (SEC ID NO: 20) (ambos mostrados esquemáticamente en la FIG. 13) fueron análogos a los constructos 8 y 6, con la excepción de que el dominio Fe o bisagra-Fc, respectivamente, se alternaron a partir del C-terminal del polipéptido al N-terminal. Adicionalmente todos los dominios Fe utilizados fueron Fe de dominio IgGl de tipo silvestre. El constructo 11, SEC ID NO: 21, (mostrado esquemáticamente en la FIG. 14) fue análogo al constructo 2 del Ejemplo 6.1 excepto que el C-terminal se diseñó para además comprender la secuencia FNRGEC (SEC ID NO: 23) . El constructo 12, SEC ID NO: 22 (mostrado esquemáticamente en la FIG. 14) fue análogo al constructo 5 del Ejemplo 6.2 excepto que el dominio Fe además comprendió una región de bisagra. También, para los constructos 11 y 12, el dominio VL 2B6 y dominio VH 2B6 comprendieron una sola modificación de aminoácido (G105C y G44C, respectivamente) de tal forma que una glicina en cada dominio fue reemplazada por cisteína.

PCR y Construcción del Vector de Expresión : Todos los protocolos de purificación de PCR y del producto PCR fueron como se describe en Ejemplo 6.1 y 6.2 Traslape PCR : Los productos finales se construyeron, amplificaron y purificaron utilizando los métodos descritos en el ejemplo 6.1 y ejemplo 6.2.

Los productos finales se clonaron en el vector de expresión de mamífero pCIneo (Promega, Inc.) como se describe previamente. El plásmido que codifica los constructos se diseñó como se identifica en la Tabla 15 : Tabla 15. CONSTRUCTOS DE PLASMIDO Expresión de polipéptido/'diacuerpo: Se realizaron tres co-transfecciones separadas en células HEK-293 utilizando Lipofectamina 2000, como se describe en la sección 6.1: p GX0669 y pMGX0719, que codifican los constructos 1 y 9, respectivamente; pMGX0669 y pMGX0718, que codifican los constructos 1 y 10, respectivamente; y pMGX0617 y pMGX0717, que codifican los constructos 11 y 12, respectivamente. La co-transfección de estos plásmidos se diseñó para conducir la expresión de un diacuerpo biespecífico (CBD) de tetravalencia con estructura de tipo IgG, inmunoespecífico para ambos FcyRIIB y FCYRIIIA. Después de tres días en cultivo, el medio acondicionado se cosechó. La cantidad de producto secretado en el medio acondicionado se cuantificó a través de ELISA Fe anti IgG utilizando Fe purificado como un estándar. Las concentraciones del producto en las muestras después se normalizaron con base en la cuantificación, y las muestras normalizadas se utilizaron en los ensayos restantes.

Western Blot: Aproximadamente 15 mi de medio acondicionado de las tres co-transfecciones antes descritas se analizaron por SDS-PAGE bajo condiciones de no reducción. Un gel se tiñó con Safestaina Azul Simple (Invitrogen) y se transfirió un gel idéntico a la membrana PVDF (Invitrogen) utilizando métodos de transferencia estándar. Después de la transferencia, la membrana se bloqueó con 5% de leche desgrasada seca en IX de PBS . La membrana después se incubó en 10 mi de 1:8,000 de H+L de IgGl anti humano de cabra conjugado con HRP diluido en 2% leche desgrasada seca 1XPBS/0.1% de T een 20 a temperatura ambiente por 1 hora con IX de PBS/0.3% de Tween 20, 2X 5 min cada uno, después 20 min a temperatura ambiente, la membrana se desarrolló con el sistema detección ECL Western blotting (Amersham Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La película se desarrolló en un procesador de rayos X.

Resultados El medio acondicionado de los sistemas de expresión recombinantes que comprende los constructos 1 y 9; constructos 1 y 10; y constructos 11 y 12 se analizó a través de análisis SDS-PAGE (bajo condiciones no de reducción) y Western-blotting (utilizando a anti-IgG como la sonda) . Western blot reveló que el producto de los sistemas que comprenden los constructos 11 y 12 o que comprenden los constructos 9 y 1 predominantemente formaron especies individuales de molécula de aproximadamente 150 kDa (FIG. 14, carriles 3 y 2, respectivamente) . Ambos productos tienen enlaces de disulfuro internos modificados entre las cadena más ligera' y 'más pesada' que comprenden los diacuerpos. En contraste, la molécula sin enlaces de disulfuro internos modificados entre las cadenas 'más ligera' y 'más pesada' , formaron los constructos 10 y 1, formaron al menos dos especies moleculares de pesos moleculares de -75 y -100 kDa (FIG. 14, carril 1) .

A pesar de los resultados de Western Blot, cada uno de los tres productos se encontró que es capaz de unir ambos CD32A y CD16 (FIGS. 15A y 15B) . Sorprendentemente, con relación al producto que comprende un dominio de bisagra-Fc C-terminal (formado de los constructos 11 y 12), el producto de ambos sistemas en donde el dominio Fe (o Fc-bisagra) estaba en el amino-terminal de la cadena de polipéptido que contiene el Fe (es decir, la cadena lraás pesada' ) (constructos 9+1 y constructos 10+1) demostró un afinidad y/o avidez mejorada a uno ambos de sus péptidos objetivo (es decir CD32B y/o CD16) .

EFECTO DEL SITIO SEPARACION INTERNO/EXTERNO EN EL PROCESAMIENTO DEL PRECURSOR DE POLIPEPTIDO Y LA EXPRESION DEL DIACUERPO BIESPECIFICO COVALENTE; DISEÑO Y CARACTERIZACION DEL DIACUERPON BIESPECIFICO QUE COMPRENDE PORCIONES DE LA CADENA LAMBDA IgG HUMANA Y EL DODMINIO DE BISAGRA Como se describe en la presente, las cadenas individuales de polipéptido del diacuerpo molécula de diacuerpo de la invención pueden expresarse como una sola molécula del precursor de poliproteína . La habilidad de los sistemas recombinantes descritos en los Ejemplos 6.1-6.3 para apropiadamente procesar y expresar un CBD funcional de tal precursor de poliproteína se ensayó modificando un ácido nucleico que codifica, ambas, la primera y la segunda cadenas de polipéptido de un CBD separado por un sitio de separación interno, en particular, un sitio de separación de furina . CBD funcional aislado del sistema recombinante comprende la molécula precursora de poliproteína .

Como se explica en el Ejemplo 6.3, la adición de los 6 aminoácidos C-terminal de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEC ID NO: 23) , se encontró que estabiliza la formación del diacuerpo, presumiblemente a través de la interacción inter-cadena mejorada entre los dominios que comprenden SEC ID NO: 23 y los dominios que comprenden un dominio Fe o a dominio bisagra-Fc. El efecto estabilizante de esta interacción de tipo cadena lambda/Fc se ensayó en CBD en donde ninguna la cadena de polipéptido comprendió un dominio Fe. Una cadena de polipéptido del diacuerpo se modificó para comprender SEC ID NO: 23 en su C-terminal; la cadena de polipéptido asociada se modificó para comprender la secuencia de aminoácido VEPKSC (SEC ID NO: 77) , que se deriva del dominio de bisagra de un IgG. La comparación de este CBD con la que comprende los constructos 1 y 2 (del ejemplo 6.1) reveló que CBD comprende los dominios derivados del dominio de bisagra y la cadena lambda exhibió una afinidad ligeramente mayor a uno ambos de sus epítopos .

Materiales y Métodos • Construcción y Diseño de Moléculas de Polipéptido: Precursor de poliproteína: Los vectores de expresión de ácido nucleico se diseñaron para producir 2 moléculas del precursor de poliproteína, ambos representados químicamente en la FIG. 17. El constructo 13 (SEC ID NO: 95) comprendido del N-terminal de la " cadena de polipéptido, el dominio VL de 3G8, el dominio VH de 2.4G2 (que se une a mCD32B) , un sitio de separación de furina, el dominio VL de 2.4G2 y el dominio VH de 3G8. La secuencia de nucleótido que codifica el constructo 13 es provista en SEC ID NO: 96. El constructo 14 (SEC ID NO: 97) (FIG. 17), comprendido del N-terminal de la cadena de polipéptido, el dominio VL de 3G8 , el dominio VH de 2.4G2 (que se une a mCD32B) , un sitio de separación de furina, a sitio FMD (Proteasa C3 del Virus de la Enfermedad de Pies y Boca), el dominio VL de 2.4G2 y el dominio VH de 3G8. La secuencia de nucleótido que codifica el constructo 14 es provista en SEC ID NO: 98.

Los vectores de expresión de ácido nucleico se diseñaron para producir versiones modificadas de los constructos 1 y 2 presentada en el Ejemplo 6.1. El constructo 15 (SEC ID NO: 99) (FIG.17) fue análogo al constructo 1 (SEC ID NO: 9), presentado en el ejemplo 6.1, con la excepción de que el C-terminal del constructo 15 comprendió la secuencia de aminoácido FNRGEC (SEC ID NO: 23) . La secuencia de ácido nucleico que codifica el constructo 15 es provista en SEC ID NO: 100. El constructo 16 (SEC ID NO: 101) (FIG. 17) fue análogo al constructo 2, presentado en el Ejemplo 6.1, con la excepción de que el C-terminal del constructo 16 comprendió la secuencia de aminoácido VEPKSC (SEC ID NO: 77) . La secuencia de ácido nucleico que codifica el constructo 16 es provista en SEC ID NO: 102.

PCR y Construcción del Vector de Expresión: Todos los protocolos de purificación PCR y del producto PCR fueron como se describe en Ejemplo 6.1 y 6.2 Traslape PCR: Los productos finales se construyeron, amplificaron purificaron utilizando los métodos descritos en el ejemplo 6.1 y ejemplo 6.2 con los iniciadores apropiados .

Los productos finales se clonaron en el vector de expresión de mamífero pCIneo (Promega, Inc.) como se describe previamente. El plásmido que codifica los constructos se diseñó como se identifica en la Tabla 16: Tabla 16. CONSTRUCTOS DE PLASMIDO Expresión de polipéptido/diacuerpo: Se realizó una transfección y una co-transfección en células HEK-293 utilizando Lipofectamina 2000, como se describe en la sección 6.1: individual: pMGX0750, que codifica el constructo 13; y co-transfección: pMGX0752 y pMGX0753, que codifica los constructos 15 y 16, respectivamente. Después de tres días en cultivo, el medio acondicionado se cosechó, y el producto secretado se purificó por afinidad como se describe.

ELISA : La unión de moléculas de diacuerpo secretadas en el medio se ensayó a través de un emparedado ELISA como se describe, supra. Se utilizó CD32B de Murino para cubrir la placa, es decir, como la proteína objetivo, y se utilizó CD16A conjugado con HRP como la sonda para el producto de la co-transfección de los constructos 15 y 16. Se utilizó mCD32B como la proteína objetivo y CD16A conjugado con biotina se utilizó como la sonda para el sistema recombinante que comprende el constructo 13.

Resultados El medio acondicionado para los sistemas de expresión recombinantes que comprende los constructos 13 se analizó mediante el emparedado ELISA. El ensayo ELISA ensayó la unión de CBD para la especificidad a cualquiera o ambos mCD32B y/o CD16 (FIG. 18) . CD32B sirvió como el antígeno objetivo y se utilizó CD16A como la sonda secundaria. La señal positiva se utilizó como sonda secundaria. La señal positiva en ELISA reveló que CBD h2.4G2-h3G8 heterodimérico del precursor de poliproteína tuvo especificidad para ambos antígenos .

Similarmente, el producto purificado generado por la co-transfección de los vectores que codifican los constructos 15 y 16 se ensayó en un ensayo ELISA y se comparó con el producto comprendido de los constructos 1 y 2 (Ejemplo 6.1) . CD32B sirvió como el antígeno objetivo y CD16A se utilizó como la sonda secundaria. Como con el producto que comprendió los constructos 1 y 2, el producto de los constructos 15 y 16 se encontró que es capaz de simultáneamente unir CD32B y CD16A. De hecho, el producto de los constructos 15 y 16 mostró una afinidad ligeramente mejorada para uno más de los antígenos objetivo, es decir CD32B o CD16A. Esto quizás se debe a la aumentada estabilidad y/o fidelidad (con relación a una interacción del dominio VH-VL de tipo silvestre) de la asociación inter-cadena facilitada por la interacción de la región de cadena lambda, FNRGEC (SEC ID NO: 23) y la región de bisagra VEPKSC (SEC ID NO: 77), que está ausente en el producto comprendido de los constructos 1 y 2.

USO DE REACTIVOS DE REDIRECCIONAMIENTO DE AFINIDAD ("DART") PARA ENLAZAR MULTIPLES AFINIDADES JUNTAS Un aspecto de la presente invención se refiere a nuevos reactivos de redireccionamiento de afinidad dual ("DART") así como a nuevas formas de enlazar múltiples afinidades juntas. Los "DARTS" pueden ser monoespecífieos , biespecífieos , triespecífieos , etc., de esta forma son capaces de simultáneamente unir uno, dos, tres o más diferentes epítopos (que pueden ser del mismo diferentes antígenos) . Los "DARTS" pueden ser adicionalmente monovalentes, bivalentes, trivalentes, tetravalentes, pentavalentes , hexavalentes, etc., de esta forma siendo capaces de simultáneamente unir uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más moléculas. Como se muestra en las Figuras 35A a 35K, estos dos atributos de los DARTS pueden combinarse, por ejemplo para producir anticuerpos biespecífieos que son tetravalentes, etc.

Un avance es el desarrollo de un DART que tiene afinidad para un receptor inmunitario prototípico, huCD32B, así como afinidad para un hapteno, fluoresceína . Este DART, denominado "2B6/4420," sirve como adaptador universal, capaz de co- ligar huCD32B con moléculas que interactúan con los asociados de unión conjugados con fluoresceína . CD32B es un receptor Fe que tiene la habilidad de extinguir las señales de activación en virtud del agrupamiento con los complejos inmunitarios de señalización de activación. En esta implementación inicial, esta tecnología permite la rápida clasificación de varios objetivos biológicos para agrupar con huCD32B sin la necesidad de generar nuevos constructos DART. El 2B6/4420 puede simplemente mezclarse con un anticuerpo fluoresceinado contra un receptor de superficie celular y por lo tanto imitar la acción de un DART con afinidad para ese receptor (FIG. 20) . Además, este reactivo permite el enlace eficiente de los reactivos de afinidad que no se expresan o producen fácilmente, permitiendo superar las limitaciones técnicas. Los DART que contienen 2B6/4420 son claramente útiles como herramientas de investigación y también como candidatos clínicos. 2B6/4420 producidas de células HEK293pueden simultáneamente unir CD32B y fluoresceína en un ensayo ELISA. Adicionalmente , puede inhibir la proliferación celular reclutando CD32B para el complejo BCR a través de la coligación con CD79. El brazo 2B6 de DART puede reemplazarse con una secuencia de anticuerpo diferente o una secuencia de unión que tiene otra especificidad relevante.

Materiales y Métodos: Constructos de Plásmido: 2B6/4420 se deriva de secuencias de MAb 2B6 humanizado (hu2B6, MGA321) y una versión Fv de ratón quimérico/Fc humano del MAb anti-fluoresceína, 4420. El DART completamente ensamblado consiste de dos polipéptidos , dando como resultado el enlace covalente de dos regiones Fe. El primer polipéptido consiste de una secuencia de señal de secreción seguida por el hu2B6VL producido como una proteína de fusión con 4420VH separado por un enlazador que consiste de los residuos de aminoácido GGGSGGGG. La secuencia FNRGEC, derivada del C-terminal de la cadena ligera kappa, está acoplada al C-terminal de este polipéptido. El otro polipéptido consiste de la secuencia de señal-4420VL-GGGSGGGG-hu2B6VH, con la secuencia VEPKSC, derivada del C-terminal del fragmento Fd IgGl humano, acoplado al C-terminal. Las cisteínas en las dos cadenas de un enlace de disulfuro, se unen covalentemente a los dos polipéptidos juntos (FIG. 20) . Las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos descritos se amplificaron por PCR de plásmidos existentes, se combinaron mediante PCR de traslape, y se clonaron en pCIneo (Promega) entre los sitios Nhe I y EcoR I. Finalmente, un DART con afinidad para huCD32B y huCD16 (2B6/3G8) que se había construido previamente utilizando métodos similares a los descritos anteriores se utilizó como control.

Anticuerpos: Los anticuerpos monoclonales de murino CD79b, CB3.1 y CB3.2 anti-humanos (hibridomas) se obtuvieron del Dr. Cooper MD, Universidad de Alabama en Birmingham, Birmingham AL. CB3.1 y CB3.2 se marcaron con isotiocianato de fluoresceína (FITC) siguiendo las instrucciones del fabricante (Pierce, Rockford IL) . El fragmento F(ab')2 de un IgG anti- ratón de cabra (GAM) , específico del fragmento Fe se obtuvo de Jackson Laboratories (West Grove, PA) . El MAb de ratón anti-huCD32B, 3H7, se produjo y purificó internamente. El anti-2B6Fv de cabra se produjo mediante la inmunización de cabras con el anticuerpo entero hu2B6 y se purificó por afinidad contra la región Fv de hu2B6. HuIgG, FITC-huIgG, e IgG HRP-anti-ratón se obtuvieron de Jackson Immunoresearch . HRP-anti-cabra se obtuvo de Southern Biotech.

Expresión de DART: Los plásmidos que codifican cada cadena se co-transfectaron en células 293H (Invitrogen) utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La proteína secretada se cosechó 3-4 veces a intervalos de tres días y se purificó por cromatografía de líquido contra la forma soluble inmovilizada de CD32B.

ELISA: Los DART 2B6/4420 o 2B6/3G8 se capturaron en placas MaxiSorp (Nalge Nunc) recubiertas con Proteína S marcada con FITC (Novagen) , IgG humano, o FITC-huIgG. La detección avanzó mediante la unión del ectodominio CD32B soluble, seguido por 3H7 (un anticuerpo monoclonal de ratón específico para CD32B) , y finalmente anti-ratón-HRP. Alternativamente, la detección se llevó a cabo uniendo antisuero purificado por afinidad policlonal Fv anti-2B6 de cabra, seguido por anti -cabra-HRP . La actividad de HRP se detectó utilizando un sustrato TMB colorimétrico (Bio FX) y se leyó en un lector de placas ELISA VersaMax.

Ensayo de Purificación y Proliferación de Célula B: Las células mononucleares de sangre periféricas se separaron mediante un método gradiente Ficoll/Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech, UK) utilizando sangre de donadores sanos.

Los linfocitos B se aislaron utilizando el it de Aislamiento Negativo de Célula B Dynal (Dynal Biotechnology Inc., NY) siguiendo las instrucciones del fabricante. La pureza de las células B aisladas (CD20+) fue mayor de 90% como se estima por el análisis FACS . Para el ensayo de proliferación las células B purificadas se sembraron en medio RPMI 1640 completo en placas de microtitulación de 96 cavidades de fondo plano a una densidad celular de lxlO5 células por cavidad en un volumen final de 200 µ? y se incubaron durante 48 hrs en la presencia o ausencia de anticuerpos y diacuerpos a 37°C en 5% de C02. Después se agregó 1 yCi/cavidad de [3H] timidina (Perkin Elmer, Wellesley, MA) y la incubación continuó por 16-18 horas más antes de la cosecha. La incorporación de [3H] timidina se midió por conteo de cintilación líquido.

Resultados Con el fin demostrar que DART 2B6/4420 es activo y específicos, se condujeron dos experimentos ELISA. Primero, se unieron 2B6/4420 o 2B6/3G8 (como a control negativo) a una proteína conjugada con fluoresceína (proteína C) que había sido recubierta sobre placas ELISA. Después, el brazo 2B6 se conecto a través de CD32B soluble. La unión se detectó a través de otro anticuerpo a CD32B con un epítopo que no traslapa el de 2B6 seguido por un anticuerpo secundario conjugado a HRP . Aunque DART 2B6/4420 es capaz de unir simultáneamente fluoresceína y CD32B, 2B6/3G8 no lo es (FIG. 21A) . Cuando los DART se capturan en placas recubiertas con CD32B soluble y la unión se detecta mediante un anticuerpo específico para hu2B6 Fv, ambos DART muestran una buena unión. Para demostrar que DART 2B6/4420 ART fue capaz de unión fluoresceína conjugada a IgG humano (dado que esto está en el contexto de la implementación inicial de este reactivo) , HuIgG, no marcado marcado con fluoresceína, se unió a las placas ELISA y se utilizó para capturar 2B6/4420. De nuevo, se utilizó 2B6/3G8 como un control negativo. La unión se detectó utilizando un anticuerpo específico para Hu2B6 Fv. DART 2B6/4420 claramente se une a FITC-HuIgG, pero no se une a HuIgG sin marcar, lo que demuestra que este DART es capaz de unir fluoresceína conjugada a un anticuerpo y que no hay una unión significativa al anticuerpo solo. Como se esperaba, no se detectó ninguna unión a través de DART 2B6/3G8 DART en ninguno de estos contextos.

Los experimentos se condujeron para demostrar que DART 2B6/4420 fue capaz de funcionar como un reactivo de afinidad dual que podría tener un efecto sobre la señalización en el contexto de un ensayo con base en célula. La co-agregación de CD32B con BCR ha demostrado que inhibe la activación de la Célula B. La habilidad de dart 286/4420 para co-acoplar CD32B con BCR recubierto con anticuerpos CD79b marcados con fluoresceína y activar la inhibición de la proliferación celular se exploró. Las células B se seleccionaron negativamente de sangre humana y se activaron a través del tratamiento concentraciones en aumento de los clones CB3.1 y CB3.2 marcados con FITC anti-humano-CD79B , y a través de la adición de un fragmento F(ab' )2 de un GAM específico Fe como un reactivo secundario para entrelazar BCR, junto con una concentración fija (5 pg/ml) de DART 286/4420 o una cantidad equivalente de DART 2B6/3G8, una molécula que no activa la fluoresceína, de esta forma utilizada como control. La proliferación celular, medida como incorporación de [3H] -timidina, se aumentó concentraciones en aumento del activador anti-CD79b-FITC monoclonal en la ausencia de DARTS o en la presencia del DART 2B6/3G8 de control. La presencia de DART 286/4420 condujo a la profunda reducción en la proliferación de la célula B a todas las concentraciones del anti-CD79b humano-FITC (FIG 22A y 22B y FIG. 23A) .

La inhibición de la proliferación no se observó cuando se trataron células B recubiertas con CB3.2 sin marcar y se activaron utilizando las mismas condiciones experimentales con DART 286/4420 probando su especificidad objetivo (FIG. 23B) . Estos datos demuestran que DART 286/4420 es capaz de entrelazar CD32B y BCR y distribuir una señal inhibidora capaz de bloquear la activación de la célula inducida por el antígeno-receptor.

DART INMUNOTERAPEUTICO CONTRA CD32B QUE EXPRESA MALIGNIDADES DE CELULA B Actualmente, las malignidades de la célula B se trataron utilizando el anticuerpo anti-CD20 Rituxan®. Algunas malignidades de la célula B, sin embargo no expresan CD20 o se hacen resistentes a Rituxan. Los DART de la presente invención proporcionan un inmunoterapéutico alternativo capaz de superar los problemas asociados con el anticuerpo anti-CD20 Rituxan®.

MGD261 es una molécula de re-direccionamiento de afinidad dual (DART) que se une a hCD32B (a través del anticuerpo h2B6) y hCD16A y hCD16B (a través del anticuerpo h3G8) .

La eficacia (depleción de célula B) y la seguridad de MGD261 se ensayó en mCD32-/- hCD16A+ C57B1/6, mCD32-/-hCD32B+ C57B1/6 y mCD32-/- hCD16A+ hCD32B+ C57B1/6. En este experimento de dosis repetida, los ratones recibieron 6 inyecciones IV (dos veces por semana durante 3 semanas) . La depleción de la célula B se monitoreó por FACS . La seguridad se monitoreó mediante observación en el lado de la jaula.

Los datos indican que MGD261 es capaz de llevar a cabo la depleción de las células B en ratones transgénicos dobles sin inducir cualquier efecto secundario significativo.

Datos: Los ratones mCD32-/- hCD16A+ C57B1/6, mCD32-/- hCD32B+ C57B1/6 y mCD32-/- hCD16A+ hCD32B+ C57B1/6 de la colonia de reproducción de MacroGenics se inyectaron IV en los días 0, 3, 7, 10, 14 y 17 con MGD261 (10, 3, 1 o 0.3 mg/kg) , o un anticuerpo irrelevante (hE16 10 mg/kg) . La sangre se recolectó en los días -19 (pre-sangrado) , 4, 11, 18, 25 y 32 para análisis FACS . La salud y actividad de los animales se registró tres veces a la semana.

DiBeño: Método de análisis FACS: Las muestras de sangre entera se recolectaron 18 días antes de la administración de h2B6-h3G8 y 4, 11, 18, 25 y 32 días después de la administración del tratamiento. Las muestras de sangre se analizaron para determinar el efecto de h2B6-h3G8 en los conteos de célula B a través del ensayo a base de FACS. Se utilizó un protocolo de no lavado para el conteo de célula B, célula T y PMN mediante el uso de perlas FlowCount, obtenidas de Beckman Coulter. El panel de anticuerpos utilizados en el análisis fue 1A8-FITC para PMN, CD3-PE para célula T, CD19-APC para Célula B y CD45-PerCP para el total de leucocitos.

Resultados Los ratones tratados con hE16 o MGD261 (en cualquier concentración) no muestran ningún signo de incomodidad en ningún momento durante la duración de la experimentación.

La depleción de la célula B se observó en ratones transgénicos dobles hCD16A y hCD32B. El diacuerpo h2B6-3G8 se conecta con hCD16A que expresa células efectoras y hCD32B expresa las células B; las conexiones fueron requeridas para la aniquilación de la célula B. La depleción de la célula B no se observó en ratones transgénicos individuales (FIGS. 24A y 24B) . No hubo cambios significativos para el nivel de las células T y PMN durante el estudio.

Como una demostración más de los inmunoterapeúticos alternativos de la presente invención, se construyó un sustituto MGD261, denominado "2.4G2-3G8 DB" . 2.4G2-3G8 DB es una molécula de re-direccionamiento de doble afinidad (DA T) que se une a mCD32B (a través del anticuerpo 2.4G2) y hCD16A y hCD16B (a través del anticuerpo h3G8) .

La eficacia (depleción de la célula B) y la seguridad de 2.4G2-3G8 DB se ensayó en ratones mCD16-/-, mCD16-/- hCD16A+ C57B1/6, mCD16-/- hCD16B+ y mCDi -/- hCD16A+ hCD16B+. En la repetición de este experimento de dosis, los ratones recibieron 9 inyecciones IP (tres veces por semana durante 3 semanas) . La depleción de la célula B se monitoreó por FACS . La seguridad se monitoreó por observación en el lado de la jaula.

Los datos indican que 2.4G2-3G8 DB es capaz de llevar a cabo la depleción de las células B en ratones transgénicos hCD16 sin inducir ningún efecto secundario.

Datos: Los ratones mCD16-/-, mCD16-/- hCD16A+ C57B1/6, mCD16-/- hCD16B+ y mCD16-/- hCD16A+ hCD16B+ de la colonia de reproducción de MacroGenics se inyectaron IP en los días 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16 y 18 con 2.4G2-3G8 DB (75 ug/ratón) , o PBS. La sangre se recolectó en los días -10 (pre-sangrado) , 4, 11 y 18 para análisis FACS. La salud y actividad del animal se registró tres veces por semana.

Grupo # de animales Dosis Artículo de Ruta Puntos en tiempo pg/ms prueba para recolección de sangre A 2 mCD16-/- - PBS IP Días -10,4,11,18 B 2 mCD16-/- 16A+ B6 - PBS IP Días -10,4,11,18 C 2 mCD16-/- 16B+ - PBS IP Días -10,4,11,18 D 2 mCD16-/- 16A+ - PBS IP Días -10,4,11,18 16B+ E 6 mCD16-/- 75 2.4G2-3G8 IP Días -10,4,11,18 DB F 6 mCD16-/- 16A+ B6 75 2.4G2-3G8 IP Días -10,4,11,18 DB G 6 mCD16-/- 16B+ 75 2.4G2-3G8 IP Días -10,4,11,18 DB H 6 mCD16-/- 16A+ 75 2.4G2-3G8 IP Días -10,4,11,18 16B+ DB Método de análisis FACS: Las muestras de sangre entera se recolectaron 10 días antes de la administración de 2.4G2-3G8 y 4, 11 y 18 después del inicio del tratamiento.

Las muestras de sangre se analizaron para determinar el efecto de 2.4G2-3G8 en los conteos de célula B mediante un ensayo con base en FACS. Se utilizó un protocolo no de lavado para el conteo de célula B, célula T y PMN utilizando tubos TruCOUNT, obtenidos de BD Immunocytometry System. El panel de anticuerpos utilizados en el análisis fue 1A8-FITC para PMN, CD3-PE para Célula T, CD19-APC para Célula B y CD45-PerCP para el total de leucocitos.

Resultados Los ratones tratados con hE16 o 2.4G2-3G8 DB no mostraron ningún signo de molestia en ningún momento durante la duración de la experimentación.

La depleción de la célula B se observó en ratones mCD 16-1- hCD 16A+ o mCD 16-1- hCD 16A+ hCD 16B+ pero no en ratones mCD 16-1- . Estos datos indican que las células efectoras que llevan hCD 16 A fueron requeridas para la aniquilación de la célula B (FIG. 25) . No hubo cambios significativos en el nivel de las células T y PMN durante el estudio .

Modelo Intravenoso (IV) : La actividad anti-tumoral de MGD261 se ensayó utilizando un modelo intravenoso (IV) de la línea de células tumorales humanas Raj i . Raj i es una línea de células de linfoma de Burkitt humana que expresa hCD32B. Cuando se inyectan intravenosamente en ratones mCD16-/-, hCD16A+, RAG1-/-, las células de tumor se localizan en la espina y da como resultado parálisis de la pata trasera.

Los datos indican que MGD261 es capaz de bloquear el crecimiento de la célula de tumor Raj i in vivo en ratones mCD16-/-, hCD16A+, RAG1 - / - . Los datos indican que MGD261 puede utilizarse en el tratamiento de CD32B que expresa malignidades de la célula B en el humano.

Datos: Se inyectaron IV doce ratones de veinte semanas de edad mCD16-/-, hCD16A+, RAGl - / - C57B1/6 de la colonia de reproducción MacroGenics en el día 0 con 5 x 106 células Raji. En los días 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27 y 30 los ratones también se trataron intraperitonealmente (IP) con 250, 25 o 2.5 ug de MGD261 o con PBS (control negativo) .

Los ratones después se observaron diariamente y se registró el peso corporal dos veces por semana. Los ratones que desarrollaron parálisis en la pata trasera fueron sacrificados .

Resultados: Los ratones tratados con PBS murieron entre el día 25 y el día 50. Los ratones tratados con MGD261 sobrevivieron al menos hasta el día 90 (FIG. 26) . La supervivencia aumentada es estadísticamente significativa. Una comparación de las curvas de supervivencia utilizando una prueba Logrank dio ?2 de 96.46 (df 9; valor P < 0.0001).

EXPRESION DART PROCARIOTAS Los experimentos se condujeron para demostrar la habilidad de producir DART en hospederos no mamíferos. Por consiguiente, Escherichia coli se transformó con un plásmido que expresa DART, y la expresión de DART se monitoreó.

Materiales y Métodos: Construcción del plásmido: 3G8 es un anticuerpo monoclonal humanizado contra HuCD 16. El DART descrito en la presente consiste de dos cadenas covalentemente enlazadas, cada una de las cuales tiene un VL seguido por un separador, después un VH seguido por Cys en un buen contexto para formar un enlace de disulfuro para la cadena opuesta. La secuencia de codificación DART 3G8VL- GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly (SEC ID NO: 10) -3G8VH-LeuGlyGlyCys se amplificó por PCR a partir de un constructo de expresión eucariota existente y se digirió con Neo I y EcoR I. El vector objetivo fue pET25b ( + ) (Novagen) , que contiene la secuencia líder pelB para la secreción en E. coli. Antes de la inserción de las secuencias 3G8/3G8 DART, el vector se modificó como sigue: Primero, el promotor T7 se reemplazó por un promotor lac de afinidad menor con el fin de favorecer la expresión soluble de las proteínas, sin embargo a nivel inferior, bajo su control. Adicionalmente , se introdujeron dos mutaciones de punto para eliminar dos codones Met internos presentes al inicio del sitio de clonación múltiple (MCS) con el fin de favorecer la iniciación en el Met presente en el inicio del líder pelB. El DART que se produce por este constructo consiste de dos brazos de la región V que tienen la misma especificidad, principalmente HuCD 16.

Expresión: Las células BL21DE3 (Novagen) se transformaron con el plásmido pET25b(+) T7-lac+ 3G8/3G8 y una colonia resistente a amp se utilizó para sembrar el cultivo del caldo. Cuando el cultivo alcanzó 0.5 unidades de DO600, se agregaron 0.5 mM de IPTG para inducir la expresión. El cultivo se cultivó a 30°C por 2 horas y se recolectó el medio libre de célula.

Purificación: El DART 3G8/3G8 se purificó en un proceso de dos pasos utilizando cromatografía de exclusión de tamaño y por afinidad. El DART se capturó del medio acondicionado utilizando cromatografía por afinidad. Específicamente, CD16A acoplado a Sepharose 4B activada con CNBr (GE Healthcare) . La resina CD16A-Sepharose se equilibró en 20 mM de Tris/HCl, pH 8.0 antes de la carga. Después de la finalización de la carga, la resina se lavó con regulador de pH de equilibrio antes de la elución del DART unido con 50 mM de Glicina, pH 3.0. El DART eluido se neutralizó inmediatamente 1M Tris/HCl pH 8.0 y se concentró utilizando un concentrador de tipo centrifugación (Vivaspin 20, 10k MWCO PES, VivaScience Inc.). El DART concentrado además se purificó por cromatografía de exclusión de tamaño utilizando una columna Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada en PBS .

Resultados Se procesaron 1.7 litros de medio cultivado en E. coli a través de la columna CD16A Sepharose . El rendimiento del DART fue 0.12 mg. El análisis del DART purificado por SDS-PAGE y SEC demostró una equivalencia con el DART de control expresado en células de mamífero (CHO) (FIG. 27) .

ELISA de unión a DART h3G8-h3G8 expresado en E. coli: La expresión de DART h3G8-h3G8 DART en E. coli se midió utilizando un ELISA. Se recubrieron 50 µ?/cavidad de 2 g/ml del anticuerpo específico Fv anti-h3G8 2C11 en una placa Maxisorp de 96 cavidades en regulador de pH de Carbonato a 4°C durante la noche. La placa se lavó tres veces con PBS-T (PBS, 0.1% de Tween 20) y después se bloqueó mediante 0.5% de BSA en PBS-T por 30 minutos a temperatura ambiente antes de agregar DART de prueba. Durante el bloqueo, DART h3G8-h3G8 expresado en E. coli, y DART h2B6-h2B6 DART (control negativo) se diluyeron en 1 y 0.3 g/ml en PBST/BSA. SE agregaron 50 µ?/cavidad de DART diluido a cada cavidad. La placa se incubó a temperatura ambiente por 1 hora. Después del lavado con PBS-T tres veces, se agregaron 50 µ?/cavidad de 0.1 µ9/??1 de sCD16-Fc de fusión biotinilado a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente por 1 hora. Después del lavado con PBS-T tres veces, 50 µ?/cavidad de a una dilución de 1:5000 de estreptavidina conjugada con HRP (Amersham Pharmacia Biotech) se utilizó para la detección y se incubó a temperatura ambiente por 1 hora. La placa se lavó con PBS-T tres veces y se desarrolló utilizando 80 ul/cavidad de sustrato TMB. Después de 5 minutos de incubación, la reacción se detuvo mediante 40 µ?/cavidad de 1% de H2S04. La DO450 nm se leyó utilizando un lector de placas de 96 cavidades y el software SOFTmax. La lectura se gráfico utilizando el software GraphPadPrism 3.03 (FIG. 28).

MUERTE DE CELULA B HUMANA INDUCIDA POR DART El PBMC humano se incubó durante la noche con: CD 16-CD32B - hu3G8- hu2b6 (descrito anteriormente) ; anticuerpo 2B6 quimérico aglicosilado ch2B6-aglyc (descrito en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos co-pendiente No. de Serie 11/108,135, publicada como US2005/0260213 , incorporada en la presente por referencia) y CD16-CD79. El ADN y las secuencias de proteína codificadas de CD16-CD79 son como sigue: H3G8VL-CB3.1VH Secuencia de Nucleótido (SEC ID NO: 226) : gacatcgtga tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga 50 gagggccacc atcaactgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg 100 atagttttat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc 150 ctcatctata ctacatccaa tctagaatct ggggtcccag acaggtttag 200 tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcagc agcctgcagg 250 ctgaggatgt ggcagtttat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300 acgttcggac aggggaccaa gcttgagatc aaaggaggcg gatccggagg 350 cggaggccag gtccaactgc agcagcctgg ggctgagctg gtgaggcctg 400 gggcttcagt gaagctgtcc tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc 450 tactggatga actgggtgaa gcagaggcct ggacaaggcc ttgaatggat 500 tggtatggtt gatccttcag acagtgaaac tcactacaat caaatgttca 550 aggacaaggc cacattgact gttgacaaat cctccagcac agcctacatg 600 cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag 650 agctatgggc tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctcagttg 700 agcccaaatc ttgt 714 Secuencia de Aminoácido (SEC ID NO: 227) : DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVD FDGDSFMN Y QQKPGQPPKL 50 LIYTTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSNEDPY 100 TFGQGTKLEI KGGGSGGGGQ VQLQQPGAEL VRPGASVKLS CKASGYTFTS 150 YWMNWVKQRP GQGLEWIGMV DPSDSETHYN QMFKDKATLT VDKSSSTAYM 200 QLSSLTSEDS AVYYCARAMG YWGQGTSVTV SSVEPKSC 238 Nucleótido (SEC gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca 50 accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100 gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150 cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200 cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250 aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc caggttaccc tgagagagtc tggccctgcg ctggtgaagc 400 ccacacagac cctcacactg acttgtacct tctctgggtt ttcactgagc 450 acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt cagcctcccg ggaaggctct 500 agagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgacaagcgc tataatccag 550 ccctgaagag ccgactgaca atctccaagg atacctccaa aaaccaggta 600 gtcctcacaa tgaccaacat ggaccctgtg gatactgcca catactactg 650 tgctcaaata aaccccgcct ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg 700 tcactgtgag ctcattcaac aggggagagt gt 732 Secuencia de Aminoácido (SEC ID NO: 229) : DWMTQTPLT LSV IGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN 50 RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100 LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS 150 TSGMGVGWIR QPPGKALEWL AHIWWDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSKNQV 200 VLTMTNMDPV DTATYYCAQI NPAWFAYWGQ GTLVTVSSFN RGEC 244 La apoptosis se ensayó mediante análisis FACS como el porcentaje de PI+Anexina-V+ población de Células Bs (células CD20+) en la población sin sincronización de FSC/SSC total (FIG. 29) . 8B5-CB3.1 DART 8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC 8B5VL se amplificó utilizando H9 y lgh630R como iniciadores, ch8B5Lc como plantilla. CB3.1VH se amplificó utilizando lgh628F y lgh629R como iniciadores, ch8B5Hc como plantilla. La secuencia enlazadora se incorporó en los iniciadores lgh630R y lgh628F. El enlazador C-terminal y el codón detención se incorporó en el iniciador lgh629R. Los productos PCR se purificaron con gel y se mezclaron en una relación molar igual, después se amplificaron utilizando H9 y lgh629R como iniciadores. El producto PCR traslapado después se digirió con endonucleasas de restricción Nhel/EcoRI, y se clonó en el vector pCIneo vector.

CB3.1VL- 8B5VH-FNRGEC CB3.1 VL se amplificó utilizando H9 y lgh630R, que comparten la misma secuencia que 8B5VL en FR4 , como iniciadores, y chCB3. lLc como plantilla. 8B5VH se amplificó utilizando lgh631F y lgh640R como iniciadores, y ch8B5Hc como plantilla. La secuencia enlazadora se incorporó en los iniciadores lgh630R y lgh631F. El enlazador C-terminal y el codón detención se incorporaron en el iniciador lgh640R. Los productos PCR se purificaron en gel y se mezclaron en una relación molar igual, después se amplificaron utilizando H9 y lgh640R como iniciadores. El producto PCR traslapado después se digirió con endonucleasas de restricción Nhel/EcoRI, y se clonaron en el vector pCIneo. 8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC con etiqueta anti -bandera La etiqueta anti -bandera se insertó entre la secuencia de señal y 8B5VL mediante el traslape de PCR. La secuencia de señal y la etiqueta de Bandera se amplificaron utilizando H9 y lgh647R como iniciadores y ch8B5Lc como templado. 8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC se volvió a amplificar utilizando lgh647F y lgh629R como iniciadores y 8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC como templado. Los productos PCR se purificaron en gel y se mezclaron en una relación molar igual, después se amplificaron utilizando H9 y lgh629R como iniciadores. El producto PCR traslapado después se digirió con endonucleasas de restricción Nhel/EcoRI, y se clonó en el vector pCIneo. 8B5VL-CB3.1VH-LGGC Para generar un enlazador C-terminal diferente en el constructo 8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC, el constructo se volvió a amplificar utilizando H9 y lgh646R como iniciadores. El enlazador LGGC C-terminal se integró en el iniciador lgh646R. El producto PCR después se digirió con endonucleasas de restricción Nhel/EcoRI, y se clonó en el vector pCIneo.

CB3.1VL-8B5VH-LGGC Se utilizó la misma estrategia para crear CB3.1VL-8B5VH-LGGC . El enlazador LGGC C-terminal se integró en el iniciador lgh648R y CB3.1 VL-8B5 VH-FNRGEC se utilizó como templado. El producto PCR después se digirió con endonucleasas de restricción Nhel/EcoRI, y se clonó en el vector pCIneo. 8B5VL-CB3. IVH-LGGC de etiqueta anti-bandera También se utilizó la misma estrategia para crear 8B5VL-CB3.1 VH-LGGC con etiqueta anti-bandera. El enlazador LGGC C-terminal se integró en el iniciador lgh648R y 8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC de etiqueta anti-bandera se utilizó como templado. El producto PCR después se digirió con endonucleasas de restricción Nhel/EcoRI, y se clonó en el vector pCIneo.

Secuencia de Nucleótido 8B5-CB3.1-VEPKSC (SEC ID NO: 230) : gacattcaga tgacacagtc tccatcctcc ctacttgcgg cgctgggaga 50 aagagtcagt ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggcttca gcagaaacca gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggtcagat tattctctca ccatcagcag tcttgagtct gaagattttg 250 cagactatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 ccaactgcag cagcctgggg ctgagctggt gaggcctggg gcttcagtga 400 agctgtcctg caaggcttct ggctacacct tcaccagcta ctggatgaac 450 tgggtgaagc agaggcctgg acaaggcctt gaatggattg gtatggttga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacaaggcca 550 cattgactgt tgacaaatcc tccagcacag cctacatgca gctcagcagc 600 ctgacatctg aggactctgc ggtctattac tgtgcaagag ctatgggcta 650 ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcagttgag cccaaatctt 700 gt 702 Secuencia de aminoácido 8B5 -CB3.1-VEPKSC (SEC ID NO: 231) : DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTCRASQEIS GYLSWLQQKP DGTIKRLIYA 50 ASTLDSGVPK RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYCLQ YFSYPLTFGA 100 GTKLELKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKAS GYTFTSYWMN 150 WVKQRPGQGL EWIGMVDPSD SETHYNQMFK DKATLTVDKS SSTAYMQLSS 200 LTSEDSAVYY CARAMGYWGQ GTSVTVSSVE PKSC 234 Secuencia de Nucleótido CB3.1-8B5-FNRGEC (SEC ID NO: 232) : gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca 50 accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100 gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150 cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200 cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250 aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450 gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500 ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550 agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600 gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650 ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700 tctcctcgtt caacagggga gagtgt 726 Secuencia de aminoácido CB3.1-8B5-FNRGEC (SEC ID NO: 233) : DWMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLN LLQRPGQSPN 50 RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100 LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCEASGFTFS 150 DAWMDWVRQS PEKGLEWVAE IR KAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDSKSS 200 VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA LGLDYWGQGT TLTVSSFNRG EC 242 8B5VL-CB3.1VH-LGGC 8B5VL se amplificó utilizando H9 y lgh694R como iniciadores, ch8B5Lc como plantilla. 8B5VH se amplificó utilizando lgh695F y lgh696R como iniciadores, ch8B5Hc como plantilla. La secuencia enlazadora se incorporó en los iniciadores lgh694R y lgh695F. HuIgGlFc se amplificó utilizando lgh355F y lgh366R como iniciadores, ch8B5Hc como plantilla. Los productos PCR se purificaron en gel y se mezclaron en una relación molar igual, después se amplificaron utilizando H9 y lgh366R como iniciadores. El producto PCR traslapado después se digirió con endonucleasas de restricción Nhel/EcoRI, y se clonó en el vector pCIneo.

Secuencia de Nucleótido 8B5VL-CB3.1VH-LGGC (SEC ID NO: 234) : gacattcaga tgacacagtc tccatcctcc ctacttgcgg cgctgggaga 50 aagagtcagt ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggcttca gcagaaacca gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggtcagat tattctctca ccatcagcag tcttgagtct gaagattttg 250 cagactatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 ccaactgcag cagcctgggg ctgagctggt gaggcctggg gcttcagtga 400 agctgtcctg caaggcttct ggctacacct tcaccagcta ctggatgaac 450 tgggtgaagc agaggcctgg acaaggcctt gaatggattg gtatggttga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacaaggcca 550 cattgactgt tgacaaatcc tccagcacag cctacatgca gctcagcagc 600 ctgacatctg aggactctgc ggtctattac tgtgcaagag ctatgggcta 650 ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696 Secuencia de aminoácido 8B5VL-CB3.1VH-LGGC (SEC ID NO: 235): DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTCRASQEIS GYLSWLQQKP DGTIKRLIYA 50 ASTLDSGVPK RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYCLQ YFSYPLTFGA 100 GTKLELKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKAS GYTFTSYWMN 150 WVKQRPGQGL EWIGMVDPSD SETHYNQMFK DKATLTVDKS SSTAYMQLSS 200 LTSEDSAVYY CARAMGYWGQ GTSVTVSSLG GC 232 Secuencia de Nucleótido CB3.1-8B5-LGGC (SEC ID NO: 236) : gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca 50 accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100 gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150 cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200 cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250 aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450 gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500 ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550 agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600 gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650 ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700 tctcctcgct gggaggctgc 720 Secuencia de aminoácido CB3.1-8B5-LGGC (SEC ID NO: 237) : DWMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN 50 RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100 LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCEASGFTFS 150 DAWMDWVRQS PEKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDSKSS 200 VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA LGLDYWGQGT TLTVSSLGGC 240 Iniciadores : Lgh628F (SEC ID NO: 238) : ggaggcggat ccggaggcgg aggccaggtc caactgcagc agcctgg 47 Lgh629R (SEC ID NO: 239) : tttgaattct aacaagattt gggctcaact gaggagacgg tgactgagg 49 Lgh630R (SEC ID NO: 240) : gcctccgcct ccggatccgc ctcctttcag ctccagcttg gtccc 45 Lgh631F (SEC ID NO: 241) : ggaggcggat ccggaggcgg aggcgaagtg aagcttgagg agtctgg 47 Lgh640R (SEC ID NO: 242) : tttgaattct aacactctcc cctgttgaac gaggagactg tgagagtgg 49 Lgh644R (SEC ID NO: 243) : tttgtcgtca tcatcgtctt tgtagtcgga gtggacacct gtggagag 48 Lgh646R (SEC ID NO: 244) : tttgaattct agcagcctcc cagtgaggag acggtgactg ag 42 Lgh647F (SEC ID NO: 245) : caaagacgat gatgacgaca aagacattca gatgacacag tctcc 45 Lgh648R (SEC ID NO: 246) : tttgaattct agcagcctcc cagcgaggag actgtgagag tgg 43 Expresión: El constructo 5 y 6, o 6 y 7, o 8 y 9, o 9 y 10, los plásmidos de expresión codificados (FIG. 30) se co-transfectaron en células HEK-293 para expresar DART 8B5-CB3.1 con o sin etiqueta anti-bandera utilizando Lipofectamina 2000 ( Invitrogen) . El medio acondicionado se cosechón cada tres días durante tres veces . El medio acondicionado después se purificó utilizando la columna de afinidad CD32B.

ELISA: El ELISA se condujo como sigue: 50 µ?/cavidad de 2 ug/ml de CD32B-Fc se recubrió en una placa Maxisorp de 96 cavidades en regulador de pH de Carbonato a 4°C durante la noche. La placa se lavó tres veces con PBS-T (PBS, 0.1% de Tween 20) y después se bloqueó mediante 0.5% de BSA en PBS-T por 30 minutos a temperatura ambiente antes de agregar la proteína de fusión Fe de cadena individual de prueba. Durante el bloque, se diluyó DART 8B5-CB3.1 en una serie de diluciones dobles partiendo de 2 g/ml. Se mezclaron 25 µ?/cavidad de DART diluido mezclado con 25 µ?/cavidad de 50 ng/ml de ch8B5 se transfirieron de la placa de dilución a la placa ELISA. La placa se incubó a temperatura ambiente por 1 hora. Después del lavado con PBS-T tres veces, se agregaron 50 µ?/cavidad de 1:10,000 de F(ab' ) 2 de anti-IgG humano de cabra de F(ab' )2 conjugado con HRP diluido (Jackson ImmunoResearch) a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente por 1 hora. La placa se lavó con PBS-T tres veces y se desarrolló con 80 µ?/cavidad de sustrato TMB . Después de 5 minutos de incubación, la reacción se detuvo mediante 40 µ?/cavidad de 1% de H2S04. La DO450 nm se leyó utilizando un lector de placas de 96 cavidades y el software SOFTmax. La lectura se gráfico utilizando el software GraphPadPrism 3.03 (FIG. 31) .

DISEÑO Y CARACTERIZACION DE DART TETRAVALENTE DE TIPO Ig Se utilizaron cuatro cadenas de polipéptido para producir una especie DART de tipo Ig que tiene sitios de unión de antígeno tetravalente (Figura 32; Figura 33) . La especie DART de tipo Ig tiene propiedades únicas, ya que sus dominios pueden diseñarse para unirse al mismo epítopo (tal como para formar un DART de tipo Ig específico de mono-epítopo, tetravalente capaz de unir cuatro moléculas de antígeno idénticas) , o para diferentes epítopos o antígenos por ejemplo, sus dominios pueden diseñarse para unirse a dos epítopos en el mismo antígeno (para de esta formar un DART de tipo Ig específico de mono-antígeno tetravalente) , o para epítopos de diferentes moléculas de antígeno para así formar un DART de tipo Ig tetravalente que tiene un par de sitios de unión específicos para un primer antígeno y un segundo par de sitios de unión para un segundo antígeno) . Las moléculas híbridas que tienen combinaciones de tales atributos pueden fácilmente producirse.

Para ilustrar las características de tales especies DART de tipo Ig, se produjo una especie DART de tipo Ig tetravalente ilustrativa que tiene un par de sitios de unión específicos para CD32 y un segundo par de sitios de unión específicos para CD16A. Esta especie DART de tipo Ig se produjo utilizando las siguientes cuatro cadenas de polipéptido: Secuencia de Nucleótido 2.4G2-3G8-hKappa (SEC ID NO: 247) : gatgtccaga tgacccagtc tccatctaat cttgctgcct ctcctggaga 50 aagtgtttcc atcaattgca aggcaagtga gagcattagc aagtatttag 100 cctggtatct acagaaacct gggaaagcaa ataagcttct tatgtacgat 150 gggtcaactt tgcaatctgg aattccatcg aggttcagtg gcagtggatc 200 tggtacagat ttcactctca ccatcagaag cctggagcct gaagattttg 250 gactctatta ctgtcaacag cattatgaat atccagccac gttcggttct 300 gggaccaagc tggagatcaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 taccctgaaa gagtctggcc ctgggatatt gcagccctcc cagaccctca 400 gtctgacttg ttctttctct gggttttcac tgaggacttc tggtatgggt 450 gtaggctgga ttcgtcagcc ttcagggaag ggtctagagt ggctggcaca 500 catttggtgg gatgatgaca agcgctataa tccagccctg aagagccgac 550 tgacaatctc caaggatacc tccagcaacc aggtattcct caaaatcgcc 600 agtgtggaca ctgcagatac tgccacatac tactgtgctc aaataaaccc 650 cgcctggttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtgagctcac 700 tgggaggctg cggcggaggg agccgtacgg tggctgcacc atcggtcttc 750 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt 800 gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg 850 tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag 900 gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa 950 agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg 1000 gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 1044 Secuencia de Aminoácido Codificada 2.4G2 - 3G8 -hKappa (SEC ID NO: 248) : DVQ TQSPSN LAASPGESVS INCKASESIS KYLA YLQKP GKA KLLMYD 50 GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTLTIRSLEP EDFGLYYCQQ HYEYPATFGS 100 GTKLEIKGGG SGGGGQVTLK ESGPGILQPS QTLSLTCSFS GFSLRTSGMG 150 VGWIRQPSGK GLEWLAHIWW DDDKRYNPAL KSRLTISKDT SSNQVFLKIA 200 SVDTADTATY YCAQINPA F AYWGQGTLVT VSSLGGCGGG SRTVAAPSVF 250 IFPPSDEQLK SGTASWCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ 300 DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC 350 Secuencia de Nucleótido 3G8 -2.4G2 -hGl (SEC ID NO: 249) : gacactgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca 50 gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg 100 atagttttat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc 150 ctcatctata ctacatccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag 200 tgccagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg 250 aggaggatac tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaaggaggcg gatccggagg 350 cggaggcgag gtggagctag tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg 400 gaaggtccct gaaactctcg tgtgcagcct caggattcac tttcagtgac 450 tattacatgg cctgggtccg gcaggctcca acgacgggtc tggagtgggt 500 cgcatccatt agttatgatg gtggtgacac tcactatcga gactccgtga 550 agggccgatt tactatttcc agagataatg caaaaagcag cctatacctg 600 caaatggaca gtctgaggtc tgaggacacg gccacttatt actgtgcaac 650 agagactacg ggaataccta caggtgttat ggatgcctgg ggtcaaggag 700 tttcagtcac tgtctcctca ctgggaggct gcggcggagg gagcgcctcc 750 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc 800 tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac 850 cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc 900 ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt 950 gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga 1000 atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct 1050 tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg 1100 gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga 1150 tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 1200 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa 1250 tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg 1300 tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1350 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat 1400 ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc 1450 catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1500 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca 1550 gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct 1600 ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1650 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta 1700 cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa 1734 Secuencia de Aminoácido Codificada3G8-2.4G2-hGl (SEC ID NO: 250) : DTVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD FDGDSFM WY QQKPGQPPKL 50 LIYTTSNLES GIPARFSASG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YCQQSNEDPY 100 TFGGGTKLEI KGGGSGGGGE VELVESGGGL VQPGRSLKLS CAASGFTFSD 150 YYMAWVRQAP TTGLEWVASI SYDGGDTHYR DSVKGRFTIS RDNAKSSLYL 200 QMDSLRSEDT ATYYCATETT GIPTGVMDA GQGVSVTVSS LGGCGGGSAS 250 TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVS N SGALTSGVHT 300 FPAVLQSSGL YSLSSWTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS 350 CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE 400 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY 450 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV 500 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ 550 GNVFSCSV H EALHNHYTQK SLSLSPGK 578 Las preparaciones de moléculas DART de tipo Ig que tienen las secuencias anteriores se obtuvieron de diferentes aislados de plásmido y se denominaron "Ig DART 1" e "Ig DART 2". La habilidad de estas especies DART de tipo Ig para unir mCD32-hCD16A en un ELISA se comparó con la del dominio solo, un DART que tiene un solo sitio de unión CD32 y CD16A ("DART"), y mAb anti-ch-mCD32 de control (Figura 34). El DART de tipo Ig de la presente invención se encontró que tiene mucho mayor afinidad de unión a antígeno que cualquier DART o anticuerpo de control.

DISEÑO Y CARACTERIZACION DE LOS DIACUERPOS ESPECIFICOS CD32B-CD79-1 y CD32B-CD79-2 Los genes que codifican CD79VL-CD32BVH (Secuencia 1) , CD32BVL-CD79VH-1 (Secuencia 2) , y CD32BVL-CD79VH-2 (Secuencia 3) se clonaron en el vector de expresión pEE13 que resulta en los constructos de expresión 1, 2, y 3, respectivamente. El plásmido de expresión del constructo 1 se co-transfectó junto con cualquier plásmido de expresión 2 o 3 en células HEK-293 para formar los diacuerpos CD32B-CD79-1 y CD32B-CD79-2 específicos, respectivamente. El medio acondicionado se cosechó cada tres días, tres veces. El medio acondicionado después se purificó utilizando la columna de afinidad CD32B.

El ELISA se condujo como sigue: Se recubrió una placa Maxisorp de 96 cavidades con 50 µ?/cavidad de 2 ug/ml de CD32B-Fc en regulador de pH de Carbonato a 4°C durante la noche. La placa se lavó tres veces con PBS-T (PBS, 0.1% de Tween 20) y después se bloqueó mediante 0.5% de BSA en PBS-T por 30 minutos a temperatura ambiente antes de agregar la proteína de fusión Fe de cadena individual de prueba, el diacuerpo biespecífico CD32B-CD79-1 o CD32B-CD79-2 se diluyó en una serie de diluciones dobles partiendo de 2 g/ml. Se mezclaron 25 µ?/cavidad de diacuerpo biespecífico diluido con 25 µ?/cavidad de 50 ng/ml del anticuerpo anti-CD32B y se agregaron a una placa ELISA. La placa se incubó a temperatura ambiente por 1 hora. Después del lavado con PBS-T tres veces, se agregaron 50 µ?/cavidad de una dilución de 1:10,000 de F(ab' )2 humano anti-IgG de cabra de F(ab' )2 conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch) a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente por 1 hora. La placa se lavó con PBS-T tres veces y se desarrolló con 80 µ?/cavidad de sustrato TMB . Después de 5 minutos de incubación, la reacción se detuvo a través de 40 µ?/cavidad de 1% de H2S04. La DO450 nm se leyó utilizando un lector de placas de 96 cavidades y el software SOFTmax. La lectura se gráfico utilizando el software GraphPadPrism 3.03. El experimento reveló que los diacuerpos específicos CD32B-CD79-1 y CD32B-CD79-2 fueron capaces de inmunoespecíficamente unir CD32-FC con una afinidad equivalente a la del anticuerpo de control anti-CD32B. El La secuencia de nucleótido y la secuencia de aminoácido codificada de los constructos antes mencionados son provistas a continuación: Secuencia 1 - Secuencia de nucleótido CD79VL-CD32BVH (SEC ID NO: 251) : gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50 gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100 gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150 cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200 cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250 aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450 gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500 ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550 agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600 gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650 ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700 tctcctcgct gggaggctgc 720 Secuencia 2 - Secuencia de aminoácido CD79VL-CD32BVH (SEC ID NO: 252) : DWMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100 LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150 DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200 LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC 240 Secuencia 3 - Secuencia de nucleótido CD32BVL- CD79VH-1 (SEC ID NO: 253) : gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50 tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250 caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400 aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450 tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacagagtca 550 ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600 ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650 ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696 Secuencia 4 - secuencia de aminoácido CD32BVL- CD79VH-1 (SEC ID NO: 254) : DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100 GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150 WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQMFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200 LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC 232 Secuencia 5 - Secuencia de nucleótido CD32BVL- CD79VH-2 (SEC ID NO: 255) : gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50 tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250 caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400 aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450 tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca 550 ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600 ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650 ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696 Secuencia 6 - secuencia de aminoácido CD32BVL- CD79VH-2 (SEC ID NO: 256) : DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50 ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100 GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150 WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200 LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC 232 CONSTRUCCION Y OPTIMIZACION DE DIACUERPOS FUNCIONALES H8B5-HBCRC Se construyó un diacuerpo que contiene regiones variables capaces de unir el complejo del receptor CD32 y de célula B ("BCRC" ) .

Clonación. Los constructos se construyeron utilizando el PCR/sobre traslape PCR estándar: h8B5VL-G3SG4-hBCRCVH M48I-LGGC: Un VL 8B5 completamente humanizado (que reconoce CD32) se amplificó utilizando lgh321F y lgh788R como iniciadores. hBCRCVH M48I se amplificó Utilizando lgh784F y lgh386R como iniciadores. Los productos PCR se purificaron en gel y se mezclaron y amplificaron utilizando lgh321F y lgh386R. El traslape del fragmento PCR después de recubrió en pEE6 en el sitio Xbal-EcoRI. "G3SG4" es un enlazador que tiene la secuencia: GGGSGGGG (SEC ID NO: 10) . hBCRCVL R45N-G3SG4-h8B5VH -LGGC El hBCRCVL R45N se amplificó utilizando lgh321F y lgh785R como iniciadores. El h8B5VH se amplificó utilizando lgh787F y lgh786R como iniciadores. Los productos PCR se purificaron en gel y mezclaron y amplificaron utilizando lgh321F y lgh786R. El traslape del fragmento PCR después se clonó en pEE13 en el sitio Xbal-EcoRI.

Construcción de vector individual. El pEE hHBCRCVL R45N-h8B5VH se digirió en los sitios Bgl H-Sal I y un fragmento de 3.3kb se purificó e insertó en pEE13 hHBCRCVL 45N-h8B5VH en los sitios BamHI-Sall. El Bgl II y BamH comparten los extremos cohesivos compatibles. La secuencia de DART y los iniciadores utilizados para la construcción de DART se describen a continuación: Secuencia de nucleótido hHBCRCVL . R45N-h8B5VH-LGGC (SEC ID NO: 257) : gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50 gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100 gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150 cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200 cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250 aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450 gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500 ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550 agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600 gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650 ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700 tctcctcgct gggaggctgc 720 Secuencia de aminoácido hHBCRCVL. R45N-h8B5VH-LGGC (SEC ID NO: 258) : DW TQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50 RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100 LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150 DAWMDWVRQA PGKGLE VAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAK S 200 LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC 240 Secuencia de nucleótido H8B5VL-hHBCRCVH M48I-LGGC (SEC ID NO: 259) : gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50 tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250 caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400 aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450 tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacagagtca 550 ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600 ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650 ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696 Secuencia de aminoácido H8B5VL-HBCRCVH M48I-LGGC (SEC ID NO: 260) : DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50 ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100 GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150 WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQMFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200 LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC 232 Iniciador Lgh321F (SEC ID NO: 261) : cgagctagct ctagatgaga tcacagttct ctctac 36 Lgh386R Iniciador (SEC ID NO: 262) : tttgaattct agcagcctcc cagtgaggag acggtgaccg tggtc 45 Lgh784F Iniciador (SEC ID NO: 263) : ggcggatccg gaggcggagg ccaggttcag ctggtgcag 39 Lgh785R Iniciador (SEC ID NO: 264) : cctccggatc cgcctccttt gatctcaagc ttggtccc 38 Lgh786R Iniciador (SEC ID NO: 265) : tttgaattct agcagcctcc caggctggag acggtcacca gg 42 Lgh787F Iniciador (SEC ID NO: 266) : ggaggcggat ccggaggcgg aggcgaagtg cagcttgtgg agtc 44 El Hu3G8VL plásmido de expresión l-G3SG4-Hu2B6VH 4-LGGC se co-transfectó junto con Hu2B6VL 5-G3SG4- Hu3G8VH 5-LGGC en células HEK-293 para formar el diacuerpo bioespecífico Hu2B6 4.5-Hu3G8 5.1 que reconoce CD32 y CD79. Al mismo tiempo, Hu2B6VL 5 -G3SG4 -Hu2B6VH 4 -LGGC y Hu3G8VL 1-G3SG4-Hu3G8VH 5 -LGGC se transfectaron individualmente en células HEK-293 para formar el diacuerpo Hu2B6 4.5 y Hu3G8 5.1. Después de tres días en cultivo, el medio acondicionado se cosechó y caracterizó mediante ELISA de unión. El resultado de este experimento se describe en la Figura 36.

Diseño Experimental: Se recubrió una placa Maxicorp de 96 cavidades en regulador de pH de Carbonato a 40°C durante la noche con 100 ng/cavidad de FcRIIb-G2 -Agly soluble. La placa se lavó tres veces con PBS/0.1% de Tween20 y después se bloqueó mediante 0.5% de BSA en PBS/0.1% de Tween 20 por 30 mins a temperatura ambiente antes de agregar los diacuerpos. Se agregó una serie de dilución doble de medio acondicionado del diacuerpo bioespecífico Hu2B6 4.5-Hu3G8 5.1, el diacuerpo Hu2B6 4.5, y diacuerpo hu3G8 5.1 partiendo de 25 ng/cavidad a cada cavidad. La placa se incubó a temperatura ambiente por 1 hora. Después de lavar con PBS/0.1% de Tween20 tres veces, se agregaron 10 ng/cavidad de FcRIIIa-G2-Biotina a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente por 1 hora. Después de lavar con PBS/0.1% de Tween20 tres veces, se utilizó una dilución de 1:5000 de 50 ul de Estreptavidina conjugada con HRP (Amersham Pharmacia Biotech) para la detección. Después de 45 minutos de incubación a temperatura ambiente, la placa se lavó con PBS/0.1% de Tween20 tres veces y se desarrolló utilizando sustrato TMB . Después de 10 minutos de incubación, la reacción se detuvo a través de 1% de H2S04. La DO450 nm se leyó mediante el programa SOFTmax. La lectura se gráfico utilizando el software GraphPadPrism 3.03.

CONSTRUCCION DE DIACUERPOS IgDART Los diacuerpos IgDART se construyeron conteniendo regiones variables capaces de unirse al complejo del receptor CD32 y célula B ("BCRC"). El primer diacuerpo utilizó un enlazador LGGCGGGS (SEC ID NO: 267) entre las secuencias VH y las secuencias Fe de la molécula. El segundo diacuerpo utilizó cualquier enlazador LEIK que tiene la secuencia: LEIK (SEC ID NO: 268) o un enlazador TVSS que tiene la secuencia TVSS (SEC ID NO: 269) . Las secuencias de las cadenas de estos diacuerpos y los polinucleótidos codificados se muestran a continuación : H8B5VL-hBCRCVH 48I, M62K_LGGCG3S_hKap a (SEC ID NO: 270) : DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50 ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100 GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150 WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200 LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GCGGGSRTVA APSVFIFPPS 250 DEQLKSGTAS WCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS 300 TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC 343 Las secuencias H8B5VL se fusionaron a las secuencias hBCRCVH por medio del enlazador GGGSGGGG (SEC ID NO: 10) localizado en la posición 108-115. Las secuencias hBCRCVH se fusionaron a las secuencias Fe a través del enlazador LGGCGGGS (SEC ID NO: 267) localizado en la posición 229-236 (ambos mostrados subrayados a continuación) . El polinucleótido que codifica la secuencia H8B5VL-hBCRCVH M48I, M62K_LGGCG3S_hKappa es : (SEC ID NO: 271) : gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50 tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250 caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400 aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450 tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca 550 ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600 ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650 ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgcggcg 700 gagggagccg aactgtggct gcaccatcgg tcttcatctt cccgccatct 750 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa 800 cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc 850 aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 900 acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa 1000 acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg 1050 tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 1082 en donde la secuencias que codifican los enlazadores: GGGSGGGG (SEC ID NO: 10) y LGGCGGGS (SEC ID NO: 267) se localizan en la posición 322-345 y 685-708, respectivamente (ambas mostradas subrayadas anteriormente) .

HBCRCVL R45N-h8B5VH_LGGCGGGS-hG1 (SEC ID NO: 272) : DWMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50 RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100 LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150 DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200 LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC GGGSASTKGP 250 SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV 300 LQSSGLYSLS SWTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK RVEPKSCDKT 350 HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW VDVSHEDPEV 400 KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV 450 SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY 500 PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF 550 SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK 574 Las secuencias hBCRCVL se fusionaron a las secuencias H8B5VH a través del enlazador GGGSGGGG (SEC ID NO: 10) localizado en la posición 113-120. Las secuencias H8B5VH se fusionaron a las secuencias Fe a través del enlazador LGGCGGGS (SEC ID NO: 267) localizado en la posición 237-244 (ambos mostradas subrayados anteriormente) . El polinucleótido que codifica la secuencia HBCRCVL R45N- h8B5VH_LGGCGGGS-hGl es : (SEC ID NO: 273) : gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50 gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100 gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150 cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200 cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250 aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 ctggaggatc cctgagactc tcttgtgccg cctctggatt cacttttagt 450 gacgcctgga tggactgggt ccgtcaggcc ccaggcaagg ggcttgagtg 500 ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550 agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgacgc caaaaacagt 600 ctgtacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg ccgtgtatta 650 ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc ctggtgaccg 700 tctccagcct gggaggctgc ggcggaggga gcgcctccac caagggccca 750 tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc 800 ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt 850 cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 900 ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgcectc 950 cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca 1000 gcaacaccaa ggtggacaag agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 1050 cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt 1100 cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc 1150 ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 1200 aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa 1250 gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca 1300 ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1350 tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa 1400 agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg 1450 agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1500 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa 1550 ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct 1600 acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1650 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag 1700 cctctccctg tctccgggta aa 1722 en donde la secuencias que codifican los enlazadores : GGGSGGGG (SEC ID NO: 10) y LGGCGGGS (SEC ID NO: 267) se localizan en la posición 337- 360 y 709 -732, respectivamente (ambas mostrados subrayados anteriormente) .

H8B5VL-HBCRCVH 48I, M62K_ ( -4 ) LEIK_hKappa (SEC ID NO: 274) : DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50 ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100 GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150 WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200 LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVLEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT 250 ASWCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL 300 TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC 335 Las secuencias H8B5VL se fusionaron a las secuencias HBCRCVH a través del enlazador GGGSGGGG (SEC ID NO: 10) localizado en la posición 108-115. Las secuencias HBCRCVH se fusionaron a las secuencias Fe a través del enlazador LEIK (SEC ID NO: 268) localizado en la posición 225-228 (ambas mostrados subrayadas anteriormente) . El polinucleótido que codifica la secuencia H8B5VL-HBCRCVH M48I, M62K_ ( -4 ) LEIK_hKappa es: (SEC ID NO: 275) : gacatecaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50 tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250 caaectatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400 aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccageta ctggatgaac 450 tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca 550 ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600 ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650 ctgggggcaa gggaccacgg tcc ggagat caagcgaact gtggctgcac 700 catcggtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 750 gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt 800 acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg 850 tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 900 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt 950 cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag 1000 agtgt 1005 en donde la secuencias que codifican los enlazadores: GGGSGGGG (SEC ID NO: 10) y LEIK (SEC ID NO: 268) se localizan en la posición 322-345 y 673-684, respectivamente (ambas mostradas subrayadas anteriormente) .

HBCRCVL R45N-h8B5VH_(-4) TVSS-hGl = HBCRCVL R45N-h8B5VH_-hGl (SEC ID NO: 276) : DWMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50 RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYC QGTHFP 100 LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150 DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200 LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSASTK GPSVFPLAPS 250 SKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVS NSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS 300 LSSWTVPSS SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKRVEPKSCD KTHTCPPCPA 350 PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VWDVSHEDP EVKFNWYVDG 400 VEVHNAKTKP REEQYNSTYR WSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP 450 IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW 500 ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA 550 LHNHYTQKSL SLSPGK 566 Las secuencias HBCRCVL se fusionaron a las secuencias h8B5VH a través del enlazador GGGSGGGG (SEC ID NO: 10) localizado en la posición 113-120. Las secuencias h8B5VH se fusionaron a las secuencias Fe a través del enlazador TVSS (SEC ID NO: 269) localizado en la posición 233-236 (ambas mostradas subrayadas anteriormente) . El polinucleótido que codifica HBCRCVL R45N- h8B5VH_ ( -4 ) TVSS-hGl es: (SEC ID NO: 277) : gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50 gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagectetta gatagtgatg 100 gaaagacata tttgaattgg ttteageaga ggccaggcca atctccaaac 150 cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200 cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250 aggctgagga tgttggggtt tattactget ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 ctggaggatc cctgagactc tcttgtgccg cctctggatt cacttttagt 450 gacgcctgga tggactgggt ccgtcaggcc ccaggcaagg ggcttgagtg 500 ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa teatgeaaca tactatgetg 550 agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgaege caaaaacagt 600 ctgtacctgc aaatgaacag ettaagaget gaagacactg ccgtgtatta 650 ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc ctggtgaccg 700 tctccagcgc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 750 tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga 800 ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca 850 gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 900 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta 950 catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag 1000 ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 1050 cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa 1100 ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg 1150 acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 1200 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag 1250 cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga 1300 atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1350 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt 1400 gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc 1450 tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1500 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct 1550 ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga 1600 gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1650 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 1698 en donde las secuencias que codifican los enlazadores: GGGSGGGG (SEC ID NO : 10) y TVSS (SEC ID NO: 269)i se localizado en la posición 337-360 y 697-708, respectivamente (ambas mostradas subrayadas anteriormente) .

OPTIMIZACION DE ENLAZADORES Como se explicó anteriormente, los diacuerpos IgDART de la presente invención preferiblemente contienen enlazadores entre las secuencias VH y las secuencias Fe de la molécula. Los experimentos se condujeron para optimizar los enlazadores con el fin de maximizar el rendimiento y la actividad. Se utilizaron los siguientes enlazadores.

Los enlazadores anteriores se introdujeron en plásmidos con el fin de hacer un grupo de Diacuerpos IgDART Diabodies que tienen diferentes combinaciones de enlazadores: Se determinaron las propiedades de agregación de los IgDARTS producidos.

Los datos inesperadamente mostraron que los constructos que tienen enlazadores, tales como los utilizados en 901A/901B; 903A/903B; y 908A/908B dieron resultados dramáticamente superiores (menos oligomerización y/o menos producción de fragmento) que los constructos que tienen enlazadores, tales como 910A/911B.

DARTS E-ESPIRAL / K-ESPIRAL Como se apreciará en vista de lo anterior, los polipéptidos individuales de un DART biespecífico pueden formar dos especies de homodímeros y una especie de heterodímero . En una modalidad de la presente invención, se puede agregar un polipéptido cargado al C-terminal de uno, o más preferiblemente, ambos polipéptidos DART. Al seleccionar polipéptidos cargados de carga opuesta para los polipéptidos individuales del DART biespecífico, la inclusión de tales polipéptidos cargados favorece la formación de heterodímeros y disminuye la formación de homodímeros. Preferiblemente, un polipéptido positivamente cargado contendrá un contenido sustancial de arginina, glutamina, histidina y/o lisina (o mezclas de tales aminoácidos) y un polipéptido negativamente cargado contendrá un contenido sustancial de aspartato glutamato (o una mezcla de tales aminoácidos) . Los polipéptidos positivamente cargados conteniendo un contenido sustancial de lisina y los polipéptidos negativamente cargados conteniendo un contenido sustancial de glutamato son particularmente preferidos. Con el fin de maximizar la atracción electrostática entre tales polipéptidos opuestamente cargados, se prefiere utilizar polipéptidos capaces de espontáneamente asumir una conformación helicoidal .

De esta forma, en una modalidad preferida, un "E-espiral" , positivamente cargado se acoplará a uno de los polipéptidos que se están utilizando para formar un DART específico y un "K-espiral" negativamente cargado se acoplará al segundo de los polipéptidos DART (Figura 37) .

Un E-espiral particularmente preferido tendrá la secuencia: (EVAALEK) 4 : SEC ID NO: 299 EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK Un K-espiral particularmente preferido tendrá la secuencia: (KVAALKE) : SEC ID NO: 300 KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE Un polipéptido DART preferido que posee un E-espiral tendrá la secuencia general: [Dominio VL]— [GGGSGGGG] -[Dominio VH]— [ (EVAALEK) 4] - GGGNS, en donde VL es el dominio Ig ligero variable de DART, GGGSGGGG es SEC ID NO: 10, VH es el dominio Ig pesado variable de DART, (EVAALEK) 4 es SEC ID NO: 299, y GGGNS es SEC ID NO: 301. Un polipéptido DART preferido que posee tal K-espiral tendrá la secuencia general : [Dominio VL] — [GGGSGGGG] — [Dominio VH] — [(KVAALKE) 4] - GGGNS, en donde VL es el dominio Ig ligero variable de DART, GGGSGGGG es SEC ID NO: 10, VH es el dominio Ig pesado variable de DART, (KVAALKE) 4 es SEC ID NO: 300, y GGGNS es SEC ID NO: 301.

DARTS QUE CONTIENEN FC E-ESPIRAL / K-ESPIRAL En una modalidad más, las regiones Fe pueden estar enlazadas a los espirales E y/o K de los DART E-espiral o K-coli .

Además de la separación entre las regiones Fe y el dominio VH DART de un DART que contiene Fe es deseable en algunos casos en donde una configuración menos separada de tales dominios da como resultado la interacción disminuida entre tales dominios y sus ligandos de unión o por el contrario interfieren con el ensamble DART. Aunque los separadores de cualquier secuencia de aminoácido pueden utilizarse, se prefiere utilizar separadores que formen espirales de hélice a, para así extender y proyectar a un máximo el dominio Fe lejos de los dominios variables (Figura 37) . Debido a que los polipéptidos de espiral antes descritos de cargas opuestas adicionalmente funcionan para promover la formación del heterodímero, tales moléculas son separadores particularmente preferidos. Tales moléculas Fc-DART que contienen espirales proveen beneficios similares a los de los Fe-DARTS, que incluyen vida media en suero mejorada y reclutamiento de la célula efectora. Los polipéptidos E-espiral y K-espiral antes descritos son particularmente preferidos para este propósito.

De esta forma, en una modalidad preferida, el DART que contiene el Fe E-espiral tendrá la secuencia general: [Dominio VL] - [GGGSGGGG] - [Dominio VH] - [ (EVAALEK) 4] - GGG — dominio Fe partiendo con D234 (numeración Kabat) , en donde VL es el dominio Ig ligero variable de DART, GGGSGGGG es SEC ID NO: 10, VH es el dominio Ig pesado variable de DART y (EVAALEK) 4 es SEC ID NO: 299.

Similarmente , en una modalidad preferida, el DART que contiene Fe K-espiral tendrá la secuencia general: [Dominio VL] - [GGGSGGGG] - [Dominio VH] - [ (KVAALKE) 4] - GGG — dominio Fe partiendo con D234 (numeración Kabat) , en donde VL es el dominio Ig ligero variable de DART, GGGSGGGG es SEC ID NO: 10, VH es el dominio Ig pesado variable de DART y (KVAALKE) 4 es SEC ID NO: 300.

Como se indica anteriormente, una molécula DART que contiene espiral o una molécula DART que contiene Fe que contiene espiral puede contener solamente uno solo de tales separadores de espiral, o puede contener más de uno de tales separadores (por ejemplo, dos separadores, preferiblemente de carga opuesta, de los cuales uno está enlazado a uno de los dominios VH de los polipéptidos DART) . Al enlazar la región Fe a tal molécula(s) separadora (s) , la habilidad para fabricar versiones bivalentes, tetravalentes, etc. de moléculas Fc-DART mediante el intercambio de cadena se mejora (Figura 39) . Como se muestra en la Figura 39, las moléculas Fc-DART pueden producirse de tal forma que forman monómeros o dímeros dependiendo de si el dominio Fe está enlazado a uno ambos dominios VH DART.

ACTIVIDAD FUNCIONAL DE DART QUE CONTIENEN FC E-ESPIRAL / K-ESPIRAL Las especies Fc-DART E-espiral y/o K-espiral se produjeron de moléculas DART bi-específicas que tienen: (1) las regiones ligera y pesada variables de CD79b (complejo BCR) -anticuerpo reactivo, CB3 y (2) las regiones ligera y pesada variables de una variante de baja afinidad (denominada Variante "YA") del CD32B-anticuerpo reactivo, 2B6. Esta región variable de cadena ligera de este anticuerpo difiere de la del anticuerpo 2B6 en el contenido de mutaciones: N50Y y V51A. De esta forma, el anticuerpo YA2B6 tiene una secuencia de región variable de cadena ligera: EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRTSQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLIKYASE SISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSNT PFTFGGGTKVEI K (SEC ID NO: 302) .

La región de la secuencia de la cadena pesada variable de este anticuerpo es: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWIHWVRQAPGQGLEWMGVIDP SDTYPNYNKKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR GDSDYYS GMDYWGQGTTVTVSS (SEC ID NO: 303) ; o El anticuerpo de baja afinidad se selecciona ya que preferiblemente unirá CD32B en cis en células que expresan CD79b (Células B) . Es decir, la configuración disminuirá la interacción con otras células que expresan CD32B (monocitos, células endoteliales, hígado) así como la interacción trans indeseable .

Los derivados E-espiral y/o K-espiral y los derivados que contienen F E-espiral y/o K-espiral de tales DART h2B6YAhCB3 se elaboraron. Se utilizó cromatografía de exclusión de tamaño para analizar el tamaño aproximado y la heterogeneidad de las moléculas producidas. Como se muestra en la Figura 40, los dímeros se formaron de los DART E-espiral / K-espiral que tienen una sola región Fe enlazada, enlazada a un dominio K-espiral así como a DARTS E-espiral / K-espiral que tienen una sola región Fe enlazada, enlazada a un dominio E-espiral. El monómero deseado, así como las moléculas de dimero se recuperaron de preparaciones en donde las regiones Fe se enlazaron a ambos espirales E y K de la misma molécula DART, con el monómero que es la mayoría del producto formado. La Figura 41 muestra la estructura posible de las moléculas de dimero producidas.

Las fracciones de la cromatografía de exclusión de tamaño se analizaron utilizando electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida para además analizar las estructuras de las moléculas producidas (Figura 42) . Los derivados de DART E-espiral / K-espiral (no región Fe) migraron como dos bandas predominantes, cada una de aproximadamente 28 kD (correspondiente al polipéptido que contiene KFc y al polipéptido que contiene EFc ligeramente menor) y a la banda menos prominente a aproximadamente 49 kD (correspondiente a el DART E-espiral / K-espiral) . Las fracciones de monómero de los derivados DART que contienen Fe E-espiral / K-espiral (EFc/K o E/KFc) de la cromatografía de exclusión de tamaño mostraron solamente ya sea una banda de peso molecular más grande o más pequeña a aproximadamente 28 kD (correspondiente a si el DART fue el DART que contiene KFc (banda con peso molecular más grande) o el DART que contiene EFc (banda con peso molecular más pequeño) . El material predominante migró a aproximadamente 49 kD (correspondiente al DART E-espiral / K-espiral) . Las bandas de pesos moleculares significativamente más altos también se observaron.

Se realizó un ELISA de unión biespecífico para caracterizar las moléculas producidas. Se colocó CD79 en una placa ELISA. Los DART después se unieron a la placa. La unión de DART detectó utilizando sCD32B-biotina seguido por incubación con estreptavidina-HRP . Como se muestra en la Figura 43, los derivados DART h2B6YAhCB3 conteniendo Fe E-espiral / K-espiral es (EFc/K o E/KFc) mostraron una mejora significativa de unión con relación a DART h2B6YAhCB3, o a un derivado DART EFc/KFc h2B6YAhCB3.

El entrelazamiento de anticuerpos que se unieron a CD79b conduce a la activación de la célula B (Van Kooten, C. et al. (1997) "Cross-Linking Of Antigen Receptor Via Ig-B (B29, CD79b) Can Induce Both Positive And Negative Signáis In CD40-Activated Human B Cells, " Clin. Exp. Immunol . 110:509-515) . Ya que las moléculas DART h2B6YAhCB3 son capaces de unirse a ambos receptores inhibidores CD79b y CD32B, tienen la habilidad de "reclutar" CD32B en sitios de unión de CD79b, y por lo tanto bloquear la proliferación de la célula B. Para demostrar esta habilidad, los DARTS se incubaron con las células B que habían sido expuestas a anticuerpos capaces de unirse recíprocamente a los anticuerpos anti-CD79b. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 44. Los resultados muestran que los anticuerpos dirigidos solamente contra CD79b o CD32B (Ch2B6N297Q y ChCB3.1N297Q, respectivamente) fallaron en la inhibición de la proliferación de la célula B. Los derivados DART EFc/KFc h2B6YA x hCB3 fueron sustancialmente más efectivos en la inhibición de la proliferación de la célula B, como lo fue el DART h2B6YA x hCB3 DART mismo y los DART h2B6YA X hCB3 VF de control. Los DARTS E-espiral / K-espiral que tiene solamente una región Fe enlazada (derivados DART E/KFc h2B6YA x hCB3 y derivador DART EFc/K h2B6YA x hCB3) se encontró que ejercen una mayor inhibición de la proliferación de la célula B.

MODIFICACIONES DE DART PARA ALTERAR LA VIDA MEDIA EN SUERO IN VIVO Como se explicó anteriormente, las moléculas de anticuerpo recombinante pequeñas de moléculas de cadena individual biespecíficas (por ejemplo, que poseen una masa molecular de aproximadamente 55 kDa) se depuran rápidamente de la circulación. Los estudios farmacocinéticos in vivo de moléculas DART en ratones mostraron la esperada vida media terminal corta de aproximadamente 2 horas .

En algunas modalidades, tales como en el tratamiento de la afección inflamatoria aguda, se desea la vida media corta, sin embargo, en otras modalidades tales como en el tratamiento de cáncer y enfermedades y afecciones crónicas, se prefieren que las moléculas DART de la presente invención exhiban vidas medias más largas.

Con el fin de mejorar las propiedades farmacocinéticas in vivo de las moléculas DART para tales usos, las moléculas DART pueden modificarse para contener una porción de polipéptido de una proteína de unión a suero en uno más de los términos de la molécula DART. Más preferiblemente, tal porción de polipéptido de una proteína de unión a suero se instalará en el C-terminal de la molécula DART. Una porción de polipéptido particularmente preferida de una proteína de unión a suero para este propósito es el dominio de unión a albúmina (ABD) para la proteína G de estreptococo. El dominio 3 de unión a albúmina (ABD3) de la proteína G de cepa G148 de estreptococo es particularmente preferida.

El dominio de unión a albúmina 3 (ABD3) de proteína G de la cepa G148 de estreptococo consiste de 46 residuos de aminoácido que forman un lote de tres hélices estable y tienen una amplia especificidad de unión a albúmina (Johansson, M.U. et al. (2002) " Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules" J. Biol. Chem . 277 ( 10 ) : 8114 - 8120 ) . La albúmina es la proteína más constante en plasma y tiene una vida media de 19 días en humanos. La albúmina posee varios pequeños sitios de unión de molécula que le permiten unirse no covalentemente a otras proteínas y por lo tanto extienden sus vidas medias en suero.

Para demostrar la habilidad de una porción de polipéptido de proteína sérica para extender la vida media de un DART, el dominio ABD3 de proteína G de estreptococo se fusionó a un DART biespecífico recombinante (inmuno-reactivo con los antígenos hCD16 y hCD32B) para generar una molécula de anticuerpo recombinante, ABD-DART hCD16-hCD32B (Figura 45) . Este ABD-DART mostró una unión específica a ambos antígenos así como con albúmina de suero humano (HSA) y fue capaz de redirigir las células efectoras in vitro. Comparado con el DART de control, ABD-DART mostró un fuerte aumento en la vida media en suero en ratones . Este método puede utilizarse como una ruta viable para aumentar la vida media de farmacéuticos potenc ialmente importantes como DART a más de 90 minutos, más de 2 horas, más de 5 horas, más de 10 horas, más de 20 horas, y más preferiblemente, más de 30 horas.

MATERIALES Y MÉTODOS: Diseño y Construcción de DART ABD : El DART ABD hCD16-hCD32B se hizo utilizando como cadena 1: hCD16VL-G3SG4-hCD32BVH-K espiral, [ ( KVAALKE ) 4 ] en donde CD16VL denota 3G8 CD16VL, G3SG4 denota SEC ID NO: 10, hCD32BVH denota 2B6 CD32BVH, y (KVAALKE) 4 denota SEC ID NO: 300; y como cadena 2 : hCD32BVL-G3SG4 -hCD16VH-GGCGGG-E espiral [ ( EVAALEK) 4 ] - GGGNS- ABD en donde CD32BVL denota CD32BVL, G3SG4 denota SEC ID NO: 10, hCD16VH denota CD16VH, GGCGGG es los residuos 2-7 de SEC ID NO: 267, E espiral [ (EVAALEK) 4] es SEC ID NO: 299, GGGNS es SEC ID NO: 301, y ABD es: LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLINNAKT VEGVKALID EILAALP (SEC ID NO: 304) Por consiguiente, la secuencia de cadena 1 (h3G8VLl-G3SG4-h2B6VH4-Kespiral-GGGNS) es: DIVMSQSPDS IAVSLGEE ' TNCK&SQSv/D IfDGDSEMN Y QQ PGQPPKL LIYTTSMLE5 GVPDRFSGSG SG DFTL IS SLQAE. VA.VY YCQQSNEDPY TFGQGTKLEÍ KGGGSGGGGQ VQLVQSGftJBV KKPGASVKVS CKA3GYTF YWIHWVRQR.P GQGLBWIGVX DFSDTYPMYN FKGRV ST VVVSTSTAYH ELRSLRSDDT V'YYC¾RHGD S YYSGMDYVv GQGTTVTVSS GGCGGG V . LKEKVAALKE KV AX E V ALKEGGGSS (SEC ID NO: 304) Un polinucleótido preferido que codifica la cadena (h3G8VLl-G3SG4-h2B6VH4- Kespiral-GGGNS) es : gacatcg ga gacccaatc tcca aetci: ttggc gtgt cr.etagggga gagggc cc ot sao gc aggccagcca aag gttgat ttgatggtg atagttttat gaa tggtac caacagaaac eaggac&gec a ccaaaetc e cat tat.H¿ ct eatecaa tci:a¾*atct ggggtcccag acag t t g cggcagtggg i:ctggg&cag acti:caceet caceatcagc &gect<<ea¾g •'.: g&¾gat.{ ggc&gt ta tactgfccagc ag aa ga agatc g a gttcgga agggg?.¿c &a gcúigag tc aaaggaggog ga ogg gg ggagg cag gttcagctgg f,gcagtctgg agctgaggtg aagaagcc.' g ggcc cagt ¾ aggv.cf.ee g íiaggc t o ggl:tacar.: ct a caac ac!:gga ac a tgggig g acaggee ct ggacaag¾ge u gag gga i.gg¾g ga t gatcet c g atae tat c aaa tacaa aaaaa ttca a ggc g&yt: cac atgacc giag cgta ccacgagcac g c ac ig gagetgagg gcctgagatc tya gacacg gccgtg avt aetgLg gag acggtgat tccgattatt actctgg a ggact&ctg gggcaaggga ccacggt ao cgt cctco ggsggatgtg g ggtggaaa agtggccg a ctgaaggaga aag tgctgc tttg?¿ agsg ¾¾ggi:cg cg cac agga aaaggtcgea gccc gaaag ag¾ cggegg gaattct (SEC ID NO: 306) Por consiguiente, la secuencia de cadena 2 (h2B6VL5-G3SG4-h3G8VH5-Eespiral- GGGNS-ABD) es: HÜVLTQSPDF QSV í? 3KKVT B' CRTSQSIG TWIHWYCiQ P DQSP LLrKE VSESXSGVPG FH'SG-SGSGTD FTLTIMSLEA SDAATYY QQ SNTWPFEÍI'GG GTKVKIKGGG SGGGGQVTLR ESGPALVKPT Q LTLTCTFS GÍTSLSTSGMG VGWIFQPPGK ftLEWIAHIWW DDDXRYHPAL SRLTIS DT S >TQWL *OT M PVDTATY YC Q?í¿PA íf AY GQGTLV? 78SGGCGGGE VAALH! !VAA LEKHIVAALHIK EVAALEKGGG SLASA VLA M ELDKYGV8 DYYKNL? NA VEGVKALI 0E1LARLP (SEC ?) NO: 307) Un polinucleótido preferido que codifica la cadena (h2B6VL5-G3SG4-h3G8VH5- Espiral -GGGNS-ABD) es: gaaaitgr.gc gae cagtc t cagaettt ?_g ctgtya cte aaag a gaaag aec t cacctgea ggaccagl:ca ga eattgg acsaa ac a tg taoca gcagaaa c gatcagtcüc caaagetcct catcaaggag gtt ctgagt ctas:ctctg¾ agcc c cg a¾gttcagt.g gcagtgg&t.c gggacaga !xaecc ca ceatcaa a eotggaagct gaagatgct caa gtatta r.gtcaa :¡a agtaa!:aco gg cg tcac g tcgg gga gggac a gg ggaga oaa ag aggcgga tcoggcggcg gaggecagg tae ctgaga gagxc ggec etgog tggt. gaagecea a c&gacccica cacfcgacttg tacettetoi jggttttc¾c -cgagc cutc tggtatgggt gtaggctgga tcgtc g tcecggga&g c c agag ggct gcaca cat t.ggr.gg gatgatgaoa agc ctat.aa f.ccag cctg aagagcegae tg aa e caaggatacc eeaaaaaee aggt.agt.cet eacsatg c aaoatgga e ctgt oat c tgcc&ca ac tac gügcr.c aataaa co cgcc gg fct got a tggg gc aagggac ttggteact gtgagc q gagga.g ¾g ggtggagaa g ggcegoac .ggaga aga ggtf.g g t ttgga aagq ag íicget'je ací: gaaaag gaggteg ag ccctggagaa aggcgg ggg aatte c gg ecgaagc aa agx:g tgg c aaeegcgaae tggataaata tggcgi:gage ga tatt l:a agaacet ja taacaa gea aagaccgtg aagg gi-.gaa ageac.gat.i: gatgaaatte tgg ogc e geet (SEC ID NO: 308) Cada segmento VL y VH segmento se amplificó por PCR utilizando DART hCD 16-hCD32B como plantilla. Para la cadena 2, la secuencias de nucleótido conteniendo E espiral y ABD se formaron a través del dímero iniciador y después se subclonaron en el extremo C-terminal de la región VH de hCD16 utilizando digestión y ligación de restricción. Ambas cadenas se clonaron en el vector pCIneo (Promega, inc . ) a en los sitios Nhel-NotlI. Los plásmidos individual que contienen la cadena respectiva digerida en NgoMIV-Nhel y los casetes de expresión de la cadena 2 digerida en BstBI-Pmel se clonaron en un solo plásmido para la transfección en células CHO para generar líneas de células estables.

Expresión y Purificación de Proteína . Para la estable transfección, las células CHO-S se transíectaron con ADN de plásmido ABD-DART hCD16-hCD32B EK. La proteína ABD-DART se purificó por cromatografía de afinidad utilizando la versión soluble del antígeno FcRIIB acoplado a Sepharose 4B activada con CNBr. La proteína concentrada además se purificó por cromatografía de exclusión de tamaño utilizando Superdex 200HR 10/30.

Ensayo de unión por ELISA: Para la captura a base de CD- 16, las placas se cubrieron con el antígeno FcRIIB a una concentración de 2 ug/ml a 4°C durante la noche. Las placas después se bloquearon con 0.5% de Peptona en PBS-T.

Las proteínas purificadas diluidas en una dilución serial doble se unieron en la placa por 1 h a temperatura ambiente. Finalmente, se realizó la detección utilizando CD32B biotinilado (50 ng/ml) seguido por Estreptavidina conjugada con HRP (1/1000, BD-Pharm) . La actividad de HRP se midió por la adición TMB y la placa se leyó en un lector de placas a DO 450 nm.

Para la captura de la albúmina de suero humana (HSA) , las placas se cubrieron con HSA a una concentración de 2ug/m a 4°C durante la noche. Después de esto se siguieron los mismos procedimientos para llevar a cabo ELISA de afinidad doble.

Ensayo ADCC mediado por célula mononuclear de sangre periférica: La citotoxicidad se midió mediante el ensayo de liberación LDH. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se purificaron de sangre humana entera (Lonza Walkersville, Inc, Gaithersburg, MD) por centrifugación por gradiente densidad Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se plaquearon 2 x 104 células T objetivo en una cavidad de una placa de cultivo tisular de 96 cavidades de fondo redondo. Se agregaron de una a cuatro diluciones seriales de diferentes moléculas DART o de anticuerpo a las células en la placa. Después de esto, se agregaron 6 x 105 PBMC a las mismas cavidades. La placa después se incubó durante la noche a 37°C y 5% de incubador C02. La placa después se centrifugó a 1200 rpm por 5 minutos, 50 µ? de sobrenadante se transfirieron a una placa ELISA de fondo plano. Se agregaron 50 µ? de solución de sustrato LDH (Promega) a cada cavidad, y la placa se incubó por 30 rain en la oscuridad a temperatura ambiente. Después se agregaron 50 µ? de solución detención a cada cavidad, y la placa se leyó a 490 nm dentro de una hora. El porcentaje de citotoxicidad de cada cavidad se calculó con la lectura de la D.O. bruta como (Muestra - AICC) / (Máx Objetivo - Objetivo Espontáneo) x 100 en donde AICC es la citotoxicidad celular independiente del anticuerpo. La curva de dosis-respuesta se generó utilizando el software Prism.

Estudio farmacocinético: Se inyectaron ratonesC57Bl/6 con una sola inyección intravenosa de DART hCD16-hCD32B a 5 mg/kg. El suero del ratón se recolectó a una Pre-dosis, 2, 30 min; 1, 3, 6, 24 y 72 h. La concentración del DART hCD16-hCD32B en suero se cuantificó. Los cálculos farmacocinéticos de DART hCD16-hCD32B se realizaron por medio del paquete de software de farmacocinético inNonlin Professional 5.1 (Pharsight Corporation, USA). Los parámetros se determinaron mediante análisis no por compartimientos (NCA) . El análisis no de compartimientos se basó en un modelo (Modelo 201) requiriendo una inyección intravenosa del fármaco. El método trapezoidal linear se utilizó para el cálculo del parámetro.

RESULTADOS Estudio de expresión y unión por ELISA: El ABD-DART CD16-hCD32B se expresó eficientemente a una concentración de 6.5 mg por litro en células CHO-S de mamífero. La actividad de unión de la proteína ABD-DART purificada para los antígenos respectivos se evaluó por ELISA. Los resultados muestran que ABD-DART hCD16-hCD32B se une simultáneamente a ambos antígenos, CD16 así como con CD32B (Figura 46A) . El perfil de unión coincides con la unión de la proteína DART de control hCD16 -hCD32B . La afinidad de ABD-DART hCD16-hCD32B purificado a albúmina de suero humano (HSA) también se demostró por ELISA (Figura 46B) . El resultado mostró la unión de DART de fusión ABD a HSA, mientras no se observó ninguna unión al DART de control hCD16-hCD32B DART.

Citotoxicidad in vi tro de ABD-DART: Con el fin demostrar la unión simultánea de este ABD-DART biespecífico a dos antígenos, uno en la célula efectora y uno en la célula T objetivo, se realizó el ensayo de aniquilación de célula redireccionado . Utilizando PBMC humano como células efectoras, ABD-DART hCD16-hCD32B indujo una potente citotoxicidad dependiente de la dosis contra las líneas de células B positivas CD32B Daudi (Figura 47) . El resultado mostró que la potencia de ABD-DART fue equivalente a la de DART progenitor.

Propiedades farmacocineticas de ABD-DART: Las propiedades farmacocinéticas de ABD-DART hCD16-hCD32B se analizaron por ELISA de muestras de suero después de una inyección i.v. de una sola dosis en ratones C57B1/6 (Figura 48) . Ambas proteínas, DART y ABD-DART mostraron eliminación bifásica de la circulación. El estudio PK de ABD-DÁRT mostró un tiempo de circulación prolongado, con una vida media terminal aumentada de 35.1 h comparada con 1.2 h para DART regular (Figura 48, Tabla 17) . La mejora de las propiedades farmacocinéticas también se demostró mediante la comparación del área por debajo de la curva (AUC) . Para el constructo ABD-DART el AUC aumentó en un factor de casi 30 después de la fusión a ABD (Tabla 17) .

En resumen, el dominio de unión de albúmina fusionado a la proteína DART (referido como ABD- DART) se diseño y produjo exitosamente. El ABD-DART hCD16-hCD32B se encontró que retiene las especificidades de sus dos determinantes antigénicas reconocidas: CD 16 y CD32B. ABD-DART se encontró que muestra una alta afinidad con albúmina de suero humano. La fusión de ABD no redujo la actividad biológica (es decir, la potencia de DART para redirigir la aniquilación de la célula tumoral) . La fusión de la molécula DART a ABD conduce a una mejora sustancial (aumento) en su vida media in vivo, y se logra el objetivo sin un aumento en tamaño dramático. La habilidad de retener un pequeño tamaño es significativo y ventajoso ya que facilita la habilidad de DART para difundirse en tejidos tumorales.

DART Her2 / RECEPTOR CÉLULA B Se construyó un Diacuerpo IgDART que contuvo regiones variables capaces de unirse a Her2/neu y al receptor de la célula T ( "TCR" ) .

Como se explicó anteriormente, el TCR se expresa nativamente por células T CD4+ o CD8+, y permite que tales células reconozcan péptidos antigénicos que se unen y se presentan por proteína MHC de clase I o clase II de células de presentación de antígeno. El reconocimiento de un complejo pMHC (péptido-MHC) por TCR inicia la propagación de una respuesta inmunitaria celular que conduce a la producción de citocinas y la lisis de la célula presentadora de antígeno. HER2/neu, un miembro importante de la familia ErbB, ha sido extensivamente investigado debido a su papel en varios carcinomas humanos y en el desarrollo en mamíferos. (Hynes y Stern (1994) Biochim. et Biophys . Acta 1198:165-184; y Dougall et al. (1994) Oncogene 9:2109-2123; Lee et al. (1995) Nature 378:394-398). El gen humano HER2/neu y la proteína HER2/neu se describen en Semba et al. (1985) Proc . Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 82:6497-6501 y Yamamoto et al. (1986) Nature 319:230-234, y la secuencia está disponible en GenBank con el número de acceso X03363. HER2/neu comprende cuatro dominios: un dominio extracelular al cual se une el ligando; un dominio de transmembrana Lipófilo; un dominio de tirosina cinasa intracelular conservado; y un dominio de señalización carboxilo-terminal que aloja varios residuos de tirosina que pueden fosforilarse . (Plowman et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:1746-1750). La secuencia del dominio extracelular HER2/neu (ECD) se describe por Franklin et al. (2004) Cáncer Cell. 5 (4 ) : 317 -328 , y está disponible en DataBank de Proteínas Registro 1S78 (2004) .

HER2/neu funciona como un receptor del factor de crecimiento y por lo general se expresa por tumores tales como cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer de célula de vejiga, cáncer ovárico, y cáncer de pulmón. HER2/neu se sobre-expresa en 25-30% de los cánceres de pecho y ovario humanos, y está asociado con un agresivo avance clínico y pobre pronóstico en estos pacientes. (Slamon et al. (1987) Science 235:177-182; Slamon et al. (1989) Science 244:707- 712) . La sobre-expresión de HER2/neu también se ha observado en otros carcinomas que incluyen carcinomas del estómago, endometrio, glándula salival, pulmón, riñon, colon, tiroides, páncreas, y vejiga. (Ver, por ejemplo, King et al. (1985) Science 229:974; McCann et al. (1990) Cáncer 65:88-92; Yonemura et al. (1991) Cáncer Research 51:1034).

Un número de anticuerpos monoclonales e inhibidores de tirosina cinasa de molécula pequeña que activan HER-I o HER2/neu han sido desarrollados, e incluyen, en particular, una variante humanizada de un anticuerpo monoclonal de murino conocido como 4D5 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc.) que reconoce un epítopo extracelular (aminoácidos 529 a 627) en el dominio II rico en cisteína de HER2/neu, que reside muy cerca de la región de transmembrana de la proteína. Los estudios han demostrado que en las células de cáncer de pecho que sobre-expresan HER2/neu el tratamiento con anticuerpos específicos para HER2/neu en combinación con agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, cisplatina, doxorubicina, taxol) provocan una más alta respuesta citotóxica que el tratamiento con quimioterapia sola. (Hancock et al. (1991) Cáncer Res. 51:4575-4580; Arteaga et al. (1994) Cáncer 54:3758-3765; Pietras et al. (1994) Oncogene 9:1829-1838). Un posible mecanismo a través del cual los anticuerpos HER2/neu podrían mejorar la respuesta a agentes quimioterapéuticos es a través de la modulación de la expresión de la proteína HER2/neu o mediante la interferencia con la reparación de ADN. (Stancovski et al. (1991) Proc . Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:8691-8695; Bacus et al. (1992) Cell Growth & Diff. 3:401-411; Bacus et al. (1993) Cáncer Res. 53:5251-5261; Klapper et al. (1997) Oncogene 14:2099-2109; Klapper et al. (2000) Cáncer Res. 60:3384-3388; Arteaga et al. (2001) J Clinical Oncology 19(18s) :32s-40s. Aunque en ciertos casos, los anticuerposanti-HER2/neu tales como HERCEPTIN® proveen beneficio terapéutico a pacientes, la mayor parte de los pacientes con cáncer de pecho y otros pacientes exhiben respuestas refractarias a tales anticuerpos. Estas respuestas reflejan, en parte, diferencias en el grado de la sóbreexpresión de HER2/neu a través de las células cancerígenas del paciente.

Como una consecuencia de contener regiones variables capaces de unirse a Her2/neu y al receptor de la célula T ( "TCR" ) , el DART tiene la habilidad de unirse a células que expresan HER2 y para por lo tanto acoplar a tales células un dominio capaz de unirse al receptor de la célula T. Cuando las células T se unen a este dominio, se activan para iniciar una respuesta inmunitaria que conduce a la aniquilación de las células que expresan HER2.

Las secuencias de aminoácido y ácido nucleico para tal DART son provistas a continuación, con secuencias VL y VH que muestran en texto simple, el enlazador VL-VH mostrado en texto subrayado, y la secuencia que codifica el motivo de heterodimerización C-terminal (SEC ID NO: 313: GFNRGEC o SEC ID NO: 314: GVEPKSC) mostrada en negrillas e itálicas.

Secuencia de aminoácido TCRVL-HER2VH (SEC ID NO: 315) EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQLQQ SGPELVKPGA SLKLSCTASG FNIKDTYIHW VKQRPEQGLE WIGRIYPTNG YTRYDPKFQD KATITADTSS NTAYLQVSRL TSEDTAVYYC SRWGGDGFYA MDYWGQGASV TVSSGFNRGE Secuencia de ácido nucleico que codifica TCRVL-HER2VH- (SEC ID NO: 316) gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gtgccacctc aagtgtaagt tacatgcact ggtatcagca gaaaccaggg aaagccccta agcgctggat ctatgacaca tccaaactgg cttctggggt cccatcaagg ttcagcggca gtggatctgg gacagaattt actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa gattttgcaa cttattactg tcagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt tggccagggg accaagcttg agatcaaagg aggcggatcc ggcggcggag gccaggttca gctgcagcag tctgggccag agcttgtgaa gccaggggcc tcactcaagt tgtcctgtac agcttctggc ttcaacatta aagacaccta tatacactgg gtgaaacaga ggcctgaaca gggcctggaa tggattggaa ggatttatcc tacgaatggt tatactagat atgacccgaa gttccaggac aaggccacta taacagcaga cacatcctcc aacacagcct acctgcaggt cagccgcctg acatctgagg acactgccgt ctattattgt tctagatggg gaggggacgg cttctatgct atggactact ggggtcaagg agcctcggtc accgtgagct ccggrattcaa caggggagag tgt Secuencia de aminoácido HER2VL-TCRVH (SEC ID NO: 317) DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKVEI GGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYKFTSYVMH WVRQAPGQGL EWIGYINPYN DVTKYNEKFK GRVTITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVHY CARGSYYDYD GFVYWGQGTL VTVSSGVEPK se Secuencia de ácido nucleico que codifica HER2VL-TCRVH- (SEC ID NO: 318) gacatcgtga tgacccagtc ccacaagttc atgtccacct ctgtgggcga tagggtcagc atcacctgca aggccagcca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca gcagaaacca ggacattetc ccaaactgct gatttactec gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat cgcttcactg geageagate tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta cacctcccac cttcggaggg ggtaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg gcctcagtga aggtctcctg caaggccagc ggttacaagt ttaccageta cgtgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gatatattaa teettacaat gatgttacta agtacaatga gaagttcaaa ggcagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc ctgagatccg aggacacggc cgtgcactac tgtgcgagag ggagetacta tgattacgac gggtttgttt actggggcca agggactctg gtcactgtga gctccggagrt tgagcccaaa tcttgt En una modalidad preferida, tales constructos se modifican para contener un dominio E espiral o K espiral que facilita la formación de heterodímeros (es decir, los dímeros TCRVL- HER2VH x HER2VL-TCRVH) . Las secuencias de aminoácido y ácido nucleico para tal DART son provistas a continuación, con las secuencias VL y VH mostradas en texto simple, el enlazador VL- VH mostrado en texto subrayado, y el enlazador que contiene la secuencia que codifica Cys para la diraerización (GGCGGG ; residuos 2-7 de SEC ID NO: 267) mostrado en itálicas. El E espiral del dominio de heterodimerización de K espiral está doblemente subrayado (la secuencia "E-espiral" preferida es 4 repeticiones heptaméricas de EVAALEK; SEC ID NO: 299; la secuencia "K-espiral" preferida es 4 repeticiones heptaméricas de r VAALKE (SEC ID NO: 300) . La secuencia que sigue al E espiral o K espiral no tiene una función atribuida.

Secuencia de aminoácido TCRVL-HER2VH-E espiral (SEC ID NO: 319) EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYGQQW SS PLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQLQQ SGPELVKPGA SLKLSCTASG EIKDTYIHW VKQRPEQGLE WIGRIYPTG YTRYDPKFQD KATITADTSS NTAYLQVSRL TSEDTAVYYC SRWGGDGFYA MDYWGQGASV VSSGGCGGG EVAALEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKGG GNS Secuencia de ácido nucleico que codifica TCRVL -HER2VH-E espiral- (SEC ID NO: 320) gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gtgccacctc aagtgtaagt tacatgcact ggtatcagca gaaaccaggg aaagccccta agcgctggat ctatgacaca tccaaactgg cttctggggt cccatcaagg ttcagcggca gtggatctgg gacagaattt actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa gattttgcaa cttattactg tcagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt tggccagggg accaagcttg agatcaaagg aggcggatcc ggcggcggag gccaggttca gctgcagcag tctgggccag agcttgtgaa gccaggggcc tcactcaagt tgtcctgtac agcttctggc ttcaacatta aagacaccta tatacactgg gtgaaacaga ggcctgaaca gggcctggaa tggattggaa ggatttatcc tacgaatggt tatactagat atgacccgaa gttccaggac aaggccacta taacagcaga cacatcctcc aacacagcct acctgcaggt cagccgcctg acatctgagg acactgccgt ctattattgt tctagatggg gaggggacgg cttctatgct atggactact ggggtcaagg agcctcggtc accgtgagct ccggaggatg tggcggtgga gaaqtqgccg cactggagaa agagqttqct gctttggaga aqqaqqtcqc tgcacttgaa aaqqaqqtcg cagccctgga qaaaggcggc gggaattct Secuencia de aminoácido HER2VL-TCRVH-K espiral (SEC ID NO: 321) DIWTTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTPGG GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYKFTSYVMH WVRQAPGQGL EWIGYINPYN DVTKYNEKFK GRVTITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVHY CARGSYYDYD GFVYWGQGTL VTVSSGGCGG GKVAALKEKV AALKEKVAAL KEKVAALKEG GGNS Secuencia de ácido nucleico que codifica HER2VL-TCRVH-K espiral (SEC ID NO: 322) gacatcgtga tgacccagtc ccacaagttc atgtccacct ctgtgggcga tagggtcagc atcacctgca aggccagcca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca gcagaaacca ggacattctc ccaaactgct gatttactcc gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat cgcttcactg gcagcagatc tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta cacctcccac cttcggaggg ggtaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg gcctcagtga aggtctcctg caaggccagc ggttacaagt ttaccagcta cgtgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gatatattaa tccttacaat gatgttacta agtacaatga gaagttcaaa ggcagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc ctgagatccg aggacacggc cgtgcactac tgtgcgagag ggagctacta tgattacgac gggtttgttt actggggcca agggactctg gtcactgtga gctccggagg atgtggcggt qgaaaaqtqq ccgcactqaa ggagaaaqtt gctgctttqa aaqaqaaqqt cqccqcactt aaqqaaaaqq tcqcaqccct gaaaqaqggc ggcgggaatt ct Las moléculas DART que tienen Her2 y los dominios del receptor de célula T (TCR) se ensayaron para su habilidad para mediar la citotoxicidad en múltiples líneas celulares de cáncer de pecho, cáncer de colon y cáncer de vejiga que habían sido previamente caracterizadas como exhibiendo bajos niveles de expresión HER2 (y de esta forma refractarios al tratamiento con el anticuerpo anti-Her2/neu, Herceptin®. Las líneas de células de cáncer de pecho ensayas son ZR75-1 (HER2 2+) (FIG. 49A) , MCF-7 (HER2 1+) (FIG. 49B) y MDA-MB468 (HER2 -ve) (FIG. 49C) . Las líneas de células de cáncer no de pecho ensayadas son HT-29 (línea de células de cáncer de vejiga) (FIG. 49E) . Como se muestra en las FIG.49A-49E, tales moléculas DART fueron sustancialmente más efectivas que HERCEPTIN® en la mediación de la citotoxicidad de líneas de células derivadas de tumor, ambas en términos de las concentraciones requeridas para lograr la citotoxicidad equivalente, y en términos de los niveles máximos de citotoxicidad observados.

Muchas modificaciones y variaciones de esta invención pueden hacerse sin apartarse de su espíritu y alcance, como será evidente para los expertos en la técnica.

Las modalidades específicas descritas en la presente se ofrecen a manera de ejemplo solamente, y la invención se limitará solamente por los términos de las reivindicaciones anexas, junto con el completo alcance de equivalentes a las cuales se intitulan las reivindicaciones. Tales modificaciones pretenden caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las referencias a patentes o no patentes, citadas en la presente se incorporan por referencia en cada publicación o patente o solicitud de patente individual como si cada publicación, o patente o solicitud de patente se indicara específica e individualmente a ser incorporada por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una molécula de diacuerpo caracterizada porque comprende una primera cadena de polipéptido y una segunda cadena de polipéptido, en donde la primera cadena de polipéptido comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específico para un segundo epítopo, y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fe o una de sus porciones, cuyo primer dominio y segundo dominio están covalentemente enlazados de tal forma que el primer dominio y el segundo dominio no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; cuya segunda cadena de polipéptido comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2) , (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VHl) , y (iii) un sexto dominio que comprende un dominio Fe, cuyo cuarto dominio y quinto dominio están covalentemente enlazados de tal forma que el cuarto dominio y el quinto dominio no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; en donde el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1) (VH1) que une el primer epítopo; en donde el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian para formar segundo sitio de unión (VL2) (VH2) que une el segundo epítopo; y en donde : (1) el segundo y el tercer dominios; o (2) el quinto y el sexto dominios; están enlazados entre sí mediante un enlazador de polipéptido de intervención que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOs: 278-298.

2. La molécula de diacuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el tercer dominio además comprende un dominio de bisagra.

3. Una molécula de diacuerpo caracterizada porque comprende una primera cadena de polipéptido y una segunda cadena de polipéptido, cuya primera cadena de polipéptido comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítopo, y (iii) un tercer dominio que comprende a dominio de bisagra y un dominio Fe o una de sus porciones, cuyo primer dominio y segundo dominio están covalentemente enlazados de tal forma que el primer dominio y el segundo dominio no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; cuya segunda cadena de polipéptido comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2) , (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VHl) , y (iii)un sexto dominio comprende los secuencia de aminoácido de al menos 2 a 8 residuos de aminoácido C-terminal de un dominio constante de cadena ligera humana, cuyo cuarto dominio y quinto dominio están covalentemente enlazados de tal forma que el cuarto dominio y el quinto dominio no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; en donde el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar primer sitio de unión (VL1) (VHl) que une el primer epítopo; en donde el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian para formar segundo sitio de unión (VL2) (VH2) que une el segundo epítopo; y en donde : (1) el segundo y el tercer dominios; o (2) el quinto y el sexto dominios; están enlazados entre sí mediante un enlazador de polipéptido de intervención que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOs : 278-298.

4. Una molécula de diacuerpo caracterizada porque comprende una primera cadena de polipéptido y una segunda cadena de polipéptido, cuya primera cadena de polipéptido comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobul na (VH2) específica para un segundo epítopo, y (iii) un tercer dominio que comprende a dominio de bisagra, cuyo primer dominio y segundo dominio están covalentemente enlazados de tal forma que el primer dominio y el segundo dominio no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; cuya segunda cadena de polipéptido comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2) , (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1) , y (iii) a sexto dominio comprende los secuencia de aminoácido de al menos 2 a 8 residuos de aminoácido C-terminal de un dominio constante de cadena ligera humana, cuyo cuarto dominio y quinto dominio están covalentemente enlazados de tal forma que el cuarto dominio y el quinto dominio no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; en donde el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar primer sitio de unión (VL1) (VH1) que une el primer epítopo; en donde el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian para formar segundo sitio de unión (VL2) (VH2) que une el segundo epítopo; y en donde : (1) el segundo y el tercer dominios; o (2) el quinto y el sexto dominios; están enlazados entre sí mediante un enlazador de polipéptido de intervención que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOS: 278-298.

5. Una molécula de diacuerpo caracterizada porque comprende una primera cadena de polipéptido y una segunda cadena de polipéptido, cuya primera cadena de polipéptido comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítopo, y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fe o una de sus porciones, cuyo primer dominio y segundo dominio están covalentemente enlazados de tal forma que el primer dominio y el segundo dominio no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; cuya segunda cadena de polipéptido comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2) , y (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1) , cuyo cuarto dominio y quinto dominio están covalentemente enlazados de tal forma que el cuarto y quinto dominios no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; en donde el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar primer sitio de unión (VL1) (VH1) que une el primer epítopo; en donde el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian para formar segundo sitio de unión (VL2) (VH2) que une el segundo epítopo; en donde el tercer dominio es N-terminal a ambos el primer dominio y el segundo dominio; y en donde: (1) el segundo y el tercer dominios; o (2) el quinto y el sexto dominios; están enlazados entre sí mediante un enlazador de polipéptido de intervención que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOS: 278-298.

6. La molécula de diacuerpo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el tercer dominio además comprende una región de bisagra.

7. Una molécula de diacuerpo caracterizada porque comprende una primera y una segunda cadena de polipéptido, cuya primera cadena de polipéptido comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, y (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítopo, cuyo primer dominio y segundo dominio están covalentemente enlazados de tal forma que el primer dominio y el segundo dominio no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; cuya segunda cadena de polipéptido comprende (i) un tercer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2), y (ii) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1) , cuyo tercer dominio y cuarto dominio están covalentemente enlazados de tal forma que el tercer dominio y cuarto dominio no se asocian para formar un sitio de unión de epítopo; en donde el primer dominio y el tercer dominio se asocian para formar primer sitio de unión (VL1) (VHl) que une el primer epítopo, cuyo sitio de unión de epítopo es específico para CD32B; en donde el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian para formar segundo sitio de unión (VL2) (VH2) que une el segundo epítopo, cuyo sitio de unión de epítopo es específico para CD16; y en donde el primera cadena de polipéptido y la segunda cadena de polipéptido están covalentemente enlazados a través de un enlace de disulfuro entre al menos un residuo de cisteína fuera del primer dominio y el segundo dominio, la primera cadena de polipéptido y al menos un residuo de cisteína fuera del tercer dominio y el cuarto dominio, en la segunda cadena de polipéptido, cuyo residuo de cisteína en la primera cadena de polipéptido no está en el C-terminal de la primera cadena de polipéptido y el residuo de cisteína en la segunda cadena de polipéptido no está en el C-terminal de la segunda cadena de polipéptido; y en donde: (1) el segundo y el tercer dominios; o (2) el quinto y el sexto dominios; están enlazados entre sí mediante un enlazador de polipéptido de intervención que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOS: 278-298.

8. Una molécula de diacuerpo caracterizada porque comprende una primera cadena de polipéptido y una segunda cadena de polipéptido, en donde: (A) la primera cadena de polipéptido comprende: (i) un dominio (A) que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un epítopo (1); (ii) un dominio (B) que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un epítopo (2); y (iii) un dominio (C) que comprende un dominio de región constante de cadena ligera (CL) o una de sus porciones; (B) la segunda cadena de polipéptido comprende: (i) un dominio (D) que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2) específico para el epítopo (2) ; (ii) un dominio (E) que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VHl) específico para el epítopo (1) ; (iii) un dominio (F) que comprende una región 1 constante de cadena pesada (CH1) dominio o una de sus porciones, y (iv) una región de bisagra de una región 2 constante de cadena pesada (CH2) y una región 3 constante de cadena pesada (CH3) ; en donde : los dominios (A) y (B) no se asocian entre sí para formar el sitio de unión de epítopo; los dominios (D) y (E) no se asocian entre sí para formar sitio de unión de epítopo; los dominios (A) y (E) se asocian para formar sitio de unión que une el epítopo (1) ; los dominios (B) y (D) se asocian para formar sitio de unión que une el epítopo (2); los dominios (C) y (F) se asocian junto a través de un enlace de disulfuro para formar un dominio CH1 o una de sus porciones; en donde : (1) los dominios (B) y (C) ; o (2) los dominios (E) y (F) ; están enlazados entre sí mediante un enlazador de polipéptido de intervención que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOs : 278-298.

9. La molécula de diacuerpo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la molécula adicionalmente comprende una tercera cadena de polipéptido y una cuarta cadena de polipéptido, en donde : (A) el tercer polipéptido cadena comprende: (i) un dominio (G) que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específico para un epítopo (3); (ii) un dominio (H) que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específico para un epítopo (4) ; y (iii) un dominio (I) que comprende un dominio de región constante de cadena ligera (CL) o una de sus porciones ; (B) el cuarto polipéptido cadena comprende: (i) un dominio (J) que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2) específico para el epítopo (4) ; (ii) un dominio (K) que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VHl) específico para el epítopo (3) ; (iii) un dominio (L) que comprende dominio de una región 1 constante de cadena pesada (CH1) o una de sus porciones ; en donde : los dominios (G) y (H) no se asocian entre sí para formar sitio de unión de epítopo; los dominios (J) y (K) no se asocian entre sí para formar sitio de unión de epítopo; los dominios (G) y (K) se asocian para formar sitio de unión que une el epítopo (3) ; los dominios (H) y (J) se asocian para formar sitio de unión que une el epítopo (4) ; los dominios (I) y (L) se asocian juntos a través de un enlace de disulfuro para formar un dominio CH1 o una de sus porciones; y la región de bisagra, la región 2 constante de cadena pesada (CH2) y la región 3 constante de cadena pesada (CH3) de la segunda y cuarta cadenas de polipéptido se asocian para formar la región Fc; y en donde : (1) los dominios (B) y (C) ; (2) los dominios (E) y (F) ; (3) los dominios (H) y (I) ; o (4) los dominios (K) y (L) ; están enlazados entre sí mediante un enlazador de polipéptido de intervención que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOs : 278-298.

10. El diacuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7, caracterizado porque la primera o la segunda cadenas de polipéptido del diacuerpo adicionalmente comprenden un separador E-espiral o K-espiral.

11. El diacuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque ambas la primera y la segunda cadenas de polipéptido del diacuerpo comprenden un separador E-espiral o K-espiral.

12. El diacuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el separador E-espiral o K-espiral está enlazado a un fragmento Fc .

13. El diacuerpo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el separador E-espiral o K-espiral está enlazado a un fragmento Fc .

14. El diacuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque separador E-espiral o K-espiral está enlazado a una porción de polipéptido de una proteína de unión a suero, la porción de polipéptido es capaz de unirse a la proteína sérica.

15. El diacuerpo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la proteína que se une al suero es una proteína de unión a albúmina.

16. El diacuerpo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la proteína de unión a suero es la proteína G de estreptococo y el polipéptido es un dominio de unión a albúmina (ABD) de la proteína G de estreptococo .

17. El diacuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el dominio de unión a albúmina (ABD) de la proteína G de estreptococo es el dominio 3 de unión a albúmina (ABD3) de proteína G de la cepa G148 de estreptococo.

18. Un diacuerpo caracterizado porque exhibe una vida media en suero in vivo mayor de 2 horas.

19. El diacuerpo de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el diacuerpo exhibe una vida media en suero in vivo mayor de 10 horas.

20. El diacuerpo de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el diacuerpo exhibe una vida media en suero in vivo mayor de 20 horas.

21. Una molécula DART caracterizada porque tiene un dominio que es un ligando de unión para el receptor del Grupo 2D Aniquilador Natural (NKG2D) .

22. La molécula DART de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la molécula adicionalmente se une a un antígeno asociado con tumor.

23. La molécula DART de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el antígeno asociado con el tumor es un antígeno de cáncer de pecho, antígeno de cáncer de ovario, antígeno de cáncer de próstata, antígeno de cáncer cervical, antígeno de carcinoma pancreático, antígeno de cáncer de pulmón, antígeno de cáncer de vejiga, antígeno de cáncer de colon, antígeno de cáncer testicular, antígeno de cáncer de glioblastoma, un antígeno asociado con una malignidad de la Célula B, un antígeno asociado con mieloma múltiple, un antígeno asociado con linfoma no de Hodgkins, o un antígeno asociado con leucemia linfocítica crónica.

24. La molécula DART de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el antígeno asociado con el tumor es A33; ADAM-9; ALCAM; Bl; BAGE; beta-catenina; CA125; Carboxipeptidasa M; CD5 ; CD 19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD28; CD32B; CD36; CD40; CD45; CD46; CD56; CD79a; CD79b; CD103; CD154 ; CDK4 ; CEA; CTLA4 ; Citoqueratina 8; EGF-R; un receptor de Efrina; ErbBl; ErbB3 ; ErbB4 ; GAGE-I; GAGE-2; GD2 ; GD3 ; G 2 ; gplOO; HER-2/neu; virus de papiloma humano EF, virus de papiloma humano E7 Integrina Alfa- V-Beta-6; JAM-3; KID3; KID31; KSA (17-1A); LUCA-2; MAGE-1; MAGE-3; MART; MUC-1; MU -1; N- acetilglucosaminiltransferasa ; Oncostatina M (Receptor Beta de Oncostatina) ; pl5; PIPA; PSA; PSMA; RAAG10; ROR1 ; SART; sTn; TES7 ; el receptor TNF-OÍ; el receptor TNF-ß; el receptor TNF-?; el receptor de Transferrina o el receptor VEGF.

25. La molécula DART de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el antígeno asociado con el tumor es HER-2/neu.

26. Una molécula DART caracterizada porque tiene el dominio de unión del receptor de célula T (TCR) .

27. La molécula DART de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la molécula adicionalmente se une al antígeno asociado con el tumor.

28. La molécula DART de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque el antígeno asociado con el tumor es un antígeno de cáncer de pecho, antígeno de cáncer de ovario, antígeno de cáncer de próstata, antígeno de cáncer cervical, antígeno de carcinoma pancreático, antígeno de cáncer de pulmón, antígeno de cáncer de vejiga, antígeno de cáncer de colon, antígeno de cáncer testicular, antígeno de cáncer de glioblastoma, un antígeno asociado con una malignidad de la Célula B, un antígeno asociado con mieloma múltiple, un antígeno asociado con linfoma no de Hodgkins, o un antígeno asociado con leucemia linfocítica crónica.

29. La molécula DART de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque el antígeno asociado con el tumor es A33; ADAM-9; ALCAM; Bl ; BAGE; beta-catenina ; CA125; Carboxipeptidasa M; CD5 ; CD19; CD20; CD22; CD23 ; CD25; CD27; CD28; CD32B; CD36; CD40; CD45; CD46; CD56; CD79a; CD79b; CD103; CD154 ; CDK4 ; CEA; CTLA4 ; Citoqueratina 8; EGF- R; un receptor de Efrina; ErbBl; ErbB3 ; ErbB4 ; GAGE-I; GAGE-2; GD2; GD3 ; GM2 ; gplOO; HER-2/neu; virus de papiloma humano EG, virus de papiloma humano E7 ; Integrina Alfa- V-Beta-6; JAM-3; KID3; KID31; KSA (17-1A); LUCA-2; MAGE-1; MAGE-3; MART; MUC-1; MUM-1; N- acetilglucosaminiltransferasa ; Oncostatina (Receptor Beta de Oncostatina) ; pl5 ; PIPA; PSA; PSMA; RAAG10; R0R1 ; SART; sTn; TES7 ; el receptor TNF-OÍ ; el receptor TNF-ß; el receptor TNF-?; el receptor de Transferrina o el receptor VEGF.

30. La molécula DART de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el antígeno asociado con el tumor es HER-2/neu.