ES2733067T3 - Diacuerpos covalentes y usos de los mismos - Google Patents

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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Abstract

Una molécula de diacuerpo que comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, estando las cadenas polipeptídicas unidas covalentemente entre sí, en la que: I. la primera cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N al extremo C: (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un epítopo (1), (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un epítopo (2), y (iii) un dominio polipeptídico cargado positiva o negativamente que asume espontáneamente una conformación helicoide, en la que el dominio polipeptídico cargado positivamente es un separador de enrollamiento-E que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 299 y el dominio polipeptídico cargado negativamente es un separador de enrollamiento-K que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 300; estando dicho primer dominio y segundo dominio unidos covalentemente de modo que el primer dominio y el segundo dominio no se asocian juntos para formar un sitio de unión a epítopo (1) o un sitio de unión a epítopo (2); II. la segunda cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N al extremo C: (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2) específica para el epítopo (2), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1) específica para el epítopo (1); (iii) un dominio polipeptídico cargado positiva o negativamente que asume espontáneamente una conformación helicoide unido al quinto dominio, en la que el dominio polipeptídico cargado positivamente es un separador de enrollamiento-E que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 299 y el dominio polipeptídico cargado negativamente es un separador de enrollamiento-K que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 300, en la que, cuando la primera cadena polipeptídica comprende el separador de enrollamiento-E, la segunda cadena polipeptídica comprende el separador de enrollamiento-K, o cuando la primera cadena polipeptídica comprende el separador de enrollamiento-K, la segunda cadena polipeptídica comprende el separador de enrollamiento-E; estando dicho cuarto dominio y quinto dominio unidos covalentemente de modo que el cuarto dominio y el quinto dominio no se asocian juntos para formar el sitio de unión a epítopo (1) o el sitio de unión a epítopo (2); en la que el primer dominio y el quinto dominio se asocian juntos para formar un sitio de unión (VL1)(VH1) que se une al epítopo (1); en la que el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian juntos para formar un sitio de unión (VL2)(VH2) que se une al epítopo (2).

Description

DESCRIPCIÓN
Diacuerpos covalentes y usos de los mismos
1. Campo de la invención
La presente divulgación se refiere a moléculas de diacuerpo, mencionadas de otro modo "reactivos de redirección de afinidad doble ("DART"). Las moléculas de diacuerpo de la divulgación comprenden al menos dos cadenas polipeptídicas que se asocian para formar al menos dos sitios de unión a epítopo, que pueden reconocer epítopos iguales o diferentes. Adicionalmente, los epítopos pueden ser de la misma molécula o moléculas diferentes o estar ubicados en la misma célula o células diferentes. Las cadenas polipeptídicas individuales de la molécula de diacuerpo pueden unirse covalentemente mediante enlaces no peptídicos, enlaces covalentes tales como, aunque sin limitación, uniones disulfuro de restos de cisteína ubicados dentro de cada cadena polipeptídica. En realizaciones particulares, las moléculas de diacuerpo de la presente divulgación comprenden además una región Fc, que permite la funcionalidad de tipo anticuerpo a manipular en la molécula.
2. Antecedentes de la invención
El diseño de diacuerpos covalentes se basa en la construcción Fv monocatenaria (scFv) (Holliger et al. (1993) "Diabodies: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). En una IgG no modificada intacta los dominios VL y VH están ubicados en diferentes cadenas polipeptídicas, es decir, la cadena ligera y la cadena pesada, respectivamente. La interacción de una cadena ligera de anticuerpo y una cadena pesada de anticuerpo y, en particular la interacción de los dominios VL y VH forma uno de los sitios de unión a epítopo del anticuerpo. Por el contrario, la construcción scFv comprende un dominio VL y VH de un anticuerpo contenido en única cadena polipeptídica, en la que los dominios están separados por un conector flexible de longitud suficiente para permitir el autoensamblaje de los dos dominios en un sitio de unión a epítopo funcional. Cuando es imposible su autoensamblaje debido a un conector de longitud insuficiente (menos de aproximadamente 12 restos de aminoácidos), dos de las construcciones scFv interactúan entre sí para formar una molécula bivalente, asociándose el VL de una cadena con el VH de la otra (revisado en Marvin et al. (2005) "Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies," Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658). Además, se ha demostrado que la adición de un resto de cisteína al extremo C de la construcción permite la unión por disulfuro de las cadenas polipeptídicas, que estabiliza el dímero resultante sin interferir en las características de unión de la molécula bivalente (véase, por ejemplo, Olafsen et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications", Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27). Además, cuando se seleccionan dominios VL y VH de diferente especificidad, puede construirse no solamente una molécula bivalente, sino también biespecífica.
Los diacuerpos bivalentes tienen aplicaciones de amplio espectro incluyendo tratamiento e inmunodiagnóstico. La bivalencia permite una gran flexibilidad en el diseño y manipulación del diacuerpo en diversas aplicaciones, proporcionando avidez potenciada por antígenos multiméricos, el entrecruzamiento de diferentes antígenos y la dirección dirigida a tipos celulares específicos dependiendo de la presencia de ambos antígenos diana. Debido a su valencia aumentada, las tasas de disociación bajas y la eliminación rápida de la circulación (para diacuerpos de pequeño tamaño, en o por debajo de ~50 kDa), las moléculas de diacuerpo conocidas en la técnica también han demostrado uso particular en el campo de las imágenes de tumores (Fitzgerald et al. (1997) "Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris", Protein Eng. 10:1221). Es de particular importancia el entrecruzamiento de diferentes células, por ejemplo, el entrecruzamiento de linfocitos T citotóxicos con células tumorales (Staerz et al. 1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells", Nature 314:628-631, y Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody'. Protein Eng. 9:299-305). Los dominios de unión a epítopo de diacuerpo también pueden estar dirigidos a un determinante superficial de cualquier célula efectora inmunitaria tal como CD3, CD16, CD32 o CD64, que se expresan en linfocitos T, linfocitos citolíticos naturales (NK) u otras células mononucleadas. En muchos estudios, un diacuerpo que se une a determinantes de células efectoras, por ejemplo, receptores de Fcy (FcyR), también se descubrió que activaba la célula efectora (Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody', Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) "Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins", Cancer Res. 59:2909-2916). Normalmente, la activación de células efectoras se activa por la unión de un anticuerpo unido a antígeno a una célula efectora mediante interacción de Fc-FcyR; por tanto, a este respecto, las moléculas de diacuerpo de la divulgación pueden mostrar funcionalidad de tipo Ig independientemente de si comprenden un dominio Fc (por ejemplo, ensayado en cualquier ensayo de función efectora conocido en la técnica o ejemplificado en la presente memoria (por ejemplo, ensayo de ADCC)). Entrecruzando células tumorales y efectoras, el diacuerpo no solamente pone la célula efectora en la proximidad de las células tumorales, sino que da lugar a la eliminación eficaz del tumor (véase, por ejemplo, Cao et al. (2003) "Bispecific Antibody Conjugales In Therapeutics", Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197).
2.1 Receptores de células efectoras y sus funciones en el sistema inmunitario
En la función inmunitaria tradicional, la interacción de los complejos de anticuerpo-antígeno con células del sistema inmunitario produce una amplia serie de respuestas, que varían desde funciones efectoras tales como citotoxicidad dependiente de anticuerpos, desgranulación de mastocitos y fagocitosis hasta señales inmunomoduladoras tales como regulación de la proliferación de linfocitos y la secreción de anticuerpos. Todas estas interacciones se inician mediante la unión del dominio Fc de los anticuerpos o complejos inmunitarios a receptores de superficie celular especializados en células hematopoyéticas. La diversidad de las respuestas celulares activadas por los anticuerpos y los complejos inmunitarios es el resultado de la heterogeneidad estructural de los receptores de Fc. Los receptores de Fc comparten dominios de unión a antígeno estructuralmente relacionados que supuestamente median la señalización intracelular.
Los receptores de Fcy, miembros de la superfamilia de proteínas del gen de inmunoglobulina, son glucoproteínas superficiales que pueden unirse a la parte Fcy de moléculas de inmunoglobulina. Cada miembro de la familia reconoce inmunoglobulinas de uno o más isotipos mediante un dominio de reconocimiento en la cadena a del receptor de Fcy. los receptores de Fcy se definen por su especificidad por subtipos de inmunoglobulina. Los receptores de Fcy para IgG se mencionan como FcyR, para IgE como FcsR y para IgA como FcaR. Diferentes células auxiliares albergan receptores de Fcy para anticuerpos de diferente isotipo, y el isotipo del anticuerpo determina las células auxiliares que se acoplarán en una respuesta dada (revisado por Ravetch J.V. et al. (1991) "Fc Receptors", Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92; Gerber J.S. et al. (2001) "Stimulatory And Inhibitory Signals Originating From The Macrophage Fcgamma Fleceptors," Microbes and Infection, 3: 131-139; Billadeau D.D. et al. (2002), "ITAMs Versus ITIMs: Striking A Balance Duríng Cell Regulation," The Journal of Clinical Investigation, 2(109): 161­ 1681; Ravetch J.V. et al. (2000) "Immune Inhibitory Receptors," Science, 290: 84-89; Ravetch J.V. et al., (2001) "IgG Fc Receptors," Annu. Rev. Immunol. 19:275-90; Ravetch J.V. (1994) "Fc Receptors: Rubor Redux" Cell, 78(4): 553­ 60). Los diferentes receptores de Fcy, las células que los expresan y su especificidad de isotipo se resume en la tabla 1 (adaptada de Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4.a edición 1999, Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, Nueva York.
Receptores de Fcy
Cada miembro de esta familia es una glucoproteína integrada en membrana que posee dominios extracelulares relacionados con un conjunto C2 de dominios relacionados con inmunoglobulina, un único dominio que abarca la membrana y un dominio intracitoplásmico de longitud variable. Hay tres FcyR conocidos, denominados FcyRI(CD64), FcyRII(CD32) y FcyRiII(CD16). Los tres receptores están codificados por distintos genes; sin embargo, la amplia homología entre los tres miembros de la familia sugiere que surgen de un progenitor común quizá por duplicación génica.
FcyRII(CD32)
Las proteínas FcyRII son glucoproteínas integradas en la membrana de 40 kDa que se unen únicamente a la IgG en complejo debido a una baja afinidad por Ig monomérica (106 M-1). Este receptor es el FcyR más ampliamente expresado, presente en todas las células hematopoyéticas incluyendo los monocitos, macrófagos, linfocitos B, linfocitos NK, neutrófilos, mastocitos y plaquetas. FcyRII tiene únicamente dos regiones de tipo inmunoglobulina en su cadena de unión a inmunoglobulina y, por tanto, una afinidad muy inferior por IgG que FcyRI. Hay tres genes de FcyRII humanos (FcyRII-A, FcyRII-B, FcyRII-C), que se unen todos a IgG en agregados o complejos inmunitarios. Las distintas diferencias dentro de los dominios citoplásmicos de FcyRII-A y FcyRII-B crean dos respuestas funcionalmente heterogéneas al ligamiento del receptor. La diferencia fundamental es que la isoforma A inicia la señalización intracelular dando lugar a activación celular, tal como fagocitosis y explosión respiratoria, mientras que la isoforma B inicia señales inhibidoras, por ejemplo, inhibiendo la activación de linfocitos B.
FcyRIII(CDW)
Debido a la heterogeneidad dentro de esta clase, el tamaño de FcyRIII varía entre 40 y 80 kDa en ratones y seres humanos. Dos genes humanos codifican dos transcritos, FcyRIIIA, una glucoproteína integrada en la membrana, y FcyRIIIB, una versión unida a glucosilfosfatidil-inositol (GPI. Un gen murino codifica un FcyRIII homólogo a la FcyRIIIA humano que abarca la membrana. El FcyRIII comparte características estructurales con cada uno de los otros dos FcyR. Igual que FcyRII, FcyRIII se une a IgG con baja afinidad y contiene los dos correspondientes dominios de tipo Ig extracelulares. FcyRIIIA se expresa en macrófagos, mastocitos y es el único FcyR en linfocitos NK. El FcyRIIIB unido a GPI actualmente se sabe que se expresa únicamente en neutrófilos humanos.
Señalización mediante FcyR
Tanto las señales activadoras como las inhibidoras se transducen mediante los FcyR después del ligamiento. Estas funciones diametralmente opuestas son el resultado de diferencias estructurales entre las diferentes isoformas del receptor. Dos dominios distintos dentro de los dominios de señalización citoplásmicos del receptor llamados motivos de activación basados en tirosina de inmunorreceptor (ITAM) o motivos inhibidores basados en tirosina de inmunorreceptor (ITIM) justifican las diferentes respuestas. El reclutamiento de diferentes enzimas citoplásmicas a estas estructuras dictamina el resultado de las respuestas celulares mediadas por FcyR. Los complejos de FcyR que contienen ITAM incluyen FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA, mientras que los complejos que contienen ITIM incluyen únicamente FcyRIIB.
Los neutrófilos humanos expresan el gen de FcyRIIA. La agrupación de FcyRIIA mediante complejos inmunitarios o entrecruzamiento por anticuerpo específico sirve para agregar los ITAM junto con las cinasas asociadas a receptor que facilitan la fosforilación de ITAM. La fosforilación de ITAM sirve como sitio de conexión para la Syk cinasa, cuya activación provoca la activación de sustratos posteriores (por ejemplo, PI3K). La activación celular da lugar a la liberación de mediadores proinflamatorios.
El gen de FcyRIIB se expresa en linfocitos B; su dominio extracelular es un 96% idéntico a FcyRIIA y se une a complejos de IgG de una manera indistinguible. La presencia de ITIM en el dominio citoplásmico de FcyRIIB define esta subclase inhibidora de FcyR. Recientemente se estableció la base molecular de esta inhibición. Cuando se coliga junto con un FcyR activador, el ITIM en FcyRIIB llega a fosforilarse y atrae al dominio SH2 de la inositol polifosfato 5'-fosfatasa (SHIP), que hidroliza los mensajeros de fosfoinositol liberados como consecuencia de la activación de tirosina cinasas mediada por FcyR que contiene ITAM, evitando por consiguiente el flujo entrante de Ca++ intracelular. Por tanto, el entrecruzamiento de FcyRIIB amortigua la respuesta activadora al ligamiento de FcyR e inhibe la sensibilidad celular. La activación de linfocitos B, la proliferación de linfocitos B y la secreción de anticuerpos, por tanto, se anula.
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El documento US 2007/004909 se refiere a moléculas de diacuerpo y usos de las mismas en el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos incluyendo trastornos inmunológicos y cánceres, en los que las moléculas de diacuerpo incluyen al menos dos cadenas polipeptídicas que se asocian para formar al menos dos sitios de unión a epítopo.
3. Compendio de la invención
La presente invención se refiere a una molécula de diacuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 en la presente memoria. Su uso puede ser en el tratamiento de una diversidad de enfermedades y trastornos incluyendo cáncer, trastornos autoinmunitarios, trastornos de alergia y enfermedades infecciosas causadas por bacterias, hongos o virus. Preferiblemente, el diacuerpo de la presente divulgación puede unirse a dos epítopos diferentes en dos células diferentes, en el que el primer epítopo se expresa en un tipo celular diferente al segundo epítopo, de modo que el diacuerpo puede poner las dos células juntas.
Se describe un diacuerpo biespecífico covalente, que es un diacuerpo que comprende una primera y una segunda cadena polipeptídica, cuya primera cadena polipeptídica comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítopo y, opcionalmente, (iii) un tercer dominio que comprende al menos un resto de cisteína, cuyo primer y segundo dominio están unidos covalentemente de modo que el primer y segundo dominio no se asocian para formar un sitio de unión a epítopo; cuya segunda cadena polipeptídica comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1) y, opcionalmente, (iii) un sexto dominio que comprende al menos un resto de cisteína, cuyo cuarto y quinto dominio están unidos covalentemente de modo que el cuarto y quinto dominio no se asocian para formar un sitio de unión a epítopo; y en el que la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están unidas covalentemente, con la condición de que la unión covalente no sea un enlace peptídico; en el que el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1)(VH1) que se une al primer epítopo; en el que el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2)(VH2) que se une al segundo epítopo.
También se describe un diacuerpo biespecífico covalentemente, que es un diacuerpo que comprende una primera y una segunda cadena polipeptídica, cuya primera cadena polipeptídica comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítopo y (iii) un tercer dominio que comprende un domino Fc o parte del mismo, cuyo primer y segundo dominio están unidos covalentemente de modo que el primer y segundo dominio no se asocian para formar un sitio de unión a epítopo; cuya segunda cadena polipeptídica comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1), cuyo cuarto y quinto dominio están unidos covalentemente de modo que el tercer y cuarto dominio no se asocian para formar un sitio de unión a epítopo; y en el que la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están unidas covalentemente, con la condición de que la unión covalente no sea un enlace peptídico; en el que el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1)(VH1) que se une al primer epítopo; en el que el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2)(VH2) que se une al segundo epítopo.
También se describe una molécula de diacuerpo, que es una molécula que comprende una primera y una segunda cadena polipeptídica, cuya primera cadena polipeptídica comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítopo y (iii) un tercer dominio que comprende un domino Fc o parte de mismo, cuyo primer y segundo dominio están unidos covalentemente de modo que el primer y segundo dominio no se asocian para formar un sitio de unión a epítopo; cuya segunda cadena polipeptídica comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1) y (iii) un sexto dominio que comprende al menos un resto de cisteína, cuyo cuarto y quinto dominio están unidos covalentemente de modo que el cuarto y quinto dominio no se asocian para formar un sitio de unión a epítopo; y en el que la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están unidas covalentemente, con la condición de que la unión covalente no sea un enlace peptídico; en el que el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1)(VH1) que se une al primer epítopo; en el que el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2)(VH2) que se une al segundo epítopo.
También se describe un diacuerpo biespecífico covalentemente, que es un diacuerpo que es un dímero de moléculas de diacuerpo, comprendiendo cada molécula de diacuerpo una primera y una segunda cadena polipeptídica, cuya primera cadena polipeptídica comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítopo y, (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fc o parte de mismo, cuyo primer y segundo dominio están unidos covalentemente de modo que el primer y segundo dominio no se asocian para formar un sitio de unión a epítopo; y cuya segunda cadena polipeptídica comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1) y (iii) un sexto dominio que comprende al menos un resto de cisteína, cuyo cuarto y quinto dominio están unidos covalentemente de modo que el cuarto y quinto dominio no se asocian para formar un sitio de unión a epítopo; y en el que la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica de cada molécula de diacuerpo están unidas covalentemente, con la condición de que la unión covalente no sea un enlace peptídico; en el que el primer dominio y el quinto dominio de cada molécula de diacuerpo se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1)(VH1) que se une al primer epítopo; en el que el segundo dominio y el cuarto dominio de cada molécula de diacuerpo se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2)(VH2) que se une al segundo epítopo.
Como alternativa se describe un diacuerpo tetraespecífico covalentemente, que es un diacuerpo que es un dímero de moléculas de diacuerpo, comprendiendo la primera molécula de diacuerpo una primera y una segunda cadena polipeptídica, cuya primera cadena polipeptídica comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítopo y, (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fc o parte de mismo, cuyo primer y segundo dominio están unidos covalentemente de modo que el primer y segundo dominio no se asocian para formar un sitio de unión a epítopo; y cuya segunda cadena polipeptídica comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1) y (iii) un sexto dominio que comprende al menos un resto de cisteína, cuyo cuarto y quinto dominio están unidos covalentemente de modo que el cuarto y quinto dominio no se asocian para formar un sitio de unión a epítopo; y en el que la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están unidas covalentemente, con la condición de que la unión covalente no sea un enlace peptídico; en el que el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1)(VH1) que se une al primer epítopo; en el que el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2)(VH2) que se une al segundo epítopo; y comprendiendo la segunda molécula de diacuerpo una primera y una segunda cadena polipeptídica, cuya primera cadena polipeptídica comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una tercera inmunoglobulina (VL3) específica para un tercer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una cuarta inmunoglobulina (VH4) específica para un cuarto epítopo y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fc o parte del mismo, cuyo primer y segundo dominio están unidos covalentemente de modo que el primer y segundo dominio no se asocian para formar un sitio de unión a epítopo; y cuya segunda cadena polipeptídica comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la cuarta inmunoglobulina (VL4), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la tercera inmunoglobulina (VH3) y (iii) un sexto dominio que comprende al menos un resto de cisteína, cuyo cuarto y quinto dominio están unidos covalentemente de modo que el cuarto y quinto dominio no se asocian para formar un sitio de unión a epítopo; y en el que la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están unidas covalentemente, con la condición de que la unión covalente no sea un enlace peptídico; en el que el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL3)(VH3) que se une al tercer epítopo; en el que el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de (VL4)(VH4) que se une al cuarto epítopo.
En determinados aspectos de la molécula de diacuerpo, el primer epítopo, el segundo epítopo y, cuando sea aplicable, el tercer epítopo y el cuarto epítopo pueden ser iguales. En otros aspectos, el primer epítopo, el segundo epítopo y, cuando sea aplicable, el tercer epítopo y el cuatro epítopo pueden diferentes entre sí. En determinados aspectos de la molécula de diacuerpo que comprende un tercer dominio de unión a epítopo, el primer epítopo y el tercer epítopo pueden ser iguales. En determinados aspectos de la molécula de diacuerpo que comprende un cuarto dominio de unión a epítopo, el primer epítopo y el cuarto epítopo pueden ser iguales. En determinados aspectos de la molécula de diacuerpo que comprende un tercer dominio de unión a epítopo, el segundo epítopo y el tercer epítopo pueden ser iguales. En determinados aspectos de la molécula de diacuerpo que comprende un cuarto dominio de unión a epítopo, el segundo epítopo y el cuarto epítopo pueden ser iguales. En aspectos preferidos de la molécula de diacuerpo, el primer epítopo y el segundo epítopo son diferentes. En otros aspectos más de la molécula de diacuerpo que comprende un tercer dominio de unión a epítopo y un cuarto dominio de unión a epítopo, el tercer epítopo y el cuarto epítopo pueden ser diferentes. Debe entenderse que cualquier combinación de los anteriores está abarcada en la presente divulgación.
En aspectos particulares de la divulgación, el primer dominio y el quinto dominio del diacuerpo o molécula de diacuerpo pueden obtenerse de la misma inmunoglobulina. En otro aspecto, el segundo dominio y el cuarto dominio del diacuerpo o molécula de diacuerpo pueden obtenerse de la misma inmunoglobulina. En otro aspecto más, el primer dominio y el quinto dominio del diacuerpo o molécula de diacuerpo pueden obtenerse de una inmunoglobulina diferente. En otro aspecto más, el segundo dominio y el cuarto dominio del diacuerpo o molécula de diacuerpo pueden obtenerse de una inmunoglobulina diferente. Debe entenderse que cualquier combinación de los anteriores está abarcada en la presente divulgación.
En determinados aspectos de la divulgación, la unión covalente entre la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica del diacuerpo o molécula de diacuerpo puede ser mediante un enlace disulfuro entre al menos un resto de cisteína en la primera cadena polipeptídica y al menos un resto de cisteína en la segunda cadena polipeptídica. Los restos de cisteína en la primera y segunda cadena polipeptídica que son responsables de la unión por disulfuro pueden encontrarse en cualquier parte en la cadena polipeptídica incluyendo dentro del primer, segundo, tercer, cuarto, quinto y sexto dominio. En una realización específica, el resto de cisteína en la primera cadena polipeptídica se encuentra en el primer dominio y el resto de cisteína en la segunda cadena polipeptídica se encuentra en el quinto dominio. El primer, segundo, cuarto y quinto dominio corresponden a las regiones variables responsables de la unión. En realizaciones preferidas, los restos de cisteína responsables de la unión por disulfuro entre la primera y segunda cadena polipeptídica están ubicados dentro del tercer y sexto dominio, respectivamente. En un aspecto particular de esta realización, el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos del extremo C de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEQ ID NO: 23) que pueden estar codificados por la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 17). En otro aspecto de esta realización, el sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos del extremo C de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEQ ID NO: 23) que pueden estar codificados por la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 17). En otro aspecto más de esta realización, el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 77), obtenida del dominio de bisagra de una IgG humana, y que puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 78). En otro aspecto de esta realización, el sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 77), obtenida del dominio de bisagra de una IgG humana, y que puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 78). En determinados aspectos de esta realización, el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos del extremo C de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEQ ID NO: 23); y el sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 77). En otros aspectos de esta realización, el sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos del extremo C de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEQ ID NO: 23); y el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 77). En otros aspectos más de esta realización, el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos del extremo C de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEQ ID NO: 23); y el sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica comprende un dominio de bisagra. En otros aspectos de esta realización, el sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos del extremo C de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEQ ID NO: 23); y el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende el dominio de bisagra. En otros aspectos más de esta realización, el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos del extremo C de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEQ ID NO: 23); y el sexto dominio de la primera cadena polipeptídica comprende un dominio Fc o parte del mismo. En otros aspectos más de esta realización, el sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos del extremo C de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEQ ID NO: 23); y el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende el dominio Fc o parte del mismo.
En otras realizaciones, los restos de cisteína en el primer o segundo polipéptido que son responsables de la unión por disulfuro pueden estar ubicados fuera del primer, segundo o tercer dominio en la primera cadena polipeptídica y fuera del cuarto, quinto y sexto dominio en la segunda cadena polipeptídica. En particular, el resto de cisteína en la primera cadena polipeptídica puede estar en el extremo N del primer dominio o puede estar en el extremo C del primer dominio. El resto de cisteína en la primera cadena polipeptídica puede estar en el extremo N del segundo dominio o puede estar en el extremo C del segundo dominio. El resto de cisteína en la primera cadena polipeptídica puede estar en el extremo N del tercer dominio o puede estar en el extremo C del tercer dominio. Además, el resto de cisteína en la segunda cadena polipeptídica puede estar en el extremo N del cuarto dominio o puede estar en el extremo C del cuarto dominio. El resto de cisteína en la segunda cadena polipeptídica puede estar en el extremo N del quinto dominio o puede estar en el extremo C del quinto dominio. Por consiguiente, el resto de cisteína en la segunda cadena polipeptídica puede estar en el extremo C del sexto dominio o puede estar en el extremo N del sexto dominio. En un aspecto particular, el enlace disulfuro puede estar entre al menos dos restos de cisteína en la primera cadena polipeptídica y al menos dos restos de cisteína en la segunda cadena polipeptídica. En un aspecto particular, en el que el tercer dominio y el sexto dominio no comprenden un dominio Fc o parte del mismo, el resto de cisteína puede estar en el extremo C de la primera cadena polipeptídica y en el extremo C de la segunda cadena polipeptídica. Debe entenderse que cualquier combinación de los anteriores está abarcada en la presente divulgación.
En realizaciones específicas de la molécula de diacuerpo descrita supra, el diacuerpo covalente de la divulgación abarca dímeros de moléculas de diacuerpo, en los que cada molécula de diacuerpo comprende una primera y segunda cadena polipeptídica. En determinados aspectos de esta realización, las moléculas de diacuerpo pueden estar unidas covalentemente para formar el dímero, con la condición de que la unión covalente no sea un enlace peptídico. En aspectos preferidos de esta realización, la unión covalente es un enlace disulfuro entre al menos un resto de cisteína en la primera cadena polipeptídica de cada una de las moléculas de diacuerpo del dímero. En aspectos aún más preferidos de esta divulgación, la unión covalente es un enlace disulfuro entre al menos un resto de cisteína en la primera cadena polipeptídica de cada una de las moléculas de diacuerpo que forman el dímero, en las que dicho al menos un resto de cisteína está ubicado en el tercer dominio de cada primera cadena polipeptídica.
En determinados aspectos de la divulgación, el primer dominio en la primera cadena polipeptídica puede estar en el extremo N del segundo dominio o puede estar en el extremo C del segundo dominio. El primer dominio en la primera cadena polipeptídica puede estar en el extremo N del tercer dominio o puede estar en el extremo C del tercer dominio. El segundo dominio en la primera cadena polipeptídica puede estar en el extremo N del primer dominio o puede estar en el extremo C del primer dominio. Además, el segundo dominio en la primera cadena polipeptídica puede estar en el extremo N del tercer dominio o puede estar en el extremo C del tercer dominio. Por consiguiente, el tercer dominio en la primera cadena polipeptídica puede estar en el extremo N del primer dominio o puede estar en el extremo C del primer dominio. El tercer dominio en la primera cadena polipeptídica puede estar en el extremo N del segundo dominio o puede estar en el extremo C del segundo dominio. Con respecto a la segunda cadena polipeptídica, el cuarto dominio puede estar en el extremo N del quinto dominio o puede estar en el extremo C del quinto dominio. El cuarto dominio puede estar en el extremo N del sexto dominio o puede estar en el extremo C del sexto dominio. El quinto dominio en la segunda cadena polipeptídica puede estar en el extremo N del cuarto dominio o puede estar en el extremo C del cuarto dominio. El quinto dominio en la segunda cadena polipeptídica puede estar en el extremo N del sexto dominio o puede estar en el extremo C del sexto dominio. Por consiguiente, el sexto dominio en la segunda cadena polipeptídica puede estar en el extremo N del cuarto dominio o puede estar en el extremo C del cuarto dominio. El sexto dominio en la segunda cadena polipeptídica puede estar en el extremo N del quinto dominio o puede estar en el extremo C del quinto dominio. Debe entenderse que cualquier combinación de los anteriores está abarcada en la presente divulgación.
En determinadas realizaciones, el primer dominio y el segundo dominio pueden estar ubicados en el extremo C del tercer dominio en la primera cadena polipeptídica; o el primer dominio y el segundo dominio pueden estar ubicados en el extremo N del tercer dominio en la primera cadena polipeptídica. Con respecto a la segunda cadena polipeptídica, el cuarto dominio y el quinto dominio pueden estar ubicados en el extremo C del sexto dominio o el cuarto dominio y el quinto dominio pueden estar ubicados en el extremo N del sexto dominio. En determinados aspectos de esta realización, la presente divulgación se refiere a un diacuerpo biespecífico covalentemente, que es un diacuerpo que es un dímero de moléculas de diacuerpo, comprendiendo cada molécula de diacuerpo una primera y una segunda cadena polipeptídica, cuya primera cadena polipeptídica comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítopo y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fc o parte de mismo, cuyo primer y segundo dominio están unidos covalentemente de modo que el primer y segundo dominio no se asocian para formar un sitio de unión a epítopo y en el que el tercer dominio está ubicado en el extremo N tanto del primero como del segundo dominio; y cuya segunda cadena polipeptídica comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1) y (iii) un sexto dominio que comprende al menos un resto de cisteína, cuyo cuarto y quinto dominio están unidos covalentemente de modo que el cuarto y quinto dominio no se asocian para formar un sitio de unión a epítopo; y en el que la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica de cada molécula de diacuerpo están unidas covalentemente, con la condición de que la unión covalente no sea un enlace peptídico; en el que el primer dominio y el quinto dominio de cada molécula de diacuerpo se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1)(VH1) que se une al primer epítopo; en el que el segundo dominio y el cuarto dominio de cada molécula de diacuerpo se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2)(VH2) que se une al segundo epítopo.
También se describe un diacuerpo tetraespecífico covalentemente, que es un diacuerpo que es un dímero de moléculas de diacuerpo, comprendiendo la primera molécula de diacuerpo una primera y una segunda cadena polipeptídica, cuya primera cadena polipeptídica comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítopo y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fc o parte de mismo, cuyo primer y segundo dominio están unidos covalentemente de modo que el primer y segundo dominio no se asocian para formar un sitio de unión a epítopo y en el que el tercer dominio está ubicado en el extremo N tanto del primer dominio como del segundo dominio; y cuya segunda cadena polipeptídica comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1) y (iii) un sexto dominio que comprende al menos un resto de cisteína, cuyo cuarto y quinto dominio están unidos covalentemente de modo que el cuarto y quinto dominio no se asocian para formar un sitio de unión a epítopo; y en el que la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están unidas covalentemente, con la condición de que la unión covalente no sea un enlace peptídico; en el que el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1)(VH1) que se une al primer epítopo; en el que el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2)(VH2) que se une al segundo epítopo; y la segunda molécula de diacuerpo comprende una primera y una segunda cadena polipeptídica, cuya primera cadena polipeptídica comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una tercera inmunoglobulina (VL3) específica para un tercer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una cuarta inmunoglobulina (VH4) específica para un cuarto epítopo y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fc o parte del mismo, cuyo primer y segundo dominio están unidos covalentemente de modo que el primer y segundo dominio no se asocian para formar un sitio de unión a epítopo y en el que el tercer dominio está ubicado en el extremo N tanto del primer dominio como del segundo dominio; y cuya segunda cadena polipeptídica comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la cuarta inmunoglobulina (VL4), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la tercera inmunoglobulina (VH3) y (iii) un sexto dominio que comprende al menos un resto de cisteína, cuyo cuarto y quinto dominio están unidos covalentemente de modo que el cuarto y quinto dominio no se asocian para formar un sitio de unión a epítopo; y en el que la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están unidas covalentemente, con la condición de que la unión covalente no sea un enlace peptídico; en el que el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL3)(VH3) que se une al tercer epítopo; en el que el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de (VL4)(VH4) que se une al cuarto epítopo.
Como se analiza anteriormente, los dominios en las cadenas polipeptídicas individuales están unidos covalentemente. En aspectos específicos, la unión covalente entre el primer y segundo dominio, el primer y tercer dominio, el segundo y tercer dominio, el cuarto y quinto dominio, el cuarto y sexto dominio, y/o el quinto y sexto dominio puede ser un enlace peptídico. En particular, el primer y segundo dominio, y el cuarto y quinto dominio pueden estar separados por el tercer dominio y el sexto dominio, respectivamente, o por restos de aminoácido adicionales, siempre que el primer y segundo, y cuarto y quinto dominios no se asocien para formar un sitio de unión. El número de restos de aminoácido puede ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 restos de aminoácido. En un aspecto preferido, el número de restos de aminoácido entre los dominios es 8.
En determinados aspectos de la molécula de diacuerpo, los dominios de la primera y segunda cadena polipeptídica que comprenden un dominio Fc, es decir, opcionalmente, el tercer y sexto dominio, respectivamente, pueden comprender además un dominio de bisagra de modo que el dominio comprenda una región de bisagra-Fc. En realizaciones alternativas, la primera cadena polipeptídica o la segunda cadena polipeptídica pueden comprender un dominio de bisagra sin que comprenda también un dominio Fc. Las cadenas pesadas, cadenas ligeras, regiones de bisagra, dominios Fc y/o dominios de bisagra-Fc para su uso en la molécula de diacuerpo pueden obtenerse de cualquier tipo de inmunoglobulina incluyendo IgA, IgD, IgE, IgG o IgM. En un aspecto preferido, el tipo de inmunoglobulina es IgG, o cualquier subtipo de la misma, es decir, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En otros aspectos, la inmunoglobulina de la que se obtienen las cadenas pesadas y ligeras está humanizada o quimerizada.
Además, el primer epítopo y el segundo epítopo y, cuando sea aplicable el tercer epítopo y el cuarto epítopo, al que se une el diacuerpo o molécula de diacuerpo pueden ser epítopos diferentes del mismo antígeno o pueden epítopos diferentes de antígenos diferentes. Los antígenos pueden ser cualquier molécula contra la que pueda generarse un anticuerpo. Por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, toxinas bacterianas, marcadores de superficie celular, marcadores autoinmunitarios, proteínas víricas, fármacos, etc. En aspectos particulares, al menos un sitio de unión a epítopo del diacuerpo es específico para un antígeno en una célula particular, tal como un linfocito B, un linfocito T, una célula fagocítica, un linfocito citolítico natural (NK) o una célula dendrítica.
En determinados aspectos de la presente invención, al menos un sitio de unión a epítopo del diacuerpo o molécula de diacuerpo es específico para un receptor de Fc, que es un receptor de Fc que puede ser un receptor de Fc activador o un receptor de Fc inhibidor. En aspectos particulares, el receptor de Fc es un receptor de Fcy, y el receptor de Fcy es un receptor FcyRI, FcyRII o FcyRIII. En aspectos más preferidos, el receptor FcyRIII es el receptor FcyRIIIA (CD16A) o el receptor FcyRIIIB (CD16B) y, más preferiblemente, el receptor FcyRIII es el receptor FcyRiIIA (CD16A). En otro aspecto preferido, el receptor FcyRII es el receptor FcyRIIA (CD32A) o el receptor FcyRIIB (CD32B) y, más preferiblemente, el receptor FcyRIIB (CD32B). En un aspecto particularmente preferido, un sitio de unión del diacuerpo es específico para CD32B y el otro sitio de unión es específico para CD16A. En una realización específica de la molécula de diacuerpo, al menos un sitio de unión a epítopo del diacuerpo o molécula de diacuerpo es específico para un receptor de Fc activador y al menos el otro sitio es específico para un receptor de Fc inhibidor. En determinados aspectos de esta realización, el receptor de Fc activador es CD32A y el receptor de Fc inhibidor es CD32B. En otros aspectos de esta realización, el receptor de Fc activador es BCR y el receptor de Fc inhibidor es CD32B. En otros aspectos más de esta realización, el receptor de Fc activador es IgERI y el receptor de Fc inhibidor es CD32B.
En casos donde un sitio de unión a epítopo es específico para CD16A, los dominios VL y VH pueden ser iguales a o similares o los dominios VL y VH del anticuerpo de ratón 3G8, cuya secuencia se ha clonado y se expone en la presente memoria. En otros casos donde un sitio de unión a epítopo es específico para CD32A, los dominios VL y VH pueden ser iguales a o similares a los dominios VL y VH del anticuerpo de ratón IV.3. En otros casos más donde un sitio de unión a epítopo es específico para CD32B, los dominios VL y VH pueden ser iguales a o similares o los dominios VL y VH del anticuerpo de ratón 2B6, cuya secuencia se ha clonado y se expone en la presente memoria. Debe entenderse que cualquiera de los dominios VL o VH de los anticuerpos 3G8, 2B6 e IV.3 puede usarse en cualquier combinación. También se describe un diacuerpo o molécula de diacuerpo biespecífico en el que el primer epítopo es específico para CD32B y el segundo epítopo es específico para CD16A.
En otros aspectos, un sitio de unión a epítopo puede ser específico para un antígeno patógeno. Tal como se usa en la presente memoria, un antígeno patógeno es un antígeno implicado en una enfermedad patógena específica, incluyendo cáncer, infección y enfermedad autoinmunitaria. Por tanto, el antígeno patógeno puede ser un antígeno tumoral, un antígeno bacteriano, un antígeno vírico o un antígeno autoinmunitario. Los antígenos patógenos ejemplares incluyen, aunque sin limitación, lipopolisacárido, antígenos víricos seleccionados del grupo que consiste en antígenos víricos del virus de la inmunodeficiencia humana, adenovirus, virus sincitial respiratorio, virus del Nilo occidental (por ejemplo, antígenos E16 y/o E53) y virus de la hepatitis, ácidos nucleicos (ADN y ARN) y colágeno. Preferiblemente, el antígeno patógeno es un antígeno neutralizante. En un aspecto preferido, cuando un sitio de unión a epítopo es específico para CD16A o CD32A, el otro sitio de unión a epítopo es específico para un antígeno patógeno excluyendo antígenos autoinmunitarios. En un aspecto preferido más, cuando un sitio de unión a epítopo es específico para CD32B, el otro sitio de unión a epítopo es específico para cualquier antígeno patógeno. En realizaciones específicas, la molécula de diacuerpo de la divulgación se une a dos antígenos diferentes en la misma célula, por ejemplo, un sitio de unión a antígeno es específico para un receptor de Fc activador mientras que otro es específico para un receptor de Fc inhibidor. En otras realizaciones, la molécula de diacuerpo se une a dos epítopos neutralizantes víricos distintos, por ejemplo, aunque sin limitación, E16 y E53 del virus del Nilo occidental.
Los diacuerpos de la divulgación pueden usarse para tratar una diversidad de enfermedades y trastornos. Se describe un método para tratar una enfermedad o trastorno, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de un diacuerpo o molécula de diacuerpo covalente de la divulgación en que al menos sitio de unión es específico para un antígeno patógeno, tal como un antígeno expresado en la superficie de una célula cancerosa o en la superficie de una bacteria o virión y al menos el otro sitio de unión es específico para un receptor de Fc, por ejemplo, CD16A.
También se describe un método para tratar una enfermedad o trastorno, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de un diacuerpo o molécula de diacuerpo de la divulgación, en que al menos un sitio de unión es específico para CD32B y al menos el otro sitio de unión es específico para CD16A.
También se describe un método para inducir tolerancia inmunitaria a antígeno patógeno, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de un diacuerpo covalente o molécula de diacuerpo covalente de la divulgación, en que al menos un sitio de unión es específico para CD32B y al menos el otro sitio de unión es específico para dicho antígeno patógeno. En aspectos de esta realización, el antígeno patógeno puede ser un alérgeno u otra molécula para la que se desea tolerancia inmunitaria, tal como una proteína expresada en tejido trasplantado.
También se describe un método para la desintoxicación, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de un diacuerpo o molécula de diacuerpo covalente de la divulgación, en que al menos un sitio de unión es específico para un marcador de superficie celular y al menos el otro sitio de unión es específico para una toxina. El diacuerpo de la divulgación administrado puede ser uno donde un sitio de unión es específico para un marcador de superficie celular tal como un Fc y el otro sitio de unión es específico para una toxina bacteriana o para un fármaco. El marcador de superficie celular puede no encontrarse en glóbulos rojos.
3.1 Definiciones
Salvo que se definan de otro modo, se pretende que todos los términos de la técnica, anotaciones y otros términos científicos o terminología usados en la presente memoria tengan los significados habitualmente comprendidos por los expertos en la materia a la que pertenece esta divulgación. En algunos casos, términos con significados habitualmente comprendidos se definen en la presente memoria por motivos de claridad y/o facilitar referencias, y la inclusión de dichas definiciones en la presente memoria no debe interpretarse necesariamente que represente una diferencia sustancial sobre lo que se entiende generalmente en la técnica. La práctica de la presente divulgación empleará, salvo que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica, química de ácidos nucleicos e inmunología, que pertenecen a las habilidades de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía, tal como, Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., ed., 1999, incluyendo los suplementos hasta 2001); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., ed., 1987, incluyendo los suplementos hasta 2001); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición (Sambrook y Russel, 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., ed., 1994); The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994); Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson, ed., Academic Press, 1996); Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W. H. Albert, y N. A. Staines, ed., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993), Harlow y Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999; y Beaucage et al. ed., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 2000).
Tal como se en la presente memoria, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" se refieren a anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos sintéticos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos policlonales, anticuerpos camelizados, Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fv biespecíficos unidos por disulfuro (sdFv), intracuerpos y anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id y anti-anti-Id contra anticuerpos de la divulgación), y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase.
Tal como se usa en la presente memoria, las expresiones "se une inmunoespecíficamente", "reconoce inmunoespecíficamente", "se une específicamente", "reconoce específicamente" y expresiones análogas se refieren a moléculas se unen específicamente a un antígeno (por ejemplo, epítopo o complejo inmunitario) y no se unen específicamente a otra molécula. Una molécula que se une específicamente a un antígeno puede unirse a otros péptidos o polipéptidos con menor afinidad, determinada por, por ejemplo, inmunoensayos, BIAcore y otros ensayos conocidos en la técnica. Preferiblemente, las moléculas que se unen específicamente a un antígeno no reaccionan de forma cruzada con otras proteínas. Las moléculas que se unen específicamente a un antígeno pueden identificarse, por ejemplo, por inmunoensayos, BIAcore u otras técnicas conocidas para los expertos en la materia.
Tal como se usa en la presente memoria, "complejo inmunitario" se refiere a una estructura que se forma cuando al menos una molécula diana y al menos un polipéptido que contiene región Fcy heteróloga se unen entre sí formando un complejo de mayor peso molecular. Ejemplos de complejos inmunitarios son complejos de antígeno-anticuerpo que pueden ser soluble o en forma de partícula (por ejemplo, un complejo de antígeno/anticuerpo en una superficie celular).
Tal como se usa en la presente memoria, las expresiones "cadena pesada", "cadena ligera", "región variable", "región estructural", "dominio constante" y similares tienen su significado habitual en la técnica de inmunología y se refieren a dominios en inmunoglobulinas de origen natural y los dominios correspondientes de proteínas de unión sintéticas (por ejemplo, recombinantes) (por ejemplo, anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos quiméricos, etc.). La unidad estructural básica de las inmunoglobulinas de origen natural (por ejemplo, IgG) es un tetrámero que tiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, habitualmente expresadas como una glucoproteína de aproximadamente 150000 Da. La parte del extremo amino ("N") de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. La parte del extremo carboxi ("C") de cada cadena define una región constante, con cadenas ligeras que tienen un único dominio constante y cadenas pesadas que habitualmente tienen tres dominios constantes y una región de bisagra. Por tanto, la estructura de las cadenas ligeras de una molécula de IgG es n-VL-CL-c y la estructura de las cadenas pesadas de IgG es n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (donde H es la región de bisagra). Las regiones variables de una molécula de IgG consisten en las regiones determinantes de complementariedad (CDR), que contienen los restos en contacto con el antígeno y segmentos que no son CDR, mencionados como segmentos estructurales, que en general mantienen la estructura y determinan la ubicación de los bucles CDR (aunque determinados restos estructurales también pueden entrar en contacto con el antígeno). Por tanto, los dominios Vl y Vh tienen la estructura n-FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4-c.
Cuando se hace referencia a proteínas de unión o anticuerpos (que se definen ampliamente en la presente memoria), la asignación de aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 y 1991). Los aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras maduras de las inmunoglobulinas se denominan por la posición de un aminoácido en la cadena. Kabat describió numerosas secuencias de aminoácidos para anticuerpos, identificó una secuencia de consenso de aminoácidos para cada subgrupo y asignó un número de resto a cada aminoácido. El esquema de numeración de Kabat es ampliable a anticuerpos no incluidos en su compendio mediante alineación del anticuerpo en cuestión con una de las secuencias de consenso de Kabat por referencia a los aminoácidos conservados. Este método para asignar números de resto se ha convertido en la norma en el campo e identifica fácilmente los aminoácidos en posiciones equivalentes en diferentes anticuerpos, incluyendo variantes quiméricas o humanizadas. Por ejemplo, un aminoácido en la posición 50 de una cadena ligera de anticuerpo humano ocupa la posición equivalente a un aminoácido en la posición 50 de una cadena ligera de anticuerpo de ratón.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "cadena pesada" se usa para definir la cadena pesada de un anticuerpo IgG. En una IgG nativa intacta, la cadena pesada comprende los dominios de inmunoglobulina VH, CH1 bisagra, CH2 y CH3. En toda la presente memoria descriptiva, la numeración de los restos en una cadena pesada de IgG es la del índice EU como en Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991). El "índice EU como en Kabat" se refiere a la numeración del anticuerpo humano IgG1 EU. Se muestran ejemplos de las secuencias de aminoácidos que contienen los dominios de bisagra, CH2 y CH3 de IgG 1 humana en las figuras 1A y 1B como se describe, infra. Las figuras 1A y 1B también exponen secuencias de aminoácidos de los dominios de bisagra CH2 y CH3 de las cadenas pesadas de IgG2, IgG3 e IgG4. Las secuencias de aminoácidos de los isotipos IgG2, IgG3 e IgG4 se alinean con las secuencias de IgG1 colocando el primer y último resto de cisteína de las regiones de bisagra respectivas, que forman los enlaces S-S entre las cadenas pesadas, en las mismas posiciones. Para la región de bisagra de IgG2 e IgG3, no todos los restos están numerados por el índice EU.
La "región de bisagra" o "dominio de bisagra" en general se define abarcando desde Glu216 hasta Pro230 de IgG1 humana. Se muestra un ejemplo de la secuencia de aminoácidos de la región de bisagra de IgG1 humana en la figura 1A (los restos de aminoácido en la figura 1A están enumerados de acuerdo con el sistema de Kabat. Las regiones de bisagra de otros isotipos de IgG pueden alinearse con la secuencia de IgG1 colocando el primer y el último resto de cisteína que forman los enlaces S-S entre las cadenas pesadas en las mismas posiciones como se muestra en la figura 1A.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "región Fc", "dominio Fc" o expresiones análogas se usan para definir una región en el extremo C de una cadena pesada de IgG. Se muestra un ejemplo de la secuencia de aminoácidos que contiene la IgG1 humana en la figura 1B. Aunque los límites pueden variar ligeramente, según se enumera de acuerdo con el sistema de Kabat, el dominio Fc se prolonga desde el aminoácido 231 hasta el aminoácido 447 (los restos de aminoácidos en la figura 1B están numerados de acuerdo con el sistema de Kabat). La figura 1B también proporciona ejemplos de las secuencias de aminoácidos de las regiones Fc de los isotipos de IgG IgG2, IgG3, e IgG4.
La región Fc de una IgG comprende dos dominios constantes, CH2 y CH3. El dominio CH2 de una región Fc de IgG humana habitualmente se prolonga desde el aminoácido 231 hasta el aminoácido 341 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (figura 1B). El dominio CH3 de una región Fc de IgG humana habitualmente se prolonga desde el aminoácido 342 hasta el 447 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (figura 1B). El dominio CH2 de una región Fc de IgG humana (también mencionada como dominio "Cy2" es único porque no se empareja mucho con otro dominio. En su lugar, dos cadenas glucídicas ramificadas unidas a N están interpuestas entre los dos dominios CH2 de una IgG nativa intacta.
Tal como se usa en la presente memoria, las expresiones "proteína de unión a FcyR", "anticuerpo contra FcyR" y "anticuerpo anti-FcYR", se usan indistintamente y se refieren a una diversidad de proteínas de tipo inmunoglobulina o derivadas de inmunoglobulina. Las "proteínas de unión a FcyR" se unen a FcyR mediante una interacción con los dominios Vl y/o Vh (que son distintos de la unión mediada a Fcy). Los ejemplos de proteínas de unión a FcyR incluyen anticuerpos completamente humanos, policlonales, quiméricos y humanizados (por ejemplo, que comprenden 2 cadenas pesadas y 2 ligeras), fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv), anticuerpos bifuncionales o multifuncionales (véase, por ejemplo, Lanzavecchia et al. (1987) "The Use Of Hybrid Hybridomas To Target Human Cytotoxic T Lymphocytes", Eur. J. Immunol. 17:105-111), anticuerpos monocatenarios (véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteins", Science 242:423-26), proteínas de fusión (por ejemplo, proteínas de fusión de presentación en fagos), "minicuerpos" (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5837821) y otras proteínas de unión a antígeno que comprenden un dominio Vl y/o Vh o fragmento del mismo. En un aspecto, la proteína de unión a FcyRIIIA es un "anticuerpo tetramérico", es decir, que tiene en general la estructura de una IgG de origen natural y que comprende dominios variables y constantes, es decir, dos cadenas ligeras que comprenden un domino VL y un dominio constante de cadena ligera y dos cadenas pesadas que comprenden un dominio VH y un dominio de bisagra y dominios constantes de cadena pesada.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "antagonistas de FcyR" y expresiones análogas se refieren a sustancias proteínicas y no proteínicas, incluyendo moléculas pequeñas que antagonizan al menos una actividad biológica de un FcyR, por ejemplo, bloquean la señalización. Por ejemplo, las moléculas de la divulgación bloquean la señalización bloqueando la unión de las IgG a un FcyR.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "derivado", en el contexto de polipéptidos o proteínas, se refiere a un polipéptido o proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que se ha alterado mediante la introducción de sustituciones, eliminaciones o adiciones de restos de aminoácido. El término "derivado", tal como se usa en la presente memoria, también se refiere a un polipéptido o proteína que se ha modificado, es decir, mediante adhesión covalente de cualquier tipo de molécula al polipéptido o proteína. Por ejemplo, aunque no a modo de limitación, un anticuerpo puede modificarse, por ejemplo, por glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica, unión a un antígeno celular u otra proteína, etc. Un polipéptido o proteína derivada puede producirse por modificaciones químicas usando técnicas conocidas para los expertos en la materia incluyen, aunque sin limitación, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, un polipéptido derivado a derivado de proteína posee una función similar o idéntica al polipéptido o proteína de la que se obtuvo. Tal como se usa en la presente memoria, el término "derivado", en el contexto de un derivado no proteínico, se refiere a una segunda molécula orgánico o inorgánica que se forma basándose en la estructura de una primera molécula orgánica o inorgánica. Un derivado de una molécula orgánica incluye, aunque sin limitación, una molécula modificada, por ejemplo, por la adición o eliminación de un grupo hidroxilo, metilo, etilo, carboxilo o amina. Una molécula orgánica también puede esterificarse, alquilarse y/o fosforilarse.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "molécula de diacuerpo" se refiere a un complejo de dos o más cadenas polipeptídicas o proteínas, comprendiendo cada una al menos un dominio VL y uno VH o fragmento del mismo, en el que ambos dominios están comprendidos dentro de una única cadena polipeptídica. En determinadas realizaciones, la "molécula de diacuerpo" incluye moléculas que comprenden un dominio Fc o de bisagra-Fc. Dichas cadenas polipeptídicas en el complejo pueden ser iguales o diferentes, es decir, la molécula de diacuerpo puede ser un homomultímero o un heteromultímero. En aspectos específicos, la "molécula de diacuerpo" incluye dímeros o tetrámeros o dichas cadenas polipeptídicas que contienen tanto un dominio VL como VH. Las cadenas polipeptídicas individuales que comprenden las proteínas multiméricas pueden unirse covalentemente a al menos otro péptido del multímero mediante enlaces disulfuro intercatenarios.
Tal como se usa en la presente memoria, los términos "trastorno" y "enfermedad" se usan indistintamente para hacer referencia a una afección en su sujeto. En particular, la expresión "enfermedad autoinmunitaria" se usa indistintamente con la expresión "trastorno autoinmunitario", para hacer referencia a una afección en un sujeto, caracterizada por lesión celular, tisular y/u orgánica causada por una reacción inmunológica del sujeto contra sus propias células, tejidos y/u órganos. La expresión "enfermedad inflamatoria" se usa indistintamente con la expresión "trastorno inflamatorio" para hacer referencia a una afección en un sujeto, caracterizada por inflamación, preferiblemente inflamación crónica. Los trastornos autoinmunitarios pueden estar asociados o no a inflamación. Además, la inflamación puede estar causada o no por un trastorno autoinmunitario. Por tanto, determinados trastornos pueden caracterizarse como trastornos tanto autoinmunitarios como inflamatorios.
"Cadenas polipeptídicas idénticas", tal como se usa en la presente memoria, también se refiere a cadenas polipeptídicas que tienen una secuencia de aminoácidos casi idéntica, por ejemplo, que incluye cadenas que tienen una o más diferencias de aminoácido, preferiblemente sustituciones conservativas de aminoácido, de modo que la actividad de las dos cadenas polipeptídicas no sea significativamente diferente.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "cáncer" se refiere a una neoplasia o tumor como resultado de un crecimiento incontrolado anómalo de células. Tal como se usa en la presente memoria, el cáncer incluye explícitamente leucemias y linfomas. En algunas realizaciones, el cáncer se refiere a un tumor benigno, que ha permanecido localizado. En otras realizaciones, el cáncer se refiere a un tumor maligno, que ha invadido y destruido estructuras corporales adyacentes y se ha propagado a sitios distantes. En algunas realizaciones, el cáncer está asociado a un antígeno cancero específico.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "agentes inmunomodulador" y variaciones de la misma se refieren a un agente que modula el sistema inmunitario de un hospedador. En determinadas realizaciones, un agente inmunomodulador es un agente inmunosupresor. En otras determinadas realizaciones, un agente inmunomodulador es un agente inmunoestimulador. Los agentes inmunomoduladores incluyen, aunque sin limitación, moléculas pequeñas, péptidos, polipéptidos, proteínas de fusión, anticuerpos, moléculas inorgánicas, agentes miméticos y moléculas orgánicas.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "epítopo" se refiere a un fragmento de un polipéptido o proteína o una molécula no proteínica que tiene actividad antigénica o inmunogénica en un animal, preferiblemente en un mamífero, y muy preferiblemente en un ser humano. Un epítopo que tiene actividad inmunogénica es un fragmento de un polipéptido o proteína que provoca una respuesta de anticuerpos en un animal. Un epítopo que tiene actividad antigénica es un fragmento de un polipéptido o proteína al que se une un anticuerpo inmunoespecíficamente como se determina por cualquier método bien conocido para los expertos en la materia, por ejemplo, por inmunoensayos. Los epítopos antigénicos no tienen que ser necesariamente inmunogénicos.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "fragmento" se refiere a un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 5 restos de aminoácido contiguos, al menos 10 restos de aminoácido contiguos, al menos 15 restos de aminoácido contiguos, al menos 20 restos de aminoácido contiguos, al menos 25 restos de aminoácido contiguos, al menos 40 restos de aminoácido contiguos, al menos 50 restos de aminoácido contiguos, al menos 60 restos de aminoácido contiguos, al menos 70 restos de aminoácido contiguos, al menos 80 restos de aminoácido contiguos, al menos 90 restos de aminoácido contiguos, al menos 100 restos de aminoácido contiguos, al menos 125 restos de aminoácido contiguos, al menos 150 restos de aminoácido contiguos, al menos 175 restos de aminoácido contiguos, al menos 200 restos de aminoácido contiguos, o al menos 250 restos de aminoácido contiguos de la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido. En una realización específica, un fragmento de un polipéptido retiene al menos una función del polipéptido.
Tal como se usa en la presente memoria, las expresiones "ácidos nucleicos" y "secuencias de nucleótidos" incluyen moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico), moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm), combinaciones de moléculas de ADN y ARN o moléculas de ADN/ARN híbridas, y análogos de moléculas de ADN o ARN. Dichos análogos pueden generarse usando, por ejemplo, análogos nucleotídicos que incluyen, aunque sin limitación, bases de inosina o tritiladas. Dichos análogos también pueden comprender moléculas de ADN o ARN que comprenden estructuras modificadas que confieren atributos beneficiosos a las moléculas tales como, por ejemplo, resistencia a nucleasa o una capacidad aumentada de cruzar membranas celulares. Los ácidos nucleicos o secuencias de nucleótidos pueden ser monocatenarias, bicatenarias, pueden contener tanto partes monocatenarias como bicatenarias y pueden contener partes tricatenarias, pero preferiblemente es ADN bicatenario.
Tal como se usa en la presente memoria, una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a esa cantidad del agente terapéutico suficiente para tratar o controlar una enfermedad o trastorno. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede referirse a la cantidad de agente terapéutico suficiente para retardar o minimizar la aparición de enfermedad, por ejemplo, retardar o minimizar la diseminación del cáncer. Una cantidad terapéuticamente eficaz también puede referirse a la cantidad del agente terapéutico que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o control de una enfermedad. Además, una cantidad terapéuticamente eficaz con respecto a un agente terapéutico de la divulgación significa la cantidad de agente terapéutico en solitario, o en combinación con otros tratamientos, que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o control de una enfermedad.
Tal como se usa en la presente memoria, las expresiones "agente profiláctico" y "agentes profilácticos" se refieren a cualquier agente o agentes que puedan usarse en la prevención de un trastorno, o prevención de recidiva o diseminación de un trastorno. Una cantidad profilácticamente eficaz puede referirse a la cantidad de agente profiláctico suficiente para prevenir la recidiva o diseminación de enfermedad hiperproliferativa, particularmente cáncer, o la aparición de ésta en un paciente, incluyendo, aunque sin limitación, los predispuestos a enfermedad hiperproliferativa, por ejemplo, los genéticamente predispuestos a cáncer o expuestos previamente a carcinógenos. Una cantidad profilácticamente eficaz también puede referirse a la cantidad del agente profiláctico que proporciona un beneficio profiláctico en la prevención de la enfermedad. Además, una cantidad profilácticamente eficaz con respecto a un agente profiláctico de la divulgación significa esa cantidad de agente profiláctico en solitario, o en combinación con otros agentes, que proporciona un beneficio profiláctico en la prevención de la enfermedad.
Tal como se usa en la presente memoria, los términos "prevenir", "previniendo" y "prevención" se refieren a la prevención de la recidiva o aparición de uno o más síntomas de un trastorno en un sujeto como resultado de la administración de un agente profiláctico o terapéutico.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "en combinación" se refiere al uso de más de un agente profiláctico y/o terapéutico. El uso de la expresión "en combinación" no restringe el orden en que se administran los agentes profilácticos y/o terapéuticos a un sujeto con un trastorno. Un primer agente profiláctico o terapéutico puede administrarse antes de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semanas, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes), simultáneamente con, o después de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas después) la administración de un segundo agente profiláctico o terapéutico a un sujeto con un trastorno.
"Función efectora", tal como se usa en la presente memoria, indica un evento bioquímico que es el resultado de la interacción de una región Fc de anticuerpo con un receptor de Fc a un antígeno. Las funcione efectoras incluyen, aunque sin limitación, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Las funciones efectoras incluyen tanto aquella que funcionan después de la unión de un antígeno como aquellas que funcionan independientemente de la unión a antígeno.
"Célula efectora", tal como se usa en la presente memoria, indica una célula del sistema inmunitario que expresa uno o más receptores de Fc y media una o más funciones efectoras. Las células efectoras incluyen, aunque sin limitación, monocitos, macrófagos, neutrófilos células dendríticas, eosinófilos, mastocitos, plaquetas, linfocitos B, linfocitos granulares grandes, células de Langerhans, linfocitos citolíticos naturales (NK) y pueden ser de cualquier organismo incluyendo, aunque sin limitación, seres humanos, ratones, ratas, conejos y monos.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "se une específicamente a un complejo inmunitario" y expresiones análogas se refieren a moléculas que se unen específicamente a un complejo inmunitario y no se unen específicamente a otra molécula. Una molécula que se une específicamente a un complejo inmunitario puede unirse a otros péptidos o polipéptidos con menor afinidad determinada por, por ejemplo, inmunoensayos, BIAcore y otros ensayos conocidos en la técnica. Preferiblemente, las moléculas que se unen específicamente a un complejo inmunitario no reaccionan de forma cruzada con otras proteínas. Las moléculas que se unen específicamente a un complejo inmunitario pueden identificarse, por ejemplo, por inmunoensayos, BIAcore u otras técnicas conocidas para los expertos en la materia.
Una "proteína de fusión estable", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una proteína de fusión que experimenta un nivel mínimo a no detectable de degradación durante la producción y/o almacenamiento, evaluado usando ensayos bioquímicos y funcionales comunes conocidos para un experto en la materia, y pueden almacenarse durante un periodo prolongado de tiempo sin pérdida en la actividad biológica, por ejemplo, unión a FcyR.
4. Breve descripción de los dibujos
FIG. 1 A-B Secuencia de aminoácidos de las regiones CHI, de bisagra y Fc de IgG humana
La figura 1 proporciona las secuencias de aminoácidos de los dominios de bisagra (A) y Fc (B) de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas. (Dominio de bisagra de IgG1 (SEQ ID NO: 1); dominio de bisagra de IgG2 (SEQ ID NO: 2); dominio de bisagra de IgG3 (SEQ ID NO: 3); dominio de bisagra de IgG4 (SEQ ID NO: 4); dominio Fc de IgG1 (SeQ ID NO: 5); dominio Fc de IgG2 (SEQ ID n O: 6); dominio Fc de IgG3 (SeQ ID NO: 7); dominio Fc de IgG1 (SEQ ID NO: 8)). Los restos de aminoácido mostrados en las figuras 1A y 1B están numerados de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat EU. Las secuencias de isotipo se alinean con las secuencias de IgG1 colocando el primer y último resto de cisteína de las regiones de bisagra respectivas, que forman los enlaces S-S entre las cadenas pesadas, en las mismas posiciones. Para la figura 1B, los restos en el dominio CH2 se indican por , mientras que los restos en el dominio CH3 se indican por ~.
FIG. 2 Representación esquemática de cadenas polipeptídicas de diacuerpos bifuncionales covalentes
Los polipéptidos de un diacuerpo bifuncional covalente consisten en un dominio VL de anticuerpo y un dominio VH de anticuerpo separados por un corto conector peptídico. El conector de 8 restos de aminoácido evita el autoensamblaje de una única cadena polipeptídica en construcciones scFv y, en su lugar, predominan las interacciones entre los dominios VL y VH de diferentes cadenas polipeptídicas. Se crearon 4 construcciones (cada construcción se describe desde el extremo amino ("n"),al lado izquierdo de la construcción, hasta el extremo carboxi ("c"), al lado derecho de la figura): la construcción (1) (SEQ ID NO: 9) comprendía, n- el dominio VL de Hu2B6, -conector (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio Vh de Hu3G8 - y una secuencia del extremo C (LGGC)-c; la construcción (2) (SEQ iD NO: 11) comprendía n- el dominio VL de Hu3G8 - conector (GGGSGGGG (SEQ iD NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - y una secuencia del extremo C (LGGC)-c; la construcción (3) (SeQ ID NO: 12) comprendía n- el dominio VL de Hu3G8 - conector (GGGSGGGG (SEQ iD NO: 10)) - el dominio Vh de Hu3G8 - y una secuencia del extremo C (LGGC)-c; la construcción (4) (SEQ ID NO: 13) comprendía n- el dominio VL de Hu2B6 - conector (GGGSGGGG (SeQ ID nO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - y una secuencia del extremo C (LGGC)-c. FIG. 3 Análisis de SDS-PAGE de diacuerpos purificados por afinidad
Los diacuerpos purificados por afinidad se sometieron a análisis de SDS-PAGE en condiciones reductoras (carriles 1-3) o no reductoras (carriles 4-6). Se indican los pesos moleculares aproximados del patrón (entre los carriles 3 y 4). Carriles 1 y 4, CMD de h3G8; carriles 2 y 5, CMD de h2B6; y carriles 3 y 6, CBD de h2B6-h3G8.
FIG. 4 A-B Análisis de SEC de diacuerpos purificados por afinidad
Los diacuerpos purificados por afinidad se sometieron a análisis SEC. (A) Perfil de elución de patrones conocidos: IgG de longitud completa (~150 kDa), fragmento Fab de IgG (~50 kDa) y scFv (~30 kDa); (B) perfil de elución de CMD de h2b6, CMD de h3G8 y CBD de h2B6-h3G8.
FIG. 5 Unión de CBD de h2B6-h3G8 a sCD32B y sCD16A
La unión del h2B6-h3G8 a sCD32B y sCD16A se ensayó en un ELISA emparedado. sCD32B se usó como proteína diana. La segunda sonda fue HRP conjugado a sCD16A. CMD de h3G8, que se une a CD16A, se usó como control.
FIG. 6 A-C Análisis de BIAcore de la unión del diacuerpo a sCD16A, sCD32B y sCD32B
La unión de CBD de h2B6-h3G8 CBD, CMD de h2B6 y CMD h3G8 a sCD16A, sCD32B y sCD32A (control negativo) se ensayó por análisis de SPR. También se ensayó scFv de h3G8 como control. (A) unión a sCD16; (B) unión a sCD32B y (C) unión a sCD32A. Los diacuerpos se inyectaron a una concentración de 100 NM, y scFv a una concentración de 200 nM, sobre las superficies de los receptores a un caudal de 50 ml/min durante 60 s.
FIG. 7 A-E Análisis de BIAcore de la unión del diacuerpo a sCD16A y sCD32B
La unión de h2B6-h3G8 CBD, CMD de h2B6 y CMD h3G8 a sCD16A, y sCD32B se ensayó por análisis de SPR. También se ensayó scFv de h3G8 como control. (A) unión del CMD de h3G8 a sCD16A; (B) unión del CBD de h2B6-h3G8 a sCD16A; (C) unión del scFv de h3G8 a sCD16A; (D) unión del CMD de h2B6 a sCD32B; y (E) unión del CBD de h2B6-h3G8 a sCD32B. Los diacuerpos se inyectaron a concentraciones de 6,25-200 nM sobre las superficies de los receptores a un caudal de 70 ml/min durante 180 s.
FIG. 8 Representación esquemática de la interacción de las cadenas polipeptídicas que comprenden los dominios VL y VH para formar una molécula de diacuerpo biespecífico covalente
NH2 y COOH representan el extremo amino y el extremo carboxi, respectivamente, de cada cadena polipeptídica. S representa el resto de cisteína del extremo C en cada cadena polipeptídica. VL y VH indican el dominio ligero variable y el dominio pesado variable, respectivamente. Las líneas punteadas y discontinuas son para distinguir entre las dos cadenas polipeptídicas y, en particular, representan las partes de conector de dichas cadenas. Fv de h2B6 y Fv de h3G8 indican un sitio de unión a epítopo específico para CD32B y CD16, respectivamente.
FIG. 9 Representación esquemática de las cadenas polipeptídicas que contiene dominios Fc de diacuerpos biespecíficos covalentes
La representación de las construcciones polipeptídicas de las moléculas de diacuerpo de la divulgación (cada construcción se describe desde el extremo amino ("n"), al lado izquierdo de la construcción, hasta el extremo carboxi ("c"), al lado derecho de la figura). La construcción (5) (SEQ ID NO: 14) comprendía n- el dominio VL de Hu2B6 - un primer conector (GGGSGGGG (SeQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu3G8 - un segundo conector (LGGC) - y un dominio Fc en el extremo C de IgG 1 humana-c; la construcción (6) (SEQ ID NO: 15) comprendía n- el dominio VL de Hu3G8 - conector (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - y un segundo conector (LGGC) - y un dominio Fc en el extremo C de IgG1 humana-c; la construcción (7) (SEQ ID NO: 16) comprendía n- el dominio VL de Hu2B6 - un primer conector (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu3G8 - y una secuencia del extremo C (Lg Gc FNRGEC) (SEQ ID NO: 17)-c; la construcción (8) (SEQ ID NO: 18) comprendía n- el dominio VL de Hu3G8 - conector (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - y un segundo conector (LGGC) -y un dominio de bisagra-Fc del extremo C de IgG 1 humana (con la sustitución de aminoácido A215V)-c.
FIG. 10 Unión de moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fc a sCD32B y sCD16A
La unión de moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fc a sCD32B y sCD16A se ensayó en un ELISA emparedado. Los diacuerpos ensayados se produjeron por 3 sistemas de expresión recombinante: cotransfección de pMGX669 y pMGX674, que expresan las construcciones 1 y 6, respectivamente; cotransfección de pMGX667 y pMGX676, que expresan las construcciones 2 y 5, respectivamente; y cotransfección de pMGX674 y pMGX676, que expresan las construcciones 5 y 6, respectivamente. sCD32B se usó como proteína diana. La sonda secundaria fue h Rp conjugado a sCD16A.
FIG. 11 Representación esquemática de la interacción de dos cadenas polipeptídicas que comprenden cada una un dominio Fc para formar un diacuerpo covalente bivalente
NH2 y COOH representan el extremo amino y el extremo carboxi, respectivamente, de cada cadena polipeptídica. S representa el al menos un enlace disulfuro entre un resto de cisteína en la segunda secuencia de conector de cada cadena polipeptídica. VL y VH indican el dominio ligero variable y el dominio pesado variable, respectivamente. Las líneas punteadas y discontinuas son para distinguir entre las dos cadenas polipeptídicas y, en particular, representan las partes del primer conector de dichas cadenas. CH2 y CH3 representan los dominios constantes CH2 y CH3 de un dominio Fc. h2B6 Fv y h3G8 Fv indican un sitio de unión a epítopo específico para CD32B y CD16, respectivamente.
FIG. 12 Unión de moléculas de diacuerpo que comprenden los dominios de bisagra/Fc a sCD32B y sCD16A La unión de moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fc a sCD32B y sCD16A se ensayó en un ELISA emparedado. Los diacuerpos ensayados se produjeron por 4 sistemas de expresión recombinante: cotransfección de pMGX669 pMGX674, que expresan las construcciones 1 y 6, respectivamente; cotransfección de pMGX669 pMGX678, que expresan las construcciones 2 y 8, respectivamente; cotransfección de pMGX677 pMGX674, que expresan las construcciones 7 y 6, respectivamente y cotransfección de pMGX677+ pMGX678, que expresan las construcciones 7 y 8 respectivamente. sCD32B se usó como proteína diana. La sonda secundaria fue HRP conjugado a sCD16A.
FIG. 13 Representación esquemática de la interacción de las cadenas polipeptídicas para formar una molécula de diacuerpo tetramérica
NH2 y COOH representan el extremo amino y el extremo carboxi, respectivamente, de cada cadena polipeptídica. S representa el al menos un enlace disulfuro entre un resto de cisteína en la segunda secuencia de conector de la cadena polipeptídica "más pesada" que alberga Fc y un resto de cisteína en la secuencia del extremo C de la cadena polipeptídica "más ligera" que no alberga Fc. Vl y VH indican el dominio ligero variable y el dominio pesado variable, respectivamente. Las líneas punteadas y discontinuas son para distinguir entre cadenas polipeptídicas y, en particular, representan las partes del primer conector de dichas cadenas más pesadas y el conector de dichas cadenas más ligeras. CH2 y CH3 representan los dominios constantes CH2 y CH3 de un dominio Fc. h2B6 Fv y h3G8 Fv indican un sitio de unión a epítopo específico para CD32B y CD16, respectivamente.
FIG. 14 Representación esquemática de cadenas polipeptídicas que contiene dominios Fc que forman diacuerpos biespecíficos covalentes
Representación de construcciones polipeptídicas que forman las moléculas de diacuerpo de la divulgación (cada construcción se describe desde el extremo amino ("n"), al lado izquierdo de la construcción, hasta el extremo carboxi ("c"), al lado derecho de la figura). La construcción (9) (SEQ ID NO: 19) comprendía n-un dominio de bisagra/Fc de IgG1 humana - el dominio VL de Hu3G8 - conector (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 -conector (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)- y una secuencia LGGC del extremo C-c; la construcción (10) (SEQ ID NO: 20) comprendía n-un dominio de Fc de IgG1 humana - el dominio VL de Hu3G8 - conector (GGGSGGGG (SEQ ID nO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - conector (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10))- y una secuencia LGGC del extremo C-c; la construcción (11) (SEQ ID NO: 21) comprendía n- el dominio VL de Hu2b6 (G105C) - conector (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10 - el dominio VH de Hu3G8 - y un dominio de bisagra/Fc del extremo C de IgG1 humana con la sustitución de aminoácido A215V-c; la construcción (12) (SEQ ID NO: 22) comprendía n- el dominio VL de Hu3G8 -conector (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 (g44C) - y una secuencia FNRGEC (SEQ ID NO: 23) del extremo C-c.
FIG. 15 A-B SDS-PAGE y análisis de transferencia de Western de diacuerpos tetraméricos de afinidad
Los diacuerpos producidos por sistemas de expresión recombinantes cotransfectado con vectores que expresan las construcciones 10 y 1, las construcciones 9 y 1 y las construcciones 11 y 12 se sometieron a análisis de SDS-PAGE en condiciones no reductoras (A) y análisis de transferencia de Western usando anticuerpo de cabra anti-IgG 1 H+L humana como sonda (B). Las proteínas en el gel SDS-PAGE se visualizaron con Simply Blue Safestain (Invitrogen). Para ambos paneles A y B, las moléculas de diacuerpo que comprenden las construcciones 10 y 1, las construcciones 9 y 1 y las construcciones 11 y 12A están en los carriles 1,2 y 3, respectivamente.
FIG. 16 Unión de moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fc y enlaces disulfuro intercatenarios genomanipulados a sCD32B y sCD16A
La unión de moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fc y enlaces disulfuro genomanipulados entre las cadenas polipeptídicas "más ligeras" y "más pesadas" a sCD32B y sCD16A se ensayó en un ELISA emparedado. Los diacuerpos ensayados se produjeron por 3 sistemas de expresión recombinante: construcciones de expresión 1 y 10, construcciones de expresión 1 y 9 y construcciones de expresión 11 y 12, respectivamente. sCD32B se usó como proteína diana. La sonda secundaria fue HRP conjugado a sCD16A. La unión de h3G8 se usó como control. FIG. 17 Representación esquemática de precursores de poliproteína de molécula de diacuerpo y representación esquemática de cadenas polipeptídicas que contienen cadena ligera lambda y/o dominios de bisagra Representación de las construcciones polipeptídicas que comprenden las moléculas de diacuerpo de la divulgación (cada construcción se describe desde el extremo amino ("n"), al lado izquierdo de la construcción, hasta el extremo carboxi ("c"), al lado derecho de la figura). La construcción (13) (SEQ ID NO: 95) comprendía n- el dominio VL de 3G8 - un primer conector (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de 2.4G2VH - un segundo conector (LGGC)- sitio de reconocimiento de furina (RAKR (SEQ ID NO: 93)-dominio VL de 2.4G2 - un tercer conector (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10))-el dominio VH de 3G8 - y un dominio LGGC del extremo C; (la secuencia de nucleótidos que codifica la SEQ ID NO: 95 se proporciona en la SEQ ID NO: 96). La construcción (14) (SEQ ID NO: 97) comprendía n- el dominio VL de 3G8 - un primer conector (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de 2.4G2VH - un segundo conector (LGGC)- sitio de reconocimiento de furina (RAKR (SEQ ID NO: 93))-sitio FMD (proteasa C3 del virus de la enfermedad glosopeda)- el dominio VL de 2.4G2 - un tercer conector (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10))-el dominio VH de 3G8 - y un dominio LGGC del extremo C; (la secuencia de nucleótidos que codifica la SEQ ID NO: 97 se proporciona en la SEQ ID NO: 98). La construcción (15) (SEQ ID NO: 99) comprendía n- el dominio VL de Hu2B6 - un conector (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu3G8 - y un dominio FNRGEC (SEQ ID NO: 23) del extremo C; (La secuencia de nucleótidos que codifica la SEQ ID NO: 99 se proporciona en la SEQ ID nO: 100). La construcción (16) (SEQ ID NO: 101) comprendía n-el dominio VL de Hu3G8 un conector (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - y un dominio VEPKSC (SEQ ID NO: 77) del extremo C; (la secuencia de nucleótidos que codifica la SEQ ID NO: 101 se proporciona en la SEQ ID NO: 102). FIG. 18 Unión de moléculas de diacuerpo derivadas de una molécula precursora de poliproteína a mCD32B y sCD16A
La unión de las moléculas de diacuerpo derivadas de construcción 13 de la molécula precursora de poliproteína (SEQ ID NO: 95) a CD32B murina (mCD32B) y CD16A soluble (sCD16A) se ensayó en un ELISA emparedado. mCD32B se usó como proteína diana. La sonda secundaria fue biotina conjugada sCD16A.
FIG. 19 Unión de moléculas de diacuerpo que comprenden la cadena lambda y/o los dominios de bisagra a sCD32B ysCD16A
La unión de moléculas de diacuerpo que comprenden dominios derivados del extremo C de la cadena ligera lambda human y el dominio de bisagra de IgG a sCD32B y sCD16A se ensayó y comparó con el diacuerpo que comprende las construcciones 1 y 2 (figura 5) en un ELISA emparedado. Los diacuerpos ensayados se produjeron por el sistema de expresión recombinante que expresa las construcciones 15 y 16 (SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 101, respectivamente). sCD32B se usó como proteína diana. La sonda secundaria fue HRP conjugado a sCD16A. Las barras con recuadros pequeños representan la combinación de construcciones 15/16 mientras que las barras con recuadros grandes representan la combinación de construcciones 1/2.
FIG. 20 Representación esquemática de 2B6/4420 DART unido a CD32B ubicado en la superficie de una célula y una molécula conjugada con fluoresceína
El diagrama muestra la flexibilidad del brazo antifluoresceína "adaptador universal" del DART, así como la posibilidad de sustituir otras especificidades en el brazo de 2B6. Las regiones V se muestran como recuadros, los conectores GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10) se muestran como líneas, el enlace disulfuro se muestra conectando las dos cadenas. Los constituyentes de una cadena se muestran en azul mientras que el otro está de color rosa. N, extremo amino; C, extremo carboxi; FL fluoresceína, VL región variable de cadena ligera; VH región variable de cadena pesada.
FIG. 21 (Paneles A y B) El 2B6/4420 DART se une específicamente a moléculas conjugadas con fluoresceína y puede unirse simultáneamente a CD32B.
(A) 2B6/4420 o 2B6/3G8 se unieron a placas de ELISA recubiertas con FITC-proteína S. La unión y función del brazo de 2B6 se detectó por acoplamiento de CD32B soluble, seguida de un anticuerpo específico por CD32B y un anticuerpo de detección secundario conjugado con HRP. (B) 2B6/4420 o 2B6/3G8 se unieron a placas de ELISA recubiertas con HuIgG o FITC-HuIgG (conjugado con fluoresceína). La unión se detectó por acoplamiento con un suero policlonal específico para 2B6 Fv seguido de un anticuerpo secundario conjugado con HRP.
FIG. 22 (Paneles A y B) Activación de linfocitos B purificados usando anticuerpos anti-CD79B humana.
Los linfocitos B purificados se activaron usando concentraciones crecientes de anticuerpos anti-CD79b humana conjugado con FiTC, CB3.1-FITC (A) o CB3.2-FITC (B) y 50 |ug/ml del fragmento F(ab')2 de Fc de IgG GAM específico (eje de abscisas). Los linfocitos B se activaron en presencia de PBS (barras blancas) o 5 |ug/ml de aFITCaCD32BDART (barras negras) o aCD16aCD32BDART (barras grises. Las reacciones se realizaron por triplicado y se calcularon las deviaciones típicas.
FIG. 23 (Paneles A y B) Activación de linfocitos B purificados
Los linfocitos B purificados de un segundo donador sano se activaron como se describe en la figura 22, panel B. El índice de proliferación se midió en células activadas en presencia del anticuerpo anti-CD79b conjugado con FITC CB3.2-FITC (A) y se comparó con el índice de proliferación de células activadas en presencia de anticuerpo CB3.2 no marcado (B).
FIG. 24 (Paneles superior e inferior) Reducción de linfocito B de ratón in vivo en ratones transgénicos HCD16A/B usando MGD261
A ratones mCD32-/- hCD16A+ C57B1/6, mCD32-/- hCD32B+ C57B1/6 y mCD32-/- hCD16A+ hCD32B+ C57B1/6 de la colonia de cría MacroGenics se les inyectó IV en los días 0, 3, 7, 10, 14 y 17 MGD261 (10, 3, 1 o 0,3 mg/kg), o un anticuerpo irrelevante (hE16 10 mg/kg). Se recogió sangre en los días -19 (antes de la exanguinación) 4, 11, 18, 25 y 32 para análisis FACS. La salud del animal y la actividad se registraron tres veces a la semana. Panel superior: h2B6-3G8 y mAb WNV; Panel inferior: ratones h2B6-3G8 -hCD16A o -hCD32B y ratones mAb WNV -hCD16A o -hCD32B.
FIG. 25 Reducción de linfocitos B de ratón in vivo en ratones transgénicos HCD16A/B usando DB 2.4G2-3G8 A ratones mCD16-/-, mCD16-/- hCD16A+ C57B1/6, mCD16-/- hCD16B+ y mCD16-/- hCD16A+ hCD16B+ de la colonia de cría MacroGenics se les inyectó IP en los días 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16 y 18 DB 2.4G2-3G8 (75 ug/ratón), o PBS. Se recogió sangre en los días -10 (antes de la exanguinación) 4, 11 y 18 para análisis FACS. La salud del animal y la actividad se registraron tres veces a la semana.
FIG. 26 Demostración de actividad antitumoral de MGD261 usando un modelo intravenoso (IV) de la línea de células tumorales humana Raji.
A ratones mCD16-/-, hCD16A+, RAG1-/- C57B1/6 de doce-veinte semanas de edad de la colonia de cría MacroGenics se les inyectó IV en el día 05 x 106 células Raji. En los días 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27 y 30 los ratones también se trataron por vía intraperitoneal (IP) con 250, 25 o 2,5 ug de MGD261 o con PBS (control negativo). Los ratones entonces se observaron diariamente y se registró el peso corporal dos veces a la semana. Los ratones que desarrollaban parálisis de las extremidades posteriores se sacrificaron.
FIG. 27 Expresión de DART en un hospedador que no es mamífero
Las células BL21DE3 (Novagen) se transformaron con el plásmido pET25b(+) T7-lac+ 3G8/3G8 y se usó una colonia resistente a amp para sembrar el caldo de cultivo. Cuando el cultivo alcanzó 0,5 unidades de DO 600, se añadió IPTG 0,5 mM para inducir la expresión. El cultivo se cultivó a 30 °C durante 2 horas y se recogió el medio sin células.
FIG. 28 ELISA de DART
Se realizó ELISA de unión a DART h3G8-h3G8 usando placas Maxisorp de 96 pocillos. Después de la reacción, la placa se lavó con PBS-T tres veces y se reveló con 80 |jl/pocillo de sustrato TMB. Después de 5 minutos de incubación, la reacción se detuvo mediante 40 ^l/pocillo de H2SO4 al 1 %. La DO 450 nm se leyó usando un lector de placa de 96 pocillos y el programa informático SOFTmax. La lectura se representó usando el programa informático GraphPadPrism 3.03.
FIG. 29 Muerte de linfocitos B humanos inducida por DART
Se incubaron PBMC humanos durante una noche con las moléculas indicadas. La apoptosis se ensayó por análisis FACS como el porcentaje de la población PI+Anexina-V+ de linfocitos B (células CD20+) en la población total no seleccionada FSC/SSC.
FIG. 30 Construcciones de DART 8B5-CB3.1
Se produjeron múltiples construcciones de DART 8B5-CB3.1 DART para ilustrar la presente divulgación. La construcción 5 y 6, o 6 y 7, u 8 y 9, o 9 y 10, codificadas en plásmidos de expresión se cotransfectaron en células HEK-293 para expresar DART 8B5-CB3.1 con o sin marca antiflag usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). El medio acondicionado se recogió cada tres días por tres veces. El medio acondicionado entonces se purificó usando columna de afinidad por CD32B.
FIG. 31 ELISA de DART 8B5-CB3.1
Se realizó ELISA de competición de DART 8B5-CB3.1/ch8B5 usando placas Maxisorp de 96 pocillos. Después de la reacción, la placa se lavó con PBS-T tres veces y se reveló con 80 jl/pocillo de sustrato TMB. Después de 5 minutos de incubación, la reacción se detuvo mediante 40 ^l/pocillo de H2SO4 al 1 %. La DO 450 nm se leyó usando un lector de placa de 96 pocillos y el programa informático SOFTmax. La lectura se representó usando el programa informático GraphPadPrism 3.03.
FIG. 32 Ilustración esquemática de la estructura DART tetravalente
Ilustra la estructura general de una especie de DART producida mediante ensamblaje de cuatro cadenas polipeptídicas. Los cuatro dominios de unión a antígeno del DART del tipo Ig se muestran como elipses con bandas y gris oscuro.
FIG. 33 DART tetravalente de tipo Ig
Proporciona un esquema de los sitios de unión a epítopo de un DART tetravalente de tipo Ig.
FIG. 34 ELISA de unión de mCD32-hCD16A
Proporciona los resultados de los ELISA que demuestran que la especie de DART tetravalente de tipo Ig del ejemplo 6.10 se une al antígeno con mayor afinidad que el anticuerpo de control (mAb chmCD32) u otras especies de DART. FIG. 35 Ilustración esquemática de moléculas de DART de Ig
Proporciona un esquema de moléculas de DART de Ig. La especificidad se indica por regiones con sombreado, patrón o de color blanco, las regiones constantes se muestran en negro y los enlaces disulfuro se indican por líneas negras de puntos. Los extremos N de todas las cadenas proteínicas están orientadas hacia la parte superior de la figura, mientras que los extremos C de todas las cadenas proteínicas están orientadas hacia la parte inferior de la figura. Las ilustraciones A-E son biespecíficas y las ilustraciones F-J son triespecíficas. Las ilustraciones A y E son tetravalentes. Las ilustraciones B, C, F, I y J son hexavalentes. Las ilustraciones D, G y H son octavalentes. Remítase a las figuras 1,2, 9, 14 y 17 y a la sección 3.1 para descripciones detalladas de los dominios individuales. FIG. 36 Capacidad de unión del diacuerpo biespecífico Hu2B64.5-Hu3G85.1
La figura 36 muestra la capacidad del diacuerpo biespecífico Hu2B64.5-Hu3G85.1 (cuadrados) de unirse a CD32b y CD16a con respecto a los diacuerpos Hu2B64.5 o Hu3G85.1 (triángulos).
FIG. 37 Esquema de derivados de DART de enrollamiento-E y enrollamiento-K
La figura 37 ilustra la conformación general de derivados de DART de enrollamiento-E y enrollamiento-K.
FIG. 38 Disposición de hélices de separadores de enrollamiento-E y enrollamiento-K preferidos
La figura 38 muestra la disposición de las hélices de la secuencia de "enrollamiento-E" preferida (EVAALEK)4 (SEQ ID NO: 299 y la secuencia de "enrollamiento-K" preferida (KVAALKE)4 (SEQ ID NO: 300).
FIG. 39 Derivados de DART que contienen Fc de enrollamiento-E y enrollamiento-K
La figura 39 ilustra las diferentes especies de derivados de DART que contienen Fc de enrollamiento-E y enrollamiento-K que pueden formarse mediante intercambio de cadenas.
FIG. 40 Cromatografía de exclusión molecular en derivados de enrollamiento-E y/o enrollamiento-K y derivados que contienen Fc de enrollamiento-E y/o enrollamiento-K de DART h2B6YAhCB3
La figura 40 muestra los resultados de la cromatografía de exclusión molecular sobre derivados de enrollamiento-E y/o enrollamiento-K y derivados que contienen Fc de enrollamiento-E y/o enrollamiento-K de DART h2B6YAhCB3. Se analizaron cuatro especies de dichas moléculas; todas tenían un enrollamiento-E y un enrollamiento-K: EK (sin región Fc), 2,1 mg; EFc/K (Fc ligado a enrollamiento-E), 2,7 mg; E/KFc (Fc ligado a enrollamiento-K), 1,8 mg; EFc/KFc (Fc ligado al enrollamiento-K y el enrollamiento-E del mismo DART), 2,0 mg.
FIG. 41 Estructura de moléculas diméricas producidas
La figura 41 muestra la posible estructura de la molécula dímera producida identificada en el cromatograma de exclusión molecular de la figura 40.
FIG. 42 Análisis electroforético en gel de SDS-poliacrilamida de los derivados de enrollamiento-E y/o enrollamiento-K y derivados que contienen Fc de enrollamiento-E y/o enrollamiento-K de DART h2B6YAhCB3
La figura 42 muestra los resultados de un análisis electroforético en gel de SDS-poliacrilamida de las fracciones obtenidas de la cromatografía de exclusión molecular (figura 40) de derivados de enrollamiento-E y/o enrollamiento-K y derivados que contienen Fc de enrollamiento-E y/o enrollamiento-K de DART h2B6YAhCB3. Carriles flanqueantes: controles de marcador molecular; carril 1: EK (sin región Fc); carril 2: EFc/K, fracción agregada; carril 3: EFc/K, fracción monomérica; carril 4: E/KFc, fracción agregada; carril 5: E/KFc, fracción monomérica; carril 6: EFc/KFc, fracción agregada; carril 7: EFc/KFc, fracción dimérica; carril 8: EFc/KFc, fracción monomérica.
FIG. 43 Análisis de ELISA de unión biespecífica de
La figura 43 muestra el resultado de un ELISA de unión biespecífica que compara derivados de DART h2B6YAhCB3 que contienen Fc de enrollamiento-E / enrollamiento-K (EFc/K o E/KFc), DART h2B6YAhCB3, control y un derivado de DART h2B6YAhCB3 EFc/KFc.
FIG. 44 Capacidad de los derivados de enrollamiento-E y/o enrollamiento-K y derivados que contienen Fc de enrollamiento-E y/o enrollamiento-E y/o enrollamiento-K de DART h2B6YAhCB3 de inhibir la proliferación de linfocitos T
La figura 44 muestra la capacidad de los derivados de enrollamiento-E y/o enrollamiento-K y derivados que contienen Fc de enrollamiento-E y/o enrollamiento-K de DART h2B6YAhCB3 de inhibir la proliferación de linfocitos T.
FIG. 45 ABD-DART hCD16-hCD32B
La figura 45 muestra un esquema de una molécula de anticuerpo recombinante, ABD-DART hCD16-hCD32B compuesto del dominio ABD3 de la proteína G de estreptococos fusionado a un DART biespecífico recombinante que es inmunorreactivo con los antígenos hCD16 y hCD32B.
FIG. 46A/46B Afinidad de unión de ABD-DART hCD16-hCD32B usando ELISA específico doble
Se recubrieron placas de ELISA con antígeno CD16 (figura 46A) o seroalbúmina humana (figura 46B) a una concentración de 2 gg/ml. Se unieron concentraciones variables de Ab D-DART hCD16-hCD32B (■) y DART hCD16-hCD32B de control (o) empezando con 2 gg/ml. Se añadió antígeno sCD32B biotinilado a la placa seguido de HRP conjugado con estreptavidina para la detección.
FIG. 47 Citotoxicidad mediada por PBMC de proteínas de DART
Citotoxicidad mediada por PBMC de proteínas de DART. Se realizaron ensayos de ADCC usando líneas de linfocitos B humanos, Daudi como células diana incubadas con PBMC como células efectoras. Se hicieron ensayos individuales por triplicado a una relación de efector a diana de 20:1 y una titulación de anticuerpos: DART hCD16A-hCD32B (•) y Ab D DART hCD16A-hCD32B (■). La citotoxicidad celular se midió por ensayo de liberación de LDH. La curva inferior a 100 es ABD DART hCD16A-hCD32B (■).
FIG. 48 Propiedades farmacocinéticas mejoradas de ABD-DART hCD16-hCD32B en ratones C57B1/6
A ratones (n=3) se les inyectó una única inyección intravenosa de (A) ABD-DART hCD16-hCD32B (•) y (B) DART hCD16-hCD32B (▲) a 5 mg/kg. Se recogió suero de ratón en diversos puntos temporales y se cuantificaron las concentraciones de proteína en suero por ELISA. Se realizaron cálculos farmacocinéticos usando WinNonlin Professional 5.1.
FIG. 49A-E Actividad de DART HER2 x TCRb sobre un panel de líneas celulares que expresan bajo contenido de HER2
Se ensayaron moléculas de DART que tienen dominios de unión a Her2 y receptor de linfocitos T (TCR) para su capacidad de mediar la citotoxicidad en múltiples líneas celulares de cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer de vejiga que se habían caracterizado previamente por mostrar bajos niveles de expresión de HER2 (y, por tanto, que son resistentes a tratamiento con el anticuerpo anti-Her2/neu, Herceptin®. Las líneas celulares de cáncer de mama ensayadas son ZR75-1 (HER2 2+) (figura 49A), MCF-7 (HER2 1+) (figura 49B) y MDA-MB468 (HER2-ve) (figura 49C). Las líneas celulares que no son de cáncer de mama ensayadas son HT-29 (línea celular de cáncer de colon) (figura 49D) y SW780 (línea celular de cáncer de vejiga) (figura 49e).
5. Descripción de las realizaciones preferidas
Cada cadena polipeptídica de la molécula de diacuerpo comprende un dominio VL y un dominio VH, que están unidos covalentemente de modo que los dominios tengan limitado su autoensamblaje. La interacción de dos de las cadenas polipeptídicas producirá dos emparejamientos VL-VH, formando dos sitios de unión a epítopo, es decir, una molécula bivalente. Cuando los dominios VL y VH se obtienen del mismo anticuerpo, las dos cadenas polipeptídicas complementarias pueden ser idénticas. Por ejemplo, cuando los dominios de unión se obtienen de un anticuerpo específico por epítopo A (es decir, el dominio de unión se forma a partir de una interacción de VLa-VHa , cada polipéptido comprenderá un VHa y un VLa . La homodimerización de dos cadenas polipeptídicas del anticuerpo provocará la formación de dos sitios de unión VLa-VHa, provocando un anticuerpo monoespecífico bivalente. Cuando los dominios VL y VH se obtienen de anticuerpos específicos para antígenos diferentes, la formación de un diacuerpo biespecífico funcional requiere la interacción de dos cadenas polipeptídicas diferentes, es decir, la formación de un heterodímero. Por ejemplo, para un diacuerpo biespecífico, una cadena polipeptídica comprenderá un VLa y un VLB; la homodimerización de dicha cadena provocará la formación de dos sitios de unión VLA-VHB, sin unión o de unión impredecible. Por el contrario, cuando dos cadenas polipeptídicas diferentes pueden interactuar libremente, por ejemplo, en un sistema de expresión recombinante, comprendiendo una un VLA y un VHB y comprendiendo la otra un VLb y un VHa , se formarán dos sitios de unión diferentes: VLa-VHa y VLb-VHb. Para todos los pares de cadenas polipeptídicas de diacuerpo, la posibilidad de alineación incorrecta o unión incorrecta de las dos cadenas es una posibilidad, es decir, la interacción de dominios VL-VL o VH-VH; sin embargo, la purificación de diacuerpos funcional se controla fácilmente basándose en la inmunoespecificidad del sitio de unión dimerizado apropiadamente usando cualquier método basado en afinidad conocido o ejemplificado en la presente memoria, por ejemplo, cromatografía de afinidad.
En otras realizaciones, una o más de las cadenas polipeptídicas del diacuerpo comprende un dominio Fc. Los dominios Fc en las cadenas polipeptídicas de las moléculas de diacuerpo dimerizan preferentemente, provocando la formación de una molécula de diacuerpo que muestra propiedades de tipo inmunoglobulina, es decir interacciones de Fc-FcyR. Los diacuerpos que comprende Fc pueden ser dímeros, por ejemplo, compuestos de dos cadenas polipeptídicas, comprendiendo cada uno un dominio VH, un domino VL y un dominio Fc. La dimerización de dichas cadenas polipeptídicas provoca un diacuerpo bivalente que comprende un domino Fc, aunque con una estructura distinta de la de un anticuerpo bivalente no modificado (figura 11). Dichas moléculas de diacuerpo mostrarán fenotipos alterados con respecto a una inmunoglobulina de tipo silvestre, por ejemplo, semivida en suero alterada, propiedades de unión, etc. En otras realizaciones, las moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fc pueden ser tetrámeros. Dichos tetrámeros comprenden dos cadenas polipeptídicas "más pesadas", es decir, una cadena polipeptídica que comprende un dominio VL, uno VH y uno Fc, y dos cadenas polipeptídicas "más ligeras", es decir, cadena polipeptídica que comprende un VL y un VH. Dichas cadenas más ligeras y más pesadas interactúan formando un monómero, y dichos monómeros interactúan mediante sus dominios Fc sin emparejar para formar una molécula de tipo Ig. Dicho diacuerpo de tipo Ig es tetravalente y puede ser monoespecífico, biespecífico o tetraespecífico.
Los al menos dos sitios de unión de la molécula de diacuerpo pueden reconocer el mismo epítopo o diferentes. Los epítopos diferentes pueden ser del mismo antígeno o epítopos de diferentes antígenos. En una realización, los epítopos son de diferentes células. En otra realización, los epítopos son antígenos de superficie celular en la misma célula o virus. Los sitios de unión a epítopo pueden reconocer cualquier antígeno contra el que pueda generarse un anticuerpo. Por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, toxinas bacterianas, marcadores de superficie celular, marcadores autoinmunitarios, proteínas víricas, fármacos, etc. En aspectos particulares, al menos un sitio de unión a epítopo del diacuerpo es específico para un antígeno en una célula particular, tal como un linfocito B, o linfocito T, una célula fagocítica, un linfocito citolítico natural (NK) o una célula dendrítica.
Cada dominio de la cadena polipeptídica del diacuerpo, es decir, el dominio VL, VH y Fc, puede estar separado por un conector peptídico. El conector peptídico puede ser de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 aminoácidos. En determinadas realizaciones, la secuencia conectora de aminoácidos es GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10) codificada por la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 74).
En determinadas realizaciones, cada cadena polipeptídica de la molécula de diacuerpo se genomanipula para que comprenda al menos un resto de cisteína que interactuará con al menos un resto de cisteína equivalente en una segunda cadena polipeptídica de la divulgación para formar un enlace disulfuro intercatenario. Dichos enlaces disulfuro intercatenarios sirven para estabilizar la molécula de diacuerpo, mejorando la expresión y recuperación en sistemas recombinantes, provocando una formulación estable y coherente, así como mejorando la estabilidad del producto aislado y/o purificado in vivo. Dicho al menos un resto de cisteína puede introducirse como un único aminoácido o como parte de una secuencia de aminoácidos más grande, por ejemplo, dominio de bisagra, en cualquier parte de la cadena polipeptídica. En una realización específica, dicho al menos un resto de cisteína se genomanipula para que se produzca en el extremo C de la cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, dicho al menos un resto de cisteína se introduce en la cadena polipeptídica dentro de la secuencia de aminoácidos LGGC. En una realización específica, el extremo C de la cadena polipeptídica que comprende la molécula de diacuerpo de la divulgación comprende la secuencia de aminoácidos LGGC. En otra realización, dicho al menos un resto de cisteína se introduce en el polipéptido dentro de una secuencia de aminoácidos que comprende un dominio de bisagra, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 4. En una realización específica, el extremo C de una cadena polipeptídica de la molécula de diacuerpo de la divulgación comprende la secuencia de aminoácidos de un dominio de bisagra de IgG, por ejemplo, SEQ ID NO: 1. En otra realización, el extremo C de una cadena polipeptídica de una molécula de diacuerpo de la divulgación comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 77), que puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 78). En otras realizaciones, dicho al menos un resto de cisteína se introduce en la cadena polipeptídica dentro de la secuencia de aminoácidos LGGCFNRGEC (SEQ ID NO: 17), que puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 76). En una realización específica, el extremo C de la cadena polipeptídica que comprende el diacuerpo de la divulgación comprende la secuencia de aminoácidos LGGCFNRGEC (SEQ ID NO: 17), que puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 76). En otras realizaciones más, dicho al menos un resto de cisteína se introduce en la cadena polipeptídica dentro de la secuencia de aminoácidos FNRGEC (SEQ ID NO: 23), que puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 75). En una realización específica, el extremo C de una cadena polipeptídica que comprende el diacuerpo de la divulgación comprende la secuencia de aminoácidos FNRGEC (SEQ ID NO: 23), que puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 75).
En determinadas realizaciones, la molécula de diacuerpo comprende al menos dos cadenas polipeptídicas, comprendiendo cada una de ellas la secuencia de aminoácidos LGGC y estando unida covalentemente por un enlace disulfuro entre los restos de cisteína en dichas secuencias LGGC. En otra realización específica, la molécula de diacuerpo comprende al menos dos cadenas polipeptídicas, comprendiendo una de ellas la secuencia FNRGEC (SEQ ID NO: 23) mientras la otra comprende un dominio de bisagra (que contiene al menos un resto de cisteína), en la que dichas al menos dos cadenas polipeptídicas están unidas covalentemente por un enlace disulfuro entre el resto de cisteína en FNRGEC (SEQ ID NO: 23) y un resto de cisteína en el dominio de bisagra. En aspectos particulares, el resto de cisteína responsable del enlace disulfuro ubicado en el dominio de bisagra es Cys-128 (numerado de acuerdo con Kabat EU; ubicado en el dominio de bisagra de una cadena pesada de IgG intacta sin modificar) y el resto de cisteína equivalente en la SEQ ID NO: 23 es Cys-214 (numerada de acuerdo con Kabat EU; ubicada en el extremo C de una cadena ligera de IgG intacta sin modificar) (Elkabetz et al. (2005) "Cysteines In CH1 Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains", J. Biol. Chem. 280:14402-14412). En otras realizaciones más, el al menos un resto de cisteína se genomanipula para que se produzca en el extremo N de la cadena de aminoácidos. En otras realizaciones más, el al menos un resto de cisteína se genomanipula para que se produzca en la parte de conector de la cadena polipeptídica de la molécula de diacuerpo. En realizaciones adicionales, el dominio VH o VL se genomanipula para que comprenda al menos una modificación de aminoácido con respecto al dominio VH o VL precursor de modo que dicha modificación de aminoácido comprende una sustitución de un aminoácido precursor con cisteína.
La divulgación abarca moléculas de diacuerpo que comprenden un dominio Fc o parte del mismo (por ejemplo, un dominio CH2 o dominio CH3). El dominio Fc o parte del mismo puede obtenerse de cualquier isotipo o alotipo de inmunoglobulina incluyendo, aunque sin limitación, IgA, IgD, IgG, IgE e IgM. En realizaciones preferidas, el dominio Fc (o parte del mismo) se obtiene de IgG. En realizaciones específicas el isotipo de IgG es IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4 o un alotipo de los mismos. En una realización, la molécula de diacuerpo comprende un dominio Fc, que es un dominio Fc que comprende un dominio CH2 y un domino CH3 independientemente seleccionados de cualquier isotipo de inmunoglobulina (es decir, un dominio Fc que comprende el domino CH2 obtenido de IgG y el dominio CH3 obtenido de IgE, o el dominio CH2 obtenido de IgG1 y el dominio CH3 obtenido de IgG2, etc.). Dicho dominio de Fc puede genomanipularse en una cadena polipeptídica que comprende la molécula de diacuerpo de la divulgación en cualquier posición con respecto a otros dominios o partes de dicha cadena polipeptídica (por ejemplo, el dominio Fc o parte del mismo, puede estar en el extremo C tanto de los dominio VL como VH del polipéptido de la cadena; puede estar en el extremo N tanto de los dominios VL como VH; o puede estar en el extremo N de un dominio y en el extremo C del otro (es decir, entre dos dominio de la cadena polipeptídica)).
La presente divulgación también abarca moléculas que comprenden un dominio de bisagra. El dominio de bisagra puede obtenerse de cualquier isotipo o alotipo de inmunoglobulina incluyendo IgA, IgD, IgG, IgE e IgM. En realizaciones preferidas, el dominio de bisagra se obtiene de IgG, en el que el isotipo de IgG es IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4, o un alotipo de los mismos. Dicho dominio de bisagra puede genomanipularse en una cadena polipeptídica que comprende la molécula de diacuerpo junto con un dominio Fc de modo que la molécula de diacuerpo comprenda un dominio de bisagra-Fc. En determinadas realizaciones, el dominio de bisagra y Fc se seleccionan independientemente de cualquier isotipo de inmunoglobulina conocido en la técnica o ejemplificado en la presente memoria. En otras realizaciones, el dominio de bisagra y Fc están separados por al menos otro dominio de la cadena polipeptídica, por ejemplo, el dominio VL. El dominio de bisagra, u opcionalmente el dominio de bisagra-Fc, puede genomanipularse en un polipéptido de la divulgación en cualquier posición con respecto a otros dominios o partes de dicha cadena polipeptídica. En determinadas realizaciones, una cadena polipeptídica de la divulgación comprende un dominio de bisagra, que es un dominio de bisagra que está en el extremo C de la cadena polipeptídica, en la que dicha cadena polipeptídica no comprende un dominio Fc. En otras realizaciones más, una cadena polipeptídica de la divulgación comprende un dominio de bisagra-Fc, que es un dominio de bisagra-Fc que está en el extremo C de la cadena polipeptídica. En realizaciones adicionales, una cadena polipeptídica de la divulgación comprende un dominio de bisagra-Fc, que es un dominio de bisagra-Fc que está en el extremo N de la cadena polipeptídica.
Como se analiza anteriormente, la divulgación abarca multímeros de cadenas polipeptídicas, comprendiendo cada una de estas cadenas polipeptídicas un dominio VH y VL. En determinados aspectos, las cadenas polipeptídicas en dichos multímeros comprenden además un dominio Fc. La dimerización de los dominios Fc da lugar a la formación de una molécula de diacuerpo que muestra funcionalidad de tipo inmunoglobulina, es decir, función mediada por Fc (por ejemplo, interacción de Fc-FcyR, unión al complemento, etc.). En determinadas realizaciones, los dominios VL y VH que comprende cada cadena polipeptídica tienen la misma especificidad, y dicha molécula de diacuerpo es bivalente y monoespecífica. En otras realizaciones, los dominios VL y VH que comprende cada cadena polipeptídica tienen diferente especificidad y el diacuerpo es bivalente y biespecífico.
En otras realizaciones más, las moléculas de diacuerpo de la divulgación abarcan tetrámeros de cadena polipeptídicas, comprendiendo cada una de estas cadenas polipeptídicas un dominio VH y VL. En determinadas realizaciones, dos cadenas polipeptídicas del tetrámero comprenden además un dominio Fc. El tetrámero, por lo tanto, está compuesto de dos cadenas polipeptídicas "más pesadas", comprendiendo cada una un dominio VL, VH y Fc, y dos cadenas polipeptídicas "más ligeras", que comprenden un dominio VL y VH. La interacción de una cadena más pesada y una más ligera en un monómero bivalente acoplado con dimerización de dichos monómeros mediante los dominios Fc de las cadenas más pesadas dará lugar a la formación de una molécula de tipo inmunoglobulina tetravalente (ejemplificada en el ejemplo 6.2 y el ejemplo 6.3). En determinados aspectos, los monómeros son iguales, y la molécula de diacuerpo tetravalente es monoespecífica o biespecífica. En otros aspectos, los monómeros son diferentes, y la molécula tetravalente es biespecífica o tetraespecífica.
La formación de una molécula de diacuerpo tetraespecífica como se describe supra requiere la interacción de cuatro cadenas polipeptídicas diferentes. Dichas interacciones son difíciles de conseguir con eficacia dentro de un sistema de producción recombinante de una célula, debido a las muchas variantes de emparejamientos incorrectos de cadenas potenciales. Una solución para aumentar la probabilidad de emparejamientos incorrectos es genomanipular mutaciones de tipo "botones en ojales" en los pares de cadenas polipeptídicas deseados. Dichas mutaciones favorecen la heterodimerización sobre la homodimerización. Por ejemplo, con respecto a las interacciones de Fc-Fc, una sustitución de aminoácido (preferiblemente una sustitución con un aminoácido que comprende un grupo lateral voluminoso que forma un "botón", por ejemplo, triptófano) puede introducirse en el dominio CH2 o CH3 de modo que la interferencia estérica impida la interacción con un domino mutado de forma similar y obligue al dominio mutado a emparejarse con un dominio en que se haya genomanipulado una mutación complementaria o de acomodación, es decir, "el ojal" (por ejemplo, una sustitución con glicina). Dichos conjuntos de mutaciones pueden genomanipularse en cualquier par de polipéptidos que comprenda la molécula de diacuerpo y, además, pueden genomanipularse en cualquier parte de las cadenas polipeptídicas de dicho par. Los métodos de genomanipulación de proteínas para favorecer la heterodimerización sobre la homodimerización son bien conocidos en la técnica, en particular con respecto a la genomanipulación de moléculas de tipo inmunoglobulina, y se incluyen en la presente memoria (véase, por ejemplo, Ridgway et al. (1996) "Knobs-Into-Holes Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization," Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library" J. Mol. Biol. 270: 26-35 y Xie et al. (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis," J. Immunol. Methods 296:95-101).
También se describen moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fc variantes o dominios de bisagra-Fc variantes (o parte de los mismos), comprendiendo dicho dominio Fc variante al menos una modificación de aminoácido (por ejemplo, sustitución, inserción, eliminación) con respecto a un dominio Fc de tipo silvestre comparable o dominio de bisagra-Fc (o parte del mismo). Las moléculas que comprenden dominios Fc variantes o dominios de bisagra-Fc (o parte de los mismos) (por ejemplo, anticuerpos) normalmente tienen fenotipos alterados con respecto a moléculas que comprenden dominios Fc de tipo silvestre o dominios de bisagra-Fc o partes de las mismos. El fenotipo variante puede expresarse como semivida en suero alterada, estabilidad alterada, susceptibilidad alterada a enzimas celulares o función efectora alterada ensayada en un ensayo dependiente de NK o dependiente de macrófagos. Las variantes del dominio Fc identificadas que alteran la función efectora se divulgan en la solicitud internacional WO 04/063351, las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos 2005/0037000 y 2005/0064514, y las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° US 2006-0134709 A1, presentada el 10 de noviembre de 2005, y US 2006-0177439 A1, presentada el 15 de diciembre de 2005, solicitadas simultáneamente de los autores de la invención.
Los diacuerpos biespecíficos de la divulgación pueden unirse simultáneamente a dos epítopos separados y distintos. En determinadas realizaciones, los epítopos son del mismo antígeno. En otras realizaciones, los epítopos son de diferentes antígenos. En realizaciones preferidas, al menos un sitio de unión a epítopo se especificó para un determinante expresado en una célula efectora inmunitaria (por ejemplo, CD3, CD16, CD32, CD64, etc.) que se expresa en linfocitos T, linfocitos citolíticos naturales (NK) u otros leucocitos monomorfonucleares. En una realización, la molécula de diacuerpo se une al determinante de célula efectora y también activa dicha célula efectora. A este respecto, las moléculas de diacuerpo de la divulgación pueden mostrar funcionalidad de tipo Ig independientemente de si comprenden además un dominio Fc (por ejemplo, ensayado en cualquier ensayo de función efectora conocido en la técnica o ejemplificado en la presente memoria (por ejemplo, ensayo de ADCC). En determinadas realizaciones, el diacuerpo biespecífico de la divulgación se une tanto a un antígeno canceroso en una célula tumoral como a un determinante de célula efectora mientras activa dicha célula. En realizaciones alternativas, el diacuerpo biespecífico o molécula de diacuerpo de la divulgación puede inhibir la activación de una célula diana, por ejemplo, célula efectora, uniéndose simultáneamente a, y, por tanto, conectando, un receptor activador e inhibidor en la misma célula (por ejemplo, unión tanto a CD32A y CD32B, BCR y CD32B o IgERI y CD32B) como se describe supra véase, la sección de Antecedentes). En un aspecto adicional de esta realización, el diacuerpo biespecífico puede mostrar propiedades antivíricas por unión simultánea a dos epítopos neutralizantes en un virus (por ejemplo, epítopos de RSV; epítopos de WNV tales como E16 y E53).
En determinadas realizaciones, las moléculas de diacuerpo biespecífico de la divulgación ofrecen oportunidades únicas para abordar tipos celulares específicos. Por ejemplo, el diacuerpo biespecífico o molécula de diacuerpo puede genomanipularse para que comprenda una combinación de sitios de unión a epítopo que reconozcan un conjunto de antígenos únicos para un tipo célula o tejido diana. Adicionalmente, cuando alguno o ambos antígenos individuales son escasamente comunes por separado en otro tipo de tejido y/o célula, pueden usarse dominios de unión de baja afinidad para construir el diacuerpo o molécula de diacuerpo. Dichos dominios de unión de baja afinidad no podrán unirse al epítopo o antígeno individual con suficiente avidez con fines terapéuticos. Sin embargo, cuando ambos epítopos o antígenos están presentes en una única célula o tejido diana, la avidez del diacuerpo o molécula de diacuerpo por la célula o tejido, con respecto a una célula o tejido que expresa únicamente uno de los antígenos, aumentará de modo que dicha célula o tejido pueda abordarse de forma eficaz por la molécula de diacuerpo. Dicha molécula biespecífica puede mostrar unión potenciada a uno o ambos de sus antígenos diana en células que expresan ambos de dichos antígenos con respecto a un diacuerpo monoespecífico o un anticuerpo con una especificidad por únicamente uno de los antígenos.
Preferiblemente, las propiedades de unión de los diacuerpos de la divulgación se caracterizan por ensayos funcionales in vitro para determinar la actividad de unión y/o una o más funciones de células efectoras mediadoras de FcyR (mediadas mediante interacciones de Fc-FcyR o mediante la unión inmunoespecífica de una molécula de diacuerpo o un FcyR) (véase la sección 5.4.2 y 5.4.3). Las afinidades y propiedades de unión de las moléculas, por ejemplo, diacuerpos de la divulgación para un FcyR pueden determinarse usando ensayos in vitro (ensayos de base bioquímica o inmunológica) conocidos en la técnica para determinar las interacciones de unión de dominio-antígeno o Fc-FcyR, es decir, unión específica de un antígeno a un dominio de unión o unión específica de una región Fc a un FcyR, respectivamente, incluyendo, aunque sin limitación, ensayo de ELISA, ensayo de resonancia de plasmones superficiales, ensayos de inmunoprecipitación (véase la sección 5.4.2. En las realizaciones más preferidas, las moléculas de la divulgación tienen propiedades de unión similares en modelos in vivo (tales como los descritos y divulgados en la presente memoria) como aquellas en ensayos de base in vitro. Sin embargo, la presente divulgación no excluye moléculas de la divulgación que no muestren el fenotipo deseado en ensayos de base in vitro, pero muestren el fenotipo deseado in vivo.
En algunas realizaciones, las moléculas de la divulgación se genomanipulan para que comprendan un patrón de glucosilación alterado o una glucoforma alterada con respecto a la parte comparable de la molécula de molde. Las glucoformas genomanipuladas pueden ser útiles para una diversidad de fines incluyendo, aunque sin limitación, potenciación de la función efectora. Las glucoformas genomanipuladas pueden generarse por cualquier método conocido por un experto en la materia, por ejemplo, usando cepas genomanipuladas o de expresión variante, por coexpresión con una o más enzimas, por ejemplo, DI N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnT111), por expresión de un diacuerpo de la divulgación en diversos organismos o líneas celulares de diversos organismos, o por modificación de uno o más glúcidos después de que el diacuerpo se haya expresado y purificado. Los métodos para generar glucoformas genomanipuladas son conocidos en la técnica e incluyen, aunque sin limitación, los descritos en Umana et al. (1999) "Engineered Glycoforms Of An Antineuroblastoma IgG1 With Optimized Antibody-Dependent Cellular Cytotoxic Activity', Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al. (2001) "Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line: Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In Adcc Through Higher Affinity For Fc Gamma RIII," Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al. (2002) "Lack Of Fucose On Human IgG1 N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity," J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al. (2003) "The Absence Of Fucose But Not The Presence Of Galactose Or Bisecting N-Acetylglucosamine Of Human IgG1 Complex-Type Oligosaccharides Shows The Critical Role Of Enhancing Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity" J Biol Chem 278:3466-3473; documento US 6602684; documento USSN 10/277370; documento USSN 10/113929; documento PCT WO 00/61739A1; documento PCT WO 01/292246A1; documento PCT WO 02/311140A1; documento PCT WO 02/30954A1; tecnología Potillegent™ (Biowa, Inc. Princeton, NJ); tecnología de genomanipulación de glucosilación GlycoMAb™(GLYCART biotechnology AG, Zurich, Suiza. Véase, por ejemplo, la publicación internacional WO 00061739; el documento EA01229125; el documento US 20030115614; Okazaki et al. (2004) "Fucose Depletion From Human IgG1 Oligosaccharide Enhances Binding Enthalpy And Association Rate Between IgG1 And FcGammaRIIIA," JMB, 336: 1239-49.
La divulgación abarca además la incorporación de aminoácidos no naturales para generar los diacuerpos de la divulgación. Dichos métodos son conocidos por los expertos en la materia tales como aquellos que usan la maquinaria biosintética natural para permitir la incorporación de aminoácidos no naturales en proteínas, véase, por ejemplo, Wang et al. (2002) "Expanding The Genetic Code," Chem. Comm. 1: 1-11; Wang et al. (2001) "Expanding The Genetic Code Of Escherichia coli," Science, 292: 498-500; van Hest et al. (2001) "Protein-Based Materials, Toward A New Level Of Structural Control," Chem. Comm. 19: 1897-1904. Estrategias alternativas se centran en las enzimas responsables de la biosíntesis de aminoacil-ARNt, véase, por ejemplo, Tang et al. (2001) "Biosynthesis Of A Highly Stable Coiled-Coil Protein Containing Hexafluoroleucine In An Engineered Bacterial Host" J. Am. Chem. Soc. 123(44): 11089-11090; Kiick et al. (2001) "Identification Of An Expanded Set Of Translationally Active Methionine Analogues In Escherichia coli," FEBS Lett. 502(1-2):25-30.
En algunas realizaciones, la divulgación abarca métodos de modificación de un dominio VL, VH o Fc de una molécula de la divulgación añadiendo o eliminando un sitio de glucosilación. Los métodos para modificar el glúcido de las proteínas son bien conocidos en la técnica y están abarcados dentro de la divulgación, véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6218149; el documento EP 0359096 B1; la publicación de Estados Unidos n.° 2002/0028486; la publicación internacional WO 03/035835; la publicación de Estados Unidos n.° 2003/0115614; la patente de Estados Unidos n.° 6218149; la patente de Estados Unidos n.° 6472511.
Las moléculas de diacuerpo de la presente divulgación pueden construirse para que comprendan un dominio que es un ligando de unión para el receptor del grupo 2D citolítico natural (NKG2D). Dichos ligandos de unión, y particularmente aquellos que no se expresan en células normales, incluyen la molécula de histocompatibilidad 60 (H60), el producto del gen 1 inducible temprano por ácido retinoico (RAE-1) y el transcrito 1 de tipo proteína de unión a UL16 murina (MULT1) (Raulet D.H. (2003) "Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands" Nature Rev. Immunol. 3:781-790; Coudert, J.D. et al. (2005) "Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells," Blood 106:1711-1717). Ligandos adicionales reactivos con NKG2D humano incluyen las moléculas relacionadas con la cadena de MHC de clase I polimórficas MICA y MICB (Diefenbach, A. et al. (1999) "Natural Killer Cells: Stress Out, Turn On, Tune In," Curr. Biol. 9(22):R851-R8533; Bauer, S. et al. (1999) "Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA," Science 285(5428):727-729; Stephens, H.A. (2001) "MICA and MICB genes: can the enigma of theirpolymorphism be resolved?," Trends Immunol. 22:378-385.
La secuencia de MICA es la SEQ ID NO: 311:
MGLGPVFLLL A G IFPFA PPG AAAEPHSLRY NLTVLSWDGS VQSGFLTEVH
LDGQPFLRCD RQKCRAKPQG QWAEDVLGNK TWDRETRDLT GNGKDLRMTL AHIKDQKEGL HSLQEIRVCE 1HEDNSTRSS QHFYYDGELF LSQNLETKEW
TMPQSSRAQT LAMNVRNFLK EDAMKTKTHY HAMHADCLQE LRRYLKSGVV LRRTVPPMVN VTRSEASEGN ITVTCRASGF YPWNITLSWR QDGVSLSHDT QQWGDVLPDG NGTYQTWVAT RICQGEEQRF TCYMEHSGNH STHPVPSGKV LVLQSHWQTF HVSAVAAAAI F V II IF Y V R C CKKKTSAAEG PELVSLQVLD QHPVGTSDHR DATQLGFQPL MSDLGSTGST EGA
La secuencia de MICB es la SEQ ID NO: 312:
PHSLRYNLMV LSQDGSVQSG FLAEGHLDGQ PFLRYDRQKR RAKPQGQWAE DVLGAKTWDT ETEDLTENGQ DLRRTLTHIK DQKGGLHSLQ EIR V CE1H ED
SSTRGSRHFY YDGELFLSQN LETQESTVPQ SSRAQTLAMN VTNFWKEDAM KTKTHYRAMQ ADCLQKLQLP PMVNVICSEV SEGNITVTCR A SSFY PRN IT LTWRQDGVSL SHNTQQWGDV LPDGNGTYQT WVATRIRQGE EQRFTCYMEH SGNHGTHPVP SGKALVLQSQ RTDFPYVSAA M P C F V I I I I L CVPCCKKKTS AAEGP
Los anticuerpos que se unen específicamente al receptor de linfocitos T incluyen el anticuerpo anti-TCR BMA 031 (Kurrle, R. et al. (1989) "BMA 031 - A TCR-Specific Monoclonal Antibody For Clinical Application," Transplant Proc.
21(1 Pt 1):1017-1019; Nashan, B. et al. (1987) "Fine Specificity Of A Panel Of Antibodies Against The TCR/CD3 Complex," Transplant Proc. 19(5):4270-4272; Shearman, C.W. et al. (1991) "Construction, Expression, And Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies With Specificity For The Human a/p T Cell," J. Immunol. 146(3):928-935; Shearman, C.W. et al. (1991) "Construction, Expression And Characterization of Humanized Antibodies Directed Against The Human a/fi T Cell Receptor," J. Immunol. 147(12):4366-4373). Los anticuerpos que se unen específicamente al receptor de NKG2D incluyen KYK-2.0 (Kwong, kY et al. (2008) "Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity," J. Mol. Biol. 384:1143-1156; y PCT/US09/54911).
A través del uso de dicho diacuerpo, la célula diana ahora se redirige para que sea una célula que pueda unirse por células que presentan el receptor (NKG2D). El receptor de NKG2D se expresa en todos los linfocitos citolíticos naturales humanos (y de otros mamíferos) (Bauer, S. et al. (1999) "Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA," Science 285(5428):727-729; Jamieson, A.M. et al. (2002) "The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing," Immunity 17(1):19-29), así como en todos los linfocitos T CD8+ (Groh, V. et al. (2001) "Costimulation Of CD8afi T Cells By Nk G2d Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells," Nat. Immunol. 2(3):255-260; Jamieson, A.M. et al. (2002) "The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing," Immunity 17(1 ):19-29).
Como alternativa, las moléculas de diacuerpo de la presente divulgación pueden construirse para que comprendan un dominio que es un ligando de unión para el receptor de linfocitos T ("TCR"). El TCR se expresa de forma nativa por linfocitos T CD4+ o CD8+, y permite que dichas células reconozcan péptidos antigénicos que se unen y presentan por proteínas de MHC de clase I o clase II de células presentadoras de antígeno. El reconocimiento de un complejo de pMHC (péptido-MHC) por un TCR inicia la propagación de una respuesta inmunitaria celular que da lugar a la producción de citocinas y la lisis de la célula presentadora de antígeno (véase, por ejemplo, Armstrong, K.M. et al. (2008) "Conformational Changes And Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptide-MHC Complexes" Biochem. J. 415(Pt 2):183-196; Willemsen, R. (2008) "Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy" Cytometry A. 73(11):1093-1099; Beier, K.C. et al. (2007) "Master Switches Of T-Cell Activation And Differentiation," Eur. Respir. J. 29:804-812; Mallone, R. et al. (2005) "Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes," Am. J. Ther.
12(6):534-550).
Construyendo dichas moléculas de diacuerpo para que comprendan adicionalmente al menos un dominio de unión a epítopo que pueda unirse a, por ejemplo, un receptor presente en la superficie de una célula diana, dichas moléculas de diacuerpo serán moléculas DART y, por tanto, podrán unirse a las células diana y causar de este modo que las células diana presenten el ligando de unión para el receptor del grupo 2D citolítico natural (NKG2D) o al TCR (lo que esté presente en el diacuerpo unido a célula diana) (véase, por ejemplo, Germain, C. et al. (2008) "Redirecting NK Cells Mediated Tumor Cell Lysis By A New Recombinant Bifunctional Protein," Prot. Engineer. Design Selection 21 (11):665-672).
Dichos diacuerpos pueden usarse para redirigir cualquier célula diana deseada a una célula que sea una diana de la lisis celular mediada por linfocitos NK o citotoxicidad mediada por linfocitos T. En una realización, el dominio de unión a epítopo del diacuerpo que puede unirse a un receptor presente en la superficie de una célula diana es un epítopo que se une a un antígeno asociado a tumor para redirigir dichas células cancerosas a sustratos para la lisis celular mediada por linfocitos NK o citotoxicidad mediada por linfocitos T. Es de particular interés un antígeno asociado a tumor que es un antígeno de cáncer de mama, un antígeno de cáncer de ovario, un antígeno de cáncer de próstata, un antígeno de cáncer cervicouterino, un antígeno de carcinoma pancreático, un antígeno de cáncer pulmonar, un antígeno de cáncer de vejiga, un antígeno de cáncer de colon, un antígeno de cáncer testicular, un antígeno de cáncer de glioblastoma, un antígeno asociado con una neoplasia de linfocitos B, un antígeno asociado con mieloma múltiple, un antígeno asociado con linfoma no hodgkiniano o un antígeno asociado con leucemia linfocítica crónica.
Los antígenos asociados a tumor adecuados para dicho uso incluyen A33 (un antígeno de carcinoma colorrectal; Almqvist, Y. 2006, Nucí Med Biol. Nov;33(8):991-998); B1 (Egloff, A.M. et al. 2006, Cáncer Res. 66(1):6-9); BAGE (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); beta-catenina (Prange W. et al. 2003 J Pathol. 201(2):250-9); Ca 125 (Bast, R.C. Jr. et al. 2005 Int J Gynecol Cancer 15 Supl. 3:274-81); CD5 (Calin, G.A. et al. 2006 Semin Oncol.
33(2):167-73; CD19 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48); CD20 (Thomas, D.A. et al. 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5):1125-36); CD22 (Kreitman, R.J. 2006 AAPS J. 18;8(3):E532-51); CD23 (Rosati, S. et al. 2005 Curr Top Microbiol Immunol. 5; 294:91-107); CD25 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther.
40(4):139-48); CD27 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40); CD28 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91 (9):1234-40); CD36 (Ge, Y. 2005 Lab Hematol. 11(1 ):31 -7); CD40/CD154 (Messmer, D. et al. 2005 Ann N YAcad Sci. 1062:51-60); CD45 (Jurcic, J.G. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):339-46); CD56 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91 (9):1234-40); CD79a/CD79b (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48; Chu, P.G. et al. 2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol. 9(2):97-106); CD103 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48); CDK4 (Lee, Y.M. et al. 2006 Cell Cycle 5(18):2110-4); CEA (antígeno carcinoembrionario; Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46; Tellez-Avila, F.I. et al. 2005 Rev Invest Clin. 57(6):814-9); CTLA4 (Peggs, K.S. et al. 2006 Curr Opin Immunol. 18(2):206-13); EGF-R (receptor del factor de crecimiento epidérmico; Adenis, A. et al.
2003 Bull Cancer. 90 n.° especial: S228-32); Erb (ErbB1; ErbB3; ErbB4; Zhou, H. et al. 2002 Oncogene 21(57):8732-40; Rimon, E. et al. 2004 Int J Oncol. 24(5):1325-38); GAGE (GAGE-1; GAGE-2; Akcakanat, A. et al. 2006 Int J Cancer. 118(1 ):123-8); GD2/GD3/GM2 (Livingston, P.O. et al. 2005 Cancer Immunol Immunother. 54(10):1018-25); gp100 (Lotem, M. et al. 2006 J Immunother. 29(6):616-27); HER-2/neu (Kumar, Pal S et al. 2006 Semin Oncol.
33(4):386-91); E6 de papilomavirus humano/E7 de papilomavirus humano (DiMaio, D. et al. 2006 Adv Virus Res.
66:125-59; KSA (17-1A) (Ragupathi, G. 2005 CancerTreat Res. 123:157-80); MAGE (MAGE-1; MAGE-3; (Bodey, B.
2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); MART (Kounalakis, N. et al. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):377-82; MuC-1 (Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46); MUM-1 (Castelli, C. et al. 2000 J Cell Physiol. 182(3):323-31); N-acetilglucosaminiltransferasa (Dennis, J.W. 1999 Biochim Biophys Acta. 6;1473(1):21 -34); p15 (Gil, J. et al.
2006 Nat Rev Mol Cell Biol. 7(9):667-77); PSA (antígeno específico de próstata; Cracco, C.M. et al. 2005 Minerva Urol Nefrol. 57(4):301 -11); PSmA (Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80); sTn (Holmberg, L.A. 2001 Expert Opin Biol Ther. 1 (5):881 -91); receptor de TNF (receptor de TNF-a, receptor de TNF-p; o receptor de TNF-y; van Horssen, R. et al. 2006 Oncologist. 11(4):397-408; Gardnerova, M. et al. 2000 Curr Drug Targets. 1(4):327-64; o receptor de VEGF (O'Dwyer. P.J. 2006 Oncologist. 11 (9):992-8).
Antígenos asociados a tumor adicionales para dicho uso (y publicaciones que divulgan anticuerpos específicamente reactivos para dichos antígenos) incluyen ADAM-9 (publicación de patente de Estados Unidos n.° 2006/0172350; publicación PCT n.° WO 06/084075); ALCAM (publicación PCT n.° WO 03/093443); carboxipeptidasa M (publicación de patente de Estados Unidos n.° 2006/0166291); CD46 (patente de Estados Unidos n.° 7148038; publicación PCT n.° WO 03/032814); citoqueratina 8 (publicación PCT n.° WO 03/024191); receptores de efrina (y en particular EphA2 (patente de Estados Unidos n.° 7569672; publicación PCT n.° WO 06/084226; integrina alfa-V-beta-6 (publicación PCT n.° WO 03/087340); JAM-3 (publicación PCT n.° WO 06/084078); KID3 (publicación PCT n.° WO 05/028498); KID31 (publicación PCT n.° WO 06/076584); LUCA-2 (publicación de patente de Estados Unidos n.° 2006/0172349; publicación PCT n.° WO 06/083852); oncostatina M (receptor beta de oncostatina) (patente de Estados Unidos n.° 7572896; publicación PCT n.° Wo 06/084092); PlPA (patente de Estados Unidos n.° 7405061; publicación PCT n.° WO 04/043239); RAAG10 (patente de Estados Unidos n.° 7527969; publicación PCT n.° WO 04/001381); ROR1 (patente de Estados Unidos n.° 5843749); TES7 (publicación PCT n.° WO 08/066691); y el receptor de transferrina (patente de Estados Unidos n.° 7572895; publicación PCT n.2 WO 05/121179).
También son de interés antígenos específicos para agentes infecciosos particulares, por ejemplo, agentes víricos que incluyen, aunque sin limitación, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB), gripe, virus del papiloma humano (VPH), virus de la glosopeda (coxackievirus), el virus de la rabia, virus del herpes simple (VHS) y los agentes causantes de la gastroenteritis, incluyendo rotavirus, adenovirus, calicivirus, astrovirus y virus Norwalk; agentes bacterianos incluyendo, aunque sin limitación, E. coli Salmonella thyphimurium, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Hemophilus influenzae, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis y Streptococcus pneumoniae, agentes fúngicos y parásitos tales como Giardi.
Como alternativa dicho epítopo puede unirse a un receptor de Fc (por ejemplo, FcyRI o FcyRII), para, por ejemplo, redirigir las células de leucemia monocítica aguda a sustratos para la lisis celular mediada por linfocitos NK.
5.1 Dominios de unión de diacuerpo
Los diacuerpos de la presente divulgación comprenden dominios de unión a antígeno en general derivados de inmunoglobulinas o anticuerpos. Los anticuerpos de los que derivan los dominios de unión usados en los métodos de la presente memoria pueden ser de cualquier origen animal, incluyendo aves y mamíferos (por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, murinos, de burro, de oveja, de conejo, de cabra, de cobaya, de camello, de caballo o de pollo). Preferiblemente, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales humanos o humanizados. Tal como se usa en la presente memoria, los anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de colecciones de inmunoglobulina humana o colecciones de secuencias codificantes de inmunoglobulina humana sintéticas o de ratones que expresan anticuerpos a partir de genes humanos.
La descripción contempla el uso de cualquier anticuerpo conocido en la técnica para el tratamiento y/o prevención del cáncer, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad inflamatoria o enfermedad infecciosa como fuente de dominios de unión para los diacuerpos de la divulgación. Se proporcionan ejemplos no limitantes de anticuerpos conocidos contra el cáncer en la sección 5.7.1, así como otros anticuerpos específicos para los antígenos diana enumerados y anticuerpos contra los antígenos del cáncer enumerados en la sección 5.6.1; se proporcionan ejemplos no limitantes de anticuerpos conocidos para el tratamiento y/o prevención de enfermedad autoinmunitaria y enfermedad inflamatoria en la sección 5.7.2, así como anticuerpos contra los antígenos diana enumerados y anticuerpos contra los antígenos enumerados en la sección 5.6.2; en otras realizaciones, pueden usarse anticuerpos contra epítopos asociados con enfermedades infecciosas como se enumera en la sección 5.6.3. En determinadas realizaciones, los anticuerpos comprenden una región Fc variante que comprende una o más modificaciones de aminoácido, que se han identificado por tener una función efectora conferida y/o afinidad potenciada por FcyRIIIB y una afinidad disminuida por FcyRIIIA con respecto a una molécula comparable que comprende una región Fc de tipo silvestre. Un ejemplo no limitante de los anticuerpos que se usan para el tratamiento o prevención de trastornos inflamatorios que pueden genomanipularse de acuerdo con la divulgación se presenta en la tabla 9, y un ejemplo no limitante de los anticuerpos que se usan para el tratamiento o prevención de trastorno autoinmunitario se presenta en la tabla 10.
Para algunos usos, incluyendo uso in vivo de anticuerpos en seres humanos y ensayos de detección in vitro, puede ser preferible usar diacuerpos con dominios variables derivados de anticuerpos humanos, quiméricos o humanizados. Los dominios variables de anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para tratamiento terapéutico de sujetos humanos. Los anticuerpos humanos pueden prepararse por una diversidad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo métodos de presentación en fagos descritos anteriormente usando colecciones de anticuerpos derivadas de secuencia de inmunoglobulina humana. Véanse también las patentes de Estados Unidos n.° 4444887 y 4716111 y las publicaciones internacionales n.° WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741.
Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo, una variante o un fragmento del mismo que puede unirse a un antígeno predeterminado y que comprende una región estructural que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y una CDR que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana. Un anticuerpo humanizado puede comprender sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos dominios variables en que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donador) y todas o sustancialmente todas las regiones estructurales son aquellas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana.
Las regiones estructurales y CDR de un anticuerpo humanizado no tienen que corresponder de forma precisa a las secuencias precursoras, por ejemplo, la CDR donadora o la región estructural de consenso pueden mutagenizarse por sustitución, inserción o eliminación de al menos un resto de modo que el resto de CDR o estructural en ese sitio no corresponda al de consenso o el anticuerpo donador. Dichas mutaciones, sin embargo, son preferiblemente no extensivas. Habitualmente, al menos un 75 % de los restos del anticuerpo humanizado corresponderán a los de las secuencias de la región estructural (FR) y CDR precursoras, más a menudo un 90 % y muchos más preferiblemente más de un 95 %. Los anticuerpos humanizados pueden producirse usando una diversidad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, aunque sin limitación, injerto de CDR (patente europea EP 239400; publicación internacional n.° WO 91/09967; y patentes de Estados Unidos n.° 5225539, 5530101, y 5585089), rechapado o repavimentación (patentes europeas n.° EP 592106 y EP 519596; Padlan (1991) "A Possible Procedure For Reducing The Immunogenicity Of Antibody Variable Domains While Preserving Their Ligand-Binding Properties," Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al. (1994) "Human-Engineered Monoclonal Antibodies Retain Full Specific Binding Activity By Preserving Non-CDR Complementarity-Modulating Residues," Protein Engineering 7(6):805-814; y Roguska et al. (1994) "Humanization Of Murine Monoclonal Antibodies Through Variable Domain Resurfacing," Proc Natl Acad Sci uSa 91:969-973), reorganización de cadenas (patente de Estados Unidos n.° 5565332) y técnicas divulgadas en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 6407213, 5766886, 5585089, la publicación internacional n.° WO 9317105, Tan et al. (2002) "'Superhumanized' Antibodies: Reduction Of Immunogenic Potential By Complementarity-Determining Region Grafting With Human Germine Sequences: Application To An Anti-CD28, " J. Immunol. 169:1119-25, Caldas et al. (2000) "Design And Synthesis Of Germline-Based Hemi-Humanized Single-Chain Fv Against The CD18 Surface Antigen," Protein Eng. 13:353-60, Morea et al. (2000) "Antibody Modeling: Implications For Engineering And Design, " Methods 20:267-79, Baca et al. (1997) "Antibody Humanization Using Monovalent Phage Display," J. Biol. Chem. 272:10678-84, Roguska et al. (1996) "A Comparison Of Two Murine Monoclonal Antibodies Humanized By CDR-Grafting And Variable Domain Resurfacing, " Protein Eng. 9:895-904, Couto et al. (1995) "Designing Human Consensus Antibodies With Minimal Positional Templates" Cancer Res. 55 (23 Sup.):5973s-5977s, Couto et al. (1995) "Anti-BA46 Monoclonal Antibody Mc3: Humanization Using A Novel Positional Consensus And In Vivo And In Vitro Characterízation," Cancer Res. 55:1717-22, Sandhu (1994) "A Rapid Procedure For The Humanization Of Monoclonal Antibodies," Gene 150:409-10, Pedersen et al. (1994) "Comparison Of Surface Accessible Residues In Human And Murine Immunoglobulin Fv Domains. Implication For Humanization Of Murine Antibodies," J. Mol. Biol. 235:959-973, Jones et al. (1986) "Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse," Nature 321:522-525, Riechmann et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy," Nature 332:323-327 y Presta (1992) "Antibody Engineering," Curr. Op. Biotech. 3(4):394-398. A menudo, los restos estructurales en las regiones estructurales se sustituirán con el resto correspondiente del anticuerpo donador de CDR para alterar, preferiblemente mejorar, la unión a antígeno. Estas sustituciones estructurales se identifican por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por modelado de las interacciones de los restos CDR y estructurales para identificar restos estructurales importantes para la unión al antígeno y comparación de secuencias para identificar restos estructurales infrecuentes en posiciones particulares. (Véase, por ejemplo, Queen et al. patente de Estados Unidos n.° 5585089; publicaciones de Estados Unidos n.22004/0049014 y 2003/0229208; patentes de Estados Unidos n.26350861; 6180370; 5693762; 5693761; 5585089; y 5530101 y Riechmann et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy," Nature 332:323-327.).
En una realización mucho más preferida, el dominio de unión humanizado se une específicamente al mismo epítopo que el anticuerpo murino donador. Un experto en la materia apreciará que la divulgación abarca injerto de CDR de anticuerpos en general. Por tanto, los anticuerpos donador y aceptador pueden obtenerse de animales de la misma especie e incluso la misma clase o subclase de anticuerpo. Más habitualmente, sin embargo, los anticuerpo donador y aceptador se obtienen de animales de diferentes especies. Típicamente, el anticuerpo donador es un anticuerpo no humano, tal como un mAb de roedor y el anticuerpo aceptador es un anticuerpo humano.
En algunas realizaciones, al menos una CDR del anticuerpo donador se injerta en el anticuerpo humano. En otras realizaciones, al menos dos y preferiblemente las tres CDR de cada una de las regiones variables de cadena pesada y/o ligera se injertan en el anticuerpo humano. Las CDR pueden comprender las CDR de Kabat, las CDR del bucle estructural o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la divulgación abarca un anticuerpo contra FcyRIIB humanizado que comprende al menos una cadena pesada con CDR injertada y al menos una cadena ligera con CDR injertada.
Los diacuerpos usados en los métodos incluyen derivados que están modificados, es decir, por la adhesión covalente de cualquier tipo de molécula al diacuerpo. Por ejemplo, aunque sin limitación, los derivados de diacuerpo incluyen diacuerpos que se han modificado, por ejemplo, por glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Puede realizarse cualquiera de numerosas modificaciones químicas por técnicas conocidas, incluyendo, aunque sin limitación, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.
Un anticuerpo quimérico es una molécula en que se obtienen diferentes partes del anticuerpo de diferentes moléculas de inmunoglobulina tales como anticuerpos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo no humano y una región constante de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Morrison (1985) "Transfectomas Provide Novel Chimeric Antibodies," Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) "Chimeric Antibodies," BioTechniques 4:214-221; Gillies et al. (1989) "High-Level Expression Of Chimeric Antibodies Using Adapted cDNA Variable Region Cassettes," J. Immunol. Methods 125:191-202; y las patentes de Estados Unidos n.26311415, 5807715, 4816567 y 4816397.
A menudo, los restos estructurales en las regiones estructurales se sustituirán con el resto correspondiente del anticuerpo donador de CDR para alterar, preferiblemente mejorar, la unión a antígeno. Estas sustituciones estructurales se identifican por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por modelado de las interacciones de los restos CDR y estructurales para identificar restos estructurales importantes para la unión al antígeno y comparación de secuencias para identificar restos estructurales infrecuentes en posiciones particulares. (Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5585089 y Riechmann et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy," Nature 332:323-327)
Los anticuerpos monoclonales a partir de los que pueden prepararse los dominios de unión de los diacuerpos de la divulgación usando una amplia diversidad de técnicas conocidas en la técnica incluyendo el uso de tecnologías de hibridoma, recombinante y de presentación en fagos, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos monoclonales usando técnicas de hibridoma incluyendo las conocidas en la técnica y mostradas, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.a ed. 1988); Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hvbridomas. pág. 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). La expresión "anticuerpo monoclonal", tal como se usa en la presente memoria, no está limitada a anticuerpos producidos mediante tecnología de hibridoma. La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se obtiene de un único clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota o fágico, y no al método por el que se produce.
Los métodos para producir y cribar anticuerpos específicos usando tecnología de hibridomas son rutinarios y bien conocidos en la técnica. En un ejemplo no limitante, pueden inmunizarse ratones con un antígeno de interés o una célula que expresa dicho antígeno. Una vez se detecta una respuesta inmunitaria, por ejemplo, se detectan anticuerpos específicos en el suero de ratón, se recoge el bazo del ratón y se aíslan los esplenocitos. Los esplenocitos entonces se fusionan por técnicas bien conocidas con cualquier célula de mieloma adecuada. Se seleccionan hibridomas y se clonan por dilución limitante. Los clones de hibridoma entonces se ensayan por métodos conocidos en la técnica para células que secreten anticuerpos que puedan unirse al antígeno. El líquido ascítico, que en general contiene niveles altos de anticuerpos, puede generarse inoculando ratones por vía intraperitoneal con clones de hibridoma positivos. Los antígenos de interés incluyen, aunque sin limitación, antígenos asociados con los cánceres proporcionados en la sección 5.8.1, antígenos asociados con las enfermedades autoinmunitarias y enfermedades inflamatorias proporcionadas en la sección 5.8.2, antígenos asociados con las enfermedades infecciosas proporcionadas en la sección 5.8.3 y las toxinas proporcionadas en la sección 5.8.4.
Los anticuerpos también pueden generarse usando diversos métodos de presentación en fagos conocidos en la técnica. En los métodos de presentación en fagos, se presentan dominios de anticuerpo funcionales en la superficie de partículas fágicas que portan las secuencias polinucleotídicas que los codifican. En una realización particular, dicho fago puede utilizarse para presentar dominios de unión a antígeno, tales como Fab y Fv o Fv estabilizados por enlace disulfuro, expresados a partir de un repertorio o colección de combinatoria de anticuerpos (por ejemplo, humanos o murinos). El fago que expresa un dominio de unión a antígeno que se une al antígeno de interés puede seleccionarse o identificarse con antígeno, por ejemplo, usando antígeno marcado o antígeno unido o capturado a una superficie sólida o microesfera. El fago usado en estos métodos es típicamente un fago filamentoso, incluyendo fd y M13. Los dominios de unión a antígeno se expresan como una proteína fusionada de forma recombinante a la proteína del fago del gen III o gen VIII. Los ejemplos de métodos de presentación en fagos que pueden usarse para preparar las inmunoglobulinas, o fragmentos de las mismas, de la presente divulgación incluyen los divulgados en Brinkmann et al. (1995) "Phage Display Of Disulfide-Stabilized Fv Fragments," J. Immunol. Methods, 182:41-50; Ames et al. (1995) "Conversion Of Murine Fabs Isolated From A Combinatorial Phage Display Library To Full Length Immunoglobulins," J. Immunol. Methods, 184:177-186; Kettleborough et al. (1994) "Isolation Of Tumor Cell-Specific Single-Chain Fv From Immunized Mice Using Phage-Antibody Libraries And The Re-Construction Of Whole Antibodies From These Antibody Fragments," Eur. J. Immunol., 24:952-958; Persic et al. (1997) "An Integrated Vector System For The Eukaryotic Expression Of Antibodies Or Their Fragments After Selection From Phage Display Libraries," Gene, 187:9-18; Burton et al. (1994) "Human Antibodies From Combinatorial Libraries," Advances in Immunology, 57:191-280; publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y patentes de Estados Unidos n.25698426; 5223409; 5403484; 5580717;5427908;5750753;5821047;5571698;5427908;5516637;5780225;5658727;5733743 y 5969108.
La tecnología de presentación en fagos puede usarse para aumentar la afinidad de un anticuerpo por su antígeno. Esta técnica sería útil para obtener anticuerpos de alta afinidad. La tecnología, mencionada como maduración de afinidad, emplea mutagénesis o paseo de CDR y reselección usando el antígeno afín para identificar anticuerpos que se unan con mayor afinidad al antígeno en comparación con el anticuerpo inicial o precursor (véase, por ejemplo, Glaser et al. (1992) "Dissection Of The Combining Site In A Humanized Anti-Tac Antibody," J. Immunology 149:2607-2614). Mutagenizar codones completos en lugar de nucleótidos individuales produce un repertorio semialeatorizado de mutaciones de aminoácido. Pueden construirse colecciones que consisten en una combinación de clones variantes cada uno de los cuales difiere en una alteración de un aminoácido en una única CDR y que contiene variantes que representan cada sustitución posible de aminoácido para cada resto CDR. Los mutantes con afinidad de unión aumentada por el antígeno pueden cribarse poniendo en contacto los mutantes inmovilizados con antígeno marcado. Puede usarse cualquier método de cribado conocido en la técnica para identificar anticuerpos mutantes con avidez aumentada por el antígeno (por ejemplo, ELISA) (véase, Wu et al. (1998) "Stepwise In Vitro Affinity Maturation Of Vitaxin, An Alphav Beta3-Specific Humanized mAb" Proc Natl. Acad Sci. USA 95:6037-6042; Yelton et al. (1995) "Affinity Maturation Of The Br96 Anti-Carcinoma Antibody By Codon-Based Mutagenesis," J. Immunology 155:1994-2004). El paseo de CDR que aleatoriza la cadena ligera también es posible (véase, Schier et al. (1996) "Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-ErbB-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site," J. Mol. Bio. 263:551 -567).
La presente divulgación también abarca el uso de dominios de unión que comprenden la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los dominios de unión descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica con mutaciones (por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácido) en las regiones estructurales o CDR. Preferiblemente, las mutaciones en estos dominios de unión mantienen o potencian la avidez y/o afinidad de los dominios de unión por FcyRIIB al que se unen inmunoespecíficamente. Pueden usarse técnicas convencionales conocidas para los expertos en la materia (por ejemplo, inmunoensayos) para ensayar la afinidad de un anticuerpo por un antígeno particular.
Pueden usarse técnicas convencionales conocidas para los expertos en la materia para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo, o fragmento del mismo, incluyendo, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediado por PCR, que provoca sustituciones de aminoácido. Preferiblemente, los derivados incluyen menos de 15 sustituciones de aminoácido, menos de 10 sustituciones de aminoácido, menos de 5 sustituciones de aminoácido, menos de 4 sustituciones de aminoácido, menos de 3 sustituciones de aminoácido o menos de 2 sustituciones de aminoácido con respecto al anticuerpo original o fragmento del mismo. En una realización preferida, los derivados tienen sustituciones conservativas de aminoácido generadas en uno o más restos de aminoácido no esenciales predichos.
5.1.1 Diacuerpos que comprenden sitios de unión a epítopo que se unen inmunoespecíficamente a FcyRIIB
En una realización particular, al menos uno de los dominios de unión de los diacuerpos de la divulgación agoniza al menos una actividad de FcyRIIB. En una realización de la molécula de diacuerpo, dicha actividad es inhibición de la señalización mediada por el receptor de linfocitos B. En otra realización, el dominio de unión inhibe la activación de linfocitos B, la proliferación de linfocitos B, la producción de anticuerpos, el flujo entrante de calcio intracelular de linfocitos B, la progresión del ciclo celular o la actividad de una o más moléculas de señalización posteriores en la ruta de transducción de señales de FcyRIIB. En otra realización más, el dominio de unión potencial la fosforilación de FcyRIIB o el reclutamiento de SHIP. En una realización adicional de la molécula de diacuerpo, el dominio de unión inhibe la actividad de MAP cinasa o el reclutamiento de Akt en la ruta de señalización mediada por el receptor de linfocitos B. En otra realización, el dominio de unión agoniza la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de FcsRI. En una realización particular, dicho dominio de unión inhibe la activación de mastocitos inducida por FcsRI, la movilización de calcio, la desgranulación, la producción de citocinas o la liberación de serotonina. En otra realización, los dominios de unión de la molécula de diacuerpo estimulan la fosforilación de FcyRIIB, estimulan el reclutamiento de SHIP, estimulan la fosforilación de SHIP y su asociación con Shc, o inhiben la activación de miembros de la familia de MAP cinasa (por ejemplo, Erk1, Erk2, JNK, p38, etc.). En otra realización más, los dominios de unión de la molécula de diacuerpo potencian la fosforilación de tirosina de p62dok y su asociación con SHIP y rasGAP. En otra realización, los dominios de unión de la molécula de diacuerpo inhiben la fagocitosis mediada por FcyR en monocitos o macrófagos.
En otra realización, los dominios de unión antagonizan al menos una actividad de FcyRIIB. En una realización, dicha actividad es activación de la señalización mediada por el receptor de linfocitos B. En una realización particular, los dominios de unión potencian la activación de linfocitos B, la proliferación de linfocitos B, la producción de anticuerpos, el flujo entrante de calcio intracelular o la actividad de una o más moléculas de señalización posteriores en la ruta de transducción de señales de FcyRIIB. En otra realización particular más, los dominios de unión disminuyen la fosforilación de FcyRIIB o el reclutamiento de SHIP. En una realización adicional de la molécula de diacuerpo, los dominios de unión potencian la actividad de MAP cinasa o el reclutamiento de Akt en la ruta de señalización mediada por el receptor de linfocitos B. En otra realización, los dominios de unión antagonizan la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de FcsRI. En una realización particular, los dominios de unión potencian la activación de mastocitos inducida por FcsRI, la movilización de calcio, la desgranulación, la producción de citocinas o la liberación de serotonina. En otra realización, los dominios de unión inhiben la fosforilación de FcyRIIB, inhiben el reclutamiento de SHIP, inhiben la fosforilación de SHIP y su asociación con Shc, potencian la activación de miembros de la familia de MAP cinasa (por ejemplo, Erk1, Erk2, JNK, p38, etc.). En otra realización más, los dominios de unión inhiben la fosforilación de tirosina de p62dok y su asociación con SHIP y rasGAP. En otra realización, los dominios de unión potencian la fagocitosis mediada por FcyR en monocitos o macrófagos. En otra realización, los dominios de unión evitan la fagocitosis, la eliminación de partículas opsonizadas por macrófagos esplénicos.
En otras realizaciones, al menos uno de los dominios de unión puede usarse para dirigir los anticuerpos de la divulgación a células que expresan FcyRIIB.
En una realización particular, uno de los dominios de unión se obtiene de un anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6 o 3H7, que tienen los números de acceso a la ATCC PTA-4591 y PTA-4592, respectivamente. Se han depositado hibridomas que producen los anticuerpos 2B6 y 3H7 en la American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209) el 13 de agosto de 2002 según las provisiones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con Fines de Procedimientos de Patente, y se les ha asignado los números de acceso PTA-4591 (para el hibridoma que produce 2B6) y PTA-4592 (para el hibridoma que produce 3H7), respectivamente. En una realización preferida, los dominios de unión son humanos o se han humanizado, preferiblemente se obtienen de una versión humanizada del anticuerpo producido por el clon 3H7 o 2B6.
La divulgación también abarca diacuerpos con dominios de unión de otros anticuerpos, que se unen específicamente a FcyRIIB, preferiblemente a FcyRIIB humano, más preferiblemente a FcyRIIB humano nativo, que se obtienen de clones que incluyen, aunque sin limitación, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 y 1F2 que tienen los números de acceso a la ATCC, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960 y PTA-5959, respectivamente. Los hibridomas que producen los clones identificados anteriormente se depositaron según las provisiones del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209) el 7 de mayo de 2004. En realizaciones preferidas, los dominios de unión de los anticuerpos descritos anteriormente están humanizados.
En una realización específica, los dominios de unión usados en los diacuerpos de la presente divulgación son de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, que comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR), preferiblemente las 6 CDR) del anticuerpo producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2. En otra realización, el dominio de unión se une al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal de ratón producido a partir del clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2, respectivamente y/o compite con el anticuerpo monoclonal de ratón producido a partir del clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2, como se determina, por ejemplo, en un ensayo de ELISA u otro inmunoensayo competitivo apropiado, y también se une a FcyRIIB con una afinidad mayor que la del dominio que se une a FcyRIIA.
La presente divulgación también abarca diacuerpos con dominios de unión que comprenden una secuencia de aminoácidos de una cadena pesada variable y/o cadena ligera variable que es al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable y/o cadena ligera del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2. La presente divulgación abarca además diacuerpos con dominios de unión que se unen específicamente a FcyRIIB con mayor afinidad que la de dicho anticuerpo o fragmento del mismo que se une a FcyRIIA, y que comprende una secuencia de aminoácidos de una o más CDR que es al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de una o más CDR del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2. La determinación del porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos puede determinarse por cualquier método conocido para los expertos en la materia, incluyendo búsquedas de proteínas en BLAST.
La presente divulgación también abarca el uso de diacuerpos que contienen dominios de unión que se unen específicamente a FcyRIIB con mayor afinidad que la del dominio de unión que se une a FcyRIIA, que están codificados por una secuencia de nucleótidos que hibrida con la secuencia de nucleótidos del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2 en condiciones rigurosas. En una realización preferida, el dominio de unión se une específicamente a FcyRIIB con mayor afinidad que la de FcyRIIA, y comprende una cadena ligera variable y/o cadena pesada variable codificada por una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera variable y/o cadena pesada variable del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2 en condiciones rigurosas. En otra realización preferida, los dominios de unión se unen específicamente a FcyRIIB con mayor afinidad que a FcyRIIA, y comprenden una o más CDR codificadas por una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de una o más CDR del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2. Las condiciones de hibridación rigurosas incluyen, aunque sin limitación, hibridación de ADN unido a filtro en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6X a aproximadamente 45 °C seguida de uno o más lavados en SSC 0,2X/SDS al 0,1 % a aproximadamente 50-65 °C, condiciones altamente rigurosas tales como hibridación con ADN unido a filtro en SSC 6X a aproximadamente 45 °C seguida de uno o más lavados en SSC 0,1X/SDS al 0,2% a aproximadamente 60 °C, u otras cualesquiera condiciones de hibridación rigurosa conocidas para los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., ed. 1989 Current Protocols in Molecular Biology. vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. y John Wiley and Sons, Inc., NY en las páginas 6.3.1 a 6.3.6 y 2.10.3).
La presente divulgación también abarca el uso de dominios de unión que comprenden la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los dominios de unión descritos anteriormente con mutaciones (por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácido) en las regiones estructural o CDR. Preferiblemente, las mutaciones en estos dominios de unión mantienen o potencian la avidez y/o afinidad de los dominios de unión por FcyRIIB al que se unen inmunoespecíficamente. Pueden usarse técnicas convencionales conocidas para los expertos en la materia (por ejemplo, inmunoensayos) para ensayar la afinidad de un anticuerpo por un antígeno particular.
Pueden usarse técnicas convencionales conocidas para los expertos en la materia para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo, o fragmento del mismo, incluyendo, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediado por PCR, que provoca sustituciones de aminoácido. Preferiblemente, los derivados incluyen menos de 15 sustituciones de aminoácido, menos de 10 sustituciones de aminoácido, menos de 5 sustituciones de aminoácido, menos de 4 sustituciones de aminoácido, menos de 3 sustituciones de aminoácido o menos de 2 sustituciones de aminoácido con respecto al anticuerpo original o fragmento del mismo. En una realización preferida, los derivados tienen sustituciones conservativas de aminoácido generadas en uno o más restos de aminoácido no esenciales predichos.
En realizaciones preferidas, los dominios de unión se obtienen de anticuerpos humanizados. Un anticuerpo específico para FcyRIIB humanizado puede comprender sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables en que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donador) y todas o sustancialmente todas las regiones estructurales son aquellas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana.
Los diacuerpos de la presente divulgación comprenden dominios variable humanizados específicos para FcyRIIB en que una o más regiones de una o más CDR de las regiones variables de cadena pesada y/o cadena ligera de un anticuerpo humano (el anticuerpo destinatario) se han sustituido por partes análogas de una o más CDR de un anticuerpo monoclonal donador que se une específicamente a FcyRIIB, con una mayor afinidad que a FcyRIIA, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2. En otras realizaciones, los anticuerpos humanizados se unen al mismo epítopo que 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2, respectivamente.
En una realización preferida, las regiones CDR del dominio de unión a FcyRIIB humanizado se obtienen de un anticuerpo murino específico para FcyRIIB. En algunas realizaciones, los anticuerpos humanizados descritos en la presente memoria comprenden alteraciones, incluyendo, aunque sin limitación, eliminaciones, inserciones, modificaciones de aminoácido del anticuerpo aceptador, es decir, regiones estructurales del dominio variable de cadena pesada y/o cadena ligera humana que son necesarias para retener la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal donador. En algunas realizaciones, las regiones estructurales de los anticuerpos humanizados descritos en la presente memoria no consisten esencialmente en la secuencia de aminoácidos precisa de la región estructural de una región variable de anticuerpo humano de origen natural, sino que contienen diversas alteraciones incluyendo, aunque sin limitación, eliminaciones, inserciones, modificaciones de aminoácido que alteran la propiedad del anticuerpo humanizado, por ejemplo, mejoran las propiedades de unión de una región de anticuerpo humanizado que es específica para la misma diana que el anticuerpo específico para FcyRIIB murino. En las realizaciones más preferidas, se genera una cantidad mínima de alteraciones en la región estructural para evitar introducciones a gran escala de restos estructurales no humanos y para asegurar inmunogenicidad mínima del anticuerpo humanizado en seres humanos. El anticuerpo monoclonal donador es preferiblemente un anticuerpo monoclonal producido por los clones 2B6, 3H7, 1 D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1 F2.
En una realización específica, el dominio de unión abarca dominios variables de un anticuerpo con CDR injertada que se une específicamente a FcyRIIB con una afinidad mayor que la de dicho anticuerpo cuando se une a FcyRIIA, en el que el anticuerpo con CDR injertada comprende un dominio de región variable de cadena pesada que comprende restos estructurales del anticuerpo destinatario y restos del anticuerpo monoclonal donador, que se une específica a FcyRIIB con una afinidad mayor que la de dicho anticuerpo cuando se une a FcyRIIA, por ejemplo, anticuerpo monoclonal producido a partir de los clones 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2. En otras realización específica, los diacuerpos de la divulgación comprenden dominios variables de un anticuerpo con CDR injertada que se une específicamente a FcyRIIB con una afinidad mayor que la de dicho anticuerpo cuando se une a FcyRIIA, en el que el anticuerpo con CDR injertada comprende un dominio de región variable de cadena ligera que comprende restos estructurales del anticuerpo destinatario y restos del anticuerpo monoclonal donador, que se une específica a FcyRIIB con una afinidad mayor que la de dicho anticuerpo cuando se une a FcyRIIA, por ejemplo, anticuerpo monoclonal producido a partir de los clones 2B6, 3H7, 1D5, 2e 1, 2H9, 2D11 o 1F2.
Los dominios variables anti-FcYRIIB humanizados usados en la divulgación pueden tener una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 (SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25) y/o CDR2 (SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 27) y/o CDR3 (SEQ ID NO: 28 o SEQ lD NO: 29) y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 (SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31) y/o CDR2 (SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35) y/o CDR3 (SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37).
En una realización específica, el diacuerpo comprende dominios variables de un anticuerpo 2B6 humanizado, en el que la región VH consiste en los segmentos FR del segmento VH de la línea germinal humana VH1-18 (Matsuda et al. (1998) "The Complete Nucleotide Sequence Of The Human Immunoglobulin Heavy Chain Variable Región Locus," J. Exp. Med. 188:2151-2162) y JH6 (Ravetch et al. (1981) "Structure Of The Human Immunoglobulin Mu Locus: Characterization Of Embryonic And Rearranged J And D Genes," Cell 27(3 Pt. 2): 583-91), y una o más regiones CDR del VH de 2B6, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SED ID NO: 24, SEQ ID nO: 26, o SEQ ID NO: 28. En una realización, el VH de 2B6 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38. En otra realización, el dominio VH de 2B6 tiene la secuencia de aminoácidos de Hu2B6VH, SEQ ID NO: 85, y puede estar codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 86. En otra realización específica, el diacuerpo comprende además una región VL, que consiste en los segmentos FR del segmento VL de la línea germinal humana VK-A26 (Lautner-Rieske et al. (1992) "The Human Immunoglobulin Kappa Locus. Characterization Of The Duplicated A Regions" Eur. J. Immunol. 22:1023-1029) y JK4 (Hieter et al. (1982) "Evolution Of Human Immunoglobulin Kappa J Region Genes," J. Biol. Chem. 257:1516-22), y una o más regiones CDR de 2B6VL, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, y SEQ ID NO: 36. En una realización, el VL de 2B6 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39; SeQ ID NO: 40, o SEQ ID NO: 41. En una realización específica, el VL de 2B6 tiene la secuencia de aminoácidos de Hu2B6VL, SEQ ID NO: 87, y puede estar codificado por la secuencia de nucleótidos proporcionada en la SEQ ID NO: 88.
En otra realización específica, el diacuerpo tiene dominios variables de un anticuerpo 3H7 humanizado, en el que la región VH consiste en los fragmentos FR de un segmento VH de la línea germinal humana y las regiones CDR del VH de 3H7, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 35. En otra realización específica, el anticuerpo 3H7 humanizado comprende además una región VL, que consiste en los segmentos FR de un segmento VL de la línea germinal humana y las regiones CDR de 3H7VL, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
En particular, los dominios de unión se unen inmunoespecíficamente a dominios extracelulares de FcyRIIB humano nativo, y comprenden (o como alternativa consisten en) secuencias de CDR de 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o
1F2, en cualquiera de las siguientes combinaciones: una CDR1 de VH y una CDR1 de VL; una CDR1 de VH y una CDR2 de VL; una CDR1 de VH una CDR2 de VH y una CDR1 de VL; una CDR2 de VH y una CDR2 de VL; una CDR2 de VH una CDR3 de VH y una CDR1 de VH; una CDR3 de VH y una CDR2 de VL; una CDR3 de una CDR3 de VL; una CDR1 de VH1, una CDR2 de VH y una CDR1 de V CDR1 de VH, una CDR2 de una CDR2 de VL; una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de V CDR2 de VH, una CDR3 de una CDR1 de VL, una CDR2 de VH, una CDR3 de VH y una CDR2 de V CDR2 de VH, una CDR2 de una CDR3 de VL; una CDR1 de VH, una CDR1 de VL y una CDR1 de VH, una CDR1 de VL una CDR2 de VH, una CDR1 de VL y una CDR2 de VL; una CDR2 de VH, una CDR1 de VL una CDR3 de VH, una CDR1 de VL y una CDR2 de VL; una CDR3 de VH, una CDR1 de VL una CDR1 de VH, una CDR2 de VH, una CDR3 de VH y una
CDR1 de VL; una CDR1 de VH, una CDR3 de VH y una CDR2 de v L; una CDR1 de VH, una CDR2 de VH, una CDR3 de VH una CDR1 de VH, una CDR2 de VH, una CDR1 de VL y una CDR2 de VL; una CDR1 de VH, una CDR1 de VL y una CDR3 de VL; una CDR1 de VH, una CDR3 de VH, una CDR1 de VL una CDR1 de VH, una CDR3 de VH, una CDR1 de VL y una CDR3 de VL; una CDR2 de VH, una CDR1 de VL y una CDR2 de VL; una CDR2 de VH, una CDR3 de VH, una CDR1 de VL una CDR2 de VH, una CDR3 de VH, una CDR2 de VL y una CDR3 de VL; una CDR1 de VH una CDR3 de VH, una CDR1 de VL y una CDR2 de VL; una CDR1 de VH, una CDR2 de VH una CDR1 de VL y una CDR3 de VL; una CDR1 de VH, una CDR2 de VH, una CDR1 de VL
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y una CDR3 de VL; una CDR1 de VH, una CDR3 de VH, una
CDR1 de VL, una CDR2 de VL, y una CDR3 de VL; una CDR2 de VH, una CDR3 de VH, una CDR1 de VL, una CDR2 de VL, y una CDR3 de VL; o cualquier combinación de las mismas de las CDR de VH y las CDR VL divulgadas en la presente memoria.
Los anticuerpos para obtener dominios de unión a incluir en los diacuerpos de la divulgación pueden caracterizase además por cartografiado de epítopos, de modo que pueden seleccionarse anticuerpos que tienen la máxima especificidad por FcyRIIB en comparación con FcyRIIA. Los métodos de cartografiado de epítopos de los anticuerpos son bien conocidos en la técnica y están incluidos dentro de los métodos de la divulgación. En determinadas realizaciones, pueden usarse proteínas de fusión que comprenden una o más regiones de FcyRIIB en el cartografiado de los epítopos de un anticuerpo de la divulgación. En una realización específica, la proteína difusión contiene la secuencia de aminoácidos de una región de un FcyRIIB fusionado a la parte Fc de IgG2 humana. Cada proteína de fusión puede comprender además sustituciones y/o remplazos de aminoácido de determinadas regiones del receptor con la región correspondiente de un receptor homólogo, por ejemplo, FcyRIIA, como se muestra en la tabla 2 a continuación. pMGX125 y pMGX132 contienen el sitio de unión de IgG del receptor FcyRIIB, el primero con el extremo C de FcyRIIB y el último con el extremo C de FcyRIIA y pueden usarse para diferenciar la unión del extremo C. Los otros tienen sustituciones de FcyRIIA en el sitio de unión de IgG y el extremo
N de FcyIIA o FcyIIB. Estas moléculas pueden ayudar a determinar la parte de la molécula receptora donde se unen los anticuerpos.
Tabla 2. Lista de proteínas de fusión que pueden usarse para investigar el epítopo de los anticuerpos monoclonales anti-FcYRIIB. Los restos 172 a 180 pertenecen al sitio de unión a IgG de FcyRIIA y B. Los aminoácidos específicos de la secuencia de FcyRIIA están en negrita.
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Las proteínas de fusión pueden usarse en cualquier ensayo bioquímico para la determinación de la unión a un anticuerpo anti-FcYRIIB de la divulgación, por ejemplo, un ELISA. En otras realizaciones, puede hacerse confirmación adicional de la especificidad de epítopo usando péptidos con restos específicos remplazados con aquellos de la secuencia de FcyRIIA.
Los anticuerpos pueden caracterizarse usando ensayos para identificar la función de los anticuerpos de la divulgación, particularmente la actividad de modular la señalización de FcyRIIB. Por ejemplo, los ensayos de caracterización pueden medir la fosforilación de restos de tirosina en el motivo ITIM de FcyRIIB, o medir la inhibición de la movilización de calcio generada por el receptor de linfocitos B. Los ensayos de caracterización pueden estar basados en células o pueden ser ensayos sin células.
Ha quedado bien establecido en la técnica que en mastocitos la coagregación de FcyRIIB con el receptor de IgE de alta afinidad, FcsRI, da lugar a la inhibición de la desgranulación inducida por antígeno, la movilización de calcio y la producción de citocinas (Metcalfe D.D. et al. (1997) "Mast Cells," Physiol. Rev. 77:1033-1079; Long E.O. (1999) "Regulation Of Immune Responses Through Inhibitory Receptors," Annu. Rev. Immunol. 17: 875-904). Los detalles moleculares de esta ruta de señalización se han dilucidado recientemente (Ott V. L. (2002) "Downstream Of Kinase, p62(dok), Is A Mediator Of FcgammaIIB Inhibition OfFc Epsilon RI Signaling, "J. Immunol. 162(9):4430-4439). Una vez coagregado con FcsRI, FcyRIIB se fosforila rápidamente en la tirosina en su motivo ITIM, y después recluta la inositol-5-fosfatasa que contiene Src de homología-2 (SHIP), una inositol polifosfato-5-fosfatasa que contiene dominio SH2, que a su vez se fosforila y asocia con Shc y p62dok (p62dok es el prototipo de una familia de moléculas adaptadores, que incluye dominios de señalización tal como un dominio de homología con pleckstrina (dominio PH) en el extremo amino, un dominio a PTB y una región del extremo carboxi que contiene motivos PXXP y numerosos sitios de fosforilación (Carpino et al. (1997) "p62(dok): A Constitutively Tyrosine-Phosphorylated, GAP-Associated Protein In Chronic Myelogenous Leukemia Progenitor Cells," Cell, 88: 197-204; Yamanshi et al. (1997) "Identification Of The Abl- And rasGAP-Associated 62 kDa Protein As A Docking Protein, Dok, " Cell, 88:205-211).
Los anticuerpos anti-FcYRIIB para su uso en la divulgación pueden caracterizarse asimismo por la capacidad de modular una o más respuestas mediadas por IgE. Preferiblemente, se usarán líneas celulares que coexpresan el receptor de alta afinidad por IgE y el receptor de baja afinidad por FcyRIIB en la caracterización de los anticuerpos anti-FcYRIIB en la modulación de las respuestas mediadas por IgE. En una realización específica, se usarán células de una línea celular de leucemia basófila de rata (RBL-H23; Barsumian E.L. et al. (1981) "IgE-Induced Histamine Release From Rat Basophilic Leukemia Cell Lines: Isolation Of Releasing And Nonreleasing Clones," Eur. J. Immunol. 11:317-323) transfectada con FcyRIIB humano de longitud completa. RBL-2H3 es una línea celular de rata bien caracterizada que se ha usado ampliamente para estudiar los mecanismos de señalización después de la activación celular mediada por IgE. Cuando se expresa en células RBL-2H3 y se coagrega con FcsRI, FcyRIIB inhibe la movilización de calcio inducida por FcsRI, la desgranulación y la producción de citocinas (Malbec et al. (1998) "Fc Epsilon Receptor I-Associated Lyn-Dependent Phosphorylation Of Fc Gamma Receptor IIB During Negative Regulation Of Mast Cell Activation," J. Immunol. 160:1647-1658; Daeron et al. (1995) "Regulation Of High-Affinity IgE Receptor-Mediated Mast Cell Activation By Murine Low-Affinity IgG Receptors," J. Clin. Invest. 95:577; Ott V. L. (2002) "Downstream Of Kinase, p62(dok), Is A Mediator Of FcgammaIIB Inhibition Of Fc Epsilon RI Signaling," J. Immunol. 162(9):4430-4439).
Los anticuerpos para su uso en la divulgación también pueden caracterizarse para la inhibición de la activación de mastocitos inducida por FcsRI. Por ejemplo, se sensibilizan células de una línea celular de leucemia basófila de rata (RBL-H23; Barsumian E.L. et al. (1981) "IgE-Induced Histamine Release From Rat Basophilic Leukemia Cell Lines: Isolation Of Releasing And Nonreleasing Clones," Eur. J. Immunol. 11:317-323) que se ha transfectado con FcyRIIB con IgE y se estimula con fragmentos F(ab')2 de IgG de conejo antirratón, para que se agregue a FcsRI en solitario, o con IgG de conejo completa antirratón para que se coagregue con FcyRIIB y FcsRI. En este sistema, la modulación indirecta de las moléculas de señalización posteriores puede ensayarse tras la adición de anticuerpos de la divulgación a las células sensibilizadas y estimuladas. Por ejemplo, puede ensayarse la fosforilación de tirosina de FcyRIIB y el reclutamiento y fosforilación de SHIP, la activación de miembros de la familia de MAP cinasa, incluyendo, aunque sin limitación, Erk1, Erk2, JNK o p38; y la fosforilación de tirosina de p62dok y su asociación con SHIP y RasGAP.
Un ensayo ejemplar para determinar la inhibición de la activación de mastocitos inducida por FcsRI por los anticuerpos de la divulgación puede comprender lo siguiente: transfectar células RBL-H23 con FcyRIIB humano, sensibilizar las células RBL-H23 con IgE; estimular las células RBL-H23 con F(ab')2 de IgG de conejo antirratón (para que se agregue a FcsRI en solitario y provoque la señalización mediada por FcsRI, como control) o estimular células RBL-H23 con IgG de conejo completa antirratón (para que se coagregue con FcyRIIB y FcsRI, provocando la inhibición de la señalización mediada por FcsRI). Las células que se han estimulado con anticuerpos IgG de conejo completos antirratón pueden preincubarse además con los anticuerpos de la divulgación. Medir la actividad dependiente de FcsRI de las células que se han preincubado con los anticuerpos de la divulgación y las células que no se han preincubado con los anticuerpos de la divulgación, y comparar los niveles de la actividad dependiente de FcsRI en estas células indicaría una modulación de la actividad dependiente de FcsRI por los anticuerpos de la divulgación.
El ensayo ejemplar descrito anteriormente puede usarse, por ejemplo, para identificar anticuerpos que bloquean la unión del ligando (IgG) al receptor FcyRIIB y antagonizan la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de FcsRI evitando la coagregación de FcyRIIB and FcsRI. Este ensayo identifica asimismo anticuerpos que potencian la coagregación de FcyRIIB y FcsRI y agonizan la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de FcsRI promoviendo la coagregación de FcyRIIB y FcsRI.
En algunas realizaciones, los diacuerpos anti-FcYRIIB, que comprenden los dominios de unión a epítopo de anticuerpos anti-FcYRIIB identificados descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica, de la divulgación se caracterizan por su capacidad de modular una respuesta mediada por IgE controlando y/o midiendo la desgranulación de los mastocitos o basófilos, preferiblemente en un ensayo basado en células. Preferiblemente, los mastocitos o basófilos para su uso en dichos ensayos se han genomanipulado para que contengan FcyRIIB humano usando métodos recombinantes convencionales conocidos para los expertos en la materia. En una realización específica, los anticuerpos anti-FcYRIIB de la divulgación se caracterizan por su capacidad de modular una respuesta mediada por IgE en un ensayo de liberación de p-hexosaminidasa basado en células (enzima contenida en los gránulos). La liberación de p-hexosaminidasa de los mastocitos y los basófilos es un evento principal en afección alérgica aguda e inflamatoria (Aketani et al. (2001) "Correlation Between Cytosolic Calcium Concentration And Degranulation In RBL-2H3 Cells In The Presence Of Various Concentrations Of Antigen-Specific IgEs," Immunol. Lett. 75: 185-189; Aketani et al. (2000) "A Screening Method For Antigen-Specific IgE Using Mast Cells Based On Intracellular Calcium Signaling," Anal. Chem. 72: 2653-2658). La liberación de otros mediadores inflamatorios incluyendo, aunque sin limitación, serotonina, e histamina puede ensayarse para medir una respuesta mediado por IgE de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria. Aunque no sin intención de limitarse a un mecanismo particular de acción, la liberación de los gránulos tales como los que contienen p-hexosaminidasa de los mastocitos y basófilos es un proceso dependiente de la concentración de calcio intracelular que se inicia por la reticulación de FcyRI con antígeno multivalente.
La capacidad de estudiar mastocitos humanos se ha limitado por la ausencia de cultivos adecuados de mastocitos humanos a largo plazo. Recientemente, se establecieron dos líneas celulares novedosas de mastocitos humanos dependientes de factor de células madre, denominadas LAD 1 y LAD 2, a partir de aspirados de médula ósea de un paciente con sarcoma/leucemia de mastocitos (Kirshenbaum et al. (2003) "Characterization Of Novel Stem Cell Factor Responsive Human Mast Cell Lines LAD 1 And 2 Established From A Patient With Mast Cell Sarcoma/Leukemia; Activation Following Aggregation Of FcRI Or FcyRI," Leukemia research, 27:677-82). Se ha descrito que ambas líneas celulares expresan FcsRI y varios marcadores de mastocitos humanos. Pueden usarse células LAD 1 y 2 para evaluar el efecto de los anticuerpos de la divulgación en respuestas mediadas por IgE. En una realización específica, los ensayos de liberación de p-hexosaminidasa basados en células tales como los descritos supra pueden usarse en células LAD para determinar cualquier modulación de la respuesta mediada por IgE por los anticuerpos anti-FcYRIIB de la divulgación. En un ensayo ejemplar, se sensibilizan mastocitos humanos, por ejemplo, LAD 1, con IgE humana quimérica antinitrofenol (NP) y se exponen a BSA-NP, el antígeno polivalente, y se controla la desgranulación celular midiendo la p-hexosaminidasa liberada en el sobrenadante (Kirshenbaum et al. (2003) "Characterization Of Novel Stem Cell Factor Responsive Human Mast Cell Lines LAD 1 And 2 Established From A Patient With Mast Cell Sarcoma/Leukemia; Activation Following Aggregation Of FcRI Or FcyRI," Leukemia research, 27:677-82).
En algunas realizaciones, si los mastocitos humanos tienen una baja expresión de FcyRIIB endógeno, determinada usando métodos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo, tinción FACS, puede ser difícil controlar y/o detectar diferencias en la activación de la ruta inhibidora mediada por los diacuerpos anti-FcYRIIB de la divulgación. La expresión FcyRIIB puede regularse por aumento usando citocinas y condiciones de crecimiento particulares. Se ha descrito que FcyRIIB está muy regulado por aumento en líneas celulares de monocitos humanos, por ejemplo, THP1 y U937, (Tridandapani et al. (2002) "Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells," J. Biol. Chem., 277(7): 5082-5089) y en monocitos humanos primarios (Pricop et al. (2001) " Differential Modulation Of Stimulatory And Inhibitory Fc Gamma Receptors On Human Monocytes By Th1 And Th2 Cytokines" J. of Immunol., 166: 531-537) por IL4. Se ha descrito que la diferenciación de células U937 con dibutiril AMP cíclico aumenta la expresión de FcyRII (Cameron et al. (2002) "Differentiation Of The Human Monocyte Cell Line, U937, With Dibutyryl CyclicAMP Induces The Expression Of The Inhibitory Fc Receptor, FcgammaRIIB" Immunology Letters 83, 171-179). Por tanto, la expresión de FcyRIIB endógena en mastocitos humanos para su uso en los métodos puede regularse por aumento usando citocinas, por ejemplo, IL-4, IL-13, para potenciar la sensibilidad de la detección.
Los diacuerpos anti-FcYRIIB también pueden ensayarse para la inhibición de la señalización mediada por el receptor de linfocitos B (BCR). La señalización mediada por BCR puede incluir al menos una o más respuestas biológicas posteriores, tales como la activación y proliferación de linfocitos B, la producción de anticuerpos, etc. La coagregación de FcyRIIB y BCR da lugar a la inhibición de la progresión del ciclo celular y la supervivencia celular. Además, la coagregación de FcyRIIB y BCR da lugar a la inhibición de la señalización mediada por BCR.
Específicamente, la señalización mediada por BCR comprende al menos uno o más de los siguientes: modulación de las moléculas de señalización posteriores (por ejemplo, estados de fosforilación de FcyRIIB, reclutamiento de SHIP, localización de Btk y/o PLCy, actividad de MAP cinasa, reclutamiento de Akt (señal antiapoptótica), movilización de calcio, progresión del ciclo celular y proliferación celular).
Aunque numerosas funciones efectoras de inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de BCR están mediadas a través de SHIP, recientemente se ha demostrado que los linfocitos B activados por lipopolisacárido (LPS) de ratones deficientes de SHIP muestran inhibición mediada por FcyRIIB significativa de la movilización de calcio, producción de Ins(1,4,5)P3 y fosforilación de Erk y Akt (Brauweiler et al. (2001) "Partially Distinct Molecular Mechanisms Mediate Inhibitory FcgammaRIIB Signaling In Resting And Activated B Cells," Journal of Immunology, 167(1): 204-211). Por consiguiente, pueden usarse linfocitos B ex vivo de ratones deficientes de SHIP para caracterizar los anticuerpos de la divulgación. Un ensayo ejemplar para determinar la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de BCR por los anticuerpos de la divulgación puede comprender lo siguiente: aislar linfocitos B esplénicos de ratones deficientes de SHIP, activar dichas células con lipopolisacárido y estimular dichas células con F(ab')2 anti-IgM para agregar BCR o con anti-IgM para coagregar BCR con FcyRIIB. Las células que se han estimulado con anti-IgM intacto para coagregar BCR con FcyRIIB pueden preincubarse ademar con los anticuerpos de la divulgación. La actividad dependiente de FcyRIIB de las células puede medirse por técnicas convencionales conocidas en la técnica. Comparar el nivel de la actividad dependiente de FcyRIIB en células que se han preincubado con los anticuerpos y las células que no se han preincubado, y comparar los niveles indicaría una modulación de la actividad dependiente de FcyRIIB por los anticuerpos.
Medir la actividad dependiente de FcyRIIB puede incluir, por ejemplo, medir la movilización de calcio intracelular por citometría de flujo, medir la fosforilación de Akt y/o Erk, medir la acumulación mediada por BCR de PI(3,4,5)P3 o medir la proliferación mediada por FcyRIIB de linfocitos B.
Los ensayos pueden usarse, por ejemplo, para identificar diacuerpos o anticuerpos anti-FcYRIIB para su uso en la divulgación, que modulan la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de BCR bloqueando el sitio de unión de ligando (IgG) al receptor FcyRIIB y antagonizando la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de BCR evitando la coagregación de FcyRIIB y BCR. Los ensayos también pueden usarse para identificar anticuerpos que potencien la coagregación de FcyRIIB y BCR y antagonicen la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de BCR.
Los anticuerpos anti-FcYRIIB también pueden ensayarse para la señalización mediada por FcyRII en monocitos/macrófagos humanos. La coagregación de FcyRIIB con un receptor que albergue el motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor (ITAM) actúa regulando por disminución la fagocitosis mediada por FcyR usando SHIP como efector (Tridandapani et al. (2002) "Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells, " J. Biol. Chem., 277(7): 5082-5089). La coagregación de FcyRIIA con FcyRIIB provoca una rápida fosforilación del resto de tirosina en el motivo ITIM de FcyRIIB, dando lugar a una potenciación en la fosforilación de SHIP, la asociación de SHIP con Shc y la fosforilación de proteínas que tienen el peso molecular de 120 y 60-65 kDa. Además, la coagregación de FcyRIIA con FcyRIIB provoca la regulación por disminución de la fosforilación de Akt, que es una serina-treonina cinasa que está implicada en la regulación celular y sirve para suprimir la apoptosis.
Los diacuerpos anti-FcYRIIB también pueden ensayarse para la inhibición de la fagocitosis mediada por FcyR en monocitos/macrófagos humanos. Por ejemplo, pueden estimularse células de una línea celular monocítica humana, THP-1, con fragmentos Fab de anticuerpo monoclonal de ratón IV.3 contra FcyRII y anticuerpo de cabra antirratón (para agregar FcyRIIA en solitario) o con anticuerpo monoclonal de ratón completo IV.3 y anticuerpo de cabra antirratón (para coagregar FcyRIIA y FcyRIIB). En este sistema, la modulación de las moléculas de señalización posteriores, tal como la fosforilación de tirosina de FcyRIIB, la fosforilación de SHIP, la asociación de SHIP con Shc y la fosforilación de Akt y la fosforilación de proteínas que tienen el peso molecular de 120 y 60-65 kDa pueden ensayarse tras la adición de moléculas de la divulgación a las células estimuladas. Además, la eficacia fagocítica dependiente de FcyRIIB de la línea celular de monocitos puede medirse directamente en presencia y ausencia de los anticuerpos de la divulgación.
Otro ensayo ejemplar para determinar la inhibición de la fagocitosis mediada por FcyR en monocitos/macrófagos humanos por los anticuerpos de la divulgación puede comprender lo siguiente: estimular células THP-1 con Fab de anticuerpo de ratón IV.3 anti-FcYRII y anticuerpo de cabra antirratón (para agregar FcyRIIA en solitario y provocar la señalización mediada por FcyRIIA); o con anticuerpo de ratón anti-FcYRII y anticuerpo de cabra antirratón (para coagregar FcyRIIA y FcyRIIB e inhibir la señalización mediada por FcyRIIA). Las células que se han estimulado con anticuerpo de ratón anti-FcYRII y anticuerpo de cabra antirratón pueden preincubarse además con las moléculas de la divulgación. Medir la actividad dependiente de FcyRIIA de las células estimuladas que se han preincubado con moléculas de la divulgación y células que no se han preincubado con los anticuerpos de la divulgación, y comparar los niveles de la actividad dependiente de FcyRIIA en estas células indicaría una modulación de la actividad dependiente de FcyRIIA por los anticuerpos de la divulgación.
El ensayo ejemplar descrito puede usarse, por ejemplo, para identificar dominios de unión que bloqueen la unión al ligando del receptor FcyRIIB y antagonicen la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de FcyRIIA evitando la coagregación de FcyRIIB y FcyRIIA. Este ensayo identifica asimismo dominios de unión que potencian la coagregación de FcyRIIB y FcyRIIA y agonizan la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de FcyRIIA.
Los dominios de unión a FcyRIIB de interés pueden ensayarse mientras estén comprendidos en los anticuerpos midiendo la capacidad de las células THP-1 de fagocitar glóbulos rojos de oveja (SRBC) opsonizados con IgG marcados con fluoresceína por métodos descritos previamente (Tridandapani et al. (2000) "The Adapter Protein LAT Enhances Fcgamma Receptor-Mediated Signal Transduction In Myeloid Cells," J. Biol. Chem. 275: 20480-7). Por ejemplo, un ensayo ejemplar para medir la fagocitosis comprende: tratar células THP-1 con los anticuerpos de la divulgación o con un anticuerpo de control que no se una a FcyR, comparar los niveles de actividad de dichas células, en el que una diferencia en las actividades de las células (por ejemplo, actividad de formación de rosetas (el número de células THP-1 que se unen a SRBC recubiertas con IgG), actividad de adherencia (el número total de SRBC unidas a células THP-1) y la tasa fagocítica) indicaría una modulación de la actividad dependiente de FcyRIIA por los anticuerpos de la divulgación. Este ensayo puede usarse para identificar, por ejemplo, anticuerpos que bloqueen la unión al ligando del receptor FcyRIIB y antagonicen la inhibición mediada por FcyRIIB de la fagocitosis. Este ensayo también puede identificar anticuerpos que potencien la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de FcyRIIA.
En una realización preferida, los dominios de unión modulan la actividad dependiente de FcyRIIB en monocitos/macrófagos humanos en al menos una o más de las siguiente maneras: modulación de las moléculas de señalización posteriores (por ejemplo, modulación del estado de fosforilación de FcyRIIB, modulación de la fosforilación de SHIP, modulación de la asociación de SHIP y Shc, modulación de la fosforilación de Akt, modulación de la fosforilación de proteínas adicionales de aproximadamente 120 y 60-65 kDa) y modulación de la fagocitosis.
5.1.2 Dominios de unión a CD16A
La siguiente sección analiza proteínas de unión a CD16A que pueden usarse como fuentes para regiones variables de cadena ligera y pesada para la producción de diacuerpos covalentes. En la presente divulgación, las proteínas de unión a CD16A incluyen moléculas que comprenden dominios VL y VH de anticuerpos anti-CD16A, cuyos dominios VH y VL se usan en la producción de los diacuerpos de la presente divulgación.
Puede usarse una diversidad de proteínas de unión a CD16A en relación con la presente divulgación. Las proteínas de unión a CD16A adecuadas incluyen anticuerpos monoclonales humanos o humanizados, así como fragmentos de anticuerpo de unión a CD16A (por ejemplo, scFv o anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, minicuerpos) y otras proteínas de tipo anticuerpo que se unan a CD16A mediante una interacción con un dominio de región variable de cadena ligera, un dominio de región variable de cadena pesada o ambos.
En algunas realizaciones, la unión a CD16A comprende un dominio VL y/o VH que tiene una o más CDR con secuencias derivadas de un anticuerpo no humano anti-CD16A, tal como un anticuerpo de ratón anti-CD16A y una o más regiones estructurales derivadas de secuencias estructurales de una o más inmunoglobulinas humanas. Se conocen varios anticuerpos monoclonales no humanos anti-CD16A, de los que pueden obtenerse las CDR y otras secuencias (véase, por ejemplo, Tamm et al. (1996) "The Binding Epitopes Of Human CD16 (Fc gamma RIII) Monoclonal Antibodies. Implications For Ligand Binding," J. Imm. 157:1576-81; Fleit et al. (1989) pág. 159; LEUKOCYTE TYPING II: HUMAN MYELOID AND HEMATOPOIETIC CELLS, Reinherz et al., ed. Nueva York: Springer-Verlag; (1986); LEUCOCYTE TYPING III: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS McMichael A J, ed., Oxford: Oxford University Press, 1986); LEUKOCYTE TYPING IV: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Kapp et al., ed. Oxford Univ. Press, Oxford; LEUKOCYTE TYPING V: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Schlossman et al., ed. Oxford Univ. Press, Oxford; LEUKOCYTE TYPING VI: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Kishimoto, ed. Taylor & Francis. Además, como se muestra en los ejemplos, pueden obtenerse nuevas proteínas de unión a CD16A que reconocen CD16A humana expresada en células usando métodos bien conocidos para la producción y selección de anticuerpos monoclonales o proteínas de unión relacionadas (por ejemplo, tecnología de hibridoma, presentación en fagos y similares). Véase, por ejemplo, Connell et al. (2002) "Phage Versus Phagemid Libraries For Generation Of Human Monoclonal Antibodies," J. Mol. Biol.
321:49-56; Hoogenboom et al. (2000) "Natural And Designer Binding Sites Made By Phage Display Technology," Imm. Today 21:371078; Krebs et al. (2001) "High-Throughput Generation And Engineering Of Recombinant Human Antibodies," J. Imm. Methods 254:67-84; y otras referencias citadas en la presente memoria. Los anticuerpos monoclonales de una especie no humana pueden quimerizarse o humanizarse usando técnicas de humanización de anticuerpos conocidas en la técnica.
Como alternativa, pueden producirse anticuerpos completamente humanos contra CD16A usando animales transgénicos que tengan elementos de un sistema inmunitario humano (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5569825 y 5545806), usando células de sangre periférica humana (Casali et al. (1986) "Human Monoclonals From Antigen-Specific Selection Of B Lymphocytes And Transformation By EBV" Science 234:476-479), cribando una colección de ADN de linfocitos B humanos de acuerdo con el protocolo general resumido por Huse et al. (1989) "Generation Of A Large Combinatorial Library Of The Immunoglobulin Repertoire In Phage Lambda," Science 246:1275-1281, y por otros métodos.
En una realización preferida, el donador de unión es del anticuerpo 3G8 o una versión humanizada del mismo, por ejemplo, tales como las divulgadas en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2004/0010124. Se contempla que, para algunos fines, puede ser ventajoso usar proteínas de unión a CD16A que se unan al receptor de CD16A en el mismo epítopo al que se une 3G8, o al menos suficientemente cerca de este epítopo para bloquear la unión por 3G8. Los métodos para el cartografiado de epítopos y los experimentos de unión competitiva para identificar proteínas de unión con las propiedades de unión deseadas son bien conocidos para los expertos en la materia de inmunología experimental. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, citado supra; Stahli et al. (1983) "Distinction Of Epitopes By Monoclonal Antibodies," Methods in Enzymology 92:242-253; Kirkland et al. (1986) "Analysis Of The Fine Specificity And Cross-Reactivity Of Monoclonal Anti-Lipid A Antibodies," J. Immunol. 137:3614-3619; Morel et al. (1988) "Monoclonal Antibodies To Bovine Serum Albumin: Affinity And Specificity Determinations" Molec. Immunol. 25:7-15; Cheung et al. (1990) "Epitope-Specific Antibody Response To The Surface Antigen Of Duck Hepatitis B Virus In Infected Ducks," Virology 176:546-552; y Moldenhauer et al. (1990) "Identity Of HML-1 Antigen On Intestinal Intraepithelial T Cells And Of B-ly7 Antigen On Hairy Cell Leukaemia" Scand. J. Immunol.
32:77-82. Por ejemplo, es posible determinar si dos anticuerpos se unen al mismo sitio usando uno de los anticuerpos para capturar el antígeno en una placa de ELISA y después midiendo la capacidad del segundo anticuerpo de unirse al antígeno capturado. La comparación de epítopos también puede conseguirse marcando un primer anticuerpo, directa o indirectamente, con una enzima, radionúclido o fluoróforo, y midiendo la capacidad de un segunda anticuerpo no marcado de inhibir la unión del primer anticuerpo al antígeno en células, en disolución o en una fase sólida.
También es posible medir la capacidad de los anticuerpos de bloquear la unión del receptor de CD16A a complejos inmunitarios formados en placas de ELISA. Dichos complejos inmunitarios se forman recubriendo en primer lugar la placa con un antígeno tal como fluoresceína, después aplicando un anticuerpo antifluoresceína específico a la placa. Este complejo inmunitario entonces sirve como ligando para receptores de Fc solubles tales como sFcRIIIa. Como alternativa, puede formarse un complejo inmunitario soluble y marcarse, directa o indirectamente, con una enzima, radionúclido o fluoróforo. Después puede medirse la capacidad de los anticuerpos de inhibir la unión de estos complejos inmunitarios marcados a receptores de Fc en células, en disolución o en una fase sólida.
Las proteínas de unión a CD16A pueden comprender o no una región Fc de inmunoglobulina humana. Las regiones Fc no están presentes, por ejemplo, en proteínas de unión de scFv. Las regiones Fc están presentes, por ejemplo, en anticuerpos IgG monoclonales tetraméricos humanos o humanizados. Como se describe supra, en algunas realizaciones de la presente divulgación, la proteína de unión a CD16A incluye una región Fc que tiene una función efectora alterada, por ejemplo, afinidad reducida por un ligando efector tal como un receptor de Fc o componente C1 del complemento en comparación con la región Fc inalterada (por ejemplo, Fc de proteínas IgG 1 de origen natural). En una realización, la región Fc no está glucosilada en el aminoácido de la región Fc correspondiente a la posición 297. Dichos anticuerpos carecen de función efectora Fc.
Por tanto, la proteína de unión a CD16A puede no mostrar unión mediada por Fc a un ligando efector tal como un receptor de Fc o el componente C1 del complemento debido a la ausencia del dominio Fc en la proteína de unión mientras que, en otros casos, la ausencia de unión o función efectora se debe a una alteración en la región constante del anticuerpo.
5.1.2.1 Proteínas de unión a CD16A que comprenden secuencias CDR similares a secuencias CDR de mAb 3G8.
Las proteínas de unión a CD16A que pueden usarse en la práctica de la divulgación incluyen proteínas que comprenden una secuencia CDR derivada de (es decir, que tiene una secuencia igual o similar a) las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón 3G8. Se clonaron y secuenciaron ADNc complementarios que codifican las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo monoclonal de ratón 3G8, incluyendo las secuencias que codifican CDR, como se describe. Las secuencias de ácido nucleico y proteínica de 3G8 se proporcionan a continuación. Usando la región variable de ratón y las secuencias CDR, se produjo una gran cantidad de anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden regiones determinantes de complementariedad derivadas de CDR de 3G8 y se analizaron sus propiedades. Para identificar anticuerpos humanizados que se unan a CD16A con alta afinidad y que tengan otras propiedades deseables, se produjeron cadenas pesadas de anticuerpo que comprendían una región VH con las CDR derivadas de 3G8 y se combinaron (por coexpresión) con cadenas ligeras de anticuerpo que comprendían una región VL con las CDR derivadas de 3G8 para producir un anticuerpo tetramérico para su análisis. Las propiedades de los anticuerpos tetraméricos resultantes se determinaron como se describe a continuación. Como se describe a continuación, las proteínas de unión a CD16A que comprenden las CDR de 3G8, tales como las proteínas de anticuerpo humanizado descritas en la presente memoria, pueden usarse de acuerdo con la divulgación.
5.1.2.1.1 Región VH
La proteína de unión a CD16A puede comprender un dominio variable de cadena pesada en que al menos una CDR (y habitualmente tres CDR) tiene la secuencia de una CDR (y más típicamente las tres CDR) de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal de ratón 3G8 y para la que las partes restantes de la proteína de unión son sustancialmente humanas (derivadas de y sustancialmente similares a, la región variable de cadena pesada de un anticuerpo o anticuerpos humanos).
También se describe un anticuerpo 3G8 humanizado o fragmento de anticuerpo que contiene CDR derivadas del anticuerpo 3G8 en una estructura sustancialmente humana, pero en que al menos una de las CDR del dominio variable de cadena pesada difiere en la secuencia de la correspondiente CDR de cadena pesada del anticuerpo de ratón 3G8. Por ejemplo, en una realización, la o las CDR difieren de la secuencia CDR de 3G8 al menos en una o más sustituciones de CDR mostradas que se sabe en la técnica que afectan a la unión de 3G8 a CD16A, como se sabe en la técnica o como se divulga en las tablas 3 y 4A-H. Las proteínas de unión a CD16 adecuadas pueden comprender 0, 1, 2, 3 o 4, o más de estas sustituciones (y a menudo tienen de 1 a 4 de estas sustituciones) y opcionalmente pueden tener sustituciones adicionales también.
Tabla 3. Sustituciones del dominio VH
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Tabla 4A. Secuencias de Vh derivadas de Vh de 3G8*
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*Las letras en la tabla 4A se refieren a secuencias de las tablas 4 B-H. Tabla 4B: FR1
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Tabla 4C: CDR1
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Tabla 4D: FR2
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Tabla 4E: CDR2
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Tabla 4F: FR3
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SKQ II)
NO. Secuencia
146 RLTISKDTSKNQVVLTNDPVDTATYYCAK
147 RLTISKDTSKNQVVLTNDPVDTATYYCAA
14K r l t isk p t sk n q v v l t n d p v d t a t y y c a h
149 RLT: TKDT SKXQVVLTNC PVDTAT YYCAR
150 I RLTITKDTSKNQVVLTNDPVDTATYYCAH
151 RLT: TKDTSKNQVVLTNDPVDTATYYCAQ
152 RLTISKDTSSNQVFLKVDTADTATYYCAQ
153 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAR
154 RLT ISKDTSKNQVVLTMDPVDTAT Y YCAQ
155 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAT
156 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAK | 157 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAA
158 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAH
159 RLTITKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAR
160 RLTITKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAH
161 RLTITKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAQ
Tabla 4G: CDR3
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Tabla 4H: FR4
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En una realización, una proteína de unión a CD16A puede comprender una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es igual que, o similar a, el dominio VH de la construcción Hu3G8VH-1, cuya secuencia se proporciona en la SEQ ID NO: 68. Por ejemplo, la descripción proporciona una proteína de unión a CD16A que comprende un dominio VH con una secuencia que (1) difiere del dominio VH de Hu3G8VH-1 (SEQ ID NO: 68) en cero, una o más de una de las sustituciones en CDR expuestas en la tabla 1; (2) difiere del dominio VH de Hu3G8VH-1 en cero, una o más de una de las sustituciones en la región estructural expuestas en la tabla 1; y (3) es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, a menudo al menos aproximadamente un 90 %, y a veces al menos aproximadamente un 95 % idéntica, o incluso al menos aproximadamente un 98 % idéntica a la secuencia de VH de Hu3G8VH-1 en las posiciones restantes.
Los dominios VH ejemplares de proteínas de unión a CD16 tienen la secuencia de 3G8VH, Hu3G8VH-5 y Hu3G8VH-22 (SEQ ID NO: 79, SeQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 70, respectivamente). Las secuencias de nucleótidos ejemplares que codifican las secuencias de 3G8VH y Hu3G8VH-5 (SEQ ID NO: 79 y SEQ ID NO: 69, respectivamente) se proporcionan por la SEQ ID NO: 80 y SEQ ID NO: 81, respectivamente.
El dominio VH puede tener una secuencia que difiere de la de Hu3G8VH-1 (SEQ ID NO: 68) en al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos 4, al menos cinco o al menos seis de las sustituciones mostradas en la tabla 3. Se cree que estas sustituciones provocan afinidad aumentada por CD16A y/o reducen la inmunogenicidad de una proteína de unión a CD16A cuando se administra a seres humanos. En determinadas realizaciones, el grado de identidad de secuencia con el dominio VH de Hu3G8VH-1 en las posiciones restantes es de al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 98 %.
Por motivos de ilustración y no de limitación, las secuencias de varios dominios VH de la proteína de unión a CD16A se muestran en la tabla 4. Las cadenas pesadas que comprenden estas secuencias fusionadas a una región constante Cy1 humana se coexpresaron con la cadena ligera de hu3G8VL-1 (descrita a continuación) para formar anticuerpos tetraméricos, y se midió la unión de los anticuerpos a CD16A para evaluar el efecto de sustituciones de aminoácido en comparación con el dominio VH de hu3G8VH-1. Construcciones en que el dominio VH tiene una secuencia de hu3G8VH-1, 2, 3, 4, 5, 8, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 42, 43, 44 y 45 mostraron unión de alta afinidad, mostrando los dominios VH de hu3G8VH-6 y -40 VH unión intermedia. Las proteínas de unión a CD16A que comprenden los dominios VH de hu3G8VH-5 y hu3G8VH-22 (SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 70, respectivamente) se considera que tienen propiedades de unión particularmente favorables.
5.1.2.2 Región VL
Se realizaron estudios similares para identificar secuencias de dominio variable de cadena ligera con propiedades de unión favorables. También se describe una proteína de unión a CD16A que contiene un dominio variables de cadena ligera en que al menos una CDR (y sustancialmente tres CDR) tiene la secuencia de una CDR (y más típicamente las tres CDR) de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal de ratón 3G8 y para la que las partes restantes de la proteína de unión son sustancialmente humanas (derivadas de y sustancialmente similares a, la región variable de cadena pesada de un anticuerpo o anticuerpos humanos).
También se describe un fragmento de un anticuerpo 3G8 humanizado que contiene CDR derivadas del anticuerpo 3G8 en una estructura sustancialmente humana, pero en que al menos una de las CDR del dominio variable de cadena ligera difiere en la secuencia de la CDR de cadena ligera del anticuerpo monoclonal de ratón 3G8. En una realización, la o las CDR difieren de la secuencia de 3G8 al menos porque tiene una o más sustituciones de aminoácido en una CDR, tales como una o más sustituciones mostradas en la tabla 2 (por ejemplo, arginina en la posición 24 en CDR1; serina en la posición 25 en CDR1; tirosina en la posición 32 en CDR1; leucina en la posición 33 en CDR1; ácido aspártico, triptófano o serina en la posición 50 en CDR2; serina en la posición 53 en CDR2; alanina o glutamina en la posición 55 en CDR2; treonina en la posición 56 en CDR2; serina en la posición 93 en CDR3; y/o treonina en la posición 94 en CDR3). En diversas realizaciones, el dominio variable puede tener 0, 1,2, 3, 4, 5 o más de estas sustituciones (y a menudo tiene de 1 a 4 de estas sustituciones) y, opcionalmente, puede tener sustituciones adicionales también.
En una realización, una proteína de unión a CD16A adecuada puede comprender una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es igual que, o similar a, el dominio VL de la construcción Hu3G8VL-1 (SEQ ID NO: 71), cuya secuencia se proporciona en la tabla 6. Por ejemplo, la descripción proporciona una proteína de unión a CD16A que comprende un dominio VL con una secuencia que (1) difiere del dominio VL de Hu3G8VL-1 (SEQ ID NO: 71) en cero, una o más de las sustituciones en CDR expuestas en la tabla 5; (2) difiere del dominio VL de Hu3G8VL-1 en cero, una o más de las sustituciones en la región estructural expuestas en la tabla 5; y (3) es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, a menudo al menos aproximadamente un 90 %, y a veces al menos aproximadamente un 95 % idéntica, o incluso al menos aproximadamente un 98 % idéntica a la secuencia de VL de Hu3G8VL-1 (SEQ ID NO: 71) en las posiciones restantes.
Tabla 5. Sustituciones en el dominio Vl de 3G8
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Tabla 6. Secuencias de VL derivadas de VL de 3G8*
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*Las letras en la tabla 6A se refieren a secuencias de las tablas 6B-H. Tabla 6B: FR1
Figure imgf000052_0002
Figure imgf000053_0002
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Tabla 6CCDRI
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SKQ II) Secuencia
NO.
171 RASQDGDSFMN
172 KSSQDGDSFMN
Figure imgf000054_0001
173 KASQDGDSYMN
174 KASQDGDSFLN
175 KASQDGDSFMA
176 KASQDGDSYLA
177 KASSDGDSFMN
178 RASSDGDSFMN
179 KSSSDGDSFMN
180 KASSDGDSYMN
181 KASSDGDSFLN
182 KASSDGDSFFA
Figure imgf000054_0002
183 KASSDGDSYLA
184 KASVDGDSFMN
185 RASVDGDSFMN________________________
186 KSSVDGDSFMN
187 KASVDGDSYMN________________________1
188 KASVDGDSFLN ¡
189 KASVDGDSFMA
190 KASVDGDSYLA
191 KASDDGDSFMN________________________
192 RASDDGDSFMN
193 KSSDDGDSFMN
194 KASDDGDSYMN________________________
195 KASDDGDSFLX________________________ |
196 KASDDGDSFMA
197 KASDDGDSYLA
198 KASFDGDSFMN________________________
199 RASFDGDSFMN
200 KSSFDGDSFMN________________________
201 KASFDGDSYMN
202 KASFDGDSFLN
203 KASFDGDSFMA
204 KASrDGDSYLA
Tabla 6D: FR2
Figure imgf000054_0003
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Tabla 6E: CDR2
Figure imgf000055_0003
Figure imgf000055_0004
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Tabla 6F: FR3
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Tabla 6G: CDR3
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Tabla 6H: FR4
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Figure imgf000058_0002
Los dominios VL ejemplares de proteínas de unión a CD16 tienen la secuencia de 3G8VL, Hu3G8VL-1 o Hu3G8VL-43 (SEQ ID NO: 82, SEQ ID nO: 71 y SEQ ID NO: 72, respectivamente) como se muestra en las tablas 5 y 6. Las secuencias ejemplares que codifican 3G8VL (SEQ ID NO: 82) y Hu3G8VL-1 (SEQ ID NO: 71) se proporcionan en la SEQ ID NO: 83 y SEQ iD NO: 84, respectivamente.
El dominio VL puede tener una secuencia que difiere de la de Hu3G8VL1 (SEQ ID NO: 71) en cero, una, al menos dos, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8 o al menos 9 de las sustituciones mostradas en la tabla 2. Se cree que estas sustituciones provocan afinidad aumentada por CD16A y/o reducen la inmunogenicidad de una proteína de unión a CD16A cuando se administra a seres humanos. En determinadas realizaciones, el grado de identidad de secuencia en las posiciones restantes es de al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 98 %.
Por motivos de ilustración y no de limitación, las secuencias de varios dominios VL de proteínas de unión a CD16A se muestran en la tabla 6. Las cadenas ligeras que comprenden estas secuencias fusionadas a un dominio constante Ck humano se coexpresaron con una cadena pesada de Hu3G8VH (descrita anteriormente) para formar anticuerpos tetraméricos, y se midió la unión de los anticuerpos a CD16A para evaluar el efecto de sustituciones de aminoácido en comparación con el dominio VL de Hu3G8VL-1 (SEQ ID NO: 71). Construcciones en que el dominio VL tiene una secuencia de hu3G8VL-1, 2, 3, 4, 5, 10, 16, 18, 19, 21, 22, 24, 27, 28, 32, 33, 34, 35, 36, 37 y 42 mostraron unión de alta afinidad y hu3G8VL-15, 17, 20, 23, 25, 26, 29, 30, 31, 38, 39, 40 y 41 mostraron unión intermedia. Las proteínas de unión a CD16A que comprenden los dominios VL de hu3G8VL-1, hu3G8VL-22 y hu3G8VL-43 se considera que tienen propiedades de unión particularmente favorables (SEQ ID NO: 71, SEQ iD NO: 73 y SEQ ID NO: 72, respectivamente).
5.1.2.2.1 Combinaciones de dominios VL y/o VH
Como se sabe en la técnica y se describe en otra parte en la presente memoria, las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina pueden expresarse de forma recombinante en condiciones en que se asocian para producir un diacuerpo, o pueden combinarse así in vitro. Por tanto, se apreciará que un dominio VL derivado de 3G8 descrito en la presente memoria puede combinarse con un dominio VH derivado de 3G8 descrito en la presente memoria, para producir un diacuerpo de unión a CD16A, y se contemplan todas estas combinaciones.
Por motivos de ilustración y no de limitación, ejemplos de diacuerpos contra CD16A útiles son aquellos que comprenden al menos un dominio VH y al menos un dominio VL, donde el dominio VH es de hu3G8VH-1, hu3G8VH-22 o hu3G8VH-5 (SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70 y SEQ iD NO: 69, respectivamente) y el dominio VL es de hu3G8VL-1, hu3G8VL-22 o hu3G8VL-43 (SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73 y SEQ ID NO: 41, respectivamente). En particular, anticuerpos humanizados que comprenden hu3G8VH-22 (SEQ iD NO: 22) y hu3G8VL-1, hu3G8VL-22 o hu3G8VL-43 (SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 72, respectivamente), o hu3G8VH-5 (SEQ ID NO: 69) y hu3G8VL-1 (SEQ ID NO: 71) tienen propiedades favorables.
Los expertos en la materia apreciarán que las secuencias de los dominios VL y VH aquí descritos pueden modificarse adicionalmente por métodos conocidos en la técnica tales como maduración de la afinidad (véase, Schier et al. (1996) "Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-ErbB-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site," J. Mol. Biol. 263:551-567; Daugherty et al. (1998) "Antibody Affinity Maturation Using Bacterial Surface Display," Protein Eng. 11:825-832 Boder et al. (1997) "Yeast Surface Display For Screening Combinatorial Polypeptide Libraries" Nat. Biotechnol.
15:553-557; Boder et al. (2000) "Directed Evolution Of Antibody Fragments With Monovalent Femtomolar Antigen-Binding Affinity," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 97:10701-10705; Hudson et al. (2003) "Engineered Antibodies" Nature Medicine 9:129-39). Por ejemplo, las proteínas de unión a CD16A pueden modificarse usando técnicas de maduración de la afinidad para identificar proteínas con afinidad aumentada por CD16A y/o afinidad disminuida por CD16B.
Una proteína de unión a CD16 ejemplar es el anticuerpo de ratón 3G8. Se describen secuencias de aminoácidos que comprenden los dominios VH y VL de 3G8 humanizado en las figuras 2, 9, 14 y se exponen en las SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72.
5.2 Diacuerpos que comprenden regiones Fc o partes de las mismas
Se describen moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fc o partes de los mismos (por ejemplo, un dominio CH2 o CH3). En determinadas realizaciones, el dominio Fc, o parte o partes del mismo, comprende uno o más dominios constantes de la región Fc de IgG2, IgG3 o IgG4 (por ejemplo, CH2 o CH3). También se describen moléculas que comprenden un dominio Fc o parte del mismo, en las que dicho dominio Fc o parte del mismo comprende al menos una modificación de aminoácido (por ejemplo, sustitución) con respecto a un dominio Fc de tipo silvestre comparable o parte del mismo. Los dominios Fc variantes son bien conocidos en la técnica, y se usan principalmente para alterar el fenotipo del anticuerpo que comprende dicho dominio Fc variante que se ensaya en cualquiera de los ensayos de actividad de unión o función efectora bien conocidos en la técnica, por ejemplo, ELISA, análisis de SPR o ADCC. Dichos dominios Fc variantes, o partes de los mismos, tienen uso en la presente divulgación confiriendo o modificando la función efectora presentada por una molécula de diacuerpo de la divulgación que comprende un dominio Fc (o parte del mismo) que se ensaya funcionalmente, por ejemplo, en un ensayo dependiente de NK o dependiente de macrófagos. Las variantes del dominio Fc identificadas que alteran la función efectora se divulgan en la solicitud internacional WO 04/063351, las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos 2005/0037000 y 2005/0064514, y las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° 2006­ 0134709 A1, presentada el 10 de noviembre de 2005, y 2006-0177439 A1 presentada el 15 de diciembre de 2005, solicitadas simultáneamente de los autores de la invención.
También se describe en uso de cualquier variante de Fc conocida en la técnica, tales como las divulgadas en Duncan et al. (1988) "Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG" Nature 332:563-564; Lund et al. (1991) "Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG," J. Immunol. 147:2657-2662; Lund et al. (1992) "Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma RII," Mol. Immunol. 29:53-59; Alegre et al. (1994) "A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo," Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al. (1995) "Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H" Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 92:11980-11984; Jefferis et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation" Immunol. Lett. 44:111-117; Lund et al. (1995) "Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors," FASEB J. 9:115-119; Jefferis et al. (1996) "Modulation Of Fc (Gamma) R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions," Immunol. Lett. 54:101-104; Lund et al. (1996) "Multiple Interactions Of Igg With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains," J. Immunol. 157:4963-4969; Armour et al. (1999) "Recombinant Human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities" Eur. J. Immunol.
29:2613-2624; Idusogie et al. (2000) "Mapping Of The C1Q Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG1 Fc," J. Immunol. 164:4178-4184; Reddy et al. (2000) "Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human Cd4" J. Immunol. 164:1925-1933; Xu et al. (2000) "In Vitro Characterization Of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies," Cell. Immunol. 200:16-26; Idusogie et al. (2001) "Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Compíement," J. Immunol.
166:2571-2575; Shields et aí. (2001) "High Resoíution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R," J. Biol. Chem. 276:6591 -6604; Jefferis et aí. (2002) "Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Modeís," Immunol. Lett. 82:57-65; Presta et aí. (2002) "Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function," Biochem. Soc. Trans. 30:487-490); documento US 5624821; documento US 5885573; documento US 6194551; documento PCT WO 00/42072; documento PCT WO 99/58572.
En determinadas realizaciones, dicha una o más modificaciones a los aminoácidos de la región Fc reducen la afinidad y avidez de la región Fc y, por tanto, la molécula de diacuerpo de la divulgación, por uno o más receptores FcyR. También se describen diacuerpos que comprenden una región Fc variante, o parte de la misma, en los que dicha región Fc variante comprende al menos una modificación de aminoácido con respecto a una región Fc de tipo silvestre, que es una región Fc variante que se une únicamente a un FcyR, en los que dicho FcyR es FcyRIIIA. Los diacuerpos pueden comprender como alternativa una región Fc variante, o parte de la misma, en los que dicha región Fc variante comprende al menos una modificación de aminoácido con respecto a una región Fc de tipo silvestre, que es una región Fc variante que se une únicamente a un FcyR, en los que FcyR es FcyRIIA. Como alternativa, los diacuerpos pueden comprender una región Fc variante, o parte de la misma, en los que dicha región Fc variante comprende al menos una modificación de aminoácido con respecto a una región Fc de tipo silvestre, que es una región Fc variante que se une únicamente a un FcyR, en los que dicho FcyR es FcyRIIB. También se describen moléculas que comprenden un dominio Fc variante en las que dicha variante confiere o media la actividad ADCC aumentada y/o una unión aumentada a FcyRIIA (CD32A), con respecto a una molécula que no comprende dominio Fc o que comprende un dominio Fc de tipo silvestre, que se mide usando métodos conocidos para los expertos en la materia y descritos en la presente memoria. Como alternativa, las moléculas pueden comprender un dominio Fc variante en las que dicha variante confiere o media la actividad ADCC disminuida (u otra función efectora) y/o una unión aumentada a FcyRIIB (CD32B), con respecto a una molécula que no comprende dominio Fc o que comprende un dominio Fc de tipo silvestre, que se mide usando métodos conocidos para los expertos en la materia y descritos en la presente memoria.
Se describe el uso de un dominio Fc que comprende dominios o regiones de dos o más isotipos de IgG. Como se sabe en la técnica, la modificación de aminoácidos de la región Fc puede afectar profundamente a la función efectora mediada por Fc y/o la actividad de unión. Sin embargo, estas alteraciones en las características funcionales pueden refinarse adicionalmente y/o manipularse cuando se implementan en el contexto de isotipos de IgG seleccionados. Asimismo, las características nativas del Fc de isotipo pueden manipularse mediante una o más modificaciones de aminoácido. Los múltiples isotipos de IgG (es decir, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) presentan propiedades físicas y funcionales diferentes incluyendo semivida en suero, fijación del complemento, afinidades de unión a FcyR y actividades de función efectora (por ejemplo, ADCC, CDC) debido a diferencias en las secuencias de aminoácidos de sus dominios de bisagra y/o Fc. En determinadas realizaciones, la modificación de aminoácidos y la región Fc de IgG se seleccionan independientemente basándose en sus actividades respectivas, de unión y/o función efectora diferentes para diseñar un diacuerpo con características deseadas. En la mayoría de las realizaciones, dichas modificaciones de aminoácido y regiones de bisagra/Fc de IgG se han ensayado por separado para la actividad de unión y/o función efectora tal como se describe en la presente memoria o se sabe en la técnica en el contexto de una IgG 1. En determinadas realizaciones, dicha modificación de aminoácidos y región de bisagra/Fc de IgG presentan funcionalidad similar, por ejemplo, afinidad aumentada por FcyRIIA, cuando se ensayan por separado para la unión a FcyR o la función efectora en el contexto de la molécula de diacuerpo u otra molécula que contenga Fc (por ejemplo, una inmunoglobulina). La combinación de dicha modificación de aminoácidos y región Fc de IgG seleccionada, entonces, actúa de forma aditiva o, más preferiblemente, de forma sinérgica para modificar dicha funcionalidad en la molécula de diacuerpo de la divulgación, con respecto a una molécula de diacuerpo de la divulgación que comprende una región Fc de tipo silvestre. En otras realizaciones, dicha modificación de aminoácidos y región Fc de IgG presentan funcionalizadas opuestas, por ejemplo, afinidad aumentada y disminuida, respectivamente, por FcyRIIA, cuando se ensayan por separado para la unión a FcyR y/o función efectora en el contexto de la molécula de diacuerpo u otra molécula que contenga Fc (por ejemplo, una inmunoglobulina) que comprenda una región Fc de tipo silvestre tal como se describe en la presente memoria o se sabe en la técnica; la combinación de dicha modificación de aminoácidos "opuesta" y región de IgG seleccionada entonces actúa atenuando o reduciendo selectivamente una funcionalidad específica en el diacuerpo de la divulgación con respecto a un diacuerpo de la divulgación que no comprende una región Fc o que comprende una región Fc de tipo silvestre del mismo isotipo. Como alternativa, se describen regiones Fc variantes que comprenden combinaciones de modificaciones de aminoácido conocidas en la técnica y regiones de IgG seleccionadas que presentan propiedades novedosas, que son propiedades no detectables cuando dichas modificaciones y/o regiones se ensayaban independientemente tal como se describe en la presente memoria.
Las características funcionales de los múltiples isotipos de IgG, y dominios de los mismos, son bien conocidos en la técnica. Las secuencias de aminoácidos de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 se presentan en las figuras 1A-1B. La selección y/o combinaciones de dos o más dominios a partir de isotipos de IgG específicos para su uso en los métodos pueden basarse en cualquier parámetro conocido de los isotipos precursores incluyendo la afinidad por FcyR (tabla 7; Flesch et al. (2000) "Functions Of The Fc Receptors For Immunoglobulin G," J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156; Chappel et al. (1993) "Identification Of A Secondary Fc Gamma RI Binding Site Within A Genetically Engineered Human IgG Antibody" J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel et al. (1991) "Identification Of The Fc Gamma Receptor Class I Binding Site In Human IgG Through The Use Of Recombinant IgG1/IgG2 Hybrid And Point-Mutated Antibodies," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9036-9040). Por ejemplo, el uso de regiones o dominios de isotipos de IgG que presentan unión limitada o ausente a FcyRIIB, por ejemplo, IgG2 o IgG4, puede encontrar uso particular cuando se desea genomanipular un diacuerpo para maximizar la unión a un receptor activador y minimizar la unión a un receptor inhibidor. Asimismo, el uso de regiones o dominios Fc de isotipos de IgG que se sabe que se unen preferentemente a C1q o FcyRIIIA, por ejemplo, IgG3 (Brüggemann et al. (1987) "Comparison Of The Effector Functions Of Human Immunoglobulins Using A Matched Set Of Chimeric Antibodies," J. Exp. Med. 166:1351-1361), puede combinarse con modificaciones de aminoácido de Fc conocidas en la técnica para potenciar la ADCC, para genomanipular una molécula de diacuerpo de modo que se maximice la actividad de función efectora, por ejemplo, activación del complemento o ADCC.
Tabla 7. Características generales de la unión de IgG a FcyR, adaptada de Flesch y Neppert, 1999, J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156
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A se une solamente a IgG en complejo
5.3 Conjugados moleculares
Las moléculas de diacuerpo de la divulgación pueden fusionarse de forma recombinante o conjugarse químicamente (incluyendo tanto conjugaciones covalentes como no covalentes) a polipéptidos heterólogos (es decir, un polipéptido no relacionado; o parte del mismo, preferiblemente al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos del polipéptido para generar proteínas de fusión. La fusión no tiene que ser directa necesariamente, pero puede producirse mediante secuencias conectoras.
Además, las moléculas de diacuerpo de la divulgación (es decir, polipéptidos) pueden conjugarse con un agente terapéutico o un resto de fármaco que modifique una respuesta biológica dada. Como alternativa a la conjugación directa, debido a los múltiples sitios de unión a epítopo en las moléculas de diacuerpo multivalentes, por ejemplo, tetravalentes de la divulgación, puede diseñarse al menos una región de unión del diacuerpo para que se una al agente terapéutico o resto de fármaco deseado sin afectar a la unión del diacuerpo.
Los agentes terapéuticos o restos de fármaco no deben interpretarse limitados a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas (es decir, PE-40), o toxina diftérica, ricina, gelonina y proteína antivírica de fitolaca, una proteína tal como factor de necrosis tumoral, interferones incluyendo, aunque sin limitación, interferón-a (IFN-a), interferón-p (IFN-p), factor de crecimiento de nervios (NGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), activador de plasminógeno tisular (TPA), un agente apoptótico (por ejemplo, TNF-a, TNF-p, AIM I como se divulga en la publicación PCT n.° WO 97/33899), AIM II (véase, la publicación PCT n.° WO 97/34911), ligando de Fas y VEGI (publicación PCT n.° WO 99/23105), un agente trombótico o un agente antiangiogénico (por ejemplo, angiostatina o endostatina), o un modificador de respuesta biológica tal como, por ejemplo, una linfocina (por ejemplo, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos ("GM-CSF"), y fator estimulador de colonias de granulocitos ("G-CSF"), factor estimulador de colonias de macrófagos, ("M-CSF"), o un factor de crecimiento (por ejemplo, hormona del crecimiento ("GH"); proteasas o ribonucleasas).
Las moléculas de diacuerpo de la divulgación (es decir, polipéptidos) pueden fusionarse a secuencias marcadoras, tal como un péptido para facilitar la purificación. En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexahistidina, tal como la marca proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, estando muchos de ellos disponibles en el mercado. Como se describe en Gentz et al. (1989) "Bioassay For Trans-Activation Using Purified Human Immunodeficiency Virus TAT-Encoded Protein: Trans-Activation Requires mRNA Synthesis," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:821-824, por ejemplo, la hexahistidina proporciona purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras marcas peptídicas útiles para la purificación incluyen, aunque sin limitación, la marca de hemaglutinina "HA", que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson et al. (1984) "The Structure Of An Antigenic Determinant In A Protein," Cell, 37:767-778) y la marca "flag" (Knappik et al. (1994) "An Improved Affinity Tag Based On The FLAG Peptide For The Detection And Purification Of Recombinant Antibody Fragments" Biotechniques, 17(4):754-761).
Pueden generarse proteínas de fusión adicionales mediante las técnicas de reorganización génica, reorganización de motivos, reorganización de exones y/o reorganización de codones (colectivamente mencionados como "reorganización de ADN"). La reorganización de ADN puede emplearse para alterar las actividades de moléculas de la divulgación (por ejemplo, sitios de unión a epítopo con mayores afinidades y menores tasas de disociación). Véanse, en general, las patentes de Estados Unidos n.° 5605793; 5811238; 5830721; 5834252; y 5837458, y Patten et al. (1997) "Applications Of DNA Shuffling To Pharmaceuticals And Vaccines" Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-733; Harayama (1998) "Artificial Evolution By DNA Shuffling," Trends Biotechnol. 16:76-82; Hansson et al. (1999) "Evolution Of Differential Substrate Specificities In Mu Class Glutathione Transferases Probed By DNA Shuffling," J. Mol. Biol. 287:265-276; y Lorenzo et al. (1998) "PCR-Based Method For The Introduction Of Mutations In Genes Cloned And Expressed In Vaccinia Virus," BioTechniques 24:308-313. Las moléculas de diacuerpo de la divulgación, o los ácidos nucleicos que codifican las moléculas de la divulgación, pueden alterarse además sometiéndolos a mutagénesis aleatoria por PCR propensa a errores, inserción aleatoria de nucleótidos u otros métodos antes de la recombinación. Puede recombinarse una o más partes de un polinucleótido que codifica una molécula de la divulgación con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.
La presente divulgación también abarca moléculas de diacuerpo de la divulgación conjugada con o que reconocen inmunoespecíficamente un agente de diagnóstico o terapéutico o cualquier otra molécula para la que se desee aumentar/disminuir la semivida en suero y/o dirigir a un subconjunto particular de células. Las moléculas de la divulgación pueden usarse de forma diagnóstica para, por ejemplo, controlar el desarrollo o progresión de una enfermedad, trastorno o infección como parte de un procedimiento de ensayo clínico para, por ejemplo, determinar la eficacia de una pauta de tratamiento dada. La detección puede verse facilitada por el acoplamiento de las moléculas de la divulgación a una sustancia detectable o por las moléculas que reconocen inmunoespecíficamente la sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos, metales emisores de positrones y iones de metales paramagnéticos no radioactivos. La sustancia detectable puede acoplarse o conjugarse directamente a las moléculas de la divulgación o indirectamente, mediante un intermedio (tal como, por ejemplo, un conector conocido en la técnica) usando técnicas conocidas en la técnica, o la molécula puede reconocer inmunoespecíficamente la sustancia detectable: unión inmunoespecífica a dicha sustancia. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4741900 para iones de metales que pueden conjugarse con anticuerpos para su uso como agentes de diagnóstico. Dicho diagnóstico y detección pueden conseguirse diseñando las moléculas para que reconozcan inmunoespecíficamente la sustancia detectable o acoplando las moléculas de la divulgación a sustancias detectables incluyendo, aunque sin limitación, diversas enzimas, enzimas incluyendo, aunque sin limitación, peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; complejos de grupo prostético tales como, aunque sin limitación, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes tales como, aunque sin limitación, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriacinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; material luminiscente tal como, aunque sin limitación, luminol; materiales bioluminiscentes tales como, aunque sin limitación, luciferasa, luciferina y aecuorina; material radioactivo tal como, aunque sin limitación, bismuto (213Bi), carbono (14C), cromo (51Cr), cobalto (57Co), flúor (18F), gadolinio (153Gd, 159Gd), galio (68Ga, 67Ga), germanio (68Ge), holmio (166Ho), indio (115In, 113In, 112In, 111In), yodo (131I, 125I, 123I, 121I), lantano (140La), lutecio (177Lu) manganeso (54Mn), molibdeno (99Mo), paladio (103Pd), fósforo (32P), praseodimio (142Pr), promecio (149Pm), renio (186Re, 188Re), rodio ( 05Rh), rutenio (97Ru), samario (153Sm), escandio (47Sc), selenio (75Se), estroncio (85Sr), azufre (35S), tecnecio (99Tc), talio (201Ti), estaño (113Sn, 117Sn),' tritio (3H), xenón (133Xe), iterbio (169Yb, 175Yb), itrio (90Y), cinc (65Zn); metales emisores de positrones usando diversas tomografías de emisión de positrones, e iones de metales paramagnéticos o radioactivos.
Las moléculas de diacuerpo de la divulgación pueden reconocen inmunoespecíficamente o conjugarse con un resto terapéutico tal como una citotoxina (por ejemplo, un agente citostático o citocida), un agente terapéutico o un elemento radioactivo (por ejemplo, emisores alfa, emisores gamma, etc.). Las citotoxinas o agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracinadiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoesteroides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen, aunque sin limitación, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo, dacarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisdiclorodiamina platino (II) ((DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (antiguamente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (antiguamente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).
Además, una molécula de diacuerpo de la divulgación puede conjugarse con o diseñarse para que reconozca inmunoespecíficamente restos terapéuticos tales como materiales radioactivos o quelantes macrocíclicos útiles para conjugar iones radiometálicos (véase anteriormente para los ejemplos de materiales radioactivos). En determinadas realizaciones, el quelante macrocíclico es ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N"'-tetraacético (DOTA) que puede adherirse al polipéptido mediante una molécula conectora. Dichas moléculas conectoras son habitualmente conocidas en la técnica y se describen en Denardo et al. (1998) "Comparison Of 1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-N,N’,N",N"’-Tetraacetic Acid (DOTA)-Peptide-ChL6, A Novel Immunoconjugate With Catabolizable Linker, To 2-Iminothiolane-2-[p-(bromoacetamido)benzyl]-DOTA-ChL6 In Breast Cancer Xenografts," Clin. Cancer Res. 4:2483-2490; Peterson et al. (1999) "Enzymatic Cleavage Of Peptide-Linked Radiolabels From Immunoconjugates," Bioconjug. Chem. 10:553-; y Zimmerman et al., (1999) "A Triglycine Linker Improves Tumor Uptake And Biodistributions Of 67-Cu-Labeled Anti-Neuroblastoma mAb chCE7 F(ab)2 Fragments" Nucl. Med. Biol. 26:943-950.
Las técnicas para conjugar dichos restos terapéuticos con polipéptidos, incluyendo, por ejemplo, dominios Fc, son bien conocidas; véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (ed.), 1985, pág. 243-56, Alan R. Liss, Inc.); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2.a Ed.), Robinson et al. (ed.), 1987, pág. 623-53, Marcel Dekker, Inc.); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (ed.), 1985, pág. 475-506); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (ed.), 1985, pág. 303-16, Academic Press; y Thorpe et al. (1982) "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugales," Immunol. Rev., 62:119-158.
La molécula de diacuerpo de la divulgación puede administrarse con o sin un resto terapéutico conjugado con la misma, administrarse en solitario o en combinación con uno o más factores citotóxicos y/o una o más citocinas para su uso como tratamiento terapéutico. Cuando se administra en solitario, al menos un epítopo de una molécula de diacuerpo multivalente, por ejemplo, tetravalente, puede diseñarse para que reconozca inmunoespecíficamente un agente terapéutico, por ejemplo, uno o más factores citotóxicos y/o una o más citocinas, que pueden administrarse simultánea o posteriormente a la molécula de la divulgación. De esta manera, la molécula de diacuerpo puede dirigir específicamente el agente terapéutico de una manera similar a la conjugación directa. Como alternativa, una molécula de la divulgación puede conjugarse con un anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo como se describe por Segal en la patente de Estados Unidos n.° 4676980. Las moléculas de diacuerpo de la divulgación también pueden adherirse a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos o purificación del antígeno diana. Dichos soportes sólidos incluyen, aunque sin limitación, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, poli(cloruro de vinilo) o polipropileno.
5.4 Caracterización de la unión de moléculas de diacuerpo
Las moléculas de diacuerpo de la presente divulgación pueden caracterizarse de una diversidad de formas. En particular, las moléculas de la divulgación pueden ensayarse para la capacidad de unirse inmunoespecíficamente a un antígeno, por ejemplo, FcRIIIA o FcRIIB, o, cuando la molécula comprende un dominio Fc (o parte del mismo) para la capacidad de presentar interacciones de Fc-FcyR, es decir, unión específica de un dominio Fc (o parte del mismo) a un FcyR. Dicho ensayo puede realizarse en disolución (por ejemplo, Houghten (1992) "The Use Of Synthetic Peptide Combinatorial Libraries For The Identification Of Bioactive Peptides," BioTechniques, 13:412-421), en microesferas (Lam (1991) "A New Type Of Synthetic Peptide Library For Identifying Ligand-Binding Activity" Nature, 354:82-84), en chips (Fodor (1993) "Multiplexed Biochemical Assays With Biological Chips," Nature, 364:555-556), en bacterias (patente de Estados Unidos n.° 5223409), en esporas (patentes de Estados Unidos n.° 5571698; 5403484; y 5223409), en plásmidos (Cull et al. (1992) "Screening For Receptor Ligands Using Large Libraries Of Peptides Linked To The C Terminus Of The Lac Repressor" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1865-1869) o en fagos (Scott et al. (1990) "Searching For Peptide Ligands With An Epitope Library," Science, 249:386-390; Devlin (1990) "Random Peptide Libraries: A Source Of Specific Protein Binding Molecules" Science, 249:404-406; Cwirla et al. (1990) "Peptides On Phage: A Vast Library Of Peptides For Identifying Ligands," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382; y Felici (1991) "Selection Of Antibody Ligands From A Large Library Of Oligopeptides Expressed On A Multivalent Exposition Vector," J. Mol. Biol., 222:301-310). Las moléculas que se ha identificado que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno, por ejemplo, FcyRIIIA, entonces pueden ensayarse para su especificidad y afinidad por el antígeno.
Las moléculas de la divulgación que se han genomanipulado para que comprendan múltiples dominios de unión a epítopo pueden ensayarse para la unión inmunoespecífica a uno o más antígenos (por ejemplo, antígeno canceroso y reactividad cruzada con otros antígenos (por ejemplo, FcyR)) o, cuando las moléculas comprenden un dominio Fc (o parte del mismo) para interacciones de Fc-FcyR por cualquier método conocido en la técnica. Los inmunoensayos que pueden usarse para analizar la unión inmunoespecífica, la reactividad cruzada y las interacciones de Fc-FcyR incluyen, aunque sin limitación, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos usando técnicas tales como transferencias de Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunoadsorción enzimática), inmunoensayos "emparedados", ensayos de inmunoprecipitación, reacción de precipitina, reacción de precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, por nombrar solo unos pocos. Dichos ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel et al., ed, 1994, Current Protocols in Molecular Biology. Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York).
La afinidad de unión y la disociación de la interacción del antígeno y el dominio de unión o la interacción de Fc-FcyR pueden determinarse por ensayos de unión competitivos. Un ejemplo de un ensayo de unión competitivo es un radioinmunoensayo que comprende la incubación de antígeno marcado, tal como FcyR tetramérico (por ejemplo, 3H o 125I, véase la sección 5.4.1) con una molécula de interés (por ejemplo, moléculas de la presente divulgación que comprenden múltiples dominios de unión a epítopo en presencia de cantidades crecientes de epítopo no marcado, tal como FcyR tetramérico (véase la sección 5.4.1), y la detección de la molécula unida al antígeno marcado. La afinidad de la molécula de la presente divulgación por un antígeno y la disociación de unión pueden determinarse a partir de los datos de saturación por análisis de Scatchard.
Las afinidades y propiedades de unión de las moléculas de la divulgación por un antígeno o FcyR pueden determinarse inicialmente usando ensayos in vitro (ensayos de base bioquímica o inmunológica) conocidos en la técnica para las interacciones del antígeno y el dominio de unión o de Fc-FcyR, incluyendo, aunque sin limitación, ensayo de ELISA, ensayos de resonancia de plasmones superficiales, ensayos de inmunoprecipitación. Preferiblemente, las propiedades de unión de las moléculas de la divulgación también se caracterizan por ensayos funcionales in vitro para determinar una o más funciones celulares efectoras mediadoras de FcyR, como se describe en la sección 5.4.2. En las realizaciones más preferidas, las moléculas de la divulgación tienen propiedades de unión similares en modelos in vivo (tales como los descritos y divulgados en la presente memoria) como aquellas en ensayos de base in vitro. Sin embargo, la presente divulgación no excluye moléculas de la divulgación que no muestren el fenotipo deseado en ensayos de base in vitro, pero muestren el fenotipo deseado in vivo.
En algunas realizaciones, el cribado y la identificación de moléculas que comprenden múltiples dominios de unión a epítopo y, opcionalmente, dominios Fc (o partes de los mismos) se hacen en ensayos de base funcional, preferiblemente en de una manera de alto rendimiento. Los ensayos de base funcional pueden ser cualquier ensayo conocido en la técnica para caracterizar una o más funciones celulares efectoras mediadas por FcyR tales como las descritas en la presente memoria en las secciones 5.4.2 y 5.4.3. Ejemplos no limitantes de funciones celulares efectoras que pueden usarse de acuerdo con los métodos descritos incluyen, aunque sin limitación, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis dependiente de anticuerpos, fagocitosis, opsonización, opsonofagocitosis, unión celular, formación de rosetas, unión a C1q y citotoxicidad mediada por células dependiente del complemento.
En una realización preferida, se usa análisis cinético BIAcore para determinar la unión y disociación de moléculas de la presente divulgación a un antígeno y/o FcyR. El análisis cinético BIAcore comprende analizar la unión y disociación de un antígeno o FcyR de chips con moléculas inmovilizadas (por ejemplo, moléculas que comprenden dominios de unión a epítopo o dominios Fc (o partes de los mismos), respectivamente) en su superficie. El análisis BIAcore se describe en la sección 5.4.3.
Preferiblemente, la clasificación celular actividad por fluorescencia (FACS), usando cualquiera de las técnicas conocidas por los expertos en la materia, se usa para ensayos de base inmunológica o funcional para caracterizar moléculas de la divulgación. Los clasificadores de flujo pueden examinar rápidamente una gran cantidad de células individuales que pueden haberse unido, por ejemplo, opsonizado, por las moléculas de la divulgación (por ejemplo, 10-100 millones de células por hora) (Shapiro et al. (1995) Practical Flow Cvtometrv). Adicionalmente, parámetros específicos usados para la optimización del comportamiento del diacuerpo incluyen, aunque sin limitación, la concentración del antígeno (es decir, el complejo tetramérico de FcyR, véase la sección 5.4.1), el tiempo de competición cinética o la rigurosidad de FACS, que pueden variarse cada uno de ellos para seleccionar las moléculas de diacuerpos que comprendan moléculas de la divulgación que presenten propiedades de unión específicas, por ejemplo, unión simultánea a múltiples epítopos. Los citómetros de flujo para clasificar y examinar células biológicas son bien conocidos en la técnica. Se describen citómetros de flujo conocidos, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos n.° 4347935; 5464581; 5483469; 5602039; 5643796; y 6211477. Otros citómetros de flujo conocidos son el sistema FACS Vantage™ fabricado por Becton Dickinson and Company, y el sistema COPAS™ fabricado por Union Biometrica.
La caracterización de la afinidad de unión a antígeno diana o afinidad de unión de Fc-FcyR, y la evaluación de la densidad del antígeno diana o FcyR en una superficie celular puede hacerse por métodos bien conocidos en la técnica, tales como análisis de Scatchard o mediante el uso de kits según las instrucciones del fabricante, tal como Quantum™ Simply Cellular ® (Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN). El uno o más ensayos funcionales pueden ser cualquier ensayo conocido en la técnica para caracterizar una o más funciones celulares efectoras mediadas por FcyR como saben los expertos en la materia o se describe en la presente memoria. Las moléculas descritas en la presente memoria que comprenden múltiples dominios de unión a epítopo y, opcionalmente, un dominio Fc (o parte del mismo) se ensayan en un ensayo ELISA para la unión a uno o más antígenos diana o uno o más FcyR, por ejemplo, FcyRIIIA, FcyRIIA, FcyRIIA; seguido de uno o más ensayos de ADCC. En algunas realizaciones, las moléculas de la divulgación se ensayan además usando un ensayo basado en resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo, BIAcore. Los ensayos basados en resonancia de plasmones superficiales son bien conocidos en la técnica, y se analizan además en la sección 5.4.3, y se ejemplifican en la presente memoria, por ejemplo, en el ejemplo 6.1.
En realizaciones mucho más preferidas, las moléculas de la invención que comprenden múltiples dominios de unión a epítopo y, opcionalmente, un dominio Fc (o parte del mismo) se caracterizan además en un modelo animal para la interacción con un antígeno diana (por ejemplo, un FcyR) o para la interacción de Fc-FcyR. Cuando tienen que evaluarse interacciones de Fc-FcyR, los modelos animales preferidos para su uso en los métodos son, por ejemplo, ratones transgénicos que expresan FcyR humanos, por ejemplo, cualquier modelo de ratón descrito en la patente de Estados Unidos n.° 5877397 y 6676927. Ratones transgénicos adicionales para su uso en dichos métodos incluyen, aunque sin limitación, ratones atímicos con inactivación de FcyRIIIA que portan FcyRIIIA humano; ratones atímicos con inactivación de FcyRIIIA que portan FcyRIIA humano; ratones atímicos con inactivación de FcyRIIIA que portan FcyRIIB humano y FcyRIIIA humano; ratones atímicos con inactivación de FcyRIIIA que portan FcyRIIB humano y FcyRIIA humano; ratones atímicos con inactivación de FcyRIIIA y FcyRIIA que portan FcyRIIIA y FcyRIIA humano y ratones atímicos con inactivación de FcyRIIIA, FcyRIIA y FcyRIIB que portan FcyRIIIA, FcyRIIA y FcyRIIB humano.
5.4.1 Ensayos de unión que comprenden FcyR
La caracterización de la unión a FcyR por moléculas que comprenden un dominio Fc (o parte del mismo) y/o que comprenden dominio de unión a epítopo específico para un FcyR puede hacerse usando cualquier FcyR, incluyendo, aunque sin limitación, variantes polimórficas de FcyR. En algunas realizaciones, se usa una variante polimórfica de FcyRIIIA, que contiene una fenilalanina en la posición 158. En otras realizaciones, la caracterización se hace usando una variante polimórfica de FcyRIIIA que contiene una valina en la posición 158. FcyRIIIA 158V presenta una mayor afinidad por lgG1 que 158F y una actividad ADCC aumentada (véase, por ejemplo, Koene et al. (1997) "Fc gammaRIIIa-158V/F Polymorphism Influences The Binding Of IgG By Natural Killer Cell Fc gammaRIIIa, Independently Of The Fc gammaRIIIa-48L/R/H Phenotype," Blood, 90:1109-14; Wu et al. (1997) "A Novel Polymorphism Of FcgammaRIIIa (CD16) Alters Receptor Function And Predisposes To Autoimmune Disease," J. Clin. Invest. 100: 1059-70; este resto, de hecho, interactúa directamente con la región de bisagra inferior de lgG1 como se muestra recientemente por los estudios de cocristalización de lgG1 -FcyRIIIA, véase, por ejemplo, Sondermann et al. (2000) "The 3.2-A Crystal Structure Of The Human IgG1 Fc Fragment-Fc gammaRIII complex" Nature, 406(6793):267-273. Los estudios han demostrado que, en algunos casos, los anticuerpos terapéuticos tienen eficacia mejorada en paciente homocigóticos para FcyRIIIA-158V. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD20 Rituximab era terapéuticamente más eficaz en pacientes homocigóticos para FcyRIIIA158V en comparación con pacientes homocigóticos para FcyRIIIA 158F (véase, por ejemplo, Cartron et al. (2002) "Therapeutic Activity Of Humanized Anti-CD20 Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fc Receptor FcgammaRIIIA Gene," Blood, 99(3): 754-758). En otras realizaciones, moléculas terapéuticas que comprenden esta región también pueden ser más eficaces en pacientes heterocigóticos para FcyRIIIA-158V y FcyRIIIA-158F, y en pacientes con FcyRIIA-131H. Aunque no se pretende limitarse a un mecanismo de acción particular, la selección de moléculas de la divulgación con alotipos alternativos puede proporcionar variantes que, una vez genomanipuladas en diacuerpos terapéuticos, serán clínicamente más eficaces para pacientes homocigóticos para dicho alotipo.
Se desarrollo un ensayo de unión de FcyR para determinar la unión de las moléculas de la divulgación a FcyR y, en particular, para determinar la unión de dominios Fc a FcyR. El ensayo permitió la detección y cuantificación de interacciones de Fc-FcyR, a pesar de la afinidad inherentemente débil del receptor por su ligando, por ejemplo, en el intervalo micromolar para FcyRIIB y FcyRIIIA. El método se describe en detalle en la solicitud internacional WO 04/063351 y las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos 2005/0037000 y 2005/0064514. En resumen, el método implica la formación de un complejo de FcyR que pueda usarse en cualquier inmunoensayo convencional conocido en la técnica, por ejemplo, FACS, ELISA, resonancia de plasmones superficiales, etc. Adicionalmente, el complejo de FcyR tiene una avidez mejorada por una región Fc, con respecto a un FcyR que no está en complejo. De acuerdo con la divulgación, el complejo molecular preferido es un complejo inmunitario tetramérico, que comprende: (a) la región soluble de FcyR (por ejemplo, la región soluble de FcyRIIIA, FcyRIIA o FcyRIIB); (b) una secuencia AVITAG de 15 aminoácidos biotinilada (AVITAG) unida de forma funcional al extremo C de la región soluble de FcyR (por ejemplo, la región soluble de FcyRIIIA, FcyRIIA o FcyRIIB); y (c) estreptavidinaficoeritrina (SA-PE); en una relación molar para formar un complejo de FcyR tetramérico (preferiblemente en una relación molar de 5:1). La proteína de fusión se biotinila enzimáticamente usando, por ejemplo, la enzima Bir A de E. coli, una biotina ligasa que biotinila específicamente un resto de lisina en la secuencia AVITAG de 15 aminoácidos. Las proteínas FcyR solubles biotiniladas entonces se mezclan con SA-PE en una relación molar de SA-PE 1X:FcyR soluble biotinilado 5X para formar un complejo de FcyR tetramérico.
Se ha demostrado que polipéptidos que comprenden regiones Fc se unen a complejos de FcyR tetraméricos con al menos una afinidad 8 veces mayor que el FcyR monomérico que no está en complejo. La unión de los polipéptidos que comprenden regiones Fc a los complejos de FcyR tetraméricos puede determinarse usando técnicas convencionales conocidas para los expertos en la materia, tales como, por ejemplo, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), radioinmunoensayos, ensayos ELISA, etc.
También se describe el uso de los complejos inmunitarios que comprenden moléculas de la divulgación, y se forman de acuerdo con los métodos descritos anteriormente, para determinar la funcionalidad de moléculas que comprenden una región Fc en ensayos basados en células o sin células.
Por cuestiones de conveniencia, los reactivos pueden proporcionarse en un kit de ensayo, es decir, una combinación de reactivos envasados para ensayar la capacidad de moléculas que comprenden regiones Fc de unirse a complejos de FcyR tetraméricos. También se contemplan otras formas de complejos moleculares para su uso en la determinación de interacciones de Fc-FcyR para su uso en los métodos, por ejemplo, proteínas de fusión.
5.4.2 Ensayos funcionales de moléculas con cadenas pesadas variantes
También se describe la caracterización de las moléculas descritas en la presente memoria que comprenden múltiples dominios de unión a epítopo y, opcionalmente, dominios Fc (o partes de los mismos) usando ensayos conocidos para los expertos en la materia para identificar la función celular efectora de las moléculas. También se describe la caracterización de las moléculas de la divulgación para la función celular efectora mediada por FcyR. Adicionalmente, cuando al menos uno de los antígenos diana de la molécula de diacuerpo de la divulgación es un FcyR, la unión del FcyR por la molécula de diacuerpo puede servir para activar las rutas mediadas por FcyR similares a las activadas por la unión de FcyR-Fc. Por tanto, cuando al menos un dominio de unión a epítopo de la molécula de diacuerpo reconoce un FcyR, la molécula de diacuerpo puede provocar la función celular efectora mediada por FcyR sin que contenga un dominio Fc (o parte del mismo), o sin unión concomitante de Fc-FcyR. Ejemplos de funciones celulares efectoras que pueden ensayarse incluyen, aunque sin limitación, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, fagocitosis, opsonización, opsonofagocitosis, unión a C1q y citotoxicidad mediada por células dependiente del complemento. Puede usarse cualquier ensayo basado en células o sin células conocido por los expertos en la materia para determinar la actividad de función celular efectora (para ensayos de células efectoras, véase Perussia et al. (2000) "Assays For Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC) And Reverse ADCC (Redirected Cytotoxicity) In Human Natural Killer Cells," Methods Mol. Biol.
121: 179-92; Baggiolini et al. (1988) "Cellular Models For The Detection And Evaluation Of Drugs That Modulate Human Phagocyte Activity," Experientia, 44(10): 841-848; Lehmann et al. (2000) "Phagocytosis: Measurement By Flow Cytometry," J. Immunol. Methods, 243(1-2): 229-42; Brown (1994) "In Vitro Assays Of Phagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes: Receptor Modulation And Signal Transduction," Methods Cell Biol., 45: 147-64; Munn et al. (1990) "Phagocytosis Of Tumor Cells By Human Monocytes Cultured In Recombinant Macrophage Colony-Stimulating Factor," J. Exp. Med., 172: 231-237, Abdul-Majid et al. (2002) "Fc Receptors Are Critical For Autoimmune Inflammatory Damage To The Central Nervous System In Experimental Autoimmune Encephalomyelitis" Scand. J. Immunol. 55: 70-81; Ding et al. (1998) "Two Human T Cell Receptors Bind In A Similar Diagonal Mode To The HLA-A2/Tax Peptide Complex Using Different TCR Amino Acids" Immunity 8:403-411).
En una realización, las moléculas de la divulgación pueden ensayarse para la fagocitosis mediada por FcyR en monocitos humanos. Como alternativa, la fagocitosis mediada por FcyR de las moléculas de la divulgación puede ensayarse en otros fagocitos, por ejemplo, neutrófilos (leucocitos polimorfonucleares; PMN); monocitos de sangre periférica humana, macrófagos derivados de monocitos, que pueden obtenerse usando procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la materia (por ejemplo, véase Brown (1994) "In Vitro Assays Of Phagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes: Receptor Modulation And Signal Transduction," Methods Cell Biol., 45: 147-164). En una realización, la función de las moléculas de la divulgación se caracteriza midiendo la capacidad de las células THP-1 de fagocitar glóbulos rojos de oveja (SRBC) opsonizados con IgG marcados con fluoresceína por métodos descritos previamente (Tridandapani et al. (2000) "The Adapter Protein LAT Enhances Fcgamma Receptor-Mediated Signal Transduction In Myeloid Cells," J. Biol. Chem. 275: 20480-20487).
Otro ensayo ejemplar para determinar la fagocitosis de las moléculas de la divulgación es un ensayo de opsonofagocitosis dependiente de anticuerpos (ADCP) que puede comprender los siguiente: recubrir una biopartícula diana tal como Escherichia coli-FITC marcada (Molecular Probes) o Staphylococcus aureus-FITC con (i) anticuerpo 4-4-20 de tipo silvestre, un anticuerpo contra fluoresceína (véase Bedzyk et al. (1989) "Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti-Fluorescein Idiotype Family," J. Biol. Chem, 264(3): 1565-1569), como anticuerpo de control para ADCP dependiente de FcyR; o (ii) anticuerpo 4-4-20 que alberga la mutación D265A que inactiva la unión a FcyRIII, como control de fondo para ADCP dependiente de FcyR; (iii) un diacuerpo que comprenden el dominio de unión a epítopo de 4-4-20 y un dominio Fc y/o un dominio de unión a epítopo específico para FcyRIII; y formar la partícula opsonizada; añadir cualquiera de las partículas opsonizadas descritas (i-iii) a células efectoras THP-1 (una línea celular monocítica disponible en la ATCC) a una relación de 1:1, 10:1, 30:1, 60:1, 75:1 o 100:1 para permitir que se produzca la fagocitosis mediada por FcyR; preferiblemente incubar las células y E. co/i-FITC/anticuerpo a 37 °C durante 1,5 horas; añadir azul tripano después de incubación (preferiblemente a temperatura ambiente durante 2-3 min.) a las células para inactivar la fluorescencia de las bacterias que se adhieren al exterior de la superficie celular sin internalizarse; transferir las células a un tampón de FACS (por ejemplo, 0,1 %, BSA en PBS, 0,1 %, azida de sodio), analizar la fluorescencia de las células THP1 usando FACS (por ejemplo, BD FACS Calibur). Preferiblemente, las células THP-1 usadas en el ensayo se analizan por FACS para la expresión de FcyR en la superficie celular. Las células THP-1 expresan tanto CD32A como CD64. CD64 es un FcyR de alta afinidad que se bloquea al realizar el ensayo de ADCP de acuerdo con los métodos de la presente memoria. Las células THP-1 se bloquean preferiblemente con 100 pg/ml de IgG1 soluble o suero humano al 10 %. Para analizar el grado de ADCP, la ventana de adquisición se establece preferiblemente en células THP-1 y se mide la mediana de la intensidad de fluorescencia. La actividad ADCP para mutantes individuales se calcula y se presenta como un valor normalizado al chMab 4-4-20 de tipo silvestre obtenido. Las partículas opsonizadas se añaden a células THP-1 de modo que la relación de las partículas opsonizadas a las células THP-1 sea de 30:1 o 60:1. En realizaciones mucho más preferidas, el ensayo de ADCP se realiza con controles, tales como E. co/i-FITC en medio, E. co/i-FITC y células THP-1 (que sirve como actividad ADCP independiente de FcyR), E. co/i-FITC, células THP-1 y anticuerpo 4-4-20 de tipo silvestre (que sirve como actividad ADCP dependiente de FcyR), E. coli-FITC, células THP-1,4-4-20 D265A (que sirve como control de fondo para la actividad ADCP dependiente de FcyR).
En otra realización, las moléculas de la divulgación pueden ensayarse para la actividad ADCC mediada por FcyR en células efectoras, por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales, usando cualquiera de los métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Perussia et al. (2000) "Assays For Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC) And Reverse ADCC (Redirected Cytotoxicity) In Human Natural Killer Cells," Methods Mol. Biol. 121: 179-92; Weng et al. (2003) "Two Immunoglobulin G Fragment C Receptor Polymorphisms Independently Predict Response To Rituximab In Patients With Folicular Lymphoma," J. Clin. Oncol.
21:3940-3947; Ding et al. (1998) "Two Human T Cell Receptors Bind In A Similar Diagonal Mode To The HLA-A2/Tax Peptide Complex Using Different TCR Amino Acids," Immunity 8:403-411). Un ensayo ejemplar para determinar la actividad ADCC de las moléculas de la divulgación se basa en un ensayo de liberación de 51Cr que comprende: marcar células diana con [51Cr]Na2CrO4 (esta molécula filtrable en la membrana celular se usa habitualmente para marcaje, ya que se une a proteínas citoplásmicas y, aunque se libera espontáneamente de las células con cinética lenta, se libera masivamente después de necrosis de la célula diana); opsonizar las células diana con las moléculas de la divulgación que comprenden cadenas pesadas variantes; combinar las células diana radiomarcadas opsonizadas con células efectoras en una placa de microvaloración a una relación apropiada de células diana a células efectoras; incubar la mezcla de células durante 16-18 horas a 37 °C; recoger los sobrenadantes; y analizar la radioactividad. La citotoxicidad de las moléculas de la divulgación entonces puede determinarse, por ejemplo, usando la siguiente fórmula: % de lisis = (cpm experimentales - cpm de la filtración de la diana)/(cpm de la lisis con detergente - cpm de la filtración de la diana) x 100 %. Como alternativa, % de lisis = (ADCC-AICC)/(liberación máxima - liberación espontánea). La lisis específica puede calcularse usando la fórmula: lisis específica = % de lisis con las moléculas de la divulgación - % de lisis en ausencia de las moléculas de la divulgación. Puede generarse un gráfico variando la relación de diana:céula efectora o la concentración de anticuerpo.
Preferiblemente, las células efectoras usadas en los ensayos de ADCC son leucocitos monomorfonucleares de sangre periférica (PBMC) que se purifican preferiblemente de sangre humana normal, usando métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, usando centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-Paque. Las células efectoras preferidas para su uso en los métodos expresan diferentes receptores activadores FcyR. También se describen células efectoras, THP-1, que expresan FcyRI, FcyRIIA y FcyRIIB, y macrófagos primarios derivados de monocitos derivados de sangre humana completa que expresan tanto FcyRIIIA como FcyRIIB, para determinar si mutantes de anticuerpo de cadena pesada muestran actividad ADCC aumentada y fagocitosis con respecto a anticuerpos IgG1 de tipo silvestre.
La línea celular de monocitos humanos, THP-1, activa la fagocitosis mediante la expresión del receptor de alta afinidad FcyRI y el receptor de baja afinidad FcyRIIA (Fleit et al. (1991) "The Human Monocyte-Like Cell Line THP-1 Expresses Fc Gamma RI And Fc Gamma RII," J. Leuk. Biol. 49: 556-565). Las células THP-1 no expresan de forma constitutiva FcyRIIA o FcyRIIB. La estimulación de estas células con citocinas afecta al patrón de expresión de FcR (Pricop et al. (2001) "Differential Modulation Of Stimulatory And Inhibitory Fc Gamma Receptors On Human Monocytes By Th1 And Th2 Cytokines," J. of Immunol., 166: 531-537). El crecimiento de células THP-1 en presencia de la citocina IL4 induce la expresión de FcyRIIB y también causa una reducción en la expresión de FcyRIIA y FcyRI. La expresión de FcyRIIB también puede potenciarse mediante una densidad celular aumentada (Tridandapani et al. (2002) "Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells, " J. Biol. Chem., 277(7): 5082-5089). Por el contrario, se ha informado de que IFNy puede dar lugar a la expresión de FcyRIIIA (Pearse et al. (1993) "Interferon Gamma-Induced Transcription Of The High-Affinity Fc Receptor For IgG Requires Assembly Of A Complex That Includes The 91-kDa Subunit Of Transcription Factor ISGF3," Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 4314-4318). La presencia o ausencia de receptores en la superficie celular puede determinarse por FACS usando métodos comunes conocidos por los expertos en la materia. La expresión inducida por citocinas de FcyR en la superficie celular proporciona un sistema para ensayar tanto la activación como la inhibición en presencia de FcyRIIB. Si las células THP-1 no puede expresar el FcyRIIB, puede usarse otra línea celular de monocitos humanos, U937. Se ha demostrado que estas células se diferencian de forma terminal en macrófagos en presencia de IFNy y TNF (Koren et al. (1979) "In Vitro Activation Of A Human Macrophage-Like Cell Line," Nature 279: 328-331).
La eliminación de células tumorales dependiente de FcyR está mediada por macrófagos y linfocitos NK en modelos de tumor de ratón (Clynes et al. (1998) "Fc Receptors Are Required In Passive And Active Immunity To Melanoma" Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95: 652-656). También se describe el uso de monocitos sedimentados de donadores como células efectoras para analizar la eficacia de mutantes de Fc en activar la citotoxicidad celular de las células diana tanto en ensayos de fagocitosis como de ADCC. Los patrones de expresión de FcyRI, FcyRIIIA y FcyRIIB se ven afectados por diferentes condiciones de crecimiento. La expresión de FcyR a partir de monocitos sedimentados congelados, monocitos sedimentados frescos, monocitos mantenidos en fBs al 10 % y monocitos cultivados en FBS GM-CSF y/o en suero humano, puede determinarse usando métodos habituales conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, las células pueden teñirse con anticuerpos específicos para FcyR y analizarse por FACS para determinar los perfiles de FcR. Las condiciones que imitan mejor la expresión de FcyR in vivo en macrófagos se usa entonces para los métodos de la presente memoria.
También se describe el uso de células de ratón especialmente cuando no se pueden obtener células humanas con los perfiles de FcyR correctos. También se describe la línea celular de macrófagos de ratón RAW264.7 (ATCC) que puede transfectarse con FcyRIIIA humano y los transfectantes estables pueden aislarse usando métodos conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Ralph et al. (1977) "Antibody-Dependent Killing Of Erythrocyte And Tumor Targets By Macrophage-Related Cell Lines: Enhancement By PPD And LPS," J. Immunol. 119: 950-4). Los transfectantes pueden cuantificarse para la expresión de FcyRIIIA mediante análisis FACS usando experimentación rutinaria y pueden usarse agentes de alta expresión en los ensayos de ADCC. También se describe el aislamiento de macrófagos peritoneales del bazo que expresan FcyR humano a partir de ratones transgénicos de inactivación tales como los divulgados en la presente memoria.
Los linfocitos pueden recogerse de sangre periférica de donadores (PBM) usando un gradiente de Ficoll-Paque (Pharmacia). Dentro de la población mononuclear aislada de células, la mayoría de la actividad ADCC se produce mediante linfocitos citolíticos naturales (NK) que contienen FcyRIIIA, pero no FcyRIIB en su superficie. Los resultados con estas células indican la eficacia de los mutantes en la activación de ADCC por linfocitos NK y establecen los reactivos para ensayo con monocitos sedimentados.
Las células diana usadas en los ensayos de ADCC incluyen, aunque sin limitación, líneas celulares de cáncer de mama, por ejemplo, SK-BR-3 con el número de acceso a la ATCC HTB-30 (véase, por ejemplo, Tremp et al. (1976) "Human Breast Cancer In Culture," Recent Results Cancer Res. 33-41); linfocitos B; células derivadas de linfoma de Burkitt, por ejemplo, células Raji con el número de acceso a la ATCC CCL-86 (véase, por ejemplo, Epstein et al. (1965) "Characteristics And Mode Of Growth Of Tissue Culture Strain (EB1) Of Human Lymphoblasts From Burkitt’s Lymphoma," J. Natl. Cancer Inst. 34: 231-240), y células Daudi con el número de acceso a la ATCC CCL-213 (véase, por ejemplo, Klein et al. (1968) "Surface IgM-Kappa Specificity On A Burkitt Lymphoma Cell In Vivo And In Derived Culture Lines," Cancer Res. 28: 1300-1310). Las células diana deben reconocerse por el sitio de unión a antígeno de la molécula de diacuerpo a ensayar.
El ensayo de ADCC se basa en la capacidad de los linfocitos NK de mediar la muerte celular mediante una ruta apoptótica. Los linfocitos NK median la muerte celular, en parte, mediante el reconocimiento por FcyRIIIA de un dominio Fc de IgG unido a un antígeno en una superficie celular. Los ensayos de ADCC usados de acuerdo con los métodos de la presente memoria pueden ser ensayos de basados en radioactividad o ensayos basados en fluorescencia. El ensayo de ADCC usado para caracterizar las moléculas descritas en la presente memoria, que comprenden regiones Fc variantes comprende marcar las células diana, por ejemplo, SK-BR-3, MCF-7, OVCAR3, Raji, células Daudi, opsonizar las células diana con un anticuerpo que reconozca un receptor de superficie celular en la célula diana mediante su sitio de unión a antígeno; combinar las células diana opsonizadas marcadas y las células efectoras a una relación apropiada, que puede determinarse por experimentación rutinaria; recoger las células; detectar el marcador en el sobrenadante de las células diana lisadas, usando un esquema de detección apropiado basado en el marcador usado. Las células diana pueden marcarse con un marcador radioactivo o un marcador fluorescente, usando métodos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, los marcadores incluyen, aunque sin limitación, [51Cr]Na2CrO4; y el éster acetoximetílico del ligando potenciador de la fluorescencia, 2,2':6',2''-terpiridina-6-6"-dicarboxilato (TDA).
En una realización preferida específica, se usa un ensayo fluorimétrico con resolución temporal para medir la actividad ADCC contra las células diana que se han marcado con el éster acetoximetílico del ligando potenciador de la fluorescencia, 2,2':6',2"-terpiridina-6-6"-dicarboxilato (TDA). Dichos ensayos fluorimétricos son conocidos en la técnica, por ejemplo, véase, Blomberg et al. (1996) "Time-Resolved Fluorometric Assay For Natural Killer Activity Using Target Cells Labelled With A Fluorescence Enhancing Ligand" Journal of Immunological Methods, 193: 199­ 206. En resumen, las células diana se marcan con el diéster acetoximeteílico de TDA (2,2':6',2"-terpiridina-6-6"-dicarboxilato de bis(acetoximetilo), (BATDA)) filtrable en la membrana, que difunde rápidamente a través de la membrana celular de células viables. Las esterasas intracelulares separan los grupos éster y la molécula TDA impermeable en la membrana regenerada se atrapa en el interior de la célula. Después de incubación de las células efectoras y diana, por ejemplo, durante al menos dos horas, hasta 3,5 horas, a 37 °C, en CO2 al 5 %, el TDA liberado de las células diana lisadas se quela con Eu3+ y la fluorescencia de los quelatos de europio-TDA formados se cuantifica en un fluorímetro de resolución temporal (por ejemplo, Victor 1420, Perkin Elmer/Wallace).
En otra realización específica, el ensayo de ADCC usado para caracterizar las moléculas de la divulgación que comprenden múltiples sitios de unión a epítopo y, opcionalmente, un dominio Fc (o parte del mismo) comprende las siguientes etapas: Preferiblemente, se marcan 4-5 x 106 células diana (por ejemplo, SK-BR-3, MCF-7, OVCAR3, células Raji) con 2,2':6',2"-terpiridina-t-6"-dicarboxilato de bis(acetoximetilo) (reactivo BATDA DELFIA, Perkin Elmer/Wallac). Para la eficacia de marcaje óptima, el número de células diana usadas en el ensayo de ADCC preferiblemente no debe exceder de 5 x 106. El reactivo BATDA se añade a las células y la mezcla se incuba a 37 °C preferiblemente en CO2 al 5 %, durante al menos 30 minutos. Las células entonces se lavan con un tampón fisiológico, por ejemplo, PBS con sulfinpirazol 0,125 mM, y medio que contiene sulfinpirazol 0,125 mM. Las células diana marcadas entonces se opsonizan (recubren) con una molécula de la divulgación que comprende un dominio de unión a epítopo específico para FcyRMA y, opcionalmente, un dominio Fc (o parte del mismo). En realizaciones preferidas, la molécula usada en el ensayo de ADCC también es específico para un receptor de superficie celular, un antígeno tumoral o un antígeno canceroso. La molécula de diacuerpo de la invención puede unirse específicamente a cualquier antígeno canceroso o tumoral, tales como los enumerados en la sección 5.6.1. Las células diana en el ensayo de ADCC se eligen de acuerdo con los sitios de unión a epítopo genomanipulados en el diacuerpo de la divulgación, de modo que el diacuerpo se una a un receptor de superficie celular de la célula diana específicamente.
Las células diana se añaden a células efectoras, por ejemplo, PBMC, para producir relaciones de efector:diana de aproximadamente 1:1, 10:1,30:1,50:1,75:1 o 100:1. Las células efectoras y diana se incuban durante al menos dos horas, hasta 3,5 horas, a 37 °C, en CO2 al 5 %. Los sobrenadantes celulares se recogen y se añaden a una disolución ácida de europio (por ejemplo, solución de europio DELFIA, Perkin Elmer/Wallac). La fluorescencia de los quelatos de europio-TDA formados se cuantifica en un fluorímetro de resolución temporal (por ejemplo, Victor 1420, Perkin Elmer/Wallac). Se determina la liberación máxima (MR) y la liberación espontánea (SR) por incubación de células diana con TX-100 al 1 % y medio en solitario, respectivamente. La citotoxicidad celular independiente de anticuerpos (AICC) se mide por incubación de células diana y efectoras en ausencia de una molécula de ensayo, por ejemplo, diacuerpo de la divulgación. Cada ensayo se realiza preferiblemente por triplicado. Se calcula el porcentaje medio de lisis específica como: Liberación experimental (ADCC) - AICC)/(MR-SR) x 100.
También se describen ensayos conocidos en la técnica, y ejemplificados en la presente memoria, para caracterizar la unión a C1q y la mediación de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) por moléculas de la divulgación que comprenden dominios Fc (o partes de los mismos). Para determinar la unión a C1q, puede realizarse un ELISA de unión a C1q. Un ensayo ejemplar puede comprender los siguiente: puede recubrirse placas de ensayo durante una noche a 4 °C con polipéptido que comprende una molécula de la divulgación o polipéptido de partida (control) en tampón de recubrimiento. Las placas entonces se lavan y se bloquean. Después del lavado, puede añadirse una alícuota de C1q humano a cada pocillo y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de un lavado adicional, pueden añadirse 100 ul de un anticuerpo de cabra anti-C1q del complemento conjugado con peroxidasa a cada pocillo y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa puede lavarse de nuevo con tampón de lavado y pueden añadirse 100 ul de tampón de sustrato que contiene OPD (dihidrocloruro de O-fenilendiamina (Sigma)) a cada pocillo. La reacción de oxidación, observada por la aparición de un color amarillo, puede dejarse proseguir durante 30 minutos y detenerse mediante la adición de 100 ul de H2SO4 4,5 N. La absorbancia entonces puede leerse a (492-405) nm.
Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al. (1997) "A Non-Radioactive Complement-Dependent Cytotoxicity Assay For Anti-CD20 Monoclonal Antibody," J. Immunol. Methods 202:163-171. En resumen, pueden diluirse diversas concentraciones de la molécula que comprende un dominio Fc (variante) (o parte del mismo) y complemento humano con tampón. Las células que expresan el antígeno al que se une la molécula de diacuerpo pueden diluirse hasta una densidad de aproximadamente 1 x 106 células/ml. Pueden añadirse mezclas de las moléculas de diacuerpo que comprenden un dominio Fc (variante) (o parte del mismo), complemento humano diluido y células que expresan el antígeno a una placa de 96 pocillos de cultivo tisular de fondo plano y se deja incubar durante 2 horas a 37 °C y CO2 al 5 % para facilitar la lisis celular mediada por el complemento. Entonces pueden añadirse 50 ul de azul alamar (Accumed International) a cada pocillo y se incuba durante una noche a 37 °C. La absorbancia se mide usando un fluorímetro de 96 pocillos con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm. Los resultados pueden expresarse en unidades de fluorescencia relativas (UFR). Las concentraciones de muestra pueden calcularse a partir de una curva patrón y el porcentaje de actividad en comparación con molécula no variante, es decir, una molécula que no comprende un dominio Fc o que comprende un dominio Fc no variante, se presenta para la variante de interés.
5.4.3. Otros ensayos
Las moléculas de la divulgación que comprenden múltiples dominios de unión a epítopo y, opcionalmente, un dominio Fc, pueden ensayarse usando cualquier ensayo basado en resonancia de plasmones superficiales conocido en la técnica para la caracterización de los parámetros cinéticos de la unión antígeno-dominio de unión o Fc-FcyR. Puede usarse cualquier instrumento de SPR disponible en el mercado incluyendo, aunque sin limitación, BIAcore Instruments, disponible en Biacore AB (Uppsala, Suecia); lAsys instruments disponible en Affinity Sensors (Franklin, MA.); el sistema IBIS disponible en Windsor Scientific Limited (Berks, R.U.), los sistemas SPR-CELLIA disponibles en Nippon Laser y en Electronics Lab (Hokkaido, Japón), y el SPR Detector Spreeta disponible en Texas Instruments (Dallas, TX). Para una revisión de la tecnología basada en SPR, véase Mullet et al., (2000) "Surface Plasmon Resonance-Based Immunoassays," Methods 22: 77-91; Dong et al., (2002), "Some new aspects in biosensors," Review in Mol. Biotech., 82: 303-23; Fivash et al., (1998), "BIAcore For Macromolecular Interaction," Current Opinión in Biotechnology 9: 97-101; Rich et al., (2000), "Advances In Surface Plasmon Resonance Biosensor Analysis," Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61. Adicionalmente, en los métodos de la presente memoria se contemplan cualquiera de los instrumentos de SPR y de los métodos basados en SPR para la medición de las interacciones de proteína-proteína descritos en las patentes de Estados Unidos n.° 6373577; 6289286; 5322798;5341215;6268125.
En resumen, los ensayos basados en SPR implican la inmovilización de un miembro de un par de unión en una superficie y el control de su interacción con el otro miembro del par de unión en disolución en tiempo real. La SPR se basa en la medición del cambio en el índice de refracción del disolvente cerca de la superficie que se produce tras la formación o la disociación del complejo. La superficie sobre la que se produce la inmovilización es el chip sensor, que es el corazón de la tecnología de SPR; consiste en una superficie de vidrio recubierta con una fina capa de oro y forma la base de un abanico de superficies especializadas diseñadas para optimizar la unión de una molécula a la superficie. En el mercado hay disponibles una diversidad de chips sensores, especialmente en las empresas indicadas supra, pudiendo usarse todos ellos en los métodos de la presente memoria. Algunos ejemplos de chips sensores incluyen los disponibles en BIAcore AB, Inc., por ejemplo, Sensor Chip CM5, SA, NTA y HPA. Una molécula de la divulgación se puede inmovilizar en la superficie de un chip sensor usando cualquiera de los métodos y las químicas de inmovilización conocidos en la técnica, que incluyen, aunque sin limitación, un acoplamiento covalente directo a través de grupos amino, un acoplamiento covalente directo a través de grupos sulfhidrilo, la unión de biotina a una superficie recubierta con avidina, el acoplamiento de un aldehído a grupos carbohidrato y la unión a través de la marca de histidina con chips NTA.
En algunas realizaciones, los parámetros cinéticos de la unión de las moléculas de la divulgación que comprenden múltiples sitios de unión a epítopo y, opcionalmente y dominio Fc, a un antígeno o un FcyR, se pueden determinar usando un instrumento BIAcore (por ejemplo, un instrumento BIAcore 1000, BIAcore Inc., Piscataway, NJ). Como se analiza supra, véase la sección 5.4.1, puede usarse cualquier FcyR para evaluar la unión de las moléculas de la invención tanto cuando al menos un sitio de unión del epítopo de la molécula de diacuerpo reconoce inmunoespecíficamente un FcyR, y/o como cuando la molécula de diacuerpo comprende un dominio Fc (o una parte del mismo). En una realización específica, el FcyR es el FcyRIIIA, preferiblemente un FcyRIIIA soluble monomérico. Por ejemplo, en una realización, el FcyRIIIA soluble monomérico es la región extracelular del FcyRIIIA unida a la secuencia conectora AVITAG). En otra realización específica, el FcyR es el FcyRIIB, preferiblemente un FcyRIIB soluble dimérico.
Para todos los ensayos inmunológicos, el reconocimiento/unión al FcyR por parte de una molécula descrita en la presente memoria se puede lograr mediante múltiples dominios: en determinadas realizaciones, las moléculas descritas en la presente memoria reconocen inmunoespecíficamente un FcyR a través de uno de los múltiples dominios de unión a epítopo; en otras realizaciones más, cuando la molécula de la invención comprende un dominio Fc (o una parte del mismo), la molécula de diacuerpo puede reconocer inmunoespecíficamente un FcyR a través de las interacciones Fc-FcyR; en otras realizaciones adicionales más, cuando una molécula de la invención comprende tanto un dominio Fc (o una parte del mismo) como un sitio de unión a epítopo que reconoce inmunoespecíficamente un FcyR, la molécula de diacuerpo puede reconocer un FcyR a través de uno o de ambos de un dominio de unión al epítopo y del dominio Fc (o una parte del mismo). Un ejemplo de ensayo para la determinación de los parámetros cinéticos de una molécula que comprende múltiples dominios de unión a epítopo y, opcionalmente y dominio Fc (o una parte del mismo) a un antígeno y/o a un FcyR usando un instrumento BIAcore comprende lo siguiente: se inmoviliza un primer antígeno en una de las cuatro celdas de flujo de la superficie de un chip sensor, preferiblemente a través de una química de acoplamiento de amina, de tal forma que se inmovilicen aproximadamente 5000 unidades de respuesta (UR) de dicho primer antígeno en la superficie. Una vez se ha preparado la superficie adecuada, las moléculas de la descritas en la presente memoria que reconocen inmunoespecíficamente dicho primer antígeno se hacen pasar a través de la superficie, preferiblemente mediante inyecciones de un minuto de una disolución de 20 pg/ml a un caudal de 5 pl/ml. Los niveles de las moléculas descritas en la presente memoria unidas a la superficie en esta fase normalmente varían entre 400 y 700 UR. Después, se inyectan unas series de diluciones de un segundo antígeno (por ejemplo, un FcyR) o de un receptor FcyR en tampón HBS-P (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, a un pH de 7,5) en la superficie a 100 pl/min. La regeneración de las moléculas entre las diferentes diluciones del segundo antígeno o del receptor se lleva a cabo preferiblemente mediante inyecciones individuales de 5 segundos de NaHCÜ3100 mM a un pH de 9,4; NaCl 3 M. Se contempla cualquier técnica de regeneración conocida en la técnica en el método de la presente memoria.
Una vez recogida la totalidad del conjunto de datos, las curvas de unión resultantes se ajustan globalmente usando los algoritmos informáticos suministrados por el fabricante del instrumento SPR, por ejemplo, BIAcore, Inc. (Piscataway, NJ). Estos algoritmos calculan tanto la Kon como la Koff, a partir de las que se deduce la constante de unión en equilibrio aparente, Kd, como la relación entre las dos constantes de velocidad (es decir, Koff/Kon). Pueden encontrarse tratamientos más detallados de cómo se derivan las constantes de velocidad individuales en el BIAevaluaion Softwson Handbook (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). El análisis de los datos generados puede llevarse a cabo usando cualquier método conocido en la técnica. Para una revisión de los diversos métodos de interpretación de los datos cinéticos generados, véase Myszka, (1997) "Kinetic Analysis Of Macromolecular Interactions Using Surface Plasmon Resonance Biosensors," Current Opinion in Biotechnology 8: 50-7; Fisher et al. (1994) "Surface Plasmon Resonance Based Methods For Measuring The Kinetics And Binding Affinities Of Biomolecular Interactions," Current Opinion in Biotechnology 5: 389-95; O'Shannessy (1994) "Determination Of Kinetic Rate And Equilibrium Binding Constants For Macromolecular Interactions: A Critique Of The Surface Plasmon Resonance Literature," Current Opinión in Biotechnology, 5:65-71; Chaiken et al. (1992) "Analysis Of Macromolecular Interactions Using Immobilized Ligands," Analytical Biochemistry, 201: 197-210; Morton et al. (1995) "Interpreting Complex Binding Kinetics From Optical Biosensors: A Comparison Of Analysis By Linearization, The Integrated Rate Equation, And Numerical Integration," Analytical Biochemistry 227: 176-85; O'Shannessy et al., 1996, Analytical Biochemistry 236: 275-83.
En realizaciones preferidas pueden usarse los parámetros cinéticos determinados mediante el uso de un análisis de SPR, por ejemplo, BIAcore, como una medida predictiva de cómo funcionará una molécula descrita en la presente memoria en un ensayo funcional, por ejemplo, ADCC. Un ejemplo de método para la predicción de la eficacia de una molécula de la divulgación basado en los parámetros cinéticos obtenidos a partir de un análisis de SPR puede comprender lo siguiente: la determinación de los valores de la Koff para la unión de una molécula descrita en la presente memoria al FcyRIIIA y al FcyRIIB (a través de un dominio de unión al epítopo y/o de un dominio Fc (o parte del mismo)); la representación gráfica de (1) Koff (wt)/Koff (mut) para el FcyRIIIA; (2) Kott (mut)/Koff (wt) para el FcyRIIB frente a los datos de ADCC. Las cifras mayores de uno muestran una disminución en la velocidad de disociación para el FcyRIIIA y un aumento en la velocidad de disociación para el FcyRIIB con respecto al tipo silvestre; y posee y función de ADCC potenciada.
5.5 Métodos para la producción de moléculas de diacuerpo de la divulgación
Las moléculas de diacuerpo de la presente divulgación pueden producirse usando una diversidad de métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo la síntesis de proteínas de novo y la expresión recombinante de ácidos nucleicos que codifican las proteínas de unión. Las secuencias de ácido nucleico deseadas pueden producirse mediante métodos recombinantes (por ejemplo, mutagénesis por PCR de una variante preparada previamente del polinucleótido deseado) o mediante síntesis de ADN en fase sólida. Habitualmente se usan métodos de expresión recombinante. También se describe un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un VH y/o un VL de CD16A, según reivindicación 1 de la presente memoria. También se describe un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un VH y/o un VL de CD32B de acuerdo con la reivindicación 1 de la presente memoria. Debido a la degeneración del código genético, diversas secuencias de ácido nucleico codifican cada secuencia de aminoácidos de la inmunoglobulina, y la presente descripción incluye todos los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de unión descritas en la presente memoria.
5.5.1 Polinucleótidos que codifican las moléculas de la divulgación
También se describen moléculas de la divulgación, incluyendo polipéptidos y anticuerpos. Los polinucleótidos que codifican las moléculas de la divulgación pueden obtenerse, y la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos determinarse, mediante cualquier método conocido en la técnica.
Una vez se ha determinado la secuencia de nucleótidos de las moléculas mediante los métodos de la presente memoria, la secuencia de nucleótidos se puede manipular usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida al sitio, PCR, etc. (véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning. A Laboratory Manual 3.a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; y Ausubel et al., ed., 1998, Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, NY), para generar, por ejemplo, anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo, mediante la generación de sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos.
En una realización, pueden cribarse colecciones humanas o cualquier otra colección disponible en la técnica, mediante las técnicas convencionales conocidas en la técnica, para clonar los ácidos nucleicos que codifican las moléculas de la divulgación.
5.5.2 Expresión recombinante de moléculas de la divulgación
Una vez se ha obtenido una secuencia de ácido nucleico que codifica las moléculas de la divulgación (es decir, los anticuerpos), puede producirse el vector para la producción de las moléculas mediante la tecnología del ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en la técnica. Pueden usarse métodos que son bien conocidos por los expertos en la materia para la construcción de los vectores de expresión que contienen las secuencias codificantes de las moléculas de la divulgación y las señales de control de la transcripción y de la traducción apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. (Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2.a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, y Ausubel et al. ed., 1998, Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, NY).
Puede transferirse un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de una molécula identificada mediante los métodos de la presente memoria a una célula hospedadora mediante técnicas convencionales (por ejemplo, electroporación, transfección liposómica y precipitación con fosfato de calcio) y después, las células transfectadas se cultivan mediante técnicas convencionales para producir las moléculas de la divulgación. En realizaciones específicas, la expresión de las moléculas de la divulgación está regulada por un promotor constitutivo, inducible o específico tisular.
Las células hospedadoras usadas para expresar las moléculas identificadas mediante los métodos de la presente memoria pueden ser células bacterianas, tales como Escherichia coli, o, preferiblemente, células eucariotas, especialmente para la expresión de una molécula de inmunoglobulina recombinante completa. En particular, las células de mamífero tales como las células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector tal como el elemento promotor génico temprano intermedio del citomegalovirus humano, es un sistema de expresión eficaz para las inmunoglobulinas (Foecking et al. (1986) "Powerful And Versatile Enhancer-Promoter Unit For Mammalian Expression Vectors," Gene 45:101-106; Cockett et al. (1990) "High Level Expression Of Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases In Chinese Hamster Ovary Cells Using Glutamine Synthetase Gene Amplification," Biotechnology 8:662-667).
Puede utilizarse una diversidad de sistemas de hospedador-vector de expresión para la expresión de las moléculas identificadas mediante los métodos de la presente memoria. Dichos sistemas de hospedador-expresión representan vehículos mediante los que pueden producirse las secuencias codificantes de las moléculas de la divulgación y purificarse posteriormente, pero también representan las células que, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, pueden expresar las moléculas de la divulgación in situ. Estas incluyen, aunque sin limitación, microrganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, de ADN de plásmido o de ADN de cósmido que contienen secuencias codificantes de las moléculas identificadas mediante los métodos de la presente memoria; de levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión recombinantes de levadura que contienen las secuencias que codifican las moléculas identificadas mediante los métodos de la presente memoria; sistemas de células de insecto o infectados con vectores de expresión víricos recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen la secuencias que codifican las moléculas identificadas mediante los métodos de la presente memoria; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión víricos recombinantes (por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y el virus del mosaico del tabaco (TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, el plásmido Ti) que contienen secuencias que codifican las moléculas identificadas mediante los métodos de la presente memoria; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 293T, 3T3, células linfocíticas (véase el documento U.S. 5807715), células Per C.6 (células de la retina humanas desarrolladas por Crucell) portadoras de construcciones de expresión recombinantes que contienen los promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, el promotor de la metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío del adenovirus; el promotor 7.5K del virus vaccinia).
En sistemas bacterianos puede seleccionarse ventajosamente una diversidad de vectores de expresión dependiendo del uso previsto para la molécula que se va a expresar. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de dicha proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de un anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de elevados niveles de los productos de la proteína de fusión que sean fácilmente purificables. Dichos vectores incluyen, aunque sin limitación, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Rüther et al. (1983) "Easy Identification Of cDNA Clones," EMBO J. 2:1791-1794), en el que la secuencia codificante del anticuerpo se puede ligar individualmente en el vector en marco con la región codificante de lac Z, de forma que se produzca una proteína de fusión; los vectores pIN (Inouye et al. (1985) "Up-Promoter Mutations In The Ipp Gene Of Escherichia Coli," Nucleic Acids Res. 13:3101-3110; Van Heeke et al. (1989) "Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia Coli," J. Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. También pueden usarse los vectores pGEX para expresar polipéptidos exógenos en forma de proteínas de fusión con la S-transferasa de glutatión (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de las células lisadas mediante una adsorción y la unión a una matriz de microesferas de glutatión-agarosa, seguido de una elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir los sitios de escisión de la trombina o de la proteasa del factor Xa, de forma que el producto genérico diana clonado se pueda liberar desde la fracción de la GST.
En un sistema de insectos se usa el virus de la polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) como vector para la expresión de los genes exógenos. El virus crece en las células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante del anticuerpo se puede clonar individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor del AcNPV (por ejemplo, el promotor de la polihedrina).
En las células hospedadoras de mamífero puede utilizarse una diversidad de sistemas de expresión basados en virus. En los casos en los que se use un adenovirus como vector de expresión, la secuencia codificante del anticuerpo de interés puede ligarse a un complejo de control de la transcripción/traducción del adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico se puede insertar después en el genoma del adenovirus mediante una recombinación in vitro o in vivo. La inserción de una región no esencial del genoma vírico (por ejemplo, la región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y que puede expresar la molécula de inmunoglobulina en los hospedadores infectados (véase, por ejemplo, Logan et al. (1984) "Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659). También pueden requerirse señales de inicio específicas para una traducción eficaz de las secuencias codificantes del anticuerpo insertadas. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG y las secuencias adyacentes. Adicionalmente, el codón de inicio debe estar en el mismo marco de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción de la totalidad del inserto. Estas señales de control de la traducción exógenas y los codones de inicio pueden ser de una diversidad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede potenciarse mediante la inclusión de los elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc. apropiados (véase, Bitter et al. (1987) "Expression And Secretion Vectors For Yeast" Methods in Enzymol. 153:516-544).
Además, puede elegirse una cepa de célula hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto génico de la forma específica deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo, una glucosilación) y el procesamiento (por ejemplo, la escisión) de los productos proteínicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, los polipéptidos que comprenden una molécula de diacuerpo de la divulgación se pueden expresar en forma de un producto génico individual (por ejemplo, en forma de una cadena polipeptídica única, es decir, en forma de un precursor de poliproteína), lo que requiere una escisión proteolítica por parte de los mecanismos celulares nativos o recombinantes para formar los polipéptidos individuales de las moléculas de diacuerpo de la divulgación. También se describe la modificación de una secuencia de ácido nucleico para codificar una molécula precursora de poliproteína que comprende los polipéptidos del diacuerpo de la divulgación, que incluye secuencias codificantes que pueden dirigir la escisión postraduccional de dicho precursor poliproteínico. La escisión postraduccional del precursor poliproteínico da como resultado los polipéptidos del diacuerpo de la invención. La escisión postraduccional de la molécula precursora que comprende los polipéptidos de diacuerpo de la divulgación puede producirse in vivo (es decir, en la célula hospedadora por parte de los sistemas/mecanismos celulares nativos o recombinantes, por ejemplo, una escisión con furina en un sitio apropiado) o puede producirse in vitro (por ejemplo, la incubación de dicha cadena polipeptídica en una composición que comprende proteasas o peptidasas con una actividad conocida y/o en una composición que comprende condiciones o reactivos conocidos por fomentar la acción proteolítica deseada). La purificación y la modificación de las proteínas recombinantes son bien conocidas en la técnica, de forma que el diseño del precursor poliproteínico podría incluir una diversidad de realizaciones fácilmente reconocidas por un trabajador experto. Puede usarse cualquier proteasa o peptidasa conocida en la técnica para la modificación descrita de la molécula precursora, por ejemplo, la trombina (que reconoce la secuencia de aminoácidos LVPRAGS (SEQ ID NO: 89)) o el factor Xa (que reconoce la secuencia de aminoácidos I(E/D)GRA (SEQ ID NO: 90) (Nagai et al. (1985) "Oxygen Binding Properties Of Human Mutant Hemoglobins Synthesized In Escherichia Coli," Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:7252-7255, y revisado en Jenny et al. (2003) "A Critical Review Of The Methods For Cleavage Of Fusion Proteins With Thrombin And Factor Xa," Protein Expr. Purif. 31:1 -11)), la enterocinasa (que reconoce la secuencia de aminoácidos DDDDKA (SEQ ID NO: 91) (Collins-Racie et al. (1995) "Production Of Recombinant Bovine Enterokinase Catalytic Subunit In Escherichia Coli Using The Novel Secretory Fusion Partner DsbA," Biotechnology 13:982-987)), la furina (que reconoce la secuencia de aminoácidos RXXRA, con preferencia por la RX(K/R)RA (SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 93, respectivamente) (aparece una R adicional en la posición P6 para potenciar la escisión)) y la AcTEV (que reconoce la secuencia de aminoácidos ENLYFQAG (SEQ ID NO: 94) (Parks et al. (1994) "Release Of Proteins And Peptides From Fusion Proteins Using A Recombinant Plant Virus Proteinase," Anal. Biochem. 216:413-417)) y la proteasa C3 del virus de la glosopeda. Véase, por ejemplo, la sección 6.4, supra.
Las diferentes células hospedadoras tienen unos mecanismos característicos y específicos para el procesamiento postraduccional y la modificación de las proteínas y de los productos génicos. Pueden elegirse las líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la correcta modificación y procesamiento de la proteína exógena expresada. A este respecto, pueden usarse células hospedadoras eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primario, la glucosilación y la fosforilación del producto génico. Dichas células hospedadoras de mamífero incluyen, aunque sin limitación, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, CRL7030 y Hs578Bst.
Para una producción a largo plazo de alto rendimiento de las proteínas recombinantes se prefiere una expresión estable. Por ejemplo, pueden modificarse líneas celulares que expresen de forma estable un anticuerpo en lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación víricos, las células hospedadoras se pueden transformar con un ADN controlado por los elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, un promotor, un potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador de selección. Después de la introducción del ADN exógeno, las células modificadas pueden dejarse en crecimiento durante 1-2 días en un medio enriquecido y después se cambian a un medio selectivo. El marcador de selección del plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que, a su vez, se pueden clonar y expandir en líneas celulares. Este método puede usarse ventajosamente para modificar líneas celulares que expresen los anticuerpos de la divulgación. Dichas líneas celulares modificadas pueden ser particularmente útiles en el cribado y la evaluación de los compuestos que interactúan directa o indirectamente con las moléculas de la divulgación.
Pueden usarse diversos sistemas de selección que incluyen, aunque sin limitación, el gen de la cinasa de timidina del virus del herpes simple (Wigler et al. (1977) "Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells," Cell 11: 223-232), la fosforribosiltransferasa de hipoxantina-guanina (Szybalska et al. (1992) "Use Of The HPRT Gene And The HAT Selection Technique In DNA-Mediated Transformation Of Mammalian Cells: First Steps Toward Developing Hybridoma Techniques And Gene Therapy" Bioessays 14: 495-500) y la fosforribosiltransferasa de adenina (Lowy et al. (1980) "Isolation Of Transforming DNA: Cloning The Hamster aprt Gene," Cell 22: 817-823) pueden emplearse en células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. También puede usarse una resistencia antimetabolito como la base de la selección de los siguientes genes: dhfir, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al. (1980) "Transformation Of Mammalian Cells With An Amplifiable Dominant-Acting Gene," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570; O'Hare et al. (1981) "Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reducíase," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527-1531); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan et al. (1981) "Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072-2076); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Tolstoshev (1993) "Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions" Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) "The Basic Science Of Gene Therapy," Science 260:926-932; y Morgan et al. (1993) "Human Gene Therapy," Ann. Rev. Biochem. 62:191-217) e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre et al. (1984) "Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells," Gene 30:147-156). Los métodos conocidos habitualmente en la técnica de la tecnología del ADN recombinante que pueden usarse se describen en Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; y en los capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (ed), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapin et al. (1981) "A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells," J. Mol. Biol. 150:1-14.
Los niveles de expresión de una molécula descrita en la divulgación pueden aumentarse mediante amplificación del vector (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning. Vol. 3 (Academic Press, Nueva York, 1987). Cuando un marcador del sistema de vector que expresa un anticuerpo es amplificable, el aumento en el nivel del inhibidor presente en el cultivo de la célula hospedadora aumentará el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada está asociada con la secuencia de nucleótidos de un polipéptido de la molécula de diacuerpo, también aumentará la producción del polipéptido (Crouse et al. (1983) "Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes," Mol. Cell. Biol. 3:257-266).
La célula hospedadora se puede cotransfectar con dos vectores de expresión, el primer vector que codifica el primer polipéptido de la molécula de diacuerpo y el segundo vector que codifica el segundo polipéptido de la molécula de diacuerpo. Los dos vectores pueden contener marcadores de selección idénticos que permiten una expresión igualitaria de ambos polipéptidos. Como alternativa, puede usarse un único vector que codifique ambos polipéptidos. Las secuencias codificantes de los polipéptidos de las moléculas de la divulgación pueden comprender ADNc o ADN genómico.
Una vez que se ha expresado recombinantemente una molécula de la divulgación (es decir, los diacuerpos), se puede purificar mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de polipéptidos, de poliproteínas o de diacuerpos (por ejemplo, esquemas análogos a la purificación de anticuerpos basándose en la selectividad del antígeno), por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, particularmente por afinidad por el antígeno específico (opcionalmente después de una selección con proteína A donde la molécula de diacuerpo comprende un dominio Fc (o parte del mismo)) y cromatografía en columna por tamaños), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica convencional para la purificación de polipéptidos, de poliproteínas o de diacuerpos.
5.6 Métodos profilácticos y terapéuticos
Las moléculas de la divulgación son particularmente útiles para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad, de un trastorno o de una infección donde se desea una función celular efectora (por ejemplo, ADCC) mediada por el FcyR (por ejemplo, un cáncer, una enfermedad infecciosa). Como se analiza supra, los diacuerpos de la invención pueden mostrar una funcionalidad de tipo anticuerpo para desencadenar una función efectora, aunque la molécula de diacuerpo no comprenda un dominio Fc. Al comprender al menos un dominio de unión al epítopo que reconoce inmunoespecíficamente un FcyR, la molécula de diacuerpo puede mostrar una unión al FcyR y una actividad análoga a las interacciones Fc-FcyR. Por ejemplo, las moléculas de la divulgación pueden unirse a un antígeno de la superficie celular y a un FcyR (por ejemplo, un FcyRIIIA) de una célula efectora inmunitaria (por ejemplo, un linfocito citolítico natural), estimulando una función efectora (por ejemplo, ADCC, CDC, fagocitosis, opsonización, etc.) contra dicha célula.
También se describe, la molécula de diacuerpo de la invención comprende un dominio Fc (o parte del mismo). En dichas realizaciones, el dominio Fc puede comprender adicionalmente al menos una modificación de aminoácido con respecto a un dominio Fc de tipo silvestre (o parte del mismo) y/o puede comprender los dominios de uno o más isotipos de IgG (por ejemplo, lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4). Las moléculas de la invención que comprenden dominios Fc variantes pueden mostrar fenotipos conferidos o alterados con respecto a las moléculas que comprenden el dominio Fc de tipo silvestre, tal como una actividad de función efectora alterada o conferida (por ejemplo, según se ensaya en un ensayo dependiente de NK o dependiente de macrófagos). Además, las moléculas descritas en la presente memoria con una actividad de función efectora conferida o alterada son útiles para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad, de un trastorno o de una infección donde se desea un aumento en la eficacia de la función efectora. Como alternativa, las moléculas de diacuerpo de la presente memoria que comprenden un dominio Fc (o parte del mismo) median en la cascada dependiente del complemento. Los dominios Fc variantes identificados por alterar la función efectora se divulgan en la solicitud internacional WO 04/063351, en las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos 2005/0037000 y 2005/0064514 y en las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US 2006-0134709 A1, presentada el 10 de noviembre de 2005, y 2006-0177439 A1, presentada el 15 de diciembre de 2005, solicitudes simultáneas de los autores de la invención.
También se describen métodos y composiciones para el tratamiento, la prevención o el control de un cáncer en un sujeto, que comprenden la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más moléculas que comprenden uno o más sitios de unión a epítopo y opcionalmente, un dominio Fc (o parte del mismo) modificado según los descrito en la presente memoria, molécula que se une adicionalmente a un oncoantígeno. Las moléculas de la divulgación son particularmente útiles para la prevención, la inhibición, la reducción del crecimiento o la regresión de tumores primarios, de metástasis de células cancerosas y de enfermedades infecciosas. Aunque sin pretender estar ligados a ningún mecanismo de acción en particular, las moléculas de la divulgación median en la función efectora, lo que da como resultado la eliminación del tumor, la reducción del tumor o una combinación de los mismos. En realizaciones alternativas, los diacuerpos de la divulgación median en la actividad terapéutica mediante la reticulación de los antígenos y/o de los receptores de la superficie celular, y en la apoptosis o señalización reguladora del crecimiento negativo potenciadas.
Aunque sin pretender estar ligados a ningún mecanismo de acción en particular, las moléculas de diacuerpo de la divulgación muestran eficacia terapéutica potenciada con respecto a los anticuerpos terapéuticos conocidos en la técnica, en parte, debido a la capacidad del diacuerpo de unirse inmunoespecíficamente a una célula diana que expresa un antígeno en particular (por ejemplo, FcyR) a unos niveles reducidos, por ejemplo, en virtud de la capacidad del anticuerpo de permanecer sobre la célula diana más tiempo debido a una avidez mejorada de la interacción de diacuerpo-epítopo.
Los diacuerpos de la divulgación con afinidad y avidez potenciadas por los antígenos (por ejemplo, FcyR) son particularmente útiles para el tratamiento, la prevención o el control de un cáncer, o de otra enfermedad o trastorno, en un sujeto, en el que los FcyR se expresan a bajos niveles en las poblaciones de células diana. Como se usa en la presente memoria, la expresión del FcyR en las células se define en términos de la densidad de dichas moléculas por célula según se mide mediante el uso de los métodos habituales conocidos por los expertos en la materia. Las moléculas descritas en la presente memoria que comprenden múltiples sitios de unión a epítopo y, opcionalmente y FcyR (o parte del mismo) preferiblemente tienen también una avidez y una afinidad y/o una función efectora conferidas o potenciadas en las células que expresan un antígeno diana, por ejemplo, un oncoantígeno, a una densidad de 30000 a 20000 moléculas/célula, a una densidad de 20000 a 10000 moléculas/célula, a una densidad de 10000 moléculas/célula o menos, a una densidad de 5000 moléculas/célula o menos, o a una densidad de 1000 moléculas/célula o menos. Las moléculas de la divulgación tienen utilidad en particular en el tratamiento, la prevención o el control de una enfermedad o de un trastorno, tal como un cáncer, en una subpoblación, en la que el antígeno objetivo se expresa a niveles bajos en la población de células diana.
Las moléculas de la divulgación también pueden utilizarse ventajosamente en combinación con otros agentes terapéuticos conocidos en la técnica para el tratamiento o la prevención de enfermedades, tales como un cáncer, una enfermedad autoinmunitaria, trastornos inflamatorios y enfermedades infecciosas. Las moléculas de la divulgación pueden usarse en combinación con anticuerpos monoclonales o quiméricos, linfocinas o factores de crecimiento hematopoyéticos (tales como, por ejemplo, IL-2, IL-3 e IL-7), que sirven, por ejemplo, para incrementar el número o la actividad de las células efectoras que interactúan con las moléculas y para incrementar la respuesta inmunitaria. Las moléculas de la divulgación también pueden utilizarse ventajosamente en combinación con uno o más fármacos usados para el tratamiento de una enfermedad, de un trastorno o de una infección, tales como, por ejemplo, agentes antineoplásicos, agentes antiinflamatorios o agentes antivíricos, por ejemplo, como se detalla en la sección 5.7.
5.6.1 Cánceres
También se describen métodos y composiciones para el tratamiento o la prevención del cáncer en un sujeto, que comprenden la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más moléculas que comprenden múltiples dominios de unión a epítopo. También se describen métodos y composiciones para el tratamiento o la prevención del cáncer en un sujeto con polimorfismos de FcyR, tales como aquellos homocigóticos para los alelos FyRIlIA-158V o FcyRIIIA-158F. También se describe la modificación de al menos un dominio de unión al epítopo de la molécula de diacuerpo para que se una inmunoespecíficamente al FcyRIIIA (158F). También se describe la modificación de al menos un dominio de unión al epítopo de la molécula de diacuerpo para que se una inmunoespecíficamente al FcyRIIIA (158V).
La eficacia del tratamiento con anticuerpo monoclonal convencional depende del polimorfismo de FcyR del sujeto (Cartron et al. (2002) "Therapeutic Activity Of Humanized Anti-CD20 Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fc Receptor FcRIIIa Gene," Blood 99: 754-758; Weng et al. (2003) '"Two Immunoglobulin G Fragment C Receptor Polymorphisms Independently Predict Response To Rituximab In Patients With Follicular Lymphoma," J Clin Oncol.
21 (21):3940-3947). Estos receptores se expresan en la superficie de las células efectoras y median en la ADCC. Los alelos de alta afinidad, de los receptores de activación de baja afinidad, mejoran la capacidad de las células efectoras para mediar en la ADCC. Al contrario que los que se basan en las interacciones de Fc-FcyR para lograr la función efectora, los métodos de la presente memoria engloban la modificación de moléculas para que reconozcan inmunoespecíficamente los receptores de activación de baja actividad, permitiendo diseñar moléculas para un polimorfismo específico. Alternativa o adicionalmente, la molécula descrita en la presente memoria se puede ser modificar para que comprenda un dominio Fc variante que muestre afinidad potenciada por FcyR (con respecto a un dominio Fc de tipo silvestre) en las células efectoras. Las moléculas modificadas descritas en la presente memoria proporcionan mejores reactivos de inmunoterapia para pacientes independientemente de su polimorfismo de FcyR.
Las moléculas de diacuerpo modificadas de acuerdo con la divulgación se ensayan mediante ADCC usando una línea celular cultivada o leucocitos PBMC derivados de un paciente, para determinar la capacidad de las mutaciones del Fc de potenciar la ADCC. La ADCC convencional se lleva a cabo usando los métodos divulgados en la presente memoria. Se recogen linfocitos de sangre periférica usando un gradiente de Ficoll-Paque (Pharmacia). Las células diana, es decir, las líneas celulares cultivadas o células derivadas de un paciente, se cargan con europio (PerkinElmer) y se incuban con los efectores durante 4 h a 37 °C. El europio liberado se detecta usando un lector de placas fluorescentes (Wallac). Los datos resultantes de la ADCC indican la eficacia de las moléculas de la divulgación para desencadenar una citotoxicidad celular mediada por linfocitos NK y establecer qué moléculas pueden ensayarse con ambas muestras de pacientes y de monocitos sedimentados. Las moléculas de diacuerpo que muestran el mayor potencial para desencadenar una actividad de ADCC se ensayan después en un ensayo de ADCC usando los PBMC de pacientes. Se usan PBMC de donadores sanos como células efectoras.
También se describen métodos para la prevención o el tratamiento de un cáncer caracterizado por un oncoantígeno mediante la genomanipulación de la molécula de diacuerpo para que reconozca inmunoespecíficamente dicho oncoantígeno, de forma que la propia molécula de diacuerpo sea citotóxica (por ejemplo, a través de la reticulación de los receptores de la superficie que da lugar a un aumento en la apoptosis, o a una regulación por disminución de las señales proliferativas) y/o comprenda un dominio Fc, de acuerdo con la divulgación, y/o medie en una o más funciones efectoras (por ejemplo, ADCC, fagocitosis). Los diacuerpos que se han genomanipulado de acuerdo con la divulgación son útiles para la prevención o el tratamiento del cáncer, dado que tienen una actividad citotóxica (por ejemplo, una destrucción potenciada de las células tumorales y/o, por ejemplo, actividad de ADCC o actividad de CDC potenciada).
Los cánceres asociados con un oncoantígeno pueden tratarse o prevenirse mediante la administración de un diacuerpo que se une al oncoantígeno y que es citotóxico, y/o que se ha modificado de acuerdo con los métodos de la presente memoria para que muestren función efectora. Por ejemplo, aunque sin limitación, los cánceres asociados con los siguientes oncoantígenos se pueden tratar o prevenir mediante los métodos y las composiciones descritos: el antígeno KS del pan-carcinoma 1/4 (Perez et al. (1989) "Isolation And Characterization Of A Cdna Encoding The Ks1/4 Epithelial Carcinoma Marker" J. Immunol. 142:3662-3667; Moller et al. (1991) "Bispecific-Monoclonal-Antibody-Directed Lysis Of Ovarían Carcinoma Cells By Activated Human T Lymphocytes," Cancer Immunol. Immunother. 33(4):210-216), el antígeno del carcinoma ovárico (CA125) (Yu et al. (1991) "Coexpression Of Different Antigenic Markers On Moieties That Bear CA 125 Determinants," Cancer Res. 51(2):468-475), el fosfato ácido prostático (Tailor et al. (1990) "Nucleotide Sequence Of Human Prostatic Acid Phosphatase Determined From A Full-Length cDNA Clone," Nucl. Acids Res. 18(16):4928), el antígeno específico prostático (Henttu et al. (1989) "cDNA Coding For The Entire Human Prostate Specific Antigen Shows High Homologies To The Human Tissue Kallikrein Genes," Biochem. Biophys. Res. Comm. 10(2):903-910; Israeli et al. (1993) "Molecular Cloning Of A Complementary DNA Encoding A Prostate-Specific Membrane Antigen," Cancer Res. 53:227-230), el antígeno asociado al melanoma p97 (Estin et al. (1989) "Transfected Mouse Melanoma Lines That Express Various Levels Of Human Melanoma-Associated Antigen p97" J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445-454), el antígeno del melanoma gp75 (Vijayasardahl et al. (1990) " The Melanoma Antigen Gp75 Is The Human Homologue Of The Mouse B (Brown) Locus Gene Product" J. Exp. Med. 171 (4):1375-1380), el antígeno del melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA) (Natali et al. (1987) "Immunohistochemical Detection Of Antigen In Human Primary And Metastatic Melanomas By The Monoclonal Antibody 140.240 And Its Possible Prognostic Significante," Cancer 59:55-63; Mittelman et al. (1990) "Active Specific Immunotherapy In Patients With Melanoma. A Clinical Trial With Mouse Antiidiotypic Monoclonal Antibodies Elicited With Syngeneic Anti-High-Molecular-Weight-Melanoma-Associated Antigen Monoclonal Antibodies," J. Clin. Invest. 86:2136-2144)), el antígeno de membrana específico prostático, el antígeno carcinoembrionario (CEA) (Foon et al. (1995) "Immune Response To The Carcinoembryonic Antigen In Patients Treated With An Anti-Idiotype Antibody Vaccine" J. Clin. Invest. 96(1):334-42), el antígeno mucínico epitelial polimorfo, el antígeno del glóbulo de grasa láctea humana, los antígenos asociados a tumores colorrectales tales como: c Ea , TAG-72 (Yokota et al. (1992) "Rapid Tumor Penetration Of A Single-Chain Fv And Comparison With Other Immunoglobulin Forms" Cancer Res. 52:3402-3408), CO17-1A (Ragnhammar et al. (1993) "Effect Of Monoclonal Antibody 17-1A And GM-CSF In Patients With Advanced Colorectal Carcinoma - Long-Lasting, Complete Remissions Can Be Induced" Int. J. Cancer 53:751-758); GICA 19-9 (Herlyn et al. (1982) "Monoclonal Antibody Detection Of A Circulating Tumor-Associated Antigen. I. Presence Of Antigen In Sera Of Patients With Colorectal, Gastric, And Pancreatic Carcinoma," J. Clin. Immunol. 2:135-140), CTA-1 y LEA, el antígeno del linfoma de Burkitt 38.13, CD19 (Ghetie et al. (1994) "Anti-CD19 Inhibits The Growth Of Human B-Cell Tumor Lines In Vitro And Of Daudi Cells In SCID Mice By Inducing Cell Cycle Arrest," Blood 83:1329-1336), el antígeno del linfoma B humano CD20 (Reff et al. (1994) "Depletion Of B Cells In Vivo By A Chimeric Mouse Human Monoclonal Antibody To CD20," Blood 83:435-445), CD33 (Sgouros et al. (1993) "Modeling And Dosimetry Of Monoclonal Antibody M195 (Anti-CD33) In Acute Myelogenous Leukemia," J. Nucl. Med. 34:422-430), los antígenos específicos de melanoma tales como el gangliósido GD2 (Saleh et al. (1993) "Generation Of A Human AntiIdiotypic Antibody That Mimics The GD2 Antigen,'' J. Immunol., 151, 3390-3398), el gangliósido GD3 (Shitara et al. (1993) "A Mouse/Human Chimeric Anti-(Ganglioside GD3) Antibody With Enhanced Antitumor Activities," Cancer Immunol. Immunother. 36:373-380), el gangliósido GM2 (Livingston et al. (1994) "Improved Survival In Stage III Melanoma Patients With GM2 Antibodies: A Randomized Trial Of Adjuvant Vaccination With GM2 Ganglioside," J. Clin. Oncol. 12:1036-1044), el gangliósido GM3 (Hoon et al. (1993) "Molecular Cloning Of A Human Monoclonal Antibody Reactive To Ganglioside GM3 Antigen On Human Cancers," Cancer Res. 53:5244-5250), el antígeno de la superficie celular tumoral específico del tipo de trasplante (TSTA) tales como los antígenos tumorales inducidos por virus, incluyendo antígenos T de virus tumorales de ADN y antígenos de la cubierta de virus tumorales de ARN, el antígeno de la alfa-fetoproteína oncofetal tal como el CEA de colon, el antígeno tumoral de vejiga oncofetal (Hellstrom et al. (1985) "Monoclonal Antibodies To Cell Surface Antigens Shared By Chemically Induced Mouse Bladder Carcinomas," Cancer. Res.
45:2210-2188), los antígenos de diferenciación tales como el antígeno del carcinoma de pulmón humano L6, L20 (Hellstrom et al. (1986) "Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma," Cancer Res.
46:3917-3923), los antígenos de fibrosarcoma, el antígeno de la leucemia de linfocitos T humana Gp37 (Bhattacharya-Chatterjee et al. (1988) "Idiotype Vaccines Against Human T Cell Leukemia. II. Generation And Characterization Of A Monoclonal Idiotype Cascade (Ab1, Ab2, and Ab3)," J. Immunol. 141:1398-1403), la neoglucoproteína, los esfingolípidos, el antígeno del cáncer de mama tal como el EGFR (el receptor del factor de crecimiento epidérmico), el antígeno HER2 (p185HER2), la mucina epitelial polimorfa (PEM) (Hilkens et al. (1992) "Cell Membrane-Associated Mucins And Their Adhesion-Modulating Property," Trends in Biochem. Sci. 17:359-363), el antígeno de linfocitos humano maligno APO-1 (Trauth et al. (1989) "Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis," Science 245:301-304), el antígeno de diferenciación (Feizi (1985) "Demonstration By Monoclonal Antibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteins And Glycolipids Are Onco-DevelopmentalAntigens," Nature 314:53-57) tal como el antígeno I encontrado en eritrocitos fetales y el endodermo primario, I(Ma) encontrado en adenocarcinomas gástricos, M18 y M39 encontrados en el epitelio mamario, SSEA-1 encontrado en células mieloides, VEP8, VEP9, Myl, VIM-D5 y D156-22 encontrados en el cáncer colorrectal, TRA-1-85 (grupo sanguíneo H), C14 encontrado en el adenocarcinoma de colon, F3 encontrado en el adenocarcinoma de pulmón, AH6 encontrado en el cáncer gástrico, hapteno Y, Ley encontrados en células de carcinoma embrionarias, TL5 (grupo sanguíneo A), el receptor de EGF encontrado en células A431, la serie E1 (grupo sanguíneo B) encontrado en el cáncer de páncreas, FC10.2 encontrado en células de carcinoma embrionarias, de adenocarcinoma gástrico, CO-514 (grupo sanguíneo Lea) encontrado en adenocarcinoma, NS-10 encontrado en adenocarcinomas, CO-43 (grupo sanguíneo Leb), G49, receptor de EGF, (grupo sanguíneo ALeb/Ley) encontrado en adenocarcinoma de colon, 19.9 encontrado en cáncer de colon, mucinas del cáncer gástrico, T5A7 encontrado en células mieloides, R24 encontrado en melanoma, 4.2, Gd3, D1.1, OFA-1, Gm2, OFA-2, Gd2, M1:22:25:8 encontrados en células de carcinoma embrionarias, y SSEA-3, SSEA-4 encontrado en embriones en la fase de 4-8 células. En otra realización, el antígeno es un péptido derivado del receptor de linfocitos T de un linfoma cutáneo de linfocitos T (véase, Edelson (1998) "Cutaneous T-Cell Lymphoma: A Model For Selective Immunotherapy," Cancer J Sci Am.
4:62-71).
Cánceres y trastornos relacionados que pueden tratarse o prevenirse mediante los métodos y las composiciones descritos en la presente memoria incluyen, aunque sin limitación, los siguientes: leucemias que incluyen, aunque sin limitación, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemias mielocíticas agudas tales como mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica, leucemias eritroleucémicas y síndrome mielodisplásico, leucemias crónicas tales como, aunque sin limitación, leucemia mielocítica (granulocítica) crónica, leucemia linfocítica crónica, tricoleucemia; policitemia vera; linfomas tales como, aunque sin limitación, enfermedad de Hodgkin, enfermedad no Hodgkin; mielomas múltiples tales como, aunque sin limitación, mieloma múltiple quiescente, mieloma no secretor, mieloma osteoesclerótico, leucemia plasmocítica, plasmocitoma solitario y plasmocitoma extramedular; macroglobulinemia de Waldenstrom; gammopatía monoclonal de significación indeterminada; gammopatía monoclonal benigna; enfermedad de la cadena pesada; sarcomas del tejido óseo y conectivo tales como, aunque sin limitación, sarcoma óseo, osteosarcoma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, tumor maligno de gigantocitos, fibrosarcoma óseo, cordoma, sarcoma periosteal, sarcomas de tejidos blandos, angiosarcoma (hemangiosarcoma), fibrosarcoma, sarcoma de Kaposi, leiomiosarcoma, liposarcoma, linfangiosarcoma, neurilemoma, rabdomiosarcoma, sarcoma sinovial; tumores cerebrales que incluyen, aunque sin limitación, glioma, astrocitoma, glioma del tronco encefálico, ependimoma, oligodendroglioma, tumor no glial, neurinoma acústico, craneofaringioma, meduloblastoma, meningioma, pineocitoma, pineoblastoma, linfoma cerebral primario; cáncer de mama que incluye, aunque sin limitación, adenocarcinoma, carcinoma lobular (microcítico), carcinoma intraductal, cáncer de mama medular, cáncer de mama mucinoso, cáncer de mama tubular, cáncer de mama papilar, enfermedad de Pages y cáncer de mama inflamatorio; cáncer adrenal, que incluye, aunque sin limitación, feocromocitoma y carcinoma adrenocortical; cáncer de tiroides tal como, aunque sin limitación, cáncer de tiroides papilar o folicular, cáncer de tiroides medular y cáncer de tiroides anaplásico; cáncer de páncreas, que incluye, aunque sin limitación, insulinoma, gastrinoma, glucagonoma, vipoma, tumor secretor de somatostatina y tumor carcinoide o de las células de los islotes; cánceres de la pituitaria que incluyen, aunque sin limitación, enfermedad de Cushing, tumor secretor de prolactina, acromegalia y diabetes insípida; cánceres oculares que incluyen, aunque sin limitación, melanoma ocular tal como melanoma de iris, melanoma de la coroides y melanoma del cuerpo ciliar y retinoblastoma; cánceres de vagina que incluyen, aunque sin limitación, carcinoma epidermoide, adenocarcinoma y melanoma; cáncer de vulva que incluye, aunque sin limitación, carcinoma epidermoide, melanoma, adenocarcinoma, carcinoma de células basales, sarcoma y enfermedad de Paget; cánceres cervicales que incluyen, aunque sin limitación, carcinoma epidermoide y adenocarcinoma; cánceres de útero que incluyen, aunque sin limitación, carcinoma endometrial y sarcoma de útero; cánceres de ovario que incluyen, aunque sin limitación, carcinoma epitelial de ovario, tumor intermedio, tumor de las células germinales y tumor estromal; cánceres de esófago que incluyen, aunque sin limitación, cáncer epidermoide, adenocarcinoma, carcinoma quístico adenoide, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma adenoepidermoide, sarcoma, melanoma, plasmocitoma, carcinoma verrucoso y carcinoma indiferenciado (microcítico); cánceres de estómago que incluyen, aunque sin limitación, adenocarcinoma, neoplásico (polipoide), ulcerativo, de diseminación superficial, de diseminación difusa, linfoma maligno, liposarcoma, fibrosarcoma y carcinosarcoma; cánceres de colon; cánceres rectales; cánceres de hígado que incluyen, aunque sin limitación, carcinoma hepatocelular y hepatoblastoma, cánceres de la vesícula biliar que incluyen, aunque sin limitación, adenocarcinoma; colangiocarcinomas que incluyen, aunque sin limitación, papilar, nodular y difuso; cánceres de pulmón que incluyen, aunque sin limitación, cáncer de pulmón no microcítico, carcinoma epidermoide (carcinoma epidermoide), adenocarcinoma, carcinoma de células grandes y cáncer de pulmón microcítico; cánceres testiculares que incluyen, aunque sin limitación, tumor germinal, seminoma, anaplásico, clásico (típico), espermatocítico, no seminoma, carcinoma embrionario, carcinoma teratoma, coriocarcinoma (tumor del saco vitelino), cánceres de próstata que incluyen, aunque sin limitación, adenocarcinoma, leiomiosarcoma y rabdomiosarcoma; cánceres de pene; cánceres orales que incluyen, aunque sin limitación, carcinoma epidermoide; cánceres basales; cánceres de las glándulas salivares que incluyen, aunque sin limitación, adenocarcinoma, carcinoma mucoepidermoide y carcinoma adenoquístico; cánceres de faringe que incluyen, aunque sin limitación, cáncer epidermoide y verrucoso; cánceres de piel que incluyen, aunque sin limitación, carcinoma de células basales, carcinoma epidermoide y melanoma, melanoma de diseminación superficial, melanoma nodular, melanoma lentigo maligno, melanoma lentiginoso acral; cánceres de riñón que incluyen, aunque sin limitación, cáncer de células renales, adenocarcinoma, hipernefroma, fibrosarcoma, cáncer de células transicionales (de la pelvis renal y/o del uréter); tumor de Wilms; cánceres de vejiga que incluyen, aunque sin limitación, carcinoma de células transicionales, cáncer epidermoide, adenocarcinoma, carcinosarcoma. Además, algunos cánceres incluyen mixosarcoma, sarcoma osteogénico, endoteliosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, mesotelioma, sinovioma, hemangioblastoma, carcinoma epitelial, cistadenocarcinoma, carcinoma broncogénico, carcinoma de las glándulas sudoríparas, carcinoma de las glándulas sebáceas, carcinoma papilar y adenocarcinomas papilares (para una revisión de dichos trastornos, véase Fishman et al. (1985) Medicine, 2.a Ed., J.B. Lippincott Co., Filadelfia; y Murphy et al. (1997) Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recoverv. Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., Estados Unidos de América).
Por consiguiente, los métodos y las composiciones descritos en la presente memoria también son útiles en el tratamiento o la prevención de una diversidad de cánceres o de otras enfermedades proliferativas anómalas que incluyen, (aunque sin limitación) las siguientes: carcinoma, que incluyen, de vejiga, de mama, de colon, de riñón, de hígado, de pulmón, de ovario, de páncreas, de estómago, de próstata, de cuello de útero, de tiroides y de piel; que incluyen, carcinoma epidermoide; tumores hematopoyéticos de la estirpe linfoide que incluyen leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de linfocitos B, linfoma de linfocitos T, linfoma de Burketts; tumores hematopoyéticos de la estirpe mieloide que incluyen leucemias mielógenas agudas y crónicas, y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimatoso que incluyen fibrosarcoma y rabdomioscarcoma; otros tumores, que incluyen, melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico que incluyen astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; tumores de origen mesenquimatoso que incluyen fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y osteosarcoma; y otros tumores, que incluyen, melanoma, xenoderma pigmentoso, queratoacantoma, seminoma, cáncer folicular de tiroides y teratocarcinoma. También se contempla que los cánceres causados por aberraciones en la apoptosis se puedan tratar también mediante los métodos y las composiciones descritos en la presente memoria. Dichos cánceres pueden incluir, aunque sin limitación, linfomas foliculares, carcinomas con mutaciones en p53, tumores de mama hormonodependientes, lesiones precancerosas de próstata y de ovario tales como poliposis adenomatosa familiar y síndromes mielodisplásicos. En realizaciones específicas, los cambios malignos o disproliferativos (tales como metaplasias y displasias) o los trastornos hiperproliferativos se tratan o se previenen mediante los métodos y las composiciones descritos en la presente memoria en el ovario, la vejiga, la mama, el colon, el pulmón, la piel, el páncreas o el útero. En otras realizaciones específicas se trata o se previene el sarcoma, el melanoma o la leucemia mediante los métodos y las composiciones descritos en la presente memoria.
En una realización específica, una molécula descrita en la presente memoria (por ejemplo, un diacuerpo que comprende múltiples dominios de unión a epítopo y, opcionalmente y dominio Fc (o parte del mismo)) inhibe o reduce el crecimiento de las células cancerosas en al menos un 99 %, al menos un 95 %, al menos un 90 %, al menos un 85 %, al menos un 80 %, al menos un 75 %, al menos un 70 %, al menos un 60 %, al menos un 50 %, al menos un 45 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 35 %, al menos un 30 %, al menos un 25 %, al menos un 20 % o al menos un 10 % con respecto al crecimiento de las células cancerosas en ausencia de dicha molécula descrita en la presente memoria.
En una realización específica, una molécula descrita en la presente memoria (por ejemplo, un diacuerpo que comprende múltiples dominios de unión a epítopo y, opcionalmente y dominio Fc (o parte del mismo)) destruye las células o inhibe o reduce el crecimiento de las células cancerosas al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 100 % mejor que la molécula precursora.
5.6.2 Enfermedad autoinmunitaria y enfermedades inflamatorias
En algunas realizaciones, las moléculas de la divulgación comprenden un dominio de unión a epítopo específico para el FcyRIIB y/o un dominio Fc variante (o parte del mismo), modificado de acuerdo con métodos descritos en la presente memoria, cuyo dominio Fc muestra una mayor afinidad por el FcyRIIB y una afinidad disminuida por el FcyRIIIA y/o por el FcyRIIA con respecto a un dominio Fc de tipo silvestre. Las moléculas de la divulgación con dichas características de unión son útiles en la regulación de la respuesta inmunitaria, por ejemplo, en la inhibición de la respuesta inmunitaria en relación con enfermedades autoinmunitarias o con enfermedades inflamatorias. Aunque sin pretender estar ligados a ningún mecanismo de acción, las moléculas de la divulgación con una afinidad por el FcyRIIB y/o que comprenden un dominio Fc con una afinidad aumentada por el FcyRIIB y una afinidad disminuida por el FcyRIIIA y/o FcyRIIA pueden dar lugar a una amortiguación en la respuesta de activación del FcyR y a una inhibición en la sensibilidad celular, y, por tanto, tienen eficacia terapéutica para el tratamiento y/o la prevención de un trastorno autoinmunitario.
También se describen métodos para la prevención, el tratamiento o el control de uno o más síntomas asociados con un trastorno inflamatorio en un sujeto, que comprenden adicionalmente la administración a dicho sujeto de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes antiinflamatorios. También se describen métodos para la prevención, el tratamiento o el control de uno o más síntomas asociados con una enfermedad autoinmunitaria, que comprenden adicionalmente la administración a dicho sujeto de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes inmunomoduladores. La sección 5.7 proporciona ejemplos no limitantes de agentes antiinflamatorios y de agentes inmunomoduladores.
Ejemplos de trastornos autoinmunitarios que se pueden tratar mediante la administración de las moléculas de la presente divulgación incluyen, aunque sin limitación, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido, enfermedad autoinmunitaria de Addison, enfermedades autoinmunitarias de la glándula suprarrenal, anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, ooforitis y orquitis autoinmunitaria, trombocitopenia autoinmunitaria, enfermedad de Behcet, penfigoide vesicular, cardiomiopatía, dermatitis herpetiforme, síndrome de disfunción inmunitaria por fatiga crónica (CFIDS), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de CREST, enfermedad de la aglutinina fría, enfermedad de Crohn, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, de Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopenia idiopática (ITP), neuropatía por IgA, artritis juvenil, liquen plano, lupus eritematoso, enfermedad de Méniére, enfermedad mixta del tejido conectivo, esclerosis múltiple, diabetes sacarina de tipo 1 o inmunitaria, miastenia grave, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policrondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriásica, fenómeno de Raynauld, síndrome de Reiter, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, síndrome de la persona rígida, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso, arteritis de takayasu, arteritis temporal/arteritis de gigantocitos, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis tales como dermatitis, vasculitis herpetiforme, vitíligo y granulomatosis de Wegener. Ejemplos de trastornos inflamatorios incluyen, aunque sin limitación, asma, encefalitis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), trastornos alérgicos, choque séptico, fibrosis pulmonar, espondiloartropatía no diferenciada, artropatía no diferenciada, artritis, osteólisis inflamatoria e inflamación crónica resultante de infecciones crónicas víricas o bacterianas. Como se describe en la presente memoria en la sección 2.2.2, algunos trastornos autoinmunitarios están asociados con una afección inflamatoria. Por tanto, hay un solapamiento entre lo que se considera un trastorno autoinmunitario y un trastorno inflamatorio. Por lo tanto, algunos trastornos autoinmunitarios también se pueden caracterizar como trastornos inflamatorios. Ejemplos de trastornos inflamatorios que pueden prevenirse, tratarse o atenderse de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria incluyen, aunque sin limitación, asma, encefalitis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), trastornos alérgicos, choque séptico, fibrosis pulmonar, espondiloartropatía no diferenciada, artropatía no diferenciada, artritis, osteólisis inflamatoria e inflamación crónica resultante de infecciones crónicas víricas o bacterianas.
Las moléculas de la divulgación que comprenden al menos un dominio de unión a epítopo específico para el FcyRIIB y/o un dominio Fc variante con una afinidad potenciada por el FcyRIIB y una afinidad disminuida por el FcyRIIIA también pueden usarse para reducir la inflamación experimentada por animales, particularmente mamíferos, con trastornos inflamatorios. En una realización específica, una molécula de la divulgación reduce la inflamación en un animal en al menos un 99 %, en al menos un 95 %, en al menos un 90 %, en al menos un 85 %, en al menos un 80 %, en al menos un 75 %, en al menos un 70 %, en al menos un 60 %, en al menos un 50 %, en al menos un 45 %, en al menos un 40 %, en al menos un 45 %, en al menos un 35 %, en al menos un 30 %, en al menos un 25 %, en al menos un 20 % o en al menos un 10 % con respecto a la inflamación en un animal al que no se le ha administrado dicha molécula.
Las moléculas de la divulgación que comprenden al menos un dominio de unión a epítopo específico para el FcyRIIB y/o un dominio Fc variante con una afinidad potenciada por el FcyRIIB y una afinidad disminuida por el FcyRIIIA también pueden usarse para prevenir el rechazo de trasplantes.
5.6.3 Enfermedad infecciosa
También se describen métodos para el tratamiento o la prevención de una enfermedad infecciosa en un sujeto, que comprenden la administración de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una o más moléculas de la divulgación que comprenden al menos un dominio de unión a epítopo específico para un agente infeccioso asociado con dicha enfermedad infecciosa. En determinadas realizaciones, las moléculas de la divulgación son tóxicas para el agente infeccioso, aumentan la respuesta inmunitaria contra dicho agente o aumentan la función efectora contra dicho agente, con respecto a la respuesta inmunitaria en ausencia de dicha molécula. Enfermedades infecciosas que pueden tratarse o prevenirse con las moléculas de la divulgación están causadas por agentes infecciosos que incluyen, aunque sin limitación, virus, bacterias, hongos, protozoos y virus.
Enfermedades víricas que pueden tratarse o prevenirse usando las moléculas de la divulgación junto con los métodos descrito en la presente memoria incluyen, aunque sin limitación, las causadas por la hepatitis de tipo A, la hepatitis de tipo B, la hepatitis de tipo C, la gripe, la varicela, adenovirus, el herpes simple de tipo I (HSV-I), el herpes simple de tipo II (HSV-II), la peste bovina, rinovirus, ecovirus, rotavirus, el virus respiratorio sincitial, el virus del papiloma, papovavirus, citomegalovirus, equinovirus, arbovirus, huntavirus, virus coxsackie, el virus de las paperas, el virus del sarampión, el virus de la rubéola, poliovirus, viruela, el virus de Epstein Barr, el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo I (VIH-I), el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo II (VIH-II) y agentes de enfermedades víricas tales como meningitis vírica, encefalitis, dengue o viruela.
Enfermedades bacterianas que pueden tratarse o prevenirse usando las moléculas de la divulgación junto con los métodos descritos en la presente memoria, que están causadas por bacterias incluyen, aunque sin limitación, micobacterias rickettsia, micoplasma, Neiseria, S. pneumoniae, Borrelia burgdorferi (enfermedad de Lyme), Bacillus antracis (carbunco), tétanos, estreptococos, estafilococos, micobacteria, tétanos, pertussis, cólera, peste, difteria, clamidia, S. aureus y legionela.
Enfermedades por protozoos que pueden tratarse o prevenirse usando las moléculas de la divulgación junto con los métodos descritos en la presente memoria, que están causadas por protozoos incluyen, aunque sin limitación, leishmania, coccidios, tripanosoma o malaria.
Enfermedades por parásitos que pueden tratarse o prevenirse usando las moléculas de la divulgación junto con los métodos descritos en la presente memoria, que están causadas por parásitos incluyen, aunque sin limitación, clamidia y rickettsia.
De acuerdo con un aspecto de la invención, las moléculas de la divulgación que comprenden al menos un dominio de unión a epítopo específico para un agente infeccioso muestran una función efectora de anticuerpo hacia dicho agente, por ejemplo, una proteína patógena. Ejemplos de agentes infecciosos incluyen, aunque sin limitación, bacterias (por ejemplo, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecials, Candida albicans, Proteus vulgaris, Staphylococcus viridans y Pseudomonas aeruginosa), un patógeno (por ejemplo, papovavirus linfotrópico B (LPV); Bordatella pertussis; el virus de la enfermedad de Borna (BDV); coronavirus bovino; el virus de la coriomeningitis; el virus del Dengue; un virus, E. coli; Ébola; Ecovirus 1; Ecovirus-11 (EV); endotoxina (LPS); bacterias entéricas; el virus huérfano entérico; enterovirus; el virus de la leucemia felina; el virus de la glosopeda; el virus de la leucemia del gibón (GALV); bacterias gramnegativas; Heliobacter pylori; el virus de la hepatitis B (HBV); el virus del herpes simple; el VIH-1; citomegalovirus humanos; coronavirus humanos; gripe A, B y C; legionela; Leishmania mexicana; Listeria monocytogenes; el virus del sarampión; meningococos; morbillivirus; el virus de la hepatitis de ratón; el virus de la leucemia murina; el virus del herpes gamma murino; retrovirus murinos; el virus de la hepatitis de ratón, coronavirus murino; Mycobacterium avium-M; Neisseria gonorrhoeae; el virus de la enfermedad de Newcastle; el parvovirus B19; Plasmodium falciparum; el virus de la varicela; Pseudomonas; rotavirus; Samonella typhimurium; Shigella; estreptococos; el virus linfotrópico de los linfocitos T 1; el virus vaccinia).
5.6.4 Desintoxicación
También se describen métodos de desintoxicación en un sujeto expuesto a una toxina (por ejemplo, una molécula de fármaco tóxica), que comprenden la administración de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una o más moléculas de la divulgación que comprenden al menos un dominio de unión a epítopo específico para la molécula de fármaco tóxica. En determinadas realizaciones, la unión de una molécula de la divulgación a la toxina reduce o elimina el efecto fisiológico adverso de dicha toxina. En otras realizaciones más, la unión de un diacuerpo de la divulgación a la toxina incrementa o potencia la eliminación, la degradación o la neutralización de la toxina con respecto a la eliminación, la degradación o la neutralización en ausencia de dicho diacuerpo. La inmunotoxicoterapia de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria puede usarse para el tratamiento de sobredosis o de exposición a fármacos que incluyen, aunque sin limitación, digixina, PCP, cocaína, colchicina y antidepresivos tricíclicos.
5.7 Tratamiento de combinación
También se describe la administración de las moléculas de la divulgación en combinación con otros tratamientos conocidos por los expertos en la materia para el tratamiento o la prevención del cáncer, de una enfermedad autoinmunitaria, de una enfermedad infecciosa o de una intoxicación, incluyendo, aunque sin limitación, las actuales quimioterapias convencionales o experimentales, tratamientos hormonales, tratamientos biológicos, inmunoterapias, radioterapias o cirugía. En algunas realizaciones, las moléculas de la divulgación se pueden administrar en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes, anticuerpos terapéuticos u otros agentes conocidos por los expertos en la materia para el tratamiento y/o la prevención del cáncer, de una enfermedad autoinmunitaria, de una enfermedad infecciosa o de una intoxicación.
En determinadas realizaciones, se administra una o más moléculas de la divulgación a un mamífero, preferiblemente a un ser humano, simultáneamente con uno o más de otros agentes terapéuticos útiles para el tratamiento de cáncer. El término "simultáneamente" no está limitado a la administración de agentes profilácticos o terapéuticos exactamente al mismo tiempo, sino que más bien significa que una molécula de la divulgación y el otro agente se administran a un mamífero en una secuencia y en un intervalo de tiempo tal que la molécula de la divulgación puede actuar junto con el otro agente para proporcionar un aumento en el beneficio con respecto a si se administraran de otro modo. Por ejemplo, cada agente profiláctico o terapéutico (por ejemplo, quimioterapia, radioterapia, tratamiento hormonal o tratamiento biológico) se puede administrar al mismo tiempo o secuencialmente en cualquier orden en puntos temporales diferentes; sin embargo, si se administran al mismo tiempo, deberían administrarse lo suficientemente cerca en el tiempo como para proporcionar el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Cada agente terapéutico se puede administrar por separado, en cualquier forma apropiada y mediante cualquier vía adecuada. En diversas realizaciones, los agentes profilácticos o terapéuticos se administran con menos de 1 hora de diferencia, con aproximadamente 1 hora de diferencia, con entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 2 horas de diferencia, con entre aproximadamente 2 horas y aproximadamente 3 horas de diferencia, con entre aproximadamente 3 horas y aproximadamente 4 horas de diferencia, con entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 5 horas de diferencia, con entre aproximadamente 5 horas y aproximadamente 6 horas de diferencia, con entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 7 horas de diferencia, con entre aproximadamente 7 horas y aproximadamente 8 horas de diferencia, con entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 9 horas de diferencia, con entre aproximadamente 9 horas y aproximadamente 10 horas de diferencia, con entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 11 horas de diferencia, con entre aproximadamente 11 horas y aproximadamente 12 horas de diferencia, con no más de 24 horas de diferencia o con no más de 48 horas de diferencia. En realizaciones preferidas, dos o más componentes se administran en la misma visita del paciente.
En otras realizaciones, los agentes profilácticos o terapéuticos se administran con entre aproximadamente 2 y 4 días de diferencia, con entre aproximadamente 4 y 6 días de diferencia, con aproximadamente 1 semana de diferencia, con entre aproximadamente 1 y 2 semanas de diferencia, o con más de 2 semanas de diferencia. En las realizaciones preferidas, los agentes profilácticos o terapéuticos se administran en un marco temporal en el que ambos agentes todavía son activos. El experto en la materia será capaz de determinar dicho marco temporal mediante la determinación de la semivida de los agentes administrados.
En determinadas realizaciones, los agentes profilácticos o terapéuticos de la invención se administran cíclicamente a un sujeto. El tratamiento cíclico implica la administración de un primer agente durante un periodo de tiempo, seguido de la administración de un segundo agente y/o de un tercer agente durante un periodo de tiempo, y la repetición de esta administración secuencial. El tratamiento cíclico puede reducir al desarrollo de resistencia a uno o más tratamientos, evitar o reducir los efectos secundarios de uno de los tratamientos y/o mejora la eficacia del tratamiento.
En determinadas realizaciones, los agentes profilácticos o terapéuticos se administran en un ciclo de menos de aproximadamente 3 semanas, aproximadamente una vez cada dos semanas, aproximadamente una vez cada 10 días o aproximadamente una vez cada semana. Un ciclo puede comprender la administración de un agente terapéutico o profiláctico mediante una infusión durante aproximadamente 90 minutos cada ciclo, aproximadamente 1 hora cada ciclo, aproximadamente 45 minutos cada ciclo. Cada ciclo puede comprender al menos 1 semana de reposo, al menos 2 semanas de reposo, al menos 3 semanas de reposo. El número de ciclos administrados es de aproximadamente 1 a aproximadamente 12 ciclos, más normalmente de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 ciclos, y más normalmente de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 ciclos.
En otras realizaciones más, los agentes terapéuticos y profilácticos de la invención se administran con unas pautas posológicas regulares, mediante infusión continua o mediante administración frecuente sin periodos de reposo prolongados. Dicha administración regular puede implicar la dosificación a unos intervalos constantes sin periodos de reposo. Normalmente, los agentes terapéuticos, en particular los agentes citotóxicos, se usan a las dosis más bajas. Dichas pautas posológicas engloban la administración crónica diaria de unas dosis relativamente bajas durante unos periodos prolongados de tiempo. En realizaciones preferidas, el uso de dosis bajas puede minimizar los efectos tóxicos secundarios y eliminar los periodos de reposo. En determinadas realizaciones, los agentes terapéuticos y profilácticos se administran mediante infusión crónica a baja dosis o continua que varía de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 2 días, a aproximadamente 1 semana, a aproximadamente 2 semanas, a aproximadamente 3 semanas, a aproximadamente 1 mes, a aproximadamente 2 meses, a aproximadamente 3 meses, a aproximadamente 4 meses, a aproximadamente 5 meses, a aproximadamente 6 meses. La cronología de dichas pautas posológicas se puede optimizar por el oncólogo.
En otras realizaciones, los ciclos de tratamiento se administran simultáneamente a un mamífero, es decir, se administran dosis individuales de los productos terapéuticos por separado todavía en un intervalo de tiempo tal que las moléculas de la divulgación pueden trabajar junto con el (los) otro(s) agente(s). Por ejemplo, un componente se puede administrar una vez por semana junto con los otros componentes, que se pueden administrar una vez cada dos semanas o una vez cada tres semanas. En otras palabras, las pautas posológicas de los productos terapéuticos se llevan a cabo simultáneamente incluso si los productos terapéuticos no se administran simultáneamente o en la misma visita del paciente.
Cuando se usan en combinación con otros agentes terapéuticos y/o profilácticos, las moléculas de la divulgación y el agente profiláctico y/o terapéutico pueden actuar aditivamente, o más preferiblemente, sinérgicamente. Una molécula de la divulgación se puede administrar simultáneamente con uno o más agentes terapéuticos en la misma composición terapéutica. Una molécula de la divulgación se puede administrar simultáneamente con uno o más de otros agentes terapéuticos en composiciones farmacéuticas por separado. Una molécula de la divulgación se puede administrar antes o después de la administración de otro agente profiláctico o terapéutico. También se describe la administración de una molécula de la divulgación en combinación con otros agentes profilácticos o terapéuticos a través de la misma o de diferentes vías de administración, por ejemplo, oral y parenteral. Cuando se administra una molécula de la divulgación simultáneamente con otro agente profiláctico o terapéutico que potencialmente produce efectos secundarios adversos que incluyen, aunque sin limitación, toxicidad, el agente profiláctico o terapéutico puede administrarse ventajosamente a una dosis que está por debajo del umbral que desencadena el efecto secundario adverso.
Las cantidades y las frecuencias de las dosis de la administración proporcionada en la presente memoria están englobadas por los términos terapéuticamente eficaz y profilácticamente eficaz. La dosis y la frecuencia variarán normalmente de acuerdo con factores específicos de cada paciente dependiendo del agente terapéutico o profiláctico específico administrado, de la gravedad y del tipo de cáncer, de la vía de administración, así como de la edad, del peso corporal, de la respuesta y de los antecedentes médicos del paciente. Las pautas adecuadas se pueden seleccionar por el experto en la materia teniendo en consideración dichos factores, y siguiendo, por ejemplo, las dosis indicadas en la bibliografía y recomendadas en el Physician's Desk Reference (56.a ed., 2002).
5.7.1 Agentes antineoplásicos
También se describe la administración de una o más moléculas de la divulgación con uno o más agentes terapéuticos usados para el tratamiento y/o la prevención de cáncer. En una realización, pueden administrarse inhibidores de la angiogénesis en combinación con las moléculas de la divulgación. Inhibidores de la angiogénesis que pueden usarse en los métodos y en las composiciones descritos en la presente memoria incluyen, aunque sin limitación: Angiostatina (un fragmento de plasminógeno); antitrombina III antiangiogénica; Angiozima; ABT-627; Bay 12-9566; Benefina; Bevacizumab; BMS-275291; inhibidores derivados de cartílago (CDI); CAI; el fragmento del complemento CD59; CEP-7055; Col 3; Combretastatina A-4; Endostatina (un fragmento de colágeno XVIII); un fragmento de fibronectina; Gro-beta; Halofuginona; Heparinasas; un fragmento de hexasacárido de heparina; HMV833; gonadotropina coriónica humana (hCG); IM-862; Interferón alfa/beta/gamma; proteína inducible por interferón (IP-10); Interleucina 12; Kringle 5 (un fragmento de plasminógeno); Marimastat; inhibidores de la metaloproteinasa (TIMP); 2-Metoxiestradiol; MMI 270 (CGS 27023A); el AcMc IMC-1C11; Neovastat; NM-3; Panzem; PI-88; el inhibidor de la ribonucleasa placentaria; el inhibidor del activador del plasminógeno; el factor plaquetario 4 (PF4); Prinomastat; un fragmento de la prolactina de 16 kDa; la proteína relacionada con la proliferina (PRP); PTK 787/ZK 222594; retinoides; Solimastat; escualamina; SS 3304; SU 5416; SU6668; SU11248; tetrahidrocortisol-S; tetratiomolibdato; talidomida; tromboespondina 1 (TSP-1); TNP-470; el factor de crecimiento transformante beta (TGF-b); vasculostatina; vasostatina (un fragmento de calreticulina); ZD6126; ZD 6474; inhibidores de la transferasa de farnesilo (FTI); y bisfosfonatos.
Agentes antineoplásicos que pueden usarse en combinación con las moléculas de la divulgación incluyen, aunque sin limitación: acivicina; aclarrubicina; clorhidrato de acodazol; acronina; adozelesina; aldesleucina; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginasa; asperlina; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastat; benzodepa; bicalutamida; clorhidrato de bisantreno; dimesilato de bisnafida; bizelesina; sulfato de bleomicina; brequinar de sodio; bropirimina; busulfano; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetimer; carboplatino; carmustina; clorhidrato de carrubicina; carzelesina; cedefingol; clorambucilo; cirolemicina; cisplatino; cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; clorhidrato de daunorrubicina; decitabina; dexormaplatino; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diaziquona; docetaxel; doxorrubicina; clorhidrato de doxorrubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; clorhidrato de eflomitina; elsamitrucina; enloplatino; enpromato; epipropidina; clorhidrato de epirrubicina; erbulozol; clorhidrato de esorrubicina; estramustina; fosfato sódico de estramustina; etanidazol; etopósido; fosfato de etopósido; etoprina; clorhidrato de fadrozol; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fosfato de fludarabina; fluorouracilo; flurocitabina; fosquidona; fostriecina de sodio; gemcitabina; clorhidrato de gemcitabina; hidroxiurea; clorhidrato de idarrubicina; ifosfamida; ilmofosina; interleucina II (incluyendo la interleucina II recombinante, o rIL2), interferón alfa-2a; interferón alfa-2b; interferón alfa-n1; interferón alfa-n3; interferón beta-I a; interferón gamma-I b; iproplatino; clorhidrato de irinotecán; acetato de lanreotida; letrozol; acetato de leuprolida; clorhidrato de liarozol; lometrexol de sodio; lomustina; clorhidrato de losoxantrona; masoprocol; maitansina; clorhidrato de mecloretamina; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfalano; menogaril; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato de sodio; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotano; clorhidrato de mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazol; nogalamicina; omaplatino; oxisuran; paclitaxel; pegaspargasa; peliomicina; pentamustina; sulfato de peplomicina; perfosfamida; pipobromano; piposulfano; clorhidrato de piroxantrona; plicamicina; plomestano; porfimer de sodio; porfiromicina; prednimustina; clorhidrato de procarbazina; puromicina; clorhidrato de puromicina; pirazofurina; riboprina; rogletimida; safingol; clorhidrato de safingol; semustina; simtrazeno; esparfosato de sodio; esparsomicina; clorhidrato de espirogermanio; espiromustina; espiroplatino; estreptonigrina; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; tecogalan de sodio; tegafur; clorhidrato de teloxantrona; temoporfina; tenipósido; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; citrato de toremifeno; acetato de trestolona; fosfato de triciribina; trimetrexato; glucuronato de trimetrexato; triptorrelina; clorhidrato de tubulozol; mostaza de uracilo; uredepa; vapreotida; verteporfina; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinapidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartrato de vinorelbina; sulfato de vinrosidina; sulfato de vinzolidina; vorozol; zeniplatino; zinostatina; clorhidrato de zorrubicina. Otros fármacos antineoplásicos incluyen, aunque sin limitación: 20-epi-1,25-dihidroxivitamina D3; 5-etiniluracilo; abiratorona; aclarrubicina; acilofulveno; adecipenol; adozelesina; aldesleucina; antagonistas ALL-TK; altretamina; ambamustina; amidox; amifostina; ácido aminolevulínico; amrrubicina; amsacrina; anagrelida; anastrozol; irografolida; inhibidores de la angiogénesis; antagonista D; antagonista G; antarelix; antiproteína morfogenética dorsalizante 1; antiandrógeno, carcinoma prostático; antiestrógeno; antineoplaston; oligonucleótidos de antisentido; glicinato de afidicolina; moduladores del gen de la apoptosis; reguladores de la apoptosis; ácido apurínico; ara-CDP-DL-PTBA; desaminasa de arginina; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatina 1; axinastatina 2; axinastatina 3; azasetrón; azatoxina; azatirosina; derivados de bacatina III; balanol; batimastat; antagonistas BCR/ABL; benzoclorinas; benzoilestauroesporina; derivados beta lactámicos; beta-aletina; betaclamicina B; ácido betulínico; inhibidor del bFGF; bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilespermina; bisnafida; bistratona A; bizelesina; breflato; bropirimina; budotitano; butionina sulfoximina; calcipotriol; calfostina C; derivados de camptotecina; IL-2 de la viruela del canario; capecitabina; carboxamida-amino-triazol; carboxiamidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inhibidor derivado del cartílago; carzelesina; inhibidores de la cinasa de caseína (ICOS); castanoespermina; cecropina B; cetrorelix; clorlnas; cloroquinoxalina sulfonamida; cicaprost; cis-porfirina; cladribina; análogos de clomifeno; clotrimazol; colismicina A; colismicina B; combretastatina A4; análogo de combretastatina; conagenina; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina 8; derivados de la criptoficina A; curacina A; ciclopentantraquinonas; cicloplatam; cipemicina; ocfosfato de citarabina; factor citolítico; citostatina; dacliximab; decitabina; deshidrodidamnina B; deslorelina; dexametasona; dexifosfamida; dexrazoxano; dexverapamilo; diaziquona; didamnina B; didox; dietilnorespermina; dihidro-5-azacitidina; dihidrotaxol, 9-; dioxamicina; difenil espiromustina; docetaxel; docosanol; dolasetrón; doxifluridina; droloxifeno; dronabinol; duocarmicina SA; ebselen; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflomitina; elemeno; emitefur; epirrubicina; epristerida; análogo de estramustina; agonistas estrogénicos; antagonistas estrogénicos; etanidazol; fosfato de etopósido; exemestano; fadrozol; fazarabina; fenretinida; filgrastim; finasterida; flavopiridol; flezelastina; fluasterona; fludarabina; clorhidrato de fluorodaunorunicina; forfenimex; formestano; fostriecina; fotemustina; texafirin gadolinio; nitrato de galio; galocitabina; ganirelix; inhibidores de la gelatinasa; gemcitabina; inhibidores del glutatión; hepsulfamo; heregulina; hexametilén bisacetamida; hipericina; ácido ibandrónico; idarrubicina; idoxifeno; idramantona; ilmofosina; ilomastat; imidazoacridonas; imiquimod; péptidos inmunoestimulantes; inhibidor del receptor del factor de crecimiento insulinoide 1; agonistas de interferón; interferones; interleucinas; iobenguano; yododoxorrubicina; ipomeanol, 4-; iroplact; irsogladina; isobengazol; isohomohalicondrina B; itasetrón; jasplakinolida; kahalalida F; triacetato de lamelarina-N; lanreotida; leinamicina; lenograstim; sulfato de lentinano; leptolestatina; letrozol; factor inhibidor de la leucemia; interferón leucocítico alfa; leuprolida estrógeno progesterona; leuprorrelina; levamisol; liarozol; análogo de poliamina lineal; péptido disacárido lipófilo; compuestos de platino lipófilos; lisoclinamida 7; lobaplatino; lombricina; lometrexol; lonidamina; losoxantrona; lovastatina; loxoribina; lurtotecán; texafirina de lutecio; lisofilina; péptidos líticos; maitansina; manostatina A; marimastat; masoprocol; maspina; inhibidores de la matrilisina; inhibidores de la metaloproteinasa de la matriz; menogaril; merbarona; meterelina; metioninasa; metoclopramida; inhibidor del MIF; mifepristona; miltefosina; mirimostim; ARN bicatenario mal emparejado; mitoguazona; mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafida; factor de crecimiento de fibroblastos mitotoxina-saporina; mitoxantrona; mofaroteno; molgramostim; anticuerpo monoclonal, gonadotropina coriónica humana; monofosforil lípido A sk de la pared celular de miobacterias; mopidamol; inhibidor del gen de resistencia a múltiples fármacos; tratamiento basado en el supresor de tumores múltiples 1; agente antineoplásico de mostaza; micaperóxido B; extracto de la pared celular de micobacterias; miriaporona; N-acetildinalina; benzamidas N-sustituidas; nafarelina; nagrestip; naloxona pentazocina; napavina; nafterpina; nartograstim; nedaplatino; nemorrubicina; ácido neridrónico; endopeptidasa neutra; nilutamida; nisamicina; moduladores del óxido nítrico; antioxidante de nitróxido; nitrulina; O6 -benciloguanina; octreotida; okicenona; oligonucleótidos; onapristona; ondansetrón; ondansetrón; oacina; inductor de la citocina oral; omaplatino; osatorona; oxaliplatino; oxaunomicina; paclitaxel; análogos de paclitaxel; derivados de paclitaxel; palauamina; palmitoilrizoxina; ácido pamidrónico; panaxitriol; panomifeno; parabactina; pazeliptina; pegaspargasa; peldesina; polisulfato pentosan sódico; pentostatina; pentrozol; perflubron; perfosfamida; alcohol perilílico; fenazinomicina; fenilacetato; inhibidores de la fosfatasa; picibanil; clorhidrato de pilocarpina; pirarrubicina; piritrexim; placetina A; placetina B; inhibidores de la activador del plasminógeno; complejo de platino; compuestos de platino; complejo de platino-triamina; porfimer de sodio; porfiromicina; prednisona; propil bis-acridona; prostaglandina J2; inhibidores del proteasoma; modulador inmunitario basado en la proteína A; inhibidor de la cinasa de proteína C; inhibidores de la cinasa de proteína C, de microalgas; inhibidores de la fosfatasa de tirosina de proteína; inhibidores de la fosforilasa de nucleósido de purina; purpurinas; pirazoloacridina; conjugado de polioxietilén hemoglobina piridoxilado; antagonistas raf; raltitrexed; ramosetrón; inhibidores de la transferasa de la proteína ras de famesilo; inhibidores ras; inhibidor ras-GAP; reteliptina desmetilada; etidronato de renio Re 186; rizoxina; ribozimas; retinamida RII; rogletimida; rohitukina; romurtida; roquinimex; rubiginona B1; ruboxilo; safingol; saintopina; SarCNU; sarcofitol A; sargramostim; miméticos de Sdi 1; semustina; inhibidores derivados de la senescencia 1; oligonucleótidos sentido; inhibidores de la transducción de señales; moduladores de la transducción de señales; proteína de unión al antígeno de cadena única; sizofiran; sobuzoxano; borocaptato de sodio; fenilacetato de sodio; solverol; proteína de unión a la somatomedina; sonarmina; ácido esparfósico; espicamicina D; espiromustina; esplenopentina; espongistatina 1; escualamina; inhibidor de células madre; inhibidor de la división de las células madre; estipiamida; inhibidores de la estromelisina; sulfinosina; antagonista del péptido intestinal vasoactivo superactivo; suradista; suramina; swainsonina; glucosaminoglucanos sintéticos; talimustina; metyoduro de tamoxifeno; tauromustina; tazaroteno; tecogalan de sodio; tegafur; telurapirilio; inhibidores de la telomerasa; temoporfina; temozolomida; tenipósido; tetraclorodecaóxido; tetrazomina; taliblastina; tiocoralina; trombopoyetina; mimético de la trombopoyetina; timalfasina; agonista del receptor de la timopoietina; timotrinano; hormona estimulante del tiroides; etiopurpurina de etil estaño; tirapazamina; bicloruro de titanoceno; topsentina; toremifeno; factor de células madre totipotente; inhibidores de la traducción; tretinoína; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorrelina; tropisetrón; turosterida; inhibidores de la cinasa de tirosina; tirfostinas; inhibidores de la UBC; ubenimex; factor inhibidor del crecimiento derivado del seno urogenital; antagonistas del receptor de la urocinasa; vapreotida; variolina B; sistema de vector, genoterapia eritrocitaria; velaresol; veramina; verdinas; verteporfina; vinorelbina; vinxaltina; vitaxina; vorozol; zanoterona; zeniplatino; zilascorb; y estimalamer zinostatina. Fármacos antineoplásicos adicionales preferidos son 5-fluorouracilo y leucovorina.
Ejemplos de anticuerpos terapéuticos que pueden usarse en los métodos descritos en la presente memoria incluyen, aunque sin limitación, ZENAPAX® (daclizumab) (Roche Pharmaceuticals, Suiza) que es un anticuerpo monoclonal inmunosupresor humanizado anti-CD25 para la prevención del rechazo agudo de un aloinjerto renal; PANOREX™ que es un anticuerpo murino antiantígeno de la superficie celular 17-IA de la IgG2a (Glaxo Wellcome/Centocor); BEC2 que es un anticuerpo murino antiidiotípico (epítopo GD3) de la IgG (ImClone System); IMC-C225 que es un anticuerpo quimérico anti-EGFR de la IgG (ImClone System); VITAXIN™ que es un anticuerpo humanizado antiintegrina aVp3 (Applied Molecular Evolution/Medlmmune); Smart M195 que es un anticuerpo humanizado anti-CD33 de la IgG (Protein Design Lab/Kanebo); LYMPHOCId E™ que es un anticuerpo humanizado anti-CD22 de la IgG (Immunomedics); ICM3 es un anticuerpo humanizado anti-ICAM3 (ICOS Pharm); IDEC-114 es un anticuerpo primatizado anti-CD80 (IDEC Pharm/Mitsubishi); IDEC-131 es un anticuerpo humanizado anti-CD40L (IDEC/Eisai); IDEC-151 es un anticuerpo primatizado anti-CD4 (IDEC); IDEC-152 es un anticuerpo primatizado anti-CD23 (IDEC/Seikagaku); SMArT anti-CD3 es un humanizado anti-CD3 de la IgG (Protein Design Lab); 5G1.1 es un anticuerpo humanizado anti-factor del complemento 5 (C5) (Alexion Pharm); D2E7 es un anticuerpo humanizado anti-TNF-a (CAT/BASF); CDP870 es un antifragmento Fab humanizado del TNF-a (Celltech); IDEC-151 es un anticuerpo primatizado anti-CD4 de la IgG1 (IDEC Pharm/SmithKline Beecham); MDX-CD4 es un anticuerpo humano anti-CD4 de la IgG (Medarex/Eisai/Genmab); CDP57l es un anticuerpo humanizado anti-TNF-a de la IgG4 (Celltech); LDP-02 es un anticuerpo humanizado anti-a4p7 (LeukoSite/Genentech); OrthoClone OKT4A es un anticuerpo humanizado anti-CD4 de la IgG (Ortho Biotech); AnTOVA™ es un anticuerpo humanizado anti-CD40L de la IgG (Biogen); ANTEGREN™ es un anticuerpo humanizado anti-VLA-4 de la IgG (Elan); y CAT-152 es un anticuerpo humano anti-TGF-p2 (Cambridge Ab Tech). Otros ejemplos de anticuerpos terapéuticos que pueden usarse se presentan en la tabla 8.
Tabla 8: Anticuerpos terapéuticos antineoplásicos
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5.7.2 Agentes inmunomoduladores y agentes antiinflamatorios
También se describen métodos de tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y de enfermedades inflamatorias que comprenden la administración de las moléculas de la divulgación junto con otros agentes de tratamiento. Ejemplos de agentes inmunomoduladores incluyen, aunque sin limitación, metotrexato, ENBREL, REMICADE™, leflunomida, ciclofosfamida, ciclosporina A y antibióticos macrólidos (por ejemplo, FK506 (tacrolimus)), metilprednisolona (MP), corticoesteroides, esteroides, micofenolato de mofetilo, rapamicina (sirolimus), mizoribina, desoxispergualina, brequinar, malononitriloamindas (por ejemplo, leflunamida), moduladores del receptor de linfocitos T y moduladores del receptor de citocinas.
Los agentes antiinflamatorios han mostrado éxito en el tratamiento de trastornos inflamatorios y autoinmunitarios, y ahora son un tratamiento común y convencional para dichos trastornos. En los métodos descritos en la presente memoria puede usarse cualquier agente antiinflamatorio bien conocido por el experto en la materia. Ejemplos no limitantes de agentes antiinflamatorios incluyen fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), fármacos antiinflamatorios esteroideos, agonistas beta, agentes anticolinérgicos y metilxantinas. Ejemplos de AINE incluyen, aunque sin limitación, ácido acetilsalicílico, ibuprofeno, celecoxib (CELEBREX™), diclofenaco (VOLTAREN™), etodolaco (LODINE™), fenoprofeno (NALFON™), indometacina (INdOc IN™), ketoralaco (TORAdOl™), oxaprozin (DAYPRO™), nabumentona (RELAFEN™), sulindaco (CLINORIL™), tolmentina (TOLECTIN™), rofecoxib (VIOXX™) naproxeno (ALEVE™, NAPROSYN™), ketoprofeno (ACTRON™) y nabumetona (RELAFEN™). Dichos AINE funcionan inhibiendo una enzima ciclooxigenasa (por ejemplo, la COX-1 y/o la COX-2). Ejemplos de fármacos antiinflamatorios esteroideos incluyen, aunque sin limitación, glucocorticoesteroides, dexametasona (DECADRON™), cortisona, hidrocortisona, prednisona (DELTASONE™), prednisolona, triamcinolona, azulfidina y eicosanoides tales como prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos.
Un ejemplo no limitante de los anticuerpos que pueden usarse para el tratamiento o la prevención de trastornos inflamatorios junto con las moléculas de la divulgación se presenta en la tabla 9, y un ejemplo no limitante de los anticuerpos que pueden usarse para el tratamiento o la prevención de un trastorno autoinmunitario se presenta en la tabla 10.
Tabla 9: Anticuerpos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias
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Tabla 10: Anticuerpos terapéuticos para el tratamiento de trastornos autoinmunitarios
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5.7.3 Agentes para su uso en el tratamiento de una enfermedad infecciosa
Las moléculas de la divulgación pueden administrarse en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o de agentes terapéuticos adicionales conocidos por los expertos en la materia para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad infecciosa. También se describe el uso de las moléculas de la divulgación en combinación con antibióticos conocidos por los expertos en la materia para el tratamiento y o la prevención de una enfermedad infecciosa. Antibióticos que pueden usarse en combinación con las moléculas de la divulgación incluyen, aunque sin limitación, un macrólido (por ejemplo, tobramicina (Tobi®)), una cefalosporina (por ejemplo, cefalexina (Keflex®), cefradina (Velosef®), cefuroxima (Ceftin®), cefprozilo (Cefzil®), cefaclor (Ceclor®), cefixima (Suprax®) o cefadroxilo (Duriccf®)), una claritromicina (por ejemplo, claritromicina (Biaxin®)), una eritromicina (por ejemplo, eritromicina (EMycin®)), una penicilina (por ejemplo, penicilina V (V-Cillin K® o Pen Vee K®)) o una quinolona (por ejemplo, ofloxacino (Floxin®), ciprofloxacino (Cipro®) o norfloxacino (Noroxin®)), antibióticos aminoglucósidos (por ejemplo, apramicina, arbekacina, bambermicinas, butirosina, dibekacina, neomicina, neomicina, undecilenato, netilmicina, paromomicina, ribostamicina, sisomicina y espectinomicina), antibióticos anfenicoles (por ejemplo, azidanfenicol, cloranfenicol, florfenicol y tianfenicol), antibióticos ansamicinas (por ejemplo, rifamida y rifampina), carbacefems (por ejemplo, loracarbef), carbapenems (por ejemplo, biapenem e imipenem), cefalosporinas (por ejemplo, cefaclor, cefadroxilo, cefamandol, cefatrizina, cefazedona, cefozopran, cefpimizol, cefpiramida y cefpiroma), cefamicinas (por ejemplo, cefbuperazona, cefmetazol y cefminox), monobactamas (por ejemplo, aztreonam, carumonam y tigemonam), oxacefems (por ejemplo, flomoxef y moxalactama), penicilinas (por ejemplo, amdinocilina, amdinocilina pivoxilo, amoxicilina, bacampicilina, ácido bencilpenicilinánico, bencilpenicilina sódica, epicilina, fenbenicilina, floxacilina, penamcilina, yodhidruro de penetamato, penicilina o-benetamina, penicilina 0, penicilina V, penicilina V benzatina, penicilina V hidrabamina, penimepiciclina y fencihicilina potásica), lincosamidas (por ejemplo, clindamicina y lincomicina), amfomicina, bacitracina, capreomicina, colistina, enduracidina, enviomicina, tetraciclinas (por ejemplo, apiciclina, clortetraciclina, clomociclina y demeclociclina), 2,4-diaminopirimidinas (por ejemplo, brodimoprim), nitrofuranos (por ejemplo, furaltadona y cloruro de furazolio), quinolonas y análogos de las mismas (por ejemplo, cinoxacino, clinafloxacino, flumequina y grepagtoxacino), sulfonamidas (por ejemplo, acetil sulfametoxipirazina, bencilsulfamida, noprilsulfamida, ftalilsulfacetamida, sulfacrisoidina y sulfacitina), sulfonas (por ejemplo, diatimosulfona, glucosulfona sódica y solasulfona), cicloserina, mupirocina y tuberina.
Las moléculas de la divulgación pueden administrarse en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes antifúngicos. Agentes antifúngicos que pueden usarse en combinación con las moléculas de la divulgación incluyen, aunque sin limitación, anfotericina B, itraconazol, ketoconazol, fluconazol, intratecal, flucitosina, miconazol, butoconazol, clotrimazol, nistatina, terconazol, tioconazol, ciclopirox, econazol, haloprogrin, naftifina, terbinafina, undecilenato y griseofuldina.
Las moléculas de la divulgación pueden administrarse en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes antivíricos. Agentes antivíricos que pueden usarse en combinación con las moléculas de la divulgación incluyen, aunque sin limitación, inhibidores de la proteasa, inhibidores nucleosídicos de la transcriptasa inversa, inhibidores no nucleosídicos de la transcriptasa inversa y análogos de nucleósidos. Ejemplos de agentes antivíricos incluyen, aunque sin limitación, zidovudina, aciclovir, gangciclovir, vidarabina, idoxuridina, trifluridina y ribavirina, así como foscarnet, amantadina, rimantadina, saquinavir, indinavir, amprenavir, lopinavir, ritonavir, los interferones alfa; adefovir, clevadina, entecavir, pleconaril.
5.8 T ratamiento de vacuna
También se describe el uso de una composición de la divulgación para inducir una respuesta inmunitaria frente a un agente antigénico o inmunogénico que incluye, aunque sin limitación, oncoantígenos y antígenos de enfermedades infecciosas (cuyos ejemplos se divulgan infra). Las composiciones de vacuna comprenden uno o más agentes antigénicos o inmunogénicos contra los que se desea una respuesta inmunitaria, en las que el uno o más agentes antigénicos o inmunogénicos están recubiertos con un anticuerpo variante descrito en la presente memoria que tiene una afinidad potenciada por el FcyRIIIA. Las composiciones de vacuna descritas en la presente memoria son particularmente eficaces para desencadenar una respuesta inmunitaria, preferiblemente una respuesta inmunitaria protectora contra el agente antigénico o inmunogénico.
En algunas realizaciones, el agente antigénico o inmunogénico de las composiciones de vacuna descritas en la presente memoria comprende un virus contra el que se desea una respuesta inmunitaria. Los virus pueden ser recombinantes o quiméricos, y preferiblemente están atenuados. La producción de virus recombinantes, quiméricos y atenuados puede llevarse a cabo usando métodos convencionales conocidos por un experto en la materia. También se describe una vacuna recombinante de virus vivos o una vacuna recombinante de virus inactivados que se va a formular como se describe en la presente memoria. Puede preferirse una vacuna de virus vivos debido a que la multiplicación en el hospedador da lugar a un estímulo prolongado de un tipo y una magnitud similar al que se produce en las infecciones naturales, y por lo tanto confiere una inmunidad duradera sustancial. La producción de dichas formulaciones de vacuna recombinantes de virus vivos puede llevarse a cabo usando métodos convencionales que implican la propagación del virus en un cultivo celular o en la alantoides de embrión de pollo, seguido de purificación.
En una realización específica, el virus recombinante no es patógeno para el sujeto al que se le va a administrar. A este respecto, el uso de virus modificados genéticamente con propósitos de vacuna puede requerir la presencia de unas características de atenuación en estas cepas. La introducción de las mutaciones apropiadas (por ejemplo, eliminaciones) en los moldes usados para la transfección puede proporcionar a los nuevos virus unas características de atenuación. Por ejemplo, pueden realizarse mutaciones específicas sin sentido que están asociadas con una sensibilidad a la temperatura o una adaptación al frío en unas mutaciones por eliminación. Estas mutaciones deberían ser más estables que las mutaciones puntuales asociadas con los mutantes sensibles al frío o a la temperatura, y las frecuencias de reversión deberían ser extremadamente bajas. Las tecnologías de ADN recombinante para la modificación de virus recombinantes son conocidas en la técnica. Por ejemplo, las técnicas para la modificación de virus de ARN de hebra negativa son conocidas en la técnica, véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5166057.
Como alternativa, pueden construirse virus quiméricos con características "suicidas" para su uso en las formulaciones de vacuna intradérmicas. Dichos virus solo experimentarían una o unas pocas rondas de replicación en el hospedador. Cuando se usa como vacuna, el virus recombinante debería experimentar unos ciclos de replicación limitados e inducir un nivel suficiente de respuesta inmunitaria, pero no iría más allá en el hospedador humano como para causar una enfermedad. Como alternativa, pueden formularse virus inactivados (destruidos). Las formulaciones de vacuna con virus inactivados pueden prepararse usando las técnicas convencionales para "destruir" los virus quiméricos. Las vacunas con virus inactivados están "muertas" en el sentido de que se ha destruido su infectividad. Idealmente, la infectividad del virus se destruye sin afectar a su inmunogenicidad. Para preparar vacunas con virus inactivados, puede cultivarse el virus quimérico en un cultivo celular o en la alantoides de embrión de pollo, purificarse mediante una ultracentrifugación zonal, inactivarse con formaldehído o p-propiolactona y combinarse.
En determinadas realizaciones, pueden modificarse en el virus epítopos completamente exógenos, incluyendo los antígenos derivados de patógenos víricos o no víricos, para su uso en las formulaciones de vacuna intradérmicas. Por ejemplo, pueden modificarse los antígenos de virus no relacionados tales como el VIH (gp160, gp120, gp41), antígenos de parásitos (por ejemplo, malaria), antígenos bacterianos o fúngicos o antígenos tumorales, en la cepa atenuada.
Puede construirse prácticamente cualquier secuencia génica heteróloga en el virus quimérico para su uso en las formulaciones de vacuna intradérmicas. Preferiblemente, las secuencias génicas heterólogas son fracciones y péptidos que actúan como modificadores de la respuesta biológica. Preferiblemente, los epítopos que inducen una respuesta inmunitaria protectora frente a cualquiera de una diversidad de patógenos, o los antígenos que se unen a los anticuerpos neutralizantes, se pueden expresar por, o como parte de, los virus quiméricos. Por ejemplo, las secuencias génicas heterólogas que se pueden construir en los virus quiméricos incluyen, aunque sin limitación, neuraminidasa de hemaglutinina de la gripe y la paragripe y glucoproteínas de fusión tales como los genes HN y F del PIV3 humano. En otra realización más, las secuencias génicas heterólogas que se pueden construir en los virus quiméricos incluyen aquellas que codifican proteínas con actividades inmunomoduladoras. Ejemplos de proteínas inmunomoduladoras incluyen, aunque sin limitación, citocinas, interferón de tipo 1, interferón gamma, factores estimuladores de colonias, interleucina 1,2, 4, 5, 6, 12 y los antagonistas de estos agentes.
También se describen células o virus patógenos, preferiblemente virus atenuados, que expresan el anticuerpo variante en su superficie.
Las composiciones de vacuna comprenden un polipéptido de fusión en el que un agente antigénico o inmunogénico está unido de forma funcional a un anticuerpo variante descrito en la presente memoria que tiene una afinidad potenciada por el FcyRIIIA. Los polipéptidos de fusión modificados para su uso en las composiciones de vacuna se crean usando métodos rutinarios de la tecnología del ADN recombinante, y pertenecen a las habilidades habituales.
También se describen métodos para inducir tolerancia en un sujeto mediante la administración de una composición. Preferiblemente, una composición adecuada para la inducción de tolerancia en un sujeto comprende un agente antigénico o inmunogénico recubierto con un anticuerpo variante descrito en la presente memoria, en el que el anticuerpo variante tiene una afinidad mayor por el FcyRIIB. Aunque sin pretender estar ligados a ningún mecanismo de acción en particular, dichas composiciones son eficaces en la inducción de tolerancia mediante la activación de la ruta inhibidora mediada por el FcyRIIB.
5.9 Composiciones y métodos de administración
La divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden moléculas de la divulgación (es decir, diacuerpos) que comprenden múltiples dominios de unión a epítopo y, opcionalmente, un dominio Fc (o parte del mismo). También se describen métodos de tratamiento, profilaxis y mejora de uno o más síntomas asociados con una enfermedad, un trastorno o una infección mediante la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de una proteína de fusión o de una molécula conjugada de la divulgación, o de una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión o una molécula conjugada de la divulgación. En un aspecto preferido, un anticuerpo, una proteína de fusión o una molécula conjugada está sustancialmente purificado (es decir, sustancialmente exento de sustancias que limiten su efecto o que produzcan efectos secundarios indeseados). En una realización específica, el sujeto es un animal, preferiblemente un mamífero, tal como un no primate (por ejemplo, vacas, cerdos, caballos, gatos, perros, ratas, etc.) y un primate (por ejemplo, un mono, tal como un mono cangrejero, y un ser humano). En una realización preferida, el sujeto es un ser humano. En otra realización preferida más, el anticuerpo es de la misma especie que el sujeto.
Se conocen diversos sistemas de administración y se pueden usar para administrar una composición que comprende moléculas de la divulgación, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes que pueden expresar el anticuerpo o la proteína de fusión, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al. (1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System," J. Biol. Chem. 262:4429-4432), la construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retrovírico o de otro vector, etc. Métodos de administración de una molécula de la divulgación incluyen, aunque sin limitación, la administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), epidural y mucosa (por ejemplo, por las vías intranasal y oral). En una realización específica, las moléculas de la divulgación se administran por vía intramuscular, intravenosa o subcutánea. Las composiciones pueden administrarse mediante cualquier vía conveniente, por ejemplo, mediante una infusión o una inyección en bolo, mediante su absorción a través del revestimiento epitelial o mucocutáneo (por ejemplo, la mucosa oral, la mucosa rectal e intestinal, etc.) y se pueden administrar junto con otro agente biológicamente activo. La administración puede ser sistémica o local. Además, también puede emplearse una administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o de un nebulizador y de una formulación con un agente aerosolizante. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 6019968; 5985320; 5985309; 5934272; 5874064; 5855913; 5290540; y 4880078; y las publicaciones PCT n.2 WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; y WO 99/66903.
Las moléculas de la divulgación pueden envasarse en un recipiente sellado herméticamente tal como una ampolla o un sobrecito que indica la cantidad de anticuerpo. Las moléculas de la divulgación se suministran en forma de un polvo liofilizado esterilizado seco o de un concentrado exento de agua en un recipiente sellado herméticamente y se pueden reconstituir, por ejemplo, con agua o con una disolución salina a la concentración apropiada para su administración a un sujeto. Preferiblemente, las moléculas de la divulgación se suministran en forma de un polvo liofilizado estéril seco en un recipiente sellado herméticamente a una dosis unitaria de al menos 5 mg, más preferiblemente de al menos 10 mg, de al menos 15 mg, de al menos 25 mg, de al menos 35 mg, de al menos 45 mg, de al menos 50 mg o de al menos 75 mg. Las moléculas liofilizadas de la divulgación se deben almacenar a entre 2 y 8 °C en su recipiente original, y las moléculas deben administrarse en las 12 horas, preferiblemente en las 6 horas, en las 5 horas, en las 3 horas o en 1 hora después de haberlas reconstituido. En una realización alternativa, las moléculas de la divulgación se suministran en forma líquida en un recipiente sellado herméticamente que indica la cantidad y la concentración de la molécula, de la proteína de fusión o de la molécula conjugada. Preferiblemente, la forma líquida de las moléculas de a divulgación se suministran en un recipiente sellado herméticamente con al menos 1 mg/ml, más preferiblemente con al menos 2,5 mg/ml, con al menos 5 mg/ml, con al menos 8 mg/ml, con al menos 10 mg/ml, con al menos 15 mg/kg, con al menos 25 mg/ml, con al menos 50 mg/ml, con al menos 100 mg/ml, con al menos 150 mg/ml, con al menos 200 mg/ml de las moléculas.
La cantidad de la composición de la molécula de diacuerpo que será eficaz en el tratamiento, la prevención o la mejora de uno o más síntomas asociados con un trastorno se puede determinar mediante técnicas clínicas convencionales. La dosis precisa que se va a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración y de la gravedad de la afección, y debería decidirse según el criterio del profesional y de las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de las curvas de dosis-respuesta derivadas a partir de los sistemas de ensayo in vitro o de modelos animales.
Para los diacuerpos englobados por la divulgación, la dosis administrada a un paciente es normalmente de 0,0001 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente. Preferiblemente, la dosis administrada a un paciente es entre 0,0001 mg/kg y 20 mg/kg, entre 0,0001 mg/kg y 10 mg/kg, entre 0,0001 mg/kg y 5 mg/kg, entre 0,0001 y 2 mg/kg, entre 0,0001 y 1 mg/kg, entre 0,0001 mg/kg y 0,75 mg/kg, entre 0,0001 mg/kg y 0,5 mg/kg, entre 0,0001 mg/kg y 0,25 mg/kg, entre 0,0001 y 0,15 mg/kg, entre 0,0001 y 0,10 mg/kg, entre 0,001 y 0,5 mg/kg, entre 0,01 y 0,25 mg/kg o entre 0,01 y 0,10 mg/kg del peso corporal del paciente. La dosis y la frecuencia de administración de los diacuerpos de la divulgación se puede reducir o alterar potenciando la captación y la penetración tisular de los diacuerpos mediante modificaciones tales como, por ejemplo, lipidación.
En una realización, las dosis de las moléculas de la divulgación administradas a un paciente son de 0,01 mg a 1000 mg/día, cuando se usan en forma de un agente de monoterapia. En otra realización, las moléculas de la divulgación se usan en combinación con otras composiciones terapéuticas, y las dosis administradas a un paciente son menores que cuando dichas moléculas se usan en forma de un agente de monoterapia.
En una realización específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas localmente en la zona en necesidad de tratamiento; esto puede conseguirse, por ejemplo y en modo alguno como limitación, mediante infusión local, mediante inyección o mediante un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras. Preferiblemente, cuando se administra una molécula de la divulgación, debe tenerse cuidado en usar materiales en los que no se absorba la molécula.
En otra realización, las composiciones se pueden administrar en una vesícula, en particular en un liposoma (véase, Langer (1990) "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533); Treat et al., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein y Fidler (ed.), Liss, Nueva York, pág. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pág. 317-327; véase en general ibid.).
En otra realización más, las composiciones pueden administrarse en un sistema de liberación controlada o de liberación mantenida. Puede usarse cualquier técnica conocida por el experto en la materia para la producción de las formulaciones de liberación mantenida que comprenden una o más moléculas de la divulgación. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4526938; la publicación PCT WO 91/05548; la publicación PCT WO 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel, " Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; y Lam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery, " Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760. En una realización, puede usarse una bomba en un sistema de liberación controlada (véase Langer, supra; Sefton, (1987) "Implantable Pumps," CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980) "Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis," Surgery 88:507-516; y Saudek et al. (1989) "A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery," N. Engl. J. Med. 321:574-579). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos para conseguir la liberación controlada de los anticuerpos (véase, por ejemplo, Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (ed.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (ed.), Wiley, Nueva York (1984); Levy et al. (1985) "Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate," Science 228:190-192; During et al. (1989) "Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization," Ann. Neurol. 25:351-356; Howard et al. (1989) "Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits," J. Neurosurg. 7(1 ):105-112); la patente de Estados Unidos n.° 5679377; la patente de Estados Unidos n.° 5916597; la patente de Estados Unidos n.° 5912015; la patente de Estados Unidos n.° 5989463; la patente de Estados Unidos n.° 5128326; la publicación PCT n.° WO 99/15154; y la publicación PCT n.° WO 99/20253). Ejemplos de los polímeros usados en las formulaciones de liberación mantenida incluyen, aunque sin limitación, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(metacrilato de metilo), poli(ácido acrílico), poli(acetato de etilen-covinilo), poli(ácido metacrílico), poliglicólidos (PEG), polianhídridos, poli(N-vinil pirrolidona), poli(alcohol vinílico), poliacrilamida, poli(etilenglicol), polilactidas (PEA), poli(lactida-co-glicólidos) (PLGA) y poliortoésteres. En otra realización más, puede colocarse un sistema de liberación controlada en las proximidades del agente terapéutico (por ejemplo, en los pulmones), y por tanto se requiere únicamente una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pág. 115-138 (1984)). En otra realización, se usan las composiciones poliméricas útiles como implantes de liberación controlada de acuerdo con Dunn et al. (véase el documento U.S. 5945155). Este método particular se basa en el efecto terapéutico de la liberación controlada in situ del material bioactivo desde el sistema polimérico. La implantación puede producirse generalmente en cualquier parte del cuerpo del paciente que necesita tratamiento terapéutico. En otra realización, se usa un sistema de administración mantenida no polimérico mediante el que se usa un implante no polimérico en el cuerpo del sujeto como sistema de administración de fármacos. Tras su implantación en el cuerpo, el disolvente orgánico del implante se disipará, se dispersará o lixiviará desde la composición hacia el líquido tisular circundante, y el material no polimérico coagulará o precipitará gradualmente para formar una matriz microporosa sólida (véase el documento U.S. 5888533).
Los sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión de Langer (1990, "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533). Puede usarse cualquier técnica conocida por el experto en la materia para la producción de formulaciones de liberación sostenida que comprenden uno o más agentes terapéuticos de la invención. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4526938; las publicaciones internacionales n.° WO 91/05548 y WO 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; y Lam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760.
Cuando la composición es un ácido nucleico que codifica un diacuerpo de la invención, el ácido nucleico se puede administrar in vivo para promover la expresión de su diacuerpo codificado, construyéndolo como parte de un vector de expresión del ácido nucleico apropiado y administrándolo de forma que se haga intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retrovírico (véase la patente de Estados Unidos n.° 4980286), o mediante inyección directa, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola génica; Biolistic, Dupont), o un recubrimiento con lípidos o receptores de la superficie celular o con agentes de transfección, o mediante su administración unido a un péptido de tipo homeosecuencia que se sabe que entra en el núcleo (véase, por ejemplo, Joliot et al., (1991) "Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868), etc. Como alternativa, puede introducirse un ácido nucleico intracelularmente e incorporarse en el ADN de la célula hospedadora para su expresión mediante recombinación homóloga.
El tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de moléculas de la divulgación puede incluir un único tratamiento, o preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo preferido, se trata un sujeto con las moléculas de la divulgación en el intervalo entre aproximadamente 0,1 y 30 mg/kg de peso corporal, una vez por semana durante entre aproximadamente 1 y 10 semanas, preferiblemente durante entre 2 y 8 semanas, más preferiblemente durante entre aproximadamente 3 y 7 semanas, e incluso más preferiblemente durante aproximadamente 4, 5 o 6 semanas. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas se administran una vez al día, dos veces al día o tres veces al día. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas se administran una vez por semana, dos veces por semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, una vez cada seis semanas, una vez cada dos meses, dos veces al año o una vez al año. También se apreciará que la dosis eficaz de las moléculas usadas para el tratamiento puede aumentarse o disminuirse durante el transcurso de un tratamiento particular.
5.9.1 Composiciones farmacéuticas
Las composiciones de la divulgación incluyen composiciones de fármacos a granel útiles en la elaboración de composiciones farmacéuticas (por ejemplo, composiciones impuras o no estériles) y composiciones farmacéuticas (es decir, composiciones que son adecuadas para su administración a un sujeto o paciente) que pueden usarse en la preparación de formas de dosificación unitarias. Dichas composiciones comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de un agente profiláctico y/o terapéutico divulgado en la presente memoria o una combinación de esos agentes y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, las composiciones de la divulgación comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de una o más moléculas de la divulgación y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La divulgación también abarca composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de diacuerpo de la divulgación y un anticuerpo terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal específico tumoral) que es específico para un oncoantígeno particular, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En una realización específica, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por un organismo regulador del gobierno federal o estatal, o recogido en la Farmacopea de los Estados Unidos o en otra Farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, a un adyuvante (por ejemplo, el adyuvante de Freund (completo e incompleto), a un excipiente o a un vehículo con el que se administra el producto terapéutico. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen del petróleo, animal, vegetable o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También pueden emplearse disoluciones salinas y disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos líquidos, particularmente para disoluciones inyectables. Excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, caliza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada seca, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Si se desea, la composición también puede contener cantidades mínimas de agentes humectantes o emulsionantes, o de agentes tamponantes del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de disoluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación mantenida y similares.
En general, los ingredientes de las composiciones de la divulgación se suministran por separado o se mezclan entre sí en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en forma de un polvo liofilizado seco o un concentrado exento de agua en un recipiente sellado herméticamente tal como una ampolla o un sobrecito que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición se va a administrar mediante una infusión, puede dispensarse con un frasco de infusión que contiene agua o disolución salina estéril de calidad farmacéutica. Cuando la composición se administra mediante inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua o de una disolución salina estéril para inyección, de forma que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.
Las composiciones de la divulgación pueden formularse como formas neutras o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque sin limitación, las formadas con aniones tales como las obtenidas a partir de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc. y las formadas con cationes tales como las obtenidas a partir de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.
5.9.2 Genoterapia
Los ácidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican moléculas de la divulgación, se administran para el tratamiento, la prevención o la mejora de uno o más síntomas asociados con una enfermedad, un trastorno o una infección, a modo de genoterapia. La genoterapia se refiere al tratamiento que se realiza mediante la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable. En esta realización, los ácidos nucleicos producen su anticuerpo o proteína de fusión codificado que media en un efecto terapéutico o profiláctico.
Pueden usarse cualquiera de los métodos de genoterapia disponibles en la técnica. A continuación, se describen métodos ejemplares.
Para revisiones generales de los métodos de genoterapia, véase Goldspiel et al. (1993) "Human Gene Therapy," Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu et al. (1991) "Delivery Systems For Gene Therapy," Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev (1993) "Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions," Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.
32:573-596; Mulligan (1993) "The Basic Science Of Gene Therapy," Science 260:926-932; y Morgan et al. (1993) "Human Gene Therapy," Ann. Rev. Biochem. 62:191-217. Métodos conocidos habitualmente en la técnica de la tecnología de ADN recombinante que pueden usarse se describen en Ausubel et al. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Ny (1993); y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).
Una composición descrita en la presente memoria puede comprender ácidos nucleicos que codifican un diacuerpo de la divulgación, siendo dichos ácidos nucleicos parte de un vector de expresión que expresa el anticuerpo en un hospedador adecuado. En particular, dichos ácidos nucleicos tienen promotores, preferiblemente promotores heterólogos, unidos de forma funcional a la región codificante del anticuerpo, siendo dicho promotor inducible o constitutivo, y, opcionalmente, específico tisular. En otra realización particular, se usan moléculas de ácido nucleico en que las secuencias codificantes del anticuerpo y cualquier otra secuencia deseada están flanqueadas por las regiones que promueven la recombinación homóloga en el sitio deseado del genoma, proporcionando así la expresión intracromosómica de los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo (Koller et al. (1989) "Inactivating The Beta 2-Microglobulin Locus In Mouse Embryonic Stem Cells By Homologous Recombination," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; y Zijlstra et al. (1989) "Germ-Line Transmission Of A Disrupted Beta 2-Microglobulin Gene Produced By Homologous Recombination In Embryonic Stem Cells," Nature 342:435-438).
Una composición descrita en la presente memoria puede comprender ácidos nucleicos que codifican una proteína de fusión, siendo dichos ácidos nucleicos parte de un vector de expresión que expresa la proteína de fusión en un hospedador adecuado. En particular, dichos ácidos nucleicos tienen promotores, preferiblemente promotores heterólogos, unidos de forma funcional a la región codificante de una proteína de fusión, siendo dicho promotor inducible o constitutivo y opcionalmente, específico tisular. En otra realización particular, se usan moléculas de ácido nucleico en que las secuencias codificantes de la proteína de fusión y cualquier otra secuencia deseada están flanqueadas por las regiones que promueven la recombinación homóloga en el sitio deseado del genoma, proporcionando así la expresión intracromosómica de la proteína de fusión.
La administración de los ácidos nucleicos a un sujeto puede ser directa, en cuyo caso el sujeto se expone directamente al ácido nucleico o a los vectores portadores del ácido nucleico, o indirecta, en cuyo caso las células se transforman en primer lugar con los ácidos nucleicos in vitro, después se trasplantan al sujeto. Estas dos estrategias se conocen, respectivamente, como genoterapia in vivo o ex vivo.
En una realización específica, las secuencias de ácido nucleico son administradas directamente in vivo, donde son expresadas para producir el producto codificado. Esto puede llevarse a cabo mediante cualquiera de numerosos métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, construyéndolos como parte de un vector de expresión del ácido nucleico adecuado y administrándolo de forma que se hagan intracelulares, por ejemplo, mediante infección usando retrovirus defectuosos o atenuados u otros vectores víricos (véase la patente de Estados Unidos n.° 4980286), o mediante inyección directa del ADN desnudo, o mediante el uso de bombardeo con micropartículas (por ejemplo, una pistola génica; Biolistic, Dupont), o recubrimiento con lípidos o con receptores de la superficie celular o con agentes de transfección, encapsulación en liposomas, en micropartículas o en microcápsulas, o mediante su administración unidas a un péptido que se sabe que entra en el núcleo, mediante su administración unidas a un antígeno sometido a una endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al. (1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble dNa Carrier System," J. Biol. Chem 262:4429-4432) (que puede usarse para los tipos de células diana que expresan específicamente los receptores), etc. En otra realización, pueden formarse complejos de ácido nucleico-antígeno en que el antígeno comprende un péptido vírico fusogénico para disociar los endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosómica. En otra realización más, el ácido nucleico se puede dirigir in vivo para una captación y una expresión celular específica, mediante su direccionamiento a un receptor específico (véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 92/06180; WO 92/22635; WO 92/20316; w O 93/14188; WO 93/20221). Como alternativa, el ácido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse en el ADN de la célula hospedadora para su expresión, mediante recombinación homóloga (Koller et al. (1989) "Inactivating The Beta 2-Microglobulin Locus In Mouse Embryonic Stem Cells By Homologous Recombination," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; y Zijlstra et al. (1989) "Germ-Line Transmission Of A Disrupted Beta 2-Microglobulin Gene Produced By Homologous Recombination In Embryonic Stem Cells," Nature 342:435-438).
Se pueden usar vectores víricos que contienen las secuencias de ácido nucleico que codifican una molécula de la divulgación (por ejemplo, un diacuerpo o una proteína de fusión). Por ejemplo, puede usarse un vector retrovírico (véase, Miller et al. (1993) "Use Of Retroviral Vectors For Gene Transfer And Expression," Meth. Enzymol. 217:581-599). Estos vectores retrovíricos contienen los componentes necesarios para el correcto empaquetamiento del genoma vírico y su integración en el ADN de la célula hospedadora. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo o una proteína de fusión que se va a usar en genoterapia se clonan en uno o más vectores, lo que facilita la administración de la secuencia de nucleótidos a un sujeto. Pueden encontrarse más detalles sobre los vectores retrovíricos en Boesen et al., (1993) "Circumvention Of Chemotherapy-Induced Myelosuppression By Transfer Of The Mdr1 Gene," Biotherapy 6:291-302), que describe el uso de un vector retrovírico para la administración del gen mdr 1 a células madre hematopoyéticas para hacer que las células madre sean más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovíricos en genoterapia son: Clowes et al. (1994) "Long-Term Biological Response Of Injured Rat Carotid Artery Seeded With Smooth Muscle Cells Expressing Retrovirally Introduced Human Genes," J. Clin. Invest. 93:644-651; Keim et al. (1994) "Retrovirus-Mediated Gene Transduction Into Canine Peripheral Blood Repopulating Cells," Blood 83:1467-1473; Salmons et al. (1993) "Targeting Of Retroviral Vectors For Gene Therapy," Human Gene Therapy 4:129-141; y Grossman et al. (1993) "Retroviruses: Delivery Vehicle To The Liver," Curr. Opin. Genetics and Devel. 3:110-114.
Los adenovirus son otros vectores víricos que pueden usarse en genoterapia. Los adenovirus son unos vehículos especialmente atractivos para la administración de genes al epitelio respiratorio. Los adenovirus infectan de forma natural el epitelio respiratorio, donde causan una enfermedad leve. Otras dianas para los sistemas de administración basados en adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, las células endoteliales y el músculo. Los adenovirus tienen la ventaja de poder infectar células que no se están dividiendo. Kozarsky et al. (1993, "Gene Therapy: Adenovirus Vectors," Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503), presentan una revisión de genoterapia basada en adenovirus. Bout et al. (1994, "Lung Gene Therapy: In Vivo Adenovirus-Mediated Gene Transfer To Rhesus Monkey Airway Epithelium," Human Gene Therapy, 5:3-10) muestran el uso de vectores de adenovirus para la transferencia de genes al epitelio respiratorio de macacos. Otros casos de uso de adenovirus en genoterapia pueden encontrarse en Rosenfeld et al. (1991) "Adenovirus-Mediated Transfer Of A Recombinant Alpha 1-Antitrypsin Gene To The Lung Epithelium In Vivo," Science 252:431-434; Rosenfeld et al. (1992) "In Vivo Transfer Of The Human Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene To The Airway Epithelium," Cell 68:143-155; Mastrangeli et al. (1993) "Diversity Of Airway Epithelial Cell Targets For In Vivo Recombinant Adenovirus-Mediated Gene Transfer," J. Clin. Invest. 91:225-234; publicación PCT WO 94/12649; y Wang et al. (1995) "A Packaging Cell Line For Propagation Of Recombinant Adenovirus Vectors Containing Two Lethal Gene-Region Deletions," Gene Therapy 2:775-783. En una realización preferida, se usan vectores de adenovirus.
También se han propuesto los virus adenoasociados (AAV) para su uso en genoterapia (véase, por ejemplo, Walsh et al. (1993) "Gene Therapy For Human Hemoglobinopathies," Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 y la patente de Estados Unidos n.° 5436146).
Otra estrategia de genoterapia implica la transferencia de un gen a las células de un cultivo tisular mediante métodos tales como electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio o infección vírica. Habitualmente, el método de transferencia incluye la transferencia de un marcador de selección a las células. Después, las células se colocan bajo selección para aislar aquellas células que han captado y están expresando el gen transferido. Después, esas células se administran a un sujeto.
En esta realización, el ácido nucleico se introduce en una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Dicha introducción puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica que incluye, aunque sin limitación, transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector vírico o un bacteriófago que contiene las secuencias de ácido nucleico, fusión celular, transferencia génica mediada por un cromosoma, transferencia génica mediada por una microcélula, fusión de esferoplastos, etc. En la técnica se conocen numerosas técnicas para la introducción de genes exógenos en células (véase, por ejemplo, Loeffler et al. (1993) "Gene Transfer Into Primary And Established Mammalian Cell Lines With Lipopolyamine-Coated DNA," Meth. Enzymol. 217:599-618, Cotten et al. (1993) "Receptor-Mediated Transport Of DnA Into Eukaryotic Cells," Meth. Enzymol. 217:618-644) y pueden usarse con la condición de que no se alteren las funciones de desarrollo y fisiológicas necesarias de las células destinatarias. La técnica debe proporcionar la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de forma que el ácido nucleico sea expresable por la célula, y preferiblemente heredable y expresable por su descendencia celular.
Las células recombinantes resultantes pueden administrarse a un sujeto mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Las células recombinantes sanguíneas (por ejemplo, las células madre hematopoyéticas o progenitoras) se administran preferiblemente por vía intravenosa. La cantidad de células contemplada para su uso depende del efecto deseado, del estado del paciente, etc., y se puede determinarse por el experto en la materia.
Las células en que se puede introducir un ácido nucleico con propósitos de genoterapia engloban cualquier tipo de célula deseado disponible e incluyen, aunque sin limitación, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos; células sanguíneas tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos; diversas células madre o progenitoras, en particular, células madre hematopoyéticas o progenitoras, por ejemplo, según se obtienen a partir de la médula ósea, de la sangre del cordón umbilical, de sangre periférica, de hígado fetal, etc.
En una realización preferida, la célula usada para genoterapia es autóloga al sujeto.
En una realización en la que se usan células recombinantes en genoterapia, las secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo o una proteína de fusión se introducen en las células de forma que sean expresables por las células o por su descendencia, y después las células recombinantes se administran in vivo para su efecto terapéutico. En una realización específica, se usan células madre o células progenitoras. Potencialmente puede usarse cualquier célula madre y/o progenitora que se pueda aislar y mantener in vitro (véase, por ejemplo, la publicación PcT WO 94/08598; Stemple et al. (1992) "Isolation Of A Stem Cell For Neurons And Glia From The Mammalian Neural Crest," Cell 7 1:973-985; Rheinwald (1980) "Serial Cultivation Of Norma1Human Epidermal Keratinocytes," Meth. Cell Bio. 21A:229-254; y Pittelkow et al. (1986) "New Techniques For The In Vitro Culture Of Human Skin Keratinocytes And Perspectives On Their Use For Grafting Of Patients With Extensive Burns," Mayo Clinic Proc. 61:771-777).
En una realización específica, el ácido nucleico a introducir con propósitos de genoterapia comprende un promotor inducible unido de forma funcional a la región codificante, de forma que la expresión del ácido nucleico sea controlable mediante el control de la presencia o de la ausencia del inductor apropiado de la transcripción.
5.9.3 Kits
También se describe un paquete o un kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes que contienen las moléculas de la divulgación. Adicionalmente, también puede incluirse uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos útiles para el tratamiento de una enfermedad en el paquete o el kit farmacéutico. También se describe un paquete o un kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes que contienen uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria. Opcionalmente, asociado a dicho(s) recipiente(s) puede haber un prospecto en la forma prescrita por un organismo gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, prospecto que refleja la aprobación por parte del organismo de la fabricación, el uso o la venta para su administración a seres humanos.
También se describen kits que pueden usarse en los métodos anteriores. En una realización, un kit comprende una o más moléculas de la divulgación. En otra realización, un kit comprende además uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos útiles para el tratamiento del cáncer, en uno o más recipientes. En otra realización, un kit comprende además uno o más anticuerpos citotóxicos que se unen a uno o más oncoantígenos asociados con un cáncer. En determinadas realizaciones, el otro agente profiláctico o terapéutico es un agente quimioterápico. En otras realizaciones, el agente profiláctico o terapéutico es una sustancia terapéutica biológica u hormonal.
5.10 Caracterización y demostración de la utilidad terapéutica
Varios aspectos de las composiciones farmacéuticas, de los agentes profilácticos o terapéuticos descritos en la presente memoria se ensayan preferiblemente in vitro, en un sistema de cultivo celular y en un organismo de un modelo animal, tal como un sistema de modelo animal de roedor, para analizar la actividad terapéutica deseada antes de su uso en seres humanos. Por ejemplo, algunos ensayos que pueden usarse para determinar si se desea la administración de una composición farmacéutica específica incluyen ensayos de cultivo celular en los que se cultiva una muestra de tejido del paciente en un cultivo y se expone o se pone en contacto de otro modo con una composición farmacéutica descrita en la presente memoria y se observa el efecto de dicha composición sobre la muestra de tejido. La muestra de tejido puede obtenerse mediante una biopsia del paciente. Este ensayo permite la identificación de la(s) molécula(s) profilácticas o terapéuticas terapéuticamente más eficaces para cada paciente individual. En varias realizaciones específicas pueden llevarse a cabo ensayos in vitro con células representativas de los tipos celulares individuales implicados en un trastorno autoinmunitario o inflamatorio (por ejemplo, linfocitos T), para determinar si una composición farmacéutica descrita en la presente memoria tiene un efecto deseado sobre dicho tipo celular.
Pueden ensayarse combinaciones de agentes profilácticos y/o terapéuticos en sistemas de modelos animales adecuados antes de su uso en seres humanos. Dichos sistemas de modelo animal incluyen, aunque sin limitación, ratas, ratones, pollos, vacas, monos, cerdos, perros, conejos, etc. Puede usarse cualquier sistema animal bien conocido en la técnica. Pueden ensayarse combinaciones de agentes profilácticos y/o terapéuticos en un sistema de modelo de ratón. Dichos sistemas de modelo son ampliamente usados y bien conocidos por los expertos. Los agentes profilácticos y/o terapéuticos se pueden administrar repetidamente. Varios aspectos del procedimiento pueden variar. Dichos aspectos incluyen la pauta temporal de administración de los agentes profilácticos y/o terapéuticos, y si dichos agentes se administran por separado o como una mezcla.
Modelos animales preferidos para su uso en los métodos descritos en la presente memoria son, por ejemplo, ratones transgénicos que expresan los FcyR humanos en células efectoras de ratón, por ejemplo, puede usarse cualquier modelo de ratón descrito en el documento U.S. 5877396. Los ratones transgénicos para su uso en los métodos incluyen, aunque sin limitación, ratones portadores del FcyRIIIA humano; ratones portadores del FcyRIIA humano; ratones portadores del FcyRIIB y del FcyRIIIA humano; ratones portadores del FcyRIIB y del FcyRIIA humano. Preferiblemente, se ensayarán las mutaciones que muestren los mayores niveles de actividad en los ensayos funcionales descritos anteriormente para su uso en los estudios con un modelo animal antes de su uso en seres humanos. Pueden prepararse cantidades suficientes de anticuerpos para su uso en los modelos animales usando los métodos descritos supra, por ejemplo, usando sistemas de expresión de mamífero y los métodos de purificación divulgados y ejemplificados en la presente memoria.
Pueden usarse modelos de xenoinjerto de ratón para el análisis de la eficacia de los anticuerpos de ratón generados contra una diana tumoral específica basándose en la afinidad y en la especificidad de los dominios de unión a epítopo de la molécula de diacuerpo de la divulgación, y en la capacidad del diacuerpo de desencadenar una respuesta inmunitaria (Wu et al. (2001) "Mouse Models For Multistep Tumorigenesis," Trends Cell Biol. 11: S2-9). Los ratones transgénicos que expresan los FcyR humanos en células efectoras de ratón son modelos animales hechos a medida para ensayar la eficacia de las interacciones de Fc-FcyR humano. Pueden usarse pares de líneas de ratón transgénicas de FcyRIIIA, FcyRIIIB y FcyRIIA generadas en el laboratorio del Dr. Jeffrey Ravetch (a través de un acuerdo de licencia con la Rockefeller U. y el Sloan Kettering Cancer center), tales como las enumeradas en la siguiente tabla 11.
Tabla 11: Cepas de ratón
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La actividad antiinflamatoria de los tratamientos de combinación se puede determinar mediante el uso de varios modelos animales experimentales de artritis inflamatoria conocidos en la técnica y descritos en Crofford L. J. y Wilder R. L., "Arthritis and Autoimmunity in Animals", en Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology. McCarty et al. (ed.), capítulo 30 (Lee y Febiger, 1993). También pueden usarse modelos animales experimentales y espontáneos de artritis inflamatoria y de enfermedades reumáticas autoinmunitarias para evaluar la actividad antiinflamatoria de los tratamientos de combinación. Los siguientes son algunos ensayos proporcionados como ejemplos, y no como limitación.
Los principales modelos animales de artritis o de enfermedad inflamatoria conocidos en la técnica y ampliamente usados incluyen: modelos de rata de artritis inducida por un adyuvante, modelos de rata y de ratón de artritis inducida por colágeno, y modelos de rata, de conejo y de hámster de artritis inducida por un antígeno, todos descritos en Crofford L. J. y Wilder R. L., "Arthritis and Autoimmunity in Animals", en Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology. McCarty et al. (ed.), capítulo 30 (Lee y Lebiger, 1993).
La actividad antiinflamatoria de los tratamientos de combinación puede evaluarse usando un modelo de rata de artritis inducida por carragenina. La artritis inducida por carragenina también se ha usado en conejos, perros y cerdos en estudios de artritis crónica o de inflamación. Se usa una evaluación histomorfométrica cuantitativa para determinar la eficacia terapéutica. Los métodos que usan dicho modelo de artritis inducida por carragenina se describen en Hansra P. et al., (2000) "Carrageenan-Induced Arthritis in the Rat', Inflammation, 24 (2): 141-155. También se usan habitualmente modelos animales de inflamación inducida por zimosano, como se sabe y se describe en la técnica.
La actividad antiinflamatoria de los tratamientos de combinación también puede evaluarse midiendo la inhibición del edema en una pata inducido por carragenina en ratas, usando una modificación del método descrito en Winter C. A. et al., (1962) "Carrageenan-Induced Edema in Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory Drugs" Proc. Soc. Exp. Biol Med. 111, 544-547. Este ensayo se ha usado como un cribado principal in vivo de la actividad antiinflamatoria de la mayoría de los AINE y se considera predictivo de la eficacia en seres humanos. La actividad antiinflamatoria de los agentes profilácticos o terapéuticos de ensayo se expresa como el porcentaje de inhibición del aumento en el peso de la pata posterior del grupo de ensayo con respecto al grupo de control al que se le ha administrado vehículo.
Adicionalmente, también pueden usarse modelos animales de enfermedad inflamatoria del intestino para evaluar la eficacia de los tratamientos de combinación (Kim et al., (1992), "Experimental Colitis In Animal Models," Scand. J. Gastroentrol. 27:529-537; Strober (1985) "Animal Models Of Inflammatory Bowel Disease--An Overview," Dig. Dis. Sci. 30(12 Supl.):3S-10S). La colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn son enfermedades inflamatorias del intestino humanas que pueden inducirse en animales. Pueden administrarse polisacáridos que incluyen, aunque sin limitación, amilopectina, carragenina, sulfato de amilopectina y sulfato de dextrano, o productos químicos irritantes que incluyen, aunque sin limitación, ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) y ácido acético a los animales por vía oral, para inducir enfermedades inflamatorias del intestino.
También pueden usarse modelos animales de trastornos autoinmunitarios para evaluar la eficacia de los tratamientos de combinación. Se han desarrollado modelos animales para trastornos autoinmunitarios tales como la diabetes de tipo 1, la autoinmunidad tiroidea, el lupus eritematoso sistémico y la glomerulonefritis (Flanders et al., (1999) "Prevention Of Type 1 Diabetes From Laboratory To Public Health," Autoimmunity 29:235-246; Rasmussen et al. (1999) "Models To Study The Pathogenesis Of Thyroid Autoimmunity," Biochimie 81:511-515; Foster (1999) "Relevance Of Systemic Lupus Erythematosus Nephritis Animal Models To Human Disease," Semin. Nephrol. 19:12-24).
Además, puede usarse cualquier ensayo conocido por los expertos en la materia para evaluar la utilidad profiláctica y/o terapéutica de los tratamientos de combinación divulgados en la presente memoria para las enfermedades autoinmunitarias y/o inflamatorias.
La toxicidad y la eficacia de los protocolos profilácticos y/o terapéuticos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o en animales experimentales, por ejemplo, para la determinación de la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y de la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación de DL50/DE5o. Se prefieren los agentes profilácticos y/o terapéuticos que muestren unos índices terapéuticos grandes. Aunque pueden usarse agentes profilácticos y/o terapéuticos que muestren unos efectos secundarios tóxicos, debe tenerse cuidado en diseñar un sistema de administración que dirija dichos agentes al sitio de tejido afectado para minimizar el daño potencial a las células no infectadas, y reducir así los efectos secundarios.
Los datos obtenidos a partir de los ensayos en cultivos celulares y en los estudios con animales pueden usarse en la formulación de un abanico de dosis de los agentes profilácticos y/o terapéuticos para su uso en seres humanos. La dosis de dichos agentes está preferiblemente en un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar en este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. Para cualquier agente usado en el método descrito en la presente memoria, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de los ensayos con cultivos celulares. Una dosis puede formularse en modelos animales para conseguir una concentración plasmática en circulación que incluya la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que consigue la mitad de la inhibición máxima de los síntomas) según se determina en el cultivo celular. Dicha información puede usarse para determinar de forma más precisa las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alta resolución.
La actividad antineoplásica de los tratamientos usados también puede determinarse mediante el uso de varios modelos animales experimentales para el estudio del cáncer, tales como el modelo de ratón SCID o de ratón transgénico o de ratón atímico con xenoinjertos humanos, modelos animales, tales como hámsteres, conejos, etc. conocidos en la técnica y descritos en Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development (1999, ed. Fiebig y Burger); Contributions to Oncology (1999, Karger); The Nude Mouse in Oncology Research (1991, ed. Boven y Winograd); y Anticancer Drug Development Guide (1997 ed. Teicher).
Modelos animales preferidos para la determinación de la eficacia terapéutica de las moléculas de la divulgación son modelos de xenoinjerto de ratón. Líneas celulares tumorales que pueden usarse como fuente para los xenoinjertos de tumores incluyen, aunque sin limitación, células SKBR3 y MCF7, que pueden proceder de pacientes con adenocarcinoma de mama. Estas células tienen receptores tanto erbB2 como de prolactina. Las células SKBR3 se han usado de forma rutinaria en la técnica como modelos de ADCC y de xenoinjerto de tumor. Como alternativa, pueden usarse células OVCAR3 derivadas de un adenocarcinoma de ovario humano como fuente para los xenoinjertos de tumores.
Los protocolos y las composiciones se ensayan preferiblemente in vitro y después in vivo, para evaluar la actividad terapéutica o profiláctica deseada, antes de su uso en seres humanos. Los agentes y los métodos terapéuticos se pueden cribar usando células de un tumor o de una línea celular maligna. Pueden usarse muchos ensayos convencionales en la técnica para evaluar dicha supervivencia y/o crecimiento; por ejemplo, la proliferación celular puede ensayarse mediante la medición de la incorporación de 3H-timidina, mediante un recuento celular directo, mediante la detección de los cambios en la actividad de transcripción de genes conocidos tales como protooncogenes (por ejemplo, fos, myc) o de marcadores del ciclo celular; la viabilidad celular puede evaluarse mediante una tinción con azul tripano, la diferenciación puede evaluarse visualmente basándose en los cambios en la morfología, en la disminución en el crecimiento y/o en la formación de colonias en agar blando o la formación de una red tubular en una membrana de base tridimensional o una preparación de matriz extracelular, etc.
Los compuestos para su uso en tratamiento se pueden ensayar en sistemas de modelo animal adecuados antes de ensayarlos en seres humanos, incluyendo, aunque sin limitación, en ratas, ratones, pollos, vacas, monos, conejos, hámsteres, etc., por ejemplo, los modelos animales descritos anteriormente. Después, los compuestos pueden usarse en los ensayos clínicos apropiados.
Además, puede usarse cualquier ensayo conocido por los expertos en la materia para evaluar la utilidad profiláctica y/o terapéutica de los tratamientos de combinación divulgados en la presente memoria para el tratamiento o la prevención del cáncer, de un trastorno inflamatorio o de una enfermedad autoinmunitaria.
6. Ejemplos
6.1 Diseño y caracterización de diacuerpos biespecíficos covalentes
Se construyó un diacuerpo monoespecífico covalente y un diacuerpo biespecífico covalente para evaluar la producción recombinante, la purificación y las características de unión de cada uno. Se encontró que las moléculas de diacuerpo purificadas por afinidad que se produjeron mediante los sistemas de expresión recombinante descritos en la presente memoria, mediante un análisis de SDS-PAGE y de SEC, consistían en especies diméricas individuales. Los análisis de ELISA y de SPR revelaron además que el diacuerpo biespecífico covalente mostraba afinidad por ambos antígenos diana y podía unirse simultáneamente a ambos antígenos.
Materiales y métodos:
Construcción y diseño de las moléculas polipeptídicas: se diseñaron vectores de expresión de ácidos nucleicos para producir cuatro construcciones polipeptídicas, representadas esquemáticamente en la figura 2. La construcción 1 (SEQ ID NO: 9) comprendía el dominio VL del anticuerpo 2B6 humanizado, que reconoce el FcyRIIB y el dominio VH del anticuerpo 3G8 humanizado, que reconoce el FcyRIIIA. La construcción 2 (SEQ ID NO: 11) comprendía el dominio VL de Hu3G8 y el dominio VH de Hu2B6. La construcción 3 (SEQ ID NO: 12) comprendía el dominio VL de Hu3G8 y el dominio v H de Hu3G8. La construcción 4 (SEQ ID NO: 13) comprendía el dominio VL de Hu2B6 y el dominio VH de Hu2B6.
PCR y construcción del vector de expresión: las secuencias codificantes de los dominios VL o VH se amplificaron a partir del ADN de molde usando cebadores directos e inversos diseñados de forma que los productos iniciales de la PCR contuvieran secuencias solapantes, permitiendo que la PCR solapante generara las secuencias codificantes de las construcciones polipeptídicas deseadas.
Amplificación inicial mediante PCR del ADN de molde: se mezclaron suavemente aproximadamente 35 ng del ADN de molde, por ejemplo, la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo de interés; 1 ul de los cebadores directo e inverso 10 uM; 2,5 gl de tampón pfuUltra 10x (Stratagene, Inc.); 1 ul de dNTP 10 mM; 1 ul de 2,5 unidades/ul de polimerasa de ADN pfuUltra (Stratagene, Inc.); y agua destilada hasta un volumen total de 25 ul, en un tubo de microcentrífuga, y se rotaron brevemente en una microcentrífuga para recoger la mezcla de reacción del fondo del tubo. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo usando el sistema de PCR GeneAmp 9700 (PE Applied Biosystem) y los siguientes ajustes: 94 °C, 2 minutos; 25 ciclos de 94 °C, cada 15 segundos; 58 °C, 30 segundos; y 72 °C, 1 minuto.
El VL de Hu2B6 se amplificó a partir de la cadena ligera de Hu2B6 usando los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 56, respectivamente. El VH de Hu2B6 se amplificó a partir de la cadena pesada de Hu2B6 usando los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58, respectivamente. El VL de Hu3G8 se amplificó a partir de la cadena ligera de Hu3G8 usando los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 59, respectivamente. El VH de Hu3G8 se amplificó a partir de la cadena pesada de Hu3G8 usando los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61, respectivamente.
Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1 % durante 30 minutos a 120 voltios. Los productos de PCR se cortaron del gel y se purificaron usando el kit de extracción MinElute GE1 (Qiagen, Inc.).
PCR solapante: los productos iniciales de PCR se combinaron como se describe a continuación y se amplificaron usando las mismas condiciones de PCR descritas para la amplificación inicial del ADN de molde. Los productos de PCR solapante también se purificaron como se describe supra.
La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 1, SEQ ID NO: 9 (mostrada esquemáticamente en la figura 2), se amplificó mediante la combinación de los productos de la PCR de las amplificaciones del VL de Hu2B6 y del v H de Hu3G8 y los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 61, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 2, SEQ ID NO: 11 (mostrada esquemáticamente en la figura 2), se amplificó mediante la combinación de los productos de PCR de las amplificaciones del VL de Hu3G8 y del VH de Hu2B6 y los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 58, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 3, SEQ ID NO: 12 (mostrada esquemáticamente en la figura 2), se amplificó mediante la combinación de los productos de PCR de las amplificaciones del VL de Hu3G8 y del VH de Hu3G8, y los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 55 y SEQ iD NO: 61, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 4, SEQ ID NO: 13 (mostrada esquemáticamente en la figura 2), se amplificó mediante la combinación de los productos de PCR de las amplificaciones del VL de Hu2B6 y del VH de Hu2B6 y los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 58, respectivamente.
Los cebadores directos de los dominios VL (es decir, SEQ ID NO: 55) y los cebadores inversos de los dominios VH (es decir, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 61) contenían sitios de restricción únicos para permitir la clonación del producto final en un vector de expresión. Los productos de PCR solapante purificados se digirieron con las endonucleasas de restricción Nhe I y EcoR I y se clonaron en el vector de expresión de mamífero pCIneo (Promega, Inc.). Los plásmidos que codifican las construcciones se denominaron como se identifica en la tabla 12:
Tabla 12. Construcciones plasmídicas
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Expresión del polipéptido/diacuerpo: pMGX0669, que codifica la construcción l, se cotransfectó con pMGX0667, que codifica la construcción 2, en células HEK-293 usando Lipofectamine 2000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). La cotransfección de estos dos plásmidos estaba diseñada para que diera lugar a la expresión de un diacuerpo biespecífico covalente (CBD) inmunoespecífico tanto para el FcyRIIB como para el FcyRIIIA (diacuerpo h2B6-h3G8). pMGX0666 y pMGX0668, que codifican las construcciones 3 y 4, respectivamente, se transfectaron por separado en células HEK-293 para la expresión de un diacuerpo monoespecífico covalente (CMD), inmunoespecífico para el FcyRIIIA (diacuerpo h3G8) y para el FcyRIIB (diacuerpo h2B6), respectivamente. Después de tres días en el cultivo, los productos secreteados se purificaron del medio acondicionado.
Purificación: los diacuerpos se capturaron del medio acondicionado usando los antígenos pertinentes acoplados a Sepharose 4B activada con CNBr. La resina de afinidad de Sepharose se equilibró en Tris/HCl 20 mM, pH de 8,0 antes de la carga. Después de la carga, la resina se lavó con tampón de equilibrado antes de la elución. Los diacuerpos eluyeron de la resina lavada usando glicina 50 mM pH de 3,0. Los diacuerpos eluidos se neutralizaron inmediatamente con Tris/HCl 1 M pH de 8,0 y se concentraron usando un concentrador de tipo centrifugación. Los diacuerpos concentrados se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de exclusión molecular usando una columna Superdex 200 equilibrada con PBS.
SEC: se usó cromatografía de exclusión molecular para analizar el tamaño aproximado y la heterogeneidad de los diacuerpos eluidos desde la columna. El análisis de SEC se llevó a cabo en una columna GE healthcare Superdex 200HR 10/30 equilibrada con PBS. La comparación con los perfiles de elución de una IgG de longitud completa (~ 150 kDa), de un fragmento Fab (~ 50 kDa) y de un Fv monocatenario (~ 30 kDa) se usaron como controles).
ELISA: la unión de los diacuerpos eluidos y purificados se caracterizó mediante un ensayo de ELISA, como se describe en 5.4.2. Se recubrieron 50 ul/pocillo de una disolución de 2 ug/ml de sCD32B-Ig en una placa de 96 pocillos Maxisorp en tampón de carbonato a 4 °C durante una noche. Se lavó tres veces con PBS-T (PBS, Tween 20 al 0,1 %) y se bloqueó con BSA al 0,5 % en PBS-T durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se diluyeron el h2B6-h3G8 CBD, el h2B6 CMD o el h3G8 CMD en el tampón de bloqueo en diluciones dobles sucesivas para generar un abanico de concentraciones de diacuerpo, desde 0,5 ug/ml hasta 0,001 ug/ml. Después la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces con PBS-T, se añadieron 50 ul/pocillo de sCD16A-biotina a 0,2 ug/ml a cada pocillo. La placa se incubó de nuevo a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces con PBS-T, se usaron 50 ul/pocillo de una dilución 1:5000 de estreptavidina conjugada con HRP (Amersham Pharmacia Biotech) para la detección. La HRP-estreptavidina se dejó en incubación durante 45 minutos a temperatura ambiente. La placa se lavó tres veces con PBS-T y se reveló usando 80 ul/pocillo de sustrato TMB. Después de una incubación de 10 minutos, la reacción de HRP-TMb se detuvo mediante la adición de 40 ul/pocillo de H2SO4 al 1 %. Se leyó la DO 450 nm mediante el uso de un lector de placa de 96 pocillos y el programa informático SOFTmax, y los resultados se representaron gráficamente usando el programa informático GraphPadPrism 3.03.
Ensayo BIAcore: los parámetros cinéticos de la unión de los diacuerpos eluidos y purificados se analizaron usando un ensayo BIAcore (BIAcore instrument 1000, BIAcore Inc., Piscataway, N. J.) y el programa informático asociado como se describe en la sección 5.4.3.
Se inmovilizaron el sCD16A, el sCD32B o el sCD32A (control negativo) en una de las cuatro celdas de flujo (celda de flujo 2) de la superficie de un chip sensor a través de una química de acoplamiento de amina (mediante la modificación de los grupos carboximetilo con una mezcla de NHS/EDC) de forma que se inmovilizaron aproximadamente 1000 unidades de respuesta (UR) de cualquiera de los receptores en la superficie. Después de esto, los ésteres activos sin reaccionar se "inactivaron" con una inyección de Et-NH2 1 M. Una vez preparada una superficie adecuada, se pasaron los diacuerpos biespecíficos covalentes (CBD h2B6-h3G8) o los diacuerpos monoespecíficos covalentes (CMD h2B6 o CMB h3G8) por encima de la superficie mediante inyecciones de 180 segundos de una disolución 6,25-200 nM a un caudal de 70 ml/min. También se ensayó el scFv h3G8 como comparación.
Una vez recogido un conjunto total de datos, las curvas de unión resultantes se ajustaron globalmente usando los algoritmos informáticos suministrados por el fabricante, BIAcore, Inc. (Piscataway, Nj). Estos algoritmos calculan tanto la Kon como la Kof, a partir de las que se deduce la constante de unión en equilibrio aparente, KD, como la relación entre las dos constantes de velocidad (es decir, Koff/Kon). Un tratamiento más detallado de cómo se derivan las constantes de velocidad individuales puede encontrarse en el BIAevaluaion Softwson Handbook (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ).
Las fases de asociación y de disociación se ajustaron por separado. Se obtuvo la constante de velocidad de disociación para un intervalo de 32-34 s de la fase de disociación de 180 s; el ajuste de la fase de asociación se obtuvo mediante un modelo Langmuir 1:1, y el ajuste de la base se seleccionó sobre la base de criterios de Rmax y ji2 para los diacuerpos biespecíficos y el scFv; se usó el ajuste del analito bivalente para la unión del CMD.
Resultados
El análisis de SDS-PAGE en unas condiciones no reductoras reveló que el producto purificado de los sistemas de expresión CMD h3G8, CMD h2B6 y CBD h2B6-h3G8 era, cada uno, una especie individual con un peso molecular estimado de aproximadamente 50 kDa (figura 3, carriles 4, 5 y 6, respectivamente). En unas condiciones reductoras, el producto purificado a partir de cualquiera de los sistemas de expresión del CMD corrió como una banda individual (carriles 1 y 2), mientras que se reveló que el producto purificado del sistema del CBD h2B6-h3G8 eran 2 proteínas individuales (figura 3, carril 3). Todos los polipéptidos purificados del sistema de expresión y visualizados mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras migraron a aproximadamente 28 kDa.
El análisis de SEC de cada de uno de los productos del sistema de expresión también reveló una única especie molecular (figura 4B), cada de las cuales eluía aproximadamente al mismo tiempo que un fragmento Fab de IgG (~ 50 kDa) (figura 4A). Los resultados indican que el producto purificado por afinidad era un homodímero covalente homogéneo para el caso del sistema de expresión del CMD, y un heterodímero covalente homogéneo para el caso del CBD h2B6-h3G8.
Se usó un ensayo de ELISA emparedado para ensayar la especificidad de unión del CBD h2B6-h3G8 por cualquiera o ambos de CD32B y/o de CD16A (figura 5). CD32B sirvió como antígeno diana, y se usó CD16A como sonda secundaria. La señal positiva del ELISA reveló que el CBD heterodimérico h2B6-h3G8 tenía especificidad por ambos antígenos. Un ensayo similar con el CMD h3G8 (que no debería unirse al CD32B) no mostró ninguna señal.
El análisis de SPR indicó que el CMD h3G8 reconocía inmunoespecíficamente sCD16, pero no sCD32B, que el CMD h2B6 reconocía inmunoespecíficamente sCD32B, pero no sCD16, y que el CBD h2B6-h3G8 reconocía inmunoespecíficamente tanto sCD16 como sCD32B (figuras 6A-B). Ninguno de los diacuerpos ensayados se unió al receptor de control, sCD32A (figura 6C).
El análisis de SPR también se usó para estimar las constantes cinéticas y en equilibrio de los CMD y del CBD h2B6-h3G8 frente a sCD16 y/o sCD32B. Los resultados se compararon con las mismas constantes calculadas para un scFV de h3G8. Las figuras 7A-E muestran los resultados gráficos del análisis de SPR. Las constantes cinéticas on y off, así como la constante en equilibrio, calculadas a partir de los resultados representados en la figura 7, se proporcionan en la tabla 13.
Tabla 13. Constantes cinéticas y en equilibrio calculadas a partir de datos de BIAcore.
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Acoplados con los resultados del análisis de ELISA, los estudios confirman que el heterodímero covalente h2B6-h3G8 retenía la especificidad tanto por CD32B como por CD16 y podía unirse a ambos antígenos simultáneamente. La molécula está representada químicamente en la figura 8.
6.2 Diseño y caracterización de diacuerpos biespecíficos covalentes que comprenden dominios Fc
En un esfuerzo por crear una molécula de tipo IgG, es decir, que comprende un dominio Fc, uno de los polipéptidos que comprende la molécula heterodimérica CBD presentada en el ejemplo 6.1 se modificó para que comprendiera adicionalmente un dominio Fc (creando una cadena "más pesada" y una "más ligera", análogas a la cadena pesada y ligera de un anticuerpo). La molécula biespecífica heterodimérica contendría entonces un dominio Fc que dimerizaría con una molécula homóloga, formando una molécula de tipo IgG tetramérica con tetravalencia (es decir, formada por una dimerización a través de los dominios Fc de las moléculas biespecíficas heterodiméricas). De forma interesante, dichas moléculas tetraméricas no fueron detectadas en el medio acondicionado de los sistemas de expresión recombinantes que usan los ensayos funcionales, por ejemplo, el ensayo del medio acondicionado para evaluar la unión inmunospecífica a los antígenos diana. En su lugar, solo se detectó una molécula dimérica, que comprende monómeros que consisten en un dominio VL, VH y Fc, en dichos ensayos funcionales. Para ensayar si se cuestionaba la estabilidad de la teórica estructura tetramérica, se diseñaron polipéptidos que comprenden el dominio Fc para que comprendieran adicionalmente una región de bisagra, mientras que los polipéptidos que comprenden la cadena "más ligera" se modificaron para que comprendieran adicionalmente los 6 aminoácidos del extremo C del dominio constante de la cadena ligera kappa humana. Cuando dichas cadenas rediseñadas "más pesadas" y "más ligeras" se coexpresaban en los sistemas de expresión recombinantes, los ensayos funcionales detectaban las moléculas de diacuerpo que podían unirse inmunoespecíficamente tanto a los antígenos diana como a los anticuerpos anti-Fc.
Materiales y métodos
Construcción y diseño de moléculas polipeptídicas: se diseñaron vectores de expresión de ácidos nucleicos para producir versiones modificadas de las construcciones 1 y 2 presentadas en el ejemplo 6.1. La construcción 5 (SEQ ID NO: 14) y la 6 (SEQ ID NO: 15) se crearon mediante genomanipulación de la construcción 1 y 2, respectivamente, para que comprendieran adicionalmente un dominio Fc. La construcción 7 (SEQ ID NO: 16) se creó mediante genomanipulación de la construcción 1 para que comprendiera adicionalmente la secuencia FNRGEC (SEQ ID NO: 23) en su extremo C. La construcción 8 (SEQ ID NO: 18) se creó mediante genomanipulación de la construcción 2 para que comprendiera adicionalmente una región de bisagra y un dominio Fc (que comprende la mutación V215A). Se muestra una representación esquemática de las construcciones 5-8 en la figura 9.
PCR y construcción del vector de expresión: todos los protocolos de PCR y de purificación del producto de PCR fueron como se describe en el ejemplo 6.1 Los plásmidos pMGX0669 y pMGX0667 sirvieron como moldes para las secuencias codificantes de las construcciones 1 y 2, respectivamente. Las secuencias codificantes para el dominio Fc de HuIgG y/o el dominio de bisagra fueron la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 5, respectivamente. Las secuencias codificantes de los ADN de molde se amplificaron usando unos cebadores directo e inverso tales que los productos de PCR contendrían secuencias solapantes, permitiendo que la PCR solapante generara las secuencias codificantes de los productos deseados.
La secuencia codificante de la construcción 1 se amplificó a partir de pMGX0669 usando los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 62, respectivamente. La secuencia codificante de la construcción 2 se amplificó a partir de pMGX0667 usando los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 63, respectivamente. La bisagra-Fc de HulgG se amplificó usando los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 66, respectivamente. La construcción 7 (SEQ ID NO: 16) se amplificó a partir de pMGX0669 usando los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 67.
PCR solapante: los productos iniciales de PCR se combinaron como se describe a continuación, se amplificaron y se purificaron como se describe en el ejemplo 6.1.
La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 5, SEQ ID NO: 14 (mostrada esquemáticamente en la figura 9), se amplificó mediante la combinación de los productos de PCR de las amplificaciones de la construcción 1 y el Fc de HuIgG y los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 64, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 6, SEQ ID NO: 15 (mostrada esquemáticamente en la figura 9), se amplificó mediante la combinación de los productos de PCR de las amplificaciones de la construcción 2 y el Fc de HuIgG y los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 66, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 8, SEQ ID NO: 18 (mostrada esquemáticamente en la figura 9), se amplificó mediante la combinación de los productos de PCR de las amplificaciones de la construcción 2 y la bisagra-Fc de HuIgG y los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 66, respectivamente.
Los productos finales se clonaron en el vector de expresión de mamífero pCIneo (Promega, Inc.) como se describe previamente. Las construcciones que codifican el plásmido se denominaron como se identifica en la tabla 14:
Tabla 14. Construcciones plasmídicas
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Expresión del polipéptido/diacuerpo: se llevaron a cabo cuatro cotransfecciones por separado en células HEK-293 usando Lipofectamine 2000, como se describe en la sección 6.1: pMGX0669 y pMGX0674, que codifican las construcciones 1 y 6, respectivamente; pMGX0667 y pMGX0676, que codifican las construcciones 2 y 5, respectivamente; y pMGX0677 y pMGX0678, que codifican las construcciones 7 y 8, respectivamente.
La cotransfección de estos plásmidos se diseñó para que diera lugar a la expresión de un diacuerpo biespecífico (CBD) de tetravalencia con una estructura de tipo IgG, inmunoespecífico tanto para el FcyRIIB como para el FcyRIIIA. También se llevó a cabo una cotransfección adicional: pMGX0674 y pMGX0676, que codifican las construcciones 6 y 5, respectivamente. Después de tres días en cultivo, se recogió el medio acondicionado. La cantidad de producto secretado en el medio acondicionado se cuantificó mediante un ELISA anti-Fc de la IgG usando Fc purificado como patrón. Las concentraciones de producto en las muestras se normalizaron después sobre la base de la cuantificación, y se usaron las muestras normalizadas para el resto de los ensayos.
ELISA: se ensayó la unión de las moléculas de diacuerpo secretadas en el medio mediante un ELISA emparedado, como se describe, supra. Salvo que se indique, se usó CD32B para recubrir la placa, es decir, como proteína diana, y se usó CD16 conjugada con HRP como sonda.
Resultados
Se usó un ensayo de ELISA para ensayar las muestras normalizadas de los sistemas de expresión recombinante que comprenden las construcciones 1 y 6 (pMGX669-pMGX674), las construcciones 2 y 5 (pMGX667-pNGX676) y las construcciones 5 y 6 (pMGX674-pMGX676) para evaluar la expresión de las moléculas de diacuerpo que pueden unirse simultáneamente a CD32B y a CD16A (figura 10). Los datos del ELISA indicaron que la cotransfección con las construcciones 1 y 6 o la cotransfección con las construcciones 2 y 5 no consiguieron producir un producto que pudiera unirse a alguno o a los dos antígenos (figura 10, □ y ▲, respectivamente). Sin embargo, la cotransfección de las construcciones 5 y 6 dio lugar a la secreción de un producto que puede unirse a ambos antígenos CD32B y CD16. El último producto era un dímero de las construcciones 5 y 6, que contiene un sitio de unión para cada antígeno con la estructura representada esquemáticamente en la figura 11.
Para dirigir la formación de una estructura heterotetramérica de tipo IgG, se unió la secuencia codificante de seis aminoácidos adicionales al extremo C de la construcción 1, generando la construcción 7 (SEQ ID NO: 16 y mostrada esquemáticamente en la figura 9). Los seis aminoácidos adicionales, FNRGEC (SEQ ID NO: 23), derivaban del extremo C de la cadena ligera kappa, y normalmente interactúan con el dominio de bisagra superior de la cadena pesada en una molécula de IgG. Después se modificó un dominio de bisagra en la construcción 6, generando la construcción 8 (SEQ ID NO: 18 y figura 9). La construcción 8 comprendía adicionalmente una mutación de aminoácido en la región de bisagra superior, A215V. Después se cotransfectaron plásmidos de expresión que codifican la construcción 7 y la construcción 8, pMGX677 y pMGX678, respectivamente, en células HEK-293, y se expresaron como se describe.
Las moléculas de diacuerpo producidas a partir del sistema de expresión recombinante que comprende las construcciones 7 y 8 (pMGX0677 pMGX0678), se compararon en un ensayo de ELISA para evaluar la unión de CD32B y de CD16a a las moléculas de diacuerpo producidas a partir de los sistemas de expresión que comprenden las construcciones 1 y 6 (pMGX669 pMGX674), las construcciones 2 y 8 (pMGX669 pMGX678) y las construcciones 6 y 7 (pMGX677 pMGX674) (figura 12).
Como antes, la molécula producida por el sistema de expresión que comprende las construcciones 1 y 6 (pMGX669 pMGX674) resultó incapaz de unirse a CD32A ni a CD16A (figura 10 y figura 12). Por el contrario, el producto de la coexpresión de cualquiera de las construcciones 7 y 6 (pMGX0677 pMGX0674) o de la coexpresión de las construcciones 7 y 8 (pMGX0677-pMGX0678) podía unirse tanto a CD32B como a CD16 (figura 12). Se aprecia que la construcción 7 es análoga a la construcción 1, con la excepción de que la construcción 7 comprende la secuencia del extremo C FNRGEC (la SEC ID NO: 23); y que la construcción 8 es análoga a la construcción 6, excepto porque la construcción 8 comprende un dominio de bisagra y la mutación A215V. Los datos indican que la adición de 6 aminoácidos adicionales en el extremo C de la cadena ligera C-kappa (FNRGEC; la SEQ ID NO: 23) a la cadena no portadora del Fc, "más ligera", ayudó a estabilizar la formación de las moléculas de diacuerpo tetraméricas de tipo IgG, independientemente de si la correspondiente cadena más pesada comprendía un dominio de bisagra (es decir, pMGX0677 pMGX0674 y pMGX0677-pMGX0678, figura 12). La adición del dominio de bisagra al polipéptido portador del Fc "más pesado", sin la adición de la secuencia FNRGEC (SEQ ID NO: 23) en el extremo C a la correspondiente cadena "más ligera", era aparentemente incapaz de lograr una estabilización similar (es decir, carece de la unión por parte del producto de cotransfección de las construcciones 2 y 8 (pMGX669 pMGX678)). La estructura de la molécula de diacuerpo tetramérica está representada esquemáticamente en la figura 13.
6.3 Efecto del orden de dominios y de los puentes de disulfuro adicionales sobre la formación del diacuerpo tetramérico de tipo IgG
Se investigó el efecto de la estabilización adicional entre las cadenas polipeptídicas "más ligeras" y "más pesadas" de la molécula de diacuerpo tetramérica de tipo IgG mediante la sustitución de restos seleccionados de las cadenas polipeptídicas por cisteínas. Los restos adicionales de cisteína proporcionan puentes disulfuro adicionales entre las cadenas "más pesadas" y las "más ligeras". Adicionalmente, se investigó el orden de los dominios sobre la actividad de unión mediante el desplazamiento del dominio Fc o del dominio de bisagra-Fc desde el extremo C de la cadena polipeptídica al extremo N. Aunque la actividad de unión de la molécula que comprende los puentes disulfuro adicionales no estaba alterada con respecto a las moléculas de diacuerpo construidas previamente con dichos enlaces, la transferencia del dominio Fc o de bisagra-Fc al extremo N de la cadena polipeptídica "más pesada" que comprende el diacuerpo sorprendentemente mejoró la afinidad de unión y/o la avidez de la molécula biespecífica por uno o ambos de sus antígenos diana.
Materiales y métodos
Construcción y diseño de moléculas polipeptídicas: se diseñaron vectores de expresión de ácidos nucleicos para producir versiones modificadas de las construcciones 5, 6 y 8 presentadas en el ejemplo 6.2. La construcción 9 (SEQ ID NO: 19) y la construcción 10 (SEQ ID NO: 20) (mostradas ambas esquemáticamente en la figura 13) eran análogas a las construcciones 8 y 6, con la excepción de que el dominio Fc o el dominio de bisagra-Fc, respectivamente, se habían desplazado desde el extremo C del polipéptido hasta el extremo N. Adicionalmente, todos los dominios Fc usados eran dominios Fc de la IgG1 de tipo silvestre. La construcción 11, SEQ ID NO: 21 (mostrada esquemáticamente en la figura 14) era análoga a la construcción 2 del ejemplo 6.1 excepto porque el extremo C se diseñó para que comprendiera adicionalmente la secuencia FNRGEC (SEQ ID NO: 23). La construcción 12, SEQ ID NO: 22 (mostrada esquemáticamente en la figura 14), era análoga a la construcción 5 del ejemplo 6.2 excepto porque el dominio Fc comprendía adicionalmente una región de bisagra. También, para las construcciones 11 y 12, el dominio VL de 2B6 y el dominio VH de 2B6 comprendían una única modificación de aminoácido (G105C y G44C, respectivamente) de forma que una glicina de cada dominio estaba sustituida por una cisteína.
PCR y construcción del vector de expresión: todos los protocolos de PCR y los productos de purificación de PCR fueron como se describe en el ejemplo 6.1 y 6.2.
PCR solapante: los productos finales se construyeron, se amplificaron y se purificaron usando los métodos descritos en el ejemplo 6.1 y en el ejemplo 6.2.
Los productos finales se clonaron en el vector de expresión de mamífero pCIneo (Promega, Inc.) como se describe previamente. Los plásmidos que codifican las construcciones se denominaron como se identifica en la tabla 15:
Tabla 15. Construcciones plasmídicas
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Expresión del polipéptido/diacuerpo: se llevaron a cabo tres cotransfecciones por separado en células HEK-293 usando Lipofectamine 2000, como se describe en la sección 6.1: pMGX0669 y pMGX07l9, que codifican las construcciones 1 y 9, respectivamente; pMGX0669 y pMGX0718, que codifican las construcciones 1 y 10, respectivamente; y pMGX0617 y pMGX0717, que codifican las construcciones 11 y 12, respectivamente. La cotransfección de estos plásmidos se diseñó para que diera lugar a la expresión de un diacuerpo biespecífico (CBD) de tetravalencia con una estructura de tipo IgG, inmunoespecífico tanto para el FcyRIIB como para el FcyRIIIA. Después de tres días en cultivo, se recogió el medio acondicionado. La cantidad de producto secretado en el medio acondicionado se cuantificó mediante un ELISA anti-Fc de la IgG usando Fc purificado como patrón. Las concentraciones de producto en las muestras se normalizaron después sobre la base de la cuantificación, y se usaron las muestras normalizadas para el resto de los ensayos.
ELISA: se ensayó la unión de las moléculas de diacuerpo secretadas en el medio mediante un ELISA emparedado, como se describe supra. Salvo que se indique, se usó CD32B para recubrir la placa, es decir, como proteína diana, y se usó CD16 conjugada con HRP como sonda.
Transferencia de Western: se analizaron aproximadamente 15 ml de medio acondicionado procedente de las tres cotransfecciones descritas anteriormente mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras. Se tiñó un gel con Simply Blue Safestain (Invitrogen) y se transfirió un gel idéntico a una membrana de PVDF (Invitrogen) usando métodos de transferencia convencionales. Después de la transferencia, la membrana se bloqueó con leche desnatada en polvo al 5 % en PBS 1x. Después, la membrana se incubó en 10 ml de anticuerpo de cabra anti-IgG 1 H+L humana conjugado con HRP diluido 1:8000 en leche desnatada en polvo al 2 % en PBS 1x/Tween 20 al 0,1 % a la temperatura ambiente durante 1 h con agitación suave. Después de un lavado con PBS 1x/Tween 20 al 0,3 %, 2 x 5 min de cada uno, después 20 min a temperatura ambiente, la membrana se reveló con un sistema de detección de transferencia de Western ECL (Amersham Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La película se reveló en un procesador de rayos X.
Resultados
El medio acondicionado de los sistemas de expresión recombinantes que comprenden las construcciones 1 y 9; las construcciones 1 y 10; y las construcciones 11 y 12, se analizó mediante un análisis de SDS-PAGE (en condiciones no reductoras) y transferencia de Western (usando un anti-IgG como sonda). La transferencia de Western reveló que el producto de los sistemas que comprenden las construcciones 11 y 12 o los que comprenden las construcciones 9 y 1 formaba predominantemente una única especie de molécula de aproximadamente 150 kDa (figura 15, carriles 3 y 2, respectivamente). Estos dos productos tienen puentes disulfuro internos modificados entre las cadenas "más ligeras" y las "más pesadas" que comprenden el diacuerpo. Por el contrario, la molécula sin los puentes disulfuro internos modificados entre las cadenas "más ligeras" y las "más pesadas", formada por las construcciones 10 y 1, formaba al menos dos especies moleculares con unos pesos moleculares de ~ 75 y de ~ 100 kDa (figura 15, carril 1).
A pesar de los resultados de la transferencia de Western, se averiguó que cada uno de los tres productos podía unirse tanto a CD32A como a CD16 (figura 16). Sorprendentemente, con respecto al producto que comprende un dominio de bisagra-Fc del extremo C (formado por las construcciones 11 y 12), el producto de ambos sistemas en los que el dominio Fc (o Fc-bisagra) estaba en el extremo amino de la cadena polipeptídica que contiene Fc (es decir, la cadena "más pesada") (construcciones 9 1 y construcciones 10 1) mostró una afinidad y/o avidez potenciadas por uno o ambos de sus péptidos diana (es decir, CD32B y/o CD16).
6.4 Efecto del sitio de escisión interno/externo sobre el procesamiento del precursor de la poliproteína y la expresión del diacuerpo biespecífico covalente; diseño y caracterización de diacuerpo biespecífico que comprende partes de la cadena lambda y el dominio de bisagra de la IgG humana
Como se describe en la presente memoria, las cadenas polipeptídicas individuales del diacuerpo o de la molécula de diacuerpo de la invención puede expresarse en forma de una molécula precursora de poliproteína individual. Se ensayó la capacidad de los sistemas recombinantes descritos en los ejemplos 6.1-6.3 de procesar y expresar apropiadamente un CBD funcional a partir de dicho precursor de poliproteína mediante la genomanipulación de un ácido nucleico para que codificara tanto la primera como la segunda cadena polipeptídica de un CBD separadas por un sitio de escisión interno, en particular, un sitio de escisión de furina. El CBD funcional se aisló del sistema recombinante que comprende la molécula precursora de poliproteína.
Como se analiza en el ejemplo 6.3, se averiguó que la adición de los 6 aminoácidos del extremo C de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEQ ID NO: 23) estabiliza la formación del diacuerpo, posiblemente a través de una interacción intercatenaria potenciada entre los dominios que comprenden la SEQ ID NO: 23 y aquellos dominios que comprenden un dominio Fc o un dominio de bisagra-Fc. El efecto estabilizador de esta interacción de tipo cadena lambda/Fc se ensayó en el CBD en el que ninguna cadena polipeptídica comprendía un dominio Fc. Se modificó una cadena polipeptídica del diacuerpo para que comprendiera la SEQ ID NO: 23 en su extremo C; la cadena polipeptídica compañera se modificó para que comprendiera la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 77), que derivaba del dominio de bisagra de una IgG. La comparación de este CBD con el formado por las construcciones 1 y 2 (del ejemplo 6.1) reveló que el CBD que comprende los dominios derivados del dominio de bisagra y la cadena lambda mostraba una afinidad ligeramente mayor por uno o ambos de sus epítopos diana. Materiales y métodos
Construcción y diseño de moléculas polipeptídicas: precursor de poliproteína: se diseñaron vectores de expresión de ácidos nucleicos para producir 2 moléculas precursoras de poliproteína, representadas ambas esquemáticamente en la figura 17. La construcción 13 (SEQ ID NO: 95) comprendía desde el extremo N de la cadena polipeptídica, el dominio VL de 3G8, el dominio VH de 2.4G2 (que se une a mCD32B), un sitio de escisión de furina, el dominio VL de 2.4G2 y el dominio VH de 3G8. La secuencia de nucleótidos que codifica la construcción 13 se proporciona en la SEQ ID NO: 96. La construcción 14 (SEQ ID NO: 97) (figura 17), comprendía desde el extremo N de la cadena polipeptídica, el dominio VL de 3G8, el dominio VH de 2.4G2 (que se une a mCD32B), un sitio de escisión de furina, un sitio de FMD (la proteasa C3 del virus de la glosopeda), el dominio VL de 2.4G2 y el dominio VH de 3G8. La secuencia de nucleótidos que codifica la construcción 14 se proporciona en la SEQ ID NO: 98.
Se diseñaron vectores de expresión de ácidos nucleicos para producir las versiones modificadas de las construcciones 1 y 2 presentadas en el ejemplo 6.1. La construcción 15 (SEQ ID NO: 99) (figura 17) era análoga a la construcción 1 (SEQ ID NO: 9), presentada en ejemplo 6.1, con la excepción de que el extremo C de la construcción 15 comprendía la secuencia de aminoácidos FNRGEC (SEQ ID NO: 23). La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 15 se proporciona en la SEQ ID NO: 100. La construcción 16 (SEQ ID NO: 101) (figura 17) era análoga a la construcción 2, presentada en el ejemplo 6.1, con la excepción de que el extremo C de la construcción 16 comprendía la secuencia de aminoácidos VEPSKC (SEQ ID NO: 77). La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 16 se proporciona en la SEQ ID NO: 102.
PCR y construcción del vector de expresión: todos los protocolos de PCR y los productos de purificación de PCR fueron como se describe en el ejemplo 6.1 y 6.2
PCR solapante: los productos finales se construyeron, se amplificaron y se purificaron usando los métodos descritos en el ejemplo 6.1 y en el ejemplo 6.2 con los cebadores apropiados.
Los productos finales se clonaron en el vector de expresión de mamífero pCIneo (Promega, Inc.) como se describe previamente. Los plásmidos que codifican las construcciones se denominan como se identifica en la tabla 16:
Tabla 16. Construcciones plasmídicas
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Expresión del polipéptido/diacuerpo: se realizó una transfección y una cotransfección en células HEK-293 usando Lipofectamine 2000, como se describe en la sección 6.1: individual: pMGX0750, que codifica la construcción 13; y cotransfección: pMGX0752 y pMGX0753, que codifican las construcciones 15 y 16, respectivamente. Después de tres días en cultivo, se recogió el medio acondicionado y el producto secretado se purificó por afinidad como se describe.
ELISA: se ensayó la unión de las moléculas de diacuerpo secretadas en el medio mediante un ELISA emparedado, como se describe, supra. Se usó CD32B murina para recubrir la placa, es decir, como proteína diana, y se usó CD16A conjugada con HRP como sonda para el producto de cotransfección de las construcciones 15 y 16. Se usó mCD32B como proteína diana, y se usó CD16A conjugada con biotina como sonda para el sistema recombinante que comprende la construcción 13.
Resultados
El medio acondicionado de los sistemas de expresión recombinantes que comprenden las construcciones 13 se analizó mediante ELISA emparedado. El ensayo de ELISA ensayó la especificidad de la unión del CBD por una o ambas de mCD32B y/o CD16 (figura 18). CD32B sirvió como antígeno diana, y se usó CD16A como sonda secundaria. La señal positiva del ELISA reveló que el CBD h2.4G2-h3G8 heterodimérico producido a partir del precursor de poliproteína tenía especificidad por ambos antígenos.
Asimismo, el producto purificado generado mediante cotransfección de los vectores que codifican las construcciones 15 y 16 se ensayó en un ensayo de ELISA y se comparó con el producto comprendido por las construcciones 1 y 2 (ejemplo 6.1). CD32B sirvió como antígeno diana, y se usó CD16A como sonda secundaria. Al igual que con el producto comprendido por las construcciones 1 y 2, se averiguó que el producto de las construcciones 15 y 16 podía unirse simultáneamente a CD32B y a CD16A. De hecho, el producto de las construcciones 15 y 16 mostró una afinidad ligeramente potenciada por uno o ambos antígenos diana, es decir, CD32B o CD16A. Esto es debido quizás al aumento en la estabilidad y o en la fidelidad (con respecto a una interacción del dominio VH-VL de tipo silvestre) de la asociación intercatenaria proporcionada por la interacción de la región de la cadena lambda, FNRGEC (SEQ ID NO: 23) y la región de bisagra VEPKSC (SEQ ID NO: 77), que está ausente en el producto comprendido por las construcciones 1 y 2.
6.5 Uso de reactivos de redirección de afinidad doble ("DART") para ligar múltiples afinidades juntas
Un aspecto de la presente divulgación se refiere a nuevos reactivos de redirección de afinidad doble ("DART"), así como nuevas maneras de ligar múltiples afinidades juntas. Los "DART" pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos, etc., por tanto, pueden unirse simultáneamente a uno, dos, tres o más epítopos diferentes (que pueden ser del mismo antígeno o de diferentes). Los "DART" adicionalmente pueden ser monovalentes, bivalentes, trivalentes, tetravalentes, pentavalentes, hexavelentes, etc., por tanto, pueden unirse simultáneamente a una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más moléculas. Como se muestra en la figura 35, estos dos atributos de DART pueden combinarse, por ejemplo, para producir anticuerpos biespecíficos que sean tetravalentes, etc.
Un avance es el desarrollo de un DART que tenga afinidad por un receptor inmunitario prototípico, huCD32B, así como afinidad por un hapteno, fluoresceína. Este DART, denominado "2B6/4420," sirve como adaptador universal, puede coligar huCD32B con moléculas que interactúan con compañeros de unión conjugados a fluoresceína. CD32B es un receptor de Fc que tiene la capacidad de inactivar las señales activadoras debido al agrupamiento con inmunocomplejos de señalización de activación. En su implementación inicial, esta tecnología permite un rápido cribado de varias dianas biológicas para el agrupamiento con huCD32B sin la necesidad de generar nuevas construcciones DART. El 2B6/4420 simplemente puede mezclarse con un anticuerpo marcado con fluoresceína contra un receptor de superficie celular y, de este modo, imita la acción de un DART con afinidad por ese receptor (figura 20). Además, este reactivo permite una vinculación eficaz de los reactivos de afinidad que no se expresan o producen fácilmente, permitiendo superar las limitaciones técnicas. Los DART que contienen 2B6/4420 son claramente útiles como herramientas de investigación y también como candidatos clínicos. 2B6/4420 producido a partir de células HEK293 puede unirse simultáneamente a CD32B y fluoresceína en un ensayo de ELISA. Adicionalmente, puede inhibir la proliferación celular mediante el reclutamiento de CD32B en el complejo BCR mediante coligamiento con CD79. El brazo 2B6 del DART puede remplazarse con una secuencia de anticuerpo diferente o una secuencia de unión que tenga otra especificidad relevante.
Materiales y métodos:
Construcciones plasmídicas: 2B6/4420 se obtiene de secuencias de MAb 2B6 humanizado (hu2B6, MGA321) y una versión quimérica de Fv ratón/Fc humano del MAb antifluoresceína, 4420. El DART completamente ensamblado consiste en dos polipéptidos, que provocan la unión covalente de dos regiones Fv. El primer polipéptido consiste en una secuencia señal de secreción seguida del hu2B6VL producido como una proteína de fusión con 4420VH separado por un conector que consiste en los restos de aminoácido GGGSGGGG. La secuencia FNRGEC, derivada del extremo C de la cadena ligera kappa, se adjunta al extremo C de este polipéptido. El otro polipéptido consiste en la secuencia señal-4420VL-GGGSGGGG-hu2B6VH, con la secuencia VEPKSC, derivada del extremo C del fragmento Fd de IgG 1 humana, añadido al extremo C. Las cisteínas en las dos cadenas forman un enlace disulfuro, que une covalentemente los dos polipéptidos juntos (figura 20). Las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos descritos se amplificaron por PCR a partir de plásmidos existentes, se combinaron por PCR solapante y se clonaron en pCIneo (Promega) entre los sitios Nhe I y EcoR I. Finalmente, se usó un DART con afinidad por huCD32B y huCD16 (2B6/3G8) que se ha construido previamente usando métodos similares a los descritos anteriormente, como control.
Anticuerpos: Los anticuerpos monoclonales murinos anti-CD79b humana, CB3.1 y CB3.2 (hibridomas) se obtuvieron de Dr. Cooper MD, Universidad de Alabama en Birmingham, Birmingham AL. CB3.1 y CB3.2 se marcaron con isotiocianato de fluoresceína (FITC) siguiendo las instrucciones del fabricante (Pierce, Rockford IL). El fragmento F(ab')2 de una IgG de cabra antirratón (GAM), específico del fragmento Fc se obtuvo de Jackson Laboratories (West Grove, PA). El MAb de ratón anti-huCD32B, 3H7, se produjo y purificó de en el propio laboratorio. El anticuerpo de cabra anti-2B6Fv se produjo inmunizando cabras con anticuerpo complejo hu2B6 y purificando por afinidad frente a la región Fv de hu2B6. Se obtuvieron HuIgG, FITC-huIgG y HRP-IgG antirratón de Jackson Immunoresearch. HRP-anticuerpo anticabra se obtuvo de Southern Biotech.
Expresión de DART: Los plásmidos que codifican cada cadena se contransfectaron en células 293H (Invitrogen) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La proteína secretada se recogió 3-4 veces a intervalos de tres días y se purificaron por cromatografía de líquidos frente a una forma soluble inmovilizada de CD32B.
ELISA: Los DART 2B6/4420 o 2B6/3G8 se capturaron en placas MaxiSorp (Nalge Nunc) recubiertas con proteína S marcada con FITC (Novagen), IgG humana o FITC-huIgG. La detección prosiguió mediante unión del ectodominio CD32B soluble, seguido de 3H7 (un anticuerpo monoclonal de ratón específico para CD32B), y finalmente anticuerpo antirratón-HRP. Como alternativa, la detección se realizó mediante unión de antisuero policlonal de cabra anti-Fv 2B6 purificado por afinidad, seguido de anticuerpo anticabra-HRP. La actividad de HRP se detectó usando un sustrato TMB colorimétrico (BioFX) y se leyó en un lecto de placas de ELISA VersaMax.
Purificación de linfocitos B y ensayo de proliferación: Se separaron leucocitos monomorfonucleares de sangre periférica por un método de gradiente en Ficoll/Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech, R.U.) usando sangre de donadores sanos. Los linfocitos B se aislaron usando kit de aislamiento negativo de linfocitos B Dynal (Dynal Biotechnology Inc., NY) siguiendo las instrucciones del fabricante. La pureza de los linfocitos B aislados (CD20+) fue mayor de un 90 % estimada por análisis FACS. Para el ensayo de proliferación, los linfocitos B purificados se sembraron en medio RPMI 1640 completo en placas de microvaloración de 96 pocillos de fondo redondo a una densidad celular de 1 x 105 células por pocillo en un volumen final de 200 gl y se incubaron durante 48 h en presencia o ausencia de anticuerpos y diacuerpos a 37 °C en un 5 % de CO2. Después se añadió 1 gCi/pocillo de [3H]timidina (Perkin Elmer, Wellesley, MA) y la incubación continuó durante 16-18 h adicionales antes de la recogida. La incorporación de [3H]timidina se midió por recuento de centello líquido.
Resultados
Para demostrar que el DART 2B6/4420 era activo y específico, se realizaron dos experimentos de ELISA. En primer lugar, 2B6/4420 o 2B6/3G8 (como control negativo) se unión a una proteína conjugada a fluoresceína (proteína S) que se había recubierto sobre placas de ELISA. A continuación, el brazo 2B6 del DART se captó por CD32B soluble. La unión se detectó mediante otro anticuerpo contra CD32B con un epítopo que no solapa con el de 2B6, seguido de anticuerpo secundario conjugado con HRP. Aunque 2B6/4420 DART puede unirse simultáneamente a fluoresceína y CD32B, 2B6/3G8 no (figura 21, panel A). Cuando los DART se capturan en placas recubiertas con CD32B soluble y se detecta la unión mediante un anticuerpo específico para hu2B6 Fv, ambos DART muestran buena unión. Para demostrar que el DART 2B6/4420 podía unirse a fluoresceína conjugada con IgG humana (dado que este es el contexto de la implementación inicial de este reactivo), HuIgG, sin marcar o marcado con fluoresceína, se unión a placas de ELISA y se usó para capturar 2B6/4420. De nuevo, se usó 2B6/3G8 como control negativo. La unión se detectó usando un anticuerpo específico para Fv Hu2B6. El DART 2B6/4420 se une claramente a FITC-HuIgG, pero no se une a HuIgG sin marcar, lo que demuestra que este DART puede unirse a fluoresceína conjugada a un anticuerpo y que no hay unión significativa al anticuerpo en solitario. Como se esperaba, no se detectó unión por el DART 2B6/3G8 en ninguno de estos contextos.
Se realizaron experimentos para demostrar que el DART 2B6/4420 podía funcionar como reactivo de afinidad doble que podía tener un efecto en la señalización en el contexto de un ensayo basado en células. La coagregación de CD32B con la BCR ha demostrado inhibir la activación de linfocitos B. Se exploró la capacidad del DART 2B6/4420 de cocaptar CD32B con la BCR recubierta con anticuerpos contra aCD79b marcados con fluoresceína y activar la inhibición de la proliferación celular. Los linfocitos B se seleccionaron negativamente de sangre humana y se activaron mediante tratamiento con concentraciones crecientes de anticuerpo de ratón anti-CD79b humano marcado con FITC, clones CB3.1 y CB3.2, y mediante la adición de un fragmento F(ab')2 de un GAM específico de Fc como reactivo secundario para reticular la BCR, junto con una concentración fija (5 gg/ml) de DART 2B6/4420 o una cantidad equivalente de DART 2B6/3G8, una molécula que no está dirigida a fluoresceína, por tanto usada como control. La proliferación celular, medida como la incorporación de [3H]-timidina, aumentó con concentraciones crecientes del activador monoclonal anti-CD79b-FITC en ausencia de DART o en presencia del DART 2B6/3G8 de control. La presencia de DART 2B6/4420 dio lugar a una profunda reducción en la proliferación de linfocitos B a todas las concentraciones de anticuerpo anti-CD79b humano-FITC (figura 22, paneles A y B y figura 23, panel A).
No se observó inhibición de la proliferación cuando los linfocitos B recubiertos con CB3.2 sin marcar y activados usando las mismas condiciones experimentales se trataban con DART 2B6/4420, que proporciona su especificidad de diana (figura 23, panel B). Estos datos demuestran que DART 2B6/4420 puede reticular CD32B y el BCR y suministrar una señal inhibidora que puede bloquear la activación celular inducida por el receptor de antígeno. 6.6 DART inmunoterapéutico contra neoplasias de linfocitos B que expresan CD32B
Actualmente, las neoplasias de linfocitos B se tratan usando anticuerpo anti-CD20 Rituxan®. Algunas neoplasias de linfocitos B, sin embargo, no expresan CD20 o llegan a ser resistentes a Rituxan. Los DART de la presente divulgación proporcionan un agente inmunoterapéutico alternativo que puede superar los problemas asociados con el anticuerpo anti-CD20 Rituxan®.
MGD261 es una molécula de redirección de afinidad doble (DART) que se une a hCD32B (mediante el anticuerpo h2B6) y hCD16A y hCD16B (mediante el anticuerpo h3G8).
La eficacia (reducción de linfocitos B) y toxicidad de MGD261 se ensayaron en mCD32-/- hCD16A+ C57B1/6, mCD32-/- hCD32B+ C57B1/6 y mCD32-/- hCD16A+ hCD32B+ C57B1/6. Este experimento de dosis repetida, los ratones recibieron 6 inyecciones IV (dos veces a la semana durante 3 semanas). La reducción de linfocitos B se controló por FACS. La toxicidad se controló por observación dentro de la jaula.
Los datos indican que MGD261 puede reducir los linfocitos B en ratones doble transgénicos sin inducir ningún efecto secundario significativo.
Datos: a ratones mCD32-/- hCD16A+ C57B1/6, mCD32-/- hCD32B+ C57B1/6 y mCD32-/- hCD16A+ hCD32B+ C57B1/6 de la colonia de cría MacroGenics se les inyectó IV en los días 0, 3, 7, 10, 14 y 17 MGD261 (10, 3, 1 o 0,3 mg/kg), o un anticuerpo irrelevante (hE16 10 mg/kg). Se recogió sangre en los días -19 (antes de la exanguinación) 4, 11, 18, 25 y 32 para análisis FACS. La salud del animal y la actividad se registraron tres veces a la semana.
Diseño:
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Método de análisis FACS: Se recogieron muestras de sangre completa a los 18 días antes de la administración de h2B6-h3G8 y 4, 11, 18, 25 y 32 días después del tratamiento. Las muestras de sangre se analizaron para determinar el efecto de h2B6-h3G8 sobre los recuentos de linfocitos B mediante un ensayo basado en FACS. Se usó un protocolo sin lavado para el recuento de linfocitos B, linfocitos T y PMN usando microesferas FlowCount, obtenidas de Beckman Coulter. El panel de anticuerpos usados en el análisis fue 1A8-FITC para PMN, CD3-PE para linfocitos T, CD19-APC para linfocitos B y CD45-PerCP para leucocitos totales.
Resultados
Los ratones tratados con hE16 o MGD261 (a cualquier concentración) no mostraban ningún signo de malestar en ningún momento durante el trascurso de la experimentación.
Se observó reducción de linfocitos B en ratones doble transgénicos para hCD16A y hCD32B. El diacuerpo h2B6-3G8 capta células efectoras que expresan hCD16A y linfocitos B que expresan hCD32B; las captaciones eran necesarias para la eliminación de linfocitos B. No se observó reducción de linfocitos B en ratones con un transgén (figura 24). No hubo cambios significativos para el nivel de linfocitos T y PMN durante el estudio.
Como demostración adicional del agente inmunoterapéutico alternativo descrito en la presente memoria, se construyó un equivalente de MGD261, llamado "2.4G2-3G8 DB". 2.4G2-3G8 DB es una molécula de redirección de afinidad doble (DART) que se une a mCD32B (mediante el anticuerpo 2.4G2) y hCD16A y hCD16B (mediante el anticuerpo h3G8).
La eficacia (reducción de linfocitos B) y toxicidad de 2.4G2-3G8 DB se ensayaron en ratones mCD16-/-, mCD16-/-hCD16A+ C57B1/6, mCD16-/- hCD16B+ y mCD16-/- hCD16A+ hCD16B+. Este experimento de dosis repetida, los ratones recibieron 9 inyecciones IP (tres veces a la semana durante 3 semanas). La reducción de linfocitos B se controló por FACS. La toxicidad se controló por observación dentro de la jaula.
Los datos indican que 2.4G2-3G8 DB puede reducir los linfocitos B en ratones transgénicos para hCD16 sin inducir ningún efecto secundario significativo.
Datos: a ratones mCD16-/-, mCD16-/- hCD16A+ C57B1/6, mCD16-/- hCD16B+ y mCD16-/- hCD16A+ hCD16B+ de la colonia de cría MacroGenics se les inyectó IP en los días 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16 y 18 DB 2.4G2-3G8 (75 ug/ratón), o PBS. Se recogió sangre en los días -10 (antes de la exanguinación) 4, 11 y 18 para análisis FACS. La salud del animal y la actividad se registraron tres veces a la semana.
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Método de análisis FACS: Se recogieron muestras de sangre completa 10 días entes de la administración de 2.4G2-3G8 y 4, 11 y 18 días después del inicio del tratamiento. Las muestras de sangre se analizaron para determinar el efecto de 2.4G2-3G8 sobre los recuentos de linfocitos B mediante un ensayo basado en FACS. Se usó un protocolo sin lavado para el recuento de linfocitos B, linfocitos T y PMN usando tubos TruCOUNT, obtenidos de BD Immunocytometry System. El panel de anticuerpos usados en el análisis fue 1A8-FITC para PMN, CD3-PE para linfocitos T, CD19-APC para linfocitos B y CD45-PerCP para leucocitos totales.
Resultados
Los ratones tratados con hE16 o 2.4G2-3G8 DB no mostraban ningún signo de malestar en ningún momento durante el trascurso de la experimentación.
Se observó reducción de linfocitos B en ratones mCD16-/- hCD16A+ o mCD16-/- hCD16A+ hCD16B+, pero no en ratones mCD16-/-. Estos datos indican que se necesitaban células efectoras que portaran hCD16A para la eliminación de linfocitos B (figura 25). No hubo cambios significativos para el nivel de linfocitos T y PMN durante el estudio.
Modelo intravenoso (IV): La actividad antitumoral de MGD261 se ensayó usando un modelo intravenoso (IV) de la línea celular de tumor humano Raji. Raji es una línea celular humana de linfoma de Burkitt que expresa hCD32B. Cuando se inyectan por vía intravenosa en ratones mCD16-/-, hCD16A+, RAG1-/-, las células tumorales se ubican en la columna y provoca parálisis de las extremidades posteriores.
Los datos indican que MGD261 puede bloquear el crecimiento de células tumorales Raji in vivo en ratones mCD16-/-, hCD16A+, RAG1-/-. Los datos indican que MGD261 puede usarse en el tratamiento de neoplasias de linfocitos B que expresan CD32B en el ser humano.
Datos: A ratones mCD16-/-, hCD16A+, RAG1-/- C57B1/6 de doce-veinte semanas de edad de la colonia de cría MacroGenics se les inyectó IV en el día 05 x 106 células Raji. En los días 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27 y 30 los ratones también se trataron por vía intraperitoneal (IP) con 250, 25 o 2.5 ug de MGD261 o con PBS (control negativo). Los ratones entonces se observaron diariamente y se registró el peso corporal dos veces a la semana. Los ratones que desarrollaban parálisis de las extremidades posteriores se sacrificaron.
Resultados: Los ratones tratados con PBS murieron entre el día 25 y el día 50. Los ratones tratados con MGD261 sobrevivieron hasta el día 90 (figura 26). La supervivencia aumentada es estadísticamente significativa. Una comparación de curvas de supervivencia usando un ensayo del orden logarítmico dio una x2 de 96,46 (df 9; valor P < 0,0001).
6.7 Expresión de DART en procariotas
Se realizaron experimentos para demostrar la capacidad de producir DART en hospedadores que no son mamíferos. Por consiguientes, se transformó Escherichia coli con un plásmido que expresaba DART y se controló la expresión de DART.
Materiales y métodos:
Construcción de plásmidos: 3G8 es un anticuerpo monoclonal humanizado contra HuCD16. El DART descrito aquí consiste en dos cadenas unidas covalentemente, teniendo cada una de ellas un VL seguido de un espaciador, después un VH seguido de una Cys en un buen contexto para formar un enlace disulfuro con la cadena opuesta. La secuencia de DART que codifica 3G8VL-GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly (SEQ ID NO: 10)-3G8VH-LeuGlyGlyCys se amplificó por PCR a partir de una construcción de expresión eucariota existente y se digirió con Nco I y EcoR I. El vector diana fue pET25b (+) (Novagen), que contiene una secuencia líder de pelB para la secreción en E. coli. Antes de la inserción de las secuencias de DART 3G8/3G8, el vector se modificó de la siguiente manera: En primer lugar, el promotor T7 se remplazó por el promotor lac de menor actividad para favorecer la expresión soluble, aunque a menor nivel, de proteínas bajo este control. Adicionalmente, se introdujeron dos mutaciones puntuales para eliminar dos codones internos de Met presentes al principio del sitio de clonación múltiples (MCS) para favorecer el inicio en la Met presente al principio del líder de pelB. El DART que se produce por esta construcción consiste en dos brazos de región V que tienen la misma especificidad, concretamente HuCD16.
Expresión: Las células BL21DE3 (Novagen) se transformaron con el plásmido pET25b(+) T7-lac+ 3G8/3G8 y se usó una colonia resistente a amp para sembrar el caldo de cultivo. Cuando el cultivo alcanzó 0,5 unidades de DO 600, se añadió IPTG 0,5 mM para inducir la expresión. El cultivo se cultivó a 30 °C durante 2 horas y se recogió el medio sin células.
Purificación: El DART 3G8/3G8 se purificó en un proceso de dos etapas utilizando cromatografía de afinidad y de exclusión molecular. El DART se capturó del medio acondicionado usando cromatografía de afinidad. Específicamente, CD16A se acopló a Sepharose 4B activada con CNBr (GE Healthcare). La resina de CD16A-Sepharose se equilibró en Tris/HCl 20 mM, pH 8,0 antes de la carga. Tras completarse la carga, la resina se lavó con tampón de equilibrado antes de la elución del DART unido con glicina 50 mM pH 3,0. El DART eluido se neutralizó inmediatamente con Tris 1 M/HCl pH 8,0 y se concentró usando un concentrador de tipo centrifugación (Vivaspin 20, PES de 10 k de MWCO, VivaScience Inc.). El DART concentrado se purificó adicionalmente por cromatografía de exclusión molecular usando una columna Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada en PBS.
Resultados
Se procesaron 1,7 litros de medio acondicionado de E. coli cultivada a través de la columna de CD16A-Sepharose. El rendimiento de DART fue 0,12 mg. El análisis del DART purificado por SDS-PAGE y SEC demostró equivalencia con el DART de control expresado en células de mamífero (CHO) (figura 27).
ELISA de unión de DART h3G8-h3G8 expresado en E. coli: La expresión del DART h3G8-h3G8 en E. coli se midió usando un ELISA. Se recubrieron 50 pl/pocillo de 2 pg/ml de anticuerpo 2C11 específico de Fv anti-h3G8 en placa Maxisorp de 96 pocillos en tampón carbonato a 4 °C durante una noche. La placa se lavó tres veces con PBS-T (PBS, Tween 20 al 0,1 %) y después se bloqueó por BSA al 0,5 % en PBS-T durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de añadir DART de ensayo. Durante el bloqueo, se diluyó el DART h3G8-h3G8 expresado en E. coli, DART h2B6-h3G8 y DART h2B6-h2B6 (control negativo) en 1 pg/ml y 0,3 pg/ml en PBST/BSA. Se añadieron 50 pl/pocillo de DART diluidos a cada pocillo. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar con PBS-T tres veces, se añadieron 50 pl/pocillo de 0,1 pg/ml de fusión de sCD16-Fc biotinilada a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar con PBS-T tres veces, se usaron 50 pl/pocillo de una dilución 1:5000 de HRP conjugada con estreptavidina (Amersham Pharmacia Biotech) para la detección y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lavó con PBS-T tres veces y se reveló usando 80 ul/pocillo de sustrato TMB. Después de 5 minutos de incubación, la reacción se detuvo mediante 40 pl/pocillo de H2SO4 al 1 %. La DO 450 nm se leyó usando un lector de placa de 96 pocillos y el programa informático SOFTmax. La lectura se representó usando el programa informático GraphPadPrism 3.03 (figura 28).
6.8 Muerte de linfocitos B humanos inducida por DART
Se incubaron PBMC humanos durante una noche con: CD16-CD32B - hu3G8-hu2b6 (descrito anteriormente); anticuerpo 2B6 quimérico aglucosilado - ch2B6-agluc (descrito en la solicitud de patente de Estados Unidos en trámite junto con la presente publicada como US2005/0260213) y CD16-CD79. Las secuencias de ADN y proteína codificada de CD16-CD79 son las siguientes:
H3G8VL-CB3.1VH
Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 226):
gacatcgtga tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga 50
gagggccacc atcaactgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg 100
atagttttat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc 150
ctcatctata ctacatccaa tctagaatct ggggtcccag acaggtttag 200
tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcagc agcctgcagg 250
ctgaggatgt ggcagtttat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300
acgttcggac aggggaccaa gcttgagatc aaaggaggcg gatccggagg 350
cggaggccag gtccaactgc agcagcctgg ggctgagctg gtgaggcctg 400
gggcttcagt gaagctgtcc tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc 450
tactggatga actgggtgaa gcagaggcct ggacaaggcc ttgaatggat 500
tggtatggtt gatccttcag acagtgaaac tcactacaat caaatgttca 550
aggacaaggc cacattgact gttgacaaat cctccagcac agcctacatg 600
cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag 650
agctatgggc tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctcagttg 700
agcccaaatc ttgt 714
Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 227):
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL 50
LIYTTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSNEDPY 100
TFGQGTKLEI KGGG3GGGGQ VQLQQPGAEL VRPGASVKLS CIÍASGYTFTS 150
YWMNWVKQRP GQGLEWIGMV DPSDSETHYN QMFKDKATLT VDKSSSTAYM 200
QLSSLTSEDS AVYYCARAMG YWGQGTSVTV SSVEPKSC 238
CB3.1VL-h3G8VH
Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 228):
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca 50
accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100
gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150
cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200
cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250
aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350
aggcggaggc caggttaccc tgagagagtc tggccctgcg ctggtgaagc 400
ccacacagac cctcacactg acttgtacct tctctgggtt ttcactgagc 450
acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt cagcctcccg ggaaggctct 500
agagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgacaagcgc tataatccag 550
ccctgaagag ccgactgaca atctccaagg atacctccaa aaaccaggta 600
gtcctcacaa tgaccaacat ggaccctgtg gatactgcca catactactg 650
tgctcaaata aaccccgcct ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg 700
tcactgtgag ctcattcaac aggggagagt gt 732
Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 229):
DWMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLLDTDGKTYLNW LLQRPGQSPN 50
RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKISRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100
LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG QVTLRESGPALVKPTQTLTL TCTFSGFSLS 150
TSGMGVGWIR QPPGKALEWL AHIWWDDDKRYNPALKSRLT ISKDTSKNQV 200
VLTMTNMDPV DTATYYCAQl NPAWFAYWGQGTLVTVSSFN RGEC 244
La apoptosis se ensayó por análisis FACS como el porcentaje de la población PI+Anexina-V+ de linfocitos B (células CD20+) en la población total no seleccionada FSC/SSC. Figura 29).
6.9 DART 8B5-CB3.1
8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC
Se amplificó 8B5VL usando H9 e lgh630R como cebadores, ch8B5Lc como molde. Se amplificó CB3.1VH usando lgh628F e lgh629R como cebadores, ch8B5Hc como molde. La secuencia conectora se incorporó en los cebadores lgh630R e lgh628F. El conector del extremo C y el codón de parada se incorporaron en el cebador lgh629R. Los productos de PCR se purificaron en gel y se mezclaron juntos en la misma relación molar, después se amplificaron usando H9 e lgh629R como cebadores. El producto de PCR solapado entonces se digirió con endonucleasas de restricción NheI/EcoRI, y se clonó en vector pCIneo.
CB3.1VL-8B5VH-FNRGEC
Se amplificó CB3.1VL usando H9 e lgh630R, que compartían la misma secuencia que 8B5VL en FR4, como cebadores, y chCB3.1 Lc como molde. Se amplificó 8B5VH usando lgh631 F e lgh640R como cebadores, y ch8B5Hc como molde. La secuencia conectora se incorporó en los cebadores lgh630R e Igh631 F. El conector del extremo C y el codón de parada se incorporaron en el cebador lgh640R. Los productos de PCR se purificaron en gel y se mezclaron juntos en la misma relación molar, después se amplificaron usando H9 e lgh640R como cebadores. El producto de PCR solapado entonces se digirió con endonucleasas de restricción NheI/EcoRI, y se clonó en vector pCIneo.
Marca antiflag-8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC
La marca antiflag se insertó entre la secuencia señal y 8B5VL por PCR solapante. La secuencia señal y la marca flag se amplificaron usando H9 e lgh647R como cebadores y ch8B5Lc como molde. Se volvió a amplificar 8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC usando lgh647F e lgh629R como cebadores y 8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC como molde. Los productos de PCR se purificaron en gel y se mezclaron juntos en la misma relación molar, después se amplificaron usando H9 e lgh629R como cebadores. El producto de PCR solapado entonces se digirió con endonucleasas de restricción NheI/EcoRI, y se clonó en vector pCIneo.
8B5VL-CB3.1VH-LGGC
Para generar un conector en el extremo C diferente en la construcción 8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC, la construcción se volvió a amplificar usando H9 e lgh646R como cebadores. El conector LGGC del extremo C se integró en el cebador lgh646R. El producto de PCR entonces se digirió con endonucleasas de restricción NheI/EcoRI, y se clonó en vector pCIneo.
CB3.1VL-8B5VH-LGGC
Se usó la misma estrategia para crear CB3.1VL-8B5VH-LGGC. El conector LGGC del extremo C se integró en el cebador lgh648R y CB3.1VL-8B5VH-FNRGEC se usó como molde. El producto de PCR entonces se digirió con endonucleasas de restricción NheI/EcoRI, y se clonó en vector pCIneo.
Marca antiflag-8B5VL-CB3.1VH-LGGC
Se usó también la misma estrategia para crear marca antiflag-8B5VL-CB3.1VH-LGGC. El conector LGGC del extremo C se integró en el cebador lgh648R y marca antiflag-8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC se usó como molde. El producto de PCR entonces se digirió con endonucleasas de restricción NheI/EcoRI, y se clonó en vector pCIneo. Secuencia de nucleótidos de 8B5-CB3.1-VEPKSC (SEQ ID NO: 230):
gacattcaga tgacacagtc tccatcctcc ctacttgcgg cgctgggaga 50
aagagtcagt ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100
gctggcttca gcagaaacca gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc 150
gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa aggttcagtg gcagtgagtc 200
tgggtcagat tattctctca ccatcagcag tcttgagtct gaagattttg 250
cagactatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350
ccaactgcag cagcctgggg ctgagctggt gaggcctggg gcttcagtga 400
agctgtcctg caaggcttct ggctacacct tcaccagcta ctggatgaac 450
tgggtgaagc agaggcctgg acaaggcctt gaatggattg gtatggttga 500
tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacaaggcca 550
cattgactgt tgacaaatcc tccagcacag cctacatgca gctcagcagc 600
ctgacatctg aggactctgc ggtctattac tgtgcaagag ctatgggcta 650
ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcagttgag cccaaatctt 700
gt 702
Secuencia de aminoácidos de 8B5-CB3.1-VEPKSC (SEQ ID NO: 231):
DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTCRASQEIS GYLSWLQQKP DGTIKRLIYA 50
ASTLDSGVPK RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYCLQ YFSYPLTFGA 100
GTKLELKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKAS GYTFTSYWMN 150
WVKQRPGQGL EWIGMVDPSD SETHYNQMFK DKATLTVDKS SSTAYMQLSS 200
LTSEDSAVYY CARAMGYWGQ GTSVTVSSVE PKSC 234
Secuencia de nucleótidos de CB3.1-8B5-FNRGEC (SEQ ID NO: 232):
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca 50
accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100
gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150
cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200
cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250
aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350
aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400
ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450
gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500
ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550
agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600
gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650
ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700
tctcctcgtt caacagggga gagtgt 726
Secuencia de aminoácidos de CB3.1-8B5-FNRGEC (SEQ ID NO: 233):
DWMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN 50
RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100
LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCEASGFTFS 150
DAWMDWVRQS PEKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDSK5S 200
VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA LGLDYWGQGT TLTVSSFNRG EC 242
8B5VL-CB3.1VH-LGGC
Se amplificó 8B5VL usando H9 e lgh694R como cebadores, ch8B5Lc como molde. Se amplificó 8B5VH usando lgh695F e lgh696R como cebadores, ch8B5Hc como molde. La secuencia conectora se incorporó en los cebadores lgh694R e lgh695F. Se amplificó HuIgG1 Fc usando lgh355F e lgh366R como cebadores, ch8B5Hc como molde. Los productos de PCR se purificaron en gel y se mezclaron juntos en la misma relación molar, después se amplificaron usando H9 e lgh366R como cebadores. El producto de PCR solapado entonces se digirió con endonucleasas de restricción NheI/EcoRI, y se clonó en vector pCIneo.
Secuencia de nucleótidos de 8B5VL-CB3.1VH-LGGC (SEQ ID NO: 234):
gacattcaga tgacacagtc tccatcctcc ctacttgcgg cgctgggaga 50
aagagtcagt ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100
gctggcttca gcagaaacca gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc 150
gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa aggttcagtg gcagtgagtc 200
tgggtcagat tattctctca ccatcagcag tcttgagtct gaagattttg 250
cagactatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350
ccaactgcag cagcctgggg ctgagctggt gaggcctggg gcttcagtga 400
agctgtcctg caaggcttct ggctacacct tcaccagcta ctggatgaac 450
tgggtgaagc agaggcctgg acaaggcctt gaatggattg gtatggttga 500
tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacaaggcca 550
cattgactgt tgacaaatcc tccagcacag cctacatgca gctcagcagc 600
ctgacatctg aggactctgc ggtctattac tgtgcaagag ctatgggcta 650
ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696
Secuencia de aminoácidos de 8B5VL-CB3.1VH-LGGC (SEQ ID NO: 235):
DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTCRASQEISGYLSWLQQKP DGTIKRLIYA 50
ASTLDSGVPK RFSGSESGSD YSLTISSLESEDFADYYCLQ YFSYPLTFGA 100
GTKLELKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPGASVKLSCKAS GYTFTSYWMN 150
WVKQRPGQGL EWIGMVDPSD SETHYNQMFKDKATLTVDKS SSTAYMQLSS 200
LTSEDSAVYY CARAMGYWGQ GTSVTVSSLGGC 232
Secuencia de nucleótidos de CB3.1-8B5-LGGC (SEQ ID NO: 236):
gatgttgtga tgacccagactccactcact ttgtcggtta acattggaca 50
accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100
gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150
cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200
cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250
aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350
aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400
ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450
gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500
ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550
agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600
gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650
ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700
tctcctcgct gggaggctgc 720
Secuencia de aminoácidos de CB3.1-8B5-LGGC (SEQ ID NO: 237):
DWMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNWLLQRPGQSPN 50
RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGIYYCWQGTHFP 100
LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG EVKLEESGGG LVQPGGSMKLSCEASGFTFS 150
DAWMDWVRQS PEKGLEWVñE IRNKAKNHAT YYAESVIGRFTISRDDSKSS 200
VYLQMNSLRAEDTGIYYCGALGLDYWGQGT TLTVSSLGGC 240
Cebadores:
Lgh628F (SEQ ID NO: 238):
ggaggcggat ccggaggcgg aggccaggtc caactgcagc agcctgg 47
Lgh629R (SEQ ID NO: 239):
tttgaattct aacaagattt gggctcaact gaggagacgg tgactgagg 49
Lgh630R (SEQ ID NO: 240):
gcctccgcct ccggatccgc ctcctttcag ctccagcttg gtccc 45
Lgh631 F (SEQ ID NO: 241):
ggaggcggat ccggaggcgg aggcgaagtg aagcttgagg agtctgg 47
Lgh640R (SEQ ID NO: 242):
tttgaattct aacactctcc cctgttgaac gaggagactg tgagagtgg 49
Lgh644R (SEQ ID NO: 243):
tttgtcgtca tcatcgtctt tgtagtcgga gtggacacct gtggagag 48
Lgh646R (SEQ ID NO: 244):
tttgaattct agcagcctcc cagtgaggag acggtgactg ag 42
Lgh647F (SEQ ID NO: 245):
caaagacgat gatgacgaca aagacattca gatgacacag tctcc 45
Lgh648R (SEQ ID NO: 246):
tttgaattct agcagcctcc cagcgaggag actgtgagag tgg 43
Expresión: La construcción 5 y 6, o 6 y 7, o 8 y 9, o 9 y 10, codificadas en plásmidos de expresión (figura 30) se contransfectaron en células HEK-293 para que expresaran DART 8B5-CB3.1 con o sin marca antiflag usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). El medio acondicionado se recogió cada tres días por tres veces. El medio acondicionado entonces se purificó usando columna de afinidad por CD32B.
ELISA: El ELISA se realizó de la siguiente manera: Se recubrieron 50 gl/pocillo de 2 ug/ml de CD32B-Fc en placa Maxisorp de 96 pocillos en tampón carbonato a 4 °C durante una noche. La placa se lavó tres veces con PBS-T (PBS, Tween 20 al 0,1 %) y después se bloqueó por BSA al 0,5 % en PBS-T durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de añadir proteína de fusión de Fc monocatenaria de ensayo. Durante el bloqueo, se diluyó el DART 8B5-CB3.1 en una dilución de factor dos empezando a 2 gg/ml. Se transfirieron 25 gl/pocillo de DART diluido mezclado con 25 gl/pocillo de 50 ng/ml de ch8B5 de la placa de dilución a la placa de ELISA. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar con PBS-T tres veces, se añadieron 50 gl/pocillo del F(ab')2 de cabra anti-F(ab')2 de IgG humano conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch) diluido 1:10000 a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lavó con PBS-T tres veces y se reveló con 80 gl/pocillo de sustrato TMB. Después de 5 minutos de incubación, la reacción se detuvo mediante 40 gl/pocillo de H2Sü 4 al 1 %. La DO 450 nm se leyó usando un lector de placa de 96 pocillos y el programa informático SOFTmax. La lectura se representó usando el programa informático GraphPadPrism 3.03 (figura 31).
6.10 Diseño y caracterización de DART tetravalente de tipo Ig
Se emplearon cuatro cadenas polipeptídicas para producir una especie de DART de tipo Ig que tiene sitios tetravalentes de unión a antígeno (figura 32; figura 33). La especie de DART de tipo Ig tiene propiedades únicas, ya que sus dominios pueden diseñarse para que se unan al mismo epítopo (para formar un DART de tipo Ig tetravalente, específico para un epítopo que puede unirse a cuatro moléculas antigénicas idénticas), o a diferentes epítopos o antígenos. Por ejemplo, sus dominios pueden diseñarse para que se unan a dos epítopos del mismo antígeno (para formar un DART de tipo Ig tetravalente, específico para un antígeno, específico para dos epítopos), o a epítopos de diferentes moléculas antigénicas para formar un DART de tipo Ig tetravalente que tiene un par de sitios de unión específicos para un primer antígeno y un segundo par de sitios de unión específicos para un segundo antígeno). Pueden producirse fácilmente moléculas híbridas que tienen combinaciones de dichos tributos.
Para ilustrar las características de dicha especie de DART de tipo Ig, se produjo una especie de DART de tipo Ig tetravalente ejemplar que tiene un par de sitios de unión específicos para CD32 y un segundo par de sitios de unión específicos para CD16A. Esta especie de DART de tipo Ig se produjo usando las cuatro siguientes cadenas polipeptídicas:
Secuencia de nucleótidos de 2.4G2-3G8-hKappa
(SEO ID NO: 247):
gatgtccaga tgacccagtc tccatctaat cttgctgcct ctcctggaga 50
aagtgtttcc atcaattgca aggcaagtga gagcattagc aagtatttag 100
cctggtatct acagaaacct gggaaagcaa ataagcttct tatgtacgat 150
gggtcaactt tgcaatctgg aattccatcg aggttcagtg gcagtggatc 200
tggtacagat ttcactctca ccatcagaag cctggagcct gaagattttg 250
gactctatta ctgtcaacag cattatgaat atccagccac gttcggttct 300
gggaccaagc tggagatcaa aggaggcgga tccggaggcggaggccaggt 350
taccctgaaa gagtctggcc ctgggatatt gcagccctcc cagaccctca 400
gtctgacttg ttctttctct gggttttcac tgaggacttc tggtatgggt 450
gtaggctgga ttcgtcagcc ttcagggaag ggtctagagt ggctggcaca 500
catttggtgg gatgatgaca agcgctataa tccagccctg aagagccgac 550
tgacaatctc caaggatacc tccagcaacc aggtattcct caaaatcgcc 600
agtgtggaca ctgcagatac tgccacatac tactgtgctc aaataaaccc 650
cgcctggttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtgagctcac 700
tgggaggctg cggcggaggg agccgtacgg tggctgcacc atcggtcttc 750
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt 800
gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg 850
tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag 900
gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa 950
agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg 1000
gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggagagtgt 1044
Secuencia de aminoácidos codificada de 2.4G2-3G8-hKappa
(SEQ ID NO: 248):
DVQMTQSPSN LAASPGESVS INCKASESIS KYLAWYLQKP GKANKLLMYD 50
GSTLQSGIPS RFSGSGSGTDFTLTIRSLEP EDFGLYYCQQ HYEYPATFGS 100
GTKLEIKGGG SGGGGQVTLKESGPGILQPS QTLSLTCSFS GFSLRTSGMG 150
VGWIRQPSGK GLEWLAHIWWDDDKRYNPAL KSRLTISKDT SSNQVFLKIA 200
SVDTADTATY YCAQINPAWFAYWGQGTLVTVSSLGGCGGG SRTVAAPSVF 250
IFPPSDEQLK SGTASWCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ 300
DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC 350
Secuencia de nucleótidos de 3G8-2.4G2-hG1
(SEQ ID N f : 249):
gacactgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca 50
gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg 100
atagttttat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc 150
ctcatctata ctacatccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag 200
tgccagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg 250
aggaggatac tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaaggaggcg gatccggagg 350
cggaggcgag gtggagctag tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg 400
gaaggtccct gaaactctcg tgtgcagcct caggattcac tttcagtgac 450
tattacatgg cctgggtccg gcaggctcca acgacgggtc tggagtgggt 500
cgcatccatt agttatgatg gtggtgacac tcactatcga gactccgtga 550
agggccgatt tactatttcc agagataatg caaaaagcag cctatacctg 600
caaatggaca gtctgaggtc tgaggacacg gccacttatt actgtgcaac 650
agagactacg ggaataccta caggtgttat ggatgcctgg ggtcaaggag 700
tttcagtcac tgtctcctca ctgggaggct gcggcggagg gagcgcctcc 750
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc 800
tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac 850
cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc 900
ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt 950
gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga 1000
atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct 1050
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg 1100
gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga 1150
tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 1200
gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa 1250
tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg 1300
tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1350
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat 1400
ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc 1450
catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1500
aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca 1550
gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct 1600
ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1650
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta 1700
cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa 1734
Secuencia de aminoácidos codificada de 3G8-2.4G2-hG1
(SEQ ID NO: 250):
DTVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL50
LIYTTSNLES GIPARFSASG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YCQQSNEDPY100
TFGGGTKLEI KGGG3GGGGE VELVESGGGL VQPGRSLKLS CAASGFTFSD150
YYMAWVRQAP TTGLEWVASI
Figure imgf000119_0001
SYDGGDTHYR DSVKGRFTIS RDNAKSSLYL200
QMDSLRSEDT ATYYCATETT GIPTGVMDAW GQGVSVTVSS LGGCGGGSAS250
TKGPSVFPLA P5SKSTSGGT
Figure imgf000119_0002
AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT300
FPAVLQSSGL YSLSSWTVP
Figure imgf000119_0003
SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS350
CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE 400
DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
Figure imgf000119_0004
HQDWLNGKEY450
KCKVSNKALP APIEKTISKA
Figure imgf000119_0005
KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV500
KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ550
GNVF5CSVMH EALHNHYTQK 3LSL3PGK 578
Se obtuvieron preparaciones de moléculas DART de tipo Ig que tienen las secuencias anteriores a partir de diferentes aislados plasmídicos y se denominaron "Ig DART 1" e "Ig DART 2". La capacidad de estas especies de DART de tipo Ig de unirse a mCD32-hCD16A en un ELISA se comparó con la de medio en solitario, un DART que tiene un solo sitio de unión a CD32 y un solo sitio de unión a CD16A ("DART"), y mAb anti-ch-mCD32 de control (figura 34). Se descubrió que el DART de tipo Ig de la presente divulgación tenía afinidad de unión a antígeno mucho mayor que el DART o el anticuerpo de control.
6.11 Diseño y caracterización de diacuerpos biespecíficos para CD32B-CD79-1 y CD32B-CD79-2
Los genes que codifican CD79VL-CD32BVH (secuencia 1), CD32BVL-CD79VH-1 (secuencia 2) y CD32BVL-CD79VH-2 (secuencia 3) se clonaron en el vector de expresión pEE13 que provoca la expresión de las construcciones 1,2 y 3, respectivamente. El plásmido de expresión de la construcción 1 se cotransfectó junto con el plásmido de expresión 2 o 3 en células HEK-293 para generar los diacuerpos biespecíficos para CD32B-CD79-1 y CD32B-CD79-2, respectivamente. El medio acondicionado se recogió cada tres días por tres veces. El medio acondicionado entonces se purificó usando columna de afinidad por CD32B.
El ELISA se realizó de la siguiente manera: Se recubrieron 50 pl/pocillo de 2 pg/ml de CD32B-Fc en placa Maxisorp de 96 pocillos en tampón carbonato a 4 °C durante una noche. La placa se lavó tres veces con PBS-T (PBS, Tween 20 al 0,1 %) y después se bloqueó por BSA al 0,5 % en PBS-T durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de añadir proteína de fusión de Fc monocatenaria de ensayo. Durante el bloqueo, se diluyó el diacuerpo biespecífico para CD32B-CD79-1 o CD32B-CD79-2 en una dilución de factor dos empezando a 2 pg/ml. Se mezclaron 25 pl/pocillo del diacuerpo biespecífico diluido con 25 pl/pocillo de 50 ng/ml de anticuerpo anti-CD32B y se añadieron a una placa de ELISA. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar con PBS-T tres veces, se añadieron 50 pl/pocillo del F(ab')2 de cabra anti-F(ab')2 de IgG humano conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch) diluido 1:10000 a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lavó con PBS-T tres veces y se reveló con 80 pl/pocillo de sustrato TMB. Después de 5 minutos de incubación, la reacción se detuvo mediante 40 pl/pocillo de H2SO4 al 1 %. La DO 450 nm se leyó usando un lector de placa de 96 pocillos y el programa informático SOFTmax. La lectura se representó usando el programa informático GraphPadPrism 3.03. El experimento reveló que los diacuerpos específicos para CD32B-CD79-1 y CD32B-CD79-2 podían unirse inmunoespecíficamente a CD32-Fc con una afinidad equivalente a la del anticuerpo de control anti-CD32B. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos codificadas de las construcciones descritas anteriormente se proporcionan a continuación:
Secuencia 1 - secuencia de nucleótidos de CD79VL-CD32BVH
(SEO ID NO: 251):
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50
gccggcctcc atotcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100
gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150
cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200
cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250
aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300
ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350
aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400
ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450
gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500
ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550
agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600
gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650
ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700
tctcctcgct gggaggctgc 720
Secuencia 2 - secuencia de aminoácidos de CD79VL-CD32BVH
(SEQ ID NO: 252):
DWMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYYCWQGTHFP 100
LTFGGGTKLE IKGGG3GGGGEVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150
DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200
LYLQMNSLRAEDTAVYYCGALGLDYWGQGT LVTVSSLGGC 240
Secuencia 3 - secuencia de nucleótidos de CD32BVL-CD79VH-1
(SEQ ID NO: 253):
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50
tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100
gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150
gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200
tgggacogag ttoaccctca ccatcagcag ccttcagoct gaagattttg 250
caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300
gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350
tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400
aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500
tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacagagtca 550
ccatgaccac agacacatcc acgagoacag cctacatgga gctgaggagc 600
ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650
ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696
Secuencia 4 - secuencia de aminoácidos de CD32BVL-CD79VH-1
(SEQ ID NO: 254):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV GSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQMFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC 232
Secuencia 5 - secuencia de nucleótidos de CD32BVL-CD79VH-2
(SEQ ID NO: 255):
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50
tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100
gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150
gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200
tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250
caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300
gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350
tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400
aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500
tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca 550
ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600
ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650
ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696
Secuencia 6 - secuencia de aminoácidos de CD32BVL-CD79VH-2
(SEQ ID NO: 256):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC 232
6.12 Construcción y optimización de diacuerpos bifuncionales H8B5-HBCRC
Se construyó un diacuerpo que contiene regiones variables que pueden unirse a CD32 y el complejo receptor de linfocitos B ("BCRC").
Clonación. Las construcciones se construyeron usando PCR convencional/PCR solapante:
h8B5VL-G3SG4-hBCRCVH M48I-LGGC:
Se amplificó un 8B5 VL completamente humanizado (que reconoce CD32) usando lgh321F e lgh788R como cebadores. Se amplificó hBCRCVH M48I usando lgh784F e lgh386R como cebadores. Los productos de PCR se purificaron en gel y se mezclaron juntos y se amplificaron usando lgh321F e lgh386R. El fragmento de PCR solapante entonces se clonó en pEE6 en el sitio XbaI-EcoRI. "G3SG4" es un conector que tiene la secuencia: GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10).
hBCRCVL R45N-G3SG4-h8B5VH-LGGC
Se amplificó el hBCRCVL R45N usando lgh321F e lgh785R como cebadores. Se amplificó el h8B5VH usando lgh787F e lgh786R como cebadores. Los productos de PCR se purificaron en gel y se mezclaron juntos y se amplificaron usando lgh321F e lgh786R. El fragmento de PCR solapante entonces se clonó en pEE13 en el sitio XbaI-EcoRI.
Construcción de vector individual. El pEE6hHBCRCVL R45N-h8B5VH se digirió en los sitios Bgl II-Sal I y se purificó un fragmento de 3,3 kb y se insertó en pEE13 hHBCRCVL 45N-h8B5VH en sitios BamHI-SalI. Bgl II y BamH I comparten extremos cohesivos compatibles. La secuencia del DART y los cebadores para construir el DART se representan a continuación:
Secuencia de nucleótidos de hHBCRCVL. R45N-h8B5VH-LGGC
(SEQ ID NO: 257):
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50
gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100
gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150
cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200
cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250
aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300
ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350
aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400
ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450
gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500
ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550
agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600
gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650
ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700
tctcctcgct gggaggctgc 720
Secuencia de aminoácidos de hHBCRCVL. R45N-h8B5VH-LGGC
(SEQ ID NO: 258):
DWMTQSPLS LPVTLGQPAS
Figure imgf000122_0001
ISCKSSQSLLDSDGKTYLNWFQQRPGQSPN 50
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS
Figure imgf000122_0002
G3GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFP 100
LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG
Figure imgf000122_0003
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 150
DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHATYYAESVIGRFTISRDDAKNS 200
LYLQMNSLRñ EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC 240
Secuencia de nucleótidos de H8B5VL-hHBCRCVH M48I-LGGC
(SEQ ID NO: 259):
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50
tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100
gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150
gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200
tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250
caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300
gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350
tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400
aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500
tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacagagtca 550
ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600
ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650
ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696
Secuencia de aminoácidos de H8B5VL-HBCRCVH M48I-LGGC
(SEQ ID NO: 260):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKPGKAPRRLIYA 50
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQYFSYPLTFGG 100
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQMFKDRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLGGC 232
Cebador Lgh321 F (SEQ ID NO: 261):
cgagctagct ctagatgaga tcacagttct ctctac 36
Cebador Lgh386R (SEQ ID NO: 262):
tttgaattct agcagcctcc cagtgaggag acggtgaccg tggtc 45
Cebador Lgh784F (SEQ ID NO: 263):
ggcggatccg gaggcggagg ccaggttcag ctggtgcag 39
Cebador Lgh785R (SEQ ID NO: 264):
cctccggatc cgcctccttt gatctcaagc ttggtccc 38
Cebador Lgh786R (SEQ ID NO: 265):
tttgaattct agcagcctcc caggctggag acggtcacca gg 42
Cebador Lgh787F (SEQ ID NO: 266):
ggaggcggat ccggaggcgg aggcgaagtg cagcttgtgg agtc 44
El plásmido de expresión de Hu3G8VL1-G3SG4-Hu2B6VH 4-LGGC se cotransfectó con Hu2B6VL5-G3SG4-Hu3G8VH5-LGGC en células HEK-293 para generar el diacuerpo biespecífico Hu2B64.5-Hu3G8 5.1 que reconoce CD32 y CD79. Al mismo tiempo, Hu2B6VL 5-G3SG4-Hu2B6VH 4-LGGC y Hu3G8VL 1-G3SG4-Hu3G8VH 5-LGGC se transfectaron individualmente en células HEK-293 para generar diacuerpo Hu2B64.5 y Hu3G85.1. Después de tres días en cultivo, el medio acondicionado se recogió y se caracterizó por ELISA de unión. El resultado de este experimento se representa en la figura 36.
Diseño experimental: Se recubrieron 100 ng/pocillo de FcRIIb-G2-agluc soluble en placa Maxisorp de 96 pocillos en tampón carbonato a 40 °C durante una noche. La placa se lavó tres veces con PBS/Tween 20 al 0,1 % y después se bloqueó mediante BSA al 0,5 % en PBS/Tween 20 al 0,1 % durante 30 min a temperatura ambiente antes de añadir diacuerpos. Se añadió una serie de dilución de factor dos de medio acondicionado de diacuerpo biespecífico Hu2B6 4.5-Hu3G8 5.1, diacuerpo Hu2B6 4.5 y diacuerpo hu3G8 5.1 empezando desde 25 ng/pocillo a cada pocillo. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar con PBS/Tween 20 al 0,1 % tres veces, se añadieron 10 ng/pocillo de FcRIIIa-G2-Biotina a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar con PBS/Tween 20 al 0,1 % tres veces, se usaron 50 ul de dilución 1:5000 de HRP conjugada con estreptavidina (Amersham Pharmacia Biotech) para la detección. Después de 45 minutos de incubación a temperatura ambiente, la placa se lavó con PBS/Tween 20 al 0,1 % tres veces y se reveló usando sustrato TMB. Después de 10 minutos de incubación, la reacción se detuvo mediante H2SO4 al 1 %. La DO 450 nm se leyó mediante el programa SOFTmax. La lectura se representó usando el programa informático GraphPadPrism 3.03.
6.13 Construcción de diacuerpos IgDART
Se construyeron diacuerpos IgDART que contienen regiones variables que pueden unirse a CD32 y complejo receptor de linfocitos B ("BCRC"). El primer diacuerpo empleó un conector LGGCGGGS (SEQ ID NO: 267) entre las secuencias VH y las secuencias Fc de la molécula. El segundo diacuerpo empleó un conector LEIK que tiene la secuencia: LEIK (SEQ ID NO: 268) o un conector TVSS que tiene la secuencia TVSS (SEQ ID NO: 269). Las secuencias de las cadenas de estos diacuerpos y polinucléotidos codificantes se muestran a continuación:
H8B5VL-hBCRCVH M48I, M62K_LGGCG3S_hKappa
(SEQ ID NO: 270):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEISGYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQPEDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFKDRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLGGCGGGSRTVA APSVFIFPPS 250
DEQLKSGTAS WCLLNWFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDS 300
TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC 343
Las secuencias H8B5VL se fusionan a las secuencias hBCRCVH mediante el conector GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10) ubicado en la posición 108-115. Las secuencias hBCRCVH se fusionan a las secuencias Fc mediante el conector LGGCGGGS (SEQ ID NO: 267) ubicado en la posición 229-236 (ambas mostradas subrayadas anteriormente). El polinucleótido que codifica la secuencia H8B5VL-hBCRCVH M48I, M62K_LGGCG3S_hKappa es:
(SEQ ID NO: 271):
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50
tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100
gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150
gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200
tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250
caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300
gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaqgt 350
tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400
aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500
tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca 550
ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600
ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650
ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggqa qqctqcqqcq 700
gagggagccg aactgtggct gcaccatcgg tcttcatctt cccgccatct 750
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa 800
cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc 850
aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 900
acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa 1000
acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg 1050
tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 1082
donde las secuencias que codifican los conectores: GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10) y LGGCGGGS (SEQ ID NO: 267) están ubicadas en la posición 322-345 y 685-708, respectivamente (ambas mostradas subrayadas anteriormente).
HBCRCVL R45N-h8B5VH LGGCGGGS-hGI
(SEQ ID NO: 272):
DWMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100
LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150
DAKMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200
LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC GGGSASTKGP 250
SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV 300
LQSSGLYSLS SWTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSKTKVDK RVEPKSCDKT 350
HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW VDVSHEDPEV 400
KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV 450
SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY 500
PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF 550
SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK 574
Las secuencias hBCRCVL se fusionan a las secuencias H8B5VH mediante el conector GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10) ubicado en la posición 113-120. Las secuencias H8B5VH se fusionan a las secuencias Fc mediante el conector LGGCGGGS (SEQ ID NO: 267) ubicado en la posición 237-244 (ambas mostradas subrayadas anteriormente). El polinucleótido que codifica la secuencia HBCRCVL R45N-h8B5VH_LGGCGGGS-hGl es:
(SEQ ID NO: 273):
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50
gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100
gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150
cgcctaattt atctggtgto taaactggao tctggggtcc cagacagatt 200
cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250
aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300
ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350
aqqcqqaqqc gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400
ctggaggatc cctgagactc tcttgtgccg cctctggatt cacttttagt 450
gacgcctgga tggactgggt ccgtcaggcc ccaggcaagg ggcttgagtg 500
ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550
agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgacgc caaaaacagt 600
ctgtacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg ccgtgtatta 650
ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc ctggtgaccg 700
tctccagcct gggaggctgc ggcggaggga gcgcctccac caagggccca 750
tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc 800
ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt 850
cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 900
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc 950
cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca 1000
gcaacaccaa ggtggacaag agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 1050
cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt 1100
cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc 1150
ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 1200
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa 1250
gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca 1300
ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1350
tccaacaaag coctcooago ccccatcgag aaaaccatct ccaaagocaa 1400
agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg 1450
agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1500
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa 1550
ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct 1600
acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1650
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag 1700
cctctccctg tctccgggta <3- 3. 1722
donde las secuencias que codifican los conectores: GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10) y LGGCGGGS (SEQ ID NO: 267) están ubicadas en la posición 337-360 y 709-732, respectivamente (ambas mostradas subrayadas anteriormente).
H8B5VL-HBCRCVH M48I, M62K_(-4)LEIK_hKappa
(SEQ ID NO: 274):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA. 50
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP edfatyyclq YFSYPLTFGG 100
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVLEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT 250
ASWCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL 300
TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC 335
Las secuencias H8B5VL se fusionan a las secuencias HBCRCVH mediante el conector GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10) ubicado en la posición 108-115. Las secuencias HBCRCVH se fusionan a las secuencias Fc mediante el conector LEIK (SEQ ID NO: 268) ubicado en la posición 225-228 (ambas mostradas subrayadas anteriormente). El polinucleótido que codifica la secuencia H8B5VL-HBCRCVH M48I, M62K_(-4)LEIK_hKappa es:
(SEO ID NO: 275):
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50
tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100
gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150
gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200
tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250
caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300
gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaqqt 350
tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400
aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500
tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca 550
ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600
ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650
ctgggggcaa gggaccacgg tcctggagat caagcqaact gtggctgcac 700
catcggtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 750
gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt 800
acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg 850
tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 900
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt 950
cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag 1000
agtgt 1005
donde las secuencias que codifican los conectores: GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10) y LEIK (SEQ ID NO: 268) están ubicadas en la posición 322-345 y 673-684, respectivamente (ambas mostradas subrayadas anteriormente).
HBCRCVL R45N-h8B5VH_(-4)TVSS-hG1 = HBCRCVL R45N-h8B5VH_-hG1
(SEQ ID NO: 276):
DWMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLLDSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100
LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150
DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHATYYAESVIGRF TISRDDAKNS 200
LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPS 250
SKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYS 300
LSSWTVPSS SLGTQTYICN VWHKPSNTKV DKRVEPKSCD KTHTCPPCPA 350
PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTCVWDVSHEDP EVKFNWYVDG 400
VEVHNAKTKP REEQYNSTYR WSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAP 450
IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEW 500
E3NGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEA 550
LHNHYTQKSL SLSPGK 566
Las secuencias HBCRCVL se fusionan a las secuencias h8B5VH mediante el conector GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10) ubicado en la posición 113-120. Las secuencias h8B5VH se fusionan a las secuencias Fc mediante el conector TVSS (SEQ ID NO: 269) ubicado en la posición 233-236 (ambas mostradas subrayadas anteriormente). El polinucleótido que codifica HBCRCVL R45N-h8B5VH_(-4)TVSS-hG1 es:
(SEQ ID NO: 277):
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50
gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100
gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150
cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200
cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250
aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300
ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaqqaq qcqqatccqq 350
aggcggaggc gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400
ctggaggatc cctgagactc tcttgtgccg cctctggatt cacttttagt 450
gacgcctgga tggactgggt ccgtcaggcc ccaggcaagg ggcttgagtg 500
ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550
agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgacgc caaaaacagt 600
ctgtacctgc aaatgaacag ottaagagot gaagacaotg oogtgtatta 650
ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc ctqqtqaccg 700
tctccagcqc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 750
tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga 800
ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca 850
gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 900
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta 950
catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag 1000
ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 1050
cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa 1100
ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg 1150
acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 1200
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag 1250
cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga 1300
atggcaagga gtacaagtgo aaggtctcoa aoaaagccct cocagccccc 1350
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt 1400
gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc 1450
tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1500
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct 1550
ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga 1600
gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1650
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 1698
donde las secuencias que codifican los conectores: GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10) y TVSS (SEQ ID NO: 269) están ubicadas en la posición 337-360 y 697-708, respectivamente (ambas mostradas subrayadas anteriormente).
6.14 Optimización de conectores
Como se analiza anteriormente, los diacuerpos IgDART de la presente divulgación contienen preferiblemente conectores entre las secuencias VH y las secuencias Fc de la molécula. Se realizaron experimentos para optimizar los conectores para maximizar el rendimiento y la actividad. Se emplearon los siguientes conectores.
Figure imgf000127_0001
Figure imgf000128_0001
Los conectores anteriores se introdujeron en plásmidos para generar un conjunto de diacuerpos IgDART que tienen diferentes combinaciones de conectores:
Figure imgf000128_0002
Se determinaron las propiedades de agregación de los IgDART producidos.
Figure imgf000128_0003
Figure imgf000129_0001
Los datos mostraron inesperadamente que las construcciones que tienen conectores, tales como los empleados en 901A/901B; 903A/903B; y 908A/908B daban resultados drásticamente superiores (menos oligomerización y/o menos producción de fragmento) que las construcciones que tienen conectores, tales como 910A/911B.
6.15 DART con enrollamiento-E/enrollamiento-K
Como se apreciará en vista de los anterior, los polipéptidos individuales de un DART biespecífico pueden formar dos especies de homodímeros y una especie de heterodímero. En una realización de la presente divulgación, puede añadirse un polipéptido cargado al extremo C de uno, o más preferiblemente, ambos polipéptidos DART. Seleccionando polipéptidos cargados de carga opuesta para los polipéptidos individuales del DART biespecífico, la inclusión de dichos polipéptidos cargados favorece la formación de heterodímeros y reduce la formación de homodímeros. Preferiblemente, un polipéptido cargado positivamente contendrá un contenido sustancial de arginina, glutamina, histidina y/o lisina (o mezclas de dichos aminoácidos) y un polipéptido cargado negativamente contendrá un contenido sustancial de aspartato o glutamato (o una mezcla de dichos aminoácidos). Los polipéptidos cargados positivamente que contienen un contenido sustancial de lisina y polipéptidos cargados negativamente que contienen un contenido sustancial de glutamato son particularmente preferidos. Para maximizar la atracción electrostática entre dichos polipéptidos cargados opuestamente, se prefiere emplear polipéptidos que puedan asumir espontáneamente una conformación helicoide.
Por tanto, en una realización preferida, se anexará un "enrollamiento-E" cargado positivamente a uno de los polipéptidos que se están usando para formar un DART biespecífico y se anexará un "enrollamiento-K" cargado negativamente al segundo de los polipéptidos de DART (figura 37).
Un enrollamiento-E particularmente preferido tendrá la secuencia: (EVAALEK)4:
SEQ ID NO: 299 EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK
Un enrollamiento-K particularmente preferido tendrá la secuencia: (KVAALKE)4:
SEQ ID NO: 300 KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE
Un polipéptido de DART preferido que posea dicho enrollamiento-E tendrá la secuencia general: [dominio VL]-[GGGSGGGG]-[dominio VH]-[(EVAALEK)4]-GGGNS, donde VL es el dominio de Ig ligero variable de DART, GGGSGGGG es la SEQ ID nO: 10, VH es el dominio de Ig pesado variable de DART, (EVAALEK)4 es la SEQ ID NO: 299, y GGGNS es la SEQ ID NO: 301. Un polipéptido de DART preferido que posea dicho enrollamiento-K tendrá la secuencia general: [dominio VL]-[GGGSGGGG]-[dominio v H]-[(KVAALKE)4]-GGGNS, donde VL es el dominio Ig ligero variable de dArT, GGGs Gg GG es la SEQ ID NO: 10, v H es el dominio de Ig pesado variable de DART, (KVAALKE)4 es la SEQ ID NO: 300, y GGGNS es la SEQ ID NO: 301.
6.16 DART que contienen Fc con enrollamiento-E/enrollamiento-K
En una realización adicional, las regiones Fc pueden ligarse a los enrollamientos-E y/o K de los DART con enrollamiento-E o enrollamiento-K.
Además, la separación entre las regiones Fc y el dominio VH de DART de un DART que contiene Fc es deseable en casos en que una disposición menos separada de dichos dominios provoca una interacción disminuida entre dichos dominios y sus ligandos de unión o interfiere de otro modo con el ensamblaje de DART. Aunque pueden emplearse separadores de cualquier secuencia de aminoácidos, es preferible emplear separadores que formen enrollamientos de hélice a, para prolongar y proyectar al máximo el dominio Fc desde los dominios variables (figura 37). Como los polipéptidos enrollados descritos anteriormente de carga opuesta funcionan adicionalmente promoviendo la formación de heterodímeros, dichas moléculas son separadores particularmente preferidos. Dichas moléculas de Fc-DART que contienen enrollamiento proporcionan beneficios similares a los de Fc-DART, incluyendo semivida en suero mejorada y reclutamiento de función efectora. Los polipéptidos con enrollamiento-E y enrollamiento-K descritos anteriormente son particularmente preferidos para este fin.
Por tanto, en una realización preferida, el DART que contiene Fc con enrollamiento-E tendrá la secuencia general:
[dominio VL]-[GGGSGGGG]-[dominio VH]-[(EVAALEK)4]-GGG-dominio Fc partiendo de D234 (numeración de Kabat), donde VL es el dominio de Ig ligero variable de DART, GGGSGGGG es la SEQ ID NO: 10, VH es el dominio de Ig pesado variable de DART y (EVAALEK)4 es la SEQ ID NO: 299.
Asimismo, en una realización preferida, el DART que contiene Fc con enrollamiento-K tendrá la secuencia general:
[dominio VL]-[GGGSGGGG]-[dominio VH]-[(KVAALKE)4]-GGG-dominio Fc partiendo de D234 (numeración de Kabat), donde VL es el dominio de Ig ligero variable de DArT, GGGSGGGG es la SEQ ID NO: 10, Vh es el dominio de Ig pesado variable de DART y (KVAALKE)4 es la SEQ ID NO: 300.
Como se indica anteriormente, una molécula de DART que contiene enrollamiento o una molécula de DART que contiene Fc que contiene enrollamiento puede contener únicamente un solo separador de dicho enrollamiento, o puede contener más de uno de dichos separadores (por ejemplo, dos separadores, preferiblemente de carga opuesta, de los que une se liga a cada uno del dominio VH de los polipéptidos de DART). Ligando la región Fc a dicha o dichas moléculas separadoras, se potencia la capacidad de generar versiones bivalentes, tetravalentes, etc. de las moléculas de Fc-Da Rt por intercambio de cadenas (figura 39). Como se muestra en la figura 39, pueden producirse moléculas de Fc-DART que formen monómeros o dímeros dependiendo de si el dominio Fc está ligado a uno o ambos dominios VH de DART.
6.17 Actividad funcional de DART que contienen Fc con enrollamiento-E/enrollamiento-K
Se produjeron especies de Fc-DART con enrollamiento-E y/o enrollamiento-K a partir de moléculas de DART biespecíficas que tienen: (1) las regiones ligera y pesada variables del anticuerpo reactivo al (complejo BCR) CD79b, CB3 y (2) las regiones ligera y pesada variables de una variante de baja afinidad (denominada variante "YA") del anticuerpo reactivo a CD32B, 2B6. Esta región variable de cadena ligera de este anticuerpo difiere de la del anticuerpo 2B6 en que contiene mutaciones: N50Y y V51A. Por tanto, el anticuerpo YA2B6 tiene la secuencia de región variable de cadena ligera:
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRTSQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLIKYASE SISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSNTWPFTFGGGTKVEI
K (SEQ ID NO: 302).
La secuencia de la región variable de cadena pesada de este anticuerpo es:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGY7FTKYW IHWVRQAPGQGLEWMGVIDP SDTYPNYNKKFKGRVTMTTDTSTSTAYMEI/RSL1 RSDD7AVYYCARNGDSDYYS
GMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 303); o
El anticuerpo de baja afinidad se seleccionó ya que se unirá preferentemente a CD32B en cis en células que expresan CD79b (linfocitos B). Por tanto, la configuración disminuirá la interacción con otras células que expresan CD32B (monocitos, células endoteliales, hígado), así como la interacción en trans indeseable.
Se prepararon derivados con enrollamiento-E y/o enrollamiento-K y los derivados que contienen Fc con enrollamiento-E y/o enrollamiento-K de dichos DART h2B6YAhCB3. Se usó cromatografía de exclusión molecular para analizar el tamaño aproximado y la heterogeneidad de las moléculas producidas. Como se muestra en la figura 40, se formaron dímeros a partir de DART con enrollamiento-E/enrollamiento-K que tienen una sola región Fc unida ligada a un dominio de enrollamiento-K, así como DART con enrollamiento-E/enrollamiento-K que tienen una sola región Fc unida ligada a un dominio de enrollamiento-E. El monómero deseado, así como las moléculas diméricas se recuperaron de preparaciones en que las regiones Fc estaban ligadas a los dos enrollamientos, E y K, de la misma molécula de DART, siendo el monómero el producto mayoritario formado. La figura 41 muestra la posible estructura de las moléculas diméricas producidas.
Las fracciones de cromatografía de exclusión molecular se analizaron usando electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida para analizar adicionalmente las estructuras de las moléculas producidas (figura 42). Los derivados de DART con enrollamiento-E/enrollamiento-K (sin región Fc) migraban como dos bandas predominantes cada una de aproximadamente 28 kD (correspondiente al polipéptido que contiene KFc y al polipéptido que contiene EFc ligeramente más pequeño) y una banda menos prominente a aproximadamente 49 kD (correspondiente al DART de enrollamiento-E/enrollamiento-K). Las fracciones monoméricas de los derivados de DART que contienen Fc con enrollamiento-E/enrollamiento-K (EFc/K o E/KFc) de la cromatografía de exclusión molecular mostraron únicamente la banda de peso molecular más grande o más pequeño a aproximadamente 28 kD (correspondiente a si el DART era el DART que contiene KFc (banda de peso molecular más grande) o el DART que contiene EFc (banda de peso molecular más pequeño). El material migraba predominantemente a aproximadamente 49 kD (correspondiente al DART de enrollamiento-E/enrollamiento-K). También se observaron bandas de peso molecular mayor significativas.
Se realizó un ELISA de unión biespecífico para caracterizar las moléculas producidas. CD79 se depositaron en una placa de ELISA. Los DART entonces se unieron a la placa. La unión del DART se detectó usando sCD32B-biotina seguido de incubación con estreptavidina-HRP. Como se muestra en la figura 43, los derivados de DART h2B6YAhCB3 que contienen Fc con enrollamiento-E/enrollamiento-K (EFc/K o E/KFc) mostraron potenciación significativa de la unión con respecto a un DART h2B6YAhCB3, o a un derivado de DART EFc/KFc h2B6YAhCB3. El entrecruzamiento de anticuerpos que se han unido a CD79b da lugar a la activación de linfocitos B (Van Kooten, C. et al. (1997) "Cross-Linking Of Antigen Receptor Via Ig-B (B29, CD79b) Can Induce Both Positive And Negative Signals In CD40-Activated Human B Cells," Clin. Exp. Immunol. 110:509-515). Como las moléculas de DART h2B6YAhCB3 pueden unirse a ambos receptores inhibidores CD79b y CD32B, tienen la capacidad de "reclutar" CD32B a sitios de unión a CD79b, y bloquear de ese modo la proliferación de linfocitos B. Para demostrar esta capacidad, los DART se incubaron con linfocitos B que se habían expuesto a anticuerpos que pueden unirse entrecruzadamente con anticuerpos anti-CD79b. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 44. Los resultados muestran que anticuerpos dirigidos únicamente contra CD79b o CD32B (Ch2B6N297Q y ChCB3.1N297Q, respectivamente) no lograban inhibir la proliferación de linfocitos B. Los derivados de DART EFc/KFc h2B6YA x hCB3 eran sustancialmente más eficaces en la inhibición de la proliferación de linfocitos B, como el propio DART h2B6YA x hCB3 y el control h2B6YA x hCB3 VF. Se descubrió que los DART con enrollamiento-E/enrollamiento-K que tienen únicamente una sola región Fc ligada (derivados de DART E/KFc h2B6YA x hCB3 y derivados de DART EFc/K h2B6YA x hCB3) ejercen la máxima inhibición sobre la proliferación de linfocitos B.
6.18 Modificaciones de DART para alterar la semivida en suero in vivo
Como se analiza anteriormente, las moléculas de anticuerpo recombinantes pequeñas tales como moléculas monocatenarias biespecíficas (por ejemplo, que tienen una masa molecular de aproximadamente 55 kDa) se eliminan rápidamente de la circulación. Estudios farmacocinéticos in vivo de moléculas de DART en ratones mostraron la semivida a corto plazo esperada de aproximadamente 2 horas.
En algunas realizaciones, tal como en el tratamiento de una afección inflamatoria aguda, se desea dicha semivida corta, sin embargo, en otras realizaciones tal como en el tratamiento de cáncer y enfermedades y afecciones crónicas, se prefiere que las moléculas de DART de la presente divulgación muestran semividas más largas.
Para mejorar las propiedades farmacocinéticas in vivo de las moléculas de DART para dichos usos, las moléculas de DART pueden modificarse para que contengan una parte polipeptídica de una proteína de unión a suero en uno o más de los extremos de la molécula de DART. Mucho más preferiblemente, dicha parte polipeptídica de una proteína de unión a suero se instalará en el extremo C de la molécula de DART. Una parte polipeptídica particularmente preferida de una proteína de unión a suero para este fin es el dominio de unión a albúmina (ABD) de la proteína G de estreptococos. El dominio 3 de unión a albúmina 3 (ABD3) de la proteína G de Streptococcus cepa G148 es particularmente preferido.
El dominio 3 de unión a albúmina (ABD3) de la proteína G de Streptococcus cepa G148 consiste en 46 restos de aminoácido que forman un grupo de tres hélices estable y tiene amplia especificidad de unión a albúmina (Johansson, M.U. et al. (2002) "Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules," J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120). La albúmina es la proteína más abundante en plasma y tiene una semivida de 19 días en seres humanos. La albúmina posee varios sitios de unión de molécula pequeña que le permiten unirse no covalentemente a otras proteínas y de ese modo prolongar sus semividas en suero.
Para demostrar la capacidad de una parte polipeptídica de una seroproteína de prolongar la semivida de un DART, se fusionó el dominio ABD3 de la proteína G de estreptococos con un DART biespecífico recombinante (inmunorreactivo con los antígenos hCD16 y hCD32B) para generar una molécula de anticuerpo recombinante, ABD-DART hCD16-hCD32B (figura 45). Este ABD-DART mostró unión específica a ambos antígenos, así como con seroalbúmina humana (HSA) y pudo redirigir las células efectoras in vitro. En comparación con el DART de control, este ABD-DART mostró un fuerte aumento de la semivida en suero en ratones. Esta estrategia puede usarse como ruta viable para aumentar la semivida de agentes farmacéuticos potencialmente importantes como DART hasta más de 90 minutos, más de 2 horas, más de 5 horas, más de 10 horas, más de 20 horas y mucho más preferiblemente, más de 30 horas.
Materiales y métodos:
Diseño y construcción de ABD DART: El ABD DART hCD16-hCD32B se preparó usando como cadena 1: hCD16VL-G3SG4-hCD32BVH-enrollamiento-K [(KVAALKE)4] donde CD16VL indica el CD16VL de 3G8, G3SG4 indica la SEQ ID NO: 10, hCD32BVH indica el CD32BVH de 2B6 y (KVAALKE)4 indica la SEQ ID NO: 300;
y como cadena 2:
hCD32BVL-G3SG4-hCDI6VH-GGCGGG-enrollamiento-E [(EVAALEK)4]-GGGNS-ABD
donde CD32BVL indica CD32BVL, G3SG4 indica la SEQ ID NO: 10, hCD16VH indica CD16VH, GGCGGG es los restos 2-7 de la SEQ ID NO: 267, enrollamiento-E [(EVAALEK)4] es la SEQ ID NO: 299, GGGNS es la SEQ ID NO: 301 y ABD es:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLINNAKT VEGVKALID EILAALP (SEQ ID NO: 304)
Por consiguiente, la secuencia de la cadena 1 (h3G8VL1 -G3SG4-h2B6VH4-enrollamientoK-GGGNS) es:
DIVMTQSFDS LAYGLGERAT INCKASQ3VD FDGDSF'MNWY QQKFGQFPKL
L:¡YTTSNLJLS GYTURF3G3G ügtdftltis SFQAEDVGVY ícqqsnbdpy
'.i'FGQGTKLEi. KGGGSGGGGü VQGVgYÍJAiiV KKFGASVKVS CKAGGYTETN
YWiYWVEQAY GQGLEGIGVT GiAQTYiNYA YKFKGRVTMT VVYSTSTAYM
ELR3LRSD0G AVVYCARNGD SDY YSCFE'YW GQGr"TVTVGG GGCGGGKYAA
LKYKVAALKE KVAALKGKVA AGKEGGGN3 (SE Q TD NO: 305)
Un polinucleótido preferido que codifica la cadena 1 (h3G8VL1 -G3SG4-h2B6VH4-enrollamientoK-GGGNS) es:
qs.categtga tqa.cccaátc tcce.qa.eAet ttggctqtq-t ctctagggqa gagggcoaeo
;■ iioaac :: goa aO v ] Y : . : aca aagtqttual 1. ttqalqqtq alaqLtttaL gacelggtac
caa cayaatic caggacágen dUCCcidi!etc elcalerata ci.aecJ.atcaa teiagad Lct
aqqq i:,coca'.; acaqq ! : 1.1.:aq t.yqeaqlqyq lcG.jqqacaa aci:,teaccct caceal:.cagc
agcctgcaqq ctgagaa.agv. ageaqtttat ta.ctqicoge aacgcaatgc. agcY.ccgtc.c
tcgttcggac aggggaccaa yeteyayate aaaaqaqaeg gal:ccyycgg cygaqyecac
q t l . cagalyg tycaylctug d<.!CÍ.gd.!tJLq aaqaaqcc Aq qyycctcayl gac.uutct.ee
Tgcaaqqctt orggt tacac cr;11 a ccaac taciqqatac act qygt qcg acaececcor.
aya caagggc ttaaylyyal t.yqayt.yall: ya i. c c 11:cty a taci:tat.ee aaallaceal
aaaaay vaca agqgcayayi. cacea tqaec ylagtey tai: ceaogayca.c aqtoí.acaiq
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aya gyaí:;jtq rieggtqgaae d.qtoaocaca ctgaagqaya ad ( ¡ ttgetyc talIgaacgag
aagqtccfccq caettatgga aaaqgt.cqca gcoctgaasg agggcggcgg gaat t: ct
(SEQ ID NO : 306)
Por consiguiente, la secuencia de la cadena 2 (h2B6VL5-G3SG4-h3G8VH5-enrollamientoE-GGGNS-ABD) es:
VCRl'EOFPGK AIEGGAHTGA GDDYRYNPAL YGPLTIGRIA GlGYQVVYFiPIG
k m d a - 'd ta 'l a ycaq::>ipahf aywgqgtlvg vasgccggge vaaiiakiayaa
LEKEVAELEK SVAALEKGEG KSLjAE.EEVLA HEEaíEKYCtVE dyykelt mua
Y (SE Q ID NO: 307)
Un polinucleótido preferido que codifica la cadena 2 (h2B6VL5-G3SG4-h3G8VH5-enrollamientoE-GGGNS-ABD) es:
Figure imgf000132_0001
Cada segmento VL y VH se amplificó por PCR usando DART hCD16-hCD32B como molde. Para la cadena 2, las secuencias de nucleótidos que contienen enrollamiento-E y ABD se formaron dimerizando el cebador y después se subclonaron en el extremo C de la región VH de hCD16 usando digestión de restricción y ligamiento. Ambas cadenas se clonaron en el vector pCIneo (Promega, inc.) en los sitios NheI-NotII. Los plásmidos individuales que albergaban la cadena 1 respectiva digerida en NgoMIV-NheI y los casetes de expresión de la cadena 2 digeridos en BstBI-PmeI entonces se clonaron en un único plásmido para la transfección en células CHO para generar líneas celulares estables.
Expresión y purificación de proteína: Para la transfección estable, se transfectaron células CHO-S con ADN plasmídico del EK ABD-DART hCD16-hCD32B. La proteína de ABD-DART se purificó por cromatografía de afinidad usando la versión soluble del antígeno FcRIIB acoplado a Sepharose 4B activada con CNBr. La proteína concentrada se purificó adicionalmente por cromatografía de exclusión molecular usando Superdex 200HR 10/30. Ensayo de unión por ELISA: Para la captura basada en CD-16, se recubrieron placas con antígeno FcRIIB a una concentración de 2 ug/ml a 4 °C durante una noche. Las placas entonces se bloquearon con peptona al 0,5 % en PBS-T. Las proteínas purificadas diluidas en una dilución en serie de factor dos se unieron en la placa durante 1 h a temperatura ambiente. Finalmente, se realizó detección usando CD32B biotinilado (50 ng/ml) seguido de HRP conjugada con estreptavidina (1/1000, BD-Pharm). La actividad de HRP se midió mediante la adición de TMB y la placa se leyó en un lector de placa a DO 450 nm.
Para la captura de seroalbúmina humana (HSA), las placas se recubrieron con HSA a una concentración de 2 ug/ml a 4 °C durante una noche. Después de eso, se siguieron los mismos procedimientos para realizar el ELISA de afinidad doble.
Ensayo de ADCC mediada por leucocitos monomorfonucleares de sangre periférica: La citotoxicidad se midió por ensayo de liberación de LDH. Se purificaron leucocitos monomorfonucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre humana completa (Lonza Walkersville, Inc, Gaithersburg, MD) por centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se sembraron 2 x 104 células diana en cada pocillo de una placa de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo redondo. Se añadió una dilución en serie de uno a cuatro de diferentes moléculas de DART o anticuerpo a las células en la placa. Después de eso, se añadieron 6 x 105 PBMC a los mismos pocillos. La placa entonces se incuba durante una noche a 37 °C y en incubadora de un 5 % de CO2. La placa entonces se centrifuga a 1200 rpm durante 5 minutos, se transfieren 50 gl de sobrenadante a una placa de ELISA de fondo plano. Se añaden 50 gl de solución de sustrato de LDH (Promega) a cada pocillo, y la placa se incuba durante 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Después se añaden 50 gl de solución de parada a cada pocillo, y la placa se lee a 490 nm en una hora. El porcentaje de citotoxicidad de cada pocillo se calcula con una lectura de D.O. sin procesar como
(Muestra - AICC)/(máx. diana - espontánea diana) x 100
donde AICC es la citotoxicidad celular independiente de anticuerpos. La curva de respuesta a la dosis se genera usando el programa informático Prism.
Estudio farmacocinético: A ratones C57B1/6 se les inyectó una única inyección intravenosa de DART hCD16-hCD32B a 5 mg/kg. Se recogieron suero de ratón antes de la dosis, 2, 30 min; 1, 3, 6, 24 y 72 h. Se cuantificó la concentración de DART hCD16-hCD32B en suero. Los cálculos farmacocinéticos de Da Rt hCD16-hCD32B se realizaron mediante el paquete de programas farmacocinéticos WinNonlin Professional 5.1 (Pharsight Corporation, EE. UU.). Los parámetros se determinaron por análisis no compartimentado (NCA). El análisis no compartimentado se basó en un modelo (modelo 201) que requería una inyección intravenosa del fármaco. Se usó el método lineal trapezoide para el cálculo de parámetros.
Resultados
Expresión y estudio de unión por ELISA: El ABD-DART hCD16-hCD32B se expresó de forma eficaz a una concentración de 6,5 mg por litro en células de mamífero CHO-S. La actividad de unión de la proteína de ABD-DART a los antígenos respectivos se evaluó por ELISA. Los resultados mostraron que ABD-DART hCD16-hCD32B se une simultáneamente con ambos antígenos, CD16 así como con CD32B (figura 46A). El perfil de unión coincide con la unión de la proteína de DART hCD16-hCD32B de control. La afinidad del ABD-dArT hCD16-hCD32B purificado por seroalbúmina humana (HSA) también se demostró por ELISA (figura 46B). El resultado mostrado unión fuerte del DART de fusión con ABD a HSA, mientras que no se observó unión con DART hCD16-hCD32B de control.
Citotoxicidad in vitro de ABD-DART: Para demostrar la unión simultánea de este ABD-DART biespecífico a dos antígenos, uno en la célula efectora y uno en la célula diana, se realizó el ensayo de eliminación celular redirigida. Usando PBMC humanos como células efectoras, ABD-DART hCD16-hCD32B indujo citotoxicidad potente, dependiente de la dosis contra líneas de linfocitos B positivos a CD32B, Daudi (figura 47). El resultado mostró que la potencia de ABD-DART era equivalente a la del DART precursor.
Propiedades farmacocinéticas de ABD-DART: Las propiedades farmacocinéticas de ABD-DART hCD16-hCD32B se analizaron por ELISA de muestras de suero después de una única dosis en inyección i.v. en ratones C57B1/6 (figura 48). Ambas proteínas, DART y ABD-DART mostraron eliminación bifásica de la circulación. El estudio PK de ABD-DART mostró un tiempo en circulación prolongado, con una semivida terminal aumentada de 35,1 h en comparación con 1,2 h para DART normales (figura 48, tabla 17). La mejora de las propiedades farmacocinéticas también se demostró por comparación del área bajo la curva (ABC). Para la construcción ABD-DART el ABC aumentó en un factor de casi 30 después de fusión a a Bd (tabla 17).
Figure imgf000134_0001
En resumen, se diseñó satisfactoriamente y se produjo una proteína de DART fusionada a dominio de unión a albúmina (mencionada como ABD-DART). Se descubrió que el ABD-DART hCD16-hCD32B retenía las especificidades por sus dos determinantes antigénicos reconocidos: CD16 y CD32B. Se descubrió que ABD-DART mostraba alta afinidad con seroalbúmina humana. La fusión de ABD no reducía la actividad biológica (es decir, la potencia del DART para la eliminación de células tumorales redirigida). La fusión de la molécula de DART con ABD dio lugar a una mejora sustancial (aumento) en su semivida in vivo, y consiguió este objetivo sin un aumento drástico en el tamaño. La capacidad de retener un pequeño tamaño es significativa y ventajosa ya que facilita la capacidad del DART de difundir en tejidos tumorales.
6.19 DART de Her2/receptor de linfocitos B
Se construyó un diacuerpo IgDART que contenía regiones variables que pueden unirse a Her2/neu y al receptor de linfocitos T ("TCR").
Como se analiza anteriormente, el TCR se expresa de forma nativa por linfocitos T CD4+ o CD8+, y permite que dichas células reconozcan péptidos antigénicos que se unen y presentan por proteínas de MHC de clase I o clase II de células presentadoras de antígeno. El reconocimiento de un complejo de pMHC (péptido-MHC) por un TCR inicia la propagación de una respuesta inmunitaria celular que da lugar a la producción de citocinas y la lisis de la célula presentadora de antígeno. HER2/neu, un miembro importante de la familia de ErbB, se ha investigado ampliamente a causa de su función en varios carcinomas humanos y en el desarrollo de mamíferos. (Hynes y Stern (1994) Biochim. et Biophys. Acta 1198:165-184; y Dougall et al. (1994) Oncogene 9:2109-2123; Lee et al. (1995) Nature 378:394-398). El gen de HER2/neu humano y la proteína HER2/neu se describen en Semba et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (EE. UU.) 82:6497-6501 y Yamamoto et al. (1986) Nature 319:230-234, y la secuencia está disponible en GenBank con el número acceso X03363. HER2/neu comprende cuatro dominios: un dominio extracelular al que se une el ligando; un dominio transmembranario lipófilo; un dominio tirosina cinasa intracelular conservado; y un dominio de señalización del extremo carboxílico que alberga varios restos de tirosina que pueden fosforilarse. (Plowman et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (EE. UU.) 90:1746-1750). La secuencia del dominio extracelular de HER2/neu (ECD) se describió por Franklin et al. (2004) Cancer Cell. 5(4):317-328, y está disponible en Protein DataBank Record 1S78 (2004).
HER2/neu funciona como receptor del factor de crecimiento y a menudo se expresa por tumores tales como cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de vejiga, cáncer de ovario y cáncer pulmonar. HER2/neu se sobreexpresa en un 25-30 % de cánceres de mama y ovario humanos, y está asociado con una progresión clínica agresiva y un mal pronóstico en estos pacientes. (Slamon et al. (1987) Science 235:177-182; Slamon et al. (1989) Science 244:707-712). La sobreexpresión de HER2/neu también se ha observado en otros carcinomas, incluyendo carcinomas del estómago, endometrio, glándula salival, pulmón, riñón, colon, tiroides, páncreas y vejiga. (Véase, por ejemplo, King et al. (1985) Science 229:974; McCann et al. (1990) Cancer 65:88-92; Yonemura et al. (1991) Cancer Research 51:1034).
Se han desarrollado varios anticuerpos monoclonales e inhibidores de tirosina cinasa de molécula pequeña dirigidos a HER-1 o HER2/neu, incluyendo, en particular, una variante humanizada de un anticuerpo monoclonal murino conocido como 4D5 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc.) que reconoce un epítopo extracelular (aminoácidos 529 a 627) en el dominio II rico en cisteína de HER2/neu, que reside muy cerca de la región transmembranaria de la proteína. Los estudios han demostrado que en células de cáncer de mama que sobreexpresan HER2/neu, el tratamiento con anticuerpos específicos para HER2/neu en combinación con agentes quimioterápicos (por ejemplo, cisplatino, doxorrubicina, taxol) provoca una mayor respuesta citotóxica que el tratamiento con quimioterapia en solitario. (Hancock et al. (1991) Cancer Res. 51:4575-4580; Arteaga et al. (1994) Cancer 54:3758-3765; Pietras et al. (1994) Oncogene 9:1829-1838). Un posible mecanismo por el que los anticuerpos contra HER2/neu podrían potencia la respuesta a agentes quimioterápicos es mediante la modulación de la expresión de la proteína HER2/neu o interfiriendo con la reparación del ADN. (Stancovski et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (Ee . UU.) 88:8691-8695; Bacus et al. (1992) Cell Growth & Diff. 3:401-411; Bacus et al. (1993) Cáncer Res. 53:5251-5261; Klapper et al. (1997) Oncogene 14:2099-2109; Klapper et al. (2000) Cancer Res. 60:3384-3388; Arteaga et al. (2001) J Clinical Oncology 19(18s):32s-40s. Aunque, en determinados casos, los anticuerpos anti-HER2/neu tales como HERCEPTIN® proporcionan beneficio terapéutico a los pacientes, la mayoría de los pacientes con cáncer de mama y otros pacientes muestran respuestas insensibles a dichos anticuerpos. Estas respuestas reflejan, en parte, las diferencias en el grado de la sobreexpresión de HER2/neu por las células cancerosas del paciente.
Como consecuencia de contener regiones variables que pueden unirse a Her2/neu y al receptor de linfocitos T ("TCR"), el DART tiene la capacidad de unirse a células que expresan HER2 y de ese modo adherirse a dichas células mediante un dominio que puede unirse al receptor de linfocitos T. Cuando dichos linfocitos T se unen a este dominio, se activan para iniciar una respuesta inmunitaria que da lugar a la eliminación de las células que expresan HER2.
Las secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico para dicho DART se proporcionan a continuación, con las secuencias VL y VH mostradas en texto sencillo, el conector de VL-VH mostrado en texto subrayado y la secuencia codificante del motivo de heterodimerización del extremo C (SEQ ID NO: 313: GFNRGEC o SEQ ID NO: 314: GVEPKSC) mostrado en negrita y cursiva.
Secuencia de aminoácidos de TCRVL-HER2VH (SEQ ID NO: 315)
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQLQQ SGPELVKPGA SLKLSCTASG FNIKDTY1HW VKQRPEQGLE WIGRIYPTNG YTRYDPKFQD
KATITADTSS NTAYLQVSRL TSEDTAVYYC SRWGGDGFYA MDYWGQGASV TVSS GFNRGE C
Secuencia de ácido nucleico que codifica TCRVL-HER2VH (SEQ ID NO: 316)
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc
ctctcctgca gtgccacctc aagtgtaagt tacatgcact ggtatcagca gaaaccaggg
aaagccccta agcgctggat ctatgacaca tccaaactgg cttctggggt cccatcaagg
ttcagcggca gtggatctgg gacagaattt actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa
gattttgcaa cttattactg tcagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt tggccagggg
accaagcttg agatcaaagg aggcggatcc ggcggcggag gccaggttca gctgcagcag
tctgggccag agcttgtgaa gccaggggcc tcactcaagt tgtcctgtac agcttctggc
ttcaacatta aagacaccta tatacactgg gtgaaacaga ggcctgaaca gggcctggaa
tggattggaa ggatttatcc tacgaatggt tatactagat atgacccgaa gttccaggac
aaggccacta taacagcaga cacatcctcc aacacagcct acctgcaggt cagccgcctg
acatctgagg acactgccgt ctattattgt tctagatggg gaggggacgg cttctatgct
atggactact ggggtcaagg agcctcggtc accgtgagct c cggat tcaa caggggagag
tgfc
Secuencia de aminoácidos de HER2VL-TCRVH (SEQ ID NO: 317)
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYKFTSYVMH WVRQAPGQGL EWIGYINPYN DVTKYNEKFK GRVTITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVHY CARGSYYDYD GFVYWGQGTL VTVSSGVEPK SC
Secuencia de ácido nucleico que codifica HER2VL-TCRVH (SEQ ID NO: 318)
gacatcgtga tgacccagtc ccacaagttc atgtccacct ctgtgggcga tagggtcagc
atcacctgca aggccagcca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca gcagaaacca
ggacattctc ccaaactgct gatttactcc gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat
cgcttcactg geageagate tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta cacctcccac cttcggaggg
ggtaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt tcagctggtg
cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg gcctcagtga aggtctcctg caaggccagc
ggttacaagt ttaccagcta cgtgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt
gagtggatcg gatatattaa tccttacaat gatgttacta agtacaatga gaagttcaaa
ggcagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc
ctgagatccg aggacacggc cgtgcactac tgtgcgagag ggagctacta tgattacgac
gggtttgttt actggggcca agggactctg gtcactgtga gctccggagt tg agcccaaa
tct t gt
En una realización preferida, dichas construcciones se modifican para que contengan un dominio de enrollamiento-E o enrollamiento-K que facilite la formación de heterodímeros (es decir, dímeros TCRVL-HER2VH x HER2VL-TCRVH). Las secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico para dicho DART se proporcionan a continuación, con las secuencias VL y VH mostradas en texto sencillo, el conector de VL-VH mostrado en texto subrayado y la secuencia codificante del conector que contiene Cys para la dimerización (GGCGGG; restos 2-7 de la SEQ ID NO: 267) mostrada en cursiva. El dominio de heterodimerización de enrollamiento-E o enrollamiento-K está doblemente subrayado (la secuencia de "enrollamiento-E" preferida es 4 repeticiones heptaméricas de EVAALEK; SEQ ID NO: 299; la secuencia de "enrollamiento-K" preferida es 4 repeticiones heptaméricas de r KVAALKE (SEQ ID NO: 300). La secuencia después del enrollamiento-E o el enrollamiento-K no tiene función adjudicada.
Secuencia de aminoácidos de TCRVL-HER2VH-enrollamientoE (SEQ ID NO: 319)
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT SKLASGVPSR FSGSGSGTE F TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQLQQ SGPELVKPGA SLKLSCTASG FNIKDTY1HW VKQRPEQGLE WIGRIYPTNG YTRYDPKFQD
KATITADTSS NTAYLQVSRL TSEDTAVYYC SRWGGDGFYA MDYWGQGASV TVSSGGCGGG EVAALEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKGG GNS
Secuencia de ácido nucleico que codifica TCRVL-HER2VH-enrollamientoE (SEQ ID NO: 320)
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc
ctctcctgca gtgccacctc aagtgtaagt tacatgcact ggtatcagca gaaaccaggg
aaagccccta agcgctggat ctatgacaca tccaaactgg cttctggggt cccatcaagg
ttcagcggca gtggatctgg gacagaattt actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa
gattttgcaa cttattactg tcagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt tggccagggg
accaagcttg agatcaaagg aggcgqatcc ggcggcqqag gccaggttca gctgcagcag
tctgggccag agcttgtgaa gccaggggcc tcactcaagt tgtcctgtac agcttctggc
ttcaacatta aagacaccta tatacactgg gtgaaacaga ggcctgaaca gggcctggaa
tggattggaa ggatttatcc tacgaatggt tatactagat atgacccgaa gttccaggac
aaggccacta taacagcaga cacatcctcc aacacagcct acctgcaggt cagccgcctg
acatctgagg acactgccgt ctattattgt tctagatggg gaggggacgg cttctatgct
atggactact ggggtcaagg agcctcggtc accgtgagct cc ggaggatg tggcggtgga
gaagtggccg cactggagaa agaggttgct gctttggaga aggaggtcgc tgcacttgaa
aaqqaqqtcq caqccctqqa qaaaggcggc gggaattct
Secuencia de aminoácidos de HER2VL-TCRVH-enrollamientoK (SEQ ID NO: 321)
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYKFTSYVMH WVRQAPGQGL EWIGYINPYN DVTKYNEKFK GRVTITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVHY CARGSYYDYD GFVYWGQGTL VTVSSGGCGG GKVAALKEKV AALKEKVAAL KEKVAALKEG GGNS
Secuencia de ácido nucleico que codifica HER2VL-TCRVH-enrollamientoK (SEQ ID NO: 322)
gacatcgtga tgacccagtc ccacaagttc atgtccacct ctgtgggcga tagggtcagc
atcacctgca aggccagcca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca gcagaaacca
ggacattctc ccaaactgct gatttactcc gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat
cgcttcactg gcagcagatc tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta cacctcccac cttcggaggg
ggtaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt tcagctggtg
cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg gcctcagtga aggtctcctg caaggccagc
ggttacaagt ttaccagcta cgtgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt
gagtggatcg gatatattaa tccttacaat gatgttacta agtacaatga gaagttcaaa
ggcagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc
ctgagatccg aggacacggc cgtgcactac tgtgcgagag ggagctacta tgattacgac
gggtttgttt actggggcca agggactctg gtcactgtga gctccggagg atgtggcggt
gga .aaagtgg ccgcactgaa ggagaaagtt gctgctttga aagagaaggt cgccgcactt
aaqqaaaaqg tcqcacrccct craaacraqggc ggcgggaatt ct
Se ensayaron moléculas de DART que tienen dominios de unión a Her2 y receptor de linfocitos T (TCR) para su capacidad de mediar la citotoxicidad en múltiples líneas celulares de cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer de vejiga que se habían caracterizado previamente por mostrar bajos niveles de expresión de HER2 (y, por tanto, que son resistentes a tratamiento con el anticuerpo anti-Her2/neu, Herceptin®. Las líneas celulares de cáncer de mama ensayadas son ZR75-1 (HER2 2+) (figura 49A), MCF-7 (HER2 1+) (figura 49B) y MDA-MB468 (HER2-va) (figura

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de diacuerpo que comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, estando las cadenas polipeptídicas unidas covalentemente entre sí, en la que:
1. la primera cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N al extremo C:
(i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un epítopo (1),
(ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un epítopo (2), y
(iii) un dominio polipeptídico cargado positiva o negativamente que asume espontáneamente una conformación helicoide, en la que el dominio polipeptídico cargado positivamente es un separador de enrollamiento-E que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 299 y el dominio polipeptídico cargado negativamente es un separador de enrollamiento-K que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 300;
estando dicho primer dominio y segundo dominio unidos covalentemente de modo que el primer dominio y el segundo dominio no se asocian juntos para formar un sitio de unión a epítopo (1) o un sitio de unión a epítopo (2); II. la segunda cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N al extremo C:
(i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2) específica para el epítopo (2),
(ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1) específica para el epítopo (1);
(iii) un dominio polipeptídico cargado positiva o negativamente que asume espontáneamente una conformación helicoide unido al quinto dominio, en la que el dominio polipeptídico cargado positivamente es un separador de enrollamiento-E que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 299 y el dominio polipeptídico cargado negativamente es un separador de enrollamiento-K que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 300, en la que, cuando la primera cadena polipeptídica comprende el separador de enrollamiento-E, la segunda cadena polipeptídica comprende el separador de enrollamiento-K, o cuando la primera cadena polipeptídica comprende el separador de enrollamiento-K, la segunda cadena polipeptídica comprende el separador de enrollamiento-E; estando dicho cuarto dominio y quinto dominio unidos covalentemente de modo que el cuarto dominio y el quinto dominio no se asocian juntos para formar el sitio de unión a epítopo (1) o el sitio de unión a epítopo (2);
en la que el primer dominio y el quinto dominio se asocian juntos para formar un sitio de unión (VL1)(VH1) que se une al epítopo (1);
en la que el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian juntos para formar un sitio de unión (VL2)(VH2) que se une al epítopo (2).
2. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 1, en la que la primera cadena polipeptídica comprende adicionalmente un tercer dominio, en la que el tercer dominio es un dominio Fc, y en la que el tercer dominio está unido al dominio polipeptídico cargado, o el tercer dominio está unido al extremo N del primer dominio.
3. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 1 o 2, en la que la segunda cadena polipeptídica comprende adicionalmente un sexto dominio, en la que el sexto dominio es un dominio Fc, y en la que el sexto dominio está unido al dominio polipeptídico cargado, o el sexto dominio está unido al extremo N del cuarto dominio.
4. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 1 o 2, en la que la molécula de diacuerpo comprende adicionalmente una tercera cadena polipeptídica y una cuarta cadena polipeptídica, estando la tercera y cuarta cadena polipeptídica unidas covalentemente entre sí, en la que:
III. la tercera cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N al extremo C:
(i) un séptimo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una tercera inmunoglobulina (VL3) específica para un epítopo (3),
(ii) un octavo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una cuarta inmunoglobulina (VH4) específica para un epítopo (4),
(iii) un dominio polipeptídico cargado positiva o negativamente que asume espontáneamente una conformación helicoide, en la que el dominio polipeptídico cargado positivamente es un separador de enrollamiento-E que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 299 y el dominio polipeptídico cargado negativamente es un separador de enrollamiento-K que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 300, y
(iv) un noveno dominio, en la que el noveno dominio es un dominio Fc;
estando dicho séptimo dominio y octavo dominio unidos covalentemente de modo que el séptimo dominio y el octavo dominio no se asocian juntos para formar un sitio de unión a epítopo (3) o un sitio de unión a epítopo (4);
IV. la cuarta cadena polipeptídica comprende, en la dirección del extremo N al extremo C:
(i) un décimo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la cuarta inmunoglobulina (VL4) específica para el epítopo (4),
(ii) un undécimo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la tercera inmunoglobulina (VH3) específica para el epítopo (3);
(iii) un dominio polipeptídico cargado positiva o negativamente que asume espontáneamente una conformación helicoide unido al undécimo dominio, en la que el dominio polipeptídico cargado positivamente es un separador de enrollamiento-E que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 299 y el dominio polipeptídico cargado negativamente es un separador de enrollamiento-K que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 300, en la que, cuando la tercera cadena polipeptídica comprende el separador de enrollamiento-E, la cuarta cadena polipeptídica comprende el separador de enrollamiento-K, o cuando la tercera cadena polipeptídica comprende el separador de enrollamiento-K, la cuarta cadena polipeptídica comprende el separador de enrollamiento-E; estando dicho décimo dominio y undécimo dominio unidos covalentemente de modo que el décimo dominio y el undécimo dominio no se asocian juntos para formar el sitio de unión a epítopo (3) o el sitio de unión a epítopo (4); en la que el séptimo dominio y el undécimo dominio se asocian juntos para formar un sitio de unión (VL3)(VH3) que se une al epítopo (3);
en la que el octavo dominio y el décimo dominio se asocian juntos para formar un sitio de unión (VL4)(VH4) que se une al epítopo (4).
5. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 1, en la que la primera cadena polipeptídica comprende adicionalmente:
(iv) una parte polipeptídica de una proteína que se une a una proteína sérica, pudiendo la parte polipeptídica unirse a la proteína sérica.
6. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 5, en la que la segunda cadena polipeptídica comprende adicionalmente:
(iv) una parte polipeptídica de una proteína que se une a una proteína sérica, pudiendo la parte polipeptídica unirse a la proteína sérica.
7. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 5 o 6, en la que la proteína que se une a una proteína sérica es una proteína de unión a albúmina.
8. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 7, en la que la proteína de unión a albúmina es la proteína G de estreptococos y la parte polipeptídica es un dominio de unión a albúmina (ABD) de la proteína G de estreptococos.
9. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 8, en la que el dominio de unión a albúmina (ABD) de la proteína G de estreptococos es el dominio 3 de unión a albúmina (ABD3) de la proteína G de Streptococcus cepa G148.
10. La molécula de diacuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que tiene un dominio que se une a un epítopo de CD16.
11. La molécula de diacuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que tiene un dominio de unión al receptor de linfocitos T (TCR).
12. La molécula de diacuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que tiene un dominio que se une a un epítopo de CD79b y un dominio que se une a un epítopo de CD32B.
13. La molécula de diacuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la que la molécula de diacuerpo se une a un antígeno asociado a tumor.
14. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 13, en la que antígeno asociado a tumor es un antígeno de cáncer de mama, un antígeno de cáncer de ovario, un antígeno de cáncer de próstata, un antígeno de cáncer cervicouterino, un antígeno de carcinoma pancreático, un antígeno de cáncer pulmonar, un antígeno de cáncer de vejiga, un antígeno de cáncer de colon, un antígeno de cáncer testicular, un antígeno de cáncer de glioblastoma, un antígeno asociado con una neoplasia de linfocitos B, un antígeno asociado con mieloma múltiple, un antígeno asociado con linfoma no hodgkiniano o un antígeno asociado con leucemia linfocítica crónica.
15. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 13, en la que el antígeno asociado a tumor es A33; ADAM-9; ALCAM; B1; BAGE; beta-catenina; CA125; carboxipeptidasa M; CD5; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD28; CD32B; CD36; CD40; CD45; CD46; CD56; CD79a; CD79b; CD103; CD154; CDK4; CEA; CTLA4; citoqueratina 8; EGF-R; un receptor de efrina; ErbB1; ErbB3; ErbB4; GAGE-1; GAGE-2; GD2; GD3; GM2; gp100; HER-2/neu; E6 de papilomavirus humano; E7 de papilomavirus humano; integrina alfa-V-beta-6; JAM-3; KID3; KID31; KSA (17-1 A); LUCA-2; MAGE-1; MAGE-3; MART; MUC-1; MUM-1; N-acetilglucosaminiltransferasa; oncostatina M (receptor beta de oncostatina); p15; PIPA; PSA; PSMA; RAAG10; ROR1; SART; sTn; TES7; el receptor de TNF-a; el receptor de TNF-p; el receptor de TNF-y; el receptor de transferrina o el receptor VEGF.
16. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 15, en la que el antígeno asociado a tumor es HER-2/neu.
17. Una composición farmacéutica que comprende la molécula de diacuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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Families Citing this family (136)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8669418B2 (en) 2005-12-22 2014-03-11 Vib Vzw Means and methods for mediating protein interference
CN102046655B (zh) 2008-04-02 2016-09-14 宏观基因有限公司 Bcr-复合体-特异性抗体和其使用方法
US8802091B2 (en) 2010-03-04 2014-08-12 Macrogenics, Inc. Antibodies reactive with B7-H3 and uses thereof
JP5998060B2 (ja) 2010-03-04 2016-09-28 マクロジェニクス，インコーポレーテッド Ｂ７−ｈ３と反応性のある抗体、その免疫学的に活性なフラグメントおよびその使用
WO2012009760A1 (en) 2010-07-20 2012-01-26 Cephalon Australia Pty Ltd Anti-il-23 heterodimer specific antibodies
KR102244173B1 (ko) * 2010-11-30 2021-04-26 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 세포상해 유도 치료제
JP6147670B2 (ja) 2010-12-22 2017-06-14 テバ・ファーマシューティカルズ・オーストラリア・ピーティワイ・リミテッド 改善された半減期を有する修飾された抗体
TWI803876B (zh) * 2011-03-28 2023-06-01 法商賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
CA2836873C (en) 2011-05-21 2019-10-22 Macrogenics, Inc. Deimmunized serum-binding domains and their use for extending serum half-life
PL2714733T4 (pl) 2011-05-21 2019-08-30 Macrogenics, Inc. Cząsteczki wiążące CD3 zdolne do wiązania z ludzkim i nieludzkim CD3
CA2837602A1 (en) 2011-06-02 2012-12-06 Nonin Medical, Inc. Home uterine activity monitoring
US9193793B2 (en) 2011-06-13 2015-11-24 Csl Limited Antibodies against G-CSFR and uses thereof
ES2746052T3 (es) 2011-06-28 2020-03-04 Inhibrx Lp Polipéptidos de fusión de serpina y métodos de uso de los mismos
US10400029B2 (en) 2011-06-28 2019-09-03 Inhibrx, Lp Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
EP2548892A1 (en) 2011-07-22 2013-01-23 CSL Behring GmbH Inhibitory anti-Factor XII/XIIa monoclonal Antibodies and their uses
KR102042982B1 (ko) 2011-07-22 2019-11-11 체에스엘 베링 게엠베하 억제성 항-ｘｉｉ/ｘｉｉａ 인자 모노클로날 항체 및 이들의 사용
CN104114577A (zh) 2011-09-30 2014-10-22 特瓦制药澳大利亚私人有限公司 针对TL1a的抗体及其用途
EP2623110A1 (en) 2012-01-31 2013-08-07 CSL Behring GmbH Factor XII inhibitors for the treatment of neurological inflammatory disorders
ES2680151T3 (es) 2012-03-01 2018-09-04 Amgen Research (Munich) Gmbh Moléculas de unión de polipéptidos de larga duración
ES2719495T3 (es) 2012-05-07 2019-07-10 Dartmouth College Anticuerpo dirigido contra b7-h6, proteínas de fusión, y métodos de uso de los mismos
AU2013285355A1 (en) 2012-07-06 2015-01-29 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
EP3632462A1 (en) 2012-07-06 2020-04-08 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
CN103087171B (zh) * 2012-12-24 2015-01-14 中国人民解放军第四军医大学 一种用于前列腺癌早期诊断和治疗的抗psma/fitc双特异性抗体及其制备方法
EA201500741A1 (ru) 2013-01-10 2016-01-29 Генмаб Б.В. ВАРИАНТЫ Fc-ОБЛАСТИ IGG1 ЧЕЛОВЕКА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
PT2953971T (pt) 2013-02-07 2023-05-02 Csl Ltd Proteínas de ligação à il-11r e suas utilizações
US9487587B2 (en) 2013-03-05 2016-11-08 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells of a companion animal that express an activating receptor and cells that express B7-H3 and uses thereof
WO2014135694A1 (en) 2013-03-08 2014-09-12 Csl Behring Ag Treatment and prevention of remote ischemia-reperfusion injury
RU2721707C2 (ru) 2013-03-14 2020-05-21 Макродженикс, Инк. Биспецифичные молекулы, иммунореактивные с иммунными эффекторными клетками, экспрессирующими активирующий рецептор
AU2014229561B2 (en) * 2013-03-15 2018-06-07 Keith Alan Charlton Self-assembling synthetic proteins
LT2970449T (lt) 2013-03-15 2019-11-25 Amgen Res Munich Gmbh Viengrandės surišančios molekulės, apimančios n galo abp
US11634502B2 (en) * 2013-03-15 2023-04-25 Amgen Inc. Heterodimeric bispecific antibodies
WO2015001085A1 (en) 2013-07-05 2015-01-08 Genmab B.V. Humanized or chimeric cd3 antibodies
UA116479C2 (uk) 2013-08-09 2018-03-26 Макродженікс, Інк. БІСПЕЦИФІЧНЕ МОНОВАЛЕНТНЕ Fc-ДІАТІЛО, ЯКЕ ОДНОЧАСНО ЗВ'ЯЗУЄ CD32B I CD79b, ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ
US11384149B2 (en) 2013-08-09 2022-07-12 Macrogenics, Inc. Bi-specific monovalent Fc diabodies that are capable of binding CD32B and CD79b and uses thereof
EP2839842A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding CD123 and CD3 and uses thereof
EP2840091A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific diabodies that are capable of binding gpA33 and CD3 and uses thereof
US20160280787A1 (en) 2013-11-11 2016-09-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule containing modified antibody variable region
ES2851386T3 (es) 2013-12-18 2021-09-06 Csl Ltd Método de tratamiento de las heridas
CA2939556A1 (en) 2014-02-14 2015-08-20 Andrew S. Chi Improved methods for the treatment of vascularizing cancers
US9738702B2 (en) 2014-03-14 2017-08-22 Janssen Biotech, Inc. Antibodies with improved half-life in ferrets
KR20220025917A (ko) 2014-05-29 2022-03-03 마크로제닉스, 인크. 삼중-특이적 결합 분자 및 그것의 사용 방법
TWI693232B (zh) 2014-06-26 2020-05-11 美商宏觀基因股份有限公司 與pd-1和lag-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法
JP6701162B2 (ja) 2014-07-11 2020-05-27 ゲンマブ エー／エス Ａｘｌに結合する抗体
TWI711629B (zh) 2014-09-03 2020-12-01 德商包林格因蓋爾漢國際股份有限公司 靶向IL-23A與TNF-α之化合物及其用途
NZ730348A (en) 2014-09-26 2024-03-22 Macrogenics Inc Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding cd19 and cd3, and uses thereof
WO2016054101A1 (en) 2014-09-29 2016-04-07 Duke University Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm
SI3200815T1 (sl) * 2014-10-02 2021-11-30 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Postopki in sestavki za zdravljenje raka
AU2015327819B2 (en) * 2014-10-03 2021-07-01 Massachusetts Institute Of Technology Antibodies that bind ebola glycoprotein and uses thereof
EP3209697A4 (en) 2014-10-23 2018-05-30 La Trobe University Fn14-binding proteins and uses thereof
IL308589A (en) * 2014-10-27 2024-01-01 Inhibrx Inc Serpin-fused polypeptides and methods of using them
US11154615B2 (en) 2014-11-11 2021-10-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Library of antigen-binding molecules including modified antibody variable region
US10940212B2 (en) 2014-12-19 2021-03-09 Monash University IL-21 agonist antibodies and methods of treatment using same
RU2017129236A (ru) * 2015-01-26 2019-03-07 Макродженикс, Инк. Мультивалентные молекулы, содержащие dr5-связывающие домены
US10344077B2 (en) 2015-03-19 2019-07-09 Duke University HIV-1 neutralizing antibodies and uses thereof (V3 antibodies)
AU2016232693B2 (en) 2015-03-19 2021-08-12 Duke University HIV-1 neutralizing antibodies and uses thereof
US11071783B2 (en) 2015-03-19 2021-07-27 Duke University HIV-1 neutralizing antibodies and uses thereof
WO2016149695A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Duke University HIV-1 NEUTRALIZING ANTIBODIES AND USES THEREOF (CD4bs ANTIBODIES)
EP3270937A4 (en) 2015-03-26 2018-09-12 The Trustees Of Dartmouth College Anti-mica antigen binding fragments, fusion molecules, cells which express and methods of using
CN106661121A (zh) * 2015-04-28 2017-05-10 酵活有限公司 经修饰的抗原结合多肽构建体及其用途
KR20180002782A (ko) 2015-05-06 2018-01-08 얀센 바이오테크 인코포레이티드 전립선 특이적 막 항원(psma) 이중특이성 결합제 및 그의 용도
TWI773646B (zh) 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
TW201709929A (zh) 2015-06-12 2017-03-16 宏觀基因股份有限公司 治療癌症的聯合療法
CA2991805A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 Genmab A/S Axl-specific antibody-drug conjugates for cancer treatment
US11359015B2 (en) 2015-07-15 2022-06-14 Genmab A/S Humanized or chimeric CD3 antibodies
MY191081A (en) * 2015-07-23 2022-05-30 Boehringer Ingelheim Int Compound targetting il-23a and b-cell activating factor (baff) and uses thereof
GEP20227419B (en) 2015-07-30 2022-10-10 Macrogenics Inc Pd-1-binding molecules and methods of use thereof
WO2017106061A1 (en) 2015-12-14 2017-06-22 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules having immunoreactivity with pd-1 and ctla-4, and methods of use thereof
BR112018014615A2 (pt) * 2016-01-20 2018-12-11 The Scripps Research Institute composições de anticorpo para ror1 e métodos relacionados
US20170233472A1 (en) 2016-02-17 2017-08-17 Macrogenics, Inc. ROR1-Binding Molecules, and Methods of Use Thereof
JP7456723B2 (ja) 2016-04-06 2024-03-27 シーエスエル、リミテッド アテローム性動脈硬化症の治療方法
BR112018071105A2 (pt) 2016-04-15 2019-02-26 Macrogenics, Inc. conjugado de droga e anticorpo, molécula de ligação, composição farmacêutica e uso
BR112018074922B1 (pt) 2016-06-02 2022-10-25 Abbvie Inc Compostos agonistas de receptores de glucocorticoides, composição farmacêutica compreendendo ditos compostos e uso terapêutico dos mesmos
EP3484922A1 (en) 2016-07-14 2019-05-22 Genmab A/S Multispecific antibodies against cd40 and cd137
AU2017331739A1 (en) 2016-09-23 2019-03-07 Csl Limited Coagulation factor binding proteins and uses thereof
KR20190070977A (ko) 2016-11-01 2019-06-21 젠맵 비. 브이 폴리펩티드 변이체 및 그의 용도
US11242402B2 (en) 2016-12-23 2022-02-08 Macrogenics, Inc. ADAM9-binding molecules, and methods of use thereof
AU2018219887A1 (en) 2017-02-08 2019-08-22 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
NZ756224A (en) 2017-02-10 2024-02-23 Genmab Bv Polypeptide variants and uses thereof
CA3235295A1 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
SG11201907753TA (en) 2017-02-24 2019-09-27 Macrogenics Inc Bispecific binding molecules that are capable of binding cd137 and tumor antigens, and uses thereof
CA3055127A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Genmab A/S Antibodies against pd-l1
CN110914301A (zh) 2017-03-31 2020-03-24 健玛保控股有限公司 双特异性抗cd37抗体，单克隆抗cd37抗体及其使用方法
JP2020521807A (ja) 2017-05-09 2020-07-27 ブイアイビー ブイゼットダブリュVib Vzw 細菌感染を処置するための手段および方法
BR112019025328A2 (pt) 2017-06-07 2020-06-23 Genmab B.V. Composição farmacêutica, uso da composição farmacêutica, métodos para tratar um indivíduo tendo um câncer e para preparar uma composição farmacêutica, e, kit de partes.
CA3071211A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Genmab A/S Binding agents binding to pd-l1 and cd137 and use thereof
EP3717011B1 (en) 2017-11-29 2022-12-07 CSL Limited Method of treating or preventing ischemia-reperfusion injury
US10772970B2 (en) 2017-12-01 2020-09-15 Abbvie Inc. Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
TW201938194A (zh) 2017-12-05 2019-10-01 日商中外製藥股份有限公司 包含結合cd3及cd137的改變的抗體可變區之抗原結合分子
AU2018379502A1 (en) 2017-12-06 2020-06-18 Abclon Inc. Antibody or antigen binding fragment thereof for specifically recognizing B cell malignancy, chimeric antigen receptor comprising same, and use thereof
BR112020011810A2 (pt) 2017-12-12 2020-11-17 Macrogenics, Inc. molécula de ligação cd16 x antígeno de doença, composição farmacêutica, uso da composição farmacêutica, e método para o tratamento de uma doença
CN109957026A (zh) * 2017-12-22 2019-07-02 成都恩沐生物科技有限公司 共价多特异性抗体
CN109971713B (zh) * 2017-12-28 2023-06-20 上海细胞治疗研究院 稳定表达PD-1抗体的Muc1特异性CAR-T细胞及其用途
JP2021510740A (ja) 2018-01-24 2021-04-30 ゲンマブ ビー．ブイ． ポリペプチド変種およびそれらの用途
PE20220278A1 (es) 2018-02-08 2022-02-25 Dragonfly Therapeutics Inc Dominios variables de anticuerpos que se dirigen al receptor nkg2d
SG11202007572VA (en) * 2018-02-15 2020-09-29 Macrogenics Inc Variant cd3-binding domains and their use in combination therapies for the treatment of disease
PE20210339A1 (es) 2018-03-12 2021-02-22 Genmab As Anticuerpos
KR20210008380A (ko) 2018-05-03 2021-01-21 젠맵 비. 브이 항체 변이체 조합물 및 그의 용도
JP7091832B2 (ja) 2018-05-24 2022-06-28 オムロンヘルスケア株式会社 センサモジュール、センサモジュールの製造方法、及び血圧測定装置
EP3802621A4 (en) * 2018-05-31 2022-03-30 The Chinese University of Hong Kong COMPOSITION AND USE OF ARGININE FORTIFIERS FOR CANCER, OBESITY, METABOLIC DISEASES AND RELATED COMPLICATIONS AND COMORBIDITIES
MA52951A (fr) 2018-06-22 2021-04-28 Genmab Holding B V Anticorps anti-cd37 et anticorps anti-cd20, compositions et méthodes d'utilisation de ceux-ci
BR112020026432A2 (pt) 2018-07-13 2021-03-23 Genmab A/S variante de anticorpo, ácido nucleico isolado, vetor de expressão, ácido nucleico, combinação de ácidos nucleicos, veículo de dispensação, célula hospedeira recombinante, métodos para produção de uma variante de um anticorpo, para aumentar pelo menos uma função efetora de um anticorpo parental e para tratar uma doença, anticorpo, composição, composição farmacêutica, e, variante de anticorpo para uso
WO2020012038A1 (en) 2018-07-13 2020-01-16 Genmab A/S Trogocytosis-mediated therapy using cd38 antibodies
SG11202101152QA (en) * 2018-08-03 2021-03-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule containing two antigen-binding domains that are linked to each other
CN110873711B (zh) * 2018-09-04 2022-02-22 华瑞同康生物技术（深圳）有限公司 一种基于全自动化学发光分析仪的血清tk1检测试剂盒
CN113260634A (zh) * 2018-09-28 2021-08-13 中外制药株式会社 包含改变的抗体可变区的抗原结合分子
WO2020070313A1 (en) 2018-10-04 2020-04-09 Genmab Holding B.V. Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-cd37 antibodies
IT201800009282A1 (it) * 2018-10-09 2020-04-09 Metis Prec Medicine Sb Srl Nuovo agente terapeutico per il trattamento di un tumore e/o metastasi
WO2020094744A1 (en) 2018-11-06 2020-05-14 Genmab A/S Antibody formulation
EP3966241A1 (en) 2019-05-09 2022-03-16 Genmab B.V. Dosage regimens for a combination of anti-dr5 antibodies for use in treating cancer
JP2023500701A (ja) 2019-11-06 2023-01-10 ジェンマブ ビー．ブイ． 抗体変種の組み合わせおよびその使用
WO2021119761A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Hudson Institute of Medical Research Cxcl10 binding proteins and uses thereof
US20230272105A1 (en) 2020-01-16 2023-08-31 Genmab A/S Formulations of cd38 antibodies and uses thereof
WO2021155916A1 (en) 2020-02-04 2021-08-12 BioNTech SE Treatment involving antigen vaccination and binding agents binding to pd-l1 and cd137
CN115315446A (zh) 2020-03-06 2022-11-08 Go医疗股份有限公司 抗糖-cd44抗体及其用途
KR20220154757A (ko) 2020-03-18 2022-11-22 젠맵 에이/에스 B7h4에 결합하는 항체
EP4126969A1 (en) 2020-03-31 2023-02-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Dll3-targeting multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
US20230293680A1 (en) 2020-07-23 2023-09-21 Genmab B.V. A composition of anti-dr5 antibodies and an immunomodulatory imide drug for use in treating multiple myeloma
US20230287088A1 (en) 2020-08-06 2023-09-14 BioNTech SE Binding agents for coronavirus s protein
EP4208200A2 (en) 2020-09-02 2023-07-12 Genmab A/S Antibody therapy
KR20230066583A (ko) 2020-09-10 2023-05-16 젠맵 에이/에스 미만성 대 b-세포 림프종을 치료하기 위한 조합 요법에서의 cd3 및 cd20에 대한 이중특이적 항체
CN116437956A (zh) 2020-09-10 2023-07-14 健玛保 用于治疗慢性淋巴细胞白血病的针对cd3和cd20的双特异性抗体
AU2021351187A1 (en) 2020-10-02 2023-04-20 Genmab A/S Antibodies capable of binding to ROR2 and bispecific antibodies binding to ROR2 and CD3
EP4301782A1 (en) 2021-03-05 2024-01-10 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cd44 antibodies and their uses
IL305636A (en) 2021-03-12 2023-11-01 Genmab As Variants of non-activating antibodies
IL308300A (en) 2021-05-07 2024-01-01 Genmab As Pharmaceutical preparations containing bispecific antibodies that bind to B7H4 and CD3
IL309319A (en) 2021-06-21 2024-02-01 Genmab As Combined dosage regimen CD137 and PD-L1 binding agents
AU2022324456A1 (en) 2021-08-05 2024-02-15 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-muc4 antibodies and their uses
CA3230934A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cmet antibodies and their uses
CA3230933A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-lamp1 antibodies and their uses
US20230109496A1 (en) 2021-09-06 2023-04-06 Genmab B.V. Antibodies capable of binding to cd27, variants thereof and uses thereof
WO2023057571A1 (en) 2021-10-08 2023-04-13 Genmab A/S Antibodies binding to cd30 and cd3
WO2023174521A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Genmab A/S Binding agents binding to epcam and cd137
WO2023218051A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
WO2023218046A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
GB202214132D0 (en) 2022-09-27 2022-11-09 Coding Bio Ltd CLL1 binding molecules

Family Cites Families (148)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1905108A (en) 1929-06-15 1933-04-25 Koppers Co Delaware Distillation of gas liquor
US4347935A (en) 1979-05-16 1982-09-07 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Method and apparatus for electrostatically sorting biological cells
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
DE3378250D1 (en) 1982-04-22 1988-11-24 Ici Plc Continuous release formulations
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
US5169933A (en) * 1988-08-15 1992-12-08 Neorx Corporation Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging
EP1541682A3 (en) 1988-09-02 2005-07-06 Dyax Corp. Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
DE68928427T2 (de) 1988-09-15 1998-06-04 Univ Columbia Antikörper mit modifiziertem Kohlenhydratgehalt und Verfahren zur Herstellung und Verwendung
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US20040049014A1 (en) 1988-12-28 2004-03-11 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5166057A (en) 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
WO1991005548A1 (en) 1989-10-10 1991-05-02 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
EP0550436A1 (en) 1989-11-06 1993-07-14 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Protein microspheres and methods of using them
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
ATE356869T1 (de) 1990-01-12 2007-04-15 Amgen Fremont Inc Bildung von xenogenen antikörpern
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
FI85768C (fi) 1990-07-04 1992-05-25 Valtion Teknillinen Foerfarande foer utfoerning av ytplasmonresonansmaetning samt i foerfarandet anvaendbar givare.
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
AU660629B2 (en) 1990-10-01 1995-07-06 University Of Connecticut, The Targeting viruses and cells for selective internalization by cells
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
EP0580737B1 (en) 1991-04-10 2004-06-16 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
AU666852B2 (en) 1991-05-01 1996-02-29 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine A method for treating infectious respiratory diseases
ATE199647T1 (de) 1991-05-14 2001-03-15 Univ Connecticut Gerichtete abgabe von genen, die immunogene proteine kodieren
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
ATE195656T1 (de) 1991-06-05 2000-09-15 Univ Connecticut Zielgerichtete freisetzung von genen, die sekretorische proteine kodieren
DE69110032T2 (de) 1991-06-08 1995-12-21 Hewlett Packard Gmbh Verfahren und Gerät zur Feststellung und/oder Konzentrationsbestimmung von Biomolekülen.
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
US5637481A (en) * 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5843749A (en) 1991-07-26 1998-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ehk and Ror tyrosine kinases
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
JP4157160B2 (ja) 1991-12-13 2008-09-24 ゾーマ テクノロジー リミテッド 改変抗体可変領域の調製のための方法
WO1993014188A1 (en) 1992-01-17 1993-07-22 The Regents Of The University Of Michigan Targeted virus
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
AU3940293A (en) 1992-04-03 1993-11-08 Alexander T. YOUNG Gene therapy using targeted viral vectors
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
CA2146747C (en) 1992-10-09 2006-12-19 Brian A. Naughton Liver reserve cells
WO1994009817A1 (en) 1992-11-04 1994-05-11 City Of Hope Novel antibody construct
AU680459B2 (en) 1992-12-03 1997-07-31 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
US5877396A (en) 1993-04-23 1999-03-02 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Mice mutant for functional Fc receptors and method of treating autoimmune diseases
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US5464581A (en) 1993-08-02 1995-11-07 The Regents Of The University Of California Flow cytometer
US5483469A (en) 1993-08-02 1996-01-09 The Regents Of The University Of California Multiple sort flow cytometer
AU696293B2 (en) 1993-12-08 1998-09-03 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
DK0744958T3 (da) 1994-01-31 2003-10-20 Univ Boston Polyklonale antistofbiblioteker
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
US5643796A (en) 1994-10-14 1997-07-01 University Of Washington System for sensing droplet formation time delay in a flow cytometer
US5602039A (en) 1994-10-14 1997-02-11 The University Of Washington Flow cytometer jet monitor system
WO1996020698A2 (en) 1995-01-05 1996-07-11 The Board Of Regents Acting For And On Behalf Of The University Of Michigan Surface-modified nanoparticles and method of making and using same
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
AU5632296A (en) 1995-04-27 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JP2000507912A (ja) 1995-08-31 2000-06-27 アルカームズ コントロールド セラピューティックス，インコーポレイテッド 作用剤の徐放性組成物
US5736152A (en) 1995-10-27 1998-04-07 Atrix Laboratories, Inc. Non-polymeric sustained release delivery system
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
US5942328A (en) 1996-02-29 1999-08-24 International Business Machines Corporation Low dielectric constant amorphous fluorinated carbon and method of preparation
WO1997032572A2 (en) 1996-03-04 1997-09-12 The Penn State Research Foundation Materials and methods for enhancing cellular internalization
AU5711196A (en) 1996-03-14 1997-10-01 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule i
EP0904278A4 (en) 1996-03-22 1999-09-15 Human Genome Sciences Inc MOLECULE II INDUCER OF APOPTOSIS
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
GB9623820D0 (en) 1996-11-16 1997-01-08 Secr Defence Surface plasma resonance sensor
WO1998024893A2 (en) 1996-12-03 1998-06-11 Abgenix, Inc. TRANSGENIC MAMMALS HAVING HUMAN IG LOCI INCLUDING PLURAL VH AND Vλ REGIONS AND ANTIBODIES PRODUCED THEREFROM
PT954282E (pt) 1997-01-16 2005-06-30 Massachusetts Inst Technology Preparacao de particulas para inalacao
EP1007569B1 (en) 1997-02-11 2009-04-08 Immunomedics, Inc. Stimulation of an immune response with antibodies labeled with the alpha-galactosyl epitope
JP3876002B2 (ja) 1997-04-14 2007-01-31 ミクロメート・アクチエンゲゼルシャフト 抗ヒト抗原受容体を産生するための斬新な方法およびそれらの使用
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
JP4441112B2 (ja) 1997-11-03 2010-03-31 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド 新脈管形成および腫瘍増殖のインヒビターであるｖｅｇｉ
US6211477B1 (en) 1998-02-26 2001-04-03 Becton Dickinson And Company Electrostatic deceleration system for flow cytometer
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE458007T1 (de) 1998-04-20 2010-03-15 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
WO1999060382A1 (de) 1998-05-20 1999-11-25 Graffinity Pharmaceutical Design Gmbh Spr-sensor zur gleichzeitigen erfassung einer vielzahl von in fluider form vorliegenden proben
US6289286B1 (en) 1998-05-29 2001-09-11 Biacore Ab Surface regeneration of biosensors and characterization of biomolecules associated therewith
AU747231B2 (en) 1998-06-24 2002-05-09 Alkermes, Inc. Large porous particles emitted from an inhaler
US6311415B1 (en) 1998-09-14 2001-11-06 Lind Shoe Company Bowling shoe with replaceable tip
PL209786B1 (pl) 1999-01-15 2011-10-31 Genentech Inc Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna
US6676927B1 (en) 1999-01-20 2004-01-13 The Rockefeller University Animal model and methods for its use in the selection of cytotoxic antibodies
EP2264166B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US7527787B2 (en) * 2005-10-19 2009-05-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
US7504256B1 (en) 1999-10-19 2009-03-17 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing polypeptide
EP1266014A2 (en) * 2000-03-24 2002-12-18 Peter Kufer Multifunctional polypeptides comprising a binding site to an epitope of the nkg2d receptor complex
CA2424977C (en) 2000-10-06 2008-03-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
DK2314686T4 (da) 2000-10-06 2023-08-21 Kyowa Kirin Co Ltd Celler, der danner antistofsammensætninger
WO2003024191A2 (en) 2001-09-21 2003-03-27 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to cancer-associated antigen cytokeratin 8 and methods of use thereof
JP4347694B2 (ja) 2001-10-16 2009-10-21 レイベン バイオテクノロジーズ，インコーポレイティド 癌関連抗原ｃｄ４６に結合する抗体およびその使用方法
WO2003035835A2 (en) 2001-10-25 2003-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
WO2003087340A2 (en) 2002-04-12 2003-10-23 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to integrin alpha-v-beta-6 and methods of use thereof
EP1497332A1 (en) * 2002-04-29 2005-01-19 GenPat77 Pharmacogenetics AG Bispecific antibody binding tcr and tirc7 and its use in therapy and diagnosis
AU2003225294A1 (en) 2002-05-03 2003-11-17 Raven Biotechnologies, Inc. Alcam and alcam modulators
DE60334453D1 (de) 2002-05-30 2010-11-18 Macrogenics Inc Cd16a bindungsproteine und verwendung zur behandlung von immunkrankheiten
CA2490399C (en) 2002-06-19 2015-10-06 Raven Biotechnologies, Inc. Novel raag10 cell surface target and a family of antibodies recognizing that target
CA2505633A1 (en) 2002-11-13 2004-05-27 Raven Biotechnologies, Inc. Antigen pipa and antibodies that bind thereto
US7534427B2 (en) * 2002-12-31 2009-05-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B cell malignancies and autoimmune diseases using unconjugated antibodies and conjugated antibodies and antibody combinations and fusion proteins
JP2006524039A (ja) 2003-01-09 2006-10-26 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 変異型Ｆｃ領域を含む抗体の同定および作製ならびにその利用法
US7960512B2 (en) 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
CN100503607C (zh) 2003-06-02 2009-06-24 新疆华世丹药物研究有限责任公司 去氢骆驼蓬碱衍生物类化合物及其应用
EP1664082B1 (en) 2003-09-18 2014-03-05 MacroGenics West, Inc. Kid3 and anti-kid3 antibodies
WO2005028507A1 (en) * 2003-09-24 2005-03-31 Monash University CRYSTAL STRUCTURE OF CD3&epsiv;Ϝ/OKT3 COMPLEX
AU2003271174A1 (en) * 2003-10-10 2005-04-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Double specific antibodies substituting for functional protein
KR20070004078A (ko) * 2004-03-31 2007-01-05 센토코 인코포레이티드 인간 ｇｌｐ-1 모방체, 조성물, 방법 및 용도
AU2005247301B2 (en) 2004-04-16 2011-08-18 Macrogenics, Inc. FC&gamma;RIIB-specific antibodies and methods of use thereof
WO2005121179A2 (en) 2004-06-07 2005-12-22 Raven Biotechnologies, Inc. Transferrin receptor antibodies
NZ582684A (en) * 2004-06-18 2011-05-27 Ambrx Inc Use of an antibody or binding fragment thereof comprising a non naturally encoded amino acid coupled to a linker
AU2005335714B2 (en) 2004-11-10 2012-07-26 Macrogenics, Inc. Engineering Fc antibody regions to confer effector function
EP1833849A4 (en) 2004-12-15 2009-08-05 Macrogenics Inc FC-GAMMA-RIIB-SPECIFIC ANTIBODIES AND METHODS FOR THEIR USE
CA2593786A1 (en) 2005-01-12 2006-07-20 Raven Biotechnologies, Inc. Kid31 and antibodies that bind thereto
CA2596115A1 (en) 2005-01-31 2006-08-10 Raven Biotechnologies, Inc. Luca2 and antibodies that bind thereto
US20060171952A1 (en) 2005-02-02 2006-08-03 Mather Jennie P JAM-3 and antibodies that bind thereto
CA2596273C (en) 2005-02-02 2017-11-14 Raven Biotechnologies, Inc. Adam-9 modulators
JP5328156B2 (ja) 2005-02-03 2013-10-30 マクロジェニックス ウエスト， インコーポレイテッド オンコスタチンｍレセプターに対する抗体
MX2007009403A (es) 2005-02-04 2007-10-02 Raven Biotechnologies Inc Anticuerpos que se unen a epha2 y metodos para usar los mismos.
US20060193849A1 (en) * 2005-02-25 2006-08-31 Antisoma Plc Biological materials and uses thereof
US9296816B2 (en) * 2005-04-15 2016-03-29 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
EP2094307A4 (en) 2006-11-08 2015-08-26 Macrogenics West Inc TES7 AND THEREO BINDING ANTIBODIES
WO2008150494A1 (en) * 2007-05-30 2008-12-11 Xencor, Inc. Methods and compositions for inhibiting cd32b expressing cells
US11392902B2 (en) 2017-06-06 2022-07-19 United Parcel Service Of America, Inc. Systems, methods, apparatuses and computer program products for providing notification of items for pickup and delivery

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