JP2015157833A - 共有結合型ダイアボディ及びその使用 - Google Patents

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Abstract

【課題】ダイアボディ分子と、免疫疾患、感染症、中毒、癌などの様々な疾患及び障害の治療における該分子の使用に関する。【解決手段】ダイアボディ分子は、同一又は異なる抗原上の同一又は異なるエピトープを認識しうる、少なくとも２つのエピトープ結合部位を形成するように会合している２つのポリペプチド鎖を有する。更に、抗原は同一の分子に由来しても、異なる分子に由来してもよい。ダイアボディ分子の個々のポリペプチド鎖は、例えば、これに限定されないが、各ポリペプチド鎖内に存在するシステイン残基のジスルフィド結合により非ペプチド結合型共有結合を介して共有結合されていてよい。特定の実施形態においては、当該ダイアボディ分子はＦｃ領域を更に有し、これにより抗体様の機能を分子中に遺伝子操作的に導入できる。【選択図】図１３

Description

関連出願の相互参照
本出願は、（２００５年４月１５日に出願され、期限が過ぎた）米国特許出願第６０／
６７１，６５７号、（２００６年４月１７日に出願され、係属中の）米国特許出願第１１
／４０９，３３９、（２００６年４月１７日に出願され、期限が過ぎた）国際特許出願Ｐ
ＣＴ／ＵＳ０６／０１４４８１号、（２００７年６月２１日に出願され、期限が過ぎた）
米国特許出願第６０／９４５，５２３号、（２００８年１月４日に出願され、期限が過ぎ
た）米国特許出願第６１／０１９，０５１、（２００８年６月１３日に出願され、係属中
の）米国特許出願第１２／１３８，８６７、（２００８年６月１３日に出願され、係属中
の）国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０８／０６６９５７号、（２００８年１２月１９日に出願
され、係属中の）米国特許出願第６１／１３９，３５２、（２００９年２月２７日に出願
され、係属中の）米国特許出願第６１／１５６，０３５及び（２００９年１０月３０日に
出願され、係属中の）米国特許出願第６１／２５６，７７９の利益を主張するものであり
、前記出願の全てを参照することによりその全体を本明細書に組み入れることとする。
本発明は、ダイアボディ分子、あるいは「二重親和性再標的化試薬（ｄｕａｌ ａｆｆ
ｉｎｉｔｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＤＡＲＴＳ））」と称される
分子に関し、免疫不全や癌を含む様々な疾患や障害の治療におけるその使用に関する。本
発明のダイアボディ分子は、同一又は異なるエピトープを認識しうるエピトープ結合部位
を少なくとも２つ形成するように結合したポリペプチド鎖を少なくとも２つ有する。また
、上記エピトープは、同一又は異なる分子由来であってよく、同一又は異なる細胞に位置
してよい。ダイアボディ分子の個々のポリペプチド鎖は、非限定的な例として、各ポリペ
プチド鎖内にあるシステイン残基のジスルフィド結合などの、非ペプチド共有結合を介し
て共有的に結合されてよい。特定の実施形態では、本発明のダイアボディ分子は、分子に
抗体様の機能性を持たせるＦｃ領域を更に有する。
共有結合型ダイアボディの設計は、単鎖Ｆｖ構築物（ｓｃＦｖ）に基づいている（Ｈｏ
ｌｌｉｇｅｒら、（１９９３）Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ：Ｓｍａｌｌ Ｂｉｖａｌｅｎｔ Ａ
ｎｄ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８；参照することによりその
全体を本明細書に組み入れることとする）。完全な形である未改変のＩｇＧでは、ＶＬ及
びＶＨドメインはそれぞれ異なるポリペプチド鎖、即ち、軽鎖と重鎖上に位置する。抗体
軽鎖と抗体重鎖との相互作用、特に、ＶＬドメインとＶＨドメインとの相互作用は、抗体
のエピトープ結合部位の１つを形成する。これに対して、ｓｃＦｖ構築物は、単一ポリペ
プチド鎖に含まれるように抗体のＶＬ及びＶＨドメインを有し、これらのドメインは、十
分な長さの可動性リンカーにより分離されており、２つのドメインを自己集合させて機能
的エピトープ結合部位になる。不十分な長さ（約１２アミノ酸残基以下）のリンカーによ
りドメインの自己集合が不可能な場合には、２つのｓｃＦｖ構築物が相互作用して、一方
の鎖のＶＬが他方のＶＨと結合している二価の分子を形成する（Ｍａｒｖｉｎら、（２０
０５）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ Ｔｏ ＩｇＧ１ｉｋｅ Ｂｉｓ
ｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．２６
：６４９−６５８に概説されている）。更に、上記構築物のＣ末端へのシステイン残基の
添加により、ポリペプチド鎖がジスルフィド結合し、得られた二量体を二価分子の結合特
性を妨げずに安定化することが示されている（例えば、Ｏｌａｆｓｅｎら、（２００４）
Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ａｎｔｉ−ＣＥＡ Ｄｉａｂｏ
ｄｙ Ａｌｌｏｗｓ Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ａｎｄ
Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ Ｆｏｒ Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｒ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１７：２１−２７参照）。更に、
異なる特異性のＶＬドメインとＶＨドメインを選択する場合には、二価であるだけでなく
、二重特異性でもある分子が構築されることもある。
二価のダイアボディは、治療や免疫診断を含む広範囲に応用される。二価性は、様々な
応用におけるダイアボディの設計と操作の適応性を大きくして、多重結合抗原への親和性
を強化し、異なる抗原を架橋し、両標的抗原の存在に依存する特異的細胞型に直接的にタ
ーゲッティングすることができる。結合価の増加、低解離速度及び（５０ｋＤａ以下の小
さなサイズのダイアボディにおける）循環からの迅速なクリアランスにより、本分野で知
られているダイアボディ分子は、腫瘍イメージングの分野における特有の使用も示されて
いる。（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄら，（１９９７），Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｕｍｏｕｒ Ｔ
ａｒｇｅｔｉｎｇ Ｂｙ Ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｄｉａｂｏｄ
ｉｅｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｅｎｇ．１０：１２２１）。特に重要なことは異なる細胞の架橋、例えば、細胞毒性Ｔ
細胞の腫瘍細胞への架橋である（Ｓｔａｅｒｚら，（１９８５），Ｈｙｂｒｉｄ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ Ｃａｎ Ｔａｒｇｅｔ Ｓｉｔｅｓ Ｆｏｒ Ａｔｔａｃｋ Ｂｙ Ｔ
Ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：６２８−６３１及びＨｏｌｌｉｇｅｒら，（１９
９６），Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｋｉｌｌｉｎｇ Ｏｆ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｃｅｌｌｓ Ｂ
ｙ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−Ｃｅｌｌｓ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｂｙ Ａ Ｂｉｓｐｅｃ
ｉｆｉｃ Ｄｉａｂｏｄｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９：２９９−３０５）。ダイアボ
ディのエピトープ結合ドメインは、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又はその
他の単核細胞上に発現されるＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３２又はＣＤ６４などの免疫エフェ
クター細胞の表面決定因子に特異性を示してもよい。多くの研究において、エフェクター
細胞決定因子、例えばＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合するダイアボディがエフェクター
細胞を活性化することも見出されている（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，（１９９６），Ｓｐｅｃ
ｉｆｉｃ Ｋｉｌｌｉｎｇ Ｏｆ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｃｅｌｌｓ Ｂｙ Ｃｙｔｏｔｏ
ｘｉｃ Ｔ−Ｃｅｌｌｓ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｂｙ Ａ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｉａ
ｂｏｄｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９：２９９−３０５及びＨｏｌｌｉｇｅｒら，（１
９９９），Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）−Ｓｐｅｃｉ
ｆｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｉｎ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ
Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｂｙ Ａｎｔｉ−ＣＤ ３ ｘ Ａｎｔｉ−ＣＥＡ Ｂｉｓｐｅｃｉ
ｆｉｃ Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｂ７ ｘ Ａｎｔｉ−ＣＥＡ Ｂｉｓｐｅｃｉｆ
ｉｃ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２９０９−２９
１６）。通常、エフェクター細胞の活性化は、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用を介してエフェク
ター細胞へ抗原結合抗体が結合することにより引き起こされる。このように、この点に関
して、本発明のダイアボディ分子は、Ｆｃドメイン（例えば、本技術分野で公知の又は本
明細書に例示（例えば、ＡＤＣＣアッセイ）されるエフェクター機能分析により分析され
る）を有するか否かとは無関係にＩｇと同様の機能性を示してもよい。腫瘍及びエフェク
ター細胞を架橋することにより、ダイアボディは、エフェクター細胞を腫瘍細胞に近接さ
せるだけでなく、腫瘍を有効に殺す働きをする（例えば、Ｃａｏら，（２００３），Ｂｉ
ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ Ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃｓ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１７１−１９７参照、参照す
ることによりその全体を本明細書に組み入れることとする）。
２．１ エフェクター細胞受容体及びその免疫系における役割
従来の免疫機能では、抗原−抗体複合体の免疫系の細胞との相互作用は、抗体依存性細
胞毒性などのエフェクター機能から、肥満細胞脱顆粒化、食作用、リンパ球増殖や抗体分
泌の制御などの免疫調節シグナルに至る多様な応答ををもたらす。これらの相互作用の全
てが、抗体のＦｃドメイン又は免疫複合体の造血細胞上の特定の細胞表面受容体への結合
を介して開始される。抗体及び免疫複合体により引き起こされる細胞性応答の多様性は、
Ｆｃ受容体の構造的不均一性による。Ｆｃ受容体は、細胞内シグナル伝達を仲介している
と考えられる、構造的に関連する抗原結合ドメインを共有する。
タンパク質の免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーであるＦｃγＲ受容
体は、免疫グロブリン分子のＦｃγタンパク質に結合できる表面糖タンパク質である。フ
ァミリーの各メンバーは、Ｆｃγ受容体のα鎖上の認識ドメインを介して１つ又は複数の
アイソタイプの免疫グロブリンを認識する。Ｆｃγ受容体は、免疫グロブリンのサブタイ
プに対するその特異性により定義される。ＩｇＧに対するＦｃγ受容体はＦｃγＲと、Ｉ
ｇＥに対するものはＦｃεＲと、ＩｇＡに対するものはＦｃαＲと呼ばれる。異なる補助
細胞は異なるアイソタイプの抗体のＦｃγ受容体を有し、抗体のアイソタイプは与えられ
た応答にどの補助細胞が携わるかを決定する（Ｒａｖｅｔｃｈ Ｊ．Ｖ．ら，（１９９１
），Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２
；Ｇｅｒｂｅｒ Ｊ．Ｓ．ら，（２００１），Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ Ａｎｄ Ｉｎｈ
ｉｂｉｔｏｒｙ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｏｒｉｇｉｎａｔｉｎｇ Ｆｒｏｍ Ｔｈｅ Ｍａｃ
ｒｏｐｈａｇｅ Ｆｃｇａｍｍａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｉ
ｎｆｅｃｔｉｏｎ，３： １３１−１３９；Ｂｉｌｌａｄｅａｕ Ｄ．Ｄ．ら，（２００
２），ＩＴＡＭｓ Ｖｅｒｓｕｓ ＩＴＩＭｓ：Ｓｔｒｉｋｉｎｇ Ａ Ｂａｌａｎｃｅ
Ｄｕｒｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２（１０９）：１６１−１６８１；Ｒａ
ｖｅｔｃｈ Ｊ．Ｖ．ら，（２０００），Ｉｍｍｕｎｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９０：８４−８９；Ｒａｖｅｔｃｈ Ｊ．Ｖ．ら，（
２００１），ＩｇＧ Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１９：２７５−９０；Ｒａｖｅｔｃｈ Ｊ．Ｖ．（１９９４），Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｓ： Ｒｕｂｏｒ Ｒｅｄｕｘ，Ｃｅｌｌ，７８（４）：５５３−６０に概説されている
）。異なるＦｃγ受容体、それらを発現する細胞、それらのアイソタイプ特異性を表１に
まとめる（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ
Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，第４版，１９９９，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ Ｌｔｄ／Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋから引用
）。
Ｆｃγ受容体
このファミリーの各メンバーは、免疫グロブリン関連ドメインのＣ２セットに関係する
細胞外ドメイン、１回膜貫通ドメイン及び可変長の細胞質内ドメインを有する内在性膜糖
タンパク質である。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩ
ＩＩ（ＣＤ１６）と名付けられた３種の公知ＦｃγＲがある。３種の受容体は異なる遺伝
子によりコードされる。しかし、３種のファミリーメンバー間の広範な相同性は、これら
が共通の前駆細胞から、恐らくは遺伝子複製により生じたことを示唆する。
ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）
ＦｃγＲＩＩタンパク質は４０ＫＤａの内在性膜糖タンパク質であり、モノマーＩｇに
対して低親和性（１０６Ｍ−１）であるため複合体化したＩｇＧとだけ結合する。この受
容体は、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好中球、肥満細胞及び血小板を含む
全ての造血細胞上に存在する最も広く発現されているＦｃγＲである。ＦｃγＲＩＩは、
その免疫グロブリン結合鎖中に免疫グロブリン様領域を２つだけ有し、従って、ＩｇＧに
対してＦｃγＲＩより遥かに低い親和性を有する。３種のヒトＦｃγＲＩＩ遺伝子（Ｆｃ
γＲＩＩ−Ａ、ＦｃγＲＩＩ−Ｂ及びＦｃγＲＩＩ−Ｃ）が存在し、それらの全てが凝集
体又は免疫複合体のＩｇＧと結合する。
ＦｃγＲＩＩ−ＡとＦｃγＲＩＩ−Ｂとには細胞質ドメイン内に明確な相違があるので
、受容体ライゲーションに対して２つの機能的に異種の応答を創出する。基本的な相違は
、Ａアイソフォームが食作用や呼吸バーストなどの細胞活性化に至る細胞内シグナル伝達
を開始するのに対し、Ｂアイソフォームは、例えばＢ細胞活性化を抑制する抑制シグナル
を開始することにある。
ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）
このクラスの不均一性のため、ＦｃγＲＩＩＩのサイズはマウス及びヒトで４０〜８０
ｋＤａの範囲にわたっている。２つのヒト遺伝子が２種の転写産物、即ち、内在性膜糖タ
ンパク質のＦｃγＲＩＩＩＡと、グリコシルホスファチジル−イノシトール（ＧＰＩ）結
合型のＦｃγＲＩＩＩＢとをコードしている。１つのマウス遺伝子は膜貫通ヒトＦｃγＲ
ＩＩＩＡに相同性を有するＦｃγＲＩＩＩをコードしている。ＦｃγＲＩＩＩは他の２つ
のＦｃγＲのそれぞれと構造上の特徴を共有する。ＦｃγＲＩＩと同様に、ＦｃγＲＩＩ
Ｉは低い親和性でＩｇＧと結合し、対応する２つの細胞外Ｉｇ様ドメインを含む。Ｆｃγ
ＲＩＩＩＡはマクロファージや肥満細胞に発現され、ＮＫ細胞では唯一のＦｃγＲである
。ＧＰＩ結合ＦｃγＲＩＩＩＢは、現在、ヒト好中球でのみ発現されることが知られてい
る。
ＦｃγＲを介するシグナル伝達
活性化と抑制の両方のシグナルは、ライゲーション後にＦｃγＲを介して伝達される。
これらの正反対の機能は、異なる受容体アイソフォーム間の構造上相違によるものである
。受容体の細胞質内シグナル伝達ドメイン内の、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（
ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ
ｍｏｔｉｆ：ＩＴＡＭ）又は免疫受容体チロシン系抑制モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃ
ｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ：ＩＴ
ＩＭ）と称される２つの異なるドメインが、この異なる応答の原因となる。これらの構造
体への異なる細胞質酵素の動員が、ＦｃγＲ媒介細胞応答の結果を規定する。ＩＴＡＭ含
有ＦｃγＲ複合体にはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＩＡが含まれるが、
ＩＴＩＭ含有複合体にはＦｃγＲＩＩＢだけが含まれる。
ヒト好中球はＦｃγＲＩＩＡ遺伝子を発現する。免疫複合体又は特異的抗体架橋を介す
るＦｃγＲＩＩＡクラスター形成は、ＩＴＡＭを、ＩＴＡＭリン酸化を促進する受容体関
連キナーゼとともに凝集させる。ＩＴＡＭリン酸化はＳｙｋキナーゼに対するドッキング
部位として働き、Ｓｙｋキナーゼの活性化は下流の基質（例えば、ＰＩ３Ｋ）の活性化を
引き起こす。細胞活性化により炎症誘発性メディエーターが放出される。
ＦｃγＲＩＩＢ遺伝子はＢリンパ球上に発現され、その細胞外ドメインはＦｃγＲＩＩ
Ａと９６％同一であって、識別できない仕方でＩｇＧ複合体に結合する。ＦｃγＲＩＩＢ
の細胞質ドメイン中にＩＴＩＭが存在することにより、ＦｃγＲのこの抑制サブクラスが
規定される。最近、この抑制の分子的機序が確立された。活性化性ＦｃγＲとともに連結
されると、ＦｃγＲＩＩＢ中のＩＴＩＭはリン酸化されて、イノシトールポリリン酸５’
−ホスファターゼ（ＳＨＩＰ）のＳＨ２ドメインを引き付け、これがＩＴＡＭ含有Ｆｃγ
Ｒ介在チロシンキナーゼ活性化の結果として放出されたホスホイノシトールメッセンジャ
ーを加水分解し、その結果、細胞内Ｃａ＋＋の流入を妨げる。従って、ＦｃγＲＩＩＢの
架橋は、ＦｃγＲライゲーションに対する活性化応答を減失させ、細胞応答性を抑制する
。このようにしてＢ細胞活性化、Ｂ細胞増殖及び抗体分泌が停止する。
Figure 2015157833
本発明は、共有結合型ダイアボディ及び／又は共有結合型ダイアボディ分子、ならびに
癌、自己免疫疾患、アレルギー疾患、及び細菌、真菌若しくはウイルスが原因の感染症を
含む各種の疾患及び障害の治療におけるその使用に関する。好ましくは、本発明のダイア
ボディは２つの異なる細胞上の２つの異なるエピトープに結合することができ、ダイアボ
ディが上記２つの細胞を寄せ集めることができるように、第１のエピトープは第２のエピ
トープとは異なる細胞型に発現される。
一実施形態において、本発明は共有結合型二重特異性ダイアボディに関し、該ダイアボ
ディは第１及び第２のポリペプチド鎖を有し、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエ
ピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含
む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可
変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を含む第２のドメイン、及び、場合により（ｉｉｉ）少
なくとも１個のシステイン残基を含む第３のドメインを有し、第１のドメインと第２のド
メインとは、第１のドメインと第２のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成し
ないように共有結合で連結されている。第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロ
ブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の
免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を含む第５のドメイン、及び、
場合により（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む第６のドメインを有し、第
４のドメインと第５のドメインとは、第４のドメインと第５のドメインとが会合してエピ
トープ結合部位を形成しないように共有結合で連結されている。そして、第１のポリペプ
チド鎖と第２のポリペプチド鎖とは共有結合（ペプチド結合を除く）で連結されており、
第１のドメインと第５のドメインとが会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合
部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成し、第２のドメインと第４のドメインが会合して、第２
のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成している。
別の実施形態において、本発明は共有結合型二重特異性ダイアボディに関し、該ダイア
ボディは第１及び第２のポリペプチド鎖を有し、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１の
エピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を
含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖
可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を含む第２のドメイン、及び（ｉｉｉ）Ｆｃドメイン
又はその一部を含む第３のドメインを有し、第１のドメインと第２のドメインとは、第１
のドメインと第２のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結
合で連結されている。第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変
ドメインの結合領域（ＶＬ２）を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの
重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を含む第５のドメインを有し、第４のドメインと
第５のドメインとは、第３のドメインと第４のドメインとが会合してエピトープ結合部位
を形成しないように共有結合で連結されている。そして第１のポリペプチド鎖と第２のポ
リペプチド鎖とは、共有結合（ペプチド結合を除く）で連結されており、第１のドメイン
と第５のドメインが会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（
ＶＨ１）を形成し、第２のドメインと第４のドメインとが会合して、第２のエピトープと
結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成している。
ある態様において、本発明はダイアボディ分子に関し、該分子は第１及び第２のポリペ
プチド鎖を有し、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免
疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）
第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ
２）を含む第２のドメイン、及び（ｉｉｉ）Ｆｃドメイン又はその一部を含む第３のドメ
インを有し、第１のドメインと第２のドメインとは、第１のドメインと第２のドメインと
が会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合で連結されている。第２のポ
リペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）
を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（
ＶＨ１）を含む第５のドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む
第６のドメインを有し、第４のドメインと第５のドメインとは、第４のドメインと第５の
ドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合で連結されている
。第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とは、共有結合（ペプチド結合を除く）
で連結され、第１のドメインと第５のドメインとが会合して、第１のエピトープと結合す
る第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成し、第２のドメインと第４のドメインとが
会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成して
いる。
ある実施形態において、本発明は共有結合型二重特異性ダイアボディに関し、該ダイア
ボディはダイアボディ分子の二量体であり、各ダイアボディ分子は第１及び第２のポリペ
プチド鎖を有し、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免
疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）
第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ
２）を含む第２のドメイン、及び（ｉｉｉ）Ｆｃドメイン又はその一部を含む第３のドメ
インを有し、１のドメインと第２のドメインとは、第１のドメインと第２のドメインとが
会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合で連結されている。第２のポリ
ペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）を
含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（Ｖ
Ｈ１）を含む第５のドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む第
６のドメインを有し、第４のドメインと第５のドメインとは、第４のドメインと第５のド
メインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合で連結されている。
各ダイアボディ分子の第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は、共有結合（ペプ
チド結合を除く）で連結され、各ダイアボディ分子の第１のドメインと第５のドメインが
会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成し、
各ダイアボディ分子の第２のドメインと第４のドメインが会合して、第２のエピトープと
結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成している。
更に他の実施形態において、本発明は共有結合型四重特異性ダイアボディに関し、該ダ
イアボディはダイアボディ分子の二量体であり、第１のダイアボディ分子は第１及び第２
のポリペプチド鎖を有し、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な
第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含む第１のドメイン、
（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領
域（ＶＨ２）を含む第２のドメイン、及び（ｉｉｉ）Ｆｃドメイン又はその一部を含む第
３のドメインを有し、第１のドメインと第２のドメインとは、第１のドメインと第２のド
メインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合で連結されている。
第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（
ＶＬ２）を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結
合領域（ＶＨ１）を含む第５のドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残
基を含む第６のドメインを有し、第４のドメインと第５のドメインとは、第４のドメイン
と第５のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合で連結さ
れている。第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とは、共有結合（ペプチド結合
を除く）で連結され、第１のドメインと第５のドメインが会合して、第１のエピトープと
結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成し、第２のドメインと第４のドメイ
ンが会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成
している。そして第２のダイアボディ分子は第１及び第２のポリペプチド鎖を有し、第１
のポリペプチド鎖は、（ｉ）第３のエピトープに特異的な第３の免疫グロブリンの軽鎖可
変ドメインの結合領域（ＶＬ３）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第４のエピトープに特
異的な第４の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ４）を含む第２のドメ
イン、及び（ｉｉｉ）Ｆｃドメイン又はその一部を含む第３のドメインを有し、第１のド
メインと第２のドメインとは、第１のドメインと第２のドメインとが会合してエピトープ
結合部位を形成しないように共有結合で連結されている。。第２のポリペプチド鎖は、（
ｉ）第４の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ４）を含む第４のドメイ
ン、（ｉｉ）第３の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ３）を含む第５
のドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む第６のドメインを有
し、第４のドメインと第５のドメインとは、第４のドメインと第５のドメインとが会合し
てエピトープ結合部位を形成しないように共有結合で連結されている。第１のポリペプチ
ド鎖と第２のポリペプチド鎖とは、共有結合（ペプチド結合を除く）で連結され、第１の
ドメインと第５のドメインが会合して、第３のエピトープと結合する第１の結合部位（Ｖ
Ｌ３）（ＶＨ３）を形成し、第２のドメインと第４のドメインが会合して、第４のエピト
ープと結合する第２の結合部位（ＶＬ４）（ＶＨ４）を形成している。
本発明のある態様において、第１のエピトープ、第２のエピトープ、適宜に、第３のエ
ピトープ及び第４のエピトープは同一であり得る。他の態様では、第１のエピトープ、第
２のエピトープ、適宜に、第３のエピトープ及び第４のエピトープがそれぞれ他と異なっ
ていてもよい。第３のエピトープの結合ドメインを有する本発明の特定の態様では、第１
のエピトープと第３のエピトープとが同一であり得る。第４のエピトープの結合ドメイン
を有する本発明の特定の態様では、第１のエピトープと第４のエピトープとが同一であり
得る。第３のエピトープの結合ドメインを有する本発明の特定の態様では、第２のエピト
ープと第３のエピトープとが同一であり得る。第４のエピトープの結合ドメインを有する
本発明の特定の態様では、第２のエピトープと第４のエピトープとが同一であり得る。本
発明の好ましい態様では、第１のエピトープと第２のエピトープとは異なっている。第３
のエピトープの結合ドメインと第４のエピトープの結合ドメインとを有する本発明の更に
他の態様では、第３のエピトープと第４のエピトープとは異なっていてよい。前述の任意
の組合せは本発明に包含されることを理解すべきである。
本発明の特定の態様においては、ダイアボディ又はダイアボディ分子の第１のドメイン
と第５のドメインとを同一の免疫グロブリンから誘導することができる。別の態様では、
ダイアボディ又はダイアボディ分子の第２のドメインと第４のドメインとを同一の免疫グ
ロブリンから誘導することができる。更に別の態様では、ダイアボディ又はダイアボディ
分子の第１のドメインと第５のドメインを異なる免疫グロブリンから誘導することができ
る。更に別の態様では、ダイアボディ又はダイアボディ分子の第２のドメインと第４のド
メインとを異なる免疫グロブリンから誘導することができる。前述の任意の組合せは本発
明に包含されることを理解すべきである。
本発明のある態様において、ダイアボディ又はダイアボディ分子の第１のポリペプチド
鎖と第２のポリペプチド鎖との間の共有結合は、第１のポリペプチド鎖上の少なくとも１
個のシステイン残基と第２のポリペプチド鎖上の少なくとも１個のシステイン残基との間
のジスルフィド結合を介するものであり得る。ジスルフィド結合に関与する第１又は第２
のポリペプチド鎖上のシステイン残基は、第１、第２、第３、第４、第５及び第６のドメ
イン内を含めて、ポリペプチド鎖上のどこにでも存在することができる。具体的な実施形
態では、第１のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第１ドメインに、そして第２のポリ
ペプチド鎖上のシステイン残基は第５ドメインに存在する。第１、第２、第４のドメイン
と第５のドメインは結合に関与する可変領域に相当する。好ましい実施形態では、第１及
び第２のポリペプチド鎖間のジスルフィド結合に関与するシステイン残基は、それぞれ第
３及び第６のドメイン内に位置づけられる。この実施形態の特定の態様では、第１のポリ
ペプチド鎖の第３ドメインは、アミノ酸配列（配列番号：１７）によりコードされるヒト
κ軽鎖のＣ末端の６アミノ酸、ＦＮＲＧＥＣ（配列番号：２３）を有する。この実施形態
の別の態様では、第２のポリペプチド鎖の第６ドメインは、アミノ酸配列（配列番号：１
７）によりコードされるヒトκ軽鎖のＣ末端の６アミノ酸、ＦＮＲＧＥＣ（配列番号：２
３）を有する。この実施形態の更に別の態様では、第１のポリペプチド鎖の第３ドメイン
は、ヌクレオチド配列（配列番号：７８）によりコードされるヒトＩｇＧのヒンジドメイ
ンから誘導されるアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号：７７）を有する。この実施形態
の別の態様では、第２のポリペプチド鎖の第６ドメインは、ヌクレオチド配列（配列番号
：７８）によりコードされるヒトＩｇＧのヒンジドメインから誘導されるアミノ酸配列Ｖ
ＥＰＫＳＣ（配列番号：７７）を有する。この実施形態の特定の態様では、第１のポリペ
プチド鎖の第３ドメインは、ヒトκ軽鎖のＣ末端の６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号：
２３）を有し、そして第２のポリペプチド鎖の第６ドメインはアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ
（配列番号：７７）を有する。この実施形態の他の態様では、第２のポリペプチド鎖の第
６ドメインは、ヒトκ軽鎖のＣ末端の６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号：２３）を有し
、そして第１のポリペプチド鎖の第３ドメインはアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号：
７７）を有する。この実施形態の更に他の態様では、第１のポリペプチド鎖の第３ドメイ
ンは、ヒトκ軽鎖のＣ末端の６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号：２３）を有し、そして
第２のポリペプチド鎖の第６ドメインはヒンジドメインを有する。この実施形態の他の態
様では、第２のポリペプチド鎖の第６ドメインは、ヒトκ軽鎖のＣ末端の６アミノ酸ＦＮ
ＲＧＥＣ（配列番号；２３）を有し、そして第１のポリペプチド鎖の第３ドメインはヒン
ジドメインを有する。この実施形態の更に他の態様では、第１のポリペプチド鎖の第３ド
メインは、ヒトκ軽鎖のＣ末端の６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号：２３）を有し、そ
して第１のポリペプチド鎖の第６ドメインはＦｃドメイン又はその一部を有する。この実
施形態の更に他の態様では、第２のポリペプチド鎖の第６ドメインは、ヒトκ軽鎖のＣ末
端の６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号：２３）を有し、そして第１のポリペプチド鎖の
第３ドメインはＦｃドメイン又はその一部を有する。
他の実施形態において、ジスルフィド結合に関与する第１又は第２のポリペプチド鎖上
のシステイン残基は、第１のポリペプチド鎖の第１、第２又は第３ドメインの外側に、そ
して第２のポリペプチド鎖の第４、第５又は第６ドメインの外側に位置し得る。特に、第
１のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第１ドメインのＮ末端、又は第１ドメインのＣ
末端に存在し得る。第１のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第２ドメインのＮ末端、
又は第２ドメインのＣ末端に存在し得る。第１のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第
３ドメインのＮ末端、又は第３ドメインのＣ末端に存在し得る。更に、第２のポリペプチ
ド鎖上のシステイン残基は第４ドメインのＮ末端、又は第４ドメインのＣ末端に存在し得
る。第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第５ドメインのＮ末端、又は第５ドメイ
ンのＣ末端に存在し得る。従って、第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第６ドメ
インのＣ末端、又は第６ドメインのＮ末端に存在し得る。特定の態様では、ジスルフィド
結合は第１のポリペプチド鎖上の少なくとも２個のシステイン残基と第２のポリペプチド
鎖上の少なくとも２個のシステイン残基との間に位置し得る。第３ドメインと第６ドメイ
ンがＦｃドメイン又はその一部を含まない特定の態様では、システイン残基が第１のポリ
ペプチド鎖のＣ末端に、かつ第２のポリペプチド鎖のＣ末端にあり得る。前述の任意の組
合せは本発明に包含されることを理解すべきである。
上に記載した本発明の具体的な実施形態においては、本発明の共有結合型ダイアボディ
はダイアボディ分子の二量体を包含し、各ダイアボディ分子が第１及び第２のポリペプチ
ド鎖を有している。この実施形態のある態様では、ダイアボディ分子同士が、共有結合は
ペプチド結合ではないという条件で、共有結合で連結されて二量体を形成している。この
実施形態の好ましい態様では、共有結合が二量体の各ダイアボディ分子の第１ポリペプチ
ド鎖上にある少なくとも１個のシステイン残基間のジスルフィド結合である。本発明の更
に好ましい態様では、共有結合が二量体を形成している各ダイアボディ分子の第１ポリペ
プチド鎖上にある少なくとも１個のシステイン残基間のジスルフィド結合であるが、該少
なくとも１個のシステイン残基が各第１ポリペプチド鎖の第３ドメインに位置している。
本発明のある態様においては、第１のポリペプチド鎖上の第１ドメインが第２ドメイン
のＮ末端、又は第２ドメインのＣ末端であり得る。第１のポリペプチド鎖上の第１ドメイ
ンは第３ドメインのＮ末端、又は第３ドメインのＣ末端であり得る。第１のポリペプチド
鎖上の第２ドメインは第１ドメインのＮ末端、又は第１ドメインのＣ末端であり得る。更
に、第１のポリペプチド鎖上の第２ドメインは第３ドメインのＮ末端、又は第３ドメイン
のＣ末端であり得る。従って、第１のポリペプチド鎖上の第３ドメインは第１ドメインの
Ｎ末端、又は第１ドメインのＣ末端であり得る。第１のポリペプチド鎖上の第３ドメイン
は第２ドメインのＮ末端、又は第２ドメインのＣ末端であり得る。第２のポリペプチド鎖
に関しては、第４ドメインが第５ドメインのＮ末端、又は第５ドメインのＣ末端であり得
る。第４ドメインは第６ドメインのＮ末端、又は第６ドメインのＣ末端であり得る。第２
のポリペプチド鎖上の第５ドメインは第４ドメインのＮ末端、又は第４ドメインのＣ末端
であり得る。第２のポリペプチド鎖上の第５ドメインは第６ドメインのＮ末端、又は第６
ドメインのＣ末端であり得る。従って、第２のポリペプチド鎖上の第６ドメインは第４ド
メインのＮ末端、又は第４ドメインのＣ末端であり得る。第２のポリペプチド鎖上の第６
ドメインは第５ドメインのＮ末端、又は第５ドメインのＣ末端であり得る。前述の任意の
組合せは本発明に包含されることを理解すべきである。
ある実施形態において、第１ドメインと第２ドメインは第１のポリペプチド鎖上の第３
ドメインのＣ末端に位置することもできる。あるいは、第１ドメインと第２ドメインは第
１のポリペプチド鎖上の第３ドメインのＮ末端に位置することもできる。第２のポリペプ
チド鎖に関して、第４ドメインと第５ドメインは第６ドメインのＣ末端に位置することも
できる。あるいは、第４ドメインと第５ドメインは第６ドメインのＮ末端に存在すること
もできる。この実施形態の特定の態様では、本発明は共有結合型二重特異性ダイアボディ
に関し、該ダイアボディはダイアボディ分子の二量体であり、各ダイアボディ分子は第１
及び第２のポリペプチド鎖を有し、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに
特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含む第１のド
メイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン
の結合領域（ＶＨ２）を含む第２のドメイン、及び（ｉｉｉ）Ｆｃドメイン又はその一部
を含む第３のドメインを有し、第１のドメインと第２のドメインとは共有結合で連結され
ているが、第１のドメインと第２のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成する
ことはなく、第３のドメインは第１ドメインと第２ドメインの両方のＮ末端側に位置する
。第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域
（ＶＬ２）を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの
結合領域（ＶＨ１）を含む第５のドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン
残基を含む第６のドメインを有し、第４のドメインと第５のドメインとは共有結合で連結
されているが、第４のドメインと第５のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成
することはなく、各ダイアボディ分子の第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖
は、共有結合はペプチド結合ではないという条件で、共有結合で連結され、各ダイアボデ
ィ分子の第１のドメインと第５のドメインが会合して、第１のエピトープと結合する第１
の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成し、各ダイアボディ分子の第２のドメインと第４
のドメインが会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２
）を形成している。
更に別の実施形態において、本発明は共有結合型四重特異性ダイアボディに関し、該ダ
イアボディはダイアボディ分子の二量体であり、第１のダイアボディ分子は第１及び第２
のポリペプチド鎖を有し、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な
第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含む第１のドメイン、
（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領
域（ＶＨ２）を含む第２のドメイン、及び（ｉｉｉ）Ｆｃドメイン又はその一部を含む第
３のドメインを有し、第１のドメインと第２のドメインとは共有結合で連結されているが
、第１のドメインと第２のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成することはな
く、第３のドメインは第１ドメインと第２ドメインの両方のＮ末端側に位置している。第
２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（Ｖ
Ｌ２）を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合
領域（ＶＨ１）を含む第５のドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基
を含む第６のドメインを有し、第４のドメインと第５のドメインとは共有結合で連結され
ているが、第４のドメインと第５のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成する
ことはなく、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とは、共有結合はペプチド結
合ではないという条件で、共有結合で連結され、第１のドメインと第５のドメインとが会
合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成し、第
２のドメインと第４のドメインが会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位
（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成している。そして第２のダイアボディ分子は第１及び第２の
ポリペプチド鎖を有し、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第３のエピトープに特異的な第
３の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ３）を含む第１のドメイン、（
ｉｉ）第４のエピトープに特異的な第４の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域
（ＶＨ４）を含む第２のドメイン、及び（ｉｉｉ）Ｆｃドメイン又はその一部を含む第３
のドメインを有し、第１のドメインと第２のドメインとは共有結合で連結されているが、
第１のドメインと第２のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成することはなく
、第３のドメインは第１ドメインと第２ドメインの両方のＮ末端側に位置する。第２のポ
リペプチド鎖は、（ｉ）第４の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ４）
を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第３の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（
ＶＨ３）を含む第５のドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む
第６のドメインを有し、第４のドメインと第５のドメインとは共有結合で連結されている
が、第４のドメインと第５のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成することは
なく、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とは、共有結合はペプチド結合では
ないという条件で、共有結合で連結され、第１のドメインと第５のドメインとが会合して
、第３のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ３）（ＶＨ３）を形成し、第２のド
メインと第４のドメインとが会合して、第４のエピトープと結合する第２の結合部位（Ｖ
Ｌ４）（ＶＨ４）を形成している。
上述したように、個々のポリペプチド鎖上のドメインは共有結合で連結されている。特
定の態様では、第１と第２のドメイン間、第１と第３のドメイン間、第２と第３のドメイ
ン間、第４と第５のドメイン間、第４と第６のドメイン間、及び／又は第５と第６のドメ
イン間の共有結合はペプチド結合であり得る。特に、第１と第２のドメイン、及び第４と
第５のドメインは、第１と第２、及び第４と第５のドメインが結合部位を形成するように
は結合しない限り、それぞれ第３のドメイン及び第６のドメインにより、又は追加のアミ
ノ酸残基により分離され得る。アミノ酸残基の数は０、１、２、３、４、５、６、７、８
又は９個のアミノ酸残基であり得る。ある好ましい態様では、ドメイン間のアミノ酸残基
の数が８個である。
本発明のある態様では、Ｆｃドメインを含む第１及び第２のポリペプチド鎖のドメイン
、即ち、場合により、それぞれ第３及び第６のドメインは、該ドメインがヒンジ−Ｆｃ領
域を含むようにヒンジドメインを更に有することができる。これとは別の実施形態では、
第１のポリペプチド鎖又は第２のポリペプチド鎖が、Ｆｃドメインを含むことなくヒンジ
ドメインを有することができる。本発明で用いる重鎖、軽鎖、ヒンジ領域、Ｆｃドメイン
、及び／又はヒンジ−Ｆｃドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭを含
む、いずれの免疫グロブリン型にも由来することができる。好ましい態様では、免疫グロ
ブリン型はＩｇＧ又はそのいずれかのサブタイプ、即ちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若
しくはＩｇＧ４である。他の態様では、軽鎖及び重鎖が由来する免疫グロブリンはヒト化
又はキメラ化されたものである。
更に、ダイアボディ又はダイアボディ分子が結合する第１エピトープと第２エピトープ
、適宜に、第３エピトープと第４エピトープは、同一の抗原に由来する異なるエピトープ
であることも、異なる抗原に由来する異なるエピトープであることもできる。抗原は、抗
体を生成することができるどのような分子であってもよく、例えば、タンパク質、核酸、
細菌毒素、細胞表面マーカー、自己免疫マーカー、ウイルスタンパク質、薬物などである
。特定の態様では、ダイアボディの少なくとも１つのエピトープ結合部位は、Ｂ細胞、Ｔ
細胞、食細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞などの特定の細胞上の抗原に対
して特異的である。
本実施形態のある態様において、ダイアボディ又はダイアボディ分子の少なくとも１つ
のエピトープ結合部位はＦｃ受容体に特異的であり、該Ｆｃ受容体は活性化性Ｆｃ受容体
又は抑制性Ｆｃ受容体であり得る。特定の態様では、Ｆｃ受容体がＦｃγ受容体であり、
Ｆｃγ受容体はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ又はＦｃγＲＩＩＩ受容体である。より好まし
い態様では、ＦｃγＲＩＩＩ受容体がＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）受容体又はＦｃγ
ＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６Ｂ）受容体であり、更に好ましくは、ＦｃγＲＩＩＩ受容体がＦｃ
γＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）受容体である。別の好ましい態様では、ＦｃγＲＩＩ受容体
がＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）受容体又はＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）受容体であり
、更に好ましくは、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）受容体である。特に好ましい態様では
、ダイアボディの１つの結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的で、他の結合部位がＣＤ１６Ａに
特異的である。本発明の特定の実施形態では、ダイアボディ又はダイアボディ分子の少な
くとも１つのエピトープ結合部位が活性化性Ｆｃ受容体に特異的で、少なくとも１つの他
の部位が抑制性Ｆｃ受容体に特異的である。この実施形態のある態様では、活性化性Ｆｃ
受容体がＣＤ３２Ａで、抑制性Ｆｃ受容体がＣＤ３２Ｂである。この実施形態の他の態様
では、活性化性Ｆｃ受容体がＢＣＲで、抑制性Ｆｃ受容体がＣＤ３２Ｂである。この実施
形態の更に他の態様では、活性化性Ｆｃ受容体がＩｇＥＲＩで、抑制性Ｆｃ受容体がＣＤ
３２Ｂである。
１つのエピトープ結合部位がＣＤ１６Ａに特異的である場合には、ＶＬ及びＶＨドメイ
ンがマウス抗体３Ｇ８（その配列はクローニングされており、本明細書に明記される）の
ＶＬ及びＶＨドメインと同一であることも、類似していることもできる。１つのエピトー
プ結合部位がＣＤ３２Ａに特異的である他の場合には、ＶＬ及びＶＨドメインがマウス抗
体ＩＶ．３のＶＬ及びＶＨドメインと同一であることも、類似していることもできる。１
つのエピトープ結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的である更に他の場合には、ＶＬ及びＶＨド
メインがマウス抗体２Ｂ６（その配列はクローニングされており、本明細書に明記される
）のＶＬ及びＶＨドメインと同一であることも、類似していることもできる。３Ｇ８、２
Ｂ６及びＩＶ．３抗体のＶＬ又はＶＨドメインのいずれもが任意の組合せで使用できるこ
とを理解すべきである。本発明はまた、第１のエピトープがＣＤ３２Ｂに特異的で、第２
のエピトープがＣＤ１６Ａに特異的である二重特異性ダイアボディ又はダイアボディ分子
に関する。
他の態様においては、エピトープ結合部位が病原性抗原に特異的であり得る。本明細書
で用いる病原性抗原とは、癌、感染症、自己免疫疾患をはじめとする特定の病原性疾患に
関わる抗原のことである。従って、病原性抗原は腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、又
は自己免疫抗原であり得る。病原性抗原の例としては、限定するものではないが、リポ多
糖、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、呼吸器多核体ウイルス、西ナイルウイルス
（例えば、Ｅ１６及び／又はＥ５３抗原）、及び肝炎ウイルスに由来するウイルス抗原か
らなる群より選択されるウイルス抗原、核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、及びコラーゲンが挙
げられる。好ましくは、病原性抗原は中和抗原である。好ましい態様において、一方のエ
ピトープ結合部位がＣＤ１６Ａ又はＣＤ３２Ａに特異的である場合、他方のエピトープ結
合部位は自己免疫抗原を除く病原性抗原に特異的である。更に別の好ましい態様において
、一方のエピトープ結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的である場合、他方のエピトープ結合部
位はいずれかの病原性抗原に特異的である。具体的な実施形態では、本発明のダイアボデ
ィ分子は同一細胞上の２つの異なる抗原に結合し、例えば、一方の抗原結合部位は活性化
性Ｆｃ受容体に特異的であるが、他方は抑制性Ｆｃ受容体に特異的である。他の実施形態
では、ダイアボディ分子は２つの異なるウイルス中和エピトープ、例えば、限定するもの
ではないが、西ナイルウイルスのＥ１６及びＥ５３に結合する。
本発明の更に別の実施形態においては、本発明のダイアボディを用いて様々な疾患や障
害を治療することができる。従って、本発明は、有効量の本発明の共有結合型ダイアボデ
ィ又はダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含む疾患又は障害の
治療方法に関し、該ダイアボディ又はダイアボディ分子は、少なくとも１つの結合部位が
癌細胞の表面又は細菌やウイルス粒子の表面に発現される抗原のような病原性抗原に特異
的であり、そして少なくとも１つの他の結合部位がＦｃ受容体、例えば、ＣＤ１６Ａに特
異的である。
更に別の実施形態においては、本発明は、有効量の本発明のダイアボディ又はダイアボ
ディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含む疾患又は障害の治療方法に関し
、該ダイアボディ又はダイアボディ分子は、少なくとも１つの結合部位がＣＤ３２Ｂに特
異的であり、そして少なくとも１つの他の結合部位がＣＤ１６Ａに特異的である。
更に別の実施形態においては、本発明は、有効量の本発明の共有結合型ダイアボディ又
は共有結合型ダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含む、病原性
抗原に対する免疫寛容の誘発方法に関し、該ダイアボディ又はダイアボディ分子は、少な
くとも１つの結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的であり、そして少なくとも１つの他の結合部
位が該病原性抗原に特異的である。この実施形態のある態様では、病原性抗原はアレルゲ
ン又は、例えば、移植した組織に発現されるタンパク質などの、免疫寛容が望まれる別の
分子であり得る。
更に別の実施形態においては、本発明は、有効量の本発明の共有結合型ダイアボディ又
はダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含む解毒方法に関し、該
ダイアボディ又はダイアボディ分子は、少なくとも１つの結合部位が細胞表面マーカーに
特異的であり、そして少なくとも１つの他の結合部位が毒素に特異的である。特定の態様
では、投与される本発明のダイアボディは、１つの結合部位がＦｃのような細胞表面マー
カーに特異的で、他の結合部位が細菌毒素又は薬物に特異的であるものである。ある態様
では、上記細胞表面マーカーは赤血球上に存在しない。
３．１．定義
特に断らないかぎり、本明細書で用いる全ての技術用語、表記法、その他の科学用語又
は専門用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解する意味を有するものとする
。場合によっては、通常理解される意味の用語であっても、明確にするために、及び／又
は参考までに本明細書中で定義され、そうした定義を本明細書に含めても、当技術分野で
一般的に理解されている意味に対する実質的な相違を表すと必ずしも解釈されるべきでな
い。本発明の実施には、他に示されない限り、当技術分野内である（組換え法を含む）分
子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学及び免疫学の従来技術を利用するも
のとする。そうした技術は文献、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編，１９９９，２００１年の追補を含
む）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９８７，２００１年の追補を含む）；Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，２００１）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓら編，１９９４）；Ｔｈｅ Ｉｍｍｕ
ｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｄ．Ｗｉｌｄ編，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ
ＮＹ，１９９４）；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｇｒｅｇ Ｔ．
Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）；Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｒ．Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ，Ｗ．
Ｈ．Ａｌｂｅｒｔ及びＮ．Ａ．Ｓｔａｉｎｅｓ編，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ：ＶＣＨ Ｖｅｒｌ
ａｇｓ ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｂＨ，１９９３），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａ
ｎｅ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９９；並びにＢｅａｕｃａｇｅら編，Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００）に詳
しく説明されている。
本明細書中で用いる用語「抗体」は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体
、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体、一本鎖Ｆｖ
（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合二重特異
性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、細胞内抗体及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明
の抗体に対する抗Ｉｄ及び抗−抗Ｉｄ抗体を含む）、並びに上記のいずれかのエピトープ
結合断片を指す。特に、抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的
に活性な断片、即ち抗原結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子はいずれの
タイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例え
ば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラス
であってもよい。
本明細書中で用いる用語「免疫特異的に結合する」、「免疫特異的に認識する」、「特
異的に結合する」、「特異的に認識する」及び同様の用語は、抗原（例えば、エピトープ
又は免疫複合体）と特異的に結合するが、他の分子とは特異的に結合しない分子を指す。
抗原と特異的に結合する分子は、例えばイムノアッセイ、バイアコア（分子間相互作用解
析）、又は当技術分野で公知の他のアッセイで測定した際に、より低い親和性で他のペプ
チド又はポリペプチドと結合してもよい。好ましくは、抗原と特異的に結合する分子は他
のタンパク質と交差反応しない。抗原と特異的に結合する分子は、例えば、イムノアッセ
イ、バイアコア、又は当業者に周知の他の技法により同定することができる。
本明細書中で用いる用語「免疫複合体」は、少なくとも１つの標的分子と少なくとも１
つの異種Ｆｃγ領域含有ポリペプチドが互いと結合して、より大きな分子量の複合体を形
成するときに形成される構造体を指す。免疫複合体の例は抗原−抗体複合体であり、これ
は可溶性又は粒状（例えば、細胞表面上の抗原／抗体複合体）のいずれかであることがで
きる。
本明細書中で用いる用語「重鎖」、「軽鎖」、「可変領域」、「フレームワーク領域」
、「定常ドメイン」などは、免疫学分野でのそれらの通常の意味を有し、天然の免疫グロ
ブリン中のドメイン及び合成（例えば、組換え）結合タンパク質（例えば、ヒト化抗体、
一本鎖抗体、キメラ抗体など）の対応するドメインを指す。天然の免疫グロブリン（例え
ば、ＩｇＧ）の基本的な構造単位は、２本の軽鎖と２本の重鎖をもつ四量体であり、通常
は約１５０，０００Ｄａの糖タンパク質として発現される。各鎖のアミノ末端（「Ｎ」）
部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸からなる可変
領域を有する。各鎖のカルボキシ末端（「Ｃ」）部分は定常領域を規定しており、１つの
定常ドメインを有する軽鎖と、通常３つの定常ドメインとヒンジ領域を有する重鎖を有す
る。従って、ＩｇＧ分子の軽鎖の構造はｎ−ＶＬ−ＣＬ−ｃであり、ＩｇＧ重鎖の構造は
ｎ−ＶＨ−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−ｃ（ここでＨはヒンジ領域）である。ＩｇＧ分
子の可変領域は、抗原と接触する残基を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）と、フレームワー
クセグメントと呼ばれ、一般に構造を維持し、ＣＤＲループの位置を決定する（しかし、
特定のフレームワーク残基が抗原と接触してもよい）非ＣＤＲセグメントとから成る。従
って、ＶＬ及びＶＨドメインは、構造ｎ−ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３
、ＣＤＲ３、ＦＲ４−ｃを有する。
結合タンパク質又は抗体（本明細書では広義に定義される）に関して述べる場合、各ド
メインへのアミノ酸の帰属はカバット（Ｋａｂａｔ）のＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７
及び１９９１）の定義に従う。免疫グロブリンの成熟重鎖及び軽鎖の可変領域由来のアミ
ノ酸は、その鎖中のアミノ酸の位置によって指定される。カバットは多数の抗体のアミノ
酸配列を記載し、各サブグループに共通のアミノ酸配列を同定し、そして各アミノ酸に残
基番号を割り当てた。カバットのナンバリング方式は、問題の抗体を、保存アミノ酸を基
準にしたカバットの共通配列の１つとアライメントすることにより、彼の一覧表には含ま
れない抗体にまで拡張することができる。残基番号を割り当てるこの方法は、当該分野で
標準的になっており、キメラやヒト化変異体を含む様々な抗体において同等の位置のアミ
ノ酸を容易に同定する。例えば、ヒト抗体軽鎖の５０位のアミノ酸は、マウス抗体軽鎖の
５０位のアミノ酸と同等の位置を占めている。
本明細書中で用いる用語「重鎖」は、ＩｇＧ抗体の重鎖を特定するために使用される。
完全な天然ＩｇＧでは、重鎖は免疫グロブリンドメインＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及
びＣＨ３を有する。本明細書全体を通して、ＩｇＧ重鎖中の残基の番号付けは、Ｋａｂａ
ｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＨ１
，ＭＤ（１９９１）（参照することにより本明細書に明示的に組み入れる）におけるよう
なＥＵインデックスのそれである。「カバットにおけるようなＥＵインデックス」とは、
ヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の番号付けを指す。ヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメ
インを含むアミノ酸配列の例を、以下に記載する図１Ａ及び１Ｂに示す。図１Ａ及び１Ｂ
には、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の重鎖のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのア
ミノ酸配列も示されている。ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４アイソタイプのアミノ酸配
列は、重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成する、それぞれのヒンジ領域の最初と最後のシステイン残
基を同じ位置に配置することによって、ＩｇＧ１配列とアライメントされる。ＩｇＧ２と
ＩｇＧ３のヒンジ領域については、全ての残基がＥＵインデックスにより番号付けされる
とは限らない。
「ヒンジ領域」又は「ヒンジドメイン」は、一般的に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６か
らＰｒｏ２３０までの広がりとして定義される。ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域のアミノ酸配
列の例を図１Ａに示す（図１Ａでのアミノ酸残基はカバットシステムに従って番号付けさ
れている）。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、図１Ａに示されるように重鎖間Ｓ
−Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することにより、Ｉｇ
Ｇ１配列とアライメントさせることができる。
本明細書中で用いる用語「Ｆｃ領域」、「Ｆｃドメイン」又は同様の用語は、ＩｇＧ重
鎖のＣ末端領域を規定するために用いられる。ヒトＩｇＧ１を含むアミノ酸配列の例を図
１Ｂに示す。カバットシステムに従って番号付けしたとき、境界はわずかに変化するかも
知れないが、Ｆｃドメインはアミノ酸２３１からアミノ酸４４７まで延びている（図１Ｂ
でのアミノ酸残基はカバットシステムに従って番号付けされている）。図１Ｂには、Ｉｇ
ＧアイソタイプＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＦｃ領域のアミノ酸配列の例も示され
ている。
ＩｇＧのＦｃ領域は、２つの定常ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３を有する。ヒトＩｇＧＦ
ｃ領域のＣＨ２ドメインは、通常、カバットのナンバリングシステムに従ってアミノ酸２
３１からアミノ酸３４１まで延びている（図１Ｂ）。ヒトＩｇＧＦｃ領域のＣＨ３ドメイ
ンは、通常、カバットのナンバリングシステムに従ってアミノ酸３４２からアミノ酸４４
７まで延びている（図１Ｂ）。ヒトＩｇＧＦｃ領域のＣＨ２ドメイン（「Ｃγ２」ドメイ
ンとも呼ばれる）は、それが他のドメインと密接に対を形成していないという点で独特で
ある。むしろ、２つのＮ−結合分岐糖鎖が、完全な天然ＩｇＧの２つのＣＨ２ドメイン間
に介在している。
本明細書中で用いる用語「ＦｃγＲ結合タンパク質」、「ＦｃγＲ抗体」及び「抗Ｆｃ
γＲ抗体」は互換的に用いられ、様々な免疫グロブリン様タンパク質又は免疫グロブリン
由来タンパク質を指す。「ＦｃγＲ結合タンパク質」はＶＬ及び／又はＶＨドメインとの
相互作用を介してＦｃγＲと結合する（Ｆｃγ介在結合とは区別される）。ＦｃγＲ結合
タンパク質の例としては、完全ヒト抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体及びヒト化抗
体（例えば、２本の重鎖と２本の軽鎖を有する）、それらの断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａ
ｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片）、二官能性若しくは多官能性抗体（例えば、Ｌａｎｚ
ａｖｅｃｃｈｉａら，（１９８７），Ｔｈｅ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｈｙｂｒｉｄ Ｈｙｂｒｉ
ｄｏｍａｓ Ｔｏ Ｔａｒｇｅｔ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏ
ｃｙｔｅｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１０５−１１１参照）、一本鎖抗体（
例えば、Ｂｉｒｄら，（１９８８），Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂｉ
ｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−２６参照）、融合タ
ンパク質（例えば、ファージディスプレイ融合タンパク質）、「ミニボディ」（例えば、
米国特許第５，８３７，８２１号参照）、ならびにＶＬ及び／又はＶＨドメイン又はその
断片を有する他の抗原結合タンパク質が挙げられる。ある態様において、ＦｃγＲＩＩＩ
Ａ結合タンパク質は「四量体抗体」、即ち、一般的に天然のＩｇＧの構造を有し、かつ可
変ドメインと定常ドメイン、即ち、ＶＬドメインと軽鎖定常ドメインを有する軽鎖２本及
びＶＨドメインと重鎖ヒンジ及び定常ドメインを有する重鎖２本を有する。
本明細書中で用いる用語「ＦｃγＲ拮抗物質」及び類似の用語は、ＦｃγＲの少なくと
も１つの生物学的活性と拮抗する（例えば、シグナル伝達を遮断する）小分子を含む、タ
ンパク質及び非タンパク質性物質を指す。例えば、本発明の分子は、ＩｇＧのＦｃγＲへ
の結合を阻害することによってシグナル伝達を遮断する。
本明細書中で用いる、ポリペプチド又はタンパク質に関する用語「誘導体」は、アミノ
酸残基の置換、欠失又は付加の導入により改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチド
又はタンパク質を指す。本明細書中で用いる用語「誘導体」はまた、改変された、即ち、
ポリペプチド又はタンパク質への任意のタイプの分子の共有結合により改変されたポリペ
プチド又はタンパク質を指す。例えば、限定するものではないが、抗体は、例えば、グリ
コシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による
誘導体化、タンパク質分解切断、細胞性抗原又は他のタンパク質との結合などにより改変
されてよい。誘導体ポリペプチド又はタンパク質は、限定するものでないが、特定の化学
的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含め、当業者に公知
の技術を用いる化学的改変により作製することができる。更に、誘導体ポリペプチド又は
タンパク質誘導体は、それが誘導された元のポリペプチド又はタンパク質と同様の又は同
一の機能を保持する。
本明細書中で用いる、非タンパク質誘導体に関する用語「誘導体」は、第１の有機又は
無機分子の構造に基づいて形成される第２の有機又は無機分子を指す。有機分子の誘導体
としては、限定するものではないが、例えば、ヒドロキシル、メチル、エチル、カルボキ
シル又はアミン基の付加又は欠失により、改変された分子を挙げることができる。有機分
子はまた、エステル化、アルキル化及び／又はリン酸化されてもよい。
本明細書中で用いる用語「ダイアボディ分子」は、２本又はそれ以上のポリペプチド鎖
又はタンパク質の複合体であって、それぞれが少なくとも１つのＶＬ及びＶＨドメイン又
はその断片を含み、両ドメインが単一のポリペプチド鎖内に含まれている該複合体を指す
。特定の実施形態において、「ダイアボディ分子」にはＦｃ又はヒンジ−Ｆｃドメインを
有する分子が含まれる。かかる複合体のポリペプチド鎖は同一でも異なっていてもよい。
即ち、ダイアボディ分子はホモ多量体又はヘテロ多量体であってよい。特定の態様では、
「ダイアボディ分子」は二量体、四量体又はＶＬ及びＶＨドメインの両方を有する前記ポ
リペプチド鎖を有する。多量体タンパク質を構成する個々のポリペプチド鎖は、鎖間のジ
スルフィド結合により多量体の少なくとも１つの他のペプチドと共有結合で連結されてい
てもよい。
本明細書中で用いる用語「障害」及び「疾患」は、互換的に使用され、被験者の症状を
指す。特に、用語「自己免疫疾患」は「自己免疫障害」と互換的に使用され、被験者自身
の細胞、組織及び／又は器官に対する被験者の免疫反応に起因する細胞、組織及び／又は
器官の損傷により特徴付けられる被験者の症状を指す。用語「炎症性疾患」は用語「炎症
性障害」と互換的に使用され、炎症、好ましくは慢性炎症により特徴付けられる被験者の
症状を指す。自己免疫障害は炎症を伴っても伴わなくてもよい。更に、炎症は自己免疫障
害に起因してもしなくてもよい。従って、ある特定の障害は自己免疫障害と炎症性障害の
両方により特徴付けられてもよい。
本明細書中で用いる「同一のポリペプチド鎖」はまた、ほぼ同一のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド鎖を指し、例えば、１個以上のアミノ酸の相違、好ましくは２つのポリペ
プチド鎖の活性が有意に異ならないような保存的アミノ酸置換を有する鎖が含まれる。
本明細書中で用いる用語「癌」は、異常な無制御の細胞増殖から生じる新生物又は腫瘍
を指す。本明細書中で用いる癌には、明確に白血病及びリンパ腫が含まれる。いくつかの
実施形態において、癌は局在化したままで存在する良性腫瘍を指す。他の実施形態におい
て、癌は、近隣の身体構造に侵入して破壊し、離れた部位に広がる悪性腫瘍を指す。いく
つかの実施形態では、癌は特定の癌抗原と関連する。
本明細書中で用いる用語「免疫調節剤」及びその変形は、宿主の免疫系を変化させる薬
剤を指す。ある特定の実施形態においては、免疫調節剤は免疫阻害剤である。ある特定の
他の実施形態においては、免疫調節剤は免疫賦活剤である。免疫調節剤としては、限定す
るものではないが、小分子、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、抗体、無機分子
、模倣剤及び有機分子が挙げられる。
本明細書中で用いる用語「エピトープ」は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましく
はヒトにおいて抗原性又は免疫原性を有するポリペプチド、タンパク質又は非タンパク質
分子の断片を指す。免疫原性を有するエピトープは、動物において抗体応答を誘発するポ
リペプチド又はタンパク質の断片である。抗原性を有するエピトープは、当業者に周知の
方法、例えばイムノアッセイにより測定されるような、抗体が免疫特異的に結合するポリ
ペプチド又はタンパク質の断片である。抗原性エピトープは必ずしも免疫原性である必要
はない。
本明細書中で用いる用語「断片」は、別のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも５
個連続したアミノ酸残基、少なくとも１０個連続したアミノ酸残基、少なくとも１５個連
続したアミノ酸残基、少なくとも２０個連続したアミノ酸残基、少なくとも２５個連続し
たアミノ酸残基、少なくとも４０個連続したアミノ酸残基、少なくとも５０個連続したア
ミノ酸残基、少なくとも６０個連続したアミノ酸残基、少なくとも７０個連続したアミノ
酸残基、少なくとも８０個連続したアミノ酸残基、少なくとも９０個連続したアミノ酸残
基、少なくとも１００個連続したアミノ酸残基、少なくとも１２５個連続したアミノ酸残
基、少なくとも１５０個連続したアミノ酸残基、少なくとも１７５個連続したアミノ酸残
基、少なくとも２００個連続したアミノ酸残基、又は少なくとも２５０個連続したアミノ
酸残基のアミノ酸配列を有するペプチド又はポリペプチドを指す。具体的な実施形態にお
いては、ポリペプチドの断片は、そのポリペプチドの少なくとも１つの機能を保持する。
本明細書中で用いる用語「核酸」及び「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡ分子（例えば、
ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子
の組合せ又はハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子及びＤＮＡ又はＲＮＡ分子の類似体を含む
。このような類似体は、例えば、限定するものではないが、イノシン又はトリチル化塩基
を有するヌクレオチド類似体を用いて生成することができる。このような類似体はまた、
例えば、ヌクレアーゼ耐性又は高められた細胞膜通過能などの分子に有益な属性を与える
、改変された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡ分子を有し得る。核酸又はヌクレオチド配列
は一本鎖、又は二本鎖であり得、一本鎖部分と二本鎖部分の両方を含んでもよく、また、
三本鎖部分を含んでもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
本明細書中で用いる「治療上有効な量」とは、疾患又は障害を治療又は管理するのに十
分な治療剤の量を指す。治療上有効な量は、疾患の発症を遅延させるか又は最小限にする
、例えば、癌の拡大を遅延させるか又は最小限にするのに十分な治療剤の量を指すことも
ある。治療上有効な量は、疾患の治療又は管理において治療上の利益を与える治療剤の量
を指すこともある。更に、本発明の治療剤についての治療上有効な量は、疾患の治療又は
管理において治療上の利益を与える、治療剤単独での又は他の治療との組み合わせにおけ
る治療剤の量を意味する。
本明細書中で用いる用語「予防剤」は、障害の予防に、又は障害の再発又は拡大の予防
に使用できる薬剤を指す。予防上有効な量は、過剰増殖性疾患、特に癌の再発又は拡大、
又は、限定するものではないが、過剰増殖性疾患の素因がある患者、例えば、遺伝的に癌
の素因があるか又は以前に発癌物質に曝された患者などの患者におけるそれらの発生を予
防するのに十分な予防剤の量を指してもよい。予防上有効な量はまた、疾患の予防におい
て予防上の利益を与える予防剤の量を指してもよい。更に、本発明の予防剤についての予
防上有効な量は、疾患の予防において予防上の利益を与える、予防剤単独での又は他の薬
剤との組み合わせにおける予防剤の量を意味する。
本明細書中で用いる用語「予防する」、「予防すること」、「予防」は、予防剤又は治
療剤の投与の結果としての、被験者における障害の１つ以上の症状の再発又は発症の予防
を指す。
本明細書中で用いる用語「組み合わせ」は、２種以上の予防剤及び／又は治療剤の使用
を指す。用語「組み合わせ」の使用は、予防剤及び／又は治療剤を障害のある被験者に投
与する順序を制限するものではない。第１の予防剤又は治療剤は、障害のある被験者に第
２の予防剤又は治療剤を投与する前（例えば５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２
時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、
２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間又は１２週間前）に、同時に、又は投
与した後（例えば５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１
２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、
５週間、６週間、８週間又は１２週間後）に、投与することができる。
本明細書において用いられる「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域と、Ｆｃ受容体
又は抗原との相互作用によりもたらされる生化学的事象を意味する。エフェクター機能の
例としては、それらに限定されるものではないが、抗体依存性細胞媒介性障害作用（ＡＤ
ＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）及び補体依存性細胞毒性作用（ＣＤＣ
）が挙げられる。エフェクター機能には、抗原の結合後に作用するものと、抗原の結合と
は無関係に作用するものの両方が含まれる。
本明細書において用いられる「エフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃ受容体を発現し
、１つ以上のエフェクター機能を媒介する、免疫系の細胞を意味する。エフェクター細胞
の例としては、それらに限定されるものではないが、単球、マクロファージ、好中球、樹
状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞があり、任意の生物、例えば、それらに限定されるもので
はないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ及びサルに由来し得る。
本明細書中で用いる用語「免疫複合体と特異的に結合する」及び類似の用語は、免疫複
合体と特異的に結合するが、別の分子とは特異的に結合しない分子を指す。免疫複合体と
特異的に結合する分子は、例えば、イムノアッセイ、バイアコア、又は当技術分野で公知
の他のアッセイ法により測定された場合、より低い親和性で他のペプチド又はポリペプチ
ドと結合してもよい。好ましくは、免疫複合体と特異的に結合する分子は他のタンパク質
と交差反応しない。免疫複合体と特異的に結合する分子は、例えば、イムノアッセイ、バ
イアコア、又は当業者に公知の他の技法により、同定することができる。
本明細書中で用いる「安定な融合タンパク質」とは、当業者に公知の通常の生化学的及
び機能性アッセイを用いて評価したとき、作製及び／又は保存中に最小限ないし検出不能
レベルの分解を受ける融合タンパク質を指し、生物学的活性、例えば、ＦｃγＲとの結合
を低下させることなく、長期間保存することができる。
本願は、さらに下記の項目に記載の発明に関する。
[項目１]
第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を有するダイアボディ分子であって、
前記第１のポリペプチド鎖と前記第２のポリペプチド鎖は互いに共有結合で連結してお
り、
前記第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリ
ンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピ
トープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を含む
第２のドメイン、並びにＥ−コイル分離体（配列番号：２９９）及びＫ−コイル分離体（
配列番号：３００）からなる群から選択される荷電ペプチドを含んでなり、前記第１のド
メインと前記第２のドメインとは、前記第１のドメインと前記第２のドメインとが会合し
てエピトープ結合部位を形成しないように共有結合で連結されており、
前記第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）前記第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの
結合領域（ＶＬ２）を含む第４のドメイン、及び（ｉｉ）前記第１の免疫グロブリンの重
鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を含む第５のドメインを含んでなり、前記第４のド
メインと前記第５のドメインとは、前記第４のドメインと前記第５のドメインとが会合し
てエピトープ結合部位を形成しないように共有結合で連結されており、
前記第１のドメインと前記第５のドメインとが会合して、前記第１のエピトープと結合
する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成しており、
前記第２のドメインと前記第４のドメインとが会合して、前記第２のエピトープと結合
する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成する
ことを特徴とするダイアボディ分子。
[項目２]
前記第２のポリペプチド鎖が、前記第１のポリペプチド鎖の前記荷電ペプチドとは反対
に荷電した荷電ポリペプチドを含むことを特徴とする、項目１に記載のダイアボディ分子。
[項目３]
前記ダイアボディの前記第２ポリペプチド鎖がＥ−コイル分離体（配列番号２９９）又
はＫ−コイル分離体（配列番号：３００）を有することを特徴とする項目２に記載のダイアボディ分子。
[項目４]
前記Ｅ−コイル分離体又はＫ−コイル分離体がＦｃドメイン又はその一部に連結されて
いることを特徴とする項目１又は２に記載のダイアボディ分子。
[項目５]
前記Ｅ−コイル分離体又はＫ−コイル分離体がＦｃドメイン又はその一部に連結されて
いることを特徴とする項目３に記載のダイアボディ分子。
[項目６]
前記Ｅ−コイル分離体又は前記Ｋ−コイル分離体が血清結合タンパク質のポリペプチド
部に連結されており、前記ポリペプチド部は血清タンパク質に結合することができること
を特徴とする項目１又は２に記載のダイアボディ分子。
[項目７]
前記血清結合タンパク質がアルブミン結合タンパク質であることを特徴とする項目６に記載のダイアボディ分子。
[項目８]
前記アルブミン結合タンパク質が連鎖球菌タンパク質Ｇであり、前記ポリペプチドが前
記連鎖球菌タンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）であることを特徴とする項目７に記載のダイアボディ分子。
[項目９]
前記連鎖球菌タンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）が連鎖球菌株Ｇ１４８
のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）であることを特徴とする項目８に記載のダイアボディ分子。
[項目１０]
前記ダイアボディ分子が２時間以上のインビボ血清半減期を示すことを特徴とする、項目６に記載のダイアボディ分子。
[項目１１]
前記ダイアボディ分子が１０時間以上のインビボ血清半減期を示す項目１０に記載のダイアボディ分子。
[項目１２]
前記ダイアボディ分子が２０時間以上のインビボ血清半減期を示す項目１０に記載のダイアボディ分子。
[項目１３]
ナチュラルキラー群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体に対する結合リガンドであるドメインを
有することを特徴とする、項目１ないし１２のいずれかに記載のダイアボディ分子。
[項目１４]
前記ダイアボディ分子が腫瘍関連抗原に更に結合することを特徴とする、項目１３に記載のダイアボディ分子。
[項目１５]
前記腫瘍関連抗原が、乳癌抗原、卵巣癌抗原、前立腺癌抗原、頸部癌抗原、膵癌抗原、
肺癌抗原、膀胱癌抗原、大腸癌抗原、精巣癌抗原、膠芽腫癌抗原、Ｂ細胞悪性腫瘍関連抗
原、多発性骨髄腫関連抗原、非ホジキンスリンパ腫関連抗原又は慢性リンパ球性白血病関
連抗原であることを特徴とする項目１４に記載のダイアボディ分子。
[項目１６]
前記腫瘍関連抗原が、Ａ３３、ＡＤＡＭ−９、ＡＬＣＡＭ、Ｂ１、ＢＡＧＥ、β−カテ
ニン、ＣＡ１２５、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２
、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４
５、ＣＤ４６、ＣＤ５６、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１０３、ＣＤ１５４、ＣＤＫ４
、ＣＥＡ、ＣＴＬＡ４、サイトケラチン８、ＥＧＦ−Ｒ、エフリン受容体、ＥｒｂＢ１、
ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ｇｐ
１００、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ヒトパピローマウイルス−Ｅ６、ヒトパピローマウイルス
−Ｅ７、インテグリンα−Ｖ−β−６、ＪＡＭ−３、ＫＩＤ３、ＫＩＤ３１、ＫＳＡ（１
７−１Ａ）、ＬＵＣＡ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ、ＭＵＣ−１、ＭＵ
Ｍ−１、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、オンコスタチンＭ（オンコス
タチン受容体β）、ｐ１５、ＰＩＰＡ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＡＧ１０、ＲＯＲ１、Ｓ
ＡＲＴ、ｓＴｎ、ＴＥＳ７、ＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ−β受容体、ＴＮＦ−γ受容体、
トランスフェリン受容体又はＶＥＧＦ受容体であることを特徴とする項目１４に記載のダイアボディ分子。
[項目１７]
前記腫瘍関連抗原が、ＨＥＲ−２／ｎｅｕであることを特徴とする項目１６に記載のダイアボディ分子。
[項目１８]
前記ダイアボディ分子がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）結合ドメインを有することを特徴とす
る、項目１又は２に記載のダイアボディ分子。
[項目１９]
前記ダイアボディ分子が腫瘍関連抗原に更に結合することを特徴とする項目１８に記載のダイアボディ分子。
[項目２０]
前記腫瘍関連抗原が、乳癌抗原、卵巣癌抗原、前立腺癌抗原、頸部癌抗原、膵癌抗原、
肺癌抗原、膀胱癌抗原、大腸癌抗原、精巣癌抗原、膠芽腫癌抗原、Ｂ細胞悪性腫瘍関連抗
原、多発性骨髄腫関連抗原、非ホジキンスリンパ腫関連抗原又は慢性リンパ球性白血病関
連抗原であることを特徴とする項目１９に記載のダイアボディ分子。
[項目２１]
前記腫瘍関連抗原が、Ａ３３、ＡＤＡＭ−９、ＡＬＣＡＭ、Ｂ１、ＢＡＧＥ、β−カテ
ニン、ＣＡ１２５、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２
、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４
５、ＣＤ４６、ＣＤ５６、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１０３、ＣＤ１５４、ＣＤＫ４
、ＣＥＡ、ＣＴＬＡ４、サイトケラチン８、ＥＧＦ−Ｒ、エフリン受容体、ＥｒｂＢ１、
ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ｇｐ
１００、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ヒトパピローマウイルス−Ｅ６、ヒトパピローマウイルス
−Ｅ７、インテグリンα−Ｖ−β−６、ＪＡＭ−３、ＫＩＤ３、ＫＩＤ３１、ＫＳＡ（１
７−１Ａ）、ＬＵＣＡ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ、ＭＵＣ−１、ＭＵ
Ｍ−１、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、オンコスタチンＭ、ｐ１５、
ＰＩＰＡ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＡＧ１０、ＲＯＲ１、ＳＡＲＴ、ｓＴｎ、ＴＥＳ７、
ＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ−β受容体、ＴＮＦ−γ受容体、トランスフェリン受容体又は
ＶＥＧＦ受容体であることを特徴とする項目１９に記載のダイアボディ分子。
[項目２２]
前記腫瘍関連抗原が、ＨＥＲ−２／ｎｅｕであることを特徴とする項目２１に記載のダイアボディ分子。
[項目２３]
前記第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）が、ＣＤ３２Ｂに特異的なエピトープ結合部
位であり、前記第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）が、ＣＤ１６に特異的なエピトープ
結合部位であることを特徴とする、項目１又は２に記載のダイアボディ分子。
ヒトＩｇＧＣＨ１、ヒンジ及びＦｃ領域のアミノ酸配列を示す図である。図１は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のヒンジ（Ａ）及びＦｃ（Ｂ）ドメインのアミノ酸配列を示す（ＩｇＧ１ヒンジドメイン（配列番号１）；ＩｇＧ２ヒンジドメイン（配列番号２）；ＩｇＧ３ヒンジドメイン（配列番号３）；ＩｇＧ４ヒンジドメイン（配列番号４）；ＩｇＧ１Ｆｃドメイン（配列番号５）；ＩｇＧ２Ｆｃドメイン（配列番号６）；ＩｇＧ３Ｆｃドメイン（配列番号７）；ＩｇＧ１Ｆｃドメイン（配列番号８））。図１Ａ及び１Ｂに示されるアミノ酸残基は、カバットＥＵのナンバリングシステムに従って番号が付されている。アイソタイプ配列については、重鎖間のＳ−Ｓ結合を形成するそれぞれのヒンジ領域の最初と最後のシステイン残基を同一位置に配置することによって、ＩｇＧ１配列とのアライメントを行っている。 図１Ｂでは、ＣＨ２ドメイン中の残基を＋で示し、ＣＨ３ドメイン中の残基を〜で示している。 共有結合型二機能性ダイアボディのポリペプチド鎖の模式図を示す。共有結合型二機能性ダイアボディのポリペプチドは、短いペプチドリンカーで分離された抗体ＶＬドメイン及び抗体ＶＨドメインから成る。８個のアミノ酸残基のリンカーは、一本鎖ポリペプチド鎖のｓｃＦｖ構築物への自己集合を妨げており、その代わりに、異なるポリペプチド鎖のＶＬドメイン及びＶＨドメイン間の相互作用が優先する。４つの構築物が作製された（各構築物は、構築物の左側のアミノ末端（「ｎ」）から図の右側のカルボキシ末端（「ｃ」）まで記載されている）。構築物（１）（配列番号９）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ２Ｂ６−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−及びＣ末端配列（ＬＧＧＣ）−ｃを含み、構築物（２）（配列番号１１）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ３Ｇ８−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−及びＣ末端配列（ＬＧＧＣ）−ｃを含み、構築物（３）（配列番号１２）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ３Ｇ８−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−及びＣ末端配列（ＬＧＧＣ）−ｃを含み、構築物（４）（配列番号１３）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ２Ｂ６−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−及びＣ末端配列（ＬＧＧＣ）−ｃを含む。 アフィニティー精製されたダイアボディのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。アフィニティー精製されたダイアボディを還元（レーン１〜３）又は非還元（レーン４〜６）条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。標準品のおおよその分子量を（レーン３及び４の間に）示している。レーン１及び４はｈ３Ｇ８ＣＭＤを、レーン２及び５はｈ２Ｂ６ＣＭＤを、レーン３及び６はｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ＣＢＤを示す。 アフィニティー精製されたダイアボディのＳＥＣ分析を示す図である。アフィニティー精製されたダイアボディをＳＥＣ分析した。（Ａ）既知標準品、即ち、全長ＩｇＧ（〜１５０ｋＤａ）、ＩｇＧのＦａｂ断片（〜５０ｋＤａ）、及びｓｃＦｖ（〜３０ｋＤａ）の溶出プロファイル。（Ｂ）ｈ２ｂ６ＣＭＤ、ｈ３Ｇ８ＣＭＤ及びｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ＣＢＤの溶出プロファイル。 アフィニティー精製されたダイアボディのＳＥＣ分析を示す図である。アフィニティー精製されたダイアボディをＳＥＣ分析した。（Ａ）既知標準品、即ち、全長ＩｇＧ（〜１５０ｋＤａ）、ＩｇＧのＦａｂ断片（〜５０ｋＤａ）、及びｓｃＦｖ（〜３０ｋＤａ）の溶出プロファイル。（Ｂ）ｈ２ｂ６ＣＭＤ、ｈ３Ｇ８ＣＭＤ及びｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ＣＢＤの溶出プロファイル。 ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ＣＢＤのｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ１６Ａへの結合を示す図である。ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ＣＢＤのｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ１６Ａへの結合を、サンドイッチＥＬＩＳＡで分析した。ｓＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として使用した。第２プローブは、ＨＲＰコンジュゲートｓＣＤ１６Ａとした。ＣＤ１６Ａに結合するｈ３Ｇ８ＣＭＤを対照として使用した。 ダイアボディのｓＣＤ１６Ａ、ｓＣＤ３２Ｂ又はｓＣＤ３２Ｂへの結合のバイアコア解析を示す図である。ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ＣＢＤ、ｈ２Ｂ６ＣＭＤ及びｈ３Ｇ８ＣＭＤのｓＣＤ１６Ａ、ｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ３２Ａ（陰性対照）への結合をＳＰＲ解析によって分析した。ｈ３Ｇ８ｓｃＦｖも対照として試験した。（Ａ）ｓＣＤ１６への結合、（Ｂ）ｓＣＤ３２Ｂへの結合、及び（Ｃ）ｓＣＤ３２Ａへの結合。ダイアボディを１００ｎＭの濃度で、ｓｃＦｖを２００ｎＭの濃度で、流速５０ｍＬ／分にて６０秒間、受容体表面に注入した。 ダイアボディのｓＣＤ１６Ａ、ｓＣＤ３２Ｂ又はｓＣＤ３２Ｂへの結合のバイアコア解析を示す図である。ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ＣＢＤ、ｈ２Ｂ６ＣＭＤ及びｈ３Ｇ８ＣＭＤのｓＣＤ１６Ａ、ｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ３２Ａ（陰性対照）への結合をＳＰＲ解析によって分析した。ｈ３Ｇ８ｓｃＦｖも対照として試験した。（Ａ）ｓＣＤ１６への結合、（Ｂ）ｓＣＤ３２Ｂへの結合、及び（Ｃ）ｓＣＤ３２Ａへの結合。ダイアボディを１００ｎＭの濃度で、ｓｃＦｖを２００ｎＭの濃度で、流速５０ｍＬ／分にて６０秒間、受容体表面に注入した。 ダイアボディのｓＣＤ１６Ａ、ｓＣＤ３２Ｂ又はｓＣＤ３２Ｂへの結合のバイアコア解析を示す図である。ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ＣＢＤ、ｈ２Ｂ６ＣＭＤ及びｈ３Ｇ８ＣＭＤのｓＣＤ１６Ａ、ｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ３２Ａ（陰性対照）への結合をＳＰＲ解析によって分析した。ｈ３Ｇ８ｓｃＦｖも対照として試験した。（Ａ）ｓＣＤ１６への結合、（Ｂ）ｓＣＤ３２Ｂへの結合、及び（Ｃ）ｓＣＤ３２Ａへの結合。ダイアボディを１００ｎＭの濃度で、ｓｃＦｖを２００ｎＭの濃度で、流速５０ｍＬ／分にて６０秒間、受容体表面に注入した。 ｓＣＤ１６Ａ及びｓＣＤ３２Ｂへのダイアボディの結合のバイアコア解析を示す図である。ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ＣＢＤ、ｈ２Ｂ６ＣＭＤ及びｈ３Ｇ８ＣＭＤのｓＣＤ１６Ａ及びｓＣＤ３２Ｂへの結合をＳＰＲ解析によって分析した。ｈ３Ｇ８ｓｃＦｖも対照として試験した。（Ａ）ｈ３Ｇ８ＣＭＤのｓＣＤ１６Ａへの結合、（Ｂ）ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ＣＢＤのｓＣＤ１６への結合、（Ｃ）ｈ３Ｇ８ｓｃＦｖのｓＣＤ１６Ａへの結合、（Ｄ）ｈ２Ｂ６ＣＭＤのｓＣＤ３２Ｂへの結合、及び（Ｅ）ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ＣＢＤのｓＣＤ３２Ｂへの結合。ダイアボディを６．２５〜２００ｎＭの濃度で、流速７０ｍＬ／分にて１８０秒間、受容体表面に注入した。 共有結合型二重特異性ダイアボディ分子を形成するためのＶＬ及びＶＨドメインを有するポリペプチド鎖の相互作用を示す模式図である。ＮＨ２及びＣＯＯＨは、それぞれ各ポリペプチド鎖のアミノ末端及びカルボキシ末端を表す。Ｓは、各ポリペプチド鎖のＣ末端システイン残基を表す。ＶＬ及びＶＨは、それぞれ軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを示す。点線及び破線は、２つのポリペプチド鎖同士を区別するためのものであり、特に前記鎖のリンカー部分を表している。ｈ２Ｂ６Ｆｖ及びｈ３Ｇ８Ｆｖは、それぞれＣＤ３２Ｂ及びＣＤ１６に特異的なエピトープ結合部位を示す。 共有結合型二重特異性ダイアボディのＦｃドメインを含むポリペプチド鎖の模式図を示す。本発明のダイアボディ分子のポリペプチド構築物を示す（各構築物は、構築物の左側のアミノ末端（「ｎ」）から図の右側のカルボキシ末端（「ｃ」）まで記載されている）。構築物（５）（配列番号１４）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ２Ｂ６−第１リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−第２リンカー（ＬＧＧＣ）−及びヒトＩｇＧ１−ｃのＣ末端Ｆｃドメインを有し、構築物（６）（配列番号１５）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ３Ｇ８−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−及び第２リンカー（ＬＧＧＣ）−及びヒトＩｇＧ１−ｃのＣ末端Ｆｃドメインを有し、構築物（７）（配列番号１６）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ２Ｂ６−第１リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−及びＣ末端配列（ＬＧＧＣＦＮＲＧＥＣ）（配列番号１７）−ｃを有し、構築物（８）（配列番号１８）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ３Ｇ８−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−及び第２リンカー（ＬＧＧＣ）−及びヒトＩｇＧ１のＣ末端ヒンジ／Ｆｃドメイン（Ａ２１５Ｖのアミノ酸置換を有する）−ｃを有する。 Ｆｃドメインを有するダイアボディ分子のｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ１６Ａへの結合を示す図である。Ｆｃドメインを有するダイアボディ分子のｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ１６Ａへの結合を、サンドイッチＥＬＩＳＡでアッセイした。アッセイしたダイアボディは、３つの組換え発現系により作製された：構築物１及び６をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６６９及びｐＭＧＸ６７４のコトランスフェクション、構築物２及び５をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６６７及びｐＭＧＸ６７６のコトランスフェクション、及び構築物５及び６をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６７４及びｐＭＧＸ６７６のコトランスフェクション。ｓＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として使用した。第２プローブは、ＨＲＰ結合ｓＣＤ１６Ａとした。 二価の共有結合型ダイアボディ分子を形成するために、それぞれ１つのＦｃドメインを有する、２つのポリペプチド鎖の相互作用を示す模式図である。ＮＨ２及びＣＯＯＨは、それぞれ各ポリペプチド鎖のアミノ末端及びカルボキシ末端を表す。Ｓは、各ポリペプチド鎖の第２リンカー配列中のシステイン残基間の少なくとも１つのジスルフィド結合を表す。ＶＬ及びＶＨは、それぞれ軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを示す。点線及び破線は、２つのポリペプチド鎖同士を区別するためのものであり、特に前記鎖の第１リンカー部分を表している。ＣＨ２及びＣＨ３は、ＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインを示す。ｈ２Ｂ６Ｆｖ及びｈ３Ｇ８Ｆｖは、それぞれＣＤ３２Ｂ及びＣＤ１６に特異的なエピトープ結合部位を示す。 ヒンジ／Ｆｃドメインを有するダイアボディ分子のｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ１６Ａへの結合を示す図である。Ｆｃドメインを有するダイアボディ分子のｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ１６Ａへの結合を、サンドイッチＥＬＩＳＡでアッセイした。アッセイしたダイアボディは、４つの組換え発現系により作製した：構築物１及び６をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６６９＋ｐＭＧＸ６７４のコトランスフェクション、構築物２及び８をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６６９＋ｐＭＧＸ６７８のコトランスフェクション、構築物７及び６をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６７７＋ｐＭＧＸ６７４のコトランスフェクション、及び構築物７及び８をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６７７＋ｐＭＧＸ６７８のコトランスフェクション。ｓＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として使用した。第２プローブは、ＨＲＰ結合ｓＣＤ１６Ａとした。 四量体ダイアボディ分子を形成するためのポリペプチド鎖の相互作用を示す模式図である。ＮＨ２及びＣＯＯＨは、それぞれ各ポリペプチド鎖のアミノ末端及びカルボキシ末端を表す。Ｓは、Ｆｃを有する「重い」ポリペプチド鎖の第２リンカー配列中のシステイン残基と、Ｆｃを有さない「軽い」ポリペプチド鎖のＣ末端配列中のシステイン残基との間の少なくとも１つのジスルフィド結合を表す。ＶＬ及びＶＨは、それぞれ軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを示す。点線及び破線は、ポリペプチド鎖同士を区別するためのものであり、特に前記重い鎖の第１リンカー部分又は前記軽い鎖のリンカーを表す。ＣＨ２及びＣＨ３は、ＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインを示す。ｈ２Ｂ６Ｆｖ及びｈ３Ｇ８Ｆｖは、それぞれＣＤ３２Ｂ及びＣＤ１６に特異的なエピトープ結合部位を示す。 共有結合型二重特異性ダイアボディのＦｃドメインを含むポリペプチド鎖の模式図を示す。本発明のダイアボディ分子を形成するポリペプチド構築物を示す（各構築物は、構築物の左側のアミノ末端（「ｎ」）から図の右側のカルボキシ末端（「ｃ」）まで記載されている）。構築物（９）（配列番号１９）は、ｎ−ヒトＩｇＧ１のヒンジ／Ｆｃドメイン−ＶＬドメインＨｕ３Ｇ８−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−及びＣ末端ＬＧＧＣ配列−ｃを有し、構築物（１０）（配列番号２０）は、ｎ−ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン−Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−及びＣ末端ＬＧＧＣ配列−ｃを有し、構築物（１１）（配列番号２１）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ２Ｂ６（Ｇ１０５Ｃ）−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−及びＡ２１５Ｖのアミノ酸置換を有するヒトＩｇＧ１のＣ末端ヒンジ／Ｆｃドメイン−ｃを有し、構築物（１２）（配列番号２２）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ３Ｇ８−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６（Ｇ４４Ｃ）のＶＨドメイン−及びＣ末端ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）配列−ｃを有する。 アフィニティー四量体ダイアボディのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット解析を示す図である。構築物１０及び１、構築物９及び１、構築物１１及び１２を発現するベクターをコトランスフェクトされた組換え発現系により作製されたダイアボディを、非還元的条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（Ａ）、及びヤギ抗ヒトＩｇＧ１Ｈ＋Ｌをプローブとして用いたウェスタンブロット解析（Ｂ）した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中のタンパク質をシンプリー・ブルー・セーフステイン（Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅｓｔａｉｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で可視化した。Ａ及びＢの両パネルにおいて、構築物１０及び１、構築物９及び１、構築物１１及び１２Ａを有するダイアボディ分子は、それぞれレーン１、２、３に相当する。 Ｆｃドメイン及び遺伝子操作によって作られた鎖間ジスルフィド結合を有するダイアボディ分子のｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ１６Ａへの結合を示す図である。Ｆｃドメイン及び「軽い」ポリペプチド鎖と「重い」ポリペプチド鎖との間の遺伝子操作によって作られたジスルフィド結合を有するダイアボディ分子の、ｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ１６Ａへの結合をサンドイッチＥＬＩＳＡでアッセイした。アッセイしたダイアボディは、３つの組換え発現系により作製した：それぞれ構築物１及び１０を発現する系、構築物１及び９を発現する系、及び構築物１１及び１２を発現する系。ｓＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として使用した。第２プローブは、ＨＲＰコンジュゲートｓＣＤ１６Ａとした。ｈ３Ｇ８の結合を対照として用いた。 ダイアボディ分子のポリタンパク質前駆体の模式図、及びλ軽鎖及び／又はヒンジドメインを含むポリペプチド鎖の模式図である。本発明のダイアボディ分子を有するポリペプチド構築物を示す（各構築物は、構築物の左側のアミノ末端（「ｎ」）から図の右側のカルボキシ末端（「ｃ」）まで記載されている）。構築物（１３）（配列番号９５）は、ｎ−ＶＬドメイン３Ｇ８−第１リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−２．４Ｇ２ＶＨのＶＨドメイン−第２リンカー（ＬＧＧＣ）−フューリン認識部位（ＲＡＫＲ（配列番号９３））−２．４Ｇ２のＶＬドメイン−第３リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号１０）−３Ｇ８のＶＨドメイン−及びＣ末端ＬＧＧＣドメイン（配列番号９５をコードするヌクレオチド配列は配列番号９６に示す）を有する。構築物（１４）（配列番号９７）は、ｎ−ＶＬドメイン３Ｇ８−第１リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−２．４Ｇ２ＶＨのＶＨドメイン−第２リンカー（ＬＧＧＣ）−フューリン認識部位（ＲＡＫＲ（配列番号９３））−ＦＭＤ（口蹄疫ウイルスプロテアーゼＣ３）部位−２．４Ｇ２のＶＬドメイン−第３リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号１０）−３Ｇ８のＶＨドメイン−及びＣ末端ＬＧＧＣドメイン（配列番号９７をコードするヌクレオチド配列は配列番号９８に示す）を有する。構築物（１５）（配列番号９９）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ２Ｂ６−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−及びＣ末端ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）ドメイン（配列番号９９をコードするヌクレオチド配列は配列番号１００に示す）を有する。構築物（１６）（配列番号１０１）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ３Ｇ８−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−Ｃ末端ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）ドメイン（配列番号１０１をコードするヌクレオチド配列は配列番号１０２に示す）を有する。 ポリタンパク質前駆体分子に由来するダイアボディ分子のｍＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ１６Ａへの結合を示す図である。ポリタンパク質前駆体分子構築物１３（配列番号９５）に由来するダイアボディ分子のマウスＣＤ３２Ｂ（ｍＣＤ３２Ｂ）及び可溶性ＣＤ１６Ａ（ｓＣＤ１６Ａ）への結合をサンドイッチＥＬＩＳＡでアッセイした。ｍＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として用いた。第２プローブはビオチンコンジュゲートｓＣＤ１６Ａとした。 λ鎖及び／又はヒンジドメインを有するダイアボディ分子のｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ１６Ａへの結合を示す図である。ヒトλ軽鎖のＣ末端に由来するドメイン及び／又はＩｇＧのヒンジドメインを有するダイアボディ分子のｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ１６Ａへの結合をサンドイッチＥＬＩＳＡでアッセイし、構築物１及び２（図５）を有するダイアボディと比較した。アッセイしたダイアボディは、構築物１５及び１６（それぞれ配列番号９９及び配列番号１０１）を発現する組換え発現系により作製した。ｓＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として使用した。第２プローブはＨＲＰコンジュゲートｓＣＤ１６Ａとした。小さな四角を付した棒線は構築物１５／１６の組合せ物を表し、また大きな四角を付した棒線は構築物１／２の組合せ物を表す。 細胞及びフルオレセインコンジュゲート分子の表面に位置するＣＤ３２Ｂへの２Ｂ６／４４２０ＤＡＲＴの結合を示す模式図である。図は、２Ｂ６アームを他の特異性で置換する可能性と共にＤＡＲＴの「万能アダプター」である抗フルオレセインアームの柔軟性を示す。Ｖ領域は長方形として示し、ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）リンカーは線として示し、ジスルフィド結合は２つの鎖を接続して示す。１つの鎖の構築物は青で示し、その他はピンクで示す。Ｎはアミノ末端、Ｃはカルボキシ末端、ＦＬはフルオレセイン、ＶＬは軽鎖可変領域、ＶＨは重鎖可変領域である。 （パネルＡ及びＢ）２Ｂ６／４４２０ＤＡＲＴはフルオレセインコンジュゲート分子に特異的に結合し、同時にＣＤ３２Ｂに結合することができる。（Ａ）２Ｂ６／４４２０又は２Ｂ６／３Ｇ８は、ＦＩＴＣ−Ｓタンパク質が被覆されているＥＬＩＳＡプレートに結合した。２Ｂ６アームの結合及び機能を、可溶性ＣＤ３２Ｂ、続いてＣＤ３２Ｂに特異的な抗体及びＨＲＰで結合された二次検出抗体の関与により検出した。（Ｂ）２Ｂ６／４４２０又は２Ｂ６／３Ｇ８は、ＨｕＩｇＧ又はＦＩＴＣ−ＨｕＩｇＧ（フルオレセイン結合）が被覆されているＥＬＩＳＡプレートに結合した。結合は、２Ｂ６Ｆｖに特異的なポリクローナル血清、続いてＨＲＰ結合第２抗体の関与により検出した。 （パネルＡ及びＢ）抗ヒトＣＤ７９Ｂ抗体を使用する精製Ｂ細胞の活性化を示す図である。精製Ｂ細胞は、抗ヒトＣＤ７９ｂ抗体、ＦＩＴＣコンジュゲートＣＢ３．１−ＦＩＴＣ（Ａ）又はＣＢ３．２−ＦＩＴＣ（Ｂ）の濃度の増加と５０μｇ／ｍＬのＧＡＭＩｇＧＦｃ特異的Ｆ（ａｂ’）２断片により活性化した（ｘ−軸）。Ｂ細胞は、ＰＢＳ（白棒線）又は５μｇ／ｍＬのαＦＩＴＣαＣＤ３２ＢＤＡＲＴ（黒棒線）若しくはαＣＤ１６αＣＤ３２ＢＤＡＲＴ（灰色棒線）の存在下に活性化された。反応は三重で行い、標準偏差を算出した。 （パネルＡ及びＢ）精製Ｂ細胞の活性化を示す図である。第２の健常なドナーからの精製Ｂ細胞は、図２２のパネルＢで説明したように活性化した。増殖指数は、抗ＣＤ７９ｂ抗体、ＦＩＴＣコンジュゲートＣＢ３．２−ＦＩＴＣ（Ａ）の存在下に活性化された細胞中で測定し、非標識ＣＢ３．２抗体（Ｂ）の存在下に活性化した細胞の増殖指数と比較した。 （上及び下パネル）ＭＧＤ２６１を使用したＨＣＤ１６Ａ／ＢトランスジェニックマウスにおけるインビボマウスＢ細胞の除去を示す図である。ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ繁殖コロニー由来のｍＣＤ３２−／−ｈＣＤ１６Ａ＋Ｃ５７Ｂ１／６、ｍＣＤ３２−／−ｈＣＤ３２Ｂ＋Ｃ５７Ｂ１／６及びｍＣＤ３２−／−ｈＣＤ１６Ａ＋ｈＣＤ３２Ｂ＋Ｃ５７Ｂ１／６マウスにＭＧＤ２６１（１０、３、１又は０．３ｍｇ／ｋｇ）又は無関係な抗体（ｈＥ１６：１０ｍｇ／ｋｇ）を０、３、７、１０、１４及び１７日目に静脈内注射した。血液を−１９（前採血）、４、１１、１８、２５及び３２日目にＦＡＣＳ分析用に採血した。動物の健康及び活動状態を週３回記録した。上パネル：ｈ２Ｂ６−３Ｇ８及びＷＮＶｍＡｂ、下パネル：ｈ２Ｂ６−３Ｇ８−ｈＣＤ１６Ａ又はｈＣＤ３２Ｂマウス及びＷＮＶｍＡｂ−ｈＣＤ１６Ａ又はｈＣＤ３２Ｂマウス。 ２．４Ｇ２−３Ｇ８ＤＢを使用したＨＣＤ１６Ａ／ＢトランスジェニックマウスにおけるインビボマウスＢ細胞の除去を示す図である。ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ繁殖コロニー由来のｍＣＤ１６−／−、ｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ａ＋Ｃ５７Ｂ１／６、ｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ｂ＋及びｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ａ＋ｈＣＤ１６Ｂ＋マウスに２．４Ｇ２−３Ｇ８ＤＢ（７５μｇ／マウス）又はＰＢＳを０、２、４、７、９、１１、１４、１６及び１８日目に静脈内注射した。血液を−１０（前採血）、４、１１及び１８日目にＦＡＣＳ分析用に採血した。動物の健康及び活動状態を週３回記録した。 ヒト腫瘍細胞株ラジ（Ｒａｊｉ）の静脈（ＩＶ）モデルを使用したＭＧＤ２６１の抗腫瘍活性を実証する図である。１２〜２０週齢のＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ繁殖コロニー由来のｍＣＤ１６−／−、ｈＣＤ１６Ａ＋、ＲＡＧ１−／−Ｃ５７Ｂ１／６マウスに５×１０６個のラジ細胞を０日目に静脈内注射した。６、９、１３、１６、２０、２３、２７及び３０日目に、２５０、２５又は２．５μｇのＭＧＤ２６１又はＰＢＳ（陰性対照）をマウス腹腔内に投与した後、マウスを毎日観察し、体重を週２回記録した。後肢麻痺を起したマウスを屠殺した。 非哺乳類宿主でのＤＡＲＴの発現を示す図である。ＢＬ２１ＤＥ３細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）をｐＥＴ２５ｂ（＋）Ｔ７−ｌａｃ＋３Ｇ８／３Ｇ８プラスミドで形質転換し、アンピシリン耐性コロニーをブロス培養に播種した。培養物が０．５ＯＤ６００ユニットに達したら、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加して発現を誘導した。培養物を３０℃で２時間増殖させて、無細胞培地を集めた。 ＤＡＲＴのＥＬＩＳＡを示す。９６−ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを使用してｈ３Ｇ８−ｈ３Ｇ８ＤＡＲＴ結合ＥＬＩＳＡを行った。反応後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、各ウェル８０μｌのＴＭＢ基質で展開した。５分間のインキュベーション後、反応を各ウェル４０μｌの１％Ｈ２ＳＯ４で停止した。９６−ウェルプレートリーダー及びＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを使用してＯＤ４５０ｎｍを測定した。読み出しはＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ３．０３ソフトウェアを使用してプロットした。 ＤＡＲＴ誘導ヒトＢ細胞死を示す。ヒトＰＢＭＣを示された分子と一夜インキュベートした。アポトーシスをＦＡＣＳ分析により、全ＦＳＣ／ＳＳＣ非依存性個体数に対するＢ細胞（ＣＤ２０＋細胞）のＰＩ＋アネキシン‐Ｖ＋個体数の割合としてアッセイした。 ８Ｂ５−ＣＢ３．１ＤＡＲＴ構築物を示す。本発明を説明するために多様な８Ｂ５−ＣＢ３．１ＤＡＲＴ構築物を作製した。構築物５及び６、６及び７、８及び９又は９及び１０をコードする発現プラスミドをＨＥＫ−２９３細胞にコトランスフェクトし、抗フラグタグを有する又は有しない８Ｂ５−ＣＢ３．１ＤＡＲＴを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して発現させた。条件培地を３日毎に３回採取した。その後、条件培地をＣＤ３２Ｂアフィニティーカラムで精製した。 ８Ｂ５−ＣＢ３．１ＤＡＲＴのＥＬＩＳＡを示す。８Ｂ５−ＣＢ３．１ＤＡＲＴ／ｃｈ８Ｂ５競合ＥＬＩＳＡを、９６−ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを使用して行った。反応後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、各ウェル８０μｌのＴＭＢ基質で展開した。５分間のインキュベーション後、反応を各ウェル４０μｌの１％Ｈ２ＳＯ４で停止した。９６−ウェルプレートリーダー及びＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを使用してＯＤ４５０ｎｍを測定した。読み出しはＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ３．０３ソフトウェアを使用してプロットした。 四価ＤＡＲＴ構造の模式図を示す。４個のポリペプチド鎖の会合により作製されたＤＡＲＴ種の一般的な構造を示す。Ｉｇ様ＤＡＲＴの４つの抗原結合ドメインは、縞及び灰色の楕円として示される。 Ｉｇ様四価ＤＡＲＴを示す。Ｉｇ様四価ＤＡＲＴのエピトープ結合部位の模式図である。 ｍＣＤ３２−ｈＣＤ１６Ａ結合ＥＬＩＳＡである。実施例６．１０のＩｇ様四価ＤＡＲＴ種が対照（ｃｈ−ｍＣＤ３２ｍＡｂ）抗体又は他のＤＡＲＴ種よりも高アフィニティーで抗原と結合することを立証するＥＬＩＳＡの結果を示す。 ＩｇＤＡＲＴ分子の模式図である。ＩｇＤＡＲＴ分子の模式図を示す。特異性は陰影、模様又は白色領域によって示し、定常領域は黒で、ジスルフィド結合は黒の点線で示す。全てのタンパク質鎖のＮ末端は、図の上部方向に向けられており、全てのタンパク質鎖のＣ末端は、図の下部方向に向けられている。例示のＡ〜Ｅは二重特異性、例示のＦ〜Ｊは三重特異性である。例示のＡ及びＥは四価であり、例示のＢ、Ｃ、Ｆ、Ｉ及びＪは六価であり、例示のＤ、Ｇ及びＨは八価である。個々のドメインの詳しい説明については図１、２、９、１４及び１７並びにセクション３．１を参照のこと。 ＨＵ２Ｂ６４．５−ＨＵ３Ｇ８５．１二重特異性ダイアボディの結合能を示す。ＨＵ２Ｂ６４．５−ＨＵ３Ｇ８５．１二重特異性ダイアボディ（四角）のＣＤ３２ｂ及びＣＤ１６ａへの結合能を、Ｈｕ２Ｂ６４．５又はＨｕ３Ｇ８５．１ダイアボディ（三角）と比較して示す。 Ｅ−コイル及びＫ−コイルＤＡＲＴ誘導体の模式図を示す。Ｅ−コイル及びＫ−コイルＤＡＲＴ誘導体の一般的な構造を示す。 好ましいＥ−コイル及びＫ−コイル分離体のへリックス配置を示す。好ましい「Ｅ−コイル」配列（ＥＶＡＡＬＥＫ）４（配列番号２９９）及び好ましい「Ｋ−コイル」配列（ＫＶＡＡＬＫＥ）４（配列番号３００）のへリックス配置を示す。 Ｅ−コイル及びＫ−コイルＦｃ含有ＤＡＲＴ誘導体を示す。鎖交換により形成することが可能なＥ−コイル及びＫ−コイルＦｃ含有ＤＡＲＴ誘導体の異なる種を示す。 ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ＤＡＲＴのＥ−コイル及び／又はＫ−コイル誘導体及びＥ−コイル及び／又はＫ−コイルＦｃ含有誘導体のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ＤＡＲＴのＥ−コイル及び／又はＫ−コイル誘導体及びＥ−コイル及び／又はＫ−コイルＦｃ含有誘導体のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。４種のそのような分子を解析した。全てがＥ−コイル及びＫ−コイル：ＥＫ（Ｆｃ領域なし）、２．１ｍｇ；ＥＦｃ／Ｋ（ＦｃがＥ−コイルに結合）、２．７ｍｇ；Ｅ／ＫＦｃ（ＦｃがＫ−コイルに結合）、１．８ｍｇ；ＥＦｃ／ＫＦｃ（Ｆｃが同じＤＡＲＴのＫ−コイル及びＥ−コイルに結合）、２．０ｍｇ。 作製した二量体分子の構造を示す。図４０のサイズ排除クロマトグラフィーにより同定された、作製された二量体分子の予想される構造を示す。 ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ＤＡＲＴのＥ−コイル及び／又はＫ−コイル誘導体及びＥ−コイル及び／又はＫ−コイルＦｃ含有誘導体のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ＤＡＲＴのＥ−コイル及び／又はＫ−コイル誘導体及びＥ−コイル及び／又はＫ−コイルＦｃ含有誘導体のサイズ排除クロマトグラフィー（図４０）により得られた分画のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の結果を示す。側方レーン：分子マーカー対照、レーン１：ＥＫ（Ｆｃ領域なし）；レーン２：ＥＦｃ／Ｋ、集合体分画；レーン３：ＥＦｃ／Ｋ、単量体分画；レーン４：Ｅ／ＫＦｃ、集合体分画；レーン５：Ｅ／ＫＦｃ、単量体分画；レーン６：ＥＦｃ／ＫＦｃ、集合体分画；レーン７：ＥＦｃ／ＫＦｃ、二量体分画；レーン８：ＥＦｃ／ＫＦｃ、単量体分画。 二重特異性結合ＥＬＩＳＡ分析を示す。Ｅ−コイル／Ｋ−コイルを含有するＦｃ含有ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ＤＡＲＴ誘導体（ＥＦｃ／Ｋ又はＥ／ＫＦｃ）、ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ＤＡＲＴ、対照及びＥＦｃ／ＫＦｃｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ＤＡＲＴ誘導体を比較する二重特異性結合ＥＬＩＳＡの結果を示す。 ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ＤＡＲＴのＥ−コイル及び／又はＫ−コイル誘導体及びＥ−コイル及び／又はＫ−コイルＦｃ含有誘導体のＴ細胞増殖抑制能である。ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ＤＡＲＴのＥ−コイル及び／又はＫ−コイル誘導体及びＥ−コイル及び／又はＫ−コイルＦｃ含有誘導体のＴ細胞増殖抑制能を示す。 ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴである。組み換え抗体分子、ｈＣＤ１６及びｈＣＤ３２Ｂ抗原と免疫反応性である組み換え二重特異性ＤＡＲＴに融合した連鎖球菌タンパク質ＧからなるｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴを模式的に示す。 二重特異性ＥＬＩＳＡによるｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴの結合アフィニティーである。ＥＬＩＳＡプレートは、濃度２μｇ／ｍＬのＣＤ１６抗原（図４６Ａ）又はヒト血清アルブミン（図４６Ｂ）で被覆した。ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴ（■）及び対照ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＤＡＲＴ（○）の濃度を２μｇ／ｍＬから変えて結合させた。ビオチニル化ｓＣＤ３２Ｂ抗原をプレートに添加後、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンを添加し検出した。 二重特異性ＥＬＩＳＡによるｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴの結合アフィニティーである。ＥＬＩＳＡプレートは、濃度２μｇ／ｍＬのＣＤ１６抗原（図４６Ａ）又はヒト血清アルブミン（図４６Ｂ）で被覆した。ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴ（■）及び対照ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＤＡＲＴ（○）の濃度を２μｇ／ｍＬから変えて結合させた。ビオチニル化ｓＣＤ３２Ｂ抗原をプレートに添加後、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンを添加し検出した。 ＤＡＲＴタンパク質のＰＢＭＣ介在細胞毒性である。ＤＡＲＴタンパク質のＰＢＭＣ介在細胞毒性を示す。ＡＤＣＣアッセイは、エフェクター細胞としてのＰＢＭＣとインキュベートする標的細胞としてのヒトＢ細胞株、Ｄｕａｄｉを用いて行った。個々の分析は、２０：１のエフェクター対標的比で、抗体の滴定：ｈＣＤ１６Ａ−ｈＣＤ３２Ｂ ＤＡＲＴ（●）及びｈＣＤ１６Ａ−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴ（■）を三重に行った。細胞介在細胞毒性は、ＬＤＨ放出アッセイにより測定した。１００で下側の曲線がｈＣＤ１６Ａ−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴ（■）である。 Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおけるｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴの改良された薬物動態的特徴である。マウス（ｎ＝３）に、５ｍｇ／ｋｇの（Ａ）ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴ（●）及び（Ｂ）ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＤＡＲＴ（▲）を単回静脈内注射した。マウス血清を様々な時点で採取し、血清中のタンパク質濃度をＥＬＩＳＡで定量した。薬物動態の計算は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ５．１を使用して行った。 ＨＥＲ２低発現細胞株のパネル上でのＨＥＲ２ｘＴＣＲｂ−ＤＡＲＴ活性である。Ｈｅｒ２及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）結合ドメインを有するＤＡＲＴ分子を、低濃度のＨＥＲ２発現（及び抗−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体、ハーセプチン（登録商標）での治療が無効である）を示すことにより予め特徴付けされた、多発性乳癌、大腸癌、膀胱癌細胞株において、細胞毒性を仲介する能力について試験した。試験された乳癌細胞株はＺＲ７５−１（ＨＥＲ２、２＋）（図４９Ａ）、ＭＣＦ−７（ＨＥＲ２、１＋）（図４９Ｂ）及びＭＤＡ−ＭＢ４６８（ＨＥＲ２−ｖｅ）（図４９Ｃ）である。試験された非乳癌細胞株は、ＨＴ−２９（大腸癌細胞株）（図４９Ｄ）及びＳＷ７８０（膀胱癌細胞株）（図４９Ｅ）である。 ＨＥＲ２低発現細胞株のパネル上でのＨＥＲ２ｘＴＣＲｂ−ＤＡＲＴ活性である。Ｈｅｒ２及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）結合ドメインを有するＤＡＲＴ分子を、低濃度のＨＥＲ２発現（及び抗−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体、ハーセプチン（登録商標）での治療が無効である）を示すことにより予め特徴付けされた、多発性乳癌、大腸癌、膀胱癌細胞株において、細胞毒性を仲介する能力について試験した。試験された乳癌細胞株はＺＲ７５−１（ＨＥＲ２、２＋）（図４９Ａ）、ＭＣＦ−７（ＨＥＲ２、１＋）（図４９Ｂ）及びＭＤＡ−ＭＢ４６８（ＨＥＲ２−ｖｅ）（図４９Ｃ）である。試験された非乳癌細胞株は、ＨＴ−２９（大腸癌細胞株）（図４９Ｄ）及びＳＷ７８０（膀胱癌細胞株）（図４９Ｅ）である。 ＨＥＲ２低発現細胞株のパネル上でのＨＥＲ２ｘＴＣＲｂ−ＤＡＲＴ活性である。Ｈｅｒ２及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）結合ドメインを有するＤＡＲＴ分子を、低濃度のＨＥＲ２発現（及び抗−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体、ハーセプチン（登録商標）での治療が無効である）を示すことにより予め特徴付けされた、多発性乳癌、大腸癌、膀胱癌細胞株において、細胞毒性を仲介する能力について試験した。試験された乳癌細胞株はＺＲ７５−１（ＨＥＲ２、２＋）（図４９Ａ）、ＭＣＦ−７（ＨＥＲ２、１＋）（図４９Ｂ）及びＭＤＡ−ＭＢ４６８（ＨＥＲ２−ｖｅ）（図４９Ｃ）である。試験された非乳癌細胞株は、ＨＴ−２９（大腸癌細胞株）（図４９Ｄ）及びＳＷ７８０（膀胱癌細胞株）（図４９Ｅ）である。 ＨＥＲ２低発現細胞株のパネル上でのＨＥＲ２ｘＴＣＲｂ−ＤＡＲＴ活性である。Ｈｅｒ２及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）結合ドメインを有するＤＡＲＴ分子を、低濃度のＨＥＲ２発現（及び抗−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体、ハーセプチン（登録商標）での治療が無効である）を示すことにより予め特徴付けされた、多発性乳癌、大腸癌、膀胱癌細胞株において、細胞毒性を仲介する能力について試験した。試験された乳癌細胞株はＺＲ７５−１（ＨＥＲ２、２＋）（図４９Ａ）、ＭＣＦ−７（ＨＥＲ２、１＋）（図４９Ｂ）及びＭＤＡ−ＭＢ４６８（ＨＥＲ２−ｖｅ）（図４９Ｃ）である。試験された非乳癌細胞株は、ＨＴ−２９（大腸癌細胞株）（図４９Ｄ）及びＳＷ７８０（膀胱癌細胞株）（図４９Ｅ）である。 ＨＥＲ２低発現細胞株のパネル上でのＨＥＲ２ｘＴＣＲｂ−ＤＡＲＴ活性である。Ｈｅｒ２及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）結合ドメインを有するＤＡＲＴ分子を、低濃度のＨＥＲ２発現（及び抗−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体、ハーセプチン（登録商標）での治療が無効である）を示すことにより予め特徴付けされた、多発性乳癌、大腸癌、膀胱癌細胞株において、細胞毒性を仲介する能力について試験した。試験された乳癌細胞株はＺＲ７５−１（ＨＥＲ２、２＋）（図４９Ａ）、ＭＣＦ−７（ＨＥＲ２、１＋）（図４９Ｂ）及びＭＤＡ−ＭＢ４６８（ＨＥＲ２−ｖｅ）（図４９Ｃ）である。試験された非乳癌細胞株は、ＨＴ−２９（大腸癌細胞株）（図４９Ｄ）及びＳＷ７８０（膀胱癌細胞株）（図４９Ｅ）である。
ダイアボディ分子の各ポリペプチド鎖は、ドメインの自己集合が起こらないように共有
結合によって連結されている、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを有する。２つのポリペプ
チド鎖の相互作用により２つのＶＬ−ＶＨ対が生じ、２つのエピトープ結合部位、即ち二
価の分子が形成される。ＶＨ又はＶＬドメインは、ポリペプチド鎖内のどの位置にも拘束
されず、即ち、アミノ（Ｎ）末端又はカルボキシ（Ｃ）末端に制限されず、また前記ドメ
インは、互いの相対的位置に制限されることもなく、即ち、ＶＬドメインがＶＨドメイン
に対してＮ末端側にあってもよいし、その逆であってもよい。唯一の制限は、機能的なダ
イアボディを形成するために、相補的なポリペプチド鎖が利用可能であるということであ
る。ＶＬ及びＶＨドメインが同一抗体に由来する場合、二本の相補的ポリペプチド鎖は、
同一であってもよい。例えば、結合ドメインがエピトープＡに特異的な抗体に由来する場
合（即ち、結合ドメインがＶＬＡ−ＶＨＡ相互作用から形成される場合）、各ポリペプチ
ドはＶＨＡ及びＶＬＡを含むことができる。抗体の２つのポリペプチド鎖のホモ二量体化
は、２つのＶＬＡ−ＶＨＡ結合部位の形成をもたらし、結果的に二価の単一特異性抗体が
得られる。ＶＬ及びＶＨドメインが異なる抗原に対して特異的な抗体に由来する場合、機
能的な二重特異性ダイアボディの形成には、異なる２つのポリペプチド鎖の相互作用、即
ち、ヘテロ二量体の形成が必要となる。例えば、二重特異性ダイアボディの場合、１つの
ポリペプチド鎖がＶＬＡ及びＶＬＢを有し、前記鎖のホモ二量体化は、結果的に、結合な
しの又は予測できない結合の、２つのＶＬＡ−ＶＨＢ結合部位の形成をもたらし得る。こ
れに対して、２つの異なるポリペプチド鎖が、例えば組換え発現系において自由に相互作
用できる場合、一方はＶＬＡ及びＶＨＢを有し、他方はＶＬＢ及びＶＨＡを有し、二つの
異なる結合部位、即ち、ＶＬＡ−ＶＨＡ及びＶＬＢ−ＶＨＢを形成できる。全てのダイア
ボディポリペプチド鎖の対に関して、２つの鎖の誤整列又は誤結合、即ち、ＶＬ−ＶＬ又
はＶＨ−ＶＨドメインの相互作用の可能性があるが、機能的なダイアボディの精製は、適
切に二量体化した結合部位の免疫特異性に基づいて、当該分野で公知の又は本明細書で例
示した、例えばアフィニティークロマトグラフィーなどの親和性に基づく方法を用いるこ
とで、容易に行うことができる。
他の実施形態では、ダイアボディの１つ以上のポリペプチド鎖がＦｃドメインを有する
。ダイアボディ分子のポリペプチド鎖におけるＦｃドメインは、優先的に二量体を形成し
、結果的に免疫グロブリン様の性質、例えば、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用を示すダイアボデ
ィ分子の形成をもたらす。Ｆｃを有するダイアボディは、例えば、それぞれがＶＨドメイ
ン、ＶＬドメイン及びＦｃドメインを有する２つのポリペプチド鎖からなる、二量体であ
ってもよい。前記ポリペプチド鎖の二量体化により、非改変型二価抗体の構造とは異なる
構造であるにもかかわらず、Ｆｃドメインを有する二価のダイアボディが生じる（図１１
）。このようなダイアボディ分子は、野生型免疫グロブリンと比較すると、血中半減期や
結合特性等の変化などの表現型の変化を示し得る。他の実施形態において、Ｆｃドメイン
を有するダイアボディ分子は四量体であってもよい。前記四量体は、２つの「重い」ポリ
ペプチド鎖、即ち、ＶＬ、ＶＨ及びＦｃドメインを有するポリペプチド鎖と、２つの「軽
い」ポリペプチド鎖、即ち、ＶＬ及びＶＨを有するポリペプチド鎖とを有する。前記軽い
鎖及び重い鎖は相互作用によって単量体を形成し、そしてこれらの単量体は、対を形成し
ていない状態のＦｃドメインを介して相互に作用してＩｇＧ様分子を形成する。このよう
なＩｇ様ダイアボディは四価であり、単一特異性、二重特異性、又は四重特異性であり得
る。
ダイアボディ分子の少なくとも２つの結合部位は、同一又は異なるエピトープを認識す
ることができる。異なるエピトープは、同一抗原由来、又は異なる抗原由来とすることが
できる。一つの実施形態において、エピトープは異なる細胞由来である。他の実施形態に
おいて、エピトープは、同一細胞又はウイルス上の細胞表面抗原である。エピトープ結合
部位は、抗体を産生できる、いかなる抗原をも認識できる。例えば、タンパク質、核酸、
細菌毒素、細胞表面マーカー、自己免疫マーカー、ウイルスタンパク質、薬剤等が挙げら
れる。具体的な態様では、ダイアボディの少なくとも１つのエピトープ結合部位は、特定
の細胞、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、貪食細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は樹状細胞
上の抗原に対して特異的である。
ダイアボディのポリペプチド鎖の各ドメイン、即ち、ＶＬ、ＶＨ及びＦＣドメインを、
ペプチドリンカーによって隔ててもよい。ペプチドリンカーは、０、１、２、３、４、５
、６、７、８又は９個のアミノ酸であってよい。ある実施形態では、アミノ酸リンカー配
列は、核酸配列（配列番号７４）によりコードされたＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）
である。
ある特定の実施形態では、ダイアボディ分子の各ポリペプチド鎖が、本発明の第２のポ
リペプチド鎖上の対応する少なくとも１個のシステイン残基と相互作用して、鎖間ジスル
フィド結合を形成する、少なくとも１個のシステイン残基を有するように作製される。こ
の鎖間ジスルフィド結合は、ダイアボディ分子の安定化に貢献し、組換え系における発現
及び回収を改善し、安定かつ着実な形成をもたらすのみならず、分離及び／又は精製され
た産物のインビボでの安定性を改善する。前記少なくとも１個のシステイン残基は、単一
のアミノ酸として、又はより長いアミノ酸配列、例えば、ヒンジドメインの一部として、
ポリペプチド鎖の任意の位置に導入してもよい。具体的な実施形態では、前記少なくとも
１個のシステイン残基がポリペプチド鎖のＣ末端に存在するように操作する。いくつかの
実施形態では、前記少なくとも１個のシステイン残基は、アミノ酸配列ＬＧＧＣ内でポリ
ペプチド鎖に導入される。具体的な実施形態では、本発明のダイアボディ分子を構成する
ポリペプチド鎖のＣ末端は、アミノ酸配列ＬＧＧＣを有する。他の実施形態で、前記少な
くとも１個のシステイン残基は、例えば、配列番号１又は配列番号４の、ヒンジドメイン
を有するアミノ酸配列内でポリペプチド鎖に導入される。具体的な実施形態では、本発明
のダイアボディ分子のポリペプチド鎖のＣ末端は、例えば配列番号１のＩｇＧヒンジドメ
インのアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、本発明のダイアボディ分子のポリペプ
チド鎖のＣ末端は、ヌクレオチド配列（配列番号７８）によってコードされ得るアミノ酸
配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）を有する。他の実施形態では、前記少なくとも１個の
システイン残基は、ヌクレオチド配列（配列番号７６）によってコードされ得るアミノ酸
配列ＬＧＧＣＦＮＲＧＥＣ（配列番号１７）内でポリペプチド鎖に導入される。具体的な
実施形態では、本発明のダイアボディ分子を構成するポリペプチド鎖のＣ末端は、ヌクレ
オチド配列（配列番号７６）によってコードされ得るアミノ酸配列ＬＧＧＣＦＮＲＧＥＣ
（配列番号１７）を有する。更に他の実施形態では、前記少なくとも１個のシステイン残
基は、ヌクレオチド配列（配列番号７５）によってコードされ得るアミノ酸配列ＦＮＲＧ
ＥＣ（配列番号２３）内でポリペプチド鎖に導入される。具体的な実施形態では、本発明
のダイアボディ分子を構成するポリペプチド鎖のＣ末端は、ヌクレオチド配列（配列番号
７５）によってコードされ得るアミノ酸配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を有する。
ある実施形態では、ダイアボディ分子は少なくとも２つのポリペプチド鎖を有し、該ポ
リペプチド鎖はそれぞれアミノ酸配列ＬＧＧＣを有し、かつ前記ＬＧＧＣ配列中のシステ
イン残基間のジスルフィド結合によって共有結合している。他の具体的な実施形態では、
ダイアボディ分子は少なくとも２つのポリペプチド鎖を有し、その一方は、配列ＦＮＲＧ
ＥＣ（配列番号２３）を有し、他方は（少なくとも１つのシステイン残基を有する）ヒン
ジドメインを有し、前記少なくとも２つのポリペプチド鎖は、ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２
３）中のシステイン残基とヒンジドメイン中のシステイン残基との間のジスルフィド結合
によって共有結合している。特定の態様では、ヒンジドメイン中に位置して、ジスルフィ
ド結合に関与するシステイン残基は、Ｃｙｓ−１２８（カバットＥＵによる番号付けでは
、改変されていない完全なＩｇＧ重鎖のヒンジドメインの中に位置する）であり、配列番
号２３中の対応するシステイン残基は、Ｃｙｓ−２１４（カバットＥＵによる番号付けで
は、改変されていない完全なＩｇＧ軽鎖のＣ末端に位置する）である（Ｅｌｋａｂｅｔｚ
ら，（２００５），Ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ Ｉｎ ＣＨｌ Ｕｎｄｅｒｌｉｅ Ｒｅｔｅｎ
ｔｉｏｎ Ｏｆ Ｕｎａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｉｇ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎｓ，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：１４４０２−１４４１２：参照することによりその全体を本
明細書中に組み入れる）。更に他の実施形態では、前記少なくとも１個のシステイン残基
がアミノ酸鎖のＮ末端に存在するように操作する。更に他の実施形態では、前記少なくと
も１個のシステイン残基がダイアボディ分子のポリペプチド鎖のリンカー部分に存在する
ように操作する。さらなる実施形態では、ＶＨ又はＶＬドメインは、親のＶＨ又はＶＬド
メインと比較して、親のアミノ酸をシステインで置換することを有する、少なくとも１つ
のアミノ酸の改変を有するように操作する。
本発明は、Ｆｃドメイン又はその一部（例えば、ＣＨ２ドメイン又はＣＨ３ドメイン）
を有するダイアボディ分子を包含する。Ｆｃドメイン又はその一部は、これらに限定はさ
れないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＭを含む免疫グロブリンのあらゆる
アイソタイプ又はアロタイプに由来するものであってよい。好ましい実施形態では、Ｆｃ
ドメイン（又はその一部）は、ＩｇＧに由来する。具体的な実施形態では、ＩｇＧアイソ
タイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４、又はそれらのアロタイプで
ある。一つの実施形態では、ダイアボディ分子はＦｃドメインを有し、このＦｃドメイン
は、免疫グロブリンアイソタイプのいずれかから独立に選択されたＣＨ２ドメイン及びＣ
Ｈ３ドメインを有する（即ち、ＦｃドメインはＩｇＧに由来するＣＨ２ドメインとＩｇＥ
に由来するＣＨ３ドメイン、又はＩｇＧ１に由来するＣＨ２ドメインとＩｇＧ２に由来す
るＣＨ３ドメイン等を含んでなる）。前記Ｆｃドメインを、前記ポリペプチド鎖の他のド
メイン又は部分に対してどんな位置であっても、本発明のダイアボディ分子を構成するポ
リペプチド鎖の中に、遺伝子操作で導入してもよい（例えば、Ｆｃドメイン若しくはその
一部が、ポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨ両ドメインのＣ末端にあってもよく、ＶＬ及びＶ
Ｈ両ドメインのＮ末端にあってもよく、又は一方のドメインのＮ末端と他方のドメインの
Ｃ末端に（即ち、ポリペプチド鎖の２つのドメインの間に）あってもよい）。
本発明はまた、ヒンジドメインを有する分子を包含する。ヒンジドメインは、ＩｇＡ、
ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＭを含む免疫グロブリンのあらゆるアイソタイプ又はア
ロタイプに由来するものであってもよい。好ましい実施形態では、ヒンジドメインはＩｇ
Ｇに由来し、そのＩｇＧアイソタイプはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４
、又はそれらのアロタイプである。前記ヒンジドメインは、ダイアボディ分子がヒンジ−
Ｆｃドメインを有するように、Ｆｃドメインと共にダイアボディ分子を構成するポリペプ
チド鎖の中に、遺伝子操作で導入してもよい。ある実施形態では、ヒンジ及びＦｃドメイ
ンは、当該分野で公知の又は本明細書で例示した免疫グロブリンアイソタイプのいずれか
から独立して選択される。他の実施形態では、ヒンジとＦｃドメインとは、ポリペプチド
鎖の少なくとも１つの他のドメイン、例えば、ＶＬドメインによって分離されている。ヒ
ンジドメインを、又は場合によりヒンジ−Ｆｃドメインを、前記ポリペプチド鎖の他のド
メイン又は一部に対してどんな位置であっても、本発明のポリペプチドの中に、遺伝子操
作で導入してもよい。ある実施形態では、本発明のポリペプチド鎖はヒンジドメインを有
し、このヒンジドメインは、Ｆｃドメインを含まないポリペプチド鎖のＣ末端に存在する
。更に他の実施形態では、本発明のポリペプチド鎖は、ポリペプチド鎖のＣ末端に存在す
るヒンジ−Ｆｃドメインを有する。さらなる実施形態では、本発明のポリペプチド鎖は、
ポリペプチド鎖のＮ末端に存在するヒンジ−Ｆｃドメインを有する。
上述したように、本発明は、ポリペプチド鎖のそれぞれがＶＨ及びＶＬドメインを有す
るポリペプチド鎖の多量体を包含する。ある態様においては、前記多量体のポリペプチド
鎖は、更にＦｃドメインを有する。Ｆｃドメインの二量体形成は、免疫グロブリン様の機
能性、即ちＦｃを介した機能（例えば、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用、補体結合等）を示すダ
イアボディ分子の形成をもらたす。ある実施形態では、各ポリペプチド鎖を構成するＶＬ
及びＶＨドメインは、同一の特異性を有し、前記ダイアボディ分子は、二価であって、か
つ単一特異的である。他の実施形態では、各ポリペプチド鎖を構成するＶＬ及びＶＨドメ
インは、異なる特異性を有し、ダイアボディは二価で、かつ二重特異性である。
更に他の実施形態では、本発明のダイアボディ分子は、それぞれがＶＨ及びＶＬドメイ
ンを有するポリペプチド鎖の四量体を包含する。ある実施形態では、四量体の２つのポリ
ペプチド鎖は、更にＦｃドメインを含む。従って、四量体は、それぞれがＶＬ、ＶＨ及び
Ｆｃドメインを有する２つの「重い」ポリペプチド鎖と、ＶＬ及びＶＨドメインを有する
２つの「軽い」ポリペプチド鎖から成っている。重い鎖と軽い鎖の相互作用による二価単
量体の形成と、重い鎖のＦｃドメインを介した二価単量体の二量化とにより、四価の免疫
グロブリン様分子を形成する（実施例６．２及び６．３に例示）。ある態様では、単量体
は同一であり、四価のダイアボディ分子は、単一特異性又は二重特異性である。他の態様
では、単量体は異なっており、四価の分子は、二重特異性又は四重特異性である。
上述のように、四重特異性ダイアボディ分子の形成には、４つの異なるポリペプチド鎖
の相互作用が必要である。そのような相互作用を単細胞組換え生産系で効率的に行わせる
ことは、鎖の潜在的なミスペアリングによる多数の変異体の存在により困難である。ミス
ペアリングの可能性が増加することに対する１つの解決策は、所望のポリペプチド鎖対へ
の「ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ」型変異の導入である。このような変異は、ホモ
二量体形成よりもヘテロ二量体形成に対して有利である。例えば、Ｆｃ−Ｆｃ相互作用に
関して、アミノ酸置換（好ましくは、「ｋｎｏｂ」を形成する嵩高な側鎖を有するアミノ
酸、例えば、トリプトファンでの置換）をＣＨ２又はＣＨ３ドメインに導入して、立体障
害が同様に変異させたドメインとの相互作用を妨げ、かつその変異型ドメインを、相補的
な又は対応する変異、即ち、「ｈｏｌｅ」（例えばグリシンでの置換）を遺伝子操作で導
入したドメインと、強制的に対合させるようにする。このような変異のセットは、ダイア
ボディ分子を構成するどのポリペプチド対にも遺伝子操作で導入することができ、更に、
そのような対のポリペプチド鎖のどの部分にも遺伝子操作で導入することができる。ホモ
二量体形成よりもヘテロ二量体形成に有利なタンパク質操作の方法、特に免疫グロブリン
様分子の操作については、当該分野でよく知られており、それらは本明細書中に包含され
る（例えば、Ｒｉｄｇｗａｙら，（１９９６），Ｋｎｏｂｓ−Ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅｓ’
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＨ３ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｆｏｒ
Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ
ｎｇｒ．９：６１７−６２１、Ａｔｗｅｌｌら，（１９９７），Ｓｔａｂｌｅ Ｈｅｔｅ
ｒｏｄｉｍｅｒｓ Ｆｒｏｍ Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｔｈｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｉｎｔｅ
ｒｆａｃｅ Ｏｆ Ａ Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ Ｕｓｉｎｇ Ａ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌ
ａｙ Ｌｉｂｒａｒｙ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７０：２６−３５、及びＸｉｅら，
（２００５），Ａ Ｎｅｗ Ｆｏｒｍａｔ Ｏｆ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ：Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２９６：９５−１０１参照。いずれの文献も参照することによりその
全体を本明細書中に組み入れる）。
本発明はまた、変異型Ｆｃ若しくは変異型ヒンジ−Ｆｃドメイン（又はその一部）を有
するダイアボディ分子を包含し、この変異型Ｆｃドメインは、相当する野生型Ｆｃドメイ
ン若しくは野生型ヒンジ−Ｆｃドメイン（又はその一部）と比べて、少なくとも１つのア
ミノ酸改変（例えば、置換、挿入、又は欠失）を有する。変異型Ｆｃドメイン若しくは変
異型ヒンジ−Ｆｃドメイン（又はその一部）を有する分子（例えば、抗体）は、野生型Ｆ
ｃドメイン若しくは野生型ヒンジ−Ｆｃドメイン又はその一部を有する分子と比較して、
通常は表現型が変化している。変異表現型は、ＮＫ依存性又はマクロファージ依存性アッ
セイでアッセイしたときに、血中半減期の変化、安定性の変化、細胞性酵素に対する感受
性の変化、又はエフェクター機能の変化として現れることがある。エフェクター機能を変
えることが同定された変異型Ｆｃドメインは、国際公開ＷＯ０４／０６３３５１号、米国
特許出願公開２００５／００３７０００号及び２００５／００６４５１４号、２００４年
１１月１０日出願の米国仮出願第６０／６２６，５１０号、２００４年１２月１５日出願
の米国仮出願第６０／６３６，６６３号及び２００６年３月１０日出願の米国仮出願第６
０／７８１，５６４号、本発明者らの同時出願である２００５年１１月１０日出願の米国
特許出願第１１／２７１，１４０号及び２００５年１２月１５日出願の米国特許出願第１
１／３０５，７８７号に開示されている。各特許文献は参照することによりその全体が本
明細書に組み込まれる。
本発明の二重特異性ダイアボディは、２つの分離した、異なるエピトープに同時に結合
できる。ある実施形態では、エピトープは同一抗原由来である。他の実施形態では、エピ
トープは異なる抗原由来である。好ましい実施形態では、少なくとも１つのエピトープ結
合部位は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又は他の単核細胞上で発現され
る、免疫エフェクター細胞上に発現される決定因子（例えば、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３
２、ＣＤ６４等）に特異的である。一つの実施形態においては、ダイアボディ分子は、エ
フェクター細胞の決定因子に結合し、かつ前記エフェクター細胞を活性化する。これに関
連して、本発明のダイアボディ分子は、それらが更にＦｃドメインを含んでいるかどうか
とは無関係に、Ｉｇ様の機能性を示すことができる（例えば、当該分野で公知の、又は本
明細書に例示される、エフェクター機能分析のいずれか（例えばＡＤＣＣアッセイ）でア
ッセイした場合）。ある実施形態では、本発明の二重特異性ダイアボディは、腫瘍細胞上
の癌抗原とエファクター細胞の決定因子との両者に結合すると同時に、エフェクター細胞
を活性化する。他に取り得る実施形態では、本発明の二重特異性ダイアボディ又はダイア
ボディ分子は、上記（背景技術の項を参照）のように、同一細胞上の活性化受容体と抑制
受容体とに同時に結合し（例えば、ＣＤ３２ＡとＣＤ３２Ｂ、ＢＣＲとＣＤ３２Ｂ、又は
ＩｇＥＲＩとＣＤ３２Ｂに結合する）、それらを連結することによって、標的、例えば、
エフェクター細胞の活性化を阻害することができる。本実施形態のさらなる態様において
、二重特異性ダイアボディは、ウイルス上の２つの中和エピトープ（例えば、ＲＳＶエピ
トープ；Ｅ１６及びＥ５３のようなＷＮＶエピトープ）に同時に結合することによって、
抗ウイルス性を示すことができる。
ある実施形態では、本発明の二重特異性ダイアボディ分子は、特定の細胞型を標的とす
るための独特な有利な状況を提供する。例えば、二重特異性ダイアボディ又はダイアボデ
ィ分子を、遺伝子操作して標的細胞型又は標的組織型に特異な一連の抗原を認識するエピ
トープ結合部位の組合せを有するようにすることができる。更に、個々の抗原の一方又は
両方が、他の組織及び／又は細胞型において個々にかなり一般的なものである場合、低親
和性結合ドメインを用いて、ダイアボディ又はダイアボディ分子を構築することができる
。このような低親和性結合ドメインは、治療目的のために十分な結合力でもって個々のエ
ピトープ又は抗原に結合できないが、エピトープ又は抗原の両方が、単一標的細胞又は組
織上に存在する場合、その細胞若しくは組織に対するダイアボディ又はダイアボディ分子
の結合力は、抗原１つだけを発現している細胞若しくは組織と比較して増加している。こ
のように前記細胞若しくは組織は、本発明によって効率的に標的化される。このような二
重特異性分子は、たった１つの抗原に対する特異性を持つ単一特異性ダイアボディ又は抗
体と比較して、前記両方の抗原を発現している細胞上の一方の又は両方の標的抗原に対し
て増強された結合性を示し得る。
好ましくは、本発明のダイアボディの結合特性は、結合活性及び／又は１つ以上のＦｃ
γＲを介したエフェクター細胞機能（Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用を通して、又はＦｃγＲへ
のダイアボディ分子の免疫特異的結合により仲介される）を測定するためのインビトロ機
能分析により特徴付けされる（セクション５．４．２及び５．４．３を参照）。ＦｃγＲ
に対する本発明の分子、例えば、ダイアボディの親和性及び結合特性は、結合ドメイン−
抗原又はＦｃ−ＦｃγＲ相互作用、即ち、それぞれ、結合ドメインへの抗原の特異的結合
、又はＦｃγＲへのＦｃ領域の特異的結合、を測定するための当該分野で知られるインビ
トロ分析法（生化学的な又は免疫学的なアッセイ法）を用いて測定することができる。前
記インビトロアッセイ法には、これらに限定されないが、ＥＬＩＳＡアッセイ法、表面プ
ラズモン共鳴アッセイ法、免疫沈降アッセイ法（セクション５．４．２参照）が含まれる
。最も好ましい実施形態では、本発明の分子は、インビトロベースのアッセイにおける結
合特性と同様の結合特性を（本明細書に記載され、開示されるような）インビボモデルに
おいて有する。しかし、本発明は、インビトロベースのアッセイでは所望の表現型を示さ
ないが、インビボでは所望の表現型を示す本発明の分子を排除するものではない。
いくつかの実施形態では、本発明の分子は、鋳型分子の対応する部分と比較して変化し
たグリコシル化パターン又は変化したグリコフォームを有するように操作される。操作さ
れたグリコフォームは、エフェクター機能を増強することを含むがこれらに限定されない
、様々な目的に有用であり得る。操作されたグリコフォームは、当業者に公知の方法のい
ずれによっても産生できる。例えば、遺伝子操作された若しくは変異型の発現株を用いる
方法、１つ以上の酵素、例えばＤＩＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ
Ｉ（ＧｎＴＩＩＩ）との共発現による方法、各種生物若しくは各種生物由来の細胞株に本
発明のダイアボディを発現させることによる方法、又はダイアボディを発現させて精製し
た後に糖鎖を改変することによる方法が挙げられる。遺伝子操作されたグリコフォームを
産生する方法は、当該分野では公知であり、かかる方法は、これらに限定はされないが、
Ｕｍａｎａら，（１９９９），Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ Ｏｆ Ａ
ｎ Ａｎｔｉｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ＩｇＧ１ Ｗｉｔｈ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ
Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｃ
ｔｉｖｉｔｙ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：１７６‐１８０；Ｄａｖｉｅｓ
ら，（２００１），Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ ＧｎＴＩＩＩ Ｉｎ Ａ Ｒｅｃｏｍ
ｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉ−ＣＤ２０ ＣＨＯ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎ
ｅ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｗｉｔｈ Ａｌｔｅｒｅｄ
Ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ Ｌｅａｄｓ Ｔｏ Ａｎ Ｉｎｃｒｅａｓｅ Ｉｎ Ａｄｃｃ
Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｈｉｇｈｅｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｆｏｒ Ｆｃ Ｇａｍｍａ ＲＩＩ
Ｉ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．７４：２８８−２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓら，
（２００２），Ｌａｃｋ Ｏｆ Ｆｕｃｏｓｅ Ｏｎ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ Ｎ−Ｌｉ
ｎｋｅｄ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｔｏ
Ｈｕｍａｎ Ｆｃｇａｍｍａ ＲＩＩＩ Ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅ
ｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７
３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａら，（２００３），Ｔｈｅ Ａｂｓｅｎｃｅ Ｏｆ
Ｆｕｃｏｓｅ Ｂｕｔ Ｎｏｔ Ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｃｅ Ｏｆ Ｇａｌａｃｔｏｓ
ｅ Ｏｒ Ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ Ｏｆ Ｈｕ
ｍａｎ ＩｇＧ１ Ｃｏｍｐｌｅｘ−Ｔｙｐｅ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ Ｓ
ｈｏｗｓ Ｔｈｅ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｏｌｅ Ｏｆ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７８：３４６６−３４７３；米国特許第６，６０２，６８４号；
米国特許出願第１０／２７７，３７０号；米国特許出願第１０／１１３，９２９号；国際
公開ＷＯ００／６１７３９Ａ１；国際公開ＷＯ０１／２９２２４６Ａ１；国際公開ＷＯ０
２／３１１１４０Ａ１；国際公開ＷＯ０２／３０９５４Ａ１；ＰｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔＴ
Ｍテクノロジー（Ｂｉｏｗａ社、プリンストン、ＮＪ）；ＧｌｙｃｏＭＡｂＴＭグリコシ
ル化エンジニアリング・テクノロジー（ＧＬＹＣＡＲＴ・ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社
、チューリッヒ、スイス）を含む。また、上記各方法は、参照することによりその全体を
本明細書に組み入れる。例えば、国際公開ＷＯ０００６１７３９号；ユーラシア特許第０
１２２９１２５号；米国特許第２００３０１１５６１４号；Ｏｋａｚａｋｉら，（２００
４），Ｆｕｃｏｓｅ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ Ｏｌｉｇ
ｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｅｎｔｈａｌｐｙ Ａｎ
ｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒａｔｅ Ｂｅｔｗｅｅｎ ＩｇＧ１ Ａｎｄ ＦｃＧａ
ｍｍａＲＩＩＩＡ，ＪＭＢ，３３６：１２３９−４９を参照。これらのそれぞれを参照す
ることによりその全体を本明細書に組み入れる。
更に本発明は、本発明のダイアボディを産生するために非天然アミノ酸を組み込むこと
を包含する。そのような方法は、天然の生合成機構を用いてタンパク質内へ非天然アミノ
酸を組み込む方法など、当業者に公知である。例えば、Ｗａｎｇら，（２００２），Ｅｘ
ｐａｎｄｉｎｇ Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１：１−１
１；Ｗａｎｇら，（２００１），Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄ
ｅ Ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：４９８‐５０
０；ｖａｎ Ｈｅｓｔら，（２００１），Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂａｓｅｄ Ｍａｔｅｒｉａ
ｌｓ，Ｔｏｗａｒｄ Ａ Ｎｅｗ Ｌｅｖｅｌ Ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｏｎｔ
ｒｏｌ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１９：１８９７−１９０４を参照。これらのそれぞれを参
照することにより、その全体を本明細書に組み入れる。もう一つの方法として、アミノア
シル−ｔＲＮＡの生合成に関与する酵素に焦点を当てたものがある。例えば、Ｔａｎｇら
，（２００１），Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｏｆ Ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｔａｂｌｅ
Ｃｏｉｌｅｄ−Ｃｏｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｈｅｘａｆｌｕｏｒ
ｏｌｅｕｃｉｎｅ Ｉｎ Ａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｈｏｓｔ
，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３（４４）：１１０８９−１１０９０；Ｋｉｉｃｋ
ら，（２００１），Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｓ
ｅｔ Ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ
Ａｎａｌｏｇｕｅｓ Ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．
５０２（１−２）：２５−３０を参照。これらのそれぞれを参照することによりその全体
を本明細書に組み入れる。
いくつかの実施形態では、本発明は、グリコシル化部位を付加又は欠失させることによ
って、本発明の分子のＶＬ、ＶＨ又はＦｃドメインを改変する方法を包含する。タンパク
質の糖を改変する方法は、当該分野で周知であり、本発明中に包含される。例えば米国特
許第６，２１８，１４９号；欧州特許第０，３５９，０９６Ｂ１；米国特許公開第２００
２／００２８４８６号；国際公開ＷＯ０３／０３５８３５号；米国特許公開第２００３／
０１１５６１４号；米国特許第６，２１８，１４９号；米国特許第６，４７２，５１１号
を参照されたい。これらは全て参照することによりその全体を本明細書に組み入れる。
本発明のダイアボディ分子は、ナチュラルキラー群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体に対する
結合リガンドであるドメインを有するように構築されてもよい。そのような結合リガンド
、特に正常細胞上には発現されない結合リガンドには、組織適合性６０（Ｈ６０）分子、
レチノイン酸初期誘導遺伝子−１（ＲＡＥ−１）産物、マウスＵＬ１６−結合タンパク質
様転写物１（ＭＵＬＴ１）が含まれる（Ｒａｕｌｅｔ Ｄ．Ｈ．，（２００３），Ｒｏｌ
ｅｓ Ｏｆ Ｔｈｅ ＮＫＧ２Ｄ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｎｄ Ｉｔｓ Ｌ
ｉｇａｎｄｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：７８１−７９０；Ｃｏｕｄ
ｅｒｔ，Ｊ．Ｄ．ら，（２００５），Ａｌｔｅｒｅｄ ＮＫＧ２Ｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ
Ｉｎ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｂｙ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｅｘｐｏｓｕｒｅ
Ｔｏ Ａｌｔｅｒｅｄ ＮＫＧ２Ｄ Ｌｉｇａｎｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ
Ｃｅｌｌｓ，Ｂｌｏｏｄ，１０６：１７１１−１７１７）。ヒトＮＫＧ２Ｄに反応性の
他のリガンドには、多型ＭＨＣクラスＩ鎖関連分子ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢが含まれる（Ｄ
ｉｅｆｅｎｂａｃｈ，Ａ．ら，（１９９９），Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ
ｓ：Ｓｔｒｅｓｓ Ｏｕｔ，Ｔｕｒｎ Ｏｎ，Ｔｕｎｅ Ｉｎ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．９
（２２）：Ｒ８５１−Ｒ８５３３；Ｂａｕｅｒ，Ｓ．ら，（１９９９），Ａｃｔｉｖａｔ
ｉｏｎ Ｏｆ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｂｙ ＮＫＧ２Ｄ，Ａ Ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ Ｆｏｒ Ｓｔｒｅｓｓ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＭＩＣＡ，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２８５（５４２８）：７２７−７２９；Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｈ．Ａ．，（２００１）
，ＭＩＣＡ ａｎｄ ＭＩＣＢ ｇｅｎｅｓ：ｃａｎ ｔｈｅ ｅｎｉｇｍａ ｏｆ ｔ
ｈｅｉｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｂｅ ｒｅｓｏｌｖｅｄ？，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．２２：３７８−３８５）。
ＭＩＣＡの配列は、以下の配列番号３１１である。
MGLGPVFLLL AGIFPFAPPG AAAEPHSLRY NLTVLSWDGS VQSGFLTEVH
LDGQPFLRCD RQKCRAKPQG QWAEDVLGNK TWDRETRDLT GNGKDLRMTL
AHIKDQKEGL HSLQEIRVCE IHEDNSTRSS QHFYYDGELF LSQNLETKEW
TMPQSSRAQT LAMNVRNFLK EDAMKTKTHY HAMHADCLQE LRRYLKSGVV
LRRTVPPMVN VTRSEASEGN ITVTCRASGF YPWNITLSWR QDGVSLSHDT
QQWGDVLPDG NGTYQTWVAT RICQGEEQRF TCYMEHSGNH STHPVPSGKV
LVLQSHWQTF HVSAVAAAAI FVIIIFYVRC CKKKTSAAEG PELVSLQVLD
QHPVGTSDHR DATQLGFQPL MSDLGSTGST EGA
ＭＩＣＢの配列は、以下の配列番号３１２である。
PHSLRYNLMV LSQDGSVQSG FLAEGHLDGQ PFLRYDRQKR RAKPQGQWAE
DVLGAKTWDT ETEDLTENGQ DLRRTLTHIK DQKGGLHSLQ EIRVCEIHED
SSTRGSRHFY YDGELFLSQN LETQESTVPQ SSRAQTLAMN VTNFWKEDAM
KTKTHYRAMQ ADCLQKLQLP PMVNVICSEV SEGNITVTCR ASSFYPRNIT
LTWRQDGVSL SHNTQQWGDV LPDGNGTYQT WVATRIRQGE EQRFTCYMEH
SGNHGTHPVP SGKALVLQSQ RTDFPYVSAA MPCFVIIIIL CVPCCKKKTS
AAEGP
Ｔ細胞受容体に特異的に結合する抗体には、抗ＴＣＲ抗体ＢＭＡ０３１（Ｋｕｒｒｌｅ
，Ｒ．ら，（１９８９），ＢＭＡ ０３１−Ａ ＴＣＲ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．２１（１，Ｐｔ．１）：１０１７−１０１９；Ｎａｓ
ｈａｎ，Ｂ．ら，（１９８７），Ｆｉｎｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ｏｆ Ａ Ｐａｎ
ｅｌ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｔｈｅ ＴＣＲ／ＣＤ３ Ｃｏｍ
ｐｌｅｘ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．１９（５）：４２７０−４２７２；Ｓｈｅ
ａｒｍａｎ，Ｃ．Ｗ．ら，（１９９１），Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ，Ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｏｆ Ｍｕｒｉｎｅ／Ｈｕｍａｎ
Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｗｉｔｈ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ｆｏ
ｒ Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ α／β Ｔ Ｃｅｌｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６（３）：
９２８−９３５；Ｓｈｅａｒｍａｎ，Ｃ．Ｗ．ら，（１９９１），Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉ
ｏｎ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕ
ｍａｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ａｇａｉｎｓｔ Ｔｈｅ
Ｈｕｍａｎ α／β Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（
１２）：４３６６−４３７３）が含まれる。ＮＫＧ２Ｄ受容体に特異的に結合する抗体に
は、ＫＹＫ−２．０（Ｋｗｏｎｇ，ＫＹら，（２００８），Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，Ａｆ
ｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，Ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏ
ｆ Ａ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＮＫＧ２Ｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ Ｗｉｔｈ Ｄｕａｌ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ Ａｎｄ Ａｇｏｎｉｓ
ｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８４：１１４３−１１５６；及び
国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０９／５４９１１）が含まれる。
そのようなダイアボディを使用することによって、標的細胞は直ちに（ＮＫＧ２Ｄ）受
容体を配置する細胞により結合可能な細胞に誘導される。ＮＫＧ２Ｄ受容体は、全てのＣ
Ｄ８＋Ｔ細胞上（Ｇｒｏｈ，Ｖ．ら，（２００１），Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｏｆ
ＣＤ８αβ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｂｙ ＮＫＧ２Ｄ Ｖｉａ Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ Ｂ
ｙ ＭＩＣ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｏｎ Ｖｉｒｕｓ−Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｃｅｌｌｓ，Ｎａ
ｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２（３）：２５５−２６０；Ｊａｍｉｅｓｏｎ，Ａ．Ｍ．ら，（２
００２），Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ Ｏｆ Ｔｈｅ ＮＫＧ２Ｄ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏ
ｒ Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｎａｔｕｒａｌ
Ｋｉｌｌｉｎｇ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１７（ｌ）：１９−２９）と同様、全てのヒト（及
び他の哺乳類）ナチュラルキラー細胞上に発現される（Ｂａｕｅｒ，Ｓ．ら，（１９９９
），Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｏｆ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｂｙ
ＮＫＧ２Ｄ，Ａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆｏｒ Ｓｔｒｅｓｓ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＭＩ
ＣＡ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５（５４２８）：７２７−７２９；Ｊａｍｉｅｓｏｎ，Ａ．
Ｍ．ら，（２００２），Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ Ｏｆ Ｔｈｅ ＮＫＧ２Ｄ Ｉｍｍｕｎｏｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｎａ
ｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｉｎｇ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１７（１）：１９−２９）。
あるいは、本発明のダイアボディ分子は、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）に対する結合リ
ガンドであるドメインを有するように構築されてもよい。ＴＣＲは、ＣＤ４＋又はＣＤ８
＋Ｔ細胞により自然に発現され、これら細胞に、抗原提示細胞のクラスＩ又はクラスＩＩ
ＭＨＣタンパク質により結合、提供される抗原性ペプチドを認識させる。ＴＣＲによるｐ
ＭＨＣ（ペプチド−ＭＨＣ）複合体の認識により、サイトカインの産生及び抗原提示細胞
の溶解を誘導する細胞免疫応答の伝播が開始する（例えば、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｋ．Ｍ
．ら，（２００８），Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｎｇｅｓ Ａｎｄ Ｆｌｅ
ｘｉｂｉｌｉｔｙ Ｉｎ Ｔ−ＣｅＩｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ
Ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，４１５（
Ｐｔ．２）：１８３−１９６；Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ，Ｒ．ら，（２００８），Ｓｅｌｅｃ
ｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｄｉｒｅｃｔｅ
ｄ Ａｇａｉｎｓｔ Ｔｕｍｏｒ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ Ｆｏｒ Ａｄｏｐ
ｔｉｖｅ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ．７３（１１）：１
０９３−１０９９；Ｂｅｉｅｒ，Ｋ．Ｃ．ら，（２００７），Ｍａｓｔｅｒ Ｓｗｉｔｃ
ｈｅｓ Ｏｆ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ
ｔｉｏｎ，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．，２９：８０４−８１２；Ｍａｌｌｏｎｅ，Ｒ．
ら，（２００５），Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍ
ｕｎｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ Ｉｎ Ａｕｔｏｉ
ｍｍｕｎｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ａｍ．Ｊ．Ｔｈｅｒ．１２（６）：５３４−５５０参照
）。
例えば、標的細胞の表面上に存在する受容体に結合できる少なくとも１つのエピトープ
結合ドメインを付加的に有するようにダイアボディ分子を構築することにより、そのよう
なダイアボディ分子はＤＡＲＴ分子であり、従って上記標的細胞に結合することができる
ので、標的細胞にナチュラルキラー群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体に対する結合リガンド又
はＴＣＲを表示させる（どちらが標的細胞結合ダイアボディ上に存在したとしても）（例
えば、Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｃ．ら，（２００８），Ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ ＮＫ Ｃｅｌ
ｌｓ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｙ Ａ Ｎｅｗ Ｒｅ
ｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒ．Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１（１１）：６６５−６７２参照）。
そのようなダイアボディは、目的の標的細胞をＮＫ細胞介在細胞溶解又はＴ細胞介在細
胞毒性の標的である細胞に誘導するために使用するこができる。一つの実施形態では、標
的細胞の表面に存在する受容体に結合することができるダイアボディのエピトープ結合ド
メインは、ＮＫ細胞介在細胞溶解又はＴ細胞介在細胞毒性のための基質中に癌細胞を誘導
するように、腫瘍関連抗原に結合するエピトープである。特に興味深いものは、乳癌抗原
、卵巣癌抗原、前立腺癌抗原、頸部癌抗原、膵癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、大腸癌抗
原、精巣癌抗原、膠芽腫癌抗原、Ｂ細胞悪性腫瘍関連抗原、多発性骨髄腫関連抗原、非ホ
ジキンスリンパ腫関連抗原又は慢性リンパ球性白血病関連抗原である、腫瘍関連抗原であ
る。
そのような使用に好適な腫瘍関連抗原としては、以下のものが挙げられる。Ａ３３（大
腸癌抗原；Ａｌｍｑｖｉｓｔ，Ｙ．２００６，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，Ｎｏｖ．
３３（８）：９９１−９９８）；Ｂ１（Ｅｇｌｏｆｆ，Ａ．Ｍ．ら，２００６，Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．６６（ｌ）：６−９）；ＢＡＧＥ（Ｂｏｄｅｙ，Ｂ．，２００２，Ｅｘｐ
ｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２（６）：５７７−８４）；β−カテニン（
Ｐｒａｎｇｅ，Ｗ．ら，２００３，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２０１（２）：２５０−９）；Ｃ
Ａ１２５（Ｂａｓｔ，Ｒ．Ｃ．Ｊｒ．ら，２００５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃａ
ｎｃｅｒ，１５，追補，３：２７４−８１）；ＣＤ５（Ｃａｌｉｎ，Ｇ．Ａ．ら，２００
６，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３３（２）：１６７−７３；ＣＤ１９（Ｔｒｏｕｓｓａｒ
ｄ，Ｘ．ら，１９９８，Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｔｈｅｒ．４０（４）：１３９−４
８）；ＣＤ２０（Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．Ａ．ら，２００６，Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．
Ｃｌｉｎ．，Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．２０（５）：１１２５−３６）；ＣＤ２２（Ｋｒｅｉｔ
ｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，２００６，ＡＡＰＳ Ｊ．，１８；８（３）：Ｅ５３２−５１）；Ｃ
Ｄ２３（Ｒｏｓａｔｉ，Ｓ．ら，２００５，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．，５；２９４：９１−１０７）；ＣＤ２５（Ｔｒｏｕｓｓａｒｄ，Ｘ．ら
，１９９８，Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｔｈｅｒ．，４０（４）：１３９−４８）；Ｃ
Ｄ２７（Ｂａｔａｉｌｌｅ，Ｒ．，２００６，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，９１（９）
：１２３４−４０）；ＣＤ２８（Ｂａｔａｉｌｌｅ，Ｒ．，２００６，Ｈａｅｍａｔｏｌ
ｏｇｉｃａ，９１（９）：１２３４−４０）；ＣＤ３６（Ｇｅ，Ｙ．，２００５，Ｌａｂ
．Ｈｅｍａｔｏｌ．１１（１）：３１−７）；ＣＤ４０／ＣＤ１５４（Ｍｅｓｓｍｅｒ，
Ｄ．ら，２００５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０６２：５１−６０）；Ｃ
Ｄ４５（Ｊｕｒｃｉｃ，Ｊ．Ｇ．，２００５，Ｃｕｒｒ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．，７（５
）：３３９−４６）；ＣＤ５６（Ｂａｔａｉｌｌｅ，Ｒ．，２００６，Ｈａｅｍａｔｏｌ
ｏｇｉｃａ，９１（９）：１２３４−４０）；ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ（Ｔｒｏｕｓｓａ
ｒｄ，Ｘ．ら，１９９８，Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｔｈｅｒ．，４０（４）：１３９
−４８；Ｃｈｕ，Ｐ．Ｇ．ら，２００１，Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．
Ｍｏｌ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．，９（２）：９７−１０６）；ＣＤ１０３（Ｔｒｏｕｓｓａｒ
ｄ，Ｘ．ら，１９９８，Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｔｈｅｒ．，４０（４）：１３９−
４８）；ＣＤＫ４（Ｌｅｅ，Ｙ．Ｍ．ら，２００６，Ｃｅｌｌ．Ｃｙｃｌｅ，５（１８）
：２１１０−４）；ＣＥＡ（癌胎児性抗原；Ｍａｔｈｅｌｉｎ，Ｃ．，２００６，Ｇｙｎ
ｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｆｅｒｔｉｌ．，３４（７−８）：６３８−４６；Ｔｅｌｌｅ
ｚ−Ａｖｉｌａ，Ｆ．Ｉ．ら，２００５，Ｒｅｖ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｃｌｉｎ．，５７（６
）：８１４−９）；ＣＴＬＡ４（Ｐｅｇｇｓ，Ｋ．Ｓ．ら，２００６，Ｃｕｒｒ，Ｏｐｉ
ｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（２）：２０６−１３）；ＥＧＦ−Ｒ（上皮成長因子受容体；
Ａｄｅｎｉｓ，Ａ．ら，２００３，Ｂｕｌｌ．Ｃａｎｃｅｒ，９０，Ｓｐｅｃ Ｎｏ：Ｓ
２２８−３２）；Ｅｒｂ（ＥｒｂＢｌ；ＥｒｂＢ３；ＥｒｂＢ４；Ｚｈｏｕ，Ｈ．ら，２
００２，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１（５７）：８７３２−４０；Ｒｉｍｏｎ，Ｅ．ら，２０
０４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，２４（５）：１３２５−３８）；ＧＡＧＥ（ＧＡＧＥ
−１；ＧＡＧＥ−２；Ａｋｃａｋａｎａｔ，Ａ．ら，２００６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅ
ｒ，１１８（１）：１２３−８）；ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｐ
．Ｏ．ら，２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，５４（
１０）：１０１８−２５）；ｇｐ１００（Ｌｏｔｅｍ，Ｍ．ら，２００６，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｔｈｅｒ．，２９（６）：６１６−２７）；ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（Ｋｕｍａｒ，Ｐａ
ｌ Ｓ．ら，２００６，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，３３（４）：３８６−９１）；ヒト
パピローマウイルス−Ｅ６／ヒトパピローマウイルス−Ｅ７（ＤｉＭａｉｏ，Ｄ．ら，２
００６，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，６６：１２５−５９；ＫＳＡ（１７−１Ａ）（
Ｒａｇｕｐａｔｈｉ，Ｇ．，２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｓ．，１２３：
１５７−８０）；ＭＡＧＥ（ＭＡＧＥ−１；ＭＡＧＥ−３；（Ｂｏｄｅｙ，Ｂ．，２００
２，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２（６）：５７７−８４）；ＭＡ
ＲＴ（Ｋｏｕｎａｌａｋｉｓ，Ｎ．ら，２００５，Ｃｕｒｒ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．，７
（５）：３７７−８２）；ＭＵＣ−１（Ｍａｔｈｅｌｉｎ，Ｃ．，２００６，Ｇｙｎｅｃ
ｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｆｅｒｔｉｌ．，３４（７−８）：６３８−４６）；ＭＵＭ−１（
Ｃａｓｔｅｌｌｉ，Ｃ．ら，２０００，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１８２（３）
：３２３−３１）；Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｄｅｎｎｉｓ，Ｊ
．Ｗ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，６；１４７３（１）
：２１−３４）；ｐｌ５（Ｇｉｌ，Ｊ．ら，２００６，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，７（９）：６６７−７７）；ＰＳＡ（前立腺特異抗原；Ｃｒａｃｃｏ，
Ｃ．Ｍ．ら，２００５，Ｍｉｎｅｒｖａ．Ｕｒｏｌ．Ｎｅｆｒｏｌ．，５７（４）：３０
１−１１）；ＰＳＭＡ（Ｒａｇｕｐａｔｈｉ，Ｇ．，２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａ
ｔ．Ｒｅｓ．，１２３：１５７−８０）；ｓＴｎ（Ｈｏｌｍｂｅｒｇ，Ｌ．Ａ．，２００
１，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１（５）：８８１−９１）；ＴＮ
Ｆ受容体（ＴＮＦ−α受容体，ＴＮＦ−β受容体又はＴＮＦ−γ受容体；ｖａｎ Ｈｏｒ
ｓｓｅｎ，Ｒ．ら，２００６，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．，１１（４）：３９７−４０８；
Ｇａｒｄｎｅｒｏｖａ，Ｍ．ら，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ．１（
４）：３２７−６４）；又はＶＥＧＦ受容体（Ｏ’Ｄｗｙｅｒ Ｐ．Ｊ．，２００６，Ｏ
ｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．，１１（９）：９９２−８）。
そのような使用のためのその他の腫瘍関連抗原（及びそのような抗原に対する特異的反
応性の抗体を開示している刊行物）としては、以下のものが挙げられる。ＡＤＡＭ−９（
米国特許公開第２００６／０１７２３５０号；国際特許ＷＯ０６／０８４０７５）；ＡＬ
ＣＡＭ（国際特許ＷＯ０３／０９３４４３）；カルボキシペプチダーゼＭ（米国特許公開
第２００６／０１６６２９１号）；ＣＤ４６（米国特許第７，１４８，０３８号；国際特
許ＷＯ０３／０３２８１４）；サイトケラチン８（国際特許ＷＯ０３／０２４１９１）；
エフリン受容体（及び、特にＥｐｈＡ２）（米国特許第７，５６９，６７２号；国際特許
ＷＯ０６／０８４２２６）；インテグリンα−Ｖ−β−６（国際特許ＷＯ０３／０８７３
４０）；ＪＡＭ−３（国際特許ＷＯ０６／０８４０７８）；ＫＩＤ３（国際特許ＷＯ０５
／０２８４９８）；ＫＩＤ３１（国際特許ＷＯ０６／０７６５８４）；ＬＵＣＡ−２（米
国特許公開第２００６／０１７２３４９；国際特許ＷＯ０６／０８３８５２）；オンコス
タチンＭ（オンコスタチン受容体β）（米国特許第７，５７２，８９６号；国際特許ＷＯ
０６／０８４０９２）；ＰＩＰＡ（米国特許第７，４０５，０６１号；国際特許ＷＯ０４
／０４３２３９）；ＲＡＡＧ１０（米国特許第７，５２７，９６９号；国際特許ＷＯ０４
／００１３８１）；ＲＯＲ１（米国特許第５，８４３，７４９号）；ＴＥＳ７（国際特許
ＷＯ０８／０６６６９１）；及びトランスフェリン受容体（米国特許第７，５７２，８９
５号；国際特許ＷＯ０５／１２１１７９）。
また、興味深いものは、特定の感染性因子、例えば、ウイルス因子に特異的な抗原であ
る。ウイルス因子としては、それらに限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
、肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）、インフルエンザ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、口
蹄疫（コクサッキーウイルス）、狂犬病ウイルス、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）及び胃腸
炎の原因物質が挙げられる。胃腸炎の原因物質としては、ロタウイルス、アデノウイルス
、カリシウイルス、アストロウイルス及びノーウォークウイルスなどが挙げられる。細菌
性因子としては、それらに限定されないが、大腸菌、サルモネラ・チフィムリウム、緑膿
菌、コレラ菌、淋菌、ヘリコバクターピロリ、インフルエンザ菌、志賀赤痢菌、黄色ブド
ウ球菌、結核菌及び肺炎連鎖球菌、並びに真菌因子や、ジアルジアなどの寄生生物が挙げ
られる。
あるいは、そのようなエピトープは、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩ
Ｉ）に結合して、例えば、急性単球性白血病細胞をＮＫ細胞介在細胞溶解のための基質中
に誘導するようにしてもよい、
５．１．ダイアボディ結合ドメイン
本発明のダイアボディは、一般に免疫グロブリン又は抗体に由来する抗原結合ドメイン
を有する。本発明の方法に使用する結合ドメインが由来する抗体は、鳥及び動物（例えば
、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ
、ウマ、又はニワトリ）を含むいずれの動物起源からのものであってもよい。好ましくは
、抗体は、ヒト又はヒト化モノクローナル抗体である。本明細書で用いる場合、「ヒト」
抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブ
リンライブラリー若しくは合成ヒト免疫グロブリンをコードする配列のライブラリーから
、又はヒト遺伝子由来の抗体を発現するマウスから、単離された抗体を含む。
本発明は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患又は感染症の治療及び／又は予防用に本分野
で公知の任意の抗体を、本発明のダイアボディの結合ドメインの供給源として使用するこ
とを意図している。既知の癌抗体の非限定的な例を、列挙した標的抗原に特異的な他の抗
体、及びセクション５．６．１で列挙した癌抗原に対する抗体と共に、セクション５．７
．１に示す。自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療及び／又は予防用の既知の抗体の非限定
的な例を、列挙した標的抗原に対する抗体及びセクション５．６．２で列挙した抗原に対
する抗体と共に、セクション５．７．２に示す。他の実施形態では、セクション５．６．
３に列挙した感染症に関連するエピトープに対する抗体を使用することができる。ある特
定の実施形態では、前記抗体は１つ以上のアミノ酸改変を有する変異型Ｆｃ領域を有し、
当該抗体は、付与されたエフェクター機能及び／又は野生型Ｆｃ領域を有する対応する分
子と比較してＦｃγＲＩＩＢに対する増強された親和性及びＦｃγＲＩＩＩＡに対する低
減された親和性を有することが、本発明の方法によって同定されている。本発明に従って
操作され得る炎症性疾患の治療又は予防に使用される抗体の非限定的例を表９に示し、自
己免疫疾患の治療又は予防に使用される抗体の非限定的例を表１０に示す。
ヒトにおける抗体のインビボ使用及びインビトロ検出アッセイを含む使用においては、
ヒト、キメラ又はヒト化抗体由来の可変ドメインを有するダイアボディを使用することが
好ましい場合がある。完全なヒト抗体由来の可変ドメインは、ヒト被験者の治療において
特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用い
た上記のファージディスプレイ法を含む、本技術分野で公知の様々な方法によって作成す
ることができる。また、米国特許第４，４４４，８８７号及び第４，７１６，１１１号；
並びに国際公開ＷＯ９８／４６６４５号、ＷＯ９８／５０４３３号、ＷＯ９８／２４８９
３号、ＷＯ９８／１６６５４号、ＷＯ９６／３４０９６号、ＷＯ９６／３３７３５号及び
ＷＯ９１／１０７４１号を参照。これらは、それぞれを参照することによりその全体を本
明細書に組み込む。
ヒト化抗体は、所定の抗原に結合でき、かつヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質
的に有するフレームワーク領域と非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有する
ＣＤＲを含む、抗体、その変異体又はそれらの断片である。ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の
全部又は実質的に全部がヒト以外の免疫グロブリン（即ち、ドナー抗体）のＣＤＲ領域と
一致し、フレームワーク領域の全部若しくは実質的に全部がヒト免疫グロブリン共通配列
のフレームワーク領域である、少なくとも１つの、一般的には２つの可変ドメインの実質
的に全部を有してもよい。
ヒト化抗体のフレームワーク領域及びＣＤＲ領域は、親配列と正確に一致する必要はな
く、例えば、ドナーＣＤＲ又は共通フレームワークに、少なくとも１個の残基の置換、挿
入若しくは欠失により変異を誘発し、その部位のＣＤＲ又はフレームワーク残基が共通又
はドナー抗体のいずれかに一致しないようにしてもよい。しかし、そのような変異を広範
囲に行うことは好ましくない。一般的には、ヒト化抗体残基の少なくとも７５％、大抵は
９０％以上、最も好ましくは９５％を超える残基が、親のフレームワーク領域（ＦＲ）及
びＣＤＲ配列に一致する。ヒト化抗体は本技術分野で公知の様々な技術を用いて作製する
ことができ、それらに限定されないが、以下のような技術を挙げることができる。ＣＤＲ
グラフト法（欧州特許第２３９，４００号；国際公開ＷＯ９１／０９９６７号；米国特許
第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号）、ベニア
リング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）法又はリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）法（
欧州特許第５９２，１０６号、第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ，（１９９１），Ａ
Ｐｏｓｓｉｂｌｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ Ｆｏｒ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｔｈｅ Ｉｍｍｕ
ｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ
Ｗｈｉｌｅ Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ Ｔｈｅｉｒ Ｌｉｇａｎｄ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒ
ｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８
９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら，（１９９４），Ｈｕｍａｎ−Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｒｅｔａｉｎ Ｆｕｌｌ Ｓｐｅｃｉ
ｆｉｃ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｂｙ Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ Ｎｏｎ−Ｃ
ＤＲ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ，Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５−８１４；及びＲｏｇｕｓｋ
ａら，（１９９４），Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｒ
ｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：９６９
−９７３）、チェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）法（米国特許
第５，５６５，３３２号）、及び、例えば、以下に開示されている技術：米国特許第６，
４０７，２１３号、第５，７６６，８８６号、第５，５８５，０８９号；国際公開ＷＯ９
３１７１０５号；Ｔａｎら，（２００２），‘Ｓｕｐｅｒｈｕｍａｎｉｚｅｄ’ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ：Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉ
ａｌ Ｂｙ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ
Ｇｒａｆｔｉｎｇ Ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｔｏ Ａｎ Ａｎｔｉ−ＣＤ２８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１
６９：１１１９−２５、Ｃａｌｄａｓら，（２０００），Ｄｅｓｉｇｎ Ａｎｄ Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ Ｏｆ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ−Ｂａｓｅｄ Ｈｅｍｉ−Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ
Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ Ｆｖ Ａｇａｉｎｓｔ Ｔｈｅ ＣＤ１８ Ｓｕｒｆａｃｅ
Ａｎｔｉｇｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１３：３５３−６０、Ｍｏｒｅａら，（
２０００），Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｆｏｒ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０：２６７−７
９、Ｂａｃａら，（１９９７），Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｕｓｉ
ｎｇ Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
，２７２：１０６７８−８４、Ｒｏｇｕｓｋａら，（１９９６），Ａ Ｃｏｍｐａｒｉｓ
ｏｎ Ｏｆ Ｔｗｏ Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈ
ｕｍａｎｉｚｅｄ Ｂｙ ＣＤＲ−Ｇｒａｆｔｉｎｇ Ａｎｄ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏ
ｍａｉｎ Ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９：８９５−９０４、Ｃ
ｏｕｔｏら，（１９９５），Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｗｉｔｈ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ Ｔｅｍｐｌａ
ｔｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（２３，追補）：５９７３ｓ−５９７７ｓ、Ｃｏｕ
ｔｏら，（１９９５），Ａｎｔｉ−ＢＡ４６ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｍｃ３：Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ
ａｌ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｈ
ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：１７１７−２２、Ｓａｎ
ｄｈｕ，（１９９４），Ａ Ｒａｐｉｄ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｈｕｍ
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１５０：４０９−１０、Ｐｅｄｅｒｓｅｎら，（１９９４），Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｏ
ｆ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ Ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ａ
ｎｄ Ｍｕｒｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｖ Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｍｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎ Ｆｏｒ Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍｕｒｉｎｅ Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３５：９５９−９７３、Ｊｏｎｅｓら，（１９
８６），Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−Ｄｅｔｅｒｍ
ｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ｉｎ Ａ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｗｉｔｈ Ｔ
ｈｏｓｅ Ｆｒｏｍ Ａ Ｍｏｕｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５、Ｒｉｅ
ｃｈｍａｎｎら，（１９８８），Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７、及びＰｒｅｓｔ
ａ，（１９９２），Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉ
ｏｌ．３（４）：３９４−３９８。しばしば、フレームワーク領域中のフレームワーク残
基を、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換して、抗原結合性を変える、好ましく
は改善させる。これらのフレームワーク置換は、本技術分野で周知の方法、例えば、ＣＤ
Ｒとフレームワーク残基の相互作用をモデリングして抗原結合性に重要なフレームワーク
残基を同定し、配列比較により特定の位置の異常なフレームワーク残基を同定することに
より同定される（例えば、Ｑｕｅｅｎら，米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許公
開第２００４／００４９０１４号、第２００３／０２２９２０８号、米国特許第６，３５
０，８６１号、第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第５，６９３，７６
１号、第５，５８５，０８９号、第５，５３０，１０１号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，（１
９８８），Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅｒ
ａｐｙ，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７。これらの全ては、参照することにより
その全体を本明細書に組み入れる）。
最も好ましい実施形態では、ヒト化結合ドメインは、ドナーマウス抗体と同一のエピト
ープに特異的に結合する。当業者には、本発明が一般に、抗体のＣＤＲ移植法を包含する
ことが理解できるであろう。従って、ドナー抗体とアクセプター抗体とは、同一種の動物
及び同一抗体クラス又はサブクラス由来であってもよい。しかし、より一般的には、ドナ
ー抗体とアクセプター抗体とは、異なる種の動物に由来する。典型的には、ドナー抗体は
ゲッ歯類のＭＡｂ等のヒト以外の抗体であり、アクセプター抗体はヒト抗体である。
ある種の実施形態では、ドナー抗体に由来する少なくとも１つのＣＤＲがヒト抗体にグ
ラフト化される。他の実施形態では、重鎖及び／又は軽鎖可変領域のそれぞれの、少なく
とも２つ、好ましくは３つ全てのＣＤＲがヒト抗体にグラフト化される。ＣＤＲは、カバ
ット（Ｋａｂａｔ）ＣＤＲ、構造的ループＣＤＲ、又はそれらの組合せを有していよい。
いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＣＤＲ移植重鎖と少なくとも１つ
のＣＤＲ移植軽鎖とを有するヒト化ＦｃγＲＩＩＢ抗体を包含する。
本発明の方法に使用されるダイアボディは、改変された誘導体、即ち、ダイアボディへ
のいずれかの種類の分子の共有結合により改変された誘導体を有する。前記ダイアボディ
誘導体としては、例えば、これらに限定されないが、グリコシル化、アセチル化、ペグ化
、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断
、細胞性リガンド又は他のタンパク質との結合等によって改変されたダイアボディを挙げ
ることができる。多数の化学改変のいずれをも公知の技術、例えば、これらに限定されな
いが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等によって
行ってもよい。更に、誘導体は１つ以上の非古典的アミノ酸を含んでもよい。
キメラ抗体は、例えば非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域
を有する抗体のように、抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリン分子に由来する分子で
ある。キメラ抗体を作製する方法は、本技術分野では公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓ
ｏｎ，（１９８５），Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａｓ Ｐｒｏｖｉｄｅ Ｎｏｖｅｌ Ｃｈ
ｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１２０２−１２０７；
Ｏｉら，（１９８６），Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ，４：２１４−２２１；Ｇｉｌｌｉｅｓら，（１９８９），Ｈｉｇｈ−Ｌｅｖｅ
ｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｕｓｉｎ
ｇ Ａｄａｐｔｅｄ ｃＤＮＡ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ
，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２５：１９１−２０２；米国特許第６，３１
１，４１５号、第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、第４，８１６，３９
７号を参照。これらは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
しばしば、フレームワーク領域中のフレームワーク残基を、ＣＤＲドナー抗体由来の対
応する残基で置換して、抗原結合性を変える、好ましくは改善させる。これらのフレーム
ワーク置換は、本技術分野で周知の方法、例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基の相互作
用をモデリングして抗原結合性に重要なフレームワーク残基を同定し、配列比較により特
定の位置の異常なフレームワーク残基を同定することにより同定される（例えば、米国特
許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，（１９８８），Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ
Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｎａｔｕｒｅ，３３２
：３２３−３２７参照。これらの全ては、参照することによりその全体を本明細書に組み
入れる）。
本発明のダイアボディの結合ドメインの由来となるモノクローナル抗体は、ハイブリド
ーマ、組換え体及びファージディスプレイ技術の使用、又はそれらの組合せを含む、本技
術分野で公知の様々な技術を用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体
は、ハイブリドーマ技術を用いて作製することができる。前記ハイブリドーマ技術には、
本技術分野で公知の技術の他、例えば、ＨａｒｌｏｗらのＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版、１９８８）；ＨａｍｍｅｒｌｉｎｇらのＭｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，
ｐｐ．５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）（いずれも参照するこ
とにより本明細書にその全部を組み入れる）に教示される技術が含まれる。本明細書で使
用する場合、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術により作製された抗体
に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、あらゆる真核生物クローン、原核生物
クローン又はファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体を意味し、それを生産
する方法を意味するものではない。
ハイブリドーマ技術を用いる、特定の抗体を作製及びスクリーニングするための方法は
通例のものであり、本技術分野において周知である。非限定的な例では、マウスを対象と
なる抗原又はそのような抗原を発現する細胞で免疫化することができる。例えば、前記抗
原に特異的な抗体がマウス血清中に検出されるように、一旦免疫応答が検出されたならば
、マウス脾臓を摘出し、脾細胞を単離する。その後、その脾細胞を周知技術によって任意
の適当なミエローマ細胞と融合させる。ハイブリドーマを限界希釈法により選択し、クロ
ーニングする。そのハイブリドーマクローンを、その後前記抗原に結合できる抗体を分泌
する細胞について、当該分野で既知の方法によりアッセイする。通常、高濃度の抗体を含
有する腹水を、マウスの腹腔内に陽性ハイブリドーマクローンを接種することによって産
生ことができる。対象となる抗原としては、これらに限定されないが、セクション５．８
．１に記載した癌に関連する抗原、セクション５．８．２に記載した自己免疫疾患及び炎
症性疾患に関連する抗原、セクション５．８．３に記載した感染症に関連する抗原、セク
ション５．８．４に記載した毒素を挙げることができる。
抗体はまた、本技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を用いて産生すること
ができる。ファージディスプレイ法では、機能性抗体ドメインが、それをコードするポリ
ヌクレオチド配列を担持するファージ粒子表面上に表示される。特定の実施形態では、そ
のようなファージを利用して、レパートリー若しくはコンビナトリアル抗体ライブラリー
（例えばヒト又はマウス）から発現された、ＦａｂやＦｖ、又はジスルフィド結合安定化
Ｆｖなどの抗原結合ドメインを表示することができる。対象の抗原に結合する抗原結合ド
メインを発現するファージを、抗原、例えば、標識化抗原、又は固体表面若しくはビーズ
に結合又は捕捉させた抗原を用いて、選択又は同定することができる。これらの方法に用
いられるファージは、典型的にはｆｄやＭ１３を含む、繊維状ファージである。抗原結合
ドメインは、ファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のどちらかに組換えに
より融合させたタンパク質として発現される。本発明の免疫グロブリン又はその断片の作
製に用いることのできるファージディスプレイ法の例としては、以下開示されている方法
を挙げることができる。Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら，（１９９５），Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌ
ａｙ Ｏｆ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｆｖ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８２：４１−５０；Ａｍｅｓら，（１９９５）
，Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｏｆ Ｍｕｒｉｎｅ Ｆａｂｓ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｆｒｏｍ
Ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｔ
ｏ Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８４：１７７−１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら，（１９９４
），Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｓｉｎｇｌ
ｅ−Ｃｈａｉｎ Ｆｖ Ｆｒｏｍ Ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ Ｍｉｃｅ Ｕｓｉｎｇ Ｐｈａ
ｇｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ａｎｄ Ｔｈｅ Ｒｅ−Ｃｏｎｓｔｒｕ
ｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｗｈｏｌｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｒｏｍ Ｔｈｅｓｅ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：９５２−９５
８；Ｐｅｒｓｉｃら，（１９９７），Ａｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙ
ｓｔｅｍ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｏｒ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ａｆｔｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ
ｉｏｎ Ｆｒｏｍ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｇｅｎｅ，１８
７：９−１８；Ｂｕｒｔｏｎら，（１９９４），Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆ
ｒｏｍ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５７：１９１−２８０；国際出願ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４
号；国際公開ＷＯ９０／０２８０９号、ＷＯ９１／１０７３７号、ＷＯ９２／０１０４７
号、ＷＯ９２／１８６１９号、ＷＯ９３／１１２３６号、ＷＯ９５／１５９８２号、ＷＯ
９５／２０４０１号；米国特許第５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５
，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０
，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号、第５，４２７，９０８
号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号、第５
，７３３，７４３号、第５，９６９，１０８号。これらのそれぞれを参照することにより
その全体を本明細書中に組み入れる。
ファージディスプレイ技術を使用して、抗原に対する抗体の親和性を増大させることが
できる。この技術は、高親和性抗体を得るのに有用である。親和性成熟と呼ばれるこの技
術は、突然変異誘発、又は同種抗原を用いたＣＤＲウォーキング及び再選択を使用して、
初期抗体若しくは親抗体と比較した場合に、抗原に対してより高い親和力で結合する抗体
を同定する（例えば、Ｇｌａｓｅｒら，（１９９２），Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔ
ｈｅ Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｉｎ Ａ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉ−Ｔａ
ｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４９：２６０７−２６１４を参照
）。単一ヌクレオチドに対してというよりもコドン全体に対しての突然変異誘発は、結果
的にアミノ酸変異の半ランダム化レパートリーをもたらす。それぞれが１つのＣＤＲ中の
単一アミノ酸の改変によって異なっている変異型クローンのプールであって、かつ各ＣＤ
Ｒ残基に対して可能なそれぞれのアミノ酸置換を提示する変異体を含んでいプールからな
るライブラリーを構築することができる。抗原に対する結合親和性を増加させた変異体は
、固定した変異体を標識抗原に接触させることによってスクリーニングすることができる
。本技術分野で公知のいずれかのスクリーニング方法を使用して、抗原に対する結合活性
が増加した変異型抗体を同定することができる（例えば、ＥＬＩＳＡ法）（Ｗｕら，（１
９９８），Ｓｔｅｐｗｉｓｅ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｕｒａｔｉ
ｏｎ Ｏｆ Ｖｉｔａｘｉｎ，Ａｎ Ａｌｐｈａｖ Ｂｅｔａ３−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｈ
ｕｍａｎｉｚｅｄ ｍＡｂ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：６
０３７−６０４２；Ｙｅｌｔｏｎら，（１９９５），Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｕｒａｔ
ｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｂｒ９６ Ａｎｔｉ−Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｂｙ Ｃｏｄｏｎ−Ｂａｓｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，
１５５：１９９４−２００４を参照）。軽鎖をランダム変異させるＣＤＲウォーキングも
使用できる（Ｓｃｈｉｅｒら，（１９９６），Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｐｉｃｏｍｏ
ｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ａｎｔｉ−Ｃ−ＥｒｂＢ−２ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ
Ｆｖ Ｂｙ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｍ
ｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｃｅｎｔ
ｅｒ Ｏｆ Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏ．，２６３：５５１−５６７を参照）。
本発明はまた、フレームワーク又はＣＤＲ領域に変異（例えば、１つ以上のアミノ酸置
換）を有する、本明細書に記載した又は本技術分野で公知のいずれかの結合ドメインのア
ミノ酸配列を有する結合ドメインの使用を包含する。好ましくは、これらの結合ドメイン
における変異は、結合ドメインが免疫特異的に結合するＦｃγＲＩＩＢに対する結合ドメ
インの結合力及び／又は親和力を維持又は増強する。当業者に公知の標準的な技術（例え
ば、イムノアッセイ）を使用して、特定の抗原に対する抗体の親和性をアッセイすること
ができる。
当業者に公知の、例えば、結果的にアミノ酸置換をもたらす部位特異的突然変異誘発及
びＰＣＲを介した突然変異誘発等を含む、標準的な技術を使用して、抗体若しくはその断
片をコードするヌクレオチド配列中に変異を導入することができる。好ましくは、誘導体
は、元の抗体又はその断片と比較して、１５個未満のアミノ酸の置換、１０個未満のアミ
ノ酸の置換、５個未満のアミノ酸の置換、４個未満のアミノ酸の置換、３個未満のアミノ
酸の置換、又は２個未満のアミノ酸の置換を含む。好ましい実施形態において、誘導体は
、１個以上の予測される非必須アミノ酸残基での保存的アミノ酸置換を有する。
５．１．１．ＦｃγＲＩＩＢと免疫特異的に結合するエピトープ結合部位を含むダイアボ
ディ
特定の実施形態において、本発明のダイアボディの少なくとも１つの結合ドメインは、
ＦｃγＲＩＩＢの少なくとも１つの活性を刺激する。本発明の一つの実施形態では、前記
活性は、Ｂ細胞受容体を介したシグナル伝達の阻害である。他の実施形態では、結合ドメ
インはＢ細胞の活性化、Ｂ細胞の増殖、抗体産生、Ｂ細胞の細胞内カルシウム流入、細胞
周期の進行、又はＦｃγＲＩＩＢシグナル伝達経路における１つ以上の下流のシグナル伝
達分子の活性を阻害する。更に他の実施形態では、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢのリ
ン酸化又はＳＨＩＰの動員を増強する。本発明のさらなる実施形態では、結合ドメインは
Ｂ細胞受容体を介したシグナル伝達経路におけるＭＡＰキナーゼ活性又はＡｋｔ動員を阻
害する。他の実施形態では、結合ドメインは、ＦｃεＲＩシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ
を介した阻害を刺激する。特定の実施形態では、前記結合ドメインは、ＦｃεＲＩ誘導肥
満細胞活性化、カルシウム動員、脱顆粒化、サイトカイン産生、又はセロトニン放出を阻
害する。他の実施形態では、本発明の結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化を刺激
し、ＳＨＩＰの動員を刺激し、ＳＨＩＰリン酸化及びそのＳｈｃとの会合を刺激し、又は
ＭＡＰキナーゼファミリーメンバー（例えば、Ｅｒｋ１、Ｅｒｋ２、ＪＮＫ、ｐ３８等）
の活性化を阻害する。さらなる他の実施形態では、本発明の結合ドメインは、ｐ６２ｄｏ
ｋのチロシンリン酸化及びそのＳＨＩＰ及びｒａｓＧＡＰとの会合を増強する。他の実施
形態では、本発明の結合ドメインは、単球又はマクロファージでのＦｃγＲを介する食作
用を阻害する。
他の実施形態では、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢの少なくとも１つの活性に拮抗す
る。一つの実施形態では、前記活性とは、Ｂ細胞受容体を介するシグナル伝達の活性化で
ある。特定の実施形態では、結合ドメインは、Ｂ細胞活性、Ｂ細胞の増殖、抗体産生、細
胞内カルシウム流入、又はＦｃγＲＩＩＢシグナル伝達経路における１つ以上の下流のシ
グナル伝達分子の活性を増強する。更に他の実施形態では、結合ドメインは、ＦｃγＲＩ
ＩＢのリン酸化又はＳＨＩＰ動員を低下させる。本発明のさらなる実施形態では、結合ド
メインは、Ｂ細胞受容体を介したシグナル伝達経路でのＭＡＰキナーゼ活性又はＡｋｔ動
員を増強する。他の実施形態においては、結合ドメインは、ＦｃεＲＩシグナル伝達のＦ
ｃγＲＩＩＢを介する阻害に拮抗する。特定の実施形態では、前記結合ドメインは、Ｆｃ
εＲＩ誘導肥満細胞活性化、カルシウム動員、脱顆粒化、サイトカイン産生、又はセロト
ニン放出を増強する。他の実施形態では、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化を
阻害し、ＳＨＩＰの動員を阻害し、ＳＨＩＰリン酸化及びそのＳｈｃとの会合を阻害し、
ＭＡＰキナーゼファミリーメンバー（例えばＥｒｋ１、Ｅｒｋ２、ＪＮＫ、ｐ３８等）の
活性化を増強する。さらなる他の実施形態では、結合ドメインは、ｐ６２ｄｏｋのチロシ
ンリン酸化、そのＳＨＩＰ及びｒａｓＧＡＰとの結合を阻害する。他の実施形態では、結
合ドメインは、単球又はマクロファージでのＦｃγＲを介する食作用を増強する。他の実
施形態においては、結合ドメインは、食作用、脾臓マクロファージによるオプソニン化粒
子のクリアランスを妨げる。
他の実施形態では、少なくとも１つの結合ドメインを使用して、ＦｃγＲＩＩＢを発現
する細胞を本発明のダイアボディの標的とすることができる。
一つの特定の実施形態では、結合ドメインの１つは、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ
−４５９１及びＰＴＡ−４５９２を有する、クローン２Ｂ６又は３Ｈ７より産生されたマ
ウスモノクローナル抗体に由来する。２Ｂ６及び３Ｈ７抗体を産生するハイブリドーマは
、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓ
ｓａｓ，ＶＡ．２０１１０−２２０９））に２００２年８月１３日に、特許手続上の微生
物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づいて寄託され、それぞれ受託
番号ＰＴＡ−４５９１（２Ｂ６を産生するハイブリドーマ）及びＰＴＡ−４５９２（３Ｈ
７を産生するハイブリドーマ）が付与された。これらは、参照することにより本明細書中
に組み込まれる。好ましい実施形態において、結合ドメインは、ヒト由来であるか、又は
ヒト化されたものであり、好ましくは、３Ｈ７又は２Ｂ６クローンにより産生された抗体
のヒト化バージョンに由来する。
本発明はまた、ＦｃγＲＩＩＢ、好ましくはヒトＦｃγＲＩＩＢ、より好ましくは天然
のヒトＦｃγＲＩＩＢに特異的に結合する、他の抗体由来の結合ドメインを有するダイア
ボディを包含する。該抗体は、これらに限定されないが、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴ
Ａ−５９５８、ＰＴＡ−５９６１、ＰＴＡ−５９６２、ＰＴＡ−５９６０及びＰＴＡ−５
９５９を有する、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１及び１Ｆ２を有するクローンに由来
する。上記同定されたクローンを産生するハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定の下
に、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖ
ｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ．２０１１０−２２０９）に２００４年５月７日に寄託さ
れ、それらは、参照することによって本明細書中に組み込まれる。好ましい実施形態では
、上述の抗体由来の結合ドメインは、ヒト化されている。
具体的な実施形態において、本発明のダイアボディに使用される結合ドメインは、２Ｂ
６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１又は１Ｆ２クローンにより産生される抗
体又はその抗原結合断片（例えば、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）、好ましくは６
つのＣＤＲ全てを含む）由来である。他の実施形態では、結合ドメインは、２Ｂ６、３Ｈ
７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１又は１Ｆ２クローンのそれぞれで産生されるマウ
スモノクローナル抗体と同一のエピトープに結合し、及び／又は、例えばＥＬＩＳＡアッ
セイ若しくは他の適当な競合イムノアッセイにおいて、２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１
、２Ｈ９、２Ｄ１１又は１Ｆ２クローンにより産生されたマウスモノクローナル抗体と競
合し、かつその結合ドメインがＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも強い親和性でＦｃγＲＩ
ＩＢと結合する。
本発明はまた、２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１又は１Ｆ２クロー
ンにより産生されるマウスモノクローナル抗体の可変重鎖及び／又は可変軽鎖のアミノ酸
配列と少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少
なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも
８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一である可変重
鎖及び／又は可変軽鎖のアミノ酸配列を有する結合ドメインを持ったダイアボディを包含
する。本発明は更に、ＦｃγＲＩＩＡに結合するよりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＢに特
異的に結合し、２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１又は１Ｆ２クローン
により産生されるマウスモノクローナル抗体の１つ以上のＣＤＲのアミノ酸配列と少なく
とも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５
％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少な
くとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一である１つ以上のＣＤＲの
アミノ酸配列を有する、結合ドメインを持ったダイアボディを包含する。２つのアミノ酸
配列の同一性パーセントは、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を含む、当業者に公知方法のいず
れによっても決定することができる。
本発明はまた、結合ドメインがＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも強い親和性でＦｃγＲ
ＩＩＢと特異的に結合する、２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１又は１
Ｆ２クローンにより産生されるマウスモノクローナル抗体のヌクレオチド配列にストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、結合ド
メインを含むダイアボディの使用を包含する。好ましい実施形態では、結合ドメインは、
ＦｃγＲＩＩＡよりも強い親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合し、かつ２Ｂ６、３Ｈ
７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１又は１Ｆ２クローンにより産生されるマウスモノ
クローナル抗体の可変軽鎖及び／又は可変重鎖のヌクレオチド配列にストリンジェントな
条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる可変軽鎖及び／又は
可変重鎖を有する。他の好ましい実施形態では、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＡよりも
強い親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合し、かつ２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、
２Ｈ９、２Ｄ１１又は１Ｆ２クローンにより産生されるマウスモノクローナル抗体の１つ
以上のＣＤＲのヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌク
レオチド配列によってコードされる１つ以上のＣＤＲを有する。ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件は、それらに限定されないが、約４５℃で６×塩化ナトリウム／
クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）溶液中でのフィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイ
ゼーション後、約５０〜６５℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液での１回以上の洗
浄であり、より高度のストリンジェントな条件は、例えば、約４５℃で６×ＳＳＣ溶液中
でのフィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーション後、約６０℃で０．１×Ｓ
ＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液にて１回以上洗浄するハイブリダイゼーション、あるいは、当
業者に公知の他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えば、Ａｕｓｕｂ
ｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓ
ｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．
，ＮＹ、ページ６．３．１〜６．３．６及び２．１０．３参照。参照することにより本明
細書に組み入れる）を含む。
本発明はまた、フレームワーク又はＣＤＲ領域に変異（例えば、１つ以上のアミノ酸置
換）を有する上記いずれかの結合ドメインのアミノ酸配列を有する結合ドメインの使用を
包含する。好ましくは、これらの結合ドメインにおける変異は、結合ドメインが免疫特異
的に結合するＦｃγＲＩＩＢに対する結合ドメインの結合力及び／又は親和性を維持又は
増強する。当業者に公知の標準的な技術（例えば、イムノアッセイ）を用いて、特定の抗
原に対する抗体の親和性をアッセイすることができる。
当業者に公知の標準的な技術を用いて、抗体又はその断片をコードするヌクレオチド配
列中に変異を導入することができる。そのような技術には、例えば、アミノ酸置換をもた
らす部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲを介する突然変異誘発が含まれる。好ましくは、
誘導体は、最初の抗体又はその断片に対して１５個未満のアミノ酸の置換、１０個未満の
アミノ酸の置換、５個未満のアミノ酸の置換、４個未満のアミノ酸の置換、３個未満のア
ミノ酸の置換、又は２個未満のアミノ酸の置換を有する。好ましい実施形態では、誘導体
は１つ以上の予測される非必須アミノ酸残基に保存的アミノ酸置換を有する。
好ましい実施形態では、結合ドメインはヒト化抗体に由来する。ヒト化ＦｃγＲＩＩＢ
特異的抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリン（即ち、ドナ
ー抗体）のＣＤＲ領域と一致し、フレームワーク領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫
グロブリン共通配列のフレームワーク領域である、少なくとも１つ、通常は２つの可変ド
メインの実質的に全てを有していてもよい。
本発明のダイアボディは、ヒト抗体（レシピエント抗体）の重鎖及び／又は軽鎖可変領
域の１つ以上のＣＤＲの１つ以上の領域が、ＦｃγＲＩＩＡに対するよりも強い親和性で
ＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合するドナーのモノクローナル抗体の１つ以上のＣＤＲの相
似部分で置換されている、ＦｃγＲＩＩＢに特異的なヒト化可変ドメインを有する。その
ようなモノクローナル抗体として、例えば、２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、
２Ｄ１１又は１Ｆ２クローンで産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。他の実施形
態では、ヒト化抗体は、それぞれ２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１又
は１Ｆ２と同一のエピトープに結合する。
好ましい実施形態では、ヒト化ＦｃγＲＩＩＢ結合ドメインのＣＤＲ領域は、ＦｃγＲ
ＩＩＢに特異的なマウス抗体に由来する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載した
ヒト化抗体は、それらに限定されないが、アクセプター抗体、即ち、ヒト抗体であり、ド
ナーモノクローナル抗体の結合特異性を保持する上で必要な重鎖及び／又は軽鎖可変ドメ
インのフレームワーク領域、のアミノ酸欠失、挿入、改変を含む改変を有する。いくつか
の実施形態では、本明細書に記載したヒト化抗体のフレームワーク領域は、必ずしも天然
のヒト抗体可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列と正確に同じである必要はなく
、例えば、マウスのＦｃγＲＩＩＢ特異的抗体と同一の標的に対して特異的であるヒト化
抗体領域の結合特性を改善するなど、ヒト化抗体の性質を変える、これらに限定されない
が、アミノ酸欠失、挿入、改変を含む様々な改変を有する。最も好ましい実施形態では、
非ヒトフレームワーク残基を広範に導入することを避け、かつヒトにおいてヒト化抗体の
最小限の免疫原性を確保するために、フレームワーク領域に対して最小数の改変を行う。
ドナーのモノクローナル抗体は、好ましくは、２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９
、２Ｄ１１又は１Ｆ２クローンにより産生されるモノクローナル抗体である。
具体的な実施形態では、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも強い親和力
でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合するＣＤＲグラフト化抗体の可変ドメインを包含する。
ここで、ＣＤＲ移植抗体は、レシピエント抗体のフレームワーク残基と、ＦｃγＲＩＩＡ
との結合よりも強い親和力でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合する、例えば、２Ｂ６、３Ｈ
７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１又は１Ｆ２クローンにより産生される、ドナーモ
ノクローナル抗体由来の残基からなる重鎖可変領域ドメインとを有する。他の具体的な実
施形態では、本発明のダイアボディは、ＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも強い親和力でＦ
ｃγＲＩＩＢと特異的に結合するＣＤＲグラフト化抗体由来の可変ドメインを有し、該Ｃ
ＤＲグラフト化抗体は、レシピエント抗体のフレームワーク残基と、ＦｃγＲＩＩＡとの
結合よりも強い親和力でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合する、例えば、２Ｂ６、３Ｈ７、
１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１又は１Ｆ２クローンにより産生される、ドナーモノク
ローナル抗体由来の残基からなる軽鎖可変領域ドメインとを有する。
本発明で用いられるヒト化抗ＦｃγＲＩＩＢ可変ドメインは、ＣＤＲ１（配列番号２４
若しくは配列番号２５）及び／又はＣＤＲ２（配列番号２６若しくは配列番号２７）及び
／又はＣＤＲ３（配列番号２８若しくは配列番号２９）のアミノ酸配列を有する重鎖可変
領域、並びに／或いはＣＤＲ１（配列番号３０若しくは配列番号３１）及び／又はＣＤＲ
２（配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４若しくは配列番号３５）及び／又はＣＤ
Ｒ３（配列番号３６若しくは配列番号３７）のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し
ていてもよい。
一つの具体的な実施形態では、ダイアボディはヒト化２Ｂ６抗体に由来する可変ドメイ
ンを有し、このダイアボディでは、ＶＨ領域がヒト生殖細胞系のＶＨセグメントであるＶ
Ｈ１−１８（Ｍａｔｓｕｄａら，（１９９８），Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌ
ｉｎ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎ Ｌｏｃｕｓ，Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８：２１５１−２１６２）及びＪＨ６（Ｒａｖｅｔｃｈら．（１９
８１），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉ
ｎ Ｍｕ Ｌｏｃｕｓ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
Ａｎｄ Ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ Ｊ Ａｎｄ Ｄ Ｇｅｎｅｓ，Ｃｅｌｌ，２７（３，
Ｐｔ．２）：５８３−９１）に由来するＦＲセグメントと、配列番号２４、配列番号２６
又は配列番号２８のアミノ酸配列を有する２Ｂ６ＶＨの１つ以上のＣＤＲ領域とから成る
。一つの実施形態では、２Ｂ６ＶＨは配列番号３８のアミノ酸配列を有する。他の実施形
態では、２Ｂ６ＶＨドメインは、配列番号８５のＨｕ２Ｂ６ＶＨのアミノ酸配列を有し、
配列番号８６のヌクレオチド配列によりコードされ得る。他の具体的な実施形態では、ダ
イアボディはＶＬ領域を更に有し、このＶＬ領域はヒト生殖細胞系ＶＬセグメントである
ＶＫ−Ａ２６（Ｌａｕｔｎｅｒ−Ｒｉｅｓｋｅら，（１９９２），Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ
Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｋａｐｐａ Ｌｏｃｕｓ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔ
ｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｄｕｐｌｉｃａｔｅｄ Ａ Ｒｅｇｉｏｎｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．，２２：１０２３−１０２９）及びＪＫ４（Ｈｉｅｔｅｒら，（１９８２）
，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｋａｐｐａ
Ｊ Ｒｅｇｉｏｎ Ｇｅｎｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：１５１６−２２
）のＦＲセグメントと、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４及び
配列番号３６のアミノ酸配列を有する、２Ｂ６ＶＬの１つ以上のＣＤＲ領域とから成る。
一つの実施形態では、２Ｂ６ＶＬは、配列番号３９、配列番号４０、又は配列番号４１の
アミノ酸配列を有する。具体的な実施形態において、２Ｂ６ＶＬは、配列番号８７のＨｕ
２Ｂ６ＶＬのアミノ酸配列を有し、配列番号８８に示されるヌクレオチド配列によりコー
ドされ得る。
他の具体的な実施形態では、ダイアボディは、ヒト化３Ｈ７抗体に由来する可変ドメイ
ンを有し、そのＶＨ領域は、ヒト生殖細胞系ＶＨセグメントに由来するＦＲセグメントと
、配列番号３５のアミノ酸配列を有する３Ｈ７ＶＨのＣＤＲ領域とから成る。他の具体的
な実施形態では、ヒト化３Ｈ７抗体は更に、ヒト生殖細胞系ＶＬセグメントのＦＲセグメ
ントと、配列番号４２のアミノ酸配列を有する３Ｈ７ＶＬのＣＤＲ領域とから成る、ＶＬ
領域を有する。
特に、結合ドメインは、天然のヒトＦｃγＲＩＩＢの細胞外ドメインと免疫特異的に結
合し、以下の組合せのいずれかにおいて２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ
１１又は１Ｆ２のＣＤＲ配列を含む（あるいは、から成る）。前記組合せは以下の通りで
ある。ＶＨＣＤＲ１とＶＬＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ１とＶＬＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ１とＶＬ
ＣＤＲ３、ＶＨＣＤＲ２とＶＬＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２とＶＬＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ２と
ＶＬＣＤＲ３、ＶＨＣＤＲ３とＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ３とＶＬＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ
３とＶＬＣＤＲ３、ＶＨ１ＣＤＲ１とＶＨＣＤＲ２とＶＬＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ１とＶＨ
ＣＤＲ２とＶＬＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ１とＶＨＣＤＲ２とＶＬＣＤＲ３、ＶＨＣＤＲ２と
ＶＨＣＤＲ３とＶＬＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２とＶＨＣＤＲ３とＶＬＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ
２とＶＨＣＤＲ２とＶＬＣＤＲ３、ＶＨＣＤＲ１とＶＬＣＤＲ１とＶＬＣＤＲ２、ＶＨＣ
ＤＲ１とＶＬＣＤＲ１とＶＬＣＤＲ３、ＶＨＣＤＲ２とＶＬＣＤＲ１とＶＬＣＤＲ２、Ｖ
ＨＣＤＲ２とＶＬＣＤＲ１とＶＬＣＤＲ３、ＶＨＣＤＲ３とＶＬＣＤＲ１とＶＬＣＤＲ２
、ＶＨＣＤＲ３とＶＬＣＤＲ１とＶＬＣＤＲ３、ＶＨＣＤＲ１とＶＨＣＤＲ２とＶＨＣＤ
Ｒ３とＶＬＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ１とＶＨＣＤＲ２とＶＨＣＤＲ３とＶＬＣＤＲ２、ＶＨ
ＣＤＲ１とＶＨＣＤＲ２とＶＨＣＤＲ３とＶＬＣＤＲ３、ＶＨＣＤＲ１とＶＨＣＤＲ２と
ＶＬＣＤＲ１とＶＬＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ１とＶＨＣＤＲ２とＶＬＣＤＲ１とＶＬＣＤＲ
３、ＶＨＣＤＲ１とＶＨＣＤＲ３とＶＬＣＤＲ１とＶＬＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ１とＶＨＣ
ＤＲ３とＶＬＣＤＲ１とＶＬＣＤＲ３、ＶＨＣＤＲ２とＶＨＣＤＲ３とＶＬＣＤＲ１とＶ
ＬＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ２とＶＨＣＤＲ３とＶＬＣＤＲ１とＶＬＣＤＲ３、ＶＨＣＤＲ２
とＶＨＣＤＲ３とＶＬＣＤＲ２とＶＬＣＤＲ３、ＶＨＣＤＲ１とＶＨＣＤＲ２とＶＨＣＤ
Ｒ３とＶＬＣＤＲ１とＶＬＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ１とＶＨＣＤＲ２とＶＨＣＤＲ３とＶＬ
ＣＤＲ１とＶＬＣＤＲ３、ＶＨＣＤＲ１とＶＨＣＤＲ２とＶＬＣＤＲ１とＶＬＣＤＲ２と
ＶＬＣＤＲ３、ＶＨＣＤＲ１とＶＨＣＤＲ３とＶＬＣＤＲ１とＶＬＣＤＲ２とＶＬＣＤＲ
３、ＶＨＣＤＲ２とＶＨＣＤＲ３とＶＬＣＤＲ１とＶＬＣＤＲ２とＶＬＣＤＲ３、又は本
明細書で開示したＶＨＣＤＲ及びＶＬＣＤＲのいずれかの組合せ。
本発明のダイアボディに含まれる結合ドメインの由来となる抗体は、ＦｃγＲＩＩＡと
比べてＦｃγＲＩＩＢに最も強い特異性をもった抗体を選択できるように、エピトープマ
ッピングによって更に特徴付けられてもよい。抗体のエピトープマッピング法は本技術分
野で周知であり、本発明の方法に包含される。ある実施形態では、ＦｃγＲＩＩＢの１つ
以上の領域を有する融合タンパク質を、本発明の抗体のエピトープをマッピングするのに
使用してもよい。具体的な実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ２のＦｃ部分と
融合しているＦｃγＲＩＩＢの領域のアミノ酸配列を含有する。各融合タンパク質は、下
記の表２に示すようなアミノ酸置換及び／又は受容体の特定領域の相同受容体、例えば、
ＦｃγＲＩＩＡの対応領域による置換を更に有することができる。ｐＭＧＸ１２５及びｐ
ＭＧＸ１３２は、ＦｃγＲＩＩＢ受容体のＩｇＧ結合部位を含み、前者はＦｃγＲＩＩＢ
のＣ末端を有し、そして後者はＦｃγＲＩＩＡのＣ末端を有し、Ｃ末端結合性を区別する
ために使用することができる。その他は、ＩｇＧ結合部位におけるＦｃγＲＩＩＡ置換、
及びＦｃγＲＩＩＡ又はＦｃγＲＩＩＢのいずれかのＮ末端を有する。これらの分子は、
抗体が結合する受容体分子の部分を決定するのに役に立つ。
Figure 2015157833
融合タンパク質は、本発明の抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体への結合を測定するための任意の生
化学的アッセイ法、例えばＥＬＩＳＡ法に使用することができる。他の実施形態において
は、特定の残基をＦｃγＲＩＩＡ配列由来の残基と置き換えたペプチドを用いて、エピト
ープ特異性のさらなる確認を行ってもよい。
抗体は、本発明の抗体の機能、特にＦｃγＲＩＩＢシグナル伝達を調節する活性、を同
定するためのアッセイ法を用いて特徴付けすることができる。例えば、本発明の特徴付け
は、ＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭモチーフ中のチロシン残基のリン酸化の測定、又はＢ細胞
受容体によって生じるカルシウム動員の阻害の測定が可能である。本発明の特徴付けは、
細胞系又は無細胞系分析法とすることができる。
肥満細胞においては、ＦｃγＲＩＩＢと高親和性ＩｇＥ受容体であるＦｃεＲＩとの共
凝集が、抗原誘導性脱顆粒化、カルシウム動員及びサイトカイン産生の阻害をもたらすこ
とは本技術分野では十分に立証されている（Ｍｅｔｃａｌｆｅ Ｄ．Ｄ．ら，（１９９７
），Ｍａｓｔ Ｃｅｌｌｓ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，７７：１０３３−１０７９；Ｌ
ｏｎｇ Ｅ．Ｏ．，（１９９９），Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓ
ｐｏｎｓｅｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ａｎｎｕ
．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７：８７５−９０４）。このシグナル伝達経路の分子的
詳細については、最近明らかとなった（Ｏｔｔ Ｖ．Ｌ．，（２００２），Ｄｏｗｎｓｔ
ｒｅａｍ Ｏｆ Ｋｉｎａｓｅ，ｐ６２（ｄｏｋ），Ｉｓ Ａ Ｍｅｄｉａｔｏｒ Ｏｆ
ＦｃｇａｍｍａＩＩＢ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｏｆ Ｆｃ Ｅｐｓｉｌｏｎ ＲＩ
Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２（９）：４４３０−４４３９）。Ｆ
ｃγＲＩＩＢは、一旦ＦｃεＲＩと共凝集すると、そのＩＴＩＭモチーフ中のチロシン上
で直ちにリン酸化され、その後Ｓｒｃホモロジー２含有イノシトール−５−ホスファター
ゼ（ＳＨＩＰ）を動員する。この酵素は、ＳＨ２ドメイン含有イノシトールポリホスフェ
ート５−ホスファターゼであって、順次リン酸化されて、Ｓｈｃ及びｐ６２ｄｏｋと会合
する。（ｐ６２ｄｏｋは、アミノ末端のプレクストリン相同ドメイン（ＰＨドメイン）の
ようなシグナル伝達ドメイン、ＰＴＢドメイン、及びＰＸＸＰモチーフと多数のリン酸化
部位を含むカルボキシ末端領域を有する、アダプター分子ファミリーのプロトタイプであ
る（Ｃａｒｐｉｎｏら，（１９９７），ｐ６２（ｄｏｋ）：Ａ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖ
ｅｌｙ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ，ＧＡＰ−Ａｓｓｏｃｉａｔ
ｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ Ｌｅｕｋｅｍ
ｉａ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ，Ｃｅｌｌ，８８：１９７−２０４；Ｙａｍａ
ｎｓｈｉら，（１９９７），Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ａｂｌ−
Ａｎｄ ｒａｓＧＡＰ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ６２ ｋＤａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓ
Ａ Ｄｏｃｋｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｄｏｋ，Ｃｅｌｌ，８８：２０５−２１１））。
本発明で使用する抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体も同様に、１つ以上のＩｇＥ介在応答を調節す
る能力について特徴付けすることができる。好ましくは、ＩｇＥに対して高親和性の受容
体及びＦｃγＲＩＩＢに対して低親和性の受容体を共発現する細胞株を、ＩｇＥ介在応答
の調節における抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体の特徴付けに用いる。具体的な実施形態においては
、全長のヒトＦｃγＲＩＩＢでトランスフェクトしたラット好塩基球性白血病細胞株（Ｒ
ＢＬ−Ｈ２３；Ｂａｒｓｕｍｉａｎ Ｅ．Ｌ．ら，（１９８１），ＩｇＥ−Ｉｎｄｕｃｅ
ｄ Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｆｒｏｍ Ｒａｔ Ｂａｓｏｐｈｉｌｉｃ
Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｒｅｌｅａｓｉ
ｎｇ Ａｎｄ Ｎｏｎｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｃｌｏｎｅｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．，１１：３１７−３２３，参照することにより、本明細書にその全体を組み入れる）由
来の細胞を用いることができる。ＲＢＬ−２Ｈ３は、十分に特徴付けられたラット細胞株
であり、ＩｇＥを介した細胞活性化後のシグナル伝達機構を研究するのに広く使用されて
いる。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞で発現され、そしてＦｃεＲＩと共凝集すると、ＦｃγＲＩＩ
Ｂは、ＦｃεＲＩ誘導カルシウム動員、脱顆粒化及びサイトカイン産生を阻害する（Ｍａ
ｌｂｅｃら，（１９９８），Ｆｃ Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉ−Ａｓｓｏｃ
ｉａｔｅｄ Ｌｙｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｆ
ｃ Ｇａｍｍａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＩＩＢ Ｄｕｒｉｎｇ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｒｅｇ
ｕｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍａｓｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，１６０：１６４７−１６５８；Ｄａｅｒｏｎら，（１９９５），Ｒｅｇｕｌａｔｉ
ｏｎ Ｏｆ Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＩｇＥ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅ
ｄ Ｍａｓｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｂｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｏｗ−Ａｆｆ
ｉｎｉｔｙ ＩｇＧ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９５：５７
７；Ｏｔｔ Ｖ．Ｌ．，（２００２），Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ Ｏｆ Ｋｉｎａｓｅ，ｐ
６２（ｄｏｋ），Ｉｓ Ａ Ｍｅｄｉａｔｏｒ Ｏｆ ＦｃｇａｍｍａＩＩＢ Ｉｎｈｉ
ｂｉｔｉｏｎ Ｏｆ Ｆｃ Ｅｐｓｉｌｏｎ ＲＩ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．，１６２（９）：４４３０−４４３９）。
本発明で使用する抗体は、ＦｃεＲＩ誘導型肥満細胞活性化の阻害について特徴付けす
ることもできる。例えば、ＦｃγＲＩＩＢでトランスフェクトされたラット好塩基球性白
血病細胞株（ＲＢＬ−Ｈ２３；Ｂａｒｓｕｍｉａｎ Ｅ．Ｌ．ら，（１９８１），ＩｇＥ
−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｆｒｏｍ Ｒａｔ Ｂａｓｏ
ｐｈｉｌｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｏｆ
Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ａｎｄ Ｎｏｎｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｃｌｏｎｅｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１：３１７−３２３）由来の細胞を、ＩｇＥで感作し、そしてＦｃ
εＲＩだけを凝集するウサギ抗マウスＩｇＧのＦ（ａｂ’）２断片で刺激するか、又はＦ
ｃγＲＩＩＢとＦｃεＲＩを共凝集する完全なウサギ抗マウスＩｇＧで刺激する。この系
では、下流シグナル伝達分子の間接的な調節を、感作及び刺激した細胞に本発明の抗体を
添加し、アッセイすることができる。例えば、ＦｃγＲＩＩＢのチロシンリン酸化及びＳ
ＨＩＰの動員とリン酸化、非限定的な例としてのＥｒｋ１、Ｅｒｋ２、ＪＮＫ又はｐ３８
を含む、ＭＡＰキナーゼファミリーメンバーの活性化、並びにｐ６２ｄｏｋのチロシンリ
ン酸化及びそのＳＨＩＰ及びＲａｓＧＡＰとの会合をアッセイすることができる。
本発明の抗体によるＦｃεＲＩ誘導型肥満細胞活性化の阻害を測定する１つの代表的な
アッセイ法は、以下を有し得る。即ち、ＲＢＬ−Ｈ２３細胞をヒトＦｃγＲＩＩＢでトラ
ンスフェクトし、ＲＢＬ−Ｈ２３細胞をＩｇＥで感作し、そしてＲＢＬ−Ｈ２３細胞をウ
サギ抗マウスＩｇＧのＦ（ａｂ’）２（ＦｃεＲＩのみを凝集し、ＦｃεＲＩ介在シグナ
ル伝達を引き起こす、対照として用いる）で刺激するか、又はＲＢＬ−Ｈ２３細胞を完全
なウサギ抗マウスＩｇＧ（ＦｃγＲＩＩＢとＦｃεＲＩを共凝集し、結果的にＦｃεＲＩ
介在シグナル伝達を阻害する）で刺激する。完全なウサギ抗マウスＩｇＧ抗体で刺激した
細胞を、更に、本発明の抗体とプレインキュベートすることができる。本発明の抗体とプ
レインキュベートした細胞、及び本発明の抗体とプレインキュベートしていない細胞のＦ
ｃεＲＩ依存性活性を測定し、これらの細胞におけるＦｃεＲＩ依存性活性のレベルを比
較することで、本発明の抗体によるＦｃεＲＩ依存性活性の調節が示される。
上記の代表的なアッセイ法を使用して、例えば、ＦｃγＲＩＩＢ受容体へのリガンド（
ＩｇＧ）結合を阻害し、かつＦｃγＲＩＩＢとＦｃεＲＩとの共凝集を妨げることによっ
てＦｃεＲＩシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ介在阻害に拮抗する抗体を同定することがで
きる。同様にこのアッセイ法は、ＦｃγＲＩＩＢとＦｃεＲＩの共凝集を増強し、かつＦ
ｃγＲＩＩＢとＦｃεＲＩの共凝集を促進することによってＦｃεＲＩシグナル伝達のＦ
ｃγＲＩＩＢ介在阻害を刺激する抗体を同定できる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のように同定された又は本技術分野で公知の
抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体のエピトープ結合ドメインを有する、本発明の抗ＦｃγＲＩＩＢダ
イアボディは、そのＩｇＥ介在応答を調節する能力について、好ましくは細胞ベースのア
ッセイにおいて、肥満細胞若しくは好塩基球の脱顆粒化をモニターし及び／又は測定する
ことによって、特徴付けされる。好ましくは、このようなアッセイに用いる肥満細胞又は
好塩基球は、当業者に公知の標準的な組換え法を用いて、ヒトＦｃγＲＩＩＢを含むよう
に遺伝子操作されている。具体的な実施形態では、本発明の抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体は、そ
のＩｇＥ介在応答を調節するその能力について、細胞ベースのβ−ヘキソサミニダーゼ（
顆粒中に含まれる酵素）放出アッセイ法により特徴付けされる。肥満細胞及び好塩基球か
らのβ−ヘキソサミニダーゼ放出は、急性アレルギー及び炎症状態の最初の事象である（
Ａｋｅｔａｎｉら，（２００１），Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｃｙｔｏ
ｓｏｌｉｃ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｄｅｇｒａｎｕｌ
ａｔｉｏｎ Ｉｎ ＲＢＬ−２Ｈ３ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｃｅ Ｏ
ｆ Ｖａｒｉｏｕｓ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃ
ｉｆｉｃ ＩｇＥｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７５：１８５−１８９；Ａｋｅｔａ
ｎｉら，（２０００），Ａ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ａｎｔｉｇｅ
ｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＥ Ｕｓｉｎｇ Ｍａｓｔ Ｃｅｌｌｓ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ
Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ａｎａｌ．Ｃｈ
ｅｍ．７２：２６５３−２６５８）。これらに限定されないが、セロトニンやヒスタミン
を含む、他の炎症性メディエーターの放出を本発明の方法に従ってアッセイし、ＩｇＥ介
在応答を測定してもよい。特定の作用機序に縛られる意図ではないが、肥満細胞及び好塩
基球からのβ−ヘキソサミニダーゼ含有顆粒のような顆粒の放出は、ＦｃγＲＩと多価抗
原との架橋により開始される細胞内カルシウム濃度依存性の過程である。
ヒト肥満細胞の研究の可能性は、好適な長期のヒト肥満細胞培養物がなかったことで制
限されていた。最近になって、ＬＡＤ１及びＬＡＤ２と呼ばれる２種の新規幹細胞因子依
存性のヒト肥満細胞株が、肥満細胞肉腫／白血病患者由来の骨髄液から樹立された（Ｋｉ
ｒｓｈｅｎｂａｕｍら，（２００３），Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｎｏ
ｖｅｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｍａ
ｓｔ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ＬＡＤ １ Ａｎｄ ２ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ Ｆｒ
ｏｍ Ａ Ｐａｔｉｅｎｔ Ｗｉｔｈ Ｍａｓｔ Ｃｅｌｌ Ｓａｒｃｏｍａ／Ｌｅｕｋ
ｅｍｉａ；Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｏｆ
ＦｃＲＩ Ｏｒ ＦｃγＲＩ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７：６７７−
８２、参照することによりその全体を本明細書に組み入れる）。両細胞株は、ＦｃεＲＩ
及びいくつかのヒト肥満細胞マーカーを発現することが記載されている。ＬＡＤ１及び２
細胞を使用して、ＩｇＥ介在応答に対する本発明の抗体の効果を評価することができる。
具体的な実施形態では、上記のような細胞系のβ−ヘキソサミニダーゼ放出分析法をＬＡ
Ｄ細胞で使用して、本発明の抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体によるＩｇＥ介在応答の調節を測定す
ることができる。代表的なアッセイ法では、ＬＡＤ１などのヒト肥満細胞を、キメラヒト
ＩｇＥ抗ニトロフェノール（ＮＰ）で刺激し、多価抗原であるＢＳＡ−ＮＰに曝露する。
そして細胞の脱顆粒化を、上清中に放出されるβ−ヘキソサミニダーゼを測定することに
よりモニターする（Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍら，（２００３），Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓｐｏｎｓｉ
ｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｍａｓｔ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ＬＡＤ １ Ａｎｄ ２ Ｅｓｔ
ａｂｌｉｓｈｅｄ Ｆｒｏｍ Ａ Ｐａｔｉｅｎｔ Ｗｉｔｈ Ｍａｓｔ Ｃｅｌｌ Ｓ
ａｒｃｏｍａ／Ｌｅｕｋｅｍｉａ；Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ａｇｇ
ｒｅｇａｔｉｏｎ Ｏｆ ＦｃＲＩ Ｏｒ ＦｃγＲＩ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ，２７：６７７−８２、参照することによりその全体を本明細書に組み入れる）。
いくつかの実施形態では、本技術分野で公知の標準的な方法、例えばＦＡＣＳ染色を使
用して測定したとき、ヒト肥満細胞の内在性ＦｃγＲＩＩＢの発現が低い場合、本発明の
抗ＦｃγＲＩＩＢダイアボディにより媒介される阻害経路の活性化の差異をモニター及び
／又は検出することが困難なことがある。従って、本発明は、サイトカイン及び特定の増
殖条件を用いてＦｃγＲＩＩＢ発現を上方制御することのできる別の方法を包含する。Ｆ
ｃγＲＩＩＢは、ＴＨＰ−１やＵ９３７等などのヒト単球系細胞株（Ｔｒｉｄａｎｄａｐ
ａｎｉら，（２００２），Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎｄ Ｉｎｈ
ｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｆｃｇａｍｍａ ＲＩＩＢ Ｉｎ Ｈｕｍａ
ｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（７）：５０
８２−５０８９）及び初代ヒト単球（Ｐｒｉｃｏｐら，（２００１），Ｄｉｆｆｅｒｅｎ
ｔｉａｌ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ Ａｎｄ Ｉｎｈｉｂ
ｉｔｏｒｙ Ｆｃ Ｇａｍｍａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙ
ｔｅｓ Ｂｙ Ｔｈ１ Ａｎｄ Ｔｈ２ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ，１６６：５３１−５３７）内では、ＩＬ４により高度に上方制御されることが記載さ
れている。ジブチリル環状ＡＭＰによるＵ９３７の分化は、ＦｃγＲＩＩの発現を増加す
ることが記載されている（Ｃａｍｅｒｏｎら，（２００２），Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔ
ｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ，Ｕ９３７
，Ｗｉｔｈ Ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ Ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｔｈｅ Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，
ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，８３：１７１−１７
９）。従って、検出感度を増強するために、本発明の方法で使用するヒト肥満細胞での内
在性ＦｃγＲＩＩＢの発現を、例えばＩＬ−４、ＩＬ−１３のようなサイトカインを用い
て上方制御してもよい。
抗ＦｃγＲＩＩＢダイアボディは、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）を介したシグナル伝達の阻
害についてアッセイすることもできる。ＢＣＲを介したシグナル伝達は、少なくとも１つ
以上の下流の生物学的応答、例えばＢ細胞の活性化及び増殖、抗体産生などを含み得る。
ＦｃγＲＩＩＢとＢＣＲとの共凝集は、細胞周期の進行及び細胞の生存を阻害する。更に
、ＦｃγＲＩＩＢとＢＣＲとの共凝集は、ＢＣＲ介在シグナル伝達を阻害する。
具体的には、ＢＣＲを介するシグナル伝達は、以下の少なくとも１つ以上を含む。即ち
、下流シグナル伝達分子の調節、例えば、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化状態、ＳＨＩＰの動
員、Ｂｔｋ及び／又はＰＬＣγの局在、ＭＡＰキナーゼ活性、Ａｋｔ（抗アポトーシスシ
グナル）の動員、カルシウム動員、細胞周期の進行、及び細胞増殖。
ＢＣＲシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ介在阻害におけるエフェクター機能の多くはＳＨ
ＩＰを介しているが、最近、ＳＨＩＰ欠損マウス由来のリポ多糖（ＬＰＳ）活性化Ｂ細胞
が、カルシウム動員、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ３産生並びにＥｒｋ及びＡｋｔのリン酸化
の顕著なＦｃγＲＩＩＢ介在阻害を示すことが立証された（Ｂｒａｕｗｅｉｌｅｒら，（
２００１），Ｐａｒｔｉａｌｌｙ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａ
ｎｉｓｍｓ Ｍｅｄｉａｔｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢ Ｓｉｇ
ｎａｌｉｎｇ Ｉｎ Ｒｅｓｔｉｎｇ Ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｂ Ｃｅｌｌｓ，
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６７（１）：２０４−２１１）。従っ
て、ＳＨＩＰ欠損マウス由来のエクスビボＢ細胞を用いて、本発明の抗体を特徴付けるこ
とができる。本発明の抗体によるＢＣＲシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ介在阻害を測定す
るための代表的なアッセイ法の一つは、以下を含み得る。即ち、ＳＨＩＰ欠損マウスから
脾臓Ｂ細胞を分離し、前記細胞をリポ多糖で活性化し、前記細胞をＦ（ａｂ’）２抗Ｉｇ
Ｍで刺激してＢＣＲを凝集させるか、又は抗ＩｇＭで刺激してＢＣＲをＦｃγＲＩＩＢと
共凝集させる。完全な抗ＩｇＭで刺激し、ＢＣＲをＦｃγＲＩＩＢと共凝集させた細胞は
、更に本発明の抗体とプレインキュベートすることができる。細胞のＦｃγＲＩＩＢ依存
性活性は、本技術分野で公知の標準的な技術によって測定することができる。抗体とプレ
インキュベートした細胞及びプレインキュベートしていない細胞のＦｃγＲＩＩＢ依存性
活性のレベルを比較することにより、その抗体によるＦｃγＲＩＩＢ依存性活性の調節を
示すことができる。
ＦｃγＲＩＩＢ依存性活性の測定は、例えば、フローサイトメトリーによる細胞内カル
シウム動員の測定、Ａｋｔ及び／若しくはＥｒｋのリン酸化の測定、ＰＩ（３，４，５）
Ｐ３のＢＣＲ介在蓄積の測定、又はＢ細胞のＦｃγＲＩＩＢ介在増殖の測定を含み得る。
前記アッセイ法を用いて、例えば、ＦｃγＲＩＩＢ受容体のリガンド（ＩｇＧ）結合部
位を阻害し、かつＦｃγＲＩＩＢとＢＣＲとの共凝集を妨げることによりＢＣＲシグナル
伝達のＦｃγＲＩＩＢ介在阻害に拮抗することで、ＢＣＲシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ
介在阻害を調節する、本発明で使用するダイアボディ又は抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体を同定す
ることができる。また、前記アッセイ法を用いて、ＦｃγＲＩＩＢとＢＣＲの共凝集を増
強し、かつＢＣＲシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ介在阻害を刺激する抗体を同定すること
もできる。
抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体は、ヒト単球／マクロファージにおけるＦｃγＲＩＩを介したシ
グナル伝達についてアッセイすることもできる。ＦｃγＲＩＩＢと免疫受容体チロシン活
性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する受容体との共凝集は、ＳＨＩＰをエフェクターとして
用いるＦｃγＲ介在食作用を下方制御するように作用する（Ｔｒｉｄａｎｄａｐａｎｉら
，（２００２），Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔ
ｏｒｙ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｆｃｇａｍｍａ ＲＩＩＢ Ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｏ
ｎｏｃｙｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（７）：５０８２−５
０８９）。ＦｃγＲＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢの共凝集は、ＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭモチ
ーフ上のチロシン残基の迅速なリン酸化をもたらし、これはＳＨＩＰのリン酸化の増強、
ＳＨＩＰとＳｈｃとの会合、１２０ｋＤａ及び６０〜６５ｋＤａの分子量を有するタンパ
ク質のリン酸化を引き起こす。更に、ＦｃγＲＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢの共凝集は、細胞
制御に関与し、アポトーシスを抑制するように働くセリン・スレオニンキナーゼである、
Ａｋｔのリン酸化の下方制御をもたらす。
抗ＦｃγＲＩＩＢダイアボディは、ヒト単球／マクロファージにおいてＦｃγＲを介し
た食作用の阻害についてアッセイすることもできる。例えば、ヒト単球系細胞株ＴＨＰ−
１由来の細胞を、ＦｃγＲＩＩに対するマウスモノクローナル抗体ＩＶ．３のＦａｂ断片
とヤギ抗マウス抗体と（ＦｃγＲＩＩＡのみを凝集させる）で刺激するか、又は完全なＩ
Ｖ．３マウスモノクローナル抗体とヤギ抗マウス抗体と（ＦｃγＲＩＩＡとＦｃγＲＩＩ
Ｂとを共凝集させる）で刺激することができる。この系では、ＦｃγＲＩＩＢのチロシン
リン酸化、ＳＨＩＰのリン酸化、ＳＨＩＰとＳｈｃとの会合、Ａｋｔのリン酸化、１２０
ｋＤａ及び６０〜６５ｋＤａの分子量を有するタンパク質のリン酸化などの下流のシグナ
ル伝達分子の調節を、本発明の分子を刺激された細胞に添加することでアッセイすること
ができる。更に、単球系細胞株のＦｃγＲＩＩＢ依存性食作用効率を、本発明の抗体の存
在下及び非存在下で直接、測定することができる。
本発明の抗体によるヒト単球／マクロファージにおけるＦｃγＲ介在食作用の阻害を測
定するための他の代表的なアッセイ法は、以下を含み得る。即ち、ＴＨＰ−１細胞を、Ｉ
Ｖ．３マウス抗ＦｃγＲＩＩ抗体のＦａｂ及びヤギ抗マウス抗体とで刺激する（ＦｃγＲ
ＩＩＡのみを凝集させ、ＦｃγＲＩＩＡ介在シグナル伝達を誘導する）か、マウス抗Ｆｃ
γＲＩＩ抗体とヤギ抗マウス抗体とで刺激する（ＦｃγＲＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢとを共
凝集させ、ＦｃγＲＩＩＡ介在シグナル伝達を阻害する）。マウス抗ＦｃγＲＩＩ抗体と
ヤギ抗マウス抗体とで刺激された細胞を、更に本発明の分子とプレインキュベートするこ
とができる。本発明の分子とプレインキュベートして刺激された細胞及び本発明の分子と
プレインキュベートしなかった細胞のＦｃγＲＩＩＡ依存性活性を測定し、これらの細胞
におけるＦｃγＲＩＩＡ依存性活性のレベルを比較することにより、本発明の抗体による
ＦｃγＲＩＩＡ依存性活性の調節を示すことができる。
上述の代表的なアッセイ法を使用して、例えば、ＦｃγＲＩＩＢ受容体のリガンド結合
を阻害し、ＦｃγＲＩＩＢとＦｃγＲＩＩＡとの共凝集を妨げることによってＦｃγＲＩ
ＩＡシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ介在阻害に拮抗する結合ドメインを同定することがで
きる。同様に、このアッセイ法で、ＦｃγＲＩＩＢとＦｃγＲＩＩＡとの共凝集を増強し
、ＦｃγＲＩＩＡシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ介在阻害を刺激する結合ドメインを同定
することができる。
対象となるＦｃγＲＩＩＢ結合ドメインは、以前に報告された方法（Ｔｒｉｄａｎｄａ
ｐａｎｉら，（２０００），Ｔｈｅ Ａｄａｐｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＡＴ Ｅｎｈ
ａｎｃｅｓ Ｆｃｇａｍｍａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｓｉｇｎａｌ Ｔ
ｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｉｎ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．，２７５：２０４８０−７）により、フルオレセイン化ＩｇＧオプソニン化ヒツジ赤血
球（ＳＲＢＣ）を貪食するＴＨＰ−１細胞の能力を測定することにより、Ｉ抗体が含有さ
れる場合、アッセイすることができる。例えば、食作用を測定するための代表的なアッセ
イ法は、ＴＨＰ−１細胞を本発明の抗体又はＦｃγＲＩＩに結合しない対照抗体で処理し
、前記細胞の活性を比較することを有する。その際、細胞の活性（例えば、ロゼット形成
活性（ＩｇＧ被覆ＳＲＢＣに結合するＴＨＰ−１細胞の数）、付着活性（ＴＨＰ−１細胞
に結合したＳＲＢＣの総数）、及び食作用率）の差異が、本発明の抗体によるＦｃγＲＩ
ＩＡ依存性活性の調節を示す。このアッセイ法を用いて、例えば、ＦｃγＲＩＩＢ受容体
のリガンド結合を阻害し、食作用のＦｃγＲＩＩＢ介在阻害に拮抗する抗体を同定するこ
とができる。このアッセイ法は、ＦｃγＲＩＩＡシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ介在阻害
を増強する抗体を同定することもできる。
好ましい実施形態では、結合ドメインは、ヒト単球／マクロファージにおけるＦｃγＲ
ＩＩＢ依存性活性を、以下の少なくとも１つ以上の方法で調節する。即ち、下流シグナル
伝達分子の調節（例えば、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化状態の調節、ＳＨＩＰリン酸化の調
節、ＳＨＩＰとＳｈｃとの会合の調節、Ａｋｔのリン酸化の調節、約１２０ｋＤａ及び６
０〜６５ｋＤａの付加的タンパク質のリン酸化の調節）及び食作用の調節である。
５．１．２．ＣＤ１６Ａ結合ドメイン
以下のセクションでは、共有結合型ダイアボディの作製のための軽鎖及び重鎖の可変領
域の供給源として使用することができる、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質について論ずる。本
発明では、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、抗ＣＤ１６Ａ抗体のＶＬ及びＶＨドメインを有
する分子を包含する。このＶＬ及びＶＨドメインは、本発明のダイアボディの作製に使用
される。
様々なＣＤ１６Ａ結合タンパク質が、本発明に関連して用いられる。好適なＣＤ１６Ａ
結合タンパク質には、ヒト又はヒト化モノクローナル抗体に加え、ＣＤ１６Ａ結合抗体断
片（例えば、ｓｃＦｖ又は１本鎖抗体、Ｆａｂ断片、ミニボディ）及び軽鎖可変領域ドメ
イン、重鎖可変領域ドメイン、又はその両方との相互作用を介してＣＤ１６Ａに結合する
他の抗体様タンパク質が含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明による使用のためのＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、マ
ウス抗ＣＤ１６Ａ抗体などの非ヒト抗ＣＤ１６Ａ抗体に由来する配列を有する１つ以上の
ＣＤＲと、１つ以上のヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列に由来する１つ以上のフ
レームワーク領域とを有する、ＶＬ及び／又はＶＨドメインを有する。ＣＤＲ及び他の配
列を得ることのできる多数の非ヒト抗ＣＤ１６Ａモノクローナル抗体が知られている（例
えば、Ｔａｍｍら，（１９９６），Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ Ｏｆ
Ｈｕｍａｎ ＣＤ １６（Ｆｃ ｇａｍｍａ ＲＩＩＩ）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｆｏｒ Ｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ，
Ｊ．Ｉｍｍ．１５７：１５７６−８１；Ｆｌｅｉｔら，（１９８９），ｐ．１５９；ＬＥ
ＵＫＯＣＹＴＥ ＴＹＰＩＮＧ ＩＩ：ＨＵＭＡＮ ＭＹＥＬＯＩＤ ＡＮＤ ＨＥＭＡ
ＴＯＰＯＩＥＴＩＣ ＣＥＬＬＳ，Ｒｅｉｎｈｅｒｚら編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉ
ｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，（１９８６）；ＬＥＵＣＯＣＹＴＥ ＴＹＰＩＮＧ ＩＩＩ：
ＷＨＩＴＥ ＣＥＬＬ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ ＡＮＴＩＧＥＮＳ，ＭｃＭｉ
ｃｈａｅｌ Ａ．Ｊ．編，Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅ
ｓｓ，１９８６；ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ ＴＹＰＩＮＧ ＩＶ：ＷＨＩＴＥ ＣＥＬＬ Ｄ
ＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ ＡＮＴＩＧＥＮＳ，Ｋａｐｐら編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎ
ｉｖ． Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ ＴＹＰＩＮＧ Ｖ：ＷＨＩＴ
Ｅ ＣＥＬＬ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ ＡＮＴＩＧＥＮＳ，Ｓｃｈｌｏｓｓｍ
ａｎら編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ
ＴＹＰＩＮＧ ＶＩ：ＷＨＩＴＥ ＣＥＬＬ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ ＡＮＴ
ＩＧＥＮＳ，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ編、Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓを参照）。更に、実
施例に示すように、細胞上に発現されたヒトＣＤ１６Ａを認識する新たなＣＤ１６Ａ結合
タンパク質は、モノクローナル抗体又は関連する結合タンパク質の作製及び選択のための
周知の方法（例えば、ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ法等）を用いて取得で
きる。例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌら，（２００２），Ｐｈａｇｅ Ｖｅｒｓｕｓ Ｐｈａ
ｇｅｍｉｄ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３２１：４９
−５６；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，（２０００），Ｎａｔｕｒａｌ Ａｎｄ Ｄｅｓｉｇ
ｎｅｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ Ｍａｄｅ Ｂｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍ．Ｔｏｄａｙ，２１：３７１０７８；Ｋｒｅｂｓら，（２
００１），Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ Ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，
Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５４：６７−８４；及び本明細書で引用した他の文献を
参照。ヒト以外の種由来のモノクローナル抗体を、本技術分野において公知の抗体のヒト
化技術を用いてキメラ化又はヒト化することができる。
あるいはまた、ＣＤ１６Ａに対する完全なヒト抗体は、ヒト免疫系の成分を有するトラ
ンスジェニック動物を用いて（例えば、米国特許第５，５６９，８２５号及び第５，５４
５，８０６号参照）、ヒト末梢血細胞を用いて（Ｃａｓａｌｉら，（１９８６），Ｈｕｍ
ａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ Ｆｒｏｍ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｓｅｌ
ｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｂ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉ
ｏｎ Ｂｙ ＥＢＶ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：４７６−４７９）、ヒトＢ細胞由来のＤ
ＮＡライブラリーをＨｕｓｅら、（１９８９），Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｌａ
ｒｇｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇ
ｌｏｂｕｌｉｎ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ Ｉｎ Ｐｈａｇｅ Ｌａｍｂｄａ，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２４６：１２７５−１２８１で概説された通常のプロトコルに従ってスクリーニン
グすることにより、更に他の方法により作製することができる。
好ましい実施形態では、結合ドナーは、例えば、米国特許公開第２００４／００１０１
２４号（参照することによりその全体を本明細書に組み入れる）に開示されているような
、３Ｇ８抗体又はそのヒト化型由来である。ある目的においては、３Ｇ８が結合するエピ
トープと同一のエピトープで、又は少なくとも当該エピトープに十分に近接しており３Ｇ
８の結合を阻止するエピトープで、ＣＤ１６Ａ受容体に結合するＣＤ１６Ａ結合タンパク
質を使用することが有利であると考えられる。所望の結合特性を有する結合タンパク質を
同定するためのエピトープマッピング及び競合的結合実験の方法は、実験免疫学の当業者
には周知である。例えば、上記で引用したＨａｒｌｏｗとＬａｎｅの論文；Ｓｔaｈｌｉ
ら，（１９８３），Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ Ｂｙ Ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，
９２：２４２−２５３；Ｋｉｒｋｌａｎｄら，（１９８６），Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｆ
Ｔｈｅ Ｆｉｎｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｒｅａｃｔｉｖｉｔ
ｙ Ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−Ｌｉｐｉｄ Ａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３７：３６１４−３６１９；Ｍｏｒｅｌら，（１９８８），Ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｔｏ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂ
ｕｍｉｎ：Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔ
ｉｏｎｓ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５：７−１５；Ｃｈｅｕｎｇら，（１９９
０），Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｔｏ
Ｔｈｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｏｆ Ｄｕｃｋ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ
Ｖｉｒｕｓ Ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｄｕｃｋｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７６：５４
６−５５２；Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら，（１９９０），Ｉｄｅｎｔｉｔｙ Ｏｆ ＨＭ
Ｌ−１ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｏｎ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａ
ｌ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｏｆ Ｂ−ｌｙ７ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｏｎ Ｈａｉｒｙ
Ｃｅｌｌ Ｌｅｕｋａｅｍｉａ，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：７７−８２
参照。例えば、２つの抗体が同一部位に結合するかどうかは、一方の抗体を用いてＥＬＩ
ＳＡプレート上で抗原を捕捉し、その後捕捉された抗原に第２の抗体が結合するかを測定
することによって、確認することができる。また、エピトープの比較は、第１の抗体を直
接的に若しくは間接的に酵素、放射性核種又は蛍光団で標識し、細胞上の、溶液中の、又
は固相上の抗原へに第１の抗体の結合を未標識の第２の抗体が阻害する能力を測定するこ
とによっても行うことができる。
ＣＤ１６Ａ受容体のＥＬＩＳＡプレート上に形成された免疫複合体への結合を阻害する
抗体の能力を測定することも可能である。前記免疫複合体は、まずフルオレセインなどの
抗原でプレートを被覆し、次に特異的な抗フルオレセイン抗体をプレートに塗布すること
によって形成される。この免疫複合体は、その後、ｓＦｃＲＩＩＩａのような可溶性Ｆｃ
受容体のリガンドとして働く。あるいはまた、可溶性の免疫複合体を形成し、酵素、放射
性核種又は蛍光団で直接的に若しくは間接的に標識してもよい。その後、これらの標識免
疫複合体と、細胞上の、溶液中の、又は固相上のＦｃ受容体との結合を阻害する抗体の能
力を測定することができる。
本発明のＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域を含んでいてもよ
いし、含まなくともよい。Ｆｃ領域は、例えば、ｓｃＦｖ結合タンパク質中には存在しな
い。Ｆｃ領域は、例えば、ヒト又はヒト化四量体モノクローナルＩｇＧ抗体に存在する。
上記のように、本発明のいくつかの実施形態では、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、エフェ
クター機能が改変されているＦｃ領域を含む。改変されたエフェクター機能として、例え
ば、未改変Ｆｃ領域（例えば、天然のＩｇＧ１タンパク質のＦｃ等）と比較した場合のＦ
ｃ受容体又は補体のＣ１成分のようなエフェクターリガンドに対する親和性の低下が挙げ
られる。一つの実施形態では、Ｆｃ領域は、２９７位に相当するＦｃ領域のアミノ酸がグ
リコシル化されていない。このような抗体はＦｃエフェクター機能を欠いている。
従って、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、結合タンパク質中にＦｃドメインを欠くことか
ら、Ｆｃ受容体又は補体のＣ１成分のようなエフェクターリガンドへのＦｃ介在結合を示
さないことがあるが、他のケースでは、結合やエフェクター機能の欠如は抗体の定常領域
の変化に起因している。
５．１．２．１．ｍＡｂ３Ｇ８ＣＤＲ配列に類似するＣＤＲ配列を有するＣＤ１６Ａ結合
タンパク質
本発明の実施に使用することができるＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、マウスモノクロー
ナル抗体３Ｇ８のＣＤＲに由来する（即ち、同一若しくは類似の配列を有している）ＣＤ
Ｒ配列を有するタンパク質を包含する。ＣＤＲをコードする配列を含む、マウス３Ｇ８モ
ノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をコードする相補的ｃＤＮＡを、上述のように
クローニングして配列決定した。３Ｇ８の核酸配列及びタンパク質配列を以下に示す。マ
ウス可変領域及びＣＤＲ配列を用いて、３Ｇ８のＣＤＲに由来する相補性決定領域を含む
多数のキメラ及びヒト化モノクローナル抗体を作製し、それらの特性を解析した。ＣＤ１
６Ａに高親和性で結合し、他の所望の特性を有するヒト化抗体を同定するために、３Ｇ８
由来のＣＤＲを有するＶＨ領域を有する抗体重鎖を作製し、３Ｇ８由来のＣＤＲを有する
ＶＬ領域を含む抗体軽鎖と（共発現により）結合させて、解析用の四量体抗体を作製した
。得られた四量体抗体の特性を以下に記載のように測定した。以下で説明するように、３
Ｇ８のＣＤＲを有するＣＤ１６Ａ結合タンパク質、例えば、本明細書に記載したヒト化抗
体タンパク質を本発明に従って使用してもよい。
５．１．２．１．１．ＶＨ領域
一つの態様において、本発明のＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、少なくとも１つのＣＤＲ
（通常は３つのＣＤＲ）がマウスモノクローナル抗体３Ｇ８重鎖の１つのＣＤＲ（一般的
には３つ全てのＣＤＲ）の配列を有し、該結合タンパク質の残りの部分が実質的にヒトの
配列を有する（ヒト抗体の重鎖可変領域に由来し、実質的にそれに類似する）、重鎖可変
ドメインを有してもよい。
一つの態様において、本発明は、実質的にヒトのフレームワーク中に３Ｇ８抗体由来の
ＣＤＲを含むヒト化３Ｇ８抗体又は抗体断片であって、重鎖可変ドメインの少なくとも１
つのＣＤＲが対応するマウス抗体３Ｇ８重鎖ＣＤＲと配列の点で異なる、上記抗体を提供
する。例えば、一つの実施形態では、ＣＤＲは、本技術分野で公知の又は表３及び表４Ａ
〜Ｈで開示したような、ＣＤ１６Ａへの３Ｇ８の結合に影響することが本技術分野で公知
である１つ以上のＣＤＲ置換を少なくとも有することで、３Ｇ８のＣＤＲ配列とは異なる
。好適なＣＤ１６結合タンパク質は、これらの置換を０、１つ、２つ、３つ又は４つ、あ
るいはそれ以上含み（多くの場合、１〜４つの置換を有する）、場合により追加の置換を
も有することができる。
Figure 2015157833
Figure 2015157833
Figure 2015157833
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Figure 2015157833
一つの実施形態では、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、配列を配列番号６８に示す、Ｈｕ
３Ｇ８ＶＨ−１構築物のＶＨドメインと同一の又は類似する重鎖可変ドメインの配列を有
してもよい。例えば、本発明は、（１）表１に記載した、０、１又はそれ以上のＣＤＲ置
換によりＨｕ３Ｇ８ＶＨ−１（配列番号６８）のＶＨドメインとは異なり、（２）表１に
記載した、０、１又はそれ以上のフレームワーク置換によりＨｕ３Ｇ８ＶＨ−１のＶＨド
メインとは異なり、（３）残りの位置はＨｕ３Ｇ８ＶＨ−１のＶＨ配列と少なくとも約８
０％同一である、多くの場合少なくとも約９０％、時には少なくとも約９５％同一である
、又は少なくとも約９８％も同一である、配列を有しているＶＨドメインを有するＣＤ１
６Ａ結合タンパク質を提供する。
本発明のＣＤ１６Ａ結合タンパク質の代表的なＶＨドメインは、３Ｇ８ＶＨ、Ｈｕ３Ｇ
８ＶＨ−５及びＨｕ３Ｇ８ＶＨ−２２の配列（それぞれ、配列番号７９、配列番号６９及
び配列番号７０）を有する。３Ｇ８ＶＨ及びＨｕ３Ｇ８ＶＨ−５の配列（それぞれ、配列
番号７９及び配列番号６９）をコードする代表的なヌクレオチド配列を、それぞれ配列番
号８０及び配列番号８１に示す。
ＶＨドメインは、表３で示した少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少
なくとも４つ、少なくとも５つ又は少なくとも６つの置換によってＨｕ３Ｇ８ＶＨ−１（
配列番号６８）の配列と異なる配列を有してもよい。これらの置換は、ＣＤ１６Ａに対す
る親和性を増加し、及び／又はヒトに投与した場合にＣＤ１６Ａ結合タンパク質の免疫原
性を低減すると考えられている。ある実施形態では、残りの位置のＨｕ３Ｇ８ＶＨ−１の
ＶＨドメインとの配列同一性の程度は、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少な
くとも約９５％、又は少なくとも約９８％である。
限定ではなく例示として、多数のＣＤ１６Ａ結合タンパク質のＶＨドメインの配列を表
４に示す。ヒトＣγ１定常領域に融合させたこれらの配列を含む重鎖を、ｈｕ３Ｇ８ＶＬ
−１軽鎖（以下に記載）と共に共発現させて、四量体の抗体を形成させた。また、ＣＤ１
６Ａへの該抗体の結合性を測定して、アミノ酸置換の効果をｈｕ３Ｇ８ＶＨ−１のＶＨド
メインと比較して評価した。ＶＨドメインがｈｕ３Ｇ８ＶＨ−１、２、３、４、５、８、
１２、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２
８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４２、４３、４４及び４
５の配列を有する構築物は高親和結合性を示し、ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−６及び４０のＶＨドメ
インは中間の結合性を示した。ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−５及びｈｕ３Ｇ８ＶＨ−２２（それぞれ
、配列番号６９及び配列番号７０）のＶＨドメインを含むＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、
特に好ましい結合特性を有すると考えられる。
５．１．２．２．ＶＬ領域
好ましい結合特性を有する軽鎖可変ドメイン配列を同定するために同様の研究を行った
。一つの態様において、本発明は、少なくとも１つのＣＤＲ（通常は３つのＣＤＲ）が、
マウスモノクローナル抗体３Ｇ８軽鎖の１つのＣＤＲ（通常は３つ全てのＣＤＲ）の配列
を有し、該結合タンパク質の残りの部分は実質的にヒトの配列（ヒト抗体の重鎖可変領域
に由来し、実質的にそれに類似する）を有する、軽鎖可変ドメインを含むＣＤ１６Ａ結合
タンパク質を提供する。
一つの態様において、本発明は、実質的にヒトのフレームワーク中に３Ｇ８抗体由来の
ＣＤＲを含むヒト化３Ｇ８抗体の断片であって、軽鎖可変ドメインの少なくとも１つのＣ
ＤＲがマウスモノクローナル抗体３Ｇ８の軽鎖ＣＤＲと配列において異なる、上記断片を
提供する。一つの実施形態では、ＣＤＲは１つ以上のアミノ酸置換、例えば表２で示した
１つ以上の置換（例えば、ＣＤＲ１の２４位のアルギニン；ＣＤＲ１の２５位のセリン；
ＣＤＲ１の３２位のチロシン；ＣＤＲ１の３３位のロイシン；ＣＤＲ２の５０位のアスパ
ラギン酸、トリプトファン若しくはセリン；ＣＤＲ２の５３位のセリン；ＣＤＲ２の５５
位のアラニン若しくはグルタミン；ＣＤＲ２の５６位のスレオニン；ＣＤＲ３の９３位に
おけるセリン；及び／又はＣＤＲ３の９４位のスレオニン）をＣＤＲ中に少なくとも有す
ることで、３Ｇ８配列とは異なっている。様々な実施形態において、可変ドメインは、こ
のような置換を０、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上有し（多くの場合、１〜
４つのこれらの置換）、場合により更なる置換を有することもできる。
一つの実施形態において、好適なＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、Ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１（
配列番号７１）構築物のＶＬドメインと同一の又は類似する軽鎖可変ドメイン配列を有し
てよく、その配列を表６に示す。例えば、本発明は、（１）表５に記載した、０、１又は
それ以上のＣＤＲ置換によりＨｕ３Ｇ８ＶＬ−１（配列番号７１）のＶＬドメインとは異
なり、（２）表５に記載した、０、１又はそれ以上のフレームワーク置換によりＨｕ３Ｇ
８ＶＬ−１のＶＬドメインとは異なり、（３）残りの位置でＨｕ３Ｇ８ＶＬ−１のＶＬ配
列（配列番号７１）と少なくとも約８０％同一である、多くの場合少なくとも約９０％、
時には少なくとも約９５％同一である、又は少なくとも約９８％も同一である、配列を有
しているＶＬドメインを有するＣＤ１６Ａ結合タンパク質を提供する。
Figure 2015157833
Figure 2015157833
Figure 2015157833
Figure 2015157833
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Figure 2015157833
Figure 2015157833
Figure 2015157833
Figure 2015157833
Figure 2015157833
本発明のＣＤ１６結合タンパク質の代表的なＶＬドメインは、表５及び６に示すように
、３Ｇ８ＶＬ、Ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１又はＨｕ３Ｇ８ＶＬ−４３の配列（それぞれ、配列番
号８２、配列番号７１及び配列番号７２）を有する。３Ｇ８ＶＬ（配列番号８２）及びＨ
ｕ３Ｇ８ＶＬ−１（配列番号７１）をコードする代表的なヌクレオチド配列を、それぞれ
配列番号８３及び配列番号８４に示す。
ＶＬドメインは、表２に示した置換の０、１、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少な
くとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ又は少
なくとも９つによってＨｕ３Ｇ８ＶＬ−１の配列（配列番号７１）とは異なる配列を有し
てもよい。これらの置換は、ＣＤ１６Ａに対する親和性を増加し、及び／又はヒトに投与
した場合にＣＤ１６Ａ結合タンパク質の免疫原性を低減すると考えられる。ある実施形態
では、残りの位置の配列同一性の程度は、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少
なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％である。
限定ではなく例示として、多数のＣＤ１６Ａ結合タンパク質のＶＬドメイン配列を表６
に示す。ヒトＣκ定常ドメインに融合したこれらの配列を有する軽鎖を、Ｈｕ３Ｇ８ＶＨ
重鎖（上述）と共発現させ、四量体の抗体を形成させ、該抗体のＣＤ１６Ａへの結合性を
測定して、アミノ酸置換の効果をＨｕ３Ｇ８ＶＬ−１のＶＬドメイン（配列番号７１）と
比較して評価した。ＶＬドメインがｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１、２、３、４、５、１０、１６、
１８、１９、２１、２２、２４、２７、２８、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及
び４２の配列を有する構築物は高親和結合性を示したが、ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１５、１７、
２０、２３、２５、２６、２９、３０、３１、３８、３９、４０及び４１は中間の結合性
を示した。ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１、ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−２２及びｈｕ３Ｇ８ＶＬ−４３（それ
ぞれ、配列番号７１、配列番号７３及び配列番号７２）のＶＬドメインを有するＣＤ１６
Ａ結合タンパク質は、特に優れた結合特性を有すると考えられている。
５．１．２．２．１．ＶＬ及び／又はＶＨドメインの組合せ
本技術分野では公知であり、また本明細書の他の箇所でも記載したように、免疫グロブ
リンの軽鎖及び重鎖は、それらが会合してダイアボディを産生する条件下で、組換え技術
によって発現させることも、またインビトロでそのように組み合わせることもできる。従
って、本明細書で記載した３Ｇ８由来のＶＬドメインを本明細書に記載した３Ｇ８由来の
ＶＨドメインと組み合わせて、ＣＤ１６Ａ結合性ダイアボディを作製することができ、そ
のような組合せの全てを意図していることは当然である。
限定ではなく例示として、有用なＣＤ１６Ａダイアボディの例は、少なくとも１つのＶ
Ｈドメインと少なくとも１つのＶＬドメインを有するものであり、そのＶＨドメインがｈ
ｕ３Ｇ８ＶＨ−１、ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−２２又はｈｕ３Ｇ８ＶＨ−５（それぞれ、配列番号
６８、配列番号７０及び配列番号６９）に由来し、ＶＬドメインがｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１、
ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−２２又はｈｕ３Ｇ８ＶＬ−４３（それぞれ、配列番号７１、配列番号７
３及び配列番号４１）に由来する。特に、ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−２２（配列番号２２）とｈｕ
３Ｇ８ＶＬ−１、ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−２２又はｈｕ３Ｇ８ＶＬ−４３（それぞれ、配列番号
７１、配列番号７０及び配列番号７２）とを有する、又はｈｕ３Ｇ８ＶＨ−５（配列番号
６９）とｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１（配列番号７１）とを有するヒト化抗体は、好ましい特性を
有する。
本明細書に記載したＶＬ及びＶＨドメインの配列を、本技術分野で公知の方法、例えば
親和性成熟等（Ｓｃｈｉｅｒら，（１９９６），Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｐｉｃｏｍ
ｏｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ａｎｔｉ−Ｃ−ＥｒｂＢ−２ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ
Ｆｖ Ｂｙ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅ
ｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｃｅｎ
ｔｅｒ Ｏｆ Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂ
ｉｏｌ．，２６３：５５１−５６７；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら，（１９９８），Ａｎｔｉｂ
ｏｄｙ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
Ｓｕｒｆａｃｅ Ｄｉｓｐｌａｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１１：８２５−８３２；
Ｂｏｄｅｒら，（１９９７），Ｙｅａｓｔ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｆｏｒ
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒ
ａｒｉｅｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：５５３−５５７；Ｂｏｄｅｒら，
（２０００），Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒ
ａｇｍｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ Ｆｅｍｔｏｍｏｌａｒ Ａｎｔｉｇ
ｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｆｆｉｎｉｔｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
．Ｓ．Ａ．，９７：１０７０１−１０７０５；Ｈｕｄｓｏｎら，（２００３），Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９：１２９−
３９を参照）によって、更に改変することができることは、当業者であれば当然、理解で
きるであろう。例えば、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質を、親和性成熟技術を用いて改変し、
ＣＤ１６Ａに対する親和性が増加した及び／又はＣＤ１６Ｂに対する親和性が低下したタ
ンパク質を同定することができる。
代表的なＣＤ１６結合タンパク質の一つは、マウス３Ｇ８抗体である。ヒト化３Ｇ８の
ＶＨ及びＶＬドメインを有するアミノ酸配列を図２、９、１４に記載し、配列番号９、配
列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８
、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号６８、配列番号
６９、配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に示す。
５．２．Ｆｃ領域又はその一部を有するダイアボディ
本発明は、Ｆｃドメイン又はその一部（例えば、ＣＨ２やＣＨ３ドメイン）を有するダ
イアボディ分子を包含する。ある実施形態では、Ｆｃドメイン又はその一部は、ＩｇＧ２
、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域の１つ以上の定常ドメイン（例えば、ＣＨ２又はＣＨ
３）を有する。他の実施形態では、本発明は、、匹敵する野生型Ｆｃドメイン又はその一
部に対して少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、置換）を有するＦｃドメイン又はそ
の一部を有する分子を包含する。変異型Ｆｃドメインは本技術分野では周知であり、例え
ば、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ解析又はＡＤＣＣなどの本技術分野で周知の結合活性アッセイ法
又はエフェクター機能アッセイ法のいずれかでアッセイした場合に、前記変異型Ｆｃドメ
インを有する抗体の表現型を変えるのに主として用いられる。このような変異型Ｆｃドメ
イン又はその一部は、例えば、ＮＫ依存的又はマクロファージ依存的アッセイ法などによ
り機能アッセイした場合に、Ｆｃドメイン（又はその一部）を有する本発明のダイアボデ
ィ分子によって示されるエフェクター機能を付与する又は改変することにより、本発明に
おいて使用される。エフェクター機能を改変すると同定されたＦｃドメイン変異体は、国
際公開ＷＯ０４／０６３３５１号、米国特許公開第２００５／００３７０００号及び第２
００５／００６４５１４号、２００４年１１月１０日に出願された米国仮出願第６０／６
２６，５１０号、２００４年１２月１５日に出願された第６０／６３６，６６３号及び２
００６年３月１０日に出願された第６０／７８１，５６４号、並びに本発明者の同時出願
である２００５年１１月１０日に出願された米国特許出願第１１／２７１，１４０号及び
２００５年１２月１５日に出願された第１１／３０５，７８７号中に開示されている。こ
れらはいずれも参照することによりその全体を本明細書中に組み入れる。
他の実施形態では、本発明は、本技術分野で公知のＦｃ変異体の使用も包含する。Ｆｃ
変異体の例は、例えば、以下に開示されている。即ち、Ｄｕｎｃａｎら，（１９８８），
Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｆｏｒ Ｔｈｅ
Ｈｕｍａｎ Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｏｎ ＩｇＧ，
Ｎａｔｕｒｅ，３３２：５６３−５６４；Ｌｕｎｄら，（１９９１），Ｈｕｍａｎ Ｆｃ
Ｇａｍｍａ ＲＩ Ａｎｄ Ｆｃ Ｇａｍｍａ ＲＩＩ Ｉｎｔｅｒａｃｔ Ｗｉｔｈ
Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｂｕｔ Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ Ｏｎ Ｈｕｍａｎ
ＩｇＧ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：２６５７−２６６２；Ｌｕｎｄら，（１９９
２），Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ Ｏｎ Ｔｈｅ ＣＨ２ Ｄｏｍ
ａｉｎ Ｏｆ ＩｇＧ Ｆｏｒ Ｍｏｕｓｅ Ｆｃ Ｇａｍｍａ ＲＩＩ，Ｍｏｌ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．，２９：５３−５９；Ａｌｅｇｒｅら，（１９９４），Ａ Ｎｏｎ−Ａｃｔ
ｉｖａｔｉｎｇ“Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ”Ａｎｔｉ−ＣＤ３ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｔａｉｎｓ Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ Ｐｒｏｐｅｒｔ
ｉｅｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，５７：１５３７−１５４３
；Ｈｕｔｃｈｉｎｓら，（１９９５），Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉ
ｏｎ，Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａｎｄ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ
ｉｃｉｔｙ Ｉｎ Ｍｉｃｅ Ｗｉｔｈ Ａ Ｇａｍｍａ ４ Ｖａｒｉａｎｔ Ｏｆ
Ｃａｍｐａｔｈ−ｌＨ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９２：
１１９８０−１１９８４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓら，（１９９５），Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ
Ｓｉｔｅｓ Ｏｎ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｏｒ Ｆｃ Ｇａｍｍａ Ｒｅｃｅｐｔｏ
ｒｓ：Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ Ｏｆ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔ
ｔ．，４４：１１１−１１７；Ｌｕｎｄら，（１９９５），Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉ
ｄｅ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｉｎ ＩｇＧ Ｃａｎ Ｍｏｄｕｌ
ａｔｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｂｙ Ｆｃ Ｇａｍｍａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＦＡ
ＳＥＢ Ｊ．，９：１１５−１１９；Ｊｅｆｆｅｒｉｓら，（１９９６），Ｍｏｄｕｌａ
ｔｉｏｎ Ｏｆ Ｆｃ（Ｇａｍｍａ）Ｒ Ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ
Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｂｙ ＩｇＧ３−Ｃｏｒｅ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，５４：１０１−１０４；Ｌｕ
ｎｄら，（１９９６），Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｉｇｇ
Ｗｉｔｈ Ｉｔｓ Ｃｏｒｅ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｃａｎ Ｍｏｄｕｌａ
ｔｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｂｙ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｆ
ｃ Ｇａｍｍａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉ Ａｎｄ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ Ｔｈｅ Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ Ｏｆ Ｉｔｓ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｃｈａｉｎｓ，Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．，１５７：４９６３−４９６９；Ａｒｍｏｕｒら，（１９９９），Ｒｅｃ
ｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｌａｃｋｉｎｇ Ｆｃｇ
ａｍｍａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｎｄ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｔｒｉ
ｇｇｅｒｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９：２６１
３−２６２４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら，（２０００），Ｍａｐｐｉｎｇ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｃ
１Ｑ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｏｎ Ｒｉｔｕｘａｎ，Ａ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ Ｗｉｔｈ Ａ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ Ｆｃ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１
６４：４１７８−４１８４；Ｒｅｄｄｙら，（２０００），Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ Ｏ
ｆ Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏ
ｎｓ Ｏｆ Ａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＩｇＧ４ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ Ｔｏ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４：１９２５−１９３３；
Ｘｕら，（２０００），Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ
Ｆｉｖｅ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＯＫＴ３ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｖａ
ｒｉａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００：１６−２６
；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら，（２００１），Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
Ｗｉｔｈ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｔｏ Ｒｅｃｒｕｉｔ Ｃｏｍｐｌ
ｅｍｅｎｔ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：２５７１−２５７５；Ｓｈｉｅｌｄｓら，
（２００１），Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｂｉ
ｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｏｎ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ Ｆｏｒ Ｆｃ ｇａｍｍａ ＲＩ
，Ｆｃ ｇａｍｍａ ＲＩＩ，Ｆｃ ｇａｍｍａ ＲＩＩＩ，Ａｎｄ ＦｃＲｎ Ａｎｄ
Ｄｅｓｉｇｎ Ｏｆ ＩｇＧ１ Ｖａｒｉａｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｂ
ｉｎｄｉｎｇ Ｔｏ Ｔｈｅ Ｆｃ ｇａｍｍａ Ｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７
６：６５９１−６６０４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓら，（２００２），Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ
Ｓｉｔｅｓ Ｏｎ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ−Ｆｃ Ｆｏｒ ＦｃｇａｍｍａＲ：Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｍｏｄｅｌｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，８２：５７−６５；Ｐｒｅｓｔａ
ら，（２００２），Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒ
ａｎｓ．，３０：４８７−４９０；米国特許第５，６２４，８２１号、第５，８８５，５
７３号及び第６，１９４，５５１号、国際公開ＷＯ００／４２０７２及びＷＯ９９／５８
５７２（これらはいずれも参照することによりその全体を本明細書中に組み入れる）。
ある実施形態では、Ｆｃ領域のアミノ酸に対する前記１つ以上の改変は、Ｆｃ領域の、
従って本発明のダイアボディ分子の、１つ以上のＦｃγＲ受容体に対する親和性及び結合
力を減じる。具体的な実施形態では、本発明は、変異型Ｆｃ領域又はその一部を有するダ
イアボディを包含し、ここで、前記変異型Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比較して少なく
とも１つのアミノ酸改変を有し、変異型Ｆｃ領域のみが１つのＦｃγＲと結合し、該Ｆｃ
γＲがＦｃγＲＩＩＩＡである。他の具体的な実施形態では、本発明は、変異型Ｆｃ領域
又はその一部を有するダイアボディを包含し、ここで、前記変異型Ｆｃ領域は、野生型Ｆ
ｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を有し、変異型Ｆｃ領域のみが１つのＦ
ｃγＲと結合し、該ＦｃγＲがＦｃγＲＩＩＡである。他の具体的な実施形態では、本発
明は、変異型Ｆｃ領域又はその一部を有するダイアボディを包含し、ここで、前記変異型
Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を有し、変異型Ｆ
ｃ領域のみが１つのＦｃγＲと結合し、該ＦｃγＲがＦｃγＲＩＩＢである。ある実施形
態では、本発明は、変異型Ｆｃドメインを有する分子を包含し、ここで、前記変異体は、
当業者に公知であり、本明細書に記載された方法を用いて測定したときに、Ｆｃドメイン
を有さない又は野生型Ｆｃドメインを有する分子と比較して、ＡＤＣＣ活性の増大及び／
又はＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）への結合性の増大を付与又は仲介する。別の実施形態
では、本発明は、変異型Ｆｃドメインを有する分子を包含し、ここで、前記変異体は、当
業者に公知であり、本明細書に記載された方法を用いて測定したときに、Ｆｃドメインを
有さない又は野生型Ｆｃドメインを有する分子と比較して、ＡＤＣＣ活性（又は他のエフ
ェクター機能）の低下及び／又はＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）への結合性の増大を付与
又は仲介する。
本発明はまた、２以上のＩｇＧアイソタイプに由来するドメイン又は領域を有するＦｃ
ドメインの使用を包含する。本技術分野で知られているように、Ｆｃ領域のアミノ酸改変
は、Ｆｃを介するエフェクター機能及び／又は結合活性に大きな影響を及ぼし得る。しか
し、機能特性のこうした改変は、選択したＩｇＧアイソタイプとの関係において実行され
る場合、更に改良され、かつ／又は操作され得る。同様に、Ｆｃアイソタイプの天然の特
性を、１つ以上のアミノ酸改変により操作してもよい。複数のＩｇＧアイソタイプ（即ち
、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）は、ヒンジ及び／又はＦｃドメインのア
ミノ酸配列の相違により、異なった物理学的及び機能的性質、例えば血中半減期、補体結
合、ＦｃγＲ結合親和性、及びエフェクター機能活性（例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣ）を示す
。ある実施形態では、所望の特徴をもつダイアボディを設計するために、アミノ酸改変及
びＩｇＧＦｃ領域は、それらのそれぞれの個別の結合性及び／又はエフェクター機能活性
に基づいて、独立に選択される。たいていの実施形態では、前記アミノ酸改変及びＩｇＧ
ヒンジ／Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１との関連において、本明細書に記載され又は本技術分野で
公知であるように、結合性及び／又はエフェクター機能活性について別々にアッセイされ
ている。ある実施形態では、前記アミノ酸改変及びＩｇＧヒンジ／Ｆｃ領域は、ダイアボ
ディ分子又は他のＦｃ含有分子（例えば、免疫グロブリン）との関連において、ＦｃγＲ
結合性又はエフェクター機能について別々にアッセイした場合、類似の機能性、例えばＦ
ｃγＲＩＩＡに対する親和性の増加等を示す。前記アミノ酸改変と選択されたＩｇＧＦｃ
領域の組み合わせは、その後、相加的に又はより好ましくは相乗的に作用して、野生型Ｆ
ｃ領域を有する本発明のダイアボディ分子と比較して、本発明のダイアボディ分子の前記
機能性を改変する。他の実施形態において、前記アミノ酸改変及びＩｇＧのＦｃ領域は、
本明細書に記載した又は本技術分野で公知の野生型Ｆｃ領域を含むダイアボディ分子若し
くは他のＦｃ含有分子（例えば、免疫グロブリン）との関連において、ＦｃγＲ結合性及
び／又はエフェクター機能について別個にアッセイした場合、相反する機能性、例えば、
ＦｃγＲＩＩＡに対する親和性のそれぞれ増加及び低下を示す。前記「相反する」アミノ
酸改変及び選択したＩｇＧ領域の組合せは、その後、Ｆｃ領域を有さない又は同一アイソ
タイプの野生型Ｆｃ領域を有する本発明のダイアボディと比較すると、本発明のダイアボ
ディの特異的機能性を選択的に弱める又は減少させるように作用する。あるいはまた、本
発明は、前記改変及び／又は領域を本明細書で記載したように独立にアッセイした場合に
は検出不能である、新規特性を示す本技術分野で公知のアミノ酸改変と選択されたＩｇＧ
領域との組合せを有する変異型Ｆｃ領域を包含する。
複数のＩｇＧアイソタイプ、及びそのドメインの機能特性は、本技術分野では周知であ
る。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のアミノ酸配列を、図１Ａ、１Ｂに示す
。本発明の方法に用いる特定のＩｇＧアイソタイプに由来する２つ以上のドメインの選択
及び／又は組合せは、ＦｃγＲに対する親和性を含め、親アイソタイプのいずれかの既知
パラメーターに基づいてよい（表７：Ｆｌｅｓｃｈら，（２０００），Ｆｕｎｃｔｉｏｎ
ｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ
Ｇ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．，１４：１４１−１５６；Ｃｈａｐｐｅｌら，
（１９９３），Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｆｃ
Ｇａｍｍａ ＲＩ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｗｉｔｈｉｎ Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌ
ｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，３３：２５１２４−２５１３１；Ｃｈａｐｐｅｌら，（１９９１），Ｉｄｅ
ｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｃ Ｇａｍｍａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｌａ
ｓｓ Ｉ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｉｎ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｔ
ｈｅ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ Ｈｙｂｒｉｄ Ａ
ｎｄ Ｐｏｉｎｔ−Ｍｕｔａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：９０３６−９０４０；これらはいずれも参照することによ
りその全体を本明細書中に組み入れる）。例えば、ＦｃγＲＩＩＢへの限定された結合を
示すか、又は結合を示さない、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４などのＩｇＧアイソタイプに由来す
る領域又はドメインの使用は、活性化受容体への結合を最大にし、抑制性受容体への結合
を最小にするようにダイアボディを操作することが望まれる場合に、特に有用であること
がある。同様に、Ｃ１ｑ又はＦｃγＲＩＩＩＡと優先的に結合することが知られる、例え
ばＩｇＧ３（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら，（１９８７），Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｏｆ Ｔ
ｈｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏ
ｂｕｌｉｎｓ Ｕｓｉｎｇ Ａ Ｍａｔｃｈｅｄ Ｓｅｔ Ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６６：１３５１−１３６１）などのＩｇ
Ｇアイソタイプに由来するＦｃ領域又はドメインの使用は、ＡＤＣＣを増強することが本
技術分野で知られるＦｃアミノ酸改変と組み合わせて、補体活性化又はＡＤＣＣなどのエ
フェクター機能活性が最大となるようにダイアボディ分子を操作してもよい。
Figure 2015157833
５．３．分子結合体
本発明のダイアボディ分子を、異種ポリペプチド（即ち、関連性のないポリペプチド、
又はその一部、好ましくはそのポリペプチドの少なくとも１０、少なくとも２０、少なく
とも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なく
とも８０、少なくとも９０又は少なくとも１００アミノ酸）と、組換えによって融合させ
て、又は化学的に結合（共有結合、非共有結合の両方を含む）させて、融合タンパク質を
作製することができる。融合は、必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を介し
ても起こり得る。
更に、本発明のダイアボディ分子（即ち、ポリペプチド）を、治療薬又は所定の生物学
的応答を改変する薬剤成分と結合させてもよい。直接的な結合に代わるものとして、本発
明の多価、例えば、四価、のダイアボディ分子上の複数のエピトープ結合部位により、ダ
イアボディの少なくとも１つの結合領域は、ダイアボディの結合に影響することなく、治
療薬又は所望の薬剤成分と結合するように設計してもよい。
治療薬又は薬剤成分は、古典的な化学治療薬に限定されるとは限らない。例えば、薬剤
成分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質又はポリペプチドであってもよい。この
ようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素（即ち、ＰＥ−
４０）又はジフテリア毒素等の毒素、リシン、ゲロニン及びヤマゴボウ抗ウイルスタンパ
ク質、腫瘍壊死因子、αインターフェロン（ＩＦＮ−α）及びβインターフェロン（ＩＦ
Ｎ−β）を含むがこれらに限定はしないインターフェロン、神経成長因子（ＮＧＦ）、血
小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、アポトー
シス剤（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、国際公開ＷＯ９７／３３８９９号に記載のＡ
ＩＭ−Ｉ）、ＡＩＭ−ＩＩ（国際公開ＷＯ９７／３４９１１号参照）、Ｆａｓリガンド及
びＶＥＧＩ（国際公開ＷＯ９９／２３１０５号）などのタンパク質、血栓剤又は血管新生
阻害剤（例えば、アンジオスタチン又はエンドスタチン）、又は例えばリンホカイン（例
えば、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）
、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「
ＧＭ−ＣＳＦ」）、及び顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」））、マクロファージ
コロニー刺激因子（「Ｍ−ＣＳＦ」）、又は成長因子（例えば、成長ホルモン（「ＧＨ」
））のような生物学的応答改変物質、プロテアーゼ、及びリボヌクレアーゼが挙げられる
。
本発明のダイアボディ分子（即ち、ポリペプチド）を、精製を容易にするためにペプチ
ドなどのマーカー配列と融合させることができる。マーカーアミノ酸配列は、その多くが
が市販されており、好ましい実施形態においては、例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥ
Ｎ，Ｉｎｃ．，９２５９，Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１
３１１）に提供されるタグなどの、ヘキサ−ヒスチジンペプチドである。Ｇｅｎｔｚら，
（１９８９），Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｆｏｒ Ｔｒａｎｓ−Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｕｓｉ
ｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ
ＴＡＴ−Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｔｒａｎｓ−Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｒｅ
ｑｕｉｒｅｓ ｍＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ，８６：８２１−８２４に記載されているように、例えば、ヘキサ−ヒスチジン
は融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグには、これら
に限定されないが、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに相当する
赤血球凝集素「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら，（１９８４），Ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ Ｏｆ Ａｎ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ Ｉｎ Ａ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ，Ｃｅｌｌ，３７：７６７−７７８）、及び「ｆｌａｇ」タグ（Ｋｎａｐｐｉｋら，
（１９９４），Ａｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｔａｇ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ
Ｔｈｅ ＦＬＡＧ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａ
ｇｍｅｎｔｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７（４）：７５４−７６１）が含まれる
。
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソ
ンシャッフリング及び／又はコドンシャッフリング（正確には「ＤＮＡシャッフリング」
と呼ばれる）の技術により産生してもよい。ＤＮＡシャッフリングを使用して、本発明の
分子の活性を変えてもよい（例えば、より高い親和性とより低い解離速度を持ったエピト
ープ結合部位）。一般には、米国特許第５，６０５，７９３号、第５，８１１，２３８号
、第５，８３０，７２１号、第５，８３４，２５２号及び第５，８３７，４５８号、Ｐａ
ｔｔｅｎら、（１９９７），Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｏｆ ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌｉ
ｎｇ Ｔｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｃｕｒｒ．
Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８：７２４−７３３；Ｈａｒａｙａｍａ，（
１９９８），Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｂｙ ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌ
ｉｎｇ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：７６−８２；Ｈａｎｓｓｏｎら
，（１９９９），Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｕｂｓｔｒ
ａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ Ｉｎ Ｍｕ Ｃｌａｓｓ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ
ｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ Ｐｒｏｂｅｄ Ｂｙ ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−２７６；及びＬｏｒｅｎｚｏら，（１９９８），
ＰＣＲ−Ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ
Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｇｅｎｅｓ Ｃｌｏｎｅｄ Ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
Ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２４：３０８−
３１３（これら特許及び文献のそれぞれを参照することによりその全体を本明細書中に組
み入れる）を参照。本発明のダイアボディ分子、又は本発明の分子をコードする核酸は、
エラープローンＰＣＲ法、ランダムヌクレオチド挿入法又は他の方法を用いたランダム変
異誘発により、組換え前に更に改変されてもよい。本発明の分子をコードするポリヌクレ
オチドの１つ以上の部分を、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、セクショ
ン、部分、ドメイン、断片等と組み換えてもよい。
本発明はまた、診断薬若しくは治療薬、又は他の血中半減期の増加／減少が望まれる分
子及び／又は細胞の特定の部分集合を標的とするいずれかの分子と結合した、又はそれら
を免疫特異的に認識する本発明のダイアボディ分子を包含する。本発明の分子を診断に使
用して、例えば、疾患、障害、又は感染の発生若しくは進行を臨床試験の一環としてモニ
ターして、例えば、所定の治療計画の効果を測定することができる。本発明の分子を検出
可能な物質と結合させることにより、又は検出可能な物質を免疫特異的に認識する分子に
より、検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、各種酵素、補欠分
子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放出金属、及び非放射性
常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能な物質は、本発明の分子と直接的に、又は媒介
物質（例えば、本技術分野で公知のリンカー）を介して間接的に、本技術分野で公知の技
術を用いて連結又は結合してもよく、あるいは、分子が検出可能な物質を免疫特異的に認
識する、即ち、前記物質と免疫特異的に結合してもよい。例えば、本発明による診断薬と
して用いるための抗体と結合させることができる金属イオンについては、米国特許第４，
７４１，９００号を参照。このような診断及び検出は、検出可能な物質を免疫特異的に認
識するように該分子を設計するか、又は本発明の分子を検出可能な物質と連結することに
より、達成することができ、検出可能な物質としては、非限定的に、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステ
ラーゼなどを含む各種酵素；非限定的に、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／
ビオチンなどの補欠分子族複合体；非限定的に、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フ
ルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセ
イン、塩化ダンシル、又はフィコエリトリンなどの蛍光物質；非限定的に、ルミノールな
どの発光物質；非限定的に、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンなどの生物発
光物質；非限定的に、ビスマス（２１３Ｂｉ）、炭素（１４Ｃ）、クロム（５１Ｃｒ）、
コバルト（５７Ｃｏ）、フッ素（１８Ｆ）、ガドリニウム（１５３Ｇｄ、１５９Ｇｄ）、
ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、ゲルマニウム（６８Ｇｅ）、ホルミウム（１６６Ｈｏ
）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１３１
Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、ランタン（１４０Ｌａ）、ルテチウム（１７７Ｌ
ｕ）、マンガン（５４Ｍｎ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、亜
リン酸（３２Ｐ）、プラセオジム（１４２Ｐｒ）、プロメチウム（１４９Ｐｍ）、レニウ
ム（１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ）、ロジウム（１０５Ｒｈ）、ルテニウム（９７Ｒｕ）、サ
マリウム（１５３Ｓｍ）、スカンジウム（４７Ｓｃ）、セレン（７５Ｓｅ）、ストロンチ
ウム（８５Ｓｒ）、硫黄（３５Ｓ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ
）、スズ（１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ）、トリチウム（３Ｈ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、
イッテルビウム（１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ）、イットリウム（９０Ｙ）、亜鉛（６５Ｚｎ
）などの放射性物質；様々な陽電子放射断層撮影に用いられる陽電子放出金属、並びに非
放射性常磁性金属イオンを挙げることができるが、これらに限定されない。
本発明のダイアボディ分子は、細胞毒素（例えば、細胞増殖阻害剤又は殺細胞剤）、治
療剤、又は放射性元素（例えば、α放射体、γ放射体など）のような治療成分を免疫特異
的に認識するか、又はそれと結合してよい。細胞毒素又は細胞毒性剤には細胞に有害な薬
剤も包含される。その例として、パクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ
、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチ
ン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアン
スラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒド
ロテストステロン、糖コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラ
ノロール及びプロマイシン、及びそれらの類似体又は同族体が挙げられる。治療剤として
は、これらに限定されないが、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプ
トプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン）、ア
ルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルム
スチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、
ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ及びシスジクロロジアミ
ン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン類（例えば、ダウノルビ
シン（かつてのダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗体（例えば、ダクチノマイシ
ン（かつてのアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアンスラマイ
シン（ＡＭＣ）、並びに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）
が挙げられる。
更に、本発明のダイアボディ分子は、治療成分、例えば放射性物質又は放射性金属イオ
ンと結合させるのに有用な大環状キレート剤と結合させるか、又はそれを免疫特異的に認
識するように設計することができる（放射性物質の例は上記を参照）。ある実施形態では
、大環状キレート剤は、リンカー分子を介してポリペプチドに結合することのできる１，
４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯ
ＴＡ）である。リンカー分子は、本技術分野で周知であり、Ｄｅｎａｒｄｏら，（１９９
８），Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｏｆ １，４，７，１０−Ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄ
ｏｄｅｃａｎｅ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−Ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ（Ｄ
ＯＴＡ）−Ｐｅｐｔｉｄｅ−ＣｈＬ６，Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅ Ｗｉｔｈ Ｃａｔａｂｏｌｉｚａｂｌｅ Ｌｉｎｋｅｒ，Ｔｏ ２−Ｉｍｉｎｏｔｈ
ｉｏｌａｎｅ−２−［ｐ−（ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｂｅｎｚｙｌ］−ＤＯＴＡ
−ＣｈＬ６ Ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ，Ｃｌｉｎ．Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４：２４８３−２４９０；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら，（１９９９），
Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｒａｄ
ｉｏｌａｂｅｌｓ Ｆｒｏｍ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ
． Ｃｈｅｍ．，１０：５５３−；及びＺｉｍｍｅｒｍａｎら，（１９９９），Ａ Ｔｒ
ｉｇｌｙｃｉｎｅ Ｌｉｎｋｅｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｔｕｍｏｒ Ｕｐｔａｋｅ Ａｎ
ｄ Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ Ｏｆ ６７−Ｃｕ−Ｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉ
−Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍＡｂ ｃｈＣＥ７ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎ
ｔｓ，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，２６：９４３−９５０に記載されており、これら
はいずれも参照することによりその全体を本明細書中に組み入れる。
前記治療成分を、例えばＦｃドメインを含めて、ポリヌクレオチドに結合させる方法は
周知である。例えば、Ａｒｎｏｎら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆ
ｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈ
ｅｒａｐｙ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔ
ｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編），１９８５，２４３−５６頁，Ａｌａｎ Ｒ．
Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ
Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版），
Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編），１９８７，６２３−５３頁，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，
Ｉｎｃ．；Ｔｈｏｒｐｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘ
ｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ，Ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ‘８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編），１９８５，４７５
−５０６頁；Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅ
ｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂ
ｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔ
ｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎら（編），１９８５，３０３−１６頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ；及びＴｈｏｒｐｅら（１９８２），Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａ
ｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉ
ｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−１５８を参照。
本発明のダイアボディ分子は、当該分子と結合した治療成分と共に若しくは治療成分な
しで投与してもよいし、単独で投与してもよいし、又は治療処置用の細胞毒性因子及び／
又はサイトカインと組み合わせて投与してもよい。単独で投与する場合、多価の、例えば
四価の、ダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープは、治療薬、例えば、細胞毒性
因子及び／又はサイトカインを免疫特異的に認識するように設計してもよく、この治療薬
は、本発明の分子と同時に、又はそれに続いて投与してもよい。このように、ダイアボデ
ィ分子は、直接的な結合と類似した方法で治療薬を特異的に標的としてもよい。あるいは
また、本発明の分子を抗体に結合させて、Ｓｅｇａｌの米国特許第４，６７６，９８０号
に記載されているように、抗体ヘテロ結合体を形成させることができる。この文献は、参
照することにより全体を本明細書中に組み入れる。本発明のダイアボディ分子はまた、固
相支持体に結合させてもよく、特に標的抗原の免疫分析又は精製に有用である。このよう
な固相支持体としては、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチ
レン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンが挙げられるが、これらに限定はされない。
５．４．ダイアボディ分子の結合の特徴付け
本発明のダイアボディ分子の特徴付けは各種方法で行ってよい。特に、本発明の分子は
、例えばＦｃＲＩＩＩＡ若しくはＦｃＲＩＩＢなどの抗原に免疫特異的に結合する能力に
ついて、又は当該分子がＦｃドメイン（若しくはその一部）を含む場合には、Ｆｃ−Ｆｃ
γＲ相互作用、即ち、Ｆｃドメイン（若しくはその一部）のＦｃγＲへの特異的結合、を
示す能力について、アッセイしてもよい。そのようなアッセイは、溶液中（例えば、Ｈｏ
ｕｇｈｔｅｎ，（１９９２），Ｔｈｅ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｉｄｅｎｔ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＢｉｏＴｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ，１３：４１２−４２１）、ビーズ上（Ｌａｍ，（１９９１），Ａ Ｎｅｗ
Ｔｙｐｅ Ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｆｏｒ Ｉｄ
ｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｎａｔｕｒｅ
，３５４：８２−８４，チップ上（Ｆｏｄｏｒ，（１９９３），Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓ Ｗｉｔｈ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｉｐ
ｓ，Ｎａｔｕｒｅ，３６４：５５５−５５６）、細菌上（米国特許第５，２２３，４０９
号）、胞子上（米国特許第５，５７１，６９８号、第５，４０３，４８４号及び第５，２
２３，４０９号）、プラスミド上（Ｃｕｌｌら，（１９９２），Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｆ
ｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｕｓｉｎｇ Ｌａｒｇｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅ
ｓ Ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｌｉｎｋｅｄ Ｔｏ Ｔｈｅ Ｃ Ｔｅｒｍｉｎｕｓ Ｏ
ｆ Ｔｈｅ Ｌａｃ Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８９：１８６５−１８６９）、又はファージ上（Ｓｃｏｔｔら，（１９９０），Ｓ
ｅａｒｃｈｉｎｇ Ｆｏｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｗｉｔｈ Ａｎ Ｅｐｉ
ｔｏｐｅ Ｌｉｂｒａｒｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，
（１９９０），Ｒａｎｄｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ Ｓｏｕｒｃｅ
Ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら，（１９９０），Ｐｅｐｔｉｄ
ｅｓ Ｏｎ Ｐｈａｇｅ：Ａ Ｖａｓｔ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｆ
ｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８−６３８２；及びＦｅｌｉｃｉ，（１９９１），Ｓｅｌｅｃ
ｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｆｒｏｍ Ａ Ｌａｒｇｅ Ｌｉ
ｂｒａｒｙ Ｏｆ Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｏｎ Ａ Ｍｕ
ｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，
２２２：３０１−３１０）（これらの文献のそれぞれは、参照することによりその全体を
本明細書中に組み入れる）で実施することができる。例えばＦｃγＲＩＩＩＡなどの抗原
に免疫特異的に結合することが同定された分子は、その後、抗原に対する特異性及び親和
性についてアッセイすることができる。
複数のエピトープ結合ドメインを有するように遺伝子操作された本発明の分子は、１つ
以上の抗原（例えば、癌抗原）に対する免疫特異的な結合性及び他の抗原（例えば、Ｆｃ
γＲ）との交差反応性について、又はその分子がＦｃドメイン（若しくはその一部）を含
む場合にはＦｃ−ＦｃγＲ相互作用について、本技術分野で公知のいずれかの方法によっ
て分析してもよい。免疫特異的結合、交差反応性、及びＦｃ−ＦｃγＲ相互作用を解析す
るために用いることができるイムノアッセイ法としては、これらに限定されないが、ウェ
スタンブロット法、ラジオイムノアッセイ法、ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着解析法）
、「サンドイッチ」イムノアッセイ法、免疫沈降アッセイ法、沈降反応、ゲル拡散沈降反
応、免疫拡散アッセイ法、凝集アッセイ法、補体結合アッセイ法、イムノラジオメトリッ
ク法、蛍光イムノアッセイ法、プロテインＡイムノアッセイ法などをほんの数例として、
これらの技術を用いた競合及び非競合アッセイ系が挙げられる。これらの分析法は、本技
術分野では日常的に行われており、周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４
，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
第１巻，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照。これは
参照することによりその全体を本明細書中に組み入れる）。
抗原−結合ドメインの相互作用、又はＦｃ−ＦｃγＲ相互作用の結合親和性及び解離速
度を競合結合アッセイ法によって測定することができる。競合結合アッセイ法の一例とし
て、標識された抗原、例えば四量体ＦｃγＲ（例えば、３Ｈ又は１２５Ｉ、セクション５
．４．１を参照）と対象の分子（例えば、複数のエピトープ結合ドメインを含む本発明の
分子）とを、四量体ＦｃγＲ（セクション５．４．１を参照）のような未標識エピトープ
の存在量を増加していきながら、インキュベートし、標識抗原に結合した該分子を検出す
ることを含む、ラジオイムノアッセイ法がある。抗原に対する本発明の分子の親和性及び
結合解離速度は、スキャッチャード分析法による飽和データから測定することができる。
抗原又はＦｃγＲに対する本発明の分子の親和性及び結合特性は、初めに抗原−結合ド
メイン又はＦｃ−ＦｃγＲ相互作用について本技術分野で公知の、これらに限定されない
が、ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴解析法、免疫沈降アッセイ法を含む、インビトロ
アッセイ法（生化学又は免疫学に基づくアッセイ法）を用いて測定してもよい。また、好
ましくは、本発明の分子の結合特性は、セクション５．４．２に記載したような１つ以上
のＦｃγＲ介在エフェクター細胞機能を測定するためのインビトロ機能アッセイ法によっ
て特徴付けされる。最も好ましい実施形態においては、本発明の分子は、インビトロアッ
セイに基づく結合特性と同様の結合特性を、インビボモデル（例えば、本明細書で記載し
、かつ開示したもの）でも有する。しかし、本発明は、インビトロアッセイでは所望の表
現型を示さないが、インビボアッセイでは所望の表現型を示す本発明の分子を排除するも
のではない。
いくつかの実施形態では、複数のエピトープ結合ドメイン、及び場合によりＦｃドメイ
ン（若しくはその一部）を有する分子のスクリーニング及び同定は、機能に基づくアッセ
イ法、好ましくは高速処理能力を持つ方法で行われる。機能に基づくアッセイ法は、例え
ば、本明細書中のセクション５．４．２及び５．４．３に記載されているような、１つ以
上のＦｃγＲ介在エフェクター細胞機能を特徴付けるための本技術分野で公知のいずれか
アッセイ法とすることができる。本発明の方法により使用できるエフェクター細胞機能の
非限定的な例として、抗体依存性細胞介在性細胞障害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性食作用、
食作用、オプソニン化、オプソニン食作用、細胞結合性、ロゼット形成、Ｃ１ｑ結合、及
び補体依存性細胞介在性細胞毒性が挙げられる。ただし、これらに限定されない。
好ましい実施形態では、バイアコア動態解析を使用して、抗原又はＦｃγＲに対する本
発明の分子の結合速度及び解離速度を測定する。バイアコア動態解析は、不動化された分
子（例えば、それぞれエピトープ結合ドメイン又はＦｃドメイン（若しくはその一部）を
有する分子）をその表面上に有するチップ上からの抗原又はＦｃγＲの結合と解離を解析
することを有する。バイアコア解析については、セクション５．４．３で説明する。
好ましくは、当業者に公知のいずれかの技術を用いた蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ
）を、本発明の分子を特徴付けするための免疫学又は機能に基づくアッセイ法に使用する
。フローソーターは、本発明の分子によって結合された、例えば、オプソニン化された多
数の細胞を個別に、かつ迅速に調べることができる（例えば、１時間あたり１０００万〜
１億個の細胞）（Ｓｈａｐｉｒｏら、（１９９５），Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃ
ｙｔｏｍｅｔｒｙ）。更に、ダイアボディの挙動を最適化するのに使用される特定のパラ
メーターには、これらに限定されないが、抗原濃度（即ち、ＦｃγＲ四量体複合体、セク
ション５．４．１を参照）、動態競合時間、又はＦＡＣＳストリンジェンシーが含まれ、
これらをそれぞれ変化させて、特異的な結合特性、例えば、複数のエピトープへの同時結
合、を示す本発明の分子を有するダイアボディ分子を選択することができる。生体細胞を
分類し、調べるフローサイトメーターは、本技術分野では周知である。公知のフローサイ
トメーターは、例えば、米国特許第４，３４７，９３５号、第５，４６４，５８１号、第
５，４８３，４６９号、第５，６０２，０３９号、第５，６４３，７９６号及び第６，２
１１，４７７号に記載されており、これらの全ての内容は、参照することにより本明細書
中に組み込まれる。他の公知のフローサイトメーターには、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎ
ｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙより市販されているＦＡＣＳ ＶａｎｔａｇｅＴＭシス
テム、及びＵｎｉｏｎ Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａより市販されているＣＯＰＡＳＴＭシステ
ムがある。
標的抗原結合親和性又はＦｃ−ＦｃγＲ結合親和性の特徴付け、及び細胞表面上の標的
抗原密度又はＦｃγＲ密度の評価は、本技術分野で周知の方法、例えばスキャッチャード
解析法などにより、又は製造者の説明書に従ったキットの使用、例えばＱｕａｎｔｕｍＴ
Ｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ（Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒは登録商標）（
Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＩＮ）の使用によ
り、行うことができる。１つ以上の機能アッセイは、当業者に公知の又は本明細書中に記
載したような１つ以上のＦｃγＲ介在エフェクター細胞機能を特徴付けるための本技術分
野で公知のいずれのアッセイ法でもよい。具体的な実施形態では、複数のエピトープ結合
ドメイン、及び場合によりＦｃドメイン（若しくはその一部）を有する本発明の分子は、
１つ以上の標的抗原又は１つ以上のＦｃγＲ、例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩ
Ａ、ＦｃγＲＩＩＡ、への結合についてＥＬＩＳＡアッセイ法でアッセイされ、続いて１
つ以上のＡＤＣＣアッセイでアッセイされる。いくつかの実施形態では、本発明の分子は
、更に表面プラズモン共鳴に基づいたアッセイ法、例えばバイアコアを用いてアッセイさ
れる。表面プラズモン共鳴に基づいたアッセイは、本技術分野では周知であるが、セクシ
ョン５．４．３で更に説明し、本明細書中でも例えば実施例６．１において例証される。
最も好ましい実施形態では、複数のエピトープ結合ドメイン、及び場合によりＦｃドメ
イン（若しくはその一部）を有する本発明の分子は、更に標的抗原（例えばＦｃγＲ）と
の相互作用又はＦｃ−ＦｃγＲ相互作用について動物モデルで特徴付けされる。Ｆｃ−Ｆ
ｃγＲ相互作用をアッセイする場合、本発明の方法で使用する上で好ましい動物モデルは
、例えば、ヒトＦｃγＲを発現するトランスジェニックマウス、例えば米国特許第５，８
７７，３９７号及び第６，６７６，９２７号に記載されているいずれかのマウスモデルで
ある。これらの文献は、参照することによりその全体を本明細書中に組み入れる。更に、
このような方法に使用されるトランスジェニックマウスには、これらに限定されないが、
ヒトＦｃγＲＩＩＩＡを担持しているＦｃγＲＩＩＩＡノックアウトヌードマウス、ヒト
ＦｃγＲＩＩＡを担持しているＦｃγＲＩＩＩＡノックアウトヌードマウス、ヒトＦｃγ
ＲＩＩＢ及びヒトＦｃγＲＩＩＩＡを担持しているＦｃγＲＩＩＩＡノックアウトヌード
マウス、ヒトＦｃγＲＩＩＢ及びヒトＦｃγＲＩＩＡを担持しているＦｃγＲＩＩＩＡノ
ックアウトヌードマウス、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＡを担持しているＦｃ
γＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＡノックアウトヌードマウス、並びにヒトＦｃγＲＩＩＩ
Ａ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢを担持しているＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩ
Ａ及びＦｃγＲＩＩＢノックアウトヌードマウスが挙げられる。
５．４．１．ＦｃγＲを有する結合アッセイ
Ｆｃドメイン（若しくはその一部）を有する、及び／又はＦｃγＲに特異的なエピトー
プ結合ドメインを有する分子によるＦｃγＲへの結合の特徴付けは、これに限定されない
がＦｃγＲの多型変異体を含め、ＦｃγＲのいずれを使用して行ってもよい。いくつかの
実施形態では、１５８位にフェニルアラニンを含むＦｃγＲＩＩＩＡの多型変異体が使用
される。他の実施形態では、１５８位にバリンを含むＦｃγＲＩＩＩＡの多型変異体を用
いて特徴付けが行われる。ＦｃγＲＩＩＩＡ １５８Ｖは、ＩｇＧ１に対する親和性が１
５８Ｆよりも高く、及びＡＤＣＣ活性が増加されている（例えば、Ｋｏｅｎｅら，（１９
９７），Ｆｃ ｇａｍｍａＲＩＩＩａ−１５８Ｖ／Ｆ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｉｎ
ｆｌｕｅｎｃｅｓ Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｏｆ ＩｇＧ Ｂｙ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋ
ｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｆｃ ｇａｍｍａＲＩＩＩａ，Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ Ｏ
ｆ Ｔｈｅ Ｆｃ ｇａｍｍａＲＩＩＩａ−４８Ｌ／Ｒ／Ｈ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，Ｂｌ
ｏｏｄ，９０：１１０９−１４；Ｗｕら．（１９９７），Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｐｏｌｙｍｏ
ｒｐｈｉｓｍ Ｏｆ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）Ａｌｔｅｒｓ Ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｅｓ Ｔｏ Ａｕｔｏｉｍｍｕ
ｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：１０５９−７０参照、
両者は参照することによりその全体を本明細書中に組み入れる）。この残基は、実際Ｉｇ
Ｇ１の下部ヒンジ領域と直接相互作用することが、ＩｇＧ１−ＦｃγＲＩＩＩＡの共結晶
化研究によって最近明らかにされた。例えば、Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら，（２０００），
Ｔｈｅ ３．２−Ａ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ
ＩｇＧ１ Ｆｃ Ｆｒａｇｍｅｎｔ−Ｆｃ ｇａｍｍａＲＩＩＩ ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｎ
ａｔｕｒｅ，４０６（６７９３）：２６７−２７３を参照。この文献は参照することによ
りその全体を本明細書中に組み入れる。研究により、いくつかのケースにおいて、治療用
抗体はＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖホモ接合患者で向上した効果を有することが明らかと
なった。例えば、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａ
ｂ）は、ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆホモ接合患者と比べてＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖ
ホモ接合患者で、より治療効果が高かった（例えば、Ｃａｒｔｒｏｎら，（２００２），
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｏｆ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉ−Ｃ
Ｄ２０ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
Ｉｎ ＩｇＧ Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩＡ Ｇｅｎｅ，Ｂｌ
ｏｏｄ，９９（３）：７５４−７５８を参照）。他の実施形態では、この領域を有する治
療用分子はまた、ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖ及びＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆに関して
ヘテロ接合の患者において、並びにＦｃγＲＩＩＩＡ−１３１Ｈをもつ患者でも、効果的
であり得る。特定の作用機序に限定するものではないが、別のアロタイプを用いた本発明
の分子の選択は、一旦治療用ダイアボディに遺伝子操作されたならば、そのようなアロタ
イプについてホモ接合性の患者に対して臨床的により効果があると思われる変異体を提供
することができる。
ＦｃγＲ結合アッセイは、本発明の分子とＦｃγＲとの結合を測定するために、特に、
ＦｃドメインとＦｃγＲとの結合を測定するために開発された。このアッセイ法により、
リガンドに対する受容体の親和性が本質的に弱くても、例えばＦｃγＲＩＩＢとＦｃγＲ
ＩＩＩＡがマイクロモルの範囲であっても、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用の検出及び定量が可
能となった。この方法は、国際公開ＷＯ０４／０６３３５１号及び米国特許出願公開第２
００５／００３７０００号及び第２００５／００６４５１４号にその詳細が記載されてお
り、いずれも参照することによりその全体を本明細書に組み入れる。簡単に言えば、この
方法は、本技術分野で公知の標準的なイムノアッセイ法のいずれか、例えばＦＡＣＳ、Ｅ
ＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴などで追跡することができるＦｃγＲ複合体の形成を含む
。更に、ＦｃγＲ複合体は、複合体形成していないＦｃγＲと比較して、Ｆｃ領域に対し
て改善された結合活性を有している。本発明によれば、好ましい分子複合体は四量体の免
疫複合体であり、この免疫複合体は、（ａ）ＦｃγＲの可溶性領域（例えば、ＦｃγＲＩ
ＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ又はＦｃγＲＩＩＢの可溶性領域）、（ｂ）ＦｃγＲの可溶性領
域（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ又はＦｃγＲＩＩＢの可溶性領域）のＣ
末端に機能し得るように連結されたビオチン化１５アミノ酸ＡＶＩＴＡＧ配列（ＡＶＩＴ
ＡＧ）、及び（ｃ）ストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡ−ＰＥ）を、四量体Ｆ
ｃγＲ複合体を形成するモル比で（好ましくは５：１のモル比で）有する。この融合タン
パク質は、例えば１５アミノ酸ＡＶＩＴＡＧ配列中のリジン残基を特異的にビオチン化す
る大腸菌ビオチンリガーゼＢｉｒＡ酵素を用いて、酵素的にビオチン化されている。ビオ
チン化された可溶性ＦｃγＲタンパク質を、その後、四量体ＦｃγＲ複合体を形成させる
ためにＳＡ−ＰＥと、１×ＳＡ−ＰＥ：５×ビオチン化可溶性ＦｃγＲのモル比で混合す
る。
Ｆｃ領域を有するポリペプチドは、単量体の非複合ＦｃγＲよりも少なくとも８倍高い
親和性で四量体ＦｃγＲ複合体と結合することがわかった。Ｆｃ領域を有するポリペプチ
ドの四量体ＦｃγＲ複合体への結合性は、当業者に公知の標準的な技術、例えば蛍光活性
化細胞選別法（ＦＡＣＳ）、ラジオイムノアッセイ法、ＥＬＩＳＡ法などを用いて測定し
てもよい。
本発明は、細胞系又は無細胞系のアッセイでＦｃ領域を有する分子の機能性を測定する
ための、上記方法により形成される本発明の分子を有する免疫複合体の使用を包含する。
便宜上、試薬は、アッセイキットで、即ちＦｃγＲ四量体複合体と結合するＦｃ領域を
有する分子の能力をアッセイするためにパッケージされた試薬の組合せで提供されてもよ
い。Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用を測定するのに使用する分子複合体の他の形態は、本発明の
方法での使用も考慮されている。例えば、２００３年１月１３日出願の米国仮出願第６０
／４３９，７０９号（これは参照することによりその全体を本明細書に組み入れる）に記
載されているように形成された融合タンパク質が挙げられる。
５．４．２．変異型重鎖をもつ分子の機能性アッセイ
本発明は、複数のエピトープ結合ドメインと、場合によりＦｃドメイン（又はその一部
）とを有する本発明の分子を、該分子のエフェクター細胞機能を同定するための当業者に
公知のアッセイ法を使用して、特徴付けることを包含する。特に、本発明は、本発明の分
子を、ＦｃγＲ介在エフェクター細胞機能について特徴付けることを包含する。更に、本
発明のダイアボディ分子の標的抗原の少なくとも１つがＦｃγＲである場合、ダイアボデ
ィ分子によるＦｃγＲの結合は、ＦｃγＲ−Ｆｃ結合により活性化される経路と類似した
ＦｃγＲ介在経路を活性化するのに役立ちうる。このように、ダイアボディ分子の少なく
とも１つのエピトープ結合ドメインがＦｃγＲを認識する場合には、ダイアボディ分子は
、Ｆｃドメイン（又はその一部）を有することなく、又は付随するＦｃ−ＦｃγＲ結合な
しに、ＦｃγＲ介在エフェクター細胞機能を誘発することができる。本発明によりアッセ
イすることができるエフェクター細胞機能の例として、これらに限定されないが、抗体依
存性細胞介在性細胞障害、食作用、オプソニン化、オプソニン食作用、Ｃｌｑ結合、及び
補体依存性細胞介在性細胞障害が挙げられる。エフェクター細胞機能活性を判定するため
に、当業者に公知の細胞ベース又は無細胞系アッセイのいずれも使用することができる（
エフェクター細胞アッセイについては、以下を参照：Ｐｅｒｕｓｓｉａら，（２０００）
，Ａｓｓａｙｓ Ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉ
ａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＡＤＣＣ）Ａｎｄ Ｒｅｖｅｒｓｅ ＡＤＣＣ（
Ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）Ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｎａｔｕｒａｌ
Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２１：１７９−
９２；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉら，（１９８８），Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｓ Ｆｏ
ｒ Ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ
Ｔｈａｔ Ｍｏｄｕｌａｔｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｈａｇｏｃｙｔｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｅ
ｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，４４（１０）：８４１−８４８；Ｌｅｈｍａｎｎら，（２０００
），Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｂｙ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍ
ｅｔｒｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４３（１−２）：２２９−４２；Ｂ
ｒｏｗｎ，（１９９４），Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｓｓａｙｓ Ｏｆ Ｐｈａｇｏｃｙｔｉ
ｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｌｅｕ
ｋｏｃｙｔｅｓ：Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｓｉｇｎａｌ Ｔ
ｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，４５：１４７−６４
；Ｍｕｎｎら，（１９９０），Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ Ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ
ｓ Ｂｙ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉ
ｎａｎｔ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｃｏｌｏｎｙ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏ
ｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７２：２３１−２３７，Ａｂｄｕｌ−Ｍａｊｉｄら，（２
００２），Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ａｒｅ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｆｏｒ Ａｕｔｏｉ
ｍｍｕｎｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄａｍａｇｅ Ｔｏ Ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ
Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕ
ｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５５
：７０−８１；Ｄｉｎｇら，（１９９８），Ｔｗｏ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒｓ Ｂｉｎｄ Ｉｎ Ａ Ｓｉｍｉｌａｒ Ｄｉａｇｏｎａｌ Ｍｏｄｅ Ｔ
ｏ Ｔｈｅ ＨＬＡ−Ａ２／Ｔａｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｕｓｉｎｇ Ｄ
ｉｆｆｅｒｅｎｔ ＴＣＲ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，８：４０３−
４１１。これらはいずれも参照することによりその全体を本明細書中に組み入れる）。
一つの実施形態では、本発明の分子をヒト単球でＦｃγＲ介在食作用についてアッセイ
することができる。あるいはまた、本発明の分子のＦｃγＲ介在食作用をその他の食細胞
、例えば、当業者に知られた標準的手順を使用して取得することができる、好中球（多形
核白血球；ＰＭＮ）、ヒト末梢血単球、単球由来マクロファージでアッセイすることもで
きる（例えば、Ｂｒｏｗｎ，（１９９４），Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｓｓａｙｓ Ｏｆ Ｐ
ｈａｇｏｃｙｔｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂ
ｌｏｏｄ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ：Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ａｎｄ
Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，４
５：１４７−１６４参照）。一つの実施形態では、本発明の分子の機能を、上述された方
法により、フルオレセイン化ＩｇＧ−オプソニン化ヒツジ赤血球細胞（ＳＲＢＣ）を貪食
するＴＨＰ−１細胞の能力を測定することによって、特徴付ける（Ｔｒｉｄａｎｄａｐａ
ｎｉら，（２０００），Ｔｈｅ Ａｄａｐｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＡＴ Ｅｎｈａｎ
ｃｅｓ Ｆｃｇａｍｍａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａ
ｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｉｎ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２７５：２０４８０−２０４８７）。
本発明の分子の食作用を判定するための別の例示的なアッセイ法は、抗体依存性オプソ
ニン食作用アッセイ（ＡＤＣＰ）であり、これは以下を含むことができる：大腸菌−標識
ＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）又は黄色ブドウ球菌−ＦＩＴＣなどの標
的生体粒子を、（ｉ）ＦｃγＲ依存性ＡＤＣＰに対する対照抗体としてのフルオレセイン
に対する抗体である野生型４−４−２０抗体（Ｂｅｄｚｙｋら，（１９８９），Ｃｏｍｐ
ａｒｉｓｏｎ Ｏｆ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅｓ Ｗｉｔｈｉｎ Ａｎ Ａｎｔｉ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｉｄｉｏｔｙｐｅ
Ｆａｍｉｌｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４（３）：１５６５−１５６９参照、
全内容を参照することにより本明細書に組み入れる）、又は（ｉｉ）ＦｃγＲ依存性ＡＤ
ＣＰに対するバックグラウンド対照としてのＦｃγＲＩＩＩへの結合をノックアウトする
Ｄ２６５Ａ突然変異を保有する４−４−２０抗体、（ｉｉｉ）４−４−２０のエピトープ
結合ドメイン及びＦｃドメイン及び／又はＦｃγＲＩＩＩに特異的なエピトープ結合ドメ
インを有するダイアボディ、で被覆し；オプソニン化した粒子を形成し；上述のオプソニ
ン化粒子（ｉ〜ｉｉｉ）のいずれかをＴＨＰ−１エフェクター細胞（単球細胞系、ＡＴＣ
Ｃより入手可能）に１：１、１０：１、３０：１、６０：１、７５：１、又は１００：１
の比で添加して、ＦｃγＲ介在食作用を発生させ；好ましくは該細胞と大腸菌−ＦＩＴＣ
／抗体を３７℃で１．５時間インキュベートし；インキュベーション後、細胞にトリパン
ブルーを添加して（好ましくは室温で２〜３分）、内部に取り込まれないで細胞表面の外
側に付着した細菌の蛍光を消失させ；細胞をＦＡＣＳバッファー（例えば、ＰＢＳ中の０
．１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム）中に移し、ＦＡＣＳ（例えば、ＢＤ ＦＡＣ
Ｓ Ｃａｌｉｂｕｒ）を用いてＴＨＰ−１細胞の蛍光をアッセイする。好ましくは、この
アッセイに用いられるＴＨＰ−１細胞を、ＦＡＣＳにより細胞表面上のＦｃγＲの発現に
ついてアッセイする。ＴＨＰ−１細胞はＣＤ３２ＡとＣＤ６４との両者を発現する。ＣＤ
６４は、本発明の方法によりＡＤＣＰアッセイを実行する際に阻害される、高親和性Ｆｃ
γＲである。ＴＨＰ−１細胞を、好ましくは１００μｇ／ｍＬの可溶性ＩｇＧ１又は１０
％ヒト血清で阻害する。ＡＤＣＰの程度をアッセイするため、ゲートを好ましくはＴＨＰ
−１細胞上に設定し、蛍光強度の中央値を測定する。個々の突然変異体についてのＡＤＣ
Ｐ活性を算出し、得られた野生型ｃｈＭａｂ４−４−２０に対して標準化した数値として
記録する。オプソニン化した粒子をＴＨＰ−１細胞に添加して、オプソニン化粒子の添加
されたＴＨＰ−１細胞に対する比が３０：１又は６０：１になるようにする。最も好まし
い実施形態では、ＡＤＣＰアッセイを、対照として、培地中の大腸菌−ＦＩＴＣ、大腸菌
−ＦＩＴＣ及びＴＨＰ−１細胞（ＦｃγＲ非依存性ＡＤＣＰ活性として使用する）、大腸
菌−ＦＩＴＣ、ＴＨＰ−１細胞及び野生型４−４−２０抗体（ＦｃγＲ依存性ＡＤＣＰ活
性として使用する）、大腸菌−ＦＩＴＣ、ＴＨＰ−１細胞、４−４−２０Ｄ２６５Ａ（Ｆ
ｃγＲ依存性ＡＤＣＰ活性についてのバックグラウンド対照として使用する）を用いて実
施する。
別の実施形態では、本発明の分子を、当業者に公知の標準的な方法のいずれかを使用し
て、エフェクター細胞、例えばナチュラルキラー細胞で、ＦｃγＲ介在ＡＤＣＣ活性につ
いてアッセイすることができる（例えば、Ｐｅｒｕｓｓｉａら，（２０００），Ａｓｓａ
ｙｓ Ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＡＤＣＣ）Ａｎｄ Ｒｅｖｅｒｓｅ ＡＤＣＣ（Ｒｅｄｉｒ
ｅｃｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）Ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌ
ｅｒ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，１２１：１７９−９２；Ｗ
ｅｎｇら，（２００３），Ｔｗｏ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ Ｆｒａｇｍｅｎ
ｔ Ｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ
Ｐｒｅｄｉｃｔ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｔｏ Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ Ｉｎ Ｐａｔｉｅｎ
ｔｓ Ｗｉｔｈ Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ Ｌｙｍｐｈｏｍａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ
．，２１：３９４０−３９４７；Ｄｉｎｇら，（１９９８），Ｔｗｏ Ｈｕｍａｎ Ｔ
Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｂｉｎｄ Ｉｎ Ａ Ｓｉｍｉｌａｒ Ｄｉａｇｏｎａ
ｌ Ｍｏｄｅ Ｔｏ Ｔｈｅ ＨＬＡ−Ａ２／Ｔａｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ
Ｕｓｉｎｇ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＴＣＲ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔ
ｙ，８：４０３−４１１参照）。本発明の分子のＡＤＣＣ活性を判定するための例示的な
アッセイ法は、以下を有する５ｌＣｒ放出アッセイに基づくものである：標的細胞を［５
１Ｃｒ］Ｎａ２ＣｒＯ４で標識し（この細胞膜透過性分子は、細胞質タンパク質と結合し
、細胞から速度論的に緩慢に自発放出されるが、標的細胞の壊死後、大量に放出されるの
で、標識用に一般的に使用される）；変異型重鎖を有する本発明の分子で標的細胞をオプ
ソニン化し；オプソニン化した放射性標識標的細胞とエフェクター細胞とを、標的細胞と
エフェクター細胞との適切な比で、マイクロタイタープレート上で混合し；この細胞混合
物を１６〜１８時間、３７℃でインキュベートし；上清を回収し；放射活性を分析する。
その後、本発明の分子の細胞毒性を、例えば以下の式を使用して算出することができる：
溶解％＝（実験ｃｐｍ−標的漏出ｃｐｍ）／（界面活性剤溶解ｃｐｍ−標的漏出ｃｐｍ）
×１００％、あるいは、溶解％＝（ＡＤＣＣ−ＡＩＣＣ）／（最大放出−自発放出）。特
異的溶解は以下の式を使用して算出することができる：特異的溶解＝本発明の分子の存在
下での溶解％−本発明の分子の不在下での溶解％。標的：エフェクター細胞の比又は抗体
濃度のいずれかを変更することによって、グラフを作成することができる。
好ましくは、本発明のＡＤＣＣアッセイで使用するエフェクター細胞は、好ましくは、
当業者に公知の標準的方法、例えばフィコール−パック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）密
度勾配遠心分離を使用して、正常ヒト血液から精製される、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）
である。本発明の方法で使用するのに好ましいエフェクター細胞は、異なるＦｃγＲ活性
化受容体を発現する。本発明は、重鎖抗体突然変異体が野生型ＩｇＧ１抗体と比較して増
加したＡＤＣＣ活性及び食作用を示すかどうかを判定するために、エフェクター細胞、Ｆ
ｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢを発現するＴＨＰ−１、ならびにＦｃγＲ
ＩＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢの両方を発現する、ヒト全血に由来する単球由来の一次マクロ
ファージを包含する。
ヒト単球細胞系であるＴＨＰ−１は、高親和性受容体ＦｃγＲＩ及び低親和性受容体Ｆ
ｃγＲＩＩＡの発現を介して食作用を活性化する（Ｆｌｅｉｔら，（１９９１），Ｔｈｅ
Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ−Ｌｉｋｅ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ＴＨＰ−１ Ｅｘｐ
ｒｅｓｓｅｓ Ｆｃ Ｇａｍｍａ ＲＩ Ａｎｄ Ｆｃ Ｇａｍｍａ ＲＩＩ，Ｊ．Ｌｅ
ｕｋ．Ｂｉｏｌ．，４９：５５６−５６５）。ＴＨＰ−１細胞は、ＦｃγＲＩＩＡ又はＦ
ｃγＲＩＩＢを構成的に発現しない。サイトカインを用いてこれらの細胞を刺激すると、
ＦｃＲ発現パターンが影響される（Ｐｒｉｃｏｐら，（２００１），Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｉａｌ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ Ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉ
ｔｏｒｙ Ｆｃ Ｇａｍｍａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔ
ｅｓ Ｂｙ Ｔｈ１ Ａｎｄ Ｔｈ２ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ
．，１６６：５３１−５３７）。サイトカインＩＬ４の存在下でのＴＨＰ−１細胞の生育
はＦｃγＲＩＩＢ発現を誘導し、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩ発現の減少を引き起こす
。また、ＦｃγＲＩＩＢ発現も細胞密度の増加によって亢進される（Ｔｒｉｄａｎｄａｐ
ａｎｉら，（２００２），Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎｄ Ｉｎｈ
ｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｆｃｇａｍｍａ ＲＩＩＢ Ｉｎ Ｈｕｍａ
ｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（７）：５０
８２−５０８９）。対照的に、ＩＦＮγはＦｃγＲＩＩＩＡの発現を導くことができると
報告されている（Ｐｅａｒｓｅら，（１９９３），Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｇａｍｍａ−
Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉ
ｔｙ Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆｏｒ ＩｇＧ Ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ａｓｓｅｍｂｌｙ
Ｏｆ Ａ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｔｈａｔ Ｉｎｃｌｕｄｅｓ Ｔｈｅ ９１−ｋＤａ Ｓ
ｕｂｕｎｉｔ Ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ＩＳＧＦ３，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：４３１４−４３１８）。細胞表面上の受
容体の有無は、当業者に公知の通常の方法を使用して、ＦＡＣＳによって確認することが
できる。サイトカインにより誘発される細胞表面上でのＦｃγＲの発現は、ＦｃγＲＩＩ
Ｂの存在下で活性化及び抑制の両方を試験する系を提供する。ＴＨＰ−１細胞がＦｃγＲ
ＩＩＢを発現することができない場合は、本発明は別のヒト単球細胞系であるＵ９３７を
更に包含する。これらの細胞は、ＩＦＮγ及びＴＮＦの存在下で、最終的にマクロファー
ジに分化することが分かっている（Ｋｏｒｅｎら，（１９７９），Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａ
ｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｈｕｍａｎ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｌｉｋｅ Ｃｅｌ
ｌ Ｌｉｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２７９：３２８−３３１）。
ＦｃγＲ依存性腫瘍細胞死滅は、マウス腫瘍モデルではマクロファージとＮＫ細胞によ
って仲介される（Ｃｌｙｎｅｓら，（１９９８），Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ａｒｅ
Ｒｅｑｕｉｒｅｄ Ｉｎ Ｐａｓｓｉｖｅ Ａｎｄ Ａｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ
Ｔｏ Ｍｅｌａｎｏｍａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：６５２
−６５６）。本発明は、食作用及びＡＤＣＣアッセイの両方で、標的細胞の細胞毒性を誘
発するＦｃ突然変異体の効力を分析するため、エフェクター細胞としての、ドナー由来の
水簸した単球の使用を包含する。ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、及びＦｃγＲＩＩＢの
発現パターンは、様々な増殖条件によって影響を受ける。水簸して凍結させた単球、水簸
した新鮮な単球、１０％ＦＢＳ中に維持した単球、ＦＢＳ＋ＧＭ−ＣＳＦ中及び／又はヒ
ト血清中で培養した単球によるＦｃγＲ発現を、当業者に知られた一般的方法を使用して
測定してもよい。例えば、細胞をＦｃγＲ特異的抗体で染色し、ＦＡＣＳによって解析し
てＦｃγＲプロファイルを決定することができる。その後、マクロファージのインビボＦ
ｃγＲ発現を最もよく模倣する条件を本発明の方法で使用する。
いくつかの実施形態では、本発明は、特に、適合するＦｃγＲプロファイルを持つヒト
細胞を取得することができない場合には、マウス細胞の使用を包含する。いくつかの実施
形態では、本発明は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡでトランスフェクトすることができるマウス
マクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ）、及び本技術分野で公知の方法を使
用して単離された安定な形質移入体を包含する（例えば、Ｒａｌｐｈら，（１９７７），
Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｋｉｌｌｉｎｇ Ｏｆ Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔ
ｅ Ａｎｄ Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｂｙ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｒｅｌａｔｅ
ｄ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ：Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｂｙ ＰＰＤ Ａｎｄ ＬＰＳ，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１９：９５０−４参照）。形質移入体は、通常の実験操作を用い
たＦＡＣＳ分析によって、ＦｃγＲＩＩＩＡ発現について定量し、高発現体を本発明のＡ
ＤＣＣアッセイに使用することができる。別の実施形態では、本発明は、本明細書で開示
したものなどのノックアウトトランスジェニックマウスからの、ヒトＦｃγＲを発現する
脾臓腹腔マクロファージの単離を包含する。
リンパ球は、フィコール−パック勾配（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、ドナーの末
梢血（ＰＢＭ）から回収してもよい。単離された細胞の単核集団内では、ほとんどのＡＤ
ＣＣ活性が、その表面にＦｃγＲＩＩＩＡを含むがＦｃγＲＩＩＢは含まないナチュラル
キラー（ＮＫ）細胞を介して生じる。これらの細胞での結果は、ＮＫ細胞ＡＤＣＣの誘発
に対する突然変異体の効力を示し、水簸した単球で試験するための試薬を確立する。
本発明のＡＤＣＣアッセイで使用する標的細胞として、これらに限定されないが、乳癌
細胞系、例えばＡＴＣＣ受託番号ＨＴＢ−３０のＳＫ−ＢＲ−３（例えば、Ｔｒｅｍｐら
，（１９７６），Ｈｕｍａｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｒ
ｅｃｅｎｔ Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，３３−４１参照）；Ｂリンパ球
；バーキットリンパ腫由来の細胞、例えばＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−８６のラジ（Ｒａｊ
ｉ）細胞（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら，（１９６５），Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
Ａｎｄ Ｍｏｄｅ Ｏｆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｔ
ｒａｉｎ（ＥＢｌ）Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｓ Ｆｒｏｍ Ｂｕｒｋ
ｉｔｔ’ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，３４：２３
１−２４０参照）、及びＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−２１３のダウジ（Ｄａｕｄｉ）細胞（
例えば、Ｋｌｅｉｎら，（１９６８），Ｓｕｒｆａｃｅ ＩｇＭ−Ｋａｐｐａ Ｓｐｅｃ
ｉｆｉｃｉｔｙ Ｏｎ Ａ Ｂｕｒｋｉｔｔ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｃｅｌｌ Ｉｎ Ｖｉ
ｖｏ Ａｎｄ Ｉｎ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｉｎｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．，２８：１３００−１３１０参照）が挙げられる。標的細胞はアッセイすべきダイ
アボディ分子の抗原結合部位によって認識されるものでなければならない。
ＡＤＣＣアッセイは、アポトーシス経路によって細胞死を仲介するＮＫ細胞の能力に基
づいている。ＮＫ細胞は、一部には細胞表面の抗原に結合したＩｇＧＦｃドメインのＦｃ
γＲＩＩＩＡ認識によって、細胞死を仲介する。本発明の方法により使用するＡＤＣＣア
ッセイは、放射性ベースの又は蛍光ベースのアッセイでもよい。変異型Ｆｃ領域を有する
本発明の分子を特徴付けるるために使用するＡＤＣＣアッセイは以下を含む：標的細胞、
例えばＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、ＯＶＣＡＲ３、ラジ、ダウジ細胞を標識し；標的細
胞を、抗原結合部位を介して標的細胞上の細胞表面受容体を認識する抗体でオプソニン化
し；標識したオプソニン化標的細胞とエフェクター細胞とを、通常の実験操作によって決
定することができる適切な比で混合し；細胞を回収し；使用した標識に基づく適切な検出
スキームを使用して、溶解した標的細胞の上清中の標識を検出する。標的細胞は本技術分
野で公知の標準的方法を使用して、放射性標識又は蛍光標識で標識してもよい。例えば、
標識として、これらに限定されないが、［５１Ｃｒ］Ｎａ２Ｃｒ０４及び蛍光増強リガン
ドである２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６−６’’−ジカルボン酸（ＴＤＡ）
のアセトキシメチルエステルが挙げられる。
具体的な好ましい実施形態では、蛍光増強リガンドである２，２’：６’，２’’−タ
ーピリジン−６−６’’−ジカルボン酸（ＴＤＡ）のアセトキシメチルエステルで標識し
た標的細胞に対するＡＤＣＣ活性を測定するために、時間分解蛍光測定アッセイを使用す
る。こうした蛍光測定アッセイは、本技術分野で公知である。例えば、Ｂｌｏｍｂｅｒｇ
ら，（１９９６），Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａ
ｙ Ｆｏｒ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｕｓｉｎｇ Ｔａｒｇ
ｅｔ Ｃｅｌｌｓ Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｗｉｔｈ Ａ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｅｎ
ｈａｎｃｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９３：１９９−２０６参照。本文献は参照することによりその全体を
本明細書に組み入れる。簡単に述べると、標的細胞を膜透過性のＴＤＡのアセトキシメチ
ルジエステルである、生細胞の細胞膜を通過して迅速に拡散する、（ビス（アセトキシメ
チル）２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６−６’’−ジカルボン酸（ＢＡＴＤＡ
））で標識する。細胞内エステラーゼがエステル基を開裂させ、再生された膜非透過性Ｔ
ＤＡ分子は細胞内に捕捉される。エフェクター細胞及び標的細胞を例えば少なくとも２時
間、長くとも３．５時間、３７℃、５％ＣＯ２下でインキュベートした後、溶解標的細胞
から放出されたＴＤＡをＥｕ３＋でキレート化し、生成したユーロピウム−ＴＤＡキレー
トの蛍光を時間分解蛍光光度計（例えば、Ｖｉｃｔｏｒ１４２０，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅ
ｒ／Ｗａｌｌａｃｅ）で定量する。
別の具体的な実施形態では、複数のエピトープ結合部位、及び場合によりＦｃドメイン
（又はその一部）を有する本発明の分子を特徴付けるために使用するＡＤＣＣアッセイは
以下を含む：好ましくは４〜５×１０６個の標的細胞（例えば、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ
−７、ＯＶＣＡＲ３、ラジ細胞）をビス（アセトキシメチル）２，２’：６’，２’’−
ターピリジン−ｔ−６’’−ジカルボン酸（ＤＥＬＦＩＡ ＢＡＴＤＡ試薬，Ｐｅｒｋｉ
ｎ Ｅｌｍｅｒ／Ｗａｌｌａｃ）で標識する。最適な標識効率のため、ＡＤＣＣアッセイ
で使用する標的細胞の数は、好ましくは５×１０６個を超えないようにすべきである。こ
の細胞にＢＡＴＤＡ試薬を添加し、混合物を３７℃、好ましくは５％ＣＯ２下で、少なく
とも３０分間インキュベートする。次に細胞を生理学的緩衝液、例えば、０．１２５ｍＭ
スルフィンピラゾールを含有するＰＢＳ、及び０．１２５ｍＭスルフィンピラゾールを含
有する培地で洗浄する。次に標識した標的細胞を、ＥｃγＲＩＩＡに特異的なエピトープ
結合ドメイン、及び任意にＦｃドメイン（又はその一部）を有する本発明の分子でオプソ
ニン化（被覆）する。好ましい実施形態では、ＡＤＣＣアッセイで使用する分子はまた、
細胞表面受容体、腫瘍抗原、又は癌抗原に特異的である。本発明のダイアボディ分子は、
セクション５．６．１に列挙するものなどの癌又は腫瘍抗原のいずれかと特異的に結合し
てもよい。ＡＤＣＣアッセイにおける標的細胞は、本発明のダイアボディが標的細胞の細
胞表面受容体と特異的に結合するように、該ダイアボディに遺伝子操作されたエピトープ
結合部位に従って選択される。
標的細胞をエフェクター細胞、例えばＰＢＭＣに、エフェクター：標的の比が約１：１
、１０：１、３０：１、５０：１、７５：１、又は１００：１になるように添加する。エ
フェクター及び標的細胞を少なくとも２時間、長くとも３．５時間、３７℃、５％ＣＯ２
下でインキュベートする。細胞上清を回収し、酸性ユーロピウム溶液（例えば、ＤＥＬＦ
ＩＡユーロピウム溶液、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ｗａｌｌａｃ）に添加する。生成さ
れたユーロピウム−ＴＤＡキレートの蛍光を、時間分解蛍光光度計（例えば、Ｖｉｃｔｏ
ｒ １４２０、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ｗａｌｌａｃ）で定量する。最大放出（ＭＲ
）及び自発放出（ＳＲ）は、標的細胞を、それぞれ１％ＴＸ−１００及び培地のみとイン
キュベートすることによって測定する。抗体非依存性細胞毒性（ＡＩＣＣ）を、試験分子
、例えば本発明のダイアボディの不在下で標的及びエフェクター細胞をインキュベートす
ることによって測定する。各アッセイは、好ましくは３回反復して実施する。特異的溶解
率の平均を次のように算出する：（実験的放出（ＡＤＣＣ）−ＡＩＣＣ）／（ＭＲ−ＳＲ
）×１００。
本発明は、Ｆｃドメイン（又はその一部）を有する本発明の分子によるＣ１ｑの結合及
び補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）の仲介を特徴付けるための、本技術分野で公知でありか
つ本明細書に例示されるアッセイ法を包含する。Ｃ１ｑ結合性を測定するために、Ｃ１ｑ
結合ＥＬＩＳＡを行ってもよい。例示的なアッセイ法は、以下を含み得る：アッセイプレ
ートを、被覆緩衝液中で本発明の分子又は出発ポリペプチド（対照）を有するポリペプチ
ドで、４℃で一晩被覆する。次いでこのプレートを洗浄し、ブロックしてもよい。洗浄後
、ヒトＣ１ｑの一定量を各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートする。更に洗浄
した後、１００μＬのヒツジ抗補体Ｃ１ｑペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を各ウェ
ルに添加し、室温で１時間インキュベートする。プレートを再度洗浄緩衝液で洗浄し、Ｏ
ＰＤ（Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ））を含む１００μｌの基質緩衝液
を各ウェルに添加する。黄色の出現によって観察される酸化反応を３０分間行い、１００
μｌの４．５ＮＨ２ＳＯ４の添加によって該反応を停止させる。次いで吸光度を（４９２
〜４０５）ｎｍで読み取る。
補体活性化を評価するために、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）アッセイを、例えばＧａ
ｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら，（１９９７），Ａ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ
Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ
Ｆｏｒ Ａｎｔｉ−ＣＤ２０ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３−１７１（参照することによりその全体を本明
細書に組み入れる）に記載されるように行ってもよい。要約すると、（変異型）Ｆｃドメ
イン（又はその一部）を有する分子及びヒト補体を様々な濃度に緩衝液で希釈する。ダイ
アボディ分子が結合する抗原を発現する細胞は、１ｍｌ当たり約１×１０６細胞の密度に
希釈する。（変異型）Ｆｃドメイン（又はその一部）を有するダイアボディ分子、希釈し
たヒト補体及び抗原を発現する細胞の混合物を、平底組織培養９６ウェルプレートに添加
して、３７℃、５％ＣＯ２下で２時間インキュベートさせて、補体介在細胞溶解を促進さ
せる。次いで、５０μＬのアラマーブルー（Ａｃｃｕｍｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ）を各ウェルに添加して、３７℃で一晩インキュベートする。吸光度は５３０ｎｍの励
起及び５９０ｎｍの発光で９６ウェル蛍光光度計を用いて測定する。結果は相対蛍光単位
（ＲＦＵ）で示してもよい。試料濃度を標準曲線から求めて、非変異型分子、即ち、Ｆｃ
ドメインを有さないか又は非変異型Ｆｃドメインを有する分子と比較した活性％を対象の
変異体について記録する。
５．４．３．その他のアッセイ
複数のエピトープ結合ドメイン、及び場合によりＦｃドメインを有する本発明の分子は
、抗原結合ドメイン又はＦｃ−ＦｃγＲ結合の速度論的パラメーターを特徴付けるための
、本技術分野で公知の表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ法のいずれかを使用してアッ
セイしてもよい。限定するわけではないが以下を含む市販のＳＰＲ装置：Ｂｉａｃｏｒｅ
社製（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）のバイアコア装置；Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｎｓ
ｏｒｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ．）製のＩＡｓｙｓ装置；Ｗｉｎｄｓｏｒ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ社（Ｂｅｒｋｓ，ＵＫ）製のＩＢＩＳシステム；日本レーザ電子社（北海道、
日本）製のＳＰＲ−ＣＥＬＬＩＡシステム；及びＴｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社
（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）製のＳＰＲ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｐｒｅｅｔａのいずれかを本
発明で使用することができる。ＳＰＲに基づく技法の概説については、Ｍｕｌｌｅｔら，
（２０００），Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２２：７７−９１；Ｄｏｎｇら，（２００２
），Ｓｏｍｅ ｎｅｗ ａｓｐｅｃｔｓ ｉｎ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ
ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．８２：３０３−２３；Ｆｉｖａｓｈら，（１９９８）
，ＢＩＡｃｏｒｅ Ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９７−１０
１；Ｒｉｃｈら，（２０００），Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｉｎ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍ
ｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：５４−６１を参照（これら
のそれぞれを参照することによりその全体を本明細書中に組み入れる）。更に、米国特許
第６，３７３，５７７号、第６，２８９，２８６号、第５，３２２，７９８号、第５，３
４１，２１５号、第６，２６８，１２５号（これらのそれぞれを参照することによりその
全体を本明細書中に組み入れる）に記載されたタンパク質−タンパク質相互作用を測定す
るためのＳＰＲ装置及びＳＰＲに基づく方法のいずれをも、本発明の方法に含むものとす
る。
概略的には、ＳＰＲベースのアッセイ法は、結合ペアの一方を表面に固定化し、及び溶
液中の前記結合ペアの他方との相互作用をリアルタイムでモニタリングすることを含む。
ＳＰＲは、複合体の形成又は解離時に生じる表面付近での溶媒の屈折率の変化を測定する
ことに基づくものである。固定化を行う表面はセンサーチップであって、これがＳＰＲ技
術の心臓部となるものである。これは金の薄層で被覆されたガラス表面からなり、該表面
への分子の結合性を最適化するように設計された様々な特殊な表面の基礎を形成する。様
々なセンサーチップが特に上記の会社から市販されており、これらのすべてを本発明の方
法で使用することができる。センサーチップの例としては、ＢＩＡｃｏｒｅ社から市販さ
れているもの、例えばＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５、ＳＡ、ＮＴＡ、及びＨＰＡが挙
げられる。本発明の分子は、これらに限定されないが、アミン基を介した直接共有結合、
スルフヒドリル基を介した直接共有結合、アビジン被覆表面へのビオチンの結合、炭水化
物基へのアルデヒド結合、及びヒスチジンタグを介したＮＴＡチップとの結合を含む、本
技術分野で公知の固定化方法及び化学作用を使用して、センサーチップの表面に固定化し
てよい。
いくつかの実施形態では、複数のエピトープ結合部位、及び場合によりＦｃドメインを
有する本発明の分子と、抗原又はＦｃγＲとの結合の速度論的パラメーターは、バイアコ
ア装置（例えば、バイアコア装置１０００、ＢＩＡｃｏｒｅ社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，
ＮＪ）を使用して測定してもよい。上述のように（セクション５．４．１参照）、ダイア
ボディ分子の少なくとも１つのエピトープ結合部位がＦｃγＲを免疫特異的に認識する場
合、及び／又はダイアボディ分子がＦｃドメイン（又はその一部）を有する場合、任意の
ＦｃγＲを使用して本発明の分子の結合を評価することができる。具体的な実施形態では
、ＦｃγＲはＦｃγＲＩＩＩＡ、好ましくは可溶性の単量体ＦｃγＲＩＩＩＡである。例
えば、一つの実施形態では、可溶性単量体ＦｃγＲＩＩＩＡは、リンカー−ＡＶＩＴＡＧ
配列に結合したＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域である（２００３年１月９日出願の米国仮
出願第６０／４３９，４９８号及び２００３年３月１９日出願の米国仮出願第６０／４５
６，０４１号を参照、これらは参照することによりその全体を本明細書中に組み入れる）
。別の具体的な実施形態では、ＦｃγＲはＦｃγＲＩＩＢ、好ましくは可溶性の二量体Ｆ
ｃγＲＩＩＢである。例えば、一つの実施形態では、可溶性二量体ＦｃγＲＩＩＢタンパ
ク質は、２００３年１月１３日出願の米国仮出願第６０／４３９，７０９号（参照するこ
とによりその全体を本明細書中に組み入れる）に記載された方法に従って調製する。
全ての免疫学的分析法において、本発明の分子によるＦｃγＲの認識／結合は複数のド
メインによって影響される。ある実施形態では、本発明の分子は複数のエピトープ結合ド
メインのうちの１つを介してＦｃγＲを免疫特異的に認識する。更に他の実施形態では、
本発明の分子がＦｃドメイン（又はその一部）を有する場合、ダイアボディ分子はＦｃ−
ＦｃγＲ相互作用を介してＦｃγＲを免疫特異的に認識することができる。更に他の実施
形態では、本発明の分子がＦｃドメイン（又はその一部）とＦｃγＲを免疫特異的に認識
するエピトープ結合部位との両方を含む場合、ダイアボディ分子はエピトープ結合ドメイ
ンとＦｃドメイン（又はその一部）の一方又は両方を介してＦｃγＲを認識することがで
きる。複数のエピトープ結合部位及び場合によりＦｃドメイン（又はその一部）を有する
分子の、抗原及び／又はＦｃγＲに対する速度論的パラメーターを、バイアコア装置を用
いて測定するアッセイ法の例では、以下を含む：第１の抗原をセンサーチップ表面の４つ
のフローセルの１つに、好ましくはアミンカップリング化学性質を介して、固定化し、そ
れにより約５０００反応単位（ＲＵ）の第１の抗原が表面に固定化されるようにする。好
適な表面が調製されたら、第１の抗原を免疫特異的に認識する本発明の分子の、好ましく
は、２０μｇ／ｍＬ溶液を、流速５μＬ／ｍＬで１分間注入して、該表面を通過させる。
この段階で該表面に結合した本発明の分子のレベルは、一般的に４００〜７００ＲＵの範
囲である。次に、ＨＢＳ−Ｐ緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中の第２の抗原（例えば、ＦｃγＲ）又はＦｃγＲ受容体の希釈
系列を該表面上に１００μＬ／分で注入する。異なる第２の抗原又は受容体希釈物間での
分子の再生は、好ましくは１００ｍＭＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４；３ＭＮａＣｌを５秒間
一回注入することによって行われる。本技術分野で公知のいずれの再生技術も本発明の方
法に想定されている。
全てのデータセットが収集されたら、得られる結合曲線を、ＳＰＲ装置製造者、例えば
ＢＩＡｃｏｒｅ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から供給されているコンピュータアル
ゴリズムを使用して、包括的に適合させる。これらのアルゴリズムでは、Ｋｏｎ及びＫｏ
ｆｆの両方を算出し、これらから見かけの平衡結合定数Ｋｄを、２つの速度定数の比（即
ち、Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）として演繹する。個々の速度定数をどのようにして誘導するかに
ついての更に詳細な処理法は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｉｏｎソフトウェアハンドブック（Ｂ
ＩＡｃｏｒｅ社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手できる。作成したデータの解析
は、本技術分野で公知のどの方法を使用してもよい。作成した速度論的データを解析する
各種方法の概説については、以下を参照：Ｍｙｓｚｋａ，（１９９７），Ｋｉｎｅｔｉｃ
Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｆ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ
Ｕｓｉｎｇ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｂｉｏｓｅｎｓ
ｏｒｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：５
０−７；Ｆｉｓｈｅｒら，（１９９４），Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎ
ａｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ｔｈｅ Ｋｉｎ
ｅｔｉｃｓ Ａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ Ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５：３８９−９５；Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ，（１９９４），Ｄ
ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｒａｔｅ Ａｎｄ Ｅｑｕｉｌｉｂ
ｒｉｕｍ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ Ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ａ Ｃｒｉｔｉｑｕｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｓｕｒｆａｃｅ
Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐ
ｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５：６５−７１；Ｃｈａｉｋｅｎら，
（１９９２），Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｆ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａ
ｃｔｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｌｉｇａｎｄｓ，Ａｎａｌｙｔｉ
ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１：１９７−２１０；Ｍｏｒｔｏｎら，（１９
９５），Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｋｉｎｅｔｉｃ
ｓ Ｆｒｏｍ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｏ
ｆ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｂｙ Ｌｉｎｅａｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔ
ｅｄ Ｒａｔｅ Ｅｑｕａｔｉｏｎ，Ａｎｄ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉ
ｏｎ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２７：１７６−８５；Ｏ’
Ｓｈａｎｎｅｓｓｙら，１９９６，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
２３６：２７５−８３（これらのそれぞれは参照することによりその全体を本明細書中に
組み入れる）。
好ましい実施形態では、ＳＰＲ解析、例えばバイアコアを使用して測定した速度論的パ
ラメーターは、本発明の分子が機能的分析法、例えばＡＤＣＣ中で、どのように機能する
かを予測するための手段として使用することができる。ＳＰＲ解析から取得した速度論的
パラメーターに基づいて本発明の分子の効力を予測するための例示的な方法は、以下を含
んでよい：本発明の分子の（エピトープ結合ドメイン及び／又はＦｃドメイン（若しくは
その一部）を介した）ＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢとの結合についてのＫｏｆｆ
値を測定し；ＡＤＣＣデータに対して、（１）ＦｃγＲＩＩＩＡについてのＫｏｆｆ（ｗ
ｔ）／Ｋｏｆｆ（ｍｕｔ）及び（２）ＦｃγＲＩＩＢについてのＫｏｆｆ（ｍｕｔ）／Ｋ
ｏｆｆ（ｗｔ）をプロットする。１よりも高い数値が、野生型と比較して、ＦｃγＲＩＩ
ＩＡに対する解離速度の低下、及びＦｃγＲＩＩＢに対する解離速度の増加を示し、ＡＤ
ＣＣ機能の存在及び亢進を示す。
５．５．本発明のダイアボディ分子の製造方法
本発明のダイアボディ分子は、デノボタンパク質合成、結合タンパク質をコードする核
酸の組換え発現を含む、本技術分野で周知の各種方法により製造することができる。所望
の核酸配列は組換え法（例えば、所望のポリヌクレオチドの以前に作製された変異体のＰ
ＣＲ突然変異誘発）により、又は固相ＤＮＡ合成により得ることができる。通常は組換え
発現法が用いられる。一つの態様において、本発明はＣＤ１６ＡＶＨ及び／又はＶＬをコ
ードする配列を有するポリヌクレオチドを提供し、別の態様では、本発明はＣＤ３２ＢＶ
Ｈ及び／又はＶＬをコードする配列を有するポリヌクレオチドを提供する。遺伝子コード
の縮重のため、それぞれの免疫グロブリンアミノ酸配列を種々の核酸配列がコードしてお
り、本発明は本明細書に記載する結合タンパク質をコードする全ての核酸を包含する。
５．５．１．本発明の分子をコードするポリヌクレオチド
本発明はまた、ポリペプチド及び抗体を含む、本発明の分子をコードするポリヌクレオ
チドを包含する。本技術分野で公知のいずれかの方法により、本発明の分子をコードする
ポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定してもよい
。
本発明の方法によって同定される分子のヌクレオチド配列が決定されたら、そのヌクレ
オチド配列を本技術分野で周知の方法、例えば組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘
発、ＰＣＲなどを使用して操作し（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ，ＮＹ；及びＡｕｓｕｂｅｌら編，１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹを参照、両者は参照することによってその全体を本明細書に組み入れる）、例えば
、アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を生じさせることによって、例えば異なるアミ
ノ酸配列をもつ抗体を作製してもよい。
一つの実施形態では、ヒトライブラリー又は本技術分野で利用し得るその他のライブラ
リーを本技術分野で公知の標準的技術によりスクリーニングして、本発明の分子をコード
する核酸をクローニングすることができる。
５．５．２．本発明の分子の組換え発現
本発明の分子（即ち、抗体）をコードする核酸配列が得られたら、該分子を産生するた
めのベクターを、組換えＤＮＡ技術により本技術分野で周知の技術を用いて作製してもよ
い。当業者に周知の方法を利用して、本発明の分子のコード配列及び適当な転写・翻訳制
御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例
えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝的組換えが挙げられる
（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、及びＡｕｓｕ
ｂｅｌら編，１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載された技術を参照）
。
本発明の方法により同定された分子のヌクレオチド配列を有する発現ベクターは、従来
技術（例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、及びリン酸
カルシウム沈降）により宿主細胞に導入し、次いでトランスフェクトした細胞を従来技術
により培養して、本発明の分子を産生させることができる。具体的な実施形態においては
、本発明の分子の発現を構成的、誘導性、又は組織特異的プロモーターにより制御する。
本発明の方法により同定された分子を発現させるために利用する宿主細胞は、大腸菌な
どの細菌細胞か、又は、特に完全な組換え免疫グロブリン分子を発現させるためには、好
ましくは真核細胞である。特に、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳
動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーターエレメン
トなどのベクターとの併用において、免疫グロブリンのための有効な発現系である（Ｆｏ
ｅｃｋｉｎｇら，（１９８６），Ｐｏｗｅｒｆｕｌ Ａｎｄ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｅｎ
ｈａｎｃｅｒ−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｕｎｉｔ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｇｅｎｅ，４５：１０１−１０６；Ｃｏｃｋｅｔｔら，（
１９９０），Ｈｉｇｈ Ｌｅｖｅｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎ
ｈｉｂｉｔｏｒ Ｏｆ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ Ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ｓｙｎ
ｔｈｅｔａｓｅ Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
，８：６６２−６６７）。
様々な宿主−発現ベクター系を利用して、本発明の方法により同定された分子を発現さ
せてもよい。このような宿主−発現系は、本発明の分子のコード配列を産生し、続いて精
製できるビヒクルに相当するが、適当なヌクレオチドコード配列により形質転換又はトラ
ンスフェクトされると本発明の分子をインサイチュで発現する細胞にも相当する。これら
としては、これらに限定されないが、本発明の方法により同定された分子のコード配列を
含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベ
クターにより形質転換された細菌（例えば大腸菌や枯草菌）などの微生物；本発明の方法
により同定された分子をコードする配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換さ
れた酵母（例えば、サッカロミセス属、ピキア属）；本発明の方法により同定された分子
をコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）
を感染させた昆虫細胞系；本発明の方法により同定された分子をコードする配列を含有す
る組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）及
びタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））を感染させた、又は組換えプラスミド発現ベクタ
ー（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；及び哺乳動物細胞のゲノム
由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルス由
来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．
５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、Ｃ
ＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞、リンパ細胞（米国特許第５，８
０７，７１５号を参照）、ＰｅｒＣ．６細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌにより開発されたヒト網膜
細胞））が挙げられる。
細菌系においては、発現される分子に対して意図される用途に応じて、多くの発現ベク
ターを有利に選択することができる。例えば、抗体の医薬組成物を産生するために大量の
タンパク質を作製する場合には、容易に精製される融合タンパク質産物の大量発現を指令
するベクターが望ましい。このようなベクターとしては、これらに限定されないが、抗体
コード配列をｌａｃＺコード領域を有するフレーム内のベクター中に個々に連結して融合
タンパク質が産生されるようにする大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒuｔｈｅｒら，
（１９８３），Ｅａｓｙ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ ｃＤＮＡ Ｃｌｏｎｅ
ｓ，ＥＭＢＯ Ｊ．，２：１７９１−１７９４）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅら，（
１９８５），Ｕｐ−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｔｈｅ ｌｐｐ Ｇ
ｅｎｅ Ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，１３：３１０１−３１１０；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅら，（１９８９），Ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ Ｉｎ Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４：５５０３−５５０
９）などが挙げられる。また、ｐＧＥＸベクターを用いて、外来ポリペプチドをグルタチ
オンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させてもよい。一
般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、溶解した細胞から、マトリックスグ
ルタチオン−アガロースビーズへの吸着及び結合、続いて遊離グルタチオンの存在下での
溶出により容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的
遺伝子産物をＧＳＴ成分から切り離せるように、トロンビン又はＸａ因子プロテアーゼ切
断部位を含むように設計されている。
昆虫系においては、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ
）が外来遺伝子を発現させるためのベクターとして利用される。このウイルスはスポドプ
テラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中で増殖する
。抗体コード配列をウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）中に個々にク
ローニングして、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御
下に配置させてもよい。
哺乳動物宿主細胞においては、多くのウイルスベースの発現系を利用することができる
。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合には、目的の抗体コード配列を、アデ
ノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーター及び三連リーダー配列と連結
してもよい。このキメラ遺伝子を次いでアデノウイルスゲノムにインビトロ又はインビボ
組換えにより挿入し得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１又はＥ３領域）へ
の挿入により、感染した宿主内で生存可能でありかつ免疫グロブリン分子を発現すること
ができる組換えウイルスが得られる（例えば、Ｌｏｇａｎら，（１９８４），Ａｄｅｎｏ
ｖｉｒｕｓ Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ Ｌｅａｄｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅ
ｓ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｏｆ ｍＲＮＡｓ Ｌａｔｅ Ａｆｔｅｒ Ｉｎｆｅｃｔ
ｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３６５５−３６５９を
参照）。特定の開始シグナルも、挿入した抗体コード配列の効率的な翻訳のために必要で
あることがある。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含む。更に、開
始コドンは、挿入全体の翻訳を確実にするために、目的のコード配列のリーディングフレ
ームと同位相になければならない。これらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、
様々な起源のものであってよく、天然でも合成でもよい。発現の効率は、適切な転写エン
ハンサーエレメント、転写終結因子などを含めることにより増強される（Ｂｉｔｔｅｒら
，（１９８７），Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ
Ｆｏｒ Ｙｅａｓｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４
４参照）。
更に、挿入した配列の発現を変えたり、遺伝子産物を所望の特定の様式に改変又はプロ
セシングしたりする宿主細胞株を選択してもよい。このようなタンパク質産物の改変（例
えばグリコシル化）及びプロセシング（例えば切断）はタンパク質の機能にとって重要で
ありうる。例えば、ある実施形態では、本発明のダイアボディ分子を有するポリペプチド
は単一の遺伝子産物として（例えば単一のポリペプチド鎖として、即ちポリタンパク質前
駆体として）発現させてもよいが、本発明のダイアボディ分子の別個のポリペプチドを形
成するために天然の又は組換えの細胞機構によるタンパク質分解切断を必要とする。従っ
て、本発明は、本発明のポリペプチドを有するポリタンパク質前駆体分子をコードする、
該ポリタンパク質前駆体の翻訳後切断を指令することができるコード配列を含む、核酸配
列を遺伝子工学的に作製することを包含する。ポリタンパク質前駆体の翻訳後切断は本発
明のポリペプチドをもたらす。本発明のポリペプチドを有する前駆体分子の翻訳後切断は
インビボ（即ち、天然の又は組換えの細胞系／機構、例えば適切な部位でのフューリン切
断により宿主細胞内）で起こってもよいし、インビトロ（例えば、既知の活性のプロテア
ーゼ若しくはペプチダーゼを有する組成物及び／又は所望のタンパク質分解作用を促進す
ることが知られている条件若しくは試薬を有する組成物中での該ポリペプチド鎖のインキ
ュベーション）で起こってもよい。組換えタンパク質の精製及び改変は本技術分野で周知
であり、ポリタンパク質前駆体の設計には当業者が容易に理解しうる多数の実施形態が含
まれる。上記の前駆体分子の改変のためには本技術分野で公知のプロテアーゼ又はペプチ
ダーゼを使用することができ、例えば、トロンビン（アミノ酸配列ＬＶＰＲＧＳ（配列番
号８９）を認識する）、又はＸａ因子（アミノ酸配列Ｉ（Ｅ／Ｄ）ＧＲ（配列番号９０）
を認識する（Ｎａｇａｉら，（１９８５），Ｏｘｙｇｅｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｐｅ
ｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｎｔ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｓ Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｚｅｄ Ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：７２５２−７２５５、及びＪｅｎｎｙら，（２００３）Ａ Ｃｒ
ｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ｃｌｅａｖａｇ
ｅ Ｏｆ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｗｉｔｈ Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ａｎｄ Ｆ
ａｃｔｏｒ Ｘａ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，３１：１−１１に概説さ
れている、それぞれを参照することによりその全体を本明細書に組み入れる））、エンテ
ロキナーゼ（アミノ酸配列ＤＤＤＤＫ（配列番号９１）を認識する（Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒ
ａｃｉｅら，（１９９５），Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂ
ｏｖｉｎｅ Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ｉｎ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ Ｕｓｉｎｇ Ｔｈｅ Ｎｏｖｅｌ Ｓｅｃｒｅｔｏ
ｒｙ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐａｒｔｎｅｒ ＤｓｂＡ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：
９８２−９８７、参照することによりその全体を本明細書に組み入れる））、フューリン
（アミノ酸配列ＲＸＸＲを認識し、ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒを優先的に認識する（それぞれ配列
番号９２及び配列番号９３）（Ｐ６位の追加のＲは切断を促進するようである））、及び
ＡｃＴＥＶ（アミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号９４）を認識する（Ｐａｒｋｓら，
（１９９４），Ｒｅｌｅａｓｅ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ
Ｆｒｏｍ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｕｓｉｎｇ Ａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１
６：４１３−４１７、参照することによりその全体を本明細書に組み入れる））、ならび
に口蹄疫ウイルスプロテアーゼＣ３が使用される。例えば、セクション６．４を参照。
異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び改変において
それぞれ特徴的かつ特異的な機構を有する。好適な細胞株又は宿主系を選ぶことにより、
発現される外来タンパク質を確実に正しく改変及びプロセシングすることができる。この
ために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のた
めの細胞機構をもつ真核宿主細胞を用いてもよい。このような哺乳動物宿主細胞としては
、これらに限定されないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、
２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３、ＷＩ３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０
及びＴ４７Ｄ、ＣＲＬ７０３０及びＨｓ５７８Ｂｓｔが挙げられる。
組換えタンパク質を長期間、高収率で産生させるためには、安定した発現が好ましい。
例えば、本発明の抗体を安定に発現する細胞株を遺伝子工学的に作製してもよい。ウイル
スの複製起点を含有する発現ベクターを使うよりもむしろ、適当な発現制御エレメント（
例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位
など）により制御されるＤＮＡ及び選択可能なマーカーで宿主細胞を形質転換する。外来
ＤＮＡを導入した後に、遺伝子操作した細胞を富化培地中で１〜２日間増殖させ、次いで
選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは選択に対する耐性を
付与し、細胞が安定してプラスミドをその染色体中に組み込み、増殖して細胞増殖巣を形
成し、続いてクローニングして細胞株に増やすことが可能である。この方法は、本発明の
抗体を発現する細胞株を遺伝子工学的に作製するために有利に使用することができる。こ
のような遺伝子工学的に作製された細胞株は、本発明の分子と直接的又は間接的に相互作
用する化合物をスクリーニングして評価する上で特に有用である。
数多くの選択系を利用することができ、限定はされないが、単純ヘルペスウイルスチミ
ジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら，（１９７７），Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｏｆ Ｐｕｒ
ｉｆｉｅｄ Ｈｅｒｐｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｇｅｎｅ
Ｔｏ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｃｅｌｌｓ，Ｃｅｌｌ，１１：２２３−２３２
）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｓｚｙｂａｌ
ｓｋａら，（１９９２），Ｕｓｅ Ｏｆ Ｔｈｅ ＨＰＲＴ Ｇｅｎｅ Ａｎｄ Ｔｈｅ
ＨＡＴ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｉｎ ＤＮＡ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ：Ｆｉｒｓｔ
Ｓｔｅｐｓ Ｔｏｗａｒｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ Ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，１４：４９５−
５００）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙら，（１９
８０），Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ＤＮＡ：Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ Ｔｈｅ Ｈａｍｓｔｅｒ ａｐｒｔ Ｇｅｎｅ，Ｃｅｌｌ，２２：８１７−８２３）
遺伝子をそれぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−又はａｐｒｔ−細胞に使用することができる。ま
た、代謝拮抗物質耐性を、以下の遺伝子を選択するための基礎として用いることができる
：メトトレキセート耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら，（１９８０），Ｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ Ｗｉｔｈ Ａｎ Ａｍｐ
ｌｉｆｉａｂｌｅ Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ａｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：３５６７−３５７０；Ｏ’Ｈａｒｅら，（１９８１）
，Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍｏｕｓｅ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ Ｔｏ
Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｂｙ Ａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
Ｐｌａｓｍｉｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ａ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｄｉｈｙｄｒ
ｏｆｏｌａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
，７８：１５２７−１５３１）；ミコフェノール酸耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａ
ｎら，（１９８１），Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ Ｔｈａ
ｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｉ
ｎｇ Ｆｏｒ Ｘａｎｔｈｉｎｅ−Ｇｕａｎｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒ
ａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２
−２０７６））；アミノグリコシドＧ−４１８耐性を与えるｎｅｏ（Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅ
ｖ，（１９９３），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔ
ｒｉａｌｓ Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，（１９９３
），Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，２６０：９２６−９３２；及びＭｏｒｇａｎら，（１９９３），Ｈｕｍａｎ Ｇ
ｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２：１９１−２１７）
；ならびにヒグロマイシン耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら，（１９８４）
，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅｓ Ｆｏｒ Ｈｙｇ
ｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ Ａｎｄ Ｇ４１８ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ａｓ Ｄｏｍｉｎａｎ
ｔ−Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍａｒｋｅｒｓ Ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｌ Ｃｅｌｌｓ，Ｇｅｎ
ｅ，３０：１４７−１５６）。組換えＤＮＡ技術の分野で一般的に知られる利用可能な方
法は、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ；Ｋｒｉｅ
ｇｌｅｒ，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；ならび
に第１２及び１３章，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編），１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹ；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら，１９８１，Ａ Ｎｅｗ Ｄｏｍｉｎａｎ
ｔ Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｍａｒｋｅｒ Ｆｏｒ Ｈｉｇｈｅｒ Ｅｕｋ
ａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４に記載されてい
る。
本発明の分子の発現量はベクター増幅により増加することができる（概要については、
Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ及びＨｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ
ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌ
ｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，第３巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９８７を参照）。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能であ
る場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤の量を増加させると、マーカー遺伝子のコ
ピー数が増加する。増幅された領域はダイアボディ分子のポリペプチドのヌクレオチド配
列と関連しているので、該ポリペプチドの産生も増加する（Ｃｒｏｕｓｅら，（１９８３
），Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ｍｉｎｉｇ
ｅｎｅｓ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７−２６６）。
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター、即ち、ダイアボディ分子の第１のポリペプ
チドをコードする第１のベクター及びダイアボディ分子の第２のポリペプチドをコードす
る第２のベクターで同時トランスフェクトしてもよい。これら２つのベクターは、両方の
ポリペプチドを同等に発現することを可能にする同一の選択マーカーを含有してもよい。
あるいは、両方のポリペプチドをコードする単一のベクターを用いてもよい。本発明の分
子のポリペプチドをコードする配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを有してもよい。
本発明の分子（即ち、ダイアボディ）を組換えにより発現させたら、これを、ポリペプ
チド、ポリタンパク質又はダイアボディを精製するための本技術分野で公知のいずれかの
方法（例えば、抗原選択性に基づく抗体精製スキームに類似）、例えば、クロマトグラフ
ィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特に（場合により、ダイアボディ分子がＦ
ｃドメイン（又はその一部）を含む場合はプロテインＡによる選択の後に）特異的抗原に
対する親和性によるもの、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差
溶解度、又はポリペプチド、ポリタンパク質若しくはダイアボディを精製するための他の
標準的な技法により精製してよい。
５．６．予防及び治療方法
本発明の分子は、ＦｃγＲにより仲介されるエフェクター細胞機能（例えば、ＡＤＣＣ
）が望まれる疾患、障害又は感染（例えば、癌、感染性疾患）を治療及び／又は予防する
のに特に有用である。以下で述べるように、本発明のダイアボディは、Ｆｃドメインを含
まないにもかかわらず、エフェクター機能の誘発において抗体に似た機能性を示す。Ｆｃ
γＲを免疫特異的に認識する少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含むことにより
、ダイアボディ分子は、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用に類似したＦｃγＲ結合及び活性を示す
。例えば、本発明の分子は免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞）上の細胞表面抗原
及びＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ）に結合して、該細胞に対するエフェクター機
能（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、食作用、オプソニン化など）を刺激する。
他の実施形態では、本発明のダイアボディ分子はＦｃドメイン（又はその一部）を有す
る。かかる実施形態では、Ｆｃドメインは野生型Ｆｃドメイン（又はその一部）に対して
少なくとも１つのアミノ酸改変を更に含み、及び／又は１つ以上のＩｇＧアイソタイプ（
例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）由来のドメインを含んでもよい。
変異型Ｆｃドメインを有する本発明の分子は、野生型Ｆｃドメインを有する分子と比べて
、賦与された又は改変された表現型、例えば改変された又は賦与されたエフェクター機能
活性（例えば、ＮＫ依存性又はマクロファージ依存性アッセイでアッセイされる）を示す
。この実施形態において、エフェクター機能活性が賦与又は改変されている本発明の分子
は、エフェクター機能活性の効果の亢進が望まれる疾患、障害又は感染の治療及び／又は
予防に有用である。ある実施形態では、Ｆｃドメイン（又はその一部）を有する本発明の
ダイアボディ分子が補体依存性カスケードを仲介する。エフェクター機能を改変するもの
として確認されたＦｃドメイン変異体は、国際出願ＷＯ０４／０６３３５１、米国特許出
願公開第２００５／００３７０００号及び第２００５／００６４５１４号、２００４年１
１月１０日に出願された米国仮出願第６０／６２６，５１０号、２００４年１２月１５日
に出願された第６０／６３６，６６３号、及び２００６年３月１０日に出願された第６０
／７８１，５６４号、並びに本発明者らの同時出願である２００５年１１月１０日に出願
された米国特許出願第１１／２７１，１４０号及び２００５年１２月１５日に出願された
第１１／３０５，７８７号に開示されており、これらのそれぞれを参照することによりそ
の全体を本明細書に組み入れる。
本発明は、被験者の癌を治療、予防又は管理するための方法ならびに組成物を包含し、
被験者に、治療に有効な量の１種以上の、本発明により遺伝子操作された１つ以上のエピ
トープ結合部位及び場合によりＦｃドメイン（又はその一部）を含み、かつ癌抗原と結合
する、分子を投与することを含む。本発明の分子は原発性腫瘍、癌細胞の転移、及び感染
性疾患の予防、阻止、増殖抑制又は退縮に特に有用である。特定の作用機構によって拘束
されるものではないが、本発明の分子はエフェクター機能を仲介して腫瘍の消失、腫瘍の
抑制、又はその両方をもたらす。別の実施形態では、本発明のダイアボディは、細胞表面
抗原及び／又は受容体の架橋及びアポトーシス又は負の増殖調節のシグナル伝達の亢進に
より治療活性を仲介する。
特定の作用機構によって拘束されるものではないが、本発明のダイアボディ分子は本技
術分野で公知の治療用抗体と比べて増大した治療効力を示すが、これは一部には、例えば
ダイアボディ−エピトープ相互作用の向上した結合力により標的細胞上により長く留まっ
ているダイアボディの能力によって、ダイアボディが特定の抗原（例えば、ＦｃγＲ）を
低濃度で発現する標的細胞と免疫特異的に結合できるためである。
抗原（例えば、ＦｃγＲ）に対する親和性及び結合力が増大している本発明のダイアボ
ディは、ＦｃγＲを低濃度で標的細胞集団に発現する被験者において、癌又は別の疾患若
しくは障害を治療、予防又は管理するのに特に有用である。本明細書中で用いる場合、細
胞でのＦｃγＲ発現は、細胞あたりの該分子の密度によって定義され、これは当業者に公
知の通常の方法を用いて測定される。複数のエピトープ結合部位、及び場合によりＦｃγ
Ｒ（又はその一部）を有する本発明の分子はまた、好ましくは、標的抗原、例えば、癌抗
原を３０，０００〜２０，０００分子／細胞の密度で、２０，０００〜１０，０００分子
／細胞の密度で、１０，０００分子／細胞若しくはそれ以下の密度で、５０００分子／細
胞若しくはそれ以下の密度で、又は１０００分子／細胞若しくはそれ以下の密度で発現す
る細胞において、結合力及び親和性及び／又はエフェクター機能が賦与されているか、又
は亢進されている。本発明の分子は、標的細胞集団に標的抗原を低濃度で発現される亜集
団において、癌のような疾患又は障害を治療、予防又は管理するのに特に利用することが
できる。
本発明の分子はまた、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、又は感染性疾患のような疾患を
治療又は予防するための本技術分野で公知の他の治療薬と組み合わせて、有利に使用する
こともできる。具体的な実施形態では、本発明の分子を、例えば該分子と相互作用して免
疫応答を高めるエフェクター細胞の数又は活性を増加させるのに役立つ、モノクローナル
若しくはキメラ抗体、リンホカイン又は造血性増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３及
びＩＬ−７など）と併用してもよい。本発明の分子はまた、疾患、障害、又は感染を治療
するために用いる１種以上の薬物、例えば抗癌剤、抗炎症剤又は抗ウイルス剤と組み合わ
せて有利に利用することもでき、これらは、例えば、セクション５．７に詳述される。
５．６．１．癌
本発明は、被験者に治療上有効な量の、複数のエピトープ結合ドメインを有する１種以
上の分子を投与することを含む、癌を治療又は予防するための方法及び組成物を包含する
。いくつかの実施形態において、本発明は、例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖ又はＦ
ｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆ対立遺伝子についてホモ接合性である、ＦｃγＲ多型を有する
被験者の癌を治療又は予防するための方法及び組成物を包含する。いくつかの実施形態に
おいて、本発明は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（１５８Ｆ）と免疫特異的に結合する、ダイアボデ
ィ分子の少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを操作することを包含する。他の実施
形態では、本発明は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（１５８Ｖ）と免疫特異的に結合する、ダイアボ
ディ分子の少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを操作することを包含する。
標準的なモノクローナル抗体療法の効力は、被験者のＦｃγＲ多型に依存する（Ｃａｒ
ｔｏｎら，（２００２），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｏｆ Ｈｕｍａ
ｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉ−ＣＤ２０ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｎｄ
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｉｎ ＩｇＧ Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＦｃＲＩＩＩａ
Ｇｅｎｅ，Ｂｌｏｏｄ，９９：７５４−７５８；Ｗｅｎｇら，（２００３），Ｔｗｏ Ｉ
ｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｏｌｙ
ｍｏｒｐｈｉｓｍｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ Ｐｒｅｄｉｃｔ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ
Ｔｏ Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ Ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｆｏｌｌｉｃｕｌａ
ｒ Ｌｙｍｐｈｏｍａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２１（２１）：３９４０−３９４
７、この両者は参照することによりその全体を本明細書に組み入れる）。これらの受容体
はエフェクター細胞の表面上に発現され、ＡＤＣＣを仲介する。低親和性の活性化受容体
の高親和性対立遺伝子は、ＡＤＣＣを仲介するエフェクター細胞の能力を改善する。Ｆｃ
−ＦｃγＲ相互作用に依存してエフェクター機能を果たすのとは対照的に、本発明の方法
は、低親和性の活性化受容体を免疫特異的に認識するように分子を操作して、該分子を特
定の多型用に設計することを包含する。これとは別に、又はこれに加えて、本発明の分子
はエフェクター細胞上のＦｃγＲに対して（野生型Ｆｃドメインと比べて）亢進した親和
性を示す変異型Ｆｃドメインを含むように操作してもよい。本発明の操作された分子は、
患者に対しそのＦｃγＲ多型にかかわらず、よりよい免疫療法試薬を提供する。
本発明により操作されたダイアボディ分子は、培養細胞株又は患者由来のＰＭＢＣ細胞
を用いたＡＤＣＣによって試験して、ＡＤＣＣを亢進させるＦｃ変異体の能力を判定する
。本明細書に開示した方法を使用して、標準的ＡＤＣＣを実施する。フィコール−パック
勾配（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、リンパ球を末梢血から回収する。標的細胞、即
ち、培養細胞株又は患者由来の細胞にユーロピウム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）をロード
し、エフェクターとともに３７℃で４時間インキュベートする。蛍光プレートリーダー（
Ｗａｌｌａｃ）を使用して、放出されたユーロピウムを検出する。得られたＡＤＣＣデー
タは、ＮＫ細胞介在細胞毒性を誘発する本発明の分子の効力を示し、どの分子が患者試料
及び水簸した単球の両方を用いて試験できるかを確立する。その後、ＡＤＣＣ活性を誘発
するのに最大の能力を示すダイアボディ分子を、患者由来のＰＢＭＣを用いたＡＤＣＣア
ッセイで試験する。健康なドナー由来のＰＢＭＣがエフェクター細胞として用られる。
従って、本発明は、癌抗原を免疫特異的に認識するようにダイアボディ分子を操作する
ことによって、癌抗原により特徴付けられる癌を予防又は治療する方法を提供するが、該
ダイアボディ分子はそれ自体が細胞毒性（例えば、アポトーシス又は増殖性シグナルの下
方抑制を増大させる表面受容体の架橋による）であり、及び／又は本発明によるＦｃドメ
インを有し、及び／又は１つ以上のエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、食作用）を仲
介するように操作される。本発明により操作されたダイアボディは、細胞毒性活性（例え
ば、亢進した腫瘍細胞殺傷及び／又は亢進した、例えば、ＡＤＣＣ活性若しくはＣＤＣ活
性）を有するので、癌の予防又は治療に有用である。
癌抗原を伴う癌は、癌抗原に結合しかつ細胞毒性を有し、かつ／又は本発明の方法によ
り操作したことによりエフェクター機能を示すダイアボディの投与によって治療又は予防
することができる。例えば、これらに限定されないが、以下の癌抗原を伴う癌を本発明の
方法及び組成物によって治療又は予防することができる：ＫＳ１／４汎癌腫抗原（Ｐｅｒ
ｅｚら，（１９８９），Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏ
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ｓ．，１８（１６）：４９２８）、前立腺特異抗原（Ｈｅｎｔｔｕら，（１９８９），ｃ
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Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｓｈｏｗｓ Ｈｉｇｈ Ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ
Ｔｏ Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ Ｇｅｎｅｓ，Ｂｉｏ
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Ｔｈｅ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｇｐ７５ Ｉｓ Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｈ
ｏｍｏｌｏｇｕｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｂ（Ｂｒｏｗｎ） Ｌｏｃｕｓ Ｇｅｎ
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分子量黒色腫抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）（Ｎａｔａｌｉら，（１９８７），Ｉｍｍｕｎｏｈ
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ｏｓｓｉｂｌｅ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ，Ｃａｎｃｅｒ，５
９：５５−６３；Ｍｉｔｔｅｌｍａｎら，（１９９０），Ａｃｔｉｖｅ Ｓｐｅｃｉｆｉ
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ａ．Ａ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｗｉｔｈ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｉｄｉｏｔｙ
ｐｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｅｌｉｃｉｔｅｄ Ｗｉｔｈ
Ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ Ａｎｔｉ−Ｈｉｇｈ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−Ｗｅｉｇｈｔ−Ｍｅｌ
ａｎｏｍａ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８６：２１３６−２１４４）、前立腺特
異膜抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）（Ｆｏｏｎら，（１９９５），Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓ
ｐｏｎｓｅ Ｔｏ Ｔｈｅ Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎ
Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｔｒｅａｔｅｄ Ｗｉｔｈ Ａｎ Ａｎｔｉ−Ｉｄｉｏｔｙｐｅ
Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６（ｌ）：３３
４−４２）、多形性上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪小球抗原、結直腸腫瘍関連抗原、例えば
ＣＥＡ、ＴＡＧ−７２（Ｙｏｋａｔａら，（１９９２），Ｒａｐｉｄ Ｔｕｍｏｒ Ｐｅ
ｎｅｔｒａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ Ｆｖ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａ
ｒｉｓｏｎ Ｗｉｔｈ Ｏｔｈｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｏｒｍｓ，Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２：３４０２−３４０８）、ＣＯ１７−１Ａ（Ｒａｇｎｈａｍｍ
ａｒら，（１９９３），Ｅｆｆｅｃｔ Ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ
１７−１Ａ Ａｎｄ ＧＭ−ＣＳＦ Ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎ
ｃｅｄ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ−Ｌｏｎｇ−Ｌａｓｔｉｎｇ，Ｃｏ
ｍｐｌｅｔｅ Ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ Ｃａｎ Ｂｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃ
ａｎｃｅｒ，５３：７５１−７５８）、ＧＩＣＡ１９−９（Ｈｅｒｌｙｎら，（１９８２
），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｃｉｒ
ｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ．Ｉ．Ｐｒｅｓ
ｅｎｃｅ Ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎ Ｓｅｒａ Ｏｆ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ
Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ，Ｇａｓｔｒｉｃ，Ａｎｄ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｒｃｉ
ｎｏｍａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２：１３５−１４０）、ＣＴＡ−１及びＬ
ＥＡ、バーキットリンパ腫抗原−３８．１３、ＣＤ１９（Ｇｈｅｔｉｅら，（１９９４）
，Ａｎｔｉ−ＣＤ１９ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｔｈｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ
Ｂ−Ｃｅｌｌ Ｔｕｍｏｒ Ｌｉｎｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ａｎｄ Ｏｆ Ｄａｕｄｉ
Ｃｅｌｌｓ Ｉｎ ＳＣＩＤ Ｍｉｃｅ Ｂｙ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｃｙｃ
ｌｅ Ａｒｒｅｓｔ，Ｂｌｏｏｄ，８３：１３２９−１３３６）、ヒトＢ−リンパ腫抗原
−ＣＤ２０（Ｒｅｆｆら，（１９９４），Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｏｆ Ｂ Ｃｅｌｌｓ
ｉｎ ｖｉｖｏ Ｂｙ Ａ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｏ ＣＤ２０，Ｂｌｏｏｄ，８３：４３５−４４５）、
ＣＤ３３（Ｓｇｏｕｒｏｓら，（１９９３），Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ａｎｄ Ｄｏｓｉｍｅ
ｔｒｙ Ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍ１９５（Ａｎｔｉ−ＣＤ３
３）Ｉｎ Ａｃｕｔｅ Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍ
ｅｄ．，３４：４２２−４３０）、ガングリオシドＧＤ２などの黒色腫特異抗原（Ｓａｌ
ｅｈら，（１９９３），Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ−Ｉｄ
ｉｏｔｙｐｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈａｔ Ｍｉｍｉｃｓ Ｔｈｅ ＧＤ２ Ａｎｔ
ｉｇｅｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１，３３９０−３３９８）、ガングリオシドＧＤ
３（Ｓｈｉｔａｒａら，（１９９３），Ａ Ｍｏｕｓｅ／Ｈｕｍａｎ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ
Ａｎｔｉ−（Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＤ３）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｗｉｔｈ Ｅｎｈ
ａｎｃｅｄ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６：３７３−３８０）、ガングリオシドＧＭ２（Ｌｉｖ
ｉｎｇｓｔｏｎら，（１９９４），Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｉｎ Ｓｔａ
ｇｅ ＩＩＩ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ ＧＭ２ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ：Ａ Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ Ｔｒｉａｌ Ｏｆ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｖａｃｃ
ｉｎａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ ＧＭ２ Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏ
ｌ．，１２：１０３６−１０４４）、ガングリオシドＧＭ３（Ｈｏｏｎら，（１９９３）
，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｏｆ Ａ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔｏ Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＭ３ Ａｎ
ｔｉｇｅｎ Ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：５２４
４−５２５０）、腫瘍特異的移植型細胞表面抗原（ＴＳＴＡ）、例えば、ＤＮＡ腫瘍ウイ
ルスのＴ抗原及びＲＮＡ腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原を始めとするウイルス誘発腫瘍
抗原、結腸のＣＥＡや膀胱腫瘍胎児抗原などの腫瘍胎児抗原−アルファフェトプロテイン
（Ｈｅｌｌｓｔｒoｍら，（１９８５），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
Ｔｏ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ Ｓｈａｒｅｄ Ｂｙ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌｌｙ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｂｌａｄｄｅｒ Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ，
Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．，４５：２２１０−２１８８）、分化抗原、例えば、ヒト肺癌抗
原Ｌ６、Ｌ２０（Ｈｅｌｌｓｔｒoｍら，（１９８６），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｍｏｕ
ｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｒａｉｓｅｄ Ａｇａｉｎｓｔ Ｈｕｍａｎ Ｌｕｎｇ
Ｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４６：３９１７−３９２３）、線維肉腫
の抗原、ヒト白血病Ｔ細胞抗原−Ｇｐ３７（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ−Ｃｈａｔｔｅｒ
ｊｅｅら，（１９８８），Ｉｄｉｏｔｙｐｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｈｕ
ｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｌｅｕｋｅｍｉａ．ＩＩ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｈ
ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｉｄｉｏｔｙｐｅ
Ｃａｓｃａｄｅ（Ａｂ１，Ａｂ２，ａｎｄ Ａｂ３），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１：
１３９８−１４０３）、新生糖タンパク質、スフィンゴリピド、乳癌抗原、例えば、ＥＧ
ＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＨＥＲ２抗原（ｐ１８５ＨＥＲ２）、多形上皮ムチン（Ｐ
ＥＭ）（Ｈｉｌｋｅｎｓら，（１９９２），Ｃｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ−Ａｓｓｏｃｉ
ａｔｅｄ Ｍｕｃｉｎｓ Ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｄｈｅｓｉｏｎ−Ｍｏｄｕｌａｔｉｎ
ｇ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１７：３５９
−３６３）、悪性ヒトリンパ球抗原−ＡＰＯ−１ （Ｔｒａｕｔｈら，（１９８９），Ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｇｒｅｓ
ｓｉｏｎ Ｂｙ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
４５：３０１−３０４）、分化抗原（Ｆｅｉｚｉ，（１９８５），Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔ
ｉｏｎ Ｂｙ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｔｈａｔ Ｃａｒｂｏｈ
ｙｄｒａｔｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ｏｆ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｎｄ Ｇ
ｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ Ａｒｅ Ｏｎｃｏ−Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ａｎｔｉｇｅ
ｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：５３−５７）、例えば胎児赤血球及び初期内胚葉中に見出
されるＩ抗原、胃腺癌中に見出されるＩ（Ｍａ）、乳房上皮中に見出されるＭ１８及びＭ
３９、骨髄細胞中に見出されるＳＳＥＡ−１、結直腸癌中に見出されるＶＥＰ８、ＶＥＰ
９、Ｍｙｌ、ＶＩＭ−Ｄ５及びＤ１５６−２２、ＴＲＡ−１−８５（血液型Ｈ）、結腸腺
癌中に見出されるＣ１４、肺腺癌中に見出されるＦ３、胃癌中に見出されるＡＨ６、胚性
癌細胞中に見出されるＹハプテンであるＬｅＹ、ＴＬ５（血液型Ａ）、Ａ４３１細胞中に
見出されるＥＧＦ受容体、膵癌中に見出されるＥｌシリーズ（血液型Ｂ）、胚性癌細胞中
に見出されるＦＣ１０．２、胃腺癌抗原、腺癌中に見出されるＣＯ−５１４（血液型Ｌｅ
ａ）、線癌中に見出されるＮＳ−


１０、ＣＯ−４３（血液型Ｌｅｂ）、Ｇ４９、ＥＧＦ受容体、結腸腺癌中に見出される（
血液型ＡＬｅｂ／Ｌｅｙ）、結腸癌、胃癌ムチン中に見出される１９．９、骨髄細胞中に
見出されるＴ５Ａ７、黒色腫中に見出されるＲ２４、胚性癌細胞中に見出される４．２、
ＧＤ３、Ｄ１．１、ＯＦＡ−１、ＧＭ２、ＯＦＡ−２、ＧＤ２、及びＭ１：２２：２５：
８、並びに４〜８−細胞期胚中に見出されるＳＳＥＡ−３及びＳＳＥＡ−４。別の実施形
態では、抗原は皮膚Ｔ細胞リンパ腫からのＴ細胞受容体由来ペプチドである（Ｅｄｅｌｓ
ｏｎ，（１９９８），Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｔ−Ｃｅｌ ｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ：Ａ Ｍ
ｏｄｅｌ Ｆｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃａｎｃｅｒ
Ｊ．Ｓｃｉ．Ａｍ．，４：６２−７１参照）。
本発明の方法及び組成物によって治療又は予防することができる癌及びこれに関連する
疾患には、これらに限定されないが、以下が含まれる：白血病、限定されないが、例えば
、急性白血病、急性リンパ性白血病、及び骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性
、赤白血球性白血病、及び脊髄形成異常症候群などの急性骨髄性白血病；慢性白血病、限
定されないが、例えば、慢性骨髄性（顆粒球）白血病、慢性リンパ性白血病、毛様細胞白
血病；真性多血症；リンパ腫、限定されないが、例えば、ホジキン病、非ホジキン病；多
発骨髄腫、限定されないが、例えば、非定型的多発骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨
髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫及び髄外性形質細胞腫；ワルデンシュトレーム
マクログロブリン血症；意義不明の単クローン性グロブリン血症；良性単クローン性グロ
ブリン血症；重鎖病；骨及び結合組織肉腫、限定されないが、例えば、骨部肉腫、骨肉腫
、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨の線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟組織
肉腫、血管腫（血管肉腫）、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉
腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫；脳腫瘍、限定されないが、例えば、グリオーマ、
星状細胞腫、脳幹グリオーマ、上衣細胞腫、乏突起グリオーマ、非グリア腫、聴神経鞘腫
、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫、松果体芽腫、初発脳リンパ腫；乳癌、限定さ
れないが、例えば、腺癌、小葉（小細胞）癌、管内癌、髄様乳癌、粘液乳癌、管状乳癌、
乳頭癌、ページェット病、及び炎症性乳癌；副腎癌、限定されないが、例えば、クロム親
和性細胞腫及び副腎皮質癌；甲状腺癌、限定されないが、例えば、乳頭性若しくは小胞性
甲状腺癌、髄様甲状腺癌及び未分化甲状腺癌；膵癌、限定されないが、例えば、膵島細胞
腫、ガストリン産生腫瘍、グルカゴン産生腫瘍、ＶＩＰ産生腫瘍、ソマトスタチン分泌腫
瘍、及びカルチノイド若しくは膵島細胞腫瘍；下垂体癌、限定されないが、例えば、クッ
シング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大症、及び尿崩症；眼の癌、限定されないが、
例えば、虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫、及び毛様体黒色腫などの眼部黒色腫、及び網膜芽腫
；膣癌、限定されないが、例えば、扁平上皮癌、腺癌、及び黒色腫；外陰部癌、限定され
ないが、例えば、扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、及びページェット病；
子宮頚部癌、限定されないが、例えば、扁平上皮癌、及び腺癌；子宮癌、限定されないが
、例えば、子宮内膜癌及び子宮肉腫；卵巣癌、限定されないが、例えば、卵巣上皮癌、境
界性腫瘍、胚細胞腫瘍、及び間質腫瘍；食道癌、限定されないが、例えば、扁平上皮癌、
腺癌、腺様嚢胞癌、粘膜表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣状癌、及
び燕麦細胞（小細胞）癌；胃癌、限定されないが、例えば、腺癌、菌状（ポリープ状）、
潰瘍性、表在性、拡散性、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、及び癌肉腫；結腸癌；直
腸癌；肝癌、限定されないが、例えば、肝細胞癌及び肝芽腫；胆嚢癌、限定されないが、
例えば、腺癌；胆管癌、限定されないが、例えば、乳頭様、結節性、及び拡散性；肺癌、
限定されないが、例えば、非小細胞肺癌、扁平上皮癌（表皮癌）、腺癌、大細胞癌及び小
細胞肺癌；精巣癌、限定されないが、例えば、胚腫瘍、精上皮腫、未分化性、古典的（典
型的）、精子細胞、非精上皮腫、胎児性癌、奇形腫、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）；前立腺癌、
限定されないが、例えば、腺癌、平滑筋肉腫、及び横紋筋肉腫；陰茎癌；口腔癌、限定さ
れないが、例えば、扁平上皮癌；基底癌；唾液腺癌、限定されないが、例えば、腺癌、粘
膜表皮癌、及び腺様嚢胞癌；咽頭癌、限定されないが、例えば、扁平上皮癌、及び疣状癌
；皮膚癌、限定されないが、例えば、基底細胞癌、扁平上皮癌及び黒色腫、表在性黒色腫
、結節性黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端性黒子性黒色腫；腎癌、限定されないが、例えば
、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行性細胞癌（腎骨盤及び／又は子宮）；ウィル
ムス腫瘍；膀胱癌、限定されないが、例えば、移行性細胞癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫
。更に、癌には、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫
、血管芽腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原性癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌及び乳頭腺癌が
含まれる（こうした疾患の総説については、Ｆｉｓｈｍａｎら，（１９８５），Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ，第２版，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ
及びＭｕｒｐｈｙら，（１９９７），Ｉｎｆｏｒｍｅｄ Ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅ
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｂｏｏｋ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｔｒｅａｔｍ
ｅｎｔ，ａｎｄ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ，Ｖｉｋｉｎｇ Ｐｅｎｇｕｉｎ，Ｐｅｎｇｕｉｎ
Ｂｏｏｋｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｉｎｃ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉ
ｃａを参照）。
従って、本発明の方法及び組成物は、限定されないが、以下を含む種々の癌又はその他
の異常増殖性疾患の治療又は予防においても有用である：癌（膀胱、乳房、結腸、腎、肝
、肺、卵巣、膵臓、胃、前立腺、子宮頚部、甲状腺及び皮膚の癌を含む）；扁平上皮癌；
リンパ造血系腫瘍（白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球白血病、Ｂ細胞リンパ
腫、Ｔ細胞リンパ腫、及びバーキットリンパ腫）；骨髄造血系腫瘍（急性及び慢性骨髄性
白血病及び前骨髄球性白血病）；間葉起源の腫瘍（線維肉腫及び横紋筋肉腫）；その他の
腫瘍（黒色腫、精上皮腫、奇形癌、神経芽腫及びグリオーマ）；中枢及び末梢神経系の腫
瘍（星状細胞腫、神経芽腫、グリオーマ、及び神経鞘腫）；間葉起源の腫瘍（線維肉腫、
横紋筋肉腫、及び骨肉腫）；並びにその他の腫瘍（黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫
、精上皮腫、甲状腺小胞癌及び奇形癌）。アポトーシスの異常に起因する癌も、本発明の
方法及び組成物によって治療しうると想定される。こうした癌として、限定されないが、
小胞腫、ｐ５３突然変異を伴う癌、乳房、前立腺及び卵巣のホルモン依存性腫瘍、並びに
家族性腺腫様ポリープ症及び脊髄形成異常症候群などの前癌性病変が挙げられる。具体的
な実施形態では、卵巣、膀胱、乳房、結腸、肺、皮膚、膵臓又は子宮において、悪性疾患
若しくは増殖異常変化（異形成及び形成不全など）、又は過剰増殖性疾患を、本発明の方
法及び組成物によって治療又は予防する。別の具体的な実施形態では、肉腫、黒色腫、又
は白血病を、本発明の方法及び組成物によって治療又は予防する。
具体的な実施形態では、本発明の分子（例えば、複数のエピトープ結合ドメイン、及び
場合によりＦｃドメイン（又はその一部）を有するダイアボディ）は、癌細胞の増殖を、
本発明の該分子の不在下での癌細胞の増殖と比較して、少なくとも９９％、少なくとも９
５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少
なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも
４０％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、
又は少なくとも１０％、癌細胞の増殖を抑制するか又は減少させる。
具体的な実施形態では、本発明の分子（例えば、複数のエピトープ結合ドメイン、及び
場合によりＦｃドメイン（又はその一部）を有するダイアボディ）は、親分子よりも、少
なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３
０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少
なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも
８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％多く、癌細胞を
殺傷するか、癌細胞の増殖を抑制するか又は減少させる。
５．６．２．自己免疫疾患及び炎症性疾患
いくつかの実施形態において、本発明の分子は、本発明の方法により操作された、Ｆｃ
γＲＩＩＢに特異的なエピトープ結合ドメイン及び／又は変異型Ｆｃドメイン（又はその
一部）を有し、該Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して、より大きなＦｃγＲ
ＩＩＢに対する親和性が高く、ＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに対する親和
性が低い。そのような結合特性を有する本発明の分子は、免疫応答の調節、例えば自己免
疫疾患又は炎症性疾患に関連する免疫応答の抑制において有用である。いずれの作用機構
にも拘束されることを意図しないが、ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性を有し、及び／又は
ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が増大しＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに対
する親和性が低下しているＦｃドメインを有する本発明の分子は、ＦｃγＲに対する活性
化応答を弱め、かつ細胞性応答の抑制することにより、自己免疫疾患の治療及び／又は予
防において治療効力を有すると思われる。
本発明はまた、被験者における、炎症性障害に関連する１つ以上の症状を予防し、治療
し、又は管理する方法を提供し、該方法は、治療上又は予防上有効な量の１つ以上の抗炎
症薬を被験者に投与することを更に含む。本発明はまた、自己免疫疾患に関連する１つ以
上の症状を予防し、治療し、又は管理する方法を提供し、該方法は、治療上又は予防上有
効な量の１つ以上の免疫調節薬を被験者に投与することを更に含む。セクション５．７に
、抗炎症薬及び免疫調節薬の非限定的な例を示す。
本発明の分子を投与することにより治療できる自己免疫障害の例には、これらに限定さ
れないが、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、副腎の
自己免疫疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫卵巣炎及び睾丸炎、自己免
疫血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎
、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、チャ
ーグ−ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素病、クローン
病、円板状狼蒼、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、糸球体腎炎、
グレーヴズ病、ギヤン−バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫
斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、メニエール病
、混合結合組織病、多発性硬化症、Ｉ型又は免疫を介する糖尿病、重症筋無力症、尋常性
天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発性
筋痛、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、
乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス
、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテ
マトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱
疹状皮膚炎脈管炎のような血管炎、白斑、及びヴェーゲナー肉芽腫症が挙げられる。炎症
性障害の例には、これらに限定されないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾
患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性障害、敗血症ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未
分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、及び慢性的なウイルス又は細菌感染から生じる慢性
炎症が挙げられる。本明細書のセクション２．２．２に記載の通り、いくつかの自己免疫
障害は炎症性疾患と関連している。このように、自己免疫障害と考えられる障害と炎症性
障害と考えられる障害との間には重複がある。従って、いくつかの自己免疫障害は炎症性
障害としても特徴付けることができる。本発明の方法により予防、治療又は管理すること
ができる炎症性障害の例としては、これらに限定されないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患
、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー障害、敗血症ショック、肺線維症、未分化
脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、及び慢性的なウイルス又は細菌感染
による慢性炎症が挙げられる。
ＦｃγＲＩＩＢに特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメイン及び／又はＦｃγ
ＲＩＩＢに対する親和性が亢進し、かつＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性が低下した変異
型Ｆｃドメインを有する本発明の分子は更に、炎症性障害のある動物、特に哺乳動物、が
経験する炎症を軽減するために使用することもできる。具体的な実施形態では、本発明の
分子は動物の炎症を、前記分子を投与されてない動物の炎症と比較して、少なくとも９９
％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少な
くとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４
５％、少なくとも４０％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少
なくとも２０％，又は少なくとも１０％軽減する。
ＦｃγＲＩＩＢに特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメイン及び／又はＦｃγ
ＲＩＩＢに対する親和性が亢進し、かつＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性が低下した変異
型Ｆｃドメインを有する本発明の分子は更に、移植の拒絶反応を防止するために用いるこ
ともできる。
５．６．３．感染性疾患
本発明はまた、被験者における感染症の治療又は予防の方法を包含し、該方法は、感染
症と関連した感染性因子に特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを有する、
１つ以上の本発明の分子の治療上又は予防上有効な量を投与することを含む。ある特定の
実施形態において、本発明の分子は感染性因子に対して毒性であり、該分子の不在下での
免疫応答と比べて、該因子に対する免疫応答を亢進するか、又は該因子に対するエフェク
ター機能を亢進する。本発明の分子によって治療又は予防し得る感染症は、これらに限定
されないが、ウイルス、細菌、真菌、原虫、及びウイルスを含む感染性因子により引き起
こされる。
本発明の方法とともに、本発明の分子を用いて治療又は予防し得るウイルス性疾患とし
ては、これらに限定されないが、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘
、アデノウイルス、Ｉ型単純ヘルペス（ＨＳＶ−Ｉ）、ＩＩ型単純ヘルペス（ＨＳＶ−Ｉ
Ｉ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、
パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボ
ウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイ
ルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、天然痘ウイルス、エプスタイン−バールウイルス
、Ｉ型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−Ｉ）、ＩＩ型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−Ｉ
Ｉ）、及びウイルス性髄膜炎、脳炎、デング熱又は天然痘のようなウイルス性疾患の因子
により引き起こされるものが挙げられる。
本発明の方法とともに、本発明の分子を用いて治療又は予防し得る細菌性疾患は、これ
らに限定されないが、マイコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、肺
炎球菌、ライム病ボレリア（ライム病）、炭疽菌（炭疽病）、破傷風、連鎖球菌、スタフ
ィロコッカス、マイコバクテリウム、百日咳、コレラ、ペスト、ジフテリア、クラミジア
、黄色ブドウ球菌及びレジオネラ菌を含む細菌により引き起こされる。
本発明の方法とともに、本発明の分子を用いて治療又は予防し得る原虫性疾患は、これ
らに限定されないが、リーシュマニア、コクシジウム、トリパノソーマ又はマラリアを含
む原虫により引き起こされる。
本発明の方法とともに、本発明の分子を用いて治療又は予防し得る寄生虫性疾患は、こ
れらに限定されないが、クラミジア及びリケッチアを含む寄生虫により引き起こされる。
本発明の１つの態様によれば、感染性因子に特異的な少なくとも１つのエピトープ結合
ドメインを有する本発明の分子は、該因子、例えば、病原性タンパク質に対する抗体エフ
ェクター機能を示す。感染性因子の例として、これらに限定されないが、細菌（例えば、
大腸菌、肺炎桿菌、黄色ブドウ球菌、腸球菌、カンジダ・アルビカンス、プロテウス・ブ
ルガリス、スタフィロコッカス・ビリダンス及びシュードモナス・アエルギノーサ）、病
原体（例えば、Ｂリンパ球向性パポバウイルス（ＬＰＶ）；ボルダテラ・ペルツッシス；
ボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）；ウシコロナウイルス；脈絡髄膜炎ウイルス；デング熱ウイ
ルス；ウイルス、大腸菌；エボラ；エコーウイルス１；エコーウイルス１１（ＥＶ）；エ
ンドトキシン（ＬＰＳ）；腸内細菌；腸内オーファンウイルス；腸内ウイルス；ネコ白血
病ウイルス；手足口病ウイルス；テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）；グラム陰性細
菌；ヘリコバクター・ピロリ；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）；単純ヘルペスウイルス；Ｈ
ＩＶ−１；ヒトサイトメガロウイルス；ヒトコロナウイルス；インフルエンザＡ、Ｂ及び
Ｃ；レジオネラ菌；リーシュマニア・メキシカーナ；リステリア・モノサイトゲネス；は
しかウイルス；髄膜炎菌；麻疹ウイルス；マウス肝炎ウイルス；マウス白血病ウイルス；
マウスガンマヘルペスウイルス；マウスレトロウイルス；マウスコロナウイルス；マウス
肝炎ウイルス；ミコバクテリウム・アビウム−Ｍ；リン菌；ニューキャッスル病ウイルス
；パルボウイルスＢ１９；熱帯熱マラリア原虫；ポックスウイルス；シュードモナス；ロ
タウイルス；サルモネラ・チフィウリウム；赤痢菌；連鎖球菌；Ｔ−細胞リンパ球ウイル
ス１；ワクシニアウイルス）が挙げられる。
５．６．４．解毒
本発明はまた、毒素（例えば、毒性の薬物分子）にさらされた被験者の解毒方法を包含
し、該方法は、毒性の薬物分子に特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを有
する１種以上の本発明の分子の治療上又は予防上有効な量を投与することを含む。ある特
定の実施形態において、本発明の分子の毒素への結合は該毒素の有害な生理学的作用を軽
減又は排除する。更に他の実施形態では、本発明のダイアボディの毒素への結合は、該ダ
イアボディの不在下での毒素の除去、分解若しくは中和と比較して、毒素の除去、分解若
しくは中和を増大又は亢進する。本発明の方法による免疫毒素療法は、これらに限定され
ないが、ジゴキシン、ＰＣＰ、コカイン、コルヒチン、三環式抗うつ薬を含む薬物の過剰
投与又は該薬物への曝露を治療するために使用することができる。
５．７．併用療法
本発明は更に、これらに限定されないが、現行の標準的及び実験的化学療法、ホルモン
療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法又は外科手術を含む、癌、自己免疫疾患、感
染症、又は中毒の治療又は予防のための当業者に公知の療法と併用して、本発明の分子を
投与することを包含する。いくつかの実施形態では、本発明の分子を、治療上又は予防上
有効な量の１種以上の薬剤、治療用抗体、又は癌、自己免疫疾患、感染症、若しくは中毒
の治療及び／又は予防のために当業者に公知の薬剤と併用して、投与してもよい。
ある実施形態では、１種以上の本発明の分子を、癌の治療に有用なその他の１種以上の
治療薬と同時に、哺乳動物、好ましくはヒトに投与する。用語「同時に」は、予防薬又は
治療薬の投与と全く同時に投与することに限定するものではなく、むしろ本発明の分子と
その他の薬剤を哺乳動物に連続的かつ一定の時間間隔以内に投与して、本発明の分子がそ
の他の薬剤と共に作用して、これらを別々に投与した場合よりも有利であることを意味す
る。例えば、予防又は治療用薬（例えば、化学療法、放射線療法、ホルモン療法又は生物
学的療法）のそれぞれを、同時に、又は任意の順序で連続的に異なる時点で投与してもよ
い。しかし、同時に投与しない場合は、所望の治療又は予防効果が提供されるように、時
間的に十分近接させて投与すべきである。各治療薬は、任意の適切な形態で、かつ任意の
好適な経路で、別々に投与することができる。種々の実施形態では、予防薬又は治療薬を
１時間未満の間隔、約１時間の間隔、約１時間〜約２時間の間隔、約２時間〜約３時間の
間隔、約３時間〜約４時間の間隔、約４時間〜約５時間の間隔、約５時間〜約６時間の間
隔、約６時間〜約７時間の間隔、約７時間〜約８時間の間隔、約８時間〜約９時間の間隔
、約９時間〜約１０時間の間隔、約１０時間〜約１１時間の間隔、約１１時間〜約１２時
間の間隔、２４時間間隔以下又は４８時間間隔以下で投与する。好ましい実施形態では、
２種以上の成分を患者の同一来診時に投与する。
別の実施形態では、予防薬又は治療薬を、約２〜４日の間隔、約４〜６日の間隔、約１
週間の間隔、約１〜２週間の間隔、２週間以上の間隔で、投与する。好ましい実施形態で
は、予防薬又は治療薬を、両方の薬剤が依然活性である時間枠内に、投与する。当業者な
らば、投与する薬剤の半減期を測定することによって、こうした時間枠を決定することが
できる。
ある実施形態では、本発明の予防薬又は治療薬を、被験者に周期的に投与する。周期的
治療には、第１薬剤をある期間投与した後、第２薬剤及び／又は第３薬剤をある期間投与
し、この連続投与を繰り返すことを含む。周期的治療は、１種以上の療法に対する耐性の
進行を減少させ、療法の１つの副作用を回避するか又は減少させ、かつ／又は治療の効力
を向上させることができる。
ある特定の実施形態では、予防薬又は治療薬を、約３週間未満の周期で、約２週間毎に
１回、約１０日毎に１回、又は約１週間毎に１回、投与する。１周期には、周期毎に約９
０分間、周期毎に約１時間、周期毎に約４５分間かけて注入することによる、治療薬又は
予防薬の投与を含むことができる。各周期は少なくとも１週間の休止、少なくとも２週間
の休止、少なくとも３週間の休止期を含むことができる。投与する周期の回数は約１〜約
１２周期、より典型的には約２〜約１０周期、より典型的には約２〜約８周期である。
更に別の実施形態では、本発明の治療及び予防薬を、規則正しい投薬計画で、長期の休
止期間を置かない連続注入又は頻繁投与のいずれかによって投与する。こうした規則正し
い投与には、休止期間のない、一定の間隔での投薬が含まれうる。典型的には、治療薬、
特に細胞毒性薬を低用量で使用する。こうした投薬計画には、長期間の比較的低用量の連
日投与が包含される。好ましい実施形態では、低用量の使用は、毒性副作用を最少にし、
休止期間を排除することができる。ある実施形態では、治療及び予防薬の長期低用量投与
又は連続注入を、約２４時間から約２日まで、約１週間まで、約２週間まで、約３週間ま
で、約１ヶ月まで、約２ヶ月まで、約３ヶ月まで、約４ヶ月まで、約５ヶ月まで、約６ヶ
月まで行う。こうした投薬計画のスケジュールは腫瘍専門家により最適化することができ
る。
別の実施形態では、複数の治療コースを哺乳動物に同時に投与する。即ち、個別の用量
の治療薬は別々に投与されるが、本発明の分子が他の薬剤と共に作用できるような時間間
隔内に投与する。例えば、ある成分を１週間に１回投与し、それと組み合わせて、別の成
分を２週間毎に１回、又は３週間毎に１回投与してもよい。言い換えれば、治療薬の投薬
計画は、治療薬が同時に又は患者の同一来診時に投与されないときでさえ、同時に実施さ
れる。
他の予防及び／又は治療薬と併用する場合、本発明の分子と他の予防及び／又は治療薬
は相加的に、より好ましくは相乗的に、作用することができる。一つの実施形態では、本
発明の分子を１つ以上の治療薬とともに同一の医薬組成物中で同時に投与する。別の実施
形態では、本発明の分子を１つ以上の他の治療薬とともに別々の医薬組成物として同時に
投与する。更に別の実施形態では、本発明の分子を、他の予防又は治療薬の投与前、又は
投与後に投与する。本発明は、同一又は異なる投与経路、例えば経口及び非経口で、本発
明の分子を他の予防又は治療薬と併用して投与することを想定している。ある特定の実施
形態では、本発明の分子を、これらに限定されないが、毒性などの有害副作用をもたらす
可能性がある他の予防又は治療薬と同時に投与する場合、その予防又は治療薬は、有害副
作用が誘発される閾値より低い用量で投与することができ、有利である。
本明細書で提供する投薬量及び投与頻度は、治療上有効な及び予防上有効なという用語
により包含されている。投薬量及び頻度は更に、典型的には各患者に特有な要因に従って
、投与する特定の治療又は予防薬、癌の重篤度及びタイプ、投与経路、ならびに患者の年
齢、体重、応答性、及び過去の病歴に応じて、変更される。好適な治療計画は、こうした
因子を考慮し、例えば文献に報告され、またＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆ
ｅｒｅｎｃｅ（第５６版，２００２）で推奨されている投薬量に従うことによって、当業
者が選択し得るものである。
５．７．１．抗癌剤
具体的な実施形態では、本発明の方法は、１つ以上の本発明の分子を、癌の治療及び／
又は予防のために使用される１つ以上の治療薬とともに投与することを包含する。一つの
実施形態では、血管新生阻害薬を本発明の分子と併用して投与してもよい。本発明の方法
及び組成物中で使用することができる血管新生阻害薬としては、これらに限定されないが
、アンギオスタチン（プラスミノーゲン断片）；抗血管新生抗トロンビンＩＩＩ；アンギ
オザイム；ＡＢＴ−６２７；Ｂａｙ１２−９５６６；ベネフィン；ベバシズマブ；ＢＭＳ
−２７５２９１；軟骨由来阻害薬（ＣＤＩ）；ＣＡＩ；ＣＤ５９補体断片；ＣＥＰ−７０
５５；Ｃｏｌ３；コンブレタスタチンＡ−４；エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩ断
片）；フィブロネクチン断片；Ｇｒｏ−β；ハロフギノン；ヘパリナーゼ類；ヘパリンヘ
キササッカライド断片；ＨＭＶ８３３；ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）；ＩＭ−８
６２；インターフェロンα／β／γ；インターフェロン誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）
；インターロイキン−１２；クリングル５（プラスミノーゲン断片）；マリマスタット；
メタロプロテイナーゼ阻害薬（ＴＩＭＰｓ）；２−メトキシエストラジオール；ＭＭＩ２
７０（ＣＧＳ２７０２３Ａ）；ＭｏＡｂＩＭＣ−１Ｃ１１；ネオバスタット；ＮＭ−３；
パンゼム；ＰＩ−８８；胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤；プラスミノーゲン活性化因子阻害
剤；血小板因子−４（ＰＦ４）；プリノマスタット；プロラクチン１６ｋＤａ断片；プロ
リフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）；ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５９４；レチノイド；
ソリマスタット；スクアラミン；ＳＳ３３０４；ＳＵ５４１６；ＳＵ６６６８；ＳＵ１１
２４８；テトラヒドロコルチゾール−Ｓ；テトラチオモリブダート；サリドマイド；トロ
ンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）；ＴＮＰ−４７０；トランスフォーミング増殖因子β
（ＴＧＦ−ｂ）；バスキュロスタチン；バソスタチン（カルレチキュリン断片）；ＺＤ６
１２６；ＺＤ６４７４；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害薬（ＦＴＩ）；及びビスホ
スホナート類が挙げられる。
本発明の医薬組成物及び剤形ならびにキットを含む、本発明の各種の実施形態において
本発明の分子と併用して使用することができる抗癌薬としては、これらに限定されないが
、アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデ
スロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミ
ド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペル
リン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカル
タミド；塩酸ビサントレン；ジメシル酸ビスナフィド；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン
；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロ
ン；カラセミド；カルベチメル；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カル
ゼレシン；セデフィンゴル；クロランブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリ
ビン；メシル酸クリスナトル；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチ
ノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メ
シル酸デザグアニン；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシ
ン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；ジ
ュアゾマイシン；エダトレキサート；塩酸エフロルニチン；エルサミトルシン；エンロプ
ラチン；エンプロマート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；塩酸エ
ソルビシン；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；
エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェ
ンレチニド；フロキシウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロシタビ
ン；フォスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒ
ドロキシウレア；塩酸イダルビシン；イフォスファミド；イルモフォシン；インターロイ
キンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩ又はｒＩＬ２を含む）、インターフェロンα−２
ａ；インターフェロンα−２ｂ；インターフェロンα−ｎ１；インターフェロンα−ｎ３
；インターフェロンβ−Ｉａ；インターフェロンγ−Ｉｂ；イプロプラチン；塩酸イリノ
テカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；塩酸リアロゾール；ロメ
トレキソルナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコル；メイタンシ
ン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロル；酢酸メレンゲストロル；メルファラン；メ
ノガリル；メルカプトプリン ；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メト
プリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；ミトマ
ルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；ミコフェノー
ル酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル
；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルホス
ファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；プ
ロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プ
ロカルバジン；ピューロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；
ログレチミド；サフィンゴル；塩酸サフィンゴル；セムスチン；シントラゼン；スパルホ
サートナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピ
ロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；
テコガランナトリウム；テガフル；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド
；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリ
ン；チラパザミン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；ト
リメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾー
ル；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラス
チン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビング
リシナート；硫酸ビンレウロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン；硫酸ビンゾ
リジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシンが挙げられる。その
他の抗癌薬としては、これらに限定されないが、２０−エピ−１，２５ジヒドロキシビタ
ミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；ア
デシペノル；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫ拮抗薬；アルトレタミン；
アンバムスチン；アミドックス；アミフォスチン；アミノレブリン酸；アンルビシン；ア
ンサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管形成阻害薬；
拮抗薬Ｄ；拮抗薬Ｇ；アンタレリクス；抗背方化形態発生タンパク質−１；抗アンドロゲ
ン前立腺癌；抗エストロゲン；抗ネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；グ
リシン酸アフィジコリン；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシスレギュレー
ター；アプリン酸；アラ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アシュラ
クリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；ア
キシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導
体；バラノル；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬ拮抗薬；ベンゾクロリン類；ベンゾイル
スタウロスポリン；βラクタム誘導体；βアレチン；βクラマイシンＢ；ベチュリン酸；
ｂＦＧＦ阻害薬；ビカルタミド；ビサントレン；ビサジリジニルスペルミン；ビスナフィ
ド；ビストラテンＡ；ビゼレシン；ブレフラート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニ
ンスルホキシイミン；カルシポトリオル；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナ
リポクスＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシ
アミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔＭ３；ＣＡＲＮ７００；軟骨由来阻害薬；カルゼレシ
ン；カゼインキナーゼ阻害薬（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロ
レリクス；クロルン；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；ｃｉｓ−ポル
フィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；
コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；
クランベシジン８１６；クリスナトル；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体
；キュラシンＡ；シクロペントアントラキノン類；シクロプラタム；シペマイシン；シタ
ラビンオクホスファート；細胞溶解因子；シトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；
デヒドロジデムニンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド；デクスラ
ゾキサン；デクスベラパミル；ジアジクオン；ジデムニンＢ；ジドクス；ジエチルノルス
ペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；ジヒドロタキソール，９−；ジオキサマイシン
；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノル；ドラセトロン；ドキシフルリ
ジン；ドロロキシフェン；ドロナビノル；ジュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコム
スチン；エデルフォシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エ
ピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲン作動薬；エストロ
ゲン拮抗薬；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；フ
ァザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドル；フ
レゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；塩酸フルロダウノルニシン；ホルフェニ
メクス；ホルメスタン；ホストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；
硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリクス；ゲラチナーゼ阻害薬；ゲムシタビン；グル
タチオン阻害薬；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ハイ
ペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモフ
ォシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン類；イミキモド；免疫刺激ペプチド類；イ
ンスリン様成長因子−１受容体阻害薬；インターフェロン作動薬；インターフェロン類；
インターロイキン類；イオベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノル，４−；イ
ロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンＢ；イタセト
ロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；三酢酸ラメラリン−Ｎ；ランレオチド；レイ
ナマイシン；レノグラスチム；硫酸レンチナン；レプトルスタチン；レトロゾール；白血
病抑制因子；白血球αインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン
；ロイプロレリン；レバミソール；リアロゾール；線状ポリアミン類似体；親油性ジサッ
カライドペプチド；親油性白金化合物；リソクリナミド７；ロバプラチン；ロンブリシン
；ロメトレキソル；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルル
トテカン； ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；溶解性ペプチド類；マイタンシ
ン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコル；マスピン；マトリリシン阻害薬
；マトリックス金属プロテイナーゼ阻害薬；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチ
オニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害薬；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリ
モスチム；ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトル）；マイトマイシン類
似体；ミトナフィド；マイトトキシン線維芽成長因子−サポリン；ミトキサントロン；モ
ファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒト絨毛ゴナドトロフィン；モノ
ホスホリルリピドＡ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ；モピダモル；多重薬剤耐性遺伝子阻
害薬；多発性腫瘍抑制因子１に基づく治療；マスタード抗癌薬；マイカペルオキシドＢ；
マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換ベンズ
アミド類；ナファレリン；ナグレスチップ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフ
テルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；中性エンド
ペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素モジュレーター；ニトロキシド抗
酸化剤；ニトルリン；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌ
クレオチド類；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口
サイトカイン誘導薬；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイ
シン；パクリタキセル；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体類；パラウアミン
；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバ
クチン；パゼリプチン；ぺグアスパルガーゼ；ペルデシン；ポリ硫酸ペントサンナトリウ
ム；ペントスタチン；ペントロゾール；パーフルブロン；パーホスファミド；ペリリルア
ルコール；フェナジノマイシン；フェニル酢酸塩；リン酸塩阻害薬；ピシバニル；塩酸ピ
ロカルピン；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラセチンＢ；プラスミノ
ーゲン活性化因子阻害薬；白金複合体；白金化合物；白金−トリアミン複合体；ポルフィ
マーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルｂｉｓ−アクリドン；プ
ロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害薬；タンパク質Ａ系免疫モジュレーター；タ
ンパク質キナーゼＣ阻害薬；タンパク質キナーゼＣ阻害薬類、ミクロアルガル；タンパク
質チロシンホスファターゼ阻害薬；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害薬；プルプリ
ン類；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン抱合体；ｒ
ａｆ拮抗薬；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質トランス
フェラーゼ阻害薬；ｒａｓ阻害薬；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害薬；脱メチル化レテリプチン；レ
ニウムＲｅ１８６エチドロナート；リゾキシン；リボザイム類；ＲＩＩレチナミド；ログ
レチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメクス；ルビギノンＢｌ；ルボキシル；サフ
ィンゴル；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトルＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ
1模倣体；セムスチン；セネセンス誘導阻害薬１；センスオリゴヌクレオチド類；シグナ
導入阻害薬；シグナル導入モジュレーター；一本鎖抗原結合性タンパク質；シゾフィラン
；ソブゾキサン；ボロカプト酸ナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロル；ソマ
トメジン結合性タンパク質；ソネルミン；スパルホジン酸；スピカマイシンＤ；スピロム
スチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン１；スクアラミン；幹細胞阻害薬；幹細胞
分裂阻害薬；スチピアミド；ストロメリシン阻害薬；スルフィノシン；高作用性血管作用
性腸内ペプチド拮抗薬；スラジスタ；スラミン；スウェインソニン；合成グリコサミノグ
リカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコ
ガランナトリウム；テガフル；テルラピリリウム；テロメラーゼ阻害薬；テモポルフィン
；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブラスチ
ン；チオコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣体；チマルファシン；チモ
ポエチン受容体作動薬；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；エチオエチオプルプリンス
ズ；チラパザミン；二塩化チタノセン；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子
；翻訳阻害薬；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサー
ト；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害薬；チルホ
スチン類；ＵＢＣ阻害薬；ウベニメクス；尿生殖洞由来成長抑制因子；ウロキナーゼ受容
体拮抗薬；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクターシステム、赤血球遺伝子治療；ベラレ
ソル；ベラミン；ベルジン類；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタ
キシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；及びジノスタチンスチ
マラマーが挙げられる。好ましいその他の抗癌薬は５−フルオロウラシル及びロイコボリ
ンである。
本発明の方法で使用することができる治療用抗体の例としては、これらに限定されない
が、急性腎同種移植片拒絶反応の予防用の、免疫抑制性ヒト化抗ＣＤ２５モノクローナル
抗体である、ＺＥＮＡＰＡＸＳ（登録商標）（ダクリズマブ）（Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、スイス）；マウス抗１７−ＩＡ細胞表面抗原ＩｇＧ２ａ抗体であ
る、ＰＡＮＯＲＥＸＴＭ（Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ／Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；マウス
抗イディオタイプ（ＧＤ３エピトープ）ＩｇＧ抗体である、ＢＥＣ２（ＩｍＣｌｏｎｅ
Ｓｙｓｔｅｍ）；キメラ抗ＥＧＦＲＩｇＧ抗体である、ＩＭＣ−Ｃ２２５（ＩｍＣｌｏｎ
ｅ Ｓｙｓｔｅｍ）；ヒト化抗αＶβ３インテグリン抗体である、ＶＩＴＡＸＩＮＴＭ（
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）；ヒ
ト化抗ＣＤ３３ＩｇＧ抗体である、ＳｍａｒｔＭ１９５（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ
Ｌａｂ／Ｋａｎｅｂｏ）；ヒト化抗ＣＤ２２ＩｇＧ抗体である、ＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ
ＴＭ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）；ヒト化抗ＩＣＡＭ３抗体である、ＩＣＭ３（ＩＣＯ
Ｓ Ｐｈａｒｍ）；霊長類化抗ＣＤ８０抗体である、ＩＤＥＣ−１１４（ＩＤＥＣＰｈａ
ｒｍ／Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）；ヒト化抗ＣＤ４０Ｌ抗体である、ＩＤＥＣ−１３１（Ｉ
ＤＥＣ／Ｅｉｓａｉ）；霊長類化抗ＣＤ４抗体である、ＩＤＥＣ−１５１（ＩＤＥＣ）；
霊長類化抗ＣＤ２３抗体である、ＩＤＥＣ−１５２（ＩＤＥＣ／Ｓｅｉｋａｇａｋｕ）；
ヒト化抗ＣＤ３ＩｇＧである、ＳＭＡＲＴ抗ＣＤ３（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌ
ａｂ）；ヒト化抗補体因子５（Ｃ５）抗体である、５Ｇ１．１（Ａｌｅｘｉｏｎ Ｐｈａ
ｒｍ）；ヒト化抗ＴＮＦ−α抗体である、Ｄ２Ｅ７（ＣＡＴ／ＢＡＳＦ）；ヒト化抗ＴＮ
Ｆ−αＦａｂ断片である、ＣＤＰ８７０（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）；霊長類化抗ＣＤ４ＩｇＧ
１抗体である、ＩＤＥＣ−１５１（ＩＤＥＣＰｈａｒｍ／ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅ
ｃｈａｍ）；ヒト抗ＣＤ４ＩｇＧ抗体である、ＭＤＸ−ＣＤ４（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｅｉｓ
ａｉ／Ｇｅｎｍａｂ）；ヒト化抗ＴＮＦ−αＩｇＧ４抗体である、ＣＤＰ５７１（Ｃｅｌ
ｌｔｅｃｈ）；ヒト化抗α４β７抗体である、ＬＤＰ−０２（ＬｅｕｋｏＳｉｔｅ／Ｇｅ
ｎｅｎｔｅｃｈ）；ヒト化抗ＣＤ４ＩｇＧ抗体である、ＯｒｔｈｏＣｌｏｎｅＯＫＴ４Ａ
（Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ）；ヒト化抗ＣＤ４０ＬＩｇＧ抗体である、ＡＮＴＯＶＡ
ＴＭ（Ｂｉｏｇｅｎ）；ヒト化抗ＶＬＡ−４ＩｇＧ抗体である、ＡＮＴＥＧＲＥＮＴＭ（
Ｅｌａｎ）；及びヒト抗ＴＧＦ−β２抗体である、ＣＡＴ−１５２（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ
Ａｂ Ｔｅｃｈ）が挙げられる。本発明に従って使用することができる治療用抗体のそ
の他の例を表８に示す。
Figure 2015157833
Figure 2015157833
Figure 2015157833
５．７．２．免疫調節薬及び抗炎症薬
本発明は、本発明の分子を他の治療薬とともに投与することを有する、自己免疫疾患及
び炎症性疾患の治療方法を提供する。免疫調節薬の例としては、これらに限定されないが
、メトトレキセート、ＥＮＢＲＥＬ、ＲＥＭＩＣＡＤＥＴＭ、レフルノミド、シクロホス
ファミド、シクロスポリンＡ、及びマクロライド抗生物質（例えば、ＦＫ５０６（タクロ
リムス））、メチルプレドニゾロン（ＭＰ）、コルチコステロイド、ステロイド、ミコフ
ェノール酸モフェチル、ラパマイシン（シロリムス）、ミゾリビン、デオキシスペルグア
リン、ブレキナル、マロノニトロアミンデ類（例えば、レフルナミド）、Ｔ細胞受容体モ
ジュレーター、及びサイトカイン受容体モジュレーターが挙げられる。
抗炎症薬は、炎症性疾患及び自己免疫疾患の治療において成功をおさめており、現在、
このような疾患のための通常かつ標準的治療薬である。当業者に周知の抗炎症薬も本発明
の方法に使用することができる。抗炎症薬の非限定的な例としては、非ステロイド系抗炎
症薬（ＮＳＡＩＤ）、ステロイド系抗炎症薬、β作動薬、抗コリン作動薬、及びメチルキ
サンチンが挙げられる。ＮＳＡＩＤの例としては、これらに限定されないが、アスピリン
、イブプロフェン、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸＴＭ）、ジクロフェナク（ＶＯＬＴ
ＡＲＥＮＴＭ）、エトドラク（ＬＯＤＩＮＥＴＭ）、フェノプロフェン（ＮＡＬＦＯＮＴ
Ｍ）、インドメタシン（ＩＮＤＯＣＩＮＴＭ）、ケトララク（ＴＯＲＡＤＯＬＴＭ）、オ
キサプロジン（ＤＡＹＰＲＯＴＭ）、ナブメントン（ＲＥＬＡＦＥＮＴＭ）、スリンダク
（ＣＬＩＮＯＲＩＬＴＭ）、トルメンチン（ＴＯＬＥＣＴＩＮＴＭ）、ロフェコキシブ（
ＶＩＯＸＸＴＭ）、ナプロキセン（ＡＬＥＶＥＴＭ、ＮＡＰＲＯＳＹＮＴＭ）、ケトプロ
フェン（ＡＣＴＲＯＮＴＭ）及びナブメトン（ＲＥＬＡＦＥＮＴＭ）が挙げられる。この
ようなＮＳＡＩＤは、シクロオキシゲナーゼ酵素（例えば、ＣＯＸ−１及び／又はＣＯＸ
−２）を阻害することにより機能する。ステロイド系抗炎症薬の例としては、これらに限
定されないが、グルココルチコイド、デキサメタゾン（ＤＥＣＡＤＲＯＮＴＭ）、コルチ
ゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン（ＤＥＬＴＡＳＯＮＥＴＭ）、プレドニゾロン、
トリアムシノロン、アザルフィジン、及びプロスタグランジン、トロンボキサン、及びロ
イコトリエンなどのエイコサノイドが挙げられる。
炎症性疾患の治療又は予防のために本発明の分子と併用して使用することができる抗体
の非限定的な例を表９に示し、また、自己免疫疾患の治療又は予防のために使用すること
ができる抗体の非限定的な例を表１０に示す。
Figure 2015157833
Figure 2015157833
Figure 2015157833
５．７．３．感染症治療用の薬剤
いくつかの実施形態では、本発明の分子は、感染症の治療及び／又は予防のために、当
業者に公知の１種以上のさらなる治療薬の治療上又は予防上有効な量と組み合わせて投与
してもよい。本発明は、感染症の治療及び／又は予防のための当業者に公知の抗生物質と
組み合わせた、本発明の分子の使用を想定している。本発明の分子と組み合わせて用いる
ことができる抗生物質としては、これらに限定されないが、マクロライド（例えば、トブ
ラマイシン（Ｔｏｂｉ（登録商標））、セファロスポリン（例えば、セファレキシン（Ｋ
ｅｆｌｅｘ（登録商標））、セフラジン（Ｖｅｌｏｃｅｆ（登録商標））、セフロキシム
（Ｃｅｆｔｉｎ（登録商標））、セフプロジル（Ｃｅｆｚｉｌ（登録商標））、セファク
ロール（Ｃｅｃｌｏｒ（登録商標））、セフィキシム（Ｓｕｐｒａｘ（登録商標））又は
セファドロキシル（Ｄｕｒｉｃｅｆ（登録商標）））、クラリスロマイシン（例えば、ク
ラリスロマイシン（Ｂｉａｘｉｎ（登録商標））、エリスロマイシン（例えば、エリスロ
マイシン（ＥＭｙｃｉｎ（登録商標））、ペニシリン（例えば、ペニシリンＶ（Ｖ−Ｃｉ
ｌｌｉｎＫ（登録商標）又はＰｅｎＶｅｅＫ（登録商標）））又はキノロン（例えば、オ
フロキサシン（Ｆｌｏｘｉｎ（登録商標））、シプロフロキサシン（Ｃｉｐｒｏ（登録商
標））又はノルフロキサシン（Ｎｏｒｏｘｉｎ（登録商標）））、アミノ配糖体系抗生物
質（例えば、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン、ブチロシン、ジベカシ
ン、ネオマイシン、ウンデシレネート、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイ
シン、シソマイシン、及びスペクチノマイシン）、アムフェニコール系抗生物質（例えば
、アジダムフェニコール、クロラムフェニコール、フロルフェニコール、及びチアムフェ
ニコール）、アンサマイシン系抗生物質（例えば、リファマイド及びリファンピン）、カ
ルバセフェム系（例えば、ロラカルベフ）、カルバペネム系（例えば、ビアペネム及びイ
ミペネム）、セファロスポリン系（例えば、セファクロール、セファドロキシル、セファ
マンドール、セファトリジン、セファゼドン、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピ
ラミド、及びセフピロム）、セファマイシン系（例えば、セフブペラゾン、セフメタゾー
ル、及びセフミノクス）、モノバクタム系（例えば、アズトレオナム、カルモナム、及び
チゲモナム）、オキサセフェム系（例えば、フロモキセフ、及びモキサラクタム）、ペニ
シリン系（例えば、アムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アモキシシリン、バカ
ンピシリン、ベンジルペニシリン酸、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン、フェ
ンベニシリン、フロキサシリン、ペナムシリン、ペネタメートヒドリオダイド、ペニシリ
ンｏ−ベネタミン、ペニシリンＯ、ペニシリンＶ、ペニシリンＶベンザチン、ペニシリン
Ｖヒドラバミン、ペニメピシクリン、及びフェンシヒシリンカリウム）、リンコサミド系
（例えば、クリンダマイシン、及びリンコマイシン）、アンフォマイシン、バシトラシン
、カプレオマイシン、コリスチン、エンジュラシジン、エンビオマイシン、テトラサイク
リン系（例えば、アピサイクリン、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、及びデ
メクロサイクリン）、２，４−ジアミノピリミジン系（例えば、ブロジモプリム）ニトロ
フラン系（例えば、フラルタドン、及び塩化フラゾリウム）、キノロン及びその類似体（
例えば、シノキサシン、クリナフロキサシン、フルメキン、及びグレパグロキサシン）、
スルホンアミド系（例えば、アセチルスルファメトキシピラジン、ベンジルスルフアミド
、ノプリルスルフアミド、フタリルスルフアセトアミド、スルフアクリソイジン、及びス
ルファシチン）、スルホン系（例えば、ジアチモスルホン、グルコスルホンナトリウム、
及びソラスルホン）、シクロセリン、ムピロシン及びチュベリンが挙げられる。
ある実施形態では、本発明の分子は、治療上又は予防上有効な量の１種以上の抗真菌剤
と組み合わせて投与することができる。本発明の分子と組み合わせて用いることができる
抗真菌剤としては、これらに限定されないが、アンフォテリシンＢ、イトラコナゾール、
ケトコナゾール、フルコナゾール、イントラセカル、フルシトシン、ミコナゾール、ブト
コナゾール、クロトリマゾール、ニスタチン、テルコナゾール、チオコナゾール、シクロ
ピロクス、エコナゾール、ハロプログリン、ナフチフィン、テルビナフィン、ウンデシレ
ネート、及びグリセオフルビンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明の分子は、治療上又は予防上有効な量の１種以上の抗
ウイルス薬と組み合わせて投与することができる。本発明の分子と組み合わせて用いるこ
とができる有効な抗ウイルス薬には、これらに限定されないが、プロテアーゼ阻害剤、ヌ
クレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤及びヌクレオシド類似体
が挙げられる。抗ウイルス薬の例としては、これらに限定されないが、ジドブジン、アシ
クロビル、ガンシクロビル、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン、及びリバ
ビリン、並びにホスカルネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビ
ル、アンプレナビル、ロピナビル、リトナビル、αインターフェロン、アデフォビル、ク
レバジン、エンテカビル、プレコナリルが挙げられる。
５．８．ワクチン療法
本発明は、本発明の組成物を用いて、抗原性又は免疫原性物質に対する免疫応答を誘発
することを更に包含し、該物質としては、これらに限定されないが、癌抗原及び感染症抗
原（これらの例は後述する）が含まれる。本発明のワクチン組成物は、免疫応答が望まれ
る１つ以上の抗原性又は免疫原性物質を含み、該１つ以上の抗原性又は免疫原性物質は、
ＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性が亢進されている本発明の変異型抗体により被覆されて
いる。本発明のワクチン組成物は、抗原性又は免疫原性物質に対する免疫応答、好ましく
は防御性免疫応答を引き起こすのに特に有効である。
いくつかの実施形態では、本発明のワクチン組成物中の抗原性又は免疫原性物質は、免
疫応答が望まれるウイルスを含む。ウイルスは組換え体又はキメラでもよく、好ましくは
弱毒化されている。組換え体、キメラ、及び弱毒化ウイルスの産生は、当業者に公知の標
準的な手法を用いて行ってよい。本発明は、本発明に従って製剤化される生組換えウイル
スワクチン又は不活化組換えウイルスワクチンを包含する。生ワクチンは、宿主内での複
製が自然感染と同種かつ同程度の持続的な刺激をもたらし、従って、十分かつ長期的な免
疫を与えるので、好ましい。そのような生組換えウイルスワクチン製剤の作製は、細胞培
養物又はニワトリ胚の尿膜中でのウイルス増殖と、それに続く精製を含む従来の方法を用
いて実施してよい。
具体的な実施形態では、組換えウイルスは、それが投与される被験者に対して非病原性
のものである。これに関して、ワクチン用に遺伝子操作ウイルスを使用するには、これら
のウイルス株が弱毒化特性をもつ必要がある。トランスフェクションに用いる鋳型に適当
な突然変異（例えば欠失）を導入すると、弱毒化特性を有する新規ウイルスが得られる。
例えば、温度感受性又は寒冷適応に関連する特定のミスセンス突然変異を、欠失突然変異
中に導入することができる。これらの突然変異は、寒冷又は温度感受性変異体に関連する
点突然変異よりも安定でなければならず、復帰突然変異の頻度が極めて低くなければなら
ない。組換えウイルスを作製するための組換えＤＮＡ技術は、本技術分野で公知であり、
本発明に包含される。例えば、負鎖ＲＮＡウイルスを改変する技術は本技術分野において
公知である。例えば、米国特許第５，１６６，０５７号を参照（これは参照することによ
りその全体を本明細書に組み入れる）。
あるいはまた、「自殺」特性を有するキメラウイルスを構築し、本発明を皮内ワクチン
製剤に使用してもよい。そのようなウイルスは、宿主内でわずかに１〜数回の複製しか行
うことがない。ワクチンとして用いたときには、組換えウイルスは限られた複製サイクル
を行い、十分なレベルの免疫応答を誘発するが、ヒト宿主中で更に複製サイクルを行って
、病気を引き起こすことはない。あるいはまた、不活化（死滅）ウイルスを本発明に従っ
て製剤化してもよい。不活化ワクチン製剤は、キメラウイルスを「死滅させる」ための、
従来の技術を用いて調製してもよい。不活化ワクチンは、その感染性が破壊されていると
いう意味で「死んでいる」。理想的には、ウイルスの感染性がその免疫原性に影響するこ
となく破壊される。不活化ワクチンを調製するには、キメラウイルスを細胞培養物若しく
はニワトリ胚尿膜中で増殖させ、ゾーン超遠心により精製し、ホルムアルデヒド若しくは
β−プロピオラクトンにより不活化してプールする。
ある実施形態では、他のウイルス性又は非ウイルス性病原体に由来する抗原を含む、完
全に外来性のエピトープを、本発明の皮内ワクチン製剤に使用されるウイルス内に遺伝子
操作により入れることができる。例えば、例えば、ＨＩＶ（ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇ
ｐ４１）のような非関連ウイルスの抗原、寄生虫抗原（例えば、マラリア）、細菌若しく
は真菌抗原又は腫瘍抗原を、遺伝子操作により弱毒化株に入れることができる。
実際上、あらゆる異種遺伝子配列を、皮内ワクチン製剤で使用するための本発明のキメ
ラウイルス内に構築してよい。好ましくは、異種遺伝子配列は、生物学的応答の改変因子
として作用する部分又はペプチドである。好ましくは、様々な病原体のいずれかに対して
防御性免疫応答を引き起こすエピトープ、又は中和抗体に結合する抗原が、キメラウイル
スによって、又はその一部として発現されてよい。例えば、本発明のキメラウイルスに構
築され得る異種遺伝子配列には、これらに限定されないが、インフルエンザ及びパライン
フルエンザ赤血球凝集素ノイラミニダーゼ及びヒトＰＩＶ３のＨＮ及びＦ遺伝子などの融
合糖タンパク質が挙げられる。また別の実施形態では、キメラウイルス内に遺伝子操作し
得る異種遺伝子配列として、免疫調節活性を有するタンパク質をコードするものが含まれ
る。免疫調節タンパク質の例としては、これらに限定されないが、サイトカイン、Ｉ型イ
ンターフェロン、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン−１、−２
、−４、−５、−６、−１２、及びこれら物質の拮抗物質が挙げられる。
また別の実施形態では、本発明は、変異型抗体をその表面に発現する病原性細胞又はウ
イルス、好ましくは弱毒化ウイルスを包含する。
代替的な実施形態では、本発明のワクチン組成物は、抗原性又は免疫原性物質が、Ｆｃ
γＲＩＩＩＡに対する親和性が亢進された本発明の変異型抗体と動作可能なように連結さ
れている、融合ポリペプチドを有する。本発明のワクチン組成物に使用するための融合ポ
リペプチドの操作は、常用の組換えＤＮＡ技術の方法を用いて行われ、通常の技能の範囲
内である。
本発明は、本発明の組成物を投与することにより、被験者に免疫寛容を誘発する方法を
更に包含する。好ましくは、被験者に免疫寛容を誘発するのに適した組成物は、本発明の
変異型抗体によって被覆された抗原性又は免疫原性物質を含み、該変異型抗体はＦｃγＲ
ＩＩＢに対してより高い親和性を有する。特定の作用機構に拘束されることを意図するも
のではないが、そのような組成物はＦｃγＲＩＩＢを介する阻害経路を活性化することに
より免疫寛容を誘発するのに有効である。
５．９．組成物及び投与方法
本発明は、複数のエピトープ結合ドメイン及び任意にＦｃドメイン（又はその一部）を
有する本発明の分子（即ちダイアボディ）を有する方法及び医薬組成物を提供する。本発
明はまた、被験者に有効な量の、本発明の融合タンパク質若しくは抱合体分子、又は本発
明の融合タンパク質若しくは抱合体分子を含む医薬組成物を投与することによる、疾患、
障害又は感染に関連する１つ以上の症状を治療、予防、及び改善する方法を更に提供する
。好ましい態様では、抗体、融合タンパク質、又は抱合体分子は、実質的に精製されてい
る（即ち、その効果を制限するか又は望ましくない副作用を引き起こす物質を実質的に含
まない）。具体的な実施形態では、被験者は動物、好ましくは哺乳動物、例えば非霊長類
（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）及び霊長類（例えば、カニクイ
ザルなどのサル及びヒト）である。好ましい実施形態では、被験者はヒトである。また別
の好ましい実施形態では、本発明の抗体は被験者と同じ生物種に由来するものである。
様々な送達系が知られていて、本発明の分子を有する組成物を投与するために利用する
ことができるが、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル内への封入、抗体又は
融合タンパク質を発現することができる組換え細胞、受容体介在細胞内取り込み（例えば
、Ｗｕら，（１９８７），Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｇ
ｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂｙ Ａ Ｓｏｌｕｂｌｅ ＤＮＡ Ｃａｒｒ
ｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：４４２９−４４３２を参照
）、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築などがある。本発明の分
子を投与する方法には、これらに限定されないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、
腹腔内、静脈内及び皮下）、硬膜外、及び粘膜（例えば、鼻腔内及び口腔経路）が含まれ
る。具体的な実施形態では、本発明の分子を筋肉内、静脈内、又は皮下に投与する。組成
物を任意の都合のよい経路により、例えば、注入又はボーラス注射により、上皮又は皮膚
粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸管粘膜など）を介する吸収により投与してもよ
く、他の生物学的活性薬剤と一緒に投与してもよい。投与は全身的でも局所的でもよい。
更に、例えば、吸入器又は噴霧器の使用により、及びエアロゾル化剤を用いる製剤化によ
り肺投与を採用することもできる。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号、第５，９
８５，３２０号、第５，９８５，３０９号、第５，９３４，２７２号、第５，８７４，０
６４号、第５，８５５，９１３号、第５，２９０，５４０号及び第４，８８０，０７８号
；及び国際公開第ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３
、ＷＯ９８／３１３４６及びＷＯ９９／６６９０３を参照（これらのそれぞれを参照する
ことによりその全体を本明細書に組み入れる）。
本発明はまた、アンプルや小袋などの、抗体の量を表示している、密閉容器中に本発明
の分子を包装することを提供する。一つの実施形態では、本発明の分子を、乾燥した無菌
凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として密閉容器に入れて供給し、例えば、水又は生理食塩水
を用いて被験者に投与するための適当な濃度に再調製することができる。好ましくは、本
発明の分子を、乾燥した無菌凍結乾燥粉末として密閉容器に入れ、少なくとも５ｍｇ、更
に好ましくは少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくと
も３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、又は少なくとも７５ｍｇの単位
用量にて供給する。凍結乾燥した本発明の分子は、その元の容器内で２〜８℃で貯蔵しな
ければならず、また、該分子は、再調製後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間
以内、３時間以内、又は１時間以内に投与しなければならない。代替的な実施形態では、
本発明の分子を、液剤として、該分子、融合タンパク質、又は抱合体分子の量及び濃度を
表示する密閉容器に入れて供給する。好ましくは、本発明の分子の液剤を、密閉容器に入
れて、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは少なくとも２．５ｍｇ／ｍＬ、少なくと
も５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１５
ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１００
ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２００ｍｇ／ｍＬの該分子にて供
給する。
疾患に関連する１つ以上の症状を治療、予防又は改善するために有効である本発明の組
成物の量は、標準的な臨床技術により決定することができる。製剤中で用いる正確な用量
はまた、投与経路や病状の重篤度にも左右され、医師の判断及び各患者の状況によって決
定されねばならない。有効な用量をインビトロ又は動物モデル試験系から誘導した用量−
応答曲線から推定してもよい。
本発明により包含されるダイアボディの場合、患者に投与される投与量は、典型的には
、患者の体重に対して、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。好ましくは
、患者に投与される用量は、患者の体重に対して、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／
ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋ
ｇ、０．０００１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋ
ｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍ
ｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０
．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ／ｋｇ又は
０．０１〜０．１０ｍｇ／ｋｇである。本発明のダイアボディの投与量と頻度は、例えば
、リピド化などの改変によりダイアボディの取込み及び組織浸透を増強することによって
、低減又は変更することができる。
一つの実施形態では、患者に投与される本発明の分子の投与量は、単剤療法として用い
られる場合、０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ／日である。他の実施形態では、本発明の分子
を他の治療用組成物と一緒に用いて、患者に投与される投与量を、上記分子を単剤療法と
して用いるときより低くする。
具体的な実施形態では、本発明の医薬組成物を、治療の必要な部位に局所投与すること
が望ましい。これは、例えば、限定するものではないが、局所注入により、注射により、
又はシリコン膜などの膜又は繊維を含む多孔質、非多孔質、又はゼラチン状の材料からな
る移植片により達成してもよい。好ましくは、本発明の分子を投与する時に、分子が吸収
されない材料を使うように注意しなければならない。
他の実施形態では、組成物を小胞、特にリポソームにより送達することができる（Ｌａ
ｎｇｅｒ，（１９９０），Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ
，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ
ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ
Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉ
ｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓ
ｔｅｉｎ，同書，ｐｐ．３１７−３２７；一般的には同書を参照）。
更に他の実施形態では、組成物を制御放出又は持続放出系で送達することができる。当
業者に公知の任意の技術を用いて、本発明の１種以上の分子を有する持続放出製剤を作製
することができる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開ＷＯ９１／０５
５４８；国際公開ＷＯ９６／２０６９８；Ｎｉｎｇら，（１９９６），Ｉｎｔｒａｔｕｍ
ｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｈｙ Ｏｆ Ａ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｏ
ｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｕｓｉｎｇ Ａ Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｒｅｌ
ｅａｓｅ Ｇｅｌ，Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３９：１７９−１８
９，Ｓｏｎｇら，（１９９５），Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｌｕｎｇ Ｔａ
ｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｌｏｎｇ−Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ，ＰＤ
Ａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，５０：３７２−３９７；Ｃｌｅｅｋら，（１９９７），Ｂｉｏｄｅｇｒａ
ｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｆｏｒ ＡｂＦＧＦ Ａｎｔｉｂ
ｏｄｙ Ｆｏｒ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｏ．Ｉ
ｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｒｅｌ． Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２４
：８５３−８５４；及びＬａｍら，（１９９７），Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏ
ｎ Ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒ Ｌｏｃａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍ
ｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２４：７５９−７６０を参
照、それぞれを参照することによりその全体を本明細書に組み入れる。他の実施形態では
、ポンプを制御放出システムで用いてもよい（Ｌａｎｇｅｒ，前掲；Ｓｅｆｔｏｎ，（１
９８７），Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ Ｐｕｍｐｓ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍ
ｅｄ．Ｅｎｇ．，１４：２０１−２４０；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，（１９８０），Ｌｏｎｇ
−Ｔｅｒｍ，Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ｈｅｐａｒｉｎ Ａｄｍ
ｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｂｙ Ａｎ Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｐ
ｕｍｐ Ｉｎ Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｒｅｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｖｅｎｏｕｓ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，Ｓｕｒｇｅｒｙ，８８：５０７−５１６；及
びＳａｕｄｅｋら，（１９８９），Ａ Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｔｒｉａｌ Ｏｆ Ｔ
ｈｅ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ Ｓ
ｙｓｔｅｍ Ｆｏｒ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．
，３２１：５７４−５７９参照）。他の実施形態では、ポリマー材料を用いて抗体の制御
放出を達成することができる（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏ
ｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（編），
ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒ
ｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（編
），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｌｅｖｙら，（１９８５），Ｉｎｈｉ
ｂｉｔｉｏｎ Ｏｆ Ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ
Ｈｅａｒｔ Ｖａｌｖｅｓ Ｂｙ Ｌｏｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−Ｒｅｌｅａｓ
ｅ Ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：１９０−１９２；Ｄｕｒｉ
ｎｇら，（１９８９），Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｏｆ Ｄｏｐａｍｉｎ
ｅ Ｆｒｏｍ Ａ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｂｒａｉｎ Ｉｍｐｌａｎｔ：Ｉｎ Ｖｉｖｏ
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１−３５６；
Ｈｏｗａｒｄら，（１９８９），Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅ
ｒｙ Ｉｎ Ｒａｔｓ Ｗｉｔｈ Ｌｅｓｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｅｍｏｒｙ Ｄｅ
ｆｉｃｉｔｓ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．，７（１）：１０５−１１２；米国特許第５，
６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号
；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；国際公開ＷＯ９
９／１５１５４；及び国際公開ＷＯ９９／２０２５３を参照）。持続放出製剤に使用され
るポリマーの例としては、これらに限定されないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタク
リレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ
−酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ
（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エ
チレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（Ｐ
ＬＧＡ）、及びポリオルトエステルが挙げられる。更に他の実施形態では、制御放出シス
テムを治療標的（例えば、肺）の近位に配置することで、全身用量の一部しか必要としな
いようにすることができる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，前掲，第２巻，ｐｐ．１１
５−１３８（１９８４）を参照）。他の実施形態では、制御放出移植片として有用なポリ
マー組成物が、Ｄｕｎｎら（米国特許第５，９４５，１５５号を参照）に従い用いられる
。この特定の方法は、ポリマー系からの生物活性物質のインサイチュ制御放出の治療効果
に基づく。移植は一般的に、治療処置を必要とする患者体内のいずれの場所でも起こり得
る。他の実施形態では非ポリマー系の持続送達システムが使用されるが、この場合には、
被験者体内の非ポリマー移植片が薬物送達システムとして使用される。体内に移植すると
、移植片の有機溶媒が、該組成物から周囲組織液中に散逸、分散又は浸出して、非ポリマ
ー材料が徐々に凝集又は沈降し、固体の微孔質マトリックスを形成する（米国特許第５，
８８８，５３３号を参照）。
制御放出システムは、Ｌａｎｇｅｒによる文献（１９９０，Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１５２７−１５３３）に
記載されている。本発明の１種以上の治療薬を有する持続放出製剤は、当業者に公知のい
ずれの技術を用いて作製することができる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号；
国際公開ＷＯ９１／０５５４８及びＷＯ ９６／２０６９８；Ｎｉｎｇら，（１９９６）
，Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｈｙ Ｏｆ Ａ Ｈ
ｕｍａｎ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｕｓｉｎｇ Ａ Ｓｕｓｔ
ａｉｎｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ Ｇｅｌ，Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，
３９：１７９−１８９；Ｓｏｎｇら，（１９９５），Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉａｔｅ
ｄ Ｌｕｎｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｌｏｎｇ−Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｍｕ
ｌｓｉｏｎｓ，ＰＤＡ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５０：３７２−３９７；Ｃｌｅｅｋら，（１９９７）
，Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｆｏｒ Ａ
ｂＦＧＦ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎ，Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍ
ａｔｅｒ．，２４：８５３−８５４；及びＬａｍら，（１９９７），Ｍｉｃｒｏｅｎｃａ
ｐｓｕｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒ Ｌｏｃａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｐｒｏ．Ｉｎ
ｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２４：７５
９−７６０を参照（これらのそれぞれを参照することによりその全体を本明細書に組み入
れる）。
本発明の組成物が本発明のダイアボディをコードする核酸である具体的な実施形態では
、該核酸を適当な核酸発現ベクターの一部として構成し、それが細胞内に取り込まれるよ
うにこれを投与することによって該核酸をインビボで投与し、そのコードされたダイアボ
ディの発現を促進することができる。細胞内への取り込みは、例えば、レトロウイルスベ
クターを使用することによって（米国特許第４，９８０，２８６号を参照）、又は直接注
射によって、又は微粒子衝突（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）に
よって、又は脂質、細胞表面受容体若しくはトランスフェクト試薬で被覆することによっ
て、又は核に侵入することが知られるホメオボックス様ペプチドと連結させて投与するこ
と（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら，（１９９１），Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ Ｈｏｍｅｏｂ
ｏｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｎｅｕｒａｌ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉ
ｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１８６４−１８６８を参照
）などによって行う。あるいはまた、核酸を細胞内に導入して、相同的組換えによって発
現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むこともできる。
治療上又は予防上有効な量の本発明の分子を用いる被験者の治療は、単回治療であって
もよいが、好ましくは、一連の治療を含む。好ましい例においては、体重当たり約０．１
〜３０ｍｇ／ｋｇの本発明の分子を用いて、週１回、約１〜１０週間にわたって、好まし
くは約２〜８週間にわたって、更に好ましくは約３〜７週間にわたって、より一層好まし
くは約４、５、又は６週間にわたって、被験者を治療する。他の実施形態では、本発明の
医薬組成物を１日１回、１日２回、又は１日３回投与する。他の実施形態では、医薬組成
物を週１回、週２回、２週毎に１回、月１回、６週毎に１回、２ヶ月毎に１回、年２回又
は年１回投与する。当然のことながら、治療に使用する分子の有効投与量は、特定の治療
期間を通して増減することがある。
５．９．１．医薬組成物
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に有用であるバルク薬組成物（例えば、不純な又
は非滅菌の組成物）及び単位投与剤形の調製に利用できる医薬組成物（即ち、被験者又は
患者に投与するのに適した組成物）を含む。そのような組成物は、予防上又は治療上有効
な量の本明細書中に開示した予防薬及び／又は治療薬又はそれらの薬剤の組合せと、製薬
上許容し得る担体とを有する。好ましくは本発明の組成物は、予防上又は治療上有効な量
の１種以上の本発明の分子及び製薬上許容される担体を有する。
本発明はまた、本発明のダイアボディ分子と、特定の癌抗原に特異的な治療用抗体（例
えば、腫瘍特異的モノクローナル抗体）と、製薬上許容される担体とを有する医薬組成物
を包含する。
具体的な実施形態において、用語「製薬上許容される」とは、動物、特にヒトでの使用
について、連邦政府又は州政府の規制当局により認可された、又は米国薬局方若しくは他
の一般的に認められた薬局方に掲げられたことを意味する。用語「担体」とは、治療薬が
それらとともに投与される、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（
完全及び不完全））、賦形剤、又は媒体を意味する。このような製薬上の担体は、ピーナ
ッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物又は合成起源のものを含む、水
や油などの無菌液体であってもよい。医薬組成物を静脈内投与する場合、水は好ましい担
体である。生理食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール水溶液も、液状担体、特
に注射液用として、利用することができる。好適な製薬上の賦形剤には、デンプン、グル
コース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲ
ル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム
、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが含まれる。組
成物はまた、所望により、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有してもよ
い。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳化液、錠剤、丸薬、カプセル剤、粉剤、持続放
出製剤などの剤形とすることができる。
一般的に、本発明の組成物の成分は、別々に又は一緒に混合して単位投与剤形で、例え
ば、乾燥した凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、活性薬剤の量が表示されているアンプ
ル又は小袋などの密閉容器に入れて供給される。組成物を注入により投与する場合は、製
薬等級の滅菌水又は生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて調剤してもよい。組成物を
注射により投与する場合は、無菌の注射用水又は生理食塩水のアンプルを成分が投与前に
混合されるようにして提供することができる。
本発明の組成物は、中性又は塩形態として製剤化することができる。製薬上許容される
塩としては、これらに限定されないが、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸
などから誘導されるアニオンにより形成された塩、及びナトリウム、カリウム、アンモニ
ウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチル
アミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されたカチオンにより形成され
た塩が含まれる。
５．９．２．遺伝子治療
具体的な実施形態では、遺伝子治療として、本発明の分子をコードする配列を有する核
酸を投与して、疾患、障害、又は感染に関連する１つ以上の症状を治療、予防、又は改善
する。遺伝子治療は、発現される又は発現可能な核酸を被験者に投与することにより行わ
れる治療を指す。本発明のこの実施形態では、核酸が、治療又は予防効果を媒介する、そ
のコードされた抗体又は融合タンパク質を産生する。
本技術分野で利用しうるいずれの遺伝子治療法も本発明に従って使用することができる
。代表的な方法を以下に記載する。
遺伝子治療法の一般的総論については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，（１９９３），Ｈｕｍ
ａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１２：４８８
−５０５；Ｗｕら，（１９９１），Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｆｏｒ Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，
（１９９３），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｉ
ａｌｓ Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａ
ｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，（１９９３），
Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２６０：９２６−９３２；及びＭｏｒｇａｎら，（１９９３），Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２：１９１−２１７を参照
。利用することができる組換えＤＮＡ技術の技術分野で一般に知られている方法は、Ａｕ
ｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；及びＫｒｉｅ
ｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、 Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記
載されている。
好ましい態様では、本発明の組成物は本発明のダイアボディをコードする核酸を含み、
該核酸は好適な宿主内で抗体を発現する発現ベクターの一部である。特に、このような核
酸は、抗体コード領域と機能的に連結されたプロモーター、好ましくは異種プロモーター
を有し、上記プロモーターは誘導性又は構成的、場合によっては組織特異的である。他の
特定の実施形態では、抗体コード配列及び他の所望の配列が、ゲノム内の所望の部位での
相同的組換えを促進する領域によって挟まれており、これにより、抗体をコードする核酸
が染色体内で発現される核酸分子が使用される（Ｋｏｌｌｅｒら，（１９８９），Ｉｎａ
ｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｔｈｅ Ｂｅｔａ ２−Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｌｏｃｕｓ
Ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｂｙ Ｈｏｍｏｌｏ
ｇｏｕｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８６：８９３２−８９３５；及びＺｉｊｌｓｔｒａら，（１９８９），Ｇｅｒｍ−Ｌ
ｉｎｅ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ Ｂｅｔａ ２−Ｍ
ｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ Ｂｙ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ｎ
ａｔｕｒｅ，３４２：４３５− ４３８）。
他の好ましい態様では、本発明の組成物は融合タンパク質をコードする核酸を含み、上
記核酸は好適な宿主において融合タンパク質を発現する発現ベクターの一部分である。特
に、このような核酸は、融合タンパク質のコード領域と機能的に連結されたプロモーター
、好ましくは異種プロモーターを有し、上記プロモーターは誘導性又は構成的、場合によ
っては組織特異的である。他の特定の実施形態では、融合タンパク質のコード配列及び他
の所望の配列が、ゲノム内の所望の部位での相同的組換えを促進する領域によって挟まれ
ており、これにより、融合タンパク質が染色体内で発現される核酸分子が使用される。
核酸の被験者への送達は、直接的、この場合には被験者を核酸又は核酸担持ベクターに
直接曝す、又は間接的、この場合には細胞を最初に核酸でインビトロにて形質転換し、次
いで被験者に移植する、のいずれであってもよい。これらの２つの手法は、それぞれ、生
体内及び生体外遺伝子治療として知られている。
具体的な実施形態では、核酸配列を直接インビボで投与し、そこで核酸がコード産物を
発現、産生する。これは、本技術分野で公知の多数の方法のいずれかにより、例えば、そ
れを適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、それを細胞内に取込まれるように投与
することにより、実施することができる。このような取込みは、例えば、欠損若しくは弱
毒化レトロウイルス又は他のベクターを使った感染により（米国特許第４，９８０，２８
６号を参照）、又は裸のＤＮＡの直接注入により、又は微粒子衝突（例えば、遺伝子銃；
Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）により、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくは
トランスフェクション試薬の被覆により、リポソーム、微粒子、若しくはマイクロカプセ
ル内への封入により、あるいは核に侵入することが知られるペプチドとそれらを連結して
投与することにより、受容体介在細胞内取り込みを受ける抗原と連結して投与すること（
例えば、Ｗｕら，（１９８７），Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎ Ｖｉｔｒ
ｏ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂｙ Ａ Ｓｏｌｕｂｌｅ ＤＮＡ Ｃ
ａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：４４２９−４４３２
を参照）（この方法は受容体を特異的に発現する細胞型を標的とするために用いられる）
などにより、実施することができる。別の実施形態では、エンドソームを破壊する融合性
ウイルスペプチドを有する抗原との核酸−抗原複合体を形成し、核酸のリソソーム分解を
回避することができる。更に別の実施形態では、特異的受容体を標的とすることにより、
核酸をインビボで細胞特異的な取込み及び発現へ向けることができる（例えば、国際公開
ＷＯ９２／０６１８０、ＷＯ９２／２２６３５、Ｗ０９２／２０３１６、Ｗ０９３／１４
１８８、ＷＯ９３／２０２２１を参照）。あるいはまた、核酸を細胞内に導入して、相同
的組換えによって、発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組込ませることができる（Ｋｏｌｌ
ｅｒら，（１９８９），Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｔｈｅ Ｂｅｔａ ２ −Ｍｉｃｒ
ｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｌｏｃｕｓ Ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ
Ｃｅｌｌｓ Ｂｙ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８９３２−８９３５；及びＺｉｊｌｓｔｒａ
ら，（１９８９），Ｇｅｒｍ−Ｌｉｎｅ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｄｉｓ
ｒｕｐｔｅｄ Ｂｅｔａ ２ −Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｄｕｃ
ｅｄ Ｂｙ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎ Ｅｍｂｒｙｏ
ｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５−４３８）。
具体的な実施形態では、本発明の分子（例えばダイアボディ又は融合タンパク質）をコ
ードする核酸配列を含有するウイルスベクターを用いる。例えば、レトロウイルスベクタ
ーを利用することができる（Ｍｉｌｌｅｒら，（１９９３），Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒｅｔｒｏ
ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ａｎｄ Ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７：５８１−５９９を参照）。これら
のレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージング及び宿主細胞ＤＮ
Ａ中への組込みのために必要な成分を含有する。遺伝子治療に利用する抗体又は融合タン
パク質をコードする核酸配列を１つ以上のベクター中にクローニングし、これによりヌク
レオチド配列の被験者への送達が容易になる。レトロウイルスベクターについてのさらな
る詳細はＢｏｅｓｅｎら，（１９９３），Ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｏｎ Ｏｆ Ｃｈｅｍ
ｏｔｈｅｒａｐｙ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｙｅｌｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｂｙ Ｔｒａ
ｎｓｆｅｒ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｍｄｒ１ Ｇｅｎｅ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，６：２９１−
３０２に見出すことができ、これは、化学療法により耐性のある造血幹細胞を作る目的で
ｍｄｒ１遺伝子を幹細胞へ送達するためのレトロウイルスベクターの使用を記載している
。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献には以下の
ものがある：Ｃｌｏｗｅｓら，（１９９４），Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｏｆ Ｉｎｊｕｒｅｄ Ｒａｔ Ｃａｒｏｔｉｄ Ａｒｔｅｒｙ
Ｓｅｅｄｅｄ Ｗｉｔｈ Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｎｇ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｌｙ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｓ，
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１；Ｋｅｉｍら，（１９９４），Ｒｅ
ｔｒｏｖｉｒｕｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｉｎｔｏ
Ｃａｎｉｎｅ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ Ｃｅ
ｌｌｓ，Ｂｌｏｏｄ，８３：１４６７−１４７３；Ｓａｌｍｏｎｓら，（１９９３），Ｔ
ａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４：１２９−１４１；及びＧ
ｒｏｓｓｍａｎら，（１９９３），Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ：Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅ
ｈｉｃｌｅ Ｔｏ Ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎ
ｄ Ｄｅｖｅｌ．，３：１１０−１１４。
アデノウイルスは、遺伝子治療に利用しうる他のウイルスベクターである。アデノウイ
ルスは、遺伝子を呼吸器上皮に送達する運搬体として特に魅力的である。アデノウイルス
は元来、呼吸器上皮に感染して軽度の疾患を引き起す。アデノウイルスに基づく送達系の
他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、及び筋肉である。アデノウイルスは分裂しな
い細胞に感染することができるので有利である。Ｋｏｚａｒｓｋｙら（１９９３，Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉ
ｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，３：４９９−５
０３）はアデノウイルスに基づく遺伝子治療法の総説を報告している。Ｂｏｕｔら（１９
９４，Ｌｕｎｇ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−
Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔｏ Ｒｈｅｓｕｓ Ｍｏｎｋｅｙ
Ａｉｒｗａｙ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，５：３
−１０）は、アデノウイルスベクターを利用して遺伝子をアカゲザルの呼吸器上皮へ導入
することを実証した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの利用の他の例は、Ｒｏｓｅｎ
ｆｅｌｄら，（１９９１），Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｆｅ
ｒ Ｏｆ Ａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｌｐｈａ１−Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ Ｇｅ
ｎｅ Ｔｏ Ｔｈｅ Ｌｕｎｇ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ Ｉｎ Ｖｉｖｏ，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２５２：４３１−４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，（１９９２），Ｉｎ Ｖｉｖｏ
Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｔｒ
ａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔ
ｏ Ｔｈｅ Ａｉｒｗａｙ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，Ｃｅｌｌ，６８：１４３−１５５；
Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら，（１９９３），Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ａｉｒｗａｙ
Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｆｏｒ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｒｅｃｏ
ｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅ
ｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９１：２２５−２３４；国際公開ＷＯ９４／１２６
４９；及びＷａｎｇら，（１９９５），Ａ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ
Ｆｏｒ Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕ
ｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｔｗｏ Ｌｅｔｈａｌ Ｇｅｎｅ−Ｒｅｇ
ｉｏｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２：７７５−７８３に見出す
ことができる。好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターが用いられる。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も遺伝子治療における利用が提案されている（例えば、
Ｗａｌｓｈら，（１９９３），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｍ
ｏｇｌｏｂｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２
０４：２８９−３００及び米国特許第５，４３６，１４６号を参照）。
遺伝子治療への他の取り組みは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸
カルシウムを介したトランスフェクション、又はウイルス感染などの方法により、組織培
養物中の細胞に遺伝子を導入することを含む。通常、導入の方法は、選択可能マーカーの
細胞への導入を含む。次いで導入遺伝子を取り込み発現する細胞を選択、単離する。次い
でそれらの細胞を被験者に送達する。
この実施形態では、核酸を細胞中に導入した後に、得られる組換え細胞をインビボ投与
する。このような導入は、当技術分野で公知のいずれかの方法、例えば、これらに限定さ
れないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション
、核酸配列を含有するウイルス又はバクテリオファージベクターを用いる感染、細胞融合
、染色体を介した遺伝子導入、微小細胞を介した遺伝子導入、スフェロプラスト融合など
により実施することができる。外来遺伝子を細胞中に導入するための多数の技術が本技術
分野で公知であり（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒら，（１９９３），Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓ
ｆｅｒ Ｉｎｔｏ Ｐｒｉｍａｒｙ Ａｎｄ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ Ｍａｍｍａｌｉ
ａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｗｉｔｈ Ｌｉｐｏｐｏｌｙａｍｉｎｅ−Ｃｏａｔｅｄ
ＤＮＡ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７：５９９−６１８；Ｃｏｔｔｅｎら，（１
９９３），Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｏｆ ＤＮＡ
Ｉｎｔｏ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７：
６１８−６４４を参照）、受容細胞の必要な発生的及び生理学的機能が破壊されないこと
を条件として本発明に従って利用することができる。その技術は核酸の細胞への安定な導
入を提供して、それにより核酸が細胞により発現可能になり、そして好ましくはその細胞
子孫に遺伝してかつ発現されうるものでなければならない。
得られる組換え細胞は、本技術分野で公知の様々な方法により被験者に送達することが
できる。組換え血液細胞（例えば、造血幹細胞又は前駆細胞）は、好ましくは、静脈内に
投与される。使用のために想定される細胞量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、
当業者が決定することが可能である。
遺伝子治療の目的で核酸が導入される細胞は、あらゆる所望の入手可能な細胞型を包含
し、これらに限定されないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細
胞、肝細胞、及びＴリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨
核球、顆粒球などの血液細胞、様々な幹細胞又は前駆細胞、特に、例えば、骨髄、臍帯血
、末梢血、胎児肝などから得られる造血幹細胞又は前駆細胞を含む。
好ましい実施形態では、遺伝子治療に使用される細胞は被験者自身に由来するものであ
る。
組換え細胞を遺伝子治療に使用する実施形態では、抗体又は融合タンパク質をコードす
る核酸配列を細胞中にそれらが該細胞又はその子孫により発現されるように導入し、次い
でその組換え細胞を治療効果のためにインビボで投与する。具体的な実施形態では、幹細
胞又は前駆細胞を用いる。単離可能でインビトロで維持できる幹細胞及び／又は前駆細胞
はどれも本発明のこの実施形態に従って利用できる可能性がある（例えば、国際公開ＷＯ
９４／０８５９８；Ｓｔｅｍｐｌｅら，（１９９２），Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ
Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ａｎｄ Ｇｌｉａ Ｆｒｏｍ Ｔｈｅ
Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｎｅｕｒａｌ Ｃｒｅｓｔ，Ｃｅｌｌ，７，１：９７３−９８５；
Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，（１９８０），Ｓｅｒｉａｌ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｎ
ｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，Ｍｅｔｈ
．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．，２１Ａ：２２９−２５４；及びＰｉｔｔｅｌｋｏｗら，（１９８
６），Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｓｋｉｎ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ Ａｎｄ Ｐｅｒｓｐ
ｅｃｔｉｖｅｓ Ｏｎ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ Ｆｏｒ Ｇｒａｆｔｉｎｇ Ｏｆ Ｐａｔ
ｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ Ｂｕｒｎｓ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐ
ｒｏｃ．，６１：７７１−７７７を参照）。
具体的な実施形態では、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、コード領域と機能的に
連結された誘導性プロモーターを含み、それにより適当な転写誘導物質の有無を制御する
ことにより核酸の発現が制御可能となる。
５．９．３．キット
本発明は、本発明の分子を充填した１つ以上の容器を有する医薬パック又はキットを提
供する。更に、疾患の治療に有用な１つ以上の他の予防又は治療薬を、医薬パック又はキ
ット中に含めることもできる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の１つ以上の成分を充
填した１つ以上の容器を有する医薬パック又はキットを提供する。場合によっては、この
ような容器に、医薬又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府当局が定める
形式で、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売の行政当局による認可を反映する注意
書きを添付することができる。
本発明は、上記の方法で使用することができるキットを提供する。一つの実施形態では
、キットは１つ以上の本発明の分子を有する。他の実施形態では、キットは更に、１つ以
上の容器中に、癌の治療に有用な１つ以上の他の予防又は治療薬を有する。別の実施形態
では、キットは更に、癌に関連する１つ以上の癌抗原と結合する１つ以上の細胞毒性性抗
体を含有する。ある実施形態では、他の予防又は治療薬は化学療法剤である。他の実施形
態では、予防又は治療薬は生物学的又はホルモン治療薬である。
５．１０．治療上の有用性の特徴付け及び検証
ヒトに使用する前に、本発明の医薬組成物、予防又は治療薬のいくつかの態様は、好ま
しくは、インビトロで、細胞培養系で、及びげっ歯類動物モデル系などの動物モデル生物
で、所望の治療活性について試験する。例えば、特定の医薬組成物の投与が適切なものか
どうかを確認するのに用いることができるアッセイには、患者組織試料を培養で増殖させ
、本発明の医薬組成物に曝露するか又は接触させ、そして組織試料に対する該組成物の効
果を観察する、細胞培養アッセイが含まれる。組織試料は患者から生検により得ることが
できる。この試験により、個々の患者に対して治療上最も有効な予防又は治療分子を同定
することができる。様々な具体的実施形態では、インビトロアッセイを、自己免疫疾患又
は炎症性疾患に関係する細胞型の代表的細胞（例えば、Ｔ細胞）を用いて実施し、本発明
の医薬組成物がそのような細胞型に対して所望の効果を奏するかどうかを確認することが
できる。
予防薬及び／又は治療薬の組合せは、ヒトで使用する前に、適当な動物モデル系で試験
することができる。このような動物モデル系としては、これらに限定されないが、ラット
、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが挙げられる。本技術分野で
周知のいずれの動物系を使用してもよい。本発明の具体的な実施形態では、予防及び／又
は治療薬の組合せはマウスモデル系で試験する。このようなモデル系は広く使用されてい
て、当業者に周知である。予防及び／又は治療薬は反復して投与することができる。この
手順の態様のいくつかは変更してもよい。かかる態様には、予防及び／又は治療薬の投与
計画の時間的管理、及びこのような薬剤を別々に投与するのか混合物として投与するのか
が含まれる。
本発明の方法に使用する好ましい動物モデルは、例えば、マウスエフェクター細胞上に
ヒトＦｃγＲを発現するトランスジェニックマウスであり、例えば、米国特許第５，８７
７，３９６号（参照することによりその全体を本明細書に組み入れる）に記載されたいず
れかのマウスモデルを本発明に用いることができる。本発明の方法に使用するトランスジ
ェニックマウスとしては、これらに限定されないが、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡを保有するマ
ウス；ヒトＦｃγＲＩＩＡを保有するマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＢ及びヒトＦｃγＲＩＩ
ＩＡを保有するマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＢ及びヒトＦｃγＲＩＩＡを保有するマウスが
挙げられる。好ましくは、上記の機能的アッセイ法において最大活性を示した変異を、ヒ
トへの使用に先立って動物モデル研究に使用して試験する。動物モデルでの使用に十分な
量の抗体を、上記の方法、例えば、本明細書に開示、例示される哺乳類発現系及び精製法
を用いて調製してもよい。
マウス異種移植モデルを用いて、腫瘍特異的標的に対して作製されたマウス抗体の効力
を、本発明のダイアボディ分子のエピトープ結合ドメインの親和性及び特異性、並びに免
疫応答を引き出すダイアボディの能力に基づいて試験してもよい（Ｗｕら，（２００１）
，Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ Ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉ
ｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１：Ｓ２−９）。マウスエフェクター細胞
上にヒトＦｃγＲを発現するトランスジェニックマウスは唯一のものであり、ヒトＦｃ−
ＦｃγＲ相互作用の効力を試験するためのオーダーメイドの動物モデルである。以下の表
１１に挙げられているようなＪｅｆｆｒｅｙ Ｒａｖｅｔｃｈ博士の研究室で作製された
ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＡトランスジェニックマウス系統の
対が（Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ大学とＳｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ癌センターとのラ
イセンス契約を介して）利用可能である。
Figure 2015157833
本発明の併用療法の抗炎症活性は、本技術分野で公知の、Ｃｒｏｆｆｏｒｄ Ｌ．Ｊ．
及びＷｉｌｄｅｒ Ｒ．Ｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ
ｉｎ Ａｎｉｍａｌｓ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ａｌｌｉｅｄ Ｃｏｎｄｉｔｉ
ｏｎｓ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，ＭｃＣａｒｔｙら（
編），第３０章（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ，１９９３）に記載の様々な炎症性関
節炎の実験動物モデルを利用して決定することができる。炎症性関節炎及び自己免疫リウ
マチ疾患の実験的及び自然発生的動物モデルはまた、本発明の併用療法の抗炎症活性を評
価するために利用することもできる。以下にアッセイ法の例のいくつかを示すが、これら
に限定されない。
当技術分野で公知であり、広く利用される関節炎又は炎症性疾患の主な動物モデルとし
ては、アジュバント誘導関節炎ラットモデル、コラーゲン誘導関節炎ラット及びマウスモ
デル、並びに抗原誘導関節炎ラット、ウサギ及びハムスターモデルが挙げられる。これら
全ては、Ｃｒｏｆｆｏｒｄ Ｌ．Ｊ．及びＷｉｌｄｅｒ Ｒ．Ｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ
ａｎｄ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ Ａｎｉｍａｌｓ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａ
ｎｄ Ａｌｌｉｅｄ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｈｅｕｍ
ａｔｏｌｏｇｙ，ＭｃＣａｒｔｙら（編），第３０章（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ
，１９９３）に記載され、これらは参照することによりその全体を本明細書に組み入れる
。
本発明の併用療法の抗炎症活性は、カラゲナン誘導関節炎ラットモデルを用いて評価す
ることができる。カラゲナンが誘導する関節炎はまた、慢性関節炎又は炎症の研究におい
て、ウサギ、イヌ及びブタでも利用されている。定量的な組織形態計測的評価が治療効力
の決定に用いられる。このようなカラゲナン誘導関節炎モデルを利用する方法は、Ｈａｎ
ｓｒａ Ｐ．ら，（２０００），Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｒｔｈｒ
ｉｔｉｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｒａｔ，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，２４（２）：１４１−１
５５に記載されている。また、ザイモサン誘導炎症動物モデルも一般的に利用されており
、本技術分野で公知である。
本発明の併用療法の抗炎症活性はまた、カラゲナンが誘導するラットの足浮腫の抑制を
、Ｗｉｎｔｅｒ Ｃ． Ａ．ら，（１９６２），Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ−Ｉｎｄｕｃｅ
ｄ Ｅｄｅｍａ ｉｎ Ｈｉｎｄ Ｐａｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｔ ａｓ ａｎ Ａｓｓ
ａｙ ｆｏｒ Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｒｕｇｓ，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．
Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１１１，５４４−５４７に記載の方法を改変して用いて測
定することにより、評価することもできる。このアッセイ法はほとんどのＮＳＡＩＤの抗
炎症活性に対する一次インビボスクリーニングとして用いられており、ヒトでの効力を予
測すると考えられている予防又は治療試験薬の抗炎症活性は、媒体を投与した対照群に対
する試験群の後足重量増加の抑制パーセントとして表される。
更に、炎症性腸疾患の動物モデルを、本発明の併用療法の効力を評価するのに用いるこ
ともできる（Ｋｉｍら，（１９９２），Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｏｌｉｔｉｓ Ｉ
ｎ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｒｏｌ．，２７
：５２９−５３７；Ｓｔｒｏｂｅｒ，（１９８５），Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ Ｏｆ
Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ−Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ，
Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．，３０（１２，Ｓｕｐｐｌ）：３Ｓ−１０Ｓ）。潰瘍性大腸炎
及びクローン病は、動物に誘導しうるヒト炎症性腸疾患である。これらに限定されないが
、アミロペクチン、カラゲーニン、硫酸アミロペクチン及び硫酸デキストランを含む硫酸
化された多糖類、又はこれらに限定されないが、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢ
Ｓ）及び酢酸を含む化学刺激剤を動物に経口投与して炎症性腸疾患を誘導することができ
る。
自己免疫疾患の動物モデルもまた、本発明の併用療法の効力を評価するのに用いること
ができる。Ｉ型糖尿病、甲状腺自己免疫、全身性エリテマトーデス、及び糸球体腎炎など
の自己免疫疾患の動物モデルが開発されている（Ｆｌａｎｄｅｒｓら，（１９９９），Ｐ
ｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｙｐｅ １ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｆｒｏｍ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｔｏ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，２９：２３
５−２４６；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら，（１９９９），Ｍｏｄｅｌｓ Ｔｏ Ｓｔｕｄｙ
Ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｏｆ Ｔｈｙｒｏｉｄ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ
，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，８１：５１１−５１５；Ｆｏｓｔｅｒ，（１９９９），Ｒｅｌｅ
ｖａｎｃｅ Ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｌｕｐｕｓ Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ Ｎｅ
ｐｈｒｉｔｉｓ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ Ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｓ
ｅｍｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，１９：１２−２４）。
更に、当業者に公知のいずれのアッセイ法も、自己免疫及び／又は炎症性疾患に対する
本明細書に開示した併用療法の予防上及び／又は治療上の有用性を評価するのに用いるこ
とができる。
本発明の予防及び／又は治療プロトコルの毒性及び効力は、細胞培養又は実験動物にお
ける標準的な薬学的手法により、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）及び
ＥＤ５０（集団の５０％における治療有効量）を測定することにより、決定することがで
きる。毒性と治療効果の間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表現
される。大きな治療指数を示す予防及び／又は治療薬が好ましい。毒性副作用を示す予防
及び／又は治療薬を使用することはできるが、このような薬物を罹患組織の部位にターゲ
ッティングする送達システムを設計して、非罹患細胞が損傷を受ける可能性を最小限に抑
え、それにより副作用を軽減するよう注意を払うべきである。
細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトに使用する予防及び／又は
治療薬の投与量の範囲を決定するのに利用することができる。このような薬物の投与量は
、好ましくは、毒性が低いか全くなく、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量
は、採用する投与剤形及び利用する投与経路に依存して変わりうる。本発明の方法で使用
するいずれの薬物においても、治療上有効な用量はまず細胞培養アッセイから推定するこ
とができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養で決定したＩＣ５０（即ち、症状の
最大半量の抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように
、決定してもよい。このような情報は、ヒトに有用な投与量を更に正確に決定するのに用
いることができる。血漿中の濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定す
ることができる。
本発明に従って使用される治療法の抗癌活性はまた、ヒト異種移植片をもつＳＣＩＤマ
ウスモデル、トランスジェニックマウス又はヌードマウスなどの癌研究用の様々な実験動
物モデルや、ハムスターやウサギなどの動物モデルを用いることにより決定することもで
き、これらは当技術分野で公知であり、Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｍｏｄ
ｅｌｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９９，Ｆｉｅｂ
ｉｇ及びＢｕｒｇｅｒ編）；Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ （
１９９９，Ｋａｒｇｅｒ）；Ｔｈｅ Ｎｕｄｅ Ｍｏｕｓｅ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１，Ｂｏｖｅｎ及びＷｉｎｏｇｒａｄ編）；及びＡｎｔｉｃａ
ｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ（１９９７編、Ｔｅｉｃｈｅ
ｒ）（これらは参照することによりその全体を本明細書に組み入れる）に記載されている
。
本発明の分子の治療効力を決定するのに好ましい動物モデルは、マウス異種移植モデル
である。異種移植腫瘍の供給源として用いることができる腫瘍細胞株としては、これらに
限定されないが、乳腺癌の患者から得られるＳＫＢＲ３及びＭＣＦ７細胞が挙げられる。
これらの細胞は、ｅｒｂＢ２とプロラクチンとの両者の受容体を有する。ＳＫＢＲ３細胞
は、ＡＤＣＣ及び異種移植腫瘍モデルとして、本技術分野において通常用いられている。
これとは別に、ヒト卵巣腺癌に由来するＯＶＣＡＲ３細胞を異種移植腫瘍の供給源として
用いることができる。
本発明のプロトコルと組成物は、ヒトに使用する前に、好ましくは、インビトロで、次
いでインビボで、所望の治療又は予防活性について試験される。治療薬及び治療法は、腫
瘍又は悪性培養細胞株の細胞を用いてスクリーニングしてもよい。本技術分野において標
準的な多くのアッセイ法を、このような生存及び／又は増殖を評価するのに用いることが
できる。例えば、細胞増殖は３Ｈ−チミジン取込みを測定することにより、直接細胞計数
により、プロトオンコジーン（例えば、ｆｏｓ、ｍｙｃ）又は細胞周期マーカーなどの公
知の遺伝子の転写活性の変化を検出することにより評価することができ、細胞生存率はト
リパンブルー染色により評価することができ、分化は形態の変化、軟寒天中での増殖及び
／又はコロニー形成の減少又は三次元基底膜又は細胞外マトリックス調製物中の管状ネッ
トワーク形成などに基づいて視覚的に評価することができる。
治療に用いる化合物は、ヒトで試験する前に好適な動物モデル系で試験することができ
、動物としては、これらに限定されないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウ
サギ、ハムスターなどが挙げられ、例えば、上記の動物モデルで試験することができる。
化合物はその後、適当な臨床試験で使用される。
更に、当業者に公知の任意のアッセイ法を使用して、癌、炎症性疾患、又は自己免疫疾
患の治療又は予防について本明細書に開示した併用療法の予防上及び／又は治療上の有効
性を評価することができる。
６．１．共有結合型二重特異性ダイアボディの設計と特徴付け
単一特異性共有結合型ダイアボディ及び二重特異性共有結合型ダイアボディを構築し、
それぞれの組換え体の作製、精製及び結合特性を評価した。本明細書に記載した組換え発
現系によって作製され、アフィニティー精製されたダイアボディ分子は、単一の二量体種
から成ることがＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ解析により判明した。ＥＬＩＳＡ及びＳＰＲ
解析により、共有結合型二重特異性ダイアボディは両方の標的抗原に親和性を示し、及び
両方の抗原と同時に結合できることが更に明らかになった。
材料及び方法
ポリペプチド分子の構築及び設計
核酸発現ベクターを設計し、図２に模式的に示した４つのポリペプチド構築物を作製した
。構築物１（配列番号９）は、ＦｃγＲＩＩＢを認識するヒト化２Ｂ６抗体のＶＬドメイ
ンとＦｃγＲＩＩＩＡとを認識するヒト化３Ｇ８抗体のＶＨドメインを含んでいた。構築
物２（配列番号１１）は、Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメインとＨｕ２Ｂ６のＶＨドメインとを含
んでいた。構築物３（配列番号１２）は、Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメインとＨｕ３Ｇ８のＶＨ
ドメインとを含んでいた。構築物４（配列番号１３）は、Ｈｕ２Ｂ６のＶＬドメインとＨ
ｕ２Ｂ６のＶＨドメインとを含んでいた。
ＰＣＲ及び発現ベクターの構築
ＶＬ及びＶＨドメインのコード配列を、最初のＰＣＲ産物が重複配列を含むように設計し
たフォワード及びリバースプライマーを用いて鋳型ＤＮＡから増幅した。これにより、重
複ＰＣＲで所望のポリペプチド構築物のコード配列を作製することが可能となる。
鋳型ＤＮＡの最初のＰＣＲ増幅
約３５ｎｇの鋳型ＤＮＡ、例えば、目的の抗体の軽鎖及び重鎖、１μＬの１０μＭフォ
ワードプライマー及びリバースプライマー、２．５μＬの１０×ｐｆｕＵｌｔｒａ緩衝液
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）、１μＬの１０ｍＭｄＮＴＰ、１μＬの２．５ユニ
ット／μＬのｐｆｕＵｌｔｒａＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）
、及び総量２５μＬになるように加えた蒸留水を、微量遠心チューブ内で静かに混合し、
微量遠心分離機で短時間回転して反応混合物をチューブの底に集めた。ＰＣＲ反応を、Ｇ
ｅｎｅＡｍｐＰＣＲシステム９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を
用いて行った。反応は、９４℃で２分間、続いて９４℃で１５秒間、５８℃で３０秒間及
び７２℃で１分間を２５サイクルに設定した。
Ｈｕ２Ｂ６のＶＬは、Ｈｕ２Ｂ６の軽鎖からフォワード及びリバースプライマー、それ
ぞれ配列番号５５及び５６、を用いて増幅した。Ｈｕ２Ｂ６のＶＨは、Ｈｕ２Ｂ６の重鎖
からフォワード及びリバースプライマー、それぞれ配列番号５７及び５８、を用いて増幅
した。Ｈｕ３Ｇ８のＶＬは、Ｈｕ３Ｇ８の軽鎖からフォワード及びリバースプライマー、
それぞれ配列番号５５及び５９、を用いて増幅した。Ｈｕ３Ｇ８のＶＨは、Ｈｕ３Ｇ８の
重鎖から、フォワード及びリバースプライマー、それぞれ配列番号６０及び６１、を用い
て増幅した。
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて１２０Ｖで３０分間、電気泳動した。ＰＣＲ産物
をゲルから切り出し、ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用
いて精製した。
重複ＰＣＲ
最初のＰＣＲ産物を下記のように混合し、鋳型ＤＮＡの最初の増幅で説明したＰＣＲ条件
と同一の条件を用いて増幅した。重複ＰＣＲの産物も、上記のように精製した。
構築物１をコードする核酸配列、配列番号９（図２に模式的に示す）をＨｕ２Ｂ６のＶ
ＬとＨｕ３Ｇ８のＶＨとのＰＣＲ増幅産物、及びフォワード及びリバースプライマー、そ
れぞれ配列番号５５及び６１、を混合して増幅した。構築物２をコードする核酸配列、配
列番号１１（図２に模式的に示す）をＨｕ３Ｇ８のＶＬとＨｕ２Ｂ６のＶＨとのＰＣＲ増
幅産物、及びフォワード及びリバースプライマー、それぞれ配列番号５５及び５８、を混
合して増幅した。構築物３をコードする核酸配列、配列番号１２（図２に模式的に示す）
をＨｕ３Ｇ８のＶＬとＨｕ３Ｇ８のＶＨとのＰＣＲ増幅産物、及びフォワード及びリバー
スプライマー、それぞれ配列番号５５及び６１、を混合して増幅した。構築物４をコード
する核酸配列、配列番号１３（図２に模式的に示す）をＨｕ２Ｂ６のＶＬとＨｕ２Ｂ６の
ＶＨとのＰＣＲ増幅産物、及びフォワード及びリバースプライマー、それぞれ配列番号５
５及び５８、を混合して増幅した。
ＶＬドメインのフォワードプライマー（即ち、配列番号５５）及びＶＨドメインのリバ
ースプライマー（即ち、配列番号５８及び配列番号６１）は、発現ベクター内へ最終産物
のクローニングする独特の制限部位を含んでいる。精製された重複ＰＣＲ産物を制限エン
ドヌクレアーゼＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、哺乳動物発現ベクターｐＣＩｎｅｏ（
Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）内にクローニングした。構築物をコードするプラスミドを表
１２に示すように命名した。
Figure 2015157833
ポリペプチド／ダイアボディの発現
構築物１をコードするｐＭＧＸ０６６９を、構築物２をコードするｐＭＧＸ０６６７と共
に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の
説明書に従ってＨＥＫ−２９３細胞にコトランスフェクトした。これら２つのプラスミド
のコトランスフェクションは、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＩＡの両方に対して免疫
特異的な共有結合型二重特異性ダイアボディ（ＣＢＤ）（ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ダイアボデ
ィ）が発現するように設計されている。構築物３及び４をそれぞれコードするｐＭＧＸ０
６６６及びｐＭＧＸ０６６８を、それぞれＦｃγＲＩＩＩＡ（ｈ３Ｇ８ダイアボディ）及
びＦｃγＲＩＩＢ（ｈ２Ｂ６ダイアボディ）に対してそれぞれ免疫特異的な共有結合型単
一特異性ダイアボディ（ＣＭＤ）の発現のために、ＨＥＫ−２９３細胞に別々に導入した
。培養３日後、分泌された産物を条件培地から精製した。
精製
ダイアボディを条件培地から、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂに結合させた関連抗原を
用いて回収した。充填前にアフィニティーセファロース樹脂を２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
８．０）で平衡化した。充填後、溶出前に、樹脂を平衡化緩衝液で洗浄した。ダイアボデ
ィを、５０ｍＭグリシン、ｐＨ３．０、を用いて洗浄済み樹脂から溶出した。溶出したダ
イアボディを、１Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０）で直ちに中和し、遠心分離型濃縮器を用い
て濃縮した。濃縮したダイアボディを、更にＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００
カラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、カラムから溶出されたダイアボディ
のおおよその大きさと不均一性を解析した。ＳＥＣ解析は、ＰＢＳで平衡化したＧＥ ｈ
ｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ１０／３０カラムで行われた。全長Ｉ
ｇＧ（約１５０ｋＤａ）、Ｆａｂ断片（約５０ｋＤａ）及び一本鎖Ｆｖ（約３０ｋＤａ）
の溶出プロファイルとの比較を対照として用いた。
ＥＬＩＳＡ：溶出及び精製されたダイアボディの結合性を、ＥＬＩＳＡアッセイによっ
てセクション５．４．２で説明したように、特徴付けした。９６−ウェルＭａｘｉｓｏｒ
ｐプレートを、１ウェル当たり５０μＬの２μｇ／ｍＬのｓＣＤ３２Ｂ−Ｉｇ溶液で、炭
酸緩衝液中、４℃で一晩被覆した。プレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ
２０）で３回洗浄し、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔ溶液で３０分間、室温にてブロッキ
ング処理した。続いて、ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ＣＢＤ、ｈ２Ｂ６ＣＭＤ又はｈ３Ｇ８ＣＭＤ
を、ブロッキング緩衝液を用いて倍々希釈し、０．５μｇ／ｍＬから０．００１μｇ／ｍ
Ｌまでの範囲のダイアボディ濃度を作製した。その後、プレートを室温で１時間インキュ
ベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、０．２μｇ／ｍＬのｓＣＤ１６Ａ−ビオチン
を１ウェル当たり５０μＬで、各ウェルに添加した。プレートを再び室温で１時間インキ
ュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、１：５０００希釈したＨＲＰ結合ストレプ
トアビジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を検出のために
１ウェル当たり５０μＬ用いた。ＨＲＰ−ストレプトアビジンを４５分間、室温でインキ
ュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＴＭＢ基質を１ウェル当たり８０μ
Ｌ用いて発色させた。１０分間のインキュベーション後、１％Ｈ２ＳＯ４を１ウェル当た
り４０μＬ加えることによって、ＨＲＰ−ＴＭＢ反応を停止させた。ＯＤ４５０ｎｍを９
６ウェルプレートリーダーとＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを用いて読み込み、結果はＧｒ
ａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ３．０３ソフトウェアを用いてプロットした。
バイアコアアッセイ
溶出及び精製されたダイアボディの結合の動態パラメーターを、セクション５．４．３で
説明したようにバイアコアアッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ１０００，
ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）及び付属のソフトウェア
を用いて解析した。
ｓＣＤ１６Ａ、ｓＣＤ３２Ｂ、又はｓＣＤ３２Ａ（陰性対照）を、センサーチップ表面
の４つのフローセルのうちの１つ（フローセル２）に、いずれの受容体も約１０００の応
答ユニット（ＲＵ）が表面上に固定されるように、（ＮＨＳ／ＥＤＣの混合物によるカル
ボキシメチル基の改変によって）アミン結合化学物を介して固定した。これに続いて、未
反応の活性エステルを、１ＭＥｔ−ＮＨ２を注入して「完成」した。調製した表面上に、
６．２５〜２００ｎＭの共有結合型二重特異性ダイアボディ（ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ＣＢＤ
）又は共有結合型単一特異性ダイアボディ（ｈ２Ｂ６ＣＭＤ又はｈ３Ｇ８ＣＭＢ）溶液を
、７０ｍＬ／ｍｉｎの流速で１８０秒間、流した。ｈ３Ｇ８ｓｃＦＶも比較用に試験した
。
全データセットを回収した時点で、得られた結合曲線を、製造業者であるＢＩＡｃｏｒ
ｅ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）より提供されるコンピュータアルゴリズムを用いて
、全体的に近似した。これらのアルゴリズムにより、Ｋｏｎ及びＫｏｆｆの両者を算出し
、これから、見かけの平衡結合定数ＫＤが２つの速度定数の比（即ちＫｏｆｆ／Ｋｏｎ）
として推定される。個々の速度定数をどのように導き出すかについてのより詳細な処理に
ついては、ＢＩＡｅｖａｌｕａｉｏｎソフトウェアハンドブック（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎ
ｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で知ることができる。
会合及び解離相は別々に近似した。解離速度定数は１８０秒の解離相の３２〜３４秒間
隔に対して得られ、会合相の一致は１：１ラングミュアモデルにより得、塩基の近似は二
重特異性ダイアボディとｓｃＦｖに関するＲｍａｘ及びカイ二乗法に基づいて選択し、二
価解析物の近似はＣＭＤ結合に使用した。
結果
非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ｈ３Ｇ８ＣＭＤ、ｈ２Ｂ６ＣＭＤ及び
ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ＣＢＤ発現系の精製産物は、約５０ｋＤａの推定分子量を有する、そ
れぞれ単一種であることが明らかとなった（図３のそれぞれレーン４、５及び６）。還元
条件下では、ＣＭＤの各発現系から精製された産物は、単一バンド（レーン１及び２）と
して移動したが、ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ＣＢＤ系から精製された産物は、２つの異なるタン
パク質（図３、レーン３）であることが明らかとなった。発現系から精製され、還元条件
下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって視覚化されたポリペプチドの全てが、約２８ｋＤａの位置
に移動した。
各発現系産物のＳＥＣ分析でも、それらが単一分子種であり（図４Ｂ）、それぞれＩｇ
ＧのＦａｂ断片（約５０ｋＤａ）とほぼ同じ時間で溶出されること（図４Ａ）が明らかと
なった。これらの結果は、アフィニティー精製した産物がＣＭＤ発現系の場合は同種の共
有結合型ホモ二量体であり、またｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ＣＢＤの場合は同種の共有結合型へ
テロ二量体であることを示している。
ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイを使用して、ＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ１６Ａのいず
れか一方又は両方に対するｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ＣＢＤの結合特異性を試験した（図５）。
ＣＤ３２Ｂを標的抗原として使用し、またＣＤ１６Ａを第２プローブとして使用した。Ｅ
ＬＩＳＡの陽性シグナルにより、ヘテロニ量体であるｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ＣＢＤは両抗原
に対して特異性を有することが明らかとなった。ｈ３Ｇ８ＣＭＤ（ＣＤ３２Ｂに結合しな
いはずである）での同様の試験では、シグナルが見られなかった。
ＳＰＲ解析は、ｈ３Ｇ８ＣＭＤがｓＣＤ１６を免疫特異的に認識するがｓＣＤ３２Ｂを
認識しないこと、ｈ２Ｂ６ＣＭＤがｓＣＤ３２Ｂを免疫特異的に認識するがｓＣＤ１６を
認識しないこと、そしてｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ＣＢＤがｓＣＤ１６とｓＣＤ３２Ｂの両方を
免疫特異的に認識することを示した（図６Ａ−Ｂ）。試験したダイアボディはいずれも、
対照受容体ｓＣＤ３２Ａには結合しなかった（図６Ｃ）。
また、ＳＰＲ解析を使用して、ｓＣＤ１６及び／又はｓＣＤ３２Ｂに対する２つのＣＭ
Ｄ及びｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ＣＢＤの速度定数及び平衡定数を推定した。結果をｈ３Ｇ８
ｓｃＦＶについて算出したた上記定数と比較した。図７Ａ−Ｅは、ＳＰＲ解析の結果をグ
ラフで示したものである。図７に描かれた結果から計算された、動的オン及びオフ速度、
並びに平衡定数を表１３に示す。
Figure 2015157833
ＥＬＩＳＡ解析の結果と合わせ、調査によりｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８共有結合型へテロニ量
体はＣＤ３２Ｂ及びＣＤ１６の両者に対して特異性を保持していること、及び両抗原に同
時に結合することができることが確認された。本分子を図８に模式的に示す。
６．２．Ｆｃドメインを含む共有結合型二重特異性ダイアボディの設計と特徴付け
ＩｇＧ様分子、即ち、Ｆｃドメインを有する分子を作るために、実施例６．１で示した
ヘテロ二量体ＣＢＤ分子を有するポリペプチドの１つを、更にＦｃドメイン（抗体の重鎖
及び軽鎖に類似する「重い」鎖及び「軽い」鎖を作り出す）を有するように改変した。従
って、ヘテロ二量体の二重特異性分子が同種分子と二量体化するＦｃドメインを含むこと
で、四価の四量体ＩｇＧ様分子（即ち、ヘテロ二量体の二重特異性分子のＦｃドメインを
介して二量体化することで形成される分子）が形成される。興味深いことに、このような
四量体分子は、例えば、標的抗原に対する免疫特異的結合性について条件培地を試験する
機能アッセイでは、組換え発現系の条件培地中に検出されなかった。代わりに、ＶＬ、Ｖ
Ｈ及びＦｃドメインからなる単量体を有する二量体分子のみが、前記機能アッセイで検出
された。理論上の四量体構造が安定性の面で問題となるかどうかを試験するために、Ｆｃ
ドメインを有するポリペプチドがヒンジ領域を更に有するように遺伝子操作し、一方「軽
い」鎖を有するポリペプチドは更にヒトκ軽鎖の定常ドメインの６個のＣ末端アミノ酸を
含むように遺伝子操作した。このように遺伝子操作した「重い」及び「軽い」鎖を組換え
発現系で共発現させたとき、機能アッセイによって、標的抗原と抗Ｆｃ抗体の両者に免疫
特異的に結合できるダイアボディ分子が検出された。
材料及び方法
ポリペプチド分子の構築及び設計
実施例６．１に示した構築物１及び２の改変型を作製するために、核酸発現ベクターを設
計した。構築物５（配列番号１４）及び６（配列番号１５）は、更にＦｃドメインを含む
ように、それぞれ構築物１及び２を遺伝子操作することにより作製された。構築物７（配
列番号１６）は、構築物１を遺伝子操作して、更にそのＣ末端に配列ＦＮＲＧＥＣ（配列
番号２３）を含むように作製した。構築物８（配列番号１８）は、構築物２を遺伝子操作
して、更にヒンジ領域とＦｃドメイン（Ｖ２１５Ａ変異を含む）を含むように作製した。
構築物５〜８を図９に模式的に示す。
ＰＣＲ及び発現ベクターの構築
ＰＣＲ及びＰＣＲ産物の精製プロトコルは全て、実施例６．１で説明した通りである。プ
ラスミドｐＭＧＸ０６６９及びｐＭＧＸ０６６７を、それぞれ構築物１及び２のコード配
列用の鋳型として用いた。ＨｕＩｇＧのＦｃドメイン用の及び／又はヒンジドメイン用の
コード配列は、それぞれ配列番号５又は配列番号１及び配列番号５とした。鋳型ＤＮＡの
コード配列は、ＰＣＲ産物が重複配列を含み、重複ＰＣＲが所望の産物のコード配列を生
成するように、フォワード及びリバースプライマーを用いて増幅した。
構築物１のコード配列は、ｐＭＧＸ０６６９からフォワード及びリバースプライマー、
それぞれ配列番号５５及び配列番号６２、を用いて増幅された。構築物２のコード配列は
、ｐＭＧＸ０６６７から、フォワード及びリバースプライマー、それぞれ配列番号５５及
び配列番号６３、を用いて増幅された。ＨｕＩｇＧヒンジ−Ｆｃは、フォワード及びリバ
ースプライマー、それぞれ配列番号６５及び配列番号６６、を用いて増幅した。構築物７
（配列番号１６）は、ｐＭＧＸ０６６９から、フォワード及びリバースプライマー、それ
ぞれ配列番号５５及び配列番号６７、を用いて増幅した。
重複ＰＣＲ：最初のＰＣＲ産物を下記のように組み合わせて、実施例６．１で説明した
ように増幅及び精製した。
構築物５、配列番号１４（図９に模式的に示す）をコードする核酸配列は、構築物１及
びＨｕＩｇＧＦｃのＰＣＲ増幅産物、並びにフォワード及びリバースプライマー、それぞ
れ配列番号５５及び配列番号６４を組み合わせて増幅した。構築物６、配列番号１５（図
９に模式的に示す）をコードする核酸配列は、構築物２及びＨｕＩｇＧＦｃのＰＣＲ増幅
産物、並びにフォワード及びリバースプライマー、それぞれ配列番号５５及び配列番号６
６を組み合わせて増幅した。構築物８、配列番号１８（図９に模式的に示す）をコードす
る核酸配列は、構築物２及びＨｕＩｇＧヒンジ−ＦｃのＰＣＲ増幅産物、並びにフォワー
ド及びリバースプライマー、それぞれ配列番号５５及び配列番号６６を組み合わせて増幅
した。
最終産物を、前述のように哺乳動物発現ベクターｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎ
ｃ．）内にクローニングした。構築物をコードするプラスミドは表１４に示したように命
名した。
Figure 2015157833
ポリペプチド／ダイアボディの発現
セクション６．１で記載したように、ＨＥＫ−２９３細胞内への４つの別々のコトランス
フェクション、即ち、構築物１及び６をそれぞれコードするｐＭＧＸ０６６９及びｐＭＧ
Ｘ０６７４、構築物２及び５をそれぞれコードするｐＭＧＸ０６６７及びｐＭＧＸ０６７
６、並びに構築物７及び８をそれぞれコードするｐＭＧＸ０６７７及びｐＭＧＸ０６７８
を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて行った。
これらのプラスミドのコトランスフェクションは、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＩ
Ａの両者に免疫特異的なＩｇＧ様構造を有する、四価の二重特異性ダイアボディ（ＣＢＤ
）を発現するように設計した。構築物６及び５をそれぞれコードするｐＭＧＸ０６７４及
びｐＭＧＸ０６７６の追加的なコトランスフェクションも行った。培養３日後、条件培地
を回収した。条件培地中の分泌産物の量を、精製されたＦｃを基準に用いて、抗ＩｇＧＦ
ｃＥＬＩＳＡによって定量した。その後、試料中の産物の濃度を定量値に基づいて正規化
し、この正規化した試料を以降のアッセイに使用した。
ＥＬＩＳＡ：培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合性を、上記サンドイッチＥＬ
ＩＳＡで分析した。特に示した場合を除き、ＣＤ３２Ｂをプレートコーティング用に、つ
まり標的タンパク質として用いた。また、ＨＲＰ結合ＣＤ１６をプローブとして使用した
。
結果
ＥＬＩＳＡアッセイにより、構築物１及び６（ｐＭＧＸ６６９−ｐＭＧＸ６７４）、構
築物２及び５（ｐＭＧＸ６６７−ｐＭＧＸ６７６）、並びに構築物５及び６（ｐＭＧＸ６
７４−ｐＭＧＸ６７６）を有する組換え発現系由来の正規化された試料を、ＣＤ３２Ｂと
ＣＤ１６Ａとに同時に結合可能なダイアボディ分子の発現について試験した（図１０）。
ＥＬＩＳＡデータは、構築物１及び６を用いたコトランスフェクション、又は構築物２及
び５を用いたコトランスフェクションでは、一方又は両方の抗原に結合できる産物は生じ
なかった（図１０、それぞれ□及び▲）。しかし、構築物５及び６のコトランスフェクシ
ョンは、ＣＤ３２Ｂ及びＣＤ１６Ａの両抗原に結合できる産物の分泌をもたらした。後者
の産物は、構築物５及び６の二量体であり、図１１に模式的に示した構造を有する各抗原
に対する１つの結合部位を有しているイア。
ＩｇＧ様へテロ四量体構造の形成を誘導するために、付加的な６個のアミノ酸のコード
配列を構築物１のＣ末端に付加して、構築物７（配列番号１６；図９に模式的に示す）を
作製した。付加的な６個のアミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）は、κ軽鎖のＣ末端に
由来し、通常ＩｇＧ分子内で重鎖の上部ヒンジドメインと相互作用する。また、ヒンジド
メインを構築物６の内部に遺伝子操作で導入し、構築物８（配列番号１８、及び図９）を
作製した。構築物８は、更に、上部ヒンジ領域中にアミノ酸変異Ａ２１５Ｖを有していた
。構築物７及び構築物８をそれぞれコードする発現プラスミド、ｐＭＧＸ６７７及びｐＭ
ＧＸ６７８を、その後ＨＥＫ−２９３細胞にコトランスフェクトし、上記のように発現さ
せた。
構築物７及び８（ｐＭＧＸ０６７７＋ｐＭＧＸ０６７８）を有する組換え発現系により
産生されたダイアボディ分子のＣＤ３２Ｂ及びＣＤ１６Ａへの結合について、構築物１及
び６（ｐＭＧＸ６６９＋ｐＭＧＸ６７４）、構築物２及び８（ｐＭＧＸ６６９＋ｐＭＧＸ
６７８）、及び構築物６及び７（ｐＭＧＸ６７７＋ｐＭＧＸ６７４）（図１２）を有する
発現系により産生されたダイアボディ分子と、ＥＬＩＳＡアッセイにより比較した。
既に述べたように、構築物１及び６（ｐＭＧＸ６６９＋ｐＭＧＸ６７４）を有する発現
系によって産生された分子は、ＣＤ３２Ａ及びＣＤ１６Ａのいずれにも結合できないこと
が実証された（図１０及び図１２）。これに対して、構築物７及び６（ｐＭＧＸ０６７７
＋ｐＭＧＸ０６７４）の共発現、又は構築物７及び８（ｐＭＧＸ０６７７−ｐＭＧＸ０６
７８）の共発現から得られた産物は、ＣＤ３２Ｂ及びＣＤ１６の両方に結合できた（図１
２）。構築物７がＣ末端配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を有することを除けば構築物
１に相似であること、及び構築物８がヒンジドメイン及びＡ２１５Ｖ変異を有することを
除けば構築物６に相似であることが注目される。このデータは、Ｃ−κ軽鎖のＣ末端に由
来する追加の６アミノ酸（ＦＮＲＧＥＣ；配列番号２３）を、Ｆｃを持たない「軽い」鎖
に付加することが、対応する重い鎖がヒンジドメインを含むか否かにかかわらず（即ちｐ
ＭＧＸ０６７７＋ｐＭＧＸ０６７４及びｐＭＧＸ０６７７−ｐＭＧＸ０６７８、図１２）
、四量体ＩｇＧ様ダイアボディ分子の形成を安定化するのに役立つことを示している。Ｆ
ｃを有する「重い」ポリペプチドにヒンジドメインを付加することは、対応する「軽い」
鎖へのＣ末端配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）の付加なしでは、明らかに同様の安定化
を達成することができなかった（即ち、構築物２及び８（ｐＭＧＸ６６９＋ｐＭＧＸ６７
）のコトランスフェクションの産物による結合が欠如している）。四量体ダイアボディ分
子の構造を図３に模式的に示す。
６．３．四量体ＩｇＧ様ダイアボディの形成におけるドメインの順番及び追加的なジスル
フィド結合の効果
四量体ＩｇＧ様ダイアボディ分子の「軽い」及び「重い」ポリペプチド鎖間の追加的な
安定化の効果を、ポリペプチド鎖上の選択された残基をシステインで置換することによっ
て調べた。付加的なシステイン残基は、「重い」鎖と「軽い」鎖との間に付加的なジスル
フィド結合を付与する。更に、Ｆｃドメイン又はヒンジ−Ｆｃドメインをポリペプチド鎖
のＣ末端からＮ末端に移すことで、結合活性に対するドメインの順番を調べた。付加的な
ジスルフィド結合を有する分子の結合活性は、そのような結合をもつ先に構築したダイア
ボディ分子と比べて変わらなかったが、Ｆｃ又はヒンジ−Ｆｃドメインを、ダイアボディ
を構成する「重い」ポリペプチド鎖のＮ末端に移すことにより、その標的抗原の一方又は
両方に対する二重特異性分子の結合親和性及び／又は結合力が驚くほど改善された。
材料及び方法
ポリペプチド分子の構築及び設計
実施例６．２で示した構築物５、６及び８の改変型を作製するために、核酸発現ベクター
を設計した。構築物９（配列番号１９）及び構築物１０（配列番号２０）（両者を図１３
に模式的に示す）は、Ｆｃドメイン又はヒンジ−ＦｃドメインがポリペプチドのＣ末端か
らＮ末端に移されていたことを除けば、それぞれ構築物８及び６に相似であった。更に、
使用したＦｃドメインは全て、野生型ＩｇＧ１のＦｃドメインであった。構築物１１、配
列番号２１（図１４に模式的に示す）は、Ｃ末端が配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を
更に有するように設計されたことを除けば、実施例６．１での構築物２に相似であった。
構築物１２、配列番号２２（図１４に模式的に示す）は、Ｆｃドメインが更にヒンジ領域
を有することを除けば、実施例６．２での構築物５に相似であった。また、構築物１１及
び１２に関しては、２Ｂ６のＶＬドメイン及び２Ｂ６のＶＨドメインは、各ドメイン中の
グリシンをシステインに置換した、単一アミノ酸変異（それぞれＧ１０５Ｃ及びＧ４４Ｃ
）を有していた。
ＰＣＲ及び発現ベクターの構築
ＰＣＲ及びＰＣＲ産物の精製プロトコルは全て、実施例６．１及び６．２で説明した通り
である。
重複ＰＣＲ
実施例６．１及び６．２に記載の方法を用いて、最終産物を構築し、増幅し、精製した。
最終産物を、前記のように哺乳動物発現ベクターｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎ
ｃ．）内にクローニングした。構築物をコードするプラスミドは表１５に示すように命名
した。
Figure 2015157833
ポリペプチド／ダイアボディの発現
セクション６．１で記載したように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いてＨＥ
Ｋ−２９３細胞内に３種の異なるコトランスフェクション：構築物１及び９をそれぞれコ
ードするｐＭＧＸ０６６９及びｐＭＧＸ０７１９、構築物１及び１０をそれぞれコードす
るｐＭＧＸ０６６９及びｐＭＧＸ０７１８、並びに構築物１１及び１２をそれぞれコード
するｐＭＧＸ０６１７及びｐＭＧＸ０７１７、を行った。これらのプラスミドのコトラン
スフェクションは、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＩＡの両方に免疫特異的なＩｇＧ様
構造をもった四価の二重特異性ダイアボディ（ＣＢＤ）を発現するように設計されている
。培養３日後、条件培地を回収した。条件培地中の分泌産物の量を、精製したＦｃを基準
として用いて、抗ＩｇＧＦｃＥＬＩＳＡにより定量した。その後、試料中の産物の濃度を
定量値に基づいて正規化し、この正規化した試料を以降のアッセイに使用した。
ＥＬＩＳＡ
培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合性を、上記サンドイッチＥＬＩＳＡによって
アッセイした。特に示した場合を除き、ＣＤ３２Ｂを、プレートを被覆するために、即ち
、標的タンパク質として用いた。また、ＨＲＰ結合ＣＤ１６をプローブとして使用した。
ウェスタンブロット
上記３つのコトランスフェクションを形成する約１５ｍＬの条件培地を、非還元条件下で
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。一枚のゲルをＳｉｍｐｌｙ・Ｂｌｕｅ・Ｓａｆｅｓｔ
ａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、他の同一のゲルを一般的な転写方法を用いて
ＰＶＤＦメンブレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に転写した。転写後、メンブレンを１×Ｐ
ＢＳ中の５％脱脂粉乳でブロックした。その後、メンブレンを、２％脱脂粉乳１×ＰＢＳ
／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中に１：８０００希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ１Ｈ＋
Ｌ抗体の１０ｍＬ中で室温にて１時間静かに撹拌しながらインキュベートした。１×ＰＢ
Ｓ／０．３％Ｔｗｅｅｎ２０で、それぞれ５分間ずつ２回洗浄した後、ＥＣＬウェスタン
ブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、
製造者の説明書に従って室温で２０分間、メンブレンを露光した。フィルムをＸ線処理装
置で現像した。
結果
構築物１及び９、構築物１及び１０、並びに構築物１１及び１２を有する組換え発現系
由来の条件培地を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元条件下）解析及びウェスタンブロッティン
グ（抗ＩｇＧをプローブとして使用）によって解析した。ウェスタンブロットにより、構
築物１１及び１２を含む系又は構築物９及び１を有する系由来の産物は、主に約１５０ｋ
Ｄａの単一分子種（それぞれ図１４のレーン３及び２）を形成することが明らかとなった
。これらの産物はいずれも、ダイアボディを構成する「軽い」鎖と「重い」鎖との間に遺
伝子操作による内部ジスルフィド結合を有している。一方、「軽い」鎖と「重い」鎖との
間に遺伝子操作による内部ジスルフィド結合を有していない、構築物１０及び１から形成
された分子は、分子量約７５ｋＤａ及び約１００ｋＤａ（図１４のレーン１）の少なくと
も２つの分子種を形成した。
ウェスタンブロットの結果にもかかわらず、３つの産物のそれぞれがＣＤ３２Ａ及びＣ
Ｄ１６の両方と結合できることがわかった（図１５）。驚くべきことに、Ｃ末端にヒンジ
−Ｆｃドメインを有する産物（構築物１１及び１２から形成）と比べて、Ｆｃ（又はＦｃ
−ヒンジ）ドメインがＦｃ含有ポリペプチド鎖（即ち「重い」鎖）のアミノ末端にある両
方の発現系に由来する産物（構築物９＋１及び構築物１０＋１）では、その標的ペプチド
（即ちＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ１６）の一方又は両方に対する親和性及び／又は結合力
が増強されることが実証された。
６．４．ポリタンパク質前駆体のプロセシングにおける内部／外部切断部位の効果、及び
共有結合型二重特異性ダイアボディの発現；ヒトＩｇＧλ鎖及びヒンジドメインの一部を
有する二重特異性ダイアボディの設計及び特徴付け
本明細書で説明したように、本発明のダイアボディの個々のポリペプチド鎖又はダイア
ボディ分子を、単一のポリタンパク質前駆体分子として発現させてもよい。実施例６．１
〜６．３で説明した組換え系の、ポリタンパク質前駆体から機能的なＣＢＤを適切にプロ
セシングして発現する能力を、内部切断部位、特にフューリン切断部位、によって分離さ
れるＣＢＤの第１及び第２ポリペプチド鎖の両方をコードする核酸を作製することによっ
て試験した。機能的なＣＢＤは、ポリタンパク質前駆体分子を有する組換え系から単離し
た。
実施例６．３で述べたように、ヒトκ軽鎖由来のＣ末端の６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配
列番号２３）の付加は、ダイアボディ形成を安定化することがわかった。おそらく、これ
は、配列番号２３を有するドメインと、Ｆｃドメイン又はヒンジ−Ｆｃドメインを有する
ドメインとの間で鎖間相互作用が増強されるためと思われる。このλ鎖／Ｆｃ様相互作用
の安定効果を、どちらのポリペプチド鎖もＦｃドメインを有さないＣＢＤで試験した。ダ
イアボディの一方のポリペプチド鎖を遺伝子操作して、そのＣ末端に配列番号２３を有す
るようにした。その相手方となるポリペプチド鎖は、ＩｇＧのヒンジドメインに由来する
アミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）を有するように遺伝子操作した。このＣＢＤ
と構築物１及び２を有するＣＢＤ（実施例６．１由来）との比較により、ヒンジドメイン
及びλ鎖に由来するドメインを有するＣＢＤは、その標的エピトープの一方又は両方に対
して僅かに大きい親和性を示すことが明らかとなった。
材料及び方法
ポリペプチド分子の構築及び設計
ポリタンパク質前駆体
２つのポリタンパク質前駆体分子を作製するように核酸発現ベクターを設計した。両分子
を図１７に模式的に示した。構築物１３（配列番号９５）は、ポリペプチド鎖のＮ末端側
から順に、３Ｇ８のＶＬドメイン、２．４Ｇ２のＶＨドメイン（ｍＣＤ３２Ｂに結合する
）、フューリン切断部位、２．４Ｇ２のＶＬドメイン、及び３Ｇ８のＶＨドメインを有し
ていた。構築物１３をコードするヌクレオチド配列を配列番号９６に示す。構築物１４（
配列番号９７）（図１７）は、ポリペプチド鎖のＮ末端側から順に、３Ｇ８のＶＬドメイ
ン、２．４Ｇ２のＶＨドメイン（ｍＣＤ３２Ｂに結合する）、フューリン切断部位、ＦＭ
Ｄ（口蹄疫ウイルスプロテアーゼＣ３）部位、２．４Ｇ２のＶＬドメイン、及び３Ｇ８の
ＶＨドメインを有していた。構築物１４をコードするヌクレオチド配列を配列番号９８に
示す。
核酸発現ベクターを、実施例６．１で示した構築物１及び２の改変型を作製するために
設計した。構築物１５（配列番９９）（図１７）は、構築物１５のＣ末端がアミノ酸配列
ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を有することを除けば、実施例６．１で示した構築物１（
配列番号９）に相似していた。構築物１５をコードする核酸配列を配列番号１００に示す
。構築物１６（配列番号１０１）（図１７）は、構築物１６のＣ末端がアミノ酸配列ＶＥ
ＰＳＫ（配列番号７７）を有することを除けば、実施例６．１で示した構築物２に相似し
ていた。構築物１６をコードする核酸配列を配列番号１０２に示す。
ＰＣＲ及び発現ベクターの構築
ＰＣＲ及びＰＣＲ産物の精製プロトコルは全て、実施例６．１及び６．２で説明した通り
である。
重複ＰＣＲ
実施例６．１及び６．２に記載の方法により、適当なプライマーを使用して、最終産物
を構築し、増幅し、精製した。
最終産物を、前述のように哺乳動物発現ベクターｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎ
ｃ．）内にクローニングした。構築物をコードするプラスミドは表１６に示すように命名
した。
Figure 2015157833
ポリペプチド／ダイアボディの発現
セクション６．１で記載したようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いてＨＥＫ
−２９３細胞内に１回のトランスフェクション及び１回のコトランスフェクションを行っ
た。単独のトランスフェクションでは、構築物１３をコードするｐＭＧＸ０７５０を、ま
た、コトランスフェクションでは構築物１５及び１６をそれぞれコードするｐＭＧＸ０７
５２及びｐＭＧＸ０７５３を用いた。培養３日後、条件培地を回収し、分泌された産物を
上記のようにアフィニティー精製した。
ＥＬＩＳＡ
培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合性を上記サンドイッチＥＬＩＳＡによりアッ
セイした。マウスＣＤ３２Ｂを、プレートを被覆するために、即ち、標的タンパク質とし
て用い、また、ＨＲＰ結合ＣＤ１６を、構築物１５及び１６のコトランスフェクションの
産物用プローブとして使用した。ｍＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として使用し、ビオチン
結合ＣＤ１６Ａを構築物１３を有する組換え系用のプローブとして使用した。
結果
構築物１３を有する組換え発現系から得られた条件培地を、サンドイッチＥＬＩＳＡで
解析した。ＥＬＩＳＡアッセイでは、ｍＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ１６の一方又は両方へ
の特異性についてＣＢＤの結合性を試験した（図１８）。ＣＤ３２Ｂを標的抗原として利
用し、またＣＤ１６Ａを第２プローブとして用いた。ＥＬＩＳＡにおける陽性シグナルに
より、ポリタンパク質前駆体から生成されるヘテロ二量体ｈ２．４Ｇ２−ｈ３Ｇ８ＣＢＤ
は両抗原に対して特異性を有することが明らかとなった。
同様に、構築物１５及び１６をコードするベクターのコトランスフェクションによって
生じた精製産物をＥＬＩＳＡアッセイで試験し、構築物１及び２からなる産物（実施例６
．１）と比較した。ＣＤ３２Ｂを標的抗原として利用し、またＣＤ１６Ａを第２プローブ
として用いた。構築物１及び２からなる産物と同様、構築物１５及び１６の産物は、同時
にＣＤ３２Ｂ及びＣＤ１６Ａと結合できることがわかった。実際、構築物１５及び１６の
産物では、標的抗原、即ちＣＤ３２Ｂ又はＣＤ１６Ａの一方又は両方に対する親和性が僅
かに亢進されていることがわかった。これは、構築物１及び２からなる産物にはない、λ
鎖領域、ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）とヒンジ領域、ＶＥＰＫＳＣ、（配列番号７７）
の相互作用によって生じた、鎖間結合の安定性及び／又は忠実性の増加（野生型のＶＨ−
ＶＬドメインの相互作用と比較したとき）によるものと思われる。
６．５．二重親和性再標的化試薬（「ＤＡＲＴ」）の多種親和性連結への使用
本発明の一つの態様は、新規二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）試薬及び多種親和性を結
合させる新規方法に関する。「ＤＡＲＴ」は、１つ、２つ、３つ又はそれ以上の異なるエ
ピトープ（これらは同一でも異なってもよい）に同時に結合できる、単一特異性、二重特
異性、三重特異性等であってよい。「ＤＡＲＴ」はまた、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ
、６つ又はそれ以上の分子に同時に結合できるように、一価、二価、三価、四価、五価、
六価などであってよい。図３５に示すように、ＤＡＲＴのこれら２つの特性を組み合わせ
て、例えば、四価の二重特異性抗体を作製してもよい。
改良点の一つは、原型の免疫受容体、ｈｕＣＤ３２Ｂ、に対する親和性の他に、ハプテ
ンであるフルオレセインに対する親和性も有するＤＡＲＴの開発である。このＤＡＲＴは
、「２Ｂ６／４４２０」と呼ばれ、フルオレセインを共役させた結合パートナーと相互作
用する分子にｈｕＣＤ３２Ｂを連結できる、普遍的なアダプターとして作用する。ＣＤ３
２Ｂは、活性化シグナル伝達免疫複合体を束ねることにより、活性化シグナルを抑えるこ
とができるＦｃ受容体である。最初の実行では、この技術により、新たなＤＡＲＴ構築物
を作製することを必要とせずに、ｈｕＣＤ３２Ｂで束ねるいくつかの生物学的標的を素早
くスクリーニングできる。２Ｂ６／４４２０は、細胞表面受容体に対するフルオレセイン
で標識した抗体と簡単に混合することができ、これにより受容体に対する親和性により、
ＤＡＲＴの作用と類似の作用を示す（図２０）。更に、この試薬により、発現や作製が難
しい親和性試薬の効果的な連結ができ、技術的制限を克服することができる。２Ｂ６／４
４２０を含有するＤＡＲＴが、研究手段として有用であることは明らかであり、臨床上も
有用な候補である。ＨＥＫ２９３細胞から作製された２Ｂ６／４４２０は、ＥＬＩＳＡア
ッセイにおいてＣＤ３２Ｂとフルオレセインとに同時に結合できる。また、ＣＤ７９との
コライゲーションを介して、ＣＤ３２ＢをＢＣＲ複合体に導入することによって、細胞増
殖を抑制することもできる。ＤＡＲＴの２Ｂ６アームは、異なる抗体配列又は他の関連す
る特異性を有する結合配列で置換してもよい。
材料及び方法
プラスミド構築物
２Ｂ６／４４２０は、ヒト化２Ｂ６ＭＡｂ（ｈｕ２Ｂ６、ＭＧＡ３２１）及び抗フルオ
レセインＭＡｂ、４４２０のキメラマウスＦｖ／ヒトＦｃ型配列に由来する。完全に組み
立てたＤＡＲＴは、２つのポリペプチドから成り、２つのＦｖ領域の共有結合を有する。
一方のポリペプチドは、分泌シグナル配列と、それに続く、アミノ酸残基ＧＧＧＳＧＧＧ
Ｇから成るリンカーにより分離された、４４２０ＶＨとの融合タンパク質として作製され
るｈｕ２Ｂ６ＶＬから成る。κ軽鎖のＣ末端由来の配列ＦＮＲＧＥＣが、このポリペプチ
ドのＣ末端に付加される。他方のポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１Ｆｄ断片のＣ末端由来の
配列ＶＥＰＫＳＣをＣ末端に付加した、シグナル配列４４２０ＶＬ−ＧＧＧＳＧＧＧＧ−
ｈｕ２Ｂ６ＶＨから成る。２つの鎖のシステインがジスルフィド結合を形成し、２つのポ
リペプチドは共有結合的に連結される（図２０）。前記のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列は、存在するプラスミドからＰＣＲ増幅され、重複ＰＣＲにより結合され、Ｎｈｅ
Ｉ部位とＥｃｏＲＩ部位の間のｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）内にクローニングされる
。最後に、上述の方法と同様の方法により事前に構築されたｈｕＣＤ３２Ｂ及びｈｕＣＤ
１６（２Ｂ６／３Ｇ８）に親和性を有するＤＡＲＴを対照として使用した。
抗体
マウスモノクローナル抗体、抗ヒトＣＤ７９ｂ、ＣＢ３．１及びＣＢ３．２（ハイブリド
ーマ）は、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬのアラバマ大学のＣｏｏ
ｐｅｒ医学博士より入手した。ＣＢ３．１及びＣＢ３．２はフルオレセインイソチオシア
ナート（ＦＩＴＣ）で、製造者の説明書（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）に従
って標識した。Ｆｃ断片特異的ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）ＩｇＧのＦ（ａｂ’）２断片は、
Ｊａｃｋｓｏｎ研究所（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）から入手した。抗ｈｕＣＤ３２Ｂ
マウスＭＡｂ、３Ｈ７、は社内で作製、精製した。ヤギ抗２Ｂ６Ｆｖは、ヤギをｈｕ２Ｂ
６全抗体で免疫し、ｈｕ２Ｂ６のＦｖ領域に対してアフィニティー精製して作製した。Ｈ
ｕＩｇＧ、ＦＩＴＣ−ｈｕＩｇＧ及びＨＲＰ−抗マウスＩｇＧは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍ
ｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから入手し、ＨＲＰ−抗ヤギ抗体は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈから入手した。
ＤＡＲＴ発現
各鎖をコードするプラスミドは、製造者の説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ
ｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して２９３Ｈ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
中にコトランスフェクトした。分泌されたタンパク質を、３日間隔で３〜４回回収し、不
動化した可溶型ＣＤ３２Ｂに対する液体クロマトグラフィーにより精製した。
ＥＬＩＳＡ
２Ｂ６／４４２０又は２Ｂ６／３Ｇ８ＤＡＲＴを、ＦＩＴＣ標識タンパク質Ｓ（Ｎｏｖａ
ｇｅｎ）、ヒトＩｇＧ又はＦＩＴＣ−ｈｕＩｇＧで被覆したＭａｘｉＳｏｒｐプレート（
Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ）上に捕捉した。検出は、可溶性ＣＤ３２Ｂ外部ドメイン、次いで
３Ｈ７（ＣＤ３２Ｂに特異的なマウスモノクローナル抗体）、及び最後に抗マウスＨＲＰ
抗体を結合させることにより行った。あるいは、検出は、ヤギ抗２Ｂ６Ｆｖポリクローナ
ルアフィニティー精製抗血清、次いで抗ヤギＨＲＰ抗体を結合させて行ってもよい。ＨＲ
Ｐ活性は、比色分析用ＴＭＢ基質（Ｂｉｏ ＦＸ）を使用し、ＶｅｒｓａＭａｘＥＬＩＳ
Ａプレートリーダーで検出した。
Ｂ細胞精製及び増殖アッセイ：末梢血単核細胞を、フィコール−パックプラス（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＫ）勾配法により、健常者の血液
を使用して分離した。Ｂリンパ球は、製造者の説明書に従って、Ｄｙｎａｌ Ｂ Ｃｅｌ
ｌ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ Ｉｎｃ．，ＮＹ）を使用して単離した。単離したＢ細胞（ＣＤ２０＋）の純度は
、ＦＡＣＳ解析により９０％以上であると推定された。増殖アッセイのために、精製Ｂ細
胞を、平底９６ウェルマイクロタイタープレート中のコンプリートＲＰＭＩ１６４０培地
に、最終容量２００μＬで、各ウェル当たり１×１０５個の濃度で播種し、抗体及びダイ
アボディの存在下及び不存在化に３７℃、５％ＣＯ２中で４８時間インキュベートした。
その後１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓ
ｌｅｙ，ＭＡ）を添加し、更に回収前に１６〜１８時間インキュベーションを続けた。［
３Ｈ］チミジンの取り込みを液体シンチレーションカウンターで測定した。
結果
２Ｂ６／４４２０ＤＡＲＴが活性で、特異的であることを実証するために、２つのＥＬ
ＩＳＡ実験を行った。まず、２Ｂ６／４４２０又は２Ｂ６／３Ｇ８（陰性対照）を、ＥＬ
ＩＳＡプレート上に被覆されたフルオレセイン結合タンパク質（Ｓタンパク質）に結合さ
せた。次いで、ＤＡＲＴの２Ｂ６アームを可溶性ＣＤ３２Ｂにより係合させた。結合を、
２Ｂ６と重ならないエピトープを有するＣＤ３２Ｂに対する他の抗体及びＨＲＰコンジュ
ゲート第２抗体により検出した。２Ｂ６／４４２０ＤＡＲＴは、フルオレセイン及びＣＤ
３２Ｂの両者に同時に結合できるが、２Ｂ６／３Ｇ８はできない（図２１、パネルＡ）。
可溶性ＣＤ３２Ｂで被覆されているプレート上にＤＡＲＴが捕捉され、その結合がｈｕ２
Ｂ６Ｆｖに特異的な抗体で検出される場合、それらのＤＡＲＴは良好な結合を示している
。２Ｂ６／４４２０ＤＡＲＴがヒトＩｇＧ（この試薬に最初から導入された）にコンジュ
ゲートしたフルオレセインに結合できることを実証するために、フルオレセインで非標識
又は標識されたＨｕＩｇＧをＥＬＩＳＡプレートに結合させ、２Ｂ６／４４２０を捕捉す
るのに使用した。この場合も、２Ｂ６／３Ｇ８を陰性対照として使用した。結合は、Ｈｕ
２Ｂ６Ｆｖに特異的な抗体を使用して検出した。２Ｂ６／４４２０ＤＡＲＴはＦＩＴＣ−
ＨｕＩｇＧに明らかに結合するが、非標識ＨＵＩｇＧには結合せず、このＤＡＲＴが抗体
にコンジュゲートしたフルオレセインに結合することができるが、抗体単独では有意な結
合を示さないことを示している。期待された通り、これらの状況のいずれにおいても、２
Ｂ６／３Ｇ８ＤＡＲＴによる結合は検出されなかった。
２Ｂ６／４４２０ＤＡＲＴが細胞ベースのアッセイとの関連においてシグナル伝達に影
響を与えることができる、二重親和性の試薬として機能できることを実証するための実験
を行った。ＣＤ３２ＢとＢＣＲとの共凝集が、Ｂ細胞の活性を抑制することが示された。
ＣＤ３２Ｂをフルオレセインで標識したαＣＤ７９ｂ抗体で被覆したＢＣＲに会合させ、
細胞増殖の阻害を引き起こす、２Ｂ６／４４２０ＤＡＲＴの能力を調査した。Ｂ細胞を、
ヒト血液からネガティブ選択し、マウス抗ヒトＣＤ７９ｂＦＩＴＣ標識、クローンＣＢ３
．１及びＣＢ３．２の濃度を上げながら処理し、Ｆｃ特異的ＧＡＭのＦ（ａｂ’）２断片
を二次試薬として添加して、フルオレセインを標的としない、所定濃度（５μｇ／ｍＬ）
の２Ｂ６／４４２０ＤＡＲＴ又は当量の２Ｂ６／４４２０ＤＡＲＴともに、ＢＣＲを架橋
することにより、活性化して、対照として使用した。［３Ｈ］チミジンの取り込みとして
測定した細胞の増殖は、ＤＡＲＴの不存在下又は対照として使用した２Ｂ６／４４２０Ｄ
ＡＲＴの存在下において、モノクローナル抗ＣＤ７９ｂＦＩＴＣ活性化剤の濃度の上昇と
ともに亢進した。２Ｂ６／４４２０ＤＡＲＴの存在は、抗ヒトＣＤ７９ｂＦＩＴＣの全て
の濃度範囲において、Ｂ細胞増殖の大きな低下をもたらした（図２２のパネルＡ及びＢ、
図２３のパネルＡ）。
非標識ＣＢ３．２で被覆し、同じ実験条件により活性化したＢ細胞をその標的特異性が
実証されている２Ｂ６／４４２０ＤＡＲＴで処理した場合には、増殖の抑制は認められな
かった（図２３のパネルＢ）。これらのデータは、２Ｂ６／４４２０ＤＡＲＴがＣＤ３２
とＢＣＲを架橋することができ、抗原受容体誘導性細胞活性化をブロックすることができ
る抑制性シグナルを送達することを示している。
６．６．ＣＤ３２Ｂ発現Ｂ細胞悪性腫瘍のＤＡＲＴ免疫治療
現在、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療には、抗ＣＤ２０抗体であるリツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ
（登録商標））を使用している。しかし、Ｂ細胞悪性腫瘍にはＣＤ２０を発現しないもの
や、リツキサンに耐性を示すものがある。本発明のＤＡＲＴは、リツキサン（登録商標）
抗ＣＤ２０抗体に係わる問題を克服することができる、代替免疫治療薬を提供する。
ＭＧＤ２６１は、ｈＣＤ３２Ｂ（ｈ２Ｂ６抗体による）、ｈＣＤ１６Ａ及びｈＣＤ１６
Ｂ（ｈ３Ｇ８抗体による）に結合する二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）分子である。
ＭＧＤ２６１の効果（Ｂ細胞除去）及び安全性を、ｍＣＤ３２−／−ｈＣＤ１６Ａ＋Ｃ
５７Ｂ１／６、ｍＣＤ３２−／−ｈＣＤ３２Ｂ＋Ｃ５７Ｂ１／６及びｍＣＤ３２−／−ｈ
ＣＤ１６Ａ＋ｈＣＤ３２Ｂ＋Ｃ５７Ｂ１／６で試験した。この繰り返し投与実験では、マ
ウスに６回静脈内注射（週２回、３週間）した。Ｂ細胞除去はＦＡＣＳによりモニターし
、安全性については症状観察によりモニターした。
データは、二重トランスジェニックマウスにおいて、ＭＧＤ２６１は、重大な副作用を
引き起こすことなくＢ細胞を除去できることを示している。
データ
ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓの繁殖コロニー由来の、ｍＣＤ３２−／−ｈＣＤ１６Ａ＋Ｃ５７
Ｂ１／６、ｍＣＤ３２−／−ｈＣＤ３２Ｂ＋Ｃ５７Ｂ１／６及びｍＣＤ３２−／−ｈＣＤ
１６Ａ＋ｈＣＤ３２Ｂ＋Ｃ５７Ｂ１／６マウスに、ＭＧＤ２６１（１０、３、１又は０．
３ｍｇ／ｋｇ）又は無関係の抗体（ｈＥ１６、１０ｍｇ／ｋｇ）を、第０、３、７、１０
、１４及び１７日目に静脈内注射した。血液を−１９（前採血）、４、１１、１８、２５
及び３２日目にＦＡＣＳ分析用に採血した。動物の健康及び活動状態を週３回記録した。
Figure 2015157833
ＦＡＣＳ分析方法
全血試料を、ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８投与の１８日前及び処置後４、１１、１８、２５及び３
２日後に採取した。血液試料をＦＡＣＳベースのアッセイにより解析して、Ｂ細胞の総数
に対するｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８の効果を決定した。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒより入
手したＦｌｏｗＣｏｕｎｔビーズを用いて、非洗浄プロトコルにより、Ｂ細胞、Ｔ細胞及
びＰＭＮを計数した。解析に使用した抗体パネルとして、ＰＭＮについては１Ａ８−ＦＩ
ＴＣ、Ｔ細胞についてはＣＤ３−ＰＥ、Ｂ細胞についてはＣＤ１９−ＡＰＣ、全白血球に
ついてはＣＤ４５−ＰｅｒＣＰを使用した。
結果
ｈＥ１６又はＭＧＤ２６１（全濃度において）で処理したマウスにおいて、全実験期間
を通して異常は見られなかった。
ｈＣＤ１６Ａ及びｈＣＤ３２Ｂ二重トランスジェニックマウスに、Ｂ細胞除去が認めら
れた。ダイアボディｈ２Ｂ６−３Ｇ８は、ｈＣＤ１６Ａ発現エフェクター細胞及びｈＣＤ
３２Ｂ発現Ｂ細胞に関与しており、その関与はＢ細胞殺作用に必要である。Ｂ細胞除去は
、単一の形質転換を施したマウスでは観察されなかった（図２４）。研究期間中、Ｔ細胞
及びＰＭＮ量に有意な変化は見られなかった。
本発明のその他の免疫治療を更に実証するために、「２．４Ｇ２−３Ｇ８ＤＢ」と呼ば
れるＭＧＤ２６１の代替物を構築した。２．４Ｇ２−３Ｇ８ＤＢは、ｍＣＤ３２Ｂ（２．
４Ｇ２抗体による）、ｈＣＤ１６Ａ及びｈＣＤ１６Ｂ（ｈ３Ｇ８抗体による）に結合する
二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）分子である。
２．４Ｇ２−３Ｇ８ＤＢの有効性（Ｂ細胞除去）及び安全性を、ｍＣＤ１６−／−、ｍ
ＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ａ＋Ｃ５７Ｂ１／６、ｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ｂ＋及びｍ
ＣＤｌ６−／−ｈＣＤ１６Ａ＋ｈＣＤ１６Ｂ＋マウスで試験した。この繰り返し投与実験
では、マウスに９回腹腔内注射（週３回、３週間）した。Ｂ細胞除去はＦＡＣＳによりモ
ニターし、安全性については症状観察によりモニターした。
データは、ｈＣＤ１６トランスジェニックマウスにおいて、２．４Ｇ２−３Ｇ８ＤＢは
、重大な副作用を引き起こすことなくＢ細胞を除去できることを示している。
データ：ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓの繁殖コロニー由来の、ｍＣＤ１６−／−、ｍＣＤ１
６−／−ｈＣＤ１６Ａ＋Ｃ５７Ｂ１／６、ｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ｂ＋及びｍＣＤｌ
６−／−ｈＣＤ１６Ａ＋ｈＣＤ１６Ｂ＋マウスに、２．４Ｇ２−３Ｇ８ＤＢ（７５μｇ／
ｋｇ）又はＰＢＳを、第０、２、４、７、９、１１、１４、１６及び１８日目に腹腔内注
射した。血液を−１０（前採血）、４、１１及び１８日目にＦＡＣＳ解析用に採血した。
動物の健康及び活動状態を週３回記録した。
Figure 2015157833
ＦＡＣＳ解析方法：全血試料を、ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８投与の１０日前及び処置の開始後
４、１１及び１８日後に採取した。血液試料をＦＡＣＳベースのアッセイにより解析して
、Ｂ細胞の総数に対するｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８の効果を決定した。ＢＤ Ｉｍｍｕｎｏｃｙ
ｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍより入手したＴｒｕＣＯＵＮＴチューブを用いて、非洗浄
プロトコルにより、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びＰＭＮを計数した。解析に使用した抗体パネルと
して、ＰＭＮについては１Ａ８−ＦＩＴＣ、Ｔ細胞についてはＣＤ３−ＰＥ、Ｂ細胞につ
いてはＣＤ１９−ＡＰＣ、全白血球についてはＣＤ４５−ＰｅｒＣＰを使用した。
結果
ｈＥ１６又は２．４Ｇ２−３Ｇ８ＤＢで処理したマウスにおいて、全実験期間を通して
異常は見られなかった。
Ｂ細胞除去が、ｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ａ＋又はｍＣＤｌ６−／−ｈＣＤ１６Ａ＋
ｈＣＤ１６Ｂ＋マウスでは認められたが、ｍＣＤ１６−／−マウスでは認められなかった
。これらのデータは、ｈＣＤ１６Ａ担持エフェクター細胞がＢ細胞殺作用に必要であった
ことを示している（図２５）。研究期間中、Ｔ細胞及びＰＭＮレベルに有意な変化は見ら
れなかった。
静脈内注射（ＩＶ）モデル
ＭＧＤ２６１の抗腫瘍活性をヒト腫瘍細胞株ラジ（Ｒａｊｉ）の静脈内注射（ＩＶ）モデ
ルを使用して試験した。ラジはｈＣＤ３２Ｂを発現するヒトバーキットリンパ腫細胞株で
ある。ｍＣＤ１６−／−、ｈＣＤ１６Ａ＋、ＲＡＧ１−／−マウスに静脈内注射すると、
腫瘍細胞が脊椎に集まり、後肢麻痺を引き起こす。
データは、ＭＧＤ２６１は、ｍＣＤ１６−／−、ｈＣＤ１６Ａ＋、ＲＡＧ１−／−マウ
スにおいて、インビボでラジ腫瘍細胞の増殖を阻止できることを示している。データは、
ＭＧＤ２６１をヒトのＣＤ３２Ｂ発現性Ｂ細胞悪性腫瘍治療に使用できることを示してい
る。
データ
１２〜２０週齢のＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ繁殖コロニー由来のｍＣＤ１６−／−、ｈＣＤ
１６Ａ＋、ＲＡＧ１−／−Ｃ５７Ｂ１／６マウスに５×１０６個のラジ細胞を０日目に静
脈内注射した。６、９、１３、１６、２０、２３、２７及び３０日目に、２５０、２５又
は２．５μｇのＭＧＤ２６１又はＰＢＳ（陰性対照）をマウス腹腔内に投与した後、マウ
スを毎日観察し、体重を週２回記録した。後肢麻痺を起したマウスを屠殺した。
結果
ＰＢＳで処理したマウスは２５日目〜５０日目の間に死亡した。ＭＧＤ２６１で処理した
マウスは、少なくとも９０日目まで生存した（図２６）。生存期間の上昇は統計的に有意
である。ログランク検定による生存曲線の比較では、χ２＝９６．４６（ｄｆ：９、
Ｐ値＜０．０００１）であった。
６．７．原核生物におけるＤＡＲＴ発現
非哺乳類宿主においてＤＡＲＴを作製することができることを示すために発現を行った
。従って、大腸菌をＤＡＲＴ発現プラスミドで形質転換し、ＤＡＲＴの発現をモニターし
た。
材料及び方法
プラスミドの構築
３Ｇ８はＨｕＣＤ１６に対するヒト化抗体である。本明細書に記載のＤＡＲＴは、２つの
共有結合により連結された鎖からなり、これらの鎖はそれぞれＶＬ、スペーサー及びＶＨ
をこの順に有し、その後ろに他方の鎖とジスルフィド結合を形成しやすくするシステイン
を有する。３Ｇ８ＶＬ−ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（配列番号
１０）−３Ｇ８ＶＨ−ＬｅｕＧｌｙＧｌｙＣｙｓをコードするＤＡＲＴ配列を、既存の真
核細胞発現構築物からＰＣＲ増幅し、ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化した。標的ベクター
としては、大腸菌内での分泌ためのｐｅｌＢリーダー配列を有するｐＥＴ２５ｂ（＋）（
Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用した。３Ｇ８／３Ｇ８ＤＡＲＴ配列の挿入前に、ベクターを以下
のように改変した。まず、その支配下でタンパク質の発現は低くなるが、その溶解性を助
けるために、Ｔ７プロモーターを低活性ｌａｃプロモーターで置換した。更に、マルチク
ローニング部位（ＭＣＳ）の先頭に存在する２つの内部メチオニンコドンを削除する２点
変異を導入し、ｐｅｌＢリーダーの先頭に存在するメチオニンで開始しやすくした。この
構築物により作製されるＤＡＲＴは、同一の特異性、即ち、ＨｕＣＤ１６を有するＶ領域
アームからなる。
発現：ＢＬ２１ＤＥ３細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）をｐＥＴ２５ｂ（＋）Ｔ７−ｌａｃ＋３
Ｇ８／３Ｇ８プラスミドで形質転換し、アンピシリン耐性コロニーをブロス培養に播種し
た。培養物が０．５ＯＤ６００ユニットに達したら、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加して発
現を誘導した。培養物を３０℃で２時間増殖させて、無細胞培地を集めた。
精製：３Ｇ８／３Ｇ８ＤＡＲＴをアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除ク
ロマトグラフィーを使用する２段階工程で精製した。ＤＡＲＴを、アフィニティークロマ
トグラフィーを使用して条件培地から捕捉した。具体的には、ＣＮＢｒ活性化セファロー
ス４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にＣＤ１６Ａを結合させた。充填前にＣＤ１６Ａ
−セファロース樹脂を２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０で平衡化した。充填後、結合ＤＡ
ＲＴを５０ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で溶出する前に、樹脂を平衡化緩衝液で洗浄した。
溶出したＤＡＲＴを、１Ｍトリス塩酸、ｐＨ８．０で直ちに中和し、遠心分離型濃縮器（
Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０、１０ｋ ＭＷＣＯ ＰＥＳ，ＶｉｖａＳｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．
）を用いて濃縮した。濃縮したＤＡＲＴを、更にＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２
００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィーによ
って精製した。
結果
１．７Ｌの大腸菌培養条件培地をＣＤ１６Ａセファロースカラムに通した。ＤＡＲＴの
収量は０．１２ｍｇであった。精製されたＤＡＲＴのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣによる
解析により、哺乳類細胞（ＣＨＯ）発現対照ＤＡＲＴとの同等性が示された（図２７）。
大腸菌発現ｈ３Ｇ８−ｈ３Ｇ８ＤＡＲＴ結合ＥＬＩＳＡ：大腸菌でのｈ３Ｇ８−ｈ３Ｇ
８ＤＡＲＴの発現をＥＬＩＳＡにより測定した。９６−ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート
を、１ウェル当たり５０μＬの２μｇ／ｍＬの抗ｈ３Ｇ８Ｆｖ特異抗体２Ｃ１１で、炭酸
緩衝液中、４℃で一晩被覆した。プレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２
０）で３回洗浄し、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔ溶液で３０分間、室温にてブロッキン
グ処理した後、試験するＤＡＲＴを添加した。ブロッキングの間に、大腸菌発現ｈ３Ｇ８
−ｈ３Ｇ８ＤＡＲＴ、ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ＤＡＲＴ及びｈ２Ｂ６−ｈ２Ｂ６ＤＡＲＴ（陰
性対照）を１μｇ／ｍＬ及び０．３μｇ／ｍＬのＰＢＳＴ／ＢＳＡ中に希釈した。各ウェ
ルに０．５μｇの希釈ＤＡＲＴを添加した。その後、プレートを室温で１時間インキュベ
ートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、１ウェル当たり５０μＬの０．１μｇ／ｍＬの
ビオチン化ｓＣＤ１６Ａ−Ｆｃ融合体を、各ウェルに添加した。プレートを室温で１時間
インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、１ウェル当たり５０μＬの１：５０
００希釈したＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を検出のために用い、室温で１時間インキュベートした。プ
レートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＴＭＢ基質を１ウェル当たり８０μＬ用いて発色させ
た。５分間のインキュベーション後、１％Ｈ２ＳＯ４を１ウェル当たり４０μＬ加えるこ
とによって、反応を停止させた。ＯＤ４５０ｎｍを９６ウェルプレートリーダーとＳＯＦ
Ｔｍａｘソフトウェアを用いて読み込み、結果はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ３．０３ソ
フトウェアを用いてプロットした（図２８）。
６．８．ＤＡＲＴ誘導ヒトＢ細胞死
ヒトＰＢＭＣをＣＤ１６−ＣＤ３２Ｂ−ｈｕ３Ｇ８−ｈｕ２ｂ６（上述）、ｃｈ２Ｂ６
−ａｇｌｙｃ−非グリコシル化キメラ２Ｂ６抗体（米国特許公開第２００５／０２６０２
１３として公開されている、同時係属中の米国特許出願第１１／１０８，１３５号に記載
、参照することにより本明細書中に組み入れる）及びＣＤ１６−ＣＤ７９と共に一晩イン
キュベートした。ＣＤ１６−ＣＤ７９のＤＮＡ及びコードされるタンパク質配列は以下の
通りである
Ｈ３Ｇ８ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ
ヌクレオチド配列（配列番号２２６）：
gacatcgtga tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga 50
gagggccacc atcaactgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg 100
atagttttat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc 150
ctcatctata ctacatccaa tctagaatct ggggtcccag acaggtttag 200
tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcagc agcctgcagg 250
ctgaggatgt ggcagtttat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300
acgttcggac aggggaccaa gcttgagatc aaaggaggcg gatccggagg 350
cggaggccag gtccaactgc agcagcctgg ggctgagctg gtgaggcctg 400
gggcttcagt gaagctgtcc tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc 450
tactggatga actgggtgaa gcagaggcct ggacaaggcc ttgaatggat 500
tggtatggtt gatccttcag acagtgaaac tcactacaat caaatgttca 550
aggacaaggc cacattgact gttgacaaat cctccagcac agcctacatg 600
cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag 650
agctatgggc tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctcagttg 700
agcccaaatc ttgt 714
アミノ酸配列（配列番号２２７）：
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL 50
LIYTTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSNEDPY 100
TFGQGTKLEI KGGGSGGGGQ VQLQQPGAEL VRPGASVKLS CKASGYTFTS 150
YWMNWVKQRP GQGLEWIGMV DPSDSETHYN QMFKDKATLT VDKSSSTAYM 200
QLSSLTSEDS AVYYCARAMG YWGQGTSVTV SSVEPKSC 238
ＣＢ３．１ＶＬ−ｈ３Ｇ８ＶＨ
ヌクレオチド配列（配列番号２２８）：
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca 50
accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100
gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150
cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200
cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250
aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350
aggcggaggc caggttaccc tgagagagtc tggccctgcg ctggtgaagc 400
ccacacagac cctcacactg acttgtacct tctctgggtt ttcactgagc 450
acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt cagcctcccg ggaaggctct 500
agagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgacaagcgc tataatccag 550
ccctgaagag ccgactgaca atctccaagg atacctccaa aaaccaggta 600
gtcctcacaa tgaccaacat ggaccctgtg gatactgcca catactactg 650
tgctcaaata aaccccgcct ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg 700
tcactgtgag ctcattcaac aggggagagt gt 732
アミノ酸配列（配列番号２２９）：
DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN 50
RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100
LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS 150
TSGMGVGWIR QPPGKALEWL AHIWWDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSKNQV 200
VLTMTNMDPV DTATYYCAQI NPAWFAYWGQ GTLVTVSSFN RGEC 244
アポトーシスをＦＡＣＳ解析により、全ＦＳＣ／ＳＳＣ非依存性個体数に対するＢ細胞
（ＣＤ２０＋細胞）のＰＩ＋アネキシン‐Ｖ＋個体数の割合としてアッセイした（図２９
）。
６．９．８Ｂ５−ＣＢ３．１ＤＡＲＴ
８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣ
８Ｂ５ＶＬは、Ｈ９及びｌｇｈ６３０Ｒをプライマーとして、ｃｈ８Ｂ５Ｌｃをテンプ
レートとして使用して増幅した。ＣＢ３．１ＶＨは、ｌｇｈ６２８Ｆ及びｌｇｈ６２９Ｒ
をプライマーとして、ｃｈ８Ｂ５Ｈｃをテンプレートとして使用して増幅した。リンカー
配列はプライマーｌｇｈ６３０Ｒ及びｌｇｈ６２８Ｆ中に組み込んだ。Ｃ末端リンカー及
び終止コドンはｌｇｈ６２９Ｒプライマーに組み込んだ。ＰＣＲ産物をゲル精製し、等モ
ル比で混合した後、Ｈ９及びｌｇｈ６２９Ｒをプライマーとして用いて増幅した。重複Ｐ
ＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＣＩｎｅｏベクタ
ーにクローニングした。
ＣＢ３．１ＶＬ−８Ｂ５ＶＨ−ＦＮＲＧＥＣ
ＣＢ３．１ＶＬは、Ｈ９及び、ＦＲ４に８Ｂ５ＶＬと同じ配列を共有する、ｌｇｈ６３
０Ｒをプライマーとして、ｃｈＣＢ３．１Ｌｃをテンプレートとして使用して増幅した。
８Ｂ５ＶＨは、ｌｇｈ６３１Ｆ及びｌｇｈ６４０Ｒをプライマーとして、ｃｈ８Ｂ５Ｈｃ
をテンプレートとして使用して増幅した。リンカー配列はプライマーｌｇｈ６３０Ｒ及び
ｌｇｈ６３１Ｆ中に組み込んだ。Ｃ末端リンカー及び終止コドンはｌｇｈ６４０Ｒプライ
マーに組み込んだ。ＰＣＲ産物をゲル精製し、等モル比で混合した後、Ｈ９及びｌｇｈ６
４０Ｒをプライマーとして用いて増幅した。重複ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限
エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＣＩｎｅｏベクターにクローニングした。
抗フラッグタグ−８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣ
抗フラッグタグをシグナル配列と８Ｂ５ＶＬの間に重複ＰＣＲにより挿入した。シグナ
ル配列及びフラッグタグは、Ｈ９及びｌｇｈ６４７Ｒをプライマーとして、ｃｈ８Ｂ５Ｌ
ｃをテンプレートとして使用して増幅した。８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣ
は、ｌｇｈ６４７Ｆ及びｌｇｈ６２９Ｒをプライマーとして、８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１Ｖ
Ｈ−ＶＥＰＫＳＣをテンプレートとして使用して再増幅した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、
等モル比で混合した後、Ｈ９及びｌｇｈ６２９Ｒをプライマーとして用いて増幅した。重
複ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＣＩｎｅｏベ
クターにクローニングした。
８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＬＧＧＣ
異なるＣ末端リンカーを８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣ構築物内で作製す
るために、構築物をＨ９及びｌｇｈ６４６Ｒをプライマーとして使用して再増幅した。Ｃ
末端ＬＧＧＣリンカーをｌｇｈ６４６Ｒプライマーに組み込んだ。ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ
／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＣＩｎｅｏベクターにクローニングし
た。
ＣＢ３．１ＶＬ−８Ｂ５ＶＨ−ＬＧＧＣ
同じ方法をＣＢ３．１ＶＬ−８Ｂ５ＶＨ−ＬＧＧＣの作製に使用した。Ｃ末端ＬＧＧＣ
リンカーをｌｇｈ６４８Ｒプライマーに組み込み、ＣＢ３．１ＶＬ−８Ｂ５ＶＨ−ＦＮＲ
ＧＥＣをテンプレートとして使用した。ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌ
クレアーゼで消化し、ｐＣＩｎｅｏベクターにクローニングした。
抗フラッグタグ−８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＬＧＧＣ
同じ方法を抗フラッグタグ−８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＬＧＧＣの作製にも使用し
た。Ｃ末端ＬＧＧＣリンカーをｌｇｈ６４８Ｒプライマーに組み込み、抗フラッグタグ−
８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣをテンプレートとして使用した。ＰＣＲ産物
をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＣＩｎｅｏベクターにクロ
ーニングした。
８Ｂ５−ＣＢ３．１−ＶＥＰＫＳＣヌクレオチド配列（配列番号２３０）：
gacattcaga tgacacagtc tccatcctcc ctacttgcgg cgctgggaga 50
aagagtcagt ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100
gctggcttca gcagaaacca gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc 150
gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa aggttcagtg gcagtgagtc 200
tgggtcagat tattctctca ccatcagcag tcttgagtct gaagattttg 250
cagactatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350
ccaactgcag cagcctgggg ctgagctggt gaggcctggg gcttcagtga 400
agctgtcctg caaggcttct ggctacacct tcaccagcta ctggatgaac 450
tgggtgaagc agaggcctgg acaaggcctt gaatggattg gtatggttga 500
tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacaaggcca 550
cattgactgt tgacaaatcc tccagcacag cctacatgca gctcagcagc 600
ctgacatctg aggactctgc ggtctattac tgtgcaagag ctatgggcta 650
ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcagttgag cccaaatctt 700
gt 702
８Ｂ５−ＣＢ３．１−ＶＥＰＫＳＣアミノ酸配列（配列番号２３１）：
DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTCRASQEIS GYLSWLQQKP DGTIKRLIYA 50
ASTLDSGVPK RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYCLQ YFSYPLTFGA 100
GTKLELKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKAS GYTFTSYWMN 150
WVKQRPGQGL EWIGMVDPSD SETHYNQMFK DKATLTVDKS SSTAYMQLSS 200
LTSEDSAVYY CARAMGYWGQ GTSVTVSSVE PKSC 234
ＣＢ３．１−８Ｂ５−ＦＮＲＧＥＣヌクレオチド配列（配列番号２３２）：
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca 50
accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100
gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150
cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200
cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250
aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350
aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400
ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450
gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500
ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550
agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600
gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650
ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700
tctcctcgtt caacagggga gagtgt 726
ＣＢ３．１−８Ｂ５−ＦＮＲＧＥＣアミノ酸配列（配列番号２３３）：
DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN 50
RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100
LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCEASGFTFS 150
DAWMDWVRQS PEKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDSKSS 200
VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA LGLDYWGQGT TLTVSSFNRG EC 242
８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＬＧＧＣ
８Ｂ５ＶＬは、Ｈ９及びｌｇｈ６９４Ｒをプライマーとして、ｃｈ８Ｂ５Ｌｃをテンプ
レートとして使用して増幅した。８Ｂ５ＶＨは、ｌｇｈ６９５Ｆ及びｌｇｈ６９６Ｒをプ
ライマーとして、ｃｈ８Ｂ５Ｈｃをテンプレートとして使用して増幅した。リンカー配列
はプライマーｌｇｈ６９４Ｒ及びｌｇｈ６９５Ｆ中に組み込んだ。ＨｕＩｇＧ１Ｆｃは、
ｌｇｈ３５５Ｆ及びｌｇｈ３６６Ｒをプライマーとして、ｃｈ８Ｂ５Ｈｃをテンプレート
として使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、等モル比で混合した後、Ｈ９及びｌ
ｇｈ３６６Ｒをプライマーとして用いて増幅した。重複ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＣＩｎｅｏベクターにクローニングした。
８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＬＧＧＣヌクレオチド配列（配列番号２３４）：
gacattcaga tgacacagtc tccatcctcc ctacttgcgg cgctgggaga 50
aagagtcagt ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100
gctggcttca gcagaaacca gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc 150
gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa aggttcagtg gcagtgagtc 200
tgggtcagat tattctctca ccatcagcag tcttgagtct gaagattttg 250
cagactatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350
ccaactgcag cagcctgggg ctgagctggt gaggcctggg gcttcagtga 400
agctgtcctg caaggcttct ggctacacct tcaccagcta ctggatgaac 450
tgggtgaagc agaggcctgg acaaggcctt gaatggattg gtatggttga 500
tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacaaggcca 550
cattgactgt tgacaaatcc tccagcacag cctacatgca gctcagcagc 600
ctgacatctg aggactctgc ggtctattac tgtgcaagag ctatgggcta 650
ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696
８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＬＧＧＣアミノ酸配列（配列番号２３５）：
DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTCRASQEIS GYLSWLQQKP DGTIKRLIYA 50
ASTLDSGVPK RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYCLQ YFSYPLTFGA 100
GTKLELKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKAS GYTFTSYWMN 150
WVKQRPGQGL EWIGMVDPSD SETHYNQMFK DKATLTVDKS SSTAYMQLSS 200
LTSEDSAVYY CARAMGYWGQ GTSVTVSSLG GC 232
ＣＢ３．１−８Ｂ５−ＬＧＧＣヌクレオチド配列（配列番号２３６）：
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca 50
accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100
gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150
cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200
cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250
aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350
aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400
ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450
gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500
ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550
agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600
gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650
ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700
tctcctcgct gggaggctgc 720
ＣＢ３．１−８Ｂ５−ＬＧＧＣアミノ酸配列（配列番号２３７）：
DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN 50
RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100
LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCEASGFTFS 150
DAWMDWVRQS PEKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDSKSS 200
VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA LGLDYWGQGT TLTVSSLGGC 240
プライマー：
Ｌｇｈ６２８Ｆ（配列番号２３８）：
ggaggcggat ccggaggcgg aggccaggtc caactgcagc agcctgg 47
Ｌｇｈ６２９Ｒ（配列番号２３９）：
tttgaattct aacaagattt gggctcaact gaggagacgg tgactgagg 49
Ｌｇｈ６３０Ｒ（配列番号２４０）：
gcctccgcct ccggatccgc ctcctttcag ctccagcttg gtccc 45
Ｌｇｈ６３１Ｆ（配列番号２４１）：
ggaggcggat ccggaggcgg aggcgaagtg aagcttgagg agtctgg 47
Ｌｇｈ６４０Ｒ（配列番号２４２）：
tttgaattct aacactctcc cctgttgaac gaggagactg tgagagtgg 49
Ｌｇｈ６４４Ｒ（配列番号２４３）：
tttgtcgtca tcatcgtctt tgtagtcgga gtggacacct gtggagag 48
Ｌｇｈ６４６Ｒ（配列番号２４４）：
tttgaattct agcagcctcc cagtgaggag acggtgactg ag 42
Ｌｇｈ６４７Ｆ（配列番号２４５）：
caaagacgat gatgacgaca aagacattca gatgacacag tctcc 45
Ｌｇｈ６４８Ｒ（配列番号２４６）：
tttgaattct agcagcctcc cagcgaggag actgtgagag tgg 43
発現
構築物５及び６、６及び７、８及び９又は９及び１０をコードする発現プラスミド（図３
０）をＨＥＫ−２９３細胞にコトランスフェクトし、抗フラグタグを有する又は有しない
８Ｂ５−ＣＢ３．１ＤＡＲＴを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ）を使用して発現させた。条件培地を３日毎に３回採取した。その後、条件培地を
ＣＤ３２Ｂアフィニティーカラムで精製した。
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡを次のように行った。９６−ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを、１ウェル
当たり５０μＬの２μｇ／ｍＬのＣＤ３２Ｂ−Ｆｃで、炭酸緩衝液中、４℃で一晩被覆し
た。プレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、０．５％
ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔ溶液で３０分間、室温にてブロッキング処理した後、試験する単鎖
Ｆｃ融合タンパク質を添加した。ブロッキングの間に、８Ｂ５−ＣＢ３．１ＤＡＲＴを２
μｇ／ｍＬから倍々希釈した。各２５μＬ／ウェルの希釈ＤＡＲＴを２５μＬ／ウェルの
５０ｎｇ／ｍＬのｃｈ８Ｂ５と混合し、希釈用プレートからＥＬＩＳＡ用プレートに移し
た。プレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、プレー
トの各ウェルに５０μＬの１：１００００希釈したＨＲＰコンジュゲートＦ（ａｂ’）２
ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を
添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗
浄し、８０μＬ／ウェルのＴＭＢ基質で発色させた。５分間のインキュベーション後、４
０μＬ／ウェルの１％Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。ＯＤ４５０ｎｍを９６ウェルプレ
ートリーダーとＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを用いて読み込んだ。結果はＧｒａｐｈＰａ
ｄＰｒｉｓｍ３．０３ソフトウェアを用いてプロットした（図３１）。
６．１０．Ｉｇ様四価ＤＡＲＴの設計と特徴付け
４つのポリペプチドを用いて、四価の抗原結合部位を有するＩｇ様ＤＡＲＴ種を作製し
た（図３２及び３３）。Ｉｇ様ＤＡＲＴ種は独特の特性を有しており、そのドメインは同
一のエピトープに結合するように（４つの同一抗原分子に結合することができる、四価の
単一エピトープ特異的Ｉｇ様ＤＡＲＴを形成するように）、又は異なるエピトープ若しく
は抗原に結合するように設計してもよいので、例えば、そのドメインを、同一抗原の２つ
のエピトープに結合するように（四価の単一抗原特異的二エピトープ特異的Ｉｇ様ＤＡＲ
Ｔを形成するように）、又は異なる抗原分子のエピトープに結合するように（第１の抗原
に特異的な一対の結合部位と第２の抗原に特異的な一対の結合部位を有する四価のＩｇ様
ＤＡＲＴを形成するように）設計してもよい。そのような特質の組み合わせを有するハイ
ブリッド分子を容易に作製することができる。
このようなＩｇ様ＤＡＲＴ種の特徴を説明するために、ＣＤ３２に特異的な一対の結合
部位とＣＤ１６Ａに特異的な第２の一対の結合部位とを有する四価Ｉｇ様ＤＡＲＴ種を例
示的に作製した。このＩｇ様ＤＡＲＴ種は、以下の４つのポリペプチド鎖を使用して作製
した。
２．４Ｇ２−３Ｇ８−ｈκヌクレオチド配列（配列番号２４７）：
gatgtccaga tgacccagtc tccatctaat cttgctgcct ctcctggaga 50
aagtgtttcc atcaattgca aggcaagtga gagcattagc aagtatttag 100
cctggtatct acagaaacct gggaaagcaa ataagcttct tatgtacgat 150
gggtcaactt tgcaatctgg aattccatcg aggttcagtg gcagtggatc 200
tggtacagat ttcactctca ccatcagaag cctggagcct gaagattttg 250
gactctatta ctgtcaacag cattatgaat atccagccac gttcggttct 300
gggaccaagc tggagatcaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350
taccctgaaa gagtctggcc ctgggatatt gcagccctcc cagaccctca 400
gtctgacttg ttctttctct gggttttcac tgaggacttc tggtatgggt 450
gtaggctgga ttcgtcagcc ttcagggaag ggtctagagt ggctggcaca 500
catttggtgg gatgatgaca agcgctataa tccagccctg aagagccgac 550
tgacaatctc caaggatacc tccagcaacc aggtattcct caaaatcgcc 600
agtgtggaca ctgcagatac tgccacatac tactgtgctc aaataaaccc 650
cgcctggttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtgagctcac 700
tgggaggctg cggcggaggg agccgtacgg tggctgcacc atcggtcttc 750
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt 800
gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg 850
tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag 900
gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa 950
agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg 1000
gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 1044
２．４Ｇ２−３Ｇ８−ｈκコードアミノ酸配列（配列番号２４８）：
DVQMTQSPSN LAASPGESVS INCKASESIS KYLAWYLQKP GKANKLLMYD 50
GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTLTIRSLEP EDFGLYYCQQ HYEYPATFGS 100
GTKLEIKGGG SGGGGQVTLK ESGPGILQPS QTLSLTCSFS GFSLRTSGMG 150
VGWIRQPSGK GLEWLAHIWW DDDKRYNPAL KSRLTISKDT SSNQVFLKIA 200
SVDTADTATY YCAQINPAWF AYWGQGTLVT VSSLGGCGGG SRTVAAPSVF 250
IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ 300
DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC 350
３Ｇ８−２．４Ｇ２−ｈＧ１ヌクレオチド配列（配列番号２４９）：
gacactgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca 50
gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg 100
atagttttat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc 150
ctcatctata ctacatccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag 200
tgccagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg 250
aggaggatac tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaaggaggcg gatccggagg 350
cggaggcgag gtggagctag tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg 400
gaaggtccct gaaactctcg tgtgcagcct caggattcac tttcagtgac 450
tattacatgg cctgggtccg gcaggctcca acgacgggtc tggagtgggt 500
cgcatccatt agttatgatg gtggtgacac tcactatcga gactccgtga 550
agggccgatt tactatttcc agagataatg caaaaagcag cctatacctg 600
caaatggaca gtctgaggtc tgaggacacg gccacttatt actgtgcaac 650
agagactacg ggaataccta caggtgttat ggatgcctgg ggtcaaggag 700
tttcagtcac tgtctcctca ctgggaggct gcggcggagg gagcgcctcc 750
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc 800
tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac 850
cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc 900
ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt 950
gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga 1000
atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct 1050
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg 1100
gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga 1150
tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 1200
gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa 1250
tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg 1300
tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1350
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat 1400
ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc 1450
catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1500
aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca 1550
gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct 1600
ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1650
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta 1700
cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa 1734
３Ｇ８−２．４Ｇ２−ｈＧ１コードアミノ酸配列（配列番号２５０）：
DTVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL 50
LIYTTSNLES GIPARFSASG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YCQQSNEDPY 100
TFGGGTKLEI KGGGSGGGGE VELVESGGGL VQPGRSLKLS CAASGFTFSD 150
YYMAWVRQAP TTGLEWVASI SYDGGDTHYR DSVKGRFTIS RDNAKSSLYL 200
QMDSLRSEDT ATYYCATETT GIPTGVMDAW GQGVSVTVSS LGGCGGGSAS 250
TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT 300
FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS 350
CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE 400
DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY 450
KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV 500
KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ 550
GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 578
上記配列を有するＩｇ様ＤＡＲＴ分子の試料は異なるプラスミド単離株から得られ、「
ＩｇＤＡＲＴ１」及び「ＩｇＤＡＲＴ２」と命名した。ＥＬＩＳＡにおけるこれらＩｇ様
ＤＡＲＴ種のｍＣＤ３２−ｈＣＤ１６Ａへの結合能を、培地そのもの、単一のＣＤ３２及
び単一のＣＤ１６Ａ結合部位（「ＤＡＲＴ」）を有するＤＡＲＴ、及び対照抗ｍＣＤ３２
ｍＡｂと比較した（図３４）。本発明のＩｇ様ＤＡＲＴは、ＤＡＲＴ及び対照抗体よりも
はるかに大きな抗原結合親和性を有することが分かった。
６．１１．ＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−１及びＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−２二重特異性ダイアボ
ディの設計と特徴付け
ＣＤ７９ＶＬ−ＣＤ３２ＢＶＨ（配列１）、ＣＤ３２ＢＶＬ−ＣＤ７９ＶＨ−１（配列
２）、及びＣＤ３２ＢＶＬ−ＣＤ７９ＶＨ−２（配列３）をコードする遺伝子をｐＥＥ１
３発現ベクターにクローニングし、それぞれ発現構築物１、２及び３を得た。構築物１発
現プラスミドを発現プラスミド２又は３とともにＨＥＫ−２９３細胞内にコトランスフェ
クトし、それぞれＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−１及びＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−２二重特異性ダ
イアボディを作製した。条件培地を３日毎に３回採取した。その後、条件培地をＣＤ３２
Ｂアフィニティーカラムで精製した
ＥＬＩＳＡを次のように行った。９６−ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを、１ウェル
当たり５０μＬの２μｇ／ｍＬのＣＤ３２Ｂ−Ｆｃで、炭酸緩衝液中、４℃で一晩被覆し
た。プレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、０．５％
ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔ溶液で３０分間、室温にてブロッキング処理した後、試験する単鎖
Ｆｃ融合タンパク質を添加した。ブロッキングの間に、ＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−１又はＣ
Ｄ３２Ｂ−ＣＤ７９−２二重特異性ダイアボディを２μｇ／ｍＬから倍々希釈した。各２
５μＬ／ウェルの希釈二重特異性ダイアボディを２５μＬ／ウェルの５０ｎｇ／ｍＬの抗
ＣＤ３２Ｂ抗体と混合し、ＥＬＩＳＡ用プレートに添加した。プレートを室温で１時間イ
ンキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、プレートの各ウェルに５０μＬの１：
１００００希釈したＨＲＰコンジュゲートＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）
２（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加した。プレートを室温で１
時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、８０μＬ／ウェルのＴＭ
Ｂ基質で発色させた。５分間のインキュベーション後、４０μＬ／ウェルの１％Ｈ２ＳＯ
４で反応を停止させた。ＯＤ４５０ｎｍを９６ウェルプレートリーダーとＳＯＦＴｍａｘ
ソフトウェアを用いて読み込んだ。結果はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ３．０３ソフトウ
ェアを用いてプロットした。本実験により、ＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−１及びＣＤ３２Ｂ−
ＣＤ７９−２二重特異性ダイアボディが、抗ＣＤ３２Ｂ対照抗体と同様の親和性でＣＤ３
２−Ｆｃに免疫特異的に結合できることが明らかになった。上述の構築物のヌクレオチド
及びコードされるアミノ酸配列を以下に示す。
配列１−ＣＤ７９ＶＬ−ＣＤ３２ＢＶＨヌクレオチド配列（配列番号２５１）：
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50
gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100
gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150
cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200
cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250
aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300
ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350
aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400
ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450
gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500
ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550
agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600
gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650
ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700
tctcctcgct gggaggctgc 720
配列２−ＣＤ７９ＶＬ−ＣＤ３２ＢＶＨアミノ酸配列（配列番号２５２）：
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100
LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150
DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200
LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC 240
配列３−ＣＤ３２ＢＶＬ−ＣＤ７９ＶＨ−１ヌクレオチド配列（配列番号２５３）：
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50
tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100
gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150
gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200
tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250
caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300
gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350
tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400
aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500
tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacagagtca 550
ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600
ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650
ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696
配列４−ＣＤ３２ＢＶＬ−ＣＤ７９ＶＨ−１アミノ酸配列（配列番号２５４）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQMFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC 232
配列５−ＣＤ３２ＢＶＬ−ＣＤ７９ＶＨ−２ヌクレオチド配列（配列番号２５５）：
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50
tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100
gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150
gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200
tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250
caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300
gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350
tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400
aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500
tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca 550
ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600
ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650
ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696
配列６−ＣＤ３２ＢＶＬ−ＣＤ７９ＶＨ−２アミノ酸配列（配列番号２５６）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC 232
６．１２．Ｈ８Ｂ５−ＨＢＣＲＣ生体機能性ダイアボディの構築及び最適化
ＣＤ３２及びＢ細胞受容体複合体（「ＢＣＲＣ」）に結合できる可変領域を含む、ダイ
アボディを構築した。
クローニング
構築物は標準ＰＣＲ／重複ＰＣＲにより構築した。
ｈ８Ｂ５ＶＬ−Ｇ３ＳＧ４−ｈＢＣＲＣＶＨ−Ｍ４８Ｉ−ＬＧＧＣ：
完全ヒト化８Ｂ５ＶＬ（ＣＤ３２を認識）は、ｌｇｈ３２１Ｆ及びｌｇｈ７８８Ｒをプラ
イマーとして使用して増幅した。ｈＢＣＲＣＶＨ−Ｍ４８Ｉは、ｌｇｈ７８４Ｆ及びｌｇ
ｈ３８６Ｒをプライマーとして使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲル精製、混合し、ｌｇ
ｈ３２１Ｆ及びｌｇｈ３８６Ｒを使用して増幅した。重複ＰＣＲ断片をＸｂａＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ部位でｐＥＥ６にクローニングした。「Ｇ３ＳＧ４」は配列：ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配
列番号１０）を有するリンカーである。
ｈＢＣＲＣＶＬ−Ｒ４５Ｎ−Ｇ３ＳＧ４−ｈ８Ｂ５ＶＨ−ＬＧＧＣ：
ｈＢＣＲＣＶＬ−Ｒ４５Ｎは、ｌｇｈ３２１Ｆ及びｌｇｈ７８５Ｒをプライマーとして使
用して増幅した。ｈ８Ｂ５ＶＨは、ｌｇｈ７８７Ｆ及びｌｇｈ７８６Ｒをプライマーとし
て使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲル精製、混合し、ｌｇｈ３２１Ｆ及びｌｇｈ７８６
Ｒを使用して増幅した。重複ＰＣＲ断片をＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ部位でｐＥＥ１３にクロ
ーニングした。
単一ベクター構築物
ｐＥＥ６ｈＨＢＣＲＣＶＬ Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨをＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩ部位で消化
し、３．３ｋｂ断片を精製し、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位でｐＥＥ１３ｈＨＢＣＲＣＶＬ
４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨに挿入した。ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩは適合性の粘着末端を共有
する。ＤＡＲＴの配列及びＤＡＲＴの構築に使用したプライマーを以下に示す。
ｈＨＢＣＲＣＶＬ．Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨ−ＬＧＧＣヌクレオチド配列（配列番号２５
７）：
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50
gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100
gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150
cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200
cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250
aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300
ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350
aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400
ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450
gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500
ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550
agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600
gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650
ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700
tctcctcgct gggaggctgc 720
ｈＨＢＣＲＣＶＬ．Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨ−ＬＧＧＣアミノ酸配列（配列番号２５８）
：
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100
LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150
DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200
LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC 240
Ｈ８Ｂ５ＶＬ−ｈＨＢＣＲＣＶＨ−Ｍ４８Ｉ−ＬＧＧＣヌクレオチド配列（配列番号２５
９）：
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50
tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100
gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150
gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200
tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250
caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300
gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350
tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400
aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500
tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacagagtca 550
ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600
ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650
ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696
Ｈ８Ｂ５ＶＬ−ＨＢＣＲＣＶＨ−Ｍ４８Ｉ−ＬＧＧＣアミノ酸配列（配列番号２６０）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQMFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC 232
Ｌｇｈ３２１Ｆプライマー（配列番号２６１）：
cgagctagct ctagatgaga tcacagttct ctctac 36
Ｌｇｈ３８６Ｒプライマー（配列番号２６２）：
tttgaattct agcagcctcc cagtgaggag acggtgaccg tggtc 45
Ｌｇｈ７８４Ｆプライマー（配列番号２６３）：
ggcggatccg gaggcggagg ccaggttcag ctggtgcag 39
Ｌｇｈ７８５Ｒプライマー（配列番号２６４）：
cctccggatc cgcctccttt gatctcaagc ttggtccc 38
Ｌｇｈ７８６Ｒプライマー（配列番号２６５）：
tttgaattct agcagcctcc caggctggag acggtcacca gg 42
Ｌｇｈ７８７Ｆプライマー（配列番号２６６）：
ggaggcggat ccggaggcgg aggcgaagtg cagcttgtgg agtc 44
Ｈｕ３Ｇ８ＶＬ１−Ｇ３ＳＧ４−Ｈｕ２Ｂ６ＶＨ４−ＬＧＧＣ発現プラスミドをＨｕ２
Ｂ６ＶＬ５−Ｇ３ＳＧ４−Ｈｕ３Ｇ８ＶＨ５−ＬＧＧＣとともにＨＥＫ−２９３細胞にコ
トランスフェクトし、ＣＤ３２及びＣＤ７９を認識する生体分子特異的ダイアボディＨｕ
２Ｂ６４．５−Ｈｕ３Ｇ８５．１を作製した。同時に、Ｈｕ２Ｂ６ＶＬ５−Ｇ３ＳＧ４−
Ｈｕ２Ｂ６ＶＨ４−ＬＧＧＣ及びＨｕ３Ｇ８ＶＬ１−Ｇ３ＳＧ４−Ｈｕ３Ｇ８ＶＨ５−Ｌ
ＧＧＣをそれぞれＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトし、Ｈｕ２Ｂ６４．５及びＨｕ
３Ｇ８ ５．１ダイアボディを作製した。３日間培養し、条件培地を回収し、結合ＥＬＩ
ＳＡにより特徴付けした。本実験結果を図３６に示す。
実験計画：９６−ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを、１００ｎｇ／ウェルの可溶性Ｆ
ｃＲＩＩｂ−Ｇ２−Ａｇｌｙで、炭酸緩衝液中、４０℃で一晩被覆した。プレートをＰＢ
Ｓ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅ
ｅｎ２０で３０分間、室温にてブロッキング処理した後、ダイアボディを添加した。Ｈｕ
２Ｂ６４．５−Ｈｕ３Ｇ８５．１生体分子特異的ダイアボディ、Ｈｕ２Ｂ６４．５ダイア
ボディ、及びｈｕ３Ｇ８５．１ダイアボディの条件培地を２５ｎｇ／ウェルから倍々希釈
し、各ウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．１
％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、プレートの各ウェルに１０ｎｇのＦｃＲＩＩＩａ−
Ｇ２−ビオチンを添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートをＰ
ＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄後、５０μＬの１：５０００希釈したＨＲＰ結
合ストレプトアビジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を検
出に用いた。室温で４５分間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅ
ｅｎ２０で３回洗浄し、ＴＭＢ基質で発色させた。１０分間のインキュベーション後、１
％Ｈ２ＳＯ４により反応を停止させた。ＯＤ４５０ｎｍをＳＯＦＴｍａｘプログラムで読
み込んだ。結果はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ３．０３ソフトウェアを用いてプロットし
た。
６．１３．ＩｇＤＡＲＴダイアボディの構築
ＣＤ３２及びＢ細胞受容体複合体（「ＢＣＲＣ」）に結合できる可変領域を含む、Ｉｇ
ＤＡＲＴダイアボディを構築した。第１のダイアボディでは、分子のＶＨ配列とＦｃ配列
の間にＬＧＧＣＧＧＧＳ（配列番号２６７）リンカーを使用した。第２のダイアボディで
は、配列ＬＥＩＫ（配列番号２６８）を有するＬＥＩＫリンカー又は配列ＴＶＳＳ（配列
番号２６９）を有するＴＶＳＳリンカーを使用した。これらダイアボディの鎖の配列及び
コードしているポリヌクレオチドの配列を以下に示す。
Ｈ８Ｂ５ＶＬ−ｈＢＣＲＣＶＨ−Ｍ４８Ｉ、Ｍ６２Ｋ＿ＬＧＧＣＧ３Ｓ＿ｈκ（配列番
号２７０）：
Figure 2015157833
１０８−１１５位置にリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）を配置して、Ｈ８Ｂ５
ＶＬ配列をｈＢＣＲＣＶＨ配列に融合させ、２２９−２３６位置にリンカーＬＧＧＣＧＧ
ＧＳ（配列番号２６７）を配置して、ｈＢＣＲＣＶＨ配列をＦｃ配列に融合させた（両者
を下線により上に示した）。
Ｈ８Ｂ５ＶＬ−ｈＢＣＲＣＶＨ−Ｍ４８Ｉ，Ｍ６２Ｋ＿ＬＧＧＣＧ３Ｓ＿ｈκ配列をコー
ドするポリヌクレオチドを次に示す。（配列番号２７１）：
Figure 2015157833
ここで、リンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）及びＬＧＧＣＧＧＧＳ（配列番号２
６７）をコードしている配列は、それぞれ３２２−３４５位置及び６８５−７０８位置に
存在する（両者を下線により上に示した）。
ＨＢＣＲＣＶＬ Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨ＿ＬＧＧＣＧＧＧＳ−ｈＧ１
（配列番号２７２）：
Figure 2015157833
１１３−１２０位置にリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）を配置して、ｈＢＣ
ＲＣＶＬ配列をＨ８Ｂ５ＶＨ配列に融合させ、２３７−２４４位置にリンカーＬＧＧＣＧ
ＧＧＳ（配列番号２６７）を配置して、Ｈ８Ｂ５ＶＨ配列をＦｃ配列に融合させた（両者
を下線により上に示した）。
ＨＢＣＲＣＶＬ−Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨ＿ＬＧＧＣＧＧＧＳ−ｈＧｌ配列をコードする
ポリヌクレオチドを次に示す。（配列番号２７３）：
Figure 2015157833
ここで、リンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）及びＬＧＧＣＧＧＧＳ（配列番号２
６７）をコードしている配列は、それぞれ３３７−３６０位置及び７０９−７３２位置に
存在する（両者を下線により上に示した）。
Ｈ８Ｂ５ＶＬ−ＨＢＣＲＣＶＨ Ｍ４８Ｉ、Ｍ６２Ｋ＿（−４）ＬＥＩＫ＿ｈκ
（配列番号２７４）：
Figure 2015157833
１０８−１１５位置にリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）を配置して、Ｈ８Ｂ５
ＶＬ配列をＨＢＣＲＣＶＨ配列に融合させ、２２５−２２８位置にリンカーＬＥＩＫ（配
列番号２６８）を配置して、ＨＢＣＲＣＶＨ配列をＦｃ配列に融合させた（両者を下線に
より上に示した）。
Ｈ８Ｂ５ＶＬ−ＨＢＣＲＣＶＨ Ｍ４８Ｉ，Ｍ６２Ｋ＿（−４）ＬＥＩＫ＿ｈκ配列を
コードするヌクレオチドを次に示す。（配列番号２７５）：
Figure 2015157833
ここで、リンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）及びＬＥＩＫ（配列番号２６８）を
コードしている配列は、それぞれ３２２−３４５位置及び６７３−６８４位置に存在する
（両者を下線により上に示した）。
ＨＢＣＲＣＶＬ Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨ＿（−４）ＴＶＳＳ−ｈＧｌ＝ＨＢＣＲＣＶ
Ｌ−Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨ＿−ｈＧ１
（配列番号２７６）：
Figure 2015157833
１１３−１２０位置にリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）を配置して、ＨＢＣＲ
ＣＶＬ配列をｈ８Ｂ５ＶＨ配列に融合させ、２３３−２３６位置にリンカーＴＶＳＳ（配
列番号２６９）を配置して、ｈ８Ｂ５ＶＨ配列をＦｃ配列に融合させた（両者を下線によ
り上に示した）。
ＨＢＣＲＣＶＬ Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨ＿（−４）ＴＶＳＳ−ｈＧ１をコードするヌ
クレオチドを次に示す：
（配列番号２７７）：
Figure 2015157833
ここで、リンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）及びＴＶＳＳ（配列番号２６９）
をコードしている配列は、それぞれ３３７−３６０位置及び６９７−７０８位置に存在す
る（両者を下線により上に示した）。
６．１４．リンカーの最適化
上述のように、本発明のＩｇＤＡＲＴダイアボディは、好ましくは分子のＶＨ配列とＦ
ｃ配列の間にリンカーを有する。収量と活性を最大にするために、リンカーの最適化の実
験を行った。以下のリンカーを使用した。
Figure 2015157833
上記のリンカーをプラスミドに導入し、異なるリンカーの組み合わせを有するＩｇＤＡ
ＲＴダイアボディのセットを作成した。
Figure 2015157833
作製されたＩｇＤＡＲＴの凝集性について決定した。
Figure 2015157833
データは、９０１Ａ／９０１Ｂ、９０３Ａ／９０３Ｂ及び９０８Ａ／９０８Ｂで使用し
たリンカーなどのリンカーを有する構築物は、９１０Ａ／９１１Ｂなどのリンカーを有す
ると比較して非常に優れた結果（低オリゴマー化及び／又は低断片作製）を与える、とい
うことを予想外に示した。
６．１５．Ｅ−コイル／Ｋ−コイルＤＡＲＴ
上記から理解されるように、二重特異性ＤＡＲＴのそれぞれのポリペプチドは、２種の
ホモ二量体と１種のヘテロ二量体を形成することができる。本発明の一つの実施形態にお
いては、荷電したポリペプチドを１つ以上、好ましくは両方のＤＡＲＴポリペプチドのＣ
末端に添加することができる。二重特異性ＤＡＲＴの個々のポリペプチドの電荷と反対に
荷電されたポリペプチドを選択することにより、そのような荷電ポリペプチドの包含がヘ
テロ二量体の形成を容易にし、ホモ二量体の形成を低減する。好ましくは、陽性に荷電し
たポリペプチドはアルギニン、グルタミン、ヒスチジン及び／又はリジン（又はこれらの
アミノ酸の混合物）を大量に含有し、陰性に荷電したポリペプチドはアスパラギン酸又は
グルタミン酸（又はこれらアミノ酸の混合物）を大量に含有する。リジンを大量に含有す
る陽性に荷電されたポリペプチド及びグルタミン酸を大量に含有する陰性に荷電されたポ
リペプチドが特に好ましい。このような反対に荷電したポリペプチド間の静電気引力を最
大にするためには、ヘリカル構造を自然発生的にとることができるポリペプチドを使用す
ることが好ましい。
従って、好ましい実施形態では、陽性に荷電した「Ｅ−コイル」を、二重特異性ＤＡＲ
Ｔを形成するために使用されるポリペプチドの１つに付加し、陰性に荷電した「Ｋ−コイ
ル」を、ＤＡＲＴの第２のポリペプチドに付加する（図３７）。
特に好ましいＥ−コイルは、配列：（ＥＶＡＡＬＥＫ）４：
配列番号２９９：EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK
を有する。
特に好ましいＫ−コイルは、配列：（ＫＶＡＡＬＫＥ）４：
配列番号３００：KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE
を有する。
このようなＥ−コイルを有する好ましいＤＡＲＴポリペプチドは一般配列：［ＶＬドメ
イン］−［ＧＧＧＳＧＧＧＧ］−［ＶＨドメイン］−［（ＥＶＡＡＬＥＫ）４］−ＧＧＧ
ＮＳを有し、ここで、ＶＬはＤＡＲＴの可変軽鎖Ｉｇドメイン、ＧＧＧＳＧＧＧＧは配列
番号１０、ＶＨはＤＡＲＴの可変重鎖Ｉｇドメイン、（ＥＶＡＡＬＥＫ）４は配列番号２
９９、ＧＧＧＮＳは配列番号３０１である。また上記のようなＫ−コイルを有する好まし
いＤＡＲＴポリペプチドは一般配列：［ＶＬドメイン］−［ＧＧＧＳＧＧＧＧ］−［ＶＨ
ドメイン］−［（ＫＶＡＡＬＫＥ）４］−ＧＧＧＮＳを有し、ここで、ＶＬはＤＡＲＴの
可変軽鎖Ｉｇドメイン、ＧＧＧＳＧＧＧＧは配列番号１０、ＶＨはＤＡＲＴの可変重鎖Ｉ
ｇドメイン、（ＫＶＡＡＬＫＥ）４は配列番号３００、ＧＧＧＮＳは配列番号３０１であ
る。
６．１６．Ｅ−コイル／Ｋ−コイルを含有するＦｃ−含有ＤＡＲＴ
好ましい実施形態では、Ｆｃ領域をＥ−コイル又はＫ−コイルＤＡＲＴのＥ及び／又は
Ｋコイルに連結することができる。
Ｆｃ領域とＦｃ含有ＤＡＲＴのＤＡＲＴのＶＨドメインとの間の分離を拡大することは
、そのようなドメインの分離が小さいとドメインとその結合リガンドとの相互作用が低下
したり、ＤＡＲＴの集合を妨げる場合には望ましい。アミノ酸配列の分離材を使用しても
よいが、可変ドメインから離してＦｃドメインを最大限に拡げ、与えるように、αへリッ
クスコイルを形成する分離材を使用することが好ましい（図３７）。上記の反対に荷電し
たコイル状のポリペプチドはヘテロ二量体の形成も促進するので、そのような分子が特に
分離材として好ましい。そのようなコイルを含有するＦｃ−ＤＡＲＴ分子は、改良された
血清半減期及びエフェクター機能の増進を含む、Ｆｃ−ＤＡＲＴと同様の有益性を提供す
る。上記Ｅ−コイル及びＫ−コイルポリペプチドはこの目的に特に好ましい。
従って、好ましい実施形態では、Ｅ−コイルを含有するＦｃ含有ＤＡＲＴは一般配列：
［ＶＬドメイン］−［ＧＧＧＳＧＧＧＧ］−［ＶＨドメイン］−［（ＥＶＡＡＬＥＫ）４
］−ＧＧＧ−Ｄ２３４（カバットのナンバリング方式）で始まるＦｃドメインを有し、こ
こで、ＶＬはＤＡＲＴの可変軽鎖Ｉｇドメイン、ＧＧＧＳＧＧＧＧは配列番号１０、ＶＨ
はＤＡＲＴの可変重鎖Ｉｇドメイン、（ＥＶＡＡＬＥＫ）４は配列番号２９９である。
同様に、好ましい実施形態では、Ｋ−コイルを含有するＦｃ含有ＤＡＲＴは一般配列：
［ＶＬドメイン］−［ＧＧＧＳＧＧＧＧ］−［ＶＨドメイン］−［（ＫＶＡＡＬＫＥ）４
］−ＧＧＧ−Ｄ２３４（カバットのナンバリング方式）で始まるＦｃドメインを有し、こ
こで、ＶＬはＤＡＲＴの可変軽鎖Ｉｇドメイン、ＧＧＧＳＧＧＧＧは配列番号１０、ＶＨ
はＤＡＲＴの可変重鎖Ｉｇドメイン、（ＫＶＡＡＬＫＥ）４は配列番号３００である。
上記のように、コイルを含有するＤＡＲＴ分子、又はコイルを含有するＦｃ含有ＤＡＲ
Ｔ分子は、そのようなコイル分離体を１個だけ含有してもよいし、２個以上の分離体（例
えば、２つの分離体、好ましくは、反対の荷電を有し、一方がＤＡＲＴポリペプチドの各
ＶＨドメインに連結されている）を含有してもよい。Ｆｃ領域をそのような分離体分子に
連結することにより、鎖を交換して二価、四価などのＦｃ−ＤＡＲＴ分子を作製する能力
が増強される（図３９）。図３９に示すように、ＦｃドメインがＤＡＲＴのＶＨドメイン
の１つ又は両者に連結するかどうかによって、単量体又は二量体を形成する、Ｆｃ−ＤＡ
ＲＴ分子を作製することができる。
６．１７．Ｅ−コイル／Ｋ−コイルを含有するＦｃ−含有ＤＡＲＴの機能活性
Ｅ−コイル及び／又はＫ−コイルを含有するＦｃ−ＤＡＲＴ種は、二重特異性ＤＡＲＴ
分子から作製した。二重特異性ＤＡＲＴ分子は、（１）ＣＤ７６ｂ（ＢＣＲ複合体）反応
性抗体、ＣＢ３、の可変軽鎖及び重鎖領域、及び（２）ＣＤ３２Ｂ反応性抗体、２Ｂ６、
の低親和性変異体（「ＹＡ」変異と呼ぶ）の可変軽鎖及び重鎖領域を有する。この抗体の
軽鎖可変領域は、Ｎ５０Ｙ及びＶ５１Ａ変異を有する点において、２Ｂ６抗体の軽鎖可変
領域とは異なっている。従って、ＹＡ２Ｂ６抗体は軽鎖可変領域配列：
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRTSQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLIKYASE
SISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSNTWPFTFGGGTKVEI
K（配列番号３０２）
を有する。
この抗体の重鎖可変領域の配列は、
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWIHWVRQAPGQGLEWMGVIDP
SDTYPNYNKKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARNGDSDYYS
GMDYWGQGTTVTVSS（配列番号３０３）
である。
ＣＤ７９ｂ（Ｂ細胞）を発現する細胞上にシス型でＣＤ３２Ｂに優先的に結合するため
に、低親和性抗体を選択した。そのような構成にすることにより、他のＣＤ３２Ｂ発現細
胞（単球、内皮細胞、肝）との相互作用が、望ましくないトランス相互作用と同様に低減
される。
ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３のＤＡＲＴなどのＥ−コイル及び／又はＫ−コイル誘導体及びＥ
−コイル及び／又はＫ−コイルを含有するＦｃ含有誘導体を作製した。作製された分子の
おおよその大きさと不均一性をサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。図４０に
示すように、二量体は、Ｋ−コイルドメインに連結された単一のＦｃ領域を有するＥ−コ
イル／Ｋ−コイルＤＡＲＴ及びＥ−コイルドメインに連結された単一のＦｃ領域を有する
Ｅ−コイル／Ｋ−コイルＤＡＲＴから形成した。望ましい単量体では、二量体分子が、Ｆ
ｃ領域が１つのＤＡＲＴ分子のＥ−及びＫ−コイルの両者に連結している調製物から回収
されたように、その主たる作製物である単量体を形成した。図４１は、作製された二量体
分子の可能な構成を示す。
サイズ排除クロマトグラフィー分画をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
分析し、作製された分子の構造を更に分析した（図４２）。（Ｆｃ領域を有さない）Ｅ−
コイル／Ｋ−コイルＤＡＲＴ誘導体は、それぞれ約２８ｋＤの２つの主なバンド（ＫＦｃ
含有ポリペプチドとそれより僅かに小さいＥＦｃ含有ポリペプチドに対応）と約４９ｋＤ
の目立たないバンド（Ｅ−コイル／Ｋ−コイルＤＡＲＴに対応）として泳動された。サイ
ズ排除クロマトグラフィーにおける、Ｅ−コイル／Ｋ−コイルを含有するＦｃ含有ＤＡＲ
Ｔ誘導体（ＥＦｃ／Ｋ又はＥ／ＫＦｃ）の単量体分画は、約２８ｋＤにより大きな又は小
さな分子量バンドのどちらか一方のみを示した（ＤＡＲＴがＫＦｃ含有ＤＡＲＴ（より大
きい分子量バンド）であるかＥＦｃ含有ＤＡＲＴ（より小さい分子量バンド）であるかに
よる）。約４９ｋＤ（Ｅ−コイル／Ｋ−コイルＤＡＲＴに対応）に主に泳動された物質が
観察された。有意に大きな分子量のバンドも観察された。
二重特異性結合ＥＬＩＳＡにより、作製された分子の特徴付けを行った。ＣＤ７９をＥ
ＬＩＳＡプレート上に配置した後、ＤＡＲＴをプレートに結合させた。ＤＡＲＴの結合は
、ｓＣＤ３２Ｂ−ビオチン、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰとのインキュベーション
により検出した。図４３に示すように、Ｅ−コイル／Ｋ−コイルを含有するＦｃ含有ｈ２
Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ＤＡＲＴ誘導体（ＥＦｃ／Ｋ又はＥ／ＫＦｃ）は、ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ
３ＤＡＲＴ又はＥＦｃ／ＫＦｃｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ＤＡＲＴ誘導体と比較して、結合性
が有意に亢進されていたことを示す。
ＣＤ７９ｂに結合した抗体の架橋は、Ｂ細胞を活性化する（Ｖａｎ Ｋｏｏｔｅｎ，Ｃ
．ら，（１９９７），Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ Ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ Ｖｉａ Ｉｇ−Ｂ（Ｂ２９，ＣＤ７９ｂ） Ｃａｎ Ｉｎｄｕｃｅ Ｂｏｔｈ
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ａｎｄ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｉｎ ＣＤ４０−Ａｃ
ｔｉｖａｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｂ Ｃｅｌｌｓ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
１１０：５０９−５１５）。ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ＤＡＲＴ分子は、ＣＤ７６ｂ及びＣＤ
３２Ｂ抑制性受容体の両者に結合できるので、ＣＤ３２ＢをＣＤ７６ｂ結合部位に「補充
」する能力を有し、これにより、Ｂ細胞増殖をブロックすることができる。この能力を実
証するために、ＤＡＲＴを、結合した抗ＣＤ７６ｂ抗体を架橋することができる抗体に曝
露したＢ細胞とインキュベートした。この実験の結果は、図４４に示す。結果は、ＣＤ７
９ｂ又はＣＤ３２Ｂの一方のみに対する抗体（それぞれＣｈ２Ｂ６Ｎ２９７Ｑ及びＣｈＣ
Ｂ３．１Ｎ２９７Ｑ）では、Ｂ細胞の増殖を抑制できないことを示している。ＥＦｃ／Ｋ
Ｆｃｈ２Ｂ６ＹＡ×ｈＣＢ３ＤＡＲＴ誘導体によるＢ細胞増殖抑制は、ｈ２Ｂ６ＹＡ×ｈ
ＣＢ３ＤＡＲＴそれ自体やｈ２Ｂ６ＹＡ×ｈＣＢ３ＶＦ対照よりも、実質的に効果的であ
った。単一のＦｃ領域が連結されているＥ−コイル／Ｋ−コイルＤＡＲＴ（Ｅ／ＫＦｃｈ
２Ｂ６ＹＡ×ｈＣＢ３ＤＡＲＴ誘導体及びＥＦｃ／Ｋｈ２Ｂ６ＹＡ×ｈＣＢ３ＤＡＲＴ誘
導体）は、Ｂ細胞増殖をより強く抑制することが見出された。
６．１８．インビボ血清半減期を変えるためのＤＡＲＴ改変
上述のように、二重特異性単鎖分子のように、（例えば、約５５ｋＤａの分子質量を持
つ）小さな組み換え抗体分子は、循環系から迅速に排除される。マウスにおけるＤＡＲＴ
分子のインビボ薬物動態研究では、予想通りにその終末半減期は約２時間と短かった。
急性炎症の治療のようないくつかの実施形態では、そのような短い半減期は望ましいが
、癌や慢性疾患などの治療のような他の実施形態では、本発明のＤＡＲＴ分子は長い半減
期を示すことが好ましい。
そのような使用に対するＤＡＲＴ分子のインビボ薬物動態特性を改良するために、ＤＡ
ＲＴ分子の末端の一方又は両方に、血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含有するよ
うにＤＡＲＴ分子を改変してもよい。最も好ましくは、血清結合タンパク質のそのような
ポリペプチド部分は、ＤＡＲＴ分子のＣ末端に組み込まれる。この目的のために特に好ま
しい血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、連鎖球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン
結合ドメイン（ＡＢＤ）である。連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ド
メイン３（ＡＢＤ３）は特に好ましい。
連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）は、安定
な３本鎖へリックスバンドルを形成する４６個のアミノ酸残基からなり、広範なアルブミ
ン結合特異性を有する（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｍ．Ｕ．ら，（２００２），Ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ， Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ， Ａｎｄ Ｍｏｄｅ Ｏｆ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏ
ｎ Ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｌｂｕｍｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｄｕｌｅｓ，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（１０）：８１１４−８１２０）。アルブミンは、血
漿中に最も大量に存在するタンパク質であり、ヒトで１９日の半減期を有する。アルブミ
ンは、他のタンパク質に非共有的に結合できる、いくつかの小分子結合部位を有し、これ
により、それらの血清半減期を延長する。
ＤＡＲＴの半減期を延長する、血清タンパク質のポリペプチド部分の能力を実証するた
めに、連鎖球菌タンパク質ＧのＡＢＤ３ドメインを組み換え二重特異性ＤＡＲＴ（ｈＣＤ
１６及びｈＣＤ３２Ｂ抗原に免疫反応性）に融合させ、組み換え抗体分子、ｈＣＤ１６−
ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴを作製した（図４５）。このＡＢＤ−ＤＡＲＴは、ヒト
血清アルブミン（ＨＳＡ）だけでなく両抗原に特異的な結合を示し、インビトロでエフェ
クター細胞を再標的化することができる。ＤＡＲＴ対照と比較して、このＡＢＤ−ＤＡＲ
Ｔのマウスでの血清半減期が非常に長くなっていた。この手法は、ＤＡＲＴのような重要
な医薬品となる可能性のあるものの半減期を、９０分以上、２時間以上、５時間以上、１
０時間以上、２０時間以上、そして最も好ましくは３０時間以上に延ばすために実行可能
な手段として使用することができる。
材料と方法
ＡＢＤ−ＤＡＲＴの設計と構築
ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴを鎖１として、
ｈＣＤ１６ＶＬ−Ｇ３ＳＧ４−ｈＣＤ３２ＢＶＨ−Ｋコイル［（ＫＶＡＡＬＫＥ）４］
（ここで、ＣＤ１６ＶＬは３Ｇ８ＣＤ１６ＶＬを意味し、Ｇ３ＳＧ４は配列番号１０を意
味し、ｈＣＤ３２ＢＶＨは２Ｂ６ＣＤ３２ＢＶＨを意味し、（ＫＶＡＡＬＫＥ）４は配列
番号３００を意味する）
鎖２として、
ｈＣＤ３２ＢＶＬ−Ｇ３ＳＧ４−ｈＣＤ１６ＶＨ−ＧＧＣＧＧＧ−Ｅコイル［（ＥＶＡＡ
ＬＥＫ）４］−ＧＧＧＮＳ−ＡＢＤ
（ここで、ＣＤ３２ＢＶＬはＣＤ３２ＢＶＬを意味し、Ｇ３ＳＧ４は配列番号１０を意味
し、ｈＣＤ１６ＶＨはＣＤ１６ＶＨを意味し、ＧＧＣＧＧＧは配列番号２６７の２−７残
基であり、Ｅコイル［（ＥＶＡＡＬＥＫ）４］は配列番号２９９であり、ＧＧＧＮＳは配
列番号３０１であり、ＡＢＤは
ＬＡＥＡＫＶＬＡＮＲ ＥＬＤＫＹＧＶＳＤＹ ＹＫＮＬＩＮＮＡＫＴ ＶＥＧＶＫＡＬ
ＩＤ ＥＩＬＡＡＬＰ（配列番号３０４）である）
を使用して作製した。
従って、鎖１（ｈ３Ｇ８ＶＬ１−Ｇ３ＳＧ４−ｈ２Ｂ６ＶＨ４−Ｋコイル−ＧＧＧＮＳ
）の配列は、
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL
LIYTTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSNEDPY
TFGQGTKLEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN
YWIHWVRQAP GQGLEWTGVI DPSDTYPNYN KKFKGRVTMT VVVSTSTAYM
ELRSLRSDDT AVYYCARNGD SDYYSGMDYW GQGTTVTVSS GGCGGGKVAA
LKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKEGGGNS（配列番号３０５）である。
鎖１（ｈ３Ｇ８ＶＬ１−Ｇ３ＳＧ４−ｈ２Ｂ６ＶＨ４−Ｋコイル−ＧＧＧＮＳ）をコー
ドする好ましいポリヌクレオチドは、
gacatcgtga tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga gagggccacc
atcaactgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg atagttttat gaactggtac
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctata ctacatccaa tctagaatct
ggggtcccag acaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcagc
agcctgcagg ctgaggatgt ggcagtttat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac
acgttcggac aggggaccaa gcttgagatc aaaggaggcg gatccggagg cggaggccag
gttcagctgg tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc
tgcaaggctt ctggttacac ctttaccaac tactggatga actgggtgcg acaggcccct
ggacaagggc ttgagtggat tggagtgatt gatccttctg atacttatcc aaattacaat
aaaaagttca agggcagagt caccatgacc gtagtcgtat ccacgagcac agcctacatg
gagctgagga gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag aaacggtgat
tccgattatt actctggtat ggactactgg gggcaaggga ccacggtcac cgtctcctcc
ggaggatgtg gcggtggaaa agtggccgca ctgaaggaga aagttgctgc tttgaaagag
aaggtcgccg cacttaagga aaaggtcgca gccctgaaag agggcggcgg gaattct
（配列番号３０６）である。
従って、鎖２（ｈ２Ｂ６ＶＬ５−Ｇ３ＳＧ４−ｈ３Ｇ８ＶＨ５−Ｅコイル−ＧＧＧＮＳ
−ＡＢＤ）の配列は、
EIVLTQSPDF QSVTPKEKVT FTCRTSQSIG TNIHWYQQKP DQSPKLLIKE
VSESISGVPS RFSGSGSGTD FTLTINSLEA EDAATYYCQQ SNTWPFTFGG
GTKVEIKGGG SGGGGQVTLR ESGPALVKPT QTLTLTCTFS GFSLSTSGMG
VGWIRQPPGK ALEWLAHIWW DDDKRYNPAL KSRLTISKDT SKNQVVLTMT
NMDPVDTATY YCAQINPAWF AYWGQGTLVT VSSGGCGGGE VAALEKEVAA
LEKEVAALEK EVAALEKGGG NSLAEAKVLA NRELDKYGVS DYYKNLINNA
KTVEGVKALI DEILAALP
（配列番号３０７）である。
鎖２（ｈ２Ｂ６ＶＬ５−Ｇ３ＳＧ４−ｈ３Ｇ８ＶＨ５−Ｅコイル−ＧＧＧＮＳ−ＡＢＤ
）をコードする好ましいポリヌクレオチドは、
gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc
ttcacctgca ggaccagtca gagcattggc acaaacatac actggtacca gcagaaacca
gatcagtctc caaagctcct catcaaggag gtttctgagt ctatctctgg agtcccatcg
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctgaaggct
gaagatgctg caacgtatta ctgtcaacaa agtaatacct ggccgttcac gttcggcgga
gggaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt taccctgaga
gagtctggcc ctgcgctggt gaagcccaca cagaccctca cactgacttg taccttctct
gggttttcac tgagcacttc tggtatgggt gtaggctgga ttcgtcagcc tcccgggaag
gctctagagt ggctggcaca catttggtgg gatgatgaca agcgctataa tccagccctg
aagagccgac tgacaatctc caaggatacc tccaaaaacc aggtagtcct cacaatgacc
aacatggacc ctgtggatac tgccacatac tactgtgctc aaataaaccc cgcctggttt
gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtgagctccg gaggatgtgg cggtggagaa
gtggccgcac tggagaaaga ggttgctgct ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag
gaggtcgcag ccctggagaa aggcggcggg aattctctgg ccgaagcaaa agtgctggcc
aaccgcgaac tggataaata tggcgtgagc gattattata agaacctgat taacaacgca
aagaccgtgg aaggcgtgaa agcactgatt gatgaaattc tggccgccct gcct
（配列番号３０８）である。
ＶＬ及びＶＨ部分はそれぞれｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＤＡＲＴをテンプレートとし
て使用してＰＣＲにより増幅した。鎖２については、Ｅ−コイルとＡＢＤを含有するヌク
レオチド配列をプライマー二量体により形成し、制限消化及びライゲーションによりｈＣ
Ｄ１６のＶＨ領域のＣ末端にサブクローニングした。両鎖をＮｈｅＩ−ＮｏｔＩＩ部位で
ｐＣＩｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）にクローニングした。ＮｇｏＭＩＶ
−ＮｈｅＩで消化された鎖１とＢｓｔＢＩ−ＰｍｅＩで消化された鎖２発現カセットのそ
れぞれを包含する個々のプラスミドを単一のプラスミドにクローニングし、安定な細胞株
を生成するたみえにＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。
タンパク質の発現と精製
安定したトランスフェクションのために、ＣＨＯ−Ｓ細胞をｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ
−ＥＫ−ＡＢＤ−ＤＡＲＴプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。ＡＢＤ−ＤＡＲＴ
タンパク質は、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂに結合した可溶性ＦｃＲＩＩＢ抗原を用
いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。濃縮したタンパク質をＳｕｐｅ
ｒｄｅｘ２００ＨＲ１０／３０を用いてサイズ排除クロマトグラフィーにより更に精製し
た。
ＥＬＩＳＡによる結合性アッセイ：ＣＤ−１６ベースの捕捉のために、プレートを２μ
ｇ／ｍＬのＦｃＲＩＩＢ抗原で４℃で一晩被覆した後、０．５％のペプトンを含有するＰ
ＢＳ−Ｔでブロックした。倍々希釈した精製タンパク質をプレートに１時間室温で結合さ
せた。最後に、ビオチニル化ＣＤ３２Ｂ（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＨＲＰコンジュゲートス
トレプトアビジン（１／１０００、ＢＤ−Ｐｈａｒｍ）による検出を行った。ＨＲＰ活性
をＴＭＢを添加して測定し、プレートをＯＤ４５０ｎｍでプレートリーダーにより読み出
した。
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）捕捉のために、プレートを２μｇ／ｍＬのＨＳＡで４℃
で一晩被覆した。その後、同じ手順で二重親和性ＥＬＩＳＡを行った。
末梢血単核細胞媒介ＡＤＣＣアッセイ：細胞毒性をＬＤＨ遊離アッセイにより測定した
。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト全血（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉ
ｎｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から、製造者の使用説明書に従ってフィコール
−ハイパック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ
Ｊ）密度勾配遠心分離により精製した。丸底９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに、
２×１０４個の標的細胞を播く。異なるＤＡＲＴ又は抗体分子を１〜４倍希釈でプレート
中の細胞に添加する。その後、６×１０５個のＰＢＭＣを同じウェルに添加する。次いで
、プレートを３７℃で一晩、５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートする。その後
、プレートを１２００ｒｐｍで５分間回転させ、５０μＬの上清を平底ＥＬＩＳＡプレー
トに移す。５０μＬのＬＤＨ基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加し、プレート
を室温で、３０分間暗所でインキュベートする。その後、５０μＬの停止液を各ウェルに
添加し、プレートを１時間以内に４９０ｎｍで読む。各ウェルの細胞毒性率を生のＯ．Ｄ
．読み出しから次のように算出する；
（試料−ＡＩＣＣ）／（標的Ｍａｘ−標的自発）×１００
ここで、ＡＩＣＣは抗体非依存性細胞毒性である。用量応答曲線はＰｒｉｓｍソフトウェ
アを使用して作成する。
薬物動態学的研究
Ｃ５７Ｂ１／６マウスに５ｍｇ／ｋｇのｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＤＡＲＴを単回静
脈内注射した。マウス血清を投与前、２分後、３０分後、１時間後、３時間後、６時間後
、２４時間後、７２時間後に採取し、血清中のｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＤＡＲＴの濃
度を定量した。ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＤＡＲＴの薬物動態の計算は、ＷｉｎＮｏｎ
ｌｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ５．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ，ＵＳＡ）を使用して行った。パラメーターは、非コンパートメント解析（ＮＣＡ）に
より決定した。非コンパートメント解析は、薬品の静脈内注射を必要とするモデル（Ｍｏ
ｄｅｌ２０１）に基づいて行った。パラメーターの計算は、線形台形法を使用した。
結果
ＥＬＩＳＡによる発現と結合研究：ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴを、
哺乳動物ＣＨＯ−Ｓ細胞中に、６．５ｍｇ／Ｌの濃度で効率的に発現させた。精製ＡＢＤ
−ＤＡＲＴタンパク質のそれぞれの抗原に対する結合活性をＥＬＩＳＡにより評価した。
結果は、ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴが、ＣＤ１６とＣＤ３２Ｂの両抗
原に同時に結合することを示した（図４６Ａ）。結合プロファイルは、対照であるｈＣＤ
１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＤＡＲＴタンパク質の結合と一致している。精製ｈＣＤ１６−ｈＣ
Ｄ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する親和性もＥＬＩＳ
Ａにより実証した（図４６Ｂ）。結果は、ＡＢＤと融合したＤＡＲＴがＨＳＡに強く結合
することが示されたが、対照ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＤＡＲＴとの結合は観察されな
かった。
ＡＢＤ−ＤＡＲＴのインビトロ細胞毒性
この二重特異性ＡＢＤ−ＤＡＲＴが、一方がエフェクター細胞上、他の１つが標的細胞上
にある２つの抗原に同時に結合できることを実証するために、再指示細胞死滅アッセイを
行った。エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを用い、ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢ
Ｄ−ＤＡＲＴは、強力な用量依存的な細胞毒性をＣＤ３２Ｂ陽性Ｂ細胞株ダウジに対して
誘導した（図４７）。結果はＡＢＤ−ＤＡＲＴの効力は親ＤＡＲＴと同等であることを示
していた。
ＡＢＤ−ＤＡＲＴの薬物動態特性
ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴの薬物動態特性を、Ｃ５７Ｂ１／６マウス
への単回静脈内注射後の血清試料のＥＬＩＳＡにより分析した（図４８）。ＤＡＲＴとＡ
ＢＤ−ＤＡＲＴの両方のタンパク質が、循環系から二相性に排除された。ＡＢＤ−ＤＡＲ
ＴのＰＫ研究では、通常のＤＡＲＴの半減期が１．２時間であるのと比較して、終末半減
期が３５．１時間に延長されたとともに、循環時間の延長が見られた（図４８、表１７）
。薬物動態特性の改良は、濃度曲線下面積（ＡＵＣ）の比較によっても実証された。ＡＢ
Ｄ−ＤＡＲＴ構築物に対して、ＡＵＣはＡＢＤへの融合後にほとんど３０倍に増加してい
る（表２２）。
Figure 2015157833
要するに、アルブミン結合ドメイン融合ＤＡＲＴタンパク質（ＡＢＤ−ＤＡＲＴと称す
る）は成功裏に設計、作製された。ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴは、そ
の抗原性決定基ＣＤ１６及びＣＤ３２Ｂの両者を認識する特異性を保持していることが見
出された。ＡＢＤ−ＤＡＲＴは、ヒト血清アルブミンに対して高い親和性を示すことが見
出された。ＡＢＤの融合は、生物学的活性（即ち、再指示腫瘍細胞死滅に対するＤＡＲＴ
の効能）を低減させなかった。ＤＡＲＴ分子のＡＢＤへの融合は、そのインビボ半減期を
有意に改良（上昇）し、大きさを著しく増加させることなく、その目標を達成した。小さ
なサイズを保つ能力は有意であり、ＤＡＲＴが腫瘍細胞に拡散していく能力を亢進するの
で有利である。
６．１９．Ｈｅｒ２／Ｂ細胞受容体ＤＡＲＴ
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ及びＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）に結合することができる可変領域を
含有するＩｇＤＡＲＴダイアボディを構築した。
上述のように、ＴＣＲはＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞により自然に発現され、抗原提示
細胞のクラスＩ又はクラスＩＩＭＨＣタンパク質により結合及び提示される抗原性ペプチ
ドを細胞に認識させる。ｐＭＨＣ（ペプチド−ＭＨＣ）複合体のＴＣＲによる認識が、サ
イトカインの作製と抗原提示細胞の溶解を導く、細胞性免疫応答の伝播を開始する。Ｅｒ
ｂＢファミリーの重要な一員であるＨＥＲ２／ｎｅｕは、いくつかのヒト癌及び哺乳類の
発生におけるその役割のために、広く研究されてきた（Ｈｙｎｅｓ及びＳｔｅｒｎ，（１
９９４），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１９８：１６５−１８４；Ｄ
ｏｕｇａｌｌら，（１９９４），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，９：２１０９−２１２３；及びＬｅ
ｅら，（１９９５），Ｎａｔｕｒｅ，３７８：３９４−３９８）。ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ
遺伝子及びＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質は、Ｓｅｍｂａら，（１９８５），Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），８２：６４９７−６５０１及びＹａｍａ
ｍｏｔｏら，（１９８６），Ｎａｔｕｒｅ、３１９：２３０−２３４に記載されており、
その配列は、ＧｅｎＢａｎｋから受託番号Ｘ０３３６３として入手可能である。ＨＥＲ２
／ｎｅｕは４つのドメイン、即ち、リガンドが結合する細胞外ドメイン、親油性膜貫通ド
メイン、保存細胞内チロシンキナーゼドメイン、及びリン酸化可能ないくつかのチロシン
残基を有するカルボキシル−末端シグナル伝達ドメインを有する（Ｐｌｏｗｍａｎら，（
１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），９０：１７４
６−１７５０）。ＨＥＲ２／ｎｅｕ細胞外（ＥＣＤ）ドメインの配列は、Ｆｒａｎｋｌｉ
ｎら，（２００４），Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．，５（４）：３１７−３２８に記載され
ており、またＰｒｏｔｅｉｎ ＤａｔａＢａｎｋ Ｒｅｃｏｒｄ １Ｓ７８（２００４）
で入手可能である。
ＨＥＲ２／ｎｅｕは成長因子受容体として機能し、乳癌、大腸癌、膀胱癌、卵巣癌、肺
癌などの腫瘍によりしばしば発現される。ＨＥＲ２／ｎｅｕは、ヒト乳癌や卵巣癌の２５
〜３０％において過剰発現され、これら患者の悪性の臨床的進行や悪性の予後と係わりを
有する（Ｓｌａｍｏｎら，（１９８７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：１７７−１８２；Ｓ
ｌａｍｏｎら，（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：７０７−７１２）。ＨＥＲ２／
ｎｅｕの過剰発現は、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎、大腸、甲状腺、膵及び膀胱の癌を
含む、他の癌にも観察されてきた（例えば、Ｋｉｎｇら，（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ
，２２９：９７４；ＭｃＣａｎｎら，（１９９０），Ｃａｎｃｅｒ，６５：８８−９２；
Ｙｏｎｅｍｕｒａら，（１９９１），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１：１０３４
）。
ＨＥＲ−Ｉ又はＨＥＲ２／ｎｅｕを標的とするモノクローナル抗体及び小分子チロシン
キナーゼ阻害剤が数多く開発された。例えば、特に、４Ｄ５（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録
商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）は、タンパク質の膜貫通領域の非常に近くに存
在する、ＨＥＲ２／ｎｅｕのシステインに富むＩＩドメインの細胞外エピトープ（アミノ
酸５２９−６２７）を認識する、マウスモノクローナル抗体のヒト化変異体である。研究
により、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現する乳癌細胞では、ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的な抗
体を化学療法剤（例えば、シスプラチン、ドキソルビシン、タキソールなど）と併用する
ことによって、化学療法単独治療と比較して、高い細胞毒性応答を引き出すことが示され
ている（Ｈａｎｃｏｃｋら，（１９９１），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５１：４５７５−
４５８０；Ａｒｔｅａｇａら，（１９９４），Ｃａｎｃｅｒ，５４：３７５８−３７６５
；Ｐｉｅｔｒａｓら，（１９９４），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，９：１８２９−１８３８）。化
学療法剤に対する応答をＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体が亢進させる考え得る機構は、ＨＥＲ２／
ｎｅｕタンパク質発現の改変又はＤＮＡ対の妨害である（Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉら，（１
９９１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），８８：８６９１
−８６９５；Ｂａｃｕｓら，（１９９２），Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ＆Ｄｉｆｆ．３：４
０１−４１１；Ｂａｃｕｓら，（１９９３），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：５２５１−
５２６１；Ｋｌａｐｐｅｒら，（１９９７），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１４：２０９９−２１
０９；Ｋｌａｐｐｅｒら，（２０００），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６０：３３８４−３
３８８；Ａｒｔｅａｇａら，（２００１），Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，
１９（１８ｓ）：３２ｓ−４０ｓ）。ある合には、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）など
の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体は、患者に治療上の利益を与えるが、乳癌及び他の疾患患者の
多くがそのような抗体に対して応答不良を示す。このような応答は、一部には患者の癌細
胞によるＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現の程度の差によるものである。
ＨＥＲ２／ｎｅｕ及びＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）に結合することができる可変領域を
含有する結果として、ＤＡＲＴは、ＨＥＲ２発現細胞に結合することができ、それによっ
てそのような細胞をＴ細胞受容体に結合することができるドメインに付着させることがで
きる。そのようなＴ細胞はこのドメインに結合し、ＨＥＲ２発現細胞の死滅を導く免疫応
答を開始させるように活性化する。
そのようなＤＡＲＴのアミノ酸及び核酸配列を、ＶＬ及びＶＨ配列は標準文字で、ＶＬ
−ＶＨリンカーは下線を付して、Ｃ末端ヘテロ二量体化モチーフをコードする配列（配列
番号３１３：ＧＦＮＲＧＥＣ又は配列番号３１４：ＧＶＥＰＫＳＣ）は太字のイタリック
体で以下に示す。
ＴＣＲＶＬ−ＨＥＲ２ＶＨアミノ酸配列（配列番号３１５）
Figure 2015157833
ＴＣＲＶＬ−ＨＥＲ２ＶＨコード核酸配列（配列番号３１６）
Figure 2015157833
ＨＥＲ２ＶＬ−ＴＣＲＶＨアミノ酸配列（配列番号３１７）
Figure 2015157833
ＨＥＲ２ＶＬ−ＴＣＲＶＨコード核酸配列（配列番号３１８）
Figure 2015157833
好ましい実施形態では、そのような構築物は、ヘテロ二量体（即ち、ＴＣＲＶＬ−ＨＥ
Ｒ２ＶＨ×ＨＥＲ２ＶＬ−ＴＣＲＶＨ二量体）の形成を促進するＥ−コイル又はＫ−コイ
ルドメインを含有するように改変される。そのようなＤＡＲＴのアミノ酸及び核酸配列を
、ＶＬ及びＶＨ配列は標準文字で、ＶＬ−ＶＨリンカーは下線を付して、二量化のための
システイン含有リンカーをコードする配列（ＧＧＣＧＧＧ；配列番号２６７の２−７残基
）は太字のイタリック体で以下に示す。Ｋ−コイルヘテロ二量体化ドメインのＥ−コイル
には二重下線を付す（好ましい「Ｅ−コイル」配列は七量体ＥＶＡＡＬＥＫ（配列番号２
９９）の４回繰り返し、好ましい「Ｋ−コイル」配列は七量体ＫＶＡＡＬＫＥ（配列番号
３００）の４回繰り返しである）。Ｅ−コイル又はＫ−コイルに続く配列は機能を有さな
い。
ＴＣＲＶＬ−ＨＥＲ２ＶＨ−Ｅコイルアミノ酸配列（配列番号３１９）
Figure 2015157833
ＴＣＲＶＬ−ＨＥＲ２ＶＨ−Ｅコイルコード核酸配列（配列番号３２０）
Figure 2015157833
ＨＥＲ２ＶＬ−ＴＣＲＶＨ−Ｋコイルアミノ酸配列（配列番号３２１）
Figure 2015157833
ＨＥＲ２ＶＬ−ＴＣＲＶＨ−Ｋコイルコード核酸配列（配列番号３２２）
Figure 2015157833
Ｈｅｒ２及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）結合ドメインを有するＤＡＲＴ分子を、ＨＥＲ２
発現が低い（従って、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）での治
療に無反応である）と特徴付けされてきた多発乳癌、大腸癌及び膀胱癌細胞株において細
胞毒性を仲介する能力について試験した。試験した乳癌細胞株は、ＺＲ７５−１（ＨＥＲ
２２＋）（図４９Ａ）、ＭＣＦ−７（ＨＥＲ２１＋）（図４９Ｂ）及びＭＤＡ−ＭＢ４６
８（ＨＥＲ２−ｖｅ）（図４９Ｃ）である。試験した非乳癌細胞株はＨＴ−２９（大腸癌
細胞株）（図４９Ｄ）及びＳＷ７８０（膀胱癌細胞株）（図４９Ｅ）である。図４９Ａ−
Ｅに示すように、上述のようなＤＡＲＴ分子は、腫瘍由来細胞株の細胞毒性を仲介する点
に関して、同等の細胞毒性を達成するために必要な濃度及び観察された細胞毒性の最大レ
ベルの両者において、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）よりも有意に効果的であった。
本発明においては、当業者にとって明らかであるように、本発明の精神と範囲から逸脱
することなく、多数の改変及び変更を行うことができる。本明細書に記載した具体的な実
施形態は、単に例示の目的で提示したものであり、本発明は、添付の特許請求の範囲及び
その権利が付与される均等の範囲によってのみ限定されるべきである。このような改変は
、添付の特許請求の範囲内にあることを意図している。本明細書で引用した全ての文献、
特許及び非特許文献は、参照することによりその全内容を本明細書に組み入れるものとし
、参照することにより個々の刊行物、特許又は特許出願が具体的かつ個別に示した程度に
おいて、その全内容を本明細書に組み入れるものとする。

Claims (30)

  1. 第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を有するダイアボディ分子であって、前
    記ポリペプチド鎖は互いに共有結合で連結しており、
    Ｉ 前記第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブ
    リンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエ
    ピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を含
    む第２のドメイン、及び（ｉｉｉ）Ｆｃドメイン又はその一部を含む第３のドメインを含
    んでなり、前記第１のドメインと前記第２のドメインとは、前記第１のドメインと前記第
    ２のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合で連結されて
    おり、
    ＩＩ 前記第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）前記第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイ
    ンの結合領域（ＶＬ２）を含む第４のドメイン、（ｉｉ）前記第１の免疫グロブリンの重
    鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を含む第５のドメイン、及び（ｉｉｉ）Ｆｃドメイ
    ンを含む第６のドメインを含んでなり、前記第４のドメインと前記第５のドメインとは、
    前記第４のドメインと前記第５のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しない
    ように共有結合で連結されており、
    （Ａ）前記第１のドメインと前記第５のドメインとが会合して、前記第１のエピトープと
    結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成しており、
    （Ｂ）前記第２のドメインと前記第４のドメインとが会合して、前記第２のエピトープと
    結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成しており、
    （Ｃ）（１）前記第２のドメインと前記第３のドメイン、及び／又は
    （２）前記第５のドメインと前記第６のドメイン
    が、配列番号２７８，２８０，２８１，２８３，２８４，２８６，２８７，２８８，２８
    ９，２９０，２９１，２９３，２９５及び２９７からなる群から選択される配列を有する
    介在性ポリペプチドリンカーにより互いに連結されている、ことを特徴とするダイアボデ
    ィ分子。
  2. 前記第３のドメインがヒンジドメインを更に含む請求項１に記載のダイアボディ分子。
  3. 第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を有するダイアボディ分子であって、前
    記ポリペプチド鎖は互いに共有結合で連結しており、
    Ｉ 前記第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブ
    リンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエ
    ピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を含
    む第２のドメイン、及び（ｉｉｉ）ヒンジドメインとＦｃドメイン又はその一部を含む第
    ３のドメインを含んでなり、前記第１のドメインと前記第２のドメインとは、前記第１の
    ドメインと前記第２のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有
    結合で連結されており、
    ＩＩ 前記第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）前記第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイ
    ンの結合領域（ＶＬ２）を含む第４のドメイン、（ｉｉ）前記第１の免疫グロブリンの重
    鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を含む第５のドメイン、及び（ｉｉｉ）ＦＮＲＧＥ
    Ｃ（配列番号２３)のアミノ酸配列を含む第６のドメインを含んでなり、前記第４のドメ
    インと前記第５のドメインとは、前記第４のドメインと前記第５のドメインとが会合して
    エピトープ結合部位を形成しないように共有結合で連結されており、
    （Ａ）前記第１のドメインと前記第５のドメインとが会合して、前記第１のエピトープと
    結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成しており、
    （Ｂ）前記第２のドメインと前記第４のドメインとが会合して、前記第２のエピトープと
    結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成しており、
    （Ｃ）（１）前記第２のドメインと前記第３のドメイン、及び／又は
    （２）前記第５のドメインと前記第６のドメイン
    が、配列番号２７８，２８０，２８１，２８３，２８４，２８６，２８７，２８８，２８
    ９，２９０，２９１，２９３，２９５及び２９７からなる群から選択される配列を有する
    介在性ポリペプチドリンカーにより互いに連結されている、ことを特徴とするダイアボデ
    ィ分子。
  4. 第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を有するダイアボディ分子であって、前
    記ポリペプチド鎖は互いに共有結合で連結しており、
    Ｉ 前記第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブ
    リンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエ
    ピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を含
    む第２のドメイン、及び（ｉｉｉ）ヒンジドメインを含む第３のドメインを含んでなり、
    前記第１のドメインと前記第２のドメインとは、前記第１のドメインと前記第２のドメイ
    ンとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合で連結されており、
    ＩＩ 前記第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）前記第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイ
    ンの結合領域（ＶＬ２）を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可
    変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を含む第５のドメイン、及び（ｉｉｉ）ＦＮＲＧＥＣ（
    配列番号２３)のアミノ酸配列を含む第６のドメインを含んでなり、前記第４のドメイン
    と前記第５のドメインとは、前記第４のドメインと前記第５のドメインとが会合してエピ
    トープ結合部位を形成しないように共有結合で連結されており、
    （Ａ）前記第１のドメインと前記第５のドメインとが会合して、前記第１のエピトープと
    結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成しており、
    （Ｂ）前記第２のドメインと前記第４のドメインとが会合して、前記第２のエピトープと
    結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成しており、
    （Ｃ）（１）前記第２のドメインと前記第３のドメイン、及び又は
    （２）前記第５のドメインと前記第６のドメイン
    が、配列番号２７８，２８０，２８１，２８３，２８４，２８６，２８７，２８８，２８
    ９，２９０，２９１，２９３，２９５及び２９７からなる群から選択される配列を有する
    介在性ポリペプチドリンカーにより互いに連結されている、ことを特徴とするダイアボデ
    ィ分子。
  5. 第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を有するダイアボディ分子であって、前
    記ポリペプチド鎖は互いに共有結合で連結しており、
    Ｉ 前記第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブ
    リンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエ
    ピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を含
    む第２のドメイン、及び（ｉｉｉ）Ｆｃドメイン又はその一部を含む第３のドメインを含
    んでなり、前記第１のドメインと前記第２のドメインとは、前記第１のドメインと前記第
    ２のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合で連結されて
    おり、
    ＩＩ 前記第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）前記第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイ
    ンの結合領域（ＶＬ２）を含む第４のドメイン、及び（ｉｉ）前記第１の免疫グロブリン
    の重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を含む第５のドメインを含んでなり、前記第４
    のドメインと前記第５のドメインとは、前記第４のドメインと前記第５のドメインとが会
    合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合で連結されており、
    （Ａ）前記第１のドメインと前記第５のドメインとが会合して、前記第１のエピトープと
    結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成しており、
    （Ｂ）前記第２のドメインと前記第４のドメインとが会合して、前記第２のエピトープと
    結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成しており、
    （Ｃ）前記第２のドメインと前記第３のドメインが、配列番号２７８，２８０，２８１，
    ２８３，２８４，２８６，２８７，２８８，２８９，２９０，２９１，２９３，２９５及
    び２９７からなる群から選択される配列を有する介在性ポリペプチドリンカーにより互い
    に連結されている、
    ことを特徴とするダイアボディ分子。
  6. 前記第３のドメインがヒンジ領域を更に含む請求項５に記載のダイアボディ分子。
  7. 請求項１ないし６のいずれかに記載のダイアボディ分子であって、（Ａ）前記第１のド
    メインと前記第３のドメインが会合して、前記第１のエピトープと結合する第１の結合部
    位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成しており、該エピトープ結合部位はＣＤ３２Ｂに対して特
    異的であり、
    （Ｂ）前記第２のドメインと前記第４のドメインが会合して、前記第２のエピトープと結
    合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成しており、該エピトープ結合部位はＣ
    Ｄ１６に対して特異的である、
    ことを特徴とするダイアボディ分子。
  8. 第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を有するダイアボディ分子であって、前
    記ポリペプチド鎖は互いに共有結合で連結しており、
    （Ａ）前記第１のポリペプチド鎖が、
    （ｉ）エピトープ（１）に特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域
    （ＶＬ１）を含むドメイン（Ａ）、
    （ｉｉ）エピトープ（２）に特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領
    域（ＶＨ２）を含むドメイン（Ｂ）、及び
    （ｉｉｉ）軽鎖定常領域（ＣＬ）又はその一部を含むドメイン（Ｃ）を有し、
    （Ｂ）前記第２のポリペプチド鎖が、
    （ｉ）前記エピトープ（２）に特異的な第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合
    領域（ＶＬ２）を含むドメイン（Ｄ）、
    （ｉｉ）前記エピトープ（１）に特異的な第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結
    合領域（ＶＨ１）を含むドメイン（Ｅ）、
    （ｉｉｉ）重鎖定常領域１（ＣＨ１）又はその一部を含むドメイン（Ｆ）、及び
    （ｉｖ）ヒンジ領域、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）を有し、
    前記ドメイン（Ａ）と前記ドメイン（Ｂ）とは互いに会合してエピトープ結合部位を形成
    することはなく、
    前記ドメイン（Ｄ）と前記ドメイン（Ｅ）とは互いに会合してエピトープ結合部位を形成
    することはなく、
    前記ドメイン（Ａ）と前記ドメイン（Ｅ）とは会合して前記エピトープ（１）に結合する
    結合部位を形成し、
    前記ドメイン（Ｂ）と前記ドメイン（Ｄ）とは会合して前記エピトープ（２）に結合する
    結合部位を形成し、
    前記ドメイン（Ｃ）と前記ドメイン（Ｆ）とはジスルフィド結合を介して会合し、ＣＨ１
    ドメイン又はその一部を形成し、
    （１）前記ドメイン（Ｂ）と前記ドメイン（Ｃ）、及び／又は
    （２）前記ドメイン（Ｅ）と前記ドメイン（Ｆ）
    が、配列番号２７８，２８０，２８１，２８３，２８４，２８６，２８７，２８８，２８
    ９，２９０，２９１，２９３，２９５及び２９７からなる群から選択される配列を有する
    介在性ポリペプチドリンカーにより互いに連結されている、ことを特徴とするダイアボデ
    ィ分子。
  9. 第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖を更に有し、前記第３のポリペプチド
    鎖と前記第４のポリペプチド鎖は互いに共有結合で連結している、請求項８に記載のダイ
    アボディ分子であって、
    （Ａ）前記第３のポリペプチド鎖が、
    （ｉ）エピトープ（３）に特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域
    （ＶＬ１）を含むドメイン（Ｇ）、
    （ｉｉ）エピトープ（４）に特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領
    域（ＶＨ２）を含むドメイン（Ｈ）、及び
    （ｉｉｉ）軽鎖定常領域（ＣＬ）又はその一部を含むドメイン（Ｉ）
    を有し、
    （Ｂ）前記第４のポリペプチド鎖が、
    （ｉ）前記エピトープ（４）に特異的な第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合
    領域（ＶＬ２）を含むドメイン（Ｊ）、
    （ｉｉ）前記エピトープ（３）に特異的な第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結
    合領域（ＶＨ１）を含むドメイン（Ｋ）、及び
    （ｉｉｉ）重鎖定常領域１（ＣＨ１）又はその一部を含むドメイン（Ｌ）
    を有し、
    前記ドメイン（Ｇ）と前記ドメイン（Ｈ）とは互いに会合してエピトープ結合部位を形成
    することはなく、
    前記ドメイン（Ｊ）と前記ドメイン（Ｋ）とは互いに会合してエピトープ結合部位を形成
    することはなく、
    前記ドメイン（Ｇ）と前記ドメイン（Ｋ）とは会合して前記エピトープ（３）に結合する
    結合部位を形成し、
    前記ドメイン（Ｈ）と前記ドメイン（Ｊ）とは会合して前記エピトープ（４）に結合する
    結合部位を形成し、
    前記ドメイン（Ｉ）と前記ドメイン（Ｌ）とはジスルフィド結合を介して会合し、ＣＨ１
    ドメイン又はその一部を形成し、
    前記第２及び第４のポリペプチド鎖の前記ヒンジ領域、前記重鎖定常領域２（ＣＨ２）及
    び前記重鎖定常領域３（ＣＨ３）は会合してＦｃドメインを形成し、
    （１）前記ドメイン（Ｈ）と前記ドメイン（Ｉ）、及び／又は
    （２）前記ドメイン（Ｋ）と前記ドメイン（Ｌ）
    が、配列番号２７８，２８０，２８１，２８３，２８４，２８６，２８７，２８８，２８
    ９，２９０，２９１，２９３，２９５及び２９７からなる群から選択される配列を有する
    介在性ポリペプチドリンカーにより互いに連結されている、
    ことを特徴とするダイアボディ分子。
  10. 前記ダイアボディ分子の前記第１ポリペプチド鎖又は前記第２ポリペプチド鎖がＥ−コ
    イル分離体又はＫ−コイル分離体を更に有することを特徴とする請求項１、２、３、４、
    ５、６又は７に記載のダイアボディ分子。
  11. 前記ダイアボディ分子の前記第１ポリペプチド鎖及び前記第２ポリペプチド鎖の両者が
    Ｅ−コイル分離体又はＫ−コイル分離体を有することを特徴とする請求項１０に記載のダ
    イアボディ分子。
  12. 前記Ｅ−コイル分離体又はＫ−コイル分離体がＦｃドメインに連結されていることを特
    徴とする請求項１０に記載のダイアボディ分子。
  13. 前記Ｅ−コイル分離体又はＫ−コイル分離体がＦｃドメインに連結されていることを特
    徴とする請求項１１に記載のダイアボディ分子。
  14. 前記Ｅ−コイル分離体又はＫ−コイル分離体が血清結合タンパク質のポリペプチド部に
    連結されており、前記ポリペプチド部は血清タンパク質に結合することができることを特
    徴とする請求項１０に記載のダイアボディ分子。
  15. 前記血清結合タンパク質がアルブミン結合タンパク質であることを特徴とする請求項１
    ４に記載のダイアボディ分子。
  16. 前記アルブミン結合タンパク質が連鎖球菌タンパク質Ｇであり、前記ポリペプチド部が
    前記連鎖球菌タンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）であることを特徴とする
    請求項１５に記載のダイアボディ分子。
  17. 前記連鎖球菌タンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）が連鎖球菌株Ｇ１４８
    のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）であることを特徴とする請求項
    １６に記載のダイアボディ分子。
  18. 前記ダイアボディ分子が２時間以上のインビボ血清半減期を示す請求項１５に記載のダ
    イアボディ分子。
  19. 前記ダイアボディ分子が１０時間以上のインビボ血清半減期を示す請求項１８に記載の
    ダイアボディ分子。
  20. 前記ダイアボディ分子が２０時間以上のインビボ血清半減期を示す請求項１８に記載の
    ダイアボディ分子。
  21. ナチュラルキラー群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体に対する結合リガンドであるドメインを
    有することを特徴とする、請求項１ないし６又は請求項８ないし１９のいずれかに記載の
    ダイアボディ分子。
  22. 前記ダイアボディ分子が腫瘍関連抗原に更に結合することを特徴とする、請求項２１に
    記載のダイアボディ分子。
  23. 前記腫瘍関連抗原が、乳癌抗原、卵巣癌抗原、前立腺癌抗原、頸部癌抗原、膵癌抗原、
    肺癌抗原、膀胱癌抗原、大腸癌抗原、精巣癌抗原、膠芽腫癌抗原、Ｂ細胞悪性腫瘍関連抗
    原、多発性骨髄腫関連抗原、非ホジキンスリンパ腫関連抗原又は慢性リンパ球性白血病関
    連抗原であることを特徴とする請求項２２に記載のダイアボディ分子。
  24. 前記腫瘍関連抗原が、Ａ３３、ＡＤＡＭ−９、ＡＬＣＡＭ、Ｂ１、ＢＡＧＥ、β−カテニ
    ン、ＣＡ１２５、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、
    ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４５
    、ＣＤ４６、ＣＤ５６、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１０３、ＣＤ１５４、ＣＤＫ４、
    ＣＥＡ、ＣＴＬＡ４、サイトケラチン８、ＥＧＦ−Ｒ、エフリン受容体、ＥｒｂＢ１、Ｅ
    ｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ｇｐ１
    ００、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ヒトパピローマウイルス−Ｅ６、ヒトパピローマウイルス−
    Ｅ７、インテグリンα−Ｖ−β−６、ＪＡＭ−３、ＫＩＤ３、ＫＩＤ３１、ＫＳＡ（１７
    −１Ａ）、ＬＵＣＡ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ、ＭＵＣ−１、ＭＵＭ
    −１、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、オンコスタチンＭ（オンコスタ
    チン受容体β）、ｐ１５、ＰＩＰＡ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＡＧ１０、ＲＯＲ１、ＳＡ
    ＲＴ、ｓＴｎ、ＴＥＳ７、ＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ−β受容体、ＴＮＦ−γ受容体、ト
    ランスフェリン受容体又はＶＥＧＦ受容体であることを特徴とする請求項２２に記載のダ
    イアボディ分子。
  25. 前記腫瘍関連抗原が、ＨＥＲ−２／ｎｅｕであることを特徴とする請求項２４に記載の
    ダイアボディ分子。
  26. 前記ダイアボディ分子がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するリガンドとなるドメインを
    有することを特徴とする、請求項１ないし６又は請求項８ないし１９のいずれかに記載の
    ダイアボディ分子。
  27. 前記ダイアボディ分子が腫瘍関連抗原に更に結合することを特徴とする請求項２６に記
    載のダイアボディ分子。
  28. 前記腫瘍関連抗原が、乳癌抗原、卵巣癌抗原、前立腺癌抗原、頸部癌抗原、膵癌抗原、
    肺癌抗原、膀胱癌抗原、大腸癌抗原、精巣癌抗原、膠芽腫癌抗原、Ｂ細胞悪性腫瘍関連抗
    原、多発性骨髄腫関連抗原、非ホジキンスリンパ腫関連抗原又は慢性リンパ球性白血病関
    連抗原であることを特徴とする請求項２７に記載のダイアボディ分子。
  29. 前記腫瘍関連抗原が、Ａ３３、ＡＤＡＭ−９、ＡＬＣＡＭ、Ｂ１、ＢＡＧＥ、β−カテ
    ニン、ＣＡ１２５、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２
    、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４
    ５、ＣＤ４６、ＣＤ５６、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１０３、ＣＤ１５４、ＣＤＫ４
    、ＣＥＡ、ＣＴＬＡ４、サイトケラチン８、ＥＧＦ−Ｒ、エフリン受容体、ＥｒｂＢ１、
    ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ｇｐ
    １００、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ヒトパピローマウイルス−Ｅ６、ヒトパピローマウイルス
    −Ｅ７、インテグリンα−Ｖ−β−６、ＪＡＭ−３、ＫＩＤ３、ＫＩＤ３１、ＫＳＡ（１
    ７−１Ａ）、ＬＵＣＡ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ、ＭＵＣ−１、ＭＵ
    Ｍ−１、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、オンコスタチンＭ（オンコス
    タチン受容体β）、ｐ１５、ＰＩＰＡ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＡＧ１０、ＲＯＲ１、Ｓ
    ＡＲＴ、ｓＴｎ、ＴＥＳ７、ＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ−β受容体、ＴＮＦ−γ受容体、
    トランスフェリン受容体又はＶＥＧＦ受容体であることを特徴とする請求項２７に記載の
    ダイアボディ分子。
  30. 前記腫瘍関連抗原が、ＨＥＲ−２／ｎｅｕであることを特徴とする請求項２９に記載の
    前記ダイアボディ分子。
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