KR20080039929A - 항-ｃｄ26 항체 및 이들의 사용 방법 - Google Patents

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페이치 루오
핑규 종
마크 히시에
얀 리
카일리 씨. 왕
치카오 모리모토
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와이스 테라퓨틱스 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 신규의 항-CD26 항체 및 그 밖의 유관 폴리펩타이드, 및 상기 항체 및 폴리펩타이드를 암호화하는 신규의 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 항체 및 폴리펩타이드의 제조 방법을 제공한다. 상기 항체 또는 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 및 세포를 추가로 제공한다. 상기 항체 및/또는 폴리펩타이드를 예컨대 세포 증식의 억제 및 CD26 유관 질병의 치료용으로 이용하는 방법을 제공한다
항-CD26항체, CD26, 항체, 면역, 암

Description

항-ＣＤ26 항체 및 이들의 사용 방법{ANTI-CD26 ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2005. 7. 22자 미국 가명세서 출원 제60/701,802호에 기한 우선권을 주장하며, 이 출원은 참고자료로서 일체성을 가지고 본 명세서에 포함되었다.
기술 분야
본 발명은 항-CD26 항체 및 그 밖의 폴리펩타이드, 특히, 인체적응형 항-CD26 항체에 관한 것이며, 뿐만 아니라 CD26 발현 유관 질병의 치료용으로 상기 항체 및 그 밖의 폴리펩타이드를 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 배경기술
CD26는 넓게 보아 110 kDa의 세포 표면 당단백질로 분류된다. CD26는 초기에 T-세포 활성화 항원으로 정의되었다(Fox et al. (1984) J. Immunol. 133, 1250-1256, FleischeR(1987) J. Immunol. 138, 1346-1350, 및 Morimoto et al. (1989) J. Immunol. 143, 3430-3439). 이 분자는 세포외 도메인, 및 광범위한 조직 분포 내에서 디펩티딜 펩티다아제 IV (DPPIV; EC3.4.14.5) 활성을 갖는다고 알려졌다(Hegen et al. (1990) J. Immunol. 144, 2908-2914 및 Ulmer et al. (1990) J. Immunol. 31, 429-435). CD26는 인간 T-세포 생리학상 다양한 기능을 가진다. 예를 들면, CD26가 T-세포 활성화를 위한 보조자극 신호를 전달할 수 있다는 사실을 나타내는 증거가 있다(Morimoto et al. (1994) Immunologist 2:4-7 및 FleischeR(1994) Immunol. Today 15:180-184). 좀 더 살펴보면, CD26는 ADA 결합 단백질로 밝혀진 바 있으며, 상기 CD26/ADA 복합체는 면역 체계의 기능을 조절하는데 핵심적인 역할을 할 수도 있다(Dong et al. (1996) J Immunol. 156(4): 1349-55, Kameoka et al. (1993) Science. 261(5120):466-9, 및 Morrison et al. (1993) J Exp Med. 177(4):1135-43). 또한, CD26와 세포성 단백질 국소이성화효소IIα의 기능적 결합이 보고된바 있다(Aytac et al. (2003) British Journal of Cancer 88:455-462).
CD26는 또한 일부 종양의 발달에 역할을 하는 것 같다. 예를 들면, CD26은 일부 공격성 T-세포 악성종양, 예컨대 T-세포 림프모구림프종/급성 림프모세포성 백혈병, 및 T 세포 CD30+ 역형성 대세포 림프종 등의 표면상에서 발현된다(Carbone et al. (1995) Blood 86(12):4617-26 및 Jones et al.(2001) Am J Clin Pathol. 115(6):885-92).
CD26에 결합하는 다양한 뮤린(murine) 항체가 보고된 바 있다. (예컨대, Morimoto et al. (1989) J. Immunol. 143:3430-39, Nam Hong Dang et al. (1990) J. Immunol. 145(12):3963-71, Nam Hong Dang et al. (1990) J. Immunol. 144(11):4092-100, PCT 출원공개번호 제WO 91/07985호(Schlossman et al.), PCT 출원공개번호 제WO 02/092127호(Nam Hong Dang et al.), 및 미국 등록특허 제 6,573,096호(Chen et al.)를 참조하라.)
기 생성된 CD26에 대한 마우스 단클론 항체의 하나는 1F7 항체로 알려졌다. ( 예컨대, 미국 등록특허 제5,120,642호, PCT 출원공개번호 제WO 91/07985호(Schlossman et al.), 및 Morimoto et al. (1989) J. 면역학, 143:3430-3439를 참조할 것.) 상기 1F7 항체가 인간 CD4 및 CD8 림프구 상의 분자량이 110,000달톤인 당단백질을 포함하는 항원과 결합하는 것으로 밝혀진 바 있으며, 후에 CD26으로 밝혀졌고, 이는 억제 유도 세포가 아닌 조력 유도 세포 상에 제시된다. 따라서, 상기 1F7 단클론 항체는 인간 CD4 림프구 세포군 내에서 조력 유도 세포와 억제 유도 세포를 구분할 수 있다고 보고되었다
이와 함께, 상기 1F7 항체 및 그 밖의 항-CD26 단클론 항체는 CD26 발현 세포 유관 질병, 예컨대 일부 암 등의 치료에 유용하다고 제안되어 왔다. (예컨대, 미국 출원공개번호 제2003/0031665호 및 PCT 출원공개번호 제WO 02/092127호 (Nam Hoang Dang et al.)을 참조할 것.) 상기 항-CD26 단클론 항체 1F7와 CD26의 결합이 Gl/S 체크포인트에서 세포 주기 정지를 유도하며, CD26 Jurkat 전달감염체(transfectant) 상에 CD26의 진입은 세포 주기 조절 단백질 p21의 발현을 강화함으로써, Gl 정지를 유도한다고 알려졌다. 상기 1F7 항체 치료는 CD26+ 종양 형성을 억제하며, 마우스 모델의 생존률을 높인다고 보고되었다(Ho et al. (2001) 임상적 Cancer Research, 7:2031-2040).
그 밖의 밝혀진 항-CD26 뮤린 단클론 항체는 레트 항-CD26 항체 E19 및 E26을 포함한다. (예컨대, 미국 등록특허 제6,573,096호, 미국 출원공개번호 제 2002/0132979호, 미국 출원공개번호 제2002/0132979호, 미국 출원공개번호 제 2004/0115202호, PCT 출원공개번호 제WO 01/74299호(Chen et al.), 및 Ghersi et al. (2002) J. Biological Chemistry, 32:29231-29241를 참조할 것.) 이러한 항체는 단일층으로부터 섬유모세포 및 상처난 세포의 세포 이동 억제 효과, 혈관 형성 억제 효과 및 인간 피부 미세혈관 내피 세포의 침습 및 모세혈관 돌출 형성의 억제효능을 나타낸다. 암 침습 및 혈관 형성을 억제하기 위한 치료용으로 사용하는 상기 항체의 용도가 제안되었다.
기 생성된 또 다른 마우스 항-CD26 단클론 항체는 14D10 이다(본 명세서에서 CM03로 나타내기도 함). (예컨대, Dong et al. (1998) Mol Immunol. 35(1):13-21 및 미국 출원공개번호 제2003/0031665호를 참조할 것.)
CD26의 활성 변화가 다양한 질환의 치료에 유용하다는 사실이 증명되어야 한다. 항-CD26 단클론 항체는 CD26의 효과를 변화시키는 하나의 수단이다.
뮤린 단클론 항체는 인간 치료에 사용되어왔다. 그러나, 뮤린 항체가 인간에 치료적으로 사용되는 경우, 치료된 개체의 상당수에서 인간 항-뮤린 항체("HAMA") 반응을 발달시킨다. 상기 HAMA 반응에서, 치료된 환자들은 마우스 항체에 대한 항체를 발달시킨다. 이는 뮤린 단클론 항체 치료법의 유효성을 제한할 뿐만 아니라, 알러지 반응을 유도하여 과민증을 유발시키기도 한다. 이와 함께, 인간 Fc 영역 및 마우스 Fv 영역을 포함하는 키메라 항체도 잠재적으로 HAMA 반응을 유발시킬 수 있다.
상기 HAMA 반응을 최소화하기 위하여, 연구자들은 인간 면역 체계가 외래의 것으로 인식하지 않는 항제를 제조하는 시도를 하였다. 사용된 일 방법은 항체의 "인체적응화"이다. 이러한 인체적응형 항체는 실질적으로 인간 복제 기점인 서열을 포함할 수 있으며, 일반적으로 다른 종, 예컨대, 설치류 종 등으로부터 유래하거나 또는 완전히 인공제조된 일부 상보성 결정 영역("CDR") 잔기 및/또는 기본틀(framework) 영역 잔기를 포함한다. 항체를 인체적응시키기 위한 다양한 방법들이 당해 기술 업계에 알려져 있다. 인체적응화의 일 형태는 인간 면역글로블린 분자의 기본틀 서열상으로 항원-특이성 뮤린 상보성-결정 영역("CDR")을 "이식"하는 것이다. 또 다른 수준의 인체적응화는 뮤린 CDR 또는 다른 가변 영역 서열을 "더 인간적인" 것으로 유전자 조작하는 것을 포함하며, 그로 인하여 상기 HAMA 반응을 감소시키는 것이다. 예를 들면, 또 다른 인체적응화의 형태는 인간 중쇄(중쇄) 및 경쇄(경쇄) 불변 영역 상으로, 예컨대, 마우스 등의 한 종으로부터 유래한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 "이식"시키고, 그 다음, 기본틀 영역("FR") 및/또는 상보성 결정 영역 내의 개개의 잔기를 인제 내에서 상기 항체의 면역원성을 낮추도록 설계된 인간 항체 및/또는 잔기로부터 유래한 잔기로 치환하는 것이다. 모든 이러한 기술들에는 항체의 결합 유효성 또는 생물학적 효과를 증가시키도록 항체 서열을 유전자 조작하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 인용된 모든 문헌, 특허, 특허출원서, 인터넷 사이트 및 인증 번호/데이터베이스 서열(폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열 포함)은 각각의 문헌, 특허, 특허출원서, 인터넷 사이트 및 인증 번호/데이터베이스 서열이 참고자료로서 특별하게 및 개별적으로 적시된 것과 같은 정도로일체성을 가지고 참고자료 로서 본 명세서에 포함되었다.
발명의 요약
본 발명은 항-CD26 항체, 항-CD26 항체의 절편, 및 그 밖의 항-CD26 항체와 유관된 폴리펩타이드 등의 신규한 폴리펩타이드를 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 항-CD26 항체는 인체적응형 항-CD26 항체이다. 폴리펩타이드를 암호화한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 또한 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 조성물, 예컨대, 본 발명의 폴리펩타이드를 포함한 약학적 조성물을 제공한다. 상기 폴리펩타이드의 제조 방법을 또한 제공한다. 이와 함께, CD26 발현 세포의 증식을 억제하기 위하여, 또는 CD26 발현과 관련된 증상의 치료 또는 진단용으로 상기 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 포함한 조성물을 사용하는 방법을 추가적으로 제공한다.
본 발명의 일 특징으로서, 본 발명은 하기의 것들을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다: (a) 서열 GX1X2LX3TYGVH(SEQ ID NO:31)를 포함하는 중쇄 CDR1, 여기서, X1은 F 또는 Y, X2는 S 또는 T, 및 X3는 T, N, 또는 S이며; (b) 서열 VIWGX1GRTDYDX2X3FMS(SEQ ID NO:32)를 포함하는 중쇄 CDR2, 여기서, X1은 G 또는 D, X2는 A 또는 S, 및 X3는 A 또는 S이며; 및/또는 (c) 서열 X1RHDWFDY(SEQ ID NO:33)를 포함하는 중쇄 CDR3, 여기서, X1은 N 또는 S이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 항체이다.
본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 하기의 것들을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다: (a) 서열 X1ASQX2IRNX3LN(SEQ ID NO:34)를 포함하는 경쇄 CDR1, 여기서, X1은 S 또는 R, X2는 G 또는 D, 및 X3는 S 또는 N이며; (b) 서열 YSSNLX1X2(SEQ ID NO:35)를 포함하는 경쇄 CDR2, 여기서, X1은 H 또는 Q 및 X2는 S 또는 T이며; 및/또는 (c) 서열 QQSX1KLPX2T(SEQ ID NO:36)를 포함하는 경쇄 CDR3, 여기서, X1은 I 또는 N, 및 X2는 F 또는 L이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 항체이다.
본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 하기의 것들을 포함하는 폴리펩타이드, 예컨대 항체를 제공한다: (a) (i) 서열 GX1X2LX3TYGVH(SEQ ID NO:31)를 포함하는 중쇄 CDR1, 여기서, X1은 F 또는 Y, X2는 S 또는 T, 및 X3는 T, N, 또는 S, (ii) 서열 VIWGX1GRTDYDX2X3FMS(SEQ ID NO:32)를 포함하는 중쇄 CDR2, 여기서, X1은 G 또는 D, X2는 A 또는 S, 및 X3는 A 또는 S, 및 (iii) 서열 X1RHDWFDY(SEQ ID NO:33)를 포함하는 중쇄 CDR3, 여기서, X1은 N 또는 S인 것으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상(예컨대, 1, 2, 또는 3)의 중쇄 CDR; 및/또는 (b) (i) 서열 X1ASQX2IRNX3LN(SEQ ID NO:34)를 포함하는 경쇄 CDR1, 여기서, X1은 S 또는 R, X2는 G 또는 D, 및 X3는 S 또는 N, (ii) 서열 YSSNLX1X2(SEQ ID NO:35)를 포함하는 경쇄 CDR2, 여기서, X1은 H 또는 Q 및 X2는 S 또는 T, 및 (iii) 서열 QQSX1KLPX2T(SEQ ID NO:36)를 포함하는 경쇄 CDR3, 여기서, X1은 I 또는 N 및 X2는 F 또는 L인 것으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상(예컨대, 1, 2, 또는 3)의 경쇄 CDR.
본 발명의 추가적인 특징으로서, 본 발명은 하기의 것들을 포함하는 폴리펩타이드, 예컨대 항체를 제공한다 : (a) (i) GFSLTTYGVH(SEQ ID NO:55), GFSLSTYGVH(SEQ ID NO:56), 및 GYSLTTYGVH(SEQ ID NO:57)로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1, (ii) VIWGDGRTDYDAAFMS(SEQ ID NO:58) 및 VIWGDGRTDYDSSFMS(SEQ ID NO:59)로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2, 및 (iii) 서열 NRHDWFDY(SEQ ID NO:60)인 중쇄 CDR3로 구성되는 군으로부터 선택된 CDR와 적어도 약 80%가 각각 동일한 하나 이상(예컨대, 1, 2, 또는 3)의 중쇄 CDR; 및/또는 (b) (i) RASQDIRNNLN(SEQ ID NO:61), RASQGIRNNLN(SEQ ID NO:62), 및 SASQDIRNSLN(SEQ ID NO:63)로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1, (ii) YSSNLHS(SEQ ID NO:64), YSSNLQS(SEQ ID NO:65) 및 YSSNLHT(SEQ ID NO:66)로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2, 및 (iii) QQSIKLPLT(SEQ ID NO:67), QQSIKLPFT(SEQ ID NO:68), 및 QQSNKLPLT(SEQ ID NO:69)로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 CDR3로 구성되는 군으로부터 선택된 CDR와 적어도 약 80%가 각각 동일한 하나 이상(예컨대, 1, 2, 또는 3)의 경쇄 CDR.
본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 하기의 것들을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다: (a) 서열 EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9AS(SEQ ID NO:37)를 포함하는 중쇄 FRl, 여기서, X1은 E 또는 Q, X2는 A 또는 G, X3는 G 또는 E, X4는 L 또는 V, X5는 V, K, 또는 E, X6는 G 또는 E, X7은 T 또는 S, X8은 T 또는 S, 및 X9은 T 또는 K이며; (b) 서열 WVRQAPGKGLEWX1G(SEQ ID NO:38)를 포함하는 중쇄 FR2, 여기서, X1은 V 또는 M이며; (c) 서열 RVTISX1DX2SKX3TX4YLQX5NSLRAEDTAVYYCX6R(SEQ ID NO:39)를 포함하는 중쇄 FR3, 여기서, X1은 K 또는 R, X2는 N 또는 T, X3는 S 또는 N, X4는 V 또는 A, X5는 M 또는 L, 및 X6는 V, M, 또는 T이고; 및/또는 (d) 서열 WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:40)를 포함하는 중쇄 FR4. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 항체이다.
본 발명의 추가적인 특징으로서, 본 발명은 하기의 것들을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다: (a) 서열 X1IXaX3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9C(SEQ ID NO:41)를 포함하는 경쇄 FR1, 여기서, X1은 D 또는 E, X2는 L 또는 E, X3는 M 또는 L, X4는 A 또는 V, X5는 S 또는 T, X6는 L, P, 또는 A, X7은 D 또는 E, X8은 V 또는 A, 및 X9은 T 또는 S이며; (b) 서열 WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO: 42)를 포함하는 경쇄 FR2; (c) 서열 GVPX1RFSGSGSGTDFTLTISRLX2X3EDX4AX5YYC(SEQ ID NO: 43)를 포함하는 경쇄 FR3, 여기서, X1은 S, D, 또는 A, X2는 E 또는 Q, X3는 P 또는 A, X4는 F 또는 V, 및 X5는 T, A, 또는 I이고; 및/또는 (d) 서열 FGSGTKVEIK(SEQ ID NO:44)를 포함하는 경쇄 FR4. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 항체이다.
본 발명의 부가적인 특징으로서, 본 발명은 하기의 것들을 포함하는 폴리펩타이드, 예컨대 항체를 제공한다: (a) (i) 서열 EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9AS(SEQ ID NO:37)를 포함하는 중쇄 FRl, 여기서, X1은 E 또는 Q, X2는 A 또는 G, X3는 G 또는 E, X4는 L 또는 V, X5는 V, K, 또는 E, X6는 G 또는 E, X7은 T 또는 S, X8은 T 또는 S, 및 X9은 T 또는 K이고; (ii) 서열 WVRQAPGKGLEWX1G(SEQ ID NO:38)를 포함하는 중쇄 FR2, 여기서, X1은 V 또는 M이고, (iii) 서열 RVTISX1DX2SKX3TX4YLQX5NSLRAEDTAVYYCX6R(SEQ ID NO:39)를 포함하는 중쇄 FR3, 여기서, X1은 K 또는 R, X2는 N 또는 T, X3는 S 또는 N, X4는 V 또는 A, X5는 M 또는 L, 및 X6는 V, M, 또는 T, 및 (iv) 서열 WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:40)를 포함하는 중쇄 FR4로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 또는 4)의 중쇄 기본틀 영역; 및/또는 (b) (i) 서열 X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9C(SEQ ID NO:41)를 포함하는 경쇄 FR1, 여기서, X1은 D 또는 E, X2는 L 또는 E, X3는 M 또는 L, X4는 A 또는 V, X5는 S 또는 T, X6는 L, P, 또는 A, X7은 D 또는 E, X8은 V 또는 A, 및 X9은 T 또는 S이며, (ii) 서열 WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO: 42)를 포함하는 경쇄 FR2, (iii) 서열 GVPX1RFSGSGSGTDFTLTISRLX2X3EDX4AX5YYC(SEQ ID NO: 43)를 포함하는 경쇄 FR3, 여기서, X1은 S, D, 또는 A, X2는 E 또는 Q, X3는 P 또는 A, X4는 F 또는 V, 및 X5는 T, A, 또는 I, 및 (iv) 서열 FGSGTKVEIK(SEQ ID NO:44)를 포함하는 경쇄 FR4로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 또는 4)의 경쇄 기본틀 영역.
본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 중쇄 CDR 및/또는 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 중쇄 FR을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다(예컨대, 본 명세서에서 전술 또는 어디에서도, 예컨대 도 3 및 5). 발명의 일 실시 태양에서, 본 발명은 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 중쇄 CDR 및/또는 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 중쇄 FR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 이와 함께, 본 발명은 또한 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 경쇄 CDR 및/또는 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 경쇄 FR를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 경쇄 CDR 및/또는 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 경쇄 FR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 것들을 포함한다: (1) 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 중쇄 CDR 및/또는 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 중쇄 FR; 및 (2) 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 경쇄 CDR 및/또는 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 경쇄 FR. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 중쇄 CDR를 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 경쇄 CDR를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명은 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 중쇄 CDR를 포함하는 중쇄 가변 영역및/또는 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 중쇄 FR를 추가로 제공한다. 이와 함께, 본 발명은 또한 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 경쇄 CDR를 포함하는 경쇄 가변 영역 및/또는 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 경쇄 FR을 제공한다.
본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 아미노산 서열
EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX10X11LXl2TYGVHWVRQAPGKGLEWX13GVIWGX14GRTDYDX15X16FMSRVTISX17DX18SKX19TX2OYLQX21NSLRAEDTAVYYCX22RX23RHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:29)를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서, X1은 E 또는 Q, X2는 A 또는 G, X3는 G 또는 E, X4는 L 또는 V, X5는 V, K, 또는 E, X6는 G 또는 E, X7은 T 또는 S, X8은 T 또는 S, X9은 T 또는 K, X10은 F 또는 Y, X11은 S 또는 T, X12는 T, N, 또는 S, X13은 V 또는 M, X14은 G 또는 D, X15은 A 또는 S, X16은 A 또는 S, X17은 K 또는 R, X18은 N 또는 T, X19은 S 또는 N, X20은 V 또는 A, X21은 M 또는 L, X22는 V, M, 또는 T, 및 X23은 N 또는 S이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 항체이다.
본 발명의 부가적인 특징으로서, 본 발명은 아미노산 서열
X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9CX10ASQX11IRNX12LNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLX13X14GVPX15RFSGSGSGTDFTLTISRLX16X17EDX18AX19YYCQQSX20KLPX21TFGSGTKVEIK(SEQ ID NO:30)를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서, X1은 D 또는 E, X2는 L 또는 E, X3는 M 또는 L, X4는 A 또는 V, X5는 S 또는 T, X6는 L, P, 또는 A, X7은 D 또는 E, X8은 V 또는 A, X9은 T 또는 S, X10은 S 또는 R, X11은 G 또는 D, X12는 S 또는 N, X13은 H 또는 Q, X14는 S 또는 T, X15은 S, D, 또는 A, X16은 E 또는 Q, X17은 P 또는 A, X18은 F 또는 V, X19은 T, A, 또는 I, X20은 I 또는 N, 및 X21은 F 또는 L이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 아미노산 서열
EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX10X11LX12TYGVHWVRQAPGKGLEWX13GVIWGX14GRTDYDX15X16FMSRVTISX17DX18SKX19TX2OYLQX21NSLRAEDTAVYYCX22RX23RHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:29)를 추가로 포함하며, 여기서, X1은 E 또는 Q, X2는 A 또는 G, X3는 G 또는 E, X4는 L 또는 V, X5는 V, K, 또는 E, X6는 G 또는 E, X7은 T 또는 S, X8은 T 또는 S, X9은 T 또는 K, X10은 F 또는 Y, X11은 S 또는 T, X12는 T, N, 또는 S, X13은 V 또는 M, X14은 G 또는 D, X15은 A 또는 S, X16은 A 또는 S, X17은 K 또는 R, X18은 N 또는 T, X19은 S 또는 N, X20은 V 또는 A, X21은 M 또는 L, X22는 V, M, 또는 T, 및 X23은 N 또는 S이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 항체이다.
본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 상기 뮤린 항체 14D10의 인체적응형인 항체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO:45; 펩타이드 6), LEYNYVKQWRHSY(SEQ ID NO:46; 펩타이드 35), TWSPVGHKLAYVW(SEQ ID NO:47; 펩타이드 55), LWWSPNGTFLAYA(SEQ ID NO:48; 펩타이드 84), RISLQWLRRIQNY(SEQ ID NO:49; 펩타이드 132), YVKQWRHSYTASY(SEQ ID NO:50; 펩타이드 37), EEEVFSAYSALWW(SEQ ID NO:51; 펩타이드 79), DYSISPDGQFILL(SEQ ID NO:52; 펩타이드 29), SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO:53; 펩타이드 30), 및 IYVKIEPNLPSYR(SEQ ID NO:54; 펩타이드 63)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드에 결합하는 폴리펩타이드, 예컨대, 항체를 제공한다.
본 발명의 부가적인 특징으로서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 15-21로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:15-21로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 절편과 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열, 및/또는 (b) SEQ ID NO: 22-28로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:22-28구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 절편과 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 15-21로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열, 및/또는 (b) SEQ ID NO:22-28로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다
본 발명의 추가적인 특징으로서, 본 발명은 도 3에 나타낸 다음의 서열: X376, X377, X378, X379, X380, X381, 및 X394 (각각 SEQ ID NO:15-21)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드, 예컨대 항체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 도 5에 나타낸 다음의 서열: X384, X385, X386, X387, X388, X399, 및 X420 (각각 SEQ ID NO:22-28)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드, 예컨대 항체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 도 3 또는 도 5에 나타낸 다음의 서열: X376, X377, X378, X379, X380, X381, X394, X384, X385, X386, X387, X388, X399, 및 X420 (SEQ ID NO:15-28)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 예컨대 항체를 제공한다.
그러나, 본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 SEQ ID NO:217, 또는 이들의 절편 또는 변이체를 포함하는 폴리펩타이드(예컨대, 항체)를 제공한다.
본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 SEQ ID NO:218, 또는 이들의 절편 또는 변이체를 포함하는 폴리펩타이드(예컨대, 항체)를 제공한다.
각각 전술한 본 발명의 특징 및 본 명세서에 기술한 다른 특징의 일 실시 태양에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 항체이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 단클론 항체이다. 각각 전술한 본 발명의 특징의 일 실시 태양, 및 본 명세서에 기술한 다른 특징에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 인체적응형 항체이다. 각각 전술한 본 발명의 특징 및 본 명세서에 기술한 다른 특징의 일 실시 태양에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 뮤린 단클론 항체가 아니다. 각각 전술한 본 발명의 특징의 일 실시 태양, 및 본 명세서에 기술한 다른 특징에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 마우스 단클론 항체가 아니다. 각각 전술한 본 발명의 특징의 일 실시 태양, 및 본 명세서에 기술한 다른 특징에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 마우스 단클론 항체 14D10가 아니다. 각각 전술한 본 발명의 특징의 일 실시 태양, 및 본 명세서에 기술한 다른 특징에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열
QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:90)의 중쇄 가변 영역을 포함하지 않는다. 각각 전술한 본 발명의 특징의 일 실시 태양, 및 본 명세서에 기술한 다른 특징에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열
DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWYQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID N0:91)의 경쇄 가변 영역을 포함하지 않는다. 각각 전술한 본 발명의 특징의 일 실시 태양, 및 본 명세서에 기술한 다른 특징에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열
QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:90)의 중쇄 가변 영역 및 서열
DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWYQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:91)의 경쇄 가변 영역 모두를 포함하지 않는다. 각각 전술한 본 발명의 특징의 일 실시 태양, 및 본 명세서에 기술한 다른 특징에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 마우스 단클론 항체 1F7이 아니다. 각각 전술한 본 발명의 특징의 일 실시 태양에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 하나 이상의 다음의 특징을 갖는다: CD26과 결합; CD26 활성의 조절, Gl/S 체크포인트에서 CD26+ 세포의 세포 주기 정지를 유발; CD26 발현 세포의 증식을 억제, 및/또는 CD26 발현과 관련된 증상(예컨대, 질병 또는 장애)의 치료에 유용하다는 것이다. 각각 전술한 본 발명의 특징의 일 실시 태양, 및 본 명세서에 기술한 다른 특징에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 인간 CD26과 결합한다.
본 명세서는 또한 전술한 각각의 폴리펩타이드의 제조 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 숙주 세포 내에서 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 것을 포함하는, 본 명세서에서 기술한 항체의 생산 방법을 제공하며, 여기서, 항체의 각 사슬은 적어도 하나 이상의 상기 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화된다.
본 발명은 전술한 각각의 폴리펩타이드를 포함하는 키트를 추가로 제공한다.
본 발명은 조성물, 예컨대, 전술한 각각의 폴리펩타이드 및 본 명세서에서 기술한 다른 폴리펩타이드를 포함하는 약학적 조성물을 추가로 제공한다. 약학적 조성물 또는 약제의 제조용으로 사용하는 각각의 이러한 폴리펩타이드의 용도 또한 제공한다. 상기 조성물은 본 명세서에 기술한 모든 방법에 사용될 수 있다.
본 발명은 세포가 본 명세서에서 기술한 폴리펩타이드(일반적으로, 소망하는 억제 효과를 나타내는 유효량의 상기 폴리펩타이드)와 접촉하는 것을 포함하는, CD26 발현 세포 증식의 억제 방법을 제공한다. 이와 함께, 본 발명은 본 명세서에서 기술한 폴리펩타이드를 포함한 조성물의 유효량을 환자에 투여하는 것을 포함하는, 환자 내에서 26 발현과 관련된 증상의 치료하는 방법을 제공한다. 본 명세서에서 기술한 조성물은 다양한 질병, 증상, 예컨대, 이식편 대 숙주 질환, 자가면역 질환, 또는 암 등의 치료에 사용될 수도 있다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 암은 혈액암이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 암은 고형 종양이다. 본 발명은 CD26+ 암 진행의 억제, CD26-발현 종양의 퇴화를 포함하는 CD26-발현 종양 성장의 억제, 및/또는 CD26 발현 암 세포의 전이 억제에 사용되는 본 명세서에서 기술한 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 일 특징으로서, 본 발명은 본 명세서에서 기술한 상기 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명의 일 특징으로서, 본 발명은 도 2 및 도 4(SEQ ID NO: 1-14)에서 나타낸 각각의 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명의 다른 특징으로서, 본 발명은 도 2 및 도 4(SEQ ID NO: 1-14)에서 나타낸 각각의 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 약 80% 일치하는 핵산 서열을 포함한 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명의 다른 특징으로서, 본 발명은 도 3 또는 도 5에서 나타낸 다음의 아미노산 서열: X376, X377, X378, X379, X380, X381, X394, X384, X385, X386, X387, X388, X399, 및 X420(SEQ ID NO: 15-28)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 제공한다. 전술한 각각의 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 또한 제공한다.
발명의 일 실시 태양에서, 본 발명의 상기 폴리펩타이드(예컨대, 항체)는 본 명세서에서 배제된 것을 포함하지 않는다.
아미노산 치환체를 포함하는 본 명세서의 서열에 관하여, 각각의 아미노산 치환체는 독립적으로 선택되는 것이라는 사실은 당해 기술 분야의 숙련자에게 자명하다. 본 발명은 또한 하나 이상의 아미노산 치환체가 제거된 아미노산 치환체를 포함하는 서열을 제공한다.
본 발명의 특징 또는 실시 태양은 마쿠쉬 군 또는 다른 대안 군으로 기술되어있기 때문에, 본 발명은 열거된 전체 군과 군 내의 개별적인 각 요소들, 가능한 모든 아군 뿐만 아니라, 하나 이상의 군 요소가 부재한 주요 군을 모두 포괄한다. 본 발명은 또한 청구항 내에서 하나 이상의 군 요소의 명백한 배제를 감안하여야 한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 CM03 (SEQ ID NO:90)의 VH 및 CM03 (SEQ ID NO:91)의 VL의 서열을 나타낸다.
도 2는 인체적응형 VL 변이체 X376 (SEQ ID NO:1), X377 (SEQ ID NO:2), X378 (SEQ ID NO:3), X379 (SEQ ID NO:4), X380 (SEQ ID NO:5), X381 (SEQ ID NO:6), 및 X394 (SEQ ID NO:7)의 DNA 서열을 나타낸다.
도 3은 CM03 VL (SEQ ID NO:91) 및 인체적응형 VL 변이체 X376 (SEQ ID NO:15), X377 (SEQ ID NO:16), X378 (SEQ ID NO:17), X379 (SEQ ID NO:18), X380 (SEQ ID NO:19), X381 (SEQ ID NO:20), 및 X394 (SEQ ID NO:21)의 아미노산 서열을 나타낸다. 카벳(Kabat) 및 서열 번호도는 경쇄 가변 영역과 일치한다.
도 4는 인체적응형 VH 변이체 X384 (SEQ ID NO:8), X385 (SEQ ID NO:9), X386 (SEQ ID NO: 10), X387 (SEQ ID NO:11) 및 X388 (SEQ ID NO: 12), X399 (SEQ ID NO:13) 및 X420 (SEQ ID NO:14)의 DNA 서열을 나타낸다.
도 5는 CM03 VH(SEQ ID NO:90) 및 인체적응형 VH 변이체 X384 (SEQ ID NO:22), X385 (SEQ ID NO:23), X386 (SEQ ID NO:24), X387 (SEQ ID NO:25) 및 X388 (SEQ ID NO:26), X399 (SEQ ID NO:27) 및 X420 (SEQ ID NO:28)의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 및 카벳 번호도를 나타내었다. 카벳 번호도는 82a, 82b, 및 82c를 포함한다.
도 6은 변이체 VH 및 변이체 VL: X389, X390, X391, X392, X393, X394, X395, X396, X399, X420, 및 X429로부터 선택된 것을 포함하는 Fab의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 나타낸다.
Fab X389는 X384 VH(SEQ ID NO:22) 및 X376 VL (SEQ ID NO: 15)를 포함하며, Fab X390는 X385 VH(SEQ ID NO:23) 및 X376 VL (SEQ ID NO: 15)를 포함하며, Fab X391는 X388 VH(SEQ ID NO:26) 및 X376 VL (SEQ ID NO: 15)를 포함하며, Fab X392 는 X384 VH(SEQ ID NO:22) 및 X379 VL (SEQ ID NO:18)를 포함하며, Fab X393는 X385 VH(SEQ ID NO:23) 및 X379 VL (SEQ ID NO: 18)를 포함하며, Fab X394는 X384 VH(SEQ ID NO:22) 및 X394 VL (SEQ ID NO:21)를 포함하며, Fab X395는 X384 VH(SEQ ID NO:22) 및 X380 VL (SEQ ID NO: 19)를 포함하며, Fab X396는 X385 VH(SEQ ID NO:23) 및 X380 VL (SEQ ID NO: 19)를 포함하며, Fab X399는 X399 VH(SEQ ID NO:27) 및 X380 VL (SEQ ID NO: 19)를 포함하며, Fab X420는 X420 VH(SEQ ID NO:28) 및 X380 VL (SEQ ID NO: 19)를 포함하며, 및 Fab X429는 X399 VH(SEQ ID NO:27) 및 X394 VL (SEQ ID NO:21)를 포함한다.
도 7은 이. 콜리(E. Coli) 균주 TGl에서 발현된, CM03 VL 변이체 X376, X377, X378, X379, X380, 또는 X381와 CM03 VH가 짝을 지어 포함된 Fab 및 CM03 VH 변이체 X384, X385, X386가 CM03 VL이 짝을 지어 포함된 Fab를 함유하는 단백질 시편이 탑재된 gel을 나타낸다.
도 8은 이. 콜리 내에서 발현된 CM03 VL 변이체 X376, X377, X378, X379, X380, 또는 X381와 CM03 VH가 짝을 지어 포함된 Fab 및 Fab X369 (CM03 VH 및 CM03 VL포함)를 함유하는 단백질의 축적량을 나타낸다.
도 9는 이. 콜리 균주 TGl에서 발현된 CM03 VH 변이체 X387 또는 X388와 CM03 VL가 짝을 지어 포함된 Fab, 및 이. 콜리 균주 HB2151 내에서 발현된 Fab X389, X390, X391, X392, X393, X395 및 X396(VH 및 VL 변이체 짝을 포함)를 함유하는 단백질 시편이 탑재된 gel을 나타낸다.
도 10은 이. 콜리 균주 HB2151에서 발현된, CM03 X369의 Fab 및 CM03 VH 및 VL 변이체 짝을 포함하는 다음의 Fab: X389, X390, X391, X392, X393, X395 및 X396의 축적량을 나타낸다.
도 11은 이. 콜리 내에서 CM03 VH 변이체 X384, X385, X386, X387 또는 X388와 CM03 VL이 짝을 지어 포함된 Fab의 축적량을 나타낸다.
도 12A는 인간 CD26에 결합된 CM03 Fab X369 및 X369의 추가 도입 후의 반응을 나타낸다.
도 12B는 인간 CD26에 결합된 CM03 Fab X369, 및 X377 VL 및 CM03 VH를 포함하는 Fab의 도입 후의 반응을 나타낸다.
도 12C는 X377 Fab와 인간 CD26의 결합 및 X377 Fab와 사전에 CM03 Fab X369와 결합한 인간 CD26의 결합을 나타낸다.
도 13은 CM03 X369 및 CM03 VH 변이체 및 VL 변이체를 포함하는 다음의 Fab: X389, X390, X391, X392, X393, X395 및 X396의 친화도 분석을 나타낸다.
도 14는 인간 CD26에 결합하기 위한 CM03 X369 Fab 및 인체적응형 CM03 Fab X389, X390, X391, X392, X393, X395 및 X396과 미분리 복수(복수) 뮤린 MAb CM03(14D10)간의 경쟁을 나타낸다.
도 15는 CM03 Fab X369 및 VH/VL 변이체 짝(X389, X390, X391, X392, X393, X395 및 X396)을 포함하는 Fab와 변이체 X376 및 CM03 VH를 포함하는 Fab에 의한 JKT/CD26+ 세포 증식 억제율을 나타낸다.
도 16은 IgGl 사슬-사슬 상호작용을 포함하는 IgGl 항체의 도해이다. 적시된 경첩부(경첩부) 서열은 SEQ ID NO:86 이다.
도 17A는 선도 서열에 결합된 예시적인 중쇄를 나타낸다. 상기 중쇄 불변 영역 아미노산 서열(인간 IgGl)을 나타낸다(SEQ ID NO:87).
도 17B는 선도 서열에 결합된 예시적인 경쇄를 나타낸다. 상기 경쇄 불변 영역 아미노산 서열 (인간 kappa)을 나타낸다(SEQ ID NO:88).
도 18은 HEK 세포에서 발현된 재조합 인체적응형 단클론 항체(rhuMAb) 409, 410, 411, 및 412, 및 CHO세포에서 발현된 rhuMAb 411를 나타낸다.
도 19는 특히 인간 CD26에 결합된 rhuMAb 409, 410, 411, 및 412이다.
도 20은 rhuMAb 변이체에 의한 CD26-결합을 나타내는 ELISA 데이터이다.
도 21은 2.5 ㎍/ml rhuMAb 409 및 410의 JKT/CD26+ 세포에 대한 48 시간 경과후 효과를 나타낸다.
도 22는 0.05, 0.1, 0.5, 2.5, 및 5 ㎍/ml rhuMAb 411의 JKT/CD26+ 세포에 대한 48시간 경과 후의 효과를 나타낸다.
도 23A 및 23B은 HEK293 세포에서 생산된 rhuMAb 409, 410, 411, 412, 420 및 429의 MTT 데이터(% 억제)를 나타낸다.
도 24은 아미노산 13개인 펩타이드와 rhuMAb 409, 411, 412 및 420 인체적응형 항체의 반응을 나타낸다.
도 25는 인간 CD26-1J2E의 결정 구조의 리본 도해이다. 에피토프 맵핑 실험에서 rhuMAb 409와 가장 반응성이 강한 펩타이드는 밝은 색으로 표시하였다.
도 26은 인간 CD26-1J2E의 결정 구조의 리본 도해이다. 에피토프 맵핑 실험에서 rhuMAb 411와 가장 반응성이 강한 펩타이드는 밝은 색으로 표시하였다.
도 27은 인간 CD26-1J2E의 결정 구조의 리본 도해이다. 에피토프 맵핑 실험에서 rhuMAb 412와 가장 반응성이 강한 펩타이드는 밝은 색으로 표시하였다.
도 28은 인간 CD26-1J2E의 결정 구조의 리본 도해이다. 에피토프 맵핑 실험에서 rhuMAb 420와 가장 반응성이 강한 펩타이드는 밝은 색으로 표시하였다.
도 29는 마우스 이종이식 모델에서 rhuMAb 411 치료가 Karpas299(T-세포 림프종) 종양 퇴화를 유도한다는 것을 나타낸다. 데이터는 동물 10 두의 평균 ±SEM 값을 나타낸다.
도 30은 마우스 이종이식 모델에서 rhuMAb 411 치료가 786-O(신장암종) 종양 성장을 상당히 지연시켰음을 나타낸다. 데이터는 동물 10 두의 평균 ±SEM 값을 나타낸다.
도 31은 복용량 의존 방식의 rhuMAb 411 치료가 Caki-2(신장암종) 이종이식 종양 성장을 감소시켰음을 나타낸다. 데이터는 동물 10 두의 평균 ±SEM 값을 나타낸다.
도 32는 조합 치료법에 의한 부가 효능에 의하여 rhuMAb 411 치료가 Caki-2(신장암종) 이종이식 종양 성장을 감소시켰음을 나타낸다. 데이터는 동물 10 두의 평균 ±SEM 값을 나타낸다.
도 33은 SCID 마우스 내에서 rhuMAb 411 치료가 PC-3(전립선암종) 이종이식 종양 성장을 감소시켰음을 나타낸다. 데이터는 동물 10 두의 평균 ±SEM 값을 나타낸다.
도 34는 조합 치료법에 의한 부가 효능에 의하여 rhuMAb 411가 PC-3 종양 성장을 감소시켰음을 나타낸다.
도 35는 마우스 이종이식 모델 내에서 rhuMAb 411 치료가 DU- 145(전립선암종) 종양 성장을 지연시켰음을 나타낸다. 데이터는 동물 10 두의 평균 ±SEM 값을 나타낸다.
도 36은 NCR 누드 마우스에서 rhuMAb 411 치료가 폐 전이 유도된 H226(폐암종)을 상당히 약화시킴을 나타낸다. 각 군의 선은 평균값을 나타낸다.
도 37은 다양한 암 세포주 내에서 CD26 세포 표면 발현의 수준 및 백분율을 나타낸다.
도 38은 이중-유전자(이중 유전자) 벡터 클론 pY392/DGV/YsCH1-3이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 항-CD26 항체의 하나 이상의 CDR 또는 FR를 포함하거나 또는 항-CD26 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역(또는 이들의 절편)을 포함하는 것을 포함하는 다양한 신규의 폴리펩타이드를 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 CD26과 결합한다. 특히, 인체적응형 항-CD26 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 신규의 항-CD26 항체를 제공한다. 조성물, 예컨대, 약학적 상기 폴리펩타이드를 포함한 조성물을 또한 제공한다. 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 또한 제공한다. 상기 폴리펩타이드의 용도 및 제조 방법을 또한 제공한다. 일 예로서, 본 발명의 폴리펩타이드는 예를 들어, CD26와 결합하는 폴리펩타이드(예컨대 항체) 제조시 중간체로써 유용하다.
본 명세서에서 "포함하는"이라는 단어를 사용하여 기술한 실시 태양은 어떠한 것이라도, 이와 유사한 실시 태양에서 "로 구성되는" 및/또는 "필수적으로 구성된" 이라는 용어로 제공될 수 있다는 사실을 이해하여야 한다.
일반 기술
달리 적시하지 않는 한, 본 발명의 실시에는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래 기술을 사용하며, 이들은 모두 당해 기술 분야 범위 내에 있는 것이다. 이러한 기술들은 하기의 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (RI. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in EnzymologY(Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Innunology(D.M. Weir and CC. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vector for Mamalian Cell(J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in ImmunologY(J.이. 콜리gan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular BiologY(Wiley and Sons, 1999); ImmunobiologY(CA. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approacH(D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: a practical approacH(P. Shepherd and C Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: a Laboratory manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).
정의
"항체"는 면역글로블린 분자의 가변 영역 내에 위치한 적어도 하나 이상의 항원 인식 부위를 통하여 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 폴리펩타이드, 등과 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로블린 분자이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는 무손상 다클론 또는 단클론 항체뿐만 아니라 이들의 절편(예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬(ScFv), 이들의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로블린 분자의 모든 변형 구조를 포괄한다. 항체는 모든 클래스의 항체, 예컨대 IgG, IgA, 또는 IgM(또는 이들의 하위-클래스)를 포함하며, 상기 항체가 특정 클래스일 필요는 없다. 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라, 면역글로블린은 서로 다른 클래스에 할당된다. 5개의 주요 클래스의 면역글로블린이 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이며, 이들 중 일부는 추가로 하위 클래스로 나누어진다(동종형), 예컨대, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2이다. 서로 다른 클래스의 면역글로블린에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 알파, 델타, 입실론, 감마, 및 뮤로 각각 칭한다. 서로 다른 클래스의 면역글로블린의 서브유닛 구조 및 3차원 구조는 잘 알려져 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "단클론 항체"는 실질적으로 균질 항체 집단으로부터 획득한 항체 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생적 돌연변이를 제외하고 동일한 집단으로부터 선택된 개별 항체를 말한다. 단클론 항체는 단일 항원 부위에 대응하는 고도의 특이성이 있다. 좀 더 살펴보면, 일반적으로 서로 다른 결정기(에피토프)를 대응하는 서로 다른 항체를 포함하는 다클론 항체 제조에 비하여, 각 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대응한다. "단클론"이라는 수식어는 실질적으로 균질 집단으로부터 획득한 항체의 특성을 지칭하며, 특정 방법에 의한 항원 제조를 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 상기 단클론 항체는 재조합 DNA 방법 예컨대, 미국 등록특허 제 4,816,567호에 기술된 방법에 의하여 제조될 수 있다. 상기 단클론 항체는 예컨대, McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554 등에서 기술한 기법을 사용하여 생성한 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "인체적응형" 항체는 비-인간 면역글로블린으로부터 유래한 최소한의 서열을 함유하는, 특이 키메라 면역글로블린, 면역글로블린 사슬, 또는 이들의 절편(예컨대 Fv, Fab, Fab`, F(ab`)2 또는 그 밖의 항체의 항원 결합 하위서열)인 비인간(예컨대 마우스) 항체의 형태를 말한다. 일부 인체적응형 항체는 인간 면역글로블린(수용자 항체)이며, 상기 수용자의 상보성 결정 영역(CDR)의 잔기는 예컨대, 소망하는 특이성, 친화도, 및 결합능을 지닌 마우스, 레트, 또는 토끼 등의 비-인간 종(공여자 항체)의 CDR의 잔기로 치환된다. 일 예로써, 인간 면역글로블린의 Fv 기본틀 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 치환된다. 일부 인체적응형 항체는 예컨대, 소망하는 특이성, 친화도, 및/또는 결합능을 지닌 마우스, 레트, 또는 토끼 등의 비-인간 종(공여자 항체)으로부터 일반적으로 유래한, 그러나 하나 이상의 Fv 기본틀 영역 잔기 및/또는 하나 이상의 Fv CDR 잔기가 상응하는 인간 잔기(즉, 인간 항체 서열에서 유래한 잔기)로 치환된, 적어도 하나 이상, 및 일반적으로 2개의 가변 도메인을 포함한다. 가장 일반적인 경우는 적어도 복수의 Fv 기본틀 영역 잔기가 인체적응형 항체의 하나 이상의 가변 도메인 내로 치환되는 것이다. 좀 더 살펴보면, 상기 인체적응형 항체는 수용자 항체나 유입된 CDR 또는 기본틀 서열에서도 발견되지 않는, 그러나 항체 성능을 추가 정제 및 최적화하기 위하여 포함되는 잔기를 포함할 수 있다. 일부 인체적응형 항체는 실질적으로 전부, 적어도 하나 이상, 및 일반적으로 2개의 가변 도메인을 포함하며, 이는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR은 비-인간 면역글로블린의 CDR에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로블린 일치 서열의 FR이다. 일부 인체적응형 항체는 실질적으로 모든, 적어도 하나 이상, 및 일반적으로 2개의 가변 도메인을 포함하며, 여기서 CDR 아미노산 잔기의 대다수는 비-인간 면역글로블린의 잔기와 대응하며, FR의 하나 이상의 아미노산 잔기는 인간 면역글로블린 일치 서열의 잔기이다. 최적화한 인체적응형 항체는 적어도 면역글로블린 불변 영역 또는 도메인(Fc)의 부분을 포함할 수도 있으며, 일반적으로 인간 면역글로블린의 불변 영역 또는 도메인의 일부이다. 일부 인체적응형 항체는 WO 99/58572 에서 기술한 바와 같이 변형된 Fc 영역을 지닌다. 일부 인체적응형 항체의 형태는 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6개)의 CDR을 지니는데, 이는 원 항체에 비하여 변형된 것이며, 원 항체의 하나 이상의 CDR "로부터 유래" 된 하나 이상의 CDR로 칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "인간 항체"는 인간에게서 생성된 항체의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 지닌 항체를 의미하며 및/또는 기술 분야에 알려졌거나 또는 본 명세서에 기재된 인간 항체를 제조하는 모든 기술을 사용하여 제조되었다. 이러한 인간 항체의 정의에는 적어도 하나 이상 인간 중쇄 폴리펩타이드 또는 적어도 하나 이상 인간 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 포함한다. 이러한 일 예로는 마우스 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체가 있다. 인간 항체는 기술 분야에 알려진 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 일 실시 태양으로서, 상기 인간 항체는 파지 라이브러리로부터 선택되며, 여기서 파지 라이브러리는 인간 항체를 발현한다 (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. MoI. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. MoI. Biol., 222:581). 인간 항체는 인간 면역글로블린 loci을 유전자삽입 동물, 예컨대, 내부 면역글로블린 유전자는 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스에 도입함으로써 제조될 수 있다. 이러한 접근법은 미국 등록특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호에 기재되어 있다. 또 다른 특징으로서, 상기 인간 항체는 표적 항 원에 대응하는 항체를 생산하는 인간 B 림프구를 무한증식시킴으로써 제조할 수 있다(이러한 B 림프구는 개체로부터 회복될 수 있거나 또는 생체 외에서 면역화될 수도 있다). 예컨대, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147 (l):86-95; 및 미국 등록특허 제 5,750,373호를 참조할 것. 발명의 일 실시 태양에서, 인간 항체는 상기 항체가 인간 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드를 함유하는 것을 의미하는 "완전 인간형"이다.
"폴리펩타이드", "올리고펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"이라는 용어는 모든 길이의 아미노산 고분자를 의미하는 것으로 본 명세서에서 혼용하고 있다. 상기 고분자는 선형 또는 가지형일 수 있으며, 변형 아미노산을 포함할 수도 있고, 비-아미노산에 의하여 단절될 수도 있다. 상기 용어는 자연적으로 또는 개입, 예를 들어, 이황화 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 그 외의 조작 또는 변형, 예컨대 라벨 성분과의 컨쥬게이션 등의 개입에 의하여 변형된 아미노산 고분자를 포괄한다. 또한 상기 정의에 포함되는 것은, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 유사체(예를 들어, 비호적 아미노산, 등을 포함)을 포함하는 폴리펩타이드 및 그 밖의 기술 분야에 알려진 변형체를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 항체에 기반을 두고 있기 때문에, 상기 폴리펩타이드는 단일 사슬 또는 결합 사슬로서 발생할 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
본 명세서에서 혼용되는 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 모든 길이의 뉴클레오타이드 고분자를 의미하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 뉴클레오타이드 는 디옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라아제에 의하여 고분자로 통합될 수 있는 모든 기질이 될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화 뉴클레오타이드 및 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 만약 이들이 존재한다면, 뉴클레오타이드 구조의 변형이 상기 고분자의 결합 전 또는 후에 가해질 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의하여 중단될 수도 있다. 폴리뉴클레오타이드는 중합 후에 예컨대, 라벨 성분과의 컨쥬게이션에 의하여 추가로 변형될 수 있다. 다른 형태의 변형에는, 예를 들어, "caps", 하나 이상의 자연 발생적 뉴클레오타이드를 유사체로 치환, 뉴클레오타이드간 변형, 예컨대, 예를 들어, 무극성 결합(예컨대, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트, 등) 및 극성 결합(예컨대, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 등)을 지닌 것들, 부속 모이어티, 예컨대, 예를 들어, 단백질 (예컨대, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩타이드, ply-L-라이신, 등)을 함유한 것들, 삽입물(intercalators, 예컨대, 아크리딘, 소랄렌, 등)을 지닌 것들, 킬레이트제(예컨대, 금속류, 방사성 금속류, 붕소, 산화 금속류, 등)을 함유한 것들, 알킬화반응기(alkylator)를 함유한 것들, 변형 결합(예컨대, 알파 아노머 핵산, 등)을 지닌 것들을 포함할 뿐만 아니라 폴리뉴클레오타이드(들)의 비변형 형태도 포함한다. 더 살펴보면, 당(sugar) 내에 일반적으로 존재하는 모든 하이드록실기는, 예를 들어, 유기인산기, 인산기에 의하여 치환, 표준 보호기에 의하여 보호, 또는 첨가 뉴클레오타이드와 추가적 결합을 형성하여 활성화될 수 있거나, 또 는 고체 지지체와 컨쥬게이션될 수도 있다. 5' 및 3' 말단부 OH는 인산화되거나 또는 아민 또는 탄소수 1 내지 20개의 유기 캡핑기 모이어티로 치환될 수 있다. 그 밖의 하이드록실기는 표준 보호기로 유도될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 리보오스 또는 디옥시리보오스 당의 유사체 형태를 함유할 수 있으며, 예를 들어, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보오스, 카보사이클릭 당 유도체, α-아노머 당, 에피머 당 예컨대, 아라비노스, 자일로스 또는 자이오시스, 피라노오스 당, 퓨라노오스 당, 세도헵툴로시스(sedoheptuloses), 비고리형 유도체 및 비염기성 뉴클레오사이드 유도체 예컨대 메틸 리보사이드를 포함하는 당해 기술 분야에 일반적으로 알려진 것이다. 하나 이상의 포스포디에스테르 결합이 다른 결합기에 의하여 치환될 수 있다.
이러한 다른 결합기는 인산염기가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR`, CO 또는 CH2 ("포름아세탈")로 치환되는 실시태양에 포함하나 이에 한정되지 않으며, 여기서, 각 R 또는 R`는 독립적으로 H이거나, 또는 에테르(-O-) 결합, 아릴, 알케닐, 시클로알킬, ㅅ시클로알케닐 또는 아르알딜(araldyl)을 선택적으로 함유하는 치환 또는 비치환 알킬(1-20C)이다. 폴리뉴클레오타이드 내의 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 전술한 설명은 RNA 및 DNA를 포함한 본 명세서에서 언급된 모든 폴리뉴클레오타이드에 적용된다.
항체의 "가변 영역"은 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역 단독이거나 또는 그 조합을 나타낸다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 고변이 영역으 로 알려진 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의하여 결합된 4개의 기본틀 영역(FR)을 각각 함유하고 있다. 각 사슬 내의 CDR은 FR에 의하여 다른 사슬의 CDR과 매우 근접하게 함께 고정되어 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여하게 된다. 적어도 2종의 CDR 결정 기술이 있다: (1) 종간 서열 변이성에 기초한 방법 (즉, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학상의 연구에 기초한 방법 (Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). 이와 함께, CDR 결정을 위하여 기술 업계에서는 이 두 방법의 조합을 사용하기도 한다.
항체의 "불변 영역"은 항체 경쇄의 불변 영역 또는 항체 중쇄의 불변 영역 단독 또는 이들의 조합을 나타낸다.
항체 또는 폴리펩타이드에 "우선적으로 결합" 또는 "특이적으로 결합"(본 명세서에서 혼용)하는 에피토프라는 용어는 당해 기술 분야에 장 알려진 용어 이며, 이러한 특이적 또는 우선적 결합을 결정하는 방법도 또한 당해 기술 분야에 잘 알려진 것이다. 어떠한 분자가 "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 한다고 알려진다는 것은 상기 분자가 다른 세포 또는 기질 보다 특정 세포 또는 기질에 더 빈번하게, 더 신속하게, 더 오래 지속되거나 및/또는 더 친화도가 높게 반응하거나 또는 결합한다는 의미이다. 표적에 "특이적으로 결합" 또는 "우선적으로 결합"하는 항체는 다른 기질과 결합할 때보다 더 높은 친화도를 지니고, 격렬하게, 더 쉽게 및/또는 더 오랜 지속시간을 가지고 결합한다는 의미이다. 예를 들어, CD26 에피 토프와 "특이적으로 결합" 또는 "우선적으로 결합"하는 항체는 다른 CD26 에피토프 또는 비-CD26 에피토프와 결합할 때보다 더 높은 친화도를 지니고, 격렬하게, 더 쉽게 및/또는 더 오랜 지속시간을 가지고 결합한다. 예를 들어, 본 정의를 통하여, 1차 표적과 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체(또는 모이어티 또는 에피토프)는 2차 표적과는 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수도 안 할 수도 있다는 사실을 이해하여야 한다. 이와 같이, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"이 배타적 결합(비록 이것이 포함된다 하여도)을 필요로 하는 것은 아니다. 필수적인 것은 아니나, 일반적으로 결합에 관한 것은 우선적 결합을 의미한다.
"숙주 세포"는 폴리뉴클레오타이드 삽입체의 통합을 위한 벡터(들)의 수용체가 될 수 있거나 또는 수용체가 된 개별 세포 또는 세포 배양을 포함한다. 숙주 세포 단일 숙주 세포의 자손을 포함하며, 상기 자손은 자연적, 우연적 또는 의도적 돌연변이에 기인한 원형 모세포와 완전하게 일치할 필요는 없다. 숙주 세포 본 발명에 의한 폴리뉴클레오타이드(들)이 생체 내에서 전달 감염된 세포를 포함한다.
"단리된" 폴리펩타이드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 자연상에서 발견되지 않는 폴리펩타이드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포, 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩타이드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물은 자연상에서 발견되는 형태가 더 이상 아닌 것인 정도로 분리된 것들을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 단리된 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 실질적으로 순수하다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "치료"란 유익한 또는 소망하는 임상적 결 과를 얻기 위한 방법이다. 본 발명의 목적을 위하여, 유익한 또는 소망하는 임상적 결과는 탐지 가능한지 탐지 불가능한지 여부를 불문하고 하나 이상의 질병 유관 증상의 완화, 질병 증세의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화가 아님), 질병 진행의 지연 또는 감속, 질병 상태의 개선 또는 경감, 및 진정 (부분적 또는 전체적)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. "치료"는 또한 미치료시의 기대 생존기간에 비하여 연장된 생존기간을 의미한다. 발명의 일 실시 태양에서, 질병의 "치료"는 칠병의 치유를 포괄하나 이에 한정되는 것은 아니다. 발명의 일 실시 태양에서, 증상에 관한 유익한 또는 소망하는 결과는 하나 이상의 하가의 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 증상의 개선, 증상의 치유, 격렬한 증상의 감소, 증상 진행의 지연, 하나 이상의 질병 유관 증상의 완화, 환자 개인의 삶의 질 향상, 및/또는 생존 기간의 연장. 본 명세서에 기재된 조성물이 암 치료용으로 사용되는 이러한 실시 태양에서, 상기 유익한 또는 소망하는 결과는 하나 이상의 하기의 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 종양 또는 암성(cancerous) 세포의 증식의 감소(또는 파괴), 종양 세포의 전이 억제, 종양 크기의 축소, 종양 성장의 억제, 종양의 퇴화, 암의 진정, 암에 의한 증상의 감소, 암 환자의 삶의 질 향상, 암 치효 약제의 복용량 감소, 암 진행의 지연, 및/또는 암 환자의 생존 기간의 연장.
"유효량"은 임상적 결과를 포함하는 유익한 또는 소망하는 임상적 결과에 영향을 미치기 충분한 양이다. 유효량은 일 회 이상의 투여시 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 유효량의 폴리펩타이드, 예컨대 본 명세서에 기재된 항-CD26 항체는 CD26 발현과 관련된 질병의 진행을 개선, 안정화, 역전, 감속 및/또는 지연 시키기 충분한 양이다. 당해 기술 분야에서 이해하고 있는 바와 같이, 예를 들어, 항-CD26 항체의 유효량은 특히, 환자의 병력 및 다른 요인 예컨대, 사용된 항-CD26 항체의 종류(및/또는 복용량)에 따라 달라질 수 있다. 당해 기술 분야의 숙련자에게 있어서 이러한 원칙이 폴리펩타이드의 실시 태양에도 적용된다는 것은 본 명세서에 의하여 명백하다.
"개체," 또는 본 명세서에서 "환자"는 척추 동물, 바람직하게는 포유류, 더 바람직하게는 인간이다. 포유류는 사육 동물 (예컨대 축우), 경주용 동물, 애완 동물(예컨대 고양이, 개, 및 말), 영장류, 마우스 및 레트를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "벡터"는 숙주 세포 내에서 하나 이상의 필요로 하는 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달하고, 바람직하게는 발현하는 구조물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 나체 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온 축합반응제 유관 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀에서 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵 세포, 예컨대 생산자 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체" 또는 "약학적으로 허용가능한 부형제"는 약물 전달시 활성 성분과 혼합되어, 상기 성분이 생물학적 활성을 보유하도록 하고, 환자의 면역 체계와 반응하지 않으면서 환자에게 독성이 없는 모든 물질을 포함한다. 그 예에는 모든 표준 약학적 담체, 예컨대 인산염 버퍼화 식염수 용액, 물, 에멀젼 예컨대 오일/물 에멀젼, 및 다양한 형태의 습윤제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여용으로 바람직한 희석액은 인산염 버퍼화 식염수 또는 생리식염수(0.9%)이다.
이러한 담체를 포함하는 조성물은 잘 알려진 종래의 방법에 의하여 제형화된다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; and Remington, The Science 및 Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000를 참조할 것).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "Koff"라는 용어는 항체/항원 복합체로부터 항체의 해리 속도 상수를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "KD"라는 용어는 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 순수"라는 것은 적어도 50% 순수(즉, 오염이 없는), 더 바람직하게는 적어도 90% 순수, 더 바람직하게는 적어도 95% 순수, 더 바람직하게는 적어도 98% 순수, 더 바람직하게는 적어도 99% 순수한 물질을 나타낸다.
폴리펩타이드
본 발명은 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR), 중쇄 및/또는 경쇄 기본틀 영역 (FR), 및/또는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 (VH 및 VL, 각각)을 포함하는 다양한 신규의 폴리펩타이드를 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 항체이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이 드는 단리된 것이다. 본 발명은 또한 실질적으로 순수한 폴리펩타이드를 포괄한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 항체는 단클론 항체이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 항체는 키메라 항체이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 항체는 인체적응형 항체이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 항체는 인간 항체이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 마우스 단클론 항체가 아니다(즉, 이와 다른 것이다). 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 마우스 단클론 항체가 아니다(즉, 이와 다른 것이다). 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 14D10 항체가 아니다(즉, 이와 다른 것이다) (Dong et al. (1998) MoI Immunol. 35(1):13-21 및 미국 공개출원 제2003/0031665호). 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 14D10 항체의 VH 또는 VL (또는 VH 및 VL 모두) 또는 특정 CDR, FR, CDR의 세트, 또는 FR의 세트를 포함하지 않는다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 14D10 항체의 하나 이상의 CDR 및/또는 하나 이상의 FR을 포함하지 않는다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 14D10 항체의 모든 CDR 및/또는 모든 FR을 포함하지 않는다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 14D10 항체의 VH 및 VL 모두를 포함하지 않는다(상기 14D10 항체의 VH 및 VL, CDR 및 FR은 도 3 및 5에서 동정되었다). 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 중쇄 가변 영역의 서열 QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(CM03 VH; SEQ ID NO:90)을 포함하지 않는다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 경쇄 가변 영역의 서열 DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK (CM03 VL; SEQ ID NO:91)을 포함하지 않는다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 중쇄 가변 영역의 서열 QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHD WFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO: 90) 및 경쇄 가변 영역의 서열 DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO:91)을 포함하지 않는다. 전술한 특징 및 본 명세서에서 기술한 다른 특징들의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 마우스 단클론 항체 1F7이 아니다(미국 등록특허 제5,120,642호; PCT 출원공개번호 제WO 91/07985호(Schlossman et al.); Morimoto et al. (1989) J. Immunology, 143:3430-3439). 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 상기 1F7 항체의 VH 및 VL 모두를 포함하지 않는다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 상기 1F7 항체의 하나 이상의 CDR 및/또는 하나 이상의 FR을 포함하지 않는다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 상기 1F7 항체의 모든 CDR 및/또는 모든 FR을 포함하지 않는다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 친화도 성숙 항체이다. 발명의 일 실시 태양에서, 본 명세서에서 기술한 폴리펩타이드는 항체 사슬, 예컨대 중쇄 또는 경쇄이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리 펩타이드 경쇄 가변 영역을 포함한다(예컨대, 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 경쇄 CDR 및/또는 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 경쇄 FR를 포함하는 경쇄 가변 영역). 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 중쇄 가변 영역을 포함한다(예컨대, 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및/또는 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 경쇄 기본틀 영역(FR)을 포함하는 중쇄 가변 영역). 발명의 일 실시 태양에서, 본 발명은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 모두를 각각 포함하는 폴리펩타이드를 포괄한다. 본 발명은 더 살펴보면, 항체 또는 CD26-결합 폴리펩타이드 합성의 중간체인 폴리펩타이드를 포괄한다.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드, 예컨대 본 명세서에 기술한 항체는 CD26과 결합한다. 발명의 일 실시 태양에서, 본 명세서에 기술한 상기 폴리펩타이드는 우선적으로 CD26과 결합한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드 인간 CD26과 결합한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드 우선적으로 인간 CD26과 결합한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 인간 CD26 및 다른 종의 CD26와 상호반응한다. 발명의 일 실시 태양에서, 본 명세서에서 기술한 폴리펩타이드는 KD가 약 200 nM 이하, 약 60 nM 이하, 약 30 nM 이하, 약 12 nM 이하, 약 6 nM 이하, 또는 약 3 nM, 또는 약 1 nM 이하인 인간 CD26과 결합한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 KD가 약 10 nM 이하인 인간 CD26과 결합한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 KD가 약 6 nM 이하인 인간 CD26과 결합한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드 는 KD가 약 3 nM 이하인 인간 CD26과 결합한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 KD가 약 1 nM 이하인 인간 CD26과 결합한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드(예컨대, 항체)는 KD가 약 0.1 nM to 약 1O nM, 약 0.1 nM 내지 약 6 nM, 약 0.1 nM 내지 약 3 nM, 또는 약 0.1 nM 내지 약 1 nM인 인간 CD26과 결합한다.
발명의 일 실시 태양에서, 본 명세서에 기술한 폴리펩타이드(예컨대, 항체)는YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO:45; 펩타이드 6), LEYNYVKQWRHSY(SEQ ID NO:46; 펩타이드 35), TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO:47; 펩타이드 55), LWWSPNGTFLAYA (SEQ ID NO:48; 펩타이드 84), RISLQWLRRIQNY(SEQ ID NO:49; 펩타이드 132), YVKQWRHSYTASY(SEQ ID NO:50; 펩타이드 37), EEEVFSAYSALWW (SEQ ID NO:51; 펩타이드 79), DYSISPDGQFILL (SEQ ID NO:52; 펩타이드 29), SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO:53; 펩타이드 30), 및 IYVKIEPNLPSYR(SEQ ID NO:54; 펩타이드 63)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드와 결합한다. 발명의 일 실시 태양에서, 본 명세서에서 기술한 폴리펩타이드는 우선적으로 하나 이상의 펩타이드와 결합한다. 이러한 펩타이드는 인간 CD26의 영역이다. 발명의 일 실시 태양에서, 본 명세서에서 기술한 폴리펩타이드는 마우스 단클론 항체 14D10와 동일한 에피토프와 결합한다. 발명의 일 실시 태양에서, 본 명세서에서 기술한 폴리펩타이드는 경쟁 측정법에서 마우스 단클론 항체 14D10와 인간 CD26의 결합을 차단할 수 있다. 발명의 일 실시 태양에서, 본 명세서에서 기술한 폴리펩타이드는 경쟁 측정법에서 마 우스 단클론 항체 1F7과 인간 CD26의 결합을 차단할 수 있다.
친화도 측정 방법은 당해 기술 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 결합 친화도는 BIAcore 바이오센서, KinExA 바이오센서, 섬광 근접 측정법, ELISA, ORIGEN 면역측정법(IGEN), 형광약화, 형광전이, 및/또는 효모 디스플레이를 사용하여 측정될 수 있다. 결합 친화도는 적합한 바이오측정법을 사용하여 선별될 수 있다.
항체와 CD26의 결합 친화도를 측정하는 한 방법은 항체의 단기능 Fab 절편의 친화도를 측정하는 것이다. 단기능 Fab 절편을 얻기 위하여, 항체, 예를 들어, IgGs는 파파인으로 분해되거나 또는 재조합 발현될 수 있다. 단클론 항체의 항-CD26 Fab 절편의 친화도는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 시스템 (BIAcore 3000TM, BIAcore, Inc., Piscaway, NJ)에 의하여 측정될 수 있다. SA 칩(스트렙타비딘)이 공급자의 지시에 따라 사용되었다. 바이오틴화(Biotinylated) CD26는 HBS-EP(100 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% P20)로 희석될 수 있으며, 0.005 mg/mL의 농도로 상기 칩에 주입될 수 있다.
개별 칩 채널 간의 가변 흐름 시간법을 사용하여 ,두 범위의 항원 밀도를 달성하였다: 면밀한 역동학 연구를 위한 10-20 반응 유닛(RU) 및 농도를 위한 500-600 RU. 관통 유출 용매(Pierce elution 버퍼) 및 4 M NaCl(2:1) 혼합물은 칩 상에 200회 이상의 주입하는 동안 CD26의 활성이 유지되도록 하면서 결합된 Fab를 효과적으로 제거한다. HBS-EP 버퍼는 모든 BIAcore 측정법을 위한 런닝 버퍼로 사용된다. 분리된 Fab 시편의 계단 희석(0.1-lOx 측정된 KD)이 100 ㎕/min으로 2분간 주입되고, 30분 까지의 해리 시간이 허용된다. Fab 단백질의 농도는 농도를 아는 표준 Fab를 사용하여 ELISA 및/또는 SDS-PAGE 전기영동에 의하여 측정될 수 있다(아미노산 분석에 의한 측정). 동적 결합 속도(Kon) 및 해리 속도 (koff)는 BIAevaluation 프로그램을 사용하여 1:1 랑뮈르(Langmuir) 결합 모델(Lofas & Johnsson, 1990)에 데이터를 일치시켜 동시에 측정할 수 있다. 평형 해리 상수(KD) 값은 Koff/Kon으로 계산되었다.
발명의 일 실시 태양에서, 본 발명은 폴리펩타이드, 예컨대 CD26 발현 세포의 증식을 억제하는 항체를 포괄한다. 본 발명은 상기 폴리펩타이드가 CD26 발현(예컨대, T-세포 악성 종양)과 관련된 증상(예컨대, 질병 또는 장애)의 치료용으로 유용한 실시 태양을 포괄한다.
발명의 일 실시 태양에서, 본 발명의 상기 폴리펩타이드(예컨대, 항체)는 하나 이상의 하기의 특징을 가질 수 있다: (a) CD26과 결합; (b) CD26 활성의 조절; (c) Gl/S 체크포인트에서 CD26+ 세포의 세포 주기 정지를 유도; (d) CD26 발현 세포의 증식을 억제, 및/또는 (e) CD26 발현과 관련된 질병의 치료에 유용함. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 CD26-발현 종양 성장의 억제, CD26-발현 종양 퇴화의 유도, 및/또는 CD26 발현 암 세포의 전이 억제에 유용하다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현과 관련된 질병은 CD26 과다 발현과 관련된 질병 또는 장애이다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현과 관련된 질병은 적어도 부분적으로, CD26에 의하여 중재된다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현과 관련 된 질병은 CD26 발현 세포의 증식과 관련된 질병이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 질병 또는 장애는 암(예컨대, 고형 종양, 췌장암, 신장암, 또는 림프종), 자가면역 질환 또는 장애, 이식편 대 숙주 질환(GVHD), 또는 염증 질병 또는 장애이다.
본 발명의 일 특징으로서, 본 발명은 본 명세서에 기술한 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6)의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 본 명세서에 기술한 하나 이상(예컨대, 1, 2, 또는 3)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및/또는 본 명세서에 기술한 하나 이상(예컨대, 1, 2, 또는 3)의 경쇄 CDR을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명의 일 특징으로서, 상기 폴리펩타이드는 본 명세서에 기술한 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 또는 4)의 중쇄 기본틀 영역(FR) 및/또는 본 명세서에 기술한 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 또는 4)의 경쇄 FR 를 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 본 명세서에 기술한 하나 이상(예컨대, 1, 2, 또는 3)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 본 명세서에 기술한 하나 이상(예컨대, 1, 2, 또는 3)의 경쇄 CDR 을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명의 또 다른 특징으로서, 상기 중쇄 가변 영역은 본 명세서에 기술한 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 또는 4)의 중쇄 기본틀 영역(FR)을 추가로 포함하며 및/또는 상기 경쇄 가변 영역은 본 명세서에 기술한 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 또는 4)의 경쇄 FR을 추가로 포함한다.
"중쇄 CDR(들)" 또는 "경쇄 CDR(들)"이라는 표현은 이러한 CDR의 실시 태양 이 중쇄 또는 경쇄 내에 각각 함유되어 있다는 것을 의미하지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 이러한 용어는 이들의 기원을 적시하기 위하여 편의상 사용하는 것이다. 본 발명은, 그러나, 하나 이상의 CDR이 (a) 중쇄 가변 영역(들) 및/또는 경쇄 가변 영역(들), 및/또는 (b) 중쇄(들) 및/또는 경쇄(들) 내에 함유되어 있는 실시 태양을 포함한다. 동일한 원칙이 기본틀 지정시에 적용된다.
본 발명은 하기의 것들을 포함하는 폴리펩타이드, 예컨대 항체를 제공한다: (a) (i) GFSLTTYGVH(SEQ ID NO:55), GFSLSTYGVH(SEQ ID NO:56), 및 GYSLTTYGVH(SEQ ID NO:57)로 구성되는 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1 (ii) VIWGDGRTDYDAAFMS(SEQ ID NO:58) 및 VI WGDGRTD YDS SFMS(SEQ ID NO:59)로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2, 및 (iii) 중쇄 CDR3 서열 NRHDWFDY(SEQ ID NO:60)로 구성되는 군으로부터 선택된 CDR와 적어도 약 80%가 각각 동일한 하나 이상(예컨대, 1, 2, 또는 3)의 중쇄 CDR; 및/또는 (b) (i) RASQDIRNNLN(SEQ ID NO:61), RASQGIRNNLN(SEQ ID NO:62), 및 SASQDIRNSLN(SEQ ID NO:63)로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1, (ii) YSSNLHS(SEQ ID NO:64), YSSNLQS(SEQ ID NO:65) 및 YSSNLHT(SEQ ID NO:66)로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2, 및 (iii) QQSIKLPLT(SEQ ID NO:67), QQSIKLPFT(SEQ ID NO:68), 및 QQSNKLPLT(SEQ ID NO:69)로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 CDR3로 구성되는 군으로부터 선택된 CDR와 적어도 약 80%가 각각 동일한 하나 이상(예컨대, 1, 2, 또는 3)의 경쇄 CDR. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 CDR(들)은 적시한 서열(들)과 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 일치한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 CD26과 결합한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 마우스 단클론 항체가 아니다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 것들을 포함하는 항체이다: (i) GFSLTTYGVH(SEQ ID NO:55)와 적어도 약 80% 일치하는 중쇄 CDR1, (ii) VIWGDGRTDYDAAFMS(SEQ ID NO:58)와 적어도 약 80% 일치하는 중쇄 CDR2, 및 (iii) NRHDWFDY(SEQ ID NO:60)와 적어도 약 80% 일치하는 중쇄 CDR3. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 것들을 포함하는 항체이다: (i) RASQGIRNNLN(SEQ ID NO:62)와 적어도 약 80% 일치하는 경쇄 CDR1, (ii) YSSNLQS(SEQ ID NO:65)와 적어도 약 80% 일치하는 경쇄 CDR2, 및 (iii) QQSIKLPFT(SEQ ID NO:68)와 적어도 약 80% 일치하는 경쇄 CDR3.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 하나 이상(예컨대, 1, 2, 또는 3)의 CDR을 포함하며, 여기서,각각의 CDR은 도 5에 나타낸 중쇄 가변 영역(VH) X384, X385, X386, X387, X388, X399, 또는 X420의 CDR을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드은 하나 이상(예컨대, 1, 2, 또는 3)의 CDR을 포함하며, 여기서,각각의 CDR는 도 3에 나타낸 경쇄 가변 영역 (VL)의 서열 X376, X377, X378, X379, X380, X381, 또는 X394의 CDR을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 하나 이상의 CDR은 각각 도 3 또는 5에 나타낸 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3이다(예컨대, CDR-Ll, CDR-L2, CDR-L3, CDR-Hl, CDR-H2, 및/또는 CDR-H3). 일부 실시 태양에는 도 5에 나타낸 중쇄 가변 영역(VH) 서열 X384, X385, X386, X387, X388, X399, 또는 X420의 하나 이상의 CDR, 및 도 3에 나타낸 경쇄 가변 영역 서열 X376, X377, X378, X379, X380, X381, 또는 X394의 하나 이상의 CDR을 포함하는 폴리펩타이드(예컨대 항체)를 포함한다
발명의 일 실시 태양에서, 본 발명은 도 5에 나타낸 VH 서열 X384, X385, X386, X387, X388, X399, 또는 X420 또는 도 3에 나타낸 경쇄 가변 영역(VL) 서열 X376, X377, X378, X379, X380, X381, 또는 X394의 적어도 하나 이상 CDR, 적어도 2개의 CDR, 또는 적어도 3개의 CDR과 적어도 약 80%가 일치하는 적어도 하나 이상 CDR을 포함하는 폴리펩타이드, 예컨대 항체를 제공한다.
다른 실시 태양에서는 도 5에서 나타낸 VH 서열 X384, X385, X386, X387, X388, X399 또는 X420, 또는 도 3에서 나타낸 VL 서열 X376, X377, X378, X379, X380, X381 또는 X394의 적어도 2 또는 3개의 CDR과 적어도 약 80% 일치하는 적어도 2 또는 3개의 CDR(들)을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 도 5 또는 3에서 나타낸 VH 또는 VL의 적어도 하나 이상 CDR, 적어도 2개, 또는 적어도 3개 CDR과 실질적으로 균질한 하나 이상의 CDR은 VH 또는 VL로서 도 5에 나타낸 서열 X384, X385, X386, X387, X388, X399, 또는 X420 또는 도 3에 나타낸 서열 X376, X377, X378, X379, X380, X381, 또는 X394의 적어도 하나 이상, 적어도 2, 또는 적어도 3개의 CDR과 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 일치한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 CDR은 CDR-Ll, CDR-L2, CDR-L3, CDR-Hl, CDR-H2, 및/또는 CDR-H3이다.
CDR의 결정법은 당해 기술 분야의 범위 내에 있다. 발명의 일 실시 태양에 서, 상기 CDR은 카밧(Kabat) CDR이다. 본 발명의 다른 실시 태양에서, 상기 CDR은 초시아(Chothia) CDR이다. 다른 실시 태양으로서, 하나 이상의 CDR은 카밧 및 초시아 정의의 조합으로 정의된다.
본 발명의 일 특징으로서, 본 발명은 하기의 것들을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다: (a) 서열 GX1X2LX3TYGVH(SEQ ID NO:31)포함하는 중쇄 CDR1, 여기서, X1은 F 또는 Y, X2는 S 또는 T, 및 X3는 T, N, 또는 S이며; (b) 서열 VIWGX1GRTDYDX2X3FMS(SEQ ID NO:32)를 포함하는 중쇄 CDR2, 여기서, X1은 G 또는 D, X2는 A 또는 S, 및 X3는 A 또는 S이며; 및/또는 (c) 서열 X1RHDWFDY(SEQ ID NO:33)를 포함하는 중쇄 CDR3, 여기서, X1은 N 또는 S이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 CDR1을 포함한다. 본 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 CDR2를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 CDR3를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 CDR1, CDR2, 및 CDR3를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 경쇄 가변 영역(예컨대, 본 명세서에 기술한 경쇄 가변 영역)를 추가로 포함한다.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 (i) 서열 GX1X2LX3TYGVH(SEQ ID NO:31)를 포함하는 CDR1, 여기서, X1은 F 또는 Y, X2는 S 또는 T, 및 X3는 T, N, 또는 S이며; (ii) 서열 VIWGX1GRTDYDX2X3FMS(SEQ ID NO:32)를 포함하는 CDR2, 여기서, X1은 G 또는 D, X2는 A 또는 S, 및 X3는 A 또는 S이며; 및 (iii) 서열 X1RHDWFDY(SEQ ID NO:33)를 포함하는 CDR3, 여기서, X1은 N 또는 S인 중쇄 CDR을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 GFSLTTYGVH(SEQ ID NO:55), GFSLSTYGVH(SEQ ID NO:56), 및 GYSLTTYGVH(SEQ ID NO:57)로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 중쇄 CDR1을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 VIWGDGRTDYDAAFMS(SEQ ID NO:58) 및 VIWGDGRTDYDSSFMS(SEQ ID NO:59)로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 중쇄 CDR2을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 서열 NRHDWFDY(SEQ ID NO:60)을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 중쇄 CDR(들)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
다시 말하자면, 본 발명의 특징 또는 실시 태양은 마쿠쉬 군 또는 다른 대안 군으로 기술되어있기 때문에, 본 발명은 열거된 전체 군과 군 내의 개별적인 각 요소들, 가능한 모든 하위군뿐만 아니라, 하나 이상의 군 요소가 부재한 주요 군을 모두 포괄한다. 본 발명은 또한 청구항 내에서 하나 이상의 군 요소의 명백한 배제를 감안하여야 한다.
발명의 일 실시 태양에서,
상기 폴리펩타이드는 하기의 것들을 포함하는 중쇄 CDR를 포함한다: (a) 서열 GFSLTTYGVH(SEQ ID NO:55)를 포함하는 CDR1; (b) 서열 VIWGDGRTDYDAAFMS(SEQ ID NO:58)를 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 NRHDWFDY(SEQ ID NO:60)를 포함하는 CDR3. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 것들을 포함하는 중쇄 CDR를 포함한다: (a) 서열 GFSLSTYGVH(SEQ ID NO:56)포함하는 CDR1; (b) 서열 VIWGDGRTDYDAAFMS(SEQ ID NO:58)를 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 NRHDWFDY(SEQ ID NO:60)를 포함하는 CDR3. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 것들을 포함하는 중쇄 CDR를 포함한다: (a) 서열 GYSLTTYGVH(SEQ ID NO:57)를 포함하는 CDR1; (b) 서열 VIWGDGRTDYDSSFMS(SEQ ID NO:59)를 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열 NRHDWFDY(SEQ ID NO:60)를 포함하는 CDR3. 전술한 각각의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 특이적 CDR1, CDR2, 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 하기의 것들을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다: (a) 서열 X1ASQX2IRNX3LN(SEQ ID NO:34)를 포함하는 경쇄 CDR1, 여기서, X1은 S 또는 R, X2는 G 또는 D, 및 X3는 S 또는 N이며; (b) 서열 YSSNLX1X2(SEQ ID NO:35)를 포함하는 경쇄 CDR2, 여기서, X1은 H 또는 Q 및 X2는 S 또는 T; 및/또는 (c) 서열 QQSX1KLPX2T(SEQ ID NO:36)를 포함하는 경쇄 CDR3, 여기서, X1은 I 또는 N 및 X2는 F 또는 L. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이 드는 항체이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 상기 CDR1을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 상기 CDR2를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 상기 CDR3를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 상기 CDR1, CDR2, 및 CDR3를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 상기 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 중쇄 가변 영역을 추가로 포함한다 (예컨대, 본 명세서에서 기술한 중쇄 가변 영역).
발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 것들을 포함하는 경쇄 CDR을 포함한다: (i) 서열 X1ASQX2IRNX3LN(SEQ ID NO:34)포함하는 CDR1, 여기서, X1은 S 또는 R, X2는 G 또는 D, 및 X3는 S 또는 N이며; (ii) 서열 YSSNLX1X2(SEQ ID NO:35)를 포함하는 CDR2, 여기서, X1은 H 또는 Q 및 X2는 S 또는 T; 및 (iii) 서열 QQSX1KLPX2T(SEQ ID NO:36)를 포함하는 CDR3, 여기서, X1은 I 또는 N 및 X2는 F 또는 L. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 RASQDIRNNLN(SEQ ID NO:61), RASQGIRNNLN(SEQ ID NO:62), 및 SASQDIRNSLN(SEQ ID NO:63)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 YSSNLHS(SEQ ID NO:64), YSSNLQS(SEQ ID NO:65) 및 YSSNLHT(SEQ ID NO:66)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 QQSIKLPLT(SEQ ID NO:67), QQSIKLPFT(SEQ ID NO:68), 및 QQSNKLPLT(SEQ ID NO:69)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 것들을 포함하는 경쇄 CDR을 포함한다: (a) 서열 RASQDIRNNLN(SEQ ID NO:61)를 포함하는 CDR1, (b) 서열 YSSNLHS(SEQ ID NO:64)를 포함하는 CDR2, 및 (c) 서열 QQSIKLPLT(SEQ ID NO:67)를 포함하는 CDR3. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 것들을 포함하는 경쇄 CDR을 포함한다: (a) 서열 RASQGIRNNLN(SEQ ID NO:62)포함하는 CDR1, (b) 서열 YSSNLQS(SEQ ID NO:65)를 포함하는 CDR2, 및 (c) 서열 QQSIKLPFT(SEQ ID NO:68)를 포함하는 CDR3. 다른 실시 태양에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 것들을 포함하는 경쇄 CDR을 포함한다: (a) 서열 SASQDIRNSLN(SEQ ID NO:63)포함하는 CDR1, (b) 서열 YSSNLHT(SEQ ID NO:66)를 포함하는 CDR2, 및 (c) 서열 QQSNKLPLT(SEQ ID NO:69)를 포함하는 CDR3. 전술한 각각의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 특이적 CDR1, CDR2, 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 것들을 포함한다: (a) 서열 GFSLTTYGVH(SEQ IDNO:55)포함하는 CDR1, (b) 서열 VIWGDGRTDYDAAFMS(SEQ ID NO:58)를 포함하는 CDR2, 및 (c) 서열 NRHDWFDY(SEQ ID NO:60)를 포함하는 CDR3을 포함하는 중쇄 CDR 및/또는 (a) 서열 RASQGIRNNLN(SEQ ID NO:62)포함하는 CDR1, (b) 서열 YSSNLQS(SEQ ID NO:65)를 포함하는 CDR2, 및 (c) 서열 QQSIKLPFT(SEQ ID NO:68)를 포함하는 CDR3을 포함하는 경쇄 CDR. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 항체이다.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 서열 GX1X2LX3TYGVH(SEQ ID NO:31)를 포함하는 중쇄 CDR1, 여기서, X1은 F 또는 Y, X2는 S 또는 T, 및 X3는 T, N, 또는 S이고, 서열 VIWGX1GRTDYDX2X3FMS(SEQ ID NO:32)를 포함하는 중쇄 CDR2, 여기서, X1은 G 또는 D, X2는 A 또는 S, 및 X3는 A 또는 S이고, 및/또는 서열 X1RHDWFDY(SEQ ID NO:33)를 포함하는 중쇄 CDR3, 여기서, X1은 N 또는 S인 것을 포함하며, 및 서열 X1ASQX2IRNX3LN(SEQ ID NO:34)를 포함하는 경쇄 CDR1, 여기서, X1은 S 또는 R, X2는 G 또는 D, 및 X3는 S 또는 N이고, 서열 YSSNLX1X2(SEQ ID NO:35)를 포함하는 경쇄 CDR2, 여기서, X1은 H 또는 Q 및 X2는 S 또는 T이고, 및/또는 서열 QQSX1KLPX2T(SEQ ID NO:36)를 포함하는 경쇄 CDR3, 여기서, X1은 I 또는 N 및 X2는 F 또는 L인 것을 추가로 포함한다. 예를 들면, 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 3종의 중쇄 CDR인 CDR1, CDR2, 및 CDR3와 3종의 경쇄 CDR인 CDR1, CDR2, 및 CDR3를 포함한다.
본 발명은 또한 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 CDR을 포함하는 폴리펩타이드를 포괄하며, 여기서,상기 폴리펩타이드 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 FR을 추가로 포함한다.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 CDR 및/또는 FR은 서열 순이다.
본 발명은 본 명세서에서 기술한 하나 이상(예컨대, 1, 2, 또는 3)의 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 추가로 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 중쇄 가변 영역은 본 명세서에서 기술한 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 또는 4)의 중쇄 FR을 를 추가로 포함한다. 이와 함께, 본 발명은 본 명세서에서 기술한 하나 이상(예컨대, 1, 2, 또는 3)의 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 경쇄 가변 영역은 본 명세서에서 기술한 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 또는 4)의 경쇄 FR을 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 중쇄 기본틀 영역(FR) 및/또는 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 경쇄 기본틀 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 본 명세서에서 기술하는 하나 이상의 중쇄 FR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 경쇄 FR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 또는 4)의 FR을 포함하며, 여기서, 각 FR은 도 5에 나타낸 중쇄 가변 영역(VH)인 서열 X384, X385, X386, X387, X388, X399, 또는 X420의 FR이다. 발명의 일 실시 태양에서, 도 5의 중쇄 가변 영역의 FR은 FRl, FR2, FR3, 또는 FR4이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 또는 4)의 FR을 포함하며, 여기서,각 FR은 도 3에 나타낸 경쇄 가변 영역(VL)인 서열 X376, X377, X378, X379, X380, X381, 또는 X394의 FR이다. 발명의 일 실시 태양에서, 도 3의 경쇄 가변 영역의 FR은 FRl, FR2, FR3, 또는 FR4이다. 일 실시 태양은 도 5에 나타낸 중쇄 가변 영역(VH) 서열 X384, X385, X386, X387, X388, X399, 또는 X420 중의 하나 이상의 FR 및 도 3에 나타낸 경쇄 가변 영역 서열 X376, X377, X378, X379, X380, X381, 또는 X394 중의 하나 이상의 FR을 포함하는 폴리펩타이드(예컨대, 항체)를 포함한다.
발명의 일 실시 태양에서, 본 발명은 도 5에서 나타낸 VH인 서열 X384, X385, X386, X387, X388, X399, 또는 X420, 또는 도 3에서 나타낸 VL인 서열 X376, X377, X378, X379, X380, X381, 또는 X394 중의 적어도 하나 이상 FR, 적어도 2개의 FR, 적어도 3개의 FR, 또는 적어도 4개의 FR과 실질적으로 균질한 적어도 하나 이상 FR을 포함하는 폴리펩타이드 (예컨대 항체)를 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 도 5 또는 3에 나타낸 VH 또는 VL의 적어도 하나 이상 FR, 적어도 2개, 적어도 3개의, 또는 적어도 4개의 FR과 실질적으로 균질한 하나 이상의 FR은 VH 또는 VL로서 도 5에 나타낸 서열 X384, X385, X386, X387, X388, X399, 또는 X420 또는 도 3에 나타낸 서열 X376, X377, X378, X379, X380, X381, 또는 X394의 적어도 하나 이상, 적어도 2개, 적어도 3개의, 또는 적어도 4개의 FR과 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 일치한다.
본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 하기의 것들을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다: (a) 서열 EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9AS(SEQ ID NO:37)를 포함하는 중쇄 FRl, 여기서, X1은 E 또는 Q, X2는 A 또는 G, X3는 G 또는 E, X4는 L 또는 V, X5는 V, K, 또는 E, X6는 G 또는 E, X7은 T 또는 S, X8은 T 또는 S, 및 X9은 T 또는 K이며; (b) 서열 WVRQAPGKGLEWX1G(SEQ ID NO:38)를 포함하는 중쇄 FR2, 여기서, X1은 V 또는 M이고; (c) 서열 RVTISX1DX2SKX3TX4YLQX5NSLRAEDTAVYYCX6R(SEQ ID NO:39)를 포함하는 중쇄 FR3, 여기서, X1은 K 또는 R, X2는 N 또는 T, X3는 S 또는 N, X4는 V 또는 A, X5는 M 또는 L, 및 X6는 V, M, 또는 T이며; 및/또는 (d) 서열 WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:40)를 포함하는 중쇄 FR4. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 상기 FR1을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 상기 FR2을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 상기 FR3를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 상기 FR1, FR2, FR3, 및 FR4 을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 FRl, FR2, FR3, 및/또는 FR4을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드 경쇄 가변 영역를 추가로 포함한다.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 서열 EVQLVESGAGVKQPGGTLRLTCTAS(SEQ ID NO:70), EVQLVQSGGGVKQPGETLRLTCTAS(SEQ ID NO:71), EVQLVQSGGGLKQPGETLRLSCTAS(SEQ ID NO:72), 또는 EVQLVESGGGVKQPGETLRLTCTAS (SEQ ID NO:73)를 포함하는 중쇄 FRl을 포함한다. 본 발명의 다른 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 서열 WVRQAPGKGLEWVG (SEQ ID NO:74) 또는 WVRQAPGKGLEWMG (SEQ ID NO:75)를 포함하는 중쇄 FR2를 포함한다. 본 발명의 다른 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 서열 RVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMR(SEQ ID NO:76), RVTISKDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCMR(SEQ ID NO:77), 또는 RVTISKDTSKSTAYLQLNSLRAEDTAVYYCTR(SEQ ID NO:78)를 포함하는 중쇄 FR3를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 서열 WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:40)를 포함하는 중쇄 FR4를 포함한다.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 FR들을 포함하는 중쇄 기본틀 영역을 포함한다: (a) 서열 EVQLVESGAGVKQPGGTLRLTCTAS(SEQ ID NO:70)를 포함하는 FRl, (b) 서열 WVRQAPGKGLEWVG(SEQ ID NO:74)를 포함하는 FR2, (c) 서열 RVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMR(SEQ ID NO:76)를 포함하는 FR3, 및 (d) 서열 WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:40)를 포함하는 FR4. 본 발명의 다른 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 FR들을 포함하는 중쇄 기본틀 영역을 포함한다: (a) 서열 EVQLVQSGGGVKQPGETLRLTCTAS(SEQ ID NO:71)를 포함하는 FRl, (b) 서열 WVRQAPGKGLEWVG(SEQ ID NO:74)를 포함하는 FR2, (c) 서열 RVTISKDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCMR(SEQ ID NO:77)를 포함하는 FR3, 및 (d) 서열 WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:40)를 포함하는 FR4. 본 발명의 또 다른 실시 상태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 FR들을 포함하는 중쇄 기본틀 영역을 포함한다: (a) 서열 EVQLVQSGGGLKQPGETLRLSCTAS(SEQ ID NO:72)를 포함하는 FRl, (b) 서열 WVRQAPGKGLEWMG(SEQ ID NO:75)를 포함하는 FR2, (c) 서열 RVTISKDTSKSTAYLQLNSLRAEDTAVYYCTR(SEQ ID NO:78)를 포함하는 FR3, 및 (d) 서열 WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:40)를 포함하는 FR4. 또 다른 실시 상태에서는, 상기 폴리펩타이드는 하기의 FR들을 포함하는 중쇄 기본틀 영역을 포함한다: (a) 서열 EVQLVESGGGVKQPGETLRLTCTAS(SEQ ID NO:73)를 포함하는 FRl, (b) 서열 WVRQAPGKGLEWVG(SEQ ID NO:74)를 포함하는 FR2, (c) 서열 RVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMR(SEQ ID NO:76)를 포함하는 FR3, 및 (d) 서열 WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:40)를 포함하는 FR4. 발명의 일 실시 태양에서, 중쇄 기본틀 영역은 중쇄 가변 영역 내에 포함되어 있다.
본 발명의 추가적인 특징으로서, 본 발명은 (a) 서열 X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9C(SEQ ID NO:41)를 포함하는 경쇄 FR1, 여기서, X1은 D 또는 E, X2는 L 또는 E, X3는 M 또는 L, X4는 A 또는 V, X5는 S 또는 T, X6는 L, P, 또는 A, X7은 D 또는 E, X8은 V 또는 A, 및 X9는 T 또는 S이고; (b) 서열 WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO: 42)를 포함하는 경쇄 FR2; (c) 서열 GVPX1RFSGSGSGTDFTLTISRLX2X3EDX4AX5YYC(SEQ ID NO: 43)를 포함하는 경쇄 FR3, 여기 서, X1은 S, D, 또는 A3 X2는 E 또는 Q, X3는 P 또는 A, X4는 F 또는 V, 및 X5는 T, A, 또는 I이며; 및/또는 (d) 서열 FGSGTKVEIK(SEQ ID NO:44)를 포함하는 경쇄 FR4를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 상기 FR1을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 상기 FR2을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 상기 FR3을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 상기 FR4을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 상기 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 상기 FRl, FR2, FR3, 및/또는 FR4을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 중쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 서열 DILMTQSPSSLSASPGDRVTISC(SEQ ID NO:79), DILLTQSPSSLSATPGERATITC(SEQ ID NO:80), 또는 EIEMTQSPSSLSVSAGERATISC(SEQ ID NO:81)를 포함하는 경쇄 FR1를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 서열 WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO:42)를 포함하는 경쇄 FR2를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 서열 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAAYYC(SEQ ID NO:82), GVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDVAAYYC(SEQ ID NO:83), 또는 GVPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDVAIYYC(SEQ ID NO:84)를 포함하는 경쇄 FR3를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 서열 FGSGTKVEIK(SEQ ID NO:44)를 포함하는 경쇄 FR4를 포함한다.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 FR을 포함하는 경쇄 기본틀 영역을 포함한다: (a) 서열 DILMTQSPSSLSASPGDRVTISC(SEQ ID NO:79)를 포함하는 FRl, (b) 서열 WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO:42)를 포함하는 FR2, (c) 서열 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAAYYC(SEQ ID NO:82)를 포함하는 FR3, 및 (d) 서열 FGSGTKVEIK (SEQ ID NO:44)를 포함하는 FR4. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 FR을 포함하는 경쇄 기본틀 영역을 포함한다: (a) 서열 DILLTQSPSSLSATPGERATITC(SEQ ID NO:80)를 포함하는 FRl, (b) 서열 WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO:42)를 포함하는 FR2, (c) 서열 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPED VAAYYC(SEQ ID NO:83)를 포함하는 FR3, 및 (d) 서열 FGSGTKVEIK (SEQ ID NO:44)를 포함하는 FR4. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 FR을 포함하는 경쇄 기본틀 영역을 포함한다: (a) 서열EIEMTQSPSSLSVSAGERATISC(SEQ ID NO:81)를 포함하는 FRl, (b) 서열 WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO:42)를 포함하는 FR2, (c) 서열 GVPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDVAIYYC(SEQ ID NO:84)를 포함하는 FR3, 및 (d) 서열 FGSGTKVEIK (SEQ ID NO:44)를 포함하는 FR4. 발명의 일 실시 태양에서, 경쇄 기본틀 영역은 경쇄 가변 영역 내에 있다.
본 발명은 본 명세서에서 기술한 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 또는 4)의 중쇄 FR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 추가로 제공한다. 이와 함께, 본 발명은 또한 본 명세서에서 기술한 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 또는 4)의 경쇄 FR 을 포함하는 경쇄 가변 영역을 제공한다.
본 발명은 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 중쇄 가변 영역 및/또는 본 명세서에서 기술한 하나의 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 추가로 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 중쇄 CDR를 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 중쇄 FR을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 경쇄 CDR 및/또는 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 경쇄 FR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 아미노산 서열 EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX1OX11LX12TYGVHWVRQAPGKGLEWX13GVIWGX14GRTDYDX15X16FMSRVTISX17DX18SKX19TX2OYLQX21NSLRAEDTAVYYCX22RX23RHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:29)를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서, X1은 E 또는 Q, X2는 A 또는 G, X3는 G 또는 E, X4는 L 또는 V, X5는 V, K, 또는 E, X6는 G 또는 E, X7은 T 또는 S, X8은 T 또는 S, X9는 T 또는 K, X10은 F 또는 Y, X11은 S 또는 T, X12는 T, N, 또는 S, X13은 V 또는 M, X14은 G 또는 D, X15은 A 또는 S, X16은 A 또는 S, X17은 K 또는 R, X18은 N 또는 T, X19은 S 또는 N, X20은 V 또는 A, X21은 M 또는 L, X22는 V, M, 또는 T, 및 X23은 N 또는 S이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 서열 EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX1OX11LX12TYGVHWVRQAPGKGLEWX13GVIWGX14GRTDYDX15X16FMSRVTISX17DX18SKX19TX2OYLQX21NSLRAEDTAVYYCX22RX23RHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:29)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서, X1은 E 또는 Q, X2는 A 또는 G, X3는 G 또는 E, X4는 L 또는 V, X5는 V, K, 또는 E, X6는 G 또는 E, X7은 T 또는 S, X8은 T 또는 S, X9은 T 또는 K, X10은 F 또는 Y, X11은 S 또는 T, X12는 T, N, 또는 S, X13은 V 또는 M, X14은 G 또는 D, X15은 A 또는 S, X16은 A 또는 S, X17은 K 또는 R, X18 은 N 또는 T, X19은 S 또는 N, X2O은 V 또는 A, X21은 M 또는 L, X22는 V, M, 또는 T, 및 X23은 N 또는 S이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 항체이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.
상기 중쇄 가변 영역의 CDR(CDR1, CDR2, 및 CDR3)을 다음의 서열 내에서 밑줄로 표시하였다(그리고 서열순으로 배열):
EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX 1O X 11 LX 12 TYGVHWVRQAPGKGLEWX13GVIWGX 14 GRTDYDX 15 X 16 FMSRVTISX17DX18SKX19TX2OYLQX21NSLRAEDTAVYYCX 22 RX 23 RHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:29), 여기서, X1은 E 또는 Q, X2는 A 또는 G, X3는 G 또는 E, X4는 L 또는 V, X5 는 V, K, 또는 E, X6는 G 또는 E, X7은 T 또는 S, X8은 T 또는 S, X9은 T 또는 K, X10은 F 또는 Y, X11은 S 또는 T, X12는 T, N, 또는 S, X13은 V 또는 M, X14은 G 또는 D, X15은 A 또는 S, X16은 A 또는 S, X17은 K 또는 R, X18은 N 또는 T, X19은 S 또는 N, X20은 V 또는 A, X21은 M 또는 L, X22는 V, M, 또는 T, 및 X23은 N 또는 S이다. 중쇄 가변 영역의 CDR2 및 CDR3(CDR-H2 및 CDR-H3)는 카밧 정의(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th edit., National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987))에 따라 정의되었다. 중쇄 가변 영역의 CDR1(CDR-Hl) 카밧 및 초시아 정의(Chothia et al., J MoI. Biol, 196:901-917)의 조합에 따라 정의되었다. 이러한 항체 CDR 정의 방법은 당해 기술 업계에 잘 알려져 있다. 예컨대, Chen et al., J. MoI. Biol, 293:865-881 (1999) 및 Muller et al., 구조, 6:1153-1167 (1998)를 참조할 것. SEQ ID NO:295에 나타낸 서열 내에서, 카밧 계수법에 의하면 CDR1의 위치는 H26-35, CDR2의 위치는 H50-65, 및 CDR3의 위치는 H95-102이다. 순차 계수법에 따르면, CDR1의 위치는 H26-35, CDR2의 위치는 H50-65, 및 CDR3의 위치는 H98-105이다. (예컨대, 예시된 중쇄 가변 영역 서열 상의 중쇄 가변 영역의 CDR 및 FR의 도시를 위한 도 5를 참조할 것)
발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 서열 EVQLVESGAGVKQPGGTLRLTCTASGFSLTTYGVHWVRQAPGKGLEWVGVIWGDGRTDYDAAFMSRVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:22; X384), EVQLVQSGGGVKQPGETLRLTCTASGFSLTTYGVHWVRQAPGKGLEWVGVIWGDGRTDYDAAFMSRVTISKDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCMRNRHDWFDYWGQGTTVT VSS(SEQ ID NO:23; X385), EVQLVQSGGGLKQPGETLRLSCTASGYSLTTYGVHWVRQAPGKGLEWMGVIWGDGRTDYDSSFMSRVTISKDTSKSTAYLQLNSLRAEDTAVYYCTRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:26; X388), 및 EVQLVESGGGVKQPGETLRLTCTASGFSLSTYGVHWVRQAPGKGLEWVGVIWGDGRTDYDAAFMSRVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMRNRHDWFDYWGQGTTVT VSS(SEQ ID NO:28; X420)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드(예컨대, 항체)는 SEQ ID NO:22(X384), SEQ ID NO:23(X385), SEQ ID NO:26(X388), 및 SEQ IDNO:28(X420)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 부가적인 특징으로서, 본 발명은 서열 X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9CX1OASQX11IRNX12LNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLX13X14GVPX15RFSGSGSGTDFTLTISRLX16X17EDX18AX19YYCQQSX2OKLPX21TFGSGTKVEIK(SEQ ID NO:30)을 포함하는 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서, X1은 D 또는 E, X2는 L 또는 E, X3는 M 또는 L, X4는 A 또는 V, X5는 S 또는 T, X6는 L, P, 또는 A, X7은 D 또는 E, X8은 V 또는 A, X9은 T 또는 S, X1O은 S 또는 R, X11은 G 또는 D, X12는 S 또는 N, X13은 H 또는 Q, X14은 S 또는 T, X15은 S, D, 또는 A, X16은 E 또는 Q, X17은 P 또는 A, X18은 F 또는 V, X19은 T, A, 또는 I, X20은 I 또는 N 및 X21은 F 또는 L이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는
X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9CX1OASQX11IRNX12LNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLX13X14GVPX15RFSGSGSGTDFTLTISRLX16X17EDX18AX19YYCQQSX2OKLPX21TFGSGTKVEIK (SEQ ID NO:30)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서, X1은 D 또는 E, X2는 L 또는 E, X3는 M 또는 L, X4는 A 또는 V, X5는 S 또는 T, X6는 L, P, 또는 A, X7은 D 또는 E, X8은 V 또는 A, X9은 T 또는 S, X10은 S 또는 R, X11은 G 또는 D, X12는 S 또는 N, X13은 H 또는 Q, X14은 S 또는 T, X15은 S, D, 또는 A, X16은 E 또는 Q, X17은 P 또는 A, X18은 F 또는 V, X19은 T, A 또는 I, X20은 I 또는 N 및 X21은 F 또는 L이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 항체이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 중쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.
경쇄 가변 영역의 CDR(CDR1, CDR2, 및 CDR3)을 다음의 서열 내에서 밑줄로 표시하였다(그리고 서열순으로 배열): X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9CX 1O ASQX 11 IRNX 12 LNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLX 13 X 14 GVPX15RFSG SGSGTDFTLTISRLX16X17EDX18AX19YYCQQSX 2O KLPX 21 TFGSGTKVEIK (SEQ ID NO:30), 여기서, X1은 D 또는 E, X2는 L 또는 E, X3는 M 또는 L, X4는 A 또는 V, X5는 S 또는 T, X6는 L, P, 또는 A, X7은 D 또는 E, X8은 V 또는 A, X9은 T 또는 S, X10은 S 또는 R, X11은 G 또는 D, X12는 S 또는 N, X13은 H 또는 Q, X14은 S 또는 T, X15은 S, D, 또는 A, X16은 E 또는 Q, X17은 P 또는 A, X18은 F 또는 V, X19은 T, A, 또는 I, X20은 I 또는 N 및 X21은 F 또는 L이다. 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3(CDR-Ll, CDR-L2, 및 CDR-L3, 각각)는 카밧 정의(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th edit., National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987))에 의하여 정의되었다. 경쇄 가변 영역의 CDR1의 위치는 L24-34, CDR2의 위치는 L50-56이고, 및 CDR3의 위치는 L89-97이다( 순차 및 카밧 계수법에 의함). (예컨대, 선택된 예시적 경쇄 가변 영역 서열 상에서 경쇄 가변 영역의 CDR 및 FR의 위치를 도시한 도 3을 참조할 것.)
발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 서열 DILMTQSPSSLSASPGDRVTISCRASQDIRNNLNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAAYYCQQSIKLPLTFGSGTKVEIK (SEQ ID NO: 15; X376), DILLTQSPSSLSATPGERATITCRASQGIRNNLNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISR LQPEDVAAYYCQQSIKLPFTFGSGTKVEIK (SEQ ID NO: 18; X379), 및 EIEMTQSPSSLSVSAGERATISCSASQDIRNSLNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLHTGVPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDVAIYYCQQSNKLPLTFGSGTKVEIK (SEQ ID NO: 19; X380)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드(예컨대, 항체)는 SEQ ID NO: 15 (X376), SEQ IDN0:18 (X379), 및 SEQ ID NO:19 (X38O)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 (a) SEQ ID NO:22 (X384), SEQ ID NO:23 (X385), SEQ ID NO:26 (X388), 및 SEQ ID NO:28 (X420)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열 및 (b) SEQ ID NO:15 (X376), SEQ ID NO:18 (X379), 및 SEQ ID NO:19 (X380)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 모두 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드(예컨대, 항체)는 (a) SEQ ID NO:22 (X384), SEQ ID NO:23 (X385), SEQ ID NO:26 (X388) 및 SEQ ID NO:28 (X420)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (b) SEQ ID NO:15 (X376), SEQ ID NO:18 (X379), 및 SEQ ID NO:19 (X380)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 모두 포함한다.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 아미노산 서열 SEQ ID NO:26 (X388) 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:15 (X376)를 모두 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 아미노산 서열 SEQ ID NO:22 (X384) 및 아미노산 서열 SEQ ID NO: 18 (X379)을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 아미노산 서열 SEQ ID NO:28 (X420) 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:19 (X380)을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 아미노산 서열 SEQ ID NO:23 (X385) 및 아미노산 서열 SEQ ID NO: 19 (X380)를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 항체이다.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 아미노산 서열 SEQ ID NO:26 (X388)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:15 (X376)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 아미노산 서열 SEQ ID NO:22 (X384)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 SEQ ID NO: 18 (X379)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 아미노산 서열 SEQ ID NO:28 (X420)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 SEQ ID NO: 19 (X380)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 아미노산 서열 SEQ ID NO:23 (X385)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:19 (X380)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드는 항체이다.
본 발명은 하기의 것들을 포함하는 폴리펩타이드, 예컨대 항체를 제공한다: (a) SEQ ID NO:15-21로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 15-21로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 절편과 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열, 및/또는 (b) SEQ ID NO:22-28로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:22-28로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 절편과 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열. 본 발명의 일 실시 태양에 있어서, 아미노산 서열은 상기 적시된 서열과 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 적어도 약 99% 또는 100%일치한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 (a) 아미노산 서열 SEQ ID NO:18 또는 SEQ ID NO: 18의 절편과 적어도 약 90% 일치하는 아미노산 서열, 및/또는 (b) 아미노산 서열 SEQ ID NO:22 또는 SEQ ID NO:22의 절편과 적어도 약 90% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 절편은 적어도 약 10개의 아미노산, 적어도 약 25개의 아미노산, 적어도 약 50개의 아미노산, 또는 적어도 약 100개의 아미노산을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 CD26과 결합한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 마우스 단클론 항체가 아니다.
본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 도 5에서 나타낸 다음의 서열: X384, X385, X386, X387, X388, X399, 및 X420(SEQ ID NO:22-28, 각각)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명은 도 5에서 나타낸 다음의 서열: X384, X385, X386, X387, X388, X399, 및 X420 (SEQ ID NO:22-28, 각각)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드, 예컨대 항체를 제공한다. 예를 들면, 발명의 일 실시 태양에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:22 (X384)와 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열과 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:23 (X385)와 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:26 (X388)와 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:28 (X420)와 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 중쇄 가변 영역은 도 5에서 나타낸 다음의 서열: X384, X385, X386, X387, X388, X399, 및 X420 (SEQ ID NO:22-28, 각각)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 적어도 약 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, 발명의 일 실시 태양에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:22-28로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 태양에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:22-28로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 추가적인 특징으로서, 본 발명은 도 3에서 나타낸 다음의 서열: X376, X377, X378, X379, X380, X381, 및 X394 (SEQ ID NO:15-21, 각각)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명은 도 3에서 나타낸 다음의 서열: X376, X377, X378, X379, X380, X381, 및 X394 (SEQ ID NO: 15-21, 각각)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드, 예컨대 항체를 추가로 제공한다. 예를 들면, 발명의 일 실시 태양에서, 경쇄 가변 영역은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 15 (X376)과 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 경쇄 가변 영역은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 18 (X379)과 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 경쇄 가변 영역은 아미노산 서열 SEQ ID NO:19 (X380)과 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 경쇄 가변 영역은 도 3에서 나타낸 다음의 서열: X376, X377, X378, X379, X380, X381, 및 X394 (SEQ ID NO: 15-21, 각각)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 적어도 약 99%, 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, 발명의 일 실시 태양에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 15-21로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 다른 실시 태양에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 15-21로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 항체는 SEQ ID NO:22-28로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 15-21로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 모두 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 항체는 SEQ ID NO:15-21로 구성되는 군으 로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:22-28로 구성되는 군으로부터 선택된아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 15-28 중의 어느 하나의 아미노산 서열의 적어도 5개의 인접 아미노산, 적어도 8개의 인접 아미노산, 적어도 약 10개의 인접 아미노산, 적어도 약 15개의 인접 아미노산, 적어도 약 20개의 인접 아미노산, 적어도 약 30개의 인접 아미노산, 또는 적어도 약 50개의 인접 아미노산을 포함한다.
본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 SEQ ID NO: 15-28로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.
특허절차상미생물기탁의국제적승인에관한부타페스트조약에 근거하여 rhuMAb 411의 중쇄 및 경쇄를 암호화한 플라스미드를 함유한 이. 콜리 시료를 "인간 CD26 cDNA에 대한 인체적응형 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄 삽입물을 지닌 플라스미드를 보유한 DH5α 에셔리시아 콜리(Escherichia 콜리)" 라는 이름 및 "S604069.YST-pABMC148 (x41l)"로 균주 지정하여 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC), 미국 버지나아주 20108 마나사스 사서함 1549 (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209, United States of America)에 2006. 6. 30일자로 기탁하였으며 수납번호는 제PAT-7695호로 할당되었다. 따라서, 본 발명은 특허절차상미생물기탁의국제적승인에관한부타페스트조약에 근거하여 "S604069.YST-pABMC148 (x41l)"로 균주 지정되어 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁된 "인간 CD26 cDNA에 대한 인체적응형 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄 삽입물을 지닌 플라스미드를 보유한 DH5α 에 셔리시아 콜리" 라는 이름의 시료의 이. 콜리 내의 플라스미드에 의해 암호화된 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명은 특허절차상미생물기탁의국제적승인에관한부타페스트조약에 근거하여 "S604069.YST-pABMC148 (x41l)"로 균주 지정되어 ATCC에 2006. 6. 30자로 기탁되어 수탁번호가 제PAT-7695호인 "인간 CD26 cDNA에 대한 인체적응형 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄 삽입물을 지닌 플라스미드를 보유한 DH5α 에셔리시아 콜리" 라는 이름의 시료의 이. 콜리 내의 플라스미드에 의해 암호화된 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 추가로 제공한다. 본 발명은 ATCC에 기탁된 수탁번호 제PAT-7695호의 이. 콜리 내의 플라스미드에 의하여 암호화된 항체를 또한 제공한다.
본 발명은 본 명세서에서 기술한 폴리펩타이드 서열(예컨대, SEQ IDNO:15-21, SEQ IDS NO: 22-28, SEQ IDS NO:29, 또는 SEQ IDS NO:30 중의 어느 하나)을 포함하는 폴리펩타이드 절편을 추가로 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 본 명세서에서 기술한 폴리펩타이드 서열의 절편을 포함하며, 여기서, 상기 절편은 길이가 적어도 약 10개의 아미노산, 적어도 약 25개의 아미노산, 적어도 약 50개의 아미노산, 적어도 약 75개의 아미노산, 또는 적어도 약 100개의 아미노산이다.
본 발명은 SEQ ID NO:217(하기하는 실시예 4 참조), 또는 이들의 절편 또는 변이체를 포함하는 폴리펩타이드(예컨대, 항체)를 추가로 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:217을 포함한다. 발명의 일 실시 태 양에서, 상기 폴리펩타이드는 신호 서열을 제외한 SEQ ID NO:217를 포함한다(당해 기술 분야의 숙련자라면 발명의 일 실시 태양에서 폴리펩타이드 상의 신호 서열은 상기 폴리펩타이드로부터 절단되었다는 것을 쉽게 이해할 수 있다.) 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:217의 가변 영역을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:217(또는 이들의 절편)과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98% 일치하는 폴리펩타이드를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:217 (또는 이들의 가변 영역)의 절편을 포함한다, 여기서,상기 절편은 길이가 적어도 약 10개의 아미노산, 적어도 약 25개의 아미노산, 적어도 약 50개의 아미노산, 적어도 약 75개의 아미노산, 또는 적어도 약 100개의 아미노산이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 인간 CD26과 결합한다.
본 발명은 SEQ ID NO:218 (하기하는 실시예 4를 참조), 또는 이들의 절편 또는 변이체를 포함하는 폴리펩타이드(예컨대, 항체)를 추가로 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:218을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 신호 서열을 제외한 SEQ ID NO:218을 포함한다 (당해 기술 분야의 숙련자라면 발명의 일 실시 태양에서 폴리펩타이드 상의 신호 서열은 상기 폴리펩타이드로부터 절단되었다는 것을 쉽게 이해할 수 있다.) 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:218의 가변 영역을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:218(또는 이들의 절편)과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98% 일치하는 폴리펩타이드를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:218(또는 이들의 가변 영역)의 절편을 포함한다, 여기서,상기 절편은 길이가 적어도 약 10개의 아미노산, 적어도 약 25개의 아미노산, 적어도 약 50개의 아미노산, 적어도 약 75개의 아미노산, 또는 적어도 약 100개의 아미노산이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:218(하기하는 실시예 4를 참조), 또는 이들의 절편 또는 변이체를 추가로 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 인간 CD26과 결합한다. 예를 들면, 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 신호 서열이 제거된 SEQ ID NO:217를 각각 포함하는 적어도 하나 이상 중쇄(예컨대, 2개의 중쇄), 및 신호 서열이 제거된 SEQ ID NO:218을 각각 포함하는 적어도 하나 이상 경쇄 (예컨대, 2개의 경쇄)를 포함하는 항체이다. 본 발명은 SEQ ID NO:219 및/또는 SEQ ID NO:220 (하기하는 실시예 13에 도시), 또는 이들의 절편, 또는 이들의 변이체의 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 추가로 제공한다 .
본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 YSLR WISDHEYLY(SEQ ID NO:45; 펩타이드 6), LEYNYVKQWRHSY(SEQ ID NO:46; 펩타이드 35), TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO:47; 펩타이드 55), LWWSPNGTFLAYA (SEQ ID NO:48; 펩타이드 84), RISLQ WLRRIQNY(SEQ ID NO:49; 펩타이드 132), YVKQ WRHSYTASY(SEQ ID NO:50; 펩타이드 37), EEEVFSAYSALWW (SEQ ID NO:51; 펩타이드 79), DYSISPDGQFILL (SEQ ID NO:52; 펩타이드 29), SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO:53; 펩타이드 30), 및 IYVKIEPNLPSYR(SEQ ID NO:54; 펩타이드 63)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드에 결 합하는 폴리펩타이드, 예컨대 항체를 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 하나 이상의 펩타이드와 우선적으로 결합한다. 이러한 펩타이드는 인간 CD26의 영역이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는, 인간 CD26의 영역에 대응하는 하나 이상의 펩타이드에 비하여, YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO:45; 펩타이드 6), LEYNYVKQWRHSY(SEQ ID NO:46; 펩타이드 35), TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO:47; 펩타이드 55), LWWSPNGTFLAYA (SEQ ID NO:48; 펩타이드 84), RISLQ WLRRIQNY(SEQ ID NO:49; 펩타이드 132), YVKQ WRHS YTAS Y(SEQ ID NO:50; 펩타이드 37), EEEVFSAYSALWW (SEQ ID NO:51; 펩타이드 79), DYSISPDGQFILL (SEQ ID NO:52; 펩타이드 29), SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO:53; 펩타이드 30), 및 IYVKIEPNLPSYR(SEQ ID NO:54; 펩타이드 63)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드에 우선적으로 결합한다.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드(예컨대, 항체)는 각각 다음의 펩타이드: YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO:45; 펩타이드 6); LEYNYVKQWRHSY(SEQ ID NO:46; 펩타이드 35); TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO:47; 펩타이드 55); LWWSPNGTFLAYA (SEQ ID NO:48; 펩타이드 84); 및 RISLQ WLRRIQNY(SEQ ID NO:49; 펩타이드 132)와 결합한다. 다른 실시 태양에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 각각 다음의 펩타이드: YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO:45; 펩타이드 6); TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO:47; 펩타이드 55); RISLQ WLRRIQNY(SEQ ID NO:49; 펩타이드 132); YVKQ WRHSYTASY(SEQ ID NO:50; 펩타이드 37); 및 EEEVFSAYSALWW (SEQ ID NO:51; 펩타이드 79)와 결합한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 각각 다음의 펩타이드: DYSISPDGQFILL (SEQ ID NO:52; 펩타이드 29); SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO:53; 펩타이드 30); 및 TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO:47; 펩타이드 55)와 결합한다. 다른 실시 태양에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 각각 다음의 펩타이드: DYSISPDGQFILL (SEQ ID NO:52; 펩타이드 29); SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO:53; 펩타이드 30); TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO:47; 펩타이드 55); 및 IYVKIEPNLPSYR(SEQ ID NO:54; 펩타이드 63)와 결합한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 특이적 펩타이드와 우선적으로 결합한다.
경쟁 측정법은 동일하거나 또는 입체적으로 오버랩핑된 에피토프를 인식함으로 두 항체가 동일한 에피토프에 결합하는지를 측정하는데 이용된다. 예컨대, Dong et al. (1998) 및 하기하는 실시예의 특이성 실험을 참조할 것. 일반적으로, 항원은 멀티-웰 플레이트에 고정되었으며 및 표지 항체의 결합을 차단하는 비표지 항체의 능력이 측정되었다. 이러한 경쟁 측정법의 일반적인 표지는 방사성 표지 또는 효소 ㅍ표지이다. 이와 함께, 당해 기술 분야에 알려진 에피토프 맵핑 기술은 항체와 결합된 에피토프를 측정하는데 사용될 수 있다. 예컨대, 하기하는 실시예 3(e) 참조할 것.
발명의 일 실시 태양에서, 본 명세서에서 기술한 폴리펩타이드는 하나 이상의 불변 영역을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 본 명세서에서 기술한 폴리펩타이드는 인간 불변 영역을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 불변 영역은 중쇄의 불변 영역이다. 본 발명의 다른 실시 태양에서, 상기 불변 영역은 경쇄의 불변 영역이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 인간 불변 영역과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 일치하는 불변 영역을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 본 명세서에서 기술한 폴리펩타이드(예컨대, 항체)는 Fc 영역을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 인간 Fc 영역을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 본 명세서에서 기술한 폴리펩타이드는 인간 Fc 영역와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 일치하는 Fc 영역을 포함한다.
발명의 일 실시 태양에서, 본 명세서에서 기술한 항체는 IgG 항체이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 항체는 IgGl 항체이다. 다른 실시 태양에 있어서, 상기 항체는 IgG2 항체이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 항체는 인간 IgG 항체이다.
본 발명은 단량체, 이량체 및 다원자가 형태의 항체이다. 예를 들어, 적어도 2개 이상의 서로 다른 항원과 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체, 단클론 항체는 본 명세서에서 기술한 항체를 사용하여 제조될 수 있다. 이중특이성 항체의 제조 방법은 당해 기술 업계에 잘 알려져 있다 (예컨대, Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210를 참조할 것). 전통적으로, 이중특이성 항체의 재조합 제조는 서로 다른 특이성을 지닌 2종의 중쇄와의 2개의 면역글로블린 중쇄-경쇄 짝의 보조발현에 기초한다(Millstein and Cuello, 1983, Nature 305, 537-539).
이중특이성 항체를 제조하는 일 방법에 따르면, 소망하는 결합 특이성을 지닌 항체 가변 도메인(항체-항원 결합 부위)이 면역글로블린 불변 도메인 서열로 융 합되었다. 상기 융합은 경첩부, CH2 및 CH3 영역의 일부를 포함하는 면역글로블린 중쇄 불변 도메인을 가지는 것이 바람직하다. 적어도 하나 이상 융합에서 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유한 제1 중쇄 불변 영역(CHl)을 가지는 것이 바람직하다. 면역글로블린 중쇄 및, 소망한다면, 상기 면역글로블린 경쇄의 융합을 암호화한 DNA가 분리 발현 벡터 내로 삽입되었으며, 적합한 숙주 개체 내로 동시전달 감염되었다. 이는 구조에 사용된 3개의 폴리펩타이드 사슬의 불공정한 비율이 최적의 수율을 제공하는 실시 상태에서 3개의 폴리펩타이드 절편의 상호 비율 조절에 있어서 상당한 가변성을 제공하게된다. 그러나, 동일 비율의 적어도 2개 폴리펩타이드 사슬의 발현이 고수율을 나타내는 경우 또는 상기 비율이 특히 중요하지 않은 경우 하나의 발현 벡터 내의 2 또는 3개 모두의 폴리펩타이드 사슬의 암호화 서열을 삽입할 수 있게 된다.
일 방법으로서, 상기 이중특이성 항체는 한 가지에 제1 결합 특이성을 지닌 혼성화 면역글로블린 중쇄 및 다른 가지에 (2차 결합 특이성을 제공하는)혼성화 면역글로블린 중쇄-경쇄 짝으로 구성되어 있다. 이중특이성 분자의 1/2에서에서만 면역글로블린 경쇄를 지닌 이러한 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로블린 사슬 조합으로부터 소망하는 이중특이성 화합물의 분리를 촉진한다. 이러한 방법은 1994. 3. 3자로 공개된 PCT 출원공개번호 제WO 94/04690호에 개시되어 있다.
2개의 공유 결합 항체를 포함하는 헤테로컨쥬게이트 항체도 본 발명의 범위 내에 존재한다. 이러한 항체는 면역계 세포가 원치않는 세포를 표적화(미국 등록특허 제4,676,980호), 및 HIV 감염의 치료(PCT 출원공개번호 제WO91/00360호 및 제 WO92/200373호; 제EP03089호)용으로 사용되어 왔다. 헤테로컨쥬게이트 항체는 모든 가교 결합 방법이 사용될 수 있다. 적합한 가교결합제 및 기술은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 미국 등록특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.
본 발명의 일 실시 태양에서, 본 명세서에서 기술한 항체는 항체 절편이다. 예를 들면, 발명의 일 실시 태양에서, 상기 항체는 Fab, Fab`, Fab`-SH, Fv, scFv 및 F(ab`)2로 구성되는 군으로부터 선택된다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 항체는Fab이다. 항체 절편 생산을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 이러한 절편은 무손상 항체의 단백질 분해 소화과정을 거쳐 유도될 수 있다 (예컨대, Morimoto et al., 1992, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 및 Brennan et al., 1985, Science 229:81를 참조할 것), 또는 재조합 숙주 세포에 의하여 직접 제조될 수도 있다. 예를 들어, Fab`-SH 절편은 이. 콜리로부터 직접 회수될 수 있으며, 화학적으로 커플링되어 F(ab`)2 절편을 형성할 수 있다(Carter et al., 1992, Bio/기술 10:163-167). 본 발명의 또 다른 실시 태양에서는, 상기 F(ab`)2는 류신 지퍼 GCN4를 사용하여 F(ab`)2 분자의 결합을 증진시켜 형성할 수 있다. 또 다른 방법에 따르면, Fv, Fab 또는 F(ab`)2 절편은 재조합 숙주 세포 배양으로부터 직접 단리된다.
발명의 일 실시 태양에서, 본 발명의 항체는 단일 사슬(ScFv), 이들의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인체적응형 항체, 키메라 항체, 이체 선형 항체, 단일 사슬 항체, 및 모든 면역글로블린 분자의 변형 입체구조이다.
단일 사슬 가변 영역 절편은 짧은 결합 펩타이드를 사용하여 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역을 결합하여 제조된다. Bird et al. (1988) Science 242:423-426.
결합 펩타이드의 예로 (GGGGS)3(SEQ ID NO:85)가 있으며, 이는 한 가변 영역의 카르복시 말단부와 다른 가변 영역의 아미노 말단부간의 약 3.5 nm를 연결한다. 다른 서열의 링커가 설계되었으며 사용되고 있다. Bird et al. (1988).
링커는 예컨대 약제에 부착 또는 고체 지지체에 부착 등의 부가 기능을 위하여 순차로 변형될 수 있다. 상기 단일 사슬 변이체는 재조합 또는 합성에 의하여 제조될 수 있다. scFv의 합성 제조에는 자동 합성기가 사용될 수 있다. 재조합 scFv 제조에는, scFv를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 함유한 적합한 플라스미드가 적합한 숙주 세포인 진핵 세포, 예컨대 효모, 식물, 곤충 또는 포유류 세포, 또는 원핵 세포, 예컨대 이. 콜리 등의 내로 도입될 수 있다. 대상 scFv를 암호화한 폴리뉴클레오타이드는 예컨대 폴리뉴클레오타이드의 결합 등의 통상의 조작에 의하여 제조될 수 있다. 결과물인 scFv는 당해 기술 분야에 알려진 표준 단백질 분리 기술을 이용하여 단리될 수 있다. 그 밖의 단일 사슬 항체의 형태, 예컨대 이체(diabodies)가 본 발명에 포함된다. 이체는 2가의 이중특이성 항체로서 동일 사슬 상의 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 사슬 상에 발현되나 두 도메인 간의 결합을 형성하기 너무 짧은 링커를 사용하여, 하나의 도메인이 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 결합하게 하므로써 2개의 항원 부위를 생성시칸다(예컨대, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123를 참조할 것).
본 발명은 항체 또는 그 밖의 특성에 상당한 영향을 미치지 않으면서도 기능적으로 동등한 항체를 포함하는 본 명세서에서 기술한 폴리펩타이드의 변형체, 및 활성을 증진하거나 감소시키는 변이체를 포괄한다. 이로써 이러한 변형의 원칙이 폴리펩타이드 및 항체에 적용된다는 사실을 이해할 수 있다. 폴리펩타이드의 변형은 당해 기술 분야의 통상의 기술이며, 본 명세서에 상세히 기재할 필요는 없다. 변형 폴리펩타이드의 예는 현저히 유해한 기능적 활성의 변화를 부여하지 않거나 또는 화학적 유도체를 사용하지 않으면서, 아미노산 잔기의 보존적 치환체, 아미노산의 하나 이상의 결실 또는 부가를 지닌 폴리펩타이드를 포함한다.
아미노산 서열 삽입체 또는 부가체는 길이가 1개의 잔기에서 100개 이상의 폴리펩타이드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합체 및 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열간 삽입체를 포함한다. 말단 삽입체의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 지닌 항체 또는 에피토프 태그와 융합된 항체를 포함한다. 그 밖의 상기 항체 분자의 삽입 변이체는 상기 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩타이드의 항체의 N- 또는 C-말단부에 융합된 것을 포함한다.
치환 변이체는 상기 항체 또는 제거된 다른 폴리펩타이드 서열 및 그 자리로 삽입된 다른 잔기 내의 적어도 하나 이상 아미노산 잔기를 지닌다. 치환 돌연변이유발을 위한 대상 부위는 CDR을 포함하며, FR 변형체도 고려된다. 보존 치환체는 "보존 치환체"라는 표제로 표 1에 나타내었다. 이러한 치환체가 생물학적 활성을 변화시킨다면, 아미노산 클래스에 대하여 상세히 기술하는 하기한 표 1에 "예시적 치환체"로 명명된 더 실질적인 변화가 도입될 수 있으며, 상기 생성물이 선별될 수 있다.
아미노산 치환체
원형 잔기 보존 치환체 예시적인 치환체
Ala(A) Val Val;Leu;Ile
Arg(R) Lys Lys;Gln;Asn
Asn(N) Gln Gln;His;Asp;Lys;Arg
Asp(D) Glu Glu;Asn
Cys(C) Ser Ser;Ala
Gln(Q) Asn Asn;Glu
Glu(E) Asp Asp;Gln
Gly(G) Ala Ala
His(H) Arg Asn;Gln;Lys;Arg
Ile(I) Leu Leu;Val;Met;Ala;Phe; Norleucine
Leu(L) Ile Norleucine;Ile;Val;Met; Ala;Phe
Lys(K) Arg Arg;Gln;Asn
Met(M) Leu Leu;Phe;Ile
Phe(F) Tyr Leu;Val;Ile;Ala;Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr Tyr;Phe
Tyr(Y) Phe Trp;Phe;Thr;Ser
Val(V) Leu Ile;Leu;Met;Phe;Ala; Norleucine
상기 항체의 생물학적 특성에 관한 실질적인 변형은
(a) 치환 영역의 상기 폴리펩타이드 골격의 구조, 예를 들어, 시트 또는 나선형 입체 구조, (b) 표적 부위 분자의 변화 및 소수성, 또는 (c) 가지 사슬의 부피 등을 유지하는 효과가 현저히 다른 치환체를 선택함으로써 수행된다. 자연 발생적 잔기는 공통 가지 사슬 특성에 기초하여 군으로 나누어진다:
(1) 소수성: Norleucine, Met, Ala, VaI, Leu, He;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr;
(3) 산성: Asp, GIu;
(4) 염기성: Asn, GIn, His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: GIy, Pro; 및
(6) 방향성: Trp, Tyr, Phe.
비보존 치환체는 이러한 클래스의 일 구성원이 다른 클래스의 염기로 교환됨으로써 생성된다. 또한 보존 치환체는 한 클래스의 일 구성원이 동일 클래스의 다른 구성원으로 교환되는 것과 관련있다.
상기 항체의 알맞은 입체구조응 유지하는데 관여하지 않는 모든 시스테인 잔기는, 일반적으로 세린으로, 치환되어 분자의 산화 안정성을 향상시키고, 비정상 가교결합을 차단하게 할 수 있다.
이와 반대로, 특히, 상기 항체가 항체 절편, 예컨대 Fv 절편인 경우, 시스테인 결합(들)이 상기 항체에 부가되어 안정성을 향상시킬 수 있다.
아미노산 변형은 하나 이상의 아미노산에서 영역, 예컨대 상기 가변 영역의 재설계에 이르는 변화 또는 변형일 수 있다. 상기 가변 영역의 변화는 결합 친화도 및/또는 특이성을 변화시킬 수 있다. 발명의 일 실시 태양에서, 1 내지 5 종의 보존 아미노산 치환체만이 CDR 도메인 내에서 제조되었다. 본 발명의 다른 실시 태양에서, 1 내지 3종의 보존 아미노산 치환체만이 CDR3 도메인 내에서 제조되었다. 본 발명의 또 다른 실시 상태에서, 상기 CDR 도메인은 CDRH3 및/또는 CDR L3이다.
또한, 상기 변형은 당화 및 비당화 폴리펩타이드, 및 예컨대, 다른 당으로의 당화, 아세틸화, 및 인산화 등의 번역-후 변형을 거친 폴리펩타이드를 포함한다.
항체는 이들의 불변 영역 내의 보존 위치에서 당화된다 (Jefferis and Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; W우측 and Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). 면역글로블린의 올리고당 가지 사슬은 단백질 기능(Boyd et al., 1996, MoI. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180) 및 입체 구조에 영향을 미치고, 당단백질의 3차원 표면상에 제시되는 당단백질 부분 간의 분자간 상호작용(Hefferis and Lund, supra; Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416)에 영향을 미친다. 올리고당은 특이적 인식 구조에 기초하여 지정된 당단백질이 특정 분자를 표적화하는데 사용될 수 있다. 항체의 당화는 항체-의존성 세포 독성(ADCC)에 영향을 미친다고 보고되었다. 특히, β(l,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제III(GnTIII)의 테트라싸이클린-제어 발현, 이등분 GIcNAc의 그리코실트랜스퍼라아제 분해 형성을 지닌 CHO 세포가 ADCC 활성을 향상시킨다고 보고되었다(Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180).
항체의 당화는 일반적으로 N-링크 또는 O-링크이다. N-링크는 아스파라긴 잔기의 가지 사슬에 탄수화물 모이어티가 결합되는 것을 나타낸다. 상기 트리펩타이드 서열인, 아스파라긴-X-세린, 아스파라긴-X-트레오닌, 및 아스파라긴-X- 시스테인(여기서 X는 프롤린을 제외한 아미노산)은 아스파라긴 가지 사슬에 탄수화물 모이어티가 효소적으로 결합되는 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드 내에 이러한 트리펩타이드 서열이 존재함으로써 잠재성 당화 부위를 형성한다. O-링크 당화는 당인 N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스, 또는 자일로스 중 하나와 하이드록시아미노산, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌의 결합을 나타내며, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신이 또한 사용될 수 있다.
상기 항체에 당화 부위의 첨가는 하나 이상의 상기 (N-링크 당화 부위를 위한) 트리펩타이드 서열을 포함하는 아미노산 서열을 변화시킴으로써 간단히 달성될 수 있다. 상기 변화는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기가 원 항체(O-링크 당화 부위에 대한)의 서열에 첨가 또는 치환됨으로써 생산될 수 있다.
항체의 당화 패턴은 밑줄친 뉴클레오타이드 서열을 변형시킴 없이 변경될 수 있다. 당화는 크게 상기 항체를 발현시키는데 사용된 숙주 세포에 좌우된다. 잠재적 치료제인 재조합 당단백질, 예컨대 항체의 발현에 사용된 세포의 유형은 토종(native) 세포가 드물기 때문에, 상기 항체의 당화 패턴시 변이체가 될 것이다 ( 예컨대 Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062- 9070를 참조하라).
숙주 세포의 선택과 함께, 항체의 재조합 생산시 당화에 양향을 미치는 요소에는 성장 모드, 배양약 조성, 배양 밀도, 산소 공급, pH, 분리법 등을 포함한다. 올리고당 생성에 관여하는 특정 효소의 도입 또는 과다 발현을 포함하는 특정 숙주 개체내에서 일어나는 당화 패턴을 변경시키는 다양한 방법들이 제안되었다(미국 등록특허 제5,047,335호; 제5,510,261호 및 제5,278,299호). 당화, 또는 특정 유형의 당화는 당단백질로부터 효소적으로 제거되었으며, 예를 들어, 엔도글리코시다아제 H(Endo H)를 사용한다. 이와 함께, 상기 재조합 숙주 세포는 다당류의 특정 유형을 처리하는데 결함이 있도록 유전적으로 조작될 수 있다. 이러한 기술 및 유사한 기술은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
다른 변형법에는 효소적 방법, 산화 치환 및 킬레이션 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 당해 기술 분야에 알려진 커플링 기술을 사용하는 것을 포함한다. 변형은, 예를 들어, 면역측정법을 위한 표지 부착을 이용할 수도 있다. 변형 폴리펩타이드는 당해 기술 분야에 잘 알려진 절차를 통해 제조되며, 당해 기술 분야에 알려진 표준 측정법을 사용하여 선별될 수 있고, 이들 중 일부는 본 명세서에서 기술하거나 실시예에 기술될 것이다.
다른 항체 변형체는 1999. 11. 18자 PCT 출원공개번호 제WO 99/58572호에 개시된 변형법에 의하여 변형된 항체를 포함한다. 이러한 항체는, 표적 분자에 대응하는 결합 도메인과 함께, 인간 면역글로블린 중쇄의 불변 도메인 전부 또는 일부와 실질적으로 균질한 아미노산 서열을 보유한 작동(effector) 도메인을 포함한다. 이러한 항체는 현저한 보체 의존성 용해(lysis), 또는 세포-매개 파괴를 촉발하지 않으며 표적 분자에 결합할 수 있다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 작동 도메인은 FcRn 및/또는 FcγRIIb에 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 것들은 2 이상의 인간 면역글로블린 중쇄 CH2 도메인으로부터 유도된 키메라 도메인에 일반적으로 기초한다. 이러한 방법에 의한 항체 변형은 종래의 항체 요법에 대한 염증 및 부작용을 회피하기 위한 만성 항체 요법에 특히 적합하다.
발명의 일 실시 태양에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 컨쥬게이션된다. 예를 들면, 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 다른 약제, 예컨대, 화학요법제, 방사선핵종, 면역요법제, 싸이토카인, 케모카인, 영상제, 독소, 생물학제, 효소억제제, 또는 항체 등과 컨쥬게이션 된다.
일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드, 예컨대 항체는 수용성 고분자의 모이어티에 컨쥬게이션된다. 상기 폴리펩타이드는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 모노메톡시-PEG, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜 또는 이와 유사한 것들과 컨쥬게이션될 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 분자가 무작위적 위치로, 또는 예정된 위치로 변형될 수 있으며, 1, 2, 3 또는 그 이상의 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 상기 고분자는 어떠한 분자량도 가능하며, 가지형 또는 비가지형일 수 있다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 모이어티는 링커를 통하여 상기 폴리펩타이드에 결합된다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 결합 모이어티는 동물 내의 상기 폴리펩타이드의 반감기 주기를 증가시킨다. 고분자, 예컨대 PEG를 항체를 포함하는 폴리펩타이드에 결합하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는 PEG화 폴리펩타이드, 예컨대 PEG화 항체이다.
본 발명은 성숙 친화도 실시 태양을 포함한다. 예를 들어, 친화도 성숙 항체는 당해 기술 분야에 알려진 방법에 의하여 제조될 수 있다(Marks et al., 1992, Bio/기술, 10:779-783; Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Schier et al, 1995, Gene, 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9; Hawkins et al, 1992, J. MoI. Biol., 226:889- 896; 및 WO2004/058184). 친화도 성숙 항체의 후보는 BIAcore 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용하는 선별법 및 파지 디스플레이, 효모 디스플레이, 및 리보솜 디스플레이를 포함하는 당해 기술 분야에 알려진 모든 선택 방법을 사용하는 선택법을 포함하는 당해 기술 분야에 알려진 방법을 사용하여 향상된 및/또는 변경된 결합 친화도로서 선별 또는 선택될 수 있다.
단클론 항체는 하리브리도마법, 예컨대 Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495에 개시된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 하리브리도마 법에서, 마우스, 햄스터, 또는 그 밖의 적합한 숙주 동물은 일반적으로 면역화제로 면역되어 면역화제에 특이적으로 결합하는 항체ffm 제조하거나 제조할 수 있는 림프구를 유도한다. 또 다른 특징으로서, 상기 림프구는 생체 외에서 면역화될 수 있다.
본 발명의 상기 단클론 항체(및 다른 폴리펩타이드)는 재조합 DNA 법, 예컨대 미국 등록특허 제4,816,567호에서 개시한 방법에 의하여 제조될 수 있다. 폴리펩타이드 및 단클론 항체의 제조법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 발명의 일 실시 태양에서, 단클론 항체를 암호화한 DNA는 예컨대, 유전자와 특이적으로 결합가능한 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머 또는 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 사용하는 종래의 방법을 사용하여 단리되고, 서열화되고 및/또는 증폭되었다. 소망하는 서열의 폴리펩타이드, 예컨대 항체를 암호화하는 서열은 당해 기술 분야에 잘 알려진 합성DNA 법, PCR 법, 및 재조합 기술의 조합을 사용하여 쉽게 제조될 수 있다. 단리된 경우, 상기 DNA는 발현 벡터 내에 위치 되고, 그 다음 면역글로블린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜리 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포 내로 전달 감염되어 재조합 숙주 세포 내에서 단클론 항체를 합성을 달성한다.
발명의 일 실시 태양에서, 본 발명의 폴리펩타이드(예컨대, 항체)는 모든 유기체, 또는 박테리아, 효모, 식물, 곤충, 및 포유류를 포함하나 이에 한정되지 않는 모든 유기체에서 유도된 세포에서 발현된다. 특정 유형의 세포는 노랑초파리(Drosophila melanogaster) 세포, 싸카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 그 밖의 효모, 이. 콜리, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), SF9 세포, HEK-293 세포, 붉은빵곰팡이(Neurospora), BHK 세포, CHO 세포, COS 세포, HeLa 세포, 섬유모세포, 신경집종 세포주, 무한증식 포유류 골수 및 림프구 세포주, Jurkat 세포, 비만 세포 및 다른 내분비 및 외분비 세포, 및 신경 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다
폴리펩타이드 제조에 유용한 다양한 단백질 발현 시스템, 벡터, 및 세포 배양액은 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 예컨대, 국제 출원번호 제WO03/054172호, 제WO04/009823호 및 제WO03/064630호, 및 미국 특허공개번호 제US2005/0170454호, 제US2005/0084928호, 및 제US2006/0003405호를 참조할 것이며, 이들의 각각은 참고 자료로서 일체성을 가지고 본 명세서에 포함되었다. 발명의 일 실시 태양에서, 글루타민 합성효소(GS) 발현 시스템이 상기 폴리펩타이드(예컨대, 항체)의 발현에 사용되었다.
상기 폴리펩타이드는 당해 기술 분야의 숙련자에게 알려진 방법을 통하여 발현 후 분리 또는 단리될 수 있다. 분리 방법의 예는 이온 교환, 소수성 친화도, 및 역상 HPLC 크로마토그래피, 및 크로마토포커싱을 포함한 전기영동적, 분자적, 면역학적 및 크로마토그래피적 기술을 포함한다. 분리의 정도는 폴리펩타이드의 용도에 따라 다양해질 수 있다. 일 예로써, 분리가 필요하지 않을 수도 있다.
상기 DNA는 예를 들어, 면역글로블린 암호화 서열 전부 또는 비면역글로블린 폴리펩타이드의 암호화 서열의 일부와 공유 결합함으로써 변형될 수 있다. 그러한 방법에서, 본 명세서에서 기술한 단클론 항체의 결합 특이성을 보유한 "키메라" 또는 "혼성화" 항체가 제조되었다. 일반적으로 이러한 비면역글로블린 폴리펩타이드는 본 발명 항체의 불변 도메인에 치환되거나, 또는 이들이they are substituted for the 본 발명 항체의 항원-결합 부위의 가변 도메인에 치환되어 일 표면 에피토프 CD26에 대한 특이성을 보유한 일 항원-결합 부위 및 다른 항원 또는 CD26 에피토프에 대한 특이성을 보유한 다른 항원-결합 부위를 포함한 키메라 2가 항체를 형성하게 된다.
본 발명은 또한 인체적응형 항체를 포함한다. 치료적 항체는 투여된 항체에 대한 면역 반응을 촉발시켜 부분적인 부작용을 유발시킨다. 이는 감소된 효능, 표적 항원을 보유한 세포의 소모, 의도하지 않은 염증 반응을 일으킬 수 있다. 상기 언급한 문제를 회피하기 위하여, 재조합 항-CD26 인체적응형 항체를 생성시킬 수 있다. 인체적응 항체 내의 일반 원칙은 인간 항체 서열을 보유한 상기 항체의 비인간성 잔여물의 적어도 일부를 교체하는 과정에서 상기 항체의 항원-결합 부분의 염기성 서열을 보유하는 것과 관련되어 있다. 단클론 항체를 인체적응화하기 위한 4개의 비제한적인 일반적인 단계는 하기의 것들을 포함한다: (1) 개시 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 뉴클레오타이드 및 예견된 아미노산 서열의 결정, (2) 인체적응형 항체의 설계, 즉, 인체적응화 과정에 사용할 항체 기본틀 영역 또는 잔기 및/또는 CDR 잔기의 결정, (3) 실제 인체적응 방법론/기술 및 (4) 인체적응형 항체의 전달감염 및 발현. 상기 불변 영역은 상기 항체가 인간의 임상적 시험 및 치료에 사용되는 경우, 인간 불변 영역 더 유사하게 유전자 조작되어 면역 반응을 회피하도록 한다. 예를 들어, ㅁ미국 등록특허 제5,997,867호 및 제5,866,692호를 참조할 것.
재조합 인체적응형 항체에서, Fcγ 부분은 Fcγ수용체 및 보체 면역 체계와 상호작용을 회피하도록 변형될 수 있다. 이러한 항체의 제조 기술은 제WO99/58572호에 개시되어 있다. 비-인간 면역글로블린으로부터 유도된 항원-결합 부위를 포함하는 다수의 "인체적응형" 항체 분자는 설치류 V 영역 및 인간 불변 도메인과 융합되어 이들과 결합된 상보성 결정 영역(CDR)을 보유한 키메라 항체를 포함하여 기술된바 있다. 예를 들어, Winter et al. Nature 349:293-299 (1991) ; Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. ScL USA 86:4220-4224 (1989); Shaw et al. J Immunol. 138:4534-4538 (1987); 및 Brown et al. Cancer Res. 47:3577-3583 (1987)를 참조할 것. 다른 참고 문헌은 적합한 인간 항체 불변 도메인과 융합 전에 인간 지지 기본틀 영역(FR) 내로 이식된 설치류 CDR를 개시한다. 예를 들어, Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988); 및 Jones et al. Nature 321 :522-525 (1986)를 참조할 것. 또 다른 참고 문헌은 재조합 조작된 설치류 기본틀 영역에 의하여 지지된 설치류 CDR을 개시한다. 예를 들어, 유럽 특허공개번호 제519,596호를 참조할 것. 이러한 유형의"인체적응형" 분자는 인간 수용체 내의 이러한 모이어티의 치료적 적용의 지속시간 및 유효성을 제한하는 설치류 항인간 항체 분자에 대한 원치않는 면역학적 반응을 최소화하도록 설계되었다.
활용가능한 항체의 인체적응 방법은 Daugherty et al., Nucl. Acids Res., 19:2471-2476 (1991) 및 미국 등록특허 제6,180,377호; 제6,054,297호; 제5,997,867호; 제5,866,692호; 제6,210,671호; 제6,350,861호; 및 PCT 제WO01/27160호에 개시되어 있다.
항체의 인체적응화 방법의 추가적인 예는 국제공개번호 제WO02/084277호 및 미국 공개특허번호 제US2004/0133357호에 기재되어 있으며, 양자는 일체성을 가지고 본 명세서에 포함되어 있다.
본 발명의 또 다른 예에서, 완전한 인간 항체는 특이적 인간 면역글로블린 단백질을 발현하도록 조작되어 판매되는 마우스를 이용하여 획득할 수 있다. 더 바람직스러운 제조(예컨대, 완전한 인간 항체) 또는 더 강건(robust)한 면역 반응을 위하여 설계된 유전자삽입 동물이 인체적응형 또는 인간 항체의 생성에 사용될 수 있다. 이러한 기술의 예는 애브제닉스(Abgenix, Inc)사(Fremont, CA)의 제노마우스(XenomouseTM) 및 메다렉스(Medarex, Inc)사 (Princeton, NJ)의 HuMAb-마우스(HuMAb-MouseR)와 TC 마우스(TC MouseTM)이다.
또 다른 예로써, 항체를 파지 디스플레이 기술에 의하여 제조합적으로 생산할 수도 있다. 예를 들어, 미국 등록특허 제5,565,332호; 제5,580,717호; 제5,733,743호 및 제6,265,150호; 및 Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994)를 참조할 것. 또 다른 특징으로서, 상기 파지 디스플레이 기술 (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990))은 미면역 공여자의 면역글로블린 가변(V) 도메인의 유전자 레퍼토리로부터 생체 외에서 인간 항체 및 항체 절편을 생산하는데 사용할 수 있다. 이러한 기술에 의하여, 항체 V 도메인 유전자는 필라멘트형 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 다수 또는 소수 외피 단백질 유전자 내로 프레임-내 클론되며, 파지 입자의 표면상 기능적 항체 절편으로서 디스플레이된다. 상기 필라멘트형 입자는 파지 게놈의 단일가닥 DNA 카피를 함유하며, 상기 항체의 기능적 특성에 기초한 선택은 이러한 물성을 발현하는 항체를 암호화한 유전자의 선택이 된다. 따라서, 상기 파지 는 B 세포의 일부 특성을 모사한다. 파지 디스플레이는 다양한 포멧으로 수행된다; 검토를 한다면, 예컨대, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993)를 참조할 것. V-유전자 분절체의 일부 공급원은 파지 디스플레이를 사용할 수 있다. Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)은 면역화된 마우스의 비장으로부터 유도된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥살론 항체의 다양성 정렬이 단리되었다. 비면역화된 인간 공여자의 V 유전자의 레퍼토리가 구성될 수 있으며, 항원(자가-항원을 포함)의 다양성 정렬에 대한 항체는 필수적으로 Mark et al, J. MoI. Biol. 222:581-597 (1991), 또는 Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)에 기술된 기술을 따라 단리될 수 있다. 자연 면역 반응에 있어서, 항체 유전자는 높은 속도로 돌연변이를 축적한다(전신 초돌연변이). 이러한 변화의 일부는 더 높은 친화도를 부여하며, B 세포 디스플레이 고-친화도 표면 면역글로블린는 속발성 항원 접종 중에 우선적으로 전사되고, 분화된다. 이 자연적 과정은 "체인 셔플링(chain shuffling)"으로 알려진 기술을 사용하여 모사될 수 있다. Marks, et al., Bio/Technol. 10:779-783 (1992)). 이러한 방법에서, 파지 디스플레이에 의하여 획득한 "주요" 인간 항체의 상기 친화도는 순차적으로 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를 미접종 공여자로부터 획득한 V 도메인 유전자의 자연 발생적 변이체(레퍼토리)의 레퍼토리로 치환함으로써 향상될 수 있다. 이러한 기술에 의하여 pM-nM 범위 내에서 친화도를 지니는 항체 및 항체 절편의 제조가 가능하게 되었다.
대형 파지 항체 레퍼토리의 제조 전략("전모체 라이브러리"로 알려짐)은 Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993)에 개시되었다. 유전자 셔플링은 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하는 데 사용할 수도 있으며, 여기서 상기 인간 항체는 출발물질인 설치류 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 지닌다. 이 방법에 따라서, "에피토프 날인"이러는 것은, 파지 디스플레이 기술로 획득한 설치류 항체의 상기 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자는 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 치환되어, 설치류-인간 키메라를 형성하는 것이다. 인간 가변 영역의 단리시, 기능적 항원-결합 부위, 즉, 상기 에피토프를 회복할 수 있는 항원 결과의 선택은 파트너의 선택을 결정(날인)한다. 잔류 설치류 V 도메인을 치환하기 위하여 절차를 반복하는 경우, 인간 항체가 획득되었다(PCT 특허 출원 제WO 9306213호, 1993. 4. 1일 공개 참조). CDR 이식에 의한 설치류 항체의 전통적인 인체적응화와 달리, 이러한 기술은 완전한 인간 항체를 제공하는데, 이들은 원 설치류의 기본틀 또는 CDR 잔기를 가지고 있디 않다. 상기한 인체적응형 항체에 관련된 사항에도 불구하고, 상기한 일반 원칙은 예를 들어, 개과, 고양이과, 영장류, 말 및 소과에 사용하기 위한 항체를 필요에 따라 조절하는데 적용될 수 있다는 사실은 명백하다.
키메라 또는 혼성화 항체는 가교결합제와 관련된 것을 포함하는 알려진 합성 단백질 화학법을 사용하여 생체 외에서 제조될 수도 있다. 예를 들어, 면역독소는 이황화 교환 반응을 사용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성하여 제조될 수도 있다. 이러한 목적을 위한 적합한 시약의 예는 이미노티오레이트 및 메틸-4- 머캅토부티르이미데이트를 포함한다.
단일 사슬 Fv 절편은, 예컨대, Iliades et al., 1997, FEBS Letters, 409:437-441에 개시된 방법에 의하여 제조될 수 있다. 다양한 링커를 사용한 이러한 단일 사슬 절편의 커플링은 Kortt et al., 1997, Protein Engineering, 10:423-433에 개시되어 있다. 재조합 제조 및 항체 조작을 위한 다양한 기술은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
발명의 일 특징으로서, 본 발명은 본 명세서에서 기술한 폴리펩타이드의 제조 방법을 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 방법은 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 것을 포함하며, 여기서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 폴리펩타이드를 암호화 하고 있다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 방법은 항체 제조 방법이며 및 숙주 세포 내에서 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 발현 (예컨대, 세포 배양에서)하는 것을 포함하고, 여기서,각 상기 항체의 사슬은 적어도 하나 이상의 상기 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화되었다. 발명의 일 실시 태양에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 벡터 내에 존재한다. 본 발명의 다른 실시 태양에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 별개의 벡터 상에 위치한다. 발명의 일 실시 태양에서, 본 명세서에서 기술한 폴리펩타이드를 제조하는 방법에는 발현되는 숙주 세포로부터 상기 폴리펩타이드를 단리하는 단계(예컨대, 숙주 세포가 성장하는 세포 배양액으로부터 단리되는 단계)를 추가로 포함한다.
폴리뉴클레오타이드, 변이체 서열, 벡터, 및 숙주 세포
본 발명은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, 본 명세서에서 기재한 항체를 추가로 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에서 기재한 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 벡터, 예컨대 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 또한 제공한다. 본 발명의 벡터 및/또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 단리된다.
본 발명의 일 특징으로서, 본 발명은 도 2 및 도 4 (SEQ IDS NO: 1-14)에 나타낸 각각의 서열, 또는 이들의 절편으로 구성되는 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명은 적당한 긴축 조건 하에서, 도 2 및 도 4 (SEQ IDS NO: 1-14)에 나타낸 폴리뉴클레오타이드로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드로 혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 추가로 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 고도의 긴축 조건하에서 도 2 및 도 4 (SEQ IDS NO: 1-14)에 나타낸 폴리뉴클레오타이드로 혼성화된다.
본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 도 3 또는 도 5에 나타낸 각각의 서열: X376, X377, X378, X379, X38O, X381, X394, X384, X385, X386, X387, X388, X399, 및 X420 (SEQ ID NO:15-28)로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명은 서열 SEQ ID NO:215 및/또는 SEQ ID NO:216 (하기하는 실시예 4를 참조)의 폴리뉴클레오타이드, 또는 이들의 절편을 포함하눈 폴리뉴클레오타이드를 추가로 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 절편은 적어도 12, 적어도 20, 적어도 50, 적어도 75, 또는 적어도 100개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 중쇄를 암호화하는 서열 SEQ ID NO:215를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 경쇄를 암호화하는 서열 SEQ ID NO:216을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 중쇄를 암호화하는 서열 SEQ ID NO:215의 절편을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 경쇄를 암호화하는 서열 SEQ ID NO:216을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 중쇄 가변 영역을 암호화하는 서열 SEQ ID NO:215의 절편을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 서열 SEQ ID NO :216의 절편을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명은 특허절차상미생물기탁의국제적승인에관한부타페스트조약에 근거하여 "S604069.YST-pABMC148 (x41l)"로 균주 지정되어 2006. 6. 30일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁되어 수탁번호 제PAT-7695호인 "인간 CD26 cDNA에 대한 인체적응형 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄 삽입물을 지닌 플라스미드를 보유한 DH5α 에셔리시아 콜리" 라는 이름의 시료의 이. 콜리 내의 플라스미드에 의하여 암호화된 상기 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 항체)를 또한 제공한다. 본 발명은 특허절차상미생물기탁의국제적승인에관한부타페스트조약에 근거하여 "S604069.YST-pABMC148 (x41l)"로 균주 지정되어 2006. 6. 30일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁되어 수탁번호 제PAT-7695호인 "인간 CD26 cDNA에 대한 인체적응형 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄 삽입물을 지닌 플라스미드를 보유한 DH5α 에셔리시아 콜리" 라는 이름의 시료의 이. 콜리 내의 플라스미드에 의하여 암호화된 상기 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 추가로 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 부착된 서열의 중쇄 및/또는 경쇄 암호화 서열을 포함한다.
발현 벡터 및 숙주 세포를 포함하는 발현 시스템은 본 발명의 폴리펩타이드, 예컨대 항체 내에서 사용될 수 있으며, 여기서, 상기 숙주 세포는 배양되었으며, 배양된 숙주 세포에 의하여 제조된 상기 폴리펩타이드가 회수되었다. 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 세포에서 상기 항체를 발현하는 숙주 환자에게 전달될 수 있다.
이러한 서열에 상보적인 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 범위에 포함된다. 폴리뉴클레오타이드는 (암호 또는 안티센스) 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으며, (게놈, cDNA 또는 합성) DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 HnRNA 분자를 포함하며, 이들은 인트론을 함유하며, 일대일 방식으로 DNA 분자에 대응하며, 및 mRNA 분자를 포함하며, 이들은 인트론을 포함하지 않는다. 추가적인 암호 또는 비암호 서열은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 내에 존재하나 반드시 필요한 것은 아니고, 폴리뉴클레오타이드는 다른 분자 및/또는 지지체와 결합할 수 있으나 반드시 그러한 것은 아니다.
본 명세서에서 기술한 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 변이체를 또한 제공한다. 상기 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 변이체는 하나 이상의 치환체, 부가체, 결실체 및/또는 삽입체를 함유할 수 있다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 변이체는 원 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리펩타이드에 의하여 암호화된 폴리펩타이드에 비하여, 암호화된 폴리펩타이드와 인간 CD26의 결합이 실질적으로 감소되지 않았다. 암호화된 폴리펩타이드의 면역반응성에 대한 효과는 본 명세서에서 기재한 바와 같이 일반적으로 평가될 수 있다. 변이체는 원 서열 또는 이들의 부분에 대하여 적어도 약 70% , 더 바람직하게는 적어도 약 80% 및 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 일치하는 것이 양호하다. 발명의 일 실시 태양에서, 서열을 CDR 또는 소절편과 비교하는 경우, 비교 윈도(비교 윈도)는 더 작아서, 예컨대, 적어도 7개의 아미노산 또는 적어도 10개의 아미노산이다.
하기하는 바와 같이 최대로 상응하게 정렬하는 경우 두 서열 내의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열이 동일하면 상기 두 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열이 "일치하는" 또는 "일치"한다고 한다. 두 서열 간의 비교는 일반적으로 일치하는 비교 윈도를 통한 서열을 비교하여 수행되며, 서열 유사성 로컬 영역을 비교한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "비교 윈도"는 적어도 약 20 개의 인접한 위치의 구획, 일반적으로 30 내지 약 75, 40 내지 약 50개의 구획을 말하며, 여기서, 서열은 두 서열이 최적 정렬된 후, 인접 위치의 같은 수의 참고 서열과 비교될 수 있다.
비교를 위한 최적 정렬은 바이오인포메틱스 소프트웨어(DNASTAR, Inc., Madison, WI)의 레이저진 수트(Lasergene suite) 내의 MegAlign 프로그램을 사용하여, 고정 변수를 이용하여 수행될 수 있다.
이 프로그램은 하기하는 참고 문헌에서 개시한 정렬법을 구체화하고 있다: Dayhoff, M.O. (1978) A Model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. Dayhoff, M.O.(ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, KW. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, MoL Biol. Evol.4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, WJ. and Lipman, DJ., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.
또 다른 특징으로서, 상기 백분률 (아미노산) 일치성은 시판된 BLAST 또는 BLAST-2 프로그램 중의 하나를 사용하여 획득할 수 있다. WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)). 백분률 (아미노산) 서열 일치성은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))를 사용하여 결정될 수 있다.
BLAST 프로그램은 Karlin and Altschul. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990) 및 Altschul, et al., J. MoI. Biol. 215:403-410 (1990); Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993); 및 Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389- 3402 (1997)의 정렬법을 기초로 하였다.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 "동일성 퍼센트"는 적어도 20 개의 위치의 비교 윈도를 통한 2 개의 최적 정렬 서열 비교에 의하여 결정되며, 여기서, 비교 윈도 내의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 일부는 2 서열의 최적 정렬의 (부가체 또는 결실체를 포함하지 않는)참고 서열에 비하여 부가체 또는 결실체(즉, 갭) of 20% 이하, 일반적으로 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%를 포함할 수 있다. 상기 퍼센트는 일치하는 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양 서열 내에서 발생하여 부합하는 위치의 수를 산출하는 위치의 수를 결정하고, 부합하는 위치의 수를 참고 서열 내의 총 위치 수(즉, 윈도 크기)로 나누고 그 결과에 100을 여 서열 일치서 퍼센트가 산출된다. 발명의 일 실시 태양에서, 비교 윈도는 더 작을 수 있다(예컨대, 7 또는 10개의0 아미노산).
변이체는 또 다른 특징으로서, 본 명세서에서 기재한 폴리뉴클레오타이드, 또는 이들의 부분 또는 보체와 실질적으로 균질할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드 변이체는 적당한 긴축 조건 하에서 토종(native) 항체 (또는 상보 서열)을 암호화하는 자연 발생적 DNA 서열과 혼성화할 수 있다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 변이체는 고도의 긴축 조건 하에서 원 서열과 혼성화할 수 있다.
적합한 "적당한 긴축 조건"에는 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0) 용액으로 선세척; 50℃-65℃, 5 X SSC에서 1박 동안 혼성화; 0. 1 % SDS를 함유한 각 of 2X, 0.5X 및 0.2X SSC로 65℃에서 20 분간 2회 세척을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "고도로 긴축 조건" 또는 "고 긴축 조건"은 다음과 같다: (1) 낮은 이온 세기 및 고온의 세척, 예를 들어, 0.015 M 염화 나트륨/0.0015 M 시트르산 나트륨/0.1% 도데실 황산 나트륨 50℃; (2) 혼성화 중 변성제, 예컨대 포름아미드, 예를 들어, 50% (v/v) 포름아미드와 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐파이롤리돈/50mM 인산나트륨 버퍼를 pH 6.5에서 사용, 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산 나트륨을 42℃에서 사용; 또는 (3) 50% 포름아미드, 5 x SSC(0.75M NaCl, 0.075 M 시트르산 나트륨), 50 mM 인산 나트륨(pH 6.8), 0.1% 파이로인산 나트륨, 5 x 댄하트 용액, 초음파 분쇄 연어 정자 DNA(50 ㎍/ml), 0.1% SDS, 및 10% 황산 덱스트란을 42℃사용하고, 42℃의 0.2 x SSC(염화 나트륨 /시트르산 나트륨) 및 50% 포름아미드를 55℃로 세척한 뒤, EDTA를 함유하는 0.1 x SSC로 구성된 고 긴축 세척을 55℃에서 한다. 당해 기술 분야의 숙련자라면 온도, 이온 세기 등을 요소 예컨대, 프로브 길이 등을 수용하도록하기 위하여 조절하는 것을 이해할 수 있다.
당해 기술 분야의 숙련자라면 유전 암호의 퇴화의 결과, 본 명세서에서 기재한 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드가 많이 존재한다는 것을 이해하여야 한다. 그럼에도, 코돈 활용의 차이에 기인한 다양한 폴리뉴클레오타이드가 본 발명에 의하여 특별히 고려되었다.
폴리뉴클레오타이드는 당해 기술 분야에 알려진 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 항체를 암호화한 DNA는 항체 mRNA를 발현하는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 획득할 수 있다. 상기 항체-암호화 유전자는 게놈 라이브러리로부터 또는 올리고뉴클레오타이드 합성에 의하여 획득할 수 있다. 라이브러리는 대상 유전자 또는 그것에 의하여 암호화된 단백질과 일치하도록 설계된 프로브(예컨대 적어도 약 20-80개 염기의 결합 파트너 또는 올리고뉴클레오타이드)로 선별될 수 있다. 예시적인 라이브러리에는 인간 간 cDNA 라이브러리 (인간 간 5' 신장 플러스 cDNA, Clontech Laboratories, Inc.) 및 마우스 신장 cDNA 라이브러리 (마우스 신장 5'-신장 cDNA, Clontech laboratories, Inc.)를 포함한다. 선택된 프로브에 의한 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 선별은 표준 실험 절차, 예컨대 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989에 개시된 절차를 사용하여 수행될 수 있다. 또 다른 특징으로서, PCR 방법을 사용하여 항체를 암호화한 유전자를 단리할 수 있다(Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995).
폴리뉴클레오타이드 변이체는 일반적으로 예컨대, 고체상 포스포아미다이트 화학 합성 등의 화학 합성을 포함하는 당해 기술 분야에 알려진 모든 방법에 의하여 제조된다. 폴리뉴클레오타이드 서열의 변형체는 표준 돌연변이유발 기술, 예컨대 올리고뉴클레오타이드 관련 부위 특이적 돌연변이유발을 사용하여 도입될 수도 있다(Adelman et al., DNA 2:183, 1983 참조). 또 다른 특징으로서, DNA가 적합한 RNA 폴리머라아제 프로모터(예컨대 T7 또는 SP6)를 보유한채 벡터 내로 통합되는 경우, RNA 분자는 항체, 또는 이들의 부분을 암호화한 DNA 서열의 생체 외 또는 생체 내 전사에 의하여 생성될 수 있다. 특정 부분은 본 명세서에서 기재한 바와 같이 암호화된 폴리펩타이드의 제조용으로 사용될 수도 있다. 이와 함께, 또 다른 특징으로서, 일 부분은 환자에게 투여되어 암호화된 폴리펩타이드가 생체 내(예컨대, 항원-제시 세포, 예컨대 수지상 세포를 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA 구조에 전달 감염시키고, 상기 전달 감염 세포를 환자에 투여)에서 생성된다.
모든 폴리뉴클레오타이드는 추가 변형되어 생체 내 안정성을 향상시키게 된다. 가능한 변형체는 5' 및/또는 3' 말단에 인접 서열의 부가; 골격 내에서 포스포디에스테라아제 결합보다 포스포로티오에이트 또는 2`O-메틸의 사용; 및/또는 비전형 염기 예컨대 이노신, 큐에오신 및 와이부토신, 및 아데닌, 싸이티딘, 구아닌, 티민 및 우라딘의 아세틸-, 메틸-, 티오- 및 그 밖의 변형 형태의 부가를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
뉴클레오타이드 서열은 종래의 재조합 DNA 기술을 사용하여 다양한 다른 뉴클레오타이드 서열과 결합할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드, 파지미드, 람다 파지 유도체 및 코스미드 등을 포함하는 다양한 클로닝 벡터 내로 클론될 수 있다. 특정 대상 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 시퀀싱 벡터를 포함한다. 일반적으로, 벡터는 적어도 하나 이상 유기체 내에서 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선택가능 마커로 기능하는 복제 원점을 함유할 것이다. 그 밖의 요소는 소망하는 용도에 의존하며, 이는 당해 기술 분야의 숙련자에게 자명하다.
본 발명의 일 실시 태양에서는, 폴리뉴클레오타이드는 제형화되어 포유류 세포 내로 침투가능하게 되고, 그 안에서 발현하게 된다. 이러한 제형화는 특히 하기하는 치료 목적에 유용하다. 당해 기술 분야의 숙련자는 표적 세포 내의 폴리뉴클레오타이드 발현을 달성하는 많은 방법이 있으며, 모든 적합한 방법을 사용할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 예컨대, 아데노바이러스(adenovirus), 아데노 유관 바이러스, 레트로바이러스(retrovirus), 또는 바씨니아 또는 그 외의 폭스 바이러스(예컨대, 아비안 폭스 바이러스(avian pox virus))를 포함하나 이에 한정되지 않는 바이러스 벡터 내로 통합될 수 있다. 이러한 벡터 내로 DNA 통합 기술은 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 레트로바이러스 벡터는 선별 마커(변환 세포의 동정 또는 선별의 보조) 및/또는 표적화 모이어티, 예컨대 특이적 표적 세포 상의 수용체 리간드를 암호화하는 유전자를 위하여 추가적으로 유전자를 전이 또는 통합하여 벡터에 표적 특이성을 부여한다. 표적화는 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 방법에 의하여 항체를 사용하여 수행될 수 있다.
약학적 조성물 및 키트
본 발명은 본 명세서에서 기재한 폴리펩타이드(예컨대, 항체) 및/또는 폴리뉴클레오타이드를 포함한 조성물을 추가로 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 본 명세서에서 기재한 상기 폴리펩타이드를 포함한 약학적 조성물을 제공한다. 상기 폴리펩타이드를 포함하는 키트를 또한 제공한다.
본 발명의 조성물은 비약학적 조성물 (예컨대, 불순 또는 비멸균 조성물) 및 약학적 조성물 (즉, 환자 또는 대상에게 투여하기 적합한 조성물)의 제조에 유용한 의약 원재 조성물을 포함하며, 이는 단위 투여형의 제조시 사용되기도 한다.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 약학적 조성물은 본 명세서에서 기술한 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용가능한 부형제(본 명세서에서 "약학적으로 허용가능한 담체"로도 나타냄)를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 약학적 조성물 내의 폴리펩타이드는 항체이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 약학적 조성물 내의 폴리펩타이드는 인체적응형 항체이다.
본 발명의 범위 내의 약학적 조성물은 생물학적으로 활성 또는 비활성인 다른 화합물을 함유할 수 있다.
약학적 조성물은 전술한 하나 이상의 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 함유할 수 있으며, 따라서 상기 폴리펩타이드는 그 위치에서 생성된다. 상기 언급한 바와 같이, DNA는 핵산 발현 시스템, 박테리아 및 바이러스 발현 시스템을 포함하는 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 다양한 전달 시스템 내에 제공될 수 있다. 많은 유전자 전달 기술이 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예컨대 Rolland, 1998, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 및 상기 문헌에 인용된 문헌에 개시되어 있다. 적합한 핵산 발현 시스템은 환자 내에서 발현을 위한 필수적인 DNA 서열을 함유한다(예컨대, 적합한 프로모터 및 종결 신호).
양호한 실시 상태에서, 상기 DNA는 바이러스 발현 시스템(예컨대, 바시니아 또는 그 밖의 폭스 바이러스, 레트로바이러스, 또는 아데노바이러스)을 사용하여 도입될 수 있으며, 이는 비병원성(결여), 자가복제 가능 바이러스의 사용과 관련되어 있다. 적합한 시스템은, 예를 들어, Fisher-Hoch et al, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321; Flexner et al., 1989, Ann. N. Y. Acad Sci. 569:86-103; Flexner et al., 1990, Vaccine 8:17-21; 미국 등록특허 제4,603,112호, 제4,769,330호, 및 제5,017,487호; 제WO 89/01973호; 미국 등록특허 제4,777,127호; 제GB 2,200,651호; 제EP 0,345,242호; 제WO 91/02805호; Berkner-Biotechinques 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431-434; Kolls et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219; Kass-Eisler et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502; Guzman et al., 1993, Circulation 88:2838-2848; 및 Guzman et al., 1993, Cir. Res. 73:1202-1207에 개시되어 있다. 이러한 발현 시스템 내로 DNA를 통합하는 기법은 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 상기 DNA는 예를 들어, Ulmer et al., 1993, Science 259:1745- 1749에 개시되고, Cohen, 1993, Science 259:1691-1692에 의하여 연구된 바와 같이 "나체"일 수 있다. 나체 DNA의 포획은 DNA를 생분해성 비드로 피복함으로서 증진시킬 수 있으며, 이는 세포 내로 효율적으로 이동하도록 한다.
당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 적합한 모든 담체가 본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있으나, 담체의 유형은 투여의 형태에 따라 다양하게 달라질 수 있다. 본 발명의 조성물은 예를 들어, 국소, 경구, 비강내, 동맥내, 두개내, 복강내, 피하조직 또는 근육내 투여를 포함하는 모든 적합한 방법의 투여를 위하여 제형화될 수 있다. 비경구 투여, 예컨대 피하조직 주사에 있어서, 상기 담체는 물, 식염수, 알콜, 지방, 왁스 또는 버퍼를 포함하는 것이 양호하다.
경구 투여에 있어서, 상기 모든 담체 또는 고형 담체, 예컨대 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린 나트륨, 활석, 셀룰로오스, 글루코스, 싸카로오스, 및 탄산 마그네슘이 사용될 수 있다. 생분해성 미세구(예컨대, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)는 본 발명의 약학적 조성물을 위한 담체가 사용될 수 있다. 적합한 생분해성 미세구는, 예를 들어, 미국 등록특허 제 4,897,268호 및 제5,075,109호에 개시되어 있다.
이러한 조성물은 버퍼를 포함할 수 있다(예컨대, 중성 버퍼 식염수 또는 인산염 버퍼 식염수), 탄수화물(예컨대, 글루코스, 만노스, 싸카로오스 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 폴리펩타이드 또는 아미노산 예컨대 글리신, 항산화제, 킬레이트제 예컨대 EDTA 또는 글루타티온, 항원보강제(예컨대, 수산화 알루미늄) 및/또는 보존제를 포함할 수 있다. 또 다른 특징으로서, 본 발명의 조성물은 정장제로서 제형화될 수 있다. 화합물은 알려진 기술을 사용하여 리포좀 내로 캡슐화될 수 있다.
본 명세서에서 기재한 조성물은 지속 방출 제형의 일부로서 투여될 수 있다(즉, 투여 후 화합물 방출의 감속에 영향을 미치는 제형 예컨대, 캡슐 또는 스폰지). 이러한 제형은 일반적으로 잘 알려진 기술을 사용하여 제조되며, 예를 들어, 경구, 좌약식 또는 피하 이식 또는 소망하는 표적 부위에 이식함으로서 투여될 수 있다.
지속 방출형 제형은 담체 매트릭스 내에서 분산된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체를 함유하며 및/또는 속도 조절 멤브레인에 의하여 둘러싸인 보유낭에 함유된다. 이러한 제형에 사용되는 담체는 생체적합성이며, 및 생분해성일 수 있다; 상기 제형은 상대적으로 일정 수준의 활성 성분 방출을 제공할 수 있는 것이 바람직하다. 지속 방출 제형을 함유한 활성 화합물의 양은 이식 부위, 속도 및 기대되는 방출 지속시간 및 치료되는 질병의 특성에 의존한다.
발명의 일 실시 태양에서, 상기 폴리펩타이드는, 예를 들어, 코아세르베이트화 기술 또는 계면 고분자화(예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-미소캡슐 및 폴리(메틸메타실레이트) 미소캡슐, 각각)에 의하여, 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐), 또는 마크로에멀젼 내에서 제조된 미소캡슐 내로 포획된다. 이러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; 및 Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000에 개시되어 있다.
상기 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위하여, 예컨대 미국 등록특허 제5,739,277호에 개시된 바와 같이 구조 수용체 결합 에피토프를 상기 항체 (특히, 항체 절편)에 통합시킬 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "구조 수용체 결합 에피토프"라는 용어는 IgG 분자의 생체 내 혈청 반감기를 증가시키는 역할을 하는 IgG 분자(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 나타낸다.
본 명세서에서 기재한 상기 항체는 면역리포좀으로 제형화될 수 있다. 상기 항체를 함유한 리포좀은 당해 기술 분야에 알려진 방법, 예컨대, Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang et al., 1980, Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030; 및 미국 등록특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호에서 개시한 방법에 의하여 제조될 수 있다. 순환시간이 증강된 리포좀은 미국 등록특허 제5,013,556호에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포좀은 딜포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도 딜포스파티딜에타놀라민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물로 역전상 증발법에 의하여 생성될 수 있다. 리포좀은 구체 크기를 정의하는 필터를 통과하여 압출되어 소망하는 반지름을 지닌 리포좀으로 산성된다. 이와 함께, 본 발명 항체의 Fab` 절편은 Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288에 개시한 바와 같이 이황화 상호 작용을 통하여 리포좀과 컨쥬게이션된다.
본 명세서에서 기재한 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 또는 숙주 세포를 포함하는 키트 및 제조용 물품이 또한 제공된다.
발명의 일 실시 태양에서, 제조용 물품은 라벨이 달린 용기를 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 비알, 및 시험관을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성된다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 용기는 CD26 발현 세포의 동정 또는 정량화, CD26 발현 세포의 증식의 억제, 또는 CD26 발현 유관 질병의 치료에 유용한 조성물을 고정한다. 발명의 일 실시 태양에서,
용기 상의 라벨은 상기 조성물이 CD26 발현 세포의 동정 또는 정량화, CD26 발현 세포의 증식의 억제, 또는 CD26 발현 유관 질병의 치료에 유용하다는 것을 적시한다.
발명의 일 실시 태양에서, 본 발명의 키트는 전술한 용기를 포함한다. 본 발명의 다른 실시 태양에서, 본 발명의 키트는 전술한 용기 및 버퍼를 포함한 2차 용기를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 키트는 그 안에 함유된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 숙주 세포의 용도에관한 설명을 하는 패키지 삽입물을 포함한다
상기 폴리펩타이드의 용법
본 발명의 폴리펩타이드(예컨대 항체)는 진단법 및 치료법을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 응용에 유용하다. CD26 발현 세포의 증식의 억제 방법이 또한 제공되었다.
본 발명의 항체 및 폴리펩타이드는 CD26 발현과 관련된 질병(예컨대 a 질병 또는 장애)의 검출, 진단 및/또는 모니터링에 사용될 수 있다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현과 관련된 질병은 비정상적 CD26 발현 유관 질병이다. 예를 들면, 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현과 관련된 질병은 변화된 또는 변종의 CD26 발현 유관 질병이다(발명의 일 실시 태양에서, 증가된 또는 감소된 CD26 발현 (정상 시료에 비하여), 및/또는 적합한 발현, 예컨대 정상적으로는 CD26 발현이 부재한 조직(들) 및/또는 세포(들) 내에서 발현의 존재, 또는 정상적으로는 CD26 발현을 하는 조직(들) 또는 세포(들) 내에서 CD26 발현의 부재). 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현과 관련된 질병은 CD26 과다 발현과 관련된 질병이다.
CD26의 과다발현은 정상적으로는 CD26 발현이 부재한 조직(들) 및/또는 세포(들) 내에서 발현의 존재, 또는 정상적으로는 CD26 발현을 하는 조직(들) 또는 세포(들) 내에서 CD26 발현의 부재하는 것을 포함하는 것으로 이해하여야 한다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현과 관련된 질병은, 적어도 부분적으로는, CD26에 의하여 매개된다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현과 관련된 질병은 CD26 발현 세포 유관 질병이다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현과 관련된 질병은 CD26 발현 세포의 증식과 관련된 질병이다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현 세포의 증식은 비정상적 증식이다. 진단 방법은 생체 외 또는 생체 내일 수 있다.
예시적인 참고 자료가 이러한 논의가 본 발명의 폴리펩타이드에 적용된다는 것을 전제로 항체에 대한 논의에서 만들어졌다.
진단적 응용에서, 상기 항체는 일반적으로 방사성동위원소, 형광 표지, 및 다양한 효소 기질 표지을 포함하나 이에 한정되지 않는 검출 가능한 모이어티를 지닌 것으로 표지하게 될 것이다. 항체에 라벨을 컨쥬게이션하는 방법은 당해 기술 업계에 잘 알려져 있다. 본 발명의 다른 실시 태양에서, 본 발명의 항체는 표지될 필요는 없으며, 이들의 존재는 본 발명의 항체에 결합된 표지 항체를 사용하여 검출할 수 있다.
본 발명의 상기 항체는 경쟁적 결합 측정법, 직접 및 간접 샌드위치 측정법, 및 면역침전 측정법 등의 알려진 측정법이 사용될 수 있다. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147- 158 (CRC Press, Inc. 1987).
상기 항체는 생체 내 진단적 측정법, 예컨대 생체 내 이미지화에 사용될 수 있다. 일반적으로, 상기 항체는 (예컨대 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 또는 3H)으로 표지되어, 면역신시오그라피(immunoscitiography)를 사용하여 대상 세포 또는 조직이 국소화되었다.
상기 항체는 당해 기술 분야에 잘 알려진 기술을 따라 병리학 염색 시약을 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징으로서, 본 발명은 CD26 발현 세포 증식의 억제 방법을 제공한다. CD26 발현 세포의 증식의 억제는 일부 내지 전부 증식 억제를 포함하는 관찰가능한 수준의 모든 억제를 포괄한다. 발명의 일 실시 태양에서, 세포의 증식은 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98%, 또는 약 100%가 억제된다. 상기 방법은 생체 외 또는 생체 내일 수 있다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 방법은 본 명세서에서 기재한 폴리펩타이드(예컨대, 항체)를 지닌 세포와 접촉하는 것을 포함한다. 일반적으로, 상기 세포는 상기 세포 증식을 억제하는데 충분한 양의 폴리펩타이드와 접촉한다.
다수의 암 세포가 CD26을 발현하는 것으로 동정되었다. 예를 들면, CD26은 각각의 다음의 암 세포에서 과다발현되는 것으로 동정되었다: T 세포 림프종 (Ruiz et al. (1998) Cytometry, 34:30-5); B 만성 림프성 백혈병 (B-CLL) (Bauvois et al. (1999) Br. J. Cancer, 79:1042-8); 갑상선 암종 (Aratake et al. (1991) Am. J. Clin. Pathol., 47:43-7); 기저 세포 암종 (Moehrle et al. (1995) J. Cutan. Pathol. 22:241-7); 유방 암(Dixon et al. (1994) Clin. Pathol., 47:43-7); 간세포 암종 (Stecca et al. (1997) 27:337-45); 및 폐 종양(Sedo et al. (1991) 40:359-62). CD26가 다양한 암세포주에서 발현된다는 사실을 지적한 실험 결과가 특정 실시예, 하기하는 실시예 12에 제공되었다.
본 명세서에서 기재한 특징의 실시 상태에서, CD26 발현 세포는 인간 세포이다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현 세포는 암세포이다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현 세포는 액혈 암세포, T-세포 암세포, 췌장 암세포, 신장 암세포, a 림프종 세포, B-세포 암세포, 갑상선 암세포, 유방 암세포, 난소 암세포, 전립선 암세포, 결장 암세포, 방광 암세포, 폐 암세포, 간 암세포, 위 암세포, 고환 암세포, 자궁 암세포, 뇌 암세포, 림프계 암세포, 피부 암세포, 뼈 암세포, 직장 암세포, 육종 세포, T-세포 림프종 세포, 폐 선암종 세포, 갑상선 암종 세포, B-세포 만성 림프성 백혈병 세포, 또는 B-세포 림프종 세포이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 암세포는 림프종 세포, 신장 암세포, 전립선 암세포, 또는 폐 암세포이다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현 세포는 종양 세포, 예컨대 고형 종양 내의 세포이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 종양 세포는 악성 또는 양성이다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현 세포는 T-세포이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 세포는 인간 T-세포이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 세포는 악성 T-세포이다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현 세포는 과다활동 면역 세포이다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현 세포는 활성화된 T-세포이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 세포는 인간의 것이다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현 암세포는 동일 종류의 비암성(cancerous) 세포에 비하여 CD26이 과다발현된다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26 과다발현 암세포는 유방 암세포, 전립선 암세포, 직장결장 암세포, 난소 암세포, 신장 암세포, T-세포 림프종, B 만성 림프성 백혈병(B-CLL), 기저 세포 암종, 간세포 암종, 또는 폐 암세포이다.
세포 증식의 억제를 평가하는 방법은 당해 기술 업계에 잘 알려져 있으며, MTT 측정법을 포함한다(예컨대, Aytac et al. (2003) British Journal of Cancer 88:455-462, Ho et al. (2001) Clinical Cancer Research 7:2031-2040, Hansen et al. (1989) J. Immunol. Methods, 119:203-210, 및 Aytac et al. (2001) Cancer Res. 61:7204-7210를 참조할 것). MTT 측정법의 예는 특정 실시예인, 하기하는 실시예 2(G), 3(D), 및 5에 제공되었다.
본 발명은 환자 내에서 CD26 발현 유관 질병을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 환자 내의 CD26 발현과 관련된 증상의 치료 방법은 본 명세서에서 기재한 폴리펩타이드, 예컨대 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 환자에 투여하는 것을 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현과 관련된 질병은 비정상적 CD26의 발현에 관련된 질병이다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현과 관련된 질병은 변화된 또는 변종의 CD26 발현과 관련된 질병이다(발명의 일 실시 태양에서, 증가 또는 감소된 CD26 발현(정상 시료에 비하여), 및/또는 적합한 발현, 예컨대 정상적으로는 CD26 발현이 부재한 조직(들) 및/또는 세포(들) 내에서 발현의 존재, 또는 정상적으로는 CD26 발현을 하는 조직(들) 또는 세포(들) 내에서 CD26 발현의 부재). 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현과 관련된 질병은 CD26 과다 발현과 관련된 질병이다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현과 관련된 질병은 적어도 부분적으로 CD26에 의하여 매개된다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현과 관련된 질병은 CD26 발현 세포 유관 질병이다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현과 관련된 질병은 CD26 발현 세포의 증식과 관련된 질병이다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26-발현 세포의 증식은 비정상적이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 CD26 발현 세포는 T-세포이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 CD26 발현 세포는 악성 또는 양성인 종양 세포이다. 발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현과 관련된 질병은 암 세포가 CD26+ 암 세포이거나 또는 CD26을 발현하는 암(즉, CD26-발현 암)이다(추가적으로 CD26을 발현하는 세포는 전술하였다.).
발명의 일 실시 태양에서, 환자 내에서 CD26 발현과 관련된 질병은 증식 질환이다. 발명의 일 실시 태양에서, 환자 내에서 CD26 발현과 관련된 질병은 암이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 암은 CD26+ 혈액암이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 암은 T-세포 암, 예컨대 T-세포 림프종이다. 예를 들면, 발명의 일 실시 태양에서, 상기 암은 T-세포 림프모세포 림프종 또는 급성 림프모세포 백혈병이다. 본 발명의 다른 실시 태양에서, 상기 암은 T-세포 CD30+ 역형성 대세포 림프종이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 암은 말초 T-세포 림프종, T-세포 만성 림프성 백혈병, 혈액면역모세포 T-세포 림프종, 혈관중심성(angiocentric) T-세포 림프종, HTLV-유관 T-세포 백혈병, 또는 성인 T-세포 백혈병이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 암은 고형 종양이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 암은 췌장암, 신장암, 또는 림프종이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 암은 B-세포암, 갑상선암, 유방암, 난소암, 전립선암, 결장암, 방광암, 폐암, 간암, 위암, 고환암, 자궁암, 뇌암, 림프계암, 피부암, 뼈암, 직장암, 육종, 폐암, B-세포 만성 림프성 백혈병, 또는 a B-세포 림프종이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 암은 CD26의 과다발현과 관련되어 있다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 암은 중피종이 아니다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 암은 흑색종이 아니다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 암은 림프종, 신장암, 전립선암, 또는 폐암이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 암은 림프종이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 암은 신장 암종이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 암은 전립선 암종이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 암은 폐 암종이다.
발명의 일 실시 태양에서, CD26 발현과 관련된 질병은 염증 질병 또는 장애이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 염증 질병은 CD26의 과다 발현와 관련되어 있다.
본 발명의 다른 실시 태양에서, CD26 발현과 관련된 질병은 혈관 형성증이다.
실시 상태를 더 살펴보면, CD26 발현과 관련된 질병은, 예컨대, 이식편 대 숙주 질환 및 자가면역 질환 또는 장애에 한정되지 않는 활성화된 면역 상태와 관련된 질병이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 질병은 에디슨병, 탈모, 강직척추염, 항인지질 증후군, 베체트병, 만성 피로 증후군, 크론씨병, 궤양대장염, 당뇨, 섬유근육통, 굿파스쳐 증후군, 그레비스병, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 루프스, 메니에르 다발성 경화증, 중증근무력증, 보통천포창, 1차 담관성 간경화, 건선, 류마티스관절염, 류마티스열, 사코이드증, 공피증, 혈관염, 백반증, 또는 베게너 육아종증이다. 발명의 일 실시 태양에서, 활성화된 면역 상태와 관련된 질병은 CD26의 과다 발현과 관련되어 있다.
본 발명의 일 특징으로서, 본 발명은 암의 치료 방법을 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 기재한 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 환자 내에서 암의 진행을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 유효량을 환자에 투여하는 것을 포함하는, 환자 내의 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 환자는 CD26-발현 종양이 있거나 또는 CD26- 발현 종양이 제거되었다. 발명의 일 실시 태양에서, 종양의 퇴화가 유도되었다. 본 발명은 본 명세서에 기재한 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자 내의 암 세포(예컨대, CD26-발현 암 세포)의 전이를 억제하는 방법을 추가로 제공한다.
발명의 일 실시 태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 추가적 형태의 요법으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 추가적 형태의 요법은 추가적인 항암 치료이다. 본 명세서에 기재된 방법의 실시 태양은 화학 요법, 방사선요법, 외과적 수술, 호르몬 요법, 및/또는 추가적 면역 요법으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 방사선요법은 외부 방출 방사선요법 또는 원격 치료법이다. 본 발명의 다른 실시 태양에서, 상기 방사선요법은 내부 요법 또는 근접치료법으로서 투여된다. 발명의 일 실시 태양에서, 추가적 형태의 요법은 하나 이상의 치료제, 예컨대, 키나아제 억제제의 투여를 포함한다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 치료제는 치료적 항체, 예컨대 항-VEGF 항체인 아비스틴(Avastin®), 항-HER2 항체인 헤르셉틴(Herceptin® (Trastuzumab))(Genentech, California), 항-CD25 항체인 제나팍스(Zenapax® (daclizumab))(Roche Pharmaceuticals, Switzerland), 및 항-CD20 항체인 리툭산(Rituxan™) (IDEC PharrnVGenentech, Roche/Zettyaku)이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 추가적 치료제는 혈관형성 억제제이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 추가적 치료제는 세포독성제이다. 일 실시 태양에서, 상기 추가적 치료제는 항암제이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 추가적 치료제는 항염증제이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 추가적 약제는 파크리탁셀(Taxol®), 도세탁셀(Taxotere®), 프레드니손, 시스플라틴, 미토마이신, 프로게스테론, 타목시펜 시트레이트, 플루오로우사실, 및 독소루비신 하이드로클로라이드로 구성되는 군으로부터 선택된 약제를 포함한다.
본 명세서에 기재된 방법(치료 방법을 포함)은 단일 시점 또는 다중 시점에, 또는 여러 부위에 단일 직접 투여에 의하여 달성된다. 투여는 여러 부위에 거의 동시에 투여될 수 있다. 투여 빈도는 치려 과정에 따라 결정되고 조절되며 소망하는 결과의 달성에 기초한다. 일부의 경우, 본 발명의 폴리펩타이드(항체 포함), 폴리뉴클레오타이드, 및 약학적 조성물의 지속형 계속 방출 제형이 적합하다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제형 및 기구가 당해 기술 업계에 잘 알려져 있다.
환자, 대상체, 또는 개체는 포유류, 예컨대 인간, 소과, 말, 개과, 고양이과, 돼지, 및 양 등의 동물을 포함한다. 상기 환자는 인간이 것이 바람직하며, 질병을 겪고 있거나 현재 증상을 보일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 환자는 암환자이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 환자는 종양을 가지거나 종양이 제거되었다. 종양이 환자로부터 제거되었더라도, 종양 세포는, 예컨대, 환자 내에 남아 있을 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들면, 일 부분의 종양이 제거되었다 하더라도, 상기 종양은 체내의 다른 부위로 전이되거나 퍼져있을 수 있다. 또한, 환자로부터 종양이 제거되었다 하더라도, 종양의 일부 또는 일부 종양 세포는 외과적 수술 등의 한계에 기인하여 우연히 또는 불가피하게 환자의 체내에 남을 수 있다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 환자는 종양(또는 암)이 발생할 위험이 있다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 환자는 추가적 치료 (예컨대, 화학 요법, 외과적 수술, 호르몬 요법, 방사선요법, 또는 추가적 면역 요법)을 받고 있거나 또는 받았었다.
상기 항체는 담체 내에서 포유류로 투여되는 것이 바람직하며; 약학적으로 허용가능한 담체가 바람직하다. 적합한 담체 및 이들의 제형은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; 및 Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000에 개시되어 있다. 일반적으로, 적합한 양의 약학적으로 허용가능한 염이 제형화에 사용되어 상기 체형에 등장성을 부여한다. 상기 담체의 예는 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함한다. 상기 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 더 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 추가의 담체는 지속 방출 제제 예컨대, 상기 항체를 포함하는 고형 소수성 고분자의 반투과성 매트릭스를 포함하는데, 상기 매트릭스는 형상화한 물건의 형태, 예컨대, 박막, 리포좀 또는 미소입자 등이다. 특정 담체는 예를 들면, 투여 경로 및 투여된 항체의 농도에 의존하는 것이 바람직하다는 것은 당해 기술 분야의 숙련자에게 자명하다.
상기 항체는 주사(예컨대, 전신, 정맥, 복강내, 피하, 근육내, 내삽법), 또는 다른 방법, 예컨대 유효한 형태로 혈관에 학실하게 전달하는 주입에 의하여 포유류에 투여된다. 상기 항체는 단리된 관류 기술, 예컨대 단리된 조직 관류에 의하여 투여되어 효과적인 국부 치료를 발휘하게 할 수도 있다. 정잭 주사가 바람직하다.
상기 폴리펩타이드(예컨대, 항체)의 유효한 복용량 및 투여 계획은 경험에 의하여 결정될 수 있으며, 이러한 결정은 당해 기술 분야의 범위 내에 있다. 당해 기술 분야의 숙련자는 투여되어야 하는 항체의 복용량이, 예를 들어, 상기 항체를 받은 포유류, 투여 경로, 사용된 항체의 특정 유형 및 포유류에 투여된 다른 약제 등에 의존한다는 것을 이해하여야한다. 적합한 항체 복용량 선택의 기준은 항체의 치료적 이용에 관한 문헌, 예컨대, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N. J., 1985, ch. 22 및 pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis 및 Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York, 1977, pp. 365-389에서 찾을 수 있다.
상기 항체 단독 사용시 일반적인 일일 복용량은 약 1 ㎍/kg 체중 내지 100 mg/kg 체중 또는 그 이상이며, 상기 언급한 요소에 의존한다. 일반적으로, 다음의 복용량이 사용된다: 적어도 약 50 mg/kg 체중; 적어도 약 10 mg/kg 체중; 적어도 약 3 mg/kg 체중; 적어도 약 1 mg/kg 체중; 적어도 약 750 ㎍/kg 체중; 적어도 약 500 ㎍/kg 체중; 적어도 약 250 ㎍/kg 체중; 적어도 약 100 ㎍/kg 체중; 적어도 약 50 ㎍/kg 체중; 적어도 약 10 ㎍/kg 체중; 적어도 약 1 ㎍/kg 체중, 또는 그 이상이 투여된다. 발명의 일 실시 태양에서, 본 발명이 제공하는 폴리펩타이드(예컨대, 항체)의 복용량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 50mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 0.1 mg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.1 mg 내지 약 20 mg/kg, 약 0.5 mg 내지 약 15 mg, 또는 약 1 mg 내지 10 mg이다. 발명의 일 실시 태양에서, 상기 복용량은 약 1 mg 내지 5 mg이다. 본 발명의 다른 실시 태양에서, 상기 복용량은 약 5 mg 내지 lO mg이다.
발명의 일 실시 태양에서, 하나 이상의 항체가 제공될 수 있다. 이러한 조성물은 적어도 하나 이상, 적어도 2개, 적어도 3개의, 적어도 4개의, 적어도 5개의 서로 다른 본 발명의 항체(폴리펩타이드 포함)를 함유할 수 있다.
상기 폴리펩타이드는 유효량의 하나 이상의 다른 치료제와 조합하여 포유류에 투여될 수도 있다. 상기 폴리펩타이드는 하나 이상의 다른 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 폴리펩타이드 및 치료제의 양은, 예를 들어, 사용되는 약제의 유형, 치료하는 대상의 병리학적 상태, 및 투여 계획 및 경로에 의존하나, 일반적으로 개별적으로 사용되는 경우 보다는 줄어들 것이다.
포유류에 항체를 투여한 후, 포유류의 생리학적 상태는 당해 기술 분야의 실무자에게 잘 알려진 다양한 방법으로 모니터할 수 있다.
이러한 투여 및 복용량의 원칙은 본 명세서에서 기술한 폴리펩타이드에도 적용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드(항체 포함)를 암호화한 폴리뉴클레오타이드는 소망하는 세포 내에서 상기 항체 또는 상기 폴리펩타이드의 전달 및 발현을 위하여 사용될 수 있다. 발현 벡터는 상기 항체가 직접 발현되도록 사용될 수 있다는 것은 자명하다. 상기 발현 벡터는 투여된 전신, 복막내, 정맥내, 근육내, 피하, 경막내, 뇌실내, 경구, 장내, 비경구, 비강내, 진피내, 또는 흡입에 의하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터의 투여는 주사를 포함하는 국부 또는 전신 투여, 경구 투여, 입자 총 또는 삽관 투여, 및 국소 투여를 포함한다. 당해 기술 분야의 숙련자는 생체 내에서 외래 단백질 발현을 얻기 위한 발현 벡터의 투여에 익숙하다. 예컨대, 미국 등록특허 제6,436,908호; 제6,413,942호; 및 제6,376,471호를 참조할 것.
본 발명의 폴리펩타이드 또는 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 치려적 조성물의 표적화 전달이 사용될 수 있다. 수용체-매개 DNA 전달 기술은 예를 들어, Findeis et al, Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou et al, Gene Therapeutics: Methods 및 Applications Of Direct Gene TransfeR(J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu et al, J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu et al, J. Biol Chem. (1994) 269:542; Zenke et al, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) (1990) 87:3655; Wu et al, J. Biol Chem. (1991) 266:338에 개시되어 있다. 폴리뉴클레오타이드를 함유한 치료적 조성물이 유전자 치료 프로토콜의 국부 투여를 위하여 약 100 ng 내지 100 mg의 DNA가 투여되었다.
약 500 ng 내지 약 50 mg, 약 1 ㎍ 내지 약 2 mg, 약 5 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 및 약 20 ㎍ 내지 약 100 ㎍의 DNA 농도 범위가 유전자 치료 프로토콜 과정에서 사용되었다. 본 발명의 치료적 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드는 유전자 전달 운반체를 사용하여 전달될 수 있다. 유전자 전달 운반체는 바이러스 또는 비-바이러스 기원일 수 있다(일반적으로, Jolly, Cancer Gene TherapY(1994) 1 :51; Kimura, Human Gene TherapY(1994) 5:845; Connelly, Human Gene TherapY(1995) 1:185; 및 Kaplitt, Nature GeneticS(1994) 6:148를 참조). 이러한 암호 서열의 발현은 포유류 내부 또는 이종유래성 프로모터를 사용하여 유도될 수 있다. 암호 서열의 발현은 설정되어 있거나 또는 조절될 수 있다.
소망하는 폴리뉴클레오타이드에 전달 및 소망하는 세포 내에서 발현을 위한 바이러스계 벡터는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예시적인 바이러스계 운반체는 재조합 레트로바이러스(예컨대, PCT 공개출원 WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; 미국 등록특허 5, 219,740; 4,777,127; 영국 등록특허 GB 2,200,651; 및 유럽 특허 EP 0345242를 참조), 알파바이러스계 벡터 (예컨대, 신드비스 바이러스 벡터, 샘리키 포레스트 바이러스(ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버 바이러스(ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네주엘라 에퀸 엔세팔리티스 바이러스(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), 및 아데노 유관 바이러스(AAV) 벡터 (예컨대, PCT 공개출원 WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655). Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147에 기술된 사멸 아데노 바이러스 결합 DNA의 투여가 사용되었다.
비바이러스 전달 운반체 및 방법으로서 사멸 아데노바이러스 단독 결합 또는 비결합 다중양이온 축합 DNA (예컨대, Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147); 리간드-결합 DNA(예컨대, Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985); 진핵 세포 전달 운반체 세포 (예컨대, 미국 등록특허 5,814,482; PCT 공개출원 WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; 및 WO 97/42338) 및 핵 전하 중성화 또는 세포 멤브레인과 융합을 포함하나 이에 한정되지 않는 것이 사용될 수 있다. 나체 DNA가 사용될 수도 있다. 예시적인 나체 DNA 도입 방법은 PCT 공개특허 제WO 90/11092호 및 미국 등록특허 제5,580,859호에 개시되어 있다. 유전자 전달 운반체로 활동하는 리포좀은 미국 등록특허 제5,422,120호; PCT 공개출원 WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; 및 유럽특허 EP 0 524 968에 개시되어 있다. 추가적인 방법은 Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411, 및 Woffendin, Proc. Natl. Acad. ScL (1994) 91:1581에 개시되어 있다.
이하 제공되는 실시예는 구체화를 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예
본 명세서에서 기재한 실시예 및 실시 태양은 단지 구체적인 설명을 위한 것이며, 당해 기술 분야의 숙련자는 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형 또는 변화를 제안할 수 있으며 이는 본 발명의 사상 및 범위의 내에 있음을 이해하여야 한다.
실시예 1 - 결합 친화도, 및 CM03 Fab의 VH와 VL 서열
CM03(본 명세서에서 14D10로 언급)는 인간 CD26에 대응하여 발생하는 마우스 단클론 항체이다. 상기 CM03의 VH 및 VL 서열은 하기하는 실시예에서 변이체를 설계하기 위한 선도체로서 사용되었다. Fab는 마우스 단클론 항체 CM03의 각 VL 및 VH 서열에 대응하는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하도록 제조될 수 있다. 이러한 CM03 Fab는 종종 본 명세서에서 "X369" 또는 "CM03 X369" 등으로 나타낸다.
Biacore® 기술 (표면 플라즈몬 공명, 또는 "SPR")이 CD26에 대한 CM03 Fab의 친화도를 측정하기 위하여 사용되었다. 일반적으로, SPR-계 바이오센서는 표면에 근접한 생체 분자의 농도를 측정함으로써 상호작용을 모니터 한다. 상기 표면은 그 위에 고정된 상호작용 파트너의 하나를 보유한다. 상대 파트너(들)을 함유한 시료가 그 표면 위로 흘러온다. 상기 시료의 분자가 표면에 부착된 반응체에 결합하는 경우, SPR 반응이 측정된다. 상기 반응은 표면에 결합된 분자에 비례한다.
이러한 친화도 측정은 생산자 메뉴얼에 따라 25℃에서 측정하였다. 분리된 재조합 인간 CD26 (rh디펩티딜 펩티다아제 IV, R&D 시스템즈, CAT# 1180-SE로부터 구득)은 PBS의 주로써 제조되었으며, CM5 칩(BiaCore Inc., CAT# BR-1000-14) 상에 고정되기 전에 농도가 ~0.05 mg/ml가 되도록 10 mM 나트륨 아세테이트 버퍼 pH 5로 희석하였다. 하기하는 이. 콜리로부터 생산된 Fab는 측정을 위하여 ~0.5 μM의 농도의 PBS로 희석되었다. 전형적인 기록은 Fab를 3분 간격으로 주사하는 것을 포함하며, 상기 결합 곡선의 실데이터를 기초로 하여 그 뒤 15분의 해리 및 분석을 수행하였다.
친화도는 하나의 분자와 다른 분자간의 단일 부위에서의 결합 세기이다. KD는 해리 상수이며, 상기 항체가 항원으로부터 해리되는 속도를 측정한다. 일반적으로, 낮은 KD 를 지닌 항체는 더 높은 친화도를 지닌다.
Biacore® 기술이 인간 CD26 항원의 VH 및 VL CM03를 포함한 Fab의 친화도를 측정하는데 사용된다. 이 데이터로부터, CM03 Fab (1.63xlO-9)의 KD 가 측정되었다. 이는 상대적으로 고 친화도를 나타낸다. CM03 Fab에 관한 추가적 친화도 데이터를 하기하는 표 2에 나타내었다 2.
Kon/SE(M-1·sec-1) Koff/SE(sec-1) KD(M)
CM03(X369) 5.09E+05/1.19E+04 8.29E-04/3.40E-06 1.63e-9
도 1은 CM03 마우스 Ab 및 CM03 Fab의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)의 서열을 나타낸다
실시예 2 - 인체적응형 CM03 변이체의 Fab
A. 서열
CM03 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 다양한 변이 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 생산하는 인체적응화에 사용되었다.
핵산 서열인 인체적응형 VL 변이체 X376 (SEQ ID NO: 1), X377 (SEQ ID NO:2), X378 (SEQ ID NO:3), X379 (SEQ ID NO:4), X380 (SEQ ID NO:5), X381 (SEQ ID NO:6), 및 X394 (SEQ ID NO:7)를 도 2에 나타내었다. 아미노산인 인체적응형 VL 변이체 X376 (SEQ ID NO: 15), X377 (SEQ ID NO:16), X378 (SEQ ID NO: 17), X379 (SEQ ID NO:18), X380 (SEQ ID NO: 19), X381 (SEQ ID NO:20), 및 X394 (SEQ ID NO:21)를 도 3에 나타내었다.
핵산 서열인 인체적응형 VH 변이체 X384 (SEQ ID NO: 8), X385 (SEQ ID NO:9), X386 (SEQ ID NO: 10), X387 (SEQ ID NO:11), X388 (SEQ ID NO: 12), X399 (SEQ ID NO:13) 및 X420 (SEQ ID NO:14) 를 도 4에 나타내었다. 아미노산 서열인 인체적응형 VH 변이체 X384 (SEQ ID NO:22), X385 (SEQ ID NO:23), X386 (SEQ ID NO:24), X387 (SEQ ID NO:25), X388 (SEQ ID NO:26), X399 (SEQ ID NO:27) 및 X420 (SEQ ID NO:28) 를 도 5에 나타내었다.
도 6은 VH 및 VL 변이체 모두를 포함하는 Fab 제조에 사용되는 변이 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 선택된 짝인 아미노산 서열을 나타낸다.
B. 발현
이. 콜리 세포주는 도 7-10에 나타낸 중쇄 및 경쇄 Fab 변이체의 발현에 사용된다.
발현을 위하여, 개체 이. 콜리 세포주를 100 ㎍/ml 카베니실린(Carbenicilline)을 함유한 2xYT 배지에 접종하여 IPTG를 첨가하여 최종 농도가 0.5 mM되기 전에 OD600=~1 될 대까지 37℃에서 배양하였으며, 상기 배양액은 그 다음 30℃에서 4-5 분간 Fab 생산하도록 유도되었다. 세포가 수확되었으며, 세포 형질 추출물이 표준 프로토콜(Phage Display, A Laboratory Manual, Carlos Barbas Ill et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)을 따라 제조되었다. 원 추출물은 생산자 설명서에 의하여 단백질 친화도 G 컬럼에서 분리되었으며 (Amerham-Pharmacia, CAT# 17-0404-01), 및 0.1 M 글리신 pH. 2.7로 녹여 분리하고, 즉시 1 M 트리스 pH 8로 중성화시켰다. 상기 시료는 Biacore 분석 및 다른 측정법을 이용하기 전에 OD280을 사용하여 단백질 농도를 위하여 광범위하게 및 결과적으로 결정된 PBS에 대하여 투석되었다.
도 7은 이. 콜리 균주 TGl에서 발현되는 CM03 VL 변이체 X376, X377, X378, X379, X380, X381의 Fab, 및 VH 변이체 X384, X385, X386의 Fab의 단백질 G 컬럼에 의하여 분리된 시료를 탑재한 비환원 조건하의 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. 상기 VL 변이체는 Fab 내에서 CM03 VH와 짝을 이루고; 상기 VH 변이체는 Fab 내의 CM03 VL과 짝을 이룬다. 각 시료에서 단백질 밴드는 약 50 kDa 부근에서 나타나며, 수득량은 X376, X377, X380, X384, X385, 및 X386에서 가장 높았다. 도 8은 이. 콜리에서 발현된 CM03 VL 변이체 X376, X377, X378, X379, X380, X381의 Fab, 및 Fab X369 (CM03)의 단백질의 축적의 양을 나타낸다. 시료 X376, X377, 및 X380은 CM03 마우스 Fab에 비하여 은 수준의 Fab 단백질을 지닌다. 도 11은 이. 콜리에서 발현된, CM03 VL과 짝을 이루는 VH 변이체 X384, X385, X386, X387 또는 X388를 포함하는 Fab의 단백질 수득량을 나타낸다
도 9는 이. 콜리 균주 TGl 내에서 Fabs인 CM03 VH 변이체 X387 및 X388의 발현, 및 Fab X389, X390, X391, X392, X393, X395 및 X396의 발현으로부터 단백질 G 컬럼에 의하여 분리된 시료가 탑재된, 비환원 조건 하의 SDS-PAGE 겔을 나타내며, 각각은 이. 콜리 HB2151 내에서 VL 변이체 및 VH 변이체의 짝을 포함한다. (상기 X387 및 X388 VH 변이체는 CM03 VL과 짝을 이룸.) 상기 VL 및 VH 짝인 Fab X389, X390, X391, X392, X393, X395 및 X396를 도6 에 나타내었다. 각 시료에서 단백질 밴드는 약 50 kDa 부근에서 나타났으며, 수득량은 X389, X390, X391, X395 및 X396에서 가장 높았다. 도 10은 이. 콜리 균주 HB2151에서 발현된 Fab VH 변이체 및 VL 변이체 짝 X389, X390, X391, X392, X393, X395 및 X396, 및 CM03 X369의 단백질 축적량을 나타낸다. 모든 경우에서 Fab 변이체 짝인 시료는 CM03 마우스 Fab 보다높은 수준의 단백질을 보유한다.
C. Fab 특성
하기하는 표 3은 Fab인 X369 (CM03 VH 및 VL), X391, X392, X396 및 X399의 다양한 이론적인 물리적 특성의 요약을 나타낸다. 예를 들면, 분자량, 극성 잔기의 수, 소수성 잔기, 등전점, 및 전체 전하량을 나타낸다.
Fab 특성
X369 분자량 49596.31 달톤 458 아미노산 38 강염기(+) 아미노산(K,R) 35 강산(-) 아미노산(D,E) 134 소수성 아미노산(A,I,L,F,W,V) 176 극성 아미노산(N,C,Q,S,T,Y) 7.992 등전점 4.973 전하(PH 7.0)
X391 분자량 49809.46 달톤 458아미노산 41강염기(+) 아미노산(K,R) 39강산(-) 아미노산(D,E) 129소수성 아미노산(A,I,L,F,W,V) 172극성 아미노산(N,C,Q,S,T,Y) 7.822등전점 3.943전하(PH 7.0)
X392 분자량 49634.45 달톤 458 아미노산 41 강염기(+) 아미노산(K,R) 36 강산(-) 아미노산(D,E) 134 소수성 아미노산(A,I,L,F,W,V) 170 극성 아미노산(N,C,Q,S,T,Y) 8.272 등전점 6.776 전하(PH 7.0)
X396 분자량 49664.36 달톤 458 아미노산 40 강염기(+) 아미노산(K,R) 39 강산(-) 아미노산(D,E) 132 소수성 아미노산(A,I,L,F,W,V) 170 극성 아미노산(N,C,Q,S,T,Y) 7.625 등전점 2.950 전하(PH 7.0)
X399 분자량 49678.39 달톤 458 아미노산 40 강염기(+) 아미노산(K,R) 39 강산(-) 아미노산(D,E) 132 소수성 아미노산(A,I,L,F,W,V) 170 극성 아미노산(N,C,Q,S,T,Y) 7.625 등전점 2.950 전하(PH 7.0)
D. 변이체 경쇄 가변 영역을 포함하는 Fab의 특이성
CM03 Fab X369 및 CM03 VH와 결합된 X377 VL 변이체를 포함하는 Fab의특이성 분석을 수행하였다. 데이터는 도 12 A, 12B, 및 12C에 나타낸다. 상기 데이터는 Biacore® 기술을 사용하여 생성되었다. CD26 결합 파트너는 하기하였다.
도 12A는 인간 CD26에 결합된 X369 (CM03 Fab)를 나타낸다. 또한 CM03의 추가적인 도입 후 약 800초에서의 반응을 나타낸다. 도 12B는 인간 CD26와 결합한 X369 (CM03 Fab)를 나타낸다. 또한 CM03 VH와 짝을 이루는 X377 VL 변이체를 포함하는 Fab의 도입 후 약 600 초에서의 반응을 나타낸다. 도 12C은 인간 CD26와 결합한 X377 Fab와 대비한 CM03 Fab X369에 의하여 선점된 CD26에 결합된 X377 Fab를 나타낸다. 감소된 수준의 X377 Fab와 X369와 미리 결합된 CD26의 결합은, X377 Fab 미리 결합하지 않은 CD26와의 결합에 비하여, X377 Fab 및 CM03 Fab X369는 유사하거나 또는 적어도 CD26와 상호작용하는 오버랩된 부위를 지닌다는 것을 적시한다.
E. Fab 변이체의 인간 CD26에 대한 친화도
하기하는 표 4는 CM03 X369 및 각각 CM03 VL 변이체 X376, X377, X378, X379, X380, 또는 X381과 결합하는 CM03 VH를 포함하는 Fab의 KD를 포함하는 친화도 분석의 요약이다. 이 데이터는 Biacore® 기술을 사용하여 생성되었다. CD26 결합 파트너를 나타내었다.
변이체 Kon/SE (M-1·sec-1) Koff/SE (sec-1 ) KD(M) Ki2
X369 5.09E+05/1.19E+04 8.29E-04/3.40E-06 1.63e-9 7.03 X376 2.58E+05/1.71E+03 5.96E-04/3.49E-06 2.31e-9 12.2 X377 3.17E+05/2.28E+03 5.96E-04/3.48E-06 1.88e-9 12.7 X378 2.85E+05/1.85E+03 8.30E-04/6.02E-06 2.92e-9 10.7 X379 5.78E+05/4.67E+03 6.70E-04/3.82E-06 1.16e-9 8.89 X380 2.94E+05/2.84E+03 6.87E-04/4.54E-06 2.33e-9 10.5 X381 2.93E+05/1.76E+03 6.01E-04/4.04E-06 2.10e-9 4.44
X369: 뮤린 CM03 Fab
하기하는 표 5는 CM03 X369 및 CM03 VH 변이체 X384, X385, X386, X387 또는 X388 중의 하나와 짝을 이루는 CM03 VL를 포함하는 Fab의 KD를 포함하는, 친화도 분석의 요약이다.
변이체 Kon/SE (M-1·sec-1) Koff/SE (sec-1 ) KD(M) Ki2
X369 5.09E+05/1.19E+04 8.29E-04/3.40E-06 1.63e-9 7.03 X384 2.62E+05/1.84E+03 3.12E-04/6.26E-06 1.19e-9 23.9 X385 2.56E+05/1.84E+03 3.75E-04/6.47E-06 1.47e-9 50.1 X386 1.84E+05/4.32E+03 4.98E-04/3.27E-06 2.71e-9 68.3 X387 1.96E+05/1.10E+04 1.00E-02/1.96E-04 5.11e-8 819 X388 2.35E+05/2.37E+03 6.98E-04/5.00E-06 2.98e-9 27.5
X369: 마우스 CM03 Fab
도 13은 X369 Fab(CM03 VH 및 VL) 및 인체적응형 CM03 VH 및 VL 변이체와 작을 이루는 다음의 Fab: X389, X390, X391, X392, X393, X395 및 X396의 친화도 분석을 나타낸다. 도 6에서 아미노산 서열인 변이체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 짝을 참조하라. 상기 분석은 실시예 1에 기술한 Biacore®를 사용하여 수행되었으며, CD26 결합 파트너를 제외하고 도시되었다.
하기하는 표 6은 표 4 및 5의 요약과 적시된 Fab의 발현 수득량을 나타낸다. 또한 선택된 Fab를 제조하기 위하여 사용된 변이체 중쇄 및 경쇄, KD, 수득률, 및 CM03 Fab에 대한 KD 및 VH 및 VL 변이체의 짝을 포함하는 선택된 Fabs의 수득률의 비율을 나타낸다
VH VL
KD(nM) 수득률(㎍/L) KD(nM) 수득률(㎍/L)
X384 1.2 260 X376 2.3 2180
X385 1.5 180 X377 1.9 350
X386 2.7 581 X378 2.9 15
X387 51 50 X379 1.2 18
X388 3 93 X380 2.3 848
X381 2.1 22
CM03 1.6 78 CM03 1.6 78
Fab VH VL 수득률(㎍/L) 비율# KD(nM) 비율##
X389 X384 X376 380 4.87 0.38 4.29
X390 X385 X376 500 6.41 0.96 1.70
X391 X388 X376 760 9.74 2.12 0.77
X392 X384 X379 150 1.92 0.24 6.79
X393 X385 X379 180 2.31 0.33 4.94
X394 X384 X394 235 3.01 0.58 2.81
X395 X384 X380 630 8.08 3.26 0.50
X396 X385 X380 760 9.74 2.53 0.64
X399 X399 X380 453 5.81 2.85 0.57
X431 X420 X380 1110 14.23 0.92 1.77
X430 X399 X394 1290 16.54 1.19 1.37
CM03 뮤린 뮤린 78 1.00 1.63 1.00
뮤린 CM03 Fab는 X369이다
# 각 개별 클론 수득률과 뮤린 CMO3의 수득률의 비율
## CM03 Fab KD와 개체 클론 KD의 비율
F. 인간 CD26에 결합하기 위한 변이체 VH 및 VL 짝을 포함하는 Fab의 특이성
변이체 VH 및 VL 서열의 짝을 포함하는 선택된 Fabs 의 특이성 분석이 수행되었다. 도 14는 CM03 X369 Fab 및 CD26에 결합하기 위한 미분리된 복수의 마우스 MAb CM03 (14D10)와 경쟁하는 인체적응형 CM03 Fabs X389, X390, X391, X392, X393, X395 및 X396를 나타낸다. 14D10와 CD26의 결합을 14D10와 CM03 변이체가 선점한 CD26의 결합을 비교하였다. 클론된 CM03의 재조합 Fab는 양성 대조구로서 사용되었다.
상기 분석은 실시예 1에 기술한 Biacore®를 사용하여 수행되었다. 모든 Fab는 14D10와 CD26의 결합 내에서 적어도 80% 감소를 나타내며, Fab 변이체 짝은 유사하거나, 또는 적어도 14D10의 결합 부위와 오버랩된다는 것을 나타낸다.
G. 생물학적 활성
세포 증식 억제능에 대하여 인체적응형 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 다양한 짝을 포함하는 Fab가 분석되었다.
다양한 Fab 변이체의 효과는 성장 억제제 효과에 대한 Jurkat CD26+에 대하여 분석되었다. 당해 기술 분야에 잘 알려진 3-4,5-디메틸티아졸-2-일-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드("MTT") 측정법이 사용되었다. 이러한 측정법은 세포 증식을 결정하기 위한 정량법이다. 일반적으로, MTT 측정법 생존가능 세포의 미토콘드리아 탈수소효소의 MTT 분해 및 다크 블루 포마잔 결정의 형성능력을 기초로하였다. 생존 세포의 수는 생성된 포마잔 생성물의 수준과 비례한다. 색은 시료 비색분석 측정법을 사용하여 정량되었다.
간단히 살펴보면, MTT 측정법을 수행하기 위하여, 50㎕의 지수적으로 증가한 Jurkat CD26+ 세포를 마이크로티터 플레이트에 놓았다 (50,000 세포/50 ㎕ 웰). CM03 Fab인 X369 및 Fab 변이체 X389, X390, X391, X392, X393, X395 및 X396 (VH 및 VL 변이체의 짝), 및 VL 변이체 X376 및 CM03 VH를 포함한 Fab를 0.1, 0.5, 1, 5 및 10 ㎍/ml의 성장 배지에 첨가하고 및 혼합하였다. 세포는 밀봉상태의 CO2 인큐베이터에서 37℃로 48 시간 동안 접종하였다. MTT를 약 1 mg/ml 첨가하였다. 세포를 2 시간 동안 37℃로 배양하였다. 포마잔의 추출이 CO2 인큐베이터 내에서 1일 동안 발생하였다. 570 nm에서의 흡광이 측정되었다.
도 15는 CM03 Fab X369 및 Fabs X389, X390, X391, X392, X393, X395 및 X396 (VH 및 VL 변이체의 짝을 포함), 및 VL 변이체 X376 및 CM03 VH을 포함하는 Fab에 의한 JKT/CD26+ 세포 증식의 억제 백분율 나타낸다.
모든 Fab는 5 또는 10 ㎍/ml 수준에서 최대로 억제되는, 세포 증식의 억제의 원인이 된다.
실시예 3 - 인체적응형 CM03 IgGl 항체
A. 서열
전장 인체적응형 항체는 선택된 VH 및 VL 짝, 인간 IgGl 중쇄 불변 영역, 및 인간 kapp 경쇄 불변 영역을 사용하여 생성되었다. 도 16은 IgGl 사슬-사슬 상호작용 및 경첩부 영역을 나타낸다. 도 17A은 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 나타낸다. 상기 중쇄 내의 VH 변이체 위치 및 선도 서열을 나타낸다. 도 17B는 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 나타낸다. 이는 또한 갱쇄 내의 VL 변이체의 위치, 및 선도 서열을 나타낸다.
하기하는 표 7 및 표 8은 사전에 시험한 Fab의 일부로 재조합 인체적응형 단클론 항체 (rhuMAb) 409, 410, 411, 412, 420 및 429를 제조하는데 사용하는 상기 VH 및 VL의 짝의 동일성을 나타낸 것이다. VH 및 VL 변이체 짝을 포함하는 Fab의 제조시 사용하는 VH 및 VL 변이체를 하기하는 표 8에 나타내었다. 예를 들면, rhuMab410는 본 명세서에서 "X410"로도 나타내며, Fab X391와 마찬가지로, X388 VH 및 X376 VL 서열을 포함한다. 도 6은 변이체 중쇄 및 경쇄의 선택된 짝의 아미노산 서열을 나타내며, 전술한 바와 같이, X369 (CM03 Fab)는 제외된다. X369 (CM03 Fab)의 CM03 VH 및 CM03 VL 서열은 rhuMAb409를 생성하는데 사용되었다.
명 명 법
Fabs MAb
X369 (CM03) rhuMAb409 X391 rhuMAb410 X392 rhuMAb411 X396 rhuMAb412 X420 rhuMAb420 X429 rhuMAb429
IgG1 Fab VH VL Fab수득률 (㎍/L) CHO 수득률 (㎍/L) Fab KD(nM)
X389 X384 X376 380 650 0.38
X390 X385 X376 500 700 0.96
X410 X391 X388 X376 760 229 2.12
X411 X392 X384 X379 150 720 0.24
X393 X385 X379 180 1580 0.33
X394 X384 X394 235 250 0.58
X395 X384 X380 630 310 3.26
X412 X396 X385 X380 760 1370 2.53
X427 X399 X399 X380 453 1420 2.85
X420 X431 X420 X380 1110 1100 0.92
X429 X430 X399 X394 1290 4300 1.19
X409 CM03 뮤린 뮤린 78 470 1.63
뮤린 CM03 Fab는 X369이다
B. 발현
도 18은 HEK293 세포에서 임시 발현되고, 및 분리된 via a 생산자 메뉴얼에 따라 단백질 A 친화도 컬럼(Procep-A, Millipore, CAT# 113111827)로 분리된 전장 재조합 인체적응형 단클론 항체 (rhuMAb) 409, 411, 410 및 412을 나타낸다. 상기 항체를 100 mM 나트륨 아세테이트(pH 3.0)로 용해시키고, 즉시 2M 트리스(pH 9.0)로 중성화시켰다. 상기 시료는 다음으로 JS4.2 로터에서 4,000 rpm으로 30 분간 회전시켜 불용성 물질을 제거하고, 0.2 ㎛ 필터로 여과하였으며, 이는 저장 전의 멸균을 위한 것이다. 도 18은 중국 햄스터 난소(CHO-DG44) 세포에서 안정적으로 발현되는 rhuMAb 411를 나타낸다. 각각의 경우에서, 전달 감염은 리포펙토민(lipofectomin)을 통하여 수행되었다.
도 18은 환원 조건 하에서 이동하는 쿠마시 블루로 염색된 SDS 폴리아크릴아미드 겔을 나타낸다. 유리된 중쇄 및 경쇄로 기대되는 이종점과 일치하는 이동점을 지닌 두개의 주요 밴드가 나타났다. 상기 표 7은 CHO 세포 내에서 발현된 다양한 지적된 전장 항체의 수득률을 나타낸다
C. 인간 CD26에 대한 rhuMAb의 친화도
rhuMAb 409, 410, 411 및 412의 CD26 결합 친화도는 하기하는 도 9에 나타내었다. 이들의 분석은 실시예 1에 기술된 Biacore®을 사용하여 수행하였으며, 결합 파트너가 전술한 rhuMAb라는 사실은 제외되었다. RhuMAb 411는 rhuMAb 409 KD의 3.7배였다. rhuMAb 410 및 412는 rhuMAb 409의 KD의 각각 0.5 및 0.4 배였다.
Biacore®에 의하여 검출한 YSCMA 항원에 대한 rhuMAB의 친화도
구조체 μM Kon/SE KOff/SE KD nM 배수
X409 0.2 5.77E+05/1.56E+04 4.73E-04/7.78E-06 8.19e-10 0.82 1 X411 0.2 4.85E+05/3.67E+03 1.08E-04/8.59E-07 2.22e-10 0.22 3.7 X410 0.1 1.58E+05/2.42E+03 2.68E-04/9.95E-06 1.69e-9 1.69 0.5 X412 0.12 2.03E+05/2.21E+03 4.23E-04/9.66E-06 2.09e-9 2.09 0.4
도 19는 특이적으로 인간 CD26와 결합한 rhuMAb 409, 411 , 410 및 412를 나타내는 데이터를 나타낸다 . 도 20은 showing the 결합 of 추가적으로 임시 발현된 rhuMAb 변이체와 인간 CD26의 결합을 나타내는, 표준 프로토콜을 사용한 ELISA(Phage display, A Laboratory Manual, Carlos Barbas III et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)의 데이터를 나타낸다(2차 항체 검출로서 l ㎍/ml 인간 CD26 피복 및 염소 항-인간-kappa HRP 컨쥬게이트 (SouthernBiotech, Birmingham, Alabama, CAT# 2060-05) ).
D. 생물학적 활성
특이적 재조합 인간 MAb의 항-증식 효과가 상기 항체에 의하여 유도된 집합체에 의하여 사정된 형태학적 측정법으로 Jurkat CD26+ 세포를 분석하였다. 도 21은 치료 대조구(상부 영상)와 비교한 rhuMAb 409 (하부 좌측 영상) 및 rhuMAb 410 (하부 우측 영상)로 치료한 세포의 영상을 나타낸다. 두 rhuMAb 모두 대조 치료구에 비하여 세포 증식 억제의 증거를 산출하였다
도 22는 대조 치료구(상부 좌측 영상)에 비하여 0.05 ㎍/ml (하부 좌측 영상), 0.1 ㎍/ml (하부 우측 영상), 0.5 ㎍/ml (중앙 좌측 영상), 2.5 ㎍/ml (중앙 우측 영상), 및 5 ㎍/ml (상부 우측 영상)의 rhuMAb 411로 치료한 결과를 나타낸다. 세포 증식의 억제의 증거가 높은 수준의 상기 항체로 관찰되었다. 억제 효과의 증거는rhuMAb 411의 증가와 함께 높아졌다; 최고 억제 농도는 rhuMAb 411가 5 ㎍/ml이다.
특이적 재조합 인간 MAbs의 효과를 Jurkat CD26+ 세포 내에서 MTT 측정법을 사용하여 성장 억제 효과에 대하여 분석하였다. rhuMAb 409, 410, 411, 412, 420 및 429를 각각 다양한 다른 농도로 시험하였다. 하기 표 10은 다양한 재조합 인간 MAbs를 위한 MTT 측정법에서 관찰된 억제 백분률을 나타낸다.
㎍/ml rhuMAb409 rhuMAb410 rhuMAb411 rhuMAb412 rhuMAb420 rhuMAb429
5 21.7 33.5 28 23.6 15.9 26.2
2.5 19.7 27.5 22.5 17.5 16.6 20.6
0.5 14.7 14 14.6 6.2 9.2 12.1
0.25 12.9 10.7 15 5.4 9.6 9.6
0.05 4.8 4 3.3 0.3 3.7 3.1
0 0 0 0 0 0 0
시험# 5 4 3 3 2 2
도 23 A 및 23B는 rhuMAb 409, 410, 411, 412, 420 및 429의 MTT 측정법 결과를 나타낸다. 도 23A는 억제 백분률을 나타내는 선형 차트를 나타내고, 반면, 도 23B은 이들의 막대 차트를 나타낸다. 나타낸 모든 항체로 한 치료는 세포 증식의 억제를 보여주었다. 상기 항체의 증가된 농도로 한 치료는 모든 경우에서 억제 백분률의 증가를 보여주었으나 rhuMAb 420은 예외인데, 이는 2.5 ㎍/ml 치료와 달리 5 ㎍/ml 치료에서 약간 감소를 나타내었다.
E. 에피토프 맵핑
에피토프 맵핑 실험을 CD26 상의 인체적응형 단클론 항체의 적절한 결합 부위를 결정하기 위하여 수행하였다. 에피토프 맵핑은 펩타이드 미소배열법(미소배열s)을 사용하여 수행하였다.
일반적으로, 이 맵핑법은 항원(여기서는 인간 CD26)의 아미노산 서열의 전부 또는 일부와 전체적으로 일치하는 오버랩 서열의 펩타이드의 합성을 필요로한다. 상기 펩타이드는 그 다음 대상 항체와 반응한다. 과다, 또는 미결합 항체는 세척되었다. 반응된 또는 결합 항체는 검출되었다. 반응 핀 상의 각 펩타이드 서열이 알려졌기 때문에, 항원의 반응 영역은 미소배열 반응 프로필은 배제되었다.
상기 미소배열은 144 개의 오버랩된 인간 CD26-유도 13-머 펩타이드로 구성되어 있다. 하기하는 것은 인간 CD26의 766 아미노산 서열(디펩티딜 펩티다아제 IV 멤브레인 형태; SEQ ID NO:89).
1 MKTPWKVLLG LLGAAALVTI ITVPVVLLNK GTDDATADSR KTYTLTDYLK
51 NTYRLKLYSL RWISDHEYLY KQENNILVFN AEYGNSSVFL ENSTFDEFGH
101 SINDYSISPD GQFILLEYNY VKQWRHSYTA SYDIYDLNKR QLITEERIPN
151 NTQWVTWSPV GHKLAYVWNN DIYVKIEPNL PSYRITWTGK EDIIYNGITD
201 WVYEEEVFSA YSALWWSPNG TFLAYAQFND TEVPLIEYSF YSDESLQYPK
251 TVRVPYPKAG AVNPTVKFFV VNTDSLSSVT NATSIQITAP ASMLIGDHYL
301 CDVTWATQER ISLQWLRRIQ NYSVMDICDY DESSGRWNCL VARQHIEMST
351 TGWVGRFRPS EPHFTLDGNS FYKIISNEEG YRHICYFQID KKDCTFITKG
401 TWEVIGIEAL TSDYLYYISN EYKGMPGGRN LYKIQLSDYT KVTCLSCELN
451 PERCQYYSVS FSKEAKYYQL RCSGPGLPLY TLHSSVNDKG LRVLEDNSAL
501 DKMLQNVQMP SKKLDFIILN ETKFWYQMIL PPHFDKSKKY PLLLDVYAGP
551 CSQKADTVFR LNWATYLAST ENIIVASFDG RGSGYQGDKI MHAINRRLGT
601 FEVEDQiEAA RQFSKMGFVD NKRIAIWGWS YGGYVTSMVL GSGSGVFKCG
651 IAVAPVSRWE YYDSVYTERY MGLPTPEDNL DHYRNSTVMS RAENFKQVEY
701 LLIHGTADDN VHFQQSAQIS KALVDVGVDF QAMWYTDEDH GIASSTAHQH
751 IYTHMSHFIK QCFSLP
아미노산 잔기 48-324 만이 미소배열 상에 제시되었다. 상기 13-머(mers)는 두개의 아미노산에 의하여 상쇄되었다. 따라서, 펩타이드 1은 아미노산 잔기 48-60을 나타내고, 펩타이드 2는 아미노산 잔기 50-62을 나타내고, 계속해서, 펩타이드 133이 아미노산 잔기 312-324를 나타내는 것으로 끝난다. 하기 표 11은 rhuMAb 409, 411, 412, 및 420의 신호 데이터를 나타낸다. 각각의 펩타이드 수에 의하여 제시된 아미노산을 도 24에 나타내었다. 열 134-144는 배경 대조구(background controls)를 나타낸다.
전술한 항체는 미소배열에 사용된 아미노산 서열의 외부의 다른 피크와 반응할 수도 있다는 사실을 주의 한다. 추가적으로, 가장 반응성 있다고 동정되지 않은 아미노산 잔기와 결합할 수도 있다. 이는 부분적으로 미소배열에 결합된 단소 펩타이드의 선형 특성과 전장 상태에서의 3차원 구조간의 불일치에 기인한다.
상기 13머는 개질 유리 표면상에 고정되었다. 고정된 펩타이드 유도체는 다음의 일반적인 구조를 갖는다: 개질 유리 표면- 링커 - 13-머 펩타이드.
상기 미소배열은 차단 버퍼로 4 시간 동안 실온에서 전처리되었으며 PBS 버퍼(pH 7.5) 및 물로 3회의 세척을 하였다. 각 전처리된 미소배열은 배경 신호를 위한 어레이 웍시(Array Worx)-미소배열 스케너로 스캔되었다. 신호가 검출되지 않았다.
대조구로서, 형광 표지된 인간 항 IgG 항체 (SIGMA #F9512, 염소에서 생산된 항-인간 IgG(Fc 특이적)-FITC 항체, 1 : 1000)를 보유하는 하나의 미소배열을 2 시간 동안 실온에서 배양시켰으며, PBS 버퍼(pH 7.5) 및 물로 3회의 세척을 하였다. 미소배열은 어레이 웍시-미소배열 스케너로 스캔되었다.
미소배열은 lO㎍ 항체를 250㎕의 측정법 버퍼(PBS-T, 0.1% NaN3) 내에서 사용하여6℃에서 rhuMAb 409, 411, 412 및 420와 함께 1일간 배양되었다. 1일 배양후 PBS 버퍼(pH 7.5) 및 물로 3회의 세척을 하였다. 상기 미소배열은 어레이 웍시-미소배열 스케너로 스캔되었다.
데이터 분석을 위하여 SPOT 인식 소프트웨어 패키지 어레이프로(ArrayPro)가 사용되었다. 데이터 평가를 위하여 각 미소배열 영상 3개의 일치하는 하위배열로부터 신호 강도의 평균값이 사용되었다. 하기 표 11은 rhuMAb 409, 411, 412, 및 420의 13-머 펩타이드에 대한 신호 강도 데이터를 나타낸다. 도 24는 rhuMAb 409, 411, 412, 및 420의 신호 데이터를 나타내는 막대 차트를 나타낸다
펩타 이드# 아미노산 단일 평균값 rhuMAb 409 단일 평균값 rhuMAb 411 단일 평균값 rhuMAb 412 단일 평균값 rhuMAb 420
Figure 112008013416366-PCT00001
Figure 112008013416366-PCT00002
Figure 112008013416366-PCT00003
도 24는 rhuMAB 409 (CM03 VH 및 VL 포함)가 펩타이드 6 (YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO:45)), 35 (LEYNYVKQ WRHSY(SEQ ID NO:46)), 55 (TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO:47)), 84 (LWWSPNGTFLAYA (SEQ ID NO:48)) 및 132 (RISLQ WLRRIQNY(SEQ ID NO:49))에 대한 최대 활성을 갖는다는 것을 나타낸다. 각각의 피크는 오버랩된 13-머 펩타이드를 지닌 작은 피크와 관련되어 있다.
불연속적 서열의 반응성은 불연속적, 또는 입체 구조적, 에피토프를 나타낸다. 도 25는 밝은 색으로 나타낸 반응성 펩타이드를 지닌 인간 CD26_1 J2E의 결정 구조의 리본 도해도를 나타낸다. 인간 CD26의 조절체는 쉽게 구입할 수 있다 (www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/MMDB/mmdb.shtml; Reference: PubMed; MMDB: 25581; PDB: 1J2E; Description: Crystal Structure of Human Dipeptidyle Peptidase IV; Deposition: H.Hiramatsu et al.). 이러한 선형, 불연속적 서열을 보여주는 3차원 구조는 항원이 3차원 상에 있는 경우 서로의 부근에 배열된다. 이는 더 살펴보면 불연속적, 또는 구조적인, 에피토프인 것 같다는 확신이 들게 한다. 그 다음, 이러한 실험에서 아미노산 48-324 만이 제시되었기 때문에, 이러한 서열 밖의 다른 반응 영역이 있다는 것을 주의하여야 한다.
RhuMAB 411는 펩타이드 6 (YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO:45)), 37 (YVKQ WRHSYTASY(SEQ ID NO:50)), 55 (TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO:47)), 79 (EEEVFSAYSALWW (SEQ IDNO:51)) 및 132 (RISLQ WLRRIQNY(SEQ ID NO:49)에 대하여 최대 반응성을 보인다. 각각의 피크는 오버랩된 13-머 펩타이드를 지닌 작은 피크와 관련되어 있다.
불연속적 서열의 반응성은 불연속적, 또는 입체 구조적, 에피토프를 나타낸다. 도 26은 밝은 색으로 나타낸 반응성 펩타이드를 지닌 인간 CD26_1J2E의 결정 구조의 리본 도해도를 나타낸다. 이러한 선형, 불연속적 서열을 보여주는 3차원 구조는 항원이, 에피토프의 불연속적 특성을 확신시키는, 3차원 상에 있는 경우 서로의 부근에 배열된다.
RhuMAB 412는 펩타이드 29 (D YSISPDGQFILL (SEQ ID NO:52)), 30 (SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO:53)) 및 55 (TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO:47))에 대하여 최대 반응성을 보인다. 각각의 피크는 오버랩된 13-머 펩타이드를 지닌 작은 피크와 관련되어 있다. 도 27은 밝은 색으로 나타낸 반응성 펩타이드를 지닌 인간 CD26_1J2E의 결정 구조의 리본 도해도를 나타낸다. 이러한 선형, 불연속적 서열을 보여주는 3차원 구조는 항원이, 불연속적, 또는 입체 구조적인 에피토프를 제시하는, 3차원 상에 있는 경우 서로의 부근에 배열된다.
RhuMAB 420은 펩타이드 29 (DYSISPDGQFILL (SEQ ID NO:52)), 30 (SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO:53)), 55 (TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO:47)) 및 63 (IYVKIEPNLPSYR(SEQ ID NO:54))에 대하여 최대 반응성을 보인다. 각각의 피크는 오버랩된 13-머 펩타이드를 지닌 작은 피크와 관련되어 있다. 도 28은 밝은 색으로 나타낸 반응성 펩타이드를 지닌 인간 CD26_1J2E의 결정 구조의 리본 도해도를 나타낸다. 이러한 선형, 불연속적 서열을 보여주는 3차원 구조는 항원이, 불연속적, 또는 입체 구조적인 에피토프를 다시 제시하는, 3차원 상에 있는 경우 서로의 부근에 배열된다.
실시예 4 - 예시적인 재조합 중쇄 및 경쇄 항체 서열
X392 Fab의 VH 및 VL 또는본 명세서에 기재한 다른 VH 및/또는 VL 서열을 포함하는 인체적응형 IgGl 항체는 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 내에서 생산되었다. 상기 X392 Fab의 VH 및 VL를 포함하는 인체적응형 IgGl 항체의 예시적인 서열을 아래에 나타내었다.
A. 예시적인 중쇄 및 경쇄를 암호화한 DNA 서열
X392 Fab의 VH 및 VL를 포함하는 인체적응형 항체의 중쇄 또는 경쇄를 암호화한 예시적인 뉴클레오타이드 서열을 아래 제공하였다. 암호화된 단백질은 상기 VH 및 VL 서열과 융합된 신호 서열을 포함한다. (신호 서열을 암호화한 서열은 밑줄로 표시하였으며, 및 가변 영역을 암호화한 서열은볼드 이텔릭체로 표시하였다.)
중쇄 (SEQ ID NO:215):
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCC G
AAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGTGCTGGAGTGAAGCAGCCGGGTGGAACCCTGCGTC
TGACCTGCACGGCTAGCGGTTTCAGCCTGACCACATACGGTGTGCACTGGGTGCGTCA
GGCGCCCGGGAAAGGTCTGGAATGGGTGGGTGTAATCTGGGGCGATGGTCGTACCGA
TTACGATGCTGCTTTCATGAGCCGGGTGACCATCAGCAAAGATACCAGCAAAAGCACC
GTGTACTTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACTGCAGTGTACTACTGCATGC
GTAATCGTCATGATTGGTTCGATTACTGGGGCCAAGGAACCACCGTGACCGTCTCGAG
C GCAAGCACCAAAGGCCCATCGGTATTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTC
TGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGA
CGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCC
TACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCT
TGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTG
GACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCC
AGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA
CACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCA
CGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATG
CCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC
CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTC
CAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGC
CCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAAC
CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG
TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA
CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCA
GCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACAC
GCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
경쇄 (SEQ ID NO:216):
ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGATGCCAGA
TGT GACATCCTGCTGACCCAGTCTCCATCTTCTCTGTCTGCTACTCCTGGCGAACGTG
CTACCATCACCTGTCGTGCCTCTCAGGGCATCCGTAACAACCTGAACTGGTATCAGCA
GAAACCAGGTCAGGCCCCACGTCTGCTGATCTACTACTCTTCTAATTTGCAGTCCGGT
GTGCCATCCCGTTTCTCCGGATCTGGTTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCTA
GACTGCAACCTGAAGACGTTGCCGCCTACTACTGCCAGCAGTCTATCAAGCTGCCATT
TACCTTCGGTTCTGGTACCAAAGTGGAGATCAAA CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTC
TTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCC
TGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCC
CTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCAC
CTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAG
TCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCA
ACAGGGGAGAGTGTTAG
B. 예시적인 중쇄 및 경쇄의 단백질 서열
X392 Fab의 VH 및 VL를 포함하는 인체적응형 항체의 중쇄 또는 경쇄의 예시적인 단백질 서열을 아래에 나타내었다. 중쇄 및 경쇄 서열은 신호 서열과 융합된 것으로 나타내었다. (신호 서열을 암호화한 서열은 밑줄로 표시하였으며, 및 가변 영역을 암호화한 서열은볼드 이텔릭체로 표시하였다.)
중쇄 (SEQ ID NO:217):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHS EVOLVESGAGVKOPGGTLRLTCTASGFSLTTYGVHWVRO
APGKGLEWVGVIWGDGRTDYDAAFMSR VTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTA VYYCMR
NRHDWFDYWGQGTTVTVSS ASTKGVSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVS
WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE
PKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE
KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
경쇄 (SEQ ID NO:218):
MSVPTOVLGLLLLWLTOARC DILLTOSPSSLSATPGERATITCRASOGIRNNLNWYOOKP
GQAPRLLIYYSSNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDVAAYYCQQSIKLPFTFGSG
TKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ
ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
실시예 5 - 예시적인 MTT 측정법 프로토콜
예시적인 MTT 측정법 프로토콜은 다음을 따른다:
Jurkat 세포는 전장 인간 CD26를 암호화하는 플라스미드로 전달감염되었으며, 200 ㎍/ml G418 하에서 선택되었다. 세포는 생활력 >95%를 유지하기 위하여 3일 간격으로 1 : 5로 계대(passage)되었다. 측정하기 약 48 시간 전, 회전(spinning) 배지는 1100 rpm로 5 분간 회전시켜 완전히 신선 성장 배지(37도)로 대체되었다. (측정 배지는 성장 배지와 동일: 87mL RPMI-1640 액체 배지 (Hyclone: SH30027-02); 10 mL FCS(56℃ 30 분 처리); 0.5 mL 페니실린/스트렙토마이신(100 ㎍/ml); 2 mL G418 (Calbiochem, 100 mg/ml PBS용액); 및 2 mL L-글루타민 (20OmM, Hyclone, #SH30034.01).) 이 방법에 의하여, 세포 생활력은 측정시 97-99%가 될 수 있다. 세포 생활력은 적어도 95%가 되어야 한다.
세포를 1100 rpm로, 5 분간 회전시켰으며(Beckman Benchtop Centrifuge), 상기 배지는 전체적으로 제거되었다. 상기 세포는 T75 플라스크 배양을 위하여 5-10 ml의 완전 배지로 재현탁되었다. 0.01 mL의 세포 현탁액은 0.01 mL의 트리판 블루 (0.125% (IX), VWR, #VWb721-0)와 혼합되었다. 0.01 mL를 균수계산기(hemacytometer)에 넣고 총 세포 및 사멸 세포의 수를 세었다. 상기 세포수/ml는 다음과 같이 계산되었다: 총 세포/4 x 희석 인자 x l0,000 = 세포/mL. 생존가능 세포 %= (총 세포-사멸 세포)/총 세포 x lOO. 상기 세포는 ~106 생존가능 세포/mL의 완전 성장 배지로 희석되었다. 종균 세포, 0.05 mL/웰을 96-웰 플레이트의 중앙 60 웰로 전달 감염시켰으며, 가장자리 웰은 성장 배지, 0.1 mL/웰로 채워졌다.
항체 시료는 0, 0.1, 0.2, 1.0, 5, 및 10 ㎍/ml의 총 0.2 mL 성장 배지로 희석되었다. 각 플레이트를 위하여, 음성 대조군, 항체 조성물 버퍼(일반적으로 PBS 또는 PBS-T, 또는 다른 버퍼) 및 양성 항체 (마우스) 대조구의 세 종류가 있다. 상기 항체 시료가 성장 배지 내에서 > 10배로 희석된 경우, 항체 조성물 버퍼는 필요치 않게된다. 주변의 웰은 성장 배지로 채워져서 플레이트 내에서 균질한 미소환경을 유지하게 된다. 상기 플레이트는 5% CO2 인큐베이터에서 37℃ +/- 0.5 ℃, 90% 습도로 48 시간 동안 배양되었다.
25 ㎕의 MTT 용액(5 mg/mL MTT)을 각 웰에 첨가하고, 상기 배양을 2 시간 지속하였다. (MTT 용액 제조를 위하여, 50 mg의 MTT(테트라졸륨염 MTT, 3-(4,5-디메틸트리아졸릴-2)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드, Calbiochem, #475989)) 분말을 10 mL의 PBS에 실온에서 용해시키고 및 완전 용해 후 0.2 μM 멤브레인으로 여과하였다.)
0.1 mL의 추출 버퍼/웰을 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 12 시간 또는 1일간 배양하였다( 추출 버퍼를 제조하기 위하여, 20 g의 SDS(W/V) 분말을 정량하여 50 mL의 MQ 수(water) 및 50 mL의 N,N-디메틸 포름아미드에 37℃로 용해시켰다. 온도가 주위 온도와 평형을 이룬 후 pH를 1M HCl로 조절하여 4.7이 되게 하였다. 마지막으로 CHX (시클로헥시미드, Calbiochem, 239764-100MG))를 최종 농도 20 ㎍/ml에 첨가하였다.) 플레이트 내의 상기 추출물은 5회 동안 상하로 피페팅(pipeting)하고 팁(tip) 내의 용액을 완전 무전하화시켜 혼합하였다. 상기 플레이트를 570 nm로 읽었다. 억제율(종양 세포 증식 억제)는 일반적으로 다음과 같이 계산된다: 억제율(%)= 1-(Mab 처리 웰의 Abs/배지 대조 웰의 Abs).
또한, Ho et al, (2001). Clinical Cancer Res. VoI 7, 2031-2040을 참조.
실시예 6 - Karpas 299 T-세포 림프종 이종 이식-함유 NCR
누드 마우스내에서 rhuMAb 411 효능
이 연구의 목적은 rhuMAb 411이 Karpas 299 T-세포 림프종 이종이식의 성장을 억제하는 능력을 조사하는 것이다. 종양 세포 이식 후 7일간, rhuMAb 411 단독 효과를 Taxol® 단독 및 Taxol® + rhuMAb 411의 효과와 비교하였다.
재료: 세포주: Karpas 299는 인간 CD26-양성 T-세포 림프종주이며, DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany)로부터 획득하였으며, 및 셀 엔드 몰레큘러 테크놀로지(Cell & Molecular Technologies, Inc., Phillipsburg, NJ)사에 수장되고 그로부터 선적되었다.
동물: 체중이 18-22 g 및 약 5-6 주령이며, 타코닉(Taconic, Germantown, NY)사로부터 구득한 암컷 NCR 무흉선 마우스.
RhuMAb 411: BDS(의약 원재), 1.0 ml/비알, 10.3 mg/ml. lot#D0679 PBS, pH 7.0 용액, 로자 바이올로지(Lonza Biologies, Slough, UK) 사 제조.
배지 및 버퍼: RPMI-1640 배지 (Cat# 15-040-CV) 및 인산염 버퍼 식염수 (PBS, Cat# 21-040-CV) 메디아텍(Mediatech, Inc., Herndon, VA)사로 부터 구득.
파크리탁셀(Paclitaxel, Taxol®, Cat# T7402) 및 디메틸설폭사이드(DMSO, Cat# D2438)는 시그마(Sigma, St. Louis, MO)사로부터 구득.
방법: 100 두의 동물 우측 옆구리에 4-6 x lO6 Karpas 299 세포의 100 ㎕의 RPMI-1640 배지 용액을 피하 이식하였다. 종양 크기 100 mm3에 이르렀을 때 마우스를 그룹으로 나누고 다음과 같이 용액을 100 ㎕ i.v. 투여하였다:
그룹 1, 운반체 (PBS) 투여; 그룹 2, 10 mg/kg 파크리탁셀(10mg/ml PBS 및 20% DMSO 용액) 투여; 그룹 3, 4 및 5, 각각 3, 10 및 30 mg/Kg의 rhuMAb 411 항체 투여. 그룹 6, 10 mg/kg rhuMAb 411 및 10 mg/kg 파크리탁셀의 조합 투여. 마우스 10 두의 각 그룹을 5주간 3회 꼬리 정맥을 통하여 엉덩이 정맥 주사로 처리하였다.
종양 부피는 주 2회 및 체중은 주 1회 측정하였다. 독성 또는 고통의 징후를 기록하였으며, 필요한 경우 동물을 안락사시켰다. 20% 이상 체중이 감소된 모든 동물은 인도적 측면에서 안락사시켰다.
결과: 도 29에 나타난 바와 같이, rhuMAb 411 복용은 전 복용량을 사용시 종양의 축소 및 많은 경우 종양의 완전 소멸을 나타내었다, 반면 대조 항체 (인간 IgG) 또는 종양학의 현재 표준 치료법에서 일상적으로 사용되는 치료제인 Taxol®을 복용한 동물에서는 완만한 종양 성장을 관찰하였다. rhuMAb 411 치료시 체중이 유지되었으며, 명시적 독성은 관찰되지 않았다. (데이터 미기재) 이러한 종양 사멸은 CD26 의존성이며 및 항체-의존성 세포 독성(ADCC), 세포간 신호 경로(세포용해 활성) 유도를 경유한 세포자멸, 보체-의존성 독성 (CDC), 또는 이러한 메카니즘의 조합에 의하여 매개되는 것 으로 보인다.
이와 대조적으로, rhuMAb 411는 CD26 단백질이 현저한 수준으로 발현되지 않는 A375, 인간 흑색종 세포주가 이식된 이종이식 마우스 모델에서는 전혀 효능을 보여주지 못하였다. (데이터 미기재)
실시예 7 - 786-0 (신장 암종) 이종이식-함유 SCID 마우스 내의
rhuMAb 411의 효능
이 연구의 목적은 rhuMAb 411이 786-0 신장 암종 이종이식의 성장을 억제하는 능력을 조사하는 것이다. rhuMAb 411 단독 효과를 PBS 및 전형적 항암 화합물(시스플라스틴 및 Taxol®) + rhuMAb 411의 효과와 비교하였다.
재료: 세포주: 786-0는 인간 CD26-양성 신장 암종주이며 ATCC로부터 분양.
동물: 체중이 18-22 g 및 약 5-6 주령이며, 타코닉(Taconic, Germantown, NY)사로부터 구득한 암컷 CB 17 SCID 마우스.
시스플라스틴은 시스마(Cat# P9394)사로부터 구득.
마트리겔은 비디 바이오사이언스(BD Biosciences(Cat# 356237))에서 구득.
HBSS는 ATCC(Cat# 30-2213)로부터 분양.
본 연구의 모든 다른 재료는 실시예 6에서 전술한 바와 같다
방법: 70 두의 동물의 우측 옆구리에 5xlO6개의 786-0 세포의 100 ㎕의 HBSS 및 마트리겔(HBSS: 마트리겔=l:l) 용액을 피하 이식하였다. 종양 크기 100 mm3에 이르렀을 때 마우스를 그룹으로 나누고 다음과 같이 용액을 100 ㎕ i.v. 투여하였다:
그룹 1, 운반체 (PBS) 투여; 그룹 2, 3 및 4, 각각 3, 10 및 30 mg/Kg의 rhuMAb 411 항체; 그룹 5, 30 mg/kg의 rhuMAb 411, 10 mg/kg의 파크리탁셀 및 2 mg/Kg의 시스플라스틴을 조합 투여. 마우스 10 두의 각 그룹은 주 2회씩 3주간 복막 주사(i.p.)로 처리하였으며 예외적으로 시스플라스틴은 1회만 투여하였다.
종양 부피는 주 2회, 체중은 주 1회 측정하였다. 독성 또는 고통의 징후를 기록하였으며, 필요한 경우 동물을 안락사시켰다. 20% 이상 체중이 감소된 모든 동물은 인도적 측면에서 안락사시켰다.
결과: 도 30에 나타난 바와 같이, 운반체 치료 동물에 비하여 786-0 종양 성장은 rhuMAb 411-치료 동물에서 현저히 억제되었다. 본 연구에서는 786- O 종양이 완전히 제거되지는 않았지만, rhuMAb 411 치료시 현저한 성장 지연이 있었다. 이와 함께, 고단위로 rhuMAb 411 (30 mg/Kg)를 단독으로 투여시 시스플라스틴과 택솔의 조합투여와 같은 효과를 나타내었다. rhuMAb 411 치료시 체중이 유지되었으며, 명시적 독성은 관찰되지 않았다. (데이터 미기재)
실시예 8 - Caki-2 (신장 암종) 이종이식- 함유 NCR 누드 마우스 내의 rhuMAb 411의 효능 및 복용량-범위
이 연구의 목적은 rhuMAb 411이 복용량 의존성 방법으로 Caki-2 신장 암종 이종이식의 성장을 억제하는 능력을 조사하는 것이다. rhuMAb 411 효과를 대조구 및 화학 치료제 화합물의 조합의 효과와 비교하였다.
재료: 세포주: Caki-2는 인간 CD26-양성 신장 암종주이며 ATCC에서 분양.
동물: 체중이 18-22 g 및 약 5-6 주령이며, 타코닉(Taconic, Germantown, NY)사로부터 구득한 암컷 NCR 누드 마우스.
도세탁셀(cat# 01885) 및 독소루비신(Cat# D515)은 시그마사로부터 구득.
본 연구의 모든 다른 재료는 실시예 6, 7에서 전술한 바와 같다
방법: 100 두의 동물 우측 옆구리에 1 x lO6 개의 Caki2 세포의 100 ㎕의 HBSS 및 마트리겔 (HBSS:마트리겔=l:l) 용액을 피하 이식하였다. 종양 크기 100 mm3에 이르렀을 때 마우스를 그룹으로 나누고 다음과 같이 용액을 100 ㎕ i.p. 투여하였다:
그룹 1, 운반체 (PBS) 투여; 그룹 2, 3, 4 및 5는 각각 1, 3, 10 및 30 mg/kg의 rhuMAb 411 항체 투여; 그룹 6 30mg/kg rhuMAb 411, 10 mg/kg 파크리탁셀, 2 mg/kg 시스플라스틴, 2 mg/kg 도세탁셀 및 8 mg/kg 독소루비신의 조합 투여. 그룹 7 rhuMAb 411만 없이 그룹 6와 같이 투여. 연구 중, 마우스 10 두의 각 그룹을 3주간 2회 i.p. 투여하였으며 예외적으로 화학 요법 화합물(시스플라스틴, 택솔, 도세탁셀 및 독소루비신)만 1회 투여하였다.
종양 부피는 주 2회 및 체중은 주 1회 측정하였다. 독성 또는 고통의 징후를 기록하였으며, 필요한 경우 동물을 안락사시켰다. 20% 이상 체중이 감소된 모든 동물은 인도적 측면에서 안락사시켰다.
결과: 도 31에 나타난 바와 같이, 운반체 치료 동물에 비하여, rhuMAb 411-치료 동물의 Caki-2 종양의 성장이 현저히 억제되었다. 게다가, rhuMAb 411의 억제는 복용량-의존성 방법으로 나타났다. 도 32에 나타낸, rhuMAb 411 + 화학 요법 화합물은 화합물 단독 치료에 비하여 더욱 강력한 억제 효과를 나타내었으며, 이는 조합치료를 사용한 부가효능으로 보인다. rhuMAb 411 치료시 체중이 유지되었으며, 명시적 독성은 관찰되지 않았다. (데이터 미기재)
실시예 9 - PC-3 (전립선 암종) 이종 이식-함유 SCID 마우스 내의 rhuMAb 411의 효능
이 연구의 목적은 rhuMAb 411이 PC-3 전립선 암종 이종이식의 성장을 억제하는 능력을 조사하는 것이다. rhuMAb 411 효과를 운반체 대조구 및 화학 치료제 화합물의 조합의 효과와 비교하였다.
재료: 세포주: PC-3은 인간 CD26-양성 전립선 암종주 및 ATCC에서 분양.
동물: 체중이 18-22 g 및 약 5-6 주령이며, 타코닉(Taconic, Germantown, NY)사로부터 구득한 수컷 CB 17 SCID 마우스.
본 연구의 모든 다른 재료는 실시예 6-8에서 전술한 바와 같다.
방법: 80 두의 동물 우측 옆구리에 3 x lO6 개의 PC3 세포의 100 ㎕의 HBSS 및 마트리겔 (HBSS:마트리겔=l:l) 용액을 피하 이식하였다. 종양 크기 100 mm3에 이르렀을 때 마우스를 그룹으로 나누고 다음과 같이 용액을 100 ㎕ i.p. 투여하였다:
그룹 1, 운반체 (PBS) 투여; 그룹 2, 3 및 4, 각각 3, 10 및 30 mg/kg의 rhuMAb 411 항체 투여; 그룹 5, 2 mg/kg 시스플라스틴 및 10 mg/kg 도세탁셀 투여; 그룹 6, 30 mg/kg rhuMAb 411만 투여하고 다른 조건은 그룹 5와 같다. 연구 중, 마우스 10 두의 각 그룹을 3주간 3회 i.p. 투여하였으며 예외적으로 화학 요법 화합물(시스플라스틴 및 도세탁셀)만 2주간 주1회 i.p. 투여하였다.
종양 부피는 주 2회 및 체중은 주 1회 측정하였다. 독성 또는 고통의 징후를 기록하였으며, 필요한 경우 동물을 안락사시켰다. 20% 이상 체중이 감소된 모든 동물은 인도적 측면에서 안락사시켰다.
결과: 도 33에 나타난 바와 같이, 운반체 치료 동물에 비하여, rhuMAb 411-치료 동물의 PC-3 종양의 성장이 현저히 억제되었다. 도 34에 나타낸, rhuMAb 411 + 화학 요법 화합물은 화합물 단독 치료에 비하여 더욱 강력한 억제 효과를 나타내었으며, 이는 조합치료를 사용한 부가효능으로 보인다. rhuMAb 411 치료시 체중이 유지되었으며, 명시적 독성은 관찰되지 않았다. (데이터 미기재)
실시예 10 - DU-145 (전립선 암종) 이종 이식-함유 Ncr 누드 마우스 내의 rhuMAb 411의 효능
이 연구의 목적은 rhuMAb 411이 DU- 145 전립선 암종 이종이식의 성장을 억제하는 능력을 조사하는 것이다. rhuMAb 411 효과를 운반체 대조구와 비교하였다.
재료: 세포주: DU-145는 인간 CD26-양성 전립선 암종주이며 ATCC에서 분양.
동물: 체중이 18-22 g 및 약 5-6 주령이며, 타코닉(Taconic, Germantown, NY)사로부터 구득한 수컷 NCR 누드 마우스.
본 연구의 모든 다른 재료는 실시예 6-8에서 전술한 바와 같다.
방법: 30 두의 동물 우측 옆구리에 3 x lO6 개의 DU145 세포의 100 ㎕의 HBSS 및 마트리겔 (HBSS:마트리겔=l:l) 용액을 피하 이식하였다. 종양 크기 100 mm3에 이르렀을 때 마우스를 그룹으로 나누고 다음과 같이 용액을 100 ㎕ i.p. 투여하였다:
그룹 1, 운반체 (PBS) 투여; 그룹 2, 30 mg/kg rhuMAb 411 항체 투여. 마우스 10 두의 각 그룹을 3주간 2회 i.p. 투여하였다.
종양 부피는 주 2회 및 체중은 주 1회 측정하였다. 독성 또는 고통의 징후를 기록하였으며, 필요한 경우 동물을 안락사시켰다. 20% 이상 체중이 감소된 모든 동물은 인도적 측면에서 안락사시켰다.
결과: 도 35에 나타난 바와 같이, 운반체 치료 동물에 비하여, rhuMAb 411-치료 동물의 DU-145 종양의 성장이 현저히 지연되었다. rhuMAb 411 치료시 체중이 유지되었으며, 명시적 독성은 관찰되지 않았다. (데이터 미기재)
실시예 11 - H226 폐 암종 전이 모델 내의 rhuMAb 411의 효능
이 연구의 목적은 rhuMAb 411이 H226, 폐 암종 세주에 의하여 유도된 전이를 억제하는 능력을 조사하는 것이다. rhuMAb 411 효과를 운반체 대조구와 비교하였다.
재료: 세포주: H226은 인간 CD26-양성 폐 암종주이며 ATCC 에서 분양.
동물: 체중이 18-22 g 및 약 5-6 주령이며, 타코닉(Taconic, Germantown, NY)사로부터 구득한 암컷 NCR 누드 마우스.
본 연구의 모든 다른 재료는 실시예 6-8에서 전술한 바와 같다.
방법: 16 두의 동물에 꼬리 정맥을 통하여 1x104 개의 H226 세포가 투여되었으며, 그 이후 그룹당 8마리씩 두 그룹으로 나누었다. 그룹 1, lOO㎕ 운반체 (PBS) 투여; 그룹 2 동일 부피의 30mg/kg rhuMAb 411 항체 투여. 두 그룹 모두 i.p, 주사를 통하여 3주간 주 2회 치료하였다. 복용 시작 4주 후, 동물을 안락사 시켰으며, 폐를 적출하였다. 각 마우스의 폐 전이의 총 수가 계수되었다.
결과: 도 36에 나타난 바와 같이, 운반체 대조구에 비하여 rhuMAb 411 투여시 더 많은 하부 전이 발생이 나타났다. PBS 그룹의 평균값은 67.25이고 rhuMAb 411 치료 그룹의 평균값은 10.5이다. rhuMAb 411 치료시 체중이 유지되었으며, 명시적 독성은 관찰되지 않았다. (데이터 미기재)
실시예 11 - rhuMAb 411의 결합 친화도
RhuMAb 411는 글루타민 합성효소 발현 시스템 (GS 시스템; Lonza Biologies, Slough, UK)을 사용하여 포유류 세포 (중국 햄스터 난소) 현탁 배양액의 발효에 의하여 생산된다. RhuMab 411의 인간 CD26 (hu-CD26)에 대한 결합 친화도는 표준 Biacore® 프로토콜을 사용하여 측정된다. 마우스 단클론 항체 14D10의 인간 CD26에 대한 결합 친화도도 측정되었다. 이러한 결합 연구의 결과를 하기 표 12에 나타내었다.
항체 Kon/SE(M-1·sec-1) Koff/SE(sec-1) KD(M)
14D10 5.09E+05/1.19E+04 8.29E-04/3.40E-06 1.63e-9
rhuMAb411 2.72E+05/1.11E+03 6.63E-05/1.91E-07 2.44e-10
모든 세포 결합 측정법에서, rhuMAb 411는 Karpas-299의 멤브레인 내의 내부 CD26 및 유사한 친화도를 지닌 수용성 인간 CD26와 결합한다고 알려졌다. (데이터 미기재)
실시예 12 - 암세포주에서 CD26의 발현
다양한 암세포주 내의 CD26 세포 표면 발현의 수준 및 백분률이 흐름세포측정(flow cytometry)에 의하여 측정되었다. 본 연구에서 시험된 암세포주는 하기 표 13에 열거하였다.
이름 종양원 공금원 cat#
K562 백혈병 세포 ATCC CLL-243
MDA-MD-231 유방암 세포 ATCC HTB-26
HT-29 직장결장 세포주 ATCC HTB-38
DU145 전립선 세포 ATCC HTB-81
PC-3 전립선 세포 ATCC CRL-1435
C3A 간암 ATCC CRL-10741
Caki1 신장암 ATCC HTB-46
Caki2 신장암 ATCC HTB-47
786O 신장암 ATCC CRL-1932
Kapas 299 T-세포 림프종 DSMZ ACC31
H226 폐암 ATCC CRL-5826
J82 방광 세포주 ATCC HTB-1
재료 및 방법: RhuMAb 411를 인비트로젠(Invitrogen, Carlsbad, California)사 제공 키트를 이용하여 Alex-488와 컨쥬게이션 시켰다. 현탁 세포가 사용되었으며, 부착성 세포주가 무엔자임 시약을 사용하여 해리되었다. 모든 세포는 90-100% 융합성이다. 세포는 인산염-버퍼 식염수 (PBS)와 10% 소 혈청 알부민(BSA)으로 원심분리(1200 rpm, 5 분간)하여 세척하였다. 세포 (100,000)가 40 ㎕의 PBS/BSA, 복제중의 4 nM rhuMAb41l-Alexa-488 에서 재현탁되었다. 음성 대조군으로서, rhuMAb41l-Alexa-488는 인간 IgGl으로 치환되었다. 세포는 완만히 교반하면서 1-2 시간 동안 실온에서 배양하였다. 200 ㎕의 PBS/BSA를 첨가하여 세포를~ 500,000/ml까지 희석하였다. 96 웰 플레이트의 세포들은 그 다음, 구아바 이지사이트 흐름세포측정기(Guava EasyCyte™ flow cytometer, Guava Technologies, Hayward, California)로 분석하였다. 데이터 분석은 구아바 익스프레스 플러스(Guava Express™ Plus) 소프트웨어로 수행하였다
결과: Alexa-488 컨쥬게이트 rhuMAb 411의 흐름 분석의 결과를 도 37에 나타내었다. CD26 세포 표면 발현의 의미있는 수준 및 백분률이 몇몇 암세포 유형, 특히, 신장, 전립선, 폐, 및 Karpas 299 암세포주에서 명백히 나타났다.
실시예 13 - 추가 예시적인 rhuMAb 411의 생산 및 분리 방법
론자 바이올로지사가 고안한 글루타민 합성효소 (GS) 발현 시스템으로 포유류 세포 (중국 햄스터 난소) 현탁액 배양액의 발효에 의한 재조합 항체 rhuMAb 411의 제조 및 이의 속발성 분리에 대한 비제한적 실시예를 아래 제공하였다. 상기 항체는 분자량이 144672 달톤인 IgGl kappa이다.
서열: rhuMAb 411의 중쇄의 폴리펩타이드 서열은 다음과 같다:
EVQLVESGAGVKQPGGTLRLTCTASGFSLTTYGVHWRQAPGKGLEWV
GVIWGDGRTDYDAAFMSRVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMRNRHDWFDY
WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS
GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV
HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ
PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:219).
rhuMAb 411의 경쇄의 폴리펩타이드 서열은 다음과 같다:
DILLTQSPSSLSATPGERATITCRASQGIRNNLNWYQQKPGQAPRLLIYYSS
NLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDVAAYYCQQSKLPFTFGSGTKVEIKRTVAAP
SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST
YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:220).
벡터의 건조: rhuMAb 411의 중쇄 가변 영역은 IgG1za 불변 영역을 암호화한 cDNA 서열과 결합하여 중쇄 단일 유전자 벡터 (SGV)를 생산한다. 경쇄 가변 영역은 론자사의 상품 벡터 pConKappa로 클론되어 경쇄 단일 유전자 벡터를 형성하게 된다. 이중 유전자 벡터는 중쇄 벡터의 완전 발현 카세트를 경쇄 벡터와 결합시켜 rhuMAb 411의 완전 중쇄 및 경쇄 모두를 발현하는 단일 벡터를 생성하여 건조된다. 상기 이중 유전자 벡터 (DGV)는 CHO 세포 내로 전달감염을 위하여 제한효소 Pvu I으로 벌크 및 선형으로 제조된다. 벡터 내의 중쇄 및 경쇄 유전자의 클론된 절편은 서열화되어 구조체를 확인하게되도 원하는 서열이 부합되는지 알게된다. 이중 유전자 벡터는 CHO 세포를 사용한 임시 전달감염 시스템 내에서 항체 발현을 위하여 시험되었으며, 정확하게 접히고 분비된 항체를 발현하도록 나타낸다. 이중 유전자 벡터 클론은 추가적인 용도를 위하여 동정되고, pY392/DGV/YsCHl-3 (도 38)로 재명명되었다.
IgGl/kappa 항체 rhuMAb 411 발현 GS-CHO 세포주의 건조 및 선택 : GS-CHO, CHOKlSV 세포주(Lonza Biologies, Inc., Slough, UK)가 상기 항체 rhuMAb 411의 생산을 위하여 사용되었다. A GS-CHO 세포주는 IgGl 항체 rhuMAb 411를 암호화한 중쇄 및 경쇄 유전자를 함유한 이중 유전자 벡터로 전달 감염되어 건조된다
CHOKlSV 세포는 전기천공, 및 다중 96-웰 플레이트 내에서 흡착시켜 이중 유전자 벡터에 전달 감염된다. 이러한 4종의 전달감염은단백질 함유 배지 CM25/10% 투석된 소 태아 혈청 (dFCS) (Lonza Biologies, Inc.) 내에서 수행되었다. 남은 2종의 전달감염은 화학적으로 정의된, 무 동물 성분(CDACF) 배지 CD-CHO 내에서 무 단백질 전달감염 프로토콜을 사용하여 수행된다. 전달감염의 익일, 선택제인 L-메티오닌 설폭시민 (MSX)를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하여 최종 농도인 50 μM을 만든다.
전달 감연체 결과물의 상청액은 반-정량적 ELISA 법을 사용하여 결합된 항체를 위하여 선별되었다. 선별된 모든 전달감염체는 검출가능한 수준의 항체를 생성하였다. 이러한 데이터로부터, 일부 전달감염체(단백질-함유 및 무 단백질 전달감염)는 상대적 항체 농도의 순위에 기초한 추가적인 평가 및 성장의 시각적 사정에 의하여 선택된다. 2차 선별은 생산성 데이터에 기초하여 수행된다. 28종의 단백질-함유 전달감염체가 무 단백질 배지의 완전한 적응에 성공하였다. 선택된 4종의 무 단백질 전달감염체는 어떠한 적응도 요구되지 않았다.
페드 배치 쉐이크-플라스크 배양의 성장 및 생산성 데이터를 검토하여 보면, 세포주는 다음의 선별 기준에 의하여 선택된다: 고수확 항체 농도, 고특이적 생산율, 및 허용가능한 성장 특성. 분리된 항체 제품의 질은 SDS-PAGE 및 IEF로 분석되었다.
선택된 세포주(본 명세서에서 "rhuMAb411M"로 나타낸다) 내의 rhuMAb 411 항체를 암호화한 유전자 서열의 통합성은 건조된 세포주의 DNA 벡터의 유전자 서열과 비교하여 확인할 수 있다. 총 RNA가 세포주 rhuMAb411M로부터 단리되었으며, cDNA 합성을위한 템플릿으로 사용되었다. 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 암호화한 서열은 사슬 암호화 서열의 5`-비변역 영역 (UTR) 및 3'-UTR을 절단하는 프라이머를 사용하여 PCR법으로 특이적으로 증폭되었다. 결과 DNA 산물은 LC 및 HC PCR 산물의 전체 cDNA 분절체를 정방향 및 역방향에서 서열화되도록 선택된 프라이머 세트를 사용하여 서열화되었다. 세포주 rhuMAMl1M 내에 존재하는 rhuMAb 411 항체의 LC를 암호화하는 전사체는 rhuMAb411M 세포주를 생성하는 rhuMAb 411-암호화 벡터 (pY392/DGV/YsCHl-3)의 서열과 일치한다. HC에 있어서, 검출된 주요 RNA 종은 rhuMAb 411-암호화 벡터(pY392/DGV/YsCHl-3) 내에 존재하는 것과 같이 일치하는 HC 서열을 암호화한다.
rhuMAb 411의 생산 방법: RhuMAb 411은 GS-CHO 세포 내의 마스터 세포 뱅크로부터 생산된다. 웰-한정 배양 배지를 사용하여 생존가능 세포 농도에서 생물 반응기에 접종하였으며 안정하고 제어된 조건하에서 발효를 유지하였다.
수확물을 스택 디스크 원심분리기에 공급하고, 여과한 뒤 생물공정 용기(BPC)내로 수거하였으며, 분리 전에 4℃로 저장하였다.
발효 및 단리 공정은 하기의 것들을 포함한다: 앰플 융해; 쉐이크 플라스크의 접종; 접종 웨이브 바이오리액터®; 공기주입 발효기의 접종; 발효; 발효 수확; 디스크 스택 원심분리기(Westfalia SAl); 포스트 원심분리 여과(2-단 렌즈 여과); 0.22 마이크로미터 여과; 및 분리.
rhuMAb 411의 분리: 상기 항체 분리 공정은 하기의 것들을 포함한다: 단백질 A-친화도 크로마토그래피; 바이러스 불활성화 (low pH(pH 3.7 +/- 0.1) 고정); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 음이온-교환 크로마토그래피, 바이러스 환원 여과(Pall DV20); 집중 및 정용여과; 여과 (0.2 미크론); 및 저장용 용기에 채움 (-20℃).
실시예 14 - rhuMAb 411의 추가 예시적인 발효
rhuMAb의 예시적인 발효를 하기 표 14에 제공하였다.
의약 제품은 환자에게 쉽게 투여할 수 있는 액상 비경구 복용형 (10 mg/mL ± 1.0 mg/mL)으로 제공된다.
성분 양/ml
rhuMAb 411 10 mg 시트르산 나트륨, USP 139 mg 시트르산, 무수물, USP 5.38 mg 싸카로오스, 과립, USP 600 mg NaOH 또는 HCl pH에 필요량 주사용수(WFI) 1 mL 정도의 적정량
미생물 기탁에 관한 지시서
(PCT 규칙 13bis)
출원인 또는 대리인 참조 번호 : 559332000440
국제 출원 번호 : PCT/US2006/028702
A. 본 지시서는 상기 명세서의 48 페이지 30줄 내지 46 페이지 22줄([0158]문단)에 언급된 미생물에 관한 것이다
B. 기탁 확인 추가 기탁은 추가의 용지에서 확인 □
기탁 기관 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)
기탁 기관의 주소 미국 20108 버지나아주 마나사스 사서함 1549
기탁 일자 승인 번호 2006. 6. 30 PAT-7695
C. 추가 지시 사항 ■
"인간 CD26 cDNA에 대한 인체적응형 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄 삽입물을 지닌 플라스미드를 보유한 DH5α 에셔리시아 콜리. S604069.YST-pABMC148 (x41l)"로 균주 지정
D. 지시를 받은 지정 국가
E. 지시의 별도 제공
하기 지시는 국제사무국에 추후 제출될것이다 1) 수탁 인증 번호 2) 수탁 영수증 사본
수리관청용 본 서면을 국제출원과 함께 수령 ■ 국제사무국용 본 서면을 국제사무국을 통하여 수령 □
담당자 담당자

Claims (65)

  1. (a) (i) 서열 GX1X2LX3TYGVH(SEQ ID NO:31)를 포함하는 중쇄 CDR1(여기서, X1은 F 또는 Y, X2는 S 또는 T, 그리고 X3는 T, N, 또는 S이다.) (ii) 서열 VIWGX1GRTDYDX2X3FMS(SEQ IDNO:32)를 포함하는 중쇄 CDR2(여기서, X1은 G 또는 D, X2는 A 또는 S, 그리고 X3는 A 또는 S이다), 및 (iii) 서열 X1RHDWFDY(SEQ ID NO:33)를 포함하는 중쇄 CDR3(여기서, X1은 N 또는 S이다.)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 CDR;
    (b) (i) 서열 X1ASQX2IRNX3LN(SEQ ID NO:34)를 포함하는 경쇄 CDR1(여기서, X1은 S 또는 R, X2는 G 또는 D, 그리고 X3는 S 또는 N이다.), (ii) 서열 YSSNLX1X2(SEQ ID NO:35)를 포함하는 경쇄 CDR2(여기서, X1은 H 또는 Q, 그리고 X2는 S 또는 T이다.) 및 (iii) 서열 QQSX1KLPX2T(SEQ ID NO:36)를 포함하는 경쇄 CDR3(여기서, X1은 I 또는 N 그리고 X2는 F 또는 L이다.)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR; 또는
    상기 (a)에 표시된 하나 이상의 중쇄 CDR 및 상기 (b)에 표시된 하나 이상의 경쇄 CDR;
    을 포함하고, 서열
    QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:90)의 중쇄 가변 영역 및 서열
    DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID N0:91)의 경쇄 가변 영역을 둘 다 포함하지 않는 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 (a)에 나타낸 하나 이상의 중쇄 CDR를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가
    (i) 서열 GX1X2LX3TYGVH(SEQ ID NO:31)를 포함하는 중쇄 CDR1(여기서, X1은 F 또는 Y, X2는 S 또는 T, 그리고 X3는 T, N, 또는 S이다.), (ii) 서열 VIWGX1GRTDYDX2X3FMS(SEQ ID NO:32)을 포함하는 중쇄 CDR2(여기서, X1은 G 또는 D, X2는 A 또는 S, 그리고 X3는 A 또는 S이다.), 및 (iii) 서열 X1RHDWFDY(SEQ ID NO:33)를 포함하는 중쇄 CDR3(여기서, X1은 N 또는 S이다.)을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가
    (i) 서열 X1ASQX2IRNX3LN(SEQ ID NO:34)를 포함하는 경쇄 CDR1(여기서, X1은 S 또는 R, X2는 G 또는 D, 그리고 X3는 S 또는 N이다.), (ii) 서열 YSSNLX1X2(SEQ ID NO:35)를 포함하는 경쇄 CDR2(여기서, X1은 H 또는 Q, 그리고 X2는 S 또는 T이다.) 및 (iii) 서열 QQSX1KLPX2T(SEQ ID NO:36)를 포함하는 경쇄 CDR35(여기서, X1은 I 또는 N 그리고 X2는 F 또는 L이다.)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 중쇄 CDR1은 서열 GFSLTTYGVH(SEQ ID NO:55), GFSLSTYGVH(SEQ ID NO:56), 및 GYSLTTYGVH(SEQ ID NO:57)로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 중쇄 CDR2는 서열 VIWGDGRTDYDAAFMS(SEQ ID NO:58) 및 VIWGDGRTDYDSSFMS(SEQ ID NO:59)로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 중쇄 CDR3은 서열 NRHDWFDY(SEQ ID NO:60)를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  8. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가
    (a) 다음을 포함하는 중쇄 CDR:
    (i) 서열 GFSLTTYGVH(SEQ ID NO:55)를 포함하는 CDR1,
    (ii) 서열 VIWGDGRTDYDAAFMS(SEQ ID NO:58)를 포함하는 CDR2, 및
    (iii) 서열 NRHDWFDY(SEQ ID NO:60)를 포함하는 CDR3;
    (b) 다음을 포함하는 중쇄 CDR:
    (i) 서열 GFSLSTYGVH(SEQ ID NO:56)을 포함하는 CDR1,
    (ii) 서열 VIWGDGRTD YDAAFMS(SEQ ID NO:58)를 포함하는 CDR2, 및
    (iii) 서열 NRHDWFDY(SEQ ID NO:60)를 포함하는 CDR3; 또는
    (c) 다음을 포함하는 중쇄 CDR:
    (i) 서열 GYSLTTYGVH(SEQ ID NO:57)를 포함하는 CDR1,
    (ii) 서열 VIWGDGRTDYDSSFMS(SEQ ID NO:59)를 포함하는 CDR2, 및
    (iii) 서열 NRHDWFDY(SEQ ID NO:60)를 포함하는 CDR3
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가
    (a) 다음을 포함하는 경쇄 CDR:
    (i) 서열 RASQDIRNNLN(SEQ ID NO:61)를 포함하는 CDR1,
    (ii) 서열 YSSNLHS(SEQ ID NO:64)를 포함하는 CDR2, 및
    iii) 서열 QQSIKLPLT(SEQ ID NO:67)를 포함하는 CDR3;
    (b) 다음을 포함하는 경쇄 CDR:
    (i) 서열 RASQGIRNNLN(SEQ ID NO:62)를 포함하는 CDR1,
    (ii) 서열 YSSNLQS(SEQ ID NO:65)를 포함하는 CDR2, 및
    (iii) 서열 QQSIKLPFT(SEQ ID NO:68)를 포함하는 CDR3; 또는
    (c) 다음을 포함하는 경쇄 CDR:
    (i) 서열 SASQDIRNSLN(SEQ ID NO:63)를 포함하는 CDR1,
    (ii) 서열 YSSNLHT(SEQ ID NO:66)를 포함하는 CDR2, 및
    (iii) 서열 QQSNKLPLT(SEQ ID NO:69)를 포함하는 CDR3
    을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드:
  10. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 상기 (b)에 나타낸 하나 이상의 경쇄 CDR를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가
    (i) 서열 X1ASQX2IRNX3LN(SEQ ID NO:34)를 포함하는 경쇄 CDR1(여기서, X1은 S 또는 R, X2는 G 또는 D, 그리고 X3는 S 또는 N이다.), (ii) 서열 YSSNLX1X2(SEQ ID NO:35)를 포함하는 경쇄 CDR2(여기서, X1은 H 또는 Q 그리고 X2는 S 또는 T이다.), 및 (iii) 서열 QQSX1KLPX2T(SEQ ID NO:36)를 포함하는 경쇄 CDR3(여기서, X1은 I 또 는 N, 그리고 X2는 F 또는 L이다.)을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  12. 제10항에 있어서, 상기 경쇄 CDR1은 RASQDIRNNLN(SEQ ID NO:61), RASQGIRNNLN(SEQ ID NO:62), 및 SASQDIRNSLN(SEQ ID NO:63)로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드
  13. 제10항에 있어서, 상기 경쇄 CDR2은 YSSNLHS(SEQ ID NO:64), YSSNLQS(SEQ ID NO:65) 및 YSSNLHT(SEQ ID NO:66)로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  14. 제10항에 있어서, 상기 경쇄 CDR3은 QQSIKLPLT(SEQ ID NO:67), QQSIKLPFT(SEQ ID NO:68), 및 QQSNKLPLT(SEQ ID NO:69)로 구성되는 군으로부터 선택된 것을 포함하는 서열을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  15. 제10항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가
    (a) 다음을 포함하는 경쇄 CDR:
    (i) 서열 RASQDIRNNLN(SEQ ID NO:61)를 포함하는 CDR1,
    (ii) 서열 YSSNLHS(SEQ ID NO:64)를 포함하는 CDR2, 및
    (iii) 서열 QQSIKLPLT(SEQ ID NO:67)를 포함하는 CDR3;
    (b) 다음을 포함하는 경쇄 CDR:
    (i) 서열 RASQGIRNNLN(SEQ ID NO:62)를 포함하는 CDR1,
    (ii) 서열 YSSNLQS(SEQ ID NO:65)를 포함하는 CDR2, 및
    (iii) 서열 QQSIKLPFT(SEQ ID NO:68)를 포함하는 CDR3; 또는
    (c) 다음을 포함하는 경쇄 CDR:
    (i) 서열 SASQDIRNSLN(SEQ ID NO:63)를 포함하는 CDR1,
    (ii) 서열 YSSNLHT(SEQ ID NO:66)를 포함하는 CDR2, 및
    (iii) 서열 QQSNKLPLT(SEQ ID NO:69)를 포함하는 CDR3
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  16. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 (a)에 나타낸 하나 이상의 중쇄 CDR 및 상기 (b)에 나타낸 하나 이상의 경쇄 CDR를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  17. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가
    (a) (i) 서열 EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9AS(SEQ ID NO:37)를 포함하는 중쇄 FRl(여기서, X1은 E 또는 Q, X2는 A 또는 G, X3는 G 또는 E, X4는 L 또는 V, X5는 V, K, 또는 E, X6는 G 또는 E, X7은 T 또는 S, X8은 T 또는 S, 그리고 X9은 T 또는 K이다.); (ii) 서열 WVRQAPGKGLEWX1G(SEQ ID NO:38)를 포함하는 중쇄 FR2(여기 서, X1은 V 또는 M이다.), (iii) 서열 RVTISX1DX2SKX3TX4YLQX5NSLRAEDTAVYYCX6R(SEQ ID NO:39)를 포함하는 중쇄 FR3(여기서, X1은 K 또는 R, X2는 N 또는 T, X3는 S 또는 N, X4는 V 또는 A, X5는 M 또는 L, 그리고 X6은 V, M, 또는 T이다.), 및 (iv) 서열 WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:40)를 포함하는 중쇄 FR4로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 기본틀 영역;
    (b) (i) 서열 X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RXSTIX9C(SEQ ID NO:41)를 포함하는 경쇄 FR1(여기서, X1은 D 또는 E, X2는 L 또는 E, X3는 M 또는 L, X4는 A 또는 V, X5는 S 또는 T, X6는 L, P, 또는 A, X7은 D 또는 E, X8은 V 또는 A, 그리고 X9은 T 또는 S이다), (ii) 서열 WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO: 42)를 포함하는 경쇄 FR2, (iii) 서열 GVPX1RFSGSGSGTDFTLTISRLX2X3EDX4AX5YYC(SEQ ID NO: 43)를 포함하는 경쇄 FR3(여기서, X1은 S, D, 또는 A, X2는 E 또는 Q, X3는 P 또는 A, X4는 F 또는 V, 및 X5는 T, A, 또는 I이다.), 및 (iv) 서열 FGSGTKVEIK(SEQ ID NO:44)를 포함하는 경쇄 FR4로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 기본틀 영역; 또는
    (c) 상기 (a)에 나타낸 하나 이상의 중쇄 기본틀 영역 및 상기 (b)에 나타낸 하나 이상의 경쇄 기본틀 영역
    을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  18. (a) 서열
    EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX1OX11LX12TYGVHWVRQAPGKGLEWX13GVIWGX14GRTDYDX15X16FMSRVTISX17DX18SKX19TX2OYLQX21NSLRAEDTAVYYCX22RX23RHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:29)로 구성되는 아미노산 서열(여기서, X1은 E 또는 Q, X2는 A 또는 G, X3는 G 또는 E, X4는 L 또는 V, X5는 V, K, 또는 E, X6는 G 또는 E, X7은 T 또는 S, X8은 T 또는 S, X9은 T 또는 K, X10 는 F 또는 Y, X11은 S 또는 T, X12는 T, N, 또는 S, X13은 V 또는 M, X14은 G 또는 D, X15은 A 또는 S, X16은 A 또는 S, X17은 K 또는 R, X18은 N 또는 T, X19은 S 또는 N, X20은 V 또는 A, X21은 M 또는 L, X22는 V, M, 또는 T, 그리고 X23은 N 또는 S이다.);
    (b)서열 X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9CX10ASQX11IRNX12LNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLX13X14GVPX15RFSGSGSGTDFTLTISRLX16X17EDX18AX19YYCQQSX2OKXPX21TFGSGTKVEIK(SEQ ID NO:30)로 구성되는 아미노산 서열(여기서, X1은 D 또는 E, X2는 L 또는 E, X3는 M 또는 L, X4는 A 또는 V, X5는 S 또는 T, X6는 L, P, 또는 A, X7은 D 또는 E, X8은 V 또는 A, X9은 T 또는 S, X10은 S 또는 R, X11은 G 또는 D, X12는 S 또는 N, X13은 H 또는 Q, X14은 S 또는 T, X15은 S, D, 또는 A, X16은 E 또는 Q, X17은 P 또는 A, X18은 F 또는 V, X19은 T, A, 또는 I, X20은 I 또는 N 그리고 X21은 F 또는 L이다.); 또는
    (c) 상기 (a)에 나타낸 아미노산 서열 및 상기 (b)에 나타낸 아미노산 서열 둘 다
    를 포함하는 폴리펩타이드.
  19. (a) SEQ ID NO:15-21로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열;
    (b) SEQ ID NO:22-28로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 일치하는 아미노산 서열; 또는
    (c) 상기 (a)에 나타낸 아미노산 서열 및 상기 (b)에 나타낸 아미노산 서열
    을 포함하고, 서열
    QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO: 90)의 중쇄 가변 영역 및 서열
    DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:91)의 경쇄 가변 영역을 둘 다 포함하지 않는 폴리펩타이드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가
    (a) SEQ ID NO:15-21로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95% 일치하는 아미노산 서열;
    (b) SEQ ID NO:22-28로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95% 일치하는 아미노산 서열; 또는
    (c) 상기 (a)에 나타낸 아미노산 서열 및 상기 (b)에 나타낸 아미노산 서열
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  21. 제20항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가
    (a) SEQ ID NO:15-21로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열;
    (b) SEQ ID NO:22-28로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열; 또는
    (c) 상기 (a)에 나타낸 아미노산 서열 및 상기 (b)에 나타낸 아미노산 서열
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  22. 제21항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가
    (a) 아미노산 서열 SEQ ID NO:26을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:15을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (b) 아미노산 서열 SEQ ID NO:22을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:18을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (c) 아미노산 서열 SEQ ID NO:28을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:19를 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (d) 아미노산 서열 SEQ ID NO:23을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:19을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  23. (a) (i) 서열 EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9AS(SEQ ID NO:37)를 포함하는 중쇄 FRl(여기서, X1은 E 또는 Q, X2는 A 또는 G, X3는 G 또는 E, X4는 L 또는 V, X5는 V, K, 또는 E, X6는 G 또는 E, X7은 T 또는 S, X8은 T 또는 S, 그리고 X9은 T 또는 K이다.); (ii) 서열 WVRQAPGKGLEWX1G(SEQ ID NO:38)를 포함하는 중쇄 FR2(여기서, X1은 V 또는 M이다.), (iii) 서열 RVTISX1DX2SKX3TX4YLQX5NSLRAEDTAVYYCX6R(SEQ ID NO:39)를 포함하는 중쇄 FR3(여기서, X1은 K 또는 R, X2는 N 또는 T, X3는 S 또는 N, X4는 V 또는 A, X5는 M 또는 L, 그리고 X6는 V, M, 또는 T이다), 및 (iv) 서열 WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:40)를 포함하는 중쇄 FR4로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 기본틀 영역;
    (b) (i) 서열 X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9C(SEQ ID NO:41)를 포함하는 경쇄 FR1(여기서, X1은 D 또는 E, X2는 L 또는 E, X3는 M 또는 L, X4는 A 또는 V, X5는 S 또는 T, X6는 L, P, 또는 A, X7은 D 또는 E, X8은 V 또는 A, 및 X9은 T 또는 S이다.), (ii) 서열 WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO: 42)를 포함하는 경쇄 FR2, (iii) 서열 GVPX1RFSGSGSGTDFTLTISRLX2X3EDX4AX5YYC(SEQ ID NO: 43)를 포함하는 경쇄 FR3(여 기서, X1은 S, D, 또는 A, X2는 E 또는 Q, X3는 P 또는 A, X4는 F 또는 V, 및 X5는 T, A, 또는 I이다.), 및 (iv) 서열 FGSGTKVEIK(SEQ ID NO:44)를 포함하는 경쇄 FR4로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 기본틀 영역; 또는
    (c) 상기 (a)에 나타낸 하나 이상의 중쇄 기본틀 영역 및 상기 (b)에 나타낸하나 이상의 경쇄 기본틀 영역;
    을 포함하고, 서열
    QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:90)의 중쇄 가변 영역 및 서열
    DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWYQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:91)의 경쇄 가변 영역을 둘 다 포함하지 않는 폴리펩타이드.
  24. YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO:45; 펩타이드 6), LEYNYVKQ WRHSY(SEQ ID NO:46; 펩타이드 35), TWSPVGHKLAYVW(SEQ ID NO:47; 펩타이드 55), LWWSPNGTFLAYA(SEQ ID NO:48; 펩타이드 84), RISLQWLRRIQNY(SEQ ID NO:49; 펩타이드 132), YVKQWRHSYTASY(SEQ ID NO:50; 펩타이드 37), EEEVFSAYSALWW(SEQ ID N0:51; 펩타이드 79), DYSISPDGQFILL(SEQ ID NO:52; 펩타이드 29), SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO:53; 펩타이드 30), 및 IYVKIEPNLPSYR(SEQ ID NO:54; 펩타이드 63)로 구성되는 군으로부 터 선택된 하나 이상의 펩타이드에 결합하는 항체로서, 여기서,
    상기 항체는 서열
    QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:90)의 중쇄 가변 영역 및 서열
    DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID N0:91)의 경쇄 가변 영역을 둘 다 포함하지 않는 항체.
  25. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 항체인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  26. 제25항에 있어서, 상기 항체는 단클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  27. 제25항에 있어서, 상기 항체는 인체적응형 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  28. 제25항에 있어서, 상기 항체는 항체 절편인 것을 특징으로 하는 항체.
  29. 제28항에 있어서, 상기 항체 절편은 Fab, Fab`, Fab`-SH, Fγ, scFγ 및 F(ab`)2 로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체.
  30. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 항체 사슬인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  31. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 뮤린 단클론 항체가 아닌 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  32. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 단리된 것임을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  33. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 CD26에 결합하는 것을 특징으로 하는폴리펩타이드.
  34. 제33항에 있어서, 상기 CD26은 인간 CD26인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  35. 제34항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 약 6 nM 이하의 KD로 인간 CD26에 결합하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  36. 제1항의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  37. 제36항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  38. 제36항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
  39. SEQ ID NO:1-14로 구성되는 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  40. 제39항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
  41. 제1항의 상기 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  42. 제1항의 폴리펩타이드와 CD26 발현 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 CD26 발현 세포 증식의 억제 방법.
  43. 제1항의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체 내에서의 CD26 발현과 관련된 질병의 치료 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 질병은 자가면역 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제43항에 있어서, 상기 질병은 이식편 대 숙주 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제43항에 있어서, 상기 질병은 암인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 암은 혈액암인 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제46항에 있어서, 상기 대상체는 CD26-발현 종양을 보유하고 있거나 또는 CD26-발현 종양을 제거한 적이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제46항에 있어서, 상기 암은 림프종, 신장암, 전립선암, 또는 폐암인 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제1항의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, CD26-발현 종양을 보유하고 있거나 또는 CD26-발현 종양을 제거한 적이 있는 대상체 내에서의 종양 성장의 억제 방법.
  51. 제1항의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체 내에서의 CD26-발현 암세포 전이의 억제 방법.
  52. 제43항에 있어서, 상기 대상체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제18항, 제19항, 또는 제23항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 항체인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  54. 제18항, 제19항, 또는 제23항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 CD26에 결합하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  55. 제18항, 제19항, 또는 제23항의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  56. 제18항, 제19항, 또는 제23항의 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  57. 제18항, 제19항, 또는 제23항의 폴리펩타이드와 CD26 발현 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, CD26 발현 세포 증식의 억제 방법.
  58. 제18항, 제19항, 또는 제23항의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체 내에서의 CD26 발현과 관련된 질병의 치료 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 질병은 암인 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제18항, 제19항, 또는 제23항의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, CD26-발현 종양을 보유하고 있거나 또는 CD26-발현 종양을 제거한 대상체 내에서의 종양 성장의 억제 방법.
  61. 제18항, 제19항, 또는 제23항의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체 내에서의 CD26-발현 암세포 전이의 억제 방법.
  62. 제46항에 있어서, 화학 요법, 방사선요법, 외과적 수술, 호르몬 요법, 또는 추가적 면역 요법으로 대상체를 치료하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제59항에 있어서, 화학 요법, 방사선요법, 외과적 수술, 호르몬 요법, 또는 추가적 면역 요법으로 대상체를 치료하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제9항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가
    (a) (i) 서열 GFSLTTYGVH(SEQ ID NO:55)를포함하는 CDR1; (ii) 서열 VIWGDGRTDYDAAFMS(SEQ ID NO:58)를 포함하는 CDR2; 및 (iii) 서열 NRHDWFDY(SEQ ID NO:60)를 포함하는 CDR3를 포함하는 중쇄 CDR; 및
    (b) (i) 서열 RASQGIRNNLN(SEQ ID NO:62)를 포함하는 CDR1; (ii) 서열 YSSNLQS(SEQ ID NO:65)를 포함하는 CDR2; 및 (iii) 서열 QQSIKLPFT(SEQ ID NO:68)를 포함하는 CDR3을 포함하는 경쇄 CDR
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  65. 이. 콜리(E. coli) 내에서 수탁번호 제PAT-7695호로 ATCC에 기탁된 플라스미드에 의하여 암호화된 항체.
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