CN101282994A - 抗cd26抗体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新的抗CD26抗体及其它相关多肽、以及编码所述抗体和多肽的新的多核苷酸。本发明也提供了制备所述抗体和多肽的方法。进一步提供了包含所述抗体或多肽的组合物和细胞。也提供了使用抗体和/或多肽的方法，例如用来抑制细胞增殖和治疗与CD26相关的病症。

Description

抗CD26抗体及其使用方法
相关申请的交互参考
本申请要求2005年7月22日提交的美国临时专利申请系列号60/701,802的优先权权益，其中所述的美国临时专利申请系列号60/701,802以其整体引入本文作为参考。
发明领域
这项发明的领域总体上涉及抗CD26抗体和其它多肽，并且尤其涉及人源化的抗CD26抗体，以及使用所述抗体和其它多肽治疗与CD26表达相关的疾病的方法。
发明背景
CD26是广泛分布的110kDa的细胞表面糖蛋白。最初，CD26被定义为T细胞活化抗原(Fox等人，(1984)J.Immunol.133，1250-1256、Fleischer(1987)J.Immunol.138，1346-1350、以及Morimoto等人(1989)J.Immunol.143，3430-3439)。已经表明，这个分子在其细胞外结构域具有二肽基肽酶IV(DPPIV；EC3.4.14.5)活性和广泛的组织分布(Hegen等人(1990)J.Immunol.144，2908-2914和Ulmer等人(1990)J.Immunol.31，429-435)。CD26在人的T细胞生理学中具有多种功能。例如，证据表明，CD26可以递送T细胞活化的共刺激信号(Morimoto等人(1994)Immunologist 2：4-7和Fleischer(1994)Immunol.Today 15：180-184)。此外，已经鉴定CD26为ADA结合蛋白质，并且CD26/ADA复合体在调节免疫系统功能中发挥关键作用(Dong等人(1996)J Immunol.156(4)：1349-55、Kameoka等人(1993)Science.261(5120)：466-9、以及Morrison等人(1993)J Exp Med.177(4)：1135-43)。CD26和细胞蛋白质拓扑异构酶IIα之间功能上的联系也已经见报道(Aytac等人(2003)British Journal of Cancer 88：455-462)。
CD26也可能在一些肿瘤的发展中具有作用。例如，CD26在一些迅速生长的T细胞恶性肿瘤例如T细胞淋巴母细胞淋巴瘤/急性淋巴母细胞白血病、以及T细胞CD30+间变性大细胞淋巴瘤(Carbone等人(1995)Blood86(12)：4617-26和Jones等人(2001)Am J Clin Pathol.115(6)：885-92)的表面上表达。
已经报道了多种结合CD26的鼠抗体。(见，例如，Morimoto等人(1989)J.Immunol.143：3430-39、Nam Hong Dang等人(1990)J.Immunol.145(12)：3963-71、Nam Hong Dang等人(1990)J.Immunol.144(11)：4092-100、PCT公开号WO 91/07985(Schlossman等人)、PCT公开号WO 02/092127(Nam Hong Dang等人)、以及美国专利号6,573,096(Chen等人))。
已知一种已生产的抗CD26的小鼠单克隆抗体为1F7抗体。(见，例如美国专利号5,120,642、PCT公开号WO 91/07985(Schlossman等人)和Morimoto等人(1989)J.Immunology，143：3430-3439)。1F7抗体鉴定为结合人CD4和CD8淋巴细胞上由110,000道尔顿分子量糖蛋白组成的、并且后来鉴定为CD26的抗原，其中所述抗原出现在辅助诱导细胞(helperinducer cells)而非抑制诱导细胞(suppressor inducer cells)上。因此，已经报道，1F7单克隆抗体能够在人CD4淋巴细胞群体中区别辅助诱导细胞和抑制诱导细胞。
此外，已经提出，1F7抗体和其它抗CD26的单克隆抗体在治疗一些与表达CD26的细胞相关的疾病例如一些癌中有用。(见，例如，美国专利公开号2003/0031665和PCT公开号WO 02/092127(Nam Hoang Dang等人))。据报道，抗CD26的单克隆抗体1F7与CD26的结合导致细胞周期停滞在G1/S限制点，并且CD26的结合(engagement)通过增强表达细胞周期调节蛋白质p21来诱导CD26 Jurkat转染子停滞在G1。也已报道，用1F7抗体治疗抑制CD26+肿瘤的形成，并在小鼠模型中增强存活率(Ho等人(2001)Clinical Cancer Research，7：2031-2040)。
其它已得到鉴定的抗CD26的鼠单克隆抗体包括大鼠抗CD26抗体E19和E26。(见，例如美国专利号6,573,096、美国专利公开号2002/0132979、美国专利公开号2002/0132979、美国专利公开号2004/0115202、PCT公开号WO 01/74299(Chen等人)和Ghersi等人(2002)J.Biological Chemistry，32：29231-29241)。据报道，这些抗体表现出抑制成纤维细胞和创伤细胞的细胞迁移来形成单层的抑制作用、对血管形成的抑制效果、以及对人皮肤微血管内皮细胞的侵入和毛细管新支(sprout)的形成具有抑制效果。已经提出了抗体在抑制癌侵入和血管发生的治疗中的用途。
另一种已产生的小鼠抗CD26的单克隆抗体是14D10(本文也称为CM03)。(见，例如Dong等人(1998)Mol Immunol.35(1)：13-21和美国专利公开号2003/0031665。)
证明改变CD26的活性在治疗多种疾病中是有用的。抗CD26的单克隆抗体是一种改变CD26作用的方法。
已在人类疗法中试验了鼠单克隆抗体。然而，当在人类中使用鼠抗体进行治疗时，在大量的治疗个体中产生人抗鼠抗体(“HAMA”)反应。在HAMA反应中，受治疗的受试者产生抗小鼠抗体的抗体。这不仅限制了鼠单克隆抗体疗法的效果，也导致产生过敏症的过敏反应。此外，甚至包含人Fc区和小鼠Fv区的嵌合抗体也潜在地引发HAMA反应。
为了最小化HAMA反应，一些研究者尝试制备不被人免疫系统识别为外源的抗体。一种使用的方法是抗体的“人源化”。这些人源化的抗体可以含有基本为人起源的序列，但通常也含有一些源自不同物种例如啮齿类物种、或者纯粹人造的互补决定区(“CDR”)残基和/或构架区残基。本领域已知多种人源化抗体的不同方法。一种人源化的形式是将抗原特异的鼠互补决定区(“CDRs”)“嫁接”到人免疫球蛋白分子的构架上。另一水平的人源化包括将鼠的CDR或其它可变区序列遗传操作(geneticengineering)为“更加人类的”、从而降低HAMA反应。例如，另一种人源化的形式是将一个物种例如小鼠的重链和轻链可变区嫁接到人重链和轻链的恒定区上，然后用衍生自人抗体的残基和/或设计为在人中降低抗体免疫原性的残基替换构架区(“FRs”)和/或互补决定区的分别的残基。所有这些技术可以包括进一步的遗传操纵抗体序列来增加抗体的结合作用或生物学作用的效果。
所有在本文引用的出版物、专利、专利申请、网址和登陆号/数据序列(包括多核苷酸和多肽序列两者)为了所有目的都以相同的程度以其整体引入作为参考，就如同每一出版物、专利、专利申请、网址或登陆号/数据序列被明确和单独地表明如此引入作为参考一样。
发明的简要概述
本发明提供了新型多肽，例如抗CD26抗体、抗CD26抗体的片段以及其它与抗CD26抗体有关的多肽。在一些实施方案中，抗CD26抗体为人源化的抗CD26抗体。也提供了包含编码所述多肽的核酸序列的多核苷酸。也提供了包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞。也提供了包含本发明多肽的组合物，例如药物组合物。也提供了制备所述多肽的方法。此外，还提供了使用多肽或包含多肽的组合物抑制表达CD26的细胞增殖或治疗或诊断与CD26表达相关的病症的方法。
在一方面，本发明提供了多肽，其包含：(a)包含序列GX1X2LX3TYGVH(SEQ ID NO：31)的重链CDR1，其中X1为F或Y、X2为S或T、并且X3为T、N或S；(b)包含序列VIWGX1GRTDYDX2X3FMS(SEQ ID NO：32)的重链CDR2，其中X1为G或D、X2为A或S、并且X3为A或S；和/或(c)包含序列X1RHDWFDY(SEQ ID NO：33)的重链CDR3，其中X1为N或S。在一些实施方案中，多肽为抗体。
在另一方面，本发明提供了多肽，其包含：(a)包含序列X1ASQX2IRNX3LN(SEQ ID NO：34)的轻链CDR1，其中X1为S或R、X2为G或D、并且X3为S或N；(b)包含序列YSSNLX1X2(SEQ ID NO：35)的轻链CDR2，其中X1为H或Q、并且X2为S或T；和/或(c)包含序列QQSX1KLPX2T(SEQ ID NO：36)的轻链CDR3，其中X1为I或N，并且X2为F或L。在一些实施方案中，多肽为抗体。
在另一方面，本发明提供了多肽例如抗体，其包含：(a)一个或多个(例如一个、两个或三个)重链CDR，所述重链CDR选自(i)包含序列GX1X2LX3TYGVH(SEQ ID NO：31)、其中X1为F或Y、X2为S或T、并且X3为T、N或S的重链CDR1；(ii)包含序列VIWGX1GRTDYDX2X3FMS(SEQ ID NO：32)、其中X1为G或D、X2为A或S、并且X3为A或S的重链CDR2；以及(iii)包含序列X1RHDWFDY(SEQ ID NO：33)、其中X1为N或S的重链CDR3，和/或(b)一个或多个(例如一个、两个或三个)轻链CDR，所述轻链CDR选自(i)包含序列X1ASQX2IRNX3LN(SEQ ID NO：34)、其中X1为S或R、X2为G或D、并且X3为S或N的轻链CDR1；(ii)包含序列YSSNLX1X2(SEQID NO：35)、其中X1为H或Q、并且X2为S或T的轻链CDR2；和/或(iii)包含序列QQSX1KLPX2T(SEQ ID NO：36)、其中X1为I或N、并且X2为F或L的轻链CDR3。
在进一步的方面，本发明提供了多肽例如抗体，其包含：(a)一个或多个(例如一个、两个或三个)重链CDR，其中每个重链CDR都具有与选自下列的CDR至少大约80％的同一性：(i)选自GFSLTTYGVH(SEQ IDNO：55)、GFSLSTYGVH(SEQ ID NO：56)和GYSLTTYGVH(SEQ IDNO：57)的重链CDR1；(ii)选自VIWGDGRTDYDAAFMS(SEQ IDNO：58)和VIWGDGRTDYDSSFMS(SEQ ID NO：59)的重链CDR2；以及(iii)重链CDR3序列NRHDWFDY(SEQ ID NO：60)；和/或(b)一个或多个(例如一个、两个或三个)轻链CDR，其中每个轻链CDR都具有与选自下列的CDR至少大约80％的同一性：(i)选自RASQDIRNNLN(SEQID NO：61)、RASQGIRNNLN(SEQ ID NO：62)和SASQDIRNSLN(SEQ IDNO：63)的轻链CDR1；(ii)选自YSSNLHS(SEQ ID NO：64)、YSSNLQS(SEQ ID NO：65)和YSSNLHT(SEQ ID NO：66)的轻链CDR2；以及(iii)选自QQSIKLPLT(SEQ ID NO：67)、QQSIKLPFT(SEQ ID NO：68)和QQSNKLPLT(SEQ ID NO：69)的轻链CDR3。
此外，在另一方面，本发明提供了多肽，其包含：(a)包含序列EVQLVXISGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9AS(SEQ ID NO：37)，其中X1为E或Q、X2为A或G、X3为G或E、X4为L或V、X5为V、K或E、X6为G或E、X7为T或S、X8为T或S、并且X9为T或K的重链FR1；(b)包含序列WVRQAPGKGLEWXIG(SEQ ID NO：38)，其中X1为V或M的重链FR2；(c)包含序列RVTISXIDX2SKX3TX4YLQX5NSLRAEDTAVYYCX6R(SEQ ID NO：39)，其中X1为K或R、X2为N或T、X3为S或N、X4为V或A、X5为M或L、并且X6为V、M或T的重链FR3；和/或(d)包含序列WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：40)的重链FR4。在一些实施方案中，多肽为抗体。
在进一步的方面，本发明提供了多肽，其包含：(a)包含序列X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9C(SEQ ID NO：41)，其中X1为D或E、X2为L或E、X3为M或L、X4为A或V、X5为S或T、X6为L、P或A、X7为D或E、X8为V或A、并且X9为T或S的轻链FR1；(b)包含序列WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO：42)的轻链FR2；(c)包含序列GVPXIRFSGSGSGTDFTLTISRLX2X3EDX4AX5YYC(SEQ ID NO：43)，其中X1为S、D或A、X2为E或Q、X3为P或A、X4为F或V、并且X5为T、A或I的轻链FR3；和/或(d)包含序列FGSGTKVEIK(SEQ IDNO：44)的轻链FR4。在一些实施方案中，多肽为抗体。
在另外的方面，本发明提供了多肽例如抗体，其包含：(a)一个或多个(例如一个、两个、三个或四个)重链构架区，其选自(i)包含序列EVQLVXISGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9AS(SEQ ID NO：37)，其中X1为E或Q、X2为A或G、X3为G或E、X4为L或V、X5为V、K或E、X6为G或E、X7为T或S、X8为T或S并且X9为T或K的重链FR1；(ii)包含序列WVRQAPGKGLEWX1G(SEQ ID NO：38)，其中X1为V或M的重链FR2；(iii)包含序列RVTISXIDX2SKX3TX4YLQX5NSLRAEDTAVYYCX6R(SEQ ID NO：39)，其中X1为K或R、X2为N或T、X3为S或N、X4为V或A、X5为M或L、并且X6为V、M或T的重链FR3；以及(iv)包含序列WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：40)的重链FR4；和/或(b)一个或多个(例如一个、两个、三个或四个)轻链构架区，其选自(i)包含序列X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RXSTIX9C(SEQ ID NO：41)，其中X1为D或E、X2为L或E、X3为M或L、X4为A或V、X5为S或T、X6为L、P或A、X7为D或E、X8为V或A、并且X9为T或S；(ii)包含序列WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO：42)的轻链FR2；(iii)包含序列GVPXIRFSGSGSGTDFTLTISRLX2X3EDX4AX5YYC(SEQ ID NO：43)，其中X1为S、D或A、X2为E或Q、X3为P或A、X4为F或V、并且X5为T、A或I的轻链FR3；以及(iv)包含序列FGSGTKVEIK(SEQ IDNO：44)的轻链FR4。
在另一方面，本发明提供了包含一个或多个本文所述重链CDR和/或一个或多个本文(例如，上文或本文其它地方，例如图3和图5)所述重链FR的多肽。在一些实施方案中，本发明提供了包含重链可变区的多肽，其中所述重链可变区包含一个或多个本文所述的重链CDR和/或一个或多个本文所述的重链FR。此外，本发明也提供了包含一个或多个本文所述轻链CDR和/或一个或多个本文所述轻链FR的多肽。在一些实施方案中，多肽包含轻链可变区，所述轻链可变区包含一个或多个本文所述的轻链CDR和/或一个或多个本文所述的轻链FR。在一些实施方案中，多肽包含：(1)一个或多个本文所述的重链CDR和/或一个或多个本文所述的重链FR；和(2)一个或多个本文所述轻链CDR和/或一个或多个本文所述轻链FR。在一些实施方案中，多肽包含含有一个或多个本文所述重链CDR的重链可变区和/或含有一个或多个本文所述轻链CDR的轻链可变区。
本发明进一步提供了包含一个或多个本文所述重链CDR和/或一个或多个本文所述重链FR的重链可变区。此外，本发明也提供了包含一个或多个本文所述轻链CDR和/或一个或多个本文所述轻链FR的轻链可变区。
在另一方面，本发明提供了包含氨基酸序列EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX10X11LX12TYGVHWVRQAPGKGLEWX13GVIWGX14GRTDYDXI5XI6FMSRVTISXI7DXI8SKXI9TX20YLQX21NSLRAEDTAVYYCX22RX23RHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：29)，其中X1为E或Q、X2为A或G、X3为G或E、X4为L或V、X5为V、K或E、X6为G或E、X7为T或S、X8为T或S、X9为T或K、X10为F或Y、X11为S或T、X12为T、N或S、X13为V或M、X14为G或D、X15为A或S、X16为A或S、X17为K或R、X18为N或T、X19为S或N、X20为V或A、X21为M或L、X22为V、M或T、并且X23为N或S的多肽。在一些实施方案中，多肽为抗体。
在另外的方面，本发明提供了包含氨基酸序列X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9CX10ASQX11IRNX12LNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLX13X14GVPX15RFSGSGSGTDFTLTISRLX16X17EDX18AX19YYCQQSX20KLPX21TFGSGTKVEIK(SEQ ID NO：30)，其中X1为D或E、X2为L或E、X3为M或L、X4为A或V、X5为S或T、X6为L、P或A、X7为D或E、X8为V或A、X9为T或S、X10为S或R、X11为G或D、X12为S或N、X13为H或Q、X14为S或T、X15为S、D或A、X16为E或Q、X17为P或A、X18为F或V、X19为T、A或I、X20为I或N、并且X21为F或L的多肽。在一些实施方案中，多肽进一步包含氨基酸序列EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX10X11LX12TYGVHWVRQAPGKGLEWX13GVIWGX14GRTDYDX15X16FMSRVTISX17DX18SKX1 9TX20YLQX21NSLRAEDTAVYYCX22RX23RHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：29)，其中X1为E或Q、X2为A或G、X3为G或E、X4为L或V、X5为V、K或E、X6为G或E、X7为T或S、X8为T或S、X9为T或K、X10为F或Y、X11为S或T、X12为T、N或S、X13为V或M、X14为G或D、X15为A或S、X16为A或S、X17为K或R、X18为N或T、X19为S或N、X20为V或A、X21为M或L、X22为V、M或T、并且X23为N或S。在一些实施方案中，多肽为抗体。
在另一方面，本发明提供的抗体为鼠抗体14D10的人源化形式。
在另一方面，本发明提供了结合一个或多个选自YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO：45；肽6)、LEYNYVKQWRHSY(SEQ ID NO：46；肽35)、TWSPVGHKLAYVW(SEQ ID NO：47；肽55)、LWWSPNGTFLAYA(SEQ ID NO：48；肽84)、RISLQWLRRIQNY(SEQ ID NO：49；肽132)、YVKQWRHSYTASY(SEQ ID NO：50；肽37)、EEEVFSA YSALWW(SEQID NO：51；肽79)、DYSISPDGQFILL(SEQ ID NO：52；肽29)、SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO：53；肽30)和IYVKIEPNLPSYR(SEQ IDNO：54；肽63)的肽的多肽，例如抗体。
在另外的方面，本发明提供了多肽，其包含：(a)具有与选自SEQ IDNO：15-21的氨基酸序列或选自SEQ ID NO：15-21的氨基酸序列的片段至少大约80％同一性的氨基酸序列，和/或(b)具有与选自SEQ ID NO：22-28的氨基酸序列或选自SEQ ID NO：22-28的氨基酸序列的片段至少大约80％同一性的氨基酸序列。在另一方面，本发明提供了多肽，其包含：(a)具有与选自SEQ ID NO：15-21的氨基酸序列至少大约80％同一性的氨基酸序列，和/或(b)具有与选自SEQ ID NO：22-28的氨基酸序列至少大约80％同一性的氨基酸序列。
在进一步的方面，本发明提供了包含轻链可变区的多肽例如抗体，其中所述轻链可变区包含与选自图3所示的下列序列：X376、X377、X378、X379、X380、X381和X394(分别为SEQ ID NO：15-21)的氨基酸序列具有至少大约80％同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了包含重链可变区的多肽例如抗体，其中所述重链可变区包含与选自图5所示的下列序列：X384、X385、X386、X387、X388、X399和X420(分别为SEQ ID NO：22-28)的氨基酸序列具有至少大约80％同一性的氨基酸序列。
此外，在其它方面，本发明提供了多肽，例如抗体，其包含选自图3或图5所示的下列任一序列：X376、X377、X378、X379、X380、X381、X394、X384、X385、X386、X387、X388、X399和X420(SEQ ID NO：15-28)的氨基酸序列。
此外，在另一方面，本发明提供了包含SEQ ID NO：217或其片段或变体的多肽(例如抗体)。
在另一方面，本发明提供了包含SEQ ID NO：218或其片段或变体的多肽(例如抗体)。
在上述每个方面以及本文所述的其它方面的一些实施方案中，多肽为抗体。在一些实施方案中，多肽为单克隆抗体。在上述每个方面以及本文所述的其它方面的一些实施方案中，多肽为人源化的抗体。在上述每个方面以及本文所述的其它方面的一些实施方案中，多肽不是鼠源的单克隆抗体。在上述每个方面以及本文所述的其它方面的一些实施方案中，多肽不是小鼠单克隆抗体。在上述每个方面以及本文所述的其它方面的一些实施方案中，多肽不是鼠源的单克隆抗体14D10。在上述每个方面以及本文所述的其它方面的一些实施方案中，多肽不包含序列QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：90)的重链可变区。在上述每个方面以及本文所述的其它方面的一些实施方案中，多肽不包含序列DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWYQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO：91)的轻链可变区。在上述每个方面以及本文所述的其它方面的一些实施方案中，多肽不包含序列QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：90)的重链可变区和序列DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWYQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO：91)的轻链可变区。在上述每个方面以及本文所述的其它方面的一些实施方案中，多肽不是小鼠单克隆抗体1F7。在上述每个方面的一些实施方案中，多肽具有一种或多种下列特性：结合CD26、调节CD26活性、导致CD26+细胞的细胞周期停滞在G1/S限制点、抑制表达CD26的细胞的增殖、和/或用于治疗与CD26表达相关的病症(例如疾病或病症)。在上述每个方面以及本文所述的其它方面的一些实施方案中，多肽结合人CD26.
也提供了制备任一上述多肽的方法。例如，本发明提供了产生本文所述抗体的方法，其包括在宿主细胞中表达一种或多种多核苷酸，其中抗体的每条链由至少一种多核苷酸编码。
本发明进一步提供了包含任一上述多肽的试剂盒。
本发明进一步提供了包含任一上述多肽以及本文所述其它多肽的组合物，例如药物组合物。同样提供了这些多肽中的每一种多肽在制备药物组合物或药物中的用途。组合物可以用于本文所述的任意一种方法中。
本发明提供了抑制表达CD26的细胞增殖的方法，其包括将细胞接触本文所述多肽(一般用有效实现目的抑制作用的多肽量)。此外，本发明提供了在受试者中治疗与CD26表达相关的病症的方法，其包括向受试者施用有效量的包含文中所述多肽的组合物。本文所述的组合物可以用来治疗多种疾病或病症，例如移植物抗宿主病、自身免疫病或癌。在一些实施方案中，癌为血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌为实体瘤。本发明也提供了本文所述组合物抑制CD26+癌恶化、抑制表达CD26的肿瘤生长、诱导表达CD26的肿瘤退化、和/或抑制表达CD26的癌细胞转移的用途。
在一些方面，本发明提供了编码本文所述多肽的多核苷酸。在一些方面，本发明提供了多核苷酸，其包含选自图2和图4所示的任一序列(SEQID NO：1-14)的核酸序列。在进一步的方面，本发明提供了多核苷酸，其包含与选自图2和图4所示的任一序列(SEQ ID NO：1-14)的核酸至少大约80％同一性的核酸序列。在其它方面，本发明进一步提供了多核苷酸，其包含编码选自任一如图3或图5所示的氨基酸序列X376、X377、X378、X379、X380、X381、X394、X384、X385、X386、X387、X388、X399和X420(SEQ ID NO：15-28)的氨基酸序列的多核苷酸。也提供了包含上述每个方面的多核苷酸的载体和宿主细胞。
在一些实施方案中，本发明的多肽(例如抗体)不包括本文所述的被排除在外的事物。
对于包含氨基酸替换的本文序列，如本领域技术人员显而易见地，每个氨基酸替换可以独立进行选择。本发明也提供了包含氨基酸替换的序列，在其中所述的氨基酸替换中除去了一个或多个氨基酸替换。
当本发明的方面或实施方案以马库什组或其它备选分组描述时，本发明不仅包含作为一个整体列出的全部组、各组的每个成员和主要组别所有可能的亚组，也包含缺失一个或多个组成员的主要组别。在要求保护的本发明中，本发明也考虑了明确排除任一组成员中的一个或多个组成员。
附图简述
图1显示CM03的VH(SEQ ID NO：90)和CM03的VL(SEQ IDNO：91)的序列。
图2显示人源化的VL变体X376(SEQ ID NO：1)、X377(SEQ IDNO：2)、X378(SEQ ID NO：3)、X379(SEQ ID NO：4)、X380(SEQ ID NO：5)、X381(SEQ ID NO：6)和X394(SEQ ID NO：7)的DNA序列。
图3显示CM03 VL(SEQ ID NO：91)和人源化的VL变体X376(SEQ IDNO：15)、X377(SEQ ID NO：16)、X378(SEQ ID NO：17)、X379(SEQ IDNO：18)、X380(SEQ ID NO：19)、X381(SEQ ID NO：20)和X394(SEQ IDNO：21)的氨基酸序列。对于轻链可变区而言，Kabat编号方案与顺序编号(sequential numbering)方案相同。
图4显示人源化的VH变体X384(SEQ ID NO：8)、X385(SEQ IDNO：9)、X386(SEQ ID NO：10)、X387(SEQ ID NO：11)以及X388(SEQ IDNO：12)、X399(SEQ ID NO：13)和X420(SEQ ID NO：14)的DNA序列。
图5显示CM03 VH(SEQ ID NO：90)和人源化的VH变体X384(SEQID NO：22)、X385(SEQ ID NO：23)、X386(SEQ ID NO：24)、X387(SEQ IDNO：25)以及X388(SEQ ID NO：26)、X399(SEQ ID NO：27)和X420(SEQ IDNO：28)的氨基酸序列。顺序编号方案与Kabat编号方案均给出。Kabat编号方案包括82a、82b和82c。
图6显示包含所选择的变体VH和变体VL的Fab VH和VL的氨基酸序列：X389、X390、X391、X392、X393、X394、X395、X396、X399、X420和X429。Fab X389包含X384 VH(SEQ ID NO：22)和X376VL(SEQID NO：15)，Fab X390包含X385 VH(SEQ ID NO：23)和X376 VL(SEQ IDNO：15)，Fab X391包含X388 VH(SEQ ID NO：26)和X376 VL(SEQ IDNO：15)，Fab X392包含X384 VH(SEQ ID NO：22)和X379 VL(SEQ IDNO：18)，Fab X393包含X385 VH(SEQ ID NO：23)和X379 VL(SEQ ID NO：18)，Fab X394包含X384 VH(SEQ ID NO：22)和X394 VL(SEQ ID NO：21)，Fab X395包含X384 VH(SEQ ID NO：22)和X380 VL(SEQ ID NO：19)，FabX396包含X385 VH(SEQ ID NO：23)和X380 VL(SEQ ID NO：19)，FabX399包含X399 VH(SEQ ID NO：27)和X380 VL(SEQ ID NO：19)，FabX420包含X420 VH(SEQ ID NO：28)和X380 VL(SEQ ID NO：19)，并且Fab X429包含X399 VH(SEQ ID NO：27)和X394 VL(SEQ ID NO：21)。
图7显示上样了蛋白质样品的凝胶，所述蛋白质样品含有在大肠杆菌(E,coli)菌株TG1中表达的Fab，所述Fab为包含与CM03 VH配对的CM03 VL变体X376、X377、X378、X379、X380或X381的Fab、和包含与CM03 VL配对的CM03 VH变体X384、X385、X386的Fab。
图8显示蛋白质积聚物的定量表示，所述蛋白质含有在大肠杆菌中表达的Fab，所述Fab为包含与CM03 VH配对的CM03 VL变体X376、X377、X378、X379、X380或X381的Fab和Fab X369(包含CM03 VH和CM03VL)。
图9显示上样了蛋白质样品的凝胶，所述蛋白质样品含有在大肠杆菌菌株TG1中表达的、包含与CM03 VL配对的CM03 VH变体X387或X388的Fab、以及在大肠杆菌菌株HB2151中表达的Fab X389、X390、X391、X392、X393、X395和X396(包含VH和VL变体对)。
图10显示在大肠杆菌菌株HB2151中表达的CM03 X369的Fab和下列包含CM03 VH和VL变体对的Fab：X389、X390、X391、X392、X393、X395和X396的积聚的定量表示。
图11显示包含与CM03 VL配对的CM03 VH变体X384、X385、X386、X387或X388的Fab在大肠杆菌中的积聚的定量表示。
图12A显示结合人CD26的CM03 Fab X369和引入额外的X369后的反应。
图12B显示结合人CD26的CM03 Fab X369和引入包含X377 VL和CM03 VH的Fab后的反应。
图12C显示X377 Fab与人CD26的结合和X377 Fab与之前已结合至CM03 Fab X369的人CD26的结合。
图13显示CM03 X369与下列包含CM03 VH变体和VL变体的Fab：X389、X390、X391、X392、X393、X395和X396的亲和性分析。
图14显示，CM03 X369 Fab和人源化的CM03 Fab X389、X390、X391、X392、X393、X395以及X396与未纯化的腹水中的鼠MAb CM03(14D10)竞争结合人CD26。
图15显示JKT/CD26+细胞增殖受CM03 Fab X369和包含VH/VL变体对(X389、X390、X391、X392、X393、X395和X396)的Fab、以及包含变体X376和CM03 VH的Fab抑制的百分数。
图16显示包括IgG1链链相互作用的IgG1抗体的简图。所示铰链序列为SEQ ID NO：86。
图17A显示连接于前导序列的示例性重链。重链恒定区氨基酸序列(人IgG1)如(SEQ ID NO：87)所示。
图17B显示连接于前导序列的示例性轻链。轻链恒定区氨基酸序列(人κ)如(SEQ ID NO：88)所示。
图18显示在HEK细胞中表达的重组的人源化单克隆抗体(rhuMAbs)409、410、411和412、以及在CHO细胞中表达的rhuMAb 411。
图19显示特异结合人CD26的rhuMAb 409、410、411和412。
图20显示ELISA数据，所述数据显示rhuMAb变体与CD26的结合。
图21显示2.5μg/ml rhuMAb409和410对JKT/CD26+细胞在48小时的作用。
图22显示0.05、0.1、0.5、2.5和5μg/ml rhuMAb411对JKT/CD26+细胞在48小时的作用。
图23A和23B显示在HEK293细胞中产生的rhuMAb409、410、411、412、420和429的MTT数据(抑制百分数)。
图24显示与rhuMAb409、411、412和420人源化抗体反应的13mer肽。
图25显示人CD26-1J2E晶体结构的带形图。在表位作图实验中与rhuMAb 409最具反应性的肽为更亮颜色。
图26显示人CD26-1J2E晶体结构的带形图。在表位作图实验中与rhuMAb 411最具反应性的肽为更亮颜色。
图27显示人CD26-1J2E晶体结构的带形图。在表位作图实验中与rhuMAb 412最具反应性的肽为更亮颜色。
图28显示人CD26-1J2E晶体结构的带形图。在表位作图实验中与rhuMAb 420最具反应性的肽为更亮颜色。
图29显示rhuMAb 411处理在小鼠异种移植(xenograft)模型中诱导Karpas299(T细胞淋巴瘤)肿瘤退化。数据表示10只动物的平均值±SEM值。
图30显示，rhuMAb 411处理在小鼠异种移植模型中显著延迟786-O(肾癌)肿瘤生长。数据表示10只动物的平均值±SEM值。
图31显示，rhuMAb 411处理以剂量依赖性方式降低Caki-2(肾癌)异种移植肿瘤的生长。数据表示10只动物的平均值±SEM值。
图32显示，rhuMAb 411处理降低Caki-2(肾癌)异种移植肿瘤的生长，其通过使用联合疗法具有额外效果。数据表示10只动物的平均值±SEM值。
图33显示，rhuMAb 411处理在SCID小鼠中降低PC-3(前列腺癌)异种移植肿瘤的生长。数据表示10只动物的平均值±SEM值。
图34显示，rhuMAb 411降低PC-3肿瘤生长，其使用联合疗法具有额外效果。
图35显示，rhuMAb 411处理在小鼠异种移植模型中延迟DU-145(前列腺癌)肿瘤的生长。数据表示10只动物的平均值±SEM值。
图36显示，rhuMAb 411处理在NCR裸鼠中显著地减弱H226(肺癌)诱导的肺转移。每组中的线表示平均值。
图37显示在多种癌细胞系中CD26细胞表面表达的水平和百分数。
图38显示双基因载体克隆pY392/DGV/YsCH1-3。
发明详述
本发明提供了多种新多肽，其中所述新多肽包括那些包含抗CD26抗体的一个或多个CDR或FR的多肽或包含抗CD26抗体的重链可变区或轻链可变区(或其片段)的多肽。在一些实施方案中，多肽结合CD26。具体而言，提供了多种新的抗CD26抗体，其包括但不限于人源化的抗CD26抗体。也提供了包含多肽的组合物，例如药物组合物。也提供了编码多肽的多核苷酸和包含多核苷酸的载体和宿主细胞。也提供了制备和使用所述多肽的方法。在一些情况中，本发明的多肽用作制备例如结合CD26的多肽(例如抗体)的中间体。
应当理解，无论哪个实施方案在本文用语言“包含”进行描述，也提供了其它以术语“由......和/......组成”或“基本由......组成”进行描述的类似实施方案。
一般技术
除非另外说明，否则本发明的实践采用分子生物学(包括重组体技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学在本领域技术之内的常规技术。此类技术在文献中得到充分解释，其中所述文献例如分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press；寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)(MJ.Gait编辑，1984)；分子生物学中的方法(Methods inMolecular Biology)，Humana Press；细胞生物学：实验册(Cell Biology：ALaboratory Notebook)(J.E.Cellis编辑，1998)Academic Press；动物细胞培养(Animal Cell Culture)(RI.Freshney编辑，1987)；细胞和组织培养入门(Introduction to Cell and Tissue Culture)(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press；细胞和组织培养：实验方法(Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures)(A.Doyle、J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑，1993-1998)J.Wiley和Sons；酶学方法(Methods in Enzymology)(Academic Press，Inc.)；实验免疫学手册(Handbook of ExperimentalImmunology)(D.M.Weir和CC.Blackwell编辑)；用于哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)(J.M.Miller和M.P.Calos编辑，1987)；分子生物学最新方法(Current Protocols inMolecular Biology)(F.M.Ausubel等人编辑，1987)；PCR：聚合酶链反应(PCR：The Polymerase Chain Reaction)(Mullis等人编辑，1994)；免疫学最新方法(Current Protocols in Immunology)(J.E.Coligan等人编辑，1991)；分子生物学中的小方法(Short Protocols in Molecular Biology)(Wiley和Sons，1999)；免疫生物学(Immunobiology)(CA.Janeway和P.Travers，1997)；抗体(P.Finch，1997)；抗体：实践方法(antibody：apractical approach)(D.Catty.编辑，IRL Press，1988-1989)；单克隆抗体：实践方法(Monoclonal antibody：a practical approach)(P.Shepherd和CDean编辑，Oxford University Press，2000)；使用抗体：实验手册(Usingantibody：a laboratory manual)(E.Harlow和D.Lane(Cold SpringHarbor Laboratory Press，1999)；抗体(The antibody)(M.Zanetti和J.D.Capra编辑，Harwood Academic Publishers，1995)。
定义
“抗体”是能够通过至少一个定位在免疫球蛋白分子可变区中的抗原识别位点特异结合靶标的免疫球蛋白分子，所述靶标例如糖、多核苷酸、脂、多肽等。如本文所用，该术语不仅包括完整的多克隆和单克隆抗体，也包括其片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白质和任一包含抗原识别位点的其它改变构型的免疫球蛋白分子。抗体包括任一类的抗体，例如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不需要为任一特定类。根据抗体在其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同类。免疫球蛋白有五种主要类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且所述类中的一些可以进一步分成亚类(同种型)，即IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgAl。将对应不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为：α、δ、ε、γ和μ。已熟知不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型。
如本文所用，“单克隆抗体”指的是从基本同质的抗体群体中获得的抗体，即除了存在少数可能天然存在的突变外，包含分别的抗体的群体是同一的。单克隆抗体高度特异，抗单一的抗原位点。此外，与多克隆抗体制备物相比，每个单克隆抗体抗抗原上的单一决定簇，而多克隆抗体一般包括抗不同决定簇(表位)的不同抗体。修饰词“单克隆的”表示抗体从基本同质的抗体群体获得的性质，并且不解释为需要通过任一特定方法来产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过重组DNA方法进行制备，如美国专利号4,816,567中所述。该单克隆抗体也可以例如从用McCafferty等人，1990，Nature，348：552-554中所述技术产生的噬菌体文库中分离。
如本文所用，“人源化的”抗体指的是非人(例如鼠)抗体形式，其为含有衍生自非人免疫球蛋白最小序列的特定嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合子序列)。一些人源化的抗体为这样的人免疫球蛋白(受体抗体(recipientantibody))，其中受体互补决定区(CDR)的残基用具预期特异性、亲和性和容量的非人物种例如小鼠、大鼠或兔(供体抗体)CDR的残基进行了替换。在一些例子中，人免疫球蛋白Fv构架区(FR)残基用相应的非人残基进行替换。一些人源化的抗体包含至少一个、并且一般两个通常衍生自非人物种例如小鼠、大鼠或兔(供体抗体)的可变区，所述可变区具有预期的特异性、亲和性和/或容量，但其中一个或多个Fv构架区残基和/或一个或多个Fv CDR残基用相应的人残基(即，衍生自人抗体序列的残基)进行了替换。最一般地，至少多个Fv构架区残基在人源化抗体的一个或多个可变结构域已被替换。此外，人源化的抗体可以包含受体抗体和引入的CDR或构架序列中都不存在的残基，但包括所述残基来进一步精炼和优化抗体性能。一些人源化的抗体基本包含所有的至少一个、并且一般两个可变结构域，其中所有或基本所有的CDR对应非人免疫球蛋白的可变区，并且所有或基本所有的FR为人免疫球蛋白共有序列的FR。一些人源化的抗体包含基本所有的至少一个、并且一般两个可变结构域，其中CDR的大多数氨基酸残基对应非人免疫球蛋白的氨基酸残基，并且FR的一个或多个氨基酸残基为人免疫球蛋白共有序列的氨基酸残基。人源化抗体优选地也包含至少部分免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)，所述免疫球蛋白恒定区或结构域一般为人免疫球蛋白的恒定区或结构域。一些人源化抗体具有如WO 99/58572所述进行修饰的Fc区。一些形式的人源化抗体具有一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个)相对于原始抗体进行改变的CDR，这也称为“衍生自”一个或多个原始抗体CDR的一个或多个CDR。
如本文所用，“人抗体”表示具有与人产生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体、和/或用本领域已知或本文公开的制备人抗体的任一技术制备的抗体。该人抗体的定义包括包含至少一条人重链多肽或至少一条人轻链多肽的抗体。一个此种实例是包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。人抗体可以用多种本领域已知技术产生。在一实施方案中，人抗体选自噬菌体文库，其中所述的噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等人，1996，NatureBiotechnology，14：309-314；Sheets等人，1998，PNAS，(USA)95：6157-6162；Hoogenboom和Winter，1991，J.Mol.Biol.，227：381；Marks等人，1991，J.Mol.Biol.，222：581)。人抗体也可以通过将人免疫球蛋白基因座(loci)引入转基因动物来制备，其中所述的转基因动物例如已将内源免疫球蛋白基因部分或完全灭活的小鼠。这种方法在美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016中进行了描述。备选地，人抗体可以通过永生化产生抗靶抗原的抗体的人B淋巴细胞(该B淋巴细胞可以从个人获得或者已在体外进行免疫)来制备。见，例如Cole等人，单克隆抗体和癌治疗(Monoclonal antibody and Cancer Therapy)，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner等人，1991，J.Immunol.，147(l)：86-95；以及美国专利号5,750,373。在一些实施方案中，人抗体为“全人的”，这表示抗体包含人重链和轻链多肽。
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换用来指任一长度氨基酸的多聚体。多聚体可以是线性或分枝的，其可以包含经修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基酸间断。该术语也包含已天然或人为进行修饰的氨基酸多聚体，例如形成二硫键、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任一其它处理或修饰例如与标记组分缀合。该定义也包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及其它本领域已知修饰的多肽。可以理解，因为本发明多肽基于抗体，所以多肽以单链或联合的链出现。
本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”指的是任一长度核苷酸的多聚体，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物、或任一可以通过DNA或RNA聚合酶掺入多聚体的物质。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可以在多聚体组装之前或之后进行。核苷酸的序列可被非核苷酸组分间断。多核苷酸可以在聚合之后进行进一步修饰，例如与标记组分缀合。其它类型的修饰包括例如“帽化”、将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替换、核苷酸之间的修饰例如不带电荷的键(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯(cabamate)等)和带电荷的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯)修饰、含有突出(pendant)部分的修饰，其中所述突出部分例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多聚-L-赖氨酸等)、用嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素(psoralen)等)的修饰、含有螯合剂(倒如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的修饰、含有烷化剂的修饰、具修饰键的修饰(例如，α异头核酸等)、以及未修饰形式的多核苷酸。此外，任一通常存在于糖中的羟基都可以例如被膦酸酯基团、磷酸酯基团替换，被标准的保护基团保护，或者激活来制备与其它核苷酸键接的额外键，或可以连接至固体支持物。5’和3’末端OH可以被磷酸化或用1-20个碳原子的胺或有机封端基团替换。其它羟基也可以衍生成标准的保护基团。多核苷酸也可以含有本领域通常已知的核糖或脱氧核糖类似物形式的糖，其包括例如，2′-O-甲基-、2′-O-烯丙基、2′-氟代-或2′-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚糖、非环状类似物和非碱性核苷类似物例如甲基核苷。一个或多个磷酸二酯键可以用备选的连接基团替换。所述备选的连接基团包括但不限于磷酸酯用P(O)S(″硫酯″)、P(S)S(″二硫代酯″)、(O)NR2(″酰胺化物″)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(″甲缩醛″)替换的实施方案，其中每个R或R’独立地为H或取代或未取代的烷基(1-20个C)，其任选包含醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳醛基(araldyl)。多核苷酸中的键不需要相同。前述描述应用于本文涉及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
抗体的“可变区”指的是单独或联合的抗体轻链可变区或抗体重链可变区。每个重链和轻链的可变区由四个通过三个互补决定区(CDR)(也已知为高变区)连接的构架区(FR)组成。每条链中的CDR通过FR密切接近地连在一起，与其它链的CDR对形成抗体的抗原结合位点做出贡献。存在至少两种确定CDR的技术：(1)基于交叉物种序列变异性的方法(即Kabat等人，有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，(第5版，1991，National Institutes of Health，Bethesda MD))；和(2)基于抗原-抗体复合体结晶学研究的方法(Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273：927-948))。此外，有时在本领域使用这两种方法的组合来确定CDR。
抗体的“恒定区”指的是单独或联合的抗体轻链恒定区或抗体重链恒定区。
“优先结合”或“特异结合”(本文可互换使用)抗体或多肽的表位为本领域深刻理解的术语，并且确定该特异或优先结合的方法在本领域也熟知。如果分子与特定细胞或物质比其与备选细胞或物质反应或联接得更加频繁、更加快速、具更长持续时间和/或具更大亲和性，那么称其为呈现“优先结合”或“特异结合”。如果抗体结合靶比其结合其它物质具更大亲和性、亲合力、更加容易、和/或具更长持续时间，那么其“特异结合”或“优先结合”靶点。例如，特异或优先结合CD26表位的抗体为结合该CD26表位比其结合其它CD26表位或非CD26表位具更大亲和性、亲合力、更加容易、和/或具更长持续时间的抗体。也可以通过阅读这个定义来理解，例如特异或优先结合第一个靶的抗体(或部分或表位)可以或不可以特异或优先地结合第二个靶。如此地，“特异结合”或“优先结合”并不必须需要(尽管其可能包括)排他的结合。一般但非必须地，谈及结合时是指优先结合。
“宿主细胞”包括可以或已经用于掺入多核苷酸插入物的载体受体的个体细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，并且由于天然、随机或人为的突变，子代不必须为与原始亲代细胞完全同一的(在形态学或基因组DNA互补体方面)。宿主细胞包括在体内转染了本发明多核苷酸的细胞。
“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物为非天然存在形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已纯化至其不再是天然存在形式的程度的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。在一些实施方案中，分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物为基本纯的。
如本文所用，“治疗”是获得有益或预期临床结果的方法。对于本发明的目的，有益或预期临床结果包括但不限于一种或多种伴随疾病的症状减轻、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进程的延迟或降缓、疾病状态的改善或缓、以及无论检测得到或检测不到的减轻(无论部分或全部)。“治疗”也表示与如果不接受治疗时的预期相比延长存活期。在一些实施方案中，“治疗”疾病可以包括但不限于治愈疾病。在一些实施方案中，谈及病症时的有益或预期结果包括但不限于下列一种或多种情况：改善病症、治愈病症、减轻病症严重程度、延缓病症恶化、减轻一种或多种伴随病症的症状、增加病症患者的生活质量、和/或延长存活期。在使用本文所述组合物治疗癌的实施方案中，有益或预期结果包括但不限于下列一种或多种情况：降低肿瘤或癌细胞的增殖(或破坏肿瘤或癌细胞)、抑制肿瘤细胞转移、缩小肿瘤大小、抑制肿瘤生长、退化肿瘤、减轻癌症、减少起因于癌的症状、增加癌症患者的生活质量、减少治疗癌所需的其它药物剂量、延迟癌症恶化、和/或延长癌症患者存活期。
“有效量”是足以起到有效或预期临床结果包括临床结果的量。有效量可以以一次或多次施用来施用。对本发明的目的，本文所述多肽例如抗CD26抗体的有效量为足够改善、稳定、反转、降缓和/或延缓与CD26表达相关的病症进展的量。如本领域所理解，例如抗CD26抗体的有效量尤其可以根据患者病史和其它因素例如所用抗CD26抗体的类型(和/或剂量)变化。如本公开对本领域技术人员显而易见的那样，所述原则应用于多肽实施方案。
“个体”(在本文也称为“受试者”)为脊椎动物，优选哺乳动物、更加优选人。哺乳动物包括但不限于农场动物(例如奶牛)、体育动物、宠物(例如猫、狗和马)、灵长类、小鼠和大鼠。
如本文所用，“载体(vector)”表示能够递送、并且优选在宿主细胞中表达一个或多个目的基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子浓缩剂相联的DNA或RNA表达载体、包裹在脂质体中的DNA或RNA表达载体、以及某些真核细胞例如生产者细胞。
如本文所用，“可药用载体(carrier)”或“可药用赋形剂”包括任一与活性成分组合、使成分保持生物学活性、并且当递送时不与受试者免疫系统反应、且对受试者无毒的物质。实例包括但不限于任一标准药物载体，例如磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂例如油/水乳剂、以及多种类型的湿润剂。气雾剂或肠胃外施用优选的稀释剂为磷酸缓冲盐水或生理(0.9％)盐水。包含此类载体的组合物通过熟知的常规方法(见，例如Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro编辑，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990；以及Remington，The Science and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing，2000)制剂。
如本文所用，术语“koff”旨在表示抗体从抗体/抗原复合体解离的解离速率常数。
如本文所用，术语“KD”旨在表示抗体-抗原相互作用的解离常数。
如本文所用，“基本纯的”指的是至少50％纯(即无污染物)、更加优选至少90％纯、更加优选至少95％纯、更加优选至少98％纯、更加优选至少99％纯的物质。
多肽
本发明提供了多种包含一个或多个重链和/或轻链互补决定区(CDR)、重链和/或轻链构架区(FR)、和/或重链和/或轻链可变区(分别为VH和VL)的新多肽。在一些实施方案中，多肽为抗体。在一些实施方案中，多肽是分离的。本发明也包括基本纯的多肽。在一些实施方案中，抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体为嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体为人源化的抗体。在一些实施方案中，抗体为人抗体。在一些实施方案中，多肽不是(即为其它而非)鼠单克隆抗体。在一些实施方案中，多肽不是鼠单克隆抗体。在一些实施方案中，多肽不是14D10抗体(Dong等人(1998)Mol Immunol.35(1)：13-21和美国专利公开号2003/0031665)。在一些实施方案中，多肽不包含14D10抗体的VH或VL(或VH和VL两者)或特定CDR、FR、CDR集或FR集。在一些实施方案中，多肽不包含14D10抗体的一个或多个CDR和/或一个或多个FR。在一些实施方案中，多肽不包含14D10抗体的所有CDR和/或所有FR。在一些实施方案中，多肽不包含14D10抗体的VH和VL这两者。(14D10抗体的VH和VL以及CDR和FR在图3和图5中被鉴定。)在一些实施方案中，多肽不包含序列QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(CM03 VH；SEQ ID NO：90)的重链可变区。在一些实施方案中，多肽不包含序列DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK(CM03 VL；SEQ ID NO：91)的轻链可变区。在一些实施方案中，多肽不包含序列QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHD WFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：90)的重链可变区和序列DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO：91)的轻链可变区。在前述每个方面和本文所述其它方面的一些实施方案中，多肽不为小鼠单克隆抗体1F7(美国专利号5,120,642；PCT公开号WO 91/07985(Schlossman等人)；Morimoto等人(1989)J.Immunology，143：3430-3439)。在一些实施方案中，多肽不包含1F7抗体的VH和VL这两者。在一些实施方案中，多肽不包含1F7抗体的一个或多个CDR和/或一个或多个FR。在一些实施方案中，多肽不包含1F7抗体的所有CDR和/或所有FR。在一些实施方案中，多肽为亲和性成熟的抗体。在一些实施方案中，本文所述多肽为抗体链，例如重链或轻链。在一些实施方案中，多肽包含轻链可变区(例如包含一个或多个本文所述轻链CDR和/或一个或多个本文所述轻链FR的轻链可变区)。在一些实施方案中，多肽包含重链可变区(例如包含一个或多个本文所述重链互补决定区(CDR)和/或一个或多个本文所述重链构架区(FR)的重链可变区)。在一些实施方案中，本发明包含其中每个都包含轻链可变区和重链可变区的多肽。本发明进一步包含为抗体或其它CD26结合多肽合成中的中间体的多肽。
在一些实施方案中，本文所述多肽例如抗体结合CD26。在一些实施方案中，本文所述多肽优先结合CD26。在一些实施方案中，多肽结合人CD26。在一些实施方案中，多肽优先结合人CD26。在一些实施方案中，多肽与人CD26或其它物种的CD26交叉反应。在一些实施方案中，本文所述多肽以大约200nM或更小、大约60nM、或大约30nM或更小、大约12nM或更小、大约6nM或更小、大约3nM、或大约1nM或更小的KD结合人CD26。在一些实施方案中，多肽以大约10nM或更小的KD结合人CD26。在一些实施方案中，多肽以大约6nM或更小的KD结合人CD26。在一些实施方案中，多肽以大约3nM或更小的KD结合人CD26。在一些实施方案中，多肽以大约1nM或更小的KD结合人CD26。在一些实施方案中，多肽(例如抗体)以大约0.1nM至大约10nM、大约0.1nM至大约6nM、大约0.1nM至大约3nM、或大约0.1nM至大约1nM的KD结合人CD26。
在一些实施方案中，本文所述多肽(例如抗体)结合至一个或多个选自YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO：45；肽6)、LEYNYVKQWRHSY(SEQ ID NO：46；肽35)、TWSPVGHKLAYVW(SEQ ID NO：47；肽55)、LWWSPNGTFLAYA(SE Q ID NO：48；肽84)、RISLQWLRRIQNY(SE QID NO：49；肽132)、YVKQWRHSYTASY(SEQ ID NO：50；肽37)、EEEVFSAYSALWW(SEQ ID NO：51；肽79)、DYSISPDGQFILL(SEQID NO：52；肽29)、SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO：53；肽30)和IYVKIEPNLPSYR(SEQ ID NO：54；肽63)的肽。在一些实施方案中，本文所述多肽优先结合至一个或多个肽。所述肽为人CD26的区域。在一些实施方案中，本文所述多肽结合与小鼠单克隆抗体14D10相同的表位。在一些实施方案中，本文所述多肽能够在竞争性测试中阻断小鼠单克隆抗体14D10与人CD26的结合。在一些实施方案中，本文所述多肽能够在竞争性测试中阻断小鼠单克隆抗体1F7与人CD26的结合。
测定亲和性的方法为本领域已知。例如，结合亲和性可以用BIAcore生物传感器、KinExA生物传感器、闪烁接近测试、ELISA、ORIGEN免疫测定法(IGEN)、荧光淬灭、荧光转移、和/或酵母展示测定。
一种测定抗体与CD26结合亲和性的方法是通过测定抗体的单功能Fab片段的亲和性。为了获得单功能的Fab片段，将抗体例如IgG用木瓜蛋白酶切割或进行重组表达。单克隆抗体抗CD26Fab片段的亲和性可以通过表面胞质共振(SPR)系统(BIAcore 3000TM，BIAcore，Inc.，Piscaway，NJ)测定。SA芯片(链霉亲和素)根据厂商说明书使用。将生物素化的CD26在HBS-EP(100mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％P20)中稀释，并以0.005mg/mL的浓度注射到芯片上。在分别的芯片通道上使用可变的流动时间，实现两个范围的抗原密度：10-20反应单位(RU)用于详细的动力学研究，并且500-600RU用于浓度研究。Pierce洗脱缓冲液混合物和4M NaCl(2∶1)有效移去结合的Fab，同时保持芯片上CD26进行超过200次注射的活性。HBS-EP缓冲液可以用作所有BIAcore测试的流动缓冲液。将连续稀释(0.1-10×估计的KD)的经纯化Fab样品以100μL/分钟注射2分钟，并通常允许高达30小时的解离时间。Fab蛋白质的浓度可以通过ELISA和/或用已知浓度(通过氨基酸分析测定)的标准Fab的SDS-PAGE电泳测定。动力学结合速率(kon)和解离速率(koff)通过用BIAevaluation程序将数据拟合至1∶1朗缪尔结合模型(Lofas&Johnsson，1990)同时获得。平衡解离常数(KD)值计算为koff/kon。
在一些实施方案中，本发明包含抑制表达CD26的细胞增殖的多肽例如抗体。本发明也包含其中多肽用于治疗与CD26表达(例如T细胞恶性肿瘤)相关的病症(例如疾病或病症)的实施方案。在一些实施方案中，本发明的多肽(例如抗体)具有下列一种或多种特性：(a)结合CD26；(b)调节CD26活性，(c)导致CD26+细胞的细胞周期停滞在G1/S限制点；(d)抑制表达CD26的细胞增殖，和/或(e)用于治疗与CD26表达相关的病症。在一些实施方案中，多肽用于抑制表达CD26的肿瘤的生长、诱导表达CD26的肿瘤退化、和/或抑制表达CD26的癌细胞的转移。在一些实施方案中，与CD26表达相关的病症为与CD26过量表达相关的疾病或病症。在一些实施方案中，与CD26表达相关的病症至少部分由CD26介导。在一些实施方案中，与CD26表达相关的病症为与表达CD26的细胞增殖相关的病症。在一些实施方案中，疾病或病症为癌(例如，实体瘤、胰腺癌、肾癌或淋巴瘤)、自身免疫疾病或病症、移植物抗宿主病(GVHD)、或炎性疾病或病症。
在一方面，本发明提供了包含一个或多个(例如一个、二个、三个、四个、五个或六个)本文所述的互补决定区(CDR)的多肽。在另一方面，本发明提供了包含一个或多个(例如一个、二个或三个)本文所述的重链互补决定区(CDR)和/或一个或多个(例如一个、二个或三个)本文所述的轻链CDR的多肽。在一些实施方案中，多肽进一步包含一个或多个(例如一个、二个、三个或四个)本文所述的重链构架区(FR)和/或一个或多个(例如一个、二个、三个或四个)本文所述的轻链FR。在另一方面，本发明提供了包含重链可变区和/或轻链可变区的多肽，其中所述重链可变区包含一个或多个(例如一个、二个或三个)本文所述的重链互补决定区(CDR)，其中所述轻链可变区包含一个或多个(例如一个、二个或三个)本文所述的轻链CDR。在一些实施方案中，重链可变区进一步包含一个或多个(例如一个、二个、三个或四个)本文所述的重链构架区(FR)，和/或轻链可变区进一步包含一个或多个(例如一个、二个、三个或四个)本文所述的轻链FR。
应该理解的是，谈及“重链CDR”或“轻链CDR”时，其不表示所述CDR的所有实施方案都分别包含在重链或轻链中。所述术语用来方便地表明其来源。然而，本发明的确包括其中一个或多个CDR包含在(a)重链可变区和/或轻链可变区、和/或(b)重链和/或轻链中的实施方案。相同的原则应用于构架的描述。
本发明提供了多肽例如抗体，其包含：(a)一个或多个(例如一个、二个或三个)重链CDR，每个具有与选自(i)选自GFSLTTYGVH(SEQ IDNO：55)、GFSLSTYGVH(SEQ ID NO：56)和GYSLTTYGVH(SEQ IDNO：57)的重链CDR1、(ii)选自VIWGDGRTDYDAAFMS(SEQ ID NO：58)和VIWGDGRTDYDSSFMS(SEQ ID NO：59)的重链CDR2和(iii重链CDR3序列NRHDWFDY(SEQ ID NO：60)的CDR至少大约80％的同一性；和/或(b)一个或多个(例如一个、二个或三个)轻链CDR，每个具有与选自(i)选自RASQDIRNNLN(SEQ ID NO：61)、RASQGIRNNLN(SEQ ID NO：62)和SASQDIRNSLN(SEQ ID NO：63)的轻链CDR1、(ii)选自YSSNLHS(SEQID NO：64)、YSSNLQS(SEQ ID NO：65)和YSSNLHT(SEQ ID NO：66)的轻链CDR2、和(iii)选自QQSIKLPLT(SEQ ID NO：67)、QQSIKLPFT(SEQ IDNO：68)和QQSNKLPLT(SEQ ID NO：69)的轻链CDR3的CDR至少大约80％的同一性。在一些实施方案中，CDR具有与所给序列至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％、至少大约98％或100％的同一性。在一些实施方案中，多肽结合CD26。在一些实施方案中，多肽不为鼠单克隆抗体。在一些实施方案中，多肽为包含(i)具有与GFSLTTYGVH(SEQ IDNO：55)至少大约80％同一性的重链CDR1、(ii)具有与VIWGDGRTDYDAAFMS(SEQ ID NO：58)至少大约80％同一性的重链CDR2、和(iii)具有与NRHDWFDY(SEQ ID NO：60)至少大约80％同一性的重链CDR3的抗体。在一些实施方案中，多肽为包含(i)具有与RASQGIRNNLN(SEQ ID NO：62)至少大约80％同一性的轻链CDR1、(ii)具有与YSSNLQS(SEQ ID NO：65)至少大约80％同一性的轻链CDR2、和(iii)具有与QQSIKLPFT(SEQ ID NO：68)至少大约80％同一性的轻链CDR3的抗体。
在一些实施方案中，多肽包含一个或多个(例如一个、二个或三个)CDR，其中每个CDR包含图5所示的重链可变区(VH)X384、X385、X386、X387、X388、X399或X420的CDR。在一些实施方案中，多肽包含一个或多个(例如一个、二个或三个)CDR，其中每个CDR包含图3所示X376、X377、X378、X379、X380、X381或X394中任一序列的轻链可变区(VL)的CDR。在一些实施方案中，一个或多个CDR为图3或图5中分别所示的轻链可变区或重链可变区的CDR1、CDR2或CDR3(例如CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3)。一些实施方案包括这样的多肽(例如抗体)，其包含一个或多个图5所示的重链可变区(VH)序列X384、X385、X386、X387、X388、X399或X420的CDR和一个或多个图3所示的轻链可变区序列X376、X377、X378、X379、X380、X381或X394的CDR。
在一些实施方案中，本发明提供了这样的多肽例如抗体，其包含至少一个与如图5所示任一序列X384、X385、X386、X387、X388、X399或X420的VH或如图3所示任一序列X376、X377、X378、X379、X380、X381或X394的轻链可变区(VL)的至少一个CDR、至少两个CDR或至少三个CDR至少大约80％同一性的CDR。其它实施方案包括这样的多肽，其包含至少两个或多个与至少两个或三个如图5所示任一序列X384、X385、X386、X387、X388、X399或X420的VH或如图3所示任一序列X376、X377、X378、X379、X380、X381或X394的VL的CDR至少大约80％同一性的CDR。在一些实施方案中，一个或多个与图5或3中所示VH和VL的至少一个CDR、至少两个、或至少三个CDR基本同源的CDR是与如图5所示任一序列X384、X385、X386、X387、X388、X399或X420或如图3所示任一序列X376、X377、X378、X379、X380、X381或X394的VH或VL的至少一个、至少两个或至少三个CDR至少大约85％、至少大约86％、至少大约87％、至少大约88％、至少大约89％、至少大约90％、至少大约91％、至少大约92％、至少大约93％、至少大约94％、至少大约95％、至少大约96％、至少大约97％、至少大约98％、至少大约99％的同一性。在一些实施方案中，CDR为CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3。
测定CDR在本领域技术之内。在一些实施方案中，CDR为KabatCDR。在其它实施方案中，CDR为Chothia CDR。此外，在更多实施方案中，一个或多个CDR通过联合Kabat和Chothia的定义来定义。
在一方面，本发明提供了这样的多肽，其包含：(a)包含序列GX1X2LX3TYGVH(SEQ ID NO：31)的重链CDR1，其中X1为F或Y，X2为S或T，并且X3为T、N或S；(b)包含序列VIWGX1GRTDYDX2X3FMS(SEQ ID NO：32)的重链CDR2，其中X1为G或D，X2为A或S，并且X3为A或S；和/或(c)包含序列X1RHDWFDY(SEQID NO：33)的重链CDR3，其中X1为N或S。在一些实施方案中，多肽包含CDR1。在一些实施方案中，多肽包含CDR2。在一些实施方案中，多肽包含CDR3。在一些实施方案中，多肽包含CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，多肽包含含有CDR1、CDR2和/或CDR3的重链可变区。在一些实施方案中，多肽进一步包含轻链可变区(例如本文所述的轻链可变区)。
在一些实施方案中，多肽包含这样的重链CDR，所述重链CDR包含(i)包含序列GX1X2LX3TYGVH(SEQ ID NO：31)的CDR1，其中X1为F或Y、X2为S或T、并且X3为T、N或S；(ii)包含序列VIWGX1GRTDYDX2X3FMS(SEQ ID NO：32)的CDR2，其中X1为G或D、X2为A或S、并且X3为A或S；和(iii)包含序列X1RHDWFDY(SEQ IDNO：33)的CDR3，其中X1为N或S。在一些实施方案中，多肽包含含有重链CDR的重链可变区。
在一些实施方案中，多肽包含含有选自GFSLTTYGVH(SEQ IDNO：55)、GFSLSTYGVH(SEQ ID NO：56)和GYSLTTYGVH(SEQ IDNO：57)的序列的重链CDR1。在一些实施方案中，多肽包含含有选自VIWGDGRTDYDAAFMS(SEQ ID NO：58)和VIWGDGRTDYDSSFMS(SEQ ID NO：59)的序列的重链CDR2。在一些实施方案中，多肽包含含有序列NRHDWFDY(SEQ ID NO：60)的重链CDR3。在一些实施方案中，多肽包含含有重链CDR的重链可变区。
另外，当本文描述本发明实施方案的任一方面谈及马库什基团或其它备选基团时，本发明不仅包含列出的全部组别整体，也包含各个组别的每个成员和主要组别所有可能的亚组，也包含缺少一个或多个组成员的主要组别。本发明也考虑了在公开的发明中一个或多个组成员被排除在外。
在一些实施方案中，多肽包含这样的重链CDR，所述重链CDR包含：(a)包含序列GFSLTTYGVH(SEQ ID NO：55)的CDR1；(b)包含序列VIWGDGRTDYDAAFMS(SEQ ID NO：58)的CDR2；和(c)包含序列NRHDWFDY(SEQ ID NO：60)的CDR3。在一些实施方案中，多肽包含这样的重链CDR，所述重链CDR包含：(a)包含序列GFSLSTYGVH(SEQ IDNO：56)的CDR1；(b)包含序列VIWGDGRTDYDAAFMS(SEQ ID NO：58)的CDR2；和(c)包含序列NRHDWFDY(SEQ ID NO：60)的CDR3。在一些实施方案中，多肽包含这样的重链CDR，所述重链CDR包含：(a)包含序列GYSLTTYGVH(SEQ ID NO：57)的CDR1；(b)包含序列VIWGDGRTDYDSSFMS(SEQ ID NO：59)的CDR2；和(c)包含序列NRHDWFDY(SEQ ID NO：60)的CDR3。在以上每个实施方案的一些实施方案中，多肽包含含有特定CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区。
在另一方面，本发明提供了多肽，其包含：(a)包含序列X1ASQX2IRNX3LN(SEQ ID NO：34)的轻链CDR1，其中X1为S或R、X2为G或D、并且X3为S或N；(b)包含序列YSSNLX1X2(SEQ ID NO：35)的轻链CDR2，其中X1为H或Q并且X2为S或T；和/或(c)包含序列QQSX1KLPX2T(SEQ ID NO：36)的轻链CDR3，其中X1为I或N并且X2为F或L。在一些实施方案中，多肽为抗体。在一些实施方案中，多肽包含CDR1。在一些实施方案中，多肽包含CDR2。在一些实施方案中，多肽包含CDR3。在一些实施方案中，多肽包含CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，多肽包含含有CDR1、CDR2和/或CDR3的轻链可变区。在一些实施方案中，多肽进一步包含重链可变区(例如本文所述的重链可变区)。
在一些实施方案中，多肽包含这样的轻链CDR，所述轻链CDR包含(i)，所述轻链CDR包含序列X1ASQX2IRNX3LN(SEQ ID NO：34)的CDR1，其中X1为S或R、X2为G或D、并且X3为S或N；(ii)包含序列YSSNLX1X2(SEQ ID NO：35)的CDR2，其中X1为H或Q并且X2为S或T；和(iii)包含序列QQSX1KLPX2T(SEQ ID NO：36)的CDR3，其中X1为I或N并且X2为F或L。在一些实施方案中，多肽包含含有轻链CDR的轻链可变区。
在一些实施方案中，多肽包含这样的轻链CDR1，所述轻链CDR1包含选自RASQDIRNNLN(SEQ ID NO：61)、RASQGIRNNLN(SEQ IDNO：62)和SASQDIRNSLN(SEQ ID NO：63)的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽包含这样的轻链CDR2，所述轻链CDR2包含选自YSSNLHS(SEQ ID NO：64)、YSSNLQS(SEQ ID NO：65)和YSSNLHT(SEQID NO：66)的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽包含这样的轻链CDR3，所述轻链CDR3包含选自QQSIKLPLT(SEQ ID NO：67)、QQSIKLPFT(SEQ ID NO：68)和QQSNKLPLT(SEQ ID NO：69)的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽包含含有轻链CDR的轻链可变区。
在一些实施方案中，多肽包含这样的轻链CDR，所述轻链CDR包含(a)包含序列RASQDIRNNLN(SEQ ID NO：61)的CDR1、(b)包含序列YSSNLHS(SEQ ID NO：64)的CDR2和(c)包含序列QQSIKLPLT(SEQ IDNO：67)的CDR3。在一些实施方案中，多肽包含这样的轻链CDR，所述轻链CDR包含(a)包含序列RASQGIRNNLN(SEQ ID NO：62)的CDR1、(b)包含序列YSSNLQS(SEQ ID NO：65)的CDR2、和(c)包含序列QQSIKLPFT(SEQ ID NO：68)的CDR3。在一些实施方案中，多肽包含这样的轻链CDR，所述轻链CDR包含(a)包含序列SASQDIRNSLN(SEQ IDNO：63)的CDR1、(b)包含序列YSSNLHT(SEQ ID NO：66)的CDR2和(c)包含序列QQSNKLPLT(SEQ ID NO：69)的CDR3。在以上每个实施方案的一些实施方案中，多肽包含含有特定CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。
在一些实施方案中，多肽包含这样的重链CDR，所述重链CDR包含(a)包含序列GFSLTTYGVH(SEQ IDNO：55)的CDR1、(b)包含序列VIWGDGRTDYDAAFMS(SEQ ID NO：58)的CDR2和(c)包含序列NRHDWFDY(SEQ ID NO：60)的CDR3，和/或这样的轻链CDR，所述轻链CDR包含(a)包含序列RASQGIRNNLN(SEQ ID NO：62)的CDR1、(b)包含序列YSSNLQS(SEQ ID NO：65)的CDR2和(c)包含序列QQSIKLPFT(SEQ ID NO：68)的CDR3。在一些实施方案中，多肽为抗体。
在一些实施方案中，多肽包含重链CDR1、重链CDR2、和/或重链CDR3，所述重链CDR1包含序列GX1X2LX3TYGVH(SEQ ID NO：31)，其中X1为F或Y、X2为S或T、并且X3为T、N或S，重链CDR2包含序列VIWGX1GRTDYDX2X3FMS(SEQ ID NO：32)，其中X1为G或D、X2为A或S、并且X3为A或S，重链CDR3包含序列X1RHDWFDY(SEQ IDNO：33)，其中X1为N或S，并且多肽进一步包含轻链CDR1、轻链CDR2、和/或轻链CDR3，所述轻链CDR1包含序列X1ASQX2IRNX3LN(SEQ IDNO：34)，其中X1为S或R、X2为G或D、并且X3为S或N，轻链CDR2包含序列YSSNLX1X2(SEQ ID NO：35)，其中X1为H或Q并且X2为S或T，轻链CDR3包含序列QQSX1KLPX2T(SEQ ID NO：36)，其中X1为I或N并且X2为F或L。例如，在一些实施方案中，多肽包含三个重链CDR，即CDR1、CDR2和CDR3，以及三个轻链CDR，即CDR1、CDR2和CDR3。
本发明也包括包含一个或多个本文所述CDR的多肽，其中所述多肽进一步包含一个或多个本文所述的FR。
在一些实施方案中，CDR和/或FR为依次排序。
本发明进一步提供了包含一个或多个(例如一个、两个或三个)本文所述重链CDR的重链可变区。在一些实施方案中，重链可变区进一步包含一个或多个(例如一个、两个、三个或四个)本文所述的重链FR。此外，本发也提供了包含一个或多个(例如一个、两个或三个)本文所述轻链CDR的轻链可变区。在一些实施方案中，轻链可变区进一步包含一个或多个(例如一个、两个、三个或四个)本文所述的轻链FR。
在另一方面，本发明提供了包含一个或多个本文所述重链构架区(FR)和/或一个或多个本文所述轻链构架区的多肽。在一些实施方案中，多肽包含含有一个或多个本文所述重链FR的重链可变区和/或含有一个或多个本文所述轻链FR的轻链可变区。
在一些实施方案中，多肽包含一个或多个(例如一个、两个、三个或四个)FR，其中每个FR包含如图5所示任一序列X384、X385、X386、X387、X388、X399或X420的重链可变区(VH)的FR。在一些实施方案中，图5中重链可变区的FR为FR1、FR2、FR3或FR4。在一些实施方案中，多肽包含一个或多个(例如一个、两个、三个或四个)FR，其中每个FR包含如图3所示任一序列X376、X377、X378、X379、X380、X381或X394的轻链可变区(VL)的FR。在一些实施方案中，图3中轻链可变区的FR为FR1、FR2、FR3或FR4。一些实施方案包括这样的多肽(例如抗体)，所述多肽包含一个或多个如图5所示任一序列X384、X385、X386、X387、X388、X399或X420的重链可变区(VH)的FR、以及一个或多个如图3所示任一序列X376、X377、X378、X379、X380、X381或X394的轻链可变区的FR。
在一些实施方案中，本发明提供了包含至少一个FR的多肽(例如抗体)，其中所述FR与如图5所示任一序列X384、X385、X386、X387、X388、X399或X420的VH或如图3所示任一序列X376、X377、X378、X379、X380、X381或X394的VL的至少一个FR、至少两个FR、至少三个FR或至少四个FR基本同源。在一些实施方案中，一个或多个与图5或图3所示的VH或VL的至少一个FR、至少两个、至少三个或至少四个FR基本同源的FR为与图5所示任一序列X384、X385、X386、X387、X388、X399或X420或图3所示任一序列X376、X377、X378、X379、X380、X381或X394的VH或VL的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个FR至少大约85％、至少大约86％、至少大约87％、至少大约88％、至少大约89％、至少大约90％、至少大约91％、至少大约92％、至少大约93％、至少大约94％、至少大约95％、至少大约96％、至少大约97％、至少大约98％、至少大约99％的同一性。
此外，在另一方面，本发明提供了这样的多肽，其包含：(a)包含序列EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9AS(SEQ ID NO：37)的重链FR1，其中X1为E或Q、X2为A或G、X3为G或E、X4为L或V、X5为V、K或E、X6为G或E、X7为T或S、X8为T或S、并且X9为T或K；(b)包含序列WVRQAPGKGLEWX1G(SEQ ID NO：38)的重链FR2，其中X1为V或M；(c)包含序列RVTISX1DX2SKX3TX4YLQX5NSLRAEDTAVYYCX6R(SEQ ID NO：39)的重链FR3，其中X1为K或R、X2为N或T、X3为S或N、X4为V或A、X5为M或L、并且X6为V、M或T；和/或(d)包含序列WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：40)的重链FR4。在一些实施方案中，多肽包含FR1。在一些实施方案中，多肽包含FR2。在一些实施方案中，多肽包含FR3。在一些实施方案中，多肽包含FR1、FR2、FR3和FR4。在一些实施方案中，多肽包含含有FR1、FR2、FR3和/或FR4的重链可变区。在一些实施方案中，多肽进一步包含轻链可变区。
在一些实施方案中，多肽包含这样的重链FR1，其包含序列EVQLVESGAGVKQPGGTLRLTCTAS(SEQ ID NO：70)、EVQLVQSGGGVKQPGETLRLTCTAS(SEQ ID NO：71)、EVQLVQSGGGLKQPGETLRLSCTAS(SEQ ID NO：72)或EVQLVESGGGVKQPGETLRLTCTAS(SEQ ID NO：73)。在其它实施方案中，多肽包含这样的重链FR2，其包含序列WVRQAPGKGLEWVG(SEQ ID NO：74)或WVRQAPGKGLEWMG(SEQ ID NO：75)。在其它实施方案中，多肽包含这样的重链FR3，其包含序列RVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMR(SEQ ID NO：76)、RVTISKDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCMR(SEQ ID NO：77)或RVTISKDTSKSTAYLQLNSLRAEDTAVYYCTR(SEQ ID NO：78)。在一些实施方案中，多肽包含含有序列WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：40)的重链FR4。
在一些实施方案中，多肽包含这样的重链构架区，所述重链构架区包含(a)包含序列EVQLVESGAGVKQPGGTLRLTCTAS(SEQ ID NO：70)的FR1、(b)包含序列WVRQAPGKGLEWVG(SEQ ID NO：74)的FR2、(c)包含序列RVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMR(SEQ IDNO：76)的FR3和(d)包含序列WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：40)的FR4。在其它实施方案中，多肽包含这样的重链构架区，所述重链构架区包含(a)包含序列EVQLVQSGGGVKQPGETLRLTCTAS(SEQ ID NO：71)的FR1、(b)包含序列WVRQAPGKGLEWVG(SEQ ID NO：74)的FR2、(c)包含序列RVTISKDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCMR(SEQ IDNO：77)的FR3和(d)包含序列WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：40)的FR4。此外，在其它实施方案中，多肽包含这样的重链构架区，所述重链构架区包含(a)包含序列EVQLVQSGGGLKQPGETLRLSCTAS(SEQ ID NO：72)的FR1、(b)包含序列WVRQAPGKGLEWMG(SEQ ID NO：75)的FR2、(c)包含序列RVTISKDTSKSTAYLQLNSLRAEDTAVYYCTR(SEQ IDNO：78)的FR3和(d)包含序列WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：40)的FR4。在一些备选实施方案中，多肽包含这样的重链构架区，所述重链构架区包含(a)包含序列EVQLVESGGGVKQPGETLRLTCTAS(SEQ ID NO：73)的FR1、(b)包含序列WVRQAPGKGLEWVG(SEQ ID NO：74)的FR2、(c)包含序列RVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMR(SEQ IDNO：76)的FR3和(d)包含序列WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：40)的FR4。在一些实施方案中，重链构架区包含在重链可变区中。
在进一步的方面，本发明提供了多肽，其包含(a)包含序列X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9C(SEQ ID NO：41)的轻链FR1，其中X1为D或E、X2为L或E、X3为M或L、X4为A或V、X5为S或T、X6为L、P或A、X7为D或E、X8为V或A、并且X9为T或S；(b)包含序列WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO：42)的轻链FR2；(c)包含序列GVPX1RFSGSGSGTDFTLTISRLX2X3EDX4AX5YYC(SEQ ID NO：43)的轻链FR3，其中X1为S、D或A、X2为E或Q、X3为P或A、X4为F或V、并且X5为T、A或I、和/或(d)包含序列FGSGTKVEIK(SEQ ID NO：44)的轻链FR4。在一些实施方案中，多肽包含FR1。在一些实施方案中，多肽包含FR2。在一些实施方案中，多肽包含FR3。在一些实施方案中，多肽包含FR4。在一些实施方案中，多肽包含FR1、FR2、FR3和FR4。在一些实施方案中，多肽包含含有FR1、FR2、FR3和/或FR4的轻链可变区。在一些实施方案中，多肽进一步包含重链链可变区。
在一些实施方案中，多肽包含这样的轻链FR1，所述轻链FR1包含序列DILMTQSPSSLSASPGDRVTISC(SEQ ID NO：79)、DILLTQSPSSLSATPGERATITC(SEQ ID NO：80)或EIEMTQSPSSLSVSAGERATISC(SEQ ID NO：81)。在一些实施方案中，多肽包含这样的轻链FR2，所述轻链FR2包含序列WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO：42)。在一些实施方案中，多肽包含这样的轻链FR3，所述轻链FR3包含序列GVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAAYYC(SEQ ID NO：82)、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDVAAYYC(SEQ ID NO：83)或GVPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDVAIYYC(SEQ ID NO：84)。在一些实施方案中，多肽包含这样的轻链FR4，所述轻链FR4包含序列FGSGTKVEIK(SEQ ID NO：44)。
在一些实施方案中，多肽包含这样的轻链构架区，所述轻链构架区包含(a)包含序列DILMTQSPSSLSASPGDRVTISC(SEQ ID NO：79)的FR1、(b)包含序列WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO：42)的FR2、c)包含序列GVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAAYYC(SEQ ID NO：82)的FR3和(d)包含序列FGSGTKVEIK(SEQ ID NO：44)的FR4。在一些实施方案中，多肽包含这样的轻链构架区，所述轻链构架区包含(a)包含序列DILLTQSPSSLSATPGERATITC(SEQ ID NO：80)的FR1、(b)包含序列WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO：42)的FR2、(c)包含序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDVAAYYC(SEQ ID NO：83)的FR3和(d)包含序列FGSGTKVEIK(SEQ ID NO：44)的FR4。在一些实施方案中，多肽包含这样的轻链构架区，所述轻链构架区包含(a)包含序列EIEMTQSPSSLSVSAGERATISC(SEQ ID NO：81)的FR1、(b)包含序列WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO：42)的FR2、(c)包含序列GVPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDVAIYYC(SEQ ID NO：84)的FR3和(d)包含序列FGSGTKVEIK(SEQ ID NO：44)的FR4。在一些实施方案中，轻链构架区包含在轻链可变区中。
本发明进一步提供了包含一个或多个(例如一个、两个、三个或四个)本文所述重链FR的重链可变区。此外，本发明也提供了包含一个或多个(例如一个、两个、三个或四个)本文所述轻链FR的轻链可变区。
本发明进一步提供了包含一个或多个本文所述重链可变区和/或一个本文所述轻链可变区的多肽。在一些实施方案中，多肽包含的重链可变区包含一个或多个本文所述重链CDR和/或一个或多个本文所述重链FR。在一些实施方案中，多肽包含的轻链可变区包含一个或多个本文所述轻链CDR和/或一个或多个本文所述轻链FR。
在另一方面，本发明提供了包含氨基酸序列EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX10X11LX12TYGVHWVRQAPGKGLEWX13GVIWGX14GRTDYDX15X16FMSRVTISX17DX18SKX1 9TX20YLQX21NSLRAEDTAVYYCX22RX23RHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：29)的多肽，其中X1为E或Q、X2为A或G、X3为G或E、X4为L或V、X5为V、K或E、X6为G或E、X7为T或S、X8为T或S、X9为T或K、X10为F或Y、X11为S或T、X12为T、N或S、X13为V或M、X14为G或D、X15为A或S、X16为A或S、X17为K或R、X18为N或T、X19为S或N、X20为V或A、X21为M或L、X22为V、M或T、并且X23为N或S。在一些实施方案中，多肽包含这样的重链可变区，所述重链可变区包含序列EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX10X11LX12TYGVHWVRQAPGKGLEWX13GVIWGX14GRTDYDX15X16FMSRVTISX17DX18SKX1 9TX20YLQX21NSLRAEDTAVYYCX22RX23RHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：29)，其中X1为E或Q、X2为A或G、X3为G或E、X4为L或V、X5为V、K或E、X6为G或E、X7为T或S、X8为T或S、X9为T或K、X10为F或Y、X11为S或T、X12为T、N或S、X13为V或M、X14为G或D、X15为A或S、X16为A或S、X17为K或R、X18为N或T、X19为S或N、X20为V或A、X21为M或L、X22为V、M或T、并且X23为N或S。在一些实施方案中，多肽为抗体。在一些实施方案中，多肽进一步包含轻链可变区。
重链可变区的CDR(CDR1、CDR2和CDR3)在下列序列中下划线(并且以相继次序定位)：EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX 10 X 11 LX 12 TYGVHWVRQAPGKGLEWX13GVIWGX 14 GRTDYDX 15 X 16 FMSRVTISX17DX18SKX1 9TX20YLQX21NSLRAEDTAVYYCX 22 RX 23 RHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：29)，其中X1为E或Q、X2为A或G、X3为G或E、X4为L或V、X5为V、K或E、X6为G或E、X7为T或S、X8为T或S、X9为T或K、X10为F或Y、X11为S或T、X12为T、N或S、X13为V或M、X14为G或D、X15为A或S、X16为A或S、X17为K或R、X18为N或T、X19为S或N、X20为V或A、X21为M或L、X22为V、M或T、并且X23为N或S。重链可变区的CDR2和CDR3(CDR-H2和CDR-H3)根据Kabat等义(Kabat等人，有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第4版，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1987))定义。重链可变区的CDR1(CDR-H1)根据Kabat和Chothia定义(Chothia等人，J Mol.Biol，196：901-917)联合定义。此类定义抗体CDR的方法为本领域已知。见，例如Chen等人，J Mol.Biol，293：865-881(1999)和Muller等人，Structure，6：1153-1167(1998)。在SEQ ID NO：29所示序列中，基于Kabat编号CDR1的位置为H26-35、CDR2的位置为H50-65、并且CDR3的位置为H95-102。根据顺序编号(sequential numbering)，CDR1的位置为H26-35，CDR2的位置为H50-65，CDR3的位置为H98-105。(见，例如图5，对所选示例性重链可变区序列图解重链可变区中的CDR和FR的位置)
在一些实施方案中，多肽包含选自EVQLVESGAGVKQPGGTLRLTCTASGFSLTTYGVHWVRQAPGKGLEWVGVIWGDGRTDYDAAFMSRVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：22；X384)，EVQLVQSGGGVKQPGETLRLTCTASGFSLTTYGVHWVRQAPGKGLEWVGVIWGDGRTDYDAAFMSRVTISKDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCMRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：23；X385)，EVQLVQSGGGLKQPGETLRLSCTASGYSLTTYGVHWVRQAPGKGLEWMGVIWGDGRTDYDSSFMSRVTISKDTSKSTAYLQLNSLRAEDTAVYYCTRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：26；X388)，和EVQLVESGGGVKQPGETLRLTCTASGFSLSTYGVHWVRQAPGKGLEWVGVIWGDGRTDYDAAFMSRVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：28；X420)的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽(例如抗体)包含这样的重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO：22(X384)、SEQ ID NO：23(X385)、SEQ ID NO：26(X388)和SEQ IDNO：28(X420)的氨基酸序列。
在另外的方面，本发明提供了包含序列X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9CX10ASQX11IRNX12LNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLX13X14GVPX15RFSGSGSGTDFTLTISRLX16X17EDX18AX19YYCQQSX20KLPX21TFGSGTKVEIK(SEQ ID NO：30)的多肽，其中X1为D或E、X2为L或E、X3为M或L、X4为A或V、X5为S或T、X6为L、P或A、X7为D或E、X8为V或A、X9为T或S、X10为S或R、X11为G或D、X12为S或N、X13为H或Q、X14为S或T、X15为S、D或A、X16为E或Q、X17为P或A、X18为F或V、X19为T、A或I、X20为I或N、并且X21为F或L。在一些实施方案中，多肽包含这样的轻链可变区，所述轻链可变区包含氨基酸序列X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9CX10ASQX11IRNX12LNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLX13X14GVPX15RFSGSGSGTDFTLTISRLX16X17EDX18AX19YYCQQSX20KLPX21TFGSGTKVEIK(SEQ ID NO：30)，其中X1为D或E、X2为L或E、X3为M或L、X4为A或V、X5为S或T、X6为L、P或A、X7为D或E、X8为V或A、X9为T或S、X10为S或R、X11为G或D、X12为S或N、X13为H或Q、X14为S或T、X15为S、D或A、X16为E或Q、X17为P或A、X18为F或V、X19为T、A或I、X20为I或N、并且X21为F或L。在一些实施方案中，多肽为抗体。在一些实施方案中，多肽进一步包含重链可变区。
轻链可变区的CDR(CDR1、CDR2和CDR3)在下列序列中下划线(并且以相继次序定位)：X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9CX 10 ASQX 11 IRNX 12 LNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLX 13 X 14 GVPX15RFSGSGSGTDFTLTISRLX16X17EDX18AX19YYCQQSX 20 KLPX 21 TFGSGTKVEIK(SEQ ID NO：30)，其中X1为D或E、X2为L或E、X3为M或L、X4为A或V、X5为S或T、X6为L、P或A、X7为D或E、X8为V或A、X9为T或S、X10为S或R、X11为G或D、X12为S或N、X13为H或Q、X14为S或T、X15为S、D或A、X16为E或Q、X17为P或A、X18为F或V、X19为T、A或I、X20为I或N、并且X21为F或L。所示轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3(分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)根据Kabat定义(Kabat等人，有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，第4版，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1987))定义。CDR1在轻链可变区中的位置为L24-34，CDR2在轻链可变区中的位置为L50-56，并且CDR3在轻链可变区中的位置为L89-97(在顺序编号方案和Kabat编号方案下)。(见，例如图3，对所选示例性轻链可变区序列图解轻链可变区中CDR和FR的位置)。
在一些实施方案中，多肽包含选自DILMTQSPSSLSASPGDRVTISCRASQDIRNNLNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAAYYCQQSIKLPLTFGSGTKVEIK(SEQ ID NO：15；X376)，DILLTQSPSSLSATPGERATITCRASQGIRNNLNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDVAAYYCQQSIKLPFTFGSGTKVEIK(SEQ ID NO：18；X379)，和EIEMTQSPSSLSVSAGERATISCSASQDIRNSLNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLHTGVPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDVAIYYCQQSNKLPLTFGSGTKVEIK(SEQ ID NO：19；X380)的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽(例如抗体)包含这样的轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO：15(X376)、SEQ ID NO：18(X379)和SEQ ID NO：19(X380)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多肽包含(a)选自SEQ ID NO：22(X384)、SEQ IDNO：23(X385)、SEQ ID NO：26(X388)和SEQ ID NO：28(X420)的氨基酸序列和(b)选自SEQ ID NO：15(X376)、SEQ ID NO：18(X379)和SEQ IDNO：19(X380)的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽(例如抗体)包含(a)包含选自SEQ ID NO：22(X384)，SEQ ID NO：23(X385)，SEQ IDNO：26(X388)和SEQ ID NO：28(X420)的氨基酸序列的重链可变区和(b)包含选自SEQ ID NO：15(X376)、SEQ ID NO：18(X379)和SEQ IDNO：19(X380)的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：26(X388)和氨基酸序列SEQ ID NO：15(X376)。在一些实施方案中，多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：22(X384)和氨基酸序列SEQ ID NO：18(X379)。在一些实施方案中，多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：28(X420)和氨基酸序列SEQ IDNO：19(X380)。在一些实施方案中，多肽包含氨基酸序列SEQ IDNO：23(X385)和氨基酸序列SEQ ID NO：19(X380)。在一些实施方案中，多肽为抗体。
在一些实施方案中，多肽包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：26(X388)的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO：15(X376)的轻链可变区。在一些实施方案中，多肽包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：22(X384)的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO：18(X379)的轻链可变区。在一些实施方案中，多肽包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：28(X420)的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO：19(X380)的轻链可变区。在一些实施方案中，多肽包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：23(X385)的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO：19(X380)的轻链可变区。在一些实施方案中，包含重链可变区和轻链可变区的多肽为抗体。
本发明提供了多肽，例如抗体，其包含(a)具有与选自SEQ ID NO：15-21的氨基酸序列或选自SEQ ID NO：15-21的氨基酸的序列片段至少大约80％同一性的氨基酸序列，和/或(b)具有与选自SEQ ID NO：22-28的氨基酸序列或选自SEQ ID NO：22-28的氨基酸序列的片段至少大约80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，氨基酸序列具有与所示序列至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％、至少大约97％、至少大约99％的同一性或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含(a)具有与SEQID NO：18或氨基酸序列SEQ ID NO：18的片段至少大约90％同一性的氨基酸序列，和/或(b)具有与SEQ ID NO：22或氨基酸序列SEQ ID NO：22的片段至少大约90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，片段包含至少大约10个氨基酸、至少大约25个氨基酸、至少大约50个氨基酸或至少大约100个氨基酸。在一些实施方案中，多肽结合CD26。在一些实施方案中，多肽不为鼠单克隆抗体。
在另一方面，本发明提供了包含具有与选自图5所示下列序列：X384、X385、X386、X387、X388、X399和X420(分别为SEQ ID NO：22-28)的氨基酸序列至少大约80％同一性的氨基酸序列的多肽。本发明也提供了多肽例如抗体，其包含这样的重链可变区，所述重链可变区包含具有与选自图5所示下列序列：X384、X385、X386、X387、X388、X399和X420(分别为SEQ ID NO：22-28)的氨基酸序列至少大约80％同一性的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，重链可变区包含具有与SEQ IDNO：22(X384)至少大约80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，重链可变区包含具有与SEQ ID NO：23(X385)至少大约80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，重链可变区包含具有与SEQ ID NO：26(X388)至少大约80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，重链可变区包含具有与SEQ ID NO：28(X420)至少大约80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，重链可变区包含具有与选自图5所示下列序列：X384、X385、X386、X387、X388、X399和X420(分别为SEQ ID NO：22-28)的氨基酸序列至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％、至少大约97％、至少大约99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，重链可变区包含与选自SEQ ID NO：22-28的氨基酸序列至少大约95％的同一性。在一些其它实施方案中，重链可变区包含选自SEQ ID NO：22-28的氨基酸序列。
在进一步的方面，本发明提供了包含具有与选自图3所示下列序列：X376、X377、X378、X379、X380、X381和X394(分别为SEQ ID NO：15-21)的氨基酸序列至少大约80％同一性的氨基酸序列的多肽。本发明进一步提供了多肽例如抗体，其包含的轻链可变区包含具有与选自图3所示下列序列：X376、X377、X378、X379、X380、X381和X394(分别为SEQ ID NO：15-21)的氨基酸序列至少大约80％同一性的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，轻链可变区包含具有与SEQ ID NO：15(X376)的氨基酸序列至少大约80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含具有与SEQ ID NO：18(X379)的氨基酸序列至少大约80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含具有与SEQ ID NO：19(X380)的氨基酸序列至少大约80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含具有与选自图3所示下列序列：X376、X377、X378、X379、X380、X381和X394(分别为SEQ ID NO：15-21)的氨基酸序列至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％、至少大约97％、至少大约99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，轻链可变区包含与选自SEQ ID NO：15-21的氨基酸序列至少大约95％的同一性。在其它实施方案中，轻链可变区包含选自SEQ ID NO：15-21的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体包含重链可变区和轻链可变区这两者，所述重链可变区包含具有与选自SEQ ID NO：22-28的氨基酸序列至少大约80％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含具有与选自SEQ ID NO：15-21的氨基酸序列至少大约80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含含有选自SEQ ID NO：15-21的氨基酸序列的轻链可变区和含有选自SEQ ID NO：22-28的氨基酸序列的重链可变区。
在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：15-28中任一氨基酸序列至少5个连续的氨基酸、至少8个连续的氨基酸、至少大约10个连续的氨基酸、至少大约15个连续的氨基酸、至少大约20个连续的氨基酸、至少大约30个连续的氨基酸或至少大约50个连续的氨基酸。
在另一方面，本发明提供了包含选自SEQ ID NO：15-28的氨基酸序列的多肽。
根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，含有编码rhuMAb 411的重链和轻链的质粒的大肠杆菌样本于2006年6月30日以“具有质粒的DH5α大肠杆菌，所述质粒具有抗人CD26 cDNA的人源化单克隆抗体的重链和轻链插入片段”的名称，菌株名称为“S604069.YST-pABMC148(x411)”保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，该中心位于美国，弗吉尼亚，马纳萨斯20108，邮政信箱1549(美利坚合众国，弗吉尼亚，马纳萨斯20110-2209，Blvd.大学10801)，保藏号为PTA-7695。因此，本发明提供了包含抗体重链和/或轻链的多肽，其由根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约以“具有质粒的DH5α大肠杆菌，所述质粒具有抗人CD26 cDNA的人源化单克隆抗体的重链和轻链插入片段”的名称，菌株名称为“S604069.YST-pABMC148(x411)”保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的大肠杆菌样本中的质粒编码。本发明进一步提供了包含抗体重链可变区和/或轻链可变区的多肽，其由根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约于2006年6月30日以“具有质粒的DH5α大肠杆菌，所述质粒具有抗人CD26 cDNA的人源化单克隆抗体的重链和轻链插入片段”的名称、菌株名称为“S604069.YST-pABMC148(x411)”保藏于ATCC、保藏号为PTA-7695的大肠杆菌样本中的质粒编码。本发明也提供了由ATCC以保藏号为PTA-7695保藏的大肠杆菌中的质粒编码的抗体。
本发明进一步提供了包含本文所述多肽序列(例如，任一SEQ IDNO：15-21、SEQ ID NO：22-28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30的)片段的多肽。在一些实施方案中，多肽包含本文所述多肽序列的片段，其中所述片段为至少大约10个氨基酸长度、至少大约25个氨基酸长度、至少大约50个氨基酸长度、至少大约75个氨基酸长度或至少大约100个氨基酸长度。
本发明进一步提供了包含SEQ ID NO：217(见下文实施例4)或其片段或变体的多肽(例如抗体)。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：217。在一些实施方案中，多肽包含除信号序列外的SEQ ID NO：217。(本领域技术人员将轻易理解，在一些实施方案中，多肽的信号序列被从多肽切除。)在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：217的可变区。在一些实施方案中，多肽包含具有与SEQ ID NO：217(或其片段)至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％或至少大约98％同一性的多肽。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：217(或其可变区)的片段，其中所述片段为至少大约10个氨基酸长度、至少大约25个氨基酸长度、至少大约50个氨基酸长度、至少大约75个氨基酸长度或至少大约100个氨基酸长度。在一些实施方案中，多肽结合人CD26。
本发明进一步提供了包含SEQ ID NO：218(见下文实施例4)或其片段或变体的多肽(例如抗体)。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：218。在一些实施方案中，多肽包含除信号序列外的SEQ ID NO：218。本领域技术人员将轻易理解，在一些实施方案中，多肽的信号序列被从多肽切除。)在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：218的可变区。在一些实施方案中，多肽包含具有与SEQ ID NO：218(或其片段)至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％或至少大约98％同一性的多肽。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：218(或其可变区)的片段，其中所述片段为至少大约10个氨基酸长度、至少大约25个氨基酸长度、至少大约50个氨基酸长度、至少大约75个氨基酸长度或至少大约100个氨基酸长度。在一些实施方案中，多肽进一步包含SEQ ID NO：218(见下文实施例4)或其片段或变体。在一些实施方案中，多肽结合人CD26。例如，在一些实施方案中，多肽为包含至少一条重链(例如两条重链)和至少一条轻链(例如两条轻链)的抗体，其中所述的每条重链包含无信号序列的SEQID NO：217、每条轻链包含无信号序列的SEQ ID NO：218。
本发明进一步提供了包含SEQ ID NO：219和/或SEQ ID NO：220(下文实施例13所示)的多肽或其片段或其变体。
在另一方面，本发明提供了这样的多肽例如抗体，所述多肽结合至一个或多个选自YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO：45；肽6)、LEYNYVKQWRHSY(SEQ ID NO：46；肽35)、TWSPVGHKLAYVW(SEQID NO：47；肽55)、LWWSPNGTFLAYA(SEQ ID NO：48；肽84)、RISLQWLRRIQNY(SEQ ID NO：49；肽132)、YVKQWRHSYTASY(SEQID NO：50；肽37)、EEEVFSAYSALWW(SEQ ID NO：51；肽79)、DYSISPDGQFILL(SEQ ID NO：52；肽29)、SISPDGQFILLEY(SEQ IDNO：53；肽30)和IYVKIEPNLPSYR(SEQ ID NO：54；肽63)的肽。在一些实施方案中，多肽优先结合至一个或多个肽。所述肽为人CD26的区域。在一些实施方案中，多肽相对一个或多个对应CD26其它区域的肽，优先结合至一个或多个选自YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO：45；肽6)、LEYNYVKQWRHSY(SEQ ID NO：46；肽35)、TWSPVGHKLAYVW(SEQID NO：47；肽55)、LWWSPNGTFLAYA(SEQ ID NO：48；肽84)、RISLQWLRRIQNY(SEQ ID NO：49；肽132)、YVKQWRHSYTASY(SEQID NO：50；肽37)、EEEVFSAYSALWW(SEQ ID NO：51；肽79)、DYSISPDGQFILL(SEQ ID NO：52；肽29)、SISPDGQFILLEY(SEQ IDNO：53；肽30)和IYVKIEPNLPSYR(SEQ ID NO：54；肽63)的肽。
在一些实施方案中，多肽(例如抗体)结合下列每个肽：YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO：45；肽6)、LEYNYVKQWRHSY(SEQ IDNO：46；肽35)、TWSPVGHKLAYVW(SEQ ID NO：47；肽55)、LWWSPNGTFLAYA(SEQ ID NO：48；肽84)和RISLQ WLRRIQNY(SEQID NO：49；肽132)。在一些实施方案中，多肽结合下列每个肽：YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO：45；肽6)、TWSPVGHKLAYVW(SEQ IDNO：47；肽55)、RISLQWLRRIQNY(SEQ ID NO：49；肽132)、YVKQWRHSYTASY(SEQ ID NO：50；肽37)和EEEVFSAYSALWW(SEQ IDNO：51；肽79)。在一些实施方案中，多肽结合下列每个肽：DYSISPDGQFILL(SEQ ID NO：52；肽29)、SISPDGQFILLEY(SEQ IDNO：53；肽30)和TWSPVGHKLAYVW(SEQ ID NO：47；肽55)。在一些实施方案中，多肽结合下列每个肽：DYSISPDGQFILL(SEQ ID NO：52；肽29)、SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO：53；肽30)、TWSPVGHKLAYVW(SEQ ID NO：47；肽55)和IYVKIEPNLPSYR(SEQID NO：54；肽63)。在一些实施方案中，多肽优先结合至特定的肽。
竞争测试法可以用来确定两个抗体是否通过识别同一或立体重叠的表位来结合相同表位。参见例如Dong等人(1998)和下列实施例中的特异性实验。一般地，将抗原固定在多孔板上，并测定未标记抗体阻断标记抗体结合的能力。用于此类竞争测试法的常见标记为放射性标记或酶标记。此外，本领域技术人员已知的表位作图技术可以用来确定抗体结合的表位。见，例如下文实施例3(e)。
在一些实施方案中，本文所述多肽包含一个或多个恒定区。在一些实施方案中，本文所述多肽包含人恒定区。在一些实施方案中，恒定区为重链恒定区。在其它实施方案中，恒定区为轻链恒定区。在一些实施方案中，多肽包含具有与人恒定区至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％、至少大约98％或100％同一性的恒定区。在一些实施方案中，本文所述多肽(例如抗体)包含Fc区。在一些实施方案中，多肽包含人Fc区。在一些实施方案中，本文所述多肽包含与人Fc区具有至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％、至少大约98％或100％同一性的的Fc区。
在一些实施方案中，本文所述多肽为IgG抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG1抗体。在一些其它实施方案中，抗体为IgG2抗体。在一些实施方案中，抗体为人IgG抗体。
本发明提供了单体、二聚体和多价体形式的抗体。例如，可以用本文公开的抗体来制备具有至少两种不同抗原的结合特异性的双特异性抗体、单克隆抗体。制备双特异性抗体的方法为本领域已知(见，例如Suresh等人，1986，Methods in Enzymology 121：210)。传统地，双特异性抗体的重组产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对和具有不同特异性的两条重链的共表达(Millstein和Cuello，1983，Nature 305，537-539)。
根据一种制备双特异性抗体的方法，将具预期结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)融合至免疫球蛋白恒定结构域序列。融合体优选地具有包含至少部分铰合部、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域。优选在至少一个融合物中存在含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和根据需要的免疫球蛋白轻链的DNA插入分别的表达载体，并共转染入适当宿主生物。当用于构建体的三种多肽链不等比率提供了最佳产率时，这在实施方案中调整这三个多肽片段的相互比例上提供了很大灵活性。但是，当至少两种相同比率的多肽链的表达产生高产率或比率没有特别意义时，可能将两个或所有三个多肽链的编码序列插入到一个表达载体中。
在一种方法中，双特异性抗体由在一臂中具第一种结合特异性的杂种免疫球蛋白重链和在另一臂中的杂种免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二种结合特异性)组成。这种仅在半个双特异性分子中具有免疫球蛋白轻链的不对称结构促进预期的双特异性化合物从不想要的免疫球蛋白链组合中分离。这种方法在1994年3月3日公开的PCT公开号WO 94/04690中描述。
包含两种共价结合的抗体的异种结合抗体(heteroconjugateantibodies)也在本发明范围之内。此类抗体已用于将免疫系统细胞靶向于不想要的细胞(美国专利号4,676,980)，以及用于治疗HIV感染(PCT申请公开号WO 91/00360和WO 92/200373；EP 03089)。异种结合抗体可以用任一方便的交联法制备。适当的交联法和技术为本领域熟知，并在美国专利号4,676,980中进行了描述。
在一些实施方案中，本文所述抗体为抗体片段。例如，在一些实施方案中，抗体选自Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv和F(ab’)2。在一些实施方案中，抗体为Fab。已经研发出多种技术来产生抗体片段。所述片段可以经过蛋白水解消化完整抗体(见，例如Morimoto等人，1992，J.Biochem.Biophys.Methods 24：107-117和Brennan等人，1985，Science 229：81)或直接通过重组宿主细胞产生来得到。例如，Fab’-SH片段可以直接从大肠杆菌中回收、并化学偶联来形成F(ab’)2片段(Carter等人，1992，Bio/Technology 10：163-167)。在另一实施方案中，F(ab’)2用亮氨酸拉链GCN4促进F(ab’)2分子组装来形成。根据另一种方法，Fv、Fab或F(ab’)2片段直接从重组的宿主细胞培养物中分离。
在一些实施方案中，本发明的抗体为单链(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白质、人源化抗体、嵌合抗体、双体(diabodies)、线性抗体、单链抗体和免疫球蛋白分子任一其它修饰的构型。
单链可变区片段通过将轻链和/或重链可变区用短连接肽连接来制备。Bird等人(1988)Science 242：423-426。连接肽的实例为(GGGGS)3(SEQID NO：85)，其在一个可变区的羧基末端和另一可变区的氨基末端桥连大约3.5nm。其它序列的接头已经设计并使用。Bird等人(1988)。接下来可以修饰接头而具有额外的功能，例如连接药物或连接至固相支持物。单链变体可以重组或合成地生产。对于合成生产scFv，可以使用自动化的合成仪。对于重组生产scFv，将含有编码scFv的多核苷酸的适当质粒引入适当宿主细胞，其中所述宿主细胞或为真核的例如酵母、植物、昆虫或哺乳动细胞、或为原核的例如大肠杆菌。编码目的scFv的多核苷酸可以通过常规方法例如多核苷酸的连接来制备。所得scFv可以用本领域已知的标准蛋白质纯化技术来分离。
也包含其它形式的单链抗体例如双体。双体为二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单一的多肽链上表达，但使用太短而不允许相同链上的两个结构域之间配对的接头，进而迫使结构域与另一链的互补结构域配对、并产生两个抗原结合位点(见，例如Holliger，P.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.，等人(1994)Structure2：1121-1123)。
本发明包含对本文所述抗体或其它多肽的修饰，其包括不显著影响其性质的功能等价抗体和具有增强或减少活性的变体。应当理解，修饰原则应用于多肽和抗体。多肽的修饰为本领域的常规操作，并且不需要在本文进行详细描述。修饰的多肽的实例包括具氨基酸残基保守替换、一个或多个氨基酸删除或添加的多肽，其中所述的修饰不显著有害地改变功能活性或化学类似物的用途。
氨基酸序列插入或添加包括长度范围在一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合、以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具N末端甲硫氨酰基残基的抗体或融合了表位标签的抗体。抗体分子的其它插入变体包括将增加抗体血清半衰期的酶或多肽融合至抗体的N或C末端。
替换变体在抗体或其它多肽序列中移去了至少一个氨基酸残基、并在其位置插入了不同残基。替换型突变最感兴趣的位点包括CDR，但也考虑FR变化。保守性替换如题为“保守性替换”的表1所示。如果此类替换导致生物学活性变化，那么可以引入在表1中称为“示例性替换”或如下文谈及氨基酸分类时进一步描述的更加本质的变化并筛选产物。
表1：氨基酸替换
  原始残基   保守性替换   示例性替换
  Ala(A)   Val   Val；Leu；Ile
  Arg(R)   Lys   Lys；Gln；Asn
  Asn(N)   Gln   Gln；His；Asp，Lys；Arg
  Asp(D)   Glu   Glu；Asn
  Cys(C)   Ser   Ser；Ala
  Gln(Q)   Asn   Asn；Glu
  Glu(E)   Asp   Asp；Gln
  Gly(G)   Ala   Ala
  His(H)   Arg   Asn；Gln；Lys；Arg
  Ile(I)   Leu   Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸
  Leu(L)  Ile   正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe
  Lys(K)  Arg   Arg；Gln；Asn
  Met(M)  Leu   Leu；Phe；Ile
  Phe(F)  Tyr   Leu；Val；Ile；Ala；Tyr
  Pro(P)  Ala   Ala
  Ser(S)  Thr   Thr
  Thr(T)  Ser   Ser
  Trp(W)  Tyr   Tyr；Phe
  Tyr(Y)  Phe   Trp；Phe；Thr；Ser
  Val(V)  Leu   Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸
抗体生物学性质的本质改变通过选择替换来实现，其中所述替换在其维持(a)在替换区域中多肽骨架的结构例如片层或螺旋构象、(b)分子在靶位点的电荷或疏水性、或(c)侧链大小的效果上显著不同。天然存在的残基基于通常的侧链性质分为下列类别：
(1)疏水的：正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；
(2)中性亲水的：半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸；
(3)酸性的：天冬氨酸、谷氨酸；
(4)碱性的：天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸；
(5)影响链定向的残基：甘氨酸、脯氨酸；和
(6)芳香族的：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
非保守性替换通过将这些这些类别的一个成员交换为另一类。更加保守的替换涉及将一类别的成员交换成相同类别的另一成员。
任何不涉及维持抗体适当构象的半胱氨酸残基也可以进行替换，通常用丝氨酸，来改善分子的氧化稳定性、并防止异常的交联。相反地，尤其是抗体为抗体片段例如Fv片段时，可以向抗体中加入半胱氨酸键来改善其稳定性。
氨基酸修饰可以是从改变或修饰一个或多个氨基酸到完全重新设计区域例如可变区的范围。可变区的改变可以改变结合亲和性和/或特异性。在一些实施方案中，在CDR结构域中进行不多于1-5个保守氨基酸的替换。在其它实施方案中，在CDR3结构域中进行不多于1-3个保守氨基酸的替换。此外，在其它实施方案中，CDR结构域为CDR H3和/或CDR L3。
修饰也包括糖基化和非糖基化的多肽、以及具其它翻译后修饰例如用不同糖的糖基化、乙酰化和磷酸化的多肽。抗体在其恒定区保守位置糖基化(Jefferis和Lund，1997，Chem.Immunol.65：111-128；Wright和Morrison，1997，TibTECH 15：26-32)。免疫球蛋白的寡糖侧链影响蛋白质的功能(Boyd等人，1996，Mol.Immunol.32：1311-1318；Wittwe和Howard，1990，Biochem.29：4175-4180)和糖蛋白部分之间的分子内相互作用，这可以影响构象和糖蛋白呈现的三维表面(Hefferis和Lund，supra；Wyss和Wagner，1996，Current Opin.Biotech.7：409-416)。寡糖也可以基于特定识别结构将给定的糖蛋白靶向至某些分子的作用。也已经报道，抗体的糖基化影响抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。具体而言，已经报道，具四环素调节的β(1，4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnT III)表达的CHO细胞具有改善的ADCC活性(Umana等人，1999，Nature Biotech.17：176-180)，其中所述β(1，4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)为催化形成二等分GIcNAc的一种糖基转移酶。
抗体的糖基化一般为N连接或O连接的。N连接的指的是糖部分与天冬酰胺残基侧链的结合。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸和天冬酰胺-X-半胱氨酸为酶促地将糖部分结合天冬酰胺侧链的识别序列，其中所述的X为除脯氨酸以外的任一氨基酸。因此，多肽中任一这些三肽序列的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指的是糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟氨基酸的结合，尽管其中所述羟氨基酸也可以用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸，但最常用的为丝氨酸或苏氨酸。
向抗体中加入糖基化位点可以方便地通过改变氨基酸序列以便其含有一个或多个上述三肽序列(对N-连接的糖基化位点)来完成。这种改变也可以通过向原始抗体序列添加或用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基替换(对O-连接的糖基化位点)来完成。
也可以改变抗体的糖基化模式，而无需改变潜在的核苷酸序列。糖基化很大地依赖于用来表达抗体的宿主细胞。因为用于表达作为潜在疗法的重组糖蛋白例如抗体的细胞类型很少是天然细胞，所以可以预期抗体糖基化模式的改变(见，例如Hse等人，1997，J.Biol.Chem.272：9062-9070)。
除了选择宿主细胞外，在重组产生抗体时影响糖基化的因素包括生长模式、培养基成分、培养密度、加氧作用、pH、纯化方案等。已经提出多种方法来改变在特定宿主生物中完成的糖基化模式，其包括引入或过量表达一些涉及寡糖产生的酶(美国专利号5,047,335、5,510,261和5,278,299)。糖基化作用或一些类型的糖基化作用可以酶学地从糖蛋白移去，例如用内切糖苷酶H(Endo H)。此外，重组的宿主细胞可以基因操作为加工一些类型的多糖缺陷型的。这些和类似技术为本领域熟知。
修饰的其它方法包括使用本领域已知的偶联技术，其中所述技术包括但不限于酶法、氧化取代和螯合作用。修饰可以用来例如结合免疫测定的标签。修饰的多肽可以用本领域确定的方法制备，并且可以用本领域已知的标准测定法筛选，其中所述的一些方法和测定在下文和实施例中进行了描述。
其它抗体修饰包括如1999年11月18日公开的PCT公开号WO99/58572所述进行修饰的抗体。这些抗体除了针对靶分子的结合结构域以外，还包含具有与人免疫球蛋白重链的所有或部分恒定结构域基本同源的氨基酸序列的效应结构域。这些抗体能够结合靶分子，而不触发明显的补体依赖性裂解或细胞介导的靶破坏。在一些实施方案中，效应结构域能特异地结合FcRn和/或FcγRIIb。这些一般基于衍生自两个或多个人免疫球蛋白重链CH2结构域的嵌合结构域。以这种方式修饰的抗体尤其适合用于慢性抗体疗法来避免常规抗体疗法的炎症和其它不利反应。
在一些实施方案中，本发明的多肽为缀合物。例如，在一些实施方案中，多肽缀合于另一试剂例如化学治疗剂、放射性核素、免疫治疗剂、细胞因子、趋化因子、成像剂、毒素、生物学试剂、酶抑制剂或抗体。
在一些实施方案中，多肽例如抗体缀合至水溶性多聚体部分。多肽可以缀合至聚乙二醇(PEG)、单甲氧基-PEG、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇等。多肽可以在分子的随机位置或者在分子的预定位置进行修饰，并且可以包括一个、两个、三个或多个结合部分。多聚体可以是任一分子量，并且可以是分支或无分支的。在一些实施方案中，部分通过接头结合多肽。在一些实施方案中，结合的部分增加多肽在动物中的循环半衰期。将多聚体例如PEG结合至多肽包括抗体的方法为本领域熟知。在一些实施方案中，多肽为PEG化的多肽例如PEG化的抗体。
本发明包括亲和性成熟的实施方案。例如，可以通过本领域已知方法(Marks等人，1992，Bio/Technology，10：779-783；Barbas等人，1994，ProcNat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813；Schier等人，1995，Gene，169：147-155；Yelton等人，1995，J.Immunol.，155：1994-2004；Jackson等人，1995，J.Immunol.，154(7)：3310-9；Hawkins等人，1992，J.Mol.Biol.，226：889-896；以及WO2004/058184)产生亲和性成熟的抗体。可以使用本领域任一已知的方法筛选或选择改善和/或改变结合亲和性的候选亲和性成熟的抗体，其中所述方法包括用BIAcore表面胞质共振分析进行筛选和用本领域任一已知的方法包括噬菌体展示、酵母展示和核糖体展示进行选择。
单克隆抗体可以用杂交瘤方法制备，例如Kohler和Milstein，1975，Nature 256：495中所述。在杂交瘤方法中，一般用致免疫试剂免疫小鼠、仓鼠或其它适当宿主动物来导致产生这样的淋巴细胞，其中所述淋巴细胞产生或能够产生特异结合致免疫试剂的抗体。备选地，可以在体外免疫淋巴细胞。
本发明的单克隆抗体(以及其它多肽)也可以通过重组DNA法制备，其中所述方法例如美国专利号4,816,567中描述的方法。制备多肽和单克隆抗体的方法为本领域熟知。在一些实施方案中，对编码单克隆抗体的DNA用常规方法进行分离、测序、和/或扩增，其中所述方法例如通过使用能特异结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因或多核苷酸的寡核苷酸探针或引物。编码预期序列的多肽例如抗体的序列也可以联合使用本领域熟知的合成DNA法、PCR法和重组技术而轻易地制备。一旦分离出DNA，就将其置入表达载体，然后将所述表达载体转染入宿主细胞来在重组的宿主细胞中获得单克隆抗体的合成，其中所述宿主细胞例如不另外产生免疫球蛋白蛋白质的大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞。
在一些实施方案中，本发明的多肽(例如抗体)在任一生物或源自任一生物的细胞中表达，其包括但不限于细菌、酵母、植物、昆虫和哺乳动物。特定类型的细胞包括但不限于果蝇(Drosophila melanogaster)细胞、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和其它酵母、大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、SF9细胞、HEK-293细胞、Neurospora、BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、HeLa细胞、成纤维细胞、Schwannoma细胞系、永生的哺乳动物骨髓和淋巴细胞系、Jurkat细胞、肥大细胞和其它内分泌和外分泌细胞、以及神经元细胞。
多种用于生产多肽的蛋白质表达系统、载体和细胞培养基为本领域常规技术人员已知。见，例如国际专利公开号WO 03/054172、WO 04/009823和WO 03/064630、以及美国专利公开号US 2005/0170454、US2005/0084928和US 2006/0003405，其中所述每项专利在此处以其整体引入作为参考。在一些实施方案中，用谷氨酰胺合成酶(GS)表达系统来表达多肽(例如抗体)。
多肽可以在表达后根据本领域技术人员已知的方法进行纯化和分离。纯化方法的实例包括电泳技术、分子技术、免疫学技术和色谱技术，其包括离子交换、疏水亲和性和反相HPLC色谱、以及色谱聚焦。纯化的必要程度根据多肽的用途不同。在一些情况中，不需要纯化。
DNA可以例如通过将全部或部分编码非免疫球蛋白多肽的编码序列共价连接至免疫球蛋白编码序列来进行修饰。以这种方式，可以制备“嵌合”或“杂种”的、具有本文公开的单克隆抗体结合特异性的抗体。一般地，用此类非免疫球蛋白多肽替换本发明抗体的恒定区、或者用它们替换本方面抗体一个抗原结合位点的可变区来产生嵌合的二价抗体，其中所述嵌合的二价抗体包含的一个抗原结合位点具有对一个表面表位CD26的特异性、并且另一抗原结合位点具有对不同抗原或CD26表位的特异性。
本发明也包含人源化的抗体。治疗的抗体通常引起不利效应，这部分是由于触发了抗所施用抗体的免疫反应。这导致降低的药物效力、带有靶抗原的细胞衰竭和不希望的炎症反应。为了防止上述情况，可产生重组的抗CD26的人源化抗体。人源化抗体的一般原则涉及保持抗体的抗原结合部分的基本序列，而至少将抗体的非人残余部分替换为人抗体序列。人源化单克隆抗体的四个常规但非限制性的一般步骤包括：(1)确定起始抗体轻链和重链可变结构域的核苷酸和预测的氨基酸序列(2)设计人源化的抗体，即决定在人源化过程中使用的抗体构架区或残基和/或CDR残基(3)实际的人源化方法/技术和(4)转染和表达人源化的抗体。如果在临床试验和人治疗中使用抗体，那么也可以将恒定区设计为更加类似于人恒定区来避免免疫反应。见，例如美国专利号5,997,867和5,866,692。
在重组的人源化抗体中，可以修饰Fcγ部分来避免与Fcγ受试者和补体免疫系统的相互作用。在WO 99/58572中描述了制备此类抗体的技术。
描述了许多包含衍生自非人免疫球蛋白的抗原结合位点的“人源化”抗体分子，其包括具有与人恒定区融合的啮齿类V区及它们的相关互补决定区(CDR)的嵌合抗体。见，例如Winter等人Nature 349：293-299(1991)；Lobuglio等人Proc.Nat.Acad.ScL USA 86：4220-4224(1989)；Shaw等人J Immunol.138：4534-4538(1987)和Brown等人Cancer Res.47：3577-3583(1987)。其它参考文献描述了在与适当的人抗体恒定结构域融合之前植入人支持构架区(FR)的啮齿类CDR。见，例如Riechmann等人Nature332：323-327(1988)；Verhoeyen等人Science 239：1534-1536(1988)和Jones等人Nature 321：522-525(1986)。另一参考文献描述了通过重组表面重塑(veneered)的啮齿类构架区支持的啮齿类CDR。见，例如欧洲专利公开号519,596。将这些类型的“人源化”分子设计为最小化不希望的对啮齿类抗人抗体分子的免疫反应，其中所述的免疫反应限制了所述部分在人受试者中治疗应用的持续时间和效力。Daugherty等人，Nucl.Acids Res.，19：2471-2476(1991)和美国专利号6,180,377、6,054,297、5,997,867、5,866,692、6,210,671、6,350,861和PCT WO 01/27160中公开了其它也可以使用的人源化抗体的方法。
国际公开号WO 02/084277和美国公开号US 2004/0133357中描述了人源化抗体的其它示例性方法，其中所述的两篇参考文献都在此处以整体引入作为参考。
此外，在另一备选的实施方案中，完全的人抗体可以通过使用商业可获得的、设计来表达特定人免疫球蛋白的小鼠来获得。也可以用设计来产生更加理想(例如完全的人抗体)或更加有力的免疫反应的转基因动物来产生人源化抗体或人抗体。该技术的实例为Abgenix，Inc.(Fremont，CA)的XenomouseTM和Medarex，Inc.(Princeton，NJ)的HuMAb-Mouse和TCMouseTM。
在另一备选的实施方案中，抗体可以通过噬菌体展示技术重组地制备。见，例如美国专利号5,565,332、5,580,717、5,733,743和6,265,150以及Winter等人，Annu.Rev.Immunol.12：433-455(1994)。备选地，噬菌体展示技术(McCafferty等人，Nature 348：552-553(1990))可以用来在体外从未免疫供体免疫球蛋白可变(V)结构域基因组分库来生产人抗体和抗体片段。根据这项技术，将抗体V结构域的基因以编码框克隆入丝状噬菌体例如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒含有单链DNA拷贝的噬菌体基因组，所以基于抗体功能性质的选择也产生对编码呈现这些性质的抗体的基因的选择。因此，噬菌体模拟B细胞的一些性质。噬菌体展示可以以多种形式进行，综述见例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion inStructural Biology 3，564-571(1993)。一些来源的V基因片段可以用作噬菌体展示。Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)从得自免疫小鼠脾的V基因小型随机组合基因库中分离了抗噁唑酮抗体的多样化阵列。可以构建未免疫的人供体V基因的所有组分库，并且可以基本根据Mark等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith等人，EMBO J.12：725-734(1993)所述的技术分离对不同抗原(包括自身抗原)阵列的抗体。在天然的免疫反应中，抗体基因高频率地积累突变(体细胞高变)。一些引入的变化将赋予更高亲和性，并且在随后的抗原攻击期间展示高亲和性表面免疫球蛋白的B细胞优先得到复制和分化。这个自然过程可以通过采用已知为“链改组”的技术(Marks等人，Bio/Technol.10：779-783(1992))模拟。在这个方法中，通过噬菌体展示获得的“原始”人抗体的亲和性可以通过随后的替换来改善，其中所述替换为将重链和轻链V区基因替换为从未免疫供体获得的天然存在的变体(所有组分库)的所有组分库。这项技术使得能产生具pM-nM范围亲和性的抗体和抗体片段。在Waterhouse等人，Nucl.Acids Res.21：2265-2266(1993)中描述了制备极大噬菌体抗体库(也已知为“所有文库的亲本”(″the mother-of-all libraries″))的策略。也可以用基因改组来从啮齿动物抗体衍生人抗体，其中所述的人抗体具有与起始的啮齿动物抗体相似的亲和性和特异性。根据这种也称为“表位印记”的方法，将通过噬菌体展示技术获得的啮齿动物抗体的重链或轻链V结构域基因替换为人V结构域基因的所有组分库，从而产生啮齿类-人嵌合体。对抗原的选择导致分离出能保持功能性抗原结合位点的人可变区，即表位控制(印记)配偶体的选择。当为了替换剩余的啮齿动物V结构域而重复这个过程时，将获得人抗体(见1993年4月1日公开的PCT专利申请PCT WO9306213)。不像常规的通过CDR移植来人源化啮齿动物抗体，这项技术提供了完全的人抗体，其中所述人抗体不具有啮齿类来源的构架或CDR残基。显然，虽然上述讨论涉及人源化的抗体，但讨论的一般原则可以应用于在例如狗、猫、灵长类、马和牛中定制抗体。
嵌合或杂种抗体也可以在体外用已知的合成蛋白质化学方法来制备，其中所述方法包括涉及交联剂的方法。例如，免疫毒素可以用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建。用于该目的的适当试剂的实例包括硫代亚氨酯(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁亚酰胺(butyrimidate)。
单链Fv片段也可以如Iliades等人，1997，FEBS Letters，409：437-441中所述地产生。Kortt等人，1997，Protein Engineering，10：423-433中描述了用多种交联剂偶联此类单链片段。本领域熟知多种重组产生和处理抗体的技术。
在一方面，本发明提供了产生本文所述多肽的方法。在一些实施方案中，方法包括在宿主细胞中表达多核苷酸。其中所述的多核苷酸编码多肽。在一些实施方案中，方法为引入产生抗体的方法，并且包括在宿主细胞中(例如在细胞培养物中)表达一条或多条多核苷酸，其中所述抗体的每条链都由至少一条多核苷酸编码。在一些实施方案中，一条或多条多核苷酸在相同的载体上。在其它的实施方案中，一条或多条多核苷酸定位在分开的载体上。在一些实施方案中，产生本文所述多肽的方法进一步包括从其表达的宿主细胞中分离(例如从宿主细胞生长的细胞培养物中分离)多肽的步骤。
多核苷酸、变体序列、载体和宿主细胞
本发明进一步提供了编码本文所述多肽例如抗体的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸编码包含本文所述重链可变区或轻链可变区的多肽。也提供了包含多核苷酸的载体例如表达载体。进一步提供了包含本发明载体和/或多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，多核苷酸是分离的。
在一方面，本发明提供了包含核酸序列的多核苷酸，其中所述核酸序列选自图2和图4(SEQ ID NO：1-14)所示的任一序列或其片段。本发明进一步提供了多核苷酸，其中所述的多核苷酸在中等严格条件下与选自图2和图4(SEQ ID NO：1-14)所示多核苷酸的杂交。在一些实施方案中，多核苷酸在高度严格条件下与图2和图4(SEQ ID NO：1-14)所示的多核苷酸杂交。
在另一方面，本发明提供了这样的多核苷酸，其包含编码氨基酸序列的多核苷酸，其中所述的氨基酸序列选自图3或图5所示的下列任一序列：X376、X377、X378、X379、X380、X381、X394、X384、X385、X386、X387、X388、X399和X420(SEQ ID NO：15-28)。
本发明进一步提供了这样的多核苷酸，其包含序列SEQ ID NO：215和/或SEQ ID NO：216(见下文实施例4)或其片段的多核苷酸。在一些实施方案中，片段包含至少12、至少20、至少50、至少75或至少100个核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包含的多核苷酸包含编码重链的SEQ IDNO：215序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含的多核苷酸包含编码轻链的SEQ ID NO：216序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含的多核苷酸包含编码重链的SEQ ID NO：215序列的片段。在一些实施方案中，多核苷酸包含的多核苷酸包含编码轻链的SEQ ID NO：216的片段。在一些实施方案中，多核苷酸包含编码重链可变区的SEQ ID NO：215序列的片段。在一些实施方案中，多核苷酸包含的多核苷酸包含编码轻链可变区的SEQ IDNO：216的片段。
本发明也提供了编码包含抗体重链和/或轻链的多肽(例如抗体)的多核苷酸，其中所述的抗体由根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约、于2006年6月30日以“具有质粒的DH5α大肠杆菌，所述质粒具有抗人CD26 cDNA的人源化单克隆抗体的重链和轻链插入片段”的名称、菌株名称为“S604069.YST-pABMC148(x411)”保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)、并且保藏号为PTA-7695的大肠杆菌样本中的质粒编码。本发明进一步提供了编码包含抗体重链可变区和/或轻链可变区的多肽的多核苷酸，其中所述的抗体由根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约、于2006年6月30日以“具有质粒的DH5α大肠杆菌，所述质粒具有抗人CD26 cDNA的人源化单克隆抗体的重链和轻链插入片段”的名称、菌株名称为“S604069.YST-pABMC148(x411)”保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)、并且保藏号为PTA-7695的大肠杆菌样本中的质粒编码。在一些实施方案中，多核苷酸包含所保藏序列的重链和/或轻链编码序列。
包含表达载体的表达系统和宿主细胞可以用于产生本发明多肽例如抗体的方法中，其中培养宿主细胞、并回收所培养宿主细胞产生的多肽。也可以将编码本发明抗体的多核苷酸递送至宿主受试者来通过宿主受试者的细胞表达抗体。
本发明也包含与任一此类序列互补的多核苷酸。多核苷酸可以是单链(编码链或反义链)或双链的，并且可以是DNA(基因组的、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子和不含有内含子的mRNA分子，所述HnRNA分子含有内含子并且以一对一的方式对应DNA分子。额外的编码序列或非编码序列可以但不需要存在于本发明多核苷酸中，并且多核苷酸可以但不需要连接至其它分子和/或支持物。
也提供了本文所述多核苷酸和多肽的变体。多核苷酸和多肽变体可以含有一个或多个替换、添加、删除和/或插入。在一些实施方案中，与由原始多核苷酸编码的多肽或多肽与人CD26的结合相比，变体为所编码多肽与人CD26的结合基本不降低的变体。所编码多肽的免疫反应性效果通常如本文所述进行评估。变体优选呈现与原始序列或其部分至少大约70％同一性、更加优选至少大约80％同一性、并且最优选至少大约90％同一性。在一些实施方案中，当序列与CDR或小片段进行比较时，比较窗口可以较小，例如至少7个氨基酸或至少10个氨基酸。
如果当如下文所述进行最大对应比对时，两个序列中的核苷酸或氨基酸序列一样，那么两个多核苷酸或多肽序列就称为“同一的”或具有“同一性”。两序列的比对一般通过比较窗口比较序列同一性、并比较序列局部区域相似性来进行。本文所用“比较窗口”指的是至少大约20个、通常30至大约75个、40至大约50个连续位置的片段，其中在两序列进行最佳对齐后，序列与相同数量连续位置的参考序列进行比较。
进行序列比对的最佳排列可以用生物信息学软件Lasergene成套软件包(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)的Megalign程序用默认参数进行。该程序收录了下列参考文献所述的一些比对方案：Dayhoff，M.O.(1978)，蛋白质中进化改变的模型-用于检测距离关系的矩阵(A model ofevolutionary change in proteins-Matrices for detecting distantrelationships)，在Dayhoff，M.O.(编辑的)蛋白质序列和结构图解(Atlas ofProtein Sequence and Structure)，National Biomedical ResearchFoundation，Washington DC的第5卷，增刊3，345-358页；Hein J.，1990，比对和系统发生的联合方法(Unified Approach to Alignment andPhylogenes)626-645页，Methods in Enzymology第183卷，AcademicPress，Inc.，San Diego，CA；Higgins，D.G.和Sharp，P.M.，1989，CABIOS5：151-153；Myers，KW.和Muller W.，1988，CABIOS 4：11-17；Robinson，E.D.，1971，Comb.Theor.11：105；Santou，N.，Nes，M.，1987，MoL Biol.Evol.4：406-425；Sneath，P.H.A.和Sokal，R.R.，1973，数值分类法的原理和数值分类法的实践(Numerical Taxonomy the Principles and Practice ofNumerical Taxonomy)，Freeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，WJ.和Lipman，DJ.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：726-730。
备选地，％(氨基酸)同一性可以通过用一种可公开获得的BLAST或BLAST-2程序获得。WU-BLAST-2计算程序(Altschul等人，Methods inEnzymology 266：460-480(1996))。百分(氨基酸)序列同一性也可以用序列比对程序NCBI-BLAST2(Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))确定。BLAST程序基于Karlin和Altschul.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268(1990)的比对方法，并如Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877(1993)以及Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997)的讨论。
在一些实施方案中，“同一性百分数”通过在至少20个位置的比对窗口比较两个最佳排列的序列来确定，其中比对窗口中的多核苷酸或多肽序列部分与进行两序列最佳排列的参考序列(不包含添加或删除)相比，可以包含20％或更少、通常5-15％或10-12％的添加或删除(即缺口)。百分数如下计算，先通过确定两个序列中出现同一核酸碱基或氨基酸残基的位置数目来产生匹配位置数，然后用匹配位置数除参考序列位置数(即窗口大小)，并用100乘以所得结果来产生序列同一性百分数。在一些实施方案中，比对窗口可以更小(例如7或10个氨基酸)。
变体也可以或备选地与本文所述多核苷酸或其部分或其互补序列是基本同源的。此类多核苷酸变体能够在中等严格条件下与天然存在的、编码天然抗体的DNA序列(或互补序列)杂交。在一些实施方案中，变体能够在高度严格条件下与原始序列杂交。
适当的“中等严格条件”包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中预洗涤、在50℃-65℃、5×SSC杂交过夜、然后在65℃用每种包含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC洗涤两次。
如本文所用，“高度严格的条件”或“高严格条件”为：(1)采用低离子强度和高温度例如在0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠、50℃进行洗涤；(2)杂交时采用变性剂，例如甲酰胺，例如42℃、含0.1％牛血清白蛋白/0.1％菲可/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/含750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠、pH 6.5的50mM磷酸钠缓冲液的50％(v/v)甲酰胺；或(3)采用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt溶液、超声处理的鲑精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖、42℃，在42℃、0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺在55℃洗涤，随后用由含有EDTA的0.1×SSC、55℃组成的高严格性洗涤。熟练技术人员懂得如何调节温度、离子强度等，这是适应诸如探针长度等因素所必需的。
本领域常规技术人员可以理解，由于遗传密码子简并性的结果，存在许多编码本文所述多肽的核苷酸序列。但是，本发明特别考虑了由于密码子使用的差异而不同的多核苷酸。
多核苷酸可以用任意一种本领域已知的多种技术来制备。编码抗体的DNA可以自表达抗体mRNA的组织制备的cDNA文库获得。编码抗体的基因也可以从基因组文库或通过寡核苷酸合成获得。文库可以用设计用来鉴定目的基因或其编码的蛋白质的探针(例如结合至少大约20-80个碱基的配偶体或寡核苷酸)来筛选。示例性文库包括人肝脏cDNA文库(人肝脏5’延伸加cDNA，Clontech Laboratories，Inc.)和小鼠肾cDNA文库(小鼠肾5’延伸cDNA，Clontech Laboratories，Inc.)。用所选探针筛选cDNA或基因组文库可以用标准方法进行，所述标准方法例如Sambrook等人，分子克隆：实验手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，纽约：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989中所述。备选地，可以用PCR法分离编码抗体的基因(Sambrook等人，见上文；Dieffenbach等人，PCR引物：实验手册(PCR Primer：A Laboratory Manual)，Cold Spring HarborLaboratory Press，1995)。
多核苷酸通常可以通过本领域任一已知的方法制备，其包括化学合成，例如固相亚磷酰胺化学合成。多核苷酸序列中的改变也可以用标准诱变技术引入，其中所述标准突变技术例如寡核苷酸定向的位点特异诱变(见Adelman等人，DNA 2：183，1983)。备选地，如果DNA掺入具适当RNA聚合酶启动子(例如T7或SP6)的载体，那么RNA分子可以通过体外或体内转录编码抗体或其部分的DNA序列来产生。某些部分也可以如本文所述地用来制备编码的多肽。此外或备选地，可以将部分施用于患者，以便在体内产生编码的多肽(例如通过用编码多肽的cDNA构建体转染抗原呈递细胞例如树突细胞，并将转染的细胞施用至患者)。
任一多核苷酸都可以进一步修饰来增加在体内的稳定性。可能的修饰包括但不限于在5’和/或3’添加侧翼序列、在主链中使用硫代磷酸酯或2’O-甲基而非磷酸二酯键、和/或包含非常规碱基，例如肌苷、queosine和怀丁苷(wybutosine)以及乙酰基-、甲基-、硫代-和其它修饰形式的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。
核苷酸序列可以用已建立的重组DNA技术连接至多种其它核苷酸序列。例如，多核苷酸可以克隆入任一多种克隆载体中，其包括质粒、噬菌粒、λ噬菌体衍生物和粘粒。特定有兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。一般而言，载体含有在至少一种生物中的复制功能起始点、方便的限制性内切酶位点、以及一个或多个选择性标记。其它元件取决于预期用途，并且对本领域常规技术人员是显而易见的。
在一些实施方案中，多核苷酸也可以制剂，以便能进入哺乳动物细胞、并且能在其中表达。此类制剂对下文所述的治疗目的尤其有用。本领域常规技术人员理解，存在许多方式来实现多核苷酸在靶细胞中的表达，并且可以采用任一适当的方法。例如，多核苷酸可以掺入病毒载体，所述病毒载体例如但不限于腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒或牛痘或其它痘病毒(例如禽痘病毒)。将DNA掺入此类载体的技术为本领域常规技术人员熟知。逆转录病毒载体可以额外地转移或掺合选择标记的基因(帮助鉴定或选择转导的细胞)和/或靶向部分来赋予载体靶向特异性，所述靶向部分例如编码特定靶细胞上受试者的配体的基因。靶向也可以用抗体通过本领域常规技术人员已知的方法实现。
药物组合物和试剂盒
本发明进一步提供了包含本文所述多肽(例如抗体)和/或多核苷酸的组合物。例如，本发明提供了包含本文所述多肽的药物组合物。也提供了包含多肽的试剂盒。
本发明的组合物包括大量用于制备非药物组合物(例如不纯或非无菌的组合物)和药物组合物(即适合施用于受试者或患者的组合物)的药物组合物，所述药物组合物可以用在单位剂型的制剂中。
在一些实施方案中，药物组合物包含本文所述多肽和可药用赋形剂(本文也称为“可药用载体”)。在一些实施方案中，药物组合物中的多肽为抗体。在一些实施方案中，药物组合物中的多肽为人源化的抗体。
本发明范围内的药物组合物也可含有其它化合物，所述化合物可以为生物学活性或无活性的。
药物组合物可以含有编码一种或多种上文所述多肽的DNA，如此以便在原位产生多肽。如上文所述，DNA可以存在于任一本领域技术人员已知的多种递送系统中，所述递送系统包括核酸表达系统、细菌和病毒表达系统。多种基因递送技术为本领域熟知，例如Rolland，1998，Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems 15：143-198和其中引用的参考文献中所述的技术。适当的核酸表达系统含有在患者中表达必需的DNA序列(例如适当的启动子和终止信号)。
在优选的实施方案中，DNA可以用病毒表达系统(例如牛痘或其痘病毒、逆转录病毒或腺病毒)引入，所述病毒表达系统可涉及使用非病原的(缺陷的)、有复制能力的病毒。例如在Fisher-Hoch等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：317-321；Flexner等人，1989，Ann.N.Y.Acad Sci.569：86-103；Flexner等人，1990，Vaccine 8：17-21；美国专利号4,603,112，4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；美国专利号4,777,127；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805；Berkner-Biotechniques 6：616-627，1988；Rosenfeld等人，1991，Science 252：431-434；Kolls等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：215-219；Kass-Eisler等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11498-11502；Guzman等人，1993，Circulation 88：2838-2848和Guzman等人，1993，Cir.Res.73：1202-1207公开了适当系统。将DNA掺入此类表达系统的技术为本领域常规技术人员所熟知。DNA也可以是“裸的”，例如在Ulmer等人，1993，Science 259：1745-1749和Cohen，1993，Science 259：1691-1692的综述中所述。可以通过将DNA包被在有效转运入细胞的可生物降解的珠子上来增加裸DNA的摄入。
在本发明药物组合物中可以采用本领域常规技术人员已知的任何适当载体，而载体类型依赖于施用模式不同。本发明的组合物可以制剂来进行任何适当方式的施用，其包括例如局部的、经口的、经鼻的、静脉内的、颅外的、腹膜内的、皮下的或肌内的施用。对于肠胃外的施用例如皮下注射，载体优选包含水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲剂。对于经口的施用，可以采用上述任一载体或固体载体，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。生物可降解的微球体(例如聚乳酸聚甘醇酸)也可以用作本发明药物组合物的载体。例如在美国专利号4,897,268和5,075,109中公开了适当的生物可降解微球体。
此类组合物也可包含缓冲液(例如中性的缓冲盐或磷酸缓冲盐)、糖(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸例如甘氨酸、抗氧化剂、螯合剂例如EDTA或谷胱甘肽、佐剂(例如氢氧化铝)和/或防腐剂。备选地，本发明的组合物可以制剂成冷冻干燥剂。化合物也可以用熟知技术包囊在脂质体中。
本文所述组合物可以作为持续释放制剂(即例如施用后起缓慢释放化合物效果的胶囊或海绵的制剂)的部分施用。此类制剂通常用熟知技术制备，并通过例如经口的、直肠的或皮下的植入、或通过植入目的靶位点来施用。持续释放的制剂可以含有分散在载体基质中的多肽、多核苷酸或抗体，和/或包含在速率控制膜包裹的储库中。在此类制剂中使用的载体为生物相容的，并且也可以是生物可降解的；优选地，制剂提供了相对恒定水平的活性组分释放。包含在持续释放制剂中的活性化合物量取决于植入位点、速率和期望的释放持续时间和所治疗病症的性质。
在一些实施方案中，多肽也可以包封在微胶囊、胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳颗粒和纳胶囊)或大乳剂中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合作用(例如分别为羟基甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲脂)微胶囊)制备。此类技术公开在Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro编辑，MackPublishing Co.，Easton，PA，1990和Remington，The Science and Practiceof Pharmacy第20版，Mack Publishing，200中。为了增加抗体的血清半衰期，可以在抗体(尤其是抗体片段)中掺入补救受试者结合表位，例如如美国专利5,739,277中所述。如本文所用，术语“补救受试者结合表位”指的是IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc区域的表位，其负责增加IgG分子在体内的血清半衰期。
本文公开的抗体也可以制剂成免疫脂质体。含有抗体的脂质体通过本领域已知的方法制备，例如Epstein等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：3688；Hwang等人，1980，Proc.Natl Acad.Sci.USA 77：4030以及美国专利号4,485,045和4,544,545中所述。美国专利号5,013,556中公开了具增强循环时间的脂质体。尤其有用的脂质体可以用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法产生。将脂质体挤过确定孔径的过滤器来产生具预期直径的脂质体。此外，可以通过二硫化物互换反应将本发明抗体的Fab’片段连接至脂质体，如Martin等人，1982，J.Biol.Chem.257：286-288中所述。
也提供了包含本文所述多肽、多核苷酸、载体或宿主细胞的试剂盒和产品(article of manufacture)。
在一些实施方案中，产品包含具标签的容器。适当的容器包括例如瓶子、管形瓶和试管。容器可以用多种物质例如玻璃或塑料制备。在一些实施方案中，容器装有组合物，所述组合物用于鉴定或定量表达CD26的细胞、抑制表达CD26的细胞的增殖、或治疗与CD26表达相关的疾病。在一些实施方案中，容器上的标签表明组合物能够用来鉴定或定量表达CD26的细胞、抑制表达CD26的细胞的增殖、或治疗与CD26表达相关的疾病。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含上述容器。在其它实施方案中，本发明的试剂盒包含上述容器和第二个包含缓冲剂的容器。在一些实施方案中，试剂盒包含这样的包装，其中插入了使用其中含有的多肽、多核苷酸、载体或宿主细胞的使用说明书。
使用多肽的方法
本发明的多肽(例如抗体)在多种应用中有用，所述应用包括但不限于诊断方法和治疗方法。也提供了抑制表达CD26的细胞增殖的方法。
本发明的抗体和多肽可以用于检测、诊断和/或监测与CD26表达相关的病症(例如疾病或病症)。在一些实施方案中，与CD26表达相关的病症为与CD26表达异常相关的病症。例如，在一些实施方案中，与CD26表达相关的病症为与改变或异常的CD26表达(在一些实施方案中，增加或降低的CD26表达(相对正常样本)，和/或不适当的表达，例如在正常缺乏CD26表达的组织和/或细胞中出现表达，或者在正常具有CD26表达的组织或细胞中缺失CD26表达)相关的病症。在一些实施方案中，与CD26表达相关的病症为与CD26过量表达相关的病症。CD26的过量表达理解为包括下列两种情况，即在正常表达CD26的细胞或组织中CD26的表达相比CD26在这些细胞或组织中的正常表达水平增加，以及在正常缺乏CD26表达的组织或细胞中存在CD26的表达。在一些实施方案中，与CD26表达相关的病症至少部分由CD26介导。在一些实施方案中，与CD26表达相关的病症为与表达CD26的细胞相关的病症。在一些实施方案中，与CD26表达相关的病症为与表达CD26的细胞增殖相关的病症。在一些实施方案中，表达CD26的细胞的增殖为异常的增殖。诊断方法可以是体外或体内的。
在本文讨论中对抗体进行了示例性谈及，应理解的是，本讨论也适用于本发明的多肽。
对于诊断性应用，抗体一般用可检测部分标记，所述可检测部分包括但不限于放射性同位素、荧光标签和多种酶-底物标签。将标签结合于抗体的方法为本领域已知。在本发明的其它实施方案中，本发明的抗体不需要被标记，并且本发明抗体的存在可以用结合本发明抗体的标记抗体来检测。
本发明的抗体可以用在任一已知的测试方法中，例如竞争性结合测试、直接和间接的夹心测试和免疫沉淀测试。Zola，单克隆抗体：技术手册(Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques)，第147-158页(CRCPress，Inc.1987)。
抗体也可以用于体内的诊断测试，例如体内成像。一般地，抗体用放射性核素(例如111In、99Tc、14C，131I、125I或3H)标记，以便目的细胞或组织可以用免疫闪烁照相术(immunoscintiography)进行定位。
抗体也可以在病理学中根据本领域熟知的技术用作染色剂。
在另一方面，本发明提供了抑制表达CD26的细胞增殖的方法。对表达CD26的细胞增殖的抑制包括任一可观察水平的抑制，其包括部分至完全抑制增殖。在一些实施方案中，细胞的增殖至少抑制了大约10％、至少大约25％、至少大约50％、至少大约75％、至少大约90％或者至少大约95％、或者至少大约98％、或大约100％。方法可以是体外或体内的。在一些实施方案中，方法包括将细胞接触本文所述多肽(例如抗体)。一般地，将细胞与足够抑制细胞增殖量的多肽接触。
已鉴定出许多癌细胞表达CD26。例如，已经鉴定出，CD26在下列每种癌细胞中都为过量表达的：T细胞淋巴瘤(Ruiz等人(1998)Cytometry，34：30-5)；B慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)(Bauvois等人(1999)Br.J.Cancer，79：1042-8)；甲状腺癌(Aratake等人(1991)Am.J.Clin.Pathol.，47：43-7)；基底细胞癌(Moehrle等人(1995)J.Cutan.Pathol.22：241-7)；乳腺癌(Dixon等人(1994)Clin.Pathol.，47：43-7)；肝细胞癌(Stecca等人(1997)27：337-45)和肺癌(Sedo等人(1991)40：359-62)。实验结果表明，CD26在多种癌细胞系中表达，下文特定实例实施例12也提供了所述结果。
在本文所述方面的一些实施方案中，表达CD26的细胞为人细胞。在一些实施方案中，表达CD26的细胞为癌细胞。在一些实施方案中，表达CD26的细胞为血液癌细胞、T细胞癌细胞、胰癌细胞、肾癌细胞、淋巴瘤细胞、B细胞癌细胞、甲状腺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、睾丸癌细胞、子宫癌细胞、脑癌细胞、淋巴癌细胞、皮肤癌细胞、骨癌细胞、直肠癌细胞、肉瘤细胞、T细胞淋巴瘤细胞、肺腺癌细胞、甲状腺癌细胞、B细胞慢性淋巴细胞白血病细胞或B细胞淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，癌细胞为淋巴瘤细胞、肾癌细胞、前列腺癌细胞或肺癌细胞。在一些实施方案中，表达CD26的细胞为肿瘤细胞，例如实体瘤中的细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞为恶性或良性的。在一些实施方案中，表达CD26的细胞为T细胞。在一些实施方案中，细胞为人T细胞。在一些实施方案中，细胞为恶性T细胞。在一些实施方案中，表达CD26的细胞为高活性的免疫细胞。在一些实施方案中，表达CD26的细胞为活化的T细胞。在一些实施方案中，细胞为人。在一些实施方案中，表达CD26的癌细胞相比相同类型的非癌细胞，过量表达CD26。在一些实施方案中，过量表达CD26的癌细胞为乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、结肠直肠癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞、T细胞淋巴瘤、B慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、基底细胞癌、肝细胞癌或肺癌细胞。
评估抑制细胞增殖的方法为本领域已知，并且包括MTT测试。(见，例如Aytac等人(2003)British Journal of Cancer 88：455-462，Ho等人(2001)Clinical Cancer Research 7：2031-2040，Hansen等人(1989)J.Immunol.Methods，119：203-210和Aytac等人(2001)Cancer Res.61：7204-7210)。下文特定实例实施例2(G)、3(D)和5中也提供了MTT测试的实例。
本发明进一步提供了在受试者中治疗与CD26表达相关病症的方法。在一些实施方案中，在受试者中治疗与CD26表达相关病症的方法包括向受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含本文所述多肽例如抗体。在一些实施方案中，与CD26表达相关的病症与CD26表达异常相关。在一些实施方案中，与CD26表达相关的病症为与改变或异常的CD26表达(在一些实施方案中，增加或降低的CD26表达(相对正常样本)，和/或不适当的表达，例如在正常缺乏CD26表达的组织和/或细胞中出现表达，或者在正常具有CD26表达的组织或细胞中缺失CD26表达)相关的病症。在一些实施方案中，与CD26表达相关的病症为与CD26过量表达相关的病症。在一些实施方案中，与CD26表达相关的病症至少部分由CD26介导。在一些实施方案中，与CD26表达相关的病症为与表达CD26的细胞相关的病症。在一些实施方案中，与CD26表达相关的病症为与表达CD26的细胞增殖相关的病症。在一些实施方案中，表达CD26的细胞的增殖为异常的。在一些实施方案中，表达CD26的细胞为T细胞。在一些实施方案中，表达CD26的细胞为肿瘤细胞，所述肿瘤细胞可以为恶性或良性的。在一些实施方案中，与CD26表达相关的病症为癌症，其中癌细胞为CD26+癌细胞或者表达CD26(即表达CD26的癌)。(其它表达CD26的细胞如上文所述。)
在一些实施方案中，在受试者中与CD26表达相关的病症为增殖性病症。在一些实施方案中，受试者与CD26表达相关的病症为癌症。在一些实施方案中，癌症为CD26+血液肿瘤。在一些实施方案中，癌症为T细胞癌，例如T细胞淋巴瘤。例如，在一些实施方案中，癌症为T细胞淋巴母细胞淋巴瘤或急性淋巴母细胞白血病。在其它实施方案中，癌症为T细胞CD30+间变性大细胞淋巴瘤。在其它实施方案中，癌症为外周T细胞淋巴瘤、T细胞慢性淋巴细胞白血病、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、血管中心T细胞淋巴瘤、HTLV相关的T细胞白血病或成人T细胞白血病。在一些实施方案中，癌症为实体瘤。在一些实施方案中，癌症为胰癌、肾癌或淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症为B细胞癌、甲状腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、肺癌、肝癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、脑癌、淋巴癌、皮肤癌、骨癌、直肠癌、肉瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病或B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症与CD26的过量表达相关。在一些实施方案中，癌症不为间皮瘤。在一些实施方案中，癌症不为黑素瘤。在一些实施方案中，癌症为淋巴瘤、肾癌、前列腺癌或肺癌。在一些实施方案中，癌症为淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症为肾癌。在一些实施方案中，癌症为前列腺癌。在一些实施方案中，癌症为肺癌。
在一些实施方案中，与CD26表达相关的病症为炎性疾病或病症。在一些实施方案中，炎性疾病与CD26的过量表达相关。
在其它实施方案中，与CD26表达相关的病症为血管发生。
在进一步的实施方案中，与CD26表达相关的病症为涉及活化的免疫状态的病症，所述病症例如但不限于移植物抗宿主病和自身免疫疾病或病症。在一些实施方案中，病症为Addison病、驼毛症、关节强硬性脊椎炎、抗磷脂综合征、Behcet病、慢性疲劳综合征、Crohn病、溃疡性结肠炎、糖尿病、纤维肌痛、肺出血肾炎综合征、葛雷夫斯病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、狼疮、Meniere多重硬化症、重症肌无力、寻常性天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、类风湿性关节炎、风湿热、肉样瘤病、硬皮病、脉管炎、白癜风、或Wegener肉芽肿病。在一些实施方案中，涉及活化的免疫状态的病症与CD26的过量表达相关。
在一方面，本发明提供了治疗癌症的方法。在一些实施方案中，本发明提供了在患有癌症的受试者中抑制癌症恶化的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述组合物。本发明进一步提供了在受试者中抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包含多肽的组合物。在一些实施方案中，受试者患有表达CD26的肿瘤，或者已经移去了表达CD26的肿瘤。在一些实施方案中，诱导肿瘤退化。本发明进一步提供了在受试者中抑制癌细胞(例如表达CD26的癌细胞)转移的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所述组合物。
在一些实施方案中，本文所述方法进一步包括用额外形式的疗法治疗受试者的步骤。在一些实施方案中，额外形式的疗法为额外的抗癌症疗法。在一些实施方案中，本文所述方法进一步包括用化学疗法、放射、手术、激素疗法和/或额外的免疫疗法治疗受试者的步骤。在一些实施方案中，放射为外源光放射或远距放射疗法。在一些备选实施方案中，放射作为体内疗法或近距放射疗法施用。在一些实施方案中，额外形式的疗法包括施用一种或多种治疗剂例如激酶抑制剂。在一些实施方案中，治疗剂为治疗性抗体例如抗VEGF的抗体Avastin抗HER2的抗体Herceptin
Figure A20068003493700872
(曲妥珠单抗(Trastuzumab))(Genentech，California)、抗CD25的抗体Zenapax
Figure A20068003493700873
(达利珠单抗(daclizumab))(Roche Pharmaceuticals，Switzerland)和抗CD20的抗体RituxanTM(IDEC Pharm/Genentech，Roche/Zettyaku)。在一些实施方案中，额外的治疗剂为血管发生抑制剂。在一些实施方案中，额外的治疗剂为细胞毒性剂。在一些实施方案中，额外的治疗剂为抗癌剂。在一些实施方案中，额外的治疗剂为抗炎药。在一些实施方案中，额外的试剂包含选自紫杉醇(Taxol
Figure A20068003493700874
)、多西紫杉(Taxotere
Figure A20068003493700875
)、强的松、顺铂、丝裂霉素、孕酮、枸橼酸他莫昔芬、氟尿嘧啶和盐酸阿霉素的试剂。
本文所述方法(包括治疗方法)可以通过在单个时间点或多个时间点向单个或多个位点单次直接注射来完成。也可以是几乎同时向多个位点施用。施用频率可以在疗程期间进行确定和调整，并且是基于完成预期结果的。在一些情况中，本发明多肽(包括抗体)、多核苷酸和药物组合物持久连续释放的制剂是合适的。本领域已知多种完成持续释放的制剂和装置。
患者、受试者或个体包括哺乳动物，例如人、牛、马科、犬科、猫科、猪和羊动物。受试者优选为人，并且可以患有或可以不患有疾病或当前未显示症状。在一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，受试者患有肿瘤或者已经移去了肿瘤。应理解的是，即使已经从受试者移去了肿瘤，但在一些情况中肿瘤细胞残留在受试者中。例如，虽然已经从一位置移去了肿瘤，但肿瘤可能已转移和扩散到身体其它位置。同样，虽然已经从受试者移去了肿瘤，但由于外科手术等的局限性，部分肿瘤或一些肿瘤细胞不经意地或不可避免地残留在受试者中。在一些实施方案中，受试者存在产生肿瘤(或癌症)的风险。在一些实施方案中，受试者正在接受或已经接受其它的治疗(例如，化学疗法、外科手术、激素疗法、放射或其它的免疫疗法)。
抗体优选在载体中施用于哺乳动物，所述载体优选可药用载体。适当载体及其制剂如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro编辑.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990；和Remington，TheScience and Practice of Pharmacy第20版Ed.Mack Publishing，2000中所述。一般而言，在制剂中使用适当量的可药用盐来赋予制剂等渗性。载体的实例包括盐水、林格液和葡萄糖溶液。溶液的pH优选从大约5至大约8，并且更加优选从大约7至大约7.5。进一步的载体包括持续释放的制品，例如包含抗体的固相疏水性多聚体的半透性基质，所述基质为有形物品形状形式，例如薄膜、脂质体或微粒。对本领域技术人员显而易见的是，一些载体更加优选地取决于例如给药途径和所施用抗体的浓度。
抗体可以通过注射(例如全身的、静脉内的、腹膜内的、皮下的、肌内的、门内的(intraportal))或通过其它方法例如输注施用，所述方法确保其以有效形式递送至血流。抗体也可以通过单独的灌注技术施用来发挥局部治疗效应，所述单独的灌注技术例如单独的组织灌注。优选静脉注射。
多肽(例如抗体)的有效剂量和施用方案可以凭经验确定，并且进行此类测定在本领域技术之内。本领域技术人员理解，必须施用的抗体剂量取决于例如接受抗体的哺乳动物、施用途径、所用抗体的特定类型和其它施用于哺乳动物的药物，从而是不同的。在关于抗体治疗用途的文献中找到选择抗体适当剂量的指导，所述文献例如单克隆抗体手册(Handbook ofMonoclonal Antibody)，Ferrone等人编辑，Noges Publications，Park Ridge，N.J.，1985，第22章，303-357页；Smith等人，人诊断和治疗中的抗体(Antibody in Human Diagnosis and Therapy)，Haber等人编辑，RavenPress，New York，1977，365-389页。单独使用抗体的一般每日剂量在每天大约1μg/kg体重至高达100mg/kg或更多，这取决于上述因素。一般地，可以使用任一下列剂量：施用至少大约50mg/kg体重、至少大约10mg/kg体重、至少大约3mg/kg体重、至少大约1mg/kg体重、至少大约750μg/kg体重、至少大约500μg/kg体重、至少大约250μg/kg体重、至少大约100μg/kg体重、至少大约50μg/kg体重、至少大约10μg/kg体重、至少大约1μg/kg体重或更多的剂量。在一些实施方案中，本文提供的多肽(例如抗体)剂量在大约0.01mg/kg至大约50mg/kg之间、在大约0.05mg/kg至大约40mg/kg之间、在大约0.1mg至大约30mg/kg之间、在大约0.1mg至大约20mg/kg之间、在大约0.5mg至大约15mg之间或在大约1mg至10mg之间。在一些实施方案中，剂量在大约1mg至5mg之间。在一些备选实施方案中，剂量在大约5mg至10mg之间。
在一些实施方案中，可以存在不止一种抗体。此类组合物可以包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种本发明的不同抗体(包括多肽)。
多肽也可以与有效量的一种或多种其它治疗剂组合施用于哺乳动物。多肽可以顺序地或同时地与一种或多种其它治疗剂施用。多肽和治疗剂的量取决于例如所用药物的类型、治疗的病理学病症和施用方案和施用途径，并且通常比每种单独使用要少。
在将抗体施用至哺乳动物后，哺乳动物的生理学状态可以以本领域技术人员熟知的多种方式进行监测。
上述施用原则和剂量适用于本文所述多肽。
编码本发明多肽(包括抗体)的多核苷酸也可以用来在目的细胞中递送和表达抗体或多肽。显而易见的是，表达载体可以用来指导抗体的表达。表达载体可以全身地、腹膜内地、静脉内地、肌内地、皮下地、鞘内地、心室内地、经口地、经肠地、胃肠外地、鼻内地、经皮地或通过吸入施用。例如，表达载体的施用包括局部或全身施用，其包括注射、经口施用、微粒枪或插管施用、以及局部施用。本领域技术人员熟悉以在体内获得外源性蛋白质表达的表达载体的施用。见，例如美国专利号6,436,908、6,413,942和6,376,471。
也可以使用定向递送包含编码本发明多肽或抗体的多核苷酸的治疗性组合物。受体介导的DNA递送技术在例如Findeis等人，Trends Biotechnol.(1993)11：202；Chiou等人，基因治疗：直接基因转移的方法和应用(GeneTherapeutics：Methods And Applications Of Direct Gene Transfer)(J.A.Wolff编著)(1994)；Wu等人，J.Biol.Chem.(1988)263：621；Wu等人，J.Biol Chem.(1994)269：542；Zenke等人，Proc.Natl Acad.Sci.(USA)(1990)87：3655；Wu等人，J.Biol Chem.(1991)266：338中进行了描述。含有多核苷酸的治疗性组合物在基因疗法实验设计中施用大约100ng至大约200mg DNA来进行局部施用。在基因疗法实验设计中也可以使用在大约500ng至大约50mg、大约1μg至大约2mg、大约5μg至大约500μg、以及大约20μg至大约100μg DNA的浓度范围。本发明的治疗性多核苷酸和多肽可以用基因递送载体递送。基因递送载体可以为病毒或非病毒来源(通常地见Jolly，Cancer Gene Therapy(1994)1：51；Kimura，Human GeneTherapy(1994)5：845；Connelly，Human Gene Therapy(1995)1：185和Kaplitt，Nature Genetics(1994)6：148)。此类编码序列可以用内源的哺乳动物启动子或异源启动子来诱导表达。编码序列的表达可以是组成型的或受调节的。
基于病毒的递送目的多核苷酸的载体以及在目的细胞中的表达为本领域所熟知。基于病毒的示例性载体包括但不限于重组体逆转录病毒(见，例如PCT公开号WO 90/07936、WO 94/03622、WO 93/25698、WO 93/25234、WO 93/11230、WO 93/10218、WO 91/02805、美国专利号5,219,740、4,777,127、GB专利号2,200,651和EP 0 345 242)、基于甲病毒的载体(例如，辛德比斯病毒载体、西米尼克森林病毒(ATCC VR-67、ATCCVR-1247)、罗斯河病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923、ATCC VR-1250、ATCC VR 1249、ATCC VR-532))和腺相关病毒(AAV)载体(见，例如PCT公开号WO 94/12649、WO93/03769、WO 93/19191、WO 94/28938、WO 95/11984和WO 95/00655)。也可以采用如Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3：147中所述的施用与已杀死的腺病毒连接的DNA。
也可以采用非病毒递送载体和方法，所述非病毒递送载体和方法包括但不限于与已杀死的腺病毒连接或不与已杀死的腺病毒连接的单独的聚阳离子浓缩的DNA(见，例如Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3：147)、配体连接的DNA(见，例如Wu，J.Biol.Chem.(1989)264：16985)、真核细胞递送载体细胞(见，例如美国专利号5,814,482、PCT公开号WO95/07994、WO 96/17072、WO 95/30763和WO 97/42338)以及核电荷中和或与细胞膜融合。也可以采用裸DNA。示例性的裸DNA引入方法在PCT公开号WO 90/11092和美国专利号5,580,859中进行了描述。作为基因递送载体的脂质体在美国专利号5,422,120、PCT公开号WO 95/13796、WO94/23697、WO 91/14445和EP 0 524 968中进行了描述。额外的方法在Philip，Mol.Cell Biol.(1994)14：2411中和在Woffendin，Proc.Natl.Acad.ScL(1994)91：1581中进行了描述。
提供了下列实施例来例证但不限制本发明。
实施例
应当理解，本文所述实施例和实施方案仅用作示例目的，并将根据其的多种修饰或变化建议给本领域技术人员，并且所述修饰和变化包括在本申请的主旨和范围内。
实施例1-CM03 Fab的结合亲和性及VH和VL序列
CM03(本文也称为14D10)为产生的抗人CD26的小鼠单克隆抗体。CM03的VH和VL序列在下列实施例中用作开始物来设计变体。也产生了包含分别对应小鼠单克隆抗体CM03 VL和VH序列的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的Fab。该CM03 Fab在本文通常称为“X369”或“CM03X369”等。
使用Biacore
Figure A20068003493700921
技术(表面胞质共振或“SPR”)来测定CM03 Fab对CD26的亲和性。一般而言，基于SPR的生物传感器通过测定靠近表面的生物分子浓度来监测相互作用。表面具有一个固定在其上的相互作用配偶体。使含有其它配偶体的样品流经表面。当样品中的分子结合吸附在表面的相互作用物时，就会检测到SPR反应。反应与结合到表面的分子质量成比例。
这些亲和性测试在25℃根据操作手册进行。将购自R&D系统(CAT#1180-SE)的纯化的重组人CD26(重组人二肽基肽酶IV)在PBS中制成母液，并在将其固定至CM5芯片(BiaCore Inc.，CAT#BR-1000-14)上之前，将其在pH 5的10mM乙酸钠缓冲液中稀释成约0.05mg/mL的浓度。将如下文所述在大肠杆菌(E.coli)中产生的Fab在PBS中稀释成约0.5μM的浓度来进行测试。一般的纪录包括3分钟Fab注射期，随后是15分钟解离期，并因此基于结合曲线的原始数据进行分析。
亲和性是一个分子与另一个分子在单个位点上的结合强度，KD为解离常数，即抗体从抗原解离速率的测定值。一般而言，具较低KD的抗体具有更高的亲和性。
使用Biacore
Figure A20068003493700922
技术测定包含CM03 VH和VL的Fab对人CD26抗原的的亲和性。从这个数据测定出CM03 Fab的KD(1.63×10-9)。这表明相对高的亲和性。CM03 Fab的其它亲和性数据如下文表2所示。
表2
  Kon/SE(M-1秒-1)   Koff/SE(秒-1)   KD(M)
  CM03(X369)   5.09E+05/1.19E+04   8.29E-04/3.40E-06   1.63e-9
图1显示CM03小鼠Ab和CM03 Fab的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的序列。
实施例2-人源化的CM03变体的Fab
A.序列
将CM03抗体的重链可变区和轻链可变区用于人源化来产生多种变体重链可变区和轻链可变区。
图2中显示人源化VL变体X376(SEQ ID NO：1)、X377(SEQ IDNO：2)、X378(SEQ ID NO：3)、X379(SEQ ID NO：4)、X380(SEQ ID NO：5)、X381(SEQ ID NO：6)和X394(SEQ ID NO：7)的核酸序列。图3中显示人源化VL变体X376(SEQ ID NO：15)、X377(SEQ ID NO：16)、X378(SEQ IDNO：17)、X379(SEQ ID NO：18)、X380(SEQ ID NO：19)、X381(SEQ IDNO：20)和X394(SEQ ID NO：21)的氨基酸。
图4显示人源化VH变体X384(SEQ ID NO：8)、X385(SEQ ID NO：9)、X386(SEQ ID NO：10)、X387(SEQ ID NO：11)、X388(SEQ ID NO：12)、X399(SEQ ID NO：13)和X420(SEQ ID NO：14)的核酸序列；图5显示人源化VH变体X384(SEQ ID NO：22)、X385(SEQ ID NO：23)、X386(SEQ IDNO：24)、X387(SEQ ID NO：25)、X388(SEQ ID NO：26)、X399(SEQ IDNO：27)和X420(SEQ ID NO：28)的氨基酸序列。
图6显示变体重链可变区和轻链可变区的所选对的氨基酸序列，所述变体重链可变区和轻链可变区对用来制备包含VH和VL变体两者的Fab。
B.表达
图7-10中显示用来表达重链和轻链Fab变体的大肠杆菌细胞系。
为了表达，将分别的大肠杆菌细胞系接种在含有100μg/ml羧苄青霉素的2×YT培养基中，使其在37℃生长至OD600＝～1后加入IPTG至终浓度0.5mM，然后将培养物在30℃诱导4-5小时来产生Fab。收集细胞并根据标准方法(Phage Display，A Laboratory Manual，Carlos Barbas III等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)制备周质提取物。将粗提物根据使用说明书在G蛋白亲和柱(Amerham-Pharmacia，CAT#17-0404-01)中纯化，并通过0.1M、pH.2.7的甘氨酸洗脱，随后立即用1M、pH 8的Tris中和。将样品在大量PBS中透析，最后在用于Biacore分析和其它测试之前用OD280测定蛋白质浓度。
图7显示在非还原条件下的SDS-PAGE凝胶，其中上样了在大肠杆菌菌株TG1中表达的CM03 VL变体X376、X377、X378、X379、X380、X381的Fab和VH变体X384、X385、X386的Fab通过G蛋白柱纯化的样品。在Fab中，VL变体与CM03 VH配对；在Fab中，VH变体与CM03VL配对。在每个样品中，蛋白质条带出现在50kDa左右，但在X376、X377、X380、X384、X385和X386中的产量最高。图8显示在大肠杆菌中表达的CM03VL变体X376、X377、X378、X379、X380、X381的Fab和Fab X369(CM03)的蛋白质积聚的定量表示。样品X376、X377和X380具有比CM03鼠Fab更高水平的Fab蛋白。图11显示包含与CM03 VL配对的VH变体X384、X385、X386、X387或X388的Fab在大肠杆菌中表达的定量的蛋白质产量。
图9显示在非还原条件下的SDS-PAGE凝胶，其中上样了在大肠杆菌菌株TG1中表达的CM03 VH变体X387和X388的Fab和在大肠杆菌HB2151中表达的每个都包含一对VL变体和VH变体的Fab X389、X390、X391、X392、X393、X395和X396通过G蛋白柱纯化的样品。(X387和X388 VH变体与CM03 VL配对。)图6显示Fab X389、X390、X391、X392、X393、X395和X396的VL和VH对。在每个样品中，蛋白质条带出现在50kDa左右，但在X389、X390、X391、X395和X396中产量最高。图10显示Fab VH变体和VL变体对X389、X390、X391、X392、X393、X395和X396、以及CM03 X369在大肠杆菌菌株HB2151中表达的蛋白质积聚的定量表示。在所有情况中，Fab变体对样品比CM03鼠Fab具有更高水平的蛋白质。
C.Fab性质
下文表3显示Fab X369(CM03 VH和VL)、X391、X392、X396和X399多种理论物理性质的概要。例如，显示分子量、带电荷残基数、疏水残基、等电点和总电荷。
表3
  Fab   性质
  X369   分子量49596.31道尔顿458个氨基酸38个强碱性(+)氨基酸(K、R)35个强酸性(-)氨基酸(D、E)134个疏水性氨基酸(A、I、L、F、W、V)176个极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)7.992等电点pH7.0时4.937的电荷
  X391   分子量49809.46道尔顿458个氨基酸41个强碱性(+)氨基酸(K、R)39个强酸性(-)氨基酸(D、E)129个疏水性氨基酸(A、I、L、F、W、V)172个极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)7.822等电点pH7.0时3.943的电荷
  X392   分子量49634.45道尔顿458个氨基酸41个强碱性(+)氨基酸(K、R)36个强酸性(-)氨基酸(D、E)134个疏水性氨基酸(A、I、L、F、W、V)170个极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)8.272等电点pH7.0时6.776的电荷
  X396   分子量49664.36道尔顿458个氨基酸40个强碱性(+)氨基酸(K、R)39个强酸性(-)氨基酸(D、E)
  132个疏水性氨基酸(A、I、L、F、W、V)170个极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)7.625等电点pH7.0时2.950的电荷
  X399   分子量49678.39道尔顿458个氨基酸40个强碱性(+)氨基酸(K、R)39个强酸性(-)氨基酸(D、E)132个疏水性氨基酸(A、I、L、F、W、V)170个极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)7.625等电点pH7.0时2.950的电荷
D.包含变体轻链可变区的Fab的特异性
对CM03 Fab X369和包含与CM03 VH连接的X377 VL变体的Fab进行特异性分析。数据在图12A、12B和12C中显示。数据使用Biacore
Figure A20068003493700961
技术产生。CD26结合配偶体如下文所述。
图12A显示结合人CD26的X369(CM03Fab)。也显示在大约800秒时引入额外的CM03后的反应。图12B显示结合人CD26的X369(CM03Fab)。也显示在大约600秒时引入包含与CM03 VH配对的X377 VL变体的Fab后的反应。图12C显示结合人CD26的X377 Fab，其与结合被CM03Fab X369预先占据的CD26的X377 Fab进行比较。与结合于先前未结合的CD26的X377 Fab相比，X377 Fab与先前已结合X369的CD26的结合下降，这表明X377 Fab和CM03 Fab X369具有类似或至少重叠的与CD26的相互作用位点。
E.Fab变体对人CD26的亲和性
下文表4显示亲和性分析的概要，其包括CM03 X369和包含与每个CM03 VL变体X376、X377、X378、X379、X380或X381组合的CM03 VH的Fab的KD。这个数据使用Biacore技术产生。CD26结合配偶体如下文所示。
表4
  变体   Kon/SE(M-1秒-1)   Koff/SE(秒-1)   KD(M)   Ki2
  X369   5.09E+05/1.19E+04   8.29E-04/3.40E-06   1.63e-9   7.03
  X376   2.58E+05/1.71E+03   5.96E-04/3.49E-06   2.31e-9   12.2
  X377   3.17E+05/2.28E+03   5.96E-04/3.48E-06   1.88e-9   12.7
  X378   2.85E+05/1.85E+03   8.30E-04/6.02E-06   2.92e-9   10.7
  X379   5.78E+05/4.67E+03   6.70E-04/3.82E-06   1.16e-9   8.89
  X380   2.94E+05/2.84E+03   6.87E-04/4.54E-06   2.33e-9   10.5
  X381   2.93E+05/1.76E+03   6.01E-04/4.04E-06   2.10e-9   4.44
X369：鼠CM03 Fab
下文表5显示亲和性分析的总结，其包括CM03 X369和包含与一个CM03 VH变体X384、X385、X386、X387或X388配对的CM03 VL的Fab的KD。
表5
  变体   Kon/SE(M-1.秒-1)   Koff/SE(秒-1)   KD(M)   Ki2
  X369   5.09E+05/1.19E+04   8.29E-04/3.40E-06   1.63e-9   7.03
  X384   2.62E+05/1.84E+03   3.12E-04/6.26E-06   1.19e-9   23.9
  X385   2.56E+05/1.84E+03   3.75E-04/6.47E-06   1.47e-9   50.1
  X386   1.84E+05/4.32E+03   4.98E-04/3.27E-06   2.71e-9   68.3
  X387   1.96E+05/1.10E+04   1.00E-02/1.96E-04   5.11e-8   819
  X388   2.35E+05/2.37E+03   6.98E-04/5.00E-06   2.98e-9   27.5
X369：鼠CM03 Fab
图13显示X369 Fab(CM03 VH和VL)和下列包含人源化CM03 VH和VL变体对的Fab的亲和性分析，所述变体对为：X389、X390、X391、X392、X393、X395和X396。见图6变体的重链和轻链可变区对的氨基酸序列。除CD26结合配偶体如图所示之外，如实施例1中所述用Biacore
Figure A20068003493700981
进行分析。
下文表6显示表4和表5以及所示Fab表达量的总结。其也显示用于制备所选Fab的变体重链和轻链、KD、产量以及所选的包含VH和VL变体的Fab与CM03 Fab相比的KD和产量的比率。
表6
Figure A20068003493700982
Figure A20068003493700983
鼠CM03 Fab为X369
#每个单独克隆产量与鼠CM03产量的比率
##CM03 Fab的Kd与单独克隆Kd的比率
F.包含变体VH和VL对的Fab结合人CD26的特异性
对包含变体VH和VL序列对的所选Fab进行特异性分析。图14显示与未纯化的腹水鼠MAb CM03(14D10)竞争结合CD26的CM03 X369 Fab和人源化的CM03 Fab X389、X390、X391、X392、X393、X395和X396。比较了14D10与CD26的结合和14D10与被CM03变体预先占据的CD26的结合。将克隆的CM03重组体Fab用作阳性对照。如实施例1所述，用Biacore进行分析。所有Fab导致14D10与CD26的结合下降至少80％，这表明Fab变体对与14D10具有类似或至少重叠的结合位点。
G.生物学活性
分析了包含不同对人源化重链可变区和轻链可变区的Fab抑制细胞增殖的能力。
在Jurkat CD26+细胞中分析多种Fab变体对生长抑制效应的影响。使用本领域熟知的3-4，5-二甲基噻唑-2-基-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(“MTT”)测定法。这种测定法是用于细胞增殖测定的定量方法。一般而言，MTT测定法基于活细胞的线粒体脱氢酶切开MTT、并形成深蓝色甲
Figure A20068003493700992
(formazan)结晶的能力。存活的细胞数与产生的甲
Figure A20068003493700993
产物水平成比例。颜色可以用简单的比色测定定量。
简要地，进行MTT测定时，将50μl指数生长的Jurkat CD26+细胞放置在微量滴定板上(50μl加样孔中50,000个细胞)。将CM03 Fab X369和Fab变体X389、X390、X391、X392、X393、X395和X396(包含VH和VL变体对)以及包含VL变体X376和CM03VH的Fab以0.1、0.5、1、5和10μg/ml的生长培养基加入，并混合。将细胞在密封的CO2培养箱中在37℃孵育48小时。加入大约1mg/ml的MTT。细胞在37℃孵育2小时。在CO2培养箱中抽提甲
Figure A20068003493700994
过夜。测定在570nm处的吸光度。
图15显示CM03 Fab X369和Fab X389、X390、X391、X392、X393、X395和X396(包含VH和VL突变对)以及包含VL变体X376和CM03VH的Fab抑制JKT/CD26+细胞增殖的百分数。
所有导致细胞增殖受抑制的Fab都在5或10μg/ml水平具最大抑制作用。
实施例3-人源化的CM03 IgG1抗体
A.序列
全长的人源化抗体用所选的VH和VL对、人IgG1重链恒定区和人κ轻链恒定区产生。图16显示IgG1链链相互作用和铰链区。图17A显示重链恒定区氨基酸序列。其也显示VH变体在重链中的位置和前导序列。图17B显示轻链恒定区氨基酸序列。其也显示VL变体在轻链中的位置和前导序列。
下文表7和表8匹配VH和VL对的身份，所述VH和VL对用来制备重组的人源化单克隆抗体(rhuMAbs)409、410、411、412、420和429，所述抗体为先前测试的一些Fab。下文表8中显示了用来制备包含VH和VL变体对的Fab的VH和VL变体。例如，本文也称为“X410”的rhuMab410包含X388VH和X376VL序列，正如Fab X391。如上文所述，图6显示除X369(CM03 Fab)以外的所选变体重链和轻链对的氨基酸序列。X369(CM03 Fab)的CM03 VH和CM03 VL序列用来产生rhuMAb409。
表7
表8
  IgG1   Fab   VH   VL   Fab产量(μg/l)   CHO产量(μg/l)   FabKd(nM)
  X389   X384   X376   380   650   0.38
  X390   X385   X376   500   700   0.96
  X410   X391   X388   X376   760   229   2.12
  X411   X392   X384   X379   150   720   0.24
  X393   X385   X379   180   1,580   0.33
  X394   X384   X394   235   250   0.58
  X395   X384   X380   630   310   3.26
  X412   X396   X385   X380   760   1,370   2.53
  X427   X399   X399   X380   453   1,420   2.85
  X420   X431   X420   X380   1110   1,100   0.92
  X429   X430   X399   X394   1290   4,300   1.19
  X409   CM03   鼠   鼠   78   470   1.63
鼠CM03 Fab为X369
B.表达
图18显示全长重组的人源化单克隆抗体(rhuMAbs)409、411、410和412，所述抗体在HEK293细胞中瞬时表达，并根据操作手册通过A蛋白亲和柱(Procep-A，Millipore，CAT#113111827)纯化。抗体通过100mM醋酸钠、pH 3.0洗脱，随后立即用2M Tris、pH 9.0中和。然后将样品在JS4.2转子中以4,000rpm旋转30分钟来移去不溶物质，并在储存前过滤通过0.2μm滤器灭菌。图18也显示在中国仓鼠卵巢(CHO-DG44)细胞中稳定表达的rhuMAb 411。在每种情况中，转染通过lipofectomin进行。
图18显示经考马斯亮蓝染色的在还原条件下进行的SDS聚丙烯酰胺凝胶。可见与游离重链和轻链预期的迁移点一致的两条主要条带。上文表7显示在CHO细胞中表达的多种所述全长抗体的产量。
C.rhuMAb对人CD26的亲和性
下文表9中显示rhuMAb409、410、411和412与CD26的CD26结合亲和性。除了结合配偶体为上文所述rhuMAb外，按照实施例1中所述用Biacore
Figure A20068003493701011
进行其分析。rhuMAb 411具有3.7倍于rhuMAb 409的KD。rhuMAb 410和412分别具有0.5和0.4倍于rhuMAb 409的KD。
表9通过Biacore
Figure A20068003493701021
检测的rhuMAB与YSCMA抗原的亲和性
Figure A20068003493701022
图19显示了数据，所述数据显示特异结合人CD26的rhuMAb 409、411、410和412。图20显示用标准实验方案(Phage Display，A LaboratoryManual，Carlos Barbas III等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)的ELISA数据，所述数据显示其它瞬时表达的rhuMAb变体与人CD26(1μg/ml人CD26包被和山羊抗人κHRP结合物(SouthernBiotech，Birmingham，Alabama，CAT#2060-05)作为检测二抗)的结合。
D.生物学活性
在Jurkat CD26+细胞中在形态学测试中分析特定的重组性人MAb的抗增殖效应，所述形态学测试评估抗体诱导的聚集。图21显示相比对照处理(上层图像)、用rhuMAb 409(下层左图)和rhuMAb 410(下层右图)处理的细胞图像。两种rhuMAb相比对照处理都产生抑制细胞增殖的证据。
图22显示相比对照(上层左图)，用0.05μg/ml(下层左图)、0.1μg/ml(下层右图)、0.5μg/ml(中间左图)、2.5μg/ml(中间右图)和5μg/ml(上层右图)rhuMAb 411处理的结果。在较高水平的抗体处观察到抑制细胞增殖的证据。抑制效果的证据随rhuMAb 411增加变得更高；最高的抑制浓度为5μg/ml rhuMAb 411处。
也在Jurkat CD26+细胞中用MTT测试法分析了特定的重组性人MAb对生长抑制效果的效果。rhuMAb 409、410、411、412、420和429每个都以多个不同浓度进行了测试。下文表10显示了多种重组人Mab在MTT测试中观察到的抑制百分数。
表10
  ug/ml   rhuMAb409   rhuMAb410   rhuMAb411   rhuMAb412   rhuMAb420   rhuMAb429
  5   21.7   33.5   28   23.6   15.9   26.2
  2.5   19.7   27.5   22.5   17.5   16.6   20.6
  0.5   14.7   14   14.6   6.2   9.2   12.1
  0.25   12.9   10.7   15   5.4   9.6   9.6
  0.05   4.8   4   3.3   0.3   3.7   3.1
  0   0   0   0   0   0   0
  测试#   5   4   3   3   2   2
图23A和23B也显示rhuMAb 409、410、411、412、420和429的MTT测试结果。图23A显示抑制百分数的线形图表示，而图23B显示其条形图表示。用所有所示抗体处理都产生细胞增殖抑制效果。除rhuMAb420外，在所有情况中用增加浓度的抗体处理导致抑制百分数增加，rhuMAb420在5μg/ml处理点相比2.5μg/ml处理点显示轻微下降。
E.表位作图
进行表位作图实验来确定人源化单克隆抗体在CD26上可能的结合位点。表位作图用肽微列阵进行。
一般地，这种作图方法需要合成重叠序列的肽，所述重叠序列合起来对应于抗原(此处为人CD26)全部或部分氨基酸序列。然后将肽和目的抗体反应。洗去过剩或未结合的抗体。检测反应或结合的抗体。因为在反应针(reactive pin)上的每个肽的序列是已知的，所以可以从微阵列反应谱推断出抗原的反应区域。
微阵列由144个重叠的、衍生自人CD26的13mer肽组成。下文显示人CD26的766个氨基酸序列(二肽基肽酶IV膜形式；SEQ ID NO：89)。
  1 MKTPWKVLLG LLGAAALVTI ITVPVVLLNK GTDDATADSR KTYTLTDYLK
 51 NTYRLKLYSL RWISDHEYLY KQENNILVFN AEYGNSSVFL ENSTFDEFGH
101 SINDYSISPD GQFILLEYNY VKQWRHSYTA SYDIYDLNKR QLITEERIPN
151 NTQWVTWSPV GHKLAYVWNN DIYVKIEPNL PSYRITWTGK EDIIYNGITD
201 WVYEEEVFSA YSALWWSPNG TFLAYAQFND TEVPLIEYSF YSDESLQYPK
251 TVRVPYPKAG AVNPTVKFFV VNTDSLSSVT NATSIQITAP ASMLIGDHYL
301 CDVTWATQER ISLQWLRRIQ NYSVMDICDY DESSGRWNCL VARQHIEMST
351 TGWVGRFRPS EPHFTLDGNS FYKIISNEEG YRHICYFQID KKDCTFITKG
401 TWEVIGIEAL TSDYLYYISN EYKGMPGGRN LYKIQLSDYT KVTCLSCELN
451 PERCQYYSVS FSKEAKYYQL RCSGPGLPLY TLHSSVNDKG LRVLEDNSAL
501 DKMLQNVQMP SKKLDFIILN ETKFWYQMIL PPHFDKSKKY PLLLDVYAGP
551 CSQKADTVFR LNWATYLAST ENIIVASFDG RGSGYQGDKI MHAINRRLGT
601 FEVEDQIEAA RQFSKMGFVD NKRIAIWGWS YGGYVTSMVL GSGSGVFKCG
651 IAVAPVSRWE YYDSVYTERY MGLPTPEDNL DHYRNSTVMS RAENFKQVEY
701 LLIHGTADDN VHFQQSAQIS KALVDVGVDF QAMWYTDEDH GIASSTAHQH
751 IYTHMSHFIK QCFSLP
在微阵列上只代表氨基酸残基48-324。13mer偏移两个氨基酸。因此，肽1代表氨基酸残基48-60、肽2代表氨基酸残基50-62，如此类推，结束于代表氨基酸残基312-324的肽133。下文表11显示rhuMAb 409、411、412和420的信号数据。其也显示图24所示的每个肽编号代表的氨基酸。行134-144代表背景对照。
注意，所述抗体可以与用于微阵列的氨基酸序列之外的其它峰发生反应。另外，可能存在未鉴定为最具反应性的氨基酸残基。这可能部分是因为结合微阵列的短肽的线性特征和全长状态抗原的三维结构之间的差异。
将13mer固定在改良的玻璃表面。固定的肽衍生物具有下列通用结构：改良的玻璃表面-接头-13mer肽。
将微阵列在室温用封闭缓冲液预处理4小时，然后用pH 7.5的PBS缓冲液和水每个洗3遍。每个预处理的微阵列都用Array Worx微阵列扫描仪扫描背景信号。未检测到信号。
作为对照，将一个微阵列与荧光素标记的人抗IgG抗体(SIGMA#F9512，在山羊中产生的抗人IgG(Fc特异的)-FITC抗体，1∶1000)在室温孵育2小时，然后用pH 7.5的PBS缓冲液和水每个洗3遍。然后用ArrayWorx微阵列扫描仪扫描微阵列。
将微阵列在6℃与rhuMAB 409、411、412和420孵育过夜，其中在250μl测试缓冲液(PBS-T，0.1％NaN3)中使用10μg抗体。过夜孵育之后，用pH 7.5的PBS缓冲液和水每个洗3遍。然后用Array Worx微阵列扫描仪扫描微阵列。
用SPOT识别软件包ArrayPro进行数据分析。用每张微阵列图像上3次同一亚阵列信号强度的平均值进行数据评估。下文表11显示rhuMAb409、411、412和420与13mer肽的信号强度数据。图24显示条形图表示的rhuMAb 409、411、412和420的信号数据。
                                  表11
肽编号        氨基酸                  平均信号值    平均信号值   平均信号值   平均信号值
                                      rhuMAb409     rhuMAb411    rhuMAb412    rhuMAb420
1     YLKNTYRLKLYSL(SEQ ID NO：92)    11.331731     3.504808     20.307692    18.951923
2     KNTYRLKLYSLRW(SEQ ID NO：93)    82.432692     16.480769    23.764423    31.028846
3     TYRLKLYSLRWIS(SEQ ID NO：94)    0.663462      0.725962     0.033654     1.125
4     RLKLYSLRWISDH(SEQ ID NO：95)    132.076923    51.326923    25.629808    35.057692
5     KLYSLRWISDHEY(SEQ ID NO：96)    64.798077     43.125       7.591346     6.634615
6     YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO：45)    183.028846    97.456731    17.629808    53.947115
7     LRWISDHEYLYKQ(SEQ ID NO：97)    110.764423    20.586538    9.485577     5.115385
8     WISDHEYLYKQEN(SEQ ID NO：98)    3.283654      0.735577     0.004808     0.009615
9     SDHEYLYKQENNI(SEQ ID NO：99)    0             0.067308     0            0
10    HEYLYKQENNILV(SEQ ID NO：100)   0.033654      0.019231     0            0.024038
11    YLYKQENNILVFN(SEQ ID NO：101)   28.870192     5.783654     4.235577     2.649038
12    YKQENNILVFNAE(SEQ ID NO：102)   0             0            0.086538     0.009615
13    QENNILVFNAEYG(SEQ ID NO：103)   1.341346      1.942308     0.682692     1.432692
14    NNILVFNAEYGNS(SEQ ID NO：104)   0             0.009615     0.043269     0
15    ILVFNAEYGNSSV(SEQ ID NO：105)   0.105769      0            0            0.009615
16    VFNAEYGNSSVFL(SEQ ID NO：106)   3.865385      1.918269     0.177885     0
17    NAEYGNSSVFLEN(SEQ ID NO：107)   0.110577      0.0625       0.004808     0.067308
18    EYGNSSVFLENST(SEQ ID NO：108)   0             0            0            0
19    GNSSVFLENSTFD(SEQ ID NO：109)   0             0            0.072115     0
20    SSVFLENSTFDEF(SEQ ID NO：110)   0             0.057692     0.379808     0.009615
21    VFLENSTFDEFGH(SEQ ID NO：111)   0             0.197115     0            0
22    LENSTFDEFGHSI(SEQ ID NO：112)   0             0.019231     0            0
23    NSTFDEFGHSIND(SEQ ID NO：113)   0             0.004808     0            0
24    TFDEFGHSINDYS(SEQ ID NO：114)   0             0.009615     0            0
25    DEFGHSINDYSIS(SEQ ID NO：115)   0             0            0            0
26    FGHSINDYSISPD(SEQ ID NO：116)   0             0.033654     0            0
27    HSINDYSISPDGQ(SEQ ID NO：117)    0           0.004808    0.298077    0
28    INDYSISPDGQFI(SEQ ID NO：118)    0.004808    0.221154    0           0.163462
29    DYSISPDGQFILL(SEQ ID NO：52)     99.745192   2.163462    97.918269   167.634615
30    SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO：53)     78.033654   6.264423    77.4375     103.365385
31    SPDGQFILLEYNY(SEQ ID NO：119)    4.9375      2.331731    3.807692    3.254808
32    DGQFILLEYNYVK(SEQ ID NO：120)    0.019231    0.019231    0.004808    0
33    QFILLEYNYVKQW(SEQ ID NO：121)    66.586538   21.817308   12.168269   12.769231
34    ILLEYNYVKQWRH(SEQ ID NO：122)    87.649038   15.658654   19.451923   47.341346
35    LEYNYVKQWRHSY(SEQ ID NO：46)     236.774038  84.745192   31.442308   42.360577
      YNYVKQWRHSYTA(SEQ ID
36    NO：123)                         106.850962  28.245192   11.456731   15.4375
37    YVKQWRHSYTASY(SEQ ID NO：50)     193.5625    98.201923   25.764423   39.245192
38    KQWRHSYTASYDI(SEQ ID NO：125)    14.519231   4.769231    1.865385    1.793269
39    WRHSYTASYDIYD(SEQ ID NO：126)    32.307692   55.6875     4.144231    5.447115
40    HSYTASYDIYDLN(SEQ ID NO：127)    49.552885   32.163462   12.586538   17.990385
41    YTASYDIYDLNKR(SEQ ID NO：128)    0.980769    0.067308    0.408654    0.423077
42    ASYDIYDLNKRQL(SEQ ID NO：129)    0           0           0.043269    0.014423
43    YDIYDLNKRQLIT(SEQ ID NO：130)    2.889423    0           0           0.048077
44    IYDLNKRQLITEE(SEQ ID NO：131)    0           0           0           0
45    DLNKRQLITEERI(SEQ ID NO：132)    0           0           0           0
46    NKRQLITEERIPN(SEQ ID NO：133)    0           0           0           0
47    RQLITEERIPNNT(SEQ ID NO：134)    0           0           0           0
48    LITEERIPNNTQW(SEQ ID NO：135)    60.288462   12.057692   0.360577    0.971154
49    TEERIPNNTQWVT(SEQ ID NO：136)    0           0.961538    8.235577    0.139423
50    ERIPNNTQWVTWS(SEQ ID NO：137)    20.644231   34.629808   5.360577    1.331731
51    IPNNTQWVTWSPV(SEQ ID NO：138)    0           0.855769    2.701923    0.201923
      NNTQWVTWSPVGH(SEQ ID
52    NO：139)                         0.129808    0.120192    0.504808    0.120192
      TQWVTWSPVGHKL(SEQ ID
53    NO：140)                         1.639423    0.004808    2.567308    4.25
      WVTWSPVGHKLAY(SEQ ID
54    NO：141)                         30.326923   13.004808   12.980769   15.149038
55    TWSPVGHKLAYVW(SEQ ID NO：47)     229.370192  123.735577  98.365385   117.5625
      SPVGHKLAYVWNN(SEQ ID
56    NO：142)                         23.254808   11.745192   3.754808    4.826923
      VGHKLAYVWNNDI(SEQ ID
57    NO：143)                         23.048077   9.668269    2.456731    1.528846
      HKLAYVWNNDIYV(SEQ ID
58    NO：144)                         59.721154   33.754808   3.206731    4.235577
59    LAYVWNNDIYVKI(SEQ ID NO：145)    6.163462    0.682692    3.197115    6.730769
60    YVWNNDIYVKIEP(SEQ ID NO：146)    0.975962    0.076923    0           0.524038
61    WNNDIYVKIEPNL(SEQ ID NO：147)    0           0.038462    0           0.451923
62    NDIYVKIEPNLPS(SEQ ID NO：148)    0.004808    0.004808    0           0.259615
63    IYVKIEPNLPSYR(SEQ ID NO：54)     17.649038   8.125       41.081731   88.706731
64    VKIEPNLPSYRIT(SEQ ID NO：149)    2.5625      0.4375      2.201923    11.995192
65    IEPNLPSYRITWT(SEQ ID NO：150)    38.826923   40.802885   13.134615   11.346154
66    PNLPSYRITWTGK(SEQ ID NO：151)    4.447115    0.110577    1.716346    2.240385
67    LPSYRITWTGKED(SEQ ID NO：152)    1.745192    0.009615    0           0.014423
68    SYRITWTGKEDII(SEQ ID NO：153)    4.543269    0           0.216346    0.192308
69    RITWTGKEDIIYN(SEQ ID NO：154)    3.25        2.451923    0.283654    0.043269
70    TWTGKEDIIYNGI(SEQ ID NO：155)    5.533654    1.004808    0.009615    0.081731
71    TGKEDIIYNGITD(SEQ ID NO：156)    4.057692    0           0           0
72    KEDIIYNGITDWV(SEQ ID NO：157)    9.889423    10.134615   0.379808    0.125
73    DIIYNGITDWVYE(SEQ ID NO：158)    6.932692    33.557692   6.341346    11.5
74    IYNGITDWVYEEE(SEQ ID NO：159)    0           0           6.173077    0.293269
75    NGITDWVYEEEVF(SEQ ID NO：160)    0.961538    9.384615    1.538462    1.870192
76    ITDWVYEEEVFSA(SEQ ID NO：161)    0.144231    0.033654    0.274038    0.25
77    DWVYEEEVFSAYS(SEQ ID NO：162)    5.923077    13.658654   0.509615    2.038462
78    VYEEEVFSAYSAL(SEQ ID NO：163)    7.956731    7.855769    4.355769    4.596154
79    EEEVFSAYSALWW(SEQ ID NO：51)     89.245192   96.394231   12.625      10.533654
80    EVFSAYSALWWSP(SEQ ID NO：164)    23.548077   17.735577   2.278846    4.100962
      FSAYSALWWSPNG(SEQ ID
81    NO：165)                         62.177885   35.370192   2.278846    4.201923
      AYSALWWSPNGTF(SEQ ID
82    NO：166)                         117.192308  67.831731   4.663462    7.091346
83    SALWWSPNGTFLA(SEQ ID NO：167)    7.413462    3.644231    0.048077    0.033654
84    LWWSPNGTFLAYA(SEQ ID NO：48)     140.740385  17.225962   30.399038   59.620192
85    WSPNGTFLAYAQF(SEQ ID NO：168)    0.033654    1.024038    2.721154    4.216346
86    PNGTFLAYAQFND(SEQ ID NO：169)    0.038462    0.524038    0.067308    0.004808
87    GTFLAYAQFNDTE(SEQ ID NO：170)    0.134615    0.028846    0           0
88    FLAYAQFNDTEVP(SEQ ID NO：171)    0           0           0           0.014423
89    AYAQFNDTEVPLI(SEQ ID NO：172)    0           0           0.4375      0.182692
90    AQFNDTEVPLIEY(SEQ ID NO：173)    0           0           0           0.009615
91    FNDTEVPLIEYSF(SEQ ID NO：174)    0.019231    2.302885    0.134615    40.956731
92    DTEVPLIEYSFYS(SEQ ID NO：175)    14.447115   11.865385   9.043269    10.764423
93    EVPLIEYSFYSDE(SEQ ID NO：176)    0.004808    0.269231    0.014423    11.201923
94    PLIEYSFYSDESL(SEQ ID NO：177)    0.067308    0.043269    1.524038    0.038462
95    IEYSFYSDESLQY(SEQ ID NO：178)    3.903846    6.139423    0.048077    0.336538
96    YSFYSDESLQYPK(SEQ ID NO：179)    0           0.014423    0           0.004808
97    FYSDESLQYPKTV(SEQ ID NO：180)    0.014423    0.014423    1.317308    0.052885
98    SDESLQYPKTVRV(SEQ ID NO：181)    0.014423    0.004808    1.014423    0.197115
99    ESLQYPKTVRVPY(SEQ ID NO：182)    0           0.086538    0.725962    0.0625
100   LQYPKTVRVPYPK(SEQ ID NO：183)    0           0.009615    0           0.004808
101   YPKTVRVPYPKAG(SEQ ID NO：184)    0.024038    0.004808    0.480769    0.846154
      KTVRVPYPKAGAV(SEQ ID
102   NO：185)                         0           0.019231    0           0.048077
103   VRVPYPKAGAVNP(SEQ ID NO：186)    0           0           0           0
104   VPYPKAGAVNPTV(SEQ ID NO：187)    0           0.004808    0           0.168269
105   YPKAGAVNPTVKF(SEQ ID NO：188)    0           0           0.509615    0
106   KAGAVNPTVKFFV(SEQ ID NO：189)    0           0.245192    0.014423    3.235577
107    GAVNPTVKFFVVN(SEQ ID NO：190)    8.730769     10.5625    11.230769    25.057692
108    VNPTVKFFVVNTD(SEQ ID NO：191)    0            1.331731   1.283654     11.1875
109    PTVKFFVVNTDSL(SEQ ID NO：192)    0            0          0.408654     0.004808
110    VKFFVVNTDSLSS(SEQ ID NO：193)    0            0.024038   0            0
111    FFVVNTDSLSSVT(SEQ ID NO：194)    0            0          0            0
112    VVNTDSLSSVTNA(SEQ ID NO：195)    0            0          0            0.043269
113    NTDSLSSVTNATS(SEQ ID NO：196)    0            0.028846   0.168269     0.004808
114    DSLSSVTNATSIQ(SEQ ID NO：197)    0            0.004808   0.033654     0
115    LssVTNATSIQIT(SEQ ID NO：198)    0            0.067308   0.0625       0.004808
116    SVTNATSIQITAP(SEQ ID NO：199)    0            0.038462   0            0
117    TNATSIQITAPAS(SEQ ID NO：200)    0            0.009615   0            0.120192
118    ATSIQITAPASML(SEQ ID NO：201)    0            0          0            0
119    SIQITAPASMLIG(SEQ ID NO：202)    0            0.024038    0           0
120    QITAPASMLIGDH(SEQ ID NO：203)    0            0.033654    0.466346    0
121    TAPASMLIGDHYL(SEQ ID NO：204)    0.019231     2.081731    0.168269    0.096154
122    PASMLIGDHYLCD(SEQ ID NO：205)    0            0.307692    0           0.014423
123    SMLIGDHYLCDVT(SEQ ID NO：206)    0.009615     0.4375      5.254808    7.514423
124    LIGDHYLCDVTWA(SEQ ID NO：207)    23.269231    12.663462   17.538462   0.913462
       GDHYLCDVTWATQ(SEQ ID
125    NO：208)                         3.769231     1.798077    0.620192    0.057692
       HYLCDVTWATQER(SEQ ID
126    NO：209)                         3.072115     0.033654    0.009615    0.245192
127    LCDVTWATQERIS(SEQ ID NO：210)    0.009615     0.009615    1.283654    0.024038
128    DVTWATQERISLQ(SEQ ID NO：211)    0.278846     0.105769    0.043269    0.125
129    TWATQERISLQWL(SEQ ID NO：212)    72.225962    23.307692   9.456731    9.807692
130    ATQERISLQWLRR(SEQ ID NO：213)    10.014423    4.302885    1.855769    4.427885
131    QERISLQWLRRIQ(sEQ ID NO：214)    38.365385    5.254808    2.9375      2.778846
132    RISLQWLRRIQNY(SEQ ID NO：49)     209.283654   113.028846  31.177885   69.014423
133    SLQWLRRIQNYSV(SEQ ID NO：124)    45.5         6.509615    9.288462    12.918269
134    对照                             11.682692    0.538462    13.995192   22.1875
135    对照                             8.269231     0.572115    14.625      18.903846
136    对照                             10.235577    0.581731    12.245192   18.4375
137    对照                             9.600962     0.923077    11.855769   15.903846
138    对照                             12.75        1.096154    14.259615   20.375
139    对照                             10.3125      0.264423    14.586538   16.600962
140    对照                             15.485577    1.461538    14.004808   23.466346
141    对照                             13.721154    1.596154    15.317308   26.552885
142    对照                             12.259615    1.086538    15.908654   24.144231
143    对照                             10.322115    0.899038    13.5        22.610577
144    对照                             10.572115    0.600962    16.177885   25.081731
图24显示，rhuMAB 409(包含CM03 VH和VL)对肽6(YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO：45))、35(LEYNYVKQ WRHSY(SEQID NO：46))、55(TWSPVGHKLAYVW(SEQ ID NO：47))、84(LWWSPNGTFLAYA(SEQ ID NO：48))和132(RISLQ WLRRIQNY(SEQ ID NO：49))具有最高的反应性。每一个这些峰都与重叠的13mer肽伴随着更小的峰。
与不连续序列的反应性表明不连续或构象的表位。图25显示人CD26_1J2E晶体结构的带状图，上文鉴定的反应性肽为更亮颜色。人CD26的等效物为公众可获得的(www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/MMDB/mmdb.shtml；参考文献：PubMed；MMDB：25581；PDB：1J2E；说明：人二肽基肽酶IV的晶体结构(Crystal Structure of Human Dipeptidyl Peptidase)；证明：H.Hiramatsu等人)。所述三维结构表明，当抗原在其三维状态中时，这些线性不连续的序列相互靠近。这进一步确认，这可能是不连续或构象的表位。再次地，应注意，由于在这些实验中只代表了48-324位的氨基酸，所以可能在这些序列外存在其它反应性区域。
RhuMAB411对肽6(YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO：45))、37(YVKQWRHSYTASY(SEQ ID NO：50))、55(TWSPVGHKLAYVW(SEQ ID NO：47))、79(EEEVFSAYSALWW(SEQ ID NO：51))和132(RISLQWLRRIQNY(SEQ ID NO：49)具有最高反应性。每一个这些峰也都与13mer肽伴随更小的峰。
与不连续序列的反应性再次表明不连续或构象的表位。图26显示人CD26_1J2E晶体结构的带状图，所述人CD26_1J2E具有上文突出显示的鉴定的反应性肽。三维结构表明，当抗原在其三维状态中时，这些线性不连续的序列相互靠近，进而证实这个表位的不连续特性。
RhuMAB412对肽29(DYSISPDGQFILL(SEQ ID NO：52))、30(SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO：53))和55(TWSPVGHKLAYVW(SEQID NO：47))具有最高反应性。每一个这些峰都与重叠的13mer肽伴随着更小的峰。图27显示人CD26_1J2E晶体结构的带状图，所述人CD26_1J2E具有上文突出显示的鉴定的活性肽。三维结构表明，当抗原在其三维状态中时，这些线性、不连续的序列相互靠近，进而表明不连续或构象的表位。
RhuMAB420对肽29(DYSISPDGQFILL(SEQ ID NO：52))、30(SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO：53))、55(TWSPVGHKLAYVW(SEQID NO：47))和63(IYVKIEPNLPSYR(SEQ ID NO：54))具有最高反应性。每一个这些峰都与重叠的13mer肽伴随着更小的峰。图28显示人CD26_1J2E晶体结构的带状图，所述人CD26_1J2E具有上文突出显示的鉴定的活性肽。三维结构表明，当抗原在其三维状态中时，这些线性、不连续的序列相互靠近，再次表明不连续或构象的表位。
实施例4-示例性的重组重链和轻链抗体序列
人源化的IgG1抗体可以用本领域常规技术人员已知的方法在细胞例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生产，所述的人源化IgG1抗体包含X392Fab的VH和VL或其它本文所述的VH和/或VL序列。下文提供了包含X392Fab的VH和VL的人源化IgG1抗体的一些示例性序列。
A.编码示例性重链和轻链的DNA序列
下文提供了编码人源化抗体重链和轻链的示例性核苷酸序列，所述人源化抗体包含X392 Fab的VH和VL。编码的蛋白质包括与VH和VL序列融合的信号序列。(编码信号序列的序列用下划线表示，并且编码可变区的序列用粗斜体表示。)
重链(SEQ ID NO：215)：
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCC
Figure A20068003493701101
Figure A20068003493701102
GCAAGCACCAAAGGCCCATCGGTATTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAG
AGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGA
ACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC
CGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCC
TCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCA
ACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATG
CCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCC
CAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTG
GTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCG
TGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTA
CCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT
ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC
AAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGG
ATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCC
AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAG
ACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACC
GTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATG
AGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
轻链(SEQ ID NO：216)：
ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGATGCCAG
ATGT
Figure A20068003493701112
Figure A20068003493701113
CGTACGGTGGCTGCACCA
TCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTT
GTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGG
ATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAA
GGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAG
AAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAC
AAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
B.示例性重链和轻链的蛋白质序列
下文提供了包含X392Fab的VH和VL的人源化抗体重链或轻链的蛋白质序列。重链和轻链序列显示为与信号序列融合。(信号序列用下划线表示，并且可变区用粗斜体表示。)
重链(SEQ ID NO：217)：
MEWSWVFLFFLSVTTGVHS
Figure A20068003493701121
Figure A20068003493701122
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV
TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK
KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA
LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP
ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
GK
轻链(SEQ ID NO：218)：
MSVPTQVLGLLLLWLTDARC
Figure A20068003493701124
Figure A20068003493701125
Figure A20068003493701126
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG
NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
实施例5-示例性MTT测试步骤
示例性MTT测试步骤如下：
用编码全长人CD26的质粒转染Jurkat细胞，并在200μg/ml G418下筛选。将细胞每三天按1∶5传代来维持＞95％的生存力。在测定前大约48小时，通过在1100rpm旋转5分钟来将旋转培养基(spinning medium)完全替换为新鲜的生长培养基(37℃)。(测试培养基与生长培养基相同：87mL RPMI-1640液体培养基(Hyclone：SH30027-02)；10mL FCS(56℃处理30分钟)；0.5mL青霉素/链霉素(100μg/mL)；2mL G418(Calbiochem，在PBS中100mg/ml)和2mL L-谷氨酰胺(200mM，Hyclone，#SH30034.01)。通过这种方法，当进行检测时，细胞生存力可以为97-99％。细胞生存力必须至少为95％。
将细胞在1100rpm、5分钟(Beckman Benchtop离心机)离心下来，并彻底弃去培养基。将细胞重悬在5-10ml完全培养基中进行T75细颈瓶培养。将0.01mL细胞悬浮物与0.01mL台盼蓝(0.125％(1×)，VWR，#VWb721-0)混合。取0.01mL置入血细胞计数器，并计数总细胞和死细胞。每毫升细胞数如下计算：总细胞数/4×稀释倍数×10,000＝细胞/mL。活细胞％＝(总细胞-死细胞)/总细胞×100。然后将细胞用完全生长培养基稀释为每mL约106个活细胞。将0.05mL/孔的种子细胞转移入96孔板的中央60孔中，并用生长培养基以0.1mL/孔填充边缘的孔。
将抗体样品用生长培养基在总共0.2mL中稀释成0、0.1、0.2、1.0、5和10μg/mL。对每个板，都有三份阴性对照，抗体制剂缓冲液(通常为PBS或PBS-T或其它缓冲液)和阳性抗体(鼠)对照。如果抗体样品在生长培养基中稀释大于10倍，那么就不需要抗体制剂缓冲液。用生长培养基填充周围的孔来维持平板的均质微环境。将平板在5％CO2培养箱中、在37℃+/-0.5℃、90％湿度中孵育48小时。
向每孔中加入25μL MTT溶液(5mg/mL MTT)，并继续孵育2小时。(为了制备MTT溶液，将50mg MTT(四唑鎓盐MTT，3-(4，5-二甲基噻唑基-2)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物，Calbiochem，#475989))粉末在室温下溶解在10mL PBS中，并在完全溶解后通过0.2μM膜过滤。)
向每孔中加入0.1mL提取缓冲液，并将平板在37℃孵育12小时或过夜。(为了制备提取缓冲液，称量20g SDS(W/V)粉末、并将其在37℃溶解在50mL MQ水和50mL N，N-二甲基甲酰胺中。当温度与周围平衡后，将pH用1M HCl调整到4.7。最后，加入CHX(环己亚酰胺，Calbiochem，239764-100MG)至终浓度为20μg/mL。)将平板中的提取物通过上下吹吸5次来混合，并完全排出接头中的溶液。在570nm对平板读数。抑制率(肿瘤细胞增殖抑制)通常如下计算：抑制率(％)＝1-(Mab处理孔的Ab/培养基对照孔的Ab)。
也参考Ho等人，(2001).Clinical Cancer Res.第7卷，2031-2040。
实施例6-rhuMAb 411在荷有Karpas 299T细胞淋巴瘤异种移植物的 NCR裸鼠中的效力
本研究的目的在于检测rhuMAb 411抑制Karpas 299T细胞淋巴瘤异种移植物生长的能力。在植入肿瘤细胞七天后，比较单独的rhuMAb 411和单独的紫杉醇
Figure A20068003493701141
以及紫杉醇
Figure A20068003493701142
加rhuMAb 411的效果。
材料：细胞系：Karpas 299，是人CD26阳性的T细胞淋巴瘤系，并且获自德国Braunschweig的DSMZ德国微生物保藏和细胞培养中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)，并在Cell&Molecular Technologies，Inc.Phillipsburg，NJ.储存和运送。
动物：从Taconic(Germantown，NY)获得的雌性NCR无胸腺小鼠，具有18-22g的体重，并且大约5-6周龄。
RhuMAb 411：BDS(大量药物物质)，1.0ml/管，10.3mg/ml。在LonzaBiologies，Slough，UK生产的溶于PBS，pH 7.0的货号#D0679。
培养基和缓冲液：RPMI-1640培养基(Cat#15-040-CV)和磷酸缓冲盐(PBS，Cat#21-040-CV)购自Mediatech，Inc.，Herndon，VA。
紫杉醇(TaxolCat#T7402)和二甲基亚砜(DMSO，Cat#D2438)获自Sigma，St.Louis，MO。
方法：在100只动物右肋皮下植入在100μl RPMI-1640培养基中的4-6×106个Karpas 299细胞。当肿瘤大小达100mm3时，将小鼠分组，并如下所述静脉内(i.v.)施用100μl溶液。
组1，接受载体(PBS)；组2接受10mg/kg紫杉醇(为在含20％DMSO的PBS中的10mg/ml溶液)；组3、4、5分别接受3、10和30mg/Kg rhuMAb411抗体。组6接受10mg/kg rhuMAb 411和10mg/kg紫杉醇的组合。每组10只小鼠通过尾静脉进行大丸剂静脉注射接受每周3次、共5周的处理。
每周测量肿瘤体积2次，并每周测量体重一次。记录毒性或恶化的征兆，并根据需要处死动物。出于人道目的，处死任何呈现20％或更多体重损失的动物。
结果：如图29所示，施用rhuMAb 411在所有所用剂量都导致肿瘤皱缩、并在许多情况中完全消失，而在施用对照抗体(人IgG)或紫杉醇
Figure A20068003493701151
的动物中观察到稳定的肿瘤生长，所述紫杉醇
Figure A20068003493701152
为在当前肿瘤学护理标准中常规使用的药物。在rhuMAb 411处理期间，体重得到维持，并且未观察到明显毒性。(数据未显示。)这种肿瘤杀伤是CD26依赖性的，并且认为是由受抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、通过细胞内的信号通路诱导的程序性细胞死亡(细胞溶解活性)、补体依赖性细胞毒性(CDC)或这些机制的组合介导。
相反地，发现rhuMAb 411在植入A375的异种移植小鼠模型中不具有效力，所述的A375为人黑素瘤细胞系，其不表达显著水平的CD26蛋白质(数据未显示。)
实施例7-rhuMAb 411在荷有786-O(肾癌)异种移植物的SCID小鼠中 的效力
本研究的目的在于检测rhuMAb 411抑制786-O肾癌异种移植物生长的能力。比较单独的rhuMAb 411和PBS、一般的抗癌化合物(顺铂和紫杉醇
Figure A20068003493701153
)加rhuMAb 411的效应。
材料：细胞系：786-O，为人CD26阳性的肾癌系，并获自ATCC。
动物：从Taconic(Germantown，NY)获得的雌性CB17 SCID小鼠，具有18-22g的体重，并且大约5-6周龄。
顺铂购自Sigma(Cat#P9394)。
基质胶(Matrigel)从BD Biosciences(Cat#356237)获得。
HBSS从ATCC(Cat#30-2213)获得。
本研究中的所有其它材料与上文实施例6中所述材料相同。
方法：在70只动物右肋皮下植入在100μl HBSS和基质胶(HBSS∶基质胶＝1∶1)中的5×106个786-O细胞。当肿瘤大小达100mm3时，将小鼠分组，并如下所述腹膜内(i.p.)施用100μl溶液：
组1，接受载体(PBS)；组2、3、4分别接受3、10和30mg/Kg的rhuMAb 411抗体；组5接受30mg/kg的rhuMAb 411、10mg/kg紫杉醇和2mg/Kg顺的组合。除了顺铂仅给药1次外，每组10只小鼠通过腹膜内注射(i.p.)接受每周2次、共3周的处理。
每周测量肿瘤体积2次，并每周测量体重一次。记录毒性或恶化的征兆，并根据需要处死动物。出于人道目的，处死任何呈现20％或更多体重损失的动物。
结果：如图30所示，相比载体处理的动物，在rhuMAb 411处理的动物中786-O肿瘤的生长受到显著抑制。虽然在我们的研究中未完全清除786-O肿瘤，但用rhuMAb 411处理存在显著的瘤生长延迟。此外，单独的高剂量rhuMAb 411(30mg/Kg)起到与顺铂和紫杉醇组合相同的效果。在rhuMAb 411处理期间，体重得到维持，并且未观察到明显的毒性。(数据未显示。)
实施例8-rhuMAb 411在荷有Caki-2(肾癌)异种移植物的NCR裸鼠中 的效力和剂量范围
本研究的目的在于检测rhuMAb 411以剂量依赖方式抑制Caki-2肾癌异种移植物生长的能力。将rhuMAb 411与载体对照以及与化学疗法化合物组合的效应进行比较。
材料：细胞系：Caki-2，人CD26阳性的肾癌系，并且获自ATCC。
动物：从Taconic(Germantown，NY)获得的雌性NCR裸鼠，具有18-22g体重，并且大约5-6周龄。
多西紫杉(cat#01885)和阿霉素(Cat#D515)从Sigma获得。
本研究中的所有其它材料与上文实施例6-7中所述材料相同。
方法：在100只动物右肋皮下植入在100μl HBSS和基质胶(HBSS∶基质胶＝1∶1)中的1×106个Caki2细胞。当肿瘤大小达100mm3时，将小鼠分组，并如下所述腹膜内(i.p.)施用100μl溶液：
组1，接受载体(PBS)；组2、3、4和5分别接受1、3、10和30mg/KgrhuMAb 411抗体；组6接受30mg/kg rhuMAb 411、10mg/kg紫杉醇、2mg/Kg顺铂、2mg/kg多西紫杉和8mg/kg阿霉素的组合。组7除不含rhuMAb 411，所有其它同组6。研究期间，除了化学疗法化合物(顺铂、紫杉醇、多西紫杉和阿霉素)仅通过腹膜内给药1次外，每组10只小鼠通过腹膜内接受每周2次、共3周的处理。
每周测量肿瘤体积2次，并每周测量体重一次。记录毒性或恶化的征兆，并根据需要处死动物。出于人道目的，处死任何呈现20％或更多体重损失的动物。
结果：如图31所示，与载体处理的动物相比，在rhuMAb 411处理的动物中Caki-2肿瘤的生长受到显著抑制，而且，这种rhuMAb 411抑制作用显示为剂量依赖方式。如图32所示，与单独的化合物相比，rhuMAb 411加上化学疗法化合物呈现更强的抑制效应，这表明使用联合疗法增加了效力。在rhuMAb 411处理期间，体重得到维持，并且没有观察到明显的毒性。(数据未显示。)
实施例9-rhuMAb 411在荷有PC-3(前列腺癌)异种移植物的SCID 小鼠中的效力
本研究的目的在于检测rhuMAb 411抑制PC-3前列腺癌异种移植物生长的能力。比较rhuMAb 411相对载体对照以及与化学疗法化合物的组合的效力。
材料：细胞系：PC-3，人CD 26阳性的前列腺癌系，并且从ATCC获得。
动物：从Taconic(Germantown，NY)获得的雄性CB17 SCID小鼠，具有18-22g体重，并且为大约5-6周龄。
本研究中的所有其它材料与上文实施例6-8中所述材料相同。
方法：在80只动物右肋皮下植入在100μl HBSS和基质胶(HBSS∶基质胶＝1∶1)中的3×106个PC3细胞。当肿瘤大小达100mm3时，将小鼠分组，并如下所述腹膜内施用100μl溶液：
组1，接受载体(PBS)；组2、3和4分别接受3、10和30mg/kg rhuMAb411抗体；组5接受2mg/kg顺铂和10mg/kg多西紫杉的组合。组6除接受30mg/kg rhuMAb 411外，所有其它与组5相同。除化学疗法化合物(顺铂和多西紫杉)仅通过腹膜内一周一次、共施用两周外，每组10只小鼠通过腹膜内注射(i.p.)接受每周3次、共3周的处理。
每周测量肿瘤体积2次，并每周测量体重一次。记录毒性或恶化的征兆，并根据需要处死动物。出于人道目的，处死任何呈现20％或更多体重损失的动物。
结果：如图33所示，与载体处理的动物相比，在用rhuMAb 411处理的动物中PC-3肿瘤的生长受到显著抑制。此外，如图34所示，rhuMAb 411加上化学疗法化合物呈现比仅用化合物更强的抑制效应，这表明使用联合疗法增加了效力。在rhuMAb 411处理期间，体重得到维持，并且没有观察到明显的毒性。(数据未显示。)
实施例10-rhuMAb 411在荷有DU-145(前列腺癌)异种移植物的 Ncr裸鼠中的效力
本研究的目的在于检测rhuMAb 411抑制DU-145前列腺癌异种移植物生长的能力。比较rhuMAb 411相对载体对照的效力。
材料：细胞系：DU-145，人CD26阳性的前列腺癌系，并从ATCC获得。
动物：从Taconic(Germantown，NY)获得的雄性NCR裸鼠，具有18-22g体重，并且为大约5-6周龄。
本研究中的所有其它材料与上文实施例6-10中所述材料相同。
方法：在30只动物右肋皮下植入在100μl HBSS和基质胶(HBSS∶基质胶＝1∶1)中的3×106个DU145细胞。当肿瘤大小达100mm3时，将小鼠分组，并如下所述腹膜内施用100μl溶液：
组1，接受载体(PBS)；组2接受30mg/kg的rhuMAb 411抗体。每组10只小鼠通过腹膜内注射(i.p.)接受每周2次、共3周的处理。
每周测量肿瘤体积2次，并每周测量体重一次。记录毒性或恶化的征兆，并根据需要处死动物。出于人道目的，处死任何呈现20％或更多体重损失的动物。
结果：如图35所示，与载体处理的动物相比，在用rhuMAb 411处理的动物中DU-145肿瘤的生长受到显著延迟。在rhuMAb 411处理期间，体重得到维持，并且没有观察到明显毒性。(数据未显示。)
实施例11-rhuMAb 411在H226肺癌转移模型中的效力
本研究的目的在于检测rhuMAb 411抑制由H226诱导的癌转移的能力。比较rhuMAb 411相对载体对照的效力。
材料：细胞系：H226，人CD26阳性的肺癌系，并从ATCC获得。
动物：从Taconic(Germantown，NY)获得的雌性NCR裸鼠，具有18-22g体重，并且为大约5-6周龄。
本研究中的所有其他材料与实施例6-10所描述的相同。
方法：向16只动物通过尾静脉注射1×104个H226细胞，并分成两组，每组8只小鼠。组1，接受100μl载体(PBS)；组2接受相同体积的30mg/kg的rhuMAb 411抗体。两组都通过腹膜内注射每周2次、共处理3周。起始施用4周后，处死动物，并取出肺。计数每组小鼠肺中转移的总数。
结果：如图36所示，与载体对照相比，施用rhuMAb 411导致低很多的转移发生。平均值为PBS组中的67.25，而rhuMAb 411处理组中的10.5。在rhuMAb 411处理期间，体重得到维持，并且没有观察到明显毒性。(数据未显示。)
实施例11-rhuMAb 411的结合亲和性
RhuMAb 411通过用谷氨酰胺合成酶表达系统(GS System；LonzaBiologies，Slough，UK)在哺乳动物(中国仓鼠卵巢)细胞悬浮培养物中发酵来产生。RhuMab 411与人CD26(hu-CD26)的结合亲和性用标准的Biacore方法测定。也测定了鼠单克隆抗体14D10与人CD26的结合亲和性。这些结合研究的结果在下文表12中给出。
表12
  抗体   Kon/SE(M-1秒-1)   Koff/SE(秒-1)   KD(M)
  14D10   0.59E+05/1.19E+04   8.29E-04/3.40E-06   1.63e-9
  rhuMAb 411   2.72E+05/1.11E+03   6.63E-05/1.91E-07   2.44e-10
在全细胞结合测试中，发现rhuMAb 411以相似的亲和性结合在Karpas-299膜中的内源CD26和可溶性人CD26。(数据未显示)
实施例12-CD26在癌细胞系中的表达
通过流式细胞仪在多种癌细胞系中测定了CD26细胞表面表达的水平和比率。在这项研究中检测的癌细胞系在下文表13中列出。
表13
  名称   肿瘤来源   供货商   目录号
  K562   白血病细胞   ATCC   CLL-243
  MDA-MD-231   乳腺癌细胞   ATCC   HTB-26
  HT-29   结肠直肠细胞系   ATCC   HTB-38
  DU145   前列腺细胞   ATCC   HTB-81
  PC-3   前列腺细胞   ATCC   CRL-1435
  C3A   肝癌   ATCC   CRL-10741
  Caki1   肾癌细胞   ATCC   HTB-46
  Caki2   肾癌细胞   ATCC   HTB-47
  786O   肾癌细胞   ATCC   CRL-1932
  Karpas 299   T细胞淋巴瘤   DSMZ   ACC31
  H226   肺癌   ATCC   CRL-5826
  J82   膀胱细胞系   ATCC   HTB-1
材料和方法：用Invitrogen(Carlsbad，California)提供的试剂盒将RhuMAb与Alex-488缀合。悬浮细胞直接使用，而贴壁细胞系用无酶试剂解离。所有细胞的90-100％汇片。细胞用含10％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲盐(PBS)通过离心(1200rpm，5分钟)洗涤。将细胞(100,000个)悬浮在双份的40μl PBS/BSA、4nM rhuMAb411-Alexa-488中。对于阴性对照，将rhuMAb411-Alexa-488用人IgG1取代。将细胞在室温下轻柔搅拌孵育1-2小时。加入200μl PBS/BSA来将细胞稀释为～500,000个/ml。然后在96孔板中用Guava EasyCyteTM流式细胞仪(GuavaTechnologies，Hayward，California)分析细胞。数据分析用GuavaExpressTM Plus软件进行。
结果：图37中显示缀合有Alexa-488的rhuMAb411的流式分析结果。CD26细胞表面表达的显著水平和百分比在一些癌细胞类型尤其是肾癌、前列腺癌、肺癌和Karpas 299癌细胞系中是明显的。
实施例13-产生和纯化rhuMAb 411的其它示例性方法
下文提供了通过用Lonza Biologies，Inc.创建的谷氨酰胺合成酶(GS)表达系统在哺乳动物(中国仓鼠卵巢)细胞悬浮培养物中发酵来产生重组性抗体rhuMAb411、及其后续纯化的非限制性实例。抗体为IgG1κ，分子量为144672道尔顿。
序列：rbuMAb 411重链的多肽序列如下：
EVQLVESGAGVKQPGGTLRLTCTASGFSLTTYGVHWVRQAPGKGLEWVGVIWGDGR
TDYDAAFMSRVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMRNRHDWFDYWGQGTT
VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP
AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK
TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP
QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF
LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：219)。
rhuMAb 411轻链的多肽序列如下：
DILLTQSPSSLSATPGERATITCRASQGIRNNLNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDVAAYYCQQSIKLPFTFGSGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：220)。
载体构建：将rhuMAb 411的重链可变区与编码IgG1za恒定区的cDNA序列组合来产生重链单基因载体(SGV)。将轻链可变区克隆入Lonza专利载体(Lonza′s proprietary vector)pConKappa来形成轻链单基因载体。双基因载体如下构建，即通过将来自重链载体的完整表达盒连接入轻链载体来产生表达rhuMAb 411完整重链和轻链两者的单一载体。大量制备双基因载体(DGV)，并用限制性酶PvuI线性化来转染入CHO细胞。对载体中克隆的重链和轻链基因片段进行测序用于确认构建体，并发现其匹配预期序列。在瞬时转染系统中用CHO细胞检测了双基因载体的抗体表达，并显示为正确折叠的表达，并分泌抗体。鉴定了双基因载体克隆以用于进一步的用途，并重新命名为pY392/DGV/YsCH1-3(图38)。
建立和筛选表达IgG1/κ抗体rhuMAb 411的GS-CHO细胞系：使用GS-CHO来产生抗体rhuMAb 411，所述GS-CHO为Lonza Biologies，Inc.(S10ugh，UK)的CHOK1SV细胞系。建立转染了双基因载体的GS-CHO细胞系，所述双基因载体含有编码IgG1抗体rhuMAb 411的重链和轻链基因。
用电穿孔法将双基因载体转染CHOK1SV细胞，并在多个96孔板中铺开。这些转染中有四次是在含有培养基CM25/10％透析的胎牛血清(dFCS)(Lonza Biologies，Inc.)的蛋白质中进行的。剩下的两次转染用无蛋白质的转染方法在化学成分明确的无动物补体(CDACF)的培养基CD-CHO中进行。转染之后的天，向96孔板的每个孔中加入选择剂氨磺酰L-蛋氨酸(L-methionine sulphoximine)(MSX)来给出50μM的终浓度。
用半定量ELISA法对所得转染子的上清进行组装抗体的筛选。所有筛选的转染子都产生可检测水平的抗体。从这些数据，选择一些转染子(得自包含蛋白质的转染子和得自无蛋白质的转染子)来进行进一步的评估，所述评估基于其相对的抗体浓度和生长的视觉判断。第二轮筛选基于生产量数据进行。二十八个包含蛋白质的转染子成功地适应在无蛋白质的培养基中生长。四个所选的无蛋白质的转染子不需要任何适应。
在检查了分批喂饲摇瓶培养物的生长和生产量数据后，细胞系用下列选择标准进行筛选：高收获抗体浓度、高特异生产率和可接受的生长特性。经纯化抗体的产物质量通过SDS-PAGE或IEF分析。
编码rhuMAb 411抗体的基因序列在所选细胞系(本文也称为“rhuMAb411M”)中的完整性通过将它们与建立细胞系的DNA载体的基因序列进行比较来证实。从细胞系rhuMAb411M中分离总RNA，并将其作为模板来合成cDNA。通过PCR法特异扩增编码轻链(LC)和重链(HC)的序列，其中使用与5’非翻译区(UTR)和3’-UTR的链编码序列退火的引物。使用选择的引物集合对所得DNA产物测序，其中所述的引物集合允许LC和HC PCR产物的整个cDNA片段在正向和反向两个方向都能测序。存在于细胞系rhuMAb411M中的编码rhuMAb 411抗体的LC的转录本与用来产生rhuMAb411M细胞系的rhuMAb 411编码载体(pY392/DGV/YsCH1-3)中的序列相同。对于HC，检测的主要RNA种类编码与存在于rhuMAb 411编码载体(pY392/DGV/YsCH1-3)中相同的HC序列。
产生rhuMAb 411的方法：RhuMAb 411自GS-CHO细胞的主细胞库产生。用充分定义的培养基向生物反应器接种有活力的细胞浓度，并在稳定和控制的条件下维持发酵。将收获物装入连续叠加的圆盘离心机，然后将滤液收集入生物加工容器(BPC)，并在纯化前储存在4℃.
发酵和分离过程包括下列依次列出的步骤：解冻安瓿、摇瓶接种、接种Wave Bioreactor
Figure A20068003493701241
空运发酵罐接种、发酵、发酵收集、圆盘堆积离心(Westfalia SA1)、后离心过滤(2阶段凸片式(lenticular)过滤)、0.22微米过滤和纯化。
rhuMAb 411的纯化：抗体纯化过程包括下列依次列出的步骤：A蛋白亲和层析、病毒灭活(低pH(pH 3.7+/-0.1)控制)、疏水相互作用层析、阴离子交换层析、病毒减少过滤(Pall DV20)、浓缩和透析过滤(diafiltration)、过滤(0.2微米)、和填充入容器进行存储(-20℃)。
实施例14-rhuMAb 411的其它示例性制剂
下文表14中提供了rhuMAb的示例性制剂。药物产物可以提供为方便患者施用的液体肠胃外剂型(10mg/mL±1.0mg/mL)。
表14
  成分   每毫升的量
  rhuMAb 411   10mg
  柠檬酸钠，USP   139mg
  柠檬酸，无水的，USP   5.38mg
  蔗糖，颗粒的，USP   600mg
  NaOH或HCl   根据pH所需
  注射用水(WFI)   加至1mL
PCT/RO/134表
申请人或代理人卷号：559332000440  国际申请号：PCT/US2006/028702
与保藏的微生物或其它生物材料有关的声名
(PCT细则第13条之2)
  A.以下指示涉及说明书46页第8-26行所指的保藏的微生物
  B.保藏鉴定                      其它保藏物在另一页鉴定□
  保藏机构名称美国典型培养物保藏中心(ATCC)
  保藏单位地址(包括邮政编码和国家)美国，弗吉尼亚，马纳萨斯20110-2209，Blvd.大学10801
  保藏日                          保藏号2006年6月30日                   PTA-7695
  C.其它声明(如果没有可空出)       此信息在另一页中续[X]
  具有质粒的DH5α大肠杆菌，所述质粒具有抗CD26 cDNA的人源化单克隆抗体的重链和轻链插入片段。菌株名称为S604069.YSTpABmc148(x411)
  D.声明适用的指定国(如果没有可空出)
  E.声明的单独提供(如果没有可空出)
  以下声明以后将提交给国际局(说明声明的一般性特征，如保藏号)
  仅用于接受机构仅用于国际局□该页连同国际申请一起收到       □国际局收到此页
  授权官员                        授权官员

Claims (65)

1. 多肽，其包含：
(a)一个或多个重链CDR，所述重链CDR选自(i)包含序列GX1X2LX3TYGVH(SEQ ID NO：31)的重链CDR1，其中X1是F或Y，X2是S或T，并且X3是T、N或S，(ii)包含序列VIWGX1GRTDYDX2X3FMS(SEQ ID NO：32)的重链CDR2，其中X1是G或D，X2是A或S，并且X3是A或S，和(iii)包含序列X1RHDWFDY(SEQ ID NO：33)的重链CDR3，其中X1是N或S；
(b)一个或多个轻链CDR，所述轻链CDR选自(i)包含序列X1ASQX2IRNX3LN(SEQ ID NO：34)的轻链CDR1，其中X1是S或R，X2是G或D，并且X3是S或N，(ii)包含序列YSSNLX1X2(SEQ ID NO：35)的轻链CDR2，其中X1是H或Q并且X2是S或T，和(iii)包含序列QQSX1KLPX2T(SEQ ID NO：36)的轻链CDR3，其中X1是I或N并且X2是F或L；或者
如(a)中所述的一个或多个重链CDR和如(b)中所述的一个或多个轻链CDR；
其中所述多肽不包含序列
QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：90)的重链可变区和序列
DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWYQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO：91)的轻链可变区这两者。
2. 权利要求1的多肽，其包含如(a)中所述的一个或多个重链CDR。
3. 权利要求2的多肽，其包含
(i)包含序列GX1X2LX3TYGVH(SEQ ID NO：31)的重链CDR1，其中X1是F或Y，X2是S或T，并且X3是T、N或S，(ii)包含序列VIWGX1GRTDYDX2X3FMS(SEQ ID NO：32)的重链CDR2，其中X1是G或D，X2是A或S，并且X3是A或S，和(iii)包含序列X1RHDWFDY(SEQID NO：33)的重链CDR3，其中X1是N或S。
4. 权利要求3的多肽，其还包含
(i)包含序列X1ASQX2IRNX3LN(SEQ ID NO：34)的轻链CDR1，其中X1是S或R，X2是G或D，并且X3是S或N，(ii)包含序列YSSNLX1X2(SEQ ID NO：35)的轻链CDR2，其中X1是H或Q并且X2是S或T，和(iii)包含序列QQSX1KLPX2T(SEQ ID NO：36)的轻链CDR3，其中X1是I或N，并且X2是F或L。
5. 权利要求1的多肽，其中重链CDR1包含选自GFSLTTYGVH(SEQ ID NO：55)、GFSLSTYGVH(SEQ ID NO：56)、和GYSLTTYGVH(SEQ ID NO：57)的序列。
6. 权利要求1的多肽，其中重链CDR2包含选自VIWGDGRTDYDAAFMS(SEQ ID NO：58)和VIWGDGRTDYDSSFMS(SEQ ID NO：59)的序列。
7. 权利要求1的多肽，其中重链CDR3包含序列NRHDWFDY(SEQID NO：60)。
8. 权利要求1的多肽，其包含
(a)重链CDR，所述重链CDR包含
(i)含有序列GFSLTTYGVH(SEQ ID NO：55)的CDR1，
(ii)含有序列VIWGDGRTDYDAAFMS(SEQ ID NO：58)的CDR2，和
(iii)含有序列NRHDWFDY(SEQ ID NO：60)的CDR3；
(b)重链CDR，所述重链CDR包含
(i)含有序列GFSLSTYGVH(SEQ ID NO：56)的CDR1，
(ii)含有序列VIWGDGRTDYDAAFMS(SEQ ID NO：58)的CDR2，和
(iii)含有序列NRHDWFDY(SEQ ID NO：60)的CDR3；或者(c)重链CDR，所述重链CDR包含
(i)含有序列GYSLTTYGVH(SEQ ID NO：57)的CDR1，
(ii)含有序列VIWGDGRTDYDSSFMS(SEQ ID NO：59)的CDR2，和
(iii)含有序列NRHDWFDY(SEQ ID NO：60)的CDR3。
9. 权利要求8的多肽，其还包含
(a)轻链CDR，所述轻链CDR包含
(i)含有序列RASQDIRNNLN(SEQ ID NO：61)的CDR1，
(ii)含有序列YSSNLHS(SEQ ID NO：64)的CDR2，和
iii)含有序列QQSIKLPLT(SEQ ID NO：67)的CDR3；
(b)轻链CDR，所述轻链CDR包含
(i)含有序列RASQGIRNNLN(SEQ ID NO：62)的CDR1，
(ii)含有序列YSSNLQS(SEQ ID NO：65)的CDR2，和
(iii)含有序列QQSIKLPFT(SEQ ID NO：68)的CDR3；或者(c)轻链CDR，所述轻链CDR包含
(i)含有序列SASQDIRNSLN(SEQ ID NO：63)的CDR1，
(ii)含有序列YSSNLHT(SEQ ID NO：66)的CDR2，和
(iii)含有序列QQSNKLPLT(SEQ ID NO：69)的CDR3。
10. 权利要求1的多肽，其包含如(b)中所述的一个或多个轻链CDR。
11. 权利要求10的多肽，其包含
(i)轻链CDR1，所述轻链CDR1包含序列X1ASQX2IRNX3LN(SEQ IDNO：34)，其中X1是S或R，X2是G或D，并且X3是S或N，(ii)轻链CDR2，所述轻链CDR2包含序列YSSNLX1X2(SEQ ID NO：35)，其中X1是H或Q并且X2是S或T，和(iii)轻链CDR3，所述轻链CDR3包含序列QQSX1KLPX2T(SEQ ID NO：36)，其中X1是I或N并且X2是F或L。
12. 权利要求10的多肽，其中轻链CDR1包含选自RASQDIRNLN(SEQ ID NO：61)、RASQGIRNNLN(SEQ ID NO：62)、和SASQDIRNSLN(SEQ ID NO：63)的序列。
13. 权利要求10的多肽，其中轻链CDR2包含选自YSSNLHS(SEQ IDNO：64)、YSSNLQS(SEQ ID NO：65)、和YSSNLHT(SEQ ID NO：66)的序列。
14. 权利要求10的多肽，其中轻链CDR3包含选自QQSIKLPLT(SEQID NO：67)、QQSIKLPFT(SEQ ID NO：68)、和QQSNKLPLT(SEQ IDNO：69)的序列。
15. 权利要求10的多肽，其包含
(a)轻链CDR，所述轻链CDR包含
(i)含有序列RASQDIRNNLN(SEQ ID NO：61)的CDR1，
(ii)含有序列YSSNLHS(SEQ ID NO：64)的CDR2，和
iii)含有序列QQSIKLPLT(SEQ ID NO：67)的CDR3；
(b)轻链CDR，所述轻链CDR包含
(i)含有序列RASQGIRNNLN(SEQ ID NO：62)的CDR1，
(ii)含有序列YSSNLQS(SEQ ID NO：65)的CDR2，和
(iii)含有序列QQSIKLPFT(SEQ ID NO：68)的CDR3；或者(c)轻链CDR，所述轻链CDR包含
(i)含有序列SASQDIRNSLN(SEQ ID NO：63)的CDR1，
(ii)含有序列YSSNLHT(SEQ ID NO：66)的CDR2，和
(iii)含有序列QQSNKLPLT(SEQ ID NO：69)的CDR3。
16. 权利要求1的多肽，其包含如(a)中所述的一个或多个重链CDR和如(b)中所述的一个或多个轻链CDR。
17. 权利要求1的多肽，其中所述多肽还包含
(a)一个或多个重链构架区，所述一个或多个重链构架区选自(i)包含序列EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9AS(SEQ ID NO：37)的重链FR1，其中X1是E或Q，X2是A或G，X3是G或E，X4是L或V，X5是V，K，或E，X6是G或E，X7是T或S，X8是T或S，并且X9是T或K；(ii)包含序列WVRQAPGKGLEWX1G(SEQ ID NO：38)的重链FR2，其中X1是V或M，(iii)包含序列RVTISX1DX2SKX3TX4YLQX5NSLRAEDTAVYYCX6R(SEQ ID NO：39)的重链FR3，其中X1是K或R，X2是N或T，X3是S或N，X4是V或A，X5是M或L，并且X6是V、M、或T，和(iv)包含序列WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：40)的重链FR4；
(b)一个或多个轻链构架区，所述一个或多个轻链构架区选自(i)包含序列X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9C(SEQ ID NO：41)的轻链FR1，其中X1是D或E，X2是L或E，X3是M或L，X4是A或V，X5是S或T，X6是L、P、或A，X7是D或E，X8是V或A，并且X9是T或S，(ii)包含序列WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO：42)的轻链FR2，(iii)包含序列GVPX1RFSGSGSGTDFTLTISRLX2X3EDX4AX5YYC(SEQ ID NO：43)的轻链FR3，其中X1是S、D、或A，X2是E或Q，X3是P或A，X4是F或V，并且X5是T、A、或I，和(iv)包含序列FGSGTKVEIK(SEQ IDNO：44)的轻链FR4；或
(c)如(a)中所述的一个或多个重链构架区和如(b)中所述的一个或多个轻链构架区。
18. 多肽，其包含
(a)由EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX10X11LX12TYGVHWVRQAPGKGLEWX13GVIWGX14GRTDYDX15X16FMSRVTISX17DX18SKX1 9TX20YLQX21NSLRAEDTAVYYCX22RX23RHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：29)组成的氨基酸序列，其中X1是E或Q，X2是A或G，X3是G或E，X4是L或V，X5是V，K，或E，X6是G或E，X7是T或S，X8是T或S，X9是T或K，X10是F或Y，X11是S或T，X12是T，N，或S，X13是V或M，X14是G或D，X15是A或S，X16是A或S，X17是K或R，X18是N或T，X19是S或N，X20是V或A，X21是M或L，X22是V、M、或T，并且X23是N或S；
(b)由X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9CX10ASQX11IRNX12LNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLX13X14GVPX15RFSGSGSGTDFTLTISRLX16X17EDX18AX19YYCQQSX20KLPX21TFGSGTKVEIK(SEQ ID NO：30)组成的氨基酸序列，其中X1是D或E，X2是L或E，X3是M或L，X4是A或V，X5是S或T，X6是L，P，或A，X7是D或E，X8是V或A，X9是T或S，X10是S或R，X11是G或D，X12是S或N，X13是H或Q，X14是S或T，X15是S，D，或A，X16是E或Q，X17是P或A，X18是F或V，X19是T，A，或I，X20是I或N并且X21是F或L；或者
(c)(a)中所述的氨基酸序列和(b)中所述的氨基酸序列这两者。
19. 多肽，其包含：
(a)与选自SEQ ID NO：15-21的氨基酸序列具有至少约80％同一性的氨基酸序列；
(b)与选自SEQ ID NO：22-28的氨基酸序列具有至少约80％同一性的氨基酸序列；或
(c)如(a)中所述的氨基酸序列和如(b)中所述的氨基酸序列；
其中所述多肽不包含序列QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：90)的重链可变区和序列DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWYQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO：91)的轻链可变区这两者。
20. 权利要求19的多肽，其包含
(a)与选自SEQ ID NO：15-21的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列；
(b)与选自SEQ ID NO：22-28的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列；或
(c)如(a)中所述的氨基酸序列和如(b)中所述的氨基酸序列。
21. 权利要求20的多肽，其包含
(a)选自SEQ ID NO：15-21的氨基酸序列；
(b)选自SEQ ID NO：22-28的氨基酸序列；或
(c)如(a)中所述的氨基酸序列和如(b)中所述的氨基酸序列。
22. 权利要求21的多肽，其包含
(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO：26的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO：15的轻链可变区；
(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO：22的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO：18的轻链可变区；
(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO：28的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO：19的轻链可变区；或
(d)含有氨基酸序列SEQ ID NO：23的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO：19的轻链可变区。
23. 多肽，其包含：
(a)一个或多个重链构架区，所述一个或多个重链构架区选自(i)包含序列EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9AS(SEQ ID NO：37)的重链FR1，其中X1是E或Q，X2是A或G，X3是G或E，X4是L或V，X5是V，K，或E，X6是G或E，X7是T或S，X8是T或S，并且X9是T或K；(ii)包含序列WVRQAPGKGLEWX1G(SEQ ID NO：38)的重链FR2，其中X1是V或M，(iii)包含序列RVTISX1DX2SKX3TX4YLQX5NSLRAEDTAVYYCX6R(SEQ ID NO：39)的重链FR3，其中X1是K或R，X2是N或T，X3是S或N，X4是V或A，X5是M或L，并且X6是V、M、或T，和(iv)包含序列WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：40)的重链FR4；
(b)一个或多个轻链构架区，所述一个或多个轻链构架区选自(i)包含序列X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9C(SEQ ID NO：41)的轻链FR1，其中X1是D或E，X2是L或E，X3是M或L，X4是A或V，X5是S或T，X6是L，P，或A，X7是D或E，X8是V或A，并且X9是T或S，(ii)包含序列WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO：42)的轻链FR2，(iii)包含序列GVPX1RFSGSGSGTDFTLTISRLX2X3EDX4AX5YYC(SEQ ID NO：43)的轻链FR3，其中X1是S、D、或A，X2是E或Q，X3是P或A，X4是F或V，并且X5是T、A、或I，和(iv)包含序列FGSGTKVEIK(SEQ IDNO：44)的轻链FR4；或者
(c)如(a)中所述的一个或多个重链构架区和如(b)中所述的一个或多个轻链构架区；
其中所述多肽不包含序列QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：90)的重链可变区和序列DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWYQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO：91)的轻链可变区这两者。
24. 结合至一个或多个肽的抗体，所述一个或多个肽选自YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO：45；肽6)，LEYNYVKQWRHSY(SEQ ID NO：46；肽35)，TWSPVGHKLAYVW(SEQ ID NO：47；肽55)，LWWSPNGTFLAYA(SEQ ID NO：48；肽84)，RISLQWLRRIQNY(SE Q ID NO：49；肽132)，YVKQWRHSYTASY(SEQ ID NO：50；肽37)，EEEVFSAYSALWW(SEQ ID NO：51；肽79)，DYSISPDGQFILL(SEQ ID NO：52；肽29)，SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO：53；肽30)，和IYVKIEPNLPSYR(SEQ ID NO：54；肽63)，其中所述抗体不包含序列QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：90)的重链可变区和序列DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWYQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO：91)的轻链可变区这两者。
25. 权利要求1的多肽，其是抗体。
26. 权利要求25的抗体，其是单克隆抗体。
27. 权利要求25的抗体，其是人源化抗体。
28. 权利要求25的抗体，其是抗体片段。
29. 权利要求28的抗体，其中所述抗体片段是选自Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv和F(ab’)2。
30. 权利要求1的多肽，其是抗体链。
31. 权利要求1的多肽，其不是鼠单克隆抗体。
32. 权利要求1的多肽，其为分离的多肽。
33. 权利要求1的多肽，其结合CD26。
34. 权利要求33的多肽，其中所述的CD26为人CD26。
35. 权利要求34的多肽，其以大约6nM或更小的KD结合至人CD26。
36. 编码权利要求1的多肽的多核苷酸。
37. 包含权利要求36的多核苷酸的载体。
38. 包含权利要求36的多核苷酸的宿主细胞。
39. 多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：1-14的核酸序列。
40. 包含权利要求39的多核苷酸的宿主细胞。
41. 药物组合物，其包含权利要求1的多肽和可药用赋形剂。
42. 抑制表达CD26的细胞增殖的方法，所述方法包括将细胞与权利要求1的多肽接触。
43. 在受试者中治疗与CD26表达相关的病症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包含权利要求1的多肽的组合物。
44. 权利要求43的方法，其中所述的病症为自身免疫疾病。
45. 权利要求43的方法，其中所述的病症为移植物抗宿主病。
46. 权利要求43的方法，其中所述的病症为癌症。
47. 权利要求46的方法，其中所述的癌症为血液肿瘤。
48. 权利要求46的方法，其中所述的受试者患有表达CD26的肿瘤或者已经移除了表达CD26的肿瘤。
49. 权利要求46的方法，其中所述的癌症为淋巴癌、肾癌、前列腺癌或肺癌。
50. 在患有表达CD26的肿瘤或者已经移除了表达CD26的肿瘤的受试者中抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包含权利要求1的多肽的组合物。
51. 在受试者中抑制表达CD26的癌细胞转移的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包含权利要求1的多肽的组合物。
52. 权利要求43的方法，其中所述的受试者为人。
53. 权利要求18、19或23中任意一项所述的多肽，所述多肽为抗体。
54. 权利要求18、19或23中任意一项所述的多肽，所述多肽结合CD26。
55. 多核苷酸，其编码权利要求18、19或23中任意一项所述的多肽。
56. 药物组合物，所述药物组合物包含权利要求18、19或23中任意一项所述的多肽和可药用赋形剂。
57. 抑制表达CD26的细胞增殖的方法，所述方法包括将细胞与权利要求18、19或23中任意一项所述的多肽接触。
58. 在受试者中治疗与CD26表达相关的病症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包含权利要求18、19或23中任意一项所述的多肽的组合物。
59. 权利要求58的方法，其中所述的病症为癌症。
60. 在患有表达CD26的肿瘤或者已经移除了表达CD26的肿瘤的受试者中抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包含权利要求18、19或23中任意一项所述的多肽的组合物。
61. 在受试者中抑制表达CD26的癌细胞转移的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包含权利要求18、19或23中任意一项所述的多肽的组合物。
62. 权利要求46的方法，所述方法还包括用化学疗法、辐射、外科手术、激素疗法或其它免疫疗法治疗受试者的步骤。
63. 权利要求59的方法，所述方法还包括用化学疗法、辐射、外科手术、激素疗法或其它免疫疗法治疗受试者的步骤。
64. 权利要求9的多肽，其包含
(a)重链CDR，所述重链CDR包含：(i)含有序列GFSLTTYGVH(SEQID NO：55)的CDR1；(ii)含有序列VIWGDGRTDYDAAFMS(SEQ IDNO：58)的CDR2；和(iii)含有序列NRHDWFDY(SEQ ID NO：60)的CDR3；和
(b)轻链CDR，所述轻链CDR包含：(i)含有序列RASQGIRNNLN(SEQ ID NO：62)的CDR1；(ii)含有序列YSSNLQS(SEQ ID NO：65)的CDR2；和(iii)含有序列QQSIKLPFT(SEQ ID NO：68)的CDR3。
65. 抗体，所述抗体由以保藏号PTA-7695保藏在ATCC的大肠杆菌(E.coli)中的质粒编码。
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