JP2003526372A - ＩｇＥ抗体のＦｃ領域の３次元モデルおよびその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＩｇＥ抗体のＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域のような抗体の３次元モデル、ならびにこのようなモデルを生成する方法が含まれる。本発明はまた、増大した安定性および／または抗体レセプター結合活性を有するムテイン、ならびに（好ましくは本発明の３次元モデルから導出される情報を使用して）このようなムテインを作製する方法を含む。本発明のムテインをコードする核酸配列および本発明のムテインを生成するためのこれらの配列の使用もまた、本発明に含まれる。抗体に対する抗体レセプタータンパク質の結合を阻害する化合物の同定のための本モデルの使用もまた、含まれる。本発明はまた、このようなムテインおよび阻害性化合物の使用（例えば、診断およびアレルギーおよび他の異常な免疫応答から動物を防御する方法を含む）。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、Ｃε３およびＣε４ドメイン（Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４、またはＦｃ
−Ｃｅ３／Ｃｅ４、領域）を含むＩｇＥ抗体の定常領域の結晶および３次元（３
−Ｄ）モデルに関する。本発明はまた、アレルギーの診断および処置ならびに動
物におけるその他の免疫応答の調節において有用なムテインおよびインヒビター
を生成するためのそのモデルの使用に関する。

【０００２】 （発明の背景） 抗体Ｆｃ−レセプター（ＦｃＲ）は、免疫系の種々の細胞に、分泌抗体の特異
性をカップリングすることにより、免疫応答において重要な役割を演じている。
マクロファージ、肥胖細胞，好酸球、および好塩基球を含む多くの細胞型は、そ
れらの表面に膜結合ＦｃＲを発現する。抗体のＦｃＲへの結合は、これら細胞に
抗原特異性を提供し、これら細胞は、活性化に際し、インターロイキン、炎症の
開始剤、ロイコトリエン、プロスタグランジン、ヒスタミン、または細胞障害性
タンパク質のような免疫応答の細胞特異的メディエーターをさらに放出する。Ｆ
ｃＲの養子特異性（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）は、これらレ
セプターを発現する種々の細胞型に、抗体抗原−認識部位の多様性をカップリン
グさせることによって、病原体放出に対し組み合わせのアプローチを可能にする
。

【０００３】 ＦｃＲで開始する機構は、感染性疾患に対する正常免疫において、ならびにア
レルギー、抗体媒介腫瘍認識、自己免疫疾患、および免疫応答が異常である（す
なわち調節されていない）その他の疾患において重要である。トランスジェニッ
クマウスを用いた最近の実験は、ＦｃＲが免疫応答において鍵となるステップを
制御し、これには、抗体関連の細胞の細胞障害性および免疫複合体の形成にとも
なう炎症カスケードが含まれることを実証する；例えば、Ｒａｖｅｔｃｈら、１
９９８、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ １６、４２１−４３２を参照の
こと。ＩｇＧ（ＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩ、およびＦｃｇＲＩＩＩ、集合的にＦ
ｃｇＲｓとして知られる）を結合するレセプターは、種々の炎症性反応を媒介し
、Ｂ細胞活性化を調節し、そしてまた超過敏反応の引き金となる。高親和性Ｆｃ
εレセプター（ＩｇＥレセプターまたはＦｃｅＲＩとして知られる）は、肥胖細
胞の活性化およびアレルギー反応およびアナフィラキシー性ショックの開始に関
連している。ＦｃｅＲＩα鎖（ＦｃεＲＩα）についてのノックアウトマウスは
、ＦｃｇＲｓがなお肥胖細胞を活性化し得るが（例えば、Ｄｏｍｂｒｏｗｉｃｚ
ら、１９９７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９、９１５−９２５；Ｏｅｔｔ
ｇｅｎら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ ３７０、３６７−３７０を参照のこと）、
ＩｇＥ媒介アナフィラキシーを増大できない（例えば、Ｄｏｍｂｒｏｗｉｃｚら
、１９９３、Ｃｅｌｌ ７５、９６９−９７６を参照のこと）。ＦｃｅＲＩはま
た、血小板および好酸球からの抗寄生反応の引き金となること、ならびにＴ細胞
の活性化のためのＭＨＣクラスＩＩ提示経路中に抗原を送達することが示されて
いる；例えば、Ｇｏｕｎｎｉら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ ３６７、１８３−１
８６；Ｊｏｓｅｐｈら、１９９７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７、２２１
２−２２１８；Ｍａｕｒｅｒら、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１、２７
３１−２７３９を参照のこと。ＦｃｅＲＩのβサブユニットは、遺伝的研究にお
いて喘息と関連している；例えば、Ｈｉｌｌら、１９９６、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎｅｔ．５、９５９−９６２；Ｈｉｌｌら、１９９５、Ｂｍｊ ３１１、７７
６−７７９；Ｋｉｍら、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｕｌｍ．Ｍｅｄ．４
、４６−４８；Ｍａｏら、１９９８、Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．５３、５４−５６
；Ｓｈｉｒａｋａｗａら、１９９４、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．７、１２５−１２９
を参照のこと。人口の顕著な部分（約２０％）がアレルギーによって影響されて
いる可能性があり、そして今世紀には、喘息の実質的増加が観察されている。Ｆ
ｃｅＲＩへのＩｇＥ結合は、異なるアレルゲンに対する反応において不可欠な事
象であるので、ＦｃｅＲＩ阻害を狙う治療ストラテジーは、これら疾患の有用な
処置を提供し得る。例えば、ＩｇＥを標的とし、そしてレセプター結合をブロッ
クするモノクローナル抗体は、治療能力を示している；例えば、Ｈｅｕｓｓｅｒ
ら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９、８０５−８１３を参
照のこと。

【０００４】 ＦｃｅＲＩは、肥胖細胞、好塩基球、好酸球、ランゲルハンス細胞および血小
板の表面上の、テトラマー（ａｂｇ_２）またはトリマー（ａｇ_２）の膜結合レセ
プターとして見出されている。ＦｃｅＲＩのα鎖は、ＦｃεＲＩαとも称され、
高親和性（約１０^−９〜１０^−１０分子／リットル（Ｍ）のＫ_Ｄ）でＩｇＥ分子
を結合し、そして単一のＣ末端膜貫通アンカーの前の停止コドンの導入により、
１７２アミノ酸の可溶性ＩｇＥ結合フラグメントとして分泌され得る；例えば、
Ｂｌａｎｋら、１９９１、Ｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６、２６３９−２
６４６を参照のこと。これは、１７２アミノ酸の可溶性ＩｇＥ−結合フラグメン
トの分泌を記載する。ヒトＦｃεＲＩαタンパク質の細胞外ドメインは、免疫グ
ロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属し、そして７つのＮ連結グリコシル化
部位を含む。ＦｃεＲＩαのグリコシル化は、レセプターの分泌および安定性に
影響するが、ＩｇＥ結合には必要ではない；例えば、ＬａＣｒｏｉｘら、１９９
３、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０、３２１−３３０；Ｌｅｔｏｕｒｎｅｕｒら
、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、８２４９−８２５６；Ｒｏｂｅ
ｒｔｓｏｎ、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８、１２７３６−１２７
４３；Ｓｃａｒｓｅｌｌｉら、１９９３、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３２９、２２３
−２２６を参照のこと。ＦｃｅＲＩのβおよびγ鎖は、シグナル伝達モジュール
である。

【０００５】 従前の研究者は、ヒトＦｃεＲＩαの核酸配列を開示している；例えば、１９
９０年１０月９日に発行されたＬｅｄｅｒによる米国特許第４，９６２，０３５
号；１９９７年６月１７日に発行されたＫｉｎｅｔらによる米国特許第５，６３
９，６６０号；Ｋｏｃｈａｎら、１９８８、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１６、３５８４；Ｓｈｉｍｉｚｕら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５、１９０７−１９１１；およびＰａｎｇら、１９９
３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１、６１６６−６１７４を参照のこと。ヒトＦｃ
ｅＲＩβ鎖およびヒトＦｃｅＲＩγ鎖の核酸配列もまた報告されている；それぞ
れ、Ｋｕｓｔｅｒら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７、１２７８２
−１２７８７；Ｋｕｓｔｅｒら、１９９０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５、
６４４８−６４５２を参照のこと。イヌＦｃεＲＩα、マウスＦｃεＲＩα、ラ
ットＦｃεＲＩα、ネコＦｃεＲＩαおよびウマＦｃεＲＩαタンパク質をコー
ドする核酸分子の核酸配列もまた報告されている；それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ^{Ｔ Ｍ} 登録番号Ｄ１６４１３；Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ２０４８９（コード
されるタンパク質配列を示す）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０３６０６；１９９
８年６月２５日に公開されたＦｒａｎｋらによるＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／２７
２０８、本明細書ではＷＯ９８／２７２０８と称される；および１９９９年８月
５日に公開されたＷｅｂｅｒらによるＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／３８９７４、本
明細書ではＷＯ９９／３８９７４と称される、を参照のこと。さらに、ＦｃεＲ
Ｉαタンパク質を用いてＩｇＥ抗体を検出する方法が、１９９８年６月４日に公
開されたＦｒａｎｋらによるＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／２３９６４、本明細書で
はＷＯ９８／２３９６４と称される；ＷＯ９８／２７２０８、前述；１９９８年
１０月１５日に公開されたＦｒａｎｋらによるＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／４５７
０７、本明細書ではＷＯ９８／４５７０７と称される；およびＷＯ９９／３８９
７４、前述、において報告されている。ＷＯ９８／２３９６４、ＷＯ９８／２７
２０８、ＷＯ９８／４５７０７およびＷＯ９９／３８９７４の各々はその全体が
本明細書に参考として援用される。

【０００６】 ＦｃεＲＩαまたはＩｇＥいずれかの、これら個々のタンパク質の結合（すな
わちこれらの間の相互作用）に関与するアミノ酸を同定することを試みるための
変異誘発およびスワッピング技法の使用のいくつかの報告があり、他のＩｇ−ス
ーパーファミリーメンバーに対する相同性を基にＦｃεＲＩαタンパク質をモデ
ルすることを試みることを報告し、そして同定化合物が見かけ上このような結合
を阻害することを報告する；例えば、Ｃｏｏｋら、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ３６、１５５７９−１５５８８；Ｈｕｌｅｔｔら、１９９４、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、１５２８７−１５２９３；Ｈｕｌｅｔｔら、１９９
５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７０、２１１８８−２１１９４；Ｍａｌｌａｍ
ａｃｉら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８、２２０７６−２２０８
３；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、１９９３、前述；Ｓｃａｒｓｅｌｌｉら、１９９３、
前述、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌら、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ
、２５、３８７−３９２；ＭｃＤｏｎｎｅｌｌら、１９９６、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕ
ｃ．Ｂｉｏｌ．３、４１９−４２６；１９９７年１０月３０日に公開されたＣｈ
ｅｎｇらによるＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／４００３３；１９９３年１月１９日に
発行されたＧｏｕｌｄらによる米国特許第５，１８０，８０５号；１９９７年１
２月２日に発行されたＧｏｕｌｄらによる米国特許第５，６９３，７５８号；１
９９６年１月２５日に公開されたＧｏｕｌｄらによるＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／
０１６４３；１９９５年６月１日に公開されたＧｏｕｌｄらによるＰＣＴ公開Ｗ
Ｏ９５／１４７７９を参照のこと。しかし、これらの参考文献のいずれも、Ｆｃ
εＲＩαタンパク質の単離された結晶または結晶に由来する３−Ｄモデルを記載
していない。

【０００７】 ＦｃＲおよび抗体とのそれらの相互作用について知られていることにかかわら
ず、それらのリガンドに対する増大した親和性、改変された基質特異性、増加し
た安定性、および診断における使用のための増加した溶解度、アレルギーおよび
その他の異常免疫応答の処置および防止のような、改善された特徴をもつＦｃＲ
および抗体の必要性が存在する。また、動物において、アレルギーを防ぐか、ま
たは処置し、そしてその他の免疫応答を調節するために安全かつ効力のある化合
物が必要である。

【０００８】 （発明の要旨） 本発明は、抗体の定常領域（Ｆｃ領域）の単離された結晶、このような結晶の
３次元（３−Ｄ）モデルおよびこのようなモデルの改変を含む。本発明はまた、
抗体ならびに抗体ムテインおよびその他の改変抗体に結合するＦｃＲの能力を阻
害する化合物を含む。また、このような結晶、モデル、阻害性化合物、ムテイン
、およびその他の改変タンパク質を産生および使用する方法が、本発明に含まれ
る。したがって、本発明は、増加した安定性、ＦｃＲのＩｇ結合ドメインに対す
る増加した親和性、改変された基質特異性、および制限されないで減少した凝集
を含む増加した溶解度のような、改良された機能を備えた抗体を含む。ムテイン
とも呼ばれるこのようなタンパク質は、アレルギーおよびその他の免疫応答異常
を検出するため、およびこのような異常から動物を保護するために有用である。
本発明はまた、動物をアレルギーから保護し（例えば、症状を、防ぎ、処置し、
低減する）、そして動物におけるその他の免疫応答を調節する、安全かつ効き目
のある阻害性化合物を提供する。

【０００９】 本発明は、Ｃε３およびＣε４ドメインを含むヒトＩｇＥＦｃ領域の３−Ｄモ
デルを含み、ここでこのモデルは、表１、表２または表３で特定される原子座標
を実質的に示す。本発明はまた、表１、表２または表３で特定される原子座標を
実質的に示すモデルの改変を含む３−Ｄモデルを含む。このようなモデルを生成
するための方法もまた本発明に含まれる。

【００１０】 本発明はまた、Ｃε３およびＣε４ドメインを含むヒトＩｇＥＦｃ領域の単離
された結晶を含む。

【００１１】 本発明は、ＩｇＥ抗体とＦｃεＲＩαタンパク質との間の結合を阻害する化合
物を同定する方法を含む。この方法は、本発明の３−Ｄモデル、特に、表１、表
２または表３で特定される原子座標を実質的に示すものを用いる工程を包含する
。このような方法を用いて同定された阻害性化合物もまた本発明に含まれる。こ
のような阻害性化合物を含む治療組成物、およびこのような治療組成物を用いて
動物をアレルギーから保護するか、またはその他の免疫応答を調節する（例えば
、動物を、その他の異常免疫応答から保護する）方法もまた本発明に含まれる。

【００１２】 本発明はまた、ＦｃＲのＦｃ結合ドメインに結合するムテインを含む。このよ
うなムテインは、配列番号２を含むタンパク質と比較して改良された機能を有し
ている。このような改良された機能の例は、増加した安定性、抗体のＦｃドメイ
ンに対する増加した親和性、改変された基質特異性、減少した凝集、および増加
した溶解度を含む。このようなムテインは、以下の工程を包含する方法により産
生される：（ａ）表１、表２、または表３で特定される原子座標を実質的に示す
３−Ｄモデルを分析する工程であって、特定のアミノ酸で置換された場合、この
タンパク質の改良された機能に影響し得る、このモデルにより提示されるタンパ
ク質の少なくとも１つのアミノ酸を同定する工程；および（ｂ）このような改良
された機能を有するムテインを産生するために同定されたアミノ酸（単数または
複数）を置換する工程。本発明はまた、非改変ＩｇＥＦｃ領域と比較して改良さ
れた機能を有するムテインを含む。

【００１３】 化学的に改変されたＩｇＥＦｃ領域であるムテインもまた含まれる。本発明の
ムテインをコードする核酸分子、このような核酸分子を含む組換え分子および組
換え細胞、およびこのようなムテインを産生する方法もまた含まれる。このよう
なムテインを含む診断試薬および診断キット、このようなムテインを含む治療組
成物、およびアレルギーまたはその他の免疫応答から動物を検出または保護する
方法もまた含まれる。

【００１４】 本発明はまた、ＩｇＥＦｃ領域の機能を改善する方法を含み、この方法は、（
ａ）表１、表２、または表３で特定される原子座標を実質的に示す３−Ｄモデル
を分析する工程であって、特定のアミノ酸で置換された場合、このタンパク質の
機能の少なくとも１つを改良するこのタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を
同定する工程；および（ｂ）この同定されたアミノ酸（単数または複数）を置換
する工程であって、この改良された機能の少なくとも１つを有するムテインを産
生する工程を包含する。

【００１５】 （発明の詳細な説明） 本発明は、抗体のＦｃ領域の単離された結晶、このような結晶の３−Ｄモデル
およびこのようなモデルの改変を含む。本発明はまた、抗体ならびにムテインお
よびその他の改変抗体に結合するＦｃＲの能力を阻害する化合物を含む。本発明
に含まれるのはまた、このような結晶、モデル、阻害性化合物、ムテイン、およ
びその他の改変タンパク質を生成および使用する方法である。

【００１６】 本発明は、ＩｇＥ抗体（Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４）のＣε３およびＣε４ドメイ
ンを含むＦｃ領域の単離された結晶、このような結晶の３−Ｄモデル、およびこ
のようなモデルの改変を含む。本明細書で用いるとき、用語「ａ」の実体または
「ａｎ」の実体は、その実体の１つ以上をいい；例えば、結晶またはモデルは、
１つ以上の結晶または１つ以上のモデルをそれぞれいう。従って、用語「ａ」（
または「ａｎ」）、「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書では交
換可能に用いられ得る。用語「包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（
ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、交換可能に用
いられ得る。さらに、「からなる群から選択される」化合物は、以下のリスト中
の１つ以上の化合物をいい、この化合物の２つ以上の混合物、または組み合わせ
をも含む。

【００１７】 本明細書で用いられるとき、ＦｃεＲＩαタンパク質の細胞外ドメインは、細
胞の外側の環境に剥き出しており、しかもＩｇＥ抗体のＦｃドメインに結合する
ＦｃｅＲＩα鎖の部分である。このような細胞外ドメインは、（ａ）成熟Ｆｃｅ
ＲＩα鎖の最初のアミノ酸から、膜貫通領域の開始部の前の最後のアミノ酸を通
じて伸びるドメインである完全な細胞外ドメイン、または機能的に等価であるド
メインであって、ここで、このようなドメインは、Ｄ１およびＤ２ドメインを含
み、このようなＦｃεＲＩαタンパク質が天然に結合するＩｇＥ抗体に対して類
似の親和性を提示し、そして構造決定を可能にするに十分な品質を有する結晶を
するか、または（ｂ）任意の細胞外ドメイン（ａ）のフラグメントであって、こ
こで、このフラグメントは、抗体のＦｃドメインに結合するその能力を保持する
。本明細書で用いられるとき、抗体に結合する、および抗体Ｆｃドメイン（すな
わち定常領域）に結合するという用語は、交換可能に用いられ得る。なぜなら、
ＦｃＲが抗体のＦｃドメインに結合することが認識されるからである。ＦｃεＲ
Ｉαタンパク質のような、ＦｃＲ（すなわち抗体に結合し得るタンパク質）は、
完全長ＦｃＲ（例えば、完全長ＦｃｅＲＩα鎖）、またはその任意のフラグメン
トであり得、ここで、このフラグメントは抗体に結合する。同様に、抗体、また
はそのＦｃ領域は、完全長抗体、またはその完全長Ｆｃ領域、またはＦｃＲに結
合するその任意のフラグメントであり得る。１つの実施形態では、Ｆｃ領域はＣ
ε３およびＣε４ドメインを含む。好ましくは、ＦｃＲは、少なくとも約１０^８ リットル／モル（Ｍ^−１）、より好ましくは少なくとも約１０^９Ｍ^−１、そして
さらにより好ましくは少なくとも約１０^１０Ｍ^−１の親和性（Ｋ_Ａ）で抗体に結
合する。

【００１８】 本発明は、いくつかの局面で驚きである。例えば、これは、ＩｇＥ抗体のＦｃ
−Ｃε３／Ｃε４領域の単離された結晶、そして、特に、結晶構造すなわち３−
Ｄモデルがそれから派生し得るに十分な品質の単離された結晶の最初の報告であ
る。このような結晶の生成は非常に困難かつ自明ではなく、そして他者により成
功することなく試みられていた。本発明者らは、そこから有用な結晶を作製する
ために好適なＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域を発見する前、多くのアプローチを試み
た。首尾良く用いられるこのような最初の領域は、本明細書でＰｈＦｃ−Ｃε３
／Ｃε４_{１−２２２}と称され、これは、Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９７８、Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ４１、３−２５の番号付けシステムを用い、ヒトＩｇＥ
Ｆｃ定常領域のアミノ酸３３０から５４７が続くアミノ末端の４つのアミノ酸
である、アラニン、アスパラギン酸、プロリンおよびシステインを含む。ＰｈＦ
ｃ−Ｃε３／Ｃε４_{１−２２２}は、本明細書では配列番号２に示される。ＰｈＦ
ｃ−Ｃε３／Ｃε４_{１−２２２}をコードする核酸分子の例は、本明細書では、ｎ
ｈＦｃ−Ｃε４_{１−６６６}と称され、この核酸配列は、配列番号１として参照さ
れる。実施例に記載のような方法を用い、昆虫細胞でＰｈＦｃ−Ｃε３／Ｃε４ _{１−２２２} が産生されるとき、良好な結晶が生成されることもまた発見された。
結晶構造の解決もまた、実施例でより詳細に記載されるように非常に困難であっ
た。例えば、努力の一部として、約１２，０００のモデルが作成され、そしてプ
ログラムＡｍｏｒｅを用いる完全Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ
サーチに用いられた（このことは、５台のＳｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓコ
ンピューターで約１０日を要する）。

【００１９】 Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｈｉ−５）細胞で産生されたＰｈＦｃ−Ｃ
ε３／Ｃε４_{１−２２２}の結晶構造の決定は、表１、表２または表３に特定され
る原子座標を実質的に提示する３−Ｄモデルを生じた。本明細書では、アミノ酸
は、それらの標準的な３または１文字コードにより表され；例えば、本明細書に
その全体が援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕｎａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照のこと。

【００２０】 このＰｈＦｃ−Ｃε３／Ｃε４_{１−２２２}の３−Ｄモデルはまた、ＩｇＧのＦ
ｃ領域の結晶構造について知られていることを考慮すれば、非常に驚きである。
このＩｇＥのＦｃ領域は、ＩｇＧのそれよりコンパクトである新規立体配座中に
存在する。このＣε３ドメインはまた、ＩｇＧと比較してＩｇＥ中で互いにより
緊密であり（約２２Åに比較して約１３Å）、ＩｇＥＦｃ構造について「閉鎖コ
ンフォメーション（ｃｌｏｓｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」の記述子に至
る。この閉鎖コンフォメーションはまた、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙらによる、１９９
９年１１月４日に出願された米国特許出願第０９／４３４，１９３中、およびＪ
ａｒｄｅｔｚｋｙらによる、２０００年５月１１日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ
００／２６２４６中に開示されているＦｃεＲＩα単独、ならびにそれらの全体
が本明細書に参考として援用される、米国特許出願第６０／１８９，８５３号、
米国特許出願第０９／４３４，１９３号、前述、ＷＯ００／２６２４６、前述、
および６０／１８９，８５３、前述に開示されているＦｃεＲＩαとＦｃ−Ｃε
３／Ｃε４単独との間の複合体の結晶構造を考慮すれば驚きである。この複合体
中のＦｃ−Ｃε３／Ｃε４の構造は、開放コンフォメーション（ｏｐｅｎ ｃｏ
ｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）であり、レセプター−結合コンフォメーションともいわ
れる。このレセプター−結合立体配座中の２つのＣε３ドメイン間の距離は約２
３Åである。これら構造の類似性および差異の比較は、実施例および６０／１８
９，８５３、前述、においてより詳細に記載されている。表１、表２または表３
に特定される原子座標を実質的に提示するモデルの分析は、報告されている変異
誘発研究の適正な解釈および洗練のためのこのようなモデルの必要性を示す。こ
のようなモデルは、ＦｃεＲＩαのＩｇＥへの結合に直接的または間接的に影響
するアミノ酸間の区別を可能にし、そして変異誘発研究で同定されたアミノ酸お
よびアミノ酸セグメントがタンパク質のどこに位置するかを示す。本発明のモデ
ルを用いることにより、ＦｃεＲＩαとＩｇＥの相互作用を識別し得、それによ
って、ムテイン産生のために標的とするアミノ酸またはＩｇＥのそのレセプター
への結合を阻害する化合物の開発のために標的とする領域を同定し得る。このよ
うなモデルはまた、ＩｇＥの閉鎖コンフォメーションを安定化する阻害性化合物
を設計する能力を導き、それによって、ＦｃＲに結合するその能力を低減する。
このようなモデルは、単独で、またはＦｃεＲＩα単独（ＵＳ ０９／４３４，
１９３、前述、およびＷＯ００／２６２４６、前述）またはＦｃεＲＩαとＦｃ
−Ｃε３／Ｃε４単独（６０／１８９，８５３、前述）との間の複合体のモデル
と組み合わせて用いられ得る。

【００２１】 本発明の１つの実施形態は、ＩｇＥ抗体のＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域の単離さ
れた結晶である。本明細書で用いられるとき、単離された結晶は、実験室で産生
されたタンパク質の結晶であり；すなわち、単離された結晶は個別に産生され、
そして天然においてインサイチュで見出される物ではない。当業者は、結晶を産
生する種々の技法があることを認識し、これには、制限されないで、ハンギング
またはシッティングドロップ方法を用いる蒸気拡散、オイル下の蒸気拡散、およ
びバッチ法を含む；例えば、Ｄｕｃｒｕｉｘら編、１９９１、Ｃｒｙｓｔａｌｌ
ｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ；Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、およびＷｙｃｋｏｆｆら編、１９８５、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１、４９−１８５を参照のこと；各々の参考
文献はその全体が参考として援用される。結晶化条件は、タンパク質の固有の特
徴および溶液中のタンパク質の濃度に依存して調節し得、しかも結晶化を行うた
めに種々の沈殿剤を用い得ることもまた認識される；このような沈殿剤は、当業
者に公知である。好適な実施形態では、Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４領域の結晶は、ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧモノメチルエーテルのような沈殿
剤を添加することによって溶液中に生成される。結晶を生成するために用いられ
るＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域は、ネイティブなタンパク質の精製、タンパク質の
化学的合成、またはタンパク質の組換え産生を含む、種々の方法により生成され
得ることもまた注目すべきである。このようなタンパク質を組換えにより産生す
るために多くの細胞型が用いられ得るが、制限されずに、昆虫細胞、例えば、Ｔ
ｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉおよびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄ
ａが好適であり、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞がより好適である。タン
パク質を産生するためのさらなる方法が以下に記載される。

【００２２】 本発明の単離された結晶は、例えば、制限されないで、金、白金、水銀、セレ
ン、銅、および鉛のような重い原子の誘導体を含み得る。このような重元素は、
ランダムに導入され得るか、または本発明の３−Ｄモデルの知識に基づく様式で
導入され得る。本発明のさらなる結晶は誘導体化されない。１つの実施形態では
、本発明の単離された結晶は、ＩｇＥ抗体のＦｃドメインへのＦｃεＲＩαタン
パク質の結合を阻害する化合物の存在下、ＩｇＥ抗体のＦｃドメインに結合した
ＦｃεＲＩαタンパク質の共結晶（ｃｏ−ｃｒｙｓｔａｌ）である。本発明のさ
らなる結晶は、本発明のムテインであるタンパク質または本発明の３−Ｄモデル
により提示されるその他のタンパク質から生成される結晶を含む。

【００２３】 本発明の単離された結晶は、Ｃε３ドメインを含むＦｃ、またはＣε３ドメイ
ンおよびＣε４ドメインを含むＦｃのような、ＦｃεＲＩαに結合する、任意の
適切なＦｃ領域の結晶であり得る。適切なＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域は、哺乳動
物Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４領域を含み、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ラットおよびマ
ウスＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域が好適であり、そしてヒトＦｃ−Ｃε３／Ｃε４
領域がなおより好適である。本発明の好適な結晶は、約４．５Åまたはそれより
高い解像度（すなわち、より小さな数がより高い解像度を意味する）までＸ線を
回折し、約４．０Åまたはより高い、約３．５Åまたはより高い、約３．２５Å
またはより高い、約３Åまたはより高い、約２．５Åまたはより高い、約２．３
Åまたはより高い、約２Åまたはより高い、約１．５Åまたはより高い、および
約１Åまたはより高い解像度が、増加するにつれてより好適である。しかし、よ
り低い解像度のさらなる結晶は、これら構造の全体のトポロジー、例えば、結合
部位の位置または分子がレセプターまたは抗体に結合する場所を識別することに
おいて有用性を有し得ることが認識される。本発明の特に好適な単離された結晶
は、配列番号２のアミノ酸配列、または別の哺乳動物Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４領域
を示す本質的に等価な配列を有する。好適なのは、空間群Ｐ４２_１２に属する結
晶である。特に好適な結晶は、１０５．６Å×１０５．６Å×４７．１Å、α＝
β＝γ＝９０゜のセル次元を有し、しかも結晶の非対称単位あたり１つのＣε３
／Ｃε４鎖を含む空間群Ｐ４２_１２に属する結晶を含む。このような好適な結晶
は、好ましくは、約２．３Åの解像度までＸ線を回折する。

【００２４】 本発明は、表１、表２または表３で特定される原子座標を実質的に提示するＦ
ｃ−Ｃε３／Ｃε４領域の３−Ｄモデルを含む。本発明はまた、表１、表２また
は表３で特定される原子座標により実質的に提示されるモデルの改変を含む３−
Ｄモデルを含む。このような改変の各々は、Ｆｃレセプタータンパク質に結合す
る抗体Ｆｃ領域を示す。Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４領域の３−Ｄモデルは、対応する
領域の実際の構造を予見する提示、またはイメージである。したがって、３−Ｄ
モデルは、原子レベルで領域の構造と機能との間の関係を探るため、および制限
されないで：増加した（すなわち促進された）安定性；増加したＦｃＲ結合活性
、例えば、ＦｃＲと抗体との間の会合速度を増加すること、および／またはそれ
らの間の解離速度を低減することによるか、または基質特異性を改変することに
より（例えば、特定種およびクラスのＦｃ領域が別の種および／または別の抗体
クラスからの抗体結合部位に結合する能力を増大する）、例えば、ＦｃＲに対す
る親和性を増大することによる；および／または増加した溶解性（例えば、減少
した凝集）のような改良された機能を有するムテイン（すなわち、遺伝子的およ
び／または化学的に改変された抗体）を設計するために用いられ得るツールであ
る。しかし、タンパク質結晶の分析により派生するタンパク質の３−Ｄモデルが
このタンパク質の固有の構造と同一ではないことは当業者に周知である。例えば
、Ｂｒａｎｄｅｎら、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔ
ｒｕｃｔｕｒｅ、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ、１９９１、特に、「このモデルが実際の結晶
に正確に決して対応しないのは驚きではない」と述べる２７７頁を参照のこと。
さらに、このモデルは、抗体のＦｃ領域の実際の構造により緊密に対応するため
にさらなる洗練を受け得る。本発明の改変の例であるこのような洗練されたモデ
ルは、このモデルが示すタンパク質の構造および作用の機構のより良好な予見者
である。本発明の３−Ｄモデルの洗練は、当業者に公知の種々の方法で得られ得
るＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域の改良されたモデルをいう。洗練は、より好適な程
度の解像度、好ましくは約４．５Å、より好ましくは約４Å、より好ましくは約
３．５Å、より好ましくは約３．２５Å、より好ましくは３Å、より好ましくは
約２．５Å、より好ましくは約２．３Å、より好ましくは約２Å、より好ましく
は約１．５Å、そしてなおより好ましくは約１Åまで決定されたモデルを含み得
る。好適な洗練は、このような改良のための基礎として３−Ｄモデルを用いて得
られ得る。

【００２５】 本発明の１つの実施形態は、表１で特定される（すなわち列挙される）原子座
標を実質的に示すＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域の３−Ｄモデルである。

【００２６】

【表１】 本発明の別の実施形態は、表２で特定される（すなわち列挙される）原子座標
を実質的に示すＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域の３−Ｄモデルである。

【００２７】

【表２】 本発明のさらに別の実施形態が、表３で特定される（すなわち列挙される）原
子座標を実質的に示すＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域の３−Ｄモデルである。

【００２８】

【表３】 本明細書中で使用される場合、原子座標は（本明細書中で構造座標または座標
とも呼ばれる）、タンパク質結晶または複合体結晶の原子によるＸ線回折で得ら
れたパターンに関連する数式から導出された数学的な座標である。この回折デー
タは、代表的には電子密度マップを計算するために使用される。この電子密度マ
ップは、結晶の単位セル中の個々の原子の位置を確立するために使用される。表
１、表２、または表３に特定化された原子座標を実質的に表すモデルは、文字通
りこれらの座標を表すモデルのみならず（例えば、座標の空間的な配向を変化す
ることによる）そのような原子座標の座標変換を表すモデルも含む。

【００２９】 本発明はまた、表１、表２または表３に特定される原子座標を実質的に表す３
−Ｄモデルの改変である３−Ｄモデルを含む。本明細書中で使用される場合、改
変（本明細書中でモデル改変と呼ばれる）は、Ｆｃレセプタータンパク質に結合
する抗体Ｆｃ領域を表すモデルである。モデル改変は、以下が挙げられるが、こ
れらに限定されない：表１、表２または表３に特定される原子座標を実質的に表
す３−Ｄモデルの精密化；表１、表２または表３に特定化される原子座標を有す
る抗体の任意のＦｃＲ結合フラグメントを表すモデル；他のＦｃＣε３／Ｃε４
結晶に基づくモデル（例えば、実施例で開示された結晶にも基づくモデル）；ホ
モロジーモデリング技術を使用して作製したモデルであって、別のＦｃ領域のア
ミノ酸配列の全てまたは任意の部分を表１、表２または表３に特定化される原子
座標を実質的に表す３−Ｄモデルに組み込むか、またはＦｃ−Ｃε３／Ｃε４の
アミノ酸配列の全体または任意の部分を別の抗体の３−Ｄモデルに組込んだ、モ
デル；および改変した機能を有するＦｃ領域を表現する改変であって、好ましく
は非改変タンパク質と比較して改善された機能を有するムテインの設計に使用さ
れ得る改変。本明細書中で使用される場合、非改変タンパク質という用語は、ラ
ンダムまたは部位指向的（すなわち、標的化された）変異誘発を意図的に受けて
いないタンパク質をいう。理論に縛られないが、開放（レセプター結合）コンフ
ォメーションおよび閉鎖コンフォメーションの形成を可能するＩｇＥのＦｃ領域
のＣε３鎖およびＣε４鎖の可撓性もまた、他の動的コンフォメーションを導き
得ると考られており、この動的コンフォメーションの全ては、本発明に包含され
る。このような可撓性もまた、このレセプターに対するＩｇＥの結合を阻害する
化合物の開発の同定のための標的である。１つの実施形態において、本発明のＦ
ｃ領域の２つのＣε３ドメイン間の距離は、約１０Å〜約２５Åの範囲にある。
別の実施形態において、本発明のＦｃ領域の２つのＣε３ドメイン間の距離は、
約２０Å〜約４０Åの範囲にあり、好ましくは、約２０Å〜約３０Åの範囲にあ
る。

【００３０】 本発明のモデルは、以下を含むがこれらに限定されない様々な形態で表され得
る：このモデルが包含する全ての原子座標を列挙する工程、物理的な３−Ｄモデ
ルを提供する工程、このモデルをコンピュータスクリーン上に画像化する工程、
上記のモデルの画像を提供する工程、およびこのモデルの画像から座標のセット
を導く工程（例えば、画像から座標を抽出するか、または類似の免疫グロブリン
ドメインを、配列番号２を有するヒトＦｃ−Ｃε３／Ｃε４_２２２タンパク質に
導入し、そして類似のドメインを導くことになる）。物理的な３−Ｄタンパク質
は実体的であり、そしてこれらにはスティックモデルおよび空間充填モデルが挙
げられるが、これらに限定されない。「コンピュータスクリーン上にモデルを画
像化する」という句は、当業者に公知の適切なコンピュータハードウェアおよび
コンピュータソフトウェア技術を使用して、コンピュータスクリーン上で、モデ
ルを表現（描画）し、そしてこれを操作する能力をいう。このような技術は、例
えば、ＥｖａｎｓおよびＳｕｔｈｅｒｌａｎｄ、Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ
、Ｕｔａｈ、Ｂｉｏｓｙｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、
ＣＡ、Ｔｒｉｐｏｓ、Ｉｎｃ．およびＭｏｌｅｃｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ
Ｉｎｃ．を含む種々の供給源から入手可能である。「モデルの画像を提供する
」という句は、モデルの「ハードコピー」を作製する能力をいう。ハードコピー
は、動画および静止画の両方を含む。このモデルのコンピュータスクリーンイメ
ージおよび画像は、以下を含むがこれらに限定されない多くの形式で視覚化され
得る：電子密度マップ、リボン図、空間充填表現、α炭素トレース、トポロジー
図、原子間ベクトルの一覧、座標のφ／ψ／χによる角度表示、およびコンタク
トマップであり、これらのいくつかの例が本図面中にある。モデルの表示は全体
モデルまたはこれの部分モデルを包含し得る。モデルはまた、データベース形式
で表示され得る。

【００３１】 本発明のモデルはまた、このモデル周囲の空間を規定する。このような空間は
モールド（ｍｏｌｄ）、またはアルファスペースとして表現され、これらを使用
してＦｃＲおよび抗体の結合を阻害する化合物の形状を予測し得る。

【００３２】 １つの実施形態において、本発明のモデルは、複合体中の対応するタンパク質
のアミノ酸の溶媒接触度を同定する。ＰｈＦｃ−Ｃε３／Ｃε４_{１−２２２}中の
アミノ酸の溶媒接触度は表４で示される。

【００３３】

【表４】 本発明の別の実施形態として、ＰｈＦｃ−Ｃε３／Ｃε４_{１−２２２}にあるア
ミノ酸の溶媒接触度が表５で示される。

【００３４】

【表５】 溶媒に接触可能である残基は、タンパク質の外表面上に提示されるアミノ酸と
して重要であり、抗体へのＦｃＲの結合に関与し得、結合活性を増大されたタン
パク質の設計、または結合などを阻害する化合物の同定に有用である。さらに、
溶媒に接触可能な残基は、改善された機能を有する抗体のＦｃ領域を産生するた
めの修飾に対する標的を提示し得る。このような分析によって、また複合体中の
タンパク質の内部または中心部において残基を同定し得る。このような残基はま
た、増大された安定性のような改善された機能を有するタンパク質を産生するた
めに標的にされ得る。

【００３５】 本発明のモデルはまた、他の供給源からは得られないさらなる情報を提供する
。例えば、モデルは、結晶間の結晶接触を同定し、ＦｃＲと接触を実質的に形成
するアミノ酸を含むＦｃＲ結合ドメインの位置を予測する。表１、表２、または
表３中の座標を示すモデルの特に重要な領域は、ＩｇＥ抗体Ｆｃ領域の２つのＣ
ε３／Ｃε４を含む鎖間のドメイン間の溝（すなわち、スペース、ギャップ）、
Ｆｃ領域のＣε３とＣε４ドメイン間のヒンジ、およびＦｃεＲＩαタンパク質
結合に関与するループ（例えばＣε２とＣε３間のリンカー、Ｃε３のＢＣルー
プ、Ｃε３のＤＥループ、およびＣε３のＦＧループ）を含むが、これらに限定
されない。これらの部位は、実施例に詳細に記載され、薬物設計およびムテイン
産生のための標的部位を示す。

【００３６】 本発明のモデルはまた、以下のＦｃεＲＩαタンパク質のいずれかの細胞外ド
メインに対するヒトＩｇＥ抗体Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４領域の親和性に少なくとも
等価な親和性を有するＦｃεＲＩαタンパク質に結合する抗体のＦｃドメインを
含む複合体を示す：ヒトＦｃεＲＩαタンパク質、イヌＦｃεＲＩαタンパク質
、ネコＦｃεＲＩαタンパク質、ウマＦｃεＲＩαタンパク質、マウスＦｃεＲ
Ｉαタンパク質、およびラットＦｃεＲＩαタンパク質。このようなモデルは、
ヒトＦｃ領域、イヌＦｃ領域、ネコＦｃ領域、ウマＦｃ領域、マウスＦｃ領域ま
たはラットＦｃ領域のＦｃεＲＩ結合ドメインを示し得る。このようなモデルは
また、基質特異性が変化したＦｃ領域を示し得、好ましくは、本発明のモデルに
基づいて設計される。

【００３７】 本発明は、それぞれのクラスのＦｃレセプターに結合するＦｃドメインを示す
モデルを含む。タンパク質を自然に結合するクラス以外のクラスのＦｃレセプタ
ーに結合するよう設計された抗体のＦｃ領域を示すモデルもまた含まれる。この
ようなクラスは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを含む。本発
明のモデルは、例えば、他の抗体のアミノ酸配列の全てまたはいずれかの部分を
表１、表２、または表３中の座標を実質的に示したような３Ｄモデルへ取り込む
ことで産生され得る。このような実施形態は、表１、表２、もしくは表３中の座
標または同様の構造（２つの抗体結合ドメイン（すなわちＩｇＥに対するＣε３
）の開放距離が、約１０Å〜約２５Åまたは約２０Å〜約４０Åの範囲である）
によって予測される構造に基づく配向（表面パックおよび曲がった角度）におい
て位置される任意のＩｇドメインを特異的にとりこむ任意のモデルを含む。従っ
て、Ｆｃ領域の開放コンフォメーションおよび閉鎖コンフォメーションの両方が
、本発明に含まれる。１つの実施形態において、本発明のモデルは、ヒトＦｃε
ＲＩα結合ドメイン以外のＦｃεＲＩα結合ドメインの３Ｄモデルである。これ
らのタンパク質およびモデルは、ホモロジーモデルによって設計され得る。

【００３８】 表１、表２、または表３中に特定される原子座標によって実質的に示される３
Ｄモデル上で、骨格原子を用いて重ね合わせる場合、本発明の好ましい改変モデ
ルは、１０Å未満のタンパク質骨格原子の２乗平均平方根偏差を有する原子配置
を含む３Ｄ構造を有するモデルである。表１、表２、または表３中に特定される
原子座標によって実質的に示される３Ｄモデル上で、骨格原子を用いて重ね合わ
せる場合、好ましくはこのようなモデルは、８Å未満のタンパク質骨格原子の２
乗平均平方根偏差を有する原子配置を含む３Ｄ構造を有し、好ましくは７Å未満
、好ましくは６Å未満、好ましくは５Å未満、好ましくは４Å未満、好ましくは
３Å未満、好ましくは２Å未満、好ましくは１Å未満である。この実施形態にお
いて、このモデルは、ＦｃＲに結合するＦｃ領域を示す。骨格原子は、モデルの
骨格（または、３Ｄフォールディングパターン）を形成する。このように、骨格
原子は、アミノ酸の基本部分（すなわち、窒素、炭素、α炭素、および酸素）で
ある。好ましいモデル改変は、デフォルトパラメータ、ショートカットを伴わな
い２つの配列間の最適なグローバルアライメントを用いるプログラムＡＬＩＧＮ
を用いて決定されるように、ヒトＩｇＥ抗体のＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域と少な
くとも約３０％、好ましくは少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約４５
％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、
そしてさらにより好ましくは少なくとも約８０％、のアミノ酸配列相同性を共有
するアミノ酸配列を有するＦｃ領域を含む。本発明の好ましいモデルは、Ｆｃε
ＲＩα結合ドメイン（すなわち、ＦｃεＲＩαタンパク質に結合する領域）を示
す。

【００３９】 本発明の１つの実施形態は、以下の工程を含む方法によって生成されるヒトＦ
ｃ−Ｃε３／Ｃε４領域の３Ｄモデルである：（ａ）ヒトＦｃ−Ｃε３／Ｃε４
領域（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質であるが、これに
限定されない）の結晶化；（ｂ）結晶化タンパク質からＸ線回折データを収集す
る；および（ｃ）好ましくはタンパク質のアミノ酸配列と組み合せて、Ｘ線回折
データからモデルを決定する。結晶形態の複合体は、当該分野で周知の種々の技
術を用いて産生し得る。本明細書で開示されるように、結晶化されるヒトＦｃ−
Ｃε３／Ｃε４領域は、好ましくはこのような領域をコードする遺伝子を用いて
形質転換した組換え体昆虫細胞（例えば、それぞれのタンパク質を産生するよう
遺伝子的に設計されたバキュロウイルス）において産生される。Ｆｃ−Ｃε３／
Ｃε４領域の純度は、タンパク質の３Ｄモデルの決定を可能にする解像度に対す
るＸ線結晶学によって分析され得る結晶の産生を許容するのに十分でなければな
らない。好ましくは、解像度は、少なくとも約４．５Å（すなわち、４．４Åま
たはそれより良い）であり、より好ましくは少なくとも約４Å、より好ましくは
少なくとも約３．５Å、より好ましくは少なくとも約３．２５Å、より好ましく
は少なくとも約３Å、より好ましくは少なくとも約２．５Å、より好ましくは少
なくとも約２．３Å、より好ましくは少なくとも約２Å、さらにより好ましくは
少なくとも約１．５Åである。このような純度を得るための方法は、当該分野で
周知である。

【００４０】 本明細書に記載されるように、Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４領域を結晶化させる好ま
しい方法は、蒸発蒸留（ｖａｐｏｒ ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）を用いる。特
に好ましい方法は、実施例に開示される。本発明はまた、当該分野で公知の複合
体を結晶化させることができる他の方法を含むことが理解されるべきである。

【００４１】 いくつかのタンパク質の３Ｄモデルが決定されてきた；例えば、Ｂｌｕｎｄｅ
ｌｌら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９７６を参照。しかし、本明細書で議論される
ようにヒトＩｇＥのＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域の結晶構造の解明は、難しかった
。１つの実施形態において、結晶構造決定は、シンクロトロン放射を用いた高解
像度データを得ることを含む。例えば、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒ
ｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、また
はＡｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ ａｔ Ａｒｇｏｎｎｅ Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｒｇｏｎｎｅ、ＩＬにおいてこ
のデータを収集し得る。このデータの収集のためのさらなる場所は、Ｂｒｏｏｋ
ｈａｖｅｎ、ＮＹ、および日本を含むが、これらに限定されない。１つの実施形
態において、結晶を扱う天然原子および重原子由来の回折データは、電子密度マ
ップ中で精製されたタンパク質構造の最初のイメージを提供する。データ収集お
よび判読に関する詳細は、実施例の項において提供される。

【００４２】 本発明の１つの実施形態は、表１、表２、または表３に挙げられる実質的配置
におけるタンパク質の配置されるアミノ酸表示（すなわち、表示アミノ酸）を含
むＦｃ領域の３Ｄモデルを産生する方法である。すなわち、複合体の座標の知識
によって、当業者は、これらの座標を用いてのタンパク質のモデルを産生するこ
とが可能になる。表１、表２、または表３に特定される座標の基本的に単純な座
標変換によって示されるモデル（または、任意のモデル）は、従来開示されたよ
うな種々の方法において提示され得、そして本発明に含まれる。

【００４３】 別の実施形態において本発明のモデルは、精密化されて、モデルの改変の例で
ある改善されたモデルが得られ、また改変モデルとして反映される。精密化方法
は、さらなるデータ収集および分析；凍結結晶からのデータの収集；溶解性分子
の構造への導入；２次構造の浄化；ならびにＦｃＲと抗体もしくは阻害性化合物
間の結晶化された複合体、または結晶化ＦｃＲもしくは抗体のみの分析を含むが
、これらに限定されない。さらなるモデル精製の方法は、３Ｄモデルを分析して
置換がなされた場合、少なくとも１つの改善された機能を有するタンパク質を産
生するような、アミノ酸残基を予測する工程、すくなくとも１つのこのような置
換をもたらす工程、改変タンパク質の活性が予測に合うか否かを決定する工程、
そして必要な場合モデルを精製する工程を含む。改変が予測に合うか否かを決定
する方法は、改変タンパク質を産生し、そして改変タンパク質を用いてアッセイ
を実施して、このタンパク質が改善した機能（例えば、所望される活性、安定性
、および溶解特性）を呈するか否かを決定する工程を包含する。このような機能
を測定するためのアッセイは、当該分野で周知である；いくつかのこのようなア
ッセイは、本明細書で開示される。

【００４４】 本発明の別の実施形態は、表１、表２または表３における座標で示されるヒト
ＩｇＥ以外の抗体を示す改変された３Ｄモデルである。好ましくは、モデルにさ
れるタンパク質のアミノ酸配列は、公知である。このような場合、改変モデルは
、ホモロジーモデリングの技術を用いて、好ましくは他の抗体のアミノ酸配列の
全てまたは任意の部分を、表１、表２または表３の３Ｄモデルを示す座標中に取
り込むことによって（例えば、移植、オーバーレイまたは置換）作製されて改変
モデルを作製し得る。ホモロジーモデリングについての一般的技術はまた、分子
置換として呼ばれ、例えば、Ｇｒｅｅｒ、１９９０、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒ
ｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７、３１７〜３
３４；Ｈａｖｅｌら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１７，１〜７；Ｓｃ
ｈｉｆｆｅｒら、１９９０、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃ
ｔｉｏｎ、ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８、３０〜４３；およびＬａｔｔｍａｎ
、１９８５、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １１５、５５〜７７において開
示される。しかし、このような技術は、本発明までにＩｇＥ抗体のＦｃ領域に適
用されなかったので、利用できるＩｇＥの任意のＦｃ領域の３Ｄモデルがない。
したがって、ここで本発明は、抗体の多くの他の天然体および変異体の構造の溶
解を可能にする。

【００４５】 １つの実施形態において、Ｆｃ領域のモデル（例えば、Ｃε３／Ｃε４領域で
あるがこれに限定されない）は、公開された図から３Ｄ座標を抽出することによ
って、または他のドメイン由来（ここで、抗体のＦｃＲ結合ドメインは、ヒトＦ
ｃ−Ｃε３／Ｃε４_２２２タンパク質に対して予測されるように配向する）の原
子を含む３Ｄモデルを構築することによって産生される。例えば、本発明のモデ
ルは、２つの公知のＦｃＲ結合ドメインをベントコンフォメーションに、ドメイ
ン間の距離が約１０〜約２５Åまたは約２０〜約４０Åになるよう配向すること
によって産生され得る。別の実施例において、２つのＩｇドメイン間のヒンジを
表１、表２または表３中の座標によって特定される同様の様式において配向する
ことによりあるモデルが作製され得る。このようなモデルは、２つのＩｇドメイ
ン間（例えば、Ｃε３とＣε４の間）のヒンジが表１、表２または表３中に挙げ
られる構造座標によって特定される様式において配向されるモデルと呼ばれる。
次いでこのモデルは、さらなる分子置換方法において使用され得る。このような
方法は、以下の工程を含む；（ａ）３つの回旋によってモデルを配向する；そし
て（ｂ）１〜３方向にモデルを平行移動して、さらなるモデル改変を生じる。

【００４６】 ３Ｄモデルがホモロジーモデリングを用いて決定される適切な抗体は、ＩｇＥ
、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはＩｇＤ抗体についてのＦｃＲに結合するタン
パク質のような任意の哺乳動物抗体を含む。ＦｃＲに結合する好ましい抗体は、
ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、マウス、およびラット抗体を含む。本発明はまた、本
発明のモデルを産生するための他のＩｇドメインの使用を含む。

【００４７】 本発明の１つの実施形態は、タンパク質が非改変タンパク質に比べて改善され
た機能を有する抗体のＦｃ領域の３Ｄモデル、およびこのような改変モデルを産
生する方法である。このような改善された機能は、増大した活性、増大した安定
性および増大した溶解性を含むが、これらに限定されない。このような改変モデ
ルは、表１、表２または表３中に示される３Ｄモデルの座標の情報の分析に基づ
いて、少なくとも１つのアミノ酸の置換によって作製され得て、その結果、この
置換が改善した機能を有するタンパク質を誘導する。本明細書において使用され
るように、置換は、（１つ以上の）アミノ酸置換、挿入、欠損、反転および／ま
たは誘導体化（例えば、アセチル化、グリコシル化、リン酸化、ＰＥＧ改変、ビ
オチン化、およびタンパク質への他のリガンドまたは他の化合物の共有結合）を
いう。１つの実施形態において、合成化学的方法を用いて、フラグメントまたは
タンパク質の全体のいずれかを産生し、例えば、非天然アミノ酸または他の化合
物をＦｃ領域の構造に導入する。例えば、本発明の構造に基づいて、ＦｃＲ結合
活性を有するインタクトなタンパク質を産生することに関連し得る合成ペプチド
または大きなタンパク質を設計し得る。この構造は、これらのペプチドについて
の開始点および終点（例えば、表面に達し得るループ）を設計することを可能に
する。本発明に従い、置換または挿入されるアミノ酸は、天然アミノ酸または非
天然アミノ酸であり得、誘導体化アミノ酸を含む。改変される場合、改善された
機能を有するタンパク質を生じるタンパク質中の領域同定の方法は、以下に開示
される。

【００４８】 本発明は、本発明の３Ｄモデルを使用し、ＦｃＲと抗体の間の結合を阻害する
化合物を同定する工程を含む。阻害性化合物を同定するのに３Ｄモデルを使う利
点は、モデルが抗体のＦｃＲがＦｃ領域（すなわち、抗体結合ドメイン）（また
抗体結合部位として示される）の部位およびＦｃＲ結合ドメイン（またＦｃＲ結
合部位として示される）に結合する部位を示すという点で多種多様なことである
。抗体結合部位およびＦｃＲ結合部位は、共にＦｃＲ：抗体相互作用部位を形成
する。このように、多数の潜在的阻害性化合物は、実験室でインビトロまたはイ
ンビボの研究を実施する必要なく、最初に分析され得る。本明細書で用いられる
場合、阻害性化合物を同定する方法は、以下を含むがこれらに限定されない：Ｆ
ｃ領域の３Ｄモデルに基づく阻害性化合物の設計の方法、ＦｃＲへの抗体の結合
を実質的に阻害する化合物を同定するための潜在的な阻害剤である化合物を用い
てこのような３Ｄモデルを調査する方法、このような３Ｄモデルを用いてこのよ
うな結合を阻害する化合物を同定するために化合物データベースをスクリーニン
グする方法、およびこれらの組み合せ。３Ｄモデルを用いての適切な阻害性化合
物の設計、調査、またはスクリーニングするための方法は、当業者に公知である
。特に、このような方法を可能にする多数のコンピュータープログラムが存在す
る。例えば、ウィルソンらによって１９９５年１２月２８日に公開されたＰＣＴ
公開番号ＷＯ９５／３５３６７（本明細書において参考としてその全体が援用さ
れる）を参照のこと。

【００４９】 阻害性化合物は、抗体のＦｃＲへの結合を阻害する天然化合物または合成化合
物のいずれかであり得る。例は、以下を含むが、これらに限定されない；無機化
合物、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、
ペプチドまたは抗体の模倣物（例えば、抗体またはレセプターの結合部位の模倣
物）ならびに他の有機化合物。化合物は、競合的または非競合的な様式のいずれ
かで結合を阻害し得、結合部位においてかまたはアロステリックにかのいずれか
で相互作用し得る。阻害性化合物は、物理的または構造的に２つの存在間の結合
を阻害し得るようにＦｃＲおよび／または化合物に関連し得るはずである。この
ように阻害性化合物は、好ましくは小さくそして効果的に結合または分裂を予防
する構造である。阻害性化合物は、１つまたは複数の工程において同定され得る
。例えば、抗体とＦｃＲ間の結合をある程度阻害することが最初に同定された化
合物は、特性を改善（例えば、より大きな有効性、安全性、可溶性等）するため
の化合物を設計、調査、またはスクリーニングするための手がかりとして用いら
れ得る。好ましい阻害性化合物は、動物に投与する場合に血清濃度が約１ｎＭ〜
約１００μＭ、より好ましくは約１０ｎＭ〜約１０μＭの濃度で有効である化合
物である。

【００５０】 本発明の１つの実施形態は、ＩｇＥ抗体とＦｃεＲＩαタンパク質の間の結合
を阻害する化合物を同定する方法である。このような方法は、表１、表２、また
は表３に特定される原子座標を実質的に示す３Ｄモデルを用いて、このような化
合物を同定する工程を含む。本発明は、ＩｇＥ結合ドメインまたはＩｇＥ抗体の
レセプター結合ドメインに直接相互作用する阻害性化合物、およびこのような構
造に間接的に相互作用する化合物を含む。好ましくは、化合物は、少なくとも以
下の１つの領域に相互作用する：ＦｃεＲＩα結合ドメイン、抗体Ｆｃ領域の２
つのＣε３／Ｃε４ドメインの間の内部ドメインの溝領域、抗体ＦｃのＣε３ま
たはＣε４ドメインの間のヒンジ領域、およびＣε３またはＣε４ドメインの領
域、閉じているかレセプター結合したＦｃ−Ｃε３／Ｃε４コンフォメーション
の間での１Åより大きく変化する相対位置。Ｃε３ドメインにおける多くの残基
が、ＩｇＥの開いた形に比べて、ＩｇＥの閉じた形におけるＣε４ドメインに有
意に近いことは注目されるべきである。理論に束縛されることはないが、Ｃε３
残基およびＣε４残基に同時に（ただしＩｇＥの閉鎖形態においてのみ）作用し
得る分子が潜在的な阻害因子であると考えられる。標的となる領域は、レセプタ
ーが結合したＩｇＥ構造と閉じたＩｇＥ構造を比較してそれぞれの距離の変化が
有意（すなわち、１Åより大きい）である２つのドメインにおける残基のセット
を含む。好ましくは、Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４領域の閉鎖形態のＩｇＥ構造の２つ
のＣε３ドメインの間の距離は、約１０〜２５Åの範囲であり、より好ましくは
、１０〜１５Å、およびさらにより好ましくは、約１３Åである。好ましい実施
形態において、阻害性化合物は、少なくとも以下の領域の１つである：Ｃε２お
よびＣε３の間のリンカー（配列番号２のアミノ酸４、７、８、９、１０、およ
び１１）；Ｃε３のＢＣループ（配列番号２のアミノ酸３７、３８、および３９
）；Ｃε３のＤＥループ（配列番号２のアミノ酸６８、６９、および７０）；Ｃ
ε３のＦＧループ（配列番号２のアミノ酸９９、１００、１０１、および１０２
）；ドメイン間の溝部分を規定する（すなわち、隣接すること、形成すること）
ループ鎖；ＩｇＥ−Ｆｃ領域の十分な構成的可撓性を調節すると考えられるＣε
３のＡＢヘリックス（配列番号２のアミノ酸２０、２１、２２、２３、および２
４）；およびＣε３のこのＡＢヘリックス上にある領域（すなわち、ヒンジ部分
を構成、および配列番号２のアミノ酸１７、１８、および１９（鎖Ａの後）、ア
ミノ酸２９、３０、および３１（鎖Ｂの後）、ならびにアミノ酸１０９、１１０
、および１１１（鎖Ｇの後）を含む領域）。阻害性化合物と作用する特に好まし
いアミノ酸は、以下：（ａ）配列番号２の位置４、７、８、９、１０、１１、１
７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２９、３０、３１、３７、３
８、３９、６８、６９、７０、９９、１００、１０１、１０２、１０９、１１０
、または１１１；および（ｂ）（ａ）のこの残基のいずれかの約１０Å内にある
表面残基。さらにより好ましい残基は、以下：（ａ）配列番号２の位置４、７、
８、９、１０、１１、３７、３８、３９、６８、６９、７０、９９、１００、１
０１、または１０２の残基；（ｂ）Ｃε３またはＣε４ドメインの領域内の残基
であり、レセプターが結合したＦｃ−Ｃε３／Ｃε４構造と閉じたＦｃ−Ｃε３
／Ｃε４構造の間で１Åより大きい変化がある相対的位置；および（ｃ）（ａ）
または（ｂ）のこの残基のいずれかの約１０Å内にある表面残基。上に示される
領域の少なくとも１つにあるような、実施例において同定されるさらなる残基は
、また好ましい。１つの好ましい実施形態は、閉じた構造からレセプターが結合
した構造または開いた構造に変換するＩｇＥ抗体の能力を阻害する化合物である
。このような重要な領域および残基を同定する能力は、本発明の１つのモデルの
見方にすぎない。１つの実施形態において、本発明の阻害性化合物は、任意の同
定された領域の少なくとも一部またはこれらの誘導体に対応するペプチド（例え
ば、ペプチド模倣物、またはペプチドを模倣した他の化合物）である。

【００５１】 ＩｇＥ抗体およびＦｃεＲＩαタンパク質の間の結合を阻害する化合物を同定
するための方法の１つの実施形態は、以下の工程を含む：（ａ）表１、表２、ま
たは表３に挙げられる原子座標、またはこれらの結合ドメインを実質的に示すモ
デルをコンピューター画面上で作る工程；（ｂ）試験される化合物の空間的な構
造を作る工程；および（ｃ）化合物がこのＦｃＲ結合ドメインと作用するか否か
を決定するために試験する工程であって、ここで、このような作用は、化合物が
ＩｇＥ抗体のＦｃεＲＩαタンパク質への結合を阻害し得ることを示す。好まし
い実施形態において、工程（ａ）は、ＦｃＲに直接相互作用するモデルのＦｃＲ
結合ドメイン中の１つ以上のアミノ酸を同定する工程を含む。試験される好まし
い化合物は、１つ以上のこれらのアミノ酸に直接作用する。阻害性化合物が作用
するはずの好ましいアミノ酸は、本明細書に開示される。

【００５２】 本発明はまた、本明細書に開示される方法にしたがって単離される阻害性化合
物を含む。例えば、保護因子（例えば、予防的または治療的な）として使用する
のに十分な量でこのような化合物を産生する方法は、当業者に公知である。任意
の適切なＦｃ領域のモデルを産生するために本発明のモデル（すなわちモデル改
変）の使用の拡大およびこのようなＦｃ領域に対する抗体の結合を阻害する化合
物を同定することは、本発明の範囲において明らかである。

【００５３】 本発明の好ましい阻害性化合物、またはより効力のある阻害性化合物を産生す
るために用いられ得る誘導体は、飽和四環式炭化水素ペルヒドロシクロペンタノ
フェナントレン（ｐｅｒｈｙｄｒｏｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｏｐｈｅｎａｎｔｈ
ｒｅｎｅ）または、これの誘導体である。このような化合物は、以下の式を有す
る構造を含み得る：

【００５４】

【化２】

【００５５】 このような化合物は、式の中に示されていない場合でも、任意の数の「Ｒ」基を
有し得ることが理解されるはずである。飽和四環式炭化水素ペルヒドロシクロペ
ンタノフェナントレンの例は、以下を含むが、これらに限定されない：イソプレ
ノイド、テルペン、胆汁酸、洗浄剤（例えば、ＣＨＡＰＳおよびＣＨＡＰＳＯ）
、コレスタン、コール酸、コレステロール、アンドロゲン、エストロゲン、およ
び他のステロイド。好ましい阻害性化合物、またはより効力のある化合物を設計
するための誘導体として用いる化合物は、３−［３−（コラミドプロリル）ジメ
チルアンモニオ］−１−プロパン−スルホナート（ＣＨＡＰＳ）または同様の環
構造を有する化合物である。ＦｃεＲＩαタンパク質およびＦｃ−Ｃε３／Ｃε
４領域中のアミノ酸とＣＨＡＰＳの相互作用は、同書６０／１８９，８５３にさ
らに詳細に記載される。

【００５６】 １つの実施形態において、本発明の阻害性化合物は、二価または他の多価化合
物であり、この化合物は、高い親和性を有する２つのＣε３／Ｃε４ドメインと
相互作用するか、またはドメイン間の溝に結合するのに十分大きい（例えば、イ
ンビボで選択されるペプチド、ペプトイド、核酸、類似の分子、そのミメトープ
（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）のような高分子であるが、これらに制限されない）。

【００５７】 本発明はまた、抗体（特に、ＩｇＥ抗体）のＦｃ領域の改変された形態を合理
的に設計し、かつ構築するための本発明の３−Ｄモデルの使用を含み、この抗体
のＦｃ領域の改変された形態は、１つ以上の改良された機能（例えば、ＩｇＥ抗
体の未改変Ｆｃ領域と比較して増加した活性、増加した安定性および増加した安
定性であるが、これらに限定されない）を有する。本発明のムテインは、全長タ
ンパク質およびそのようなタンパク質のフラグメント（すなわち、短縮バージョ
ン）を含む。

【００５８】 本発明の１つの実施形態は、ＦｃＲのＦｃ結合ドメインに結合するムテインを
含むＦｃ領域である。このようなムテインは、配列番号２を含むタンパク質と比
較して改良された機能を有する。このような改良された機能の例としては、増加
した安定性、ＦｃＲに対する増加した親和性、変化した基質特異性および増加し
た溶解性が挙げられるがこれらに限定されない。このようなムテインは、以下の
工程を包含する方法によって産生され得る：（ａ）表１、表２または表３におい
て特定される原子座標を実質的に示す３−Ｄモデルを分析して、このモデルによ
って示されるタンパク質の少なくとも１つアミノ酸（特定のアミノ酸によって置
換される場合に、このタンパク質の改良された機能をもたらす）を同定する工程
；および（ｂ）同定したアミノ酸を置換して、改良された機能を有するムテイン
を産生する工程。座標の知識は、例えば、疎水性コアまたはその表面における特
定の残基を標的化すること、特定の特性（例えば、高い安定性、高い親和性、変
化した基質特異性または他の所望な特性（すなわち、改良された機能））につい
て、次いで選択され得る改変体の利用可能なセットを産生することを可能にする
。この座標のない場合、非常に多数の改変体を分析しなければならない（例えば
、約１０^１１のオーダーの可能性）。対照的に、この構造は、例えばファージデ
ィスプレイまたは他の方法によって所望の特性を選択するために、最も関連した
残基を選ぶのを可能にする。好ましい実施形態において、１つ以上のアミノ酸の
置換は、タンパク質の３−Ｄ構造を実質的に破壊しない；つまり、改変されたタ
ンパク質、すなわちムテインはなお、ＦｃＲに結合し得る。好ましいムテインは
、ＦｃεＲＩαタンパク質に結合するＩｇＥ抗体のＦｃドメインであるが、本発
明はまた、ＦｃＲの他のクラスに対するムテイン結合も含む。

【００５９】 １つの実施形態において、本発明のムテインは、その未改変対応部分と比較し
て増加した安定性を有する。本明細書中で使用される場合、増加した安定性とは
、例えば、より高いかまたはより低い温度に対して、より酸性のまたは塩基性の
ｐＨに対して、より高いかまたはより低い塩濃度に対して、酸化および／または
還元に対して、他の化学分解の形態に対して、ならびにタンパク質分解に対して
、未改変Ｆｃ領域と比較してさらに耐性であるムテインの能力をいう。増加した
安定性はまた、保管の間（すなわち、より長い貯蔵寿命を有する）または使用の
間（すなわち、反応条件下でより長い半減期を有する）のいずれかの長い期間に
、未改変タンパク質よりも安定である、本発明のムテインの能力をいい得る。本
発明のムテインはまた、アンフォールディングの減少したエントロピーを示し得
、それによってタンパク質を安定化する。増加した安定性は、当業者に公知の種
々の方法を用いて測定され得る：例としては、以下の決定が挙げられるがこれら
に限定されない：融解温度、熱変性、圧力変性、アンフォールディングのエンタ
ルピー、タンパク質の自由エネルギーまたは例えば、尿素、塩化グアニジウム、
チオシアン酸グアニジウムなどのカオトロピズム薬剤の存在下での安定性。本発
明の好ましいムテインは、未改変Ｆｃ領域の融解温度よりも実質的に高い融解温
度を有する。好ましくは、ムテインの融解温度は、対応する未改変タンパク質の
融解温度よりも、少なくとも約１℃高く、そしてより好ましくは、約１０℃高い
。対応する未改変タンパク質の活性ｐＨ領域よりも、少なくとも約１ ｐＨ単位
高いおよび／または低いｐＨ領域にわたる結合活性を有するムテインもまた好ま
しい。

【００６０】 本発明の別の実施形態は、その未改変対応部分と比較して、ＦｃＲに対する増
加した親和性を示すムテインである。本明細書中で使用される場合、増加した親
和性を有するムテインは、その未改変対応部分よりも、高い親和性定数（Ｋ_Ａ）
または低い解離定数（Ｋ_Ｄ）を示すＦｃ領域である。このようなより高い親和性
定数は、ムテインとＦｃＲとの間の会合速度（ｋ_ａ）を増加させ、そして／また
はムテインとＦｃＲとの間の解離速度（ｋ_ｄ）を減少させることによって達成さ
れ得る。本発明の好ましいムテインは、約３．３×１０^−１０モル／リットル（
Ｍ）より小さいかまたは等しいＫ_Ｄと当量な、少なくとも約３×１０^９リットル
／モル（Ｍ^−１）のＦｃＲについてのＫ_Ａを有する。より好ましくは、少なくと
も約２×１０^１０Ｍ^−１、そしてなおさらに好ましくは、少なくとも約１×１０ ^１１ Ｍ^−１のＦｃＲについてのＫ_Ａを有するムテインである。少なくとも約１×
１０^５リットル／モル−秒のＦｃＲについてのｋ_ａを有するムテインおよび３×
１０^−５／秒より小さいかまたは等しいＦｃＲについてのｋ_ｄを有するムテイン
もまた好ましい。より好ましくは、少なくとも約３×１０^５リットル／モル−秒
、そしてなおさらに好ましくは、１×１０^６リットル／モル−秒のＦｃＲについ
てのｋ_ａを有するムテインである。約１×１０^−５／秒より小さいかもしくは等
しいか、またはなおより好ましくは、３×１０^−４／秒より小さいかまたは等し
いＦｃＲについてのｋ_ｄを有するムテインもまた好ましい。好ましいＦｃＲは、
ＦｃεＲＩαである。このような結合定数を測定する方法は、当業者に周知であ
る；例えば、Ｃｏｏｋら、１９９７，同書（これは、ヒトＦｃεＲＩαタンパク
質のヒトＩｇＥへの結合に関する以下の値を報告している：３．５（±０．９）
×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１のｋ_ａ１；８．６（±３．５）×１０^４Ｍ^−１ｓ^−１のｋ _ａ２ ；１．２（±０．１）×１０^−２ｓ^−１のｋ_ｄ１；３．２（±０．８）×１
０^−５ｓ^−１のｋ_ｄ２；２．０×１０^７Ｍ^−１のＫ_Ａ１；２．９×１０^９Ｍ^−１ のＫ_Ａ２）を参照のこと。

【００６１】 本発明の別の実施形態は、その未改変対応部分と比較して変化した基質特異性
を示すムテインである。変化した基質特異性を示すムテインは、その未改変対応
部分による通常の結合よりも異なる型の抗体クラスまたは抗体種に関して、Ｆｃ
Ｒに増加した親和性で結合するムテインである。１つの実施形態において、変化
した基質特異性を有するヒトＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域のムテインは、別の哺乳
動物のＩｇＥ抗体（例えば、イヌＩｇＥ抗体、ネコＩｇＥ抗体、ウマＩｇＥ抗体
、マウスＩｇＥ抗体またはラットＩｇＥ抗体であるが、これらに限定されない）
に結合するレセプターに、増加した親和性で結合するＦｃ領域である。別の実施
形態において、変化した基質特異性を有するヒトＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域のム
テインは、別のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＤ（ＩｇＧ
が好ましい））の抗体についてＦｃレセプターに、増加した親和性で結合するＦ
ｃ領域である。このようなムテインはまた、変化した種の基質特異性を示す。ム
テインが変化した基質特異性を示すか否かを決定する方法は、当業者に周知であ
る。

【００６２】 本発明のなお別の実施形態は、その未改変の対応部分と比較して増加した溶解
性を示すムテインである。このようなタンパク質は、凝集体をほとんど形成しな
いようである。ムテインが増加した溶解性を示すか否かを決定する方法は、当業
者に周知である。

【００６３】 本明細書中に開示されるように、表１、表２または表３において実質的に座標
を表す３−Ｄモデルは、改良された機能を有するムテインを生成するための（例
えば、改変するために標的を同定して、改変された機能を有するムテインを得る
ための）戦略を決定する際に有利である。標的の例としては、ＦｃεＲＩαタン
パク質と直接的にかまたは間接的に相互作用するＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域の標
的領域が挙げられるがこれらに限定されない。

【００６４】 本発明に従って、改良された機能を有するムテインは、本発明の３−Ｄモデル
の分析から得られる情報に基づいて少なくとも１つアミノ酸を置換して、改良さ
れた機能を有するムテインを生成する工程を含有する方法によって生成され得る
。例えば、ヒトＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域の構造の認識は、改良された機能に影
響を与える置換、挿入、欠失、転化および／または誘導体化の予測および生成を
許容することによって、タンパク質の合理的設計および改変された形態の構築を
許容する。つまり、本発明の３−Ｄモデルの分析は、アミノ酸残基が重要であり
、そして例えば、アミノ酸がタンパク質に損害を与えることなしに変化されるよ
うに情報を提供する。アミノ酸置換を行う際に、類似の原子数を有し、かつ目標
がこのような相互作用を意図的に変化させることではない限り、塩架橋、疎水性
相互作用および水素結合の保存を可能にするアミノ酸置換の使用が好ましい。ヒ
トＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域の３−Ｄ構造は、大きな欠失が特にタンパク質の種
々のドメイン間の関係および大部分の構造が結晶中に十分に整理されているとい
う観察に起因して、望まれなくてもよいことを示唆する。

【００６５】 タンパク質の機能を改良し得る１つのアミノ酸置換がその機能を実質的に改良
し得るが、１つより多くのアミノ酸置換がこの置換の数および配置に依存して累
積的に変化を生じ得ることが理解されるべきである。例えば、タンパク質の安定
性を実質的に増加し得る１つのアミノ酸置換は、その改変したタンパク質の融解
温度を約１℃増加し得るが、約５から約６の置換は、得られるタンパク質の融解
温度を約１０℃増加し得る。

【００６６】 本発明に従って、Ｆｃ領域の３−Ｄモデルが、当業者に公知の技術を使用して
分析されて、溶媒に対してモデル内に示されるアミノ酸の接近性を決定し得る。
このような情報は、例えば、表４または表５に提供される。

【００６７】 多数の方法が、本発明のムテインを生成するために使用され得る。１つの方法
は、以下の工程を包含する：（ａ）表１、表２または表３に特定化される座標を
実質的に示す３−Ｄモデルを分析して、モデル化したタンパク質の少なくとも１
つのアミノ酸（このアミノ酸は、特定化したアミノ酸により置換される場合、改
良された機能に影響をもたらす）を同定する工程；および（ｂ）同定したアミノ
酸を置換して、改良された機能を有するムテインを生成する工程。１つの実施形
態において、ムテインを生成する方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ヒトＦ
ｃ−Ｃε３／Ｃε４領域のモデルの重要な領域を、未改変Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４
領域と比較した改良された機能を有するＦｃ領域のアミノ酸配列と比較して、改
良された機能を有するＦｃ領域の少なくとも１つのアミノ酸セグメントを同定す
る工程であって、このアミノ酸セグメントは、このモデルによって示されるＦｃ
−Ｃε３／Ｃε４領域に取り込まれた場合、Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４領域に改良さ
れた機能を与える工程；および（ｂ）Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４領域にこのセグメン
トを取り込み、それによって改良された機能を有するムテインを提供する工程。
別の実施形態において、タンパク質を生成する方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）ヒトＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域を表すモデルを使用して、変異誘発によっ
て無作為化され得る残基の３−Ｄ配置を同定し、改良された機能が選択され得る
分子のライブラリーの構築を可能にする工程；および（ｂ）改良された機能を有
する変異誘発されたライブラリーの少なくとも１つのメンバーを同定する工程。
１つの例において、ムテインは、以下の工程を包含する方法によって生成され得
る：（ａ）そのタンパク質のモデルを分析することによって同定されるようなＦ
ｃ−Ｃε３／Ｃε４領域の標的（例えば、ＦｃＲ結合ドメイン）をコードする核
酸分子の無作為な変異誘発を実施する工程；（ｂ）このような変異誘発した核酸
分子をファージディスプレイライブラリーにクローニングする工程（ここで、こ
のファージディスプレイライブラリーはこの標的を発現する）；および（ｃ）改
良された機能を有する標的（例えば、ＦｃＲに対する増加した親和性を示すＦｃ
Ｒ結合ドメイン）を発現するライブラリーの少なくとも１つのメンバーを同定す
る工程。上記のように、このモデルは、このモデルの非存在下において達成され
得ない簡単な様式におけるこの技術の使用を可能にする。これらの方法が、本発
明のムテインを生成するための本発明の他のモデルを用いてもまた使用され得る
こともまた注意のこと。

【００６８】 本発明は、本発明の３−Ｄモデルの分析に基づいた、多数の方法を包含し、本
発明のムテインを生成するためにこのモデルによって表されるタンパク質の少な
くとも１つのアミノ酸残基を置換する（すなわち、付加、除去、置換、反転、誘
導化）。このような方法は、以下の工程を含むがこれらに限定されない：（ａ）
少なくとも１つの非強制ループ中の少なくとも１つのアミノ酸を置換する工程；
（ｂ）アミノ末端のアミノ酸残基をカルボキシル末端のアミノ酸残基に連結する
工程；（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸部位を誘導化に適したアミノ酸で置換す
る工程；（ｄ）タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸対をシステイン対で置換
して、タンパク質を安定化するジスルフィド結合の形成を可能にする工程；（ｅ
）ＦｃεＲＩα結合ドメインの少なくとも１つのアミノ酸を置換して、ＩｇＥ
Ｆｃ領域と対応するＦｃＲとの間の親和性を増加させる工程；（ｆ）タンパク質
の少なくとも１つのアミノ酸をあるアミノ酸で置換して、それによって、この置
換がこのタンパク質のアンフォールディングのエントロピーを減少させる、工程
；（ｇ）タンパク質の少なくとも１つのアスパラギンおよびグルタミンを、置換
されるよりも脱アミノ反応を受けにくいアミノ酸で置換する工程；（ｈ）少なく
とも１つのメチオニン、ヒスチジンまたはトリプトファンを、置換されるよりも
酸化反応または還元反応を受けにくいアミノ酸で置換する工程；（ｉ）タンパク
質の少なくとも１つのアルギニンを、置換されるよりもジカルボニル化合物改変
を受けにくいアミノ酸で置換する工程；（ｊ）タンパク質機能を減少させるのに
十分な還元糖と反応を受けやすいタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を、こ
の反応を受けにくいアミノ酸で置換する工程；（ｋ）タンパク質の少なくとも１
つのアミノ酸をこのタンパク質の内部コアの安定性を増加し得るアミノ酸で置換
する工程；（ｌ）タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を少なくとも１つのＮ
連結グリコシル化部位で置換する工程；（ｍ）タンパク質の少なくとも１つのＮ
連結グリコシル化部位を、Ｎ連結グリコシル化部位を含有しない少なくとも１つ
のアミノ酸で置換する工程；ならびに（ｎ）タンパク質の少なくとも１つのアミ
ノ酸をこのタンパク質の凝集を減少させるアミノ酸で置換する工程。本発明のム
テインは、ＰＣＴ ＷＯ００／２６２４６、同書（本明細書中にその全体が参考
として援用されるこのような方法は、本発明のＦｃ−Ｃε３／Ｃε４ムテインに
適用され得る）において開示されるものと類似の方法および原理を用いて生成さ
れ得る。

【００６９】 アミノ酸置換は、以下を含む当業者に公知の組換えＤＮＡ技術を用いて実行さ
れ得る：部位指向型変異誘発（例えば、オリゴヌクレオチド変異誘発、無作為的
変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）−補助変異誘発、ギャップ−環状
部位指向型変異誘発（ｇａｐｐｅｄ−ｃｉｒｃｌｅ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅ
ｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）または所望のタンパク質（例えば、ヒトＦｃεＲ
Ｉαタンパク質であるが、これに限定されない）をコードする核酸分子の化学的
合成法、引き続く適した発現系（好ましくは、昆虫、哺乳動物、細菌、酵母、昆
虫または哺乳動物発現系）における変異遺伝子。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
同書を参照のこと。

【００７０】 本発明のムテインが、改変していないアミノ酸を含み得ることが理解されるべ
きである。なぜなら、これらのアミノ酸は、タンパク質の機能にネガティブに影
響を与えるからである。このようなアミノ酸は、本発明の３−Ｄモデルを用いて
同定され得る。

【００７１】 本発明のモデルの使用を拡張して、任意の適切なＦｃＲまたは他のＩｇドメイ
ン含有タンパク質に対する改変のモデルを生成し、かつこの改変を作製して、所
望の機能を有するムテインを生成することが、本発明の範囲内であることもまた
理解されるべきである。

【００７２】 抗体ムテインは、診断用途および治療用途を含むがそれらに限定されない種々
の用途を有する。例えば、ムテインを使用して、抗体レセプタータンパク質を発
現する細胞を、画像化し得る（例えば、肥満細胞癌、喘息および他の病状を検出
するためか、または例えば、誘導化ＩｇＥの放射免疫療法を用いて抗体レセプタ
ータンパク質を発現する癌を処置するためのインビボ画像化についてのＮＭＲ−
特異的標識など）。ムテインはまた、アトピー性個体において（例えば、一工程
のＦＡＣＳ分析のためのタグを用いて）ＦｃＲ発現をモニタリングするためにか
、またはアトピー性個体においてＩｇＥをモニタリングするために使用され得る
。ムテインはまた、インヒビターとしてかまたは毒素ＩｇＥ−Ｆｃ融合タンパク
質として使用されて、ＦｃＲ発現細胞を標的化し、それらを殺す（例えば、肥満
細胞腫瘍または重度のアレルギーにおいて）。また、低い親和性のＩｇＥレセプ
ター（ＦｃｅＲＩＩ）結合に影響を与えるが、ＦｃｅＲＩ結合に影響を与えない
ムテインが、設計または選択され得る。

【００７３】 本発明はまた、本発明のムテインをコードする核酸分子ならびにこのような核
酸分子を含む組換え分子および組換え細胞を含む。このようなタンパク質を生成
する方法はまた、本明細書中に開示される。

【００７４】 本発明はまた、本発明の３−Ｄモデルによって同定されるような以下の新規な
構造物を含む。ＩｇＥとＦｃεＲＩαとの間の直接的な相互作用を示す好ましい
構造物は、ＦｃεＲＩα結合ドメイン、上記抗体Ｆｃ領域タンパク質の２つのＣ
ε３／Ｃε４ドメイン間のドメイン間の溝、上記抗体Ｆｃ領域のＣε３とＣε４
ドメインとの間のヒンジ、およびＣε３またはＣε４ドメインの領域、閉鎖Ｆｃ
−Ｃε３／Ｃε４コンフォメーションとレセプター結合Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４コ
ンフォメーションとの間で１Åより大きく変化する相対的な位置。好ましい組成
物は、Ｃε２とＣε３との間のリンカー、Ｃε３のＢＣループ、Ｃε３のＤＥル
ープおよびＣε３のＦＧループ、ドメイン間の溝を規定するループおよび鎖、Ｃ
ε３のＡＢヘリックスならびに上記Ｃε３のＡＢヘリックスの上にわたる領域。
本発明はまた、このような組成物をコードするための核酸分子を含む。

【００７５】 本発明はまた、以下からなる群から選択される単離されたＦｃ−Ｃε３／Ｃε
４タンパク質を含む：（ａ）配列番号２からなるタンパク質；および（ｂ）（ａ
）のタンパク質に構造的に相同な単離されたタンパク質。ここで前記（ｂ）のタ
ンパク質は、ＦｃεＲＩαタンパク質に結合する。昆虫細胞中で生成されるこの
ようなタンパク質もまた、本発明に含まれる。１つの実施形態において、Ｆｃ−
Ｃε３／Ｃε４タンパク質は、ヒトＦｃ−Ｃε３／Ｃε４タンパク質、イヌＦｃ
−Ｃε３／Ｃε４タンパク質、ネコＦｃ−Ｃε３／Ｃε４タンパク質、ウマＦｃ
−Ｃε３／Ｃε４タンパク質、マウスＦｃ−Ｃε３／Ｃε４タンパク質またはラ
ットＦｃ−Ｃε３／Ｃε４タンパク質である。本発明はまた、このようなタンパ
ク質をコードする核酸分子、ならびにこのような核酸分子を含む組換え分子、組
換え細胞および組換えウイルスを含む。このような核酸分子、組換え分子、組換
えウイルスおよび組換え細胞を用いてこのようなタンパク質を生成する方法もま
た含まれる。

【００７６】 本発明はまた、本発明のタンパク質（未改変のタンパク質、このようなタンパ
ク質内の新規の構造物およびムテインを含むがこれらに限定されない）をコード
する単離された核酸分子を含む。本明細書中で使用される場合、タンパク質をコ
ードする単離された核酸分子は、その自然環境から取り出された核酸分子である
。従って「単離された」か、核酸分子が精製された程度までを反映しない。単離
された核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかの
誘導体であり得る。

【００７７】 本発明のムテインをコードする核酸分子は、これまで開示された組換えＤＮＡ
技術を用いて、または化学合成によって、親タンパク質遺伝子（例えば、改変さ
れていないまたは既に改変されたタンパク質コード遺伝子、またはその部分）の
変異によって生成され得る。得られたムテイン核酸分子は、当業者に公知の組換
えＤＮＡ技術（例えば、ＰＣＲ増幅またはクローニング（例えば、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら、同書を参照のこと））、または化学合成によって増幅され得る。ムテイ
ンはまた、未改変のタンパク質をコードする核酸分子またはムテインをコードす
る遺伝子により発現されるタンパク質の化学改変により生成され得る。

【００７８】 本発明のタンパク質は、種々の方法（組換えタンパク質の生成および回収なら
びに化学合成を含む）で生成され得る。１つの実施形態では、本発明のタンパク
質は、タンパク質を生成するのに有効な条件下でタンパク質を発現させ得る細胞
を培養し、そしてこのタンパク質を回収することによって生成される。培養に好
ましい細胞は、このタンパク質を発現させ得る組換え細胞であり、この組換え細
胞は、本発明の１つ以上の核酸分子で宿主細胞を形質転換することによって生成
される。宿主細胞への核酸分子の形質転換は、核酸分子が細胞に挿入され得る任
意の方法によって達成され得る。形質転換技術としては、トランスフェクション
、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸
着、およびプロトプラスト融合が挙げられるが、これらに限定されない。組換え
細胞は、単細胞のままであっても、または成長して組織、器官、または多細胞生
物になってもよい。本発明の形質転換された核酸分子は、染色体外のままであり
得るか、または発現されるそれらの能力が保持される様式で宿主細胞の染色体内
の１つ以上の部位に組み込まれ得る。

【００７９】 形質転換するのに適切な宿主細胞は、形質転換され得る任意の細胞が挙げられ
る。宿主細胞は、形質転換されていない細胞または少なくとも１つの核酸分子で
既に形質転換された細胞のいずれかであり得る。本発明の宿主細胞は、本発明の
タンパク質を内因的に（すなわち、天然に）生成し得るが、しかし、このような
細胞は、好ましくない。本発明の宿主細胞は、本発明の核酸分子で形質転換され
た場合、本発明のタンパク質を生成し得る任意の細胞（細菌細胞、酵母細胞、他
の真菌類細胞、昆虫細胞、動物細胞、および植物細胞を含む）であり得る。好ま
しい宿主細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が
挙げられ、そしてより好ましい宿主細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ細胞
、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞、Ｐｉｃｈｉａ細胞
、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ細胞、および哺乳動物
細胞が挙げられる。特に好ましい宿主細胞は、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ
細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞であり、Ｔ．ｎｉ
細胞が特に好ましい。

【００８０】 組換え細胞は、好ましくは、１つ以上の転写制御配列を含む発現ベクターに作
動可能に連結された本発明の核酸分子を含む組換え分子で宿主細胞を形質転換す
ることにより生成される。句「作動可能に連結された」とは、核酸分子が宿主細
胞に形質転換された場合に発現され得るような様式で、発現ベクターにこの分子
が挿入されることをいう。本明細書中で使用されるように、発現ベクターは、宿
主細胞を形質転換し、この宿主細胞内で複製し、そして特定された核酸分子の発
現を行い得るＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターである。発現ベクターは、原
核生物または真核生物のいずれかであり得、そして代表的には、ウイルスまたは
プラスミドである。本発明の発現ベクターとしては、本発明の組換え細胞（細菌
細胞、酵母細胞、他の真菌類細胞、昆虫細胞、動物細胞、および植物細胞を含む
）において機能する（すなわち、遺伝子発現を指向する）任意のベクターが挙げ
られる。本発明の好ましい発現ベクターは、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、お
よび哺乳動物細胞において遺伝子発現を指向し得る。

【００８１】 本発明の核酸分子は、宿主細胞に適合性であり、かつ核酸分子の発現を制御す
る調節制御配列（例えば、プロモーター、オペレーター、リプレッサー、エンハ
ンサー、終結配列、複製起点、および他の調節制御配列）を含む発現ベクターに
作動可能に連結され得る。特に、本発明の組換え分子は、転写制御配列を含む。
転写制御配列は、転写の開始、延長、および終結を制御する配列である。特に重
要な転写制御配列は、転写開始を制御する配列（例えば、プロモーター配列、エ
ンハンサー配列、オペレーター配列、およびリプレッサー配列）である。適切な
転写制御配列としては、本発明の組換え細胞の少なくとも１つで機能し得る任意
の転写制御配列が挙げられる。このような種々の転写制御配列は、当業者に公知
である。好ましい転写制御配列としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、およ
び哺乳動物細胞において機能する配列が挙げられる。

【００８２】 組換えＤＮＡの技術の使用が、例えば、宿主細胞中の核酸分子コピー数、それ
らの核酸分子が転写される効率、生じる転写物が翻訳される効率、および翻訳後
修飾の効率を操作することによって形質転換された核酸分子の発現を改良し得る
ことは、当業者によって理解され得る。本発明の核酸分子の発現を増加させるた
めに有用な組換え技術としては、核酸分子の高コピー数のプラスミドへの作動可
能な連結、この核酸分子の１つ以上の宿主細胞染色体への組み込み、ベクター安
定性配列（ｖｅｃｔｏｒ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のプラスミ
ドへの付加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハ
ンサー）の置換または改変、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、
シャイン‐ダルガーノ配列）の置換または改変、宿主細胞のコドン用法に対応す
る本発明の核酸分子の改変、転写を不安定化する配列の欠失、および発酵の間一
時的に組換え細胞増殖を組換えタンパク質産生から切り離す制御シグナルの使用
が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の発現された組換えタンパク質
の活性は、このようなタンパク質をコードする核酸分子を断片化、修飾、または
誘導体化することによって、改変され得る。

【００８３】 本発明に従って、組換え細胞を使用して、このようなタンパク質を産生するの
に効率的な条件下で、このような細胞を培養することによってタンパク質を産生
し、そしてそのタンパク質を回収し得る。タンパク質を産生するのに効率的な条
件としては、タンパク質産生を可能にする適切な培地、バイオリアクター、温度
、ｐＨおよび酸素条件が挙げられるが、これらに限定されない。適切な培地とは
、本発明の細胞が、培養される場合、タンパク質を産生し得る任意の培地をいう
。効果的な培地としては、代表的に、同化性糖質源、窒素源およびリン酸源なら
びに適切な塩、無機質、金属および他の栄養素（例えば、ビタミン）を含む水性
培地である。培地は、複合栄養素を含み得るか、または規定される最小培地であ
り得る。本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター（バッチ、フェッド・バ
ッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）、細胞リサイクル、および連続ファーメンター（ｃ
ｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ）が挙げられるが、これらに限定され
ない）において培養され得る。培養はまた、振とうフラスコ、試験管、マイクロ
タイターディッシュ、およびペトリ皿中でも行われ得る。培養は、組換え細胞に
適した温度、ｐＨ、および酸素含有量で行われる。このような培養条件は、当業
者に周知である。

【００８４】 産生に使用されるベクター系および宿主系に依存して、生じたタンパク質は、
組換え細胞内に残存し得るか；発酵培地に分泌され得るか；２つの細胞膜間の間
隙（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ中のペリプラズム間隙）に分泌され得るか；または細
胞膜またはウイルス膜の外表面上に保持され得るかのいずれかである。句「タン
パク質の回収」は、単純にタンパク質を含む全発酵培地を収集することであり、
そして分離または精製のさらなる工程を意味する必要はない。本発明のタンパク
質は、種々の標準的タンパク質精製技術（例えば、アフィニティークロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水的相互作用クロ
マトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、クロ
マトフォーカシングおよび差次的可溶化を含むが、これらに限定されない）を用
いて、精製され得る。

【００８５】 本発明はまた、本発明のＦｃ領域に選択的に結合する単離された（すなわち、
自然環境から取り出された）抗体を含む。本明細書中で使用される場合、用語「
選択的に結合する」は、本発明のＦｃ領域に優先的に結合するための本発明の抗
体の能力をいう。結合は、当該分野において標準的な種々の方法（例えば、酵素
イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、イムノブロットアッセイなど）を使用
して、測定され得る；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（同書）を参照のこと。本発
明の単離された抗体は、体液（例えば、血清を含むが、これに限定されない）中
の抗体、または異なる程度で精製された抗体を含み得る。本発明の抗体は、ポリ
クローナルであってもよいし、モノクローナルであってもよい。このような抗体
の機能的等価物（例えば、抗体フラグメントおよび遺伝子操作された抗体（単鎖
抗体または１を超えるエピトープに結合し得るキメラ抗体を含む））もまた、本
発明に含まれる。抗体は、当業者に公知の方法を使用して産生され得る。本発明
の抗体を産生する好ましい方法は、（ａ）抗体を産生するために有効量の本発明
のタンパク質を動物に投与する工程および（ｂ）抗体を回収する工程を包含する
。別の方法において、本発明の抗体は、本発明のタンパク質を産生するための以
前に開示されているような技術を使用して、組換え的に産生される。定義される
タンパク質に対して惹起される抗体は、このような抗体が、診断アッセイにおけ
る干渉または治療的組成物で使用される場合の副作用を他に引き起こし得る他の
物質に対する抗体を実質的に混入していないので、有利である。

【００８６】 本発明の抗体は、本発明の範囲内である種々の潜在的用途を有する。このよう
な用途の例は、ＷＯ９８／２７２０８（同書）（例えば、２４頁を参照のこと）
において開示される；このような用途は、その全体が本明細書中において参考と
して援用される。

【００８７】 本発明のＦｃ領域は、抗体に結合するＦｃ領域の少なくとも部分および二次分
子（基質に結合されないＦｃ領域と少なくとも同程度有効な様式で、抗体レセプ
ター部分が抗体に結合するような様式で、キメラ分子を基質に結合させ得る）を
含むキメラ分子を含み得る。適切な二次分子の例としては、免疫グロブリン分子
の部分または基質上に固定され得る適切な結合パートナーを有する別のリガンド
（例えば、ビオチンおよびアビジン、または金属結合タンパク質および金属（例
えば、Ｈｉｓ）、または糖結合タンパク質および糖（例えば、マルトース））を
含む。

【００８８】 本発明は、動物におけるアレルギーの診断および処置ならびに他の免疫応答の
調節のための本発明のＦｃ領域、それに対する抗体、および阻害的化合物の使用
を含む。

【００８９】 １つの実施形態は、以下の治療的化合物の少なくとも１つを含む治療的組成物
である：本発明の阻害的化合物、本発明のムテイン、または本発明の抗体。また
、動物をアレルギーまたは他の異常な免疫応答から保護する方法も含まれる。こ
のような方法は、本発明の治療的組成物を動物に投与する工程を包含する。本明
細書中で使用される場合、動物をアレルギーまたは他の異常な免疫応答から保護
する本発明の治療的組成物の能力は、この組成物がアレルギーまたは他の異常な
免疫応答を、例えば、処置、改善または予防する能力をいう。治療的組成物の全
般的特徴ならびにこのような治療的組成物を産生および使用するための方法は、
例えば、ＷＯ９８／２７２０８（同書）（例えば、３９〜４７頁を参照）中に開
示され；このような組成物および方法は、本明細書中においてその全体が参考と
して援用される。ＷＯ９８／２７２０８（同書）に開示される組成物および使用
は、ネコのＦｃεＲＩαタンパク質に関するが、これらはまた、本発明の治療的
組成物にも適用可能であることも留意されるべきである。本発明の治療的組成物
は、それらが本発明の３−Ｄモデルの分析に由来し得、そして改良された機能（
例えば、効力および安全性）を有するので、有利である。

【００９０】 別の実施形態は、本発明のムテインを含む診断試薬である。本明細書中で使用
される場合、診断試薬は、動物におけるアレルギーまたは他の異常免疫応答を検
出するために使用されるムテインを含む組成物である。また、（ａ）アレルギー
もしくは他の異常免疫応答、またはそれらに対する感受性を動物において検出す
るため（本発明のムテインを含む診断試薬の使用を含む）、および（ｂ）ＩｇＥ
またはＦｃＲ結合アッセイの性能を高めるため、の方法（インビボの方法および
インビトロの方法を含む）も本発明に含まれ、上記方法は、本発明のムテインを
アッセイに組み込む工程を包含する。診断試薬の一般的特徴ならびにこのような
診断試薬を産生および使用するための方法は、例えば、ＷＯ９８／２７２０８（
同書）（例えば、２〜３９頁を参照）中に開示され；このような試薬および方法
は、本明細書中においてその全体が参考として援用される。ＷＯ９８／２７２０
８（同書）に開示される試薬および使用は、ネコのＦｃεＲＩαタンパク質に関
するが、これらはまた、本発明の診断試薬、キット、および検出方法にも適用可
能であることも留意されるべきである。本発明のムテインは、このような適用に
おいて、抗体に対するそれらの増強された親和性、改変された特異性、増強され
た可溶性および／または増強された安定性、例えば、別の反対の条件における使
用を可能にすること、および延長される貯蔵寿命の理由から、有利である。

【００９１】 以下の実施例は、例示の目的のために提供され、そして本発明の範囲を制限す
ることを意図されない。

【００９２】 （実施例） （実施例１） この実施例は、本発明の結晶およびモデルの産生および分析を記載する。Ｆｃ
−Ｃｅ３／Ｃｅ４残基の番号付は、Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎら、（同書）の慣例に
従うことが留意されるべきである。

【００９３】 可溶性ＩｇＥの、その高親和性レセプター（ＦｃεＲＩ）への結合は、アレル
ギー応答および抗寄生生物免疫に関連する事象のカスケードにおいて、必要不可
欠な工程である^１−３。抗原によるレセプター結合型ＩｇＥの架橋は、エフェク
ター細胞活性へ導く細胞内シグナル伝達事象を誘発する^４。この実施例は、Ｆｃ
εＲＩに結合するヒトＩｇＥ−Ｆｃドメイン（Ｃε３およびＣε４）の２．３Å
結晶構造の溶液を記載し、これの座標は表１に開示される。ＩｇＥ−Ｆｃ結晶構
造は、ＩｇＧ−Ｆｃ構造と比較する場合、Ｃε３ドメインの大きい（約１５°）
三次再配列を表し、ＩｇＥ−Ｆｃは、ＦｃεＲＩに結合する。遊離のＩｇＥ−Ｆ
ｃは、Ｃε３ドメインを「閉鎖」形状に密接に近接して配置するさらにコンパク
トな配置を採用して、レセプター結合ループを妨害する。このＩｇＥ−Ｆｃのコ
ンフォメーション変化は、Ｃε３ドメイン内に位置する３つの順応性のあるセグ
メントによって媒介されていて、ドメイン間の結合ループによるものではない。
ＩｇＥ−Ｆｃのこの「閉鎖」構造は、異なる抗体のクラスのエフェクタードメイ
ンにおける新規のコンフォメーション変化についての可能性を際立たせ、そして
アレルギーおよび喘息の処置のための治療化合物の設計についての新規な方法を
提案する。

【００９４】 抗体Ｆｃドメインの細胞性抗体レセプターとの相互作用は、種々の抗体レパー
トリーを、免疫系の多くのエフェクター細胞に結合する。抗体サブクラス（Ｉｇ
Ｅ、ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体を含む）に対して特異的なＦｃレセプターは、造血
系の細胞の重複しているが個別のサブセットで見出され、それによって免疫応答
の個別の機構を誘引（ｔｒｉｇｇｅｒ）し得る^{１、４、５}。ＩｇＥ媒介免疫反応
は、寄生生物感染、アレルギーおよび喘息に関連している。

【００９５】 ＩｇＥ抗体は、２つのＦａｂおよび３つの定常ドメイン（Ｃε２、Ｃε３、Ｃ
ε４）の二量体によって形成される１つのＦｃからなる。ＩｇＧ分子と比較する
と、ＩｇＥは、ＩｇＧのリンカー領域に取って代わる更なる定常ドメイン（Ｃε
２）を有し、一方ＩｇＥの Ｃε３およびＣε４ドメインはＩｇＧのＣγ２およ
びＣγ３ドメインに相同的である。インタクトＩｇＥおよびＦｃフラグメントは
、高い親和性（Ｋ_Ｄ約１０^−９〜１０^−１０）でＦｃεＲＩのα鎖に結合してお
り、変異誘発の研究は、Ｃε３ドメイン残基がレセプターへの結合に関与してい
ることを実証した^６〜１１。このことは、ＩｇＥ−Ｆｃ：ＦｃεＲＩα複合体の
結晶学的研究と矛盾しない。ＩｇＥ−Ｃε２ドメインは、ＩｇＥ−Ｃε３／Ｃε
４ドメインの構築物がレセプターに結合する高い親和性を保持しているので、レ
セプター結合に対して重要であると考えられていない。

【００９６】 結晶学的研究のためのタンパク質を入手するために、Ｃ末端ＩｇＥ−Ｆｃドメ
イン（Ｃε３／Ｃε４）を昆虫細胞内で発現させ、そして方法の節に記載される
ように精製した。高エネルギーシンクロトロンＸ線源を使用して２．３Åまで回
折するのではなく、実験室のＸ線源を使用して弱く回折する結晶を得た。ＩｇＥ
−Ｆｃ Ｃε３／Ｃε４構造を、２つの免疫グロブリンドメインに関するコアモ
デルの約１２，０００の異なるコンフォメーション変化を用いて、２つのドメイ
ン間の結合ループに近い中心に位置された約３本の軸を回転させることによって
ドメインの方向を変化させる自動化分子置換検索法（ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｓｔｒａｔｅｇｙ）
によって解明した。コース（角度３°での）検索によって、より微細なドメイ
ンの回転によりさらに精度をあげた１つの有望な解答を得た。この構造を、何回
かの精製に供し、そして電子密度マップを省くシュミレーションされたアニーリ
ング複合体に組み込ませ、表６に示される最終的な統計を得た。Ｒフリー（Ｒｆ
ｒｅｅ）およびＲ因子はそれぞれ、２．３Åの解像度に対して良い構造を有する
。

【００９７】 ＩｇＥのＣε３／Ｃε４ドメインに関する全体的な構造を、図１ａおよび２ａ
に示す。２つの免疫グロブリンドメインは、抗体定常ドメインのＣ１セットに属
し、そして、それぞれ図１ｂ、２ｂおよび１ｃ、２ｃに示されるレセプター結合
ＩｇＥ−Ｆｃドメインおよびレセプター結合ＩｇＧ−Ｆｃドメインの構造に個別
に類似している。鎖間ジスルフィドがこの領域において生じ、生化学的に形成す
ることが示され得る事実にも関わらず、Ｎ末端残基〜Ｖ３３６（Ｃε２／Ｃε３
リンカー）に対する密度は、ＩｇＧ−Ｆｃ構造中で観測されない。ＦｃεＲＩを
結合させる際に、Ｃε２／Ｃε３リンカーを電子密度マップにおいて整列（ｏｒ
ｄｅｒ）し、視覚化する（例えば、６０／１８９，８５３を参照のこと）。Ｉｇ
Ｇ−Ｆｃと同様に、重鎖二量体のＣε３ドメインは、いかなる鎖間結合をも形成
せず、一方Ｃε４ドメインは、大規模な二量体境界面（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）を
形成し、約１８６０Å^２の表面積を覆い隠す。ＩｇＥのＮ３９４で見出された保
存された炭化水素は、Ｃε３ドメインＣε４ドメインとの間のキャビティを充填
し、二量体境界面を横切る制限された接触を作製する。ＩｇＧ−Ｆｃ構造と対照
的に、ＩｇＥの炭化水素を除去し得、そしてＦｃεＲＩへの結合を保持する^８。

【００９８】 ＩｇＥ−Ｆｃ結晶構造は、Ｆｃドメイン対する新規でありかつコンパクトな閉
鎖コンフォメーションを表す。互いに関しそしてドメインＣε４ドメインに関す
る２つのＣε３ドメインの相対的な配置は、実質的にＩｇＧ−Ｆｃまたはレセプ
ター結合型ＩｇＧ−Ｆｃ構造と異なる（図１）。Ｃε３／Ｃε４の角度は、Ｉｇ
Ｇ−ＦｃのＣγ２／Ｃγ３ドメイン間でかまたはレセプター結合型ＩｇＥ−Ｆｃ
について見出されるより鋭い（図１）。遊離ＩｇＥ−Ｆｃは、そのより短い全体
の高さ（図１ａ、約７Å）によって示されるようにＩｇＧ−Ｆｃの６５×６４×
３６Å（図１ｃ）およびレセプター結合型ＩｇＥ−Ｆｃの容積（図ｌｂ）と比較
して、５８×６３×４０Åの全容積を有し、よりコンパクトである（例えば、６
０／１８９，８５３）を参照のこと。ＩｇＥ−Ｆｃ構造内のＣ３ドメインはまた
、図２に示されるループ残基間の距離によって示されるように、互いにより密接
に接近する。Ｃε３またはＣγ２ Ｉｇドメインの鎖Ａ中の第１残基間の距離を
、容易に比較し、ループの柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）に起因する距離に
おける差異を最小にし得る。ＩｇＧ（図２ｃ）において、この距離は約２２Åで
あり（ＩｇＧ構造間でいくらか変化する）、レセプター結合型ＩｇＥ−Ｆｃ（図
２ｂ）において、この距離は約２３Åであり、一方閉鎖ＩｇＥ（図２ａ）におい
て、この距離は約１３Åである。全体的に、レセプター結合型ＩｇＥおよびＩｇ
Ｇ−Ｆｃ構造は、非結合のＩｇＥ−Ｆｃ構造よりも、互いにより密接に共通して
いる。

【００９９】 ＩｇＧ−Ｆｃ構造におけるコンフォメーションの差異を留意してきたけれども ^{１２、１３} 、これらは、レセプター結合および閉鎖ＩｇＥ−Ｆｃ構造に対して観
測される程大きくはない。図３は、本明細書中において観測される閉鎖ＩｇＥ−
Ｆｃ構造と共に、９つの異なるＩｇＧ構造の重ね合わせ（ｓｕｐｅｒｐｏｓｉｔ
ｉｏｎ）を示す。ＩｇＥ−Ｆｃは、観測されたＩｇＧ−Ｆｃ構造内の動きの幅を
有意に超えて位置する。レセプター結合型ＩｇＥ−Ｆｃおよび閉鎖形態のＩｇＥ
−Ｆｃの重ね合わせを図３に示し、観測される大きなコンフォメーション変化を
実証する。Ｃε３のＡＢヘリックスおよびドメイン間リンカー残基は、開放およ
び閉鎖ＩｇＥコンフォメーションの重ね合わせによって示されるように（図３）
、Ｃε４ドメインに関して相対的に固定されたままである。ＩｇＧ−Ｆｃコンフ
ォメーションの最大の差異は、配列において６５％同一であるヒトとマウスＩｇ
Ｇ−Ｆｃ構造との比較において見出され、潜在的にコンフォメーションの差異の
いくつかを説明する^１２。対照的に、本明細書中で比較するＩｇＥ−Ｆｃ構造は
、同一な配列の分子についてのコンフォメーションの大きな柔軟性を実証する。

【０１００】 ＩｇＥ−Ｆｃのコンフォメーションの差異の分析を図４ａに示し、その中でＤ
ｙｎＤｏｍプログラムを使用して閉鎖形態と開放形態との比較を行った^ｌ４。Ｄ
ｙｎｄｏｍは、異なるコンフォメーション状態におけるタンパク質に対して半硬
質ドメインとして動く残基を分類し、ＩｇＥドメイン運動についてのドメイン間
螺旋軸およびヒンジ残基を同定する。開放形態および閉鎖形態を関係づける約１
５°の回転および０．６Å変換（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を伴って、ＩｇＥの
たわみ運動（ｂｅｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｏｎ）の軸を図４ａ中の矢印によって示
す。２つのドメイン間のたわみは、ドメイン間領域（残基４３６〜４４０）中で
は起こらず、むしろＣεドメイン自体の中で起こる。ヒンジを構成する残基は、
Ｃε３−ＡＢヘリックス上に位置し、アミノ酸３４２〜３４４（鎖Ａの後）、３
５４〜３５６（鎖Ｂの前）、および４３４〜４３６（鎖Ｇの後）を含み、そして
これを図４ａにおいて淡紫色で強調する。

【０１０１】 ＩｇＧ−およびＩｇＥ−Ｆｃドメイン内の見かけの柔軟性における差異に関す
る構造の原理は、ＤｙｎＤｏｍによって同定される３つのペプチドセグメントに
おけるヒンジの運動の可能性を考慮すると、単に２つの免疫グロブリンドメイン
間のリンカーアミノ酸における配列の差異に基づくのではない。ドメイン間リン
カー領域およびＡＢヘリックスは、閉鎖ＩｇＥ−Ｆｃ構造および開放ＩｇＥ−Ｆ
ｃ構造の比較で相対的に固定化されたままである（図１ｃおよび４ａ）。ＡＢヘ
リックスのＣ末端における小さな構造変化は、ＩｇＥ−Ｃε３と比較してＩｇＧ
−Ｃγ２配列中の１残基の挿入を説明し、そしてこれらは、ＩｇＥ中のヒンジ領
域の部分ではない（図４ｂ）。ＩｇＥおよびＩｇＧの両方において、Ｃε３また
はＣγ２のＡおよびＢのβ鎖は、切り離され、そしてＡＢヘリックスの一端上に
水素結合せず、そしてＩｇＥ結合が集中しているようにみえるこの領域中に存在
する（図４ａおよび図４ｂ）。ＩｇＧ−Ｆｃ構造とＩｇＥ−Ｆｃ構造との比較は
、Ｃε３／Ｃε４境界面から外側へのＩｇＥ−Ｆｃ ＡＢヘリックスの位置内の
協調的なシフトを示し、これはＩｇＥ−Ｆｃ構造におけるより大きな回転自由度
を説明し得る（図４ｂ）。閉鎖ＩｇＥ−Ｆｃ構造において、ＡＢヘリックスの直
後のヒンジ残基（アミノ酸３５４〜３５６）は、重なったＩｇＧ−Ｆｃ ＡＢヘ
リックスと立体的に衝突する（図４ｂ）。このように、ＩｇＥ−Ｆｃに関して本
明細書中で観察される閉鎖コンフォメーションは、ＩｇＧ−Ｆｃ ＡＢヘリック
スの位置ゆえに、ＩｇＧ−Ｆｃに対して近づきにくくなり得る。さらなる残基も
また、ＩｇＧおよびＩｇＥにおけるコンフォメーションの差異に寄与し得る（例
えば、Ａ鎖におけるＩｇＧ中のＰ２５７／Ｐ２５８の代わりにＩｇＥにおけるＲ
３４２／Ｐ３４３の変化、およびＩｇＥ−ＡＢヘリックスの始まりにおけるＰ３
５４の存在）。ＩｇＧ中の２重プロリン配列に接近しやすいφ／ψ角度における
差異は、ＩｇＧ−Ｆｃｓの開放の形状をさらに安定化する。ヒトＩｇＥ−Ｆｃと
対照的に、マウスおよびラットの配列は、この２重プロリンモチーフを含む。プ
ロリンに対するＲ３４２の変異が溶液技術によって測定されるような開放形状を
安定化するか否か、およびこの変異がＩｇＥレセプターに対する結合親和性に影
響するか否かを試験することは興味深い。

【０１０２】 閉鎖ＩｇＥ−Ｆｃ構造において観測される大きなコンフォメーション変化は、
ＦｃεＲＩと相互作用するＣε３ドメインの頂部（ｔｏｐ）でループを新たに方
向付ける。図４ｃは、遊離ＩｇＥ−Ｆｃ中のＣα炭素原子対とレセプター結合型
ＩｇＥ−Ｆｃとの間の距離を比較することによって、これらのコンフォメーショ
ン差異を定量化する。ＦｃεＲＩを結合することに関与するループをグラフ上で
強調し、これらの領域がＩｇＥ−Ｆｃの結合形態と遊離形態との間で１０〜１４
Å動くことを観測した。回転軸がＣε３ドメイン基部の近くに位置するので（図
４ａ）、Ｃε３β鎖中のアミノ酸に対応するこのプロットにおいて、漸増Ｃα変
位（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）の勾配が見られ得る。このプロットにおけるピ
ークは、最も大きな変位を示す、Ｃε３ドメインの頂部でのループに相当する（
図４ｃ）。Ｃε３ドメインにおけるＡＢ−ヘリックスは、図３中で示されるドメ
イン運動と同様に、この分析によってＣε４ドメインに構造的に連結されるよう
である。

【０１０３】 ＩｇＥ−Ｆｃレセプター結合ループの１０〜１４Åの運動は、これらのループ
が「閉鎖」形態で不完全に位置し、レセプター結合表面と相互作用することを示
唆する。図５ａおよび５ｂは、結合型および遊離型についてのＣε３ドメインの
ＦｃＲ−結合ループの表面表示を示す。この内部ヒンジについてのＣε３ドメイ
ンの回転は、このレセプター結合表面を新たに方向づける。開放レセプター結合
形態においては、Ｃε３ループを曝し、そしてＣε２ドメインに対するＮ末端リ
ンカー残基と合わせ、ＦｃεＲＩの広くかつ凸型の表面と相互作用する冠様構造
を形成する。対照的に、閉鎖Ｆｃコンフォメーションにおいて、レセプター結合
ループをＩｇＥ−Ｆｃの二価元素軸（ｄｉａｄ ａｘｉａｌ）をお互いに交差す
る方向へ新たに方向付け、レセプターの結合を受け入れ得ないより狭い内部ドメ
インギャップを形成する。ＩｇＧのＣγ２ドメインと「開放」形態のＩｇＥのＣ
ε３ドメインを分ける比較的大きな空間は、閉鎖ＩｇＥ−Ｆｃにおいて、よりい
っそう大きな裂け目となる（図５ａ）。

【０１０４】 溶液中のＩｇＥ−Ｆｃコンフォメーションは動的（ｄｙｎａｍｉｃ）であり得
、そして全範囲のＣε３コンフォメーション移動度は確立されていない。しかし
ながら、溶液におけるＩｇＥコンフォメーションの生物物理学的研究は、ＩｇＧ
抗体と比較した場合、ＩｇＥコンフォメーションのよりコンパクトなモデルを以
前に提唱した。ＩｇＥ−Ｆｃ（Ｃε２／Ｃε３／Ｃε４）の３つのドメイン構築
物の中性子散乱研究は、溶液における、ＩｇＧ−Ｆｃのドメイン構築物よりもよ
りコンパクトな構造と矛盾しない^１５。さらに、インタクトＩｇＥについてＮ末
端からＣ末端までの距離はまた、蛍光エネルギー移動（約７１Å）によって測定
され、そして溶液中の抗体に対するたわみコンフォメーションを示唆し、ＩｇＧ
と比較した場合、より少ないヒンジ媒介柔軟性を有する^{１６、１７}。これらの研
究はまた本明細書中で報告される結晶構造に観測されるよりコンパクトなＩｇＥ
−Ｆｃコンフォメーションと矛盾しない。

【０１０５】 ＩｇＥ−Ｆｃにおけるこの観察されたコンフォメーションの可撓性は、ＩｇＥ
生物学的機能の独特の局面のために重要であり得る。ＩｇＥ−Ｆｃ自由度は、Ｆ
ｃεＲＩとの誘導一致相互作用を可能にし得、高親和性結合に寄与するか、また
は低親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩＩ）との相互作用においてもまた重要
であり得る（図６）。ＦｃεＲＩＩは、３つのレクチンドメインのうち２つを介
してＩｇＥ−Ｆｃと相互作用をすると考えられる三量体Ｃ型レクチンである^１８ 。ＩｇＧ抗体は、この独特の抗体−レセプター相互作用におけるＩｇＥ−Ｆｃコ
ンフォメーション変化についての潜在的な生物学的な役割と一致して、対応する
レクチン様レセプターと相互作用をしない。最終的に、この閉鎖ＩｇＥ−Ｆｃコ
ンフォメーションの観察は、ＩｇＥ−ＦｃεＲＩ相互作用の新しいインヒビター
の設計のためのテンプレートを提供する（図６）。（直接的な競合部位または間
接的なアロステリック部位のいずれかでの）低分子の結合による閉鎖ＩｇＥ−Ｆ
ｃコンフォメーションの安定化は、レセプターの結合を遮断し得（図６）、Ｉｇ
Ｅ媒介アレルギー疾患の処置のための治療的インヒビターの新しいクラスを導く
。インビトロにおいて選択されたペプチドがＩｇＧ−Ｆｃのヒンジ領域と結合す
るという最近の知見は、ＦｃεＲＩ結合を遮断するために閉鎖ＩｇＥ−Ｆｃヒン
ジと選択的に結合するペプチドの設計を示唆する^１９。

【０１０６】 （方法） （ヒトＩｇＥ−Ｆｃの発現および結晶化） ＩｇＥ−Ｆｃ Ｃε３／Ｃε４を、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ｂａｃｕｌｏｇｏ
ｌｄ発現系を使用して昆虫細胞において発現させた。簡単には、Ｃε３／Ｃε４
ドメインをコードするＤＮＡを、ｐＡＣｇｐ６７発現ベクターおよび確立された
方法によって産生される組換えウイルス中にサブクローニングした。ＩｇＥ−Ｆ
ｃ Ｃε３／Ｃε４タンパク質発現と、レセプターベースのＥＬＩＳＡアッセイ
によってモニターし、そしてタンパク質を、従来の技術（イオン交換、ゲル濾過
およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ）によって、感染したＴ．ｎｉ細
胞の上清（１０〜２０リットル）から精製した。このＦｃ構築物は、残基Ｄ３３
０で開始するネイティブ配列の上流に、４つのアミノ酸（ＡＤＰＣ）を含むＮ末
端配列（ＡＤＰＣＤＳＮ）をコードする。このシステインは、天然のＩｇＥ−Ｆ
ｃ ｃｙｓ３２８由来の１つの残基と置換されるが、単離されたＩｇＥ−Ｆｃの
９５％より多くで分子内ジスルフィド結合を形成する。

【０１０７】 精製されたＩｇＥ−Ｆｃを、１．３２ｃｍ^−１（ｍｇ／ｍＬ）^−１のｅ２８０
ｎｍを使用して、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）中で１０ｍｇ／ｍｌに濃縮
した。結晶を、懸滴方法を使用して、０．５ｍｌのタンパク質および５ｍｌの沈
殿剤（２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．６、３３％（ｗ／ｖ）ポリエチレング
リコール４０００）を混合することによって得た。結晶は、室温で１〜３日間成
長し、そしてこの結晶は、塩またはＰＥＧ濃度ならびに温度における小さな変化
に敏感だった。結晶を、２５ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．６、３７％ＰＥＧ４０
００中に収集し、そして凍結保護物質（収集緩衝液および１５％（ｖ／ｖ）エチ
レングリコール）に、液体窒素中に急速凍結する前に、約３０秒間移した。結晶
は、セルの大きさがａ＝ｂ＝１０５．６Å、ｃ＝４７．１Åおよびα＝β＝γ＝
９０°である空間群Ｐ４２_１２に属し、そして結晶の非対称単位につき１つのＣ
ε３／Ｃε４鎖を含む。

【０１０８】 （結晶構造の決定および精製） ＩｇＥ−Ｆｃ結晶由来のデータは、最初は不定に異方性であったが、結晶を、
誘導体スクリーニングのために使用する重原子（白金、水銀および他の金属を含
む）で処理した場合、実質的に改良された。これらの知見に基づいて、結晶を、
凍結およびデータ収集する前に１ｍＭの塩化銅（ＩＩ）で処理した。ネイティブ
の結晶からの最初の回析が、約３．０Åの解像度に限定され、そしてしばしば分
割した格子を示したけれども、銅処理結晶は、少なくとも２．３Åの解像度で、
ほとんど異方性の格子の問題を伴わずに回析した。この改良は、凍結前のＩｇＥ
−Ｆｃ Ｎ末端残基中の残留遊離システインの酸化（５％未満）に起因し得る。
データをＭａｒ３００イメージングプレートシステムを使用するＳＳＲＬビーム
ライン７−１で、およびＭａｒＣＣＤディテクターを使用するＡｄｖａｎｃｅｄ
Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ ＤＮＤ−ＣＡＴ５Ｉｄビームラインで、これら
の結晶から収集した。ネイティブおよび誘導体のデータを処理し、そしてプログ
ラムのＨＫＬ一式を使用して積分した。

【０１０９】 個々のＩｇドメインおよび、とりわけＩｇＧ−Ｆｃ構造の重ね合わせを含む、
ＩｇＧ−Ｆｃ構造に基づくＩｇＥの種々のモデルを使用する、分子置換（ＭＲ）
方法によって結晶構造を解析する最初の試みは失敗した。ＭＲ探査を、Ａｍｏｒ
ｅ、ＣＮＳ／ＸＰＬＯＲおよびＥＰＭＲを用いて実行したが成功しなかった。重
原子探査を、広い範囲の化合物（２７）、濃度（０．１〜２０ｍＭ）およびｐＨ
範囲（４．６〜８．５）を使用して実行したが、よい振る舞いの同形の誘導体は
生じなかった。

【０１１０】 ＭＲ探査は、この探査モデルと比較してＩｇＥ−Ｆｃについての変化したコン
フォメーションに起因して失敗する可能性があったので、Ｃε４に対する屈曲、
湾曲およびＣε３回転角度の系統的な探索を行った。この探査のために、インタ
クトなマウスモノクローナル抗体（ＰＤＢコード１ＩＧＴ）^２０の結晶構造由来
のＣγ２およびＣγ３ドメインを使用した。これらのドメインを切断して非相同
ループおよび側鎖を除去し、ＩｇＥ−Ｆｃ構築物において２２２残基の代わりに
１４４残基を有するモデルを提供した。この２つのドメインは、起点にＣγ２／
Ｃγ３リンカー残基を配置し、ｚ軸の周りで屈曲回転を可能にするようにＣγ２
およびＣγ３が向けられるように翻訳された。Ｘ、ＹおよびＺの周りの３つの回
転を、Ｃγ２ドメインに適用し、一方、ＣＣＰ４一式^２１由来のプログラムｌｓ
ｑｋａｂを使用して、Ｃγ３を固定したままにした。およそ１２０００のモデル
を、自動的に作製し、そして、プログラムＡｍｏｒｅ^２１を使用する完全な分子
置換探査において使用し、５つのシリコングラフィックスコンピューターで、約
１０日間かかった。このモデルは、それぞれの回転において３°の増分で、出発
モデルの周りを−３０〜＋４０度の角度範囲でカバーした。有望な開始探査溶液
を、探査範囲を制限して回転段階サイズを０．５度の増分に減少させることによ
って、精密化した。この細密な探査は、３８％の相関係数および１５〜４Å解像
度のデータを有する４８９％のＲ因子を有するモデルを提供する。このモデルを
、剛体精密化に供し、そしてシミュレートしたアニーリングする複合省略図（ｃ
ｏｍｐｏｓｉｔ ｏｍｉｔ ｍａｐ）を、プログラムＣＮＳ^２２の使用によって
３Åの解像度までを計算した。解釈可能な密度は、探査モデルから省略された領
域において観察され、そしてこのモデルにおける誤差は容易に同定され得た。モ
デル構築および精密化を、プログラムＯ^２３およびＣＮＳ^２２を使用して続けた
。０〜２．３Åの解像度のデータ全てについての現在の精密化統計を、表６に集
める。

【０１１１】

【表６】

【０１１２】 （参考文献） １．Ｋｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７、９３１〜９７２（
１９９９）。 ２．Ｍｅｔｚｇｅｒ、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １２５、３７〜４８（１９９２
）。 ３．Ｓｕｔｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３６６、４２１〜４２８（１９９３）。 ４．Ｄａｅｒｏｎ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５、２０３〜２３４
（１９９７）。 ５．Ｒａｖｅｔｃｈら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６、４２１〜４
３２（１９９８）。 ６．Ｗｅｅｔａｌｌら、Ｉｍｍｕｎｏｌ １４５、３８４９〜３８５４（１９９
０）。 ７．Ｎｉｓｓｉｍら、Ｅｍｂｏ Ｊ １０、１０１〜１０７（１９９１）。 ８．Ｂａｓｕら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８、１３１１８〜１３１２７（
１９９３）。 ９．Ｈｅｎｒｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６、１５５６８〜１５５７８
（１９９７）。 １０．Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９、２６３６８〜２６３
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８）。 １３．Ｈａｒｒｉｓら、Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７２、１９１〜２０８（１９
９９）。 １４．Ｈａｙｗａｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ３０、１４４〜１５４（１９９８
）。 １５．Ｂｅａｖｉｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４、１４４４９〜１４４
６１（１９９５）。 １６．Ｚｈｅｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０、９１２５〜９１３２（
１９９１）。 １７．Ｚｈｅｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１、７４４６〜７４５６（
１９９２）。 １８．Ｓｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６、２１１２〜２１２２（１９
９７）。 １９．ＤｅＬａｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７、１２７９〜１２８３（２００
０）。 ２０．Ｈａｒｒｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３６０、３６９〜３７２（１９９２）。 ２１．Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅ
ｃｔ、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ、Ｄ５０、７６０〜７６３（１９９４）。 ２２．Ｂｒｕｎｇｅｒら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ
Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５４、９０５〜９２１（１９９８）。 ２３．Ｊｏｎｅｓら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ａ ４７、１１０〜
１１９（１９９１）。

【０１１３】 （実施例２） この実施例は、実施例１に記載するモデルのさらなる精製を記載する。Ｆｃ−
Ｃε３／Ｃε４（本明細書中において、またＦｃ Ｃε３−Ｃε４として参照さ
れる）の残基の番号付けは、Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎら（同書）の決まりに従うこ
とに注意すべきである。

【０１１４】 ＩｇＥ抗体は、抗寄生生物免疫応答、ならびにアレルギーおよび喘息の炎症反
応を媒介する。この実施例は、２．３Å解像度までのヒトＩｇＥ−Ｆｃ Ｃε３
−Ｃε４ドメインの結晶構造の解明を記載し、（その座標は）表２および表３に
開示される。このＩｇＥ−Ｆｃ結晶構造は、Ｆｃドメインについて新規の閉鎖コ
ンフォメーションを明らかにする。例えば、この構造は、関連するＩｇＧ−Ｆｃ
構造、およびその高い親和性レセプターＦｃεＲＩと結合したＩｇＥ−Ｆｃ結合
と比較した場合、Ｎ末端Ｃε３ドメインの大きな転位を明らかにする。このＩｇ
Ｅ−Ｆｃは、極めて近接し２つのＣε３ドメインを配置する、より小型の閉鎖コ
ンフォメーションをとり、ドメイン間のキャビティのサイズを減少し、そしてＦ
ｃεＲＩ結合部位の部分を覆い隠す。このコンフォメーションの可撓性を可能に
し得るＣε３−Ｃε４ドメイン間の境界面の独特の構造特徴が同定される。Ｆｃ
ドメインの可撓性は、ＩｇＥが、その両方のレセプター、すなわちＦｃεＲＩお
よびＦｃεＲＩＩと最適な相互作用を形成することを可能にし得る。ＩｇＥ−Ｆ
ｃのこの構造は、アロステリックに作用してレセプター結合を遮断する分子の設
計を含む、抗アレルギー処置のための新しいストラテジーを示唆する。

【０１１５】 （Ａ．背景） この抗体のレパートリーの機能的多様性は、抗原特異的結合部位の作製および
これらの特異的結合部位の免疫系の異なるエフェクター機構への結合の両方を包
含する。抗体中においては、これら２つの機能的な役割は、Ｆａｂ領域およびＦ
ｃ領域というこのタンパク質の分離可能な部分において見出される。２つの抗原
結合部位は、抗体のＦａｂ領域中に含まれ、これは抗体の重鎖を介してＦｃエフ
ェクタードメインと共有結合する（Ｈａｒｒｉｓら、１９９９；Ｐａｄｌａｎ、
１９９４）。このＦｃドメインは、下流のエフェクター機能の活性化についての
特異性を提供し、そして抗体の重鎖の定常ドメインのみに由来する。Ｂ細胞発達
の間のアイソタイプスイッチは、５つの主なクラスまたはアイソタイプ：ＩｇＡ
、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに分類される、異なる重鎖の定常領域に
連結する、同一の抗原特異性を有する免疫グロブリンを産生する。異なるＦｃア
イソタイプは、細胞性レセプターまたは可溶性タンパク質と異なるセットと相互
作用し、特定の防御機構を開始する。エフェクター機構が、特定の病原、感染の
物理的位置、および免疫応答の異なる段階に適用される。Ｆｃ関連エフェクター
機構としては、貪食作用、細胞性細胞傷害の開始、ならびに炎症経路、補体の活
性化および抗体産生のフィードバック調節が挙げられる（Ｄａｅｒｏｎ、１９９
７；Ｋｉｎｅｔ、１９９９；ＲａｖｅｔｃｈおよびＣｌｙｎｅｓ、１９９８）。

【０１１６】 ＩｇＥ抗体は、そのＦｃドメインを介して、免疫系の２つの細胞性レセプター
（ＦｃεＲＩおよびＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３））と相互作用する。ＩｇＥ抗体は
、マスト細胞、好塩基球および好酸球の表面上にある、高親和性レセプター（す
なわち、ＦｃεＲＩ）と結合する（Ｋｉｎｅｔ、１９９９；Ｍｅｔｚｇｅｒ、１
９９２）。レセプター結合ＩｇＥによる多価抗原の結合は、レセプター凝集を引
き起こし、細胞活性を誘発する。マスト細胞上で、これはヒスタミン、炎症媒介
物および血管拡張剤の放出を誘導する。環境アレルゲンに対するマスト細胞反応
は、アレルギー、ぜん息、およびアナフィラキシーの病理と関連がある（Ｔｕｒ
ｎｅｒおよびＫｉｎｅｔ、１９９９）。ＦｃεＲＩによる好酸球の活性化は、寄
生生物感染に対する防御機構を提供し（Ｇｏｕｎｎｉら、１９９４；Ｋｉｎｅｔ
、１９９９）、一方樹状細胞のＦｃεＲＩは、ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示経路中
にＩｇＥ結合抗原を送達し得る（Ｍａｕｒｅｒら、１９９８）。ＩｇＥ抗体はま
た、より低い親和性レセプターであるＦｃεＲＩＩと相互作用し、このレセプタ
ーは抗原提示、細胞傷害、およびＩｇＥ産生の調節に関する（Ｓｕｔｔｏｎおよ
びＧｏｕｌｄ、１９９３）。ＦｃεＲＩがＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体に特
異的な抗体レセプターのファミリーと相同性である一方、ＦｃεＲＩＩは、タン
パク質の異なる構造的なクラスに属し、そしてＩｇＥ系と独特に関連する。

【０１１７】 ＩｇＥは、ヒト化抗ＩｇＥモノクローナル抗体を使用するぜん息についての現
在の治療的アプローチの標的である（Ｃｈａｎｇ、２０００；Ｊａｒｄｉｅｕお
よびＦｉｃｋ、１９９９）。ＩｇＥ−Ｆｃに対する抗体は、レセプター結合を遮
断し、レセプター活性化レセプター活性化および発現レベルにおける減少を誘導
し、そしてＩｇＥ血清レベルにおける減少を誘発する。ＩｇＥ−Ｆｃの構造研究
は、抗ＩｇＥ治療を改良すること、そして多種多様なアトピー疾患の処置のため
のインヒビターを設計することへの新しい経路を提供し得る。

【０１１８】 ＩｇＥは、εアイソタイプの２つの重鎖と関連する２つの抗体軽鎖を含む。こ
れらの重鎖の３つのＣ末端定常ドメイン（Ｃε２、Ｃε３およびＣε４）は、二
量体化してＦｃエフェクタードメインを形成する。ＩｇＧと比較して、ＩｇＥ抗
体はさらなる定常ドメインＣε２を有する（図７ａ）。このＣε３およびＣε４
ドメインは、ＩｇＧ−Ｆｃ Ｃγ２ドメインおよびＣγ３ドメインと相同性であ
り、それぞれヒトＩｇＥとＩｇＧ１との間に３２％の配列同一性がある（図７ｂ
）。インタクトなＩｇＥおよびＩｇＥ−Ｆｃフラグメント（Ｃε２−Ｃε４、Ｃ
ε３−Ｃε４）の両方は、ＦｃεＲＩへ高親和性（Ｋ_Ｄ約１０^−９〜１０^−１０ Ｍ）で結合し、そして変異誘発研究は、この相互作用の媒介（Ｂａｓｕら、１９
９３；Ｈｅｎｒｙら、１９９７；Ｎｉｓｓｉｍら、１９９１；Ｐｒｅｓｔａら、
１９９４；Ｗｅｅｔａｌｌら、１９９０）ならびにＦｃεＲＩＩへの結合（Ｓｈ
ｉら、１９９７；ＳｕｔｔｏｎおよびＧｏｕｌｄ、１９９３）にＣε３ドメイン
残基を関連付けた。ＩｇＥ−Ｆｃ Ｃε３−Ｃε４は、両方のＦｃεＲＩ（Ｂａ
ｓｕら、１９９３；Ｈｅｎｒｙら、１９９７；Ｙｏｎｇら、１９９５）およびＦ
ｃεＲＩＩ（Ｓｈｉら、１９９７）と結合したままであり、構造研究のための最
小の構築物を示唆する。

【０１１９】 抗体Ｆｃドメインの結晶学的研究は、以前にＩｇＧクラスに限定されており、
Ｆｃ−エフェクター機能における配列および構造多様性の役割について多くの謎
を開放する。

【０１２０】 （Ｂ．構造決定） ヒトＩｇＥ−ＦｃのＣ末端ドメイン、すなわちＣε３−Ｃε４（図７）を、方
法に記載されるように昆虫細胞で発現させた。このＩｇＥ−Ｆｃ Ｃε３−Ｃε
４タンパク質は、３つの潜在的なＮ結合糖質結合部位を含むが、しかしＮ３７１
およびＮ３９４の２つのみがインビボでグリコシル化される（Ｂａｓｕら、１９
９３；Ｙｏｕｎｇら、１９９５）。エンドグリコシダーゼ消化、トリプシンペプ
チドの質量分析、および変異分析によるＦｃ糖質の特徴付けは、高マンノース糖
質がＮ３９４に結合していることを示し、このＮ３９４はＦｃドメイン中の保存
グリコシル化部位である。両方の脱グリコシル化ＩｇＥ−Ｆｃ（Ｂａｓｕら、１
９９３）および高マンノースＩｇＥ（ＧｒａｎａｔｏおよびＮｅｅｓｅｒ、１９
８７）がＦｃεＲＩへの高い結合親和性を保持すると言えども、脱グリコシル化
ＩｇＥ−Ｆｃは、凝集傾向を有し、このことにより脱グリコシル化ＩｇＥ−Ｆｃ
は結晶学的研究についての質の悪い候補となる（Ｂａｓｕら、１９９３）。

【０１２１】 このＩｇＥ−Ｆｃを、精製して均質化および結晶化した。結晶は、セルの大き
さがａ＝ｂ＝１０５．６Å、ｃ＝４７．１Åである空間群Ｐ４２_１２に属する。
この結晶は、非対称範囲で単一のＩｇＥ−Ｆｃ鎖（二量体分子の半分）を含み、
この分子二量体の軸は結晶学的ダイアドに沿って位置する。この結晶は、シンク
ロトンＸ線供給源を使用して、Ｘ線２．０Åを回折する。種々のＩｇＧ−Ｆｃモ
デルを使用する分子置換探査は成功せず、重原子探査もまた成功しなかった。こ
のＩｇＥ−Ｆｃ Ｃε３−Ｃε４構造を、２つのＩｇドメインについてのコアモ
デル約１２，０００個の異なるコンフォメーション改変体を使用する、自動化分
子置換探査によって、体系的にＣε３およびＣε４ドメインモデルに関する角度
を変化させて解析した。データ収集および精密化統計は、表７に示される。現在
のＲ_ｆｒｅｅおよびＲ_ｗｏｒｋは、２．３Å解像度に対してそれぞれ２７％およ
び２４．２％であり、である。このタンパク質の１０アミノ末端残基（鎖間のジ
スルフィドを含む）および４つのＣ末端残基についての密度は存在しない。さら
に、Ｃε４ ＡＢループについての密度は乏しい。

【０１２２】

【表７】

【０１２３】 （Ｃ．ＩｇＥ構造の説明） ＩｇＥのＣε３ドメインおよびＣε４ドメインは、Ｉｇ定常ドメインのＣ１セ
ットに属する（Ｍｕｒｚｉｎら、１９９５）。ＩｇＥのＣε３ドメインおよびＣ
ε４ドメインは、個々にＩｇＧのＣγ２ドメインおよびＣγ３ドメインにそれぞ
れ相同性であるが、ＩｇＥ−ＦｃおよびＩｇＧ−Ｆｃの構造に基づいた配列アラ
イメントは、二次構造におけるいくつかの変化を明らかにする（図７ｂ）。Ｉｇ
Ｅと比較して、ＩｇＧは、ＣγＡＢへリックスのすぐ後に隆起を形成する単一の
残基挿入（ＩｇＧ１中のＩ２５３）を含む。このＩｇＥ Ｃε３ドメインは、Ｃ
’鎖を欠失し、そしてＣε４ドメインは、Ｃγ３中のＡＢヘリックスの代わりに
、不十分に並んだＡＢループを有する。２つのプロリン（Ｐ３８１およびＰ４５
４）は、水素結合能力の変更によってこれらの二次構造の破壊に寄与し得る。

【０１２４】 ＩｇＥ−Ｆｃのリボン図を、図８に示す。ＩｇＧ−Ｆｃにおけるように、Ｉｇ
Ｅ−Ｆｃの上側ドメイン（Ｃε３）は、いかなる直接のタンパク質：タンパク質
接触をも形成しない。この保存された糖質結合部位（Ｎ３９４）は、Ｃε３ドメ
インの間のキャビティに面する。観察された電子密度が、この部位でのグリコシ
ル化と一致する一方、密度の乏しい質は、糖質のモデル化を不可能にする。この
モデルに糖質残基を含むことは、Ｒ_ｆｒｅｅを減少せず、または電子密度マップ
を改良もしなかった。しかし、この電子密度は、糖質残基がお互いＦｃ二量体軸
の近くで接触し、Ｃε３ドメインの間の狭い間隙の底を形成することを示唆する
。このＣε４ドメインは、二量体境界面を横切って広範な接触を形成し、約１，
８６０Å^２を隠す。単鎖のＣε３ドメインとＣε４ドメインとの間に形成された
１４の原子接触（４Å未満）が８７２Å^２を隠し、そして二量体において全部で
１，７４４Å^２をその上に隠す。

【０１２５】 この領域における鎖間のジスルフィドの形成にも関わらず、Ｖ３３６に対して
Ｎ末端側の残基（Ｃε２−Ｃε３リンカー領域）についての電子密度が観察され
ない。これらのＣε２−Ｃε３リンカー残基は、ＦｃεＲＩとの複合体において
整列しており（Ｇａｒｍａｎら、２０００）そしてこれらの残基のいくつかは、
レセプターと相互作用する。Ｃε２ドメインの非存在が、遊離ＦｃにおけるＣε
２−Ｃε３リンカーの乱れに寄与し得るが、ＦｃεＲＩに対するリンカー残基の
非対称結合は、可撓性が機能的に重要であることを示唆する。

【０１２６】 （Ｄ．ＩｇＥ−Ｆｃは新規のコンフォメーションを適用とする） ＩｇＥ−Ｆｃ Ｃε３−Ｃε４ドメインの結晶構造は、抗体エフェクタードメ
インについての新規の閉鎖コンフォメーションを明らかにする（図８）。遊離Ｉ
ｇＥ−Ｆｃにおいて、このＣε３−Ｃε４ドメイン間の角度は、相同なＩｇＧ−
Ｆｃドメインの間（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒら、１９７６；Ｈａｒｒｉｓら、１
９９９）か、またはＦｃεＲＩ結合ＩｇＥ−Ｆｃ（開放コンフォメーション、Ｇ
ａｒｍａｎら、２０００）において観察される角度よりも鋭い。お互いに関して
、およびＣε４ドメインに対しての２つのＣε３ドメインの相対配置の両方が、
変更される。閉鎖構造において、ＩｇＥ−Ｆｃ Ｃε３ドメインは、共により近
接し、そしてわずかにお互いに関して回転する。Ｃε３ドメインおよびＣγ２ド
メインの平面図は、ドメイン間ギャップにおける相違を例示する（図８ｂ）。Ｉ
ｇＥ−Ｆｃにおいて、Ｃε３ Ａストランドの第１残基の間の距離は、たったの
１３Åである。レセプター結合ＩｇＥ−Ｆｃにおいて、この距離は２３Åまで増
加し、これはＩｇＧ２ａ−ＦｃにおけるＣγ２ドメインの間で観察される２２Å
と類似する（Ｈａｒｒｉｓら、１９９７）。このＣε３ドメインは、お互いによ
り近接するよう接近するだけでなく、Ｃε４ドメインともより近接に位置する。
例えば、Ｃε３ドメインの頂点（ＤＥループにおける残基Ｔ３９６）は、Ｃε４
ドメインの頂点（残基Ｓ４９１）から２３Åである。ＩｇＧ２ａにおける対応す
る残基間の距離は３３Åであり、そしてレセプター結合ＩｇＥ−Ｆｃ（開放形態
）において、この距離は３１Åである。従って、開放形態と閉鎖形態との間の変
化において、それぞれのＣε３ドメインの頂点は、二量体軸を横切って他のＣε
３ドメインに向かって１０Å移動し、そして同じ鎖のＣε４ドメインに向かって
８Å移動する。ＩｇＥのより上側のドメイン（Ｃε３）のより下側ドメイン（Ｃ
ε４）への近接な接近は、ＩｇＧ−Ｆｃと比較して、ＩｇＥ−Ｆｃの全体の高さ
を約７Å減少する。このＩｇＥ−Ｆｃコンフォメーション変化は、ＩｇＧ−Ｆｃ
結晶構造の間で観察されるどの相違よりもかなり大きい。ＩｇＧ−Ｆｃの６つの
結晶構造は、ＩｇＧ−Ｆｃの単鎖の９つの異なる知見を提供する（これらの３つ
の構造において、その２本の鎖は、結晶学的対称性によって同一であるように制
約される）。これらの９つのＩｇＧ−Ｆｃ鎖（それらのＣγ３ドメインを介して
整列する）は、Ｃγ２位置のファミリーとしてＩｇＧ−Ｆｃコンフォメーション
可変性を明らかにする（図９ａ）。この閉鎖構造において、このＩｇＥ Ｃε３
ドメインは、観察されるＩｇＧ−Ｆｃコンフォメーションの範囲から遠く外側に
位置する。ＦｃεＲＩと結合する場合、Ｃε３ドメインとＣε４ドメインとの間
の角度が増加し、そしてこのＣε３ドメインは、ＩｇＧ Ｃγ２ドメインについ
ての観察された位置に接近する。ＩｇＧ−Ｆｃにおける構造的変化のいくつかは
、配列の相違に起因し得る。ヒトＩｇＧ構造が、約９５％の配列同一性を共有し
、そしてマウスの構造が約６７％の同一性を有する一方、ＩｇＧ Ｃγ２位置に
おける最も大きい相違は、約６４％の同一性を共有するヒト構造とマウス構造と
の間で起こる（Ｈａｒｒｉｓら、１９９９）。しかし、最も大きいコンフォメー
ション変化は、配列が同一である。ＩｇＥ−Ｆｃの開放形態と閉鎖形態との間で
生じ、このことは、ＩｇＥ−Ｆｃの固有の可撓性を示す。

【０１２７】 （Ｅ．ＩｇＥ−ＦｃおよびＩｇＧ−Ｆｃコンフォメーション可撓性の分析） ＩｇＥ−Ｆｃコンフォメーション変化は、開放コンフォメーションおよび閉鎖
コンフォメーションにおける２つのＩｇドメインに関する軸によって示され得る
。プログラムＤｙｎＤｏｍ（ＨａｙｗａｒｄおよびＢｅｒｅｎｄｓｅｎ、１９９
８）は、この軸について、約１３°の回転および１Åの移動を規定する（図９ｂ
中の矢印）。驚くべきことに、この軸はＣε３−Ｃε４リンカー領域（４３６〜
４４０）中に位置しないが、むしろＣε３−Ｃε４ドメイン境界線の近く、Ｃε
３ドメインそれ自体の中に位置する。コンフォメーションの変化を媒介するヒン
ジ残基は、Ｃε３ ＡＢヘリックスの両方の末端に（残基３４３〜３４５および
残基３５１〜３５２）、ならびにＣε３−Ｃε４リンカー領域（残基４３５〜４
３６）に近接して位置する。観察されたＩｇＧ−Ｆｃ構造のいずれも、このよう
な大きな程度の可撓性を示さない。同じＦｃの２つのＣγ２ドメインがそのＣγ
３ドメインに関して異なる配向を示す３つのＩｇＧ−Ｆｃ構造が解析された（１
ＦＣ１（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、１９８１）、１ＩＧＹ（Ｈａｒｒｉｓら、１
９９８）および１ＩＧＴ（Ｈａｒｒｉｓら、１９９７））。この構造の変化は同
じＦｃで生じるので、配列の変化に起因する相違は排除される。それぞれの構造
について、ＤｙｎＤｏｍ分析は、この２つの配座異性体の間で６〜７°の移動を
示すＣγ２−Ｃγ３境界面付近の軸を同定する（図９ｃ）。この軸の方向は、お
互いと、およびＩｇＥ−Ｆｃの方向と異なり、そしてこの軸の方向は、Ｃγ２の
別個の移動（例えば、横から横へ（ｓｉｄｅ−ｔｏ−ｓｉｄｅ））を示す。しか
し、ＩｇＧ運動のいずれも、ＩｇＥ−Ｆｃにおいて見られる開放から閉鎖へのコ
ンフォメーション変化に対応しない。このヒンジ軸の異なる位置およびＩｇＧ−
Ｆｃによって示される大いにより小さな範囲の運動は、Ｉｇドメインの可撓性が
複数の因子に関与することを示唆する。

【０１２８】 ＩｇＥ−Ｆｃの閉鎖コンフォメーションと開放コンフォメーションとの間での
Ｃα配位における変化を、図９ｄにプロットする。この変化は、ＦｃεＲＩ（Ｇ
ａｒｍａｎら，２０００）に対して非対称的に結合する２つのＦｃ鎖に対して、
わずかに異なる。Ｃε３ ＡＢヘリックス（３４４〜３５２）およびドメイン間
リンカー（４３６〜４４０）は、Ｃε４ドメインに対して固定されたまま比較的
残存するが、Ｃε３ ＥＦヘリックス残基（４０６〜４１３）は、４ÅまでのＣ
α移動を示す（図９ａ）。位置的な変化は、ヒンジから離れるにつれてより大き
くなり、Ｃε３残基の最大の変位は、ＦｃεＲＩに結合するＢＣ（３６３〜３６
８）、ＤＥ（３９３〜３９５）およびＦＧ（４２２〜４２８）ループにおけるＦ
ｃの頂部で観察された（図９ｂ）。これらのループにおける残基は、開放コンフ
ォメーションと閉鎖コンフォメーションとの間で、７〜１６Å移動する（図９ｃ
）。大きな差異はまた、Ｃε２−Ｃε３リンカーに隣接したＡストランドにおい
て観察される。

【０１２９】 （Ｆ．ＩｇＥ−Ｆｃ炭水化物） ＩｇＥおよびＩｇＧの両方において、保存された炭水化物付着部位は、上部ド
メイン（それぞれ、Ｃε３およびＣγ２）の間のキャビティと向かい合う。炭水
化物残基は、この構造中に含まれていないが、約５個の炭水化物部分についての
部分的な電子密度が、保存されたＮ３９４部位で観察され得、これはコア（−Ｇ
ｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ）の後で２つのアームに分枝する。ＩｇＧにおいてのように
、炭水化物の電子密度は、タンパク質の内面に沿って存在し、溶媒から疎水性残
基を遮蔽する（ＩｇＥ残基Ｙ３３９、Ｌ３５９、Ｖ３６１）。しかし、炭水化物
は、溶媒から隔離されない。ＩｇＥにおいて、Ｎ３９４に付着した炭水化物は、
ネイティブな条件下でエンドグリコシダーゼによって取り除かれ得る。このこと
は、この領域が、溶液中において少なくとも一過的に接近可能であることを示唆
する（Ｂａｓｕら，１９９３）。

【０１３０】 炭水化物は、ＦｃεＲＩへの高親和性結合のために必要とされない。このこと
は、炭水化物が、ＩｇＥ−Ｆｃのコンフォメーションに有意には影響を及ぼさな
いことを示唆する。ＩｇＡのグリコシル化は同様に、Ｆｃ−レセプター結合のた
めに必要とされない（Ｍａｔｔｕら，１９９８）。対照的に、ＩｇＧにおける保
存されたＮ結合型付着部位（ＩｇＧ１におけるＮ２９７）での炭水化物の存在は
、Ｆｃレセプター結合活性を維持するために重要である（Ｊｅｆｆｅｒｉｓら，
１９９８）。哺乳動物、酵母および昆虫細胞において生成される、ＩｇＧのコア
グリコシル化（−ＧＩｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３）が、この炭水化物機能のために十分
であるようである（Ｊｅｆｆｅｒｉｓら，１９９８）。ＩｇＧの機能研究および
生物物理学的研究により、炭水化物部分は、Ｆｃ構造に対して限られた局所的な
効果のみを有することが示されている（Ｊｅｆｆｅｒｉｓら，１９９８）。グリ
コシル化ＩｇＧ−Ｆｃおよび無グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）Ｉ
ｇＧ−Ｆｃと、モノクローナル抗体のパネルとの比較は、検出可能なエピトープ
の差異を示さなかった。このことは、全体的な構造変化が生じなかったことを示
唆する（Ｗａｌｋｅｒら，１９８９）。^１Ｈ−ＮＭＲを使用して、ＩｇＧ−Ｆｃ
の構造に対するグリコシル化の影響を研究した。ヒスチジン共鳴を、グリコシル
化ＩｇＧ−Ｆｃおよび非グリコシル化ＩｇＧ−Ｆｃにおいてモニターした（Ｌｕ
ｎｄら，１９９０；Ｍａｔｓｕｄａら，１９９０）。モニターされた５個のヒス
チジンのうち、保存されたグリコシル化部位付近の１つのみ（Ｃγ２ ＢＣルー
プにおけるＨ２６８）が、局所的な環境における任意の変化を報告した。Ｃγ２
−Ｃγ３ドメイン界面のヒスチジンは、いかなる構造的差異も検出しなかった。
ＩｇＥ−Ｆｃ：ＦｃεＲＩ結晶構造に基づき、保存されたグリコシル化部位を含
むＣγ２ ＢＣループおよびＤＥループは、ＦｃγＲ相互作用において直接的に
関与することが予期される（Ｇａｒｍａｎら，２０００）。これらのループにお
ける局所的な構造変化は、レセプター結合に影響を及ぼし得る。

【０１３１】 （Ｇ．ドメイン間界面での構造的変化） ＩｇＧ−Ｆｃ（Ｃγ２−Ｃγ３）およびＩｇＥ−Ｆｃ（Ｃε３−Ｃε４）の両
方のドメイン間界面は、Ｆｃ機能に重要であり、そしてこの界面における構造的
差異は、Ｆｃドメインの可撓性に影響を及ぼし得る。４つのタンパク質が、Ｉｇ
Ｇのこの領域に結合する：新生児Ｆｃレセプター（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら，１
９９４）、リウマチ因子（Ｃｏｒｐｅｒら，１９９７）、プロテインＡ（Ｄｅｉ
ｓｅｎｈｏｆｅｒ，１９８１）およびプロテインＧ（Ｓａｕｅｒ−Ｅｒｉｋｓｓ
ｏｎら，１９９５）。ＩｇＥのこの領域に対するタンパク質の直接的な結合は、
示されていない。ＦｃεＲＩＩについての結合部位は、Ｃε３の外面に広範にマ
ッピングされた（Ｓｈｉら，１９９７；ＳｕｔｔｏｎおよびＧｏｕｌｄ，１９９
３）が、ＦｃεＲＩ結合部位は、この界面に対して遠位であり、そしてＣε３の
ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ、ならびにＣε２−Ｃε３リンカーを含む（Ｇａｒ
ｍａｎら，２０００；Ｈｅｎｒｙら，１９９７；Ｐｒｅｓｔａら，１９９４）。
しかし、Ｃε３−Ｃε４ドメイン界面の残基は、ＦｃεＲＩとの直接的な接触を
形成しないという事実にも関わらず、この領域における変異は、ＦｃεＲＩ結合
に対して著しい効果を有し得る。例えば、ＩｇＥ Ｃε３ ＡＢヘリックス残基
を、ＩｇＧ Ｃγ２ ＡＢヘリックス残基で置換することは、単一のアミノ酸変
異（Ｆ３２９Ａ）（Ｐｒｅｓｔａら，１９９４）と同様に、結合を破壊する。こ
のことは、Ｃε３−Ｃε４ドメイン界面の相互作用が、機能的なＦｃを維持する
において重要であることを示唆する。ＡＢヘリックス（Ｃε３またはＣγ２にお
ける）は、ＩｇＥおよびＩｇＧの両方におけるＦｃドメイン間での大半の原子接
触（４Å以内の原子）を媒介する（図７ａ）。ＡＢヘリックスは、隣接残基およ
び上部ドメインのＥＦヘリックス中の残基と接触する。ＡＢヘリックスはまた、
より下部のＩｇドメイン（Ｃε４またはＣγ３）のＣ、ＦおよびＧストランド、
ならびにＦＧループにおける残基と接触する。ドメイン間接触を媒介する際のＡ
Ｂヘリックスの中心的役割にも関わらず、ＡＢヘリックス残基は、ＩｇＥとＩｇ
Ｇとの間で保存されていない。このヘリックスのわずか１残基のみ（εＤ３４７
、γＤ２６２）が不変である（図７ｂ）。さらに、ＡＢヘリックスに接触する残
基の大半は、ＩｇＥとＩｇＧとの間で保存されていない。ＡＢヘリックス残基に
よってなされる接触パターンは、ＩｇＥとＩｇＧとにおいて相違する。ＩｇＥに
おいて、ＡＢヘリックスによってなされる接触の大半は、開放コンフォメーショ
ンにおける下部（Ｃε４）ドメイン（１５／２１）の残基に対してである（図１
０ａ）。わずか１つの接触が、閉鎖形態におけるＥＦヘリックスに対してなされ
、そして２つのさらなる接触が、開放コンフォメーションにおいて形成される（
破線）。ＩｇＧでは、ＡＢヘリックス接触の大半（１２／２１）は、同じＣγ２
ドメイン内の他の残基に対してであり、９つは、下部のＣγ３ドメインに対して
接触する。Ｃγ２ ＡＢヘリックスは、ＥＦヘリックスに対して広範な接触を形
成する。２つの残基（特に、Ｖ２６３およびＨ３２９）は、Ｃγ２ドメイン内に
おける９つの接触のネットワークを形成する。ＩｇＧドメイン間界面に固有の２
つの著しい構造的特徴が存在する（図９ａ、１０ｄ）。ＩｇＧ Ｃγ２ ＡＢヘ
リックスの後への単一残基（イソロイシン２６６）の挿入は、ヘリックスの末端
に明らかな隆起を形成する。このイソロイシンは、隣接残基と共に、ＩｇＧの表
面上に浅いポケットの部分を形成する（図１０ｄ）。ＩｇＧにおける第二の差異
は、ＡＢヘリックスに向かい合うＥＦヘリックスにおける保存されたヒスチジン
（Ｈ３２９）の存在である。このヒスチジンは、種および亜類型にわたってＩｇ
Ｇにおいて完全に保存されているが、他のＩｇアイソタイプでは見いだされない
。ヒスチジン３２９は、Ｉ２６６および隣接残基によって形成されるポケットに
対して５つの原子接触を形成する（図１０ｄ）。Ｈ３２９によってなされる接触
は、すべてのＩｇＧ−Ｆｃ構造（ＡＢヘリックスが、下部のＩｇドメインにもは
や接触せず、かつＣγ２−Ｃγ３ドメイン界面から離れるようにシフトした、高
度に歪曲されたＦａｂ−Ｆｃヒンジ欠失ＩｇＧを含む（Ｇｕｄｄａｔら，１９９
３））において維持される。非グリコシル化ＩｇＧ−Ｆｃにおいて、ＩｇＧ Ｈ
３２９の^１Ｈ共鳴は不変である（Ｌｕｎｄら，１９９０；Ｍａｔｓｕｄａら，１
９９０）。このことは、これらの相互作用の保存を示唆する。

【０１３２】 対照的に、ＩｇＥにおいて対応する残基（Ｔ４０７）は、開放形態においてＡ
Ｂヘリックスと２つの接触をなし（図１０ａ、１０ｃ）、そして閉鎖形態では、
わずか１つのみの接触をなし、かつＡＢヘリックスから離れるように移動する（
図９ａ、１０ａ〜ｃ）。ラットおよびマウスのＩｇＥ配列において、Ｔ４０７は
、アラニンによって置換される。このことは、これら側鎖の相互作用の保存が重
要ではないことを示唆する。

【０１３３】 他のＣγ２ドメイン残基に対してＩｇＧ ＡＢヘリックスにより形成される広
範な接触、およびＡＢヘリックスに対するＥＦヘリックス残基Ｈ３２９の密接な
充填は、ＩｇＧ Ｃγ２−Ｃγ３界面を識別する。ＩｇＧでは、ＡＢヘリックス
は、下部（Ｃγ３）ドメインよりも上部（Ｃγ２）ドメインと、より密接に結合
される。対照的に、ＩｇＥ界面は、下部Ｃε４ドメイン残基とＣε３ ＡＢヘリ
ックス残基の広範な相互作用によって特徴付けられ（図１０ａ）、そしてＥＦヘ
リックスとの接触は制限される。ＩｇＥ Ｃε３およびＩｇＧ Ｃγ２の両方に
おいて、ＡおよびＢストランドは分離し、そしてＡＢヘリックスのいずれの側で
も水素結合を形成せず、ＡＢヘリックスの位置付けにおける幾分の可撓性を許容
する。しかし、この可撓性は、Ｃγ２ ＡＢとＥＦヘリックスとの広範な相互作
用によって、ＩｇＧに制限され得る。ＩｇＥでは、Ｃε３ ＡＢとＥＦヘリック
スとの間でなされる制限された接触によって、このヘリックスが独立して移動す
ることを可能にし得る。

【０１３４】 （Ｈ．ＦｃεＲＩ結合部位に対するコンフォメーション変化の効果） ＩｇＥ−Ｆｃ構造の大きなコンフォメーション変化は、高親和性レセプター（
ＦｃεＲＩ）と相互作用するＣε３ドメインにおけるループを再配向する。Ｆｃ
εＲＩ結合ループの大きな移動は、これらが、レセプターと相互作用するために
閉鎖ＩｇＥ−Ｆｃ構造において不十分にしか位置付けられないことを示唆する。
図１１は、開放Ｆｃ構造および閉鎖Ｆｃ構造の分子表面描写を示す（レセプター
結合残基は、マゼンタで強調表示される）。開放形態では、レセプター結合ルー
プが露出され、そして結合残基は、ＦｃεＲＩと相互作用するために利用可能な
、大きな凹表面を提示する。閉鎖形態では、これらのループは、部分的に不明瞭
であり、そしてＩｇＥ−Ｆｃ二分子軸にわたり互いに向き合い、レセプターの結
合を収容し得ない２つのＣε３ドメイン間に狭いギャップのみを残す。Ｃε３
ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループは、閉鎖コンフォメーションにおいてほぼ接近不
能であるが、Ｖ３３６に対してＮ末端の無秩序なＣε２−Ｃε３リンカー残基は
、閉鎖ＩｇＥ−Ｆｃ構造においてさえ、レセプターとの最初の相互作用を形成し
得る。リンカー残基に対するレセプターの結合は、Ｆｃのコンフォメーションを
、結合ループを露出する開放形態へとシフトさせ得る。

【０１３５】 （Ｉ．ＩｇＥ−Ｆｃコンフォメーションの可撓性についての構造的基礎） ＩｇＥ−Ｆｃ構造は、Ｆｃ−レセプター結合およびヒト疾患における治療的介
入について暗示する、抗体エフェクタードメインの新規なコンフォメーションを
明らかにする。閉鎖ＩｇＥ−Ｆｃの構造は、抗体アイソタイプのエフェクタード
メインが、アイソタイプ特異的な生物学的機能に関連する構造的特徴を進化させ
てきたことを示唆する。ＩｇＥ−Ｆｃの可撓性に影響を及ぼし得る構造的特徴と
しては、ヒンジ残基の位置およびパッキング（ｐａｃｋｉｎｇ）、ならびにＣε
３−Ｃε４ドメイン界面での特異的相互作用（例えば、Ｃε３ ＡＢヘリックス
の位置および接触）が挙げられる。コンフォメーションにおける変化に潜在的に
作用し得る他の因子（例えば、特定の結晶パッキング環境、複合糖質に代わる高
マンノースの存在、またはＣε２ドメインの欠失）が、考えられてきた。本発明
はまた、非対称性ユニットにおいて両方とも閉鎖形態にある２つのＩｇＥ−Ｆｃ
分子を含む、ＩｇＥ−Ｆｃの第２結晶形態の溶液を含む。これらの５つのＩｇＥ
−Ｆｃ鎖はすべて、類似したコンフォメーションをとる。このことは、閉鎖コン
フォメーションが、特定の結晶パッキング力によって影響されないことを示す。

【０１３６】 保存された付着部位での異なる炭水化物構造が、観察されたＩｇＥ−Ｆｃのコ
ンフォメーション変化の程度に影響を及ぼし得るのか否かは、依然として確証さ
れていない。ＩｇＧの生化学的研究は、上記で考察したような、Ｆｃドメインの
全体的な三次元配置を維持するにおける、保存された炭水化物の制限された構造
的役割を示唆している。ＩｇＥ−Ｆｃ（ＦｃεＲＩα結合）の機能的研究は、保
存された炭水化物の重要な役割に対して反論しているが、異なるＩｇＥ−Ｆｃ糖
形態（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）の構造的研究は、この問題を解決し得る。

【０１３７】 生化学的研究および生物物理的研究は、ＩｇＥ−Ｆｃ Ｃε２ドメインが、本
明細書で解析されたＣε３−Ｃε４構造とは別個の構造的ユニットを形成するこ
とを示している。Ｃε２−Ｃε３リンカーは、タンパク質分解性消化に対して感
受性であり（Ｐｅｒｅｚ−ＭｏｎｔｆｏｒｔおよびＭｅｔｚｇｅｒ，１９８２）
、そしてＦｃεＲＩを結合する際に非対称性のコンフォメーションをとる（Ｇａ
ｒｍａｎら，２０００）。このことは、Ｃε２−Ｃε３リンカーが、接近可能で
ありかつ可撓性であることを示唆する。ＩｇＥ−Ｆｃ中におけるＣε２ドメイン
の存在または非存在は、ＦｃεＲＩ結合の結合定数または熱力学的パラメーター
（ΔＧ°、ΔＨ°、ΔＳ°、およびΔＣｐ°）を有意には変更しない（Ｋｅｏｗ
ｎら，１９９８）。従って、レセプターへの結合様式は、インタクトなＩｇＥ−
ＦｃおよびＩｇＥ−Ｆｃ Ｃε３−Ｃε４に類似している可能性がある。あわせ
ると、これらの結果は、Ｃε２ドメインが、Ｃε３ドメインの構造またはコンフ
ォメーションに対してほとんど影響を有さないことを示唆する。

【０１３８】 ＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４ドメイン界面の構造的特徴は、ＩｇＧ Ｃγ２−Ｃγ
３ドメイン界面と比較して、ＩｇＥ−Ｆｃのコンフォメーションの可撓性を可能
にしているようである。第１ドメイン（Ｃε３またはＣγ２）のＡＢヘリックス
は、Ｆｃ構造における大半のドメイン間接触を媒介し、そして５つの異なる抗体
クラスのわたり、配列において保存されていない。ＡＢヘリックスと、２つのＦ
ｃ Ｉｇドメインとのパッキング接触は、抗体アイソタイプにわたって有意に相
違し得、潜在的にＦｃのコンフォメーション、可撓性および機能に影響を及ぼす
。異なる抗体クラスのＦｃドメインに関するコンフォメーションの可撓性範囲は
、アイソタイプ特異的なエフェクター機能の進化に関連付けられ得る。ＩｇＧ構
造のより制限された可撓性は、ＦｃγＲおよび相補体（Ｃ１ｑ）の相互作用のた
めの構造的要件における類似性を反映し得る。

【０１３９】 他の実験的証拠によって、ＩｇＥは溶液中で湾曲したコンフォメーションをと
り、そしてコンフォメーション変化が、ＦｃεＲＩへの結合に際して生じ得るこ
とが示唆された。これらの実験の設計および解釈は、本発明の特定のＩｇＥ−Ｆ
ｃコンフォメーション変化を予測し得なかった。ＦｃεＲＩへのＩｇＥ−Ｆｃの
結合（Ｋｅｏｗｎら，１９９８）は、比較的大きな熱容量変化（ΔＣｐ°＝−８
１５ｃａｌ／ｍｏｌ Ｋ）によって特徴付けられ、これは部分的に、ＩｇＥ−Ｆ
ｃコンフォメーション変化によって引き起こされ得る。対照的に、ＩｇＧ−Ｆｃ
のその相同な低親和性レセプター（ＦｃγＲＩＩＩ）への結合は、より小さな熱
容量変化（ΔＣｐ°＝−３６０ｃａｌ／ｍｏｌ Ｋ）を示す。蛍光エネルギー移
動実験によって、ＩｇＥのＮ末端とＣ末端との間の距離の平均は、わずか約７０
Å（ＩｇＥが、代表的な抗体のＹまたはＴ形態の平面から有意に湾曲する場合に
のみ可能である距離）であることが示された（Ｚｈｅｎｇら，１９９１）。中性
子散乱研究によって、インタクトなＩｇＥ−Ｆｃ（Ｃε２−Ｃε４）は、このド
メインの線状配置が可能とするよりも、有意により緻密な形状を有することが示
された（Ｂｅａｖｉｌら，１９９５）。このことは、湾曲がＩｇＥ−Ｆｃ領域内
において生じることを示唆する。ＩｇＥ−Ｆｃ結晶構造は、Ｃε２−Ｃε３リン
カー領域でのインタクトなＩｇＥの湾曲の解釈を支持し、そして中性子散乱デー
タの分析のためのより良好なモデルを提供し得る。ＩｇＥ可撓性の実験的試験が
、ここで、この構造に基づいて開発され得る。

【０１４０】 （Ｊ．ＩｇＥ−Ｆｃコンフォメーションの可撓性についての生物学的および治
療的意味） ＩｇＥ−Ｆｃにおけるコンフォメーションの可撓性は、ＩｇＥの生物学的機能
の固有の局面のために重要であり得る。ＩｇＥ−Ｆｃ可撓性は、ＦｃεＲＩとの
誘導されたフィット相互作用（ｉｎｄｕｃｅｄ−ｆｉｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏ
ｎ）を可能にし得ることで高親和性結合に寄与し、かつ低親和性ＩｇＥレセプタ
ーであるＦｃεＲＩＩとの相互作用のために重要であり得る（図１２）。Ｆｃε
ＲＩＩは、三量体Ｃ型レクチンであり、これは、その３つのレクチンドメインの
うちの２つを通してＩｇＥ−Ｆｃと相互作用すると考えられる（Ｓｈｉら，１９
９７）。ＩｇＧ抗体は、対応するレクチン様レセプターを有さない。このことは
、ＩｇＥ−Ｆｃコンフォメーションの可撓性が、この固有の抗体−レセプター相
互作用のために重要であり得ることを示唆する。

【０１４１】 ＩｇＥ−Ｆｃについての閉鎖コンフォメーションの存在および開放形態が、高
親和性レセプターに結合するという証明（Ｇａｒｍａｎら，２０００）は、Ｉｇ
Ｅ：ＦｃεＲＩ相互作用のインヒビターの設計のための新たなストラテジーを示
唆する（図１２）。ＩｇＥ−Ｆｃを結合しかつＦｃεＲＩとの相互作用をブロッ
クするモノクローナル抗体は、アレルギーおよびぜん息の処置のためのこのアプ
ローチの治療的可能性を示した（Ｃｈａｎｇ，２０００；Ｊａｒｄｉｅｕおよび
Ｆｉｃｋ，１９９９）。直接的に競合部位または間接的にアロステリック部位の
いずれかでの分子の結合による、閉鎖ＩｇＥ−Ｆｃコンフォメーションの安定性
は、レセプター結合をブロックし得、ＩｇＥ媒介性アレルギー疾患の処置のため
の新たなクラスの治療的インヒビターをもたらす。ＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４ドメ
イン界面は、ＩｇＧ−Ｆｃについて示されたような（ＤｅＬａｎｏら，２０００
）、レセプター結合のアロステリックインヒビターとして作用する可能性を有す
る、インビトロで選択される小リガンドの結合に対する標的を提供し得る（図１
３）。ＩｇＥ−Ｆｃの閉鎖コンフォメーションは、アトピー性疾患を軽減するた
めの新たな経路の探索および生物学的なエフェクター機構におけるＦｃドメイン
の可撓性の機能的役割の探索のための基礎を提供する。

【０１４２】 （Ｋ．方法） （１．ヒトＩｇＥ−Ｆｃの発現および精製） 昆虫細胞からのＩｇＥ−Ｆｃの発現、精製および特徴付けを、実施例１に記載
のように実施した。

【０１４３】 （２．結晶化および結晶の処理） 精製されたＩｇＥ−Ｆｃを、１．３２ｃｍ^−１（ｍｇ／ｍｌ）^−１のε_{２８０ ｎｍ} を用いて、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中において１０ｍｇ／ｍｌに
濃縮した。結晶を、０．５μｌタンパク質および０．５μｌ沈殿剤（２５ｍＭ酢
酸ナトリウム、ｐＨ４．６、３３％ポリエチレングリコール［ＰＥＧ］４０００
）を混合することによって、拡散蒸着法を使用して懸滴において成長させた。結
晶は、２２℃で１〜３日間成長され、そして塩またはＰＥＧの濃度および温度に
おける小さな変化に対して感受性であった。結晶を、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、
ｐＨ４．６、３７％ＰＥＧ ４０００中に収集し、素早く（３０秒未満で）凍結
保護物質溶液（収集溶液＋１５％（ｖ／ｖ）エチレングリコール）に移し、そし
て液体窒素中において急速冷却した。結晶は、空間群Ｐ４２_１２（ａ＝ｂ＝１０
５．６Å，ｃ＝４７．１Å）に属し、そして１非対称性ユニットあたり１つのＣ
ε３−Ｃε４鎖を含む。結晶を、より高いｐＨ収集溶液に連続的に移して、金属
結合およびレドックス化学を容易にした。広範囲の化合物（２７）、濃度（０．
１〜２０ｍＭ）およびｐＨ範囲（４．６〜８．５）での重原子スクリーニング（
約１００条件）は、同型誘導体も異常誘導体も生じなかった。しかし、水銀また
は白金で処理された結晶は、ネイティブな結晶よりも良好に回折された。これら
の観察に基づき、結晶を、冷却およびデータ収集の前に１ｍＭ塩化銅（ＩＩ）で
処理した。ネイティブな結晶は、シンクロトロン源を使用して約２．８Å解像度
で回折され、そして強い異方性を示し、そして時折、開裂された格子を示した。
銅で処理された結晶は、少なくとも２．０Å解像度に回折され、ほとんどまたは
全く異方性を有さなかった。本発明者らおよび他者ら（Ｂａｓｕら，１９９３）
は、ＩｇＥ−Ｆｃの小さな画分が鎖間ジスルフィドを形成しないことを観察した
。銅ＩＩは、ジスルフィドに対して残存する遊離システインを酸化した可能性が
ある。

【０１４４】 （３．データ収集、分子置換および精製） データを、Ｍａｒ３００画像化プレートシステムを使用するＳＳＲＬビームラ
イン７−１（ｗｔｃｕ１）、およびＭａｒＣＣＤ検出器を使用するＡｄｖａｎｃ
ｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ ＤＮＤ−ＣＡＴ ５ＩＤビームライン（ｗ
ｔｃｕ３）において、銅処理結晶から−１６０℃で収集した。このデータを、Ｈ
ＫＬプログラムパッケージソフト（ＯｔｗｉｎｏｗｓｋｉおよびＭｉｎｏｒ，１
９９７）を使用して処理および集積した。ＡＭｏＲｅ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉ
ｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ，１９９４），ＣＮＳ／Ｘ
ＰＬＯＲ（Ｂｒｕｉｎｇｅｒら，１９９８）およびＥＰＭＲ（Ｋｉｓｓｉｎｇｅ
ｒら，１９９９）を用いる最初の分子置換（ＭＲ）検索は、ＩｇＧ−Ｆｃ構造に
基づく種々のＩｇＥモデル（個々のＩｇドメインおよび７個のＩｇＧ構造を組み
込む複合モデルを含む）を使用して失敗した。次いで、Ｃε４と比較して屈曲し
、湾曲し、かつ回転した角度のＣε３の組織的な調査を行った。ループおよび非
相同性側鎖を短縮化（ｔｒｕｎｃａｔｅ）することによってインタクトなＩｇＧ
構造（マウスＩｇＧ２ａ，ＰＤＢエントリー１ＩＧＴ（Ｈａｒｒｉｓら，１９９
７））から誘導されたＣγ２−Ｃγ３ドメインからモデルを構築し、２２２残基
のＩｇＥ−Ｆｃについての１４４残基モデルを得た。このモデルのＣγ２−Ｃγ
３リンカー領域をその基点に配置し、Ｚ軸の周りで屈曲を生じさせるようにＣγ
２およびＣγ３を配向付けた。Ｃγ３を固定したまま、Ｘ、ＹおよびＺ周辺での
回転をＣγ２ドメインに適用した（３°工程）。約１２，０００モデルをプログ
ラムｌｓｑｋａｂ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ
Ｐｒｏｊｅｃｔ，１９９４）で自動的に生成し、そして結晶（ｃｒｙｓｔａｌ
）ｗｔｃｕ１からの１５〜４Åのデータを用いる完全ＡＭｏＲｅ（Ｃｏｌｌａｂ
ｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ，１９９４）検
索に使用した（表７）。このモデルは、出発ＩｇＧ２ａ構造の周りで−３０〜＋
４０度の角度範囲にわたった。単一分解（ｓｉｎｇｌｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（
出発構造から約１７°）が見出され、そして１．０°の回転増分を使用する局所
的研究によって改善された。より微細な研究により、３８％の相関係数および４
８．９％のＲ_{ｆａｃｔｏｒ}を有する分解を生じた。シミュレートされたアニーリ
ング複合体欠損電子密度マップ（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ−ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｃ
ｏｍｐｏｓｉｔｅ−ｏｍｉｔ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍａｐ）へ
のモデル構築および精製のサイクルを、プログラムＯ（Ｊｏｎｅｓら，１９９１
）およびＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒら，１９９８）を使用して、結晶ｗｔｃｕ３か
らのより高度な解像度のデータを用いて継続した。精製を、｜Ｆ｜＞０および異
方性バルク溶媒補正を使用して、３０〜２．３Åからのすべてのデータに対して
実施した。Ｒ_ｆｒｅｅを減少した精製工程のみを受容した。このモデルは、残基
３３６〜５４３を含み、そしてこの構築物において存在するＮ末端の１０残基お
よびＣ末端の４残基を欠失する。レセプター結合ループ（Ｃε３ ＢＣ、ＤＥお
よびＦＧループ）は、他の残基の大半よりも、弱い密度および高いＢ因子を有す
る。Ｃε４ ＡＢループについての密度は特に貧弱であり、そしてこのループを
立体的にモデル化した。すべての残基が、Ｎ４８１を例外として、ラマチャンド
ランプロットの受容領域内に存在した。しかし、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒ残
基を欠失する密着回転（ｔｉｇｈｔ ｔｕｒｎ）内のこの残基には、良好な密度
が存在する。いくつかの密度は、Ｎ３９４部位で観察された炭水化物についてで
あったが、炭水化物を構築する試みは、Ｒ_ｆｒｅｅも電子密度マップも改善せず
、そしてそのため、これをモデルには含めなかった。Ｎ３７１部位に付着した炭
水化物について、電子密度は存在しない。現在の精製統計を、表７にまとめる。
図を、プログラムＭＯＬＳＣＲＩＰＴ（Ｋｒａｕｌｉｓ，１９９１），ＧＲＡＳ
Ｐ（Ｎｉｃｈｏｌｌｓら，１９９１）およびＲａｓｔｅｒ ３Ｄ（Ｍｅｒｒｉｔ
ｔおよびＢａｃｏｎ，１９９７）を使用して作成した。

【０１４５】 （Ｌ．参考文献）

【０１４６】

【表８】

【０１４７】

【０１４８】

【０１４９】 本発明の種々の実施形態を詳細に記載したが、これらの実施形態の改変および
適応が当業者に思い浮かぶことは明らかである。しかし、このような改変および
適応は、添付の特許請求の範囲に示されるように、本発明の範囲内であることが
明確に理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、非結合ＩｇＥ−Ｆｃ、レセプター結合ＩｇＥ−ＦｃおよびＩｇＧ−Ｆ
ｃの構造の側面図の比較を示す。Ｎ末端ドメインを、青色で示す。図１ａは、Ｉ
ｇＥ−ＦｃのＣε３−Ｃε４ドメインの閉鎖形態を示す。図１ｂは、ＩｇＥ−Ｆ
ｃのＣε３−Ｃε４ドメインの開放形態を示す。図１ｃは、非結合ＩｇＧ−Ｆｃ
を示す。

【図２】 図２は、非結合ＩｇＥ−Ｆｃ、レセプター結合ＩｇＥ−ＦｃおよびＩｇＧ−Ｆ
ｃの構造（Ｎ末端ドメイン）の平面図の比較である。βストランドは、Ａ〜Ｇで
表示され、そして、各Ｆｃの構造についてＡストランドの第１残基間に線が引か
れている。閉鎖ＩｇＥコンフォメーションにおいて、この距離は、１３Åであり
、この開放形態において、この距離は、２３Åであり、そして、ＩｇＧ−Ｆｃの
構造において、この距離は、２２Åである。図２ａは、ＩｇＥ−ＦｃのＣε３−
Ｃε４ドメインの閉鎖形態を示す。図２ｂは、ＩｇＥ−ＦｃのＣε３−Ｃε４ド
メインの開放形態を示す。図２ｃは、非結合ＩｇＧ−Ｆｃを示す。

【図３】 図３は、開放ＩｇＥ−Ｆｃの構造（濃青色）および閉鎖ＩｇＥ−Ｆｃの構造（
赤色）を有する、９個の結晶学的に独立したＩｇＧ−Ｆｃの構造（灰色／青色）
の重ね合わせを示す。ＩｇＧおよびＩｇＥのＦｃの構造を、Ｃ末端のドメイン（
Ｃγ２またはＣε３）からのＣα炭素を用いて重ね合わせた。ＩｇＧ−Ｆｃの構
造を、ＰＤＢファイル（１ＩＧＴ、１ＦＣ１、１ＦＣ２、１ＦＣＣ、１ＩＧＹお
よび１ＡＤＱ）から用いた。１ＭＣＯヒンジ欠損抗体の構造は、これがタンパク
質構造の全体にわたって異常なドメインの対形成を示すので、この分析には含め
なかった。星印を、ＩｇＥ−ＦｃのＢＣループ中の残基３６６の隣に配置する。

【図４ａ】 図４ａは、結合ＩｇＥ−Ｆｃと遊離ＩｇＥ−Ｆｃとの間の構造の差異を特徴付
けるドメインの運動のＤｙｎＤｏｍ分析を示す。Ｆｃ（ｃ３／ｃ４単量体）の２
分の１を、暗赤色の線で示される屈曲の軸を有する閉鎖コンフォメーションにお
いて示す。ＤｙｎＤｏｍを用いて、その軸の位置を決定し、そしてその角度の変
化を算出した。ヒンジ残基（３４３〜３４５、３５１〜３５２、および４３５〜
４３６）を、淡紫色で縁取った。Ｆｃの開放形態および閉鎖形態の両方において
相対的に固定されたままである残基は、Ｃε４ドメインの全体、ドメイン間リン
カー、およびＣε３のＡＢヘリックスを含む。Ｃε３ドメインにおける残基は、
セミリジッド（ｓｅｍｉ−ｒｉｇｉｄ）ドメインとして移動する。

【図４ｂ】 図４ｂは、Ｃε３／Ｃε４およびＣγ２／Ｃγ３の境界面で残基の接写を示す
。ＩｇＧ−Ｆｃ（赤色）（ｐｄｂファイルの１ＩＧＴ由来）および閉鎖ＩｇＥ−
Ｆｃ（青色）を、Ｃ末端ドメイン（Ｃγ３またはＣε４）における残基を用いて
重ね合わせた。ここで留意すべき点は、ドメイン間の境界面から離れたＩｇＥ−
Ｆｃヘリックスの置換（青色の円柱）およびＩｇＧ−ＦｃヘリックスへのＣε３
残基の密接なアプローチである。両ドメインとのＡＢヘリックスの相互作用は、
異なる抗体のＦｃドメインの移動度の全範囲を決定し得る。

【図４ｃ】 図４ｃは、遊離状態の結晶構造およびレセプター結合結晶構造におけるＩｇＥ
−Ｆｃの両鎖について観察された残基置換のグラフを示す。一方の鎖を赤色の円
で示し、他方の鎖を青色のひし形で示す。各構造におけるアミノ酸残基間のＣα
の距離を、２つのＣε４ドメインのアライメントに基づいて２つの構造を重ね合
わせた後、算出した。結合しているレセプターに関連したループを、黄色で示し
て強調し、そしてこのループは、遊離形態において約６〜１４Å移動する。「Ｎ
」は、Ｃε３のＡストランド残基を示し、「Ｃ」は、カルボキシ末端であり、「
Ｌ」は、規則正しく並んでいないＣε４のＡＢループを同定し、そして「Ｘ」は
、結晶接触に起因する差異を同定する。

【図５ａ】 図５ａは、閉鎖ＩｇＥ−Ｆｃの構造（左）および開放ＩｇＥ−Ｆｃの構造（右
）におけるＣε３およびＣε４ドメイン（平面図）の表面表示を示す。レセプタ
ー結合残基を、マゼンタ色で示し、そしてこれは、Ｃε３のＢＣ、ＤＥおよびＦ
Ｇループ由来である。

【図５ｂ】 図５ｂは、図５ａで記載されたＣε３およびＣε４ドメインの側面図を示す。

【図６】 図６は、レセプター結合および構造ベースのインヒビター設計におけるＩｇＥ
コンフォメーション変化についての潜在的役割を図示する。ＩｇＥ分子の開放形
態は、この複合体の結晶構造によって示されるように、高親和性レセプター（Ｆ
ｃεＲＩ）と相互作用し得る。ＩｇＥはまた、低親和性レセプターに結合し、こ
れは、Ｃ型レクチンドメインの三量体（ＦｃεＲＩＩ）である。ＦｃεＲＩＩは
、この図の上方左手の部分示されるように、ＩｇＥ構造の閉鎖形態と潜在的に相
互作用し得る。レクチンドメインを青色で示し、一方、ＩｇＥ−ＦｃのＣε３ド
メインを黄色で示す。３つのこれらのレクチンドメインのうちの２つだけが、Ｉ
ｇＥと相互作用すると考えられる。ＩｇＥ相互作用の３つの異なるクラスのイン
ヒビターをまた、この図の左手側に示す。１つのクラスは、開放ＩｇＥに結合し
、そしてＦｃｅＲＩ結合部位に対して競合し得る（競合、下方左側）。別のクラ
スは、Ｃｅ３／Ｃｅ４ヒンジ付近のＩｇＥ領域に結合し、そして閉鎖形態のＩｇ
Ｅを安定化し得る。従って、ＦｃｅＲＩの結合を間接的に阻害する（アロステリ
ックインヒビター、中央左側）。第３のクラスのインヒビターは、ＩｇＥのＦｃ
ｅＲＩ結合領域と相互作用し得るが、閉鎖形態のＩｇＥを安定化し、ＦｃｅＲＩ
結合の競合インヒビターおよびコンフォメーションインヒビターの両方として機
能する（コンフォメーションインヒビター、中央左側）。

【図７】 図７Ａは、ＩｇＧ抗体およびＩｇＥ抗体の一般構造を示す。両抗体は、２つの
アイソタイプ特異的重鎖および２つの軽鎖（Ｈ_２Ｌ_２）を含む。Ｆａｂドメイン
は、重鎖および軽鎖の成分の両方を含むが、Ｆｃドメイン（ピンク色の陰影部分
）は、独占的に軽鎖由来である。ＩｇＥ−Ｆｃは、ＩｇＧ−Ｆｃと比較して付加
ドメイン対（Ｃε２）を含む。ＩｇＥのＣε３−Ｃε４ドメインは、ＩｇＧのＣ
γ２−Ｃγ３ドメインに対して相同である。図７Ｂは、ヒトＩｇＥ−ＦｃのＣε
３−Ｃε４の、結晶構造を解析した４つのＩｇＧ−Ｆｃの配列との立体構造に基
づいた配列アライメントを示す。ＩｇＥの２次構造を、βストランドについての
矢印およびαヘリックスについてのリボンを用いて示す。色のついた帯は、ヒン
ジ残基（青色）、ＦｃεＲＩ結合ループ（ピンク色）および炭水化物接着部位（
緑色の点）を示す。この配列アライメント内で、保存された残基を淡青色の陰影
で示し、一方、ＩｇＧとＩｇＥとの間の構造的差異（２次構造における挿入、欠
失、変化）を黄色で強調する。さらに、完全に保存されたＣγ２のＡＢヘリック
スのヒスチジン残基（Ｉｇｇ１におけるＨ３１０、ＩｇＧ２ａにおけるＨ３２９
）およびＩｇＥにおける対応残基（スレオニン４０９）をそれぞれ、黄色および
ピンク色で示す。（配列の上の）ＩｇＥのナンバリングは、Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏ
ｎおよびＢｅｎｎｉｃｈに従う。ヒトＩｇＧ１のナンバリングを、配列の真下に
付す。マウスＩＧ２ａ（１ＩＧＴ）のＰＤＢナンバリングを、下部に斜体で示す
（ここで留意すべき点は、このナンバリングシステムにおいて欠損が存在するこ
とである）。

【図８】 図８Ａは、非結合ＩｇＥ−Ｆｃ、レセプター結合ＩｇＥ−ＦｃおよびＩｇＧ−
Ｆｃの構造の側面図の比較を示す。Ｎ末端のドメインを、青色で示す、図８Ｂは
、非結合ＩｇＥ−Ｆｃ、レセプター結合ＩｇＥ−ＦｃおよびＩｇＧ−Ｆｃの構造
（Ｎ末端のドメイン）の平面図の比較である。βストランドは、Ａ〜Ｇで表示さ
れ、そして、各Ｆｃ構造について、Ａストランドの第１残基間に線が引かれてい
る。閉鎖ＩｇＥコンフォメーションにおいて、この距離は１３Åであり、開放形
態において、この距離は２３Åであり、そしてＩｇＧ−Ｆｃ構造において、この
距離は２２Åである。

【図９】 図９Ａは、開放ＩｇＥ−Ｆｃの構造（濃青色）および閉鎖ＩｇＥ−Ｆｃの構造
（赤色）を有する、９個の結晶学的に独立したＩｇＧ−Ｆｃの構造（灰色／青色
）の重ね合わせを示す。ＩｇＧおよびＩｇＥのＦｃの構造を、Ｃ末端のドメイン
（Ｃγ２またはＣε３）からのＣα炭素を用いて重ね合わせた。ＩｇＧ−Ｆｃの
構造を、ＰＤＢファイル（１ＩＧＴ、１ＦＣ１、１ＦＣ２、１ＦＣＣ、１ＩＧＹ
および１ＡＤＱ）から用いた。星印を、ＩｇＥ−ＦｃのＢＣループ中の残基３６
６の隣に配置する。ここで留意すべき点は、ドメイン間の境界面から離れたＩｇ
Ｅ−Ｆｃヘリックスの置換、閉鎖コンフォメーションにおけるＩｇＥ−ＦｃのＥ
Ｆヘリックスの移動、ならびにＩｇＧ残基挿入部位でのＩｇＧ−ＦｃのＡＢヘリ
ックスおよびＩｇＧ−ＦｃのＥＦヘリックスの密接なアプローチである。図９Ｂ
は、ＩｇＧ−ＦｃのＤｙｎＤｏｍ分析を示す。Ｆｃの一方の鎖のステレオ図（閉
鎖コンフォメーション）を、矢印で示される回転軸とともに示す。ヒンジ残基（
３４３〜３４５、３５１〜３５２、および４３５〜４３６）をシアン色で縁取っ
ている。セミリジッドドメインとして移動するＣε３ドメイン残基を、赤色で示
す。Ｆｃの開放形態および閉鎖形態の両方で相対的に固定されたままの残基を青
色で示す。図９Ｃは、３つのＩｇＧ−Ｆｃ構造のＤｙｎＤｏｍ分析を示す。回転
軸ならびにＩｇＧ２ａ構造のＣαトレース上のマウスＩｇＧ１（１ＩＧＹ）（シ
アン色）、マウスＩｇＧ２ａ（１ＩＧＴ）（紫色）、およびヒトＩｇＧ１（１Ｆ
Ｃ１）（ピンク色）についてのヒンジ残基を有するステレオ図を示す。図９Ｄは
、ＩｇＥ−Ｆｃの閉鎖コンフォメーションと開放コンフォメーションとの間のＣ
αの座標における変化を示す。一方の鎖を赤い円で示し、もう片方の鎖を青色の
ひし形で示す。レセプター結合ループを、ピンク色で示して強調し；ヒンジ残基
をシアン色で示す。「Ｎ」は、Ｃε３のＡストランド残基を示し、「Ｃ」は、カ
ルボキシ末端、「Ｌ」は、規則正しく並んでいないＣε４のＡＢループを同定し
、そして「Ｘ」は、結晶接触に起因する差異を同定する。

【図１０】 図１０Ａは、ＡＢヘリックス残基９ＩｇＥのＣε３またはＩｇＧのＣγ２によ
ってなされた接触を図示する。ＡＢヘリックスおよびＥＦヘリックスの残基を、
灰色のらせんホイールで示し、一方、より低ドメイン（Ｃε３またはＣ４）の残
基を、下に示す（青色の楕円中に青色で記されている）。上部ドメイン接触（Ｃ
ε３またはＣγ２に対する）は、ＥＦヘリックスにおける残基およびＡＢヘリッ
クスに直ぐに隣接する残基を含む。より低ドメイン接触（Ｃε４またはＣγ３に
対する）は、Ｃ，Ｃ’、ＦおよびＧのβシートストランドならびにＦＧループか
らの残基を含む。ＩｇＥ−Ｆｃの開放形態においてのみ形成される接触を、青色
の破線で示し；閉鎖形態においてのみ形成される単一接触を、赤線で示す。Ｉｇ
Ｇにおける保存されたＨ３２９によってなされた接触を、青色の実線で示す。完
全に保存されたＥＦヘリックスのＨ３２９残基およびＡＢヘリックスの直後の突
出部を形成する挿入残基Ｉ２６６を、黄色で示す。図１０Ｂは、閉鎖ＩｇＥ−Ｆ
ｃにおけるＥＦヘリックス残基Ｔ４０７のＡＢヘリックスとの相互作用の表面表
示を示し、一方、図１０Ｃは、開放ＩｇＥ−Ｆｃにおけるこれと同様の相互作用
を示す。図１０Ｄは、ＩｇＧ−Ｆｃにおける対応残基（保存されたＨ３２９）の
、Ｃγ２のＡＢヘリックスのＣ末端での突起物とのパッキング相互作用の表面表
示を示す。

【図１１】 図１１Ａは、閉鎖ＩｇＥ−Ｆｃの構造（左）および開放ＩｇＥ−Ｆｃの構造（
右）におけるＣε３およびＣε４ドメインの分子の表面表示（側面図）を示す。
レセプター結合残基を、マゼンタ色で示し、そしてこれはＣε３のＢＣ、ＤＥお
よびＦＧループ由来である。図１１Ｂは、図１１Ａに記載されるＣε３およびＣ
ε４ドメインの平面図を示す。

【図１２】 図１２は、Ｆｃレセプター結合および構造ベースのインヒビター設計における
ＩｇＥの可撓性について可能性のある役割を示す。Ｃε３ドメインを、異なるコ
ンフォメーション状態（開放状態（ピンク色）および閉鎖状態（黄色））に対応
するよう色付けし；Ｃε４ドメインを灰色で示す。ＩｇＥ分子の開放形態は、高
親和性レセプター（ＦｃεＲＩ）に結合し得る。低親和性レセプター（ＦＣεＲ
ＩＩ）は、未同定コンフォメーションのＩｇＥ−Ｆｃ（緑色）に結合する三量体
Ｃ型レクチンである。ＩｇＥ：ＦｃεＲＩ相互作用のインヒビターの３つの潜在
的クラス（結合部位競合インヒビター、結合部位コンフォメーションインヒビタ
ー、およびアロステリックコンフォメーションインヒビター）を示す。

【図１３】 図１３は、ＩｇＥ−Ｆｃヒンジ付近の潜在的薬物結合部位を図示する。仮想薬
物（緑色）を、ヒンジキャビティの内側に示す。キャビティ周辺の残基としては
、以下が挙げられる：Ｒ３４２、Ｐ３４３、Ｓ３４４、Ｐ３４５、Ｌ３４８、Ｗ
４１０、Ｉ４１１、Ｋ４３５、Ｔ４３６、Ｒ４４０、Ｐ４７１、Ｅ４７２、Ｄ４
７３、Ｅ５２９。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｈ０４５ 1/19 1/21 1/21 7/00 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 7/00 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/53 33/566 23/20 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｇ０１Ｎ 23/20 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G001 AA01 BA18 CA01 LA01 RA02 4B024 AA01 AA11 BA61 CA02 DA02 EA04 HA01 4B064 AG26 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA90Y AB01 BA02 CA44 CA46 4C084 AA17 NA14 ZB132 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA75 EA20 EA50 FA74

Claims (69)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ３次元モデルであって、該モデルは、以下： （ａ）Ｃε３ドメインおよびＣε４ドメインを含むヒトＩｇＥ Ｆｃ領域（Ｆｃ
   −Ｃε３／Ｃε４）の３次元モデルであって、ここで該モデルが、実質的に表１
   、表４および表５からなる群より選択される表に特定化される原子座標を表す、
   ３次元モデル；および （ｂ）該（ａ）のモデルの改変体を含む３次元モデルであって、ここで、該改変
   が、ＦｃεＲＩαタンパク質に結合する抗体Ｆｃ領域を表す、３次元モデル、 からなる群より選択される、３次元モデル。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のモデルであって、ここで、該モデルが、以
   下： 該モデルが包含する全原子の座標を列挙する工程、 物理学的３次元モデルを提供する工程、 該モデルをコンピュータスクリーン上で画像化する工程、 該モデルの画像を提供する工程、および 該モデルの画像に基づいて座標のセットを導く工程、 からなる群より選択される方法によって表される、モデル。
3. 【請求項３】 請求項１に記載のモデルであって、ここで、前記モデルが、
   表２および表６からなる群より選択される表に列挙される前記タンパク質のアミ
   ノ酸残基の溶媒接触度を同定する、モデル。
4. 【請求項４】 請求項１に記載のモデルであって、ここで、該モデルが、Ｆ
   ｃεＲＩαタンパク質の細胞外ドメインに対するヒトＩｇＥ抗体のＦｃ−Ｃε３
   ／Ｃε４領域の親和性と少なくとも等価である親和性で、ＦｃεＲＩαタンパク
   質に結合する抗体を表し、該ＦｃεＲＩαタンパク質は、ヒトＦｃεＲＩαタン
   パク質、イヌＦｃεＲＩαタンパク質、ネコＦｃεＲＩαタンパク質、ウマＦｃ
   εＲＩαタンパク質、マウスＦｃεＲＩαタンパク質、およびラットＦｃεＲＩ
   αタンパク質からなる群より選択される、モデル。
5. 【請求項５】 請求項１に記載のモデルであって、ここで、該モデルが、抗
   体のＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域を表現し、該抗体が、ヒトＩｇＥ抗体、イヌＩｇ
   Ｅ抗体、ネコＩｇＥ抗体、ウマＩｇＥ抗体、マウスＩｇＥ抗体、およびラットＩ
   ｇＥ抗体からなる群より選択される、モデル。
6. 【請求項６】 前記モデルが、ヒトＩｇＥ以外のＩｇＥ抗体のＦｃ−Ｃε３
   ／Ｃε４領域の３次元モデルを含む、請求項１に記載のモデル。
7. 【請求項７】 前記モデルが、前記他のＩｇＥ抗体のＦｃ−Ｃε３／Ｃε４
   領域のアミノ酸配列の全てまたは任意の部分を前記ヒトＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領
   域の３次元モデルに組込むことによって作製される、請求項６に記載のモデル。
8. 【請求項８】 前記モデルが、ＦｃεＲＩα結合ドメインを表す、請求項１
   に記載のモデル。
9. 【請求項９】 請求項１に記載のモデルであって、該モデルが、以下： （ａ）ヒトＩｇＥ抗体のＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域を結晶化する工程； （ｂ）該結晶化した領域からＸ線回折データを収集する工程；および （ｃ）該領域の該データおよびアミノ酸配列から該モデルを決定する工程 を包含する方法によって作製される、モデル。
10. 【請求項１０】 前記Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４領域が、配列番号２のアミノ酸
    配列を有する、請求項９に記載のモデル。
11. 【請求項１１】 請求項１に記載のモデルであって、ここで、該モデルが、
    表１、表４および表５からなる群より選択される表に特定化される原子によって
    実質的に表現される３次元モデルと重ね合わせた場合に、１０Å未満のタンパク
    質骨格原子の平方自乗平均偏差を有する原子座標を含む３次元構造を有する、モ
    デル。
12. 【請求項１２】 前記改変が、配列番号２のアミノ酸配列を有するＩｇＥ
    Ｆｃ領域と少なくとも約３０％のアミノ酸配列相同性を共有する抗体Ｆｃ領域を
    含む、請求項１に記載のモデル。
13. 【請求項１３】 請求項１に記載のモデルであって、ここで、該モデルが、
    改善された機能を有するＩｇＥ Ｆｃ領域を表し、 該改善された機能が、以下： 配列番号２のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＥ Ｆｃ領域の安定性と比較して、
    増大した安定性、 配列番号２のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＥ Ｆｃ領域のＦｃεＲＩαに対す
    る親和性と比較して増大したＦｃεＲＩαタンパク質に対する親和性、 配列番号２のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＥ Ｆｃ領域のヒトＦｃεＲＩαに
    対する親和性と比較して改変された基質親和性、および 配列番号２のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＥ Ｆｃ領域の可溶性と比較して増
    大した可溶性、 からなる群より選択された改善された機能を有する、モデル。
14. 【請求項１４】 前記モデルが、ＦｃεＲＩαタンパク質とＩｇＥ抗体との
    間の選択的結合のインヒビターを同定するために使用される、請求項１に記載の
    モデル。
15. 【請求項１５】 前記モデルが、ＦｃεＲＩαタンパク質とＩｇＥ抗体のＦ
    ｃ−Ｃε３／Ｃε４領域との間の結晶接触を同定する、請求項１に記載のモデル
    。
16. 【請求項１６】 請求項１に記載のモデルであって、前記抗体のＦｃ領域の
    Ｃε３ドメインおよびＣε４ドメインが、表１、表４および表５からなる群より
    選択される表によって特定化される構造座標によって特定化されるような様式で
    配向される、モデル。
17. 【請求項１７】 請求項１に記載のモデルであって、ここで、以下： 前記抗体のＦｃ領域の２つのＣε３／Ｃε４ドメイン間にあるドメイン間の溝
    、 該抗体のＦｃ領域のＣε３ドメインとＣε４ドメインとの間にあるヒンジ、
    およびＦｃεＲＩα結合に関連するループからなる群より選択される構造が、表
    １、表４、および表５からなる群より選択される表で特定化される構造座標によ
    り特定化される様式で配向される、モデル。
18. 【請求項１８】 請求項１７に記載のモデルであって、前記ＦｃεＲＩ結合
    ループが、Ｃε２とＣε３との間のリンカー、Ｃε３のＢＣループ、Ｃε３のＤ
    ＥループおよびＣε３のＦＧループからなる群より選択される、モデル。
19. 【請求項１９】 前記２つのＣε３ドメイン間の距離が、約１０Å〜約２５
    Åの範囲にある、請求項１に記載のモデル。
20. 【請求項２０】 前記２つのＣε３ドメイン間の距離が、約１３Åである、
    請求項１に記載のモデル。
21. 【請求項２１】 ヒトＩｇＥ抗体のＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域の３次元モデ
    ルの作製方法であって、該方法は、該領域のアミノ酸を表１、表４および表５か
    らなる群より選択される表に特定化される原子座標で実質的に表す工程を包含す
    る、方法。
22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の方法であって、該モデルが、以下： 該モデルが包含する全原子の座標を列挙する工程、 物理的３次元モデルを提供する工程、 該モデルをコンピュータスクリーン上で画像化する工程、 該モデルの画像を提供する工程、および 該モデルの画像に基づいて座標のセットを導く工程、 からなる群より選択される方法によって表される、方法。
23. 【請求項２３】 ヒトＦｃεＲＩα結合ドメイン以外のＦｃεＲＩα結合ド
    メインの３次元モデルの作製方法であって、該ヒトＦｃεＲＩα結合ドメインが
    、 表１、表４および表５からなる群より選択される表に特定化される原子座標を実
    質的に表す３次元モデルによって表され、該方法がホモロジーモデリング工程を
    包含する、方法。
24. 【請求項２４】 請求項２３に記載の方法であって、該方法が、前記他のＦ
    ｃεＲＩα結合ドメインのアミノ酸の少なくとも一部を、表１、表４および表５
    からなる群より選択される表に特定化される原子座標を実質的に表す前記３次元
    モデルに組み込む工程であって、該他のＦｃεＲＩα結合ドメインのモデルを作
    製する工程を包含する、方法。
25. 【請求項２５】 請求項２３に記載の方法であって、該方法が、２つのＣε
    ３ドメイン間の距離が約１０Å〜約２５Åの範囲にあるように前記免疫グロブリ
    ンドメインを配向する工程を包含する、方法。
26. 【請求項２６】 ヒトＩｇＥ抗体のＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域の単離された
    結晶。
27. 【請求項２７】 前記領域が配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項２
    ６に記載の結晶。
28. 【請求項２８】 前記結晶が、空間群 ｓｐａｃｅｇｒｏｕｐＰ４２_１２に
    属する、請求項２６に記載の結晶。
29. 【請求項２９】 請求項２６に記載の結晶であって、該結晶が、１０５．６
    Å×１０５．６Å×４７．１Å、α＝β＝γ＝９０°の寸法のセルを有し、そし
    て該結晶の非対称単位当たり１つのＣε３／Ｃε４鎖を含む、結晶。
30. 【請求項３０】 前記Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４領域が昆虫細胞において生成さ
    れる、請求項２６に記載の結晶。
31. 【請求項３１】 前記結晶が約２．３Åの解像度でＸ線を回折する、請求項
    ２６に記載の結晶。
32. 【請求項３２】 ヒトＩｇＥ抗体のＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域の単離された
    結晶を生成するための方法であって、該方法は、蒸着を包含する、方法。
33. 【請求項３３】 前記Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４領域が配列番号２のアミノ酸配
    列を有する、請求項３２に記載の方法。
34. 【請求項３４】 請求項３２に記載の方法であって、前記結晶が、１０５．
    ６Å×１０５．６Å×４７．１Å、α＝β＝γ＝９０°の寸法のセルを有するｓ
    ｐａｃｅｇｒｏｕｐＰ４２_１２からなる群より選択される空間群に属する、方法
    。
35. 【請求項３５】 前記Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４領域が昆虫細胞で生成される、
    請求項３２に記載の方法。
36. 【請求項３６】 前記結晶が約２．３Åの解像度でＸ線を回折する、請求項
    ３２に記載の方法。
37. 【請求項３７】 単離されたＦｃ−Ｃε３／Ｃε４タンパク質であって、 該タンパク質は、以下： （ａ）配列番号２からなるタンパク質；および （ｂ）（ａ）のタンパク質と構造的に相同な単離されたタンパク質からなる群
    より選択される、ここで、該（ｂ）のタンパク質がＦｃεＲＩαタンパク質に結
    合する、Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４タンパク質。
38. 【請求項３８】 前記タンパク質が、昆虫細胞で生成される、請求項３７の
    タンパク質。
39. 【請求項３９】 請求項３７のタンパク質であって、該Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε
    ４タンパク質が、ヒトＦｃ−Ｃε３／Ｃε４タンパク質、イヌＦｃ−Ｃε３／Ｃ
    ε４タンパク質、ネコＦｃ−Ｃε３／Ｃε４タンパク質、ウマＦｃ−Ｃε３／Ｃ
    ε４タンパク質、マウスＦｃ−Ｃε３／Ｃε４タンパク質およびラットＦｃ−Ｃ
    ε３／Ｃε４タンパク質からなる群より選択される、タンパク質。
40. 【請求項４０】 請求項３７に記載のタンパク質をコードしている核酸配列
    を含む、核酸分子。
41. 【請求項４１】 請求項４０に記載の核酸配列を含む、組換え分子。
42. 【請求項４２】 請求項４０に記載の核酸配列を含む、組換えウイルス。
43. 【請求項４３】 請求項４０に記載の核酸配列を含む、組換え細胞。
44. 【請求項４４】 請求項４３に記載の組換え細胞を培養する工程を包含する
    、タンパク質を産生するための方法。
45. 【請求項４５】 ＩｇＥ抗体とＦｃεＲＩαタンパク質との間の結合を阻害
    する化合物を同定するための方法であって、該方法は、ヒトＩｇＥのＦｃ−Ｃε
    ３／Ｃε４領域の３次元モデルを使用して、該化合物を同定する工程を包含し、
    ここで、該モデルが、表１、表４および表５からなる群より選択される表により
    特定化される原子座標を実質的に表す、方法。
46. 【請求項４６】 請求項４５に記載の方法であって、ここで、前記化合物が
    、 前記ＦｃεＲＩα結合ドメイン、前記抗体Ｆｃ領域の２つのＣε３／Ｃε４ドメ
    インの間にあるドメイン間の溝、該抗体のＦｃ領域のＣε３ドメインとＣε４ド
    メインとの間にあるヒンジ、およびＣε３ドメインまたはＣε４ドメインの領域
    からなる群より選択される該モデルの領域と相互作用し、ここで、該Ｃε３ドメ
    インまたはＣε４ドメインの領域の相対的な位置が、閉鎖Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４
    コンフォメーションとレセプター結合Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４コンフォメーション
    との間で１Åを超えて変化する、方法。
47. 【請求項４７】 前記Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４領域の２つのＣε３ドメイン間
    の距離が約１０Å〜約２５Åの範囲にある、請求項４６に記載の方法。
48. 【請求項４８】 前記Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４領域の２つのＣε３ドメイン間
    の距離が約１３Åである、請求項４６に記載の方法。
49. 【請求項４９】 請求項４５に記載の方法であって、ここで、前記化合物が
    、Ｃε２とＣε３との間のリンカー、Ｃε３のＢＣループ、Ｃε３のＤＥループ
    、およびＣε３のＦＧループ、ドメイン間の溝を規定するループまたはストラン
    ド、Ｃε３のＡＢヘリックスおよび、該Ｃε３のＡＢヘリックスの上部に存在す
    る領域からなる群より選択される前記モデルの領域と相互作用する、方法。
50. 【請求項５０】 請求項４５の方法であって、ここで、 前記化合物が、以下： （ａ）第４位，７位、８位、９位、１０位、１１位、１７位、１８位、１９位
    、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２９位、３０位、３１位、３７位
    、３８位、３９位、６８位、６９位、７０位、９９位、１００位、１０１位、１
    ０２位、１０９位、１１０位および１１１位からなる群より選択される配列番号
    ２における位置を有する残基；および （ｂ）該（ａ）の残基のうちいずれかの約１０Å内にある、表面の残基、 からなる群より選択されるアミノ酸と相互作用する、方法。
51. 【請求項５１】 請求項４５の方法であって、ここで、前記化合物が、以下
    ： （ａ）第４位，７位、８位、９位、１０位、１１位、３７位、３８位、３９位
    、６８位、６９位、７０位、９９位、１００位、１０１位および１０２位からな
    る群より選択される配列番号２における位置を有する残基； （ｂ）Ｃε３ドメインまたはＣε４ドメインの領域中の残基であって、ここで
    、該Ｃε３ドメインまたはＣε４ドメインの領域の相対的な位置が、閉鎖Ｆｃ−
    Ｃε３／Ｃε４コンフォメーションとレセプター結合Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４コン
    フォメーションとの間で１Åを超えて変化する、残基；および （ｃ）該（ａ）または（ｂ）の残基のうちのいずれかの約１０Å内に存在する
    、表面残基、 からなる群より選択されるアミノ酸と相互作用する、方法。
52. 【請求項５２】 前記化合物が閉鎖コンフォメーションからレセプター結合
    コンフォメーションへ変換するＩｇＥ抗体の能力を阻害する、請求項４５に記載
    の方法。
53. 【請求項５３】 前記閉鎖コンフォメーションが、Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４領
    域を含み、該Ｃε３ドメイン間の距離が約１０Å〜約２５Åの範囲にある、請求
    項５２に記載の方法。
54. 【請求項５４】 前記レセプター結合コンフォメーションが、Ｆｃ−Ｃε３
    ／Ｃε４領域を含み、該Ｃε３ドメイン間の距離が約２０Å〜約３０Åである、
    請求項５２に記載の方法。
55. 【請求項５５】 請求項４５に記載の方法であって、該方法が、以下： （ａ）前記モデル、または前記Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４領域のＦｃεＲＩα結合
    ドメインのモデルを、コンピュータスクリーン上に生成する工程； （ｂ）試験される化合物の空間的構造を生成する工程；および （ｃ）該化合物が該ＦｃεＲＩα結合ドメインと相互作用する否かを決定する
    試験を行う工程であって、このような相互作用によって該化合物が前記ＦｃεＲ
    Ｉαに対するＩｇＥ抗体の結合を阻害し得ることを示す、工程、 を包含する、方法。
56. 【請求項５６】 請求項４５の方法であって、ここで、前記方法が、該化合
    物を同定するために３次元モデルを使用する工程をさらに包含し、該３次元モデ
    ルが、ヒト高親和性ＦｃεＲＩαタンパク質の細胞外ドメインの３次元モデル、
    およびヒト高親和性ＦｃεＲＩαタンパク質の細胞外ドメインとヒトＩｇＥ抗体
    のＦｃ−Ｃε３／Ｃε４領域との複合体の３次元モデルからなる群より選択され
    る、方法。
57. 【請求項５７】 前記阻害性化合物が、前記モデルで予測された空間の少な
    くとも１つの領域に対応する構造を有する、請求項４５に記載の方法。
58. 【請求項５８】 前記阻害性化合物が、四環式炭化水素ペルヒドロシクロペ
    ンタノフェナントレンである、請求項４５に記載の方法。
59. 【請求項５９】 請求項４５に記載の方法であって、ここで、該阻害性化合
    物が、以下の構造式： 【化１】 を含む、方法。
60. 【請求項６０】 請求項４５に記載の方法であって、ここで、３−［３−（
    コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン−スルホナート（ＣＨ
    ＡＰＳ）をリードとして使用して、該阻害性化合物を同定する、方法。
61. 【請求項６１】 請求項４５に記載の方法であって、ここで、 前記阻害性化合物が、２つのＣε３／Ｃε４ドメインと相互作用する二価化合
    物、およびドメイン間の溝に結合するに十分に大きい化合物からなる群より選択
    される、方法。
62. 【請求項６２】 請求項４５に記載の方法に従って同定された阻害性化合物
    。
63. 【請求項６３】 請求項６２に記載の阻害性化合物を含む治療組成物。
64. 【請求項６４】 アレルギーから動物を防御する方法であって、該方法は、
    請求項６２の阻害性化合物を該動物に投与する工程を包含する、方法。
65. 【請求項６５】 ＦｃεＲＩαタンパク質のＩｇＥ結合ドメインに結合する
    ムテインであって、ここで、該ムテインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むＦ
    ｃ−Ｃε３／Ｃε４タンパタンパク質に比較して改善された機能を有し、ここで
    、該改善された機能が、以下： 配列番号２のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＥ Ｆｃ領域の安定性に比較して増
    大した安定性、 配列番号２のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＥ Ｆｃ領域のＦｃεＲＩαの親和
    性と比較してＦｃεＲＩαタンパク質に対する増大した親和性、 配列番号２のアミノ酸配列を含むＩｇＥ領域のヒトＦｃεＲＩαに対する親和
    性と比較して改変された基質親和性、および 配列番号２のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＥ Ｆｃ領域の可溶性に比較して増
    大した可溶性、 からなる群より選択され、ここで、 該ムテインが、以下： （ａ）表１、表４、および表５からなる群より選択された表に特定化される原
    子座標を実質的に表す３次元モデルを分析して、該モデルにより表される該Ｆｃ
    −Ｃε３／Ｃε４タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を同定する工程であっ
    て、該Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４タンパク質は、特定のアミノ酸により置換された場
    合に該Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４タンパク質の改善された機能をもたらす、工程；お
    よび （ｂ）該同定されたアミノ酸を置換して、該改善された機能を有するムテイン
    を生成する工程、 を包含する方法によって生成される、ムテイン。
66. 【請求項６６】 Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４領域を含む抗体の機能を改善するた
    めの方法であって、該改善された機能が、増大した安定性、増大したＦｃεＲＩ
    αタンパク質のＩｇＥ結合ドメインに対する親和性、改変された基質特異性、お
    よび増大した可溶性、からなる群より選択され、 該方法が、以下： （ａ）表１、表４、および表５からなる群より選択された表に特定化される原
    子座標を実質的に表現する３次元モデルを分析して、少なくとも１つのＦｃ−Ｃ
    ε３／Ｃε４領域のアミノ酸を同定する工程であって、該Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４
    領域は、特定のアミノ酸により置換された場合に該Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４領域の
    改善された機能をもたらすモデルにより表現される、工程；および （ｂ）該同定されたアミノ酸を置換して、該改善された機能の少なくとも１つ
    を有するムテインを生成する工程、 を包含する、方法。
67. 【請求項６７】 組成物であって、該組成物が、ＦｃεＲＩα結合ドメイン
    、抗体Ｆｃ領域の２つのＣε３／Ｃε４ドメインの間にあるドメイン間の溝、抗
    体のＦｃ領域のＣε３ドメインとＣε４ドメインとの間にあるヒンジ、およびＣ
    ε３ドメインまたはＣε４ドメインの領域からなる群より選択され、ここで、該
    Ｃε３ドメインまたはＣε４ドメインの領域の相対的な位置が、閉鎖Ｆｃ−Ｃε
    ３／Ｃε４コンフォメーションとレセプター結合Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４コンフォ
    メーションとの間で１Åを超えて変化する、組成物。
68. 【請求項６８】 請求項６７に記載の組成物であって、ここで、 該組成物は、以下： Ｃε２とＣε３との間のリンカー、Ｃε３のＢＣループ、Ｃε３のＤＥループ、
    およびＣε３のＦＧループ、ドメイン間の溝を規定するループまたはストランド
    、Ｃε３のＡＢヘリックスおよび、該Ｃε３のＡＢヘリックスの上部に存在する
    領域からなる群より選択される、組成物。
69. 【請求項６９】 請求項６７のタンパク質をコードする単離された核酸分子
    。