CN113874423A - 用于使用改进的聚合物形成珠粒的组合物、方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于制备水凝胶的系统和方法，所述水凝胶包括细胞、细胞核或一种或多种源自细胞或细胞核的组分。一种用于制备水凝胶的方法可以包括：提供细胞或细胞核、第一聚合物，其中所述第一聚合物包括多个第一交联前体，所述多个第一交联前体中的每个第一交联前体包括叠氮基团；提供第二聚合物，其中所述第二聚合物包括多个第二交联前体，所述多个第二交联前体中的每个第二交联前体包括炔烃基团；以及通过所述第一交联前体的第一部分与所述第二交联前体的第二部分之间的反应使所述第一聚合物和所述第二聚合物交联，由此提供所述包括所述细胞或细胞核的水凝胶。

Description

用于使用改进的聚合物形成珠粒的组合物、方法和系统
技术领域
本公开涉及用于制备水凝胶的方法、组合物和系统，所述水凝胶包括细胞、细胞核或一种或多种源自细胞或细胞核的组分。
背景技术
可以出于如鉴定样品内的部分样品的类型等各种目的处理样品。样品可以是生物样品。可以出于如检测疾病(例如，癌症)或鉴定特定物种等各种目的处理生物样品。有如聚合酶链反应(PCR)和测序等各种用于处理样品的方法。
生物样品可以在各种反应环境内进行处理，如分区。分区可以是孔或液滴。可以采用液滴或孔以使得生物样品能够被分离和单独处理的方式来处理生物样品。例如，此类液滴可以与其它液滴流体隔离，从而能够准确控制液滴中的相应环境。
分区中的生物样品可以经受如化学过程或物理过程等各种过程。分区中的样品可以经受加热或冷却或化学反应，如产生可定性或可定量处理的物种。
发明内容
水凝胶基质(包含珠粒)可以创建半开放系统，所述半开放系统能够将大分子包封在基质边界内，同时允许小分子渗透基质。大分子可以是生物样品，包含例如细胞、大蛋白质或长核酸。小分子可以是例如试剂、较小的蛋白质或较短的核酸。例如，酶可以小到足以渗透基质。水凝胶基质还可以包括不稳定键，使得在水凝胶基质降解之后，包封的大分子可以从基质的范围内释放到周围环境中。本文提供了用于产生水凝胶基质的方法、系统和组合物，所述水凝胶基质能够包封大分子并且允许小分子渗透基质。
在一些方面，本公开提供了一种凝胶，其包括：(a)细胞、细胞核或一种或多种源自细胞的成分；(b)两种或更多种聚合物；以及(c)多个接头，所述多个接头中的每个接头包括1,2,3-三唑部分，其中所述接头交联所述两种或更多种聚合物。在一些实施例中，所述两种或更多种聚合物的中的每种聚合物独立地包括选自由以下组成的组的至少一个：聚烯烃、烯烃共聚物、丙烯酸、乙烯基聚合物、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酰亚胺、甲醛树脂、聚氨酯、醚聚合物、纤维素、热塑性弹性体和热塑性聚氨酯。在一些实施例中，所述两种或更多种聚合物中的每种聚合物独立地是聚丙烯酰胺。在一些实施例中，所述多个接头中的每个接头独立地连接到所述两种或更多种聚合物的酰胺。在一些实施例中，所述多个接头中的每个接头包括不稳定键。在一些实施例中，所述不稳定键是化学不稳定键、热不稳定键或光不稳定键。在一些实施例中，所述不稳定键包括二硫键。在一些实施例中，所述1,2,3-三唑部分通过在足以形成所述1,2,3-三唑部分的条件下用炔烃基团处理叠氮基团的方法形成。在一些实施例中，凝胶进一步包括包封在所述凝胶内的至少一种试剂。
在一些实施例中，所述凝胶是水凝胶。在一些实施例中，所述凝胶进一步包括带电物种。在一些实施例中，所述带电物种带正电。在一些实施例中，所述带电物种包括三甲基铵。在一些实施例中，所述带电物种带负电。在一些实施例中，所述带电物种包括磷酸盐。在一些实施例中，所述带电物种连接到所述聚合物或凝胶网络。在一些实施例中，所述两种或更多种聚合物中的至少一种聚合物是带电聚合物。在一些实施例中，所述带电聚合物是带正电的聚合物。在一些实施例中，所述带正电的聚合物包括壳聚糖或聚乙烯亚胺。在一些实施例中，所述带电聚合物是带负电的聚合物。在一些实施例中，所述带负电的聚合物包括藻酸盐。在一些实施例中，所述两种或更多种聚合物中的至少一种聚合物包括带电部分，并且其中所述带电部分通过接头连接到所述两种或更多种聚合物中的所述至少一种聚合物。在一些实施例中，所述接头包括能够从所述两种或更多种聚合物中的所述至少一种聚合物上切割所述带电部分的不稳定键。在一些实施例中，所述不稳定键是化学不稳定键、热不稳定键或光不稳定键。
在一些方面，本公开提供了一种形成包括细胞或细胞核的凝胶的方法，所述方法包括：(a)提供(i)第一聚合物，其中所述第一聚合物包括多个第一交联前体，所述多个第一交联前体中的每个第一交联前体包括叠氮基团；(ii)第二聚合物，其中所述第二聚合物包括多个第二交联前体，所述多个第二交联前体中的每个第二交联前体包括炔烃基团；以及(iii)所述细胞或所述细胞核；(b)通过所述第一交联前体的第一部分与所述第二交联前体的第二部分之间的反应使所述第一聚合物和所述第二聚合物交联，从而形成包括所述细胞或细胞核的所述凝胶。在一些实施例中，所述第一聚合物和所述第二聚合物独立地包括选自由以下组成的组的至少一个：聚烯烃、烯烃共聚物、丙烯酸、乙烯基聚合物、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酰亚胺、甲醛树脂、聚氨酯、醚聚合物、纤维素、热塑性弹性体和热塑性聚氨酯。在一些实施例中，所述第一聚合物或所述第二聚合物进一步包括不稳定键。在一些实施例中，所述第一聚合物和所述第二聚合物进一步包括不稳定键。在一些实施例中，所述不稳定键是二硫键。在一些实施例中，至少约80％的所述不稳定键在(b)中的所述反应期间保持完整。在一些实施例中，所述反应在所述叠氮化物和所述炔烃之间形成1,2,3-三唑。在一些实施例中，所述方法进一步包括在(b)之前，提供被配置成催化(b)中的所述反应的催化剂。在一些实施例中，所述方法进一步包括在(b)之后，从所述凝胶中去除所述催化剂和/或其衍生物。在一些实施例中，所述凝胶由多种所述第一聚合物和多种所述第二聚合物形成。在一些实施例中，所述凝胶是水凝胶。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在(b)之后，裂解所述细胞或所述细胞核以将一种或多种细胞或细胞核成分释放到所述凝胶中。在一些实施例中，所述一种或多种细胞或细胞核成分包括核酸。在一些实施例中，所述核酸包括核糖核酸。在一些实施例中，所述核糖核酸是信使核糖核酸(mRNA)。在一些实施例中，所述核糖核酸是微核糖核酸(miRNA)。在一些实施例中，所述核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)。在一些实施例中，所述DNA是基因组DNA。在一些实施例中，所述一种或多种细胞或细胞核成分包括染色质。在一些实施例中，所述一种或多种细胞或细胞核成分包括蛋白质。在一些实施例中，所述一种或多种细胞或细胞核成分能够保留在所述凝胶内。在一些实施例中，所述一种或多种细胞或细胞核成分能够在所述凝胶内保留至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少12或至少24小时。在一些实施例中，所述方法进一步包括使所述DNA变性。在一些实施例中，所述变性包括使所述凝胶与化学试剂接触。在一些实施例中，所述化学试剂是碱性试剂。在一些实施例中，所述方法进一步包括在(b)之后透化所述细胞或所述细胞核。在一些实施例中，所述方法进一步包括在(b)之前，将所述第一聚合物、所述第二聚合物和所述细胞或细胞核共同分离成分区。在一些实施例中，所述分区是孔。在一些实施例中，所述分区是乳液中的水性液滴。在一些实施例中，所述分区包括被配置成催化(b)中的所述反应的试剂。在一些实施例中，所述乳液包括油相，所述油相包括试剂，所述试剂包括铜(II)部分，并且其中所述水性液滴包括能够将所述铜(II)部分还原成铜(I)部分的还原剂，其中所述铜(I)部分催化(b)中的所述反应。在一些实施例中，所述乳液包括促进所述铜(II)部分从所述油相转运到所述水性液滴中的试剂。在一些实施例中，所述方法进一步包括在(b)之前，裂解或透化所述分区中的所述细胞或细胞核。
在一些方面，本公开提供了一种用于生成细胞珠粒的方法，所述方法包括：(a)生成包括来自多个细胞的细胞或来自多个细胞核的细胞核、聚合或凝胶前体和带电物种的分区；以及(b)使所述分区经受足以使所述聚合或凝胶前体反应的条件以生成聚合物或凝胶网络，所述聚合物或凝胶网络包括(i)所述细胞或其衍生物，和(ii)所述带电物种，由此提供所述细胞珠粒。在一些实施例中，所述分区在多个分区之中。在一些实施例中，所述方法进一步包括从所述多个分区生成多个细胞珠粒。在一些实施例中，所述带电物种带正电。在一些实施例中，所述带电物种包括三甲基铵。在一些实施例中，所述带电物种是(3-丙烯酰胺基丙基)三甲基铵。在一些实施例中，所述带电物种带负电。在一些实施例中，所述带电物种包括磷酸盐。在一些实施例中，所述带电物种连接到所述聚合物或凝胶网络。在一些实施例中，所述细胞珠粒包括多种化学交联剂。在一些实施例中，所述带电物种连接到所述化学交联剂的化学交联剂。在一些实施例中，所述方法进一步包括在(b)之前，使所述细胞珠粒经受足以裂解所述细胞或细胞核的条件以将一种或多种细胞或细胞核成分释放到所述细胞珠粒中。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在(b)之后，使所述细胞珠粒经受足以裂解所述细胞或细胞核的条件以将一种或多种细胞或细胞核成分释放到所述细胞珠粒中。在一些实施例中，所述一种或多种细胞或细胞核成分包括核酸。在一些实施例中，所述核酸包括核糖核酸。在一些实施例中，所述核糖核酸是信使核糖核酸。在一些实施例中，所述核酸包括脱氧核糖核酸。在一些实施例中，所述一种或多种细胞或细胞核成分包括蛋白质。在一些实施例中，所述一种或多种细胞或细胞核成分能够保留在所述细胞珠粒内。在一些实施例中，所述一种或多种细胞或细胞核成分能够在所述细胞珠粒内保留至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少12或至少24小时。
在一些方面，本公开提供了一种用于生成细胞珠粒的方法，所述方法包括：(a)生成包括(i)来自多个细胞的细胞或来自多个细胞核的细胞核和(ii)带电聚合或凝胶前体的分区；以及(b)使所述分区经受足以使所述聚合或凝胶前体反应的条件以生成带电聚合物或凝胶网络，所述带电聚合物或凝胶网络包括所述细胞或所述细胞核或其衍生物，由此提供所述细胞珠粒。在一些实施例中，所述带电聚合或凝胶前体包括正电荷。在一些实施例中，所述带电聚合或凝胶前体包括壳聚糖。在一些实施例中，所述带电聚合或凝胶前体包括聚乙烯亚胺。在一些实施例中，所述带电聚合或凝胶前体包括负电荷。在一些实施例中，所述带电聚合或凝胶前体包括藻酸盐。在一些实施例中，所述方法进一步包括在(b)之前，使所述细胞珠粒经受足以裂解所述细胞或细胞核的条件以将一种或多种细胞或细胞核成分释放到所述细胞珠粒中。在一些实施例中，所述方法进一步包括在(b)之后，使所述细胞珠粒经受足以裂解所述或细胞核的条件以将一种或多种细胞或细胞核成分释放到所述细胞珠粒中。在一些实施例中，所述一种或多种细胞或细胞核成分核酸。在一些实施例中，所述核酸包括核糖核酸。在一些实施例中，所述核糖核酸是信使核糖核酸。在一些实施例中，所述核酸包括脱氧核糖核酸。在一些实施例中，所述一种或多种细胞或细胞核成分包括蛋白质。在一些实施例中，所述一种或多种细胞或细胞核成分能够保留在所述细胞珠粒内。在一些实施例中，所述一种或多种细胞或细胞核成分能够在所述细胞珠粒内保留至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少12或至少24小时。
在一些方面，本公开提供了一种用于分析来自细胞的一种或多种组分的组合物，所述组合物包括细胞珠粒，所述细胞珠粒包括聚合或交联聚合物网络，其包括细胞、细胞核或一种或多种源自细胞或细胞核的成分，其中所述聚合或交联的聚合物网络带电。在一些实施例中，所述聚合物网络带正电。在一些实施例中，所述聚合物网络包括聚乙烯亚胺。在一些实施例中，所述聚合物网络包括壳聚糖。在一些实施例中，所述聚合物网络带负电。在一些实施例中，所述聚合物网络包括藻酸盐。
在一些方面，本公开提供了一种用于分析来自细胞的一种或多种组分的组合物，所述组合物包括细胞珠粒，所述细胞珠粒包括聚合或交联聚合物网络，其包括(i)细胞、细胞核或一种或多种源自细胞或细胞核的成分；和(ii)带电物种。在一些实施例中，所述聚合物网络包括化学交联剂。在一些实施例中，所述细胞珠粒包括来自所述细胞的与所述化学交联剂连接的组分。在一些实施例中，所述带电物种连接到所述聚合物网络。在一些实施例中，所述带电物种共价连接到所述聚合物网络。在一些实施例中，所述带电物种连接到来自所述细胞的组分。在一些实施例中，所述带电物种非共价连接到来自所述细胞的所述组分。在一些实施例中，所述带电物种带正电。在一些实施例中，所述带电物种包括三甲基铵。在一些实施例中，所述带电物种是(2-氨基乙基)三甲基铵。在一些实施例中，所述带电物种是(3-丙烯酰胺基丙基)三甲基铵。在一些实施例中，所述带电物种带负电。在一些实施例中，所述带电物种包括磷酸盐。
对于本领域技术人员而言，通过以下具体实施方式本公开的另外的方面和优点将变得显而易见，其中仅示出和描述了本公开的说明性实施例。如将认识到的，本公开能够具有其它不同的实施例，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，而所有这些都不脱离本公开。因此，附图和说明书将在本质上被视为是说明性的而非限制性的。
本说明书中所提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用结合在此，其程度就如同明确且单独地指明了每一个单独的出版物、专利或专利申请通过引用结合。在通过引用的方式并入的公开和专利或专利申请与本说明书中所包含的公开内容相抵触的情况下，本说明书意欲替代和/或优先于任何这类矛盾材料。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体地阐述。通过参考对说明性实施例进行阐述的以下详细说明，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在所述实施例中利用了本发明的原理，并且在所述附图(在本文也称为“图(Figure/FIG.)”)中：
图1示出了用于分离单个生物颗粒的微流体通道结构的实例。
图2示出了用于将携带条形码的珠粒递送到液滴的微流体通道结构的实例。
图3示出了用于共同分离生物颗粒和试剂的微流体通道结构的实例。
图4示出了用于将珠粒受控分离成离散液滴的微流体通道结构的实例。
图5示出了用于增加液滴生成通量的微流体通道结构的实例。
图6示出了用于增加液滴生成通量的微流体通道结构的另一个实例。
图7示出了用于共同分离生物颗粒和试剂以形成被配置成形成水凝胶的液滴的微流体通道结构的实例。
图8示出了示例水凝胶组合物和用于在液滴中形成水凝胶的步骤。
图9示出了用于生成点击化学聚合物网络的示例方法。
图10展示了用于生成本公开的细胞珠粒的示例方法。
图11A-B示出了示例带电水凝胶聚合物网络。图11A示出了包括连接到聚合物网络的带正电物种的细胞珠粒的示意图。图11B示出了包括连接到聚合物网络的带负电物种的细胞珠粒的示意图。
图12A-B示出了另外的示例带电水凝胶聚合物网络。图12A示出了包括连接到含二硫化物的化学交联剂的带正电物种的细胞珠粒的示意图。图12B示出了包括连接到含二硫化物的化学交联剂的带负电物种的细胞珠粒的示意图。
图13展示了用于生成包括来自细胞的成分的液滴的示例过程。
图14展示了用于生成包括来自细胞的成分的液滴的另一个示例过程。
图15展示了用于生成包括互补脱氧核糖核酸的细胞珠粒的示例过程。
图16A示意性地展示了用于生成包括条形码化珠粒和细胞珠粒的液滴的示例方法。图16B展示了用于生成细胞珠粒的示例微流体架构。图16C展示了用于生成包括条形码化珠粒和细胞珠粒的液滴的示例微流体架构。图16D展示了使用图16C中所示出的架构生成包括条形码化珠粒和细胞珠粒的液滴的示例液滴生成过程。
图17示出了用于生成细胞珠粒和包括细胞珠粒和凝胶珠粒的分区的示例过程。
图18示出了被编程或以其它方式被配置成实施本文所提供的方法和系统的示例计算机系统。
图19示出了包封细胞的细胞珠粒的代表性显微镜图像。
图20示出了从细胞珠粒中包括的细胞获得的DNA的实验测序结果。
图21A图示了用于生成细胞珠粒的示例工作流程。图21B示出了在没有细胞定心的情况下生成的细胞珠粒的成像结果。图21C示出了在有细胞定心的情况下生成的细胞珠粒的成像结果。
图22示出了来自实例4的细胞定心实验的结果图。
图23示出了来自实例5的细胞珠粒生成实验的结果图。
图24示出了来自实例6的细胞珠粒生成实验的结果图。
图25A示出了来自实例7中描述的包括使用不同抗坏血酸钠浓度的细胞珠粒生成实验的结果。图25B示出了来自实例7中描述的包括使用不同胶凝时间的细胞珠粒生成实验的结果。图25C示出了来自实例7中描述的包括使用不同THPTA浓度的细胞珠粒生成实验的结果。图25D示出了来自实例7中描述的包括使用不同抗坏血酸钠浓度的细胞珠粒生成实验的结果。
图26A示出了来自实例7中描述的包括使用不同CuAcAc浓度的细胞珠粒生成实验的结果。图26B示出了来自实例7中描述的包括使用不同胶凝时间的细胞珠粒生成实验的结果。
图27A示出了来自实例8中描述的包括使用不同THPTA浓度的细胞珠粒生成实验的结果。图27B示出了来自实例8中描述的包括使用不同抗坏血酸钠浓度的细胞珠粒生成实验的结果。图27C示出了来自实例8中描述的包括使用不同抗坏血酸钠浓度的细胞珠粒生成实验的结果。图27D示出了来自实例8中描述的包括使用不同抗坏血酸钠浓度的细胞珠粒生成实验的结果。
图28A示出了来自实例8中描述的包括使用不同THPTA浓度的细胞珠粒生成实验的结果。图28B示出了来自实例8中描述的包括使用不同胶凝时间的细胞珠粒生成实验的结果。
图29示出了使用叠氮化物-吡啶甲基改性的接头的示例性低铜浓度点击化学交联反应。
图30示出了使用叠氮化物改性和DBCO改性的接头的示例性无铜点击化学交联反应。
图31A示出了如实例11中所描述，使用叠氮化物-吡啶甲基改性的接头的低铜浓度点击化学交联的结果。
图31B示出了如实例11中所描述，使用叠氮化物-吡啶甲基改性的接头的低铜浓度点击化学交联的结果。
图32示出了与不稳定的氨基甲酸酯键形成交联的示例性点击化学交联反应，以及随后用DETA和热切割氨基甲酸酯。
图33示出了如实例12中所描述的用DETA和热降解氨基甲酸酯交联的结果。
图34A示出了可以通过点击化学形成蛋白酶可切割交联的示例性炔丙基-多肽接头。
图34B示出了通过点击化学形成示例性蛋白酶可裂解多肽交联和随后的选择性蛋白酶催化的交联降解。
图35示出了通过点击化学形成交联聚合物的示例性反应，其中所述聚合物中的一种聚合物用通过点击化学连接的poly-T寡核苷酸捕获试剂进行了改性。
具体实施方式
尽管本文中已经示出并且描述了本发明的各个实施例，但是对于本领域的技术人员而言将显而易见的是，这些实施例仅作为示例提供。在不背离本发明的情况下，本领域的技术人员可以想到各种变化、改变和取代。应当理解，可以采用本文所描述的本发明的实施例的各种替代方案。
在值被描述为范围的情况下，应当理解，此类公开包含此类范围内所有可能的子范围的公开，以及落入此类范围内的特定数值，无论是特定数值或特定子范围是明确规定的。
如本文所使用的术语“条形码”通常指传达或能够传达关于分析物的信息的标签或标识符。条形码可以是分析物的一部分。条形码可以独立于分析物。除了分析物的内源性特征(例如，分析物或末端序列的大小)之外，条形码可以是连接到分析物(例如，核酸分子)的标签或标签的组合。条形码可以是唯一的。条形码可以有多种不同的格式。例如，条形码可以包含：多核苷酸条形码；随机核酸和/或氨基酸序列；和合成的核酸和/或氨基酸序列。条形码可以以可逆或不可逆的方式连接到分析物。可以在样品测序之前、期间和/或之后将条形码添加到例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)样品的片段。条形码可以实时鉴定和/或量化单个测序读段。
如本文所使用的术语“实时”可以指小于约1秒、十分之一秒、百分之一秒、毫秒或更少的响应时间。响应时间可能大于1秒。在一些情况下，实时可以指同时或基本上同时处理、检测或鉴定。
如本文所使用的，术语“受试者”通常是指动物，如哺乳动物(例如，人)或禽类(例如，鸟类)或如植物等其它生物体。受试者可以是脊椎动物、哺乳动物、啮齿动物(例如，小鼠)、灵长类动物、猿猴或人。动物可以包含但不限于农场动物、竞技动物和宠物。受试者可以是健康或无症状的个体、患有或怀疑患有疾病(例如，癌症)或疾病倾向的个体，和/或需要疗法或怀疑需要疗法的个体。受试者可以是患者。
如本文所使用的，术语“基因组”通常指来自受试者的基因组信息，所述基因组信息可以是例如受试者遗传信息的至少一部分或全部。基因组可以用DNA或RNA编码。基因组可以包括(例如，对蛋白质进行编码的)编码区域以及非编码区域。基因组可以包含生物体中所有染色体的序列。例如，人基因组通常共有46条染色体。所有这些的序列可以构成人基因组。
术语“衔接子”、“适配器”和“标签”可以同义使用。衔接子或标签可以通过任何方法偶联到待“标记”的多核苷酸序列，包含连接、杂交或其它方法。
如本文所使用的，术语“测序”通常是指用于确定一种或多种多核苷酸中核苷酸碱基序列的方法和技术。多核苷酸可以是例如核酸分子，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，其包含其变体或衍生物(例如，单链DNA)。测序可以通过目前可用的各种系统进行，如但不限于
Figure BDA0003366638640000091
太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)
Figure BDA0003366638640000092
OXFORD
Figure BDA0003366638640000093
或生命科技公司(Life Technologies)(ION
Figure BDA0003366638640000094
)的测序系统。可替代地或另外，可以使用核酸扩增、聚合酶链反应(PCR)(例如，数字PCR、定量PCR或实时PCR)或等温扩增来进行测序。此类系统可以提供对应于受试者(例如，人)的遗传信息的多个原始遗传数据，如由系统从受试者提供的样品生成的。在一些实例中，此类系统提供测序读段(本文中也称为“读段”)。读段可以包含对应于已测序的核酸分子序列的一串核酸碱基。在一些情况下，本文提供的系统和方法可以与蛋白质组学信息一起使用。
如本文所使用的，术语“珠粒”通常是指颗粒。珠粒可以是固体或半固体颗粒。珠粒可以是凝胶珠粒。凝胶珠粒可以包含聚合物基质(例如，通过聚合或交联形成的基质)。珠粒可以由聚合材料形成。珠粒可以是磁性的或非磁性的。珠粒可以是刚性的。珠粒可以是柔性的和/或可压缩的。珠粒可以是可破坏的或可溶解的。
如本文所使用的，术语“样品”通常是指受试者的生物样品。生物样品可以包括任何数量的大分子，例如细胞大分子。生物样品可以是核酸样品或蛋白质样品。生物样品也可以是碳水化合物样品或脂质样品。生物样品可以源自另一个样品。样品可以是如活组织检查、核心活组织检查、针抽吸物或细针抽吸物等组织样品。样品可以是如血液样品、尿液样品或唾液样品等流体样品。样品可以是皮肤样品。样品可以是脸颊拭子。样品可以是血浆或血清样品。样品可以是无细胞或无细胞样品。无细胞样品可以包含胞外多核苷酸。胞外多核苷酸可以从身体样品中分离，所述身体样品可以选自由以下组成的组：血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜排泄物、痰、粪便和眼泪。
如本文所使用的，术语“生物颗粒”通常是指源自生物样品的离散生物系统。生物颗粒可以是病毒。生物颗粒可以是细胞或细胞的衍生物。生物颗粒可以是细胞器。生物颗粒可以是来自细胞群的稀有细胞。生物颗粒可以是任何类型的细胞，包含但不限于原核细胞、真核细胞、细菌、真菌、植物、哺乳动物或其它动物细胞类型、支原体、正常组织细胞、肿瘤细胞或任何其它细胞类型，无论是源自单细胞或多细胞生物。生物颗粒可以是或可以包含基质(例如，凝胶或聚合物基质)，所述基质包括细胞或来自细胞的一种或多种成分(例如，细胞珠粒)，如来自细胞的DNA、RNA、细胞器、蛋白质或其任何组合。生物颗粒可以从受试者的组织中获得。生物颗粒可以是硬化细胞。此类硬化细胞可以包含或不包含细胞壁或细胞膜。生物颗粒可以包含细胞的一种或多种成分，但可以不包含细胞的其它成分。此类成分的实例是细胞核或细胞器。细胞可以是活细胞。活细胞可以能够被培养，例如，当封闭在凝胶或聚合物基质中时被培养或当包括凝胶或聚合物基质时被培养。
如本文所使用的，术语“大分子成分”通常是指包含在生物颗粒内的大分子。大分子成分可以包括核酸。大分子成分可以包括DNA。大分子成分可以包括RNA。RNA可以是信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)或转移RNA(tRNA)。RNA可以是转录物。大分子成分可以包括蛋白质。大分子成分可以包括肽。大分子成分可以包括多肽。
如本文所使用的，术语“分子标签”通常是指能够与大分子成分结合的分子。分子标签可以以高亲和力与大分子成分结合。分子标签可以以高度特异性与大分子成分结合。分子标签可以包括核苷酸序列。分子标签可以包括核酸序列。核酸序列可以是分子标签的至少一部分或全部。分子标签可以是核酸分子或可以是核酸分子的一部分。分子标签可以是寡核苷酸或多肽。分子标签可以包括DNA适体。分子标签可以是或包括引物。分子标签可以是或包括蛋白质。分子标签可以包括多肽。分子标签可以是条形码。
本文提供用于通过乳液胶凝形成水凝胶基质(包含珠粒)的组合物和方法。另外，水凝胶基质可以包封如生物样品等大分子。生物样品可以是细胞、大蛋白质或长核酸。水凝胶基质可以包括细胞或来自细胞的一种或多种组分(例如，细胞珠粒)。水凝胶基质可以允许较小的分子渗透基质。较小的分子可以是试剂、较小的蛋白质或较短的核酸。较小的蛋白质可以是酶。水凝胶可以是可降解的。
一方面，本公开提供了一种可降解水凝胶的组合物，所述组合物包括两种或更多种聚合物和配置成形成交联的多个接头。所述多个接头中的每个接头可以包括不稳定键和1,2,3-三唑部分。所述两种或更多种聚合物可以通过此类接头交联。
一方面，本公开提供了一种形成水凝胶的方法。所述方法可以包括(a)提供第一聚合物，其中所述第一聚合物包括多个第一交联前体；(b)提供第二聚合物，其中所述第二聚合物包括多个第二交联前体；以及(c)通过所述第一交联前体的第一部分与所述第二交联前体的第二部分之间的反应使所述第一聚合物和所述第二聚合物交联，从而形成所述水凝胶。
一方面，本文所描述的系统和方法提供将单个生物颗粒的大分子成分内容物区室化、沉积或分离成离散的区室或分区(本文可互换地称为分区)，其中每个分区保持其自己的内容物与其它分区的内容物分离。分区可以是乳液中的液滴。分区可以包括一个或多个其它分区。
本公开的分区可以包括生物颗粒和/或其大分子成分。分区可以包括一个或多个凝胶珠粒。分区可以包括一个或多个细胞珠粒。分区可以包含单个凝胶珠粒、单个细胞珠粒或单个细胞珠粒和单个凝胶珠粒两者。细胞珠粒可以是生物颗粒和/或其一种或多种大分子成分，其包裹在凝胶或聚合物基质内部，如通过含有生物颗粒和能够聚合或胶凝的前体的液滴的聚合。如条形码等唯一标识符可以在液滴生成之前、之后或同时被注射到液滴中，如通过微胶囊(例如，珠粒)，如下文进一步描述的。微流体通道网络(例如，在芯片上)可以用于生成如本文所描述的分区。还可以在单个生物颗粒的分离中采用替代机制，包含多孔膜，细胞的水性混合物通过多孔膜被挤出到非水性流体中。
分区可以在流体流内流动。分区可以包括例如具有围绕内部流体中心或核心的外部屏障的微囊泡。在一些情况下，分区可以包括能够将材料夹带和/或保留在其基质内的多孔基质。分区可以包括非水连续相(例如，油相)内的水性流体液滴。分区可以包括第二相内第一相的液滴，其中第一相和第二相是不混溶的。例如，在美国专利申请公开号2014/0155295中描述了多种不同的容器，出于所有目的，所述美国专利申请通过引用整体并入本文。例如，美国专利申请公开号2010/0105112中描述了用于在非水或油连续相中产生稳定液滴的乳液系统，出于所有目的，所述美国专利申请通过引用整体并入本文。
在乳液中的液滴的情况下，在一个非限制性实例中，可以通过将水性流体中的生物颗粒的流动流引入非水性流体的流动流中来实现将单个生物颗粒分配到离散分区，使得在所述两个流的接合点处产生液滴。通过以一定浓度和/或生物颗粒流速提供水流，可以控制所得分区的占据率(例如，每个分区的生物颗粒数量)。在使用单个生物颗粒分区的情况下，可以选择不混溶流体的相对流速，使得分区平均每个分区可以含有少于一个生物颗粒，以确保那些被占据的分区主要是单个占据的。在一些情况下，多个分区之间的分区可以含有至多一种生物颗粒(例如，珠粒、细胞或细胞材料)。在一些实施例中，可以选择流体的相对流速使得大部分分区被占据，例如，仅允许小百分比的未被占据的分区。可以控制流和通道架构以确保给定数量的单个占据的分区、小于某个级别的未占据的分区和/或小于某个级别的多个占据的分区。
图1示出了用于分离单个生物颗粒的微流体通道结构100的实例。通道结构100可以包含在通道接合点110处连通的通道段102、104、106和108。在操作中，包含悬浮的生物颗粒(或细胞)114的第一水性流体112可以沿着通道段102被输送到接合点110，而与水性流体112不混溶的第二流体116从通道段104和106中的每一个通道段递送到接合点110以产生流入通道段108并从接合点110流出的第一水性流体112的离散液滴118、120。通道段108可以流体地偶联到可以存储和/或收获离散液滴的出口储器。生成的离散液滴可以包含单个生物颗粒114(如液滴118)。生成的离散液滴可以包含多于一个的单个生物颗粒114(图1中未示出)。离散液滴可以不含有生物颗粒114(如液滴120)。每个离散分区可以保持其自身内容物(例如，单个生物颗粒114)与其它分区的内容物分离。
第二流体116可以包括如氟化油等油，所述油包含用于稳定所得液滴的含氟表面活性剂，例如，抑制所得液滴118、120的后续聚结。例如，在美国专利申请公开号2010/0105112中描述了特别有用的分离流体和含氟表面活性剂的实例，出于所有目的，所述美国专利申请通过引用整体并入本文。
应当理解，本文所描述的通道段可以偶联到多种不同的流体源或接收组件中的任何一个，包含储器、管、歧管或其它系统的流体组件。应当理解，微流体通道结构100可以具有其它几何形状。例如，微流体通道结构可以具有多于一个的通道接合点。例如，微流体通道结构可以具有2个、3个、4个或5个通道段，每个通道段携带在通道接合点处会合的生物颗粒、细胞珠粒和/或凝胶珠粒。流体可以经由一个或多个流体流动单元沿着一个或多个通道或储器引导流动。流体流动单元可以包括压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。流体还可以或以其它方式通过施加的压差、离心力、电动泵、真空、毛细管或重力流等来控制。
产生的液滴可以包括液滴的两个子集：(1)占据的液滴118，所述液滴含有一个或多个生物颗粒114和(2)未占据的液滴120，所述液滴不含有任何生物颗粒114。占据的液滴118可以包括单个占据的液滴(具有一个生物颗粒)和多个占据的液滴(具有多于一个的生物颗粒)。如本文其它地方所描述的，在一些情况下，大多数占据的分区可以包含每个占据的分区不超过一个生物颗粒，并且生成的分区中的一些分区可以未被占据(任何生物颗粒的)。然而，在一些情况下，占据的分区中的一些分区可能包含多于一个的生物颗粒。在一些情况下，可以控制分离过程，使得少于约25％的占据的分区含有多于一个的生物颗粒，并且在许多情况下，少于约20％的未占据的分区具有多于一个的生物颗粒，而在一些情况下，少于约10％或甚至少于约5％的占据的分区包含每个分区多于一个的生物颗粒。
在一些情况下，可能需要最小化过多数量的空分区的创建，如以降低成本和/或提高效率。虽然这种最小化可以通过在分离接合点110处提供足够数量的生物颗粒(例如，生物颗粒114)来实现，如为了确保至少一个生物颗粒被封装在分区中，泊松分布(Poissoniandistribution)可以预期地增加包含多个生物颗粒的分区的数量。因此，在要获得单个占据的分区的情况下，最多约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或更少的生成分区可以未被占据。
在一些情况下，可以控制生物颗粒中的一种或多种生物颗粒(例如，在通道段102中)或其它流体引导到分离接合点(例如，在通道段104、106中)的流动，使得在许多情况下不超过约50％的生成分区、不超过约25％的生成分区或不超过约10％的生成分区未被占据。可以控制这些流以呈现单个占据的分区的非泊松分布，同时提供较低级别的未占据的分区。可以实现上述未占据的分区的范围，同时仍提供上文所描述的单个占据率中的任何一个。例如，在许多情况下，使用本文所描述的系统和方法可以创建占据率小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％以及在许多情况下，小于约5％，同时具有小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、小于约5％或更少的未占据的分区的所得分区。
如应当理解的，上文所描述的占据率也适用于包含生物颗粒和另外的试剂的分区，包含但不限于携带条形码化核酸分子(例如，寡核苷酸)的微胶囊(关于图2描述)。占据的分区(例如，占据的分区的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)可以包含包括条形码化核酸分子的微胶囊(例如，珠粒)和生物颗粒两者。
另一方面，除了或作为基于液滴的分离的替代，生物颗粒可以被封装在微胶囊内，所述微胶囊包括外壳、层或多孔基质，其中夹带一个或多个单独的生物颗粒或生物颗粒的小组。微胶囊可以包含其它试剂。生物颗粒的封装可以通过多种工艺进行。此类工艺将含有生物颗粒的水性流体与聚合前体材料结合，所述聚合前体材料在对聚合物前体施加特定刺激时可以能够形成凝胶或其它固体或半固体基质。此类刺激可以包含例如热刺激(加热或冷却)、光刺激(例如，通过光固化)、化学刺激(例如，通过交联、前体的聚合引发(例如，通过添加的引发剂)等和/或以上的组合。
包括生物颗粒的微胶囊的制备可以通过多种方法进行。例如，气刀液滴或气溶胶发生器可以用于将前体流体的液滴分配到胶凝溶液中以便形成包含单个生物颗粒或生物颗粒的小组的微胶囊。同样，基于膜的封装系统可以用于生成包括如本文所描述的封装的生物颗粒的微胶囊。本公开的微流体系统，如图1所示的微流体系统可以容易地用于封装如本文所描述的细胞。具体地，并且参考图1，包括(i)生物颗粒114和(ii)聚合物前体材料(未示出)的水性流体112流入通道接合点110，其中所述水性流体通过非水性流体116的流动分离成液滴118、120。在封装方法的情况下，非水性流体116还可以包含引发剂(未示出)以引起聚合物前体的聚合和/或交联以形成包含夹带的生物颗粒的微胶囊。聚合物前体/引发剂对的实例包含在美国专利申请公开号2014/0378345中描述的那些，出于所有目的，所述美国专利申请通过引用整体并入本文。
例如，在聚合物前体材料包括如线性聚丙烯酰胺、PEG或其它线性聚合材料等线性聚合物材料的情况下，活化剂可以包括交联剂或活化形成的液滴内的交联剂的化学品。同样，对于包括可聚合单体的聚合物前体，活化剂可以包括聚合引发剂。例如，在某些情况下，在聚合物前体包括丙烯酰胺单体与N,N'-双-(丙烯酰基)胱胺(BAC)共聚单体的混合物的情况下，可以在通道段104和106中的第二流体流116内提供如四乙基亚甲基二胺(TEMED)等试剂，其可以引发丙烯酰胺和BAC共聚成交联聚合物网络或水凝胶。
在第二流体流116在接合点110处与第一流体流112接触时，在液滴形成期间，TEMED可以从第二流体116扩散到包括线性聚丙烯酰胺的水性流体112中，这将活化液滴118、120内聚丙烯酰胺的交联，导致凝胶(例如，水凝胶)微胶囊的形成，作为夹带细胞的固体或半固体珠粒或颗粒114。尽管根据聚丙烯酰胺封装进行了描述，但在本文所描述的方法和组合物的上下文中也可以采用其它“可活化”封装组合物。例如，形成藻酸盐液滴，然后暴露于二价金属离子(例如，Ca2+离子)可以用作使用所描述工艺的封装工艺。同样，琼脂糖液滴也可以通过基于温度的胶凝(例如，冷却等)转化为胶囊。
在一些情况下，封装的生物颗粒可以选择性地从微胶囊中释放出来，如随着时间的推移或在施加特定刺激时，充分降解微胶囊以允许生物颗粒(例如，细胞)或其其它内容物从微胶囊中释放出来，如进入分区(例如，液滴)。例如，在上文所描述的聚丙烯酰胺聚合物的情况下，微胶囊的降解可以通过引入合适的还原剂，如DTT等来实现，以裂解交联聚合物基质的二硫键。参见例如美国专利申请公开号2014/0378345，出于所有目的，所述美国专利申请通过引用整体并入本文。
生物颗粒可以经受足以使前体聚合或胶凝的其它条件。足以使前体聚合或胶凝的条件可以包括暴露于加热、冷却、电磁辐射和/或光。足以使前体聚合或胶凝的条件可以包括足以使前体聚合或胶凝的任何条件。在聚合或胶凝之后，可以在生物颗粒周围形成聚合物或凝胶。聚合物或凝胶对于化学或生化试剂可以是扩散可渗透的。聚合物或凝胶对于生物颗粒的大分子成分可以是扩散不可渗透的。以此方式，聚合物或凝胶可以起作用以允许生物颗粒经受化学或生化操作，同时将大分子成分空间地限制在由聚合物或凝胶限定的液滴区域。聚合物或凝胶可以包含二硫化物交联聚丙烯酰胺、琼脂糖、藻酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)-二丙烯酸酯、PEG-丙烯酸酯、PEG-硫醇、PEG-叠氮化物、PEG-炔烃、其它丙烯酸酯、壳聚糖、透明质酸、胶原蛋白、纤维蛋白、明胶或弹性蛋白。聚合物或凝胶可以包括任何其它聚合物或凝胶。
聚合物或凝胶可以被官能化以结合如核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质或其它分析物等靶向分析物。聚合物或凝胶可以通过被动机制聚合或胶凝。聚合物或凝胶在碱性条件下或在升高的温度下可以是稳定的。聚合物或凝胶可以具有类似于珠粒的机械性质的机械性质。例如，聚合物或凝胶可以具有与珠粒类似的大小。聚合物或凝胶可以具有与珠粒的机械强度类似的机械强度(例如，拉伸强度)。聚合物或凝胶的密度可以低于油。聚合物或凝胶的密度可以大致类似于缓冲液的密度。聚合物或凝胶可以具有可调孔径。可以选择孔径以例如保留变性的核酸。可以选择孔径以维持对如氢氧化钠(NaOH)等外源化学品和/或如抑制剂等内源化学品的扩散渗透性。聚合物或凝胶可以是生物相容的。聚合物或凝胶可以维持或增强细胞活力。聚合物或凝胶可以是生化相容的。聚合物或凝胶可以热、化学、酶促和/或光学方式聚合和/或解聚。
聚合物可以包括用二硫键交联的聚(丙烯酰胺-共-丙烯酸)。聚合物的制备可以包括两步反应。在第一活化步骤中，聚(丙烯酰胺-共-丙烯酸)可以暴露于酰化剂以将羧酸转化为酯。例如，聚(丙烯酰胺-共-丙烯酸)可以暴露于4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMTMM)。聚丙烯酰胺-共-丙烯酸可以暴露于4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓的其它盐。在第二交联步骤中，第一步骤中形成的酯可以暴露于二硫化物交联剂。例如，酯可以暴露于胱胺(2,2'-二硫代双(乙胺))。在这两个步骤之后，生物颗粒可以被通过二硫键连接在一起的聚丙烯酰胺链包围。以此方式，生物颗粒可以被包封在凝胶或基质(例如，聚合物基质)内部或包括凝胶或基质以形成“细胞珠粒”。细胞珠粒可以含有生物颗粒(例如，细胞)或生物颗粒的大分子成分(例如，RNA、DNA、蛋白质等)。细胞珠粒可以包含单个细胞或多个细胞或单个细胞或多个细胞的衍生物。例如，细胞裂解和洗涤后，细胞裂解物中的抑制组分可以被洗掉，并且大分子成分可以结合为细胞珠粒。本文所公开的系统和方法可以适用于含有生物颗粒的细胞珠粒(和/或液滴或其它分区)和含有生物颗粒的大分子成分的细胞珠粒(和/或液滴或其它分区)两者。
封装的生物颗粒可以提供比基于液滴的分离生物颗粒更易于储存和更便携的某些潜在优势。此外，在一些情况下，可能需要在分析之前使生物颗粒温育选定的时间段，如以便表征在存在或不存在不同刺激的情况下此类生物颗粒随时间的变化。在此类情况下，封装可以允许比在乳液液滴中分离更长的温育，但是在一些情况下，液滴分离的生物颗粒还可以温育不同的时间段，例如至少10秒、至少30秒、至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少5小时或至少10小时或更长时间。生物颗粒的封装可以构成生物颗粒的分离，其它试剂共同分离到所述生物颗粒中。可替代地或另外，封装的生物颗粒可以容易地沉积到如上文所描述的其它分区(例如，液滴)中。
分区可以包括如条形码等一个或多个唯一标识符。条形码可以先前、随后或同时递送到容纳区室化或分离的生物颗粒的分区。例如，可以在液滴生成之前、之后或同时将条形码注入液滴中。条形码到特定分区的递送允许个体生物颗粒的特性稍后归属于特定分区。条形码可以例如在核酸分子(例如，寡核苷酸)上通过任何合适的机制递送到分区。条形码化核酸分子可以通过微胶囊递送到分区。在一些情况下，条形码化核酸分子可以最初与微胶囊结合，然后在施加允许核酸分子从微胶囊解离或释放的刺激时从微胶囊释放。在一些情况下，微胶囊可以包括珠粒。下文进一步详细地描述了珠粒。
图2示出了用于将携带条形码的珠粒递送到液滴的微流体通道结构200的实例。通道结构200可以包含在通道接合点210处连通的通道段201、202、204、206和208。在操作中，通道段201可以将包含多个珠粒214(例如，具有核酸分子、寡核苷酸、分子标签)的水性流体212沿着通道段201输送到接合点210中。所述多个珠粒214可以源自珠粒的悬浮液。例如，通道段201可以连接到包括珠粒214的水性悬浮液的储器。通道段202可以将包含多个生物颗粒216的水性流体212沿着通道段202输送到接合点210中。所述多个生物颗粒216可以源自生物颗粒的悬浮液。例如，通道段202可以连接到包括生物颗粒216的水性悬浮液的储器。在一些情况下，第一通道段201或第二通道段202或两个段中的水性流体212可以包含一种或多种试剂，如下文进一步描述的。与水性流体212(例如，油)不混溶的第二流体218可以从通道段204和206中的每一个通道段递送到接合点210。在来自通道段201和202中的每一个通道段的水性流体212和来自通道段204和206中的每一个通道段的第二流体218在通道接合点210处会合时，水性流体212可以被分离为第二流体218中的离散液滴220，并且沿着通道段208从接合点210流出。通道段208可以将离散液滴递送到流体偶联到通道段208的出口储器，在所述出口储器可以收获离散液滴。
作为替代，通道段201和202可以在接合点210上游的另一个接合点处相遇。在此类接合点处，珠粒和生物颗粒可以形成混合物，所述混合物沿着另一个通道被引导至接合点210以产生液滴220。所述混合物可以以交替的方式提供珠粒和生物颗粒，使得例如液滴包括单个珠粒和单个生物颗粒。
珠粒、生物颗粒和液滴可以以基本规则的流动分布(例如，以规则的流速)沿着通道流动。此类规则的流动分布可以允许液滴包含单个珠粒和单个生物颗粒。此类规则的流动分布可以允许液滴的占据率(例如，具有珠粒和生物颗粒的液滴)大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。例如，在美国专利公开号2015/0292988中提供了此类规则的流动分布和可以用于提供此类规则的流动分布的装置，所述美国专利通过引用整体并入本文。
第二流体218可以包括如氟化油等油，所述油包含用于稳定所得液滴的含氟表面活性剂，例如，抑制所得液滴220的后续聚结。
生成的离散液滴可以包含单个生物颗粒216。生成的离散液滴可以包含携带条形码或其它试剂的珠粒214。生成的离散液滴可以包含单个生物颗粒和携带条形码的珠粒两者，如液滴220。在一些情况下，离散液滴可以包含多于一个的单个生物颗粒或不包含生物颗粒。在一些情况下，离散液滴可以包含多于一个的珠粒或不包含珠粒。离散液滴可以未被占据(例如，没有珠粒、没有生物颗粒)。
有利地，分离生物颗粒的离散液滴和携带条形码的珠粒可以有效地允许将条形码归属于分区内生物颗粒的大分子成分。分区的内容物可以与其它分区的内容物保持分离。
应当理解，本文所描述的通道段可以偶联到多种不同的流体源或接收组件中的任何一个，包含储器、管、歧管或其它系统的流体组件。应当理解，微流体通道结构200可以具有其它几何形状。例如，微流体通道结构可以具有多于一个的通道接合点。例如，微流体通道结构可以具有2个、3个、4个或5个通道段，每个通道段携带在通道接合点处相遇的珠粒。流体可以经由一个或多个流体流动单元沿着一个或多个通道或储器引导流动。流体流动单元可以包括压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。流体还可以或以其它方式通过施加的压差、离心力、电动泵、真空、毛细管或重力流等来控制。
珠粒可以是多孔的、无孔的、固体的、半固体的、半流体的、流体的和/或其组合。在一些情况下，珠粒可以是可溶解的、可破坏的和/或可降解的。在一些情况下，珠粒可以是不可降解的。在一些情况下，珠粒可以是凝胶珠粒。凝胶珠粒可以是水凝胶珠粒。凝胶珠粒可以由如聚合或单体物种等分子前体形成。半固体珠粒可以是脂质体珠粒。固体珠粒可以包括金属，所述金属包含氧化铁、金和银。在一些情况下，珠粒可以是二氧化硅珠粒。在一些情况下，珠粒可以是刚性的。在其它情况下，珠粒可以是柔性的和/或可压缩的。
珠粒可以是任何合适的形状。珠粒形状的实例包含但不限于球形、非球形、椭圆形、长方形、无定形、圆形、圆柱形和其变型。
珠粒可以是一致大小或不均匀大小。在一些情况下，珠粒的直径可以是至少约1微米(μm)、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更大。在一些情况下，珠粒的直径可能小于约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更小。在一些情况下，珠粒的直径可能在约40-75μm、30-75μm、20-75μm、40-85μm、40-95μm、20-100μm、10-100μm、1-100μm、20-250μm或20-500μm的范围内。
在某些方面，珠粒可以作为具有相对较单分散大小分布的珠粒群体或多个珠粒提供。在可能需要在分区内提供相对较一致量的试剂的情况下，保持相对较一致的珠粒特性如大小可以有助于整体一致性。具体地，本文所描述的珠粒可以具有大小分布，所述大小分布的其横截面尺寸的变异系数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％，并且在一些情况下小于15％、小于10％、小于5％或更小。
珠粒可以包括天然和/或合成材料。例如，珠粒可以包括天然聚合物、合成聚合物或天然和合成聚合物两者。天然聚合物的实例包含蛋白质和糖如脱氧核糖核酸、橡胶、纤维素、淀粉(例如，直链淀粉、支链淀粉)、蛋白质、酶、多糖、丝、聚羟基烷酸酯、壳聚糖、葡聚糖、胶原蛋白、角叉菜胶、卵叶车前子、阿拉伯胶、琼脂、明胶、虫胶、梧桐树胶、黄原胶、玉米糖胶、瓜尔胶、刺梧桐树胶、琼脂糖、海藻酸、藻酸盐或其天然聚合物。合成聚合物的实例包含丙烯酸、尼龙、硅酮、氨纶、粘胶人造丝、聚羧酸、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙二醇、聚氨酯、聚乳酸、二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚(三氟氯乙烯)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯、聚异丁烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲醛)、聚甲醛、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(四氟乙烯)、聚(乙酸乙烯酯)、聚(乙烯醇)、聚(氯乙烯)、聚(偏二氯乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、聚(氟乙烯)和/或其组合(例如，共聚物)。珠粒也可以由聚合物以外的材料形成，包含脂质、胶束、陶瓷、玻璃陶瓷、材料复合物、金属、其它无机材料等。
在一些情况下，珠粒可以含有分子前体(例如，单体或聚合物)，其可以通过分子前体的聚合形成聚合物网络。在一些情况下，前体可以是能够通过例如化学交联进行进一步聚合的已经聚合的物种。在一些情况下，前体可以包括丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺单体、低聚物或聚合物中的一种或多种。在一些情况下，珠粒可以包括预聚物，所述预聚物是能够进一步聚合的低聚物。例如，聚氨酯珠粒可以使用预聚物制备。在一些情况下，珠粒可以含有可以进一步聚合在一起的单个聚合物。在一些情况下，珠粒可以通过不同前体的聚合生成，使得它们包括混合聚合物、共聚物和/或嵌段共聚物。在一些情况下，珠粒可以包括聚合前体(例如，单体、寡聚物、线性聚合物)、核酸分子(例如，寡核苷酸)、引物与其它实体之间的共价键或离子键。在一些情况下，共价键可以是碳-碳键或硫醚键。
交联可以是永久性的或可逆的，这取决于所使用的特定交联剂。可逆交联可以允许聚合物在适当条件下线性化或解离。在一些情况下，可逆交联还可以允许与珠粒表面结合的材料可逆地连接。在一些情况下，交联剂可以形成二硫键。在一些情况下，形成二硫键的化学交联剂可以是胱胺或经修饰的胱胺。
在一些情况下，二硫键可以在分子前体单元(例如，单体、寡聚物或线性聚合物)或并入珠粒中的前体与核酸分子(例如，寡核苷酸)之间形成。例如，胱胺(包含经修饰的胱胺)是包括二硫键的有机试剂，其可以用作珠粒的单个单体或聚合前体之间的交联剂。聚丙烯酰胺可以在存在胱胺或包括胱胺的物种(例如，经修饰的胱胺)的情况下聚合以生成包括二硫键的聚丙烯酰胺凝胶珠粒(例如，包括化学还原性交联剂的化学可降解珠粒)。在珠粒暴露于还原剂时，二硫键可以允许珠粒降解(或溶解)。
在一些情况下，壳聚糖，即线性多糖聚合物，可以通过亲水链与戊二醛交联以形成珠粒。壳聚糖聚合物的交联可以通过由热量、压力、pH变化和/或辐射引发的化学反应来实现。
在一些情况下，珠粒可以包括丙烯酰胺基(acrydite)部分，所述丙烯酰胺基部分在某些方面可以用于将一个或多个核酸分子(例如，条形码序列、条形码化核酸分子、条形码化寡核苷酸、引物或其它寡核苷酸)连接到珠粒。在一些情况下，丙烯酰胺基部分可以指丙烯酰胺基与一种或多种物种的反应生成的丙烯酰胺基类似物，如丙烯酰胺基与其它单体和交联剂在聚合反应期间的反应。丙烯酰胺基部分可以被修饰以与待连接的物种形成化学键，如核酸分子(例如，条形码序列、条形码化核酸分子、条形码化寡核苷酸、引物或其它寡核苷酸)。丙烯酰胺基部分可以用能够形成二硫键的硫醇基团修饰或可以用已经包括二硫键的基团修饰。硫醇或二硫化物(通过二硫化物交换)可以用作待连接物种的锚定点或可以将丙烯酰胺基部分的另一部分用于连接。在一些情况下，连接可以是可逆的，使得当二硫键断裂时(例如，在存在还原剂的情况下)，连接的物种从珠粒中释放。在其它情况下，丙烯酰胺基部分可以包括可以用于连接的反应性羟基。
用于连接核酸分子(例如，寡核苷酸)的珠粒的官能化可以通过多种不同的方法来实现，包含活化聚合物内的化学基团、将活性或可活化的官能团并入聚合物结构中或在珠粒产生中的预聚物或单体阶段连接。
例如，聚合形成珠粒的前体(例如，单体、交联剂)可以包括丙烯酰胺基部分，使得当生成珠粒时，珠粒也包括丙烯酰胺基部分。丙烯酰胺基部分可以连接到核酸分子(例如，寡核苷酸)，所述核酸分子可以包含引发序列(例如，用于扩增靶核酸的引物、随机引物、用于信使RNA的引物序列)和/或一个或多个条形码序列。所述一个或多个条形码序列可以包含与给定珠粒偶联的所有核酸分子相同的序列和/或与给定珠粒偶联的所有核酸分子不同的序列。核酸分子可以并入珠粒中。
在一些情况下，核酸分子可以包括功能序列，例如用于连接到测序流动池，例如用于
Figure BDA0003366638640000201
测序的P5序列。在一些情况下，核酸分子或其衍生物(例如，从核酸分子生成的寡核苷酸或多核苷酸)可以包括另一个功能序列，例如，用于连接到测序流动池以进行依诺米那(Illumina)测序的P7序列。在一些情况下，核酸分子可以包括条形码序列。在一些情况下，引物可以进一步包括唯一分子标识符(UMI)。在一些情况下，引物可以包括用于依诺米那测序的R1引物序列。在一些情况下，引物可以包括用于依诺米那测序的R2引物序列。可以与本公开的组合物、装置、方法和系统一起使用的此类核酸分子(例如，寡核苷酸、多核苷酸等)和其用途的实例在美国专利公开号2014/0378345和2015/0376609中提供，所述美国专利中的每一个通过引用整体并入本文。
在一些情况下，包括反应性或能够被活化以使其变为反应性的官能团的前体可以与其它前体聚合以生成包括活化或可活化的官能团的凝胶珠粒。然后可以使用官能团将另外的物种(例如，二硫化物接头、引物、其它寡核苷酸等)连接到凝胶珠粒。例如，一些包括羧酸(COOH)基团的前体可以与其它前体共聚以形成也包括COOH官能团的凝胶珠粒。在一些情况下，丙烯酸(包括游离COOH基团的物种)、丙烯酰胺和双(丙烯酰基)胱胺可以一起共聚以生成包括游离COOH基团的凝胶珠粒。凝胶珠粒的COOH基团可以被活化(例如，通过1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMTMM))，使得所述基团具有反应性(例如，在EDC/NHS或DMTMM用于活化的情况下与胺官能团反应)。活化的COOH基团然后可以与合适的物种(例如，包括胺官能团的物种，其中羧酸基团被活化以与胺官能团反应)反应，所述物种包括待连接到珠粒的部分。
在其聚合网络中包括二硫键的珠粒可以通过将二硫键中的一些还原成游离硫醇来用另外的物种官能化。可以通过例如还原剂(例如，DTT、TCEP等)的作用来还原二硫键以生成游离硫醇基团，而不溶解珠粒。珠粒的游离硫醇然后可以与物种或包括另一个二硫键的物种的游离硫醇反应(例如，通过硫醇-二硫键交换)，使得所述物种可以连接到珠粒(例如，通过生成的二硫键)。在一些情况下，珠粒的游离硫醇可以与任何其它合适的基团反应。例如，珠粒的游离硫醇可以与包括丙烯酰胺基部分的物种反应。珠粒的游离硫醇基团可以通过迈克尔(Michael)加成化学反应与丙烯酰胺基反应，使得包括丙烯酰胺基的物种与珠粒连接。在一些情况下，可以通过包含如N-乙基马来酰亚胺或碘乙酸盐等硫醇封端剂来防止不受控反应。
可以控制珠粒内二硫键的活化，使得仅活化少量二硫键。例如，可以通过控制用于生成游离硫醇基团的还原剂的浓度和/或用于在珠粒聚合中形成二硫键的试剂的浓度来进行控制。在一些情况下，低浓度(例如，还原剂分子:凝胶珠粒比率小于或等于约1:100,000,000,000、小于或等于约1:10,000,000,000、小于或等于约1:1,000,000,000、小于或等于约1:100,000,000、小于或等于约1:10,000,000、小于或等于约1:1,000,000、小于或等于约1:100,000、小于或等于约1:10,000)的还原剂可以用于还原。控制还原为游离硫醇的二硫键数量可以有助于确保官能化期间的珠粒结构完整性。在一些情况下，如荧光染料等光学活性剂可以通过珠粒的游离硫醇基团偶联到珠粒，并且用于量化珠粒中存在的游离硫醇的数量和/或跟踪珠粒。
在一些情况下，在凝胶珠粒形成之后向凝胶珠粒添加部分可以是有利的。例如，在凝胶珠粒形成之后添加寡核苷酸(例如，条形码化寡核苷酸)可以避免在聚合期间可能发生的链转移终止期间物种的损失。此外，较小的前体(例如，不包括侧链基团和连接部分的单体或交联剂)可以用于聚合并且由于粘性效应可以最小程度地阻碍增长的链端。在一些情况下，凝胶珠粒合成之后的官能化可以使装载有潜在破坏性试剂(例如，自由基)和/或化学环境的物种(例如，寡核苷酸)的暴露最小化。在一些情况下，生成的凝胶可以具有上限临界溶解温度(UCST)，所述温度允许珠粒因温度而膨胀和塌陷。在随后用寡核苷酸使珠粒官能化期间，此类官能性可以有助于寡核苷酸(例如，引物)渗入珠粒中。产生后官能化也可以用于控制珠粒中物种的装载率，使得例如使装载率的可变性最小化。物种装载也可以在分批过程中进行，使得多个珠粒可以在单个批次中被物种官能化。
注射或以其它方式引入分区的珠粒可以包括可释放、可切割或可逆地连接的条形码。注射或以其它方式引入分区的珠粒可以包括可活化的条形码。注射或以其它方式引入分区的珠粒可以是可降解的、可破坏的或可溶解的珠粒。
条形码可以可释放、可切割或可逆地连接到珠粒，使得条形码可以通过切割条形码分子与珠粒之间的键而释放或可释放或通过底层珠粒本身的降解而释放，从而允许接近条形码或可被其它试剂接近或两者兼而有之。在非限制性实例中，可以通过还原二硫键、使用限制酶、光活化切割或通过其它类型的刺激(例如，化学、热、pH、酶促等)的切割和/或反应来实现切割，如本文其它地方所描述的。可释放条形码有时可以被称为可活化的，因为一旦释放，所述条形码就可用于反应。因此，例如，可活化的条形码可通过从珠粒(或本文所描述的其它合适类型的分区)释放条形码来活化。在所描述的方法和系统的上下文中还设想了其它可活化的配置。
除了珠粒与如含有条形码的核酸分子(例如，条形码化寡核苷酸)等相关分子之间的可切割键之外或作为替代，珠粒可以自发地或在暴露于一种或多种刺激(例如，温度变化、pH变化、暴露于特定化学物种或相、暴露于光、还原剂等)时可以是可降解、可破裂或可溶解的。在一些情况下，珠粒可以是可溶解的，使得珠粒的材料组分在暴露于特定化学物种或如温度变化或pH变化等环境变化时溶解。在一些情况下，凝胶珠粒可以在高温和/或碱性条件下降解或溶解。在一些情况下，珠粒可以是可热降解的，使得当珠粒暴露于适当的温度变化(例如，热量)时，珠粒降解。与物种(例如，核酸分子，例如，条形码化寡核苷酸)结合的珠粒的降解或溶解可能导致物种从珠粒释放。
从上述公开应当理解，珠粒的降解可以指在和不在结构上降解物理珠粒本身的情况下结合或夹带的物种从珠粒解离。例如，珠粒的降解可以涉及通过本文其它地方所描述的一种或多种物种和/或方法切割可切割的键。在另一个实例中，例如由于化学环境的变化夹带的物种可以通过渗透压差从珠粒释放。举例来说，由于渗透压差引起的珠粒孔径的改变通常可以在珠粒本身没有结构降解的情况下发生。在一些情况下，由于珠粒的渗透溶胀而导致的孔径增加可以允许在珠粒内释放夹带的物种。在其它情况下，由于孔径收缩，珠粒的渗透收缩可以使珠粒更好地保留夹带的物种。
可以将可降解珠粒引入如乳液的液滴或孔等分区中，使得珠粒在分区内降解，并且当施加适当的刺激时，任何相关物种(例如，寡核苷酸)在液滴内释放。游离物种(例如，寡核苷酸、核酸分子)可以与分区中包含的其它试剂相互作用。例如，包括胱胺并且通过二硫键连接到条形码序列的聚丙烯酰胺珠粒可以与油包水乳液液滴内的还原剂组合。在液滴内，还原剂可以破坏各种二硫键，导致珠粒降解并且将条形码序列释放到液滴的水性内部环境中。在另一个实例中，在碱性溶液中加热包括珠粒结合的条形码序列的液滴也可能导致珠粒降解和连接的条形码序列释放到液滴的水性内部环境中。
任何合适数量的分子标签分子(例如，引物、条形码化寡核苷酸)可以与珠粒相关联，使得在从珠粒释放时，分子标签分子(例如引物，例如，条形码化寡核苷酸)以预定义的浓度存在于分区中。可以选择此类预定义的浓度以促进用于在分区内生成测序文库的某些反应，例如扩增。在一些情况下，引物的预定义的浓度可以受到产生带有核酸分子(例如，寡核苷酸)的珠粒的过程的限制。
在一些情况下，珠粒可以非共价装载一种或多种试剂。可以通过例如使珠粒经受足以使珠粒溶胀的条件、允许试剂有足够的时间扩散到珠粒的内部以及使珠粒经受足以使珠粒消溶胀的条件来非共价地装载珠粒。珠粒的溶胀可以例如通过将珠粒置于热力学有利的溶剂中、使珠粒经受较高或较低的温度、使珠粒经受较高或较低的离子浓度和/或使珠粒经受电场来实现。珠粒的溶胀可以通过各种溶胀方法来实现。珠粒的消溶胀可以通过例如将珠粒转移到热力学不利的溶剂中、使珠粒经受较低或高温度、使珠粒经受较低或较高的离子浓度和/或去除电场来实现。珠粒的消溶胀可以通过各种消溶胀方法来实现。将珠粒转移可能会导致珠粒中的孔收缩。然后，收缩会阻碍珠粒内的试剂从珠粒内部扩散出来。阻碍可能是由于试剂与珠粒内部之间的空间相互作用。转移可以微流体方式实现。例如，转移可以通过将珠粒从一种共流溶剂流移动到不同的共流溶剂流来实现。珠粒的溶胀性和/或孔径可以通过改变珠粒的聚合物组成来调节。
在一些情况下，与前体连接的丙烯酰胺基部分、与前体连接的另一个物种或前体本身可以包括如化学、热或光敏感键等不稳定键，例如二硫键、UV敏感键等。一旦丙烯酰胺基部分或包括不稳定键的其它部分并入珠粒中，珠粒也可以包括不稳定键。例如，不稳定键可以用于将物种(例如，条形码、引物等)可逆地连接(例如，共价连接)到珠粒。在一些情况下，热不稳定键可以包含基于核酸杂交的连接，例如，其中寡核苷酸与连接到珠粒的互补序列杂交，使得杂交体的热熔化释放来自珠粒或微胶囊的寡核苷酸，例如含条形码的序列。
将多种类型的不稳定键添加到凝胶珠粒上可能会产生能够响应各种刺激的珠粒。每种类型的不稳定键可能对相关联刺激(例如，化学刺激、光、温度、酶促等)敏感，使得可以通过施加适当的刺激来控制通过每个不稳定键连接到珠粒的物种的释放。此类官能性可以用于从凝胶珠粒控制释放物种。在一些情况下，在凝胶珠粒形成之后，包括不稳定键的另一种物种可以通过例如如上文所描述的凝胶珠粒的活化官能团连接到凝胶珠粒。应当理解，可释放、可切割或可逆地连接到本文所描述的珠粒的条形码包含通过切割条形码分子与珠粒之间的键而释放或可释放或通过底层珠粒本身的降解而释放的条形码，从而允许接近条形码或可被其它试剂接近或两者兼而有之。
如本文所描述的可释放的条形码有时可以被称为可活化的，因为一旦释放，所述条形码就可用于反应。因此，例如，可活化的条形码可通过从珠粒(或本文所描述的其它合适类型的分区)释放条形码来活化。在所描述的方法和系统的上下文中还设想了其它可活化的配置。
除了可热切割的键、二硫键和UV敏感键之外，可以偶联到前体或珠粒的不稳定键的其它非限制性实例包含酯键(例如，可被酸、碱或羟胺切割)、氨基甲酸酯键(例如，可用二亚乙基三胺“DETA”切割)、邻位二醇键(例如，可通过高碘酸钠切割)、狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)键(例如，可通过热量切割)、砜键(例如，可通过碱切割)、甲硅烷基醚键(例如，可通过酸切割)、糖苷键(例如，可通过淀粉酶切割)、肽键(例如，可通过蛋白酶切割)或磷酸二酯键(例如，可通过核酸酶(例如，DNase)切割))。如下文进一步描述的，键可以通过靶向如限制酶(例如，限制性内切核酸酶)等酶的其它核酸分子切割。
在珠粒生成期间(例如，在前体的聚合期间)，物种可以被封装在珠粒中。此类物种可以参与或不参与聚合。可以将此类物种加入聚合反应混合物中，使得生成的珠粒在珠粒形成时包括所述物种。在一些情况下，此类物种可以在形成后添加到凝胶珠粒中。此类物种可以包含，例如，核酸分子(例如，寡核苷酸)、包含本文所描述的那些的用于核酸扩增反应的试剂(例如，引物、聚合酶、dNTP、辅因子(例如，离子辅因子)、缓冲液)、用于酶促反应的试剂(例如，酶、辅因子、底物、缓冲液)、用于如聚合、连接或消化等核酸修饰反应的试剂和/或用于一个或多个测序平台(例如，用于
Figure BDA0003366638640000241
的
Figure BDA0003366638640000242
)的模板制备(例如，标记)的试剂。此类物种可以包含本文所描述的一种或多种酶，包含但不限于聚合酶、逆转录酶、限制酶(例如，内切核酸酶)、转座酶、连接酶、蛋白酶K、DNase等。此类物种可以包含本文其它地方所描述的一种或多种试剂(例如，裂解剂、抑制剂、灭活剂、螯合剂、刺激)。此类物种的捕获可以通过前体聚合期间生成的聚合物网络密度、凝胶珠粒内离子电荷的控制(例如，通过与聚合物种连接的离子物种)或通过其它物种的释放来控制。在珠粒降解时和/或通过施加能够从珠粒中释放物种的刺激，可以从珠粒中释放被封装的物种。可替代地或另外，在分区形成期间或之后，可以在分区(例如，液滴)中分离物种。此类物种可以包含但不限于也可以封装在珠粒中的上述物种。
可降解珠粒可以包括一种或多种具有不稳定键的物种，使得当珠粒/物种暴露于适当的刺激时，键断裂，并且珠粒降解。不稳定键可以是化学键(例如，共价键、离子键)或可以是另一种类型的物理相互作用(例如，范德华相互作用(van der Waals interaction)、偶极-偶极相互作用等)。在一些情况下，用于生成珠粒的交联剂可以包括不稳定键。在暴露于适当的条件下时，不稳定键可以断裂，并且珠粒降解。例如，当包括胱胺交联剂的聚丙烯酰胺凝胶珠粒暴露于还原剂时，胱胺的二硫键可以断裂并且珠粒降解。
与不降解的珠粒相比，当向珠粒施加适当的刺激时，可降解珠粒可以用于更快速地从珠粒释放连接的物种(例如，核酸分子、条形码序列、引物等)。例如，对于结合到多孔珠粒的内表面的物种或在封装的物种的情况下，物种在珠粒降解时可以具有较大的流动性和对溶液中其它物种的可及性。在一些情况下，物种还可以通过可降解接头(例如，二硫化物接头)连接到可降解珠粒。可降解接头可以对与可降解珠粒相同的刺激作出反应，或者两种可降解物种可以对不同的刺激作出反应。例如，条形码序列可以通过二硫键连接到包括胱胺的聚丙烯酰胺珠粒。在条形码化珠粒暴露于还原剂时，珠粒降解，并且条码序列在条形码序列与珠粒之间的二硫键以及珠粒中胱胺的二硫键断裂时被释放。
从上述公开应当理解，虽然在如上所述的许多情况下被称为珠粒的降解，但所述降解可以指在和不在结构上降解物理珠粒本身的情况下结合或夹带的物种从珠粒解离。例如，例如由于化学环境的变化夹带的物种可以通过渗透压差从珠粒释放。举例来说，由于渗透压差引起的珠粒孔径的改变通常可以在珠粒本身没有结构降解的情况下发生。在一些情况下，由于珠粒的渗透溶胀而导致的孔径增加可以允许在珠粒内释放夹带的物种。在其它情况下，由于孔径收缩，珠粒的渗透收缩可以使珠粒更好地保留夹带的物种。
在提供可降解珠粒的情况下，避免在给定时间之前将此类珠粒暴露于导致此类降解的一个或多个刺激可能是有益的，以便例如避免过早的珠粒降解和由此类降解引起的问题，包含例如不良的流动特性和聚集。举例来说，在珠粒包括如二硫化物基团等可还原的交联基团的情况下，将期望避免使此类珠粒与还原剂，例如DTT或其它二硫键切割试剂接触。在此类情况下，对本文所描述的珠粒的处理在一些情况下将不提供如DTT等还原剂。因为在商业酶制剂中经常提供还原剂，所以在处理本文所描述的珠粒时可以期望提供不含还原剂(或不含DTT)的酶制剂。此类酶的实例包含例如聚合酶制剂、逆转录酶制剂、连接酶制剂以及可以用于处理本文所描述的珠粒的许多其它酶制剂。术语“不含还原剂”或“不含DTT”的制剂可以指具有用于降解珠粒的此类材料的小于约1/10、小于约1/50或甚至小于约1/100的下限范围的制剂。例如，对于DTT，不含还原剂的制剂可以具有小于约0.01毫摩尔(mM)、0.005mM、0.001mM DTT、0.0005mM DTT或甚至小于约0.0001mM DTT。在许多情况下，DTT的量可以是不可检测的。
许多化学触发剂可以用于触发珠粒的降解。这些化学变化的实例可以包含但不限于pH介导的珠粒内组分完整性的变化、珠粒组分通过交联键切割的降解和珠粒组分的解聚。
在一些实施例中，珠粒可以由包括如BAC或胱胺等可降解化学交联剂的材料形成。此类可降解交联剂的降解可以通过多种机制实现。在一些实例中，珠粒可以与化学降解剂接触，所述化学降解剂可以引起氧化、还原或其它化学变化。例如，化学降解剂可以是如二硫苏糖醇(DTT)等还原剂。还原剂的另外的实例可以包含β-巯基乙醇、(2S)-2-氨基-1,4-二巯基丁烷(二硫代丁胺或DTBA)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其组合。还原剂可以降解形成珠粒的凝胶前体之间形成的二硫键，从而降解珠粒。在其它情况下，溶液的如pH的增加等pH的变化可能会触发珠粒的降解。在其它情况下，暴露于如水等水溶液可能会触发水解降解，从而导致珠粒降解。
还可以在施加热刺激时诱导珠粒释放其内容物。温度的变化可以导致珠粒发生各种变化。例如，热量可以导致固体珠粒液化。热量的变化可以导致珠粒熔化，使得珠粒的一部分降解。在其它情况下，热量可以增加珠粒组分的内部压力，使得珠粒破裂或爆炸。热量也可以作用于用作构建珠粒的材料的热敏感聚合物。
任何合适的药剂都可以降解珠粒。在一些实施例中，温度或pH的变化可以用于降解珠粒内的热敏感或pH敏感键。在一些实施例中，化学降解剂可以用于通过氧化、还原或其它化学变化来降解珠粒内的化学键。例如，化学降解剂可以是如DTT等还原剂，其中DTT可以降解交联剂与凝胶前体之间形成的二硫键，从而降解珠粒。在一些实施例中，可以添加还原剂以降解珠粒，这可能会或可能不会导致珠粒释放其内容物。还原剂的实例可以包含二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、(2S)-2-氨基-1,4-二巯基丁烷(二硫代丁胺或DTBA)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其组合。还原剂可以以约0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM的浓度存在。还原剂可以以至少约0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM或大于10mM的浓度存在。还原剂可以以至多约10mM、5mM、1mM、0.5mM、0.1mM或更少的浓度存在。
任何合适数量的分子标签分子(例如，引物、条形码化寡核苷酸)可以与珠粒相关联，使得在从珠粒释放时，分子标签分子(例如引物，例如，条形码化寡核苷酸)以预定义的浓度存在于分区中。可以选择此类预定义的浓度以促进用于在分区内生成测序文库的某些反应，例如扩增。在一些情况下，引物的预定义的浓度可以受到产生带有寡核苷酸的珠粒的过程的限制。
虽然图1和图2已经在上文提供基本上单个占据的分区方面进行了描述，但在某些情况下，可能期望提供多个占据的分区，例如，含有两个、三个、四个或更多个细胞和/或微胶囊(例如，珠粒)，其包括单个分区内的条形码化核酸分子(例如，寡核苷酸)。因此，如上所述，可以控制含有流体和分离流体的生物颗粒和/或珠粒的流动特性以提供此类多个占据的分区。具体地，可以控制流动参数以提供大于约50％的分区、大于约75％、并且在一些情况下大于约80％、90％、95％或更高的给定占据率。
在一些情况下，可以使用另外的微胶囊将另外的试剂递送到分区。在此类情况下，将不同的珠粒引入公共通道或液滴生成接合点，从不同的珠粒来源(例如，含有不同的相关联试剂)通过不同的通道入口引入此类公共通道或液滴生成接合点(例如，接合点210)可以是有利的。在此类情况下，可以控制不同的珠粒进入通道或接合点的流动和频率以提供来自每个来源的特定比例的微胶囊，同时确保此类珠粒的给定配对或组合成具有给定数量生物颗粒的分区(例如，每个分区一个生物颗粒和一个珠粒)。
本文所描述的分区可以包括小体积，例如小于约10微升(μL)、5μL、1μL、900皮升(pL)、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL、500纳升(nL)、100nL、50nL或更少。
例如，在基于液滴的分区的情况下，液滴的总体积可以小于约1000pL、900pL、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL或更少。在与微胶囊共同分离的情况下，应当理解，分区内的样品流体体积，例如包含共同分离的生物颗粒和/或珠粒，可以小于上文所描述体积的约90％、小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％或小于上文所描述体积的约10％。
如本文其它地方所描述的，分离物种可以生成分区群体或多个分区。在此类情况下，可以生成或以其它方式提供任何合适数量的分区。例如，可以生成或以其它方式提供至少约1,000个分区、至少约5,000个分区、至少约10,000个分区、至少约50,000个分区、至少约100,000个分区、至少约500,000个分区、至少约1,000,000个分区、至少约5,000,000个分区、至少约10,000,000个分区、至少约50,000,000个分区、至少约100,000,000个分区、至少约500,000,000个分区、至少约1,000,000,000个分区或更多个分区。此外，所述多个分区可以包括未占据的分区(例如，空分区)和占据的分区。
根据某些方面，生物颗粒可以与裂解试剂一起被分离，以便在分区内释放生物颗粒的内容物。在此类情况下，裂解剂可以在将生物颗粒引入分离接合点/液滴生成区(例如，接合点210)的同时或紧接在其之前与生物颗粒悬浮液接触，如通过通道接合点上游的另外的一个或多个通道。根据其它方面，另外地或可替代地，生物颗粒可以与其它试剂一起分离，如下文将进一步描述的。
图3示出了用于共同分离生物颗粒和试剂的微流体通道结构300的实例。通道结构300可以包含通道段301、302、304、306和308。通道段301和302在第一通道接合点309处连通。通道段302、304、306和308在第二通道接合点310处连通。
在示例操作中，通道段301可以将包含多个生物颗粒314的水性流体312沿着通道段301输送到第二接合点310中。作为替代或另外，通道段301可以输送珠粒(例如，凝胶珠粒)。珠粒可以包括条形码分子。
例如，通道段301可以连接到包括生物颗粒314的水性悬浮液的储器。在第二接合点310的上游并且紧接在到达其之前，通道段301可以在第一接合点309处与通道段302会合。通道段302可以将悬浮在水性流体312中的多种试剂315(例如，裂解剂)沿着通道段302输送到第一接合点309中。例如，通道段302可以连接到包括试剂315的储器。在第一接合点309之后，通道段301中的水性流体312可以将生物颗粒314和试剂315两者朝向第二接合点310携带。在一些情况下，通道段301中的水性流体312可以包含一种或多种试剂，所述一种或多种试剂可以是与试剂315相同或不同的试剂。与水性流体312(例如，油)不混溶的第二流体316可以从通道段304和306中的每一个通道段递送到第二接合点310。在来自通道段301的水性流体312和来自通道段304和306中的每一个通道段的第二流体316在第二通道接合点310处会合时，水性流体312可以被分离为第二流体316中的离散液滴318，并且沿着通道段308从第二接合点310流出。通道段308可以将离散液滴318递送到流体偶联到通道段308的出口储器，在所述出口储器可以收获离散液滴。
第二流体316可以包括如氟化油等油，所述油包含用于稳定所得液滴的含氟表面活性剂，例如，抑制所得液滴318的后续聚结。
生成的离散液滴可以包含单个生物颗粒314和/或一个或多个试剂315。在一些情况下，生成的离散液滴可能包含携带条形码的珠粒(未示出)，如通过本文其它地方所描述的其它微流体结构。在一些情况下，离散液滴可以未被占据(例如，没有试剂、没有生物颗粒)。
有利地，当裂解试剂和生物颗粒共同分离时，裂解试剂可以促进分区内生物颗粒内容物的释放。分区中释放的内容物可以与其它分区的内容物保持分离。
应当理解，本文所描述的通道段可以偶联到多种不同的流体源或接收组件中的任何一个，包含储器、管、歧管或其它系统的流体组件。应当理解，微流体通道结构300可以具有其它几何形状。例如，微流体通道结构可以具有多于两个的通道接合点。例如，微流体通道结构可以具有2个、3个、4个、5个或更多个通道段，每个通道段携带在通道接合点处会合的相同或不同类型的珠粒、试剂和/或生物颗粒。可以控制每个通道段中的流体流动以控制将不同元素分离成液滴。流体可以经由一个或多个流体流动单元沿着一个或多个通道或储器引导流动。流体流动单元可以包括压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。流体还可以或以其它方式通过施加的压差、离心力、电动泵、真空、毛细管或重力流等来控制。
裂解剂的实例包含生物活性试剂，如用于裂解不同细胞类型例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物等的裂解酶，如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌素、唇形蛋白酶(labiase)、细胞裂解酶、裂解酶和多种可从例如西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,Inc.)(密苏里州圣路易斯)获得的其它裂解酶以及其它可商购获得的裂解酶。其它裂解剂可以另外地或可替代地与生物颗粒共同分离以导致生物颗粒的内容物释放到分区中。例如，在一些情况下，可以使用基于表面活性剂的裂解溶液来裂解细胞，但这些对于表面活性剂可以干扰稳定乳液的基于乳液的系统来说可能不太理想。在一些情况下，裂解溶液可以包含非离子表面活性剂，例如TritonX-100和Tween20。在一些情况下，裂解溶液可以包含离子表面活性剂，例如十二烷基肌氨酸钠和十二烷基硫酸钠(SDS)。在某些情况下也可以使用电穿孔、热、声或机械细胞破碎，例如，基于非乳液的分离，如可以补充或代替液滴分离的生物颗粒的封装，其中封装的任何孔径足够小以在细胞破碎后保留给定大小的核酸片段。
除了与上文所描述的生物颗粒共同分离的裂解剂外，其它试剂也可以与生物颗粒共同分离，包含例如DNase和RNase灭活剂或抑制剂，如蛋白酶K、螯合剂、如EDTA和其它用于去除或以其它方式减少负面活性或不同细胞裂解物组分对核酸后续处理的影响的试剂。另外，在封装的生物颗粒的情况下，可以将生物颗粒暴露于适当的刺激以从共同分离的微胶囊中释放生物颗粒或其内容物。例如，在一些情况下，化学刺激可以与封装的生物颗粒共同分离，以允许微胶囊降解并将细胞或其内容物释放到更大的分区中。在一些情况下，此刺激可以与本文其它地方所描述的用于核酸分子(例如，寡核苷酸)从它们相应的微胶囊(例如，珠粒)释放的刺激相同。在替代方面，这可以是不同且非重叠的刺激，以便允许封装的生物颗粒在与核酸分子释放到同一分区不同的时间被释放到分区中。
另外的试剂也可以与生物颗粒共同分离，如用于片段化生物颗粒DNA的内切酶、DNA聚合酶和于扩增生物颗粒的核酸片段并将条形码分子标签连接到扩增片段的dNTP。可以共同分离其它酶，包含但不限于聚合酶、转座酶、连接酶、蛋白酶K、DNase等。另外的试剂还可以包含逆转录酶，包含具有末端转移酶活性的酶、引物和寡核苷酸，以及可以用于模板切换的切换寡核苷酸(在本文中也称为“切换寡核苷酸”或“模板切换寡核苷酸”)。在一些情况下，模板切换可以用于增加cDNA的长度。在一些情况下，模板切换可以用于将预定义的核酸序列附加到cDNA。在模板切换的实例中，可以从模板例如细胞mRNA的逆转录生成cDNA，其中具有末端转移酶活性的逆转录酶可以以不依赖模板的方式向cDNA添加另外的核苷酸，例如polyC。切换寡核苷酸可以包含与另外的核苷酸互补的序列，例如polyG。cDNA上的另外的核苷酸(例如，polyC)可以与切换寡核苷酸上的另外的核苷酸(例如，polyG)杂交，由此切换寡核苷酸可以被逆转录酶用作模板以进一步延伸cDNA。模板切换寡核苷酸可以包括杂交区域和模板区域。杂交区域可以包括能够与靶标杂交的任何序列。在一些情况下，如先前所描述的，杂交区域包括一系列G碱基以补充cDNA分子3'末端处的突出C碱基。所述一系列G碱基可以包括1个G碱基、2个G碱基、3个G碱基、4个G碱基、5个G碱基或超过5个G碱基。模板序列可以包括任何要并入到cDNA中的序列。在一些情况下，模板区域包括至少1个(例如，至少2个、3个、4个、5个或更多个)标签序列和/或功能序列。切换寡核苷酸可以包括脱氧核糖核酸；核糖核酸；经修饰的核酸，其包含2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、反向dT、5-甲基dC、2'-脱氧肌苷、超级T(5-羟基丁炔基-2'-脱氧尿苷)、超级G(8-氮杂-7-脱氮鸟苷)、锁核酸(LNA)、解锁核酸(UNA，例如，UNA-A、UNA-U、UNA-C、UNA-G)、Iso-dG、Iso-dC、2'氟碱基(例如，氟C、氟U、氟A和氟G)或其任何组合。
在一些情况下，切换寡核苷酸的长度可以为至少约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个或250个核苷酸或更长。
在一些情况下，切换寡核苷酸的长度可以为至多约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个或250个核苷酸。
一旦细胞的内容物被释放到其相应的分区中，其中含有的大分子组分(例如，如RNA、DNA或蛋白质等生物颗粒的大分子成分)可以在分区内进一步处理。根据本文所描述的方法和系统，单个生物颗粒的大分子组分含量可以提供有唯一标识符，使得在表征那些大分子组分时，它们可以归属于源自相同的一个或多个生物颗粒。将特性归属于单个生物颗粒或生物颗粒组的能力是通过将唯一标识符专门分配给单个生物颗粒或生物颗粒组来提供的。唯一标识符，例如，以核酸条形码的形式，可以被分配或与单个生物颗粒或生物颗粒群体相关联，以便用唯一标识符标记或标注生物颗粒的大分子组分(以及其特性)。然后可以使用这些唯一标识符将生物颗粒的组分和特性归属于单个生物颗粒或生物颗粒组。
在一些方面，这通过将单个生物颗粒或生物颗粒组与唯一标识符共同分离来执行，如上文所描述的(参考图2)。在一些方面，以包括核酸条形码序列的核酸分子(例如，寡核苷酸)的形式提供唯一标识符，所述核酸条形码序列可以连接到或以其它方式与单个生物颗粒的核酸内容物或生物颗粒的其它组分相关联，特别是与那些核酸的片段相关联。核酸分子被分离使得在给定分区中的核酸分子之间，其中含有的核酸条形码序列是相同的，但是在不同分区之间，核酸分子可以并且确实具有不同的条形码序列，或者至少表示给定分析中所有分区的大量不同条形码序列。在一些方面，仅一种核酸条形码序列可以与给定分区相关联，但在一些情况下，可能存在两种或更多种不同的条形码序列。
核酸条形码序列可以包含核酸分子(例如，寡核苷酸)序列内的约6到约20个或更多个核苷酸。在一些情况下，条形码序列的长度可以是约6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以是至少约6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以是至多约6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个核苷酸或更短。这些核苷酸可以是完全连续的，即在单个相邻的核苷酸区段中，或者它们可以分隔成两个或多个由1个或多个核苷酸分隔的单独子序列。在一些情况下，分隔的条形码子序列的长度可以为约4个到约16个核苷酸。在一些情况下，条形码子序列可以是约4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以是至少约4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以是至多约4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个核苷酸或更短。
共同分离的核酸分子还可以包括用于处理来自共同分离的生物颗粒的核酸的其它功能序列。这些序列包含例如靶向或随机/通用扩增引物序列，用于从分区内的单个生物颗粒扩增基因组DNA，同时连接相关联的条形码序列、测序引物或引物识别位点、杂交或探测序列，例如用于鉴定序列的存在或用于下拉条形码化核酸或许多其它潜在功能序列中的任何一个。也可以采用共同分离寡核苷酸的其它机制，包含例如两个或更多个液滴的聚结，其中一个液滴含有寡核苷酸，或将寡核苷酸微分配到分区中，例如微流体系统内的液滴。
在实例中，提供如珠粒等微胶囊，所述微胶囊各自包含大量可释放地连接到珠粒的上文所描述的条形码化核酸分子(例如，条形码化寡核苷酸)，其中连接到特定珠粒的所有核酸分子将包含相同的核酸条形码序列，但其中大量不同的条形码序列跨所使用的珠粒群体表示。在一些实施例中，例如包括聚丙烯酰胺聚合物基质的水凝胶珠粒用作固体支持物和将核酸分子递送到分区中的载体，因为它们能够携带大量核酸分子，并且可以被配置成在暴露于特定刺激时释放那些核酸分子，如本文其它地方所描述的。在一些情况下，珠粒群体提供不同的条形码序列文库，所述条形码序列文库包含至少约1,000个不同的条形码序列、至少约5,000个不同的条形码序列、至少约10,000个不同的条形码序列、至少约50,000个不同的条形码序列、至少约100,000个不同的条形码序列、至少约1,000,000个不同的条形码序列、至少约5,000,000个不同的条形码序列或至少约10,000,000个不同的条形码序列或更多。另外，每个珠粒可以提供有大量连接的核酸(例如，寡核苷酸)分子。具体地，单个珠粒上包含条形码序列的核酸分子的分子数量可以是至少约1,000个核酸分子、至少约5,000个核酸分子、至少约10,000个核酸分子、至少约50,000个核酸分子、至少约100,000个核酸分子、至少约500,000个核酸、至少约1,000,000个核酸分子、至少约5,000,000个核酸分子、至少约10,000,000个核酸分子、至少约50,000,000个核酸分子、至少约100,000,000个核酸分子、至少约250,000,000个核酸分子和在一些情况下至少约10亿个核酸分子或更多。给定珠粒的核酸分子可以包含相同(或共同)条形码序列、不同条形码序列或两者的组合。给定珠粒的核酸分子可以包含多组核酸分子。给定组的核酸分子可以包含相同的条形码序列。相同的条形码序列可以不同于另一组核酸分子的条形码序列。
此外，当珠粒群体被分离时，所得分区群体还可以包含不同的条形码文库，所述条形码文库包含至少约1,000个不同的条形码序列、至少约5,000个不同的条形码序列、至少约10,000个不同的条形码序列、至少至少约50,000个不同的条形码序列、至少约100,000个不同的条形码序列、至少约1,000,000个不同的条形码序列、至少约5,000,000个不同的条形码序列或至少约10,000,000个不同的条形码序列。另外，群体的每个分区可以包含至少约1,000个核酸分子、至少约5,000个核酸分子、至少约10,000个核酸分子、至少约50,000个核酸分子、至少约100,000个核酸分子、至少约500,000个核酸、至少约1,000,000个核酸分子、至少约5,000,000个核酸分子、至少约10,000,000个核酸分子、至少约50,000,000个核酸分子、至少约100,000,000个核酸分子、至少约250,000,000个核酸分子和在一些情况下至少约10亿个核酸分子。
在一些情况下，可能需要在给定分区内并入多个不同的条形码，连接到所述分区内的单个或多个珠粒。例如，在一些情况下，一组混合但已知的条形码序列可以在后续处理中提供更大的鉴定保证，例如，通过向给定分区提供更强的条形码地址或归属，作为给定分区输出的重复或独立确认。
在对珠粒施加特定刺激时，核酸分子(例如，寡核苷酸)可从珠粒释放。在一些情况下，刺激可以是光刺激，例如通过切割释放核酸分子的光不稳定键。在其它情况下，可以使用热刺激，其中珠粒环境温度的升高将导致键的切割或核酸分子形成珠粒的其它释放。在仍其它情况下，可以使用切割核酸分子与珠粒的键或以其它方式导致核酸分子从珠粒释放的化学刺激。在一种情况下，此类组合物包含上文所描述的用于封装生物颗粒的聚丙烯酰胺基质，并且可以通过暴露于如DTT等还原剂而被降解以释放连接的核酸分子。
在一些方面，提供了用于受控分离的系统和方法。液滴大小可以通过调节通道架构(例如，微流体通道架构)中的某些几何特征来控制。例如，可以调节通道的膨胀角、宽度和/或长度以控制液滴大小。
图4示出了用于将珠粒受控分离成离散液滴的微流体通道结构的实例。通道结构400可以包含在通道接合点406(或交叉点)处与储器404连通的通道段402。储器404可以是腔室。如本文所使用的，对“储器”的任何提及也可以指“腔室”。在操作中，包含悬浮珠粒412的水性流体408可以沿通道段402输送到接合点406中以与和储器404中的水性流体408不混溶的第二流体410会合以产生流入储器404的水性流体408的液滴416、418。在水性流体408和第二流体410会合的接合点406处，液滴可以基于如接合点406处的水动力、两种流体408、410的流速、流体性质和通道结构400的某些几何参数(例如，w、h0、α等)等因素形成。通过从通道段402通过接合点406连续注射水性流体408可以在储器404中收集多个液滴。
生成的离散液滴可以包含珠粒(例如，如在占据的液滴416中)。可替代地，生成的离散液滴可以包含多于一个珠粒。可替代地，生成的离散液滴可以不包含任何珠粒(例如，如在未占据的液滴418中)。在一些情况下，生成的离散液滴可以含有一种或多种生物颗粒，如本文其它地方所描述的。在一些情况下，生成的离散液滴可以包括一种或多种试剂，如本文其它地方所描述的。
在一些情况下，水性流体408可以具有基本上一致的珠粒412的浓度或频率。珠粒412可以从单独的通道(图4中未示出)引入通道段402中。通道段402中珠粒412的频率可以通过控制珠粒412被引入通道段402的频率和/或通道段402和单独通道中的流体的相对流速来控制。在一些情况下，珠粒可以从多个不同的通道引入通道段402，并且相应地控制频率。
在一些情况下，通道段402中的水性流体408可以包括生物颗粒(例如，参考图1和2所描述的)。在一些情况下，水性流体408可以具有基本上一致的生物颗粒的浓度或频率。与珠粒一样，生物颗粒可以从单独的通道引入通道段402。通道段402中的水性流体408中的生物颗粒的频率或浓度可以通过控制生物颗粒被引入通道段402的频率和/或通道段402和单独通道中的流体的相对流速来控制。在一些情况下，生物颗粒可以从多个不同的通道引入通道段402，并且相应地控制频率。在一些情况下，第一单独通道可以引入珠粒并且第二单独通道可以将生物颗粒引入通道段402中。引入珠粒的第一单独通道可以在引入生物颗粒的第二单独通道的上游或下游。
第二流体410可以包括如氟化油等油，所述油包含用于稳定所得液滴的含氟表面活性剂，例如，抑制所得液滴的后续聚结。
在一些情况下，第二流体410可以不经受和/或引导到任何流入或流出储器404的流动。例如，第二流体410可以在储器404中基本上静止。在一些情况下，第二流体410可以在储器404内经受流动，但不会流入或流出储器404，如通过向储器404施加压力和/或受在接合点406处的水性流体408的进入流动的影响。可替代地，第二流体410可以经受和/或引导流入或流出储器404。例如，储器404可以是将第二流体410从上游引导到下游、输送生成的液滴的通道。
在接合点406处或附近的通道结构400可以具有至少部分地确定由通道结构400形成的液滴的大小的某些几何特征。通道段402可以在接合点406处或附近具有高度h0和宽度w。举例来说，通道段402可以包括矩形横截面，所述矩形横截面通向具有更宽横截面(如宽度或直径)的储器404。可替代地，通道段402的横截面可以是其它形状，如圆形、梯形、多边形或任何其它形状。在接合点406处或附近的储器404的顶壁和底壁可以以膨胀角α倾斜。膨胀角α允许舌状物(在接合点406处离开通道段402并在液滴形成之前进入储器404的水性流体408的一部分)增加深度并且促进中间形成的液滴的曲率的减小。液滴大小可能随着膨胀角的增加而减小。对于上述几何参数h0、w和α，可以通过以下等式预测所得液滴半径Rd：
Figure BDA0003366638640000361
举例来说，对于w＝21μm，h＝21μm和α＝3°的通道结构，预测的液滴大小为121μm。在另一个实例中，对于w＝25μm，h＝25μm和α＝5°的通道结构，预测的液滴大小为123μm。在另一个实例中，对于w＝28μm，h＝28μm和α＝7°的通道结构，预测的液滴大小为124μm。
在一些情况下，膨胀角α可以介于约0.5°到约4°、约0.1°到约10°或约0°到约90°的范围之间。例如，膨胀角可以是至少约0.01°、0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°或更高。在一些情况下，膨胀角可以是至多约89°、88°、87°、86°、85°、84°、83°、82°、81°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°、1°、0.1°、0.01°或更小。在一些情况下，宽度w可以介于约100微米(μm)到约500μm的范围之间。在一些情况下，宽度w可以介于约10μm到约200μm的范围之间。可替代地，宽度可小于约10μm。可替代地，宽度可大于约500μm。在一些情况下，进入接合点406的水性流体408的流速可以介于约0.04微升(μL)/分钟(min)与约40微升/分钟之间。在一些情况下，进入接合点406的水性流体408的流速可以介于约0.01微升(μL)/分钟(min)与约100微升/分钟之间。可替代地，进入接合点406的水性流体408的流速可以小于约0.01微升/分钟。可替代地，进入接合点406的水性流体408的流速可以大于约40微升/分钟，如45微升/分钟、50微升/分钟、55微升/分钟、60微升/分钟、65微升/分钟、70微升/分钟、75微升/分钟、80微升/分钟、85微升/分钟、90微升/分钟、95微升/分钟、100微升/分钟、110微升/分钟、120微升/分钟、130微升/分钟、140微升/分钟、150微升/分钟或更大。在如约小于或等于10微升/分钟的流速等较低流速下，液滴半径可能不取决于进入接合点406的水性流体408的流速。
在一些情况下，生成的至少约50％的液滴可以具有一致的大小。在一些情况下，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多生成的液滴可以具有一致的大小。可替代地，生成的小于约50％的液滴可以具有一致的大小。
液滴生成的通量可以通过增加生成点来增加，如增加水性流体408通道段(例如，通道段402)与储器404之间的接合点(例如，接合点406)的数量。可替代地或另外地，可以通过增加通道段402中的水性流体408的流速来增加液滴生成的通量。
图5示出了用于增加液滴生成通量的微流体通道结构的实例。微流体通道结构500可以包括多个通道段502和储器504。所述多个通道段502中的每个通道段可以与储器504流体连通。通道结构500可以包括多个通道段502与储器504之间的多个通道接合点506。每个通道接合点都可以是液滴生成点。来自图4中的通道结构400的通道段402和其组件的任何描述可以对应于通道结构500中的所述多个通道段502的给定通道段和其对应组件的任何描述。来自通道结构400的储器404和其组件的任何描述可以对应于来自通道结构500的储器504和其对应组件的任何描述。
所述多个通道段502中的每个通道段可以包括水性流体508，所述水性流体包含悬浮珠粒512。储器504可以包括与水性流体508不混溶的第二流体510。在一些情况下，第二流体510可以不经受和/或引导到任何流入或流出储器504的流动。例如，第二流体510可以在储器504中基本上静止。在一些情况下，第二流体510可以在储器504内经受流动，但不会流入或流出储器504，如通过向储器504施加压力和/或受在接合点处的水性流体508的进入流动的影响。可替代地，第二流体510可以经受和/或引导流入或流出储器504。例如，储器504可以是将第二流体510从上游引导到下游、输送生成的液滴的通道。
在操作中，包含悬浮珠粒512的水性流体508可以沿着所述多个通道段502输送到多个接合点506中以与储器504中的第二流体510会合以产生液滴516、518。液滴可以在与储器504的每个对应接合点处从每个通道段形成。在水性流体508和第二流体510会合的接合点处，液滴可以基于如接合点处的水动力、两种流体508、510的流速、流体性质和通道结构500的某些几何参数(例如，w、h0、α等)等因素形成，如本文其它地方所描述的。通过从所述多个通道段502通过所述多个接合点506连续注射水性流体508可以在储器504中收集多个液滴。通量可以随着通道结构500的并行通道配置而显著增加。例如，具有包括水性流体508的五个入口通道段的通道结构生成液滴的频率是可以是具有一个入口通道段的通道结构的五倍，前提是通道段中的流体流速基本上相同。不同入口通道段中的流体流速可以基本上相同或可以不基本上相同。根据实际情况和允许的储器的大小，通道结构可以具有尽可能多的平行通道段。例如，通道结构可以具有至少约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、500个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1500个、5000个或更多个平行或基本上平行的通道段。
几何参数，w、h0和α对于所述多个通道段502中的通道段中的每个通道段可以是一致的或可以不是一致的。例如，每个通道段在其与储器504的相应通道接合点处或附近可以具有相同或不同的宽度。例如，每个通道段在其与储器504的相应通道接合点处或附近可以具有相同或不同的高度。在另一个实例中，储器504在与所述多个通道段502的不同通道接合点处可以具有相同或不同的膨胀角。当几何参数一致时，有利地，即使通过增加的通量，也可以将液滴大小控制为一致。在一些情况下，当需要具有不同的液滴大小分布时，所述多个通道段502的几何参数可以相应地变化。
在一些情况下，生成的至少约50％的液滴可以具有一致的大小。在一些情况下，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多生成的液滴可以具有一致的大小。可替代地，生成的小于约50％的液滴可以具有一致的大小。
图6示出了用于增加液滴生成通量的微流体通道结构的另一个实例。微流体通道结构600可以包括多个通道段602，这些通道段大体上围绕储器604的周边呈圆形布置。所述多个通道段602中的每个通道段可以与储器604流体连通。通道结构600可以包括多个通道段602与储器604之间的多个通道接合点606。每个通道接合点都可以是液滴生成点。来自图2中的通道结构400的通道段402和其组件的任何描述可以对应于通道结构600中的所述多个通道段602的给定通道段和其对应组件的任何描述。来自通道结构400的储器404和其组件的任何描述可以对应于来自通道结构600的储器604和其对应组件的任何描述。
所述多个通道段602中的每个通道段可以包括水性流体608，所述水性流体包含悬浮珠粒612。储器604可以包括与水性流体608不混溶的第二流体610。在一些情况下，第二流体610可以不经受和/或引导到任何流入或流出储器604的流动。例如，第二流体610可以在储器604中基本上静止。在一些情况下，第二流体610可以在储器604内经受流动，但不会流入或流出储器604，如通过向储器604施加压力和/或受在接合点处的水性流体608的进入流动的影响。可替代地，第二流体610可以经受和/或引导流入或流出储器604。例如，储器604可以是将第二流体610从上游引导到下游、输送生成的液滴的通道。
在操作中，包含悬浮珠粒612的水性流体608可以沿着所述多个通道段602输送到多个接合点606中以与储器604中的第二流体610会合以产生多个液滴616。液滴可以在与储器604的每个对应接合点处从每个通道段形成。在水性流体608和第二流体610会合的接合点处，液滴可以基于如接合点处的水动力、两种流体608、610的流速、流体性质和通道结构600的某些几何参数(例如，通道段602的宽度和高度、储器604的膨胀角等)等因素形成，如本文其它地方所描述的。通过从所述多个通道段602通过所述多个接合点606连续注射水性流体608可以在储器604中收集多个液滴。通量可以随着通道结构600的基本上并行通道配置而显著增加。根据实际情况和允许的储器的大小，通道结构可以具有尽可能多的基本上平行通道段。例如，通道结构可以具有至少约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1500个、5000个或更多个平行或基本上平行的通道段。所述多个通道段可以基本上均匀地间隔开，例如，围绕储器的边缘或周边。可替代地，所述多个通道段的间距可以是不均匀的。
储器604可以在每个通道接合点处或附近具有膨胀角α(图6中未示出)。所述多个通道段602中的每个通道段可以在每个通道接合点处或附近具有宽度w和高度h0。几何参数，w、h0和α对于所述多个通道段602中的通道段中的每个通道段可以是一致的或可以不是一致的。例如，每个通道段在其与储器604的相应通道接合点处或附近可以具有相同或不同的宽度。例如，每个通道段在其与储器604的相应通道接合点处或附近可以具有相同或不同的高度。
储器604在与所述多个通道段602的不同通道接合点处可以具有相同或不同的膨胀角。例如，圆形储器(如图6所示出的)可以具有锥形、圆顶状或半球形顶板(例如，顶壁)以在所述多个通道接合点606处或附近为每个通道段602提供相同或基本上相同的膨胀角。当几何参数一致时，有利地，即使通过增加的通量，也可以将所得液滴大小控制为一致。在一些情况下，当需要具有不同的液滴大小分布时，所述多个通道段602的几何参数可以相应地变化。
在一些情况下，生成的至少约50％的液滴可以具有一致的大小。在一些情况下，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多生成的液滴可以具有一致的大小。可替代地，生成的小于约50％的液滴可以具有一致的大小。注射到液滴中的珠粒和/或生物颗粒可能具有或可能不具有一致大小。
通道网络，例如，如上文或本文其它地方所描述的，可以流体偶联到适当的流体组件。例如，入口通道段流体偶联到它们要输送到通道接合点的适当材料来源。这些来源可以包含多种不同流体组件中的任何一种，从限定在微流体装置的主体结构中或连接到其的简单储器到从装置外来源、歧管、流体流动单元(例如，致动器、泵、压缩机)等递送流体的流体管道。同样，出口通道段(例如，通道段208、储器604等)可以流体偶联到用于分离的细胞的接收容器或导管以供后续处理。再次，这可以是限定在微流体装置主体中的储器或者它可以是用于将分离的细胞递送到后续过程操作、仪器或组件的流体导管。
本文所描述的方法和系统可以用于大大提高单细胞应用和/或其它接收基于液滴的输入的应用的效率。例如，在对占据的细胞和/或适当大小的细胞进行分选后，可以进行的后续操作可以包含扩增产物的生成、纯化(例如，通过固相可逆固定化(SPRI))、进一步处理(例如，剪切、连接功能序列，以及随后的扩增(例如，通过PCR))。这些操作可以批量发生(例如，在分区外)。在分区是乳液中的液滴的情况下，乳液可以被破坏，并且液滴的内容物汇集用于另外的操作。可以与带有条形码的珠粒一起共同分离的另外的试剂可以包含阻断核糖体RNA(rRNA)的寡核苷酸和从细胞中消化基因组DNA的核酸酶。可替代地，可以在另外的处理操作期间应用rRNA去除剂。通过此类方法生成的构建体的配置可以帮助在测序和/或对多核苷酸序列的5'末端进行测序期间最小化(或避免)poly-T序列的测序。扩增产物，例如第一扩增产物和/或第二扩增产物，可以经受测序以进行序列分析。在一些情况下，可以使用用于测序的部分发夹扩增(PHASE)方法进行扩增。
多种应用需要评估生物颗粒群体内不同生物颗粒或生物体类型的存在和量化，包含例如，微生物组分析和表征、环境测试、食品安全测试、流行病学分析，例如在跟踪污染中等。
用于形成凝胶基质的方法
本文所描述的方法和系统可以用于生成包括单个生物颗粒和聚合物分子的离散液滴，所述聚合物分子被配置成在受控条件下(例如，点击化学)交联。在一些情况下，交联聚合物可以是可降解的基质。在一些情况下，交联聚合物可以是凝胶。在一些情况下，交联聚合物可以是水凝胶基质。在一些情况下，交联聚合物可以包封生物样品例如，细胞或核酸。在一些情况下，另外的试剂可以渗透到交联基质中。在一些情况下，聚合物分子之间的交联可以是可切割的，并且在基质切割或降解之后，基质内包封的内容物可以被释放。在一些情况下，交联基质和/或包封在其中的内容物可以带条形码。
图7示出了用于共同分离生物颗粒和试剂以生成交联水凝胶基质的微流体通道结构700的实例。通道结构700可以包含通道段701、702、704、706和708。通道段701和702在第一通道接合点709处连通。通道段701、702、704、706和708在第二通道接合点710处连通。
在示例操作中，通道段701可以将包含多个生物颗粒714的水性流体712沿着通道段701输送到第二接合点710中。作为替代或另外，通道段701可以输送珠粒(例如，凝胶珠粒)。珠粒可以包括条形码分子。
例如，通道段701可以连接到包括生物颗粒714的水性悬浮液的储器。在第二接合点710的上游并且紧接在到达其之前，通道段701可以在第一接合点709处与通道段702会合。通道段702可以将悬浮在水性流体712中的多种试剂715A(例如，聚合物分子A)和715B(例如，聚合物分子B)沿着通道段702输送到第一接合点709中。例如，通道段702可以连接到包括试剂715A和715B的储器。在第一接合点709之后，通道段701中的水性流体712可以将生物颗粒714和试剂715A和715B两者朝向第二接合点710携带。在一些情况下，通道段701中的水性流体712可以包含一种或多种试剂，所述一种或多种试剂可以是与试剂715A和715B相同或不同的试剂。与水性流体712不混溶的第二流体716(例如，油)可以从通道段704和706中的每一个通道段递送到第二接合点710。在来自通道段701的水性流体712和来自通道段704和706中的每一个通道段的第二流体716在第二通道接合点710处会合时，水性流体712可以被分离为第二流体716中的离散液滴718，并且沿着通道段708从第二接合点710流出。通道段708可以将离散液滴718递送到流体偶联到通道段708的出口储器，在所述出口储器可以收获离散液滴。
第二流体716可以包括如氟化油等油，所述油包含用于稳定所得液滴的含氟表面活性剂，例如，抑制所得液滴718的后续聚结。
生成的离散液滴可以包含单个生物颗粒714和/或试剂715A和715B中的一个或多个试剂。在一些情况下，生成的离散液滴可能包含携带条形码的珠粒(未示出)，如通过本文其它地方所描述的其它微流体结构。在一些情况下，离散液滴可以未被占据(例如，没有试剂、没有生物颗粒)。如下文所示出的，点击化学可以用于交联捕获在同一离散液滴中的聚合物分子以生成水凝胶(例如，715A和715B)。在一些情况下，点击化学可以用于生成可降解的水凝胶(例如，715A和715B)。
凝胶
如本文所使用的，术语“凝胶”通常是指三维聚合基质；水凝胶是凝胶的实例。凝胶可以具有液体特性和固体特性两者，并且可以展现出有组织的材料结构。水凝胶可以是被配置成吸收/容纳水或生物流体的三维、亲水性、聚合基质。在一些情况下，当水是分散介质时，水凝胶可以因水而变得溶胀。参见例如《欧洲聚合物杂志(Eur.Polym.J.)》,2015,65:252-67和《高级研究杂志(J.Adv.Res)》,2015,6:105-21，所述文献中的每个文献出于所有目的通过引用整体并入本文。水凝胶可以采取许多形式。在一些情况下，水凝胶可以是由单体之间的交联反应产生的水溶胀、交联聚合网络。在一些情况下，水凝胶可以是将水保留在其基质内但可能不溶解于水的聚合材料。
水凝胶可以通过许多方式合成。在一些情况下，水凝胶可以通过一个步骤程序合成，例如多官能单体的聚合和同时发生的交联反应。在一些情况下，水凝胶可以通过多个步骤程序合成，例如，首先聚合单体，然后通过使用可以响应于不同条件的正交反应基团进行交联反应以允许逐步方法。
水凝胶产品可以基于其聚合组合物(均聚水凝胶、共聚水凝胶或多元聚合物水凝胶)、交联类型(化学交联或物理交联)、物理外观(基质、薄膜或微球)、网络电荷(非离子、离子、两性或兼性或两性离子)和来源(天然(例如，壳聚糖)或合成(例如，聚丙烯酰胺))进行分类。
水凝胶可以通过可以产生交联聚合物的技术合成。在一些情况下，共聚/交联自由基聚合可以用于通过使亲水单体与多官能交联分子反应来产生水凝胶。这可以通过例如通过化学反应连接聚合物链、使用电离辐射生成可以作为交联接合点重组的主链自由基或如缠结、静电和微晶形成等物理相互作用来实现。聚合类型可以包含本体聚合、溶液聚合和悬浮聚合。
悬浮聚合或分散聚合可以用于油包水或乳液工艺，有时称为“反转悬浮”。在一些情况下，单体和引发剂可以作为均匀混合物分散在油相或烃相中。在一些情况下，可以首先产生两种类型的聚合物分子，每一种聚合物分子都具有用于交联目的的反应性交联部分。然后这两种类型的聚合物分子可以被包封在乳液中，使得这两种反应性交联部分可以反应并且在两种类型的聚合物之间形成交联，从而完成水凝胶的合成。
在一些情况下，水凝胶可以由单体、聚合引发剂和交联试剂合成。聚合反应完成后，形成的水凝胶可以与剩余的起始材料和不需要的副产物等分离。形成的聚合物的长度可以根据水凝胶的所需性质进行控制。
用于合成水凝胶的聚合类型可以包含但不限于接枝聚合、交联聚合、水溶性聚合物的网络形成和辐射交联聚合等。
聚合可以由引发剂或自由基生成化合物引发，例如过氧化苯甲酰、2,2-偶氮-异丁腈(AIBN)和过氧二硫酸铵或通过使用UV、γ或电子束辐射。
在一些情况下，本文公开的水凝胶包括如聚(丙烯酸)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚丙烯酰胺、一些多糖或其任何衍生物等聚合物。这些聚合物可以是无毒的，并且所述聚合物可以用于各种制药和生物医学应用。因此，在一些情况下，所述聚合物可能不需要从反应系统中去除，从而消除了在形成水凝胶后进行纯化步骤的需要。
聚合物可以包括特定长度或长度范围的聚合物分子。聚合物分子的长度可以至少为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、1,000个、2,000个、5,000个、10,000个、20,000个、50,000个、100,000个、200,000个、500,000个、1,000,000个、2,000,000个、5,000,000个、10,000,000个、20,000,000个、100,000,000个、200,000,000个、500,000,000个或1,000,000,000个骨架原子或分子(例如，碳)。聚合物分子的长度可以至多为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、1,000个、2,000个、5,000个、10,000个、20,000个、50,000个、100,000个、200,000个、500,000个、1,000,000个、2,000,000个、5,000,000个、10,000,000个、20,000,000个、100,000,000个、200,000,000个、500,000,000个或1,000,000,000个骨架原子或分子(例如，碳)。聚合物分子的长度可以至少为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、1,000个、2,000个、5,000个、10,000个、20,000个、50,000个、100,000个、200,000个、500,000个、1,000,000个、2,000,000个、5,000,000个、10,000,000个、20,000,000个、100,000,000个、200,000,000个、500,000,000个或1,000,000,000个单体单元(例如，乙烯基分子或丙烯酰胺分子)。聚合物分子的长度可以至多为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、1,000个、2,000个、5,000个、10,000个、20,000个、50,000个、100,000个、200,000个、500,000个、1,000,000个、2,000,000个、5,000,000个、10,000,000个、20,000,000个、100,000,000个、200,000,000个、500,000,000个或1,000,000,000个单体单元(例如，乙烯基分子或丙烯酰胺分子)。
点击化学
如本文所使用的，术语“点击化学”通常是指以下反应：模块化、范围广、产率高、仅生成如可以通过非色谱方法去除的副产物等无害的副产物，并且具有立体特异性(但不一定具有对映选择性)。参见例如《德国应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.)》,2001,40(11):2004-2021，所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。在一些情况下，点击化学可以描述成对的官能团，所述官能团可以在温和的水性条件下选择性地相互反应。
点击化学反应的实例可以是叠氮化物和炔烃的Huisgen 1,3-偶极环加成，即，形成称为1,2,3-三唑的5元杂原子环的铜催化的叠氮化物与炔烃的反应。所述反应也可以称为Cu(I)-催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)、Cu(I)点击化学或Cu+点击化学。点击化学的催化剂可以是Cu(I)盐或通过用还原试剂将Cu(II)试剂还原为Cu(I)试剂而原位制备的Cu(I)盐(《药物研究(Pharm Res.)》2008,25(10):2216–2230)。已知的用于点击化学的Cu(II)试剂可以包含但不限于Cu(II)-(TBTA)复合物和Cu(II)(THPTA)复合物。TBTA，即三-[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺，也称为三-(苄基三唑基甲基)胺，可以是Cu(I)盐的稳定配体。THPTA，即三-(羟丙基三唑基甲基)胺可以是Cu(I)的稳定剂的另一个实例。也可以完成其它条件以使用无铜点击化学从叠氮化物和炔烃构建1,2,3-三唑环，如通过应变促进的叠氮化物-炔点击化学反应(SPAAC，参见例如《化学通讯(Chem.Commun.)》,2011,47:6257-6259和《自然(Nature)》,2015,519(7544):486-90)，所述文献中的每个文献出于所有目的通过引用整体并入本文。
本公开还考虑使用点击化学反应产生不是1,2,3-三唑的化学键。可用于制备生物相容性凝胶的一系列此类点击化学反应是本领域众所周知的。参见例如，Madl和Heilshorn,“用于工程化细胞外基质的生物正交策略(Bioorthogonal Strategies forEngineering Extracellular Matrices)”,《先进功能材料(Adv.Funct.Mater.)》2018,28:1706046，所述文献在此通过引用并入本文。
可用于本公开的组合物和方法的无铜且不产生1,2,3-三唑键的点击化学反应的实例是逆电子需求狄尔斯-阿尔德(Inverse-electron demand Diels-Alder，IED-DA)反应。(参见例如，Madl和Heilshorn2018。)如本文其它地方所描述的，在IED-DA点击化学反应中，点击化学官能团对包括四嗪基团和反式环辛烯(TCO)基团或四嗪基团和降冰片烯基团。此反应不含铜并且产生包括二氢哒嗪基团而不是1,2,3-三唑的键。
可用于本公开的组合物和方法但产生除1,2,3-三唑之外的化学键的其它特定双正交点击化学反应包含一对呋喃和马来酰亚胺官能团之间的狄尔斯-阿尔德反应、施陶丁格(Staudinger)连接和氧化腈环加成反应。这些点击化学反应和其它反应是本领域众所周知的并且在例如Madl和Heilshorn 2018中有描述。
因此，在一些实施例中，可用于形成本公开的交联聚合物的无铜点击化学可以选自：(a)应变促进的叠氮化物/二苯并环辛炔-胺(DBCO)点击化学；(b)逆电子需求狄尔斯-阿尔德(IED-DA)四嗪/反式环辛烯(TCO)点击化学；(c)逆电子需求狄尔斯-阿尔德(IED-DA)四嗪/降冰片烯点击化学；(d)狄尔斯-阿尔德马来酰亚胺/呋喃点击化学；(e)施陶丁格连接；以及(f)腈氧化物/降冰片烯环加成点击化学。
例如，图7中所示出的离散液滴718可以经受图8中所示出的铜催化的点击化学条件。图8示出了在乳液系统中通过点击化学形成水凝胶的示例过程。如图8所示出的，乳液系统800、802和804可以表示聚合物分子交联形成水凝胶的不同阶段。乳液系统800可以包括浸入油相810中的离散液滴808(包括水)。在离散液滴808内，两个聚合物分子812和814可以一起分离。聚合物分子812可以包括包含不稳定键816(例如，二硫键)的第一交联前体和第一点击化学部分818。聚合物分子814可以包括第二点击化学部分820。另外，在油相810中，可以有如试剂822(示出为铜(II)试剂)等其它试剂，需要所述试剂来促进第一点击化学部分818与第二点击化学部分820之间的点击化学反应，无论是通过其本身还是通过其衍生物。因为试剂822保留在离散液滴808之外，所以通常在离散液滴808内不发生点击化学反应。
在乳液系统802中，试剂822中的一些试剂可以通过物理或化学过程渗透到离散液滴808中。在一些情况下，试剂822变成或以其它方式被处理变成离散液滴808中的试剂824(示出为铜(I)试剂)。转化为试剂824可能需要另外的试剂(未示出，例如，如抗坏血酸钠等还原剂)。在这些实施例中，试剂824可以是引发第一点击化学部分818与第二点击化学部分820之间的点击化学反应所需的试剂。一旦靠近第一点击化学部分818和第二点击化学部分820两者，试剂824就可以引发点击化学反应，如Cu(I)-催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)，参见乳液系统804。
如图8的乳液系统804所示出的，在存在试剂824的情况下，作为第一点击化学部分818与第二点击化学部分820之间的点击化学反应的结果，通过新形成的部分828形成将两个聚合物分子812和814连接在一起的交联826。因此可以形成包括交联聚合物分子812和814的水凝胶。如果需要，可以从新形成的水凝胶中去除试剂822和/或824。在一些情况下，刺激(例如，化学、热或光刺激)施加于不稳定键816以释放交联826和/或降解水凝胶。
具有点击化学部分的共聚物
下文的方案1描绘了导致生成一对包括点击化学部分的聚合物分子以用于随后的共聚反应的示例合成途径。
方案1
Figure BDA0003366638640000471
单体A可以与单体B反应以产生聚合物C。单体B可以在可聚合部分与点击化学部分CL1之间包括接头L1。通过改变反应条件，聚合物C可以包括方案1中所示出的式的可重复单元，因为n(n是大于1的整数)个重复规则聚合物单元段被至少一个聚合物单元夹在中间，所述聚合物单元包括点击化学部分CL1，并且将有总共m(m是正整数)个包括点击化学部分CL1的单元。重复规则聚合物单元与带有点击化学部分的单元之间的相对比率可以通过多种方式控制，包含改变对应单体A和B的相对量。聚合物C的分子量和长度可以通过链终止条件控制。类似地，单体A可以与单体D反应以产生聚合物E。单体D可以包括可聚合部分与点击化学部分CL2之间的接头L2。通过改变反应条件，聚合物E可以包括方案1中所示出的式的可重复单元，其中n(n是大于1的整数)个重复规则聚合物单元段被至少一个聚合物单元夹在中间，所述聚合物单元包括点击化学部分CL2，并且将有总共m(m是正整数)个包括点击化学部分CL2的单元。重复规则聚合物单元与带有点击化学部分的聚合物单元之间的相对比率可以通过多种方式控制，包含改变对应单体A和D的相对量。聚合物E的分子量和长度可以通过链终止条件控制。整数n和m在方案1中的每种情况下是独立的，因为聚合物C和E可以具有相同或不同的整数n和m。
接头L1和L2的长度和/或化学组成可以变化，这取决于水凝胶孔的大小、接头的刚性、接头的亲水性等。通常，接头L1和L2可以包括与所需点击化学反应条件、所需聚合条件和/或所需细胞珠粒条件相兼容的任何化学基团。因此，在一些实施例中，接头L1和L2的组合物可以包括选自以下的化学基团：胺、酰胺、芳基、酰亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、二氢哒嗪、酯、醚、杂芳基、腙、肟、磷酸二酯、聚乙二醇(PEG)、方酸、噻唑、噻唑烷、硫醚、三唑或其任何组合。在一些实施例中，接头L1和L2的组合物可以各自包括烷基、烷氧基、烷基氨基、烷基氨基烷基、烷氧基烷基、芳基烷基、芳基烷氧基、芳基烷基氨基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、杂芳基烷基氨基或其任何组合。
在一些实施例中，接头L1和L2中的至少一个包括铜螯合化学基团。由于螯合基团有效地增加了反应位点处的铜离子浓度，在与点击化学部分CL1或CL2相邻的接头L1或L2中存在铜螯合基团可以促进加速点击化学反应。参见例如，Uttamapinant等人,“具有用于生物分子标记的铜螯合叠氮化物的快速、细胞兼容的点击化学(Fast,Cell-compatibleClick Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling)”《德国应用化学英文国际版(Angew.Chem.Int.Ed.Eng.)》2012年6月11日；51(24):5852-5856，所述文献在此通过引用并入本文。另外，使用具有如叠氮化物-吡啶甲基基团等点击化学部分的铜螯合接头可以允许使用显著降低的铜浓度来进行聚合物交联反应，如本公开的方法中所描述的。在一些实施例中，包括如吡啶甲基基团等铜螯合基团的接头L1和L2可以允许点击化学反应中的铜浓度降低至少10％、至少25％、至少50％或至少75％或更多的量。进而在使用低铜反应制备的细胞珠粒和凝胶珠粒中，使用较低的铜浓度可以大大增加生物分子的产率，例如减少RNA降解。在一些实施例中，在接头中使用铜螯合基团可以导致检测到的基因(例如，在基于细胞珠粒的基因表达测量中)增加至少10％、至少25％、至少50％或至少75％或更多的量。在实例中进一步描述了在本公开的点击化学方法中并入示例性铜螯合基团叠氮化物-吡啶甲基。
在一些情况下，接头L1和L2中的至少一个进一步包括不稳定键。在一些实施例中，接头L1和/或L2可以进一步包括多于一个不稳定键，包含生物正交不稳定键。可以包含在L1和/或L2中的不稳定键的示例性类型可以包含化学不稳定键、热不稳定键、光不稳定键、酶促不稳定键或其组合。可以是L1和L2的一部分的不稳定键的更多具体实例可以包含二硫键、酯键、氨基甲酸酯键、邻位二醇键、狄尔斯-阿尔德键、砜键、甲硅烷基醚键、糖苷键、肽键或磷酸二酯键。不稳定键也可以是可被如限制酶等核酸靶向酶切割的键。
在一些实施例中，接头L1和L2进一步包括二硫键。用还原剂二硫苏糖醇(DTT)切割二硫键的能力是本领域众所周知的。在实例中进一步描述了在本公开的实施例中在接头L1和L2中并入不稳定二硫键。
然而，在一些情况下，期望DTT存在于基于细胞珠粒的反应的试剂混合物中，但仍然能够选择性地切割接头L1和L2。因此，在一些实施例中，接头L1和L2可以进一步包括为氨基甲酸酯键的不稳定键。氨基甲酸酯键在存在DTT的情况下不稳定，但可以通过二亚乙基三胺(DETA)和热量选择性切割。在一些实施例中，接头L1和L2可以进一步包括为氨基甲酸酯键的不稳定键，并且不包括二硫键。在实例中进一步描述了包括氨基甲酸酯基团的示例性不稳定接头和切割氨基甲酸酯的方法以及在本公开的基于细胞珠粒的方法中的用途。
在一些情况下，接头L1和L2可以进一步包括为酶促不稳定键的不稳定键。例如，接头L1和L2可以包含具有被特定蛋白酶特异性切割的序列的多肽。可以将包括具有末端炔丙基部分的特定多肽序列的接头并入聚合物中，如图34A所示出的。然后炔丙基可以与第二聚合物上的叠氮化物修饰的接头进行标准的CuAAC点击化学反应以产生1,2,3-三唑交联的凝胶基质，如图34B所示出的。这种由特定多肽序列交联的凝胶基质然后可以通过暴露于对序列中的肽键具有选择性的蛋白酶而选择性地酶促降解。如图34B所示出的，蛋白酶，例如II型胶原酶，可以在M与S氨基酸残基之间的肽键处选择性地切割8聚体多肽序列，例如GGRMSMPV。
众所周知，特定蛋白酶可以选择性地切割多肽序列中的特定肽键。还经考虑用于降解凝胶中的聚合物交联的蛋白酶不切割可能存在于基于细胞珠粒的生物测定系统中的其它肽/蛋白质，如聚合酶或逆转录酶。下文表1中提供了对特定多肽序列具有高度选择性并且可以用于与在存在生物颗粒和其它大分子成分的情况下选择性降解水凝胶基质相关的实施例中的示例性蛋白酶。
表1
Figure BDA0003366638640000501
例如，HRV 3C蛋白酶是在“3C”多肽切割标签LEVLFQGP的Q与G残基之间进行切割的高度特异性的蛋白酶，并且是可商购获得的“PreScission蛋白酶”或“PSP”。另一种示例性高度特异性蛋白酶是肠激酶。肠激酶是通常参与胰蛋白酶的蛋白酶切割的肠道酶，所述胰蛋白酶特异性切割“EKT”识别序列DDDDK的K之后的肽键。类似地，如上所述，II型胶原酶特异性切割序列GGRMSMPV中M与S之间的肽键。
在一些实施例中，接头L1和L2可以包括可由蛋白酶选择性切割的肽键。在一些实施例中，接头L1和L2可以包括多肽，所述多肽包括可由蛋白酶选择性切割的肽键，任选地其中所述多肽具有选自GGRMSMPV、LEVLFQGP和DDDDK的序列。在一些实施例中，蛋白酶选自HRV3C蛋白酶、肠激酶和II型胶原酶。
如本文其它地方所描述的，广泛的点击化学反应可以用于生成用于本公开的组合物和方法的聚合物。有用的点击化学反应包含众所周知的如CuAAC等铜催化的反应，以及无铜点击化学反应。因此，部分CL1和CL2可以包括任何一对进行点击化学反应的化学基团。在一些情况下，点击化学部分(CL1或CL2)中的一个点击化学部分包括叠氮化物而另一个包括炔烃。在一些情况下，点击化学部分(CL1或CL2)中的一个点击化学部分包括叠氮化物而另一个包括二苯并环辛炔(DBCO)基团。
叠氮化物-炔烃CuAAC反应和应变促进的无Cu叠氮化物-DBCO反应两者均产生包括1,2,3-三唑部分的点击化学键。然而，如本文其它地方所描述的，本公开还考虑凝胶组合物和制备所述凝胶组合物的方法，其中接头和相关联的点击化学反应用于不包括1,2,3-三唑的键。此类替代点击化学反应和所得键是本领域众所周知的。参见例如，Madl和Heilshorn,“用于工程化细胞外基质的生物正交策略”,《先进功能材料》2018,28:1706046，所述文献在此通过引用并入本文。因此，在一些情况下，经考虑点击化学反应是逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应，其中点击化学部分(CL1或CL2)中的一个点击化学部分包括四嗪基团，而另一个基团包括反式环辛烯(TCO)基团或降冰片烯基团。在这两种情况下，四嗪与TCO或降冰片烯的使用，点击化学反应产生包括二氢哒嗪基团而不是1,2,3-三唑的键。
不产生1,2,3-三唑但可以用于本文所描述的凝胶组合物和制备所述凝胶组合物的方法的其它点击化学部分和反应包含呋喃-马来酰亚胺狄尔斯-阿尔德反应。因此，在一些实施例中，点击化学部分(CL1或CL2)中的一个点击化学部分包括呋喃部分，并且另一个包括马来酰亚胺部分。
在一些情况下，整数n和m是基于所产生的聚合物C和E的性质来选择的。此类性质可以包含交联前/后聚合物的粘度、稳定性、形成的水凝胶的孔径、胶凝速率、纯度、纯化程序、点击化学部分与聚合条件的相容性、去除引发剂所需的程序等。
点击化学条件
如图8所示出的，在一些实施例中，铜(II)物种(试剂822)存在于包括待交联聚合物的离散液滴外部的油相中。然而，在这些实施例中，铜(I)物种(试剂824)是使离散液滴内部能够发生点击化学反应的催化剂。在这些情况下，最初存在于外部油相中的铜(II)物种可以交换到离散液滴内部的水相中，然后被水相中的还原剂(例如抗坏血酸钠)还原以在离散液滴内部的水相中产生铜(I)物种。
在一些情况下，方案2可以示出交换过程。为了在油相中形成铜(II)物种，第一步骤可以是乙酸铜(II)盐与表示为Krytox-COOH的氟化羧酸之间的交换反应，所述氟化羧酸包括全氟化烷基链以制备化合物/将全氟化油相中的稳定悬浮液与酸性羧酸基团复合以对铜(II)进行复合。全氟化合物或聚合物，如聚(全氟-环氧丙烷)以是名称为
Figure BDA0003366638640000511
并由杜邦公司(DuPont)生产的化合物类型。
然后Krytox-COO-复合的铜(II)盐可以进一步与全氟化表面活性剂Krytox-PEG-Krytox组合以在液滴的水相内部形成铜(II)的乳液液滴。对于如此形成的液滴的组成，表面活性剂Krytox-PEG-Krytox保留在水相(内部)和全氟化油相(外部)的界面处，表面活性剂的PEG组分面向内部水相，并且全氟化臂指向外部油相。以此方式，形成了铜(II)物种的油相悬浮液，并且在点击化学反应期间油相悬浮液铜(II)物种在油相中是稳定的。此外，当需要时，例如在点击化学反应完成之前或之后，可以通过过滤去除裸铜(II)物种和/或油相悬浮液铜(II)物种。
在一些情况下，混合上述试剂(乙酸铜(II)、Krytox-COOH和表面活性剂Krytox-PEG-Krytox)的顺序可以是重要的。例如，所有三种组分的直接混合可能无法提供所需的铜(II)物种于油相中的悬浮液。首先将乙酸铜(II)和Krytox-COOH混合，然后添加表面活性剂，连同搅拌/混合等的逐步程序可以产生所需的悬浮液。
方案2.
Figure BDA0003366638640000521
具有两个亲氟尾部和一个亲水头部基团的含氟表面活性剂(式I，下文中称为“三嵌段表面活性剂”)可以减少乳液液滴的聚结并且为包含例如，含凝胶珠粒的乳液系统的乳液系统提供稳定性。另外，也可以使用具有一个亲氟尾部和一个亲水头部基团的含氟表面活性剂(式II，下文中称为“二嵌段表面活性剂”或“二嵌段共聚物”)来为乳液系统提供稳定性。n和m都是大于1的整数。Krytox-PEG-Krytox是三嵌段表面活性剂的实例。
Figure BDA0003366638640000522
第二步骤可以是将溶解的铜(II)物种输送/相转移到含有待交联的聚合物的液滴中。多种因素可以影响输送/相转移，包含但不限于油相和/或水相中相应配体(例如，THPTA或TBTA)的浓度、水相中的其它水性组分(例如，表面活性剂、磁性颗粒、如水等溶剂、如
Figure BDA0003366638640000523
F-108等表面活性剂)、所用还原剂的类型和数量(二硫化物，如二硫苏糖醇(DTT)或抗坏血酸钠、聚合物以及制备期间油相与水相之间的v/v比)。
第三步骤可以是在液滴的水相内部将铜(II)物种还原为铜(I)物种。还原试剂，例如抗坏血酸钠，可以基于其作为还原剂的化学性质以及它与聚合物的其它部分和/或接头基团和/或存在于液滴的水相内部的其它试剂的相容性来选择。例如，当接头基团(例如，点击化学部分CL1或CL2)包括二硫键时，使用DTT作为铜还原剂可能会干扰聚合物或水凝胶的完整性，因为在铜(II)物种的还原期间可以切割接头基团内的二硫键，从而阻止生成所需的水凝胶。
第四步骤可以是由液滴内部的铜(I)物种催化的点击化学反应。在一些情况下，在液滴内部可以存在至少一对分别带有两个点击化学部分818和820的聚合物，用于发生点击化学反应。在一些情况下，可以存在多对此类聚合物。在图7所描绘的液滴形成过程期间，可以控制一个液滴内部的此类聚合物对的数量。因为涉及交联，所以可能存在其中一种聚合物与多于一种的其它聚合物交联以形成水凝胶的情况。
在点击化学步骤期间可以考虑的因素可以包含但不限于液滴的大小、每个液滴中所包封的聚合物的长度/数量/类型/比率、液滴水相内部还原剂与铜(I)/铜(II)物种的比率、铜(I)物种与聚合物上的点击化学部分的比率、配体(例如，THPTA或TBTA)的作用、反应的时间和温度、是否存在外部影响(例如，摇晃或涡旋、微波等)、溶解氧以及点击化学反应完成后如何分离不需要的试剂/副产物。
在一些情况下，点击化学反应可以在惰性气体条件下运行。例如，反应可以在N2或Ar下进行，从而减少铜(I)物种的氧气或空气氧化。在一些情况下，增加还原剂的添加量以抵消铜(I)物种的这种氧气或空气氧化的副反应。在一些情况下，替代从铜(II)物种开始，将铜(I)物种添加到水性流体中作为叠氮化物-炔烃环加成的催化剂。在一些情况下，当铜(I)物种是最初添加到水性流体中用于叠氮化物-炔烃环加成的催化剂时，为反应提供无氧系统。
在一些情况下，可以进行溶剂交换以从形成的水凝胶中去除不需要的试剂。
在一些情况下，可以通过向水凝胶中添加另外的试剂或从水凝胶去除一些试剂来对水凝胶进行进一步的转化。
在一些情况下，生物样品(例如，细胞或细胞核或核酸)被包封在点击化学反应期间形成的水凝胶的孔内部。在一些情况下，通过使生物样品与输送到水凝胶中(例如，通过水凝胶孔)的试剂反应，可以在水凝胶内部修饰或表征生物样品。
在一些情况下，铜纳米颗粒可以与包封在水凝胶内部的细胞复合。在这些情况下，铜纳米颗粒用于催化点击化学反应从而形成水凝胶。铜纳米颗粒可以用作铜(II)或铜(I)物种的替代物或补充物。例如，细胞可以在分离之前与铜纳米颗粒复合(例如，成液滴)。然后用本文所描述的点击化学聚合物将包括铜纳米颗粒的细胞分离(例如，成液滴)，从而生成交联水凝胶。细胞复合铜纳米颗粒的使用可以允许水凝胶的选择性胶凝，使得点击化学反应仅在包括铜复合细胞的液滴中进行。
在一些情况下，在交联前体之间的交联反应期间，交联前体中的不稳定键(例如，二硫键)或由此形成的交联保持完整(即，未断裂)。在一些情况下，约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的不稳定键在交联反应期间可以保持完整。在一些情况下，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的不稳定键在交联反应期间可以保持完整。
在一些情况下，交联中的不稳定键(例如，二硫键)可以通过用试剂(例如，还原剂，如DTT、TCEP等)处理而断裂，使得包封在水凝胶内部的生物样品被释放和/或水凝胶的孔膨胀，使得能够与生物样品反应的一种或多种试剂现在可以接近生物样品。
图9示出了使用点击化学生成的示例水凝胶的示意图。第一共聚物901包括炔烃部分902，并且第二共聚物904包括叠氮化物部分905。炔烃部分902可以包括可降解的接头(例如，二硫键903)。可替代地或另外，叠氮化物部分905可以包括可降解的接头。炔烃部分902可以在存在Cu(I)的情况下与叠氮化物部分905反应以生成包括1,2,3-三唑部分906的链间接头。
用于细胞珠粒生成的方法
本公开的方法可以包括生成一种或多种包括本文所公开的聚合物中的一种或多种聚合物的细胞珠粒。图10示出了用于生成细胞珠粒的示例方法。在此实例中，细胞和聚合物或凝胶前体与不混溶的流体(例如，油)混合，从而生成多个水性液滴，包含包括细胞1002的液滴1001。如本文所描述的，液滴1001可以包括带电物种。液滴1001经受足以使聚合物或凝胶前体聚合或胶凝的条件以生成包括细胞1002的细胞珠粒1003。胶凝可以包括本文所描述的胶凝机制和聚合物中的任何一种，包含利用点击化学反应的那些，如本文其它地方所描述的。在一些情况下，细胞珠粒1003经受足以裂解细胞1002的处理条件，将细胞的组分释放到细胞珠粒中。在其它实施例中，在聚合物或凝胶前体聚合或胶凝以生成细胞珠粒1003之前，细胞1002在液滴901中裂解。在仍其它实施例中，细胞1002在聚合物或凝胶前体的聚合或胶凝之前或之后被透化。在水相中收集细胞珠粒以生成多个细胞珠粒1004。细胞珠粒可以储存以供进一步处理。在一些情况下，在聚合物或凝胶前体聚合或胶凝之后，带电物种可以连接到细胞珠粒。例如，聚合物或凝胶前体可以包括一个或多个官能团，所述一个或多个官能团在聚合物或凝胶前体的聚合或胶凝之后促进带电物种的连接。在其它实施例中，聚合物或凝胶前体包括官能团，所述官能团包括带电物种，其在聚合物或凝胶前体的聚合或胶凝期间并入细胞珠粒中。
一方面，本公开提供了用于生成包括带电物种的细胞珠粒的方法。首先，可以生成包括来自多个细胞的细胞、聚合或凝胶前体和带电物种的分区。接下来，可以使所述分区经受足以使所述聚合或凝胶前体反应的条件以生成聚合物或凝胶网络，所述聚合物或凝胶网络包括所述细胞或其衍生物，和所述带电物种，从而生成细胞珠粒。可以使分区经受足以使聚合或凝胶前体聚合或胶凝的条件。足以使聚合或凝胶前体聚合或胶凝的条件在本文其它地方描述。在一些实施例中，细胞被裂解以将细胞组分释放到细胞珠粒中。细胞可以在聚合或凝胶前体聚合或胶凝之前、与聚合或凝胶前体聚合或胶凝同时或在聚合或凝胶前体聚合或胶凝之后裂解。在其它实施例中，细胞珠粒中的细胞不被裂解，而是被透化以允许接近细胞核内的组分。
另一方面，本公开提供了用于生成包括带电物种的细胞珠粒的方法。首先，可以生成包括从细胞分离的细胞核、聚合或凝胶前体和带电物种的分区。接下来，可以使所述分区经受足以使所述聚合或凝胶前体反应的条件以生成聚合物或凝胶网络，所述聚合物或凝胶网络包括细胞核和所述带电物种，从而生成细胞珠粒。可以使分区经受足以使聚合或凝胶前体聚合或胶凝的条件。足以使聚合或凝胶前体聚合或胶凝的条件在本文其它地方描述。例如，铜催化剂可以用于催化点击化学反应，从而生成水凝胶。在一些实施例中，细胞核被裂解以将细胞核组分释放到细胞珠粒中。细胞核可以在聚合或凝胶前体聚合或胶凝之前、与聚合或凝胶前体聚合或胶凝同时或在聚合或凝胶前体聚合或胶凝之后裂解。在其它实施例中，细胞珠粒中的细胞核不被裂解，而是被透化以允许接近细胞核内的细胞核组分。
带电物种可以是带正电的物种。带正电的物种可以是包括正电荷的试剂。带正电的物种可以包括三甲基铵。带正电的物种可以是(3-丙烯酰胺基丙基)-三甲基铵。带电物种可以是带负电的物种。带负电的物种可以包括磷酸盐。带电物种可以连接到聚合物或凝胶网络。在聚合期间，带电物种可以并入聚合物或凝胶网络中。细胞珠粒可以包括一种或多种化学交联剂。化学交联剂可以是二硫键。带电物种可以连接到一种或多种化学交联剂。细胞的衍生物可以是来自细胞的组分(例如，DNA、RNA、蛋白质等)。生成细胞珠粒的方法可以包括裂解分区(例如，液滴)内的细胞以从细胞释放组分。组分可以是核酸。核酸可以是DNA(例如，基因组DNA)或RNA(例如，mRNA、siRNA)。组分可以是蛋白质。组分可以是带负电的组分，例如DNA、RNA或miRNA。组分可以是带正电的组分，例如蛋白质。来自细胞的组分可以与带电物种相互作用。来自细胞的组分可以非共价连接到带电物种。
在一些实施例中，来自或源自细胞的带负电的组分(例如，DNA)与细胞珠粒(例如，细胞珠粒聚合物的带正电的官能团)的带正电的物种(例如，((3-丙烯酰胺基丙基)-三甲基铵)通过离子相互作用来相互作用。在其它实施例中，来自或源自细胞的带正电的组分(例如，蛋白质)与细胞珠粒(例如，细胞珠粒聚合物的带负电的官能团)的带负电的物种(例如，磷酸盐)通过离子相互作用来相互作用。在仍其它实施例中，来自或源自细胞的带负电的组分(例如，DNA)与细胞珠粒(例如，细胞珠粒聚合物的带正电的官能团)的带正电的物种(例如，((3-丙烯酰胺基丙基)-三甲基铵)相互作用，并且来自或源自细胞的带正电的组分(例如，蛋白质)与细胞珠粒(例如，细胞珠粒聚合物的带负电的官能团)的带负电的物种(例如，磷酸盐)相互作用。因此，例如，由于与细胞珠粒的带电物种的静电相互作用来自细胞的一种或多种组分可以能够保留在细胞珠粒内。来自细胞的组分能够在细胞珠粒内保留约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或更长时间。来自细胞的组分能够在细胞珠粒内保留至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时或更长时间。来自细胞的组分能够在细胞珠粒内保留至多1小时、至多2小时、至多3小时、至多4小时、至多5小时、至多6小时、至多12小时、至多24小时、至多48小时或至多72小时。
一方面，本公开提供了用于生成包括带电聚合物或凝胶网络的细胞珠粒(例如，包括带电物种的细胞珠粒)的方法。首先，可以生成包括来自多个细胞的细胞和聚合或凝胶前体的分区。接下来，可以使所述分区经受足以使所述带电聚合或凝胶前体反应的条件以生成带电聚合物或凝胶网络，所述带电聚合物或凝胶网络包括所述细胞或其衍生物，由此提供包括带电物种的细胞珠粒。所述反应可以使聚合物或凝胶前体上的净电荷改变，从而生成带电的聚合物或凝胶网络。所述反应可以使聚合物或凝胶网络上的净电荷改变，从而生成带电的聚合物或凝胶网络。
聚合物或凝胶前体可以是带正电的。聚合物或凝胶前体可以包括壳聚糖。聚合物或凝胶前体可以包括聚乙烯亚胺(PEI)。聚合物或凝胶前体可以是带负电的。聚合物或凝胶前体可以包括藻酸盐。细胞的衍生物可以是来自细胞的组分(例如，DNA、RNA、蛋白质等)。生成细胞珠粒的方法可以包括裂解分区(例如，液滴)内的细胞以从细胞释放组分。组分可以是核酸。核酸可以是DNA(例如，基因组DNA)或RNA(例如，mRNA、siRNA)。组分可以是蛋白质。组分可以是带负电的组分，例如DNA、RNA或miRNA。组分可以是带正电的组分，例如蛋白质。来自细胞的组分可以与带电聚合物或凝胶网络相互作用。来自细胞的组分可以非共价连接到包括带电物种的细胞珠粒的聚合物或凝胶网络。在一些实施例中，来自或源自细胞的带负电的组分(例如，DNA)与细胞珠粒(例如，带正电的聚合物或凝胶网络)的带正电的物种通过离子相互作用来相互作用。在其它实施例中，来自或源自细胞的带正电的组分(例如，蛋白质)与细胞珠粒(例如，带负电的聚合物或凝胶网络)的带负电的物种通过离子相互作用来相互作用。在仍其它实施例中，来自或源自细胞的带负电的组分(例如，DNA)与细胞珠粒(例如，带正电的聚合物或凝胶网络)的带正电的物种相互作用，并且来自或源自细胞的带正电的组分(例如，蛋白质)与细胞珠粒(例如，带负电的聚合物或凝胶网络)的带负电的物种相互作用。因此，例如，由于与细胞珠粒的带电物种的静电相互作用来自细胞的一种或多种组分可以能够保留在细胞珠粒内。例如，由于与带电聚合物或凝胶网络的相互作用，来自细胞的组分可以能够保留在细胞珠粒内。来自细胞的组分能够在细胞珠粒内保留约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或更长时间。来自细胞的组分能够在细胞珠粒内保留至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时或更长时间。来自细胞的组分能够在细胞珠粒内保留至多1小时、至多2小时、至多3小时、至多4小时、至多5小时、至多6小时、至多12小时、至多24小时、至多48小时或至多72小时。
一方面，本公开提供了用于生成包括带电物种的细胞珠粒的方法。首先，可以生成包括来自多个细胞的细胞和聚合或凝胶前体的分区。接下来，可以使所述分区经受足以使所述聚合或凝胶前体反应的条件以生成聚合物或凝胶网络，所述聚合物或凝胶网络包括所述细胞或其衍生物。接下来，可以将带电物种偶联到聚合物或凝胶网络，由此提供包括带电物种的细胞珠粒。可以使分区经受足以使聚合或凝胶前体聚合或胶凝的条件。足以使聚合或凝胶前体聚合或胶凝的条件在本文其它地方描述。例如，铜催化剂可以用于催化点击化学反应，从而生成水凝胶。在一些情况下，细胞被裂解以释放细胞组分。细胞可以在聚合或凝胶前体聚合或胶凝之前、与聚合或凝胶前体聚合或胶凝同时或在聚合或凝胶前体聚合或胶凝之后裂解。
聚合物或凝胶网络可以是可降解的聚合物或凝胶网络，如本文所描述的，使得细胞珠粒是可降解的细胞珠粒。通过生成多个分区可以生成任意数量的细胞珠粒。在一些情况下，生成约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约10个、约50个、约100个、约500个、约1000个、约5000个、约10000个、约20000个、约50000个、约100000个或更多个细胞珠粒，从而生成多个细胞珠粒。细胞珠粒可以与条形码珠粒(例如，凝胶珠粒)一起分离以供细胞或其组分的分析。
用于细胞分析的组合物
本文公开了包括细胞珠粒的组合物，所述细胞珠粒包括聚合或交联聚合物网络，所述聚合或交联聚合物网络包括细胞或由细胞生成的裂解细胞，其中聚合或交联聚合物网络带电。细胞珠粒可以包括来自细胞的组分。组分可以是核酸。核酸可以是DNA(例如，基因组DNA)或RNA(例如，mRNA、miRNA)。组分可以是蛋白质。聚合物网络可以是带正电的。聚合物网络可以包括壳聚糖。聚合物网络可以包括PEI。聚合物网络可以是带负电的。聚合物网络可以包括藻酸盐。来自细胞的组分能够在细胞珠粒内保留约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或更长时间。来自细胞的组分能够在细胞珠粒内保留至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时或更长时间。来自细胞的组分能够在细胞珠粒内保留至多1小时、至多2小时、至多3小时、至多4小时、至多5小时、至多6小时、至多12小时、至多24小时、至多48小时或至多72小时。
本文还公开了包括细胞珠粒的组合物，所述细胞珠粒包括聚合或交联聚合物网络，所述聚合或交联聚合物网络包括细胞或由细胞生成的裂解细胞和带电物种。细胞珠粒可以包括来自所述细胞的组分。组分可以是核酸。核酸可以是DNA(例如，基因组DNA)或RNA(例如，mRNA、miRNA)。组分可以是蛋白质。带电物种可以是带正电的。带电物种可以包括三甲基铵。带电物种可以是(2-氨基乙基)三甲基铵。带电物种可以是(3-丙烯酰胺基丙基)三甲基铵。带电物种可以是带负电的。带电物种可以包括磷酸盐。来自细胞的组分能够在细胞珠粒内保留约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或更长时间。来自细胞的组分能够在细胞珠粒内保留至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时或更长时间。来自细胞的组分能够在细胞珠粒内保留至多1小时、至多2小时、至多3小时、至多4小时、至多5小时、至多6小时、至多12小时、至多24小时、至多48小时或至多72小时。
图11A示出了本公开的示例细胞珠粒，所述示例细胞珠粒包括连接到聚合物或凝胶网络的带正电的物种。细胞珠粒1101包括连接到聚合物或凝胶网络的带正电的物种1103。可以使用本文所公开的方法中的任何方法生成包括带正电的物种1103的细胞珠粒1101，所述方法包含带电聚合或凝胶前体(例如，包括带电官能团的凝胶前体)的聚合或胶凝。细胞珠粒1101还包括来自单个细胞的带负电的细胞组分1102(例如，核酸，如DNA)。带正电的物种1103与带负电的细胞组分1102相互作用，从而将带负电的细胞组分1102保留在细胞珠粒1101中。细胞珠粒1101被储存，随着时间的推移，带负电的细胞组分1102几乎没有扩散到细胞珠粒之外。
图11B示出了本公开的示例细胞珠粒，所述示例细胞珠粒包括连接到聚合物或凝胶网络的带负电的物种。细胞珠粒1111包括连接到聚合物或凝胶网络的带负电的物种1113。可以使用本文所公开的方法中的任何方法生成包括带负电的物种1113的细胞珠粒1111，所述方法包含带电聚合或凝胶前体(例如，包括带电官能团的凝胶前体)的聚合或胶凝。细胞珠粒1111还包括来自单个细胞的带正电的细胞组分1112(例如，包括净正电荷区域的蛋白质或多肽)。带负电的物种1113与带正电的细胞组分1112相互作用，从而将带正电的细胞组分1112保留在细胞珠粒1111中。细胞珠粒1111被储存，带正电的细胞组分1112几乎没有扩散到细胞珠粒之外。
图12A示出了本公开的示例细胞珠粒，所述示例细胞珠粒包括连接到可释放的化学交联剂的带正电的物种。细胞珠粒1201包括连接到可释放的化学交联剂1204(例如，二硫键)的带正电的物种1203。可以使用本文所公开的方法中的任何方法生成包括连接到可释放的化学交联剂1204的带正电的物种1203的细胞珠粒1201，所述方法包含包括连接到可释放的化学交联剂的带电官能团的凝胶前体的聚合或胶凝。在其它实施例中，通过凝胶前体的聚合或胶凝生成包括连接到可释放的化学交联剂1204的带正电的物种1203的细胞珠粒1201，然后使用交联剂将聚合或胶凝的细胞珠粒与带电官能团官能化。细胞珠粒1201还包括来自单个细胞的带负电的细胞组分1202(例如，核酸，如DNA)。带正电的物种1203与带负电的细胞组分1202相互作用，从而将带负电的细胞组分1202保留在细胞珠粒1201中。细胞珠粒1201被储存，随着时间的推移，带负电的细胞组分1202几乎没有扩散到细胞珠粒之外。
图12B示出了本公开的细胞珠粒的实例，所述细胞珠粒包括连接到可释放的化学交联剂的带负电的物种。细胞珠粒1211包括连接到可释放的化学交联剂1204(例如，二硫键)的带负电的物种1213。可以使用本文所公开的方法中的任何方法生成包括连接到可释放的化学交联剂1214的带负电的物种1213的细胞珠粒1211，所述方法包含包括连接到可释放的化学交联剂的带电官能团的凝胶前体的聚合或胶凝。在其它实施例中，通过凝胶前体的聚合或胶凝生成包括连接到可释放的化学交联剂1214的带负电的物种1213的细胞珠粒1211，然后使用交联剂将聚合或胶凝的细胞珠粒与带电官能团官能化。细胞珠粒1211还包括来自单个细胞的带正电的细胞组分1212(例如，包括净正电荷区域的蛋白质或多肽)。带负电的物种1213与带正电的细胞组分1212相互作用，从而将带正电的细胞组分1212保留在细胞珠粒1211中。细胞珠粒1211被储存，随着时间的推移，带正电的细胞组分1212几乎没有扩散到细胞珠粒之外。
本公开的带电细胞珠粒和带电水凝胶(例如，图11A-B、图12A-B)还可以包括如本文其它地方所公开的交联聚合物中的任何交联聚合物(例如，点击化学聚合物，如图8中)。
细胞珠粒
一方面，本公开提供了用于生成细胞珠粒的方法和系统，其可以用于处理来自单个细胞的不同组分。可以通过如本文所描述的方法生成细胞珠粒，例如通过在包括细胞或来自细胞的成分的分区中聚合分子前体(例如，聚合物或凝胶前体)。细胞珠粒可以包括来自细胞的一种或多种不同类型的组分，包含例如DNA(例如，gDNA、染色质等)、RNA(例如，mRNA、miRNA)、蛋白质和/或代谢物。组分可以包括在细胞珠粒中和/或连接到细胞珠粒。可以通过将细胞封装在聚合物或凝胶基质中并且在凝胶或聚合物基质中裂解细胞，在细胞被封装在聚合物或凝胶基质中时裂解细胞或裂解细胞使其成分封装在聚合物或凝胶基质中来生成细胞珠粒。聚合物或凝胶基质可以包括一种或多种被配置成与来自细胞的组分(例如，DNA、RNA、蛋白质等)相互作用的带电物种。
用于生成细胞珠粒的分区可以包括一种或多种用于进行一种或多种反应的试剂。物种可以包含例如，包含本文所描述的那些的用于核酸扩增或延伸反应的试剂(例如，引物、聚合酶、核苷酸、辅因子(例如，离子辅因子)、缓冲液等)、用于酶促反应的试剂(例如，酶、辅因子、底物、缓冲液等)、用于如聚合、连接或消化等核酸修饰反应的试剂和/或用于模板制备的试剂。
试剂可以包括用于使由点击化学反应产生的核酸损伤最小化的试剂。例如，可以将自由基清除剂添加到分区中，从而降低在点击化学反应期间生成的自由基对核酸造成损伤的风险。在一些情况下，自由基清除剂包括二甲亚砜(DMSO)。DMSO可以以防止核酸损伤的足够浓度添加到用于生成细胞珠粒的分区中。在一些实施例中，DMSO以至少约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％或更多的量添加到分区中。
分区内的一种或多种试剂可以连接到前体(例如，聚合物或凝胶前体)。试剂可以共价连接到前体。试剂可以可逆地或不可逆地连接到前体。试剂可以通过丙烯酰胺基部分连接到前体。
在一些情况下，寡核苷酸可以连接到前体。连接到前体的寡核苷酸可以用于例如捕获RNA和/或进行逆转录反应。寡核苷酸可以包括poly-T序列或poly-U序列(例如，可以是poly-T引物)。在一些实施例中，poly-T序列用于与poly-A序列杂交，例如来自细胞的mRNA。在一些实施例中，poly-U序列用于与poly-A序列杂交，例如来自细胞的mRNA。
在一些情况下，如poly-T序列等寡核苷酸可以通过不可逆的点击化学反应连接到前体(例如，聚合物)。在一些实施例中，寡核苷酸的这种点击化学连接可以在产生凝胶基质的聚合物交联期间进行。例如，如图35所描绘的，与用叠氮化物和炔烃点击化学基团修饰的聚合物一起引入乳液液滴中的炔丙基化的poly-T寡核苷酸通过CuAAC点击化学连接，导致与叠氮化物修饰的聚合物的叠氮化物修饰的接头位点中的一些叠氮化物修饰的接头位点形成1,2,3-三唑键。其它位点与炔烃修饰的聚合物形成交联，导致包括共价连接的poly-T试剂的能够捕获聚腺苷酸化的RNA转录物的凝胶基质。
用于生成细胞珠粒的分区可以包括一种或多种颗粒(例如，磁性颗粒)。分区内的一种或多种试剂可以连接到颗粒。试剂可以共价连接到颗粒。试剂可以可逆地或不可逆地连接到颗粒。试剂可以通过丙烯酰胺基部分连接到颗粒。在一些情况下，寡核苷酸可以连接到颗粒。连接到颗粒的寡核苷酸可以用于例如捕获RNA和进行逆转录反应。在一些实施例中，颗粒(其任选地为磁性颗粒)包括与其连接的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括能够与例如来自细胞的mRNA的poly-A序列杂交的poly-T序列。
分区内的细胞可以如本文所描述的被裂解，从而将成分从细胞释放到分区中。成分可以包含多种类型的细胞组分，包含蛋白质、代谢物和/或核酸分子(例如，DNA、RNA(例如，信使RNA)等)。可替代地或另外，分区内的细胞可以被透化。透化可以允许某些试剂、物种、成分等在有或没有完全细胞裂解的情况下转移进和/或转移出细胞。在一些实施例中，在细胞珠粒聚合或胶凝之前裂解或透化细胞。在其它实施例中，在细胞珠粒聚合或胶凝同时裂解或透化细胞。在一些实施例中，在细胞珠粒聚合或胶凝之后裂解或透化细胞。在仍其它实施例中，细胞在细胞珠粒中时不被裂解或透化。
试剂可以包含在分区内，包含连接到前体、颗粒等的试剂，并且可以用于对细胞或来自或源自细胞的成分进行一种或多种反应。反应可以是例如扩增、逆转录或脱氨基反应。在一些实施例中，所述一种或多种反应在细胞珠粒聚合或胶凝之前进行。在一些实施例中，所述一种或多种反应在细胞珠粒聚合或胶凝同时进行。在一些实施例中，所述一种或多种反应在细胞珠粒聚合或胶凝之后进行。在一些情况下，寡核苷酸(例如，引物)用于对来自细胞的信使RNA进行逆转录反应，从而生成互补DNA(cDNA)。逆转录可以包括向cDNA添加另外的核苷酸，例如，如polyC等多核苷酸。在一些情况下，可以进行模板切换以进一步延伸cDNA。模板切换可以将一个或多个另外的序列附加到cDNA。在一些情况下，另外的序列可以用于促进核酸延伸/扩增和/或条形码化，如本文所描述的。cDNA可以连接到前体和/或颗粒。在一些情况下，寡核苷酸用于在生成细胞珠粒之前从细胞中捕获信使RNA(例如，通过杂交)。
图13展示了用于从细胞mRNA生成cDNA并且将所述cDNA连接到聚合前体的示例方法。分区1300(例如，乳液中的水性液滴)可以包括细胞1301和连接到聚合前体1310的寡核苷酸1302。在一些实施例中，寡核苷酸1302包括poly-T序列、随机N聚体、靶向捕获/引物序列和/或如本文其它地方所描述的功能序列等任何其它另外的序列。在一些情况下，分区1300进一步包括一种或多种试剂，如用于对细胞的一种或多种组分(例如，逆转录酶、缓冲液、辅因子等)进行一种或多种反应的试剂或用于使聚合前体聚合或胶凝的试剂1310。分区1300还可以任选地包括模板切换寡核苷酸(未示出)。细胞1301被裂解或透化，从而释放或以其它方式允许接近多种类型的细胞成分，所述细胞成分包含信使RNA(mRNA)1303和基因组DNA(gDNA)1305。寡核苷酸1302可以用于进行mRNA的逆转录(RT)，从而生成与聚合前体1310连接的互补DNA(cDNA)1304。在一些情况下，可以使用模板切换寡核苷酸进行模板切换反应以例如将另外的序列附加到cDNA。包括cDNA的聚合前体1310然后可以聚合或胶凝以产生包括cDNA 1304和gDNA 1305的细胞珠粒。在一些实施例中，聚合前体1310被聚合或胶凝以形成包括mRNA 1303(其可以与寡核苷酸1302杂交)的细胞珠粒，并且在细胞珠粒中生成gDNA 1305和cDNA 1304。在一些实施例中，寡核苷酸1302通过不稳定键可释放地连接到凝胶前体1310。
图14展示了用于使用连接到磁性颗粒的寡核苷酸捕获细胞mRNA或生成cDNA的示例方法。分区1400(例如，乳液中的水性液滴)可以包括细胞1401、连接到颗粒1403(例如，珠粒或磁性颗粒)的寡核苷酸1402和聚合前体1410。在一些实施例中，寡核苷酸1402包括poly-T序列、随机N聚体、靶向捕获/引物序列和/或如本文其它地方所描述的功能序列等任何其它另外的序列。在一些情况下，分区1400进一步包括一种或多种试剂，如用于对细胞的一种或多种组分(例如，逆转录酶、缓冲液、辅因子等)进行一种或多种反应的试剂或用于使聚合前体聚合或胶凝的试剂1410。细胞1401可以被裂解或透化，从而释放或以其它方式允许接近多种类型的细胞成分，所述细胞成分包含mRNA1404和基因组DNA(gDNA)1405。然后使mRNA1404经受使其与寡核苷酸1402杂交(例如，通过poly-T序列)的条件，从而捕获mRNA。在一些实施例中，杂交的mRNA 1404被转化为cDNA。然后可以使聚合前体1410聚合或胶凝以生成细胞珠粒，所述细胞珠粒包括连接有颗粒的mRNA 1404(或cDNA)和gDNA 1405。因此，捕获的mRNA 1404(例如，与偶联到颗粒1403的寡核苷酸1402杂交)被并入到细胞珠粒中。在一些情况下，捕获的mRNA1404或cDNA可以从分区1400中纯化出来并单独处理。
在一些实施例中，分区经受足以生成包括一种或多种试剂的细胞珠粒的条件。例如，可以使包括连接到试剂(例如，引物、核酸分子等)的聚合物前体的分区液滴聚合或胶凝，使得试剂连接到聚合物或凝胶基质(即，连接到细胞珠粒)。在一些情况下，试剂通过不稳定键(例如，化学不稳定键、热不稳定键或光不稳定键)可释放地连接到凝胶前体。试剂可以共价连接到细胞珠粒。试剂可以可逆或不可逆地连接到细胞珠粒。试剂可以连接到凝胶珠粒的表面。试剂可以连接到细胞珠粒的内部。在一些情况下，mRNA连接到细胞珠粒。例如，可以使连接到来自细胞的mRNA的聚合物前体聚合或胶凝以生成细胞珠粒，使得mRNA连接到细胞珠粒。在一些情况下，cDNA连接到细胞珠粒。例如，可以使连接到源自细胞的cDNA的聚合物前体聚合以生成细胞珠粒，使得cDNA连接到细胞珠粒。在一些情况下，一种或多种寡核苷酸连接到细胞珠粒。例如，可以使连接到寡核苷酸的聚合物前体聚合或胶凝以生成细胞珠粒，使得寡核苷酸连接到细胞珠粒。
图15展示了生成包括连接到聚合物基质的试剂的细胞珠粒的实例。可以使包括连接到核酸分子1502和1503(例如，mRNA、cDNA、引物等)的聚合物前体1510的分区1500经受足以使聚合物前体聚合的条件，从而生成包括连接到聚合物基质1530的核酸分子1502和1503的细胞珠粒1511。在一些情况下，分区1550包括第一类型的聚合物前体1510和第二类型的聚合物前体1520，并且生成包括聚合物前体1510和1520的共聚物1530的细胞珠粒1511。在一些情况下，核酸分子连接到第一和/或第二聚合物前体。例如，核酸分子1502可以连接到第一类型的聚合物前体1510，并且核酸分子1503可以连接到第二类型的聚合物前体1520，并且生成包括连接到聚合物基质1540的核酸分子1502和1503的细胞珠粒1511。在一些情况下，核酸分子1502和核酸分子1503是相同的。在一些情况下，核酸分子1502和核酸分子1503是相同类型的分子(例如，mRNA或cDNA)，但可以含有不同的序列。在其它情况下，核酸分子1502和核酸分子1503是不同的。
将大分子成分(例如，核酸分子、蛋白质等)连接到细胞珠粒或细胞珠粒内的颗粒可以用于制备用于进一步处理的物种。例如，连接到细胞珠粒或颗粒的核酸分子可以在保持连接到细胞珠粒或颗粒的同时进行处理。在处理之后，核酸可以从细胞珠粒和/或颗粒释放(例如，释放到分区中)以供分析。在一些情况下，将一种类型的细胞组分或其衍生物(例如，mRNA、cDNA)连接到细胞珠粒或细胞珠粒内的颗粒，同时封装但不连接另一种类型的细胞组分(例如，基因组DNA)可能是有用的。这在例如促进多种类型的组分的单独处理方面可能是有用的。例如，在细胞珠粒形成之后，细胞珠粒可以被转移到水溶液中并且经受如本文所描述的另外的处理。例如，细胞珠粒可以批量经受逆转录以从捕获的mRNA生成cDNA(例如，与连接到细胞珠粒基质或如磁性颗粒等颗粒的寡核苷酸杂交)。
分离细胞珠粒
细胞珠粒可以与核酸条形码分子一起分离并且细胞珠粒的或源自细胞珠粒的核酸分子(例如，mRNA、cDNA、gDNA等)可以如本文其它地方所描述的带条形码。在一些实施例中，细胞珠粒与携带条形码的珠粒(例如，凝胶珠粒)共同分离并且细胞珠粒的或源自细胞珠粒的核酸分子如本文其它地方所描述的带条形码。用于生成包括细胞珠粒和核酸条形码分子的液滴的示例方法的概述示意性地描绘在图16A中。图16A中描述的方法包括三个阶段1610、1620和1630；每个相应阶段包括：(1)生成细胞珠粒(1610)；(2)细胞珠粒溶剂交换与处理(1620)；以及(3)细胞珠粒和条形码的共同分离，用于随后细胞珠粒(或源自其)的一种或多种成分的标记(例如，条形码化)(1630)。
继续参考图16A，阶段1610包括向微流体芯片1604提供油1601、聚合或凝胶前体1602和细胞或细胞核1603(例如，细胞、固定细胞、交联细胞、细胞核、透化细胞核等)用于液滴生成。聚合或凝胶前体可以如例如图11-12中所描述的带电。可以进一步向微流体芯片1604提供如本文其它地方所描述的那些等带电物种(图16A中未示出)用于共同分离。如图16B中详述的，微流体芯片1604包括多个包括油1601、聚合或凝胶前体1602和细胞1603的储器。微流体芯片1604还可以包括一个或多个包括一种或多种另外的试剂的另外的储器(未示出)。聚合或凝胶前体1602和细胞1603从它们的储器流动(例如，通过施加的力的作用，如通过真空的负压或通过泵的正压)到第一通道接合点并组合形成水流。此水流然后流动到第二通道接合点，其中提供油1601。从第一通道接合点提供的水流与油1601不混溶，导致油1605中生成水性液滴的悬浮液，所述悬浮液然后流动到储器以进行收集。可以通过任何合适的方法控制微流体芯片1604内的流动，所述方法包含在一个通道或多个通道中使用一个或多个流动调节器、定制微流体通道的尺寸等，如本文其它地方所描述的。如图16A和图16B所示出的，产品包括液滴1605，所述液滴包括来自细胞1603的细胞和聚合或凝胶前体1602。在一些情况下，液滴1625的液滴中的至少一些液滴包括单个细胞。
在一些情况下，使液滴1605经受足以裂解其中包括的细胞或细胞核的条件，从而将细胞大分子成分释放到液滴1605中。可以使大分子成分(例如，核酸、蛋白质等)经受一种或多种反应以进行另外的处理。本文其它地方更详细地描述了大分子成分的处理。在其它实施例中，使液滴1605经受足以透化细胞(或细胞核)的条件，从而促进接近细胞(或细胞核)的一种或多种大分子成分以进行进一步处理。然后使液滴1605经受适于使聚合或凝胶前体1602在液滴1605中聚合或胶凝的条件以生成细胞珠粒1606。
继续图16A，然后使液滴1605经受适于使聚合或凝胶前体1602在液滴1605中聚合或胶凝的条件，这生成封装细胞(或细胞核)1603的细胞珠粒1606。当所得细胞珠粒1606悬浮在油中时，启动阶段1620，所述阶段包括配置成将细胞珠粒1606重新悬浮在水相1611中的溶剂交换。在本文其它地方提供了关于溶剂交换的另外的细节和实例。
重新悬浮的水性细胞珠粒1611然后可以批量被任选地处理1612以制备用于分析一种或多种细胞组分的细胞珠粒。例如，在1612中，可以使细胞珠粒1611经受适于裂解或透化细胞珠粒1613中的细胞(或细胞核)的条件，从而释放或以其它方式允许接近一种或多种细胞成分(例如，核酸，如mRNA和gDNA、蛋白质等)。与细胞裂解分开或同时，还使细胞珠粒(例如，1611或1613)批量经受使源自与细胞珠粒1611相关联的细胞(例如，gDNA)的核酸变性的条件。细胞珠粒1613的聚合基质有效地阻碍或阻止如核酸和/或蛋白质等较大分子从细胞珠粒1613扩散。另外，在带电物种被引入聚合物基质的情况下，细胞珠粒的电荷(例如，正电荷)有效地防止了具有相反电荷的分子(例如，核酸)的扩散。细胞珠粒1613是足够多孔的以促进变性剂扩散到细胞珠粒基质中以接触细胞珠粒1613内的核酸。在一些情况下，然后可以使细胞珠粒(1611或1613)批量经受适于对源自与细胞珠粒(1611或1613)相关联的细胞的核酸或其它分析物进行一种或多种反应的条件。例如，可以将抗体洗入和/或洗出重新悬浮的细胞珠粒(1611或1613)。在处理1612之后，然后将所得细胞珠粒1613收集1614并且可以在阶段1630启动之前储存。
在阶段1630中，生成包括细胞珠粒(1611或1613)和条形码珠粒1622(例如，包括连接到其的核酸条形码分子的凝胶珠粒)的液滴。如图16A所示出的，向微流体芯片1623提供油1621、细胞珠粒1613和条形码珠粒1622，每个条形码珠粒都包括条形码序列(例如，每个珠粒包括唯一条形码序列)。图16C示出了示例微流体芯片1623。如图16C所示出的，微流体芯片1623包括多个包括油1621、细胞珠粒1613和条形码珠粒1622(例如，凝胶珠粒)的储器。所述芯片还包含另外的储器1627和1628，所述另外的储器可以用于提供另外的试剂(例如，用于核酸扩增的试剂、可以降解或溶解细胞珠粒和/或凝胶珠粒的试剂、降解条形码与凝胶珠粒之间的键的试剂等)。细胞珠粒1613和条形码珠粒1622从它们的储器流动(例如，通过施加的力的作用，如通过真空的负压或通过泵的正压)到第一通道接合点并形成水性混合物。还可以将来自储器1627和1628的材料提供给第一通道接合点处的水性混合物。
可替代地，细胞珠粒和凝胶珠粒可以在引入微流体芯片之前混合。在这种情况下，微流体芯片1623的单个储器包括细胞珠粒和凝胶珠粒的混合物。可以改变混合物中细胞珠粒与凝胶珠粒的比率以改变生成的包括单个细胞珠粒和单个凝胶珠粒的液滴的数量。细胞珠粒和凝胶珠粒的混合物可以(例如，通过施加的力的作用，如通过真空的负压或通过泵的正压)从储器流动到第一通道接合点，在一些情况下与来自储器1627和/或1628的材料一起。作为替代或另外，细胞可以与凝胶珠粒混合。例如，一组细胞和细胞珠粒可以与凝胶珠粒混合，或者一组细胞可以与凝胶珠粒混合。
在一些实施例中，包括细胞珠粒1613、条形码珠粒1621和在一些情况下另外的试剂的水性混合物然后流动到第二通道接合点，向所述第二通道接合点提供油1621。从第一通道接合点提供的水性混合物与油1621不混溶，导致油中生成水性液滴1625的悬浮液，所述悬浮液然后流动到储器以进行收集。微流体芯片还可以包含可以从第二通道出现的流中接受过量油的储器1629。可以通过任何合适的策略控制微流体芯片1623内的流动，包含在通道中使用一个或多个流动调节器(参见图16C和16D)或使用连接通道的一个或多个流动调节器、使用各种通道、定制通道的尺寸等。如图16A和图16C所示出的，除了由储器1627和1628提供的任何其它试剂之外，液滴1625包括细胞珠粒1613和条形码珠粒1622(例如，凝胶珠粒)。在一些情况下，液滴1625中的至少一些液滴包括单个细胞珠粒和单个条形码珠粒(例如，单个凝胶珠粒)。
在降解或溶解细胞珠粒1613、条形码珠粒1622(例如，凝胶珠粒)和/或条形码与条形码珠粒1622(例如，凝胶珠粒)之间的键的试剂存在于液滴中的情况下，这些试剂可以从细胞珠粒1613释放细胞珠粒1613中捕获的核酸和/或从条形码珠粒1622释放条形码。核酸条形码分子然后与释放的细胞组分(例如，细胞核酸)相互作用以生成用于核酸测序的条形码化核酸分子，如本文其它地方所描述的。在条形码珠粒(例如，凝胶珠粒)被降解或核酸条形码分子可释放地连接到条形码珠粒(例如，凝胶珠粒)的实施例中，条形码化细胞组分(例如，条形码化cDNA或gDNA片段)不连接到珠粒。在给定液滴包括单个细胞珠粒和包括核酸条形码分子(包括共同的条形码序列)的单个条形码化珠粒的情况下，条形码化细胞组分(或其衍生物)可以通过共同的条形码序列与给定细胞珠粒的细胞(或如细菌或病毒等其它生物样品)相关联。
图16D描绘了两个示例微流体反应，所述示例微流体反应表明了使用图16A的方法和图16B和16C中描绘的微流体装置生成包括细胞珠粒和凝胶珠粒的液滴1625。图16D(图A)示出了包括细胞珠粒和凝胶珠粒的液滴，而图16D(图B)示出了包括包含磁性材料(例如，磁性颗粒)和凝胶珠粒的细胞珠粒的液滴。
包括与条形码分子相关联的条形码珠粒(例如，凝胶珠粒)和封装如细胞核酸等细胞成分的珠粒(例如，细胞珠粒)的分区可以用于成分分析，如美国专利公开号2018/0216162中所描述的，所述美国专利出于所有目的通过引用整体并入本文。图17示意性地描绘了包括条形码珠粒和细胞珠粒的分区的生成。在操作1701中通过将细胞封装在聚合物基质中以形成细胞珠粒来生成细胞珠粒。然后在操作1702中裂解细胞，使得核酸和细胞的其它成分从细胞中释放出来并且被细胞珠粒聚合物基质截留。然后在操作1703中在适于例如消化蛋白质和/或使核酸(例如，通过碱性试剂)变性的条件下处理细胞珠粒。然后可以洗涤和分离细胞珠粒以供进一步处理。
计算机系统
本公开提供了被编程为实施本公开的方法的计算机系统。图18示出了计算机系统1801，所述计算机系统被编程或以其它方式配置成(i)在液滴形成期间控制微流体系统，例如在不同通道处添加每种组分的速率，(ii)控制液滴内部点击化学反应的反应条件和(iii)进行测序应用。计算机系统1801可以调节本公开的各个方面，例如调节添加各种试剂例如还原剂的速率，以及在形成液滴时调节微流体结构中一个或多个通道中的流体流速。计算机系统1801可以是用户的电子装置或相对于电子装置远程定位的计算机系统。电子装置可以是移动电子装置。
计算机系统1801包含中央处理单元(CPU，本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)1805，所述中央处理单元可以是单核或多核处理器或用于并行处理的多个处理器。计算机系统1801还包含存储器或存储器位置1810(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存)、电子存储单元1815(例如，硬盘)、用于与一个或多个其它系统通信的通信接口1820(例如，网络适配器)以及外围装置1825，如高速缓存、其它存储器、数据存储设备和/或电子显示适配器。存储器1810、存储单元1815、接口1820和外围装置1825通过如母板等通信总线(实线)与CPU 1805通信。存储单元1815可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机系统1801可以借助于通信接口1820可操作地耦接到计算机网络(“网络”)1830。网络1830可以是英特网、互联网和/或外联网或与英特网通信的内联网和/或外联网。网络1830在一些情况下是电信网络和/或数据网络。网络1830可以包含一个或多个计算机服务器，所述一个或多个计算机服务器可以实现如云计算等分布式计算。在一些情况下，网络1830借助于计算机系统1801可以实施对等网络，所述对等网络可以实现将装置耦接到计算机系统1801以充当客户端或服务器。
CPU 1805可以执行一系列机器可读指令，所述一系列机器可读指令可以体现在程序或软件中。指令可以存储在如存储器1810等存储器位置中。指令可以涉及CPU 1805，所述指令可以随后编程或以其它方式配置CPU 1805以实施本公开的方法。由CPU 1805执行的操作的实例可以包含取得、解码、执行和回写。
CPU 1805可以是如集成电路等电路的一部分。系统1801的一个或多个其它组件可以包含在电路中。在一些情况下，电路是专用集成电路(ASIC)。
存储单元1815可以存储文件，如驱动程序、库和保存的程序。存储单元1815可以存储用户数据，例如用户偏好和用户程序。计算机系统1801在一些情况下可以包含一个或多个另外的数据存储单元，所述一个或多个另外的数据存储单元位于计算机系统1801外部，如定位在通过内联网或因特网与计算机系统1801通信的远程服务器上。
计算机系统1801可以通过网络1830与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统1801可以与用户(例如，操作者)的远程计算机系统通信。远程计算机系统的实例包含个人计算机(例如，便携式PC)、平板或平板PC(例如，
Figure BDA0003366638640000681
iPad、
Figure BDA0003366638640000682
GalaxyTab)、电话、智能电话(例如，
Figure BDA0003366638640000683
iPhone、安卓使能的装置、
Figure BDA0003366638640000684
)或个人数字助理。用户可以通过网络1830访问计算机系统1801。
可以通过存储在计算机系统1801的电子存储位置上(例如存储器1810或电子存储单元1815上)的机器(例如，计算机处理器)可执行代码实施如本文所描述的方法。机器可执行或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用期间，代码可以由处理器1805执行。在一些情况下，代码可以从存储单元1815中检索并且存储在存储器1810上以供由处理器1805随时访问。在一些情形下，可以排除电子存储单元1815，并且在存储器1810上存储机器可执行指令。
代码可以被预先编译和被配置成用于与具有被适配成执行代码的处理器的机器一起使用，或可以在运行期间进行编译。代码可以以编程语言供应，可以选择所述编程语言以实现以预先编译或类编译(as-compiled)的方式执行代码。
本文提供的如计算机系统901等系统和方法的各方面可以体现在编程中。技术的各个方面可以被视为通常呈机器(或处理器)可执行代码和/或相关联的数据形式的“产品”或“制品”，所述机器可执行代码和/或相关联的数据在一种类型的机器可读介质上进行或体现在所述一种类型的机器可读介质中。机器可执行代码可以存储在如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪存)或硬盘等电子存储单元上。“存储”类型介质可以包含计算机、处理器等的任何或全部有形存储器或其相关联的模块，如可以在任何时间为软件编程提供非暂时性存储的各种半导体存储器、磁带驱动、硬盘驱动等。软件的全部或部分有时可以通过因特网或各种其它电信网络通信。此类通信例如可以实现将软件从一个计算机或处理器加载到另一个计算机或处理器中，例如从管理服务器或主机计算机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可以承载软件元素的另一种类型的介质包含如通过有线和光学陆地线网络以及在各个空中链路之上跨本地装置之间的物理接口使用的光波、电波和电磁波。如有线或无线链路、光学链路等的承载此类波的物理元素还可以被视为承载软件的介质。如本文所使用的，除非限制为非暂时性、有形“存储”介质，否则如计算机或机器“可读介质”等术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
因此，如计算机可执行代码等机器可读介质可以采取许多形式，包含但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包含例如光盘或磁盘，如任何计算机中的存储装置中的任何存储装置等，如可以用于实施附图中示出的数据库等的任何存储装置。易失性存储介质包含动态存储器，如此类计算机平台的主存储器。有形传输介质包含同轴电缆；铜线和光纤光学器件，包含在计算机系统内包括总线的导线。载波传输介质可以采用电信号或电磁信号的形式，或声波或光波的形式，如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间生成的那些。因此，计算机可读介质的常见形式包含例如：软盘、软磁盘、硬盘、磁带、任何其它磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其它光学介质、穿孔卡、纸带、任何其它带有孔图案的物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、闪速-EPROM、任何其它存储器芯片或存储器盒、承载数据或指令的载波、承载此类载波的电缆或链路、或计算机可以从其读取程序代码和/或数据的任何其它介质。计算机可读介质的这些形式中的许多形式可以涉及将一个或多个指令的一个或多个序列承载到处理器以供执行。
计算机系统1801可以包含电子显示器1835或者与所述电子显示器通信，所述电子显示器包括用于提供例如水凝胶形成的程度和水凝胶的溶胀比的户界面(UI)1840。UI的实例包含但不限于图形用户界面(GUI)和基于web的用户界面。
本公开的方法和系统可以通过一个或多个算法来实施。算法可以在由中央处理单元1805执行时通过软件实施。所述算法可以例如进行测序，并且根据某些反应的程度调节各种试剂的添加。
本公开的装置、系统、组合物和方法可以用于各种应用，例如处理单个分析物(例如，RNA、DNA或蛋白质)或多种分析物(例如，DNA和RNA、DNA和蛋白质、RNA和蛋白质或RNA、DNA和蛋白质)形成单个细胞。例如，在分区(例如，液滴)中分离生物颗粒(例如，细胞或细胞珠粒)，并且来自生物颗粒的多种分析物被处理以供后续处理。所述多种分析物可以来自单个细胞。例如，这可以实现细胞的同时蛋白质组学、转录组学和基因组分析。
实例1：具有点击化学部分的单体和聚合物的合成
在一些情况下，羧酸基团被引入聚合物中作为锚来连接点击化学部分/前体。如方案3所示出的，含酸聚合物1C可以通过单体1A与单体1B在存在引发剂的情况下反应制备。整数m和n大于1。
方案3
Figure BDA0003366638640000701
当在存在约1.6M NaF(NaF:总单体的比率为约1:1)和热引发剂(例如，2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐，来自和光公司(Wako)的VA-044，约0.1wt％)的情况下在约30℃到约50℃的温度下使用相对于单体1A约1wt％的单体1B时，可以获得数均摩尔质量(Mn)为约156K的聚合物，其中多分散指数(MW/Mn)为约1.786。
根据方案4A，聚合物1C可以与炔丙基胺1D偶联以得到聚合物1E，其可以带有多个点击化学部分(炔烃)。偶联剂可以是由酸和胺形成酰胺键的任何偶联剂。例如，EDCI、HOBt或HATU。反应可以在受控pH下进行，例如约pH 5.0到约pH 9.0、约pH 6.0到约pH 8.0、约pH6.5到约pH 7.5、约pH 5.0、约pH 5.5、约pH 6.0、约pH 6.5、约pH 7.0、约pH 7.5、约pH 8.0、约pH 8.5或约pH 9.0。
方案4A
Figure BDA0003366638640000711
可替代地，聚合物1E可以由单体1A和单体1F在方案5所示出的聚合反应中形成。单体1F可以在存在偶联剂的情况下通过单体1A与炔丙胺1D之间的偶联反应形成，所述偶联剂类似于方案4中使用的偶联试剂。在一些情况下，在存在约0.1wt％的AIBN和1.2M的NaF的情况下，在30℃下，相对于单体1A约1.5wt％的单体1F可以形成聚合物1E。
方案5
Figure BDA0003366638640000712
含叠氮化物的聚合物的合成也可以采用至少两种不同的途径。类似于含炔丙基聚合物的方案4A的一种途径是使用酰胺偶联剂将聚合物1C的羧酸偶联到带有叠氮化物官能团的伯胺1DD，以提供含叠氮化物的聚合物1EE，如方案4B所示出的。
方案4B
Figure BDA0003366638640000721
可替代地，带有叠氮化物官能团的伯胺可以是对叠氮基吡啶甲基化合物1DP，其可以使用酰胺偶联剂偶联到聚合物1C以提供含对叠氮基吡啶甲基的聚合物1EF，如方案4C所示出的。
方案4C
Figure BDA0003366638640000722
如图29所描绘和本文其它地方所描述的，对叠氮基吡啶甲基官能团能够螯合Cu(I)/Cu(II)，从而促进叠氮基吡啶甲基与对应炔烃接头之间的铜催化的点击化学交联，其中存在铜离子浓度显著较低。如实例11中所表明的，使用较低的铜浓度导致改进的生物相容性(例如，减少的RNA降解)，这极大地改进了在存在这些交联聚合物的情况下进行的基因表达分析和其它生物测定。
此外，如本文其它地方所描述的，在一些实施例中，聚合物的交联可以使用无铜点击化学反应进行。例如，可以使用无铜应变促进的叠氮化物-炔烃点击化学反应(SPAAC)(参见例如《化学通讯》,2011,47:6257-6259和《自然》,2015,519(7544):486-90)，其中叠氮化物修饰的接头与二苯并环辛炔-胺(DBCO)修饰的接头反应以形成如图30所示出的点击化学键。连接到聚丙烯酰胺聚合物的叠氮化物修饰的接头1EE可以如上文方案4B中所描述的使用。
连接到聚丙烯酰胺1EG的DBCO修饰的接头可以使用磺化DBCO-类似物1DG来制备，如方案4D所示出的。
方案4D
Figure BDA0003366638640000731
另一种途径是将单体1A与含叠氮化物的丙烯酰胺聚合。两种合成的共同点可以是胺试剂1H，如方案6所示出的。胺试剂1H可以与聚合物1C偶联以得到含叠氮化物的聚合物1J。另外，胺试剂1H可以与丙烯酰氯偶联以产生单体1I，所述单体可以与单体1A聚合以得到含叠氮基团的聚合物1J。
方案6
Figure BDA0003366638640000732
可以如方案7A所示出的合成含炔丙基的单体1M。炔丙醇可以与羰基-二咪唑反应以得到炔丙基化剂1K。胱胺1L与炔丙基化剂1K的单炔丙基化可以提供单炔丙基化胱胺1KL，其可以在游离胺上进一步酰化以提供二硫键连接的炔丙基化单体1M。单体1M是可降解的含炔烃单体。
方案7A
Figure BDA0003366638640000741
可替代地，可以如方案7B中所示出的合成不包含二硫键的含炔丙基单体1Q。然而，单体1Q含有不稳定的氨基甲酸酯键。如本文其它地方所描述的，单体1Q可以用于形成在存在DTT的情况下不降解但可以在存在DETA和热量的情况下选择性地降解的交联聚合物。
方案7B
Figure BDA0003366638640000751
方案7B的合成基本上与方案7A相同，然而试剂1,6-二己胺1R而不是胱胺1L与炔丙基化剂1K反应以提供单炔丙基化己胺氨基甲酸酯1KR。然后可以将1KR的游离胺进一步酰化以提供氨基甲酸酯连接的炔丙基化单体1Q。
含叠氮化物的单体1N可以由对叠氮苯胺通过酰化制备，如方案8所示出的。
方案8
Figure BDA0003366638640000752
单体1M、1N中的每一个单体可以与单体1A进行聚合以产生带有点击化学部分的对应聚合物。
实验1：制备油相中的铜(II)试剂。
1)铜(II)盐的悬浮液。在室温下，将约2.50mM Krytox-COOH和约1.25mM Cu(OAc)2在HFE-7500中搅拌约48小时。
2)制备GB油。可以通过将约2.50mM双-Krytox-乙二醇-聚合物(Krytox-PEG-Krytox或BKEP或式I)和约0.25mM Krytox在溶剂HFE-7500工程化油中混合来制备GB油。可以批量预先调配GB油。
3)制备油相溶液CB油。铜(II)盐的悬浮液和GB油可以v/v＝1:1的比率组合在一起，并且可以将所得混合物在室温下搅拌约1小时，并且通过0.22μm PES过滤器过滤以去除不溶性铜(II)盐。滤液是包括含1.25mM BKEP、约1.375mM Krytox-COOH和约0.625mM铜(II)的HFE-7500的CB油。可以使用UV-vis吸收光谱法(最大吸收波长在约286nm处)分析水层中铜(II)的浓度。
实验2：制备水相溶液。
可以通过在水中混合含叠氮化物和含炔烃的聚合物的聚合物对(3.5w/v％)、F-108(0.5w/v％)、磁性颗粒(0.12w/v％)、THPTA(0.25mM)来制备水相溶液的储备溶液1。
可以通过在水中混合含叠氮化物和含炔烃的聚合物的聚合物对(3.5w/v％)、F-108(0.5w/v％)、磁性颗粒(0.12w/v％)、THPTA(0.25mM)和抗坏血酸钠(156mM)来制备水相溶液的储备溶液2。
实验3：在不存在细胞的情况下的点击化学和胶凝。
为了制备离散液滴的乳液，可以采用类似于图7中描绘的设备设置的设备设置。具体地，储备溶液1(30μL，来自实验2)可以通过通道701馈送；储备溶液2(40μL，来自实验2)可以通过通道702馈送；并且CB油(200μL，来自实验1)可以通过通道704馈送。可以在收集孔中获得液滴的油包水乳液的集合。液滴的乳液可以在孔(带盖)中保持约60分钟。随后的溶剂交换可以将油相转化为水相。胶凝可以在肉眼和显微镜下观察到。凝胶的溶胀比可以通过在显微镜下比较水相中的单分散(100分钟)和NaOH相中的单分散(5分钟)之间的大小数据来测量。
实验4：在存在细胞的情况下的点击化学和胶凝。
为了制备离散液滴的乳液，可以采用类似于图7中描绘的设备设置的设备设置。具体地，储备溶液1(30μL，来自实验2)可以通过通道701馈送；储备溶液2(40μL，来自实验2)和细胞(100个细胞/μL)可以通过通道702馈送；并且CB油(200μL，来自实验1)可以通过通道704馈送。可以在收集孔中获得液滴的油包水乳液的集合。液滴的乳液可以在孔(带盖)中保持约60分钟。随后的溶剂交换可以将油相转化为水相(5mM EDTA)。凝胶可以用磷酸盐缓冲盐水洗涤(3×)。可以观察到胶凝。可以在显微镜下观察到单个细胞捕获的凝胶(例如，图19)。凝胶的溶胀比可以通过比较油相中的单分散液滴(100分钟)和水相中的单分散珠粒(5分钟)之间的大小数据来测量。
实验5：使用AIBN作为引发剂的聚合
连接有点击化学前体的共聚物聚(丙烯酰胺)可以如下通过自由基溶液聚合合成：丙烯酰胺单体(50mmol，丙烯酰胺和其包括点击化学部分的衍生物的混合物)、NaF(1.6M)和2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(VA-044，0.05mmol)可以溶解于水。可以将混合物用氮气鼓泡半小时，并且经受30℃到40℃，持续24小时。冷却到室温后，可以基于其在水性溶剂相对于有机溶剂(己烷、EtOAc和EtOH等)中的溶解度来获得所需产物。
实例2：炔丙基化单体和共聚物的合成
可以如方案9所示出的合成含炔丙基的单体2D。炔丙醇与羰基-二咪唑反应以得到炔丙基化剂2A，如所示出的。胱胺2B与炔丙基化剂2A的单炔丙基化提供单炔丙基化胱胺2C，其在游离胺上进一步酰化以提供二硫键连接的炔丙基化单体2D。单体2D是可降解的含炔烃单体。
方案9
Figure BDA0003366638640000771
连接有点击化学前体的共聚物如下通过自由基溶液聚合合成(参见方案10和方案11)。
对于第一共聚物，丙烯酰胺单体(50mmol，丙烯酰胺和单体2D的混合物)、NaF(1.6M)和2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(AIBN，0.05mmol)溶解于水中。将混合物用氮气鼓泡30分钟，然后经受30℃到40℃，持续24小时。冷却到室温后，基于其在水性溶剂相对于有机溶剂(己烷、EtOAc、EtOH等)中的溶解度来获得所需产物。
方案10
Figure BDA0003366638640000781
对于第二共聚物，将聚(丙烯酰胺)聚合物和DMTMM溶解于水中，并且用NaOH将pH校正为7.5。添加3-叠氮基-1-丙胺，并且将溶液在室温避光搅拌约16小时。将产物通过透析纯化并冻干以得到呈白色固体的目标共聚物。
方案11
Figure BDA0003366638640000782
实例3：使用通过点击化学生成的细胞珠粒进行单个细胞DNA测序
如实例2中所描述的进行叠氮化物和炔烃聚合物的合成。
制备油相中的铜(II)试剂
1)铜(II)盐的悬浮液。在室温下，将约1.375mM Krytox-COOH和约1.25mM Cu(OAc)2在HFE-7500中搅拌约48小时。
2)制备GB油。通过将约2.50mM双-Krytox-乙二醇-聚合物(Krytox-PEG-Krytox或BKEP或式I)和约0.25mM Krytox在溶剂HFE-7500工程化油中混合来制备GB油。批量预先调配GB油。
3)制备油相溶液CB油。铜(II)盐的悬浮液和GB油以v/v＝1:1的比率组合在一起，并且将所得混合物在室温下搅拌约1小时，并且通过0.22μm PES过滤器过滤以去除不溶性铜(II)盐。滤液是包括含1.25mM BKEP、约1.375mM Krytox-COOH和约0.625mM铜(II)的HFE-7500的CB油。
制备水相溶液
通过在水中混合含叠氮化物(1.75w/v％)和含炔烃的聚合物(1.75w/v％)的聚合物对、F-108(0.5w/v％)、磁性颗粒(如表2所指示的)、含THPTA(1.00mM)的水、抗坏血酸钠(10.00mM)和任选地DMSO(如表2所指示的)来制备包括抗坏血酸钠的储备溶液。针对每种样品类型生成了不含抗坏血酸钠的对应储备溶液，用于细胞珠粒生成(参见下文)。
表2
Figure BDA0003366638640000791
在存在细胞的情况下的点击化学和胶凝
为了制备离散液滴的乳液，可以采用类似于图7中描绘的设备设置的设备设置。具体地，含有抗坏血酸钠(60μL)和BJ细胞
Figure BDA0003366638640000792
的储备溶液通过第一通道(例如，701)馈送；不含抗坏血酸钠的对应储备溶液(40μL)通过第二通道(例如，702)馈送；并且无铜油(270μL)通过第三通道(例如，704)馈送。在收集孔中获得液滴的油包水乳液的集合。液滴的乳液在孔(带盖)中保持约15分钟，其中以1000rpm振荡。然后，添加CB油至最终铜浓度为0.9mM。液滴的乳液在孔中另外保持45分钟，其中以1000rpm振荡。随后的溶剂交换用于将油相转化为水相(5mM EDTA)。将凝胶在磷酸盐缓冲盐水(3×)中洗涤，从而生成细胞珠粒。胶凝在肉眼和显微镜下观察到。
DNA测序
处理所得细胞珠粒用于DNA测序，如本文其它地方所描述的。简而言之，将细胞珠粒分离成带条形码珠粒的液滴，裂解并且使来自细胞的DNA带条形码。分离所得条形码化DNA并且经受核酸测序。对每个样品的核酸测序结果进行分析，并且与最佳细胞珠粒性能的目标规格进行比较。表3中示出了此分析结果。
表3
Figure BDA0003366638640000801
图20示出了来自一个样品AN400_0.06_DMSO的测序结果，表明了使用这些条件的高质量测序结果。
实例4：细胞定心
如实例2中所描述的进行叠氮化物和炔烃聚合物的合成。
制备油相中的铜(II)试剂
1)铜(II)盐的悬浮液。在室温下，将约1.375mM Krytox-COOH和约1.25mM Cu(OAc)2在HFE-7500中搅拌约48小时。
2)制备GB油。通过将约2.50mM双-Krytox-乙二醇-聚合物(Krytox-PEG-Krytox或BKEP或式I)和约0.25mM Krytox在溶剂HFE-7500工程化油中混合来制备GB油。批量预先调配GB油。
3)制备油相溶液CB油。铜(II)盐的悬浮液和GB油以v/v＝1:1的比率组合在一起，并且将所得混合物在室温下搅拌约1小时，并且通过0.22μm PES过滤器过滤以去除不溶性铜(II)盐。滤液是包括含1.25mM BKEP、约1.375mM Krytox-COOH和约0.625mM铜(II)的HFE-7500的CB油。
制备水相溶液
通过在水中混合含叠氮化物(1.75w/v％)和含炔烃的聚合物(1.75w/v％)的聚合物对、F-108(0.5w/v％)、磁性颗粒(0.12w/v％)、含THPTA(1.00mM)的水和抗坏血酸钠(150.00mM)来制备包括抗坏血酸钠的储备溶液。针对每种样品类型生成了不含抗坏血酸钠的对应储备溶液，用于细胞珠粒生成(参见下文)。
在存在细胞的情况下的点击化学和胶凝
为了制备离散液滴的乳液，可以采用类似于图7中描绘的设备设置的设备设置。具体地，含有抗坏血酸钠(60μL)和从受试者获得的外周血单核细胞(PBMC)的储备溶液通过第一通道(例如，701)馈送；不含抗坏血酸钠的对应储备溶液(40μL)通过第二通道(例如，702)馈送；并且无铜油(270μL)通过第三通道(例如，704)馈送。在收集孔中获得液滴的油包水乳液的集合。液滴的乳液被分成两组孔并且通过图21A所示出的工作流程进行处理。将一组乳液覆盖约15分钟，其中以1000rpm振荡以促进细胞定心。将第二组覆盖约15分钟，没有振荡。然后，添加CB油至最终铜浓度为0.625mM。液滴的乳液在孔中另外保持45分钟，其中以1000rpm振荡。随后的溶剂交换用于将油相转化为水相(5mM EDTA)。将凝胶在磷酸盐缓冲盐水(3×)中洗涤，从而生成细胞珠粒。胶凝在肉眼和显微镜下观察到。
核染色和成像
将细胞珠粒用
Figure BDA0003366638640000811
核染色进行染色，并且使用荧光显微镜成像。图21B(未定心)和21C(定心)示出了成像结果。图22示出了细胞定心分析的结果，表明与未进行定心程序的乳液相比，进行定心程序(振荡)的乳液生成更多数量的细胞珠粒，细胞靠近珠粒的中心。
实例5：细胞珠粒生成参数影响DNA降解
生成了包括叠氮化物和包括炔烃聚合物、λDNA和图23中所指示的另外的组分的乳液。如以150mM提供的抗坏血酸钠。每个都是使用无铜油生成的。通过定量PCR(qPCR)测量每个的λDNA浓度。这些结果指示，在存在顺磁性颗粒(PMP)和抗坏血酸钠(Na Asc)的情况下，由于DNA降解，λDNA浓度降低。从条件中去除PMP会消除DNA降解。
实例6：DMSO添加和/或PMP选择影响DNA降解
生成了包括叠氮化物和包括炔烃聚合物、DNA和图24中所指示的另外的组分的乳液。每个都是使用含铜油生成的。以10mM提供抗坏血酸钠。测试了两种不同的PMP；SpheroTM羧基磁性颗粒(Sphero)，其包括围绕聚苯乙烯核的氧化铁涂层，以及Dynabeads磁性珠粒(Dyna)，其包括被外层聚合物涂层包围的氧化铁核，每个都在不同浓度的DMSO中，如图24所指示的。这些结果指示使用Dynabeads和添加至少5％DMSO可以防止DNA降解。
实例7：使用CuAcAc生成细胞珠粒
在不同参数下测试了使用六氟乙酰丙酮铜(II)(CuAcAc)作为点击化学介导的细胞珠粒生成的铜源。
图25A示出了使用10mM到200mM范围内的不同抗坏血酸钠(Na Asc)浓度生成细胞珠粒的结果。使用以下参数如本文所描述的生成细胞珠粒：1mM THPTA、1mM CuAcAc和2.5mMKmPEG油。这些结果表明，在这些条件下，100mM的抗坏血酸钠提供最佳的细胞珠粒生成。
图25B示出了使用0分钟到过夜(ON)范围内的不同的胶凝时间生成细胞珠粒的结果。使用以下参数如本文所描述的生成细胞珠粒：1mM THPTA、1mM CuAcAc、2.5mM KmPEG油和100mM抗坏血酸钠。这些结果表明，在这些条件下，60分钟的胶凝时间是实现最佳的细胞珠粒生成所需的最短时间。
图25C示出了使用0.5mM到8mM范围内的不同THPTA浓度生成细胞珠粒的结果。使用以下参数如本文所描述的生成细胞珠粒：1mM CuAcAc、2.5mM KmPEG油和20mM抗坏血酸钠。这些结果表明，在这些条件下，5mM的THPTA提供最佳的细胞珠粒生成。
图25D示出了使用2.5mM到100mM范围内的不同抗坏血酸钠(Na Asc)浓度生成细胞珠粒的结果。使用以下参数如本文所描述的生成细胞珠粒：5mM THPTA、1mM CuAcAc和2.5mMKmPEG油。这些结果表明，在这些条件下，50mM的抗坏血酸钠提供最佳的细胞珠粒生成。
图26A示出了使用0.3125mM到3.75mM范围内的不同CuAcAc浓度生成细胞珠粒的结果。使用以下参数如本文所描述的生成细胞珠粒：5mM THPTA、2.5mM KmPEG油和20mM抗坏血酸钠。这些结果表明，在这些条件下，1mM的CuAcAc提供最佳的细胞珠粒生成。
图26B示出了使用0分钟到过夜(ON)范围内的不同的胶凝时间生成细胞珠粒的结果。使用以下参数如本文所描述的生成细胞珠粒：5mM THPTA、1mM CuAcAc、2.5mM KmPEG油和50mM抗坏血酸钠。这些结果表明，在这些条件下，15分钟的胶凝时间是实现最佳的细胞珠粒生成所需的最短时间。
表4示出了鉴定为使用CuAcAc，仅需要15分钟的胶凝时间生成细胞珠粒的最佳参数。
表4
组分 最终浓度
叠氮化物聚合物混合物 1.75w/v％
炔烃聚合物混合物 1.75w/v％
F-108 0.50w/v％
磁性颗粒(PMP) 0.12w/v％
配体(THPTA) 5.00mM
还原剂(Na Asc)。 50.00mM
添加剂(DMSO) 5v/v％
实例8：使用Cu2OAc生成细胞珠粒
在不同参数下测试了使用乙酸铜(Cu2OAc)作为点击化学介导的细胞珠粒生成的铜源。
图27A示出了使用0.05mM到8mM范围内的不同THPTA浓度生成细胞珠粒的结果。使用以下参数如本文所描述的生成细胞珠粒：5mM抗坏血酸钠、0.625mM Cu2OAc和2.5mMKmPEG油。这些结果表明，在这些条件下，1mM的THPTA提供最佳的细胞珠粒生成。对于0.05mM、5mM和8mM的THPA浓度，未观察到胶凝。
图27B示出了使用2.5mM到100mM范围内的不同抗坏血酸钠(Na Asc)浓度生成细胞珠粒的结果。使用以下参数如本文所描述的生成细胞珠粒：1mM THPTA、0.625mM Cu2OAc和2.5mM KmPEG油。这些结果表明，在这些条件下，50mM的抗坏血酸钠提供最佳的细胞珠粒生成。
图27C示出了使用2.5mM到100mM范围内的不同抗坏血酸钠(Na Asc)浓度生成细胞珠粒的结果。使用以下参数如本文所描述的生成细胞珠粒：1mM THPTA、1mM Cu2OAc和2.5mMKmPEG油。这些结果表明，在这些条件下，20mM的抗坏血酸钠提供最佳的细胞珠粒生成。
图27D示出了使用2.5mM到100mM范围内的不同抗坏血酸钠(Na Asc)浓度生成细胞珠粒的结果。使用以下参数如本文所描述的生成细胞珠粒：1mM THPTA、2mM Cu2OAc和2.5mMKmPEG油。这些结果表明，在这些条件下，20mM的抗坏血酸钠提供最佳的细胞珠粒生成。
图28A示出了使用0.025mM到5mM范围内的THPTA浓度生成细胞珠粒的结果。使用以下参数如本文所描述的生成细胞珠粒：2mM Cu2OAc、20mM抗坏血酸钠和2.5mM KmPEG油。这些结果表明，在这些条件下，1mM的THPTA提供最佳的细胞珠粒生成。
图28B示出了使用0分钟到过夜(ON)范围内的不同的胶凝时间生成细胞珠粒的结果。使用以下参数如本文所描述的生成细胞珠粒：1mM THPTA、2mM Cu2OAc、2.5mM KmPEG油和20mM抗坏血酸钠。这些结果表明，在这些条件下，30分钟的胶凝时间是实现最佳的细胞珠粒生成所需的最短时间。
表5示出了鉴定为使用Cu2OAc，仅需要30分钟的胶凝时间生成细胞珠粒的最佳参数。
表5
组分 最终浓度
叠氮化物聚合物混合物 1.75w/v％
炔烃聚合物混合物 1.75w/v％
F-108 0.50w/v％
磁性颗粒(PMP) 0.12w/v％
配体(THPTA) 1.00mM
还原剂(Na Asc)。 20.00mM
添加剂(DMSO) 5v/v％
实例9：生成铜纳米颗粒/细胞复合物
从美国研究纳米材料公司(US Research Nanomaterials Inc.)获得铜纳米颗粒(CuNP)。将10mg CuNP悬浮在1mL完全细胞培养基中。将CuNP超声处理2分钟，然后涡旋10分钟。将10mL完全细胞培养基添加到CuNP悬浮液中，并且以150g离心5分钟以去除大颗粒。收集上清液，并且以1000g离心5分钟。丢弃上清液，并且将沉淀物重新悬浮于1mL完全细胞培养基中。将所得CuNP悬浮液在浴式超声仪中超声处理30分钟。
接下来，将细胞以每mL 107个细胞重新悬浮于完全细胞培养基中。将1mL的CuNP分散体添加到细胞悬浮液中，并且在4℃下温育15分钟。然后，将混合物在4℃下以50g离心5分钟，轻轻混合，并且使用相同的条件再次离心。将细胞沉淀物用10mL完全细胞培养基洗涤两次，在4℃下以20g离心，并且每次洗涤后去除上清液。最后，将CuNP/细胞混合物重新悬浮于500μL完全培养基中以生成细胞珠粒。
实例10：用于细胞珠粒生成的铜纳米颗粒的用途
CuNP/细胞混合物连同用于细胞珠粒生成的聚合物被分离成如本文所描述的液滴。包括细胞/CuNP复合物的液滴中的聚合物通过点击化学使用CuNP作为催化剂交联，从而生成细胞珠粒。不包括细胞/CuNP复合物的液滴中的聚合物不会交联。生成细胞珠粒群体。
实例11：使用吡啶甲基聚合物生成低铜浓度细胞珠粒
此实例展示了如何使用具有铜螯合叠氮基吡啶甲基官能团的聚合物，在低铜浓度下从离散液滴的乳液中生成细胞珠粒(CB)。如图29所示意性描绘的和本文其它地方所描述的，用叠氮基-吡啶甲基官能团修饰的接头可以与炔烃修饰的接头进行铜催化的点击反应以形成包括1,2,3-三唑点击化学键的交联。进一步地，叠氮基-吡啶甲基官能团螯合铜离子的能力有效地提高了铜催化的点击反应位点处的铜浓度。反应位点处有效铜浓度的这种增加允许降低反应中的总铜浓度而不损失交联效率。细胞珠粒生成过程中总铜浓度的降低显著提高了生物相容性，例如RNA组分的降解。
根据实例3中描述的方法从离散液滴的乳液生成两组CB。一组CB包含具有叠氮基-吡啶甲基官能团的聚合物，而另一组有具有标准叠氮化物官能团的聚合物。两组CB的生成是通过铜催化的点击化学在0.0625mM到0.625mM的铜浓度范围内进行的。通过显微镜确定在不同铜浓度条件下生成的CB的大小。
如图31A所示出的，在使用吡啶甲基聚合物形成的CB和使用标准非吡啶甲基聚合物形成的CB中观察到显著差异。在将Cu浓度降低一半(从0.625mM到0.3125mM)时，吡啶甲基聚合物CB的溶胀比(SR)展现没有变化。此外，使用0.0625mM的Cu浓度在37C的油中仅30分钟可以生成吡啶甲基聚合物CB，并且展现SR仅从0.70小幅增加到0.81。相比之下，在0.0625mM的Cu浓度下无法生成非吡啶甲基聚合物CB，并且甚至Cu浓度从0.625mM降低到0.3125mM导致CB溶胀比从0.70显著增加到1.07。
进行了进一步的实验，其中CB是从含有GM12878细胞的分散在聚合物混合物中的液滴的乳液生成的，所述聚合物混合物含有在低Cu浓度(0.15mM或0.20mM)下具有叠氮基-吡啶甲基官能团的聚合物或在较高Cu浓度(0.625mM)下具有叠氮基-烷基(即，非吡啶甲基)官能团的聚合物。对于含有吡啶甲基或非吡啶甲基聚合物的液滴，液滴内的胶凝在室温下在以下条件下进行45分钟：(a)吡啶甲基聚合物：0.15mM Cu、8mM抗坏血酸钠；或0.20mM Cu、10mM抗坏血酸钠；(b)非吡啶甲基聚合物：0.625mM Cu、10mM抗坏血酸钠。胶凝后，破坏乳液，并且将所得CB在PBS中洗涤两次，然后通过离心包装。将等量的不同组CB(取决于铜浓度)添加到3'RT混合物中，并且执行标准的“单个细胞3'v2”方案以生成cDNA产品(美国加利福尼亚州普莱森顿的10x Genomics公司(10x Genomics,Pleasanton,CA,USA))。3'RT混合物中的DTT用于降解水凝胶基质的二硫化物交联，从而溶解CB。
如图31B所描绘的结果示出的，在通过点击化学交联具有叠氮基-吡啶甲基官能团的聚合物和较低铜浓度(0.15mM或0.2mM)形成的CB中，相对于细胞对照，检测到约～95％的基因和～94％的唯一分子标识符(UMI)。相比之下，在使用非吡啶甲基聚合物和较高铜浓度(0.625mM)形成的CB中，相对于细胞对照，检测到仅45％的基因和仅33％的UMI。
总之，在离散液滴胶凝以形成CB期间使用显著较低的Cu浓度的能力可以通过并入具有叠氮基-吡啶甲基官能团的聚合物来实现。在形成CB时使用较低的铜浓度导致RNA降解显著减少和基因检测显著改进。
实例12：具有氨基甲酸酯键的化学降解细胞珠粒
此实例展示了如何用二乙基三胺(DETA)和热量选择性降解由具有不稳定氨基甲酸酯(而不是二硫化物)键的离散液滴的乳液生成的CB。
离散液滴的乳液是由用接头修饰的聚合物生成的，所述接头包含叠氮化物或炔烃基团，能够进行CuAAC点击化学。如图32所描绘的方案所展示的，具有炔烃基团的接头包括炔丙基-氨基甲酸酯部分，所述炔丙基-氨基甲酸酯部分与叠氮化物接头修饰的聚合物进行铜催化的点击化学交联反应以形成凝胶基质。形成凝胶基质的交联包括1,2,3-三唑部分但不包含二硫键。因此，它们不易被DTT处理降解。替代地，交联可以通过用聚胺(例如，DETA)和热量(例如，60℃)处理来降解，其用于切割氨基甲酸酯基团如图32所示出的。
除了包括炔丙基-氨基甲酸酯部分(且无二硫键)的接头外，如实例3中所描述的从液滴乳液生成CB，如图32所示出的。分析包括氨基甲酸酯键的所得CB在存在DETA和热量的情况下的降解特性。使用光学显微镜监测降解。30μL氨基甲酸酯CB在60℃下暴露于200μL含10％DETA的PBS溶液中，并且与暴露于不含DETA的对照PBS溶液的氨基甲酸酯CB进行比较。氨基甲酸酯CB在60℃下在10％DETA中15分钟后完全降解。
为了进一步比较，不含氨基甲酸酯键的凝胶珠粒(GB)(美国加利福尼亚州普莱森顿的10x Genomics公司)也用10％DETA和热量进行处理，并且在显微镜下监测降解情况。如图33所描绘的数据图所示出的，在用10％DETA和60℃热量处理时，具有含氨基甲酸酯的交联的CB在处理的前10分钟内从～60μm溶胀到～110μm，并且在处理15分钟后完全溶解。相比之下，具有不含氨基甲酸酯的交联的GB在15分钟后没有发生显著变化，指示在存在10％DETA和加热到60℃的情况下没有降解。
尽管有所附权利要求，但本文中阐述的公开内容也由以下条款定义，这可以单独或与一个或多个其它原因或实施例组合是有益的。在不限制前述描述的情况下，提供了如下文编号的本公开的某些非限制性条款，其中单独编号的条款中的每一个条款可以使用或与先前或以下条款中的任何条款组合。因此，这旨在为所有此类组合提供支持，并且不一定限于下文明确提供的特定组合：
1.一种组合物，其包括：(a)生物颗粒和/或大分子成分；以及(b)两种或更多种交联聚合物，其中交联通过点击化学形成。
2.根据条款1所述的组合物，其中所述交联聚合物是凝胶。
3.根据条款1所述的组合物，其中所述交联聚合物包封所述生物颗粒和/或大分子成分。
4.根据条款1所述的组合物，其中所述交联包括吡啶甲基部分。
5.根据条款1所述的组合物，其中所述点击化学是铜催化的。
6.根据条款5所述的组合物，其中所述铜催化的点击化学包括选自约0.3mM或更小、约0.2mM或更小和约0.15mM或更小的铜浓度。
7.根据条款1所述的组合物，其中所述点击化学是无铜的。
8.根据条款7所述的组合物，其中所述无铜点击化学选自：(a)应变促进的叠氮化物/二苯并环辛炔-胺(DBCO)点击化学；(b)逆电子需求狄尔斯-阿尔德(IED-DA)四嗪/反式环辛烯(TCO)点击化学；(c)逆电子需求狄尔斯-阿尔德(IED-DA)四嗪/降冰片烯点击化学；(d)狄尔斯-阿尔德马来酰亚胺/呋喃点击化学；(e)施陶丁格连接；以及(f)腈氧化物/降冰片烯环加成点击化学。
9.根据条款8所述的组合物，其中所述交联包括1,2,3-三唑部分。
10.根据条款8所述的组合物，其中所述交联包括二氢哒嗪部分。
11.根据条款1所述的组合物，其中所述交联包括不稳定键。
12.根据条款11所述的组合物，其中所述不稳定键选自化学不稳定键、热不稳定键、酶促不稳定键、光不稳定键或其组合。
13.根据条款11所述的组合物，其中所述不稳定键选自二硫键、氨基甲酸酯键、肽键或其组合。
14.根据条款1所述的组合物，其中所述组合物进一步包括通过点击化学连接到所述聚合物中的至少一种聚合物的至少一种试剂。
15.根据条款14所述的组合物，其中所述至少一种试剂是寡核苷酸。
16.根据条款15所述的组合物，其中所述寡核苷酸包括poly-T序列。
17.一种形成凝胶的方法，其包括：在点击化学反应条件下在分区中组合(i)生物颗粒和/或大分子成分，和(ii)配置成通过点击化学交联的两种或更多种聚合物。
18.根据条款17所述的方法，其中被配置成交联的所述聚合物之一包括吡啶甲基部分。
19.根据条款17所述的方法，其中所述点击化学反应条件包括选自约0.3mM或更少、约0.2mM或更少和约0.15mM或更少的铜浓度。
20.根据条款17所述的方法，其中所述点击化学反应条件是无铜的。
21.根据条款20所述的方法，其中所述两种或更多种聚合物被配置成通过选自以下的无铜点击化学交联：(a)应变促进的叠氮化物/二苯并环辛炔-胺(DBCO)点击化学；(b)逆电子需求狄尔斯-阿尔德(IED-DA)四嗪/反式环辛烯(TCO)点击化学；(c)逆电子需求狄尔斯-阿尔德(IED-DA)四嗪/降冰片烯点击化学；(d)狄尔斯-阿尔德马来酰亚胺/呋喃点击化学；(e)施陶丁格连接；以及(f)腈氧化物/降冰片烯环加成点击化学。
22.根据条款20所述的方法，其中点击化学键包括1,2,3-三唑部分。
23.根据条款20所述的方法，其中点击化学键包括二氢哒嗪部分。
24.根据条款17所述的方法，其中所述形成的交联包括不稳定键。
25.根据条款24所述的方法，其中所述不稳定键是化学不稳定键、热不稳定键、酶促不稳定键或光不稳定键。
26.根据条款24所述的方法，其中所述不稳定键是二硫键、氨基甲酸酯键或肽键。
27.根据条款17所述的方法，其中所述分区是孔。
28.根据条款17所述的方法，其中所述分区是乳液中的离散液滴。
29.一种组合物，其包括：(a)生物样品；以及(b)两种或更多种交联聚合物的凝胶，其中交联是通过点击化学使用包括铜螯合基团的接头形成的。
30.根据条款29所述的组合物，其中所述交联包括吡啶甲基部分。
31.根据条款29到30中任一项所述的组合物，其中所述铜螯合基团是吡啶甲基；任选地其中所述吡啶甲基是叠氮基吡啶甲基。
32.根据条款29到31中任一项所述的组合物，其中所述点击化学是铜催化的；任选地其中所述铜催化的点击化学包括选自约0.3mM或更小、约0.2mM或更小和约0.15mM或更小的铜浓度。
33.根据条款29到32中任一项所述的组合物，其中所述两种或更多种聚合物的一种聚合物包括选自由以下组成的组的至少一个成员：聚烯烃、烯烃共聚物、丙烯酸、乙烯基聚合物、聚酯、聚酰胺、聚酰亚胺、甲醛树脂、聚氨酯、醚聚合物、纤维素、热塑性弹性体和热塑性聚氨酯。
34.根据条款29到33中任一项所述的组合物，其中所述凝胶是水凝胶。
35.根据条款29到34中任一项所述的组合物，其中所述交联聚合物分布在整个所述凝胶中。
36.根据条款29到35中任一项所述的组合物，其中所述交联聚合物包封所述生物样品；任选地其中所述生物样品包括细胞、细胞核或源自所述细胞的一种或多种成分。
37.根据条款29到36中任一项所述的组合物，其中所述两种或更多种聚合物的一种聚合物是聚丙烯酰胺。
38.根据条款29到37中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括通过点击化学连接到所述聚合物中的至少一种聚合物的至少一种试剂。
39.一种组合物，其包括：(a)生物样品；以及(b)两种或更多种交联聚合物的凝胶，其中交联是通过无铜点击化学形成的，其中所述无铜点击化学选自：(i)应变促进的叠氮化物/二苯并环辛炔-胺(DBCO)点击化学；(ii)逆电子需求狄尔斯-阿尔德(IED-DA)四嗪/反式环辛烯(TCO)点击化学；(iii)逆电子需求狄尔斯-阿尔德(IED-DA)四嗪/降冰片烯点击化学；(iv)狄尔斯-阿尔德马来酰亚胺/呋喃点击化学；以及(v)施陶丁格连接；以及(iv)腈氧化物/降冰片烯环加成点击化学。
40.根据条款39所述的组合物，其中所述交联包括1,2,3-三唑部分。
41.根据条款39所述的组合物，其中所述交联包括二氢哒嗪部分。
42.根据条款39到41中任一项所述的组合物，其中所述两种或更多种交联聚合物的一种聚合物包括选自由以下组成的组的至少一个成员：聚烯烃、烯烃共聚物、丙烯酸、乙烯基聚合物、聚酯、聚酰胺、聚酰亚胺、甲醛树脂、聚氨酯、醚聚合物、纤维素、热塑性弹性体和热塑性聚氨酯。
43.根据条款39到42中任一项所述的组合物，其中所述凝胶是水凝胶。
44.根据条款39到43中任一项所述的组合物，其中所述交联聚合物分布在整个所述凝胶中。
45.根据条款39到44中任一项所述的组合物，其中所述交联聚合物包封所述生物样品；任选地其中所述生物样品包括细胞、细胞核或源自所述细胞的一种或多种成分。
46.根据条款39到45中任一项所述的组合物，其中所述两种或更多种交联聚合物的一种聚合物是聚丙烯酰胺。
47.一种组合物，其包括：(a)生物样品；以及(b)两种或更多种交联聚合物的凝胶，并且其中所述交联包括不稳定键。
48.根据条款47所述的组合物，其中所述不稳定键选自二硫键、氨基甲酸酯键、肽键或其组合。
49.根据条款47到48中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括通过点击化学连接到所述聚合物中的至少一种聚合物的至少一种试剂。
50.根据条款49所述的组合物，其中所述至少一种试剂是寡核苷酸。
51.根据条款50所述的组合物，其中所述寡核苷酸包括poly-T序列。
52.根据条款47到51中任一项所述的组合物，其中所述凝胶是水凝胶。
53.根据条款47到52中任一项所述的组合物，其中所述交联聚合物分布在整个所述凝胶中。
54.根据条款47到53中任一项所述的组合物，其中所述交联聚合物包封所述生物样品；任选地其中所述生物样品包括细胞、细胞核或源自所述细胞的一种或多种成分。
尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施例，但对于本领域的技术人员而言显而易见的是此类实施例仅通过举例的方式提供。本发明并不旨在受说明书内提供的具体实例限制。尽管已经参考上述说明书描述了本发明，但本文中的实施例的描述和说明并不打算以限制意义理解。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替代。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文所阐述的取决于各种条件和变量的特定描绘、配置或相对比例。应当理解的是，本文描述的本发明的实施例的不同替代方案可以用于实践本发明。因此设想的是本发明还应涵盖任何此类替代、修改、变化或等同物。以下权利要求旨在限定本发明的范围并且由此覆盖在这些权利要求和其等效物的范围内的方法和结构。

Claims (25)

1.一种组合物，其包括：
(a)生物样品；以及
(b)两种或更多种交联聚合物的凝胶，其中交联是通过点击化学使用包括铜螯合基团的接头形成的。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述交联包括吡啶甲基部分。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述铜螯合基团是吡啶甲基；任选地其中所述吡啶甲基是叠氮基吡啶甲基。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述点击化学是铜催化的；任选地其中所述铜催化的点击化学包括选自约0.3mM或更小、约0.2mM或更小和约0.15mM或更小的铜浓度。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述两种或更多种聚合物的一种聚合物包括选自由以下组成的组的至少一个成员：聚烯烃、烯烃共聚物、丙烯酸、乙烯基聚合物、聚酯、聚酰胺、聚酰亚胺、甲醛树脂、聚氨酯、醚聚合物、纤维素、热塑性弹性体和热塑性聚氨酯。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述凝胶是水凝胶。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述交联聚合物分布在整个所述凝胶中。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述交联聚合物包封所述生物样品；任选地其中所述生物样品包括细胞、细胞核或源自所述细胞的一种或多种成分。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述两种或更多种交联聚合物的一种聚合物是聚丙烯酰胺。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物进一步包括通过点击化学连接到所述聚合物中的至少一种聚合物的至少一种试剂。
11.一种组合物，其包括：
(a)生物样品；
(b)两种或更多种交联聚合物的凝胶，其中交联是通过无铜点击化学形成的，其中所述无铜点击化学选自：
(i)应变促进的叠氮化物/二苯并环辛炔-胺(DBCO)点击化学；
(ii)逆电子需求狄尔斯-阿尔德(inverse electron demand Diels-Alder，IED-DA)四嗪/反式环辛烯(TCO)点击化学；
(iii)逆电子需求狄尔斯-阿尔德(IED-DA)四嗪/降冰片烯点击化学；
(iv)狄尔斯-阿尔德马来酰亚胺/呋喃点击化学；以及
(v)施陶丁格(Staudinger)连接；以及(iv)腈氧化物/降冰片烯环加成点击化学。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述交联包括1,2,3-三唑部分。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述交联包括二氢哒嗪部分。
14.根据权利要求11所述的组合物，其中所述两种或更多种交联聚合物的一种聚合物包括选自由以下组成的组的至少一个成员：聚烯烃、烯烃共聚物、丙烯酸、乙烯基聚合物、聚酯、聚酰胺、聚酰亚胺、甲醛树脂、聚氨酯、醚聚合物、纤维素、热塑性弹性体和热塑性聚氨酯。
15.根据权利要求11所述的组合物，其中所述凝胶是水凝胶。
16.根据权利要求11所述的组合物，其中所述交联聚合物分布在整个所述凝胶中。
17.根据权利要求11所述的组合物，其中所述交联聚合物包封所述生物样品；任选地其中所述生物样品包括细胞、细胞核或源自所述细胞的一种或多种成分。
18.根据权利要求11所述的组合物，其中所述两种或更多种交联聚合物的一种聚合物是聚丙烯酰胺。
19.一种组合物，其包括：
(a)生物样品；
(b)两种或更多种交联聚合物的凝胶，其中所述交联包括不稳定键。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述不稳定键选自二硫键、氨基甲酸酯键、肽键或其组合。
21.根据权利要求19所述的组合物，其中所述组合物进一步包括通过点击化学连接到所述聚合物中的至少一种聚合物的至少一种试剂。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述至少一种试剂是寡核苷酸。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述寡核苷酸包括poly-T序列。
24.根据权利要求19所述的组合物，其中所述凝胶是水凝胶。
25.根据权利要求19所述的组合物，其中所述交联聚合物分布在整个所述凝胶中。
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