CN111386134B - 使用改进的聚合物形成珠的组合物、方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于制备水凝胶的系统和方法，所述水凝胶包含细胞、细胞核、或源自细胞或细胞核的一种或多种组分。一种用于制备水凝胶的方法可包括：提供细胞或细胞核、第一聚合物，其中所述第一聚合物包含多个第一交联前体，所述多个第一交联前体中的每一个包含叠氮基；提供第二聚合物，其中所述第二聚合物包含多个第二交联前体，所述多个第二交联前体中的每一个包含炔基；以及经由所述第一交联前体的第一部分与所述第二交联前体的第二部分之间的反应使所述第一聚合物和所述第二聚合物交联，从而提供包含所述细胞核或细胞核的水凝胶。

Description

使用改进的聚合物形成珠的组合物、方法和系统
交叉引用
本申请要求2018年6月19日提交的美国临时专利申请号62/687,161和2017年10月4日提交的美国临时专利申请号62/568,021的优先权，其中的每一个出于所有目的通过引用整体并入本文。
背景技术
样品可被处理用于各种目的，诸如鉴定样品内的部分的样品类型。样品可为生物样品。生物样品可被处理用于各种目的，诸如检测疾病(例如，癌症)或鉴定特定物质。有多种方法用于处理样品，例如聚合酶链反应(PCR)和测序。
生物样品可在各种反应环境(例如分配物)中被处理。分配物可为孔或液滴。液滴或孔可用于处理生物样品，其方式使得生物样品能够被分配和单独处理。例如，这种液滴可与其他液滴流体隔离，从而能够精确控制液滴中的相应环境。
分配物中的生物样品可经受各种处理，诸如化学处理或物理处理。分配物中的样品可经受加热或冷却，或化学反应，以便产生可被定性或定量处理的物质。
发明内容
水凝胶基质(包括珠)可产生能够将大分子包封在基质边界内同时允许小分子渗透基质的半开放系统。大分子可为生物样品，包括例如细胞、大蛋白质或长核酸。小分子可为例如试剂、较小的蛋白质或较短的核酸。例如，酶可足够小以渗透基质。水凝胶基质还可包含不稳定键，使得在水凝胶基质降解后，包封的大分子可从基质的界限释放到周围环境中。本文提供了用于生产水凝胶基质的方法、系统和组合物，所述水凝胶基质能够包封大分子并允许小分子渗透所述基质。
在一些方面，本公开提供了一种凝胶，所述凝胶包含：(a)细胞、细胞核或源自细胞的一种或多种组分；(b)两种或更多种聚合物；以及(c)多个接头，所述多个接头中的每一个包含1,2,3-三唑部分，其中所述接头使所述两种或更多种聚合物交联。在一些实施方式中，所述两种或更多种聚合物中的每个独立地包含选自由以下组成的组中的至少一种：聚烯烃、烯烃共聚物、丙烯酸类、乙烯基聚合物、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酰亚胺、甲醛树脂、聚氨酯、醚聚合物、纤维素、热塑性弹性体和热塑性聚氨酯。在一些实施方式中，所述两种或更多种聚合物中的每个独立地为聚丙烯酰胺。在一些实施方式中，所述多个接头中的每一个独立地与所述两种或更多种聚合物的酰胺连接。在一些实施方式中，所述多个接头中的每一个包括不稳定键。在一些实施方式中，所述不稳定键为化学不稳定键、热不稳定键或光不稳定键。在一些实施方式中，所述不稳定键包括二硫键。在一些实施方式中，所述1,2,3-三唑部分通过在足以形成所述1,2,3-三唑部分的条件下用炔基处理叠氮基的工艺形成。在一些实施方式中，所述凝胶还包含至少一种包封在所述凝胶内的试剂。
在一些实施方式中，所述凝胶为水凝胶。在一些实施方式中，所述凝胶还包含带电物质。在一些实施方式中，所述带电物质带正电。在一些实施方式中，所述带电物质包括三甲基铵。在一些实施方式中，所述带电物质带负电。在一些实施方式中，所述带电物质包括磷酸盐。在一些实施方式中，所述带电物质与所述聚合物或凝胶网络附着。在一些实施方式中，所述两种或更多种聚合物中的至少一种为带电聚合物。在一些实施方式中，所述带电聚合物为带正电聚合物。在一些实施方式中，所述带正电聚合物包含壳聚糖或聚乙烯亚胺。在一些实施方式中，所述带电聚合物为带负电聚合物。在一些实施方式中，所述带负电聚合物包含藻酸盐。在一些实施方式中，所述两种或更多种聚合物中的至少一种包含带电部分，并且其中所述带电部分通过接头与所述两种或更多种聚合物中的所述至少一种连接。在一些实施方式中，所述接头包括不稳定键，所述不稳定键能够将所述带电部分从所述两种或更多种聚合物中的所述至少一种切割。在一些实施方式中，所述不稳定键为化学不稳定键、热不稳定键或光不稳定键。
在一些方面，本公开提供了一种形成包含细胞或细胞核的凝胶的方法，所述方法包括：(a)提供(i)第一聚合物，其中所述第一聚合物包含多个第一交联前体，所述多个第一交联前体中的每一个包含叠氮基；(ii)第二聚合物，其中所述第二聚合物包含多个第二交联前体，所述多个第二交联前体中的每一个包含炔基；以及(iii)所述细胞或所述细胞核；(b)通过所述第一交联前体的第一部分和所述第二交联前体的第二部分之间的反应，使所述第一聚合物和所述第二聚合物交联，从而形成包含所述细胞或所述细胞核的所述凝胶。在一些实施方式中，所述第一聚合物和所述第二聚合物独立地包含选自由以下组成的组中的至少一种：聚烯烃、烯烃共聚物、丙烯酸类、乙烯基聚合物、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酰亚胺、甲醛树脂、聚氨酯、醚聚合物、纤维素、热塑性弹性体和热塑性聚氨酯。在一些实施方式中，所述第一聚合物或所述第二聚合物还包含不稳定键。在一些实施方式中，所述第一聚合物和所述第二聚合物还包含不稳定键。在一些实施方式中，所述不稳定键为二硫键。在一些实施方式中，在(b)中的所述反应期间至少约80％的所述不稳定键保持完整。在一些实施方式中，所述反应在所述叠氮化物和所述炔烃之间形成1,2,3-三唑。在一些实施方式中，所述方法还包括在(b)之前，提供配置成催化(b)中的所述反应的催化剂。在一些实施方式中，所述方法还包括在(b)之后，从所述凝胶中除去所述催化剂和/或其衍生物。在一些实施方式中，所述凝胶由多种所述第一聚合物和多种所述第二聚合物形成。在一些实施方式中，所述凝胶为水凝胶。
在一些实施方式中，所述方法还包括在(b)之后，裂解所述细胞或所述细胞核，以将一种或多种细胞或细胞核成分释放到所述凝胶中。在一些实施方式中，所述一种或多种细胞或细胞核成分包含核酸。在一些实施方式中，所述核酸包含核糖核酸。在一些实施方式中，所述核糖核酸为信使核糖核酸(mRNA)。在一些实施方式中，所述核糖核酸为微小核糖核酸(miRNA)。在一些实施方式中，所述核酸包含脱氧核糖核酸(DNA)。在一些实施方式中，所述DNA为基因组DNA。在一些实施方式中，所述一种或多种细胞或细胞核成分包括染色质。在一些实施方式中，所述一种或多种细胞或细胞核成分包含蛋白质。在一些实施方式中，所述一种或多种细胞或细胞核成分能够保留在所述凝胶中。在一些实施方式中，所述一种或多种细胞或细胞核成分能够在所述凝胶内保留至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少12小时或至少24小时。在一些实施方式中，所述方法还包括使所述DNA变性。在一些实施方式中，所述变性包括使所述凝胶与化学试剂接触。在一些实施方式中，所述化学试剂为碱性试剂。在一些实施方式中，所述方法还包括在(b)之后，使所述细胞或所述细胞核渗透化。在一些实施方式中，所述方法还包括在(b)之前，将所述第一聚合物、所述第二聚合物和所述细胞或细胞核共同分配到分配物中。在一些实施方式中，所述分配物为孔。在一些实施方式中，所述分配物为乳液中的水性液滴。在一些实施方式中，所述分配物包含被配置成催化(b)中的所述反应的试剂。在一些实施方式中，所述乳液包含油相，所述油相包含含有铜(II)部分的试剂，并且其中所述水性液滴包含能够将所述铜(II)部分还原成铜(I)部分的还原剂，其中所述铜(I)部分催化(b)中的所述反应。在一些实施方式中，所述乳液包含促进所述铜(II)部分从所述油相输送到所述水性液滴中的试剂。在一些实施方式中，所述方法还包括在(b)之前，使所述细胞或细胞核在所述分配物中裂解或渗透化。
在一些方面，本公开提供了一种用于产生细胞珠的方法，所述方法包括：(a)产生分配物，所述分配物包含来自多个细胞的细胞或来自多个核的核、聚合物或凝胶前体、以及带电物质；以及(b)使所述分配物经受足以使所述聚合物或凝胶前体反应的条件，以产生包含(i)所述细胞或其衍生物和(ii)所述带电物质的聚合物或凝胶网络，从而提供所述细胞珠。在一些实施方式中，所述分配物在多个分配物中。在一些实施方式中，所述方法还包括从所述多个分配物产生多个细胞珠。在一些实施方式中，所述带电物质带正电。在一些实施方式中，所述带电物质包括三甲基铵。在一些实施方式中，所述带电物质为(3-丙烯酰氨基丙基)三甲基铵。在一些实施方式中，所述带电物质带负电。在一些实施方式中，所述带电物质包括磷酸盐。在一些实施方式中，所述带电物质附着于所述聚合物或凝胶网络。在一些实施方式中，所述细胞珠包含多种化学交联剂。在一些实施方式中，所述带电物质附着于所述化学交联剂(chemical cross-linker)中的化学交联剂(chemical-cross linker)。在一些实施方式中，所述方法还包括在(b)之前，使所述细胞珠经受足以裂解所述细胞或细胞核的条件，以将一种或多种细胞或细胞核成分释放到所述细胞珠中。
在一些实施方式中，所述方法还包括在(b)之后，使所述细胞珠经受足以裂解所述细胞或细胞核的条件，以将一种或多种细胞或细胞核成分释放到所述细胞珠中。在一些实施方式中，所述一种或多种细胞或细胞核成分包含核酸。在一些实施方式中，所述核酸包含核糖核酸。在一些实施方式中，所述核糖核酸为信使核糖核酸。在一些实施方式中，所述核酸包含脱氧核糖核酸。在一些实施方式中，所述一种或多种细胞或细胞核成分包含蛋白质。在一些实施方式中，所述一种或多种细胞或细胞核成分能够保留在所述细胞珠内。在一些实施方式中，所述一种或多种细胞或细胞核成分能够在所述细胞珠内保留至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少12小时或至少24小时。
在一些方面，本公开提供了一种用于产生细胞珠的方法，所述方法包括：(a)产生分配物，所述分配物包含(i)来自多个细胞的细胞或来自多个核的核以及(ii)带电聚合物或凝胶前体；以及(b)使所述分配物经受足以使所述聚合物或凝胶前体反应的条件，以产生包含所述细胞或所述核或其衍生物的带电聚合物或凝胶网络，从而提供所述细胞珠。在一些实施方式中，所述带电聚合物或凝胶前体包含正电荷。在一些实施方式中，所述带电聚合物或凝胶前体包含壳聚糖。在一些实施方式中，所述带电聚合物或凝胶前体包含聚乙烯亚胺。在一些实施方式中，所述带电聚合物或凝胶前体包含负电荷。在一些实施方式中，所述带电聚合物或凝胶前体包含藻酸盐。在一些实施方式中，所述方法还包括在(b)之前，使所述细胞珠经受足以裂解所述细胞或细胞核的条件，以将一种或多种细胞或细胞核成分释放到所述细胞珠中。在一些实施方式中，所述方法还包括在(b)之后，使所述细胞珠经受足以裂解所述细胞或细胞核的条件，以将一种或多种细胞或细胞核成分释放到所述细胞珠中。在一些实施方式中，所述一种或多种细胞或细胞核成分包含核酸。在一些实施方式中，所述核酸包含核糖核酸。在一些实施方式中，所述核糖核酸为信使核糖核酸。在一些实施方式中，所述核酸包含脱氧核糖核酸。在一些实施方式中，所述一种或多种细胞或细胞核成分包含蛋白质。在一些实施方式中，所述一种或多种细胞或细胞核成分能够保留在所述细胞珠内。在一些实施方式中，所述一种或多种细胞或细胞核成分能够在所述细胞珠内保留至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少12小时或至少24小时。
在一些方面，本公开提供了一种用于分析细胞的一种或多种组分的组合物，包含细胞珠，所述细胞珠包含聚合的或交联的聚合物网络，所述聚合物网络包含细胞、细胞核或源自细胞或细胞核的一种或多种成分，其中所述聚合的或交联的聚合物网络带有电。在一些实施方式中，所述聚合物网络带正电。在一些实施方式中，所述聚合物网络包含聚乙烯亚胺。在一些实施方式中，所述聚合物网络包含壳聚糖。在一些实施方式中，所述聚合物网络带负电。在一些实施方式中，所述聚合物网络包含藻酸盐。
在一些方面，本公开提供了一种用于分析来自细胞的一种或多种组分的组合物，包含细胞珠，所述细胞珠包含聚合的或交联的聚合物网络，所述聚合物网络包含(i)细胞、细胞核或源自细胞或细胞核的一种或多种成分；以及(ii)带电物质。在一些实施方式中，所述聚合物网络包含化学交联剂。在一些实施方式中，所述细胞珠包含来自附着于所述化学交联剂的所述细胞的组分。在一些实施方式中，所述带电物质附着于所述聚合物网络。在一些实施方式中，所述带电物质共价附着于所述聚合物网络。在一些实施方式中，所述电荷物质附着于来自所述细胞的组分。在一些实施方式中，所述带电物质非共价附着于来自所述细胞的组分。在一些实施方式中，所述带电物质带正电。在一些实施方式中，所述带电物质包括三甲基铵。在一些实施方式中，所述带电物质为(2-氨基乙基)三甲基铵。在一些实施方式中，所述带电物质为(3-丙烯酰氨基丙基)三甲基铵。在一些实施方式中，所述带电物质带负电。在一些实施方式中，所述带电物质包括磷酸盐。
从以下详细描述中，本公开的另外的方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中仅显示和描述了本公开的说明性实施方式。如将认识到的，本公开能够具有其他和不同的实施方式，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本公开。因此，附图和说明书应被认为是说明性的，而不是限制性的。
通过引用的并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入本文。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容矛盾的程度上，本说明书旨在取代和/或优先于任何这种矛盾的材料。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下详细描述和附图(在此也称为"图")将获得对本发明的特征和优点的更好理解，以下详细描述阐述了利用本发明的原理的说明性实施方式，在附图中：
图1显示用于分配个体生物颗粒的微流体通道结构的示例。
图2显示用于将携带条形码的珠递送到液滴的微流体通道结构的示例。
图3显示用于共同分配生物颗粒和试剂的微流体通道结构的示例。
图4显示用于将珠受控地分配到离散液滴中的微流体通道结构的示例。
图5显示用于增加液滴产生吞吐量的微流体通道结构的示例。
图6显示用于增加液滴产生吞吐量的微流体通道结构的另一示例。
图7显示用于共同分配生物颗粒和试剂以形成被配置成形成水凝胶的液滴的微流体通道结构的示例。
图8显示示例性水凝胶组合物和在液滴中形成水凝胶的步骤。
图9显示用于产生点击化学聚合物网络的示例性方法。
图10显示用于产生本公开的细胞珠的示例性方法。
图11A至图11B显示示例性带电水凝胶聚合物网络。图11A显示包含附着于聚合物网络的带正电物质的细胞珠的示意图。图11B显示包含附着于聚合物网络的带负电物质的细胞珠的示意图。
图12A至图12B显示另外的示例性带电水凝胶聚合物网络。图12A显示包含附着于含二硫化物的化学交联剂的正电荷物质的细胞珠的示意图。图12B显示包含附着于含二硫化物的化学交联剂的负电荷物质的细胞珠的示意图。
图13说明用于从细胞产生包括各种成分的液滴的示例性过程。
图14说明用于从细胞产生包括各种成分的液滴的另一示例性过程。
图15说明用于产生包括互补脱氧核糖核酸的细胞珠的示例性过程。
图16A示意性地说明用于产生包含条形码珠和细胞珠的液滴的示例性方法。图16B说明用于产生细胞珠的示例性微流体架构。图16C说明用于产生包含条形码珠和细胞珠的液滴的示例性微流体架构。图16D说明使用图16C所示的架构产生包含条形码珠和细胞珠的液滴的示例性液滴产生过程。
图17显示产生细胞珠和包含细胞珠和凝胶珠的分配物的示例性过程。
图18显示被编程或以其他方式配置成实现本文提供的方法和系统的示例性计算机系统。
图19显示包封细胞的细胞珠的代表性显微镜图像。
图20显示从包含在细胞珠中的细胞获得的DNA的实验测序结果。
图21A图示了用于产生细胞珠的示例工作流程。图21B显示来自没有细胞定中心而产生的细胞珠的成像结果。图21C显示来自具有细胞定中心而产生的细胞珠的成像结果。
图22显示实施例4的细胞定中心实验的结果图。
图23显示实施例5的细胞珠产生实验的结果图。
图24显示实施例6的细胞珠产生实验的结果图。
图25A显示来自实施例7中所述的细胞珠产生实验的结果，包括使用不同浓度的抗坏血酸钠。图25B显示来自实施例7中所述的细胞珠产生实验的结果，包括使用不同的胶凝时间。图25C显示来自实施例7中所述的细胞珠产生实验的结果，包括使用不同浓度的THPTA。图25D显示来自实施例7中所述的细胞珠产生实验的结果，包括使用不同浓度的抗坏血酸钠。
图26A显示来自实施例7所述的细胞珠产生实验的结果，包括使用不同浓度的CuAcAc。图26B显示来自实施例7中所述的细胞珠产生实验的结果，包括使用不同的胶凝时间。
图27A显示来自实施例8中所述的细胞珠产生实验的结果，包括使用不同浓度的THPTA。图27B显示来自实施例8中所述的细胞珠产生实验的结果，包括使用不同浓度的抗坏血酸钠。图27C显示来自实施例8中所述的细胞珠产生实验的结果，包括使用不同浓度的抗坏血酸钠。图27D显示来自实施例8中所述的细胞珠产生实验的结果，包括使用不同浓度的抗坏血酸钠。
图28A显示来自实施例8中所述的细胞珠产生实验的结果，包括使用不同浓度的THPTA。图28B显示来自实施例8中所述的细胞珠产生实验的结果，包括使用不同的胶凝时间。
具体实施方式
虽然本文已经显示和描述了本发明的各种实施方式，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施方式仅以示例的方式提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员可想到许多变化、改变和替换。应当理解，可采用这里描述的本发明的实施方式的各种替代方案。
在将值描述为范围的情况下，应理解，此类公开包括此类范围内的所有可能的子范围的公开，以及落在此类范围内的具体数值，而不管具体数值或具体子范围是否明确陈述。
如本文所用，术语"条形码"通常是指传达或能够传达关于分析物的信息的标签或标识符。条形码可为分析物的一部分。条形码可独立于分析物。条形码可为附着于分析物(例如核酸分子)的标记，或者为除了分析物的内源特征(例如分析物的大小或末端序列)之外的标记物的组合。条形码可以是独特的。条形码可具有各种不同的格式。例如，条形码可包括：多核苷酸条形码；随机核酸和/或氨基酸序列；以及合成的核酸和/或氨基酸序列。条形码可采用可逆或不可逆的方式附着于分析物。例如，可在样品测序之前、期间和/或之后，将条形码加入到脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)样品的片段。条形码可允许实时鉴定和/或定量个体测序读取。
如本文所用，术语"实时"可指小于约1秒、十分之一秒、百分之一秒、毫秒或更短的响应时间。响应时间可大于1秒。在一些情况下，实时可指同时或基本上同时的处理、检测或鉴定。
如本文所用，术语"受试者"通常指动物，例如哺乳动物(例如人)或禽类(例如鸟)，或其他生物体，例如植物。受试者可为脊椎动物、哺乳动物、啮齿动物(例如小鼠)、灵长类动物、猿或人。动物可包括但不限于农场动物、运动动物和宠物。受试者可为健康或无症状个体、患有或怀疑患有疾病(例如癌症)或疾病的先兆的个体和/或需要治疗或怀疑需要治疗的个体。受试者可为患者。
如本文所用，术语"基因组"通常是指来自受试者的基因组信息，其可为例如受试者遗传信息的至少一部分或全部。基因组可编码DNA或RNA。基因组可包含编码区(例如，编码蛋白质的编码区)以及非编码区。基因组可包括生物体中所有染色体的序列。例如，人类基因组通常具有总共46条染色体。所有这些序列一起可构成人类基因组。
术语"衔接子(adaptor(s))"、"衔接子(adapter(s))"和"标签"可同义使用。衔接子或标记可通过任何方法偶联至待"标记"的多核苷酸序列，所述方法包括结扎、杂交或其他方法。
如本文所用，术语"测序"通常是指用于确定一个或多个多核苷酸中的核苷酸碱基序列的方法和技术。多核苷酸可为例如核酸分子，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，包括其变体或衍生物(例如单链DNA)。测序可通过目前可用的各种系统进行，例如但不限于Pacific Biosciences/>OXFORD/>或Life的测序系统。或者或另外，可使用核酸扩增、聚合酶链式反应(PCR)(例如，数字PCR、定量PCR或实时PCR)或等温扩增来进行测序。这样的系统可提供对应于受试者(例如，人)的遗传信息的多个原始遗传数据，如由系统从受试者提供的样品所产生得。在一些实例中，此类系统提供测序读取(本文中也称为"读取")。读取可包括对应于已经被测序的核酸分子的序列的核酸碱基的串。在一些情况下，本文提供的系统和方法可与蛋白质组信息一起使用。
如本文所用，术语"珠"通常是指颗粒。珠可为固体或半固体颗粒。珠可为凝胶珠。凝胶珠可包括聚合物基质(例如，通过聚合或交联形成的基质)。珠可由聚合材料形成。珠可为磁性的或非磁性的。珠可为刚性的。珠可为柔性的和/或可压缩的。珠可为可破裂或可溶解的。
如本文所用，术语"样品"通常是指受试者的生物样品。生物样品可包括任何数量的大分子，例如细胞大分子。生物样品可为核酸样品或蛋白质样品。生物样品也可为碳水化合物样品或脂质样品。生物样品可源自另一样品。样品可为组织样品，例如活检、组织芯活检、针抽吸物或细针抽吸物。样品可为流体样品，例如血液样品、尿样品或唾液样品。样品可为皮肤样品。样品可为脸颊拭子。样品可为血浆或血清样品。样品可为脱细胞或无细胞样品。无细胞样品可包括细胞外多核苷酸。细胞外多核苷酸可从身体样品中分离，所述身体样品可选自以下组成的组：血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、痰、粪便和泪液。
如本文所用，术语"生物颗粒"通常是指源自生物样品的离散生物系统。生物颗粒可为病毒。生物颗粒可为细胞或细胞的衍生物。生物颗粒可为细胞器。生物颗粒可为来自细胞群体的稀有细胞。生物颗粒可为任何类型的细胞，包括但不限于原核细胞、真核细胞、细菌、真菌、植物、哺乳动物或其他动物细胞类型、支原体、正常组织细胞、肿瘤细胞或任何其他细胞类型，无论源自单细胞还是多细胞生物体。生物颗粒可为或可包括基质(例如凝胶或聚合物基质)，所述基质包含细胞或来自细胞的一种或多种成分(例如细胞珠)，如来自细胞的DNA、RNA、细胞器、蛋白质或其任意组合。生物颗粒可从受试者的组织获得。生物颗粒可为硬化细胞。这种硬化的细胞可包括或不包括细胞壁或细胞膜。生物颗粒可包括细胞的一种或多种成分，但可不包括细胞的其他成分。这种成分的示例为细胞核或细胞器。细胞可为活细胞。活细胞可能够被培养，例如，当被包封在凝胶或聚合物基质中时被培养，或当包含凝胶或聚合物基质时被培养。
如本文所用，术语"大分子成分"通常是指包含在生物颗粒内的大分子。大分子成分可包含核酸。大分子成分可包括DNA。大分子成分可包括RNA。RNA可为信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)或转运RNA(tRNA)。RNA可为转录物。大分子成分可包括蛋白质。大分子成分可包括肽。大分子成分可包括多肽。
如本文所用，术语"分子标记"通常是指能够结合大分子成分的分子。分子标签可高亲和力地结合大分子成分。分子标记可高特异性地结合大分子成分。分子标记可包含核苷酸序列。分子标记可包含核酸序列。核酸序列可为分子标记的至少一部分或全部。分子标记可为核酸分子或者可为核酸分子的一部分。分子标记可为寡核苷酸或多肽。分子标记可包括DNA适体。分子标记可为或包含引物。分子标记可为或包含蛋白质。分子标记可包含多肽。分子标记可为条形码。
本文提供了用于通过乳液胶凝来形成水凝胶基质(包括珠)的组合物和方法。此外，水凝胶基质可包封大分子，例如生物样品。生物样品可为细胞、大蛋白质或长核酸。水凝胶基质可包含细胞或来自细胞的一种或多种组分(例如，细胞珠)。水凝胶基质可允许较小的分子渗透基质。较小分子可为试剂、较小蛋白质或较短核酸。较小的蛋白质可为酶。水凝胶可以是可降解的。
在一方面，本公开提供了一种可降解水凝胶的组合物，所述组合物包含两种或更多种聚合物和被配置成形成交联的多个接头。多个接头中的每一个可包含不稳定键和1,2,3-三唑部分。两种或更多种聚合物可通过这种接头交联。
在一方面，本公开提供了一种形成水凝胶的方法。所述方法可包括(a)提供第一聚合物，其中所述第一聚合物包含多个第一交联前体；(b)提供第二聚合物，其中所述第二聚合物包含多个第二交联前体；以及(c)经由第一交联前体的第一部分与第二交联前体的第二部分之间的反应，使第一聚合物和第二聚合物交联，从而形成水凝胶。
在一方面，本文所述的系统和方法提供了将个体生物颗粒的大分子成分内含物区室化、沉积或分配到离散的区室或分配物(在本文中可互换地称为分配物)中，其中每个分配物保持其自身的内含物与其他分配物的内含物的分离。该分配物可为乳液中的液滴。分配物可包括一种或多种其他分配物。
本公开的分配物可包含生物颗粒和/或其大分子成分。分配物可包括一个或多个凝胶珠。分配物可包含一个或多个细胞珠。分配物可包括单个凝胶珠、单个细胞珠、或单个细胞珠和单个凝胶珠二者。细胞珠可为生物颗粒和/或一种或多种包裹在凝胶或聚合物基质内的大分子成分，例如通过含有生物颗粒和能够聚合或胶凝的前体的液滴的聚合。独特的标识符，例如条形码，可在液滴产生之前、之后或同时被注射到液滴中，例如通过微胶囊(例如，珠)，如下面进一步描述的。微流体通道网络(例如，在芯片上)可用于产生如本文所述的分配物。在个体生物颗粒的分配中也可使用替代的机制，包括多孔膜，细胞的水性混合物通过该多孔膜被挤出到非水性流体中。
分配物可在流体流内流动。分配物可包括例如具有围绕内部流体中心或核心的外部屏障的微泡。在一些情况下，分配物可包括多孔基质，该多孔基质能够夹带和/或保留其基质内的材料。分配物可包含在非水性连续相(例如油相)内的水性流体的液滴。分配物可包含在第二相中的第一相的液滴，其中第一相和第二相不混溶。各种不同的容器例如在美国专利申请公开号2014/0155295中描述，为了所有目的其通过引用整体并入本文。用于在非水性或油连续相中产生稳定液滴的乳液体系描述于例如美国专利申请公开号2010/0105112中，其出于所有目的通过引用整体并入本文。
在乳液中的液滴的情况下，在一个非限制性实例中，将个体生物颗粒分配到离散分配物可通过将水性流体中的生物颗粒的流动流引入到非水性流体的流动流中，使得在两个流的接合部处产生液滴来实现。通过以生物颗粒的某一浓度和/或流速提供水流，可控制所得分配物的占据率(例如，每个分配物的生物颗粒的数量)。在使用单个生物颗粒分配物的情况下，可选择不混溶流体的相对流速，使得平均起来，分配物可包含每个分配物少于一个生物颗粒，以便确保被占据的那些分配物主要被单独占据。在一些情况下，多个分配物中的分配物可含有至多一个生物颗粒(例如，珠、细胞或细胞材料)。在一些实施方式中，可选择流体的相对流速，使得大部分分配物被占据，例如，仅允许小百分比的未被占据的分配物。可控制流和通道架构，以确保给定数量的单独占据的分配物、小于某一水平的未占据的分配物和/或小于某一水平的多重占据的分配物。
图1显示用于分隔个体生物颗粒的微流体通道结构100的示例。通道结构100可包括在通道接合部110处连通的通道段102、104、106和108。在操作中，包括悬浮生物颗粒(或细胞)114的第一水性流体112可沿通道段102被输送到接合部110中，而与水性流体112不混溶的第二流体116从通道段104和106中的每一个被递送到接合部110，以产生第一水性流体112的离散液滴118、120，其流入通道段108中，并且从接合部110流走。通道段108可流体地偶联到出口储器，离散液滴可在该出口储器中储存和/或收获。所产生的离散液滴可包括个体生物颗粒114(例如液滴118)。所产生的离散液滴可包括多于一个的个体生物颗粒114(图1中未显示)。离散液滴可不含生物颗粒114(例如液滴120)。每个离散分配物可维持其自身的内含物(例如，个体生物颗粒114)与其他分配物的内含物的分离。
第二流体116可包括油，例如氟化油，其包括用于稳定所得到的液滴的含氟表面活性剂，例如，抑制所得到的液滴118、120的随后聚结。特别有用的分配流体和含氟表面活性剂的示例描述于例如美国专利申请公开号2010/0105112中，其出于所有目的通过引用整体并入本文。
如将理解的，本文所述的通道段可偶联到多种不同流体源或接收部件中的任何一个，包括储器、管道、歧管或其他系统的流体部件。如将理解的，微流体通道结构100可具有其他几何形状。例如，微流体通道结构可具有多于一个通道接合部。例如，微流体通道结构可具有2个、3个、4个或5个通道段，每个通道段携带在通道接合部处相遇的生物颗粒、细胞珠和/或凝胶珠。流体可经由一个或多个流体流动单元沿一个或多个通道或储器被引导流动。流体流动单元可包括压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。还可或以其他方式通过施加的压力差、离心力、电动泵送、真空、毛细或重力流等来控制流体。
所产生的液滴可包括两个液滴子集：(1)含有一种或多种生物颗粒114的被占据的液滴118，以及(2)不含任何生物颗粒114的未被占据的液滴120。占据的液滴118可包括单个占据的液滴(具有一个生物颗粒)和多个占据的液滴(具有多于一个生物颗粒)。如本文别处所述，在一些情况下，大多数占据的分配物可包括每个占据的分配物不超过一个生物颗粒，并且一些所产生的分配物可未被占据(任何生物颗粒的)。然而，在一些情况下，一些占据的分配物可包括多于一个生物颗粒。在一些情况下，可控制分配物过程，使得少于约25％的占据的分配物包含多于一个生物颗粒，并且在许多情况下，少于约20％的占据的分配物具有多于一个生物颗粒，而在一些情况下，少于约10％或甚至少于约5％的占据的分配物包括每个分配物多于一个生物颗粒。
在一些情况下，可能期望最小化过量的空分配物的产生，以便降低成本和/或提高效率。虽然这种最小化可通过在分配接合部110处提供足够数量的生物颗粒(例如，生物颗粒114)来实现，以便确保至少一个生物颗粒被封装在分配物中，但是泊松分布(Poissoniandistribution)可预期地增加包括多个生物颗粒的分配物的数量。因此，在要获得单个占据的分配物的情况下，至多约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或更少的所产生的分配物可未被占据。
在一些情况下，可控制被引导到分配接合部中(例如，在通道段104、106中)的其他流体或生物颗粒中的一种或多种(例如，在通道段102中)的流动，使得在许多情况下，不超过约50％的所产生的分配物、不超过约25％的所产生的分配物或不超过约10％的所产生的分配物未被占据。可控制这些流动以便呈现单占据分配物的非泊松分布，同时提供较低水平未占据分配物。可实现未占据分配物的上述范围，同时仍然提供上述单个占据率中的任何一个。例如，在许多情况下，本文所述的系统和方法的使用可产生所得分配物，该所得分配物具有小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％，并且在许多情况下小于约5％的多个占据率，同时具有小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、小于约5％或更小的未占据分配物。
如将理解的，上述占据率也适用于包括生物颗粒和另外的试剂二者的分配物，包括但不限于携带条形码化核酸分子(例如，寡核苷酸)的微胶囊(关于图2描述)。被占据的分配物(例如，被占据的分配物的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)可包括包含条形码化核酸分子的微胶囊(例如，珠)和生物颗粒二者。
在另一方面，除了基于液滴的分配之外或作为基于液滴的分配的替代，生物颗粒可被封装在微胶囊内，所述微胶囊包括外壳、层或多孔基质，在所述外壳、层或多孔基质中夹带了一种或多种个体生物颗粒或小群生物颗粒。微胶囊可包括其他试剂。生物颗粒的封装可通过多种工艺进行。这种工艺将含有生物颗粒的水性流体与聚合物前体材料结合，在对聚合物前体施加特定刺激时，所述聚合物前体材料能够形成凝胶或其他固体或半固体基质。这种刺激可包括例如热刺激(加热或冷却)、光刺激(例如，通过光固化)、化学刺激(例如，通过交联、前体的聚合引发(例如，通过加入的引发剂)等，和/或上述的组合。
包含生物颗粒的微胶囊的制备可通过多种方法进行。例如，气刀液滴或气溶胶发生器可用于将前体流体的液滴分配到胶凝化溶液中，以便形成包括个体生物颗粒或小群生物颗粒的微胶囊。同样，基于膜的封装系统可用于产生包含如本文所述的封装的生物颗粒的微胶囊。本公开的微流体系统，例如图1所示的微流体系统，可容易地用于封装如本文所述的细胞。特别地，并参考图1，包含(i)生物颗粒114和(ii)聚合物前体材料(未显示)的水性流体112流入通道接合部110，在此其通过非水性流体116的流动被分配成液滴118、120。在封装方法的情况下，非水性流体116还可包括引发剂(未显示)以引起聚合物前体的聚合和/或交联，以形成包括夹带的生物颗粒的微胶囊。聚合物前体/引发剂对的示例包括在美国专利申请公开号2014/0378345中描述的那些，其出于所有目的通过引用整体并入本文。
例如，在聚合物前体材料包括线性聚合物材料，例如线性聚丙烯酰胺、PEG或其他线性聚合物材料的情况下，活化剂可包括交联剂，或活化形成的液滴内的交联剂的化学品。同样，对于包含可聚合单体的聚合物前体，活化剂可包含聚合引发剂。例如，在某些情况下，当聚合物前体包含丙烯酰胺单体与N,N'-双-(丙烯酰基)胱胺(BAC)共聚单体的混合物时，可在通道段104和106中的第二流体流116内提供试剂如四乙基亚甲基二胺(TEMED)，其可引发丙烯酰胺和BAC共聚为交联的聚合物网络或水凝胶。
在第二流体流116与第一流体流112在接合部110处接触时，在液滴形成期间，TEMED可从第二流体116扩散到包含线性聚丙烯酰胺的水性流体112中，这将激活液滴118、120内的聚丙烯酰胺的交联，从而导致形成凝胶(例如水凝胶)微胶囊，作为夹带细胞114的固体或半固体珠或颗粒。尽管根据聚丙烯酰胺封装进行了描述，但是其他"可活化"封装组合物也可用于本文所述的方法和组合物的情况中。例如，藻酸盐液滴的形成，随后暴露于二价金属离子(例如Ca2+离子)，可用作使用所述工艺的封装工艺。同样，琼脂糖液滴也可通过基于温度的胶凝化(例如，在冷却时等)转化为胶囊。
在一些情况下，封装的生物颗粒可选择性地从微胶囊释放，例如通过时间的推移或在施加特定刺激时，其使微胶囊充分降解以允许生物颗粒(例如细胞)或它的其他内含物从微胶囊释放，例如进入分配物(例如液滴)。例如，在上述聚丙烯酰胺聚合物的情况下，微胶囊的降解可通过引入合适的还原剂(如DTT等)，以切割交联聚合物基质的二硫键来实现。参见例如美国专利申请公开号2014/0378345，其出于所有目的通过引用整体并入本文。
生物颗粒可经受足以使前体聚合或胶凝的其他条件。足以使前体聚合或胶凝的条件可包括暴露于加热、冷却、电磁辐射和/或光。足以使前体聚合或胶凝的条件可包括足以使前体聚合或胶凝的任何条件。在聚合或胶凝化之后，可在生物颗粒周围形成聚合物或凝胶。聚合物或凝胶可以是对化学试剂或生化试剂可扩散渗透的。聚合物或凝胶可以是对生物颗粒的大分子成分可扩散地不可渗透的。如此，聚合物或凝胶可起作用以允许生物颗粒经受化学或生物化学操作，同时将大分子成分空间地限制到由聚合物或凝胶限定的液滴的区。聚合物或凝胶可包括二硫化物交联的聚丙烯酰胺、琼脂糖、藻酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)-二丙烯酸酯、PEG-丙烯酸酯、PEG-硫醇、PEG-叠氮化物、PEG-炔、其他丙烯酸酯、壳聚糖、透明质酸、胶原、纤维蛋白、明胶或弹性蛋白中的一种或多种。聚合物或凝胶可包括任何其他聚合物或凝胶。
聚合物或凝胶可被功能化以结合到靶向分析物，诸如核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质或其他分析物。聚合物或凝胶可通过被动机制聚合或胶凝。聚合物或凝胶在碱性条件下或在升高的温度下可以是稳定的。聚合物或凝胶可具有与珠的机械性质类似的机械性质。例如，聚合物或凝胶可具有与珠相似的尺寸。聚合物或凝胶可具有与珠相似的机械强度(例如拉伸强度)。聚合物或凝胶的密度可比油的密度低。聚合物或凝胶的密度可大致类似于缓冲液的密度。聚合物或凝胶可具有可调的孔径。可选择孔径以例如保留变性的核酸。可选择孔径以保持对外源性化学物质(例如氢氧化钠(NaOH))和/或内源性化学物质(例如抑制剂)的扩散渗透性。聚合物或凝胶可以是生物相容的。聚合物或凝胶可维持或增强细胞活力。聚合物或凝胶可以是生化相容的。聚合物或凝胶可热、化学、酶和/或光学聚合和/或解聚。
聚合物可包括用二硫键交联的聚(丙烯酰胺-共聚-丙烯酸)。聚合物的制备可包括两步反应。在第一活化步骤中，可将聚(丙烯酰胺-共聚-丙烯酸)暴露于酰化剂以将羧酸转化为酯。例如，可将聚(丙烯酰胺-共聚-丙烯酸)暴露于4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMTMM)。可将聚丙烯酰胺-共聚-丙烯酸暴露于4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓的其他盐。在第二交联步骤中，可将在第一步骤中形成的酯暴露于二硫化物交联剂。例如，可将酯暴露于胱胺(2,2'-二硫代双(乙胺))。在这两个步骤之后，生物颗粒可被通过二硫键连接在一起的聚丙烯酰胺链包围。如此，生物颗粒可被包裹在凝胶或基质(例如，聚合物基质)内或可包含凝胶或基质(例如，聚合物基质)，以形成"细胞珠"。细胞珠可含有生物颗粒(例如细胞)或生物颗粒的大分子成分(例如RNA、DNA、蛋白质等)。细胞珠可包括单细胞或多细胞，或单细胞或多细胞的衍生物。例如，在裂解和洗涤细胞后，可将来自细胞裂解物的抑制性组分洗掉，并且可将大分子成分作为细胞珠结合。本文公开的系统和方法可适用于包含生物颗粒的细胞珠(和/或液滴或其他分配物)和包含生物颗粒的大分子成分的细胞珠(和/或液滴或其他分配物)。
封装的生物颗粒可提供某些潜在的优点，比基于液滴的分配的生物颗粒更耐贮存和更轻便。此外，在一些情况下，可能期望允许生物颗粒在分析之前孵育选定的时间段，例如以便表征在存在或不存在不同刺激物的情况下此类生物颗粒随时间的变化。在此类情况下，封装可允许比在乳液液滴中的分配更长的孵育，尽管在一些情况下，液滴分配的生物颗粒也可被孵育不同的时间段，例如至少10秒、至少30秒、至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少5小时或至少10小时或更长。生物颗粒的封装可构成生物颗粒的分配，其他试剂被共同分配到该生物颗粒中。或者或此外，封装的生物颗粒可容易地沉积到如上所述的其他分配物(例如，液滴)中。
分配物可包括一个或多个独特标识符，例如条形码。条形码可预先、随后或同时递送到保持划分的或分配的生物颗粒的分配物。例如，条形码可在液滴产生之前、之后或同时被注入液滴中。将条形码递送至特定分配物允许随后将个体生物颗粒的特征归属于特定分配物。条形码可例如在核酸分子(例如寡核苷酸)上通过任何合适的机制递送至分配物。可经由微胶囊将条形码化核酸分子递送至分配物。在一些情况下，条形码化核酸分子可最初与微胶囊缔合，然后在施加刺激物时从微胶囊释放，所述刺激物允许核酸分子从微胶囊解离或释放。在一些情况下，微胶囊可包含珠。以下进一步详细描述珠。
图2显示用于将携带条形码的珠递送到液滴的微流体通道结构200的示例。通道结构200可包括在通道接合部210处连通的通道段201、202、204、206和208。在操作中，通道段201可将包含多个珠214(例如，具有核酸分子、寡核苷酸、分子标记)的水性流体212沿通道段201输送至接合部210中。多个珠214可源自珠的悬浮液。例如，通道段201可与包含珠214的水悬浮液的储器连接。通道段202可将包含多个生物颗粒216的水性流体212沿通道段202输送至接合部210中。多个生物颗粒216可源自生物颗粒的悬浮液。例如，通道段202可与包含生物颗粒216的水悬浮液的储器连接。在一些情况下，第一通道段201或第二通道段202或两个通道段中的水性流体212可包括一种或多种试剂，如下文进一步描述的。与水性流体212(例如油)不混溶的第二流体218可从通道段204和206中的每一个输送到接合部210。当来自每个通道段201和202的水性流体212与来自每个通道段204和206的第二流体218在通道接合部210处相遇时，水性流体212可在第二流体218中被分配成离散液滴220，并沿通道段208流动离开接合部210。通道段208可将离散液滴输送到流体地偶联到通道段208的出口储器，在该出口储器中可收获液滴。
作为替代，通道段201和202可在接合部210上游的另一接合部处相遇。在这种接合部，珠和生物颗粒可形成混合物，该混合物沿另一个通道被引导到接合部210，以产生液滴220。混合物可以交替的方式提供珠和生物颗粒，使得例如液滴包含单个珠和单个生物颗粒。
珠、生物颗粒和液滴可以基本规则的流型(例如，以规则的流速)沿通道流动。这种规则的流型(flow profiles)可允许液滴包括单个珠和单个生物颗粒。这种规则的流型可允许液滴具有大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的占据率(例如，具有珠和生物颗粒的液滴)。此类规则的流型和可用于提供此类规则的流型的装置提供于例如美国专利公开号2015/0292988中，其通过引用整体并入本文。
第二流体218可包括油，例如氟化油，其包括用于稳定所得液滴，例如抑制所得液滴220随后聚结的含氟表面活性剂。
所产生的离散液滴可包括个体生物颗粒216。所产生的离散液滴可包括条形码或其他携带试剂的珠214。所产生的离散液滴可包括个体生物颗粒和携带条形码的珠两者，例如液滴220。在一些情况下，离散液滴可包括多于一个的个体生物颗粒或不包括生物颗粒。在一些情况下，离散液滴可包含多于一个珠或不含珠。离散液滴可以是未被占据的(例如，没有珠，没有生物颗粒)。
有利地，分配生物颗粒和携带条形码的珠的离散液滴可有效地允许将条形码归属于分配物内的生物颗粒的大分子成分。分配物的内含物可保持与其他分配物的内含物分离。
如将理解的，本文所述的通道段可偶联到多种不同流体源或接收部件中的任何一个，包括储器、管道、歧管或其他系统的流体部件。如将理解的，微流体通道结构200可具有其他几何形状。例如，微流体通道结构可具有多于一个通道接合部。例如，微流体通道结构可具有2个、3个、4个或5个通道段，每个通道段携带在通道接合部处相遇的珠。流体可经由一个或多个流体流动单元沿一个或多个通道或储器被引导流动。流体流动单元可包括压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。流体还可或以其他方式通过施加的压差、离心力、电动泵送、真空、毛细或重力流等来控制。
珠可为多孔的、无孔的、固体的、半固体的、半流体性的、流体性的和/或其组合。在一些情况下，珠可为可溶解的、可破裂的和/或可降解的。在一些情况下，珠可能不可降解。在一些情况下，珠可为凝胶珠。凝胶珠可为水凝胶珠。凝胶珠可由分子前体形成，例如聚合物或单体物质。半固体珠可为脂质体珠。固体珠可包含金属，包括氧化铁、金和银。在一些情况下，珠可为二氧化硅珠。在一些情况下，珠可以是刚性的。在其他情况下，珠可以是柔性的和/或可压缩的。
珠可为任何合适的形状。珠形状的示例包括但不限于球形、非球形、椭圆形、长方形、无定形、圆形、圆柱形及其变型。
珠可具有均匀的尺寸或不均匀的尺寸。在一些情况下，珠的直径可为至少约1微米(μm)、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更大。在一些情况下，珠的直径可小于约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更小。在一些情况下，珠的直径可在约40-75μm、30-75μm、20-75μm、40-85μm、40-95μm、20-100μm、10-100μm、1-100μm、20-250μm或20-500μm范围内。
在某些方面，珠可作为具有相对单分散的尺寸分布的一群或多个珠提供。在可能需要在分配物内提供相对一致量的试剂的情况下，维持相对一致的珠特性，例如大小，可有助于整体一致性。特别地，本文所述的珠可具有这样的尺寸分布，其在其横截面尺寸上的差异系数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％，并且在一些情况下，小于15％、小于10％、小于5％或更小。
珠可包括天然和/或合成材料。例如，珠可包含天然聚合物、合成聚合物或天然和合成聚合物二者。天然聚合物的示例包括蛋白质和糖，例如脱氧核糖核酸、橡胶、纤维素、淀粉(例如直链淀粉、支链淀粉)、蛋白质、酶、多糖、丝、聚羟基脂肪酸酯、壳聚糖、葡聚糖、胶原、角叉菜胶、卵叶车前子、阿拉伯胶、琼脂、明胶、虫胶、苹婆胶、黄原胶、玉米糖胶、瓜尔胶、刺梧桐树胶、琼脂糖、藻酸、藻酸盐、或其天然聚合物。合成聚合物的示例包括丙烯酸类、尼龙、有机硅、氨纶、粘胶人造丝、聚羧酸、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙二醇、聚氨酯、聚乳酸、二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚(氯三氟乙烯)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯、聚异丁烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲醛)、聚甲醛、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(四氟乙烯)、聚(乙酸乙烯酯)、聚(乙烯醇)、聚(氯乙烯)、聚(偏二氯乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、聚(氟乙烯)、和/或它们的组合(例如，共聚物)。珠也可由除聚合物之外的材料形成，包括脂质、胶束、陶瓷、玻璃-陶瓷、材料复合物、金属、其他无机材料等。
在一些情况下，珠可含有分子前体(例如单体或聚合物)，其可通过分子前体的聚合形成聚合物网络。在一些情况下，前体可为已经聚合的物质，其能够经由例如化学交联进行进一步聚合。在一些情况下，前体可包含丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺单体、低聚物或聚合物中的一种或多种。在一些情况下，珠可包含预聚物，其为能够进一步聚合的低聚物。例如，聚氨酯珠可使用预聚物制备。在一些情况下，珠可包含可进一步聚合在一起的个体聚合物。在一些情况下，可通过不同前体的聚合产生珠，使得它们包含混合聚合物、共聚物和/或嵌段共聚物。在一些情况下，珠可包含聚合物前体(例如，单体、低聚物、线性聚合物)、核酸分子(例如，寡核苷酸)、引物和其他实体之间的共价键或离子键。在一些情况下，共价键可为碳-碳键或硫醚键。
交联可为永久的或可逆的，这取决于所用的特定交联剂。可逆交联可允许聚合物在适当的条件下线性化或解离。在一些情况下，可逆交联也可允许结合到珠表面的材料的可逆附着。在一些情况下，交联剂可形成二硫键。在一些情况下，形成二硫键的化学交联剂可为胱胺或修饰的胱胺。
在一些情况下，可在分子前体单元(例如，单体、低聚物或线性聚合物)或掺入珠的前体与核酸分子(例如，寡核苷酸)之间形成二硫键。例如，胱胺(包括修饰的胱胺)为包含二硫键的有机试剂，其可用作珠的个体单体前体或聚合物前体之间的交联剂。聚丙烯酰胺可在胱胺或包含胱胺的物质(例如，修饰的胱胺)的存在下聚合，以产生包含二硫键的聚丙烯酰胺凝胶珠(例如，包含化学可还原的交联剂的化学可降解的珠)。二硫键可允许珠在暴露于还原剂时被降解(或溶解)。
在一些情况下，壳聚糖(一种线性多糖聚合物)可与戊二醛通过亲水性链交联，以形成珠。壳聚糖聚合物的交联可通过由热、压力、pH变化和/或辐射引发的化学反应来实现。
在一些情况下，珠可包含丙烯酰胺基(acrydite)部分，其在某些方面可用于将一个或多个核酸分子(例如，条形码序列、条形码化核酸分子、条形码化寡核苷酸、引物或其他寡核苷酸)附着于珠。在一些情况下，丙烯酰胺基部分可指由丙烯酰胺基与一种或多种物质的反应，例如在聚合反应期间丙烯酰胺基与其他单体和交联剂的反应产生的丙烯酰胺基类似物。可修饰丙烯酰胺基部分以与待附着的物质例如核酸分子(例如，条形码序列、条形码化核酸分子、条形码化寡核苷酸、引物或其他寡核苷酸)形成化学键。可用能够形成二硫键的巯基基团修饰丙烯酰胺基部分，或者可用已经包含二硫键的基团修饰丙烯酰胺基部分。硫醇或二硫化物(通过二硫化物交换)可用作待附着的物质的锚定点，或者丙烯酰胺基部分的另一部分可用于附着。在一些情况下，附着可以是可逆的，使得当二硫键被破坏时(例如，在还原剂的存在下)，所附着的物质从珠释放。在其他情况下，丙烯酰胺基部分可包含可用于附着的反应性羟基。
用于核酸分子(例如，寡核苷酸)的附着的珠的官能化可通过多种不同的方法实现，包括聚合物内的化学基团的活化、聚合物结构中活性或可活化官能团的掺入、或在珠生产中在预聚物或单体阶段的附着。
例如，被聚合以形成珠的前体(例如，单体、交联剂)可包含丙烯酰胺基部分，使得当产生珠时，珠也包含丙烯酰胺基部分。丙烯酰胺基部分可附着于核酸分子(例如，寡核苷酸)，其可包括引发序列(例如，用于扩增靶核酸的引物、随机引物、用于信使RNA的引物序列)和/或一个或多个条形码序列。一个或多个条形码序列可包括对于偶联到给定珠的所有核酸分子相同的序列和/或横过偶联到给定珠的所有核酸分子不同的序列。核酸分子可被掺入到珠中。
在一些情况下，核酸分子可包含功能序列，例如用于附着于测序流式细胞，例如用于测序的P5序列。在一些情况下，核酸分子或其衍生物(例如，从核酸分子产生的寡核苷酸或多核苷酸)可包含另一功能序列，例如，用于附着于用于Illumina测序的测序流式细胞的P7序列。在一些情况下，核酸分子可包含条形码序列。在一些情况下，引物可进一步包含独特的分子标识符(UMI)。在一些情况下，引物可包含用于Illumina测序的R1引物序列。在一些情况下，引物可包含用于Illumina测序的R2引物序列。可与本公开的组合物、装置、方法和系统一起使用的此类核酸分子(例如，寡核苷酸、多核苷酸等)及其用途的示例提供于美国专利公开号2014/0378345和2015/0376609中，其中的每一个通过引用整体并入本文。
在一些情况下，包含官能团的前体可与其他前体聚合，以产生包含活化的或可活化的官能团的凝胶珠，所述官能团为反应性的或能够被活化以使得它变得为反应性的。然后，官能团可用于将另外的物质(例如，二硫化物接头、引物、其他寡核苷酸等)附着于凝胶珠。例如，一些包含羧酸(COOH)基团的前体可与其他前体共聚，以形成也包含COOH官能团的凝胶珠。在一些情况下，丙烯酸(包含游离COOH基团的物质)、丙烯酰胺和双(丙烯酰基)胱胺可共聚在一起，以产生包含游离COOH基团的凝胶珠。凝胶珠的COOH基团可被活化(例如，经由1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMTMM))，使得它们为反应性的(例如，当EDC/NHS或DMTMM用于活化时，对胺官能团为反应性的)。然后，活化的COOH基团可与包含待与珠连接的部分的合适物质(例如，包含胺官能团的物质，其中羧酸基团被活化以与胺官能团反应)反应。
在其聚合物网络中包含二硫键的珠可被另外的物质经由将一些二硫键还原成游离硫醇而官能化。二硫键可通过例如还原剂(例如DTT、TCEP等)的作用而被还原，以产生游离的巯基，而珠不会溶解。然后，珠的游离硫醇可与物质或包含另一个二硫键的物质的游离硫醇反应(例如，通过硫醇-二硫化物交换)，使得物质可与珠连接(例如，通过产生的二硫键)。在一些情况下，珠的游离硫醇可与任何其他合适的基团反应。例如，珠的游离硫醇可与包含丙烯酰胺基部分的物质反应。珠的游离硫醇基团可经由迈克尔加成化学与丙烯酰胺基反应，使得包含丙烯酰胺基的物质与珠连接。在某些情况下，通过包括硫醇封端剂如N-乙基马来酰亚胺或碘乙酸酯，可防止不受控制的反应。
可控制珠内二硫键的活化，使得仅少量二硫键被活化。例如，通过控制用于产生游离巯基的还原剂的浓度和/或用于在珠聚合中形成二硫键的试剂的浓度，可进行控制。在一些情况下，低浓度还原剂(例如，还原剂分子与凝胶珠的比率小于或等于约1:100,000,000,000、小于或等于约1:10,000,000,000、小于或等于约1:1,000,000,000、小于或等于约1:100,000,000、小于或等于约1:10,000,000、小于或等于约1:1,000,000、小于或等于约1:100,000、小于或等于约1:10,000)可用于还原。控制还原成游离硫醇的二硫键的数目可用于在官能化期间确保珠结构完整性。在一些情况下，光学活性剂(例如荧光染料)可经由珠的游离硫醇基团偶联到珠，并且用于定量存在于珠中的游离硫醇的数目和/或追踪珠。
在一些情况下，在凝胶珠形成之后将各部分加入到凝胶珠中可能是有利的。例如，在凝胶珠形成之后加入寡核苷酸(例如，条形码化寡核苷酸)，可避免在聚合期间可能发生的链转移终止期间物质的损失。此外，较小的前体(例如，不含侧链基团和连接部分的单体或交联剂)可用于聚合，并且由于粘性效应，其生长链端受阻最小化。在一些情况下，在凝胶珠合成之后的官能化可使物质(例如，寡核苷酸)待加载潜在破坏剂(例如，自由基)和/或化学环境的的暴露最小化。在一些情况下，所产生的凝胶可具有上临界溶解温度(UCST)，其可允许珠的温度驱动溶胀和坍塌。这样的官能团可有助于寡核苷酸(例如，引物)在随后用寡核苷酸对珠进行官能化期间渗入珠。生产后官能化也可用于控制珠中物质的加载比，使得例如加载比的可变性最小化。物质加载也可在分批过程中进行，使得可在单一批次中用物质官能化多个珠。
注射或以其他方式引入到分配物中的珠可包括可释放地、可切割地或可逆地附着的条形码。注射或以其他方式引入到分配物中的珠可包含可活化的条形码。注射或以其他方式引入到分隔物中的珠可以是可降解的、可破裂的或可溶解的珠。
条形码可以可释放地、可切割地或可逆地附着于珠，使得条形码可通过切割条形码分子和珠之间的连锁而释放或可释放，或通过下面的珠本身的降解而释放，从而允许条形码被其他试剂接近或可接近，或二者。在非限制性实例中，可通过二硫键的还原、使用限制酶、光活化切割或通过其他类型的刺激(例如化学的、热的、pH的、酶的等)和/或反应的切割来实现切割，如本文其他地方所述。可释放的条形码有时可被称为可激活的，因为它们一旦被释放就可用于反应。因此，例如，可激活的条形码可通过从珠(或本文所述的其他合适类型的分配物)释放条形码来激活。在所述方法和系统的上下文中也设想了其他可激活配置。
除了珠和相关分子(例如含条形码的核酸分子(例如条形码化寡核苷酸))之间的可切割连锁之外，或作为其替代，珠可以是可降解的、可破裂的或自发地或在暴露于一种或多种刺激物(例如温度变化、pH变化、暴露于特定化学物质或相、暴露于光、还原剂等)时可溶解的。在一些情况下，珠可以是可溶解的，使得当暴露于特定化学物质或环境变化如温度变化或pH变化时，珠的材料组分被溶解。在一些情况下，凝胶珠可在高温和/或碱性条件下降解或溶解。在一些情况下，珠可以是可热降解的，使得当珠暴露于适当的温度变化(例如，热)时，珠降解。与物质(例如，核酸分子，例如，条形码化寡核苷酸)结合的珠的降解或溶解可导致所述物质从珠释放。
从上述公开内容中可理解，珠的降解可指结合或夹带的物质从珠上解离，无论是有或没有结构降解物理珠本身。例如，珠的降解可涉及通过本文别处所述的一种或多种物质和/或方法切割可切割的连锁。在另一个示例中，夹带的物质可通过由于例如改变化学环境而产生的渗透压差从珠中释放。例如，由于渗透压差引起的珠孔径的改变通常可在珠本身没有结构降解的情况下发生。在一些情况下，由于珠的渗透溶胀而引起的孔径的增加可允许珠内夹带的物质的释放。在其他情况下，由于孔径收缩，珠的渗透收缩可使珠更好地保留夹带的物质。
可将可降解珠引入到分配物中，例如孔或乳液的液滴，使得当施加适当的刺激时，珠在分配物内降解并且任何相关的物质(例如寡核苷酸)在液滴内释放。游离物质(例如，寡核苷酸、核酸分子)可与包含在分配物中的其他试剂相互作用。例如，包含胱胺并通过二硫键与条形码序列连接的聚丙烯酰胺珠可与还原剂在油包水乳液的液滴内组合。在液滴内，还原剂可破坏各种二硫键，导致珠降解并将条形码序列释放到液滴的水性内部环境中。在另一个示例中，在碱性溶液中加热包含结合珠的条形码序列的液滴也可导致珠降解和将附着的条形码序列释放到液滴的水性内部环境中。
任何合适数量的分子标记分子(例如，引物、条形码化寡核苷酸)可与珠缔合，使得在从珠释放后，分子标记分子(例如，引物，例如，条形码化寡核苷酸)以预定义浓度存在于分配物中。可选择这样的预定义浓度以促进用于在分配物内产生测序文库的某些反应，例如扩增。在一些情况下，引物的预定义浓度可受到产生带有核酸分子(例如寡核苷酸)的珠的过程的限制。
在一些情况下，珠可非共价地加载一种或多种试剂。例如，通过使珠经受足以使珠溶胀的条件，允许有足够的时间使试剂扩散到珠的内部，以及使珠经受足以使珠去溶胀的条件，可非共价地加载珠。例如，通过将珠置于热力学有利的溶剂中，使珠经受更高或更低的温度，使珠经受更高或更低的离子浓度，和/或使珠经受电场，可实现珠的溶胀。珠的溶胀可通过各种溶胀方法来完成。例如，通过将珠转移到热力学不利的溶剂中、使珠经受更低或更高的温度、使珠经受更低或更高的离子浓度和/或除去电场，可实现珠的去溶胀。珠的去溶胀可通过各种去溶胀方法来实现。转移珠可能导致珠中的孔收缩。然后，这种收缩可阻碍珠内的试剂扩散到珠内部之外。阻碍可能是由于试剂和珠内部之间的空间相互作用。转移可微流体地完成。例如，通过将珠从一个并流溶剂流移动到不同的并流溶剂流，可实现转移。珠的溶胀性和/或孔径可通过改变珠的聚合物组成来调节。
在一些情况下，与前体连接的丙烯酰胺基部分、与前体连接的另一物质或前体本身可包含不稳定键，例如化学、热或光敏键，例如二硫键、UV敏感键等。一旦将包含不稳定键的丙烯酰胺基部分或其他部分引入珠，珠也可包含不稳定键。不稳定键可例如用于将物质(例如条形码、引物等)与珠可逆地连接(例如共价连接)。在一些情况下，热不稳定键可包括基于核酸杂交的附着，例如，其中寡核苷酸与附着于珠的互补序列杂交，使得杂交物的热熔融从珠或微胶囊释放寡核苷酸，例如，含有条形码的序列。
向凝胶珠中加入多种类型的不稳定键可导致产生能够响应于不同刺激的珠。每种类型的不稳定键可能对相关刺激(例如化学刺激、光、温度、酶等)敏感，使得通过施加适当的刺激，可控制经由每个不稳定键附着于珠的物质的释放。这种功能性可用于物质从凝胶珠的受控释放。在一些情况下，包含不稳定键的另一物质可在凝胶珠形成后通过例如如上所述的凝胶珠的活化官能团与凝胶珠连接。如将理解的，可释放地、可切割地或可逆地附着于本文所述的珠的条形码包括通过切割条形码分子和珠之间的连锁而释放或可释放的条形码，或通过下面的珠本身的降解而释放的条形码，从而允许条形码被其他试剂接近或可接近，或二者。
如本文所述的可释放的条形码有时可称为可激活的，因为它们一旦释放就可用于反应。因此，例如，可激活的条形码可通过从珠(或本文所述的其他合适类型的分配物)释放条形码来激活。在所述方法和系统的上下文中也设想了其他可激活配置。
除了可热切割的键、二硫键和UV敏感键之外，可偶联到前体或珠的不稳定键的其他非限制性实例包括酯键(例如，用酸、碱或羟胺切割)、邻位二醇键(例如，可经由高碘酸钠切割)、Diels-Alder键(例如，可经由热切割)、砜键(例如，可经由碱切割)、甲硅烷基醚键(例如，可经由酸切割)、糖苷键(例如，可经由淀粉酶切割)、肽键(例如，可经由蛋白酶切割)或磷酸二酯键(例如，可经由核酸酶(例如，DNAase切割)切割)。键可通过其他核酸分子靶向酶切割，例如限制酶(例如限制性内切核酸酶)，如下文进一步描述。
在珠产生期间(例如，在前体的聚合期间)，物质可被封装在珠中。这些物质可参与或不参与聚合。这些物质可进入聚合反应混合物中，使得在珠形成时产生的珠包含所述物质。在一些情况下，可在形成后将这样的物质加入凝胶珠。这些物质可包括，例如，核酸分子(例如，寡核苷酸)，用于核酸扩增反应的试剂(例如，引物、聚合酶、dNTPs、辅因子(例如，离子辅因子)，缓冲液)，包括本文所述的那些，用于酶反应的试剂(例如，酶、辅因子、底物、缓冲液)，用于核酸修饰反应例如聚合、结扎或消化的试剂，和/或用于一种或多种测序平台的模板制备(例如，标签化)的试剂(例如，用于的/>)。这些物质可包括本文所述的一种或多种酶，包括但不限于聚合酶、逆转录酶、限制性酶(例如，内切核酸酶)、转座酶、连接酶、蛋白酶K、脱氧核糖核酸酶等。这样的物质可包括本文其他地方描述的一种或多种试剂(例如，裂解剂、抑制剂、灭活剂、螯合剂、刺激剂)。这种物质的捕捉可通过在前体的聚合期间产生的聚合物网络密度、凝胶珠内的离子电荷的控制(例如，通过与聚合物质连接的离子物质)或通过其他物质的释放来控制。封装的物质可在珠降解时和/或通过施加能够从珠释放物质的刺激物而从珠释放。替代地或另外，物质可在分配物形成期间或之后在分配物(例如，液滴)中被分配。这样的物质可包括但不限于上述物质，其也可被封装在珠中。
可降解的珠可包含一种或多种具有不稳定键的物质，使得当珠/物质暴露于适当的刺激时，键断裂并且珠降解。不稳定键可为化学键(例如共价键、离子键)或者可为另一种类型的物理相互作用(例如范德华相互作用、偶极-偶极相互作用等)。在一些情况下，用于产生珠的交联剂可包含不稳定键。在暴露于适当条件时，不稳定键可被破坏，珠降解。例如，在包含胱胺交联剂的聚丙烯酰胺凝胶珠暴露于还原剂时，胱胺的二硫键可被破坏并且珠被降解。
与不降解的珠相比，当向珠施加适当的刺激时，可降解的珠可用于从珠更快地释放附着的物质(例如核酸分子、条形码序列、引物等)。例如，对于结合到多孔珠的内表面的物质或在封装物质的情况下，在珠降解时，物质可具有更大的移动性和对溶液中的其他物质的可接近性。在一些情况下，物质还可经由可降解接头(例如二硫化物接头)附着于可降解珠。可降解的接头可响应与可降解的珠相同的刺激，或者两种可降解的物质可响应不同的刺激。例如，条形码序列可经由二硫键附着于包含胱胺的聚丙烯酰胺珠。在将条形码珠暴露于还原剂时，珠降解，并且在条形码序列与珠之间的二硫键以及珠中的胱胺的二硫键二者断裂时，释放条形码序列。
从上述公开内容可理解，虽然被称为珠的降解，但是在如上所述的许多情况下，降解可指结合的或夹带的物质从珠的解离，无论是有或没有结构降解物理珠本身。例如，夹带的物质可通过由于例如改变化学环境而产生的渗透压差从珠中释放。例如，由于渗透压差引起的珠孔径的改变通常可在珠本身没有结构降解的情况下发生。在一些情况下，由于珠的渗透溶胀而引起的孔径的增加可允许珠内夹带的物质的释放。在其他情况下，由于孔径收缩，珠的渗透收缩可使珠更好地保留夹带的物质。
在提供可降解珠的情况下，避免在给定时间之前将此类珠暴露于引起此类降解的一种或多种刺激可能是有益的，以便例如避免过早的珠降解和由此类降解引起的问题，包括例如差的流动特性和聚集。例如，当珠包含可还原的交联基团时，例如二硫化物基团，期望避免这样的珠与还原剂(例如DTT)或其他二硫化物切割试剂接触。在这种情况下，在一些情况下，对本文所述的珠的处理将提供不含还原剂，如DTT。因为在商业酶制剂中通常提供还原剂，所以在处理本文所述的珠时，可能期望提供不含还原剂(或不含DTT)的酶制剂。这些酶的示例包括例如聚合酶制剂、逆转录酶制剂、连接酶制剂以及许多其他可用于处理本文所述的珠的酶制剂。术语"不含还原剂"或"不含DTT"的制剂可指制剂具有小于用于降解珠的此类材料的下限范围的约1/10、小于约1/50、或甚至小于约1/100。例如，对于DTT，不含还原剂的制剂可具有小于约0.01毫摩尔(mM)、0.005mM、0.001mM的DTT、0.0005mM的DTT，或甚至小于约0.0001mM的DTT。在许多情况下，DTT的量检测不到。
许多化学触发剂可用于触发珠的降解。这些化学变化的示例可包括但不限于pH介导的对珠内组分完整性的改变、通过切割交联键的珠组分降解和珠组分解聚。
在一些实施方式中，珠可由包含可降解的化学交联剂如BAC或胱胺的材料形成。这种可降解交联剂的降解可通过许多机理完成。在一些实例中，可使珠与可诱导氧化、还原或其他化学变化的化学降解剂接触。例如，化学降解剂可为还原剂，例如二硫苏糖醇(DTT)。还原剂的其他实例可包括β-巯基乙醇、(2S)-2-氨基-1,4-二巯基丁烷(二硫代丁胺或DTBA)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其组合。还原剂可降解在形成珠的凝胶前体之间形成的二硫键，并因此降解珠。在其他情况下，溶液pH的变化，例如pH的增加，可触发珠的降解。在其他情况下，暴露于水溶液(如水)可触发水解降解，并因此珠降解。
在施加热刺激时，还可诱导珠释放其内含物。温度的变化可引起珠的各种变化。例如，加热可导致固体珠液化。热量的变化可能导致珠的熔化，使得珠的一部分降解。在其他情况下，热量可能增加珠组分的内部压力，使得珠破裂或爆裂。热也可作用于用作构建珠的材料的热敏聚合物。
任何合适的试剂都可降解珠。在一些实施方式中，温度或pH的变化可用于降解珠中的热敏或pH敏感的键。在一些实施方式中，化学降解剂可用于通过氧化、还原或其他化学变化来降解珠中的化学键。例如，化学降解剂可为还原剂，例如DTT，其中DTT可降解在交联剂和凝胶前体之间形成的二硫键，从而降解珠。在一些实施方式中，可加入还原剂以降解珠，这可引起或可不引起珠释放其内含物。还原剂的示例可包括二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、(2S)-2-氨基-1,4-二巯基丁烷(二硫代丁胺或DTBA)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其组合。还原剂可以约0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM的浓度存在。还原剂可以至少约0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM或大于10mM的浓度存在。还原剂可以至多约10mM、5mM、1mM、0.5mM、0.1mM或更低的浓度存在。
任何合适数量的分子标记分子(例如，引物、条形码化寡核苷酸)可与珠缔合，使得在从珠释放后，分子标记分子(例如，引物，例如，条形码化寡核苷酸)以预定义浓度存在于分配物中。可选择这样的预定义浓度，以促进用于在分配物内产生测序文库的某些反应，例如扩增。在一些情况下，引物的预定义浓度可受到产生携带寡核苷酸的珠的过程的限制。
尽管图1和图2已经根据上述提供基本上单一占据的分配物进行了描述，但是，在某些情况下，可能期望提供多重占据的分配物，例如，在单一分配物内包含两个、三个、四个或更多个细胞和/或微胶囊(例如，珠)，所述微胶囊包含条形码化核酸分子(例如，寡核苷酸)。因此，如上所述，可控制包含生物颗粒和/或珠的流体和分配流体的流动特性，以提供这种多重占据的分配物。特别地，可控制流动参数，以在大于约50％的分配物、大于约75％的分配物、以及在一些情况下大于约80％、90％、95％或更高的分配物处提供给定的占据率。
在一些情况下，可使用另外的微胶囊将另外的试剂递送至分配物。在这种情况下，可能有利的是将不同的珠引入共同的通道或液滴产生接合部，从不同珠源(例如，含有不同的相关试剂)通过不同的通道入口引入这种共同的通道或液滴产生接合部(例如，接合部210)。在这种情况下，可控制不同珠流入通道或接合部的流量和频率，以提供来自各源的微胶囊的一定比例，同时确保这些珠与给定数量的生物颗粒(例如，每个分配物，一个生物颗粒和一个珠)在分配物中给定的配对或组合。
本文所述的分配物可包含小体积，例如，小于约10微升(μL)、5μL、1μL、900皮升(pL)、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL、500纳升(nL)、100nL、50nL或更少。
例如，在基于液滴的分配物的情况下，液滴的总体积可小于约1000pL、900pL、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL或更小。在用微胶囊共同分配的情况下，应理解，在分配物内的例如包括共同分配的生物颗粒和/或珠的样品流体体积可小于上述体积的约90％，小于上述体积的约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％或小于约10％。
如本文别处所述，分配物质可产生一个群体或多个分配物。在这种情况下，可产生或以其他方式提供任何合适数量的分配物。例如，可产生或以其他方式提供至少约1,000个分配物、至少约5,000个分配物、至少约10,000个分配物、至少约50,000个分配物、至少约100,000个分配物、至少约500,000个分配物、至少约1,000,000个分配物、至少约5,000,000个分配物、至少约10,000,000个分配物、至少约50,000,000个分配物、至少约100,000,000个分配物、至少约500,000,000个分配物、至少约1,000,000,000个分配物、或更多分配物。此外，多个分配物可包含未占据分配物(例如，空分配物)及占据分配物二者。
根据某些方面，生物颗粒可与裂解试剂一起被分配，以便在分配物内释放生物颗粒的内含物。在这种情况下，可在将生物颗粒引入到分配接合部/液滴产生区(例如接合部210)中的同时或紧邻其之前，例如通过通道接合部上游的一个或多个另外的通道，使裂解剂与生物颗粒悬浮液接触。根据其他方面，另外或替代地，生物颗粒可与其他试剂一起被分配，如将在下文进一步描述的。
图3显示用于共同分配生物颗粒和试剂的微流体通道结构300的示例。通道结构300可包括通道段301、302、304、306和308。通道段301和302在第一通道接合部309处连通。通道段302、304、306和308在第二通道接合部310处连通。
在示例操作中，通道段301可将包括多个生物颗粒314的水性流体312沿通道段301输送到第二接合部310中。作为替代或补充，通道段301可输送珠(例如凝胶珠)。珠可包含条形码分子。
例如，通道段301可与包含生物颗粒314的水悬浮液的储器连接。在到达第二接合部310的上游和紧邻其之前，通道段301可在第一接合部309处与通道段302相遇。通道段302可将悬浮在水性流体312中的多种试剂315(例如，裂解剂)沿通道段302输送到第一接合部309中。例如，通道段302可与包括试剂315的储器连接。在第一接合部309之后，通道段301中的水性流体312可将生物颗粒314和试剂315二者携带到第二接合部310。在一些情况下，通道段301中的水性流体312可包含一种或多种试剂，其可以是与试剂315相同或不同的试剂。与水性流体312不混溶的第二流体316(例如油)可从通道段304和306中的每一个递送到第二接合部310。在来自通道段301的水性流体312和来自通道段304和306中的每一个的第二流体316在第二通道接合部310处相遇时，水性流体312可在第二流体316中被分配为离散液滴318，并且沿通道段308流动离开第二接合部310。通道段308可将离散液滴318递送至流体地偶联到通道段308的出口储器，在该处可对它们进行收获。
第二流体316可包括油，例如氟化油，其包括用于稳定所得液滴的含氟表面活性剂，例如抑制所得液滴318的后续聚结。
所产生的离散液滴可包括个体生物颗粒314和/或一种或多种试剂315。在一些情况下，所产生的离散液滴可包括携带条形码的珠(未显示)，例如通过本文别处描述的其他微流体结构。在一些情况下，离散液滴可未被占据(例如，没有试剂，没有生物颗粒)。
有利地，当裂解试剂和生物颗粒被共同分配时，裂解试剂可促进生物颗粒的内含物在分配物内的释放。在分配物中释放的内含物可保持与其他分配物的内含物分离。
如将理解的，本文所述的通道段可偶联到多种不同流体源或接收部件中的任何一个，包括储器、管道、歧管或其他系统的流体部件。如将理解的，微流体通道结构300可具有其他几何形状。例如，微流体通道结构可具有多于两个通道接合部。例如，微流体通道结构可具有2个、3个、4个、5个或更多个通道段，每个通道段携带在通道接合部相遇的相同或不同类型的珠、试剂和/或生物颗粒。可控制每个通道段中的流体流动，以控制将不同元素分配成液滴。流体可经由一个或多个流体流动单元沿一个或多个通道或储器被引导流动。流体流动单元可包括压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等，以控制流体的流动。流体还可或以其他方式通过施加的压力差、离心力、电动泵送、真空、毛细或重力流等来控制。
裂解剂的示例包括生物活性试剂，例如用于裂解不同细胞类型的裂解酶，例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物等，例如溶菌酶、无色肽酶、溶葡球菌素、唇形酶、基塔拉斯酶(kitalase)、溶细胞酶，和可从例如Sigma-Aldrich公司(St Louis，MO)获得的多种其他裂解酶，以及其他可商购获得的裂解酶。其他裂解剂可另外或替代地与生物颗粒共同分配，以引起生物颗粒的内含物释放到分配物中。例如，在一些情况下，基于表面活性剂的裂解溶液可用于裂解细胞，尽管这些对于基于乳液的系统可能是不太期望的，其中表面活性剂可干扰稳定的乳液。在一些情况下，裂解溶液可包括非离子表面活性剂，例如TritonX-100和Tween 20。在一些情况下，裂解溶液可包括离子表面活性剂，例如十二烷基肌氨酸钠和十二烷基硫酸钠(SDS)。电穿孔、热、声或机械细胞破碎也可用于某些情况，例如基于非乳液的分配，例如生物颗粒的封装，其可作为液滴分配的补充或替代，其中封装的任何孔径足够小以在细胞破碎后保留给定大小的核酸片段。
除了上述与生物颗粒共同分配的裂解剂之外，其他试剂也可与生物颗粒共同分配，包括例如脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶失活剂或抑制剂，如蛋白酶K，螯合剂，如EDTA，以及用于去除或以其他方式降低不同细胞裂解物组分对后续核酸处理的负面活性或影响的其他试剂。此外，在封装的生物颗粒的情况下，可将生物颗粒暴露于适当的刺激，以从共同分配的微胶囊中释放生物颗粒或其内含物。例如，在一些情况下，化学刺激物可与封装的生物颗粒共同分配，以允许微胶囊降解并将细胞或其内含物释放到更大的分配物中。在一些情况下，该刺激可与本文别处描述的用于从其各自的微胶囊(例如，珠)释放核酸分子(例如，寡核苷酸)的刺激相同。在可选的方面，这可以是不同的且非重叠的刺激，以便允许封装的生物颗粒在与核酸分子释放到同一分配物中的不同时间被释放到分配物中。
其他试剂也可与生物颗粒共同分配，例如用于断裂生物颗粒的DNA的内切核酸酶、用于扩增生物颗粒的核酸片段并将条形码分子标记附着于扩增片段的DNA聚合酶和dNTPs。其他酶可以是共同分配的，包括但不限于聚合酶、转座酶、连接酶、蛋白酶K、脱氧核糖核酸酶等。另外的试剂还可包括逆转录酶，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和寡核苷酸、以及可用于模板转换的转换寡核苷酸(本文也称为"转换寡核苷酸"或"模板转换寡核苷酸")。在一些情况下，模板转换可用于增加cDNA的长度。在一些情况下，模板转换可用于将预定义的核酸序列附加到cDNA上。在模板转换的示例中，cDNA可由模板(例如细胞mRNA)的逆转录产生，其中具有末端转移酶活性的逆转录酶可采用模板非依赖性方式向cDNA加入额外的核苷酸(例如，聚C)。转换寡核苷酸可包括与另外的核苷酸(例如，聚G)互补的序列。cDNA上的另外的核苷酸(例如，聚C)可与转换寡核苷酸上的另外的核苷酸(例如，聚G)杂交，从而转换寡核苷酸可被逆转录酶用作模板以进一步延伸cDNA。模板转换寡核苷酸可包含杂交区和模板区。杂交区可包含能够与靶杂交的任何序列。在某些情况下，如前所述，杂交区包含一系列G碱基以互补cDNA分子3'末端的悬垂的C碱基。G碱基系列可包括1个G碱基、2个G碱基、3个G碱基、4个G碱基、5个G碱基或多于5个G碱基。模板序列可包括任何待掺入到cDNA中的序列。在一些情况下，模板区包含至少1个(例如，至少2个、3个、4个、5个或更多个)标记序列和/或功能序列。转换寡聚物可包含：脱氧核糖核酸；核糖核酸；修饰的核酸，包括2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、反向dT、5-甲基dC、2'-脱氧肌苷、Super T(5-羟基丁炔基(butynl)-2'-脱氧尿苷)、Super G(8-氮杂-7-脱氮鸟苷)、锁定核酸(LNA)、非锁定核酸(UNA，例如UNA-A、UNA-U、UNA-C、UNA-G)、Iso-dG、Iso-dC、2'氟碱基(例如氟C、氟U、氟A和氟G)或任何组合。
在一些情况下，转换寡核苷酸的长度可为至少约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个或250个核苷酸或更长。
在一些情况下，转换寡核苷酸的长度可为至多约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个或250个核苷酸。
一旦细胞的内含物被释放到它们各自的分配物中，其中包含的大分子组分(例如，生物颗粒的大分子成分，诸如RNA、DNA或蛋白质)可在分配物内被进一步处理。根据本文所述的方法和系统，个体生物颗粒的大分子组分内含物可提供有独特的标识符，使得在表征那些大分子组分时，它们可被归属于源自相同的一个或多个生物颗粒。通过将独特标识符具体分配给个体生物颗粒或生物颗粒的组，提供了将特征归属于个体生物颗粒或生物颗粒的组的能力。例如，可将核酸条形码形式的独特标识符与个体生物颗粒或生物颗粒群体分配或相关联，以便用独特标识符标记或标注生物颗粒的大分子组分(并且因此，其特征)。然后，这些独特的标识符可用于将生物颗粒的组分和特征归属于个体生物颗粒或生物颗粒的组。
在一些方面，这通过用独特标识符共同分配个体生物颗粒或生物颗粒的组来进行，例如如上所述(参考图2)。在一些方面，独特标识符以核酸分子(例如，寡核苷酸)的形式提供，所述核酸分子包含核酸条形码序列，所述核酸条形码序列可附着于或以其他方式与个体生物颗粒的核酸内含物或生物颗粒的其他组分相关联，并且特别地附着于那些核酸的片段。将核酸分子分配，使得在给定分配物中的核酸分子之间，其中所含有的核酸条形码序列相同，但在不同分配物之间，核酸分子可能并且确实具有不同的条形码序列，或在给定的分析中至少代表跨越所有分配物的大量不同条形码序列。在一些方面，仅一个核酸条形码序列可与给定分配物相关联，但在一些情况下，可存在两个或更多个不同的条形码序列。
核酸条形码序列可在核酸分子(例如，寡核苷酸)的序列内包括约6个至约20个或更多个核苷酸。在一些情况下，条形码序列的长度可以是约6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以是至少约6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以是至多约6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个核苷酸或更短。这些核苷酸可以是完全连续的，即在相邻核苷酸的单一序列段中，或者它们可被分成由一个或更多个核苷酸分开的两个或更多个分开的子序列。在一些情况下，分开的条形码子序列的长度可以是约4个至约16个核苷酸。在一些情况下，条形码子序列可以是约4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以是至少约4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以是至多约4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个核苷酸或更短。
共同分配的核酸分子还可包含可用于处理来自共同分配的生物颗粒的核酸的其他功能序列。这些序列包括：例如用于从分配物内的个体生物颗粒扩增基因组DNA同时附着相关条形码序列的靶向或随机/通用扩增引物序列，测序引物或引物识别位点，杂交或探测序列，例如用于鉴定序列的存在或用于下拉条形码化核酸，或许多其他潜在功能序列中的任一种。也可使用共同分配寡核苷酸的其他机制，包括例如两个或更多个液滴的聚结，其中一个液滴含有寡核苷酸，或寡核苷酸微分配到分配物中，例如微流体系统内的液滴。
在一个示例中，提供了微胶囊，例如珠，其各包含可释放地附着于珠的大量上述条形码化核酸分子(例如，条形码化寡核苷酸)，其中附着于特定珠的所有核酸分子将包含相同的核酸条形码序列，但其中在所使用的珠的群体中存在大量多样化条形码序列。在一些实施方式中，水凝胶珠(例如包含聚丙烯酰胺聚合物基质)被用作固体支持物和将核酸分子递送至分配物中的递送媒介物，因为它们能够携带大量核酸分子，并且可被配置成在暴露于特定刺激时释放那些核酸分子，如本文别处所述。在一些情况下，珠群体提供多样化条形码序列文库，其包括至少约1,000个不同的条形码序列、至少约5,000个不同的条形码序列、至少约10,000个不同的条形码序列、至少约50,000个不同的条形码序列、至少约100,000个不同的条形码序列、至少约1,000,000个不同的条形码序列、至少约5,000,000个不同的条形码序列、或至少约10,000,000个不同的条形码序列或更多。另外，每个珠可提供有大量附着的核酸(例如，寡核苷酸)分子。特别地，在个体珠上包括条形码序列的核酸分子的分子数目可为至少约1,000个核酸分子、至少约5,000个核酸分子、至少约10,000个核酸分子、至少约50,000个核酸分子、至少约100,000个核酸分子、至少约500,000个核酸、至少约1,000,000个核酸分子、至少约5,000,000个核酸分子、至少约10,000,000个核酸分子、至少约50,000,000个核酸分子、至少约100,000,000个核酸分子、至少约250,000,000个核酸分子，并且在一些情况下，至少约十亿个核酸分子或更多。给定珠的核酸分子可包括相同(或共同)条形码序列、不同条形码序列、或二者的组合。给定珠的核酸分子可包括多组核酸分子。给定组的核酸分子可包括相同的条形码序列。相同的条形码序列可不同于另一组的核酸分子的条形码序列。
此外，当将珠群体分配时，所得分配物群体还可包括多样化条形码文库，其包括至少约1,000个不同的条形码序列、至少约5,000个不同的条形码序列、至少约10,000个不同的条形码序列、至少约50,000个不同的条形码序列、至少约100,000个不同的条形码序列、至少约1,000,000个不同的条形码序列、至少约5,000,000个不同的条形码序列、或至少约10,000,000个不同的条形码序列。另外，群体的每个分配物可包括至少约1,000个核酸分子、至少约5,000个核酸分子、至少约10,000个核酸分子、至少约50,000个核酸分子、至少约100,000个核酸分子、至少约500,000个核酸、至少约1,000,000个核酸分子、至少约5,000,000个核酸分子、至少约10,000,000个核酸分子、至少约50,000,000个核酸分子、至少约100,000,000个核酸分子、至少约250,000,000个核酸分子，并且在一些情况下，至少约十亿个核酸分子。
在一些情况下，可期望在给定分配物内掺入多个不同的条形码，其附着于分配物内的单个珠或多个珠。例如，在一些情况下，混合的但已知的一组条形码序列可在后续处理中提供更大的鉴定保证，例如，通过向给定分配物提供条形码的更强地址或归属，作为来自给定分配物的输出的重复或独立确认。
在对珠施加特定刺激时，核酸分子(例如寡核苷酸)可从珠释放。在一些情况下，刺激可为光刺激，例如通过切割释放核酸分子的光不稳定连锁。在其他情况下，可使用热刺激，其中珠环境的温度升高将导致切割连锁或核酸分子从珠的其他释放。仍在其他情况下，可使用化学刺激，其切割核酸分子与珠的连锁，或者以其他方式导致核酸分子从珠释放。在一种情况下，这种组合物包括上述用于封装生物颗粒的聚丙烯酰氨基质，并且通过暴露于还原剂(例如DTT)，可被降解以供释放所附着的核酸分子。
在一些方面，提供了用于受控分配的系统和方法。通过调节通道架构(例如，微流体通道架构)中的某些几何特征，可控制液滴尺寸。例如，可调节通道的膨胀角度、宽度和/或长度，以控制液滴尺寸。
图4显示用于将珠受控地分配到离散液滴中的微流体通道结构的示例。通道结构400可包括在通道接合部406(或交叉点)处与储器404连通的通道段402。储器404可为腔室。如本文所用，任何对"储器"的提及也可指"腔室"。在操作中，包括悬浮的珠412的水性流体408可沿通道段402被输送到接合部406中，以遇到与储器404中的水性流体408不混溶的第二流体410，以产生流入储器404中的水性流体408的液滴416、418。在水性流体408和第二流体410相遇的接合点406处，可基于诸如接合点406处的流体动力、两种流体408、410的流速、流体特性和通道结构400的某些几何参数(例如，w、h0、α等)的因素，形成液滴。通过从通道段402经由接合点406连续地注入水性流体408，可在储器404中收集多个液滴。
所产生的离散液滴可包括珠(例如，如在被占据的液滴416中)。或者，所产生的离散液滴可包括多于一个珠。或者，所产生的离散液滴可不包括任何珠(例如，如在未占据的液滴418中)。在一些情况下，所产生的离散液滴可含有一种或多种生物颗粒，如本文别处所述。在一些情况下，所产生的离散液滴可包含一种或多种试剂，如本文别处所述。
在一些情况下，水性流体408可具有基本上均匀浓度或频率的珠412。珠412可从单独的通道(图4中未显示)引入通道段402。通过控制将珠412引入通道段402的频率和/或在通道段402和单独通道中的流体的相对流速，可控制通道段402中的珠412的频率。在一些情况下，可从多个不同的通道将珠引入通道段402中，并相应地控制频率。
在一些情况下，通道段402中的水性流体408可包括生物颗粒(例如，参照图1和图2所述)。在一些情况下，水性流体408可具有基本上均匀浓度或频率的生物颗粒。如同珠一样，生物颗粒可从单独的通道引入通道段402。通过控制将生物颗粒引入通道段402的频率和/或在通道段402和单独通道中的流体的相对流速，可控制通道段402中的水性流体408中的生物颗粒的频率或浓度。在一些情况下，生物颗粒可从多个不同的通道引入通道段402，并且相应地控制频率。在一些情况下，第一单独通道可引入珠，第二单独通道可将生物颗粒引入通道段402中。引入珠的第一单独通道可在引入生物颗粒的第二单独通道的上游或下游。
第二流体410可包括油，例如氟化油，其包括用于稳定所得液滴的含氟表面活性剂，例如抑制所得液滴随后聚结。
在一些情况下，第二流体410可不经受和/或被引导至储器404中的或离开储器404的任何流动。例如，第二流体410在储器404中可为基本上静止的。在一些情况下，第二流体410可经受在储器404内的流动，但不在储器404中或离开储器404，诸如经由向储器404施加压力和/或如受在接合点406处的水性流体408的来流(incomingflow)的影响。或者，第二流体410可经受和/或被引导至储器404中的或离开储器404的流动。例如，储器404可以是将第二流体410从上游引导到下游的通道，从而输送所产生的液滴。
在接合点406处或附近的通道结构400可具有某些几何特征，这些几何特征至少部分地确定由通道结构400形成的液滴的尺寸。通道段402可在接合点406处或附近具有高度h0和宽度w。例如，通道段402可包括矩形横截面，其导致具有较宽横截面(例如在宽度或直径上)的储器404。或者，通道段402的横截面可为其他形状，例如圆形、梯形、多边形或任何其他形状。储器404的顶壁和底壁在接合点406处或附近可以膨胀角α倾斜。膨胀角度α允许舌部(在接合部406处离开通道段402并在液滴形成之前进入储器404的水性流体408的一部分)的深度增加，并促进减小中间形成的液滴的曲率。液滴尺寸可随着膨胀角的增加而减小。对于上述几何参数h0、w和α，可通过以下等式预测所得液滴半径Rd：
例如，对于w＝21μm、h＝21μm且α＝3°的通道结构，预测的液滴尺寸为121μm。在另一个示例中，对于具有w＝25μm、h＝25μm且α＝5°的通道结构，预测的液滴尺寸为123μm。在另一个示例中，对于w＝28μm、h＝28μm且α＝7°的通道结构，预测的液滴尺寸为124μm。
在一些情况下，膨胀角α可在约0.5°至约4°、约0.1°至约10°或约0°至约90°的范围之间。例如，膨胀角可为至少约0.01°、0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°或更高。在一些情况下，膨胀角可为至多约89°、88°、87°、86°、85°、84°、83°、82°、81°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°、1°、0.1°、0.01°或更小。在一些情况下，宽度w可在约100微米(μm)到约500μm的范围之间。在一些情况下，宽度w可在约10μm到约200μm的范围之间。或者，宽度可小于约10微米。或者，宽度可大于约500微米。在一些情况下，进入接合部406的水性流体408的流速可在约0.04微升(μL)/分钟(min)到约40μL/min之间。在一些情况下，进入接合部406的水性流体408的流速可在约0.01微升(μL)/分钟(min)到约100μL/min之间。或者，进入接合部406的水性流体408的流速可小于约0.01μL/min。或者，进入接合部406的水性流体408的流速可大于约40μL/min，例如45μL/min、50μL/min、55μL/min、60μL/min、65μL/min、70μL/min、75μL/min、80μL/min、85μL/min、90μL/min、95μL/min、100μL/min、110μL/min、120μL/min、130μL/min、140μL/min、150μL/min或更大。在较低的流速下，例如大约小于或等于10微升/分钟的流速，液滴半径可不取决于进入接合部406的水性流体408的流速。
在一些情况下，所产生的液滴的至少约50％可具有均匀的尺寸。在一些情况下，所产生的液滴的至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多可具有均匀的尺寸。或者，所产生的液滴少于约50％可具有均匀的尺寸。
通过增加产生点，例如增加水性流体408通道段(例如通道段402)和储器404之间的接合部(例如接合部406)的数量，可增加液滴产生的吞吐量。作为替代或补充，通过增加通道段402中的水性流体408的流速，可增加液滴产生的吞吐量。
图5显示用于增加的液滴产生吞吐量的微流体通道结构的示例。微流体通道结构500可包括多个通道段502和储器504。多个通道段502中的每一个可与储器504流体连通。通道结构500可包括在多个通道段502和储器504之间的多个通道接合部506。每个通道接合部处可为液滴产生点。来自图4中的通道结构400的通道段402及其部件的任何描述可对应于通道结构500中的多个通道段502的给定通道段及其相应部件的任何描述。来自通道结构400的储器404及其部件的任何描述可对应于来自通道结构500的储器504及其相应部件的任何描述。
多个通道段502的每一个通道段可包含水性流体508，该水性流体508包含悬浮的珠512。储器504可包括与水性流体508不混溶的第二流体510。在一些情况下，第二流体510可不经受和/或被引导到储器504中的或离开储器504的任何流。例如，第二流体510在储器504中可以是基本上静止的。在一些情况下，第二流体510可经受在储器504内的流动，但不在储器504中或离开储器504，诸如经由向储器504施加压力和/或如受在接合点处的水性流体508的来流影响。或者，第二流体510可经受和/或被引导到储器504中的或离开储器504的流。例如，储器504可为将第二流体510从上游引导至下游的通道，从而输送所产生的液滴。
在操作中，包括悬浮的珠512的水性流体508可沿多个通道段502输送到多个接合部506中，以与储器504中的第二流体510相遇，以产生液滴516、518。液滴可从每个通道段在与储器504的每个相应的接合部处形成。在水性流体508和第二流体510相遇的接合点处，基于诸如接合点处的流体动力、两种流体508、510的流速、流体特性和通道结构500的某些几何参数(例如，w、h0、α等)的因素，可形成液滴，如本文别处所述。通过从多个通道段502经由多个接合点506连续地注射水性流体508，可在储器504中收集多个液滴。吞吐量可随着通道结构500的平行通道配置而显著增加。例如，具有五个包括水性流体508的入口通道段的通道结构可产生比具有一个入口通道段的通道结构频繁五倍的液滴，条件是通道段中的流体流速基本上相同。不同入口通道段中的流体流率可基本相同或可基本不同。通道结构可具有与实际的和允许的储器尺寸一样多的平行通道段。例如，通道结构可具有至少约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、500个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1500个、5000个或更多个平行或基本上平行的通道段。
几何参数w、h0和α对于多个通道段502中的每个通道段可以是均匀的或不均匀的。例如，每个通道段在其与储器504的相应通道接合部处或附近可具有相同或不同的宽度。例如，每个通道段在其与储器504的相应通道接合部处或附近可具有相同或不同的高度。在另一个示例中，储器504在与多个通道段502的不同通道接合部处可具有相同或不同的膨胀角。当几何参数均匀时，有利地，即使吞吐量增加，液滴尺寸也可被控制为均匀的。在一些情况下，当希望具有不同的液滴尺寸分布时，多个通道段502的几何参数可相应地变化。
在一些情况下，所产生的液滴的至少约50％可具有均匀的尺寸。在一些情况下，所产生的液滴的至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多可具有均匀的尺寸。或者，所产生的液滴中少于约50％可具有均匀的尺寸。
图6显示用于增加的液滴产生吞吐量的微流体通道结构的另一示例。微流体通道结构600可包括多个通道段602，其通常围绕储器604的周边圆形排列。多个通道段602中的每一个可与储器604流体连通。通道结构600可包括多个通道段602与储器604之间的多个通道接合部606。每个通道接合部可为液滴产生点。来自图2中的通道结构400的通道段402及其部件的任何描述可对应于通道结构600中的多个通道段602的给定通道段及其相应部件的任何描述。来自通道结构400的储器404及其部件的任何描述可对应于来自通道结构600的储器604及其相应部件的任何描述。
多个通道段602的每一个通道段可包含水性流体608，该水性流体608包含悬浮的珠612。储器604可包括与水性流体608不混溶的第二流体610。在一些情况下，第二流体610可不经受和/或被引导到储器604中的或离开储器604的任何流。例如，第二流体610在储器604中可以是基本上静止的。在一些情况下，第二流体610可经受在储器604内的流动，但不在储器604中或离开储器604，诸如经由向储器604施加压力和/或如受在接合点处的水性流体608的来流影响。或者，第二流体610可经受和/或被引导到储器604中的或离开储器604的流。例如，储器604可以是将第二流体610从上游引导至下游的通道，从而输送所产生的液滴。
在操作中，包括悬浮的珠612的水性流体608可沿多个通道段602输送到多个接合部606中，以与储器604中的第二流体610相遇，以产生多个液滴616。液滴可从每个通道段在与储器604的每个相应的接合部处形成。在水性流体608和第二流体610相遇的接合点处，基于诸如接合点处的流体动力、两种流体608、610的流速、流体特性和通道结构600的某些几何参数(例如，通道段602的宽度和高度、储器604的膨胀角等)的因素，可形成液滴，如本文别处所述。通过从多个通道段602经由多个接合点606连续地注射水性流体608，可在储器604中收集多个液滴。吞吐量可随着通道结构600的基本上平行的通道配置而显著增加。通道结构可具有与实际的和允许的储器尺寸一样多的基本上平行的通道段。例如，通道结构可具有至少约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1500个、5000个或更多个平行或基本上平行的通道段。多个通道段可例如围绕储器的边缘或周边基本上均匀地间隔开。或者，多个通道段的间隔可以是不均匀的。
储器604在每个通道接合点处或附近可具有膨胀角α(图6中未显示)。多个通道段602中的每个通道段在通道接合点处或附近可具有宽度w和高度h0。几何参数w、h0和α对于多个通道段602中的每个通道段可为均匀的或不均匀的。例如，每个通道段在其与储器604的相应通道接合部处或附近可具有相同或不同的宽度。例如，每个通道段可在其与储器604的相应通道接合部处或附近具有相同或不同的高度。
储器604在与多个通道段602的不同通道接合部处可具有相同或不同的膨胀角。例如，圆形储器(如图6所示)可具有圆锥形、圆顶状或半球形顶棚(例如顶壁)，以便在多个通道接合部606处或附近为每个通道段602提供相同或基本相同的膨胀角。当几何参数均匀时，有利地，即使吞吐量增加，所得液滴尺寸也可被控制成为均匀的。在一些情况下，当希望具有不同的液滴尺寸分布时，多个通道段602的几何参数可相应地变化。
在一些情况下，所产生的液滴中的至少约50％可具有均匀的尺寸。在一些情况下，所产生的液滴中的至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多可具有均匀的尺寸。或者，所产生的液滴中少于约50％可具有均匀的尺寸。注入液滴中的珠和/或生物颗粒可具有均匀的尺寸或可不具有均匀的尺寸。
例如，如上所述或本文其他地方所述的通道网络可流体地偶联到适当的流体部件。例如，入口通道段流体地偶联到它们要递送到通道接合部的材料的适当来源。这些源可包括多种不同的流体部件中的任何一种，从限定在微流体装置的主体结构中或连接到微流体装置的主体结构的简单储器到从装置外的源、歧管、流体流动单元(例如，致动器、泵、压缩机)等递送流体的流体导管。同样地，出口通道段(例如，通道段208、储器604等)可流体地偶联到用于经分配的细胞的接收容器或导管，以用于后续处理。同样，这可以是限定在微流体装置的主体中的储器，或者它可以是用于将经分配的细胞递送至随后的工艺操作、仪器或部件的流体导管。
本文所述的方法和系统可用于大大提高单细胞施用和/或接收基于液滴的输入的其他施用的效率。例如，在分选已占据的细胞和/或适当大小的细胞之后，可进行的后续操作可包括产生扩增产物、纯化(例如，通过固相可逆固定(SPRI))、进一步处理(例如，剪切、连接功能序列、以及后续扩增(例如，通过PCR))。这些操作可批量发生(例如，在分配物之外)。在分配物为乳液中的液滴的情况下，可破坏乳液，并且合并液滴的内含物用于另外的操作。可与携带条形码的珠一起共同分配的另外的试剂可包括阻断核糖体RNA(rRNA)的寡核苷酸和消化来自细胞的基因组DNA的核酸酶。或者，rRNA去除剂可在额外的处理操作期间应用。通过这种方法产生的结构物的配置可帮助最小化(或避免)测序期间聚T序列的测序和/或多核苷酸序列的5'端的测序。扩增产物(例如第一扩增产物和/或第二扩增产物)可经受测序，用于序列分析。在一些情况下，可使用用于测序的部分发夹扩增(PHASE)方法进行扩增。
多种应用需要评估生物颗粒群内不同生物颗粒或生物体类型的存在和定量，包括例如微生物组分析和表征、环境测试、食品安全测试、流行病学分析，例如跟踪污染等。
形成凝胶基质的方法
本文所述的方法和系统可用于产生离散液滴，所述离散液滴包含被配置成在受控条件(例如，点击化学)下交联的个体生物颗粒和聚合物分子。在一些情况下，交联聚合物可为可降解基质。在一些情况下，交联聚合物可为凝胶。在一些情况下，交联聚合物可为水凝胶基质。在一些情况下，交联聚合物可包封生物样品，例如细胞或核酸。在一些情况下，另外的试剂可渗透到交联的基质中。在一些情况下，聚合物分子之间的交联可以是可切割的，并且基质内包封的内含物可在基质劈裂或降解后释放。在一些情况下，交联基质和/或包封在其中的内含物可被条形码化。
图7显示用于共同分配生物颗粒和试剂以产生交联的水凝胶基质的微流体通道结构700的示例。通道结构700可包括通道段701、702、704、706和708。通道段701和702在第一通道接合部709处连通。通道段701、702、704、706和708在第二通道接合部710处连通。
在示例性操作中，通道段701可将包含多个生物颗粒714的水性流体712沿通道段701输送到第二接合部710中。作为替代或此外，通道段701可输送珠(例如，凝胶珠)。珠可包含条形码分子。
例如，通道段701可与包含生物颗粒714的水悬浮液的储器连接。在到达第二接合部710的上游和紧邻其之前，通道段701可在第一接合部709处与通道段702相遇。通道段702可将悬浮在水性流体712中的多种试剂715A(例如，聚合物分子A)和715B(例如，聚合物分子B)沿通道段702输送到第一接合部709中。例如，通道段702可与包括试剂715A和715B的储器连接。在第一接合部709之后，通道段701中的水性流体712可将生物颗粒714和试剂715A及715B二者携带到第二接合部710。在一些情况下，通道段701中的水性流体712可包含一种或多种试剂，其可以是与试剂715A和715B相同或不同的试剂。与水性流体712不混溶的第二流体716(例如油)可从通道段704和706中的每一个递送到第二接合部710。在来自通道段701的水性流体712和来自通道段704和706中的每一个的第二流体716在第二通道接合部710处相遇时，水性流体712可在第二流体716中被分配为离散液滴718，并且沿通道段708流动离开第二接合部710。通道段708可将离散液滴718递送至流体地偶联到通道段708的出口储器，在该处可对它们进行收获。
第二流体716可包括油，例如氟化油，其包括用于稳定所得液滴的含氟表面活性剂，例如抑制所得液滴718的后续聚结。
所产生的离散液滴可包括个体生物颗粒714和/或一种或多种试剂715A和715B。在一些情况下，所产生的离散液滴可包括携带条形码的珠(未显示)，例如通过本文别处描述的其他微流体结构。在一些情况下，离散液滴可未被占据(例如，没有试剂，没有生物颗粒)。如下所示，点击化学可用于交联在相同离散液滴中捕捉的聚合物分子，以产生水凝胶(例如715A和715B)。在一些情况下，点击化学可用于产生可降解水凝胶(例如715A和715B)。
凝胶
如本文所用，术语"凝胶"通常是指三维聚合物基质；水凝胶为凝胶的一个示例。凝胶可具有液体和固体两种特性，并且可展现出有组织的材料结构。水凝胶可为三维的、亲水性的、聚合基质，其被配置成吸收/容纳水或生物流体。在一些情况下，当水为分散介质时，水凝胶可变得被水溶胀。参见例如Eur.Polym.J.,2015,65:252-67和J.Adv.Res,2015,6:105-21，其中的每一个出于所有目的通过引用整体并入本文。水凝胶可采用许多形式。在一些情况下，水凝胶可为通过单体之间的交联反应产生的水溶胀的、交联聚合物网络。在一些情况下，水凝胶可为将水保留在其基质内但可能不溶解于水中的聚合物材料。
水凝胶可采用许多方式合成。在一些情况下，水凝胶可在一步程序中合成，例如多官能单体的聚合和同时发生的交联反应。在一些情况下，水凝胶可采用多步骤程序合成，例如首先单体聚合，随后通过使用可响应不同条件的正交反应性基团进行交联反应以允许逐步的方法。
水凝胶产品可基于它们的聚合物组成(均聚水凝胶、共聚水凝胶或多聚合物水凝胶)、交联类型(化学交联或物理交联)、物理外观(基质、膜或微球)、网络电荷(非离子的、离子的、两性的(amphoteric)或两性的(ampholytic)、或两性离子的)和来源(天然的(例如壳聚糖)或合成的(例如聚丙烯酰胺))进行分类。
水凝胶可通过可产生交联聚合物的技术合成。在一些情况下，共聚/交联自由基聚合可通过使亲水性单体与多官能交联分子反应而用于产生水凝胶。这可通过例如经由化学反应连接聚合物链、使用电离辐射以产生主链自由基来完成，所述主链自由基可作为交联接合重组，或者物理相互作用，例如缠结、静电和微晶形成。聚合类型可包括本体、溶液和悬浮聚合。
悬浮聚合或分散聚合可用于油包水或乳液工艺，有时称为"反相悬浮"。在一些情况下，单体和引发剂可作为均匀混合物分散在油相或烃相中。在一些情况下，可首先制备两种类型的聚合物分子，每种具有用于交联目的反应性交联部分。然后，这两种类型的聚合物分子可被包封在乳液中，使得两种反应性交联部分可反应并在两种类型的聚合物之间形成交联，从而完成水凝胶的合成。
在一些情况下，水凝胶可由单体、聚合引发剂和交联试剂合成。聚合反应完成后，形成的水凝胶可与剩余的原料和不需要的副产物等分离。形成的聚合物的长度可根据水凝胶的所需性质来控制。
用于合成水凝胶的聚合类型可包括但不限于接枝聚合、交联聚合、水溶性聚合物的网络形成和辐射交联聚合等。
聚合可通过引发剂或产生自由基的化合物引发，例如过氧化苯甲酰、2,2-偶氮-异丁腈(AIBN)和过氧化二硫酸铵，或通过使用UV辐射、γ辐射或电子束辐射引发。
在一些情况下，本文公开的水凝胶包含聚合物，例如聚(丙烯酸)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚丙烯酰胺、一些多糖或其任何衍生物。这些聚合物可为无毒的，并且它们可用于各种药物和生物医学应用中。因此，在一些情况下，它们可能不需要从反应体系中除去，从而消除了在水凝胶形成之后对纯化步骤的需要。
聚合物可包括特定长度或长度范围的聚合物分子。聚合物分子的长度可为至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、1,000个、2,000个、5,000个、10,000个、20,000个、50,000个、100,000个、200,000个、500,000个、1,000,000个、2,000,000个、5,000,000个、10,000,000个、20,000,000个、100,000,000个、200,000,000个、500,000,000个或1,000,000,000个主链(backbone)原子或分子(例如，碳)。聚合物分子的长度可为至多2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、1,000个、2,000个、5,000个、10,000个、20,000个、50,000个、100,000个、200,000个、500,000个、1,000,000个、2,000,000个、5,000,000个、10,000,000个、20,000,000个、100,000,000个、200,000,000个、500,000,000或1,000,000,000个主链原子或分子(例如碳)。聚合物分子的长度可为至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、1,000个、2,000个、5,000个、10,000个、20,000个、50,000个、100,000个、200,000个、500,000个、1,000,000个、2,000,000个、5,000,000个、10,000,000个、20,000,000个、100,000,000个、200,000,000个、500,000,000或1,000,000,000个单体单元(例如乙烯基分子或丙烯酰胺分子)。聚合物分子的长度可为至多2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、1,000个、2,000个、5,000个、10,000个、20,000个、50,000个、100,000个、200,000个、500,000个、1,000,000个、2,000,000个、5,000,000个、10,000,000个、20,000,000个、100,000,000个、200,000,000个、500,000,000或1,000,000,000个单体单元(例如乙烯基分子或丙烯酰胺分子)。
点击化学
本文所用的术语"点击化学"通常是指模块化的、范围广泛的、产生高产率的、仅产生无害的副产物(例如可通过非色谱方法除去的那些)的反应，并且是立体特异性的(但不一定是对映选择性的)。参见，例如Angew.Chem.Int.Ed.,2001,40(11):2004-2021，其出于所有目的通过引用整体并入本文。在一些情况下，点击化学可描述可在温和的水性条件下选择性地彼此反应的官能团对。
点击化学反应的示例可为叠氮化物和炔烃的惠斯根(Huisgen)1,3-偶极环加成反应，即叠氮化物与炔烃的铜催化反应，以形成称为1,2,3-三唑的5-元杂原子环。该反应也可被称为Cu(I)-催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)、Cu(I)点击化学或Cu+点击化学。点击化学的催化剂可为Cu(I)盐，或通过用还原剂将Cu(II)试剂还原成Cu(I)试剂而原位制备的Cu(I)盐(Pharm Res.2008，25(10)：2216-2230)。已知的用于点击化学的Cu(II)试剂可包括但不限于Cu(II)-(TBTA)络合物和Cu(II)(THPTA)络合物。TBTA为三-[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺，也称为三-(苄基三唑基甲基)胺，它可为Cu(I)盐的稳定配体。THPTA为三-(羟丙基三唑基甲基)胺，它可为Cu(I)的稳定剂的另一个示例。也可完成其他条件以使用无铜点击化学由叠氮化物和炔构建1,2,3-三唑环，例如通过菌株促进的叠氮化物-炔点击化学反应(SPAAC，参见例如Chem Commun，2011，47:6257-6259和Nature，2015,519(7544)：486-90)，其中的每一个出于所有目的通过引用整体并入本文。
例如，图7中所示的离散液滴718可经受图8中所示的点击化学条件。图8显示在乳液体系中通过点击化学形成水凝胶的示例性过程。如图8所示，乳液体系800、802和804可代表不同的阶段，通过这些阶段聚合物分子交联以形成水凝胶。乳液体系800可包括浸没在油相810中的离散液滴808(包含水)。在离散液滴808内，两个聚合物分子812和814可被分配在一起。聚合物分子812可包含第一交联前体，其包含不稳定键816(例如二硫键)和第一点击化学部分818。聚合物分子814可包含第二点击化学部分820。另外，在油相810中，可存在其他试剂，诸如试剂822(显示为铜(II)试剂)，可需要该试剂以促进第一点击化学部分818和第二点击化学部分820之间的点击化学反应，无论是由其自身还是其衍生物。因为试剂822保持在离散液滴808的外部，所以在离散液滴808内通常不发生点击化学反应。
在乳液体系802中，试剂822中的一些可经由物理或化学过程渗透到离散液滴808中。在一些情况下，试剂822变成或以其他方式处理成离散液滴808中的试剂824(示出为铜(I)试剂)。转化为试剂824可能需要另外的试剂(未显示，例如还原剂，如抗坏血酸钠)。在这些实施方式中，试剂824可为引发第一点击化学部分818和第二点击化学部分820之间的点击化学反应所需的试剂。一旦接近第一点击化学部分818和第二点击化学部分820二者，试剂824就可引发点击化学反应，例如Cu(I)-催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)，参见乳液体系804。
如图8的乳液体系804中所示，在试剂824存在下，由于第一点击化学部分818与第二点击化学部分820之间的点击化学反应的结果，形成经由新形成的部分828将两个聚合物分子812和814连接在一起的交联826。因此，可形成包含交联聚合物分子812和814的水凝胶。如果需要，可从新形成的水凝胶中除去试剂822和/或824。在一些情况下，对不稳定键816施加刺激(例如，化学、热或光刺激)，以释放交联826和/或降解水凝胶。
具有点击化学部分的共聚物
下面的方案1描述了导致产生一对包含点击化学部分的聚合物分子的示例性合成途径，所述聚合物分子用于随后的共聚反应。
方案1。
单体A可与单体B反应，以产生聚合物C。单体B可包含在可聚合部分和点击化学部分CL1之间的连接基L1。通过改变反应条件，聚合物C可包含方案1中所示化学式的可重复单元，因为n(n为大于1的整数)个重复的规则聚合物单元的段被至少一个包含点击化学部分CL1的聚合物单元夹在中间，且总共m(m为正整数)个单元包含点击化学部分CL1。重复的规则聚合物单元和带有点击化学部分的单元之间的相对比率可以多种方式控制，包括改变相应单体A和B的相对量。聚合物C的分子量和长度可通过链终止条件来控制。类似地，单体A可与单体D反应，以产生聚合物E。单体D可包含在可聚合部分和点击化学部分CL2之间的连接基L2。通过改变反应条件，聚合物E可包含方案1中所示化学式的可重复单元，因为n(n为大于1的整数)个重复的规则聚合物单元的段被至少一个包含点击化学部分CL2的聚合物单元夹在中间，且总共m(m为正整数)个单元包含点击化学部分CL2。重复的规则聚合物单元和带有点击化学部分的聚合物单元之间的相对比率可以多种方式控制，包括改变相应单体A和D的相对量。聚合物E的分子量和长度可通过链终止条件来控制。在方案1的每种情况下，整数n和m是独立的，因为聚合物C和E可具有相同或不同的整数n’s和m’s。
连接基L1和L2的组成可各自包括烷基、烷氧基、烷基氨基、烷基氨基烷基、烷氧基烷基、或其任何组合。连接基L1和L2的长度和/或组成可变化，这取决于水凝胶的孔的尺寸、接头的刚性、接头的亲水性等。
在一些情况下，连接基L1和L2中的至少一个还包含不稳定键，例如二硫键。在一些情况下，点击化学部分CL1和CL2中的一个包含叠氮化物，而另一个包含炔烃。在某些情况下，整数n和m根据所生产的聚合物C和E的性能来选择。这些性能可包括交联前/后聚合物的粘度、稳定性、所形成的水凝胶的孔径、胶凝速率、纯度、纯化程序、点击化学部分与聚合条件的相容性、除去引发剂所需的程序等。
点击化学条件
如图8所示，在一些实施方式中，铜(II)物质(试剂822)存在于油相中，在包含待交联聚合物的离散液滴之外。然而，在这些实施方式中，铜(I)物质(试剂824)为催化剂，以使得能够在离散液滴内进行点击化学反应。在这些情况下，最初存在于外部油相中的铜(II)物质可交换到离散液滴内部的水相中，然后通过水相中的还原剂(例如抗坏血酸钠)还原，以在离散液滴内部的水相中产生铜(I)物质。
在一些情况下，交换过程可示于方案2中。为了在油相中形成铜(II)物质，第一步可以是乙酸铜(II)盐和氟化羧酸(表示为Krytox-COOH)之间的交换反应，该氟化羧酸包括全氟化烷基链以使化合物/络合物成为全氟化油相中稳定的悬浮液，并包括酸性羧基以络合铜(II)。全氟化的化合物或聚合物，例如聚(全氟-环氧丙烷)，可以是名称为并且由杜邦(DuPont)生产的化合物类型。
然后Krytox-COO-络合的铜(II)盐可进一步与全氟化的表面活性剂Krytox-PEG-Krytox结合，以在液滴的水相内形成铜(II)的乳液液滴。对于这样形成的液滴的组成，表面活性剂Krytox-PEG-Krytox保留在水相(内部)和全氟化油相(外部)的界面上，其中表面活性剂的PEG组分面对内部水相，全氟化的臂指向外部油相。这样，形成铜(II)物质的油相悬浮液，并且在点击化学反应期间油相悬浮的铜(II)物质在油相中稳定。此外，当需要时，例如，在点击化学反应完成之前或之后，可通过过滤除去裸露的铜(II)物质和/或油相悬浮的铜(II)物质。
在某些情况下，混合上述试剂(乙酸铜(II)、Krytox-COOH和表面活性剂Krytox-PEG-Krytox)的顺序可能是重要的。例如，直接混合所有三种组分可能不能提供所需的铜(II)物质在油相中的悬浮液。通过将醋酸铜(II)和Krytox-COOH首先混合，然后加入表面活性剂，并搅拌/混合等的逐步程序，可生产所需的悬浮液。
方案2。
具有两个亲氟尾部和一个亲水头部基团的含氟表面活性剂(式I，下文中称为"三嵌段表面活性剂")可降低乳液液滴的聚结并为乳液体系(包括例如乳液包凝胶珠体体系)提供稳定性。此外，具有一个亲氟尾部和一个亲水头部基团的含氟表面活性剂(式II，下文中称为"二嵌段表面活性剂"或"二嵌段共聚物")也可用于为乳液体系提供稳定性。n和m均为大于1的整数。Krytox-PEG-Krytox为三嵌段表面活性剂的一个示例。
第二步可以是将溶解的铜(II)物质输送/相转移到含有待交联聚合物的液滴中。各种因素可影响输送/相转移，包括但不限于油相和/或水相中的相应配体(例如THPTA或TBTA)的浓度、水相中的其他水性组分(例如表面活性剂、磁性颗粒、溶剂如水、表面活性剂如F-108、所用还原剂的类型和量(二硫化物如二硫苏糖醇(DTT)或抗坏血酸钠、聚合物、以及制备期间油相和水相之间的v/v比率)。
第三步可以是在液滴的水相内将铜(II)物质还原成铜(I)物质。可基于作为还原剂的化学性质及其与聚合物和/或连接基和/或存在于液滴的水相内的其他试剂的其他部分的相容性，选择还原剂，例如抗坏血酸钠。例如，当连接基(例如，点击化学部分CL1或CL2)包含二硫键时，使用DTT作为铜还原剂可能干扰聚合物或水凝胶的完整性，因为连接基内的二硫键在铜(II)物质还原期间可被劈裂，从而阻止产生所需的水凝胶。
第四步可以是由液滴内的铜(I)物质催化的点击化学反应。在一些情况下，在液滴内可存在至少一对分别带有两个点击化学部分818和820的聚合物，以便发生点击化学反应。在一些情况下，可存在多对这样的聚合物。在图7所示的液滴形成过程中，可控制一个液滴内的这种聚合物对的数量。因为涉及交联，所以可能存在其中一种聚合物与多于一种的其他聚合物交联以形成水凝胶的情况。
在点击化学步骤期间可考虑的因素可包括但不限于液滴的尺寸、每个液滴中包封的聚合物的长度/数量/类型/比率、液滴的水相内部的还原剂与铜(I)/铜(II)物质的比率、铜(I)物质与聚合物上点击化学部分的比率、配体(例如THPTA或TBTA)的作用、反应的时间和温度、是否存在外部影响(例如摇动或涡旋、微波等)、溶解氧、以及在点击化学反应完成之后如何分离不想要的试剂/副产物。
在一些情况下，点击化学反应可在惰性气体条件下运行。例如，反应可在N2或Ar下进行，使得降低铜(I)物质的氧-氧化或空气-氧化。在一些情况下，增加加入的还原剂的量以对抗铜(I)物质的这种氧-氧化或空气-氧化的副反应。在一些情况下，不是从铜(II)物质开始，而是将铜(I)物质加入到水性流体中作为叠氮化物-炔烃环加成反应的催化剂。在一些情况下，当铜(I)物质为最初加入水性流体中用于叠氮化物-炔烃环加成的催化剂时，为反应提供无氧体系。
在一些情况下，可进行溶剂交换，以从形成的水凝胶中除去不需要的试剂。
在一些情况下，通过将额外试剂加入到水凝胶中或从水凝胶移除一些试剂，可对水凝胶执行进一步转化。
在一些情况下，生物样品(例如，细胞或核或核酸)被包封在点击化学反应期间形成的水凝胶的孔内。在一些情况下，生物样品可通过使生物样品与输送到水凝胶中(例如，通过水凝胶孔)的试剂反应而在水凝胶内被改性或表征。
在一些情况下，铜纳米颗粒可与包封在水凝胶内的细胞络合。在这些情况下，铜纳米颗粒用于催化点击化学反应，从而形成水凝胶。或者或另外，铜纳米颗粒可用作铜(II)或铜(I)物质。例如，细胞可在分配(例如，分配为液滴)之前与铜纳米颗粒络合。然后，用本文所述的点击化学聚合物分配(例如，分配为液滴)包含铜纳米颗粒的细胞，从而产生交联的水凝胶。使用细胞络合的铜纳米颗粒可允许水凝胶的选择性胶凝，使得点击化学反应仅在包含铜络合的细胞的液滴中进行。
在一些情况下，在交联前体之间的交联反应期间，交联前体中的不稳定键(例如二硫键)或由此形成的交联保持完整(即，未断裂)。在一些情况下，在交联反应期间，约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的不稳定键可保持完整。在一些情况下，在交联反应期间，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的不稳定键可保持完整。
在一些情况下，交联中的不稳定键(例如二硫键)可通过用试剂(例如还原剂，如DTT、TCEP等)处理而断裂，使得包封在水凝胶内的生物样品被释放和/或扩张水凝胶的孔，使得能够与生物样品反应的一种或多种试剂现在可接近生物样品。
图9显示使用点击化学产生的示例性水凝胶的示意图。第一共聚物901包含炔部分902，且第二共聚物904包含叠氮化物部分905。炔部分902可包含可降解的连接基(例如，二硫键903)。或者或另外，叠氮化物部分905可包含可降解的连接基。炔部分902可在Cu(I)的存在下与叠氮化物部分905反应，以产生包含1,2,3-三唑部分906的链间连接基。
细胞珠产生的方法
本公开的方法可包括产生一个或多个细胞珠，所述细胞珠包含本文公开的一种或多种聚合物。图10显示用于产生细胞珠的示例性方法。在该示例中，细胞和聚合物或凝胶前体与不可混溶的流体(例如，油)混合，从而产生多个水性液滴，包括包含细胞1002的液滴1001。液滴1001可包括带电物质，如本文所述。液滴1001经受足以使聚合物或凝胶前体聚合或胶凝的条件，以产生包含细胞1002的细胞珠1003。胶凝可包括本文所述的任何胶凝机制和聚合物，包括利用点击化学反应的那些，如本文别处所述。在一些情况下，使细胞珠1003经受足以裂解细胞1002的处理条件，从而将细胞的组分释放到细胞珠中。在其他实施方式中，在聚合物或凝胶前体的聚合或胶凝之前，细胞1002在液滴901中裂解，以产生细胞珠1003。仍在其他实施方式中，在聚合物或凝胶前体的聚合或胶凝之前或之后，将细胞1002渗透化。在水相中收集细胞珠，以产生多个细胞珠1004。细胞珠可被储存用于进一步处理。在一些情况下，在聚合物或凝胶前体的聚合或胶凝之后，带电物质可附着于细胞珠。例如，聚合物或凝胶前体可包含一个或多个官能团，该官能团在聚合物或凝胶前体的聚合或胶凝之后促进带电物质的附着。在其他实施方式中，聚合物或凝胶前体包含含有带电物质的官能团，其在聚合物或凝胶前体的聚合或胶凝期间被掺入到细胞珠中。
在一方面，本公开提供了用于产生包含带电物质的细胞珠的方法。首先，可产生包括来自多个细胞的细胞、聚合物或凝胶前体和带电物质的分配物。接着，可使该分配物经受足以使聚合物前体或凝胶前体反应的条件，以产生包含细胞或其衍生物和带电物质的聚合物或凝胶网络，从而产生细胞珠。可使分配物经受足以使聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝的条件。足以使聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝的条件在本文别处描述。在一些实施方式中，将细胞裂解，以将细胞的组分释放到细胞珠中。在使聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝之前，在使聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝的同时，或在使聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝之后，可将细胞裂解。在其他实施方式中，不将细胞珠中的细胞裂解，但使其渗透化，以允许接近核中的组分。
在另一方面，本公开提供了用于产生包含带电物质的细胞珠的方法。首先，可产生包含从细胞分离的核、聚合物或凝胶前体和带电物质的分配物。接着，可使分配物经受足以使聚合物前体或凝胶前体反应的条件，以产生包含核和带电物质的聚合物或凝胶网络，从而产生细胞珠。可使该分配物经受足以使聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝的条件。足以使聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝的条件在本文别处描述。例如，铜催化剂可用于催化点击化学反应，从而产生水凝胶。在一些实施方式中，使核裂解，以将核的组分释放到细胞珠中。在使聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝之前，在使聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝的同时，或在使聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝之后，可使核裂解。在其他实施方式中，不将细胞珠中的核裂解，但使其渗透化，以允许接近核中的细胞核组分。
带电物质可为带正电物质。带正电物质可为包含正电荷的试剂。带正电物质可包括三甲基铵。带正电物质可为(3-丙烯酰氨基丙基)-三甲基铵。带电物质可为带负电物质。带负电物质可包括磷酸盐。带电物质可附着于聚合物或凝胶网络。在聚合过程中，带电物质可掺入到聚合物或凝胶网络中。细胞珠可包含一种或多种化学交联剂。化学交联剂可为二硫键。带电物质可附着于一种或多种化学交联剂。细胞的衍生物可为来自细胞的组分(例如，DNA、RNA、蛋白质等)。产生细胞珠的方法可包括裂解分配物(例如，液滴)内的细胞，以从细胞释放组分。组分可为核酸。核酸可为DNA(例如，基因组DNA)或RNA(例如，mRNA、siRNA)。组分可为蛋白质。组分可为带负电组分，例如DNA、RNA或miRNA。组分可为带正电组分，例如蛋白质。来自细胞的组分可与带电物质相互作用。来自细胞的组分可非共价地附着于带电物质上。
在一些实施方式中，来自或源自细胞的带负电组分(例如DNA)通过离子相互作用与细胞珠(例如，细胞珠聚合物的带正电官能团)的带正电物质(例如，(3-丙烯酰氨基丙基)-三甲基铵)相互作用。在其他实施方式中，来自或源自细胞的带正电组分(例如，蛋白质)通过离子相互作用与细胞珠(例如，细胞珠聚合物的带负电官能团)的带负电物质(例如，磷酸盐)相互作用。仍在其他实施方式中，来自或源自细胞的带负电组分(例如DNA)与细胞珠(例如，细胞珠聚合物的带正电官能团)的带正电物质(例如，(3-丙烯酰氨基丙基)-三甲基铵)相互作用，并且来自或源自细胞的带正电组分(例如，蛋白质)与细胞珠(例如，细胞珠聚合物的带负电官能团)的带负电物质(例如，磷酸盐)相互作用。因此，例如，由于与细胞珠的带电物质的静电相互作用，来自细胞的一种或多种组分能够保留在细胞内。来自细胞的组分能够在细胞珠内保留约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或更长。来自细胞的组分能够在细胞珠内保留至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时或更长。来自细胞的组分能够在细胞珠内保留至多1小时、至多2小时、至多3小时、至多4小时、至多5小时、至多6小时、至多12小时、至多24小时、至多48小时或至多72小时。
在一个方面，本公开提供了用于产生包含带电聚合物或凝胶网络的细胞珠(例如，包含带电物质的细胞珠)的方法。首先，可产生包含来自多个细胞的细胞和聚合物前体或凝胶前体的分配物。接着，可使分配物经受足以使所述带电聚合物前体或凝胶前体反应的条件，以产生包含细胞或其衍生物的带电聚合物或凝胶网络，从而提供包含带电物质的细胞珠。该反应可使得聚合物或凝胶前体上的净电荷变化，从而产生带电聚合物或凝胶网络。该反应可使得聚合物或凝胶网络上的净电荷变化，从而产生带电聚合物或凝胶网络。
聚合物或凝胶前体可带正电。聚合物或凝胶前体可包括壳聚糖。聚合物或凝胶前体可包括聚乙烯亚胺(PEI)。聚合物或凝胶前体可带负电。聚合物或凝胶前体可包括藻酸盐。细胞的衍生物可为来自细胞的组分(例如，DNA、RNA、蛋白质等)。产生细胞珠的方法可包括裂解分配物(例如，液滴)内的细胞，以从细胞释放组分。组分可为核酸。核酸可为DNA(例如，基因组DNA)或RNA(例如，mRNA、siRNA)。组分可为蛋白质。组分可为带负电组分，例如DNA、RNA或miRNA。组分可为带正电组分，例如蛋白质。来自细胞的组分可与带电聚合物或凝胶网络相互作用。来自细胞的组分可非共价地附着于包含带电物质的细胞珠的聚合物或凝胶网络。在一些实施方式中，来自或源自细胞的带负电组分(例如，DNA)通过离子相互作用与细胞珠的带正电物质(例如，带正电聚合物或凝胶网络)相互作用。在其他实施方式中，来自或源自细胞的带正电组分(例如，蛋白质)通过离子相互作用与细胞珠的带负电物质(例如，带负电聚合物或凝胶网络)相互作用。仍在其他实施方式中，来自或源自细胞的带负电组分(例如，DNA)与细胞珠的带正电物质(例如，带正电聚合物或凝胶网络)相互作用，并且来自或源自细胞的带正电组分(例如，蛋白质)与细胞珠的带负电物质(例如，带负电聚合物或凝胶网络)相互作用。因此，例如，由于与细胞珠的带电物质的静电相互作用，来自细胞的一种或多种组分能够保留在细胞内。来自细胞的组分能够在细胞珠内保留约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或更长。来自细胞的组分能够在细胞珠内保留至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时或更长。来自细胞的组分能够在细胞珠内保留至多1小时、至多2小时、至多3小时、至多4小时、至多5小时、至多6小时、至多12小时、至多24小时、至多48小时或至多72小时。
在一方面，本公开提供了用于产生包含带电物质的细胞珠的方法。首先，可产生包含来自多个细胞的细胞和聚合物前体或凝胶前体的分配物。接着，可使分配物经受足以使聚合物前体或凝胶前体反应的条件，以产生包含细胞或其衍生物的聚合物或凝胶网络。接着，带电物质可偶联到聚合物或凝胶网络，从而提供包括带电物质的细胞珠。可使该分配物经受足以使聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝的条件。足以使聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝的条件在本文别处描述。例如，铜催化剂可用于催化点击化学反应，从而产生水凝胶。在一些情况下，使细胞核裂解，以释放细胞组分。在使聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝之前，在使聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝的同时，或在使聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝之后，可使细胞裂解。
聚合物或凝胶网络可为如本文所述的可降解聚合物或凝胶网络，使得细胞珠为可降解细胞珠。通过产生多个分配物，可产生任何数量的细胞珠。在一些情况下，产生约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约10个、约50个、约100个、约500个、约1000个、约5000个、约10000个、约20000个、约50000个、约100000个或更多个细胞珠，从而产生多个细胞珠。细胞珠可与条形码珠(例如，凝胶珠)一起分配，用于分析细胞或其组分。
用于细胞分析的组合物
本文公开了包含细胞珠的组合物，所述细胞珠包含聚合的或交联的聚合物网络，所述聚合物网络包含细胞或由所述细胞产生的裂解细胞，其中所述聚合的或交联的聚合物网络带有电。细胞珠可包含来自细胞的组分。组分可为核酸。核酸可为DNA(例如，基因组DNA)或RNA(例如，mRNA、miRNA)。组分可为蛋白质。聚合物网络可带正电。聚合物网络可包括壳聚糖。聚合物网络可包含PEI。聚合物网络可带负电。聚合物网络可包括藻酸盐。来自细胞的组分能够在细胞珠内保留约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或更长。来自细胞的组分能够在细胞珠内保留至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时或更长。来自细胞的组分能够在细胞珠内保留至多1小时、至多2小时、至多3小时、至多4小时、至多5小时、至多6小时、至多12小时、至多24小时、至多48小时或至多72小时。
本文还公开了包含细胞珠的组合物，所述细胞珠包含聚合的或交联的聚合物网络，所述聚合物网络包含细胞或由所述细胞产生的裂解细胞以及带电物质。细胞珠可包含来自细胞的组分。组分可为核酸。核酸可为DNA(例如，基因组DNA)或RNA(例如，mRNA、miRNA)。组分可为蛋白质。带电物质可带正电。带电物质可包括三甲基铵。带电物质可为(2-氨基乙基)三甲基铵。带电物质可为(3-丙烯酰氨基丙基)三甲基铵。带电物质可带负电。带电物质可包括磷酸盐。来自细胞的组分能够在细胞珠内保留约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或更长。来自细胞的组分能够在细胞珠内保留至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时或更长。来自细胞的组分能够在细胞珠内保留至多1小时、至多2小时、至多3小时、至多4小时、至多5小时、至多6小时、至多12小时、至多24小时、至多48小时或至多72小时。
图11A显示本公开的示例性细胞珠，其包含附着于聚合物或凝胶网络的带正电物质。细胞珠1101包含附着于聚合物或凝胶网络的带正电物质1103。可使用本文公开的任何方法产生包含带正电物质1103的细胞珠1101，包括带电聚合物前体或凝胶前体(例如包含带电官能团的凝胶前体)的聚合或胶凝。细胞珠1101还包含来自单细胞的带负电细胞组分1102(例如，核酸，如DNA)。带正电物质1103与带负电细胞组分1102相互作用，从而将带负电细胞组分1102保留在细胞珠1101中。细胞珠1101被储存，随着时间的推移，带负电细胞组分1102很少到没有扩散到细胞珠之外。
图11B显示本公开的示例性细胞珠，其包含附着于聚合物或凝胶网络的带负电物质。细胞珠1111包括附着于聚合物或凝胶网络的带负电物质1113。可使用本文公开的任何方法产生包含带负电物质1113的细胞珠1111，包括带电聚合物前体或凝胶前体(例如，包含带电官能团的凝胶前体)的聚合或胶凝。细胞珠1111还包含来自单细胞的带正电细胞组分1112(例如，包含净正电荷区的蛋白质或多肽)。带负电物质1113与带正电细胞组分1112相互作用，从而将带正电细胞组分1112保留在细胞珠1111中。细胞珠1111被储存，带正电细胞组分1112很少到没有扩散到细胞珠之外。
图12A显示本公开的示例性细胞珠，其包含附着于可释放的化学交联剂的带正电物质。细胞珠1201包含附着于可释放的化学交联剂1204(例如，二硫键)的带正电物质1203。可使用本文公开的任何方法产生包含附着于可释放的化学交联剂1204的带正电物质1203的细胞珠1201，包括包含附着于可释放的化学交联剂的带电官能团的凝胶前体的聚合或胶凝。在其他实施方式中，通过凝胶前体的聚合或胶凝，随后使用交联剂用带电官能团使聚合的或胶凝的细胞珠官能化，来产生包含附着于可释放的化学交联剂1204的带正电物质1203的细胞珠1201。细胞珠1201还包含来自单细胞的带负电细胞组分1202(例如，核酸，如DNA)。带正电物质1203与带负电细胞组分1202相互作用，从而将带负电细胞组分1202保留在细胞珠1201中。细胞珠1201被储存，随着时间的推移，带负电细胞组分1202很少到没有扩散到细胞珠之外。
图12B显示本公开的细胞珠的示例，其包含附着于可释放的化学交联剂的带负电物质。细胞珠1211包含附着于可释放的化学交联剂1204(例如二硫键)的带负电物质1213。可使用本文公开的任何方法产生包含附着于可释放的化学交联剂1214的带负电物质1213的细胞珠1211，包括包含附着于可释放的化学交联剂的带电官能团的凝胶前体的聚合或胶凝。在其他实施方式中，通过凝胶前体的聚合或胶凝，随后使用交联剂用带电官能团使聚合的或胶凝的细胞珠官能化，产生包含附着于可释放的化学交联剂1214的带负电物质1213的细胞珠1211。细胞珠1211还包含来自单细胞的带正电细胞组分1212(例如，包含净正电荷区的蛋白质或多肽)。带负电物质1213与带正电细胞组分1212相互作用，从而将带正电细胞组分1212保留在细胞珠1211中。细胞珠1211被储存，随着时间的推移，带负电细胞组分1212很少到没有扩散到细胞珠之外。
本公开的带电细胞珠和带电水凝胶(例如，图11A至图11B，图12A至图12B)也可包括如本文别处公开的任何交联聚合物(例如，点击化学聚合物，如图8中所示)。
细胞珠
在一方面，本公开提供了用于产生细胞珠的方法和系统，其可用于处理来自单细胞的不同组分。细胞珠可通过本文所述的方法产生，例如通过在包含细胞或来自细胞的成分的分配物中的分子前体(例如，聚合物或凝胶前体)的聚合。细胞珠可包含来自细胞的一种或多种不同类型的组分，包括例如DNA(例如，gDNA、染色质等)、RNA(例如，mRNA、miRNA)、蛋白质和/或代谢物。组分可包含在细胞珠中和/或附着于细胞珠。通过将细胞封装在聚合物或凝胶基质中，并使细胞在凝胶或聚合物基质中裂解，在将细胞封装在聚合物或凝胶基质中的同时使细胞裂解，或使细胞裂解使得其成分被封装在聚合物或凝胶基质中，可产生细胞珠。聚合物或凝胶基质可包含一种或多种带电物质，所述带电物质被配置成与来自细胞的组分(例如，DNA、RNA、蛋白质等)相互作用。
用于产生细胞珠的分配物可包含用于进行一种或多种反应的一种或多种试剂。物质可包括例如用于核酸扩增或延伸反应的试剂(例如，引物、聚合酶、核苷酸、辅助因子(例如，离子辅助因子)、缓冲液等)，包括本文所述的那些，用于酶促反应的试剂(例如，酶、辅助因子、底物、缓冲液等)，用于核酸修饰反应(例如，聚合、连接或消化)的试剂，和/或用于模板制备的试剂。
试剂可包括用于将点击化学反应导致的核酸损伤最小化的试剂。例如，可将自由基清除剂加入到分配物中，从而降低由在点击化学反应期间产生的自由基对核酸造成的损伤的风险。在一些情况下，自由基清除剂包括二甲亚砜(DMSO)。可将DMSO以足以防止核酸损伤的浓度加入到用于产生细胞珠的分配物中。在一些实施方式中，DMSO以至少约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％或更大的量加入到分配物中。
在分配物内的一种或多种试剂可附着于前体(例如，聚合物或凝胶前体)。试剂可共价附着于前体。试剂可以可逆地或不可逆地附着于前体。试剂可通过丙烯酰胺基部分附着于前体。在一些情况下，寡核苷酸可附着于前体。附着于前体的寡核苷酸可用于例如捕获RNA和/或进行逆转录反应。寡核苷酸可包含聚T序列(例如，可为聚T引物)。在一些实施方式中，聚T序列用于与例如来自细胞mRNA的聚A序列杂交。
用于产生细胞珠的分配物可包含一种或多种颗粒(例如磁性颗粒)。在分配物内的一种或多种试剂可附着于颗粒。试剂可共价地附着于颗粒上。试剂可以可逆地或不可逆地附着于颗粒。试剂可通过丙烯酰胺基部分附着于颗粒。在一些情况下，寡核苷酸可附着于颗粒。附着于颗粒的寡核苷酸可用于例如捕获RNA并进行逆转录反应。在一些实施方式中，颗粒(其任选地为磁性颗粒)包含与其附着的寡核苷酸，其包含能够与例如来自细胞的mRNA的聚A序列杂交的聚T序列。
分配物内的细胞可如本文所述裂解，从而将成分从细胞释放到分配物中。成分可包括多种类型的细胞组分，包括蛋白质、代谢物和/或核酸分子(例如，DNA、RNA(例如，信使RNA)等)。或者或另外，可使分配物内的细胞被渗透化。渗透化可允许在有或没有完全细胞裂解的情况下将某些试剂、物质、成分等转移到细胞中和/或从细胞中转移出来。在一些实施方式中，在细胞珠聚合或胶凝之前，使细胞裂解或渗透化。在其他实施方式中，与细胞珠的聚合或胶凝同时，使细胞裂解或渗透化。在一些实施方式中，在细胞珠聚合或胶凝之后，使细胞裂解或渗透化。仍在其他实施方式中，不使细胞裂解或渗透而仍在细胞珠中。
试剂可包括在分配物内，包括附着于前体、颗粒等的试剂，并且可用于在细胞或来自或源自细胞的成分上执行一个或多个反应。反应可为例如扩增、逆转录或脱氨反应。在一些实施方式中，在细胞珠聚合或胶凝之前进行一个或多个反应。在一些实施方式中，与细胞珠的聚合或胶凝同时进行一个或多个反应。在一些实施方式中，在细胞珠的聚合或胶凝之后进行一个或多个反应。在一些情况下，寡核苷酸(例如引物)用于对来自细胞的信使RNA进行逆转录反应，从而产生互补DNA(cDNA)。逆转录可包括向cDNA中加入额外的核苷酸，例如多核苷酸，如聚C。在一些情况下，可进行模板转换以进一步延伸cDNA。模板转换可将一个或多个额外的序列附加到cDNA上。在一些情况下，额外的序列可用于促进核酸延伸/扩增和/或条形码化，如本文所述。cDNA可附着于前体和/或颗粒。在一些情况下，在产生细胞珠之前，寡核苷酸用于从细胞中捕获信使RNA(例如，通过杂交)。
图13说明了从细胞mRNA产生cDNA并将cDNA附着于聚合物前体的示例性方法。分配物1300(例如，乳液中的水性液滴)可包含细胞1301和附着于聚合物前体1310的寡核苷酸1302。在一些实施方式中，寡核苷酸1302包含聚T序列、随机N聚体(random N-mer)、靶向捕获/引物序列和/或任何其他额外序列，例如本文其他地方描述的功能序列。在一些情况下，分配物1300还包括一种或多种试剂，诸如用于对细胞的一种或多种组分(例如，逆转录酶、缓冲液、辅因子等)进行一种或多种反应的试剂或用于使聚合物前体1310聚合或胶凝的试剂。分配物1300还可任选地包含模板转换寡核苷酸(未显示)。使细胞1301裂解或渗透化，从而释放或以其他方式允许接近多种类型的细胞成分，包括信使RNA(mRNA)1303和基因组DNA(gDNA)1305。寡核苷酸1302可用于进行mRNA的逆转录(RT)，从而产生附着于聚合物前体1310的互补DNA(cDNA)1304。在一些情况下，可使用模板转换寡核苷酸进行模板转换反应，以例如将另外的序列附加到cDNA上。然后，可将包含cDNA的聚合物前体1310聚合或胶凝，以产生包含cDNA1304和gDNA1305的细胞珠。在一些实施方式中，将聚合物前体1310聚合或胶凝，以形成包含mRNA1303(其可与寡核苷酸1302杂交)和gDNA1305的细胞珠，并且在细胞珠中产生cDNA1304。在一些实施方式中，寡核苷酸1302通过不稳定键可释放地附着于凝胶前体1310。
图14说明使用附着于磁性颗粒的寡核苷酸捕获细胞mRNA或产生cDNA的示例性方法。分配物1400(例如，乳液中的水性液滴)可包含细胞1401、附着于颗粒1403(例如，珠或磁性颗粒)的寡核苷酸1402和聚合物前体1410。在一些实施方式中，寡核苷酸1402包含聚T序列、随机N聚体、靶向捕获/引物序列和/或任何其他额外序列，例如本文其他地方描述的功能序列。在一些情况下，分配物1400还包括一种或多种试剂，诸如用于对细胞的一种或多种组分(例如，逆转录酶、缓冲液、辅因子等)进行一种或多种反应的试剂或用于使聚合物前体1410聚合或胶凝的试剂。可使细胞1401裂解或渗透化，从而释放或以其他方式允许接近多种类型的细胞成分，包括mRNA1404和基因组DNA(gDNA)1405。然后，使mRNA1404经受使其与寡核苷酸1402杂交(例如，通过聚T序列)的条件，从而捕获mRNA。在一些实施方式中，杂交的mRNA1404被转化成cDNA。然后，可使聚合物前体1410聚合或胶凝，以产生包含颗粒附着的mRNA1404(或cDNA)和gDNA1405的细胞珠。因此，将捕获的mRNA1404(例如，与偶联到颗粒1403的寡核苷酸1402杂交)掺入细胞珠中。在一些情况下，捕获的mRNA1404或cDNA可从分配物1400纯化出来并单独处理。
在一些实施方式中，使分配物经受足以产生包含一种或多种试剂的细胞珠的条件。例如，可使包含附着于试剂(例如引物、核酸分子等)的聚合物前体的分配物液滴聚合或胶凝，使得试剂附着于聚合物或凝胶基质(即附着于细胞珠)。在一些情况下，试剂通过不稳定键(例如，化学不稳定键、热不稳定键或光不稳定键)可释放地附着于凝胶前体。试剂可共价地附着于细胞珠。试剂可以可逆地或不可逆地附着于细胞珠。试剂可附着于凝胶珠的表面。试剂可附着在细胞珠的内部。在一些情况下，mRNA附着于细胞珠。例如，可使附着于来自细胞的mRNA的聚合物前体聚合或胶凝，以产生细胞珠，使得mRNA附着于细胞珠。在一些情况下，cDNA附着于细胞珠。例如，可使附着于源自细胞的cDNA的聚合物前体聚合，以产生细胞珠，使得cDNA附着于细胞珠上。在一些情况下，一种或多种寡核苷酸附着于细胞珠。例如，可使附着于寡核苷酸的聚合物前体聚合或胶凝，以产生细胞珠，使得寡核苷酸附着于细胞珠。
图15说明产生包含附着于聚合物基质的试剂的细胞珠的示例。包含附着于核酸分子1502和1503(例如mRNA、cDNA、引物等)的聚合物前体1510的分配物1500可经受足以使聚合物前体聚合的条件，从而产生包含附着于聚合物基质1530的核酸分子1502和1503的细胞珠1511。在一些情况下，分配物1550包含第一类型的聚合物前体1510和第二类型的聚合物前体1520，并且产生包含聚合物前体1510和1520的共聚物1530的细胞珠1511。在一些情况下，核酸分子附着于第一和/或第二聚合物前体。例如，核酸分子1502可附着于第一类型的聚合物前体1510，核酸分子1503可附着于第二类型的聚合物前体1520，并且产生包含附着于聚合物基质1540的核酸分子1502和1503的细胞珠1511。在一些情况下，核酸分子1502和核酸分子1503相同。在一些情况下，核酸分子1502和核酸分子1503为相同类型的分子(例如mRNA或cDNA)，但可包含不同的序列。在其他情况下，核酸分子1502和核酸分子1503不同。
将大分子成分(例如核酸分子、蛋白质等)附着于细胞珠或细胞珠内的颗粒可用于制备用于进一步处理的物质。例如，附着于细胞珠或颗粒的核酸分子可在保持附着于细胞珠或颗粒的同时被处理。在处理之后，核酸可从细胞珠和/或颗粒释放(例如，释放到分配物中)以供分析。在一些情况下，可能有用的是将一种类型的细胞组分或其衍生物(例如mRNA、cDNA)附着于细胞珠或细胞珠内的颗粒，同时封装但不附着另一种类型的细胞组分(例如基因组DNA)。这在例如促进多种类型的组分的单独处理中可能是有用的。例如，在细胞珠形成后，可将细胞珠转移至水溶液中并经受如本文所述的另外的处理。例如，可使细胞珠批量经受逆转录，以从捕获的mRNA产生cDNA(例如，与附着于细胞珠基质或颗粒(如磁性颗粒)的寡核苷酸杂交)。
分配细胞珠
细胞珠可与核酸条形码分子一起分配，并且细胞珠的或源自细胞珠的核酸分子(例如mRNA、cDNA、gDNA等)可如本文别处所述进行条形码化。在一些实施方式中，细胞珠与携带条形码的珠(例如，凝胶珠)共同分配，并且细胞珠的或源自细胞珠的核酸分子如本文别处所述被条形码化。图16A中示意性地描述了用于产生包含细胞珠和核酸条形码分子的液滴的示例性方法的概述。图16A中描述的方法包括三个阶段1610、1620和1630；每个相应的阶段包括：(1)细胞珠的产生(1610)；(2)细胞珠溶剂交换和处理(1620)；以及(3)细胞珠和条形码的共同分配，用于随后标记(例如，条形码化)细胞珠的(或源自细胞珠的)一种或多种成分(1630)。
继续参考图16A，阶段1610包括向用于液滴产生的微流体芯片1604提供油1601、聚合物前体或凝胶前体1602、以及细胞或核1603(例如，细胞、固定细胞、交联细胞、核、渗透化核等)。聚合物前体或凝胶前体可例如如图11-12所述带电。带电物质(图16A中未显示)，例如本文其他地方所述的那些，可进一步提供给微流体芯片1604，用于共同分配。如图16B中详细显示的，微流体芯片1604包括多个储器，所述储器包括油1601、聚合物前体或凝胶前体1602和细胞1603。微流体芯片1604还可包括一个或多个附加储器(未显示)，所述附加储器包括一种或多种附加试剂。聚合物前体或凝胶前体1602和细胞1603从它们的储器流动(例如，通过施加的力的作用，例如通过真空的负压或通过泵的正压)到第一通道接合部，并且结合以形成水流。然后，该水性流流到第二通道接合部，在该接合部中提供油1601。从第一通道接合部提供的水性流与油1601不混溶，从而导致在油1605中产生水性液滴的悬浮液，其然后流到储器用于收集。可通过任何合适的方法控制微流体芯片1604内的流动，包括在通道中或不同通道中使用一个或多个流量调节器、微流体通道的尺寸等，如本文别处所述。如图16A和图16B两者所示，产品包括液滴1605，其包括来自细胞1603的细胞和聚合物前体或凝胶前体1602。在一些情况下，液滴1625中的至少一些液滴包括单细胞。
在一些情况下，液滴1605经受足以裂解其中包含的细胞或核的条件，从而将细胞大分子成分释放到液滴1605中。大分子成分(例如核酸、蛋白质等)可经受一个或多个反应以供另外的处理。大分子成分的处理在本文其他地方更详细地描述。在其他实施方式中，液滴1605经受足以使细胞(或核)渗透化的条件，从而促进接近细胞(或核)的一种或多种大分子成分以供进一步处理。然后，液滴1605经受适于使聚合物前体或凝胶前体1602在液滴1605中聚合或胶凝的条件，以产生细胞珠1606。
继续参考图16A，液滴1605然后经受适于使聚合物前体或凝胶前体1602在液滴1605中聚合或胶凝的条件，这产生封装细胞(或核)1603的细胞珠1606。当所得细胞珠1606悬浮于油中时，开始阶段1620，其包括被配置成使细胞珠1606重悬于水相1611中的溶剂交换。本文其他地方提供了关于溶剂交换的其他细节和示例。
然后，可任选地批量处理1612重悬的水性细胞珠1611，以制备用于分析一种或多种细胞组分的细胞珠。例如，在1612中，细胞珠1611可经受适合于使细胞珠1613中的细胞(或核)裂解或渗透化的条件，从而释放或以其他方式允许接近一种或多种细胞成分(例如，核酸，如mRNA和gDNA，蛋白质等)。单独地或与细胞裂解同时，细胞珠(例如1611或1613)也批量经受使源自与细胞珠1611缔合的细胞的核酸(例如gDNA)变性的条件。细胞珠1613的聚合物基质有效地阻碍或阻止较大分子(如核酸和/或蛋白质)从细胞珠1613扩散。此外，在将带电物质引入聚合物基质的情况下，细胞珠的电荷(例如正电荷)有效地防止相反电荷的分子(例如核酸)的扩散。细胞珠1613为足够多孔的，以促进变性剂扩散到细胞珠基质中，从而接触细胞珠1613内的核酸。在一些情况下，然后细胞珠(1611或1613)可批量经受适于对源自与细胞珠(1611或1613)缔合的细胞的核酸或其他分析物进行一种或多种反应的条件。例如，抗体可被洗入和/或洗出重悬的细胞珠(1611或1613)。在处理1612之后，然后收集1614所得到的细胞珠1613，并且可在阶段1630开始之前储存。
在阶段1630中，产生液滴，该液滴包含细胞珠(1611或1613)和条形码珠1622(例如包含与其附着的核酸条形码分子的凝胶珠)。如图16A所示，向微流体芯片1623提供各包含条形码序列的油1621、细胞珠1613和条形码珠1622(例如，每个珠包含独特的条形码序列)。图16C显示示例性微流体芯片1623。如图16C所示，微流体芯片1623包括多个储器，其包括油1621、细胞珠1613和条形码珠1622(例如，凝胶珠)。芯片还包括附加的储器1627和1628，其可用于供应附加的试剂(例如，用于核酸扩增的试剂、可降解或溶解细胞珠和/或凝胶珠的试剂、可降解条形码和凝胶珠之间的连锁的试剂等)。细胞珠1613和条形码珠1622从它们的储器流动(例如，通过施加的力的作用，例如通过真空的负压或通过泵的正压)到第一通道接合部并形成水性混合物。来自储器1627和1628的材料也可在第一通道接合部处被提供至水性混合物。
或者，细胞珠和凝胶珠可在引入微流体芯片之前混合。在这种情况下，微流体芯片1623的单个储器包括细胞珠和凝胶珠的混合物。可改变混合物中细胞珠与凝胶珠的比例以改变所产生的包含单细胞珠和单一凝胶珠的液滴的数目。细胞珠和凝胶珠的混合物可从储器流动(例如，通过施加的力的作用，例如通过真空的负压或通过泵的正压)到第一通道接合部，在一些情况下，与来自储器1627和/或1628的材料一起。作为替代或补充，细胞可与凝胶珠混合。例如，细胞和细胞珠的集合可与凝胶珠混合，或者细胞的集合可与凝胶珠混合。
在一些实施方式中，然后使包含细胞珠1613、条形码珠1621和在一些情况下另外的试剂的水性混合物流动至第二通道接合部，向其提供油1621。从第一通道接合部提供的水性混合物与油1621不混溶，导致在油中产生水滴1625的悬浮液，然后该悬浮液流到用于收集的储器中。微流体芯片还可包括储器1629，其可接受来自从第二通道出现的流的过量油。可通过任何合适的策略控制微流体芯片1623内的流动，包括在通道中使用一个或多个流量调节器(参见图16C和图16D)、或连接通道、使用各种通道、确定通道的尺寸等。如图16A和图16C两者所示，除了包含由储器1627和1628提供的任何其他试剂之外，液滴1625还包含细胞珠1613和条形码珠1622(例如，凝胶珠)。在一些情况下，液滴1625的至少一些液滴包含单细胞珠和单个条形码珠(例如，单个凝胶珠)。
当降解或溶解细胞珠1613、条形码珠1622(例如凝胶珠)和/或条形码与条形码珠1622(例如凝胶珠)之间的连锁的试剂存在于液滴中时，这些试剂可从细胞珠1613释放在细胞珠1613中捕捉的核酸和/或从条形码珠1622释放条形码。核酸条形码分子然后与释放的细胞组分(例如，细胞核酸)相互作用，以产生条形码化核酸分子，用于如本文别处所述的核酸测序。在条形码珠(例如，凝胶珠)降解或核酸条形码分子被可释放地附着于条形码珠(例如，凝胶珠)的实施方式中，条形码化的细胞组分(例如，条形码化的cDNA或gDNA片段)不附着于珠。在给定液滴包含单细胞珠和单个条形码珠的情况下，该单个条形码珠包含含有共同条形码序列的核酸条形码分子，条形码化细胞组分(或其衍生物)可经由共同条形码序列与给定细胞珠的细胞(或其他生物样品，例如细菌或病毒)缔合。
图16D描述了两个示例性微流体反应，其说明使用图16A的方法和图16B和图16C中描述的微流体装置产生包括细胞珠和凝胶珠的液滴1625。图16D(平板A)显示包括细胞珠和凝胶珠的液滴，而图16D(平板B)显示包括细胞珠和凝胶珠的液滴，所述细胞珠包括磁性材料(例如，磁性颗粒)。
包含与条形码分子缔合的条形码珠(例如，凝胶珠)和封装如细胞核酸的细胞成分的珠(例如，细胞珠)的分配物可用于成分分析，如在美国专利公开号2018/0216162中所述，其出于所有目的通过引用整体并入本文。图17中示意性地描述了包含条形码珠和细胞珠的分配物的产生。在操作1701中，通过将细胞封装在聚合物基质中以形成细胞珠来产生细胞珠。然后，在操作1702中，使细胞裂解，使得核酸和细胞的其他成分从细胞释放并被细胞珠聚合物基质捕集。然后，在操作1703中，在适于例如消化蛋白质和/或使核酸变性(例如，通过碱性试剂)的条件下处理细胞珠。然后，可洗涤和分离细胞珠以供进一步处理。
计算机系统
本公开提供了被编程以实现本公开的方法的计算机系统。图18显示计算机系统1801，其被编程或以其他方式配置以(i)在液滴形成期间控制微流体系统，例如在不同通道加入每种组分的速率，(ii)控制液滴内点击化学反应的反应条件，以及(iii)进行测序应用。计算机系统1801可调节本公开的各个方面，例如，当形成液滴时，调节加入各种试剂(例如还原剂)的速率，以及调节微流体结构中的一个或多个通道中的流体流速。计算机系统1801可为用户的电子设备或相对于电子设备远程定位的计算机系统。电子设备可为移动电子设备。
计算机系统1801包括中央处理单元(CPU，在此也称为"处理器"和"计算机处理器")1805，其可为单核或多核处理器，或者用于并行处理的多个处理器。计算机系统1801还包括存储器或存储器位置1810(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存)、电子存储单元1815(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口1820(例如，网络适配器)、以及诸如高速缓存、其他存储器、数据存储和/或电子显示器适配器的外围设备1825。存储器1810、存储单元1815、接口1820和外围设备1825通过诸如主板的通信总线(实线)与CPU1805通信。存储单元1815可为用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机系统1801可在通信接口1820的帮助下可操作地偶联到计算机网络("网络")1830。网络1830可为因特网、因特网和/或外联网、或者与因特网通信的内联网和/或外联网。在一些情况下，网络1830为电信和/或数据网络。网络1830可包括一个或多个计算机服务器，其可实现分布式计算，诸如云计算。在一些情况下，网络1830在计算机系统1801的帮助下可实现对等网络，该对等网络可使得偶联到计算机系统1801的设备能够充当客户端或服务器。
CPU1805可执行机器可读指令序列，其可以程序或软件来实现。指令可存储在诸如存储器1810的存储器位置中。指令可被引导到CPU1805，其可随后编程或以其他方式配置CPU1805，以实施本公开的方法。由CPU1805执行的操作的示例可包括获取、解码、执行和写回。
CPU1805可为电路的一部分，例如集成电路。系统1801的一个或多个其他部件可包括在电路中。在一些情况下，电路为专用集成电路(ASIC)。
存储单元1815可存储文件，例如驱动程序、库和保存的程序。存储单元1815可存储用户数据，例如用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统1801可包括一个或多个附加数据存储单元，其在计算机系统1801的外部，例如位于通过内联网或因特网与计算机系统1801通信的远程服务器上。
计算机系统1801可通过网络1830与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统1801可与用户(例如，操作者)的远程计算机系统通信。远程计算机系统的示例包括个人计算机(例如，便携式PC)、平板PC(例如，iPad、/>Galaxy Tab)、电话、智能电话(例如，/>iPhone、支持安卓的设备、/>)、或个人数字助理。用户可经由网络1830访问计算机系统1801。
可通过存储在计算机系统1801的电子存储位置(例如，存储器1810或电子存储单元1815)上的机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实现本文所述的方法。机器可执行或机器可读代码可以软件的形式提供。在使用期间，代码可由处理器1805执行。在一些情况下，可从存储单元1815检索代码，并将其存储在存储器1810上，以便由处理器1805准备访问。在一些情况下，可排除电子存储单元1815，并且机器可执行指令被存储在存储器1810上。
代码可被预编译并被配置成与具有适于执行代码的处理器的机器一起使用，或者可在运行时间被编译。可用编程语言来提供代码，可选择编程语言来使代码能够以预编译或按编译后的方式执行。
本文提供的系统和方法的各方面，诸如计算机系统901，可编程来体现。本技术的各个方面可被认为是"产品"或"制品"，其通常具有机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式，其被承载在一种机器可读介质上或体现在一种机器可读介质中。机器可执行代码可存储在电子存储单元上，例如存储器(例如只读存储器、随机存取存储器、闪存)或硬盘。"存储"型介质可包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器或其相关联的模块，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可在任何时间为软件编程提供非暂时性存储。软件的全部或部分有时可通过因特网或各种其他电信网络来通信。例如，这种通信可使得能够将软件从一个计算机或处理器加载到另一个计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可承载软件元素的另一类型的介质包括光波、电波和电磁波，诸如通过有线和光陆线网络以及通过各种空中链路跨本地设备之间的物理接口使用的。携带这种波的物理元件，诸如有线或无线链路、光链路等，也可被认为是承载软件的介质。如本文所使用的，除非限于非暂时性的、有形的"存储"介质，否则诸如计算机或机器"可读介质"的术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
因此，诸如计算机可执行代码的机器可读介质可采取许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，诸如任何计算机中的任何存储设备等，诸如可用于实现附图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如这种计算机平台的主存储器。有形传输介质包括：同轴电缆；铜线和光纤，包括构成计算机系统内的总线的导线。载波传输介质可采取电信号或电磁信号、或声波或光波的形式，例如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间产生的那些。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、软磁盘、硬盘、磁带、任何其他磁介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光介质、穿孔卡片纸带、任何其他具有孔图案的物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或盒、传输数据或指令的载波、传输这种载波的电缆或链路、或计算机可从其读取编程代码和/或数据的任何其他介质。许多这些形式的计算机可读介质可参与将一个或多个指令的一个或多个序列承载到处理器以供执行。
计算机系统1801可包括或与之通信的电子显示器1835，所述电子显示器包括用户界面(UI)1840，用于例如提供水凝胶形成的程度和水凝胶的溶胀比。UI的示例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户界面。本公开的方法和系统可通过一个或多个算法来实现。可在由中央处理单元1805执行时通过软件来实现算法。该算法可例如进行测序，并根据某些反应的程度调节各种试剂的加入。
本公开的装置、系统、组合物和方法可用于各种应用，例如处理单个分析物(例如，RNA，DNA，或蛋白质)或形成单细胞的多个分析物(例如，DNA和RNA，DNA和蛋白质，RNA和蛋白质，或RNA、DNA和蛋白质)。例如，生物颗粒(例如，细胞或细胞珠)被分配在分配物(例如，液滴)中，并且来自生物颗粒的多种分析物被处理以用于后续处理。多种分析物可来自单细胞。这可使得例如细胞的同时的蛋白质组学、转录组学和基因组分析成为可能。
实施例1：具有点击化学部分的单体和聚合物的合成
在一些情况下，将羧酸基团引入聚合物中作为附着点击化学部分/前体的锚。如方案3所示，含酸聚合物1C可通过单体1A与单体1B在引发剂存在下的反应制备。整数m和n大于1。
方案3。
当在约1.6M的NaF(NaF：总单体的比率为约1:1)和热引发剂(例如，2,2'-偶氮二[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐，来自Wako的VA-044，约0.1重量％)的存在下，在约30℃至约50℃的温度下，相对于单体1A使用约1重量％的单体1B时，可获得数均摩尔质量(Mn)为约156K的聚合物，其多分散指数(MW/Mn)为约1.786。
根据方案4A，聚合物1C可与炔丙胺1D偶联，得到聚合物1E，其可带有多个点击化学部分(炔烃)。偶联剂可为由酸和胺形成酰胺键的任何偶联剂。例如EDCI、HOBt或HATU。反应可在受控的pH下进行，例如，pH值为约5.0至pH值为约9.0、pH值为约6.0至pH值为约8.0、pH值为约6.5至pH值为约7.5、pH值为约5.0、pH值为约5.5、pH值为约6.0、pH值为约6.5、pH值为约7.0、pH值为约7.5、pH值为约8.0、pH值为约8.5或pH值为约9.0。
方案4A。
类似地，使用酰胺偶联剂，将聚合物1C偶联至带有叠氮化物官能团的伯胺1DD，可合成互补的含叠氮化物的聚合物1EE，如方案4B所示。
方案4B。
或者，聚合物1E可由单体1A和单体1F在方案5所示的聚合反应中形成。可在类似于方案4中所用的偶联剂存在下，通过单体1A和炔丙胺1D之间的偶联反应形成单体1F。在一些情况下，在30℃下，在约0.1重量％的AIBN和1.2M的NaF的存在下，相对于单体1A约1.5重量％的单体1F可形成聚合物1E。
方案5。
含叠氮化物的聚合物的合成也可采用至少两种不同的途径。一种途径为将聚合物1C的羧酸与含叠氮化物的胺偶联。另一种途径为使单体1A与含叠氮化物的丙烯酰胺聚合。两种合成的共同点可为如方案6所示的胺试剂1H。胺试剂1H可与聚合物1C偶联，得到含叠氮化物的聚合物1J。另外，胺试剂1H可与丙烯酰氯偶联，以产生单体1I，其可与单体1A聚合，以得到含有叠氮基的聚合物1J。
方案6
如方案7所示，可合成含炔丙基的单体1M。炔丙醇可与羰基二咪唑反应，以得到炔丙基化剂1K。用炔丙基化剂1K对胱胺1L进行单炔丙基化，可提供单炔丙基化的胱胺1KL，其可进一步在游离胺上酰化，以提供二硫化物连接的炔丙基化的单体1M。单体1M为可降解的含炔的单体。
方案7。
含叠氮化物的单体1N可通过酰化由对叠氮基苯胺制备，如方案8所示。
方案8。
单体1M、1N中的每一种可与单体1A进行聚合，以产生带有点击化学部分的相应的聚合物。
实验2：在油相中制备铜(II)试剂。
1)铜(II)盐的悬浮液。在室温下，将约2.50mM的Krytox-COOH和约1.25mM的Cu(OAc)2在HFE-7500中搅拌约48小时。
2)GB油的制备。通过在溶剂HFE-7500工程油中混合约2.50mM的双-Krytox-乙二醇聚合物(Krytox-PEG-Krytox或BKPP或式I)和约0.25mM的Krytox，可制备GB油。可批量预配制GB油。
3)油相溶液CB油的制备。铜(II)盐悬浮液和GB油可以v/v＝1:1的比例结合在一起，所得混合物可在室温下搅拌约1小时，并通过0.22μm的PES过滤器过滤，以除去不溶性铜(II)盐。滤液为CB油，其包含在HFE-7500中的1.25mM的BKEP、约1.375mM的Krytox-COOH和约0.625mM铜(II)。水层中铜(II)的浓度可使用紫外-可见吸收光谱(在约286nm处的最大吸光度波长)分析。
实验3：制备水相溶液。
通过在水中混合含叠氮化物的聚合物和含炔的聚合物的聚合物对(3.5％w/v)、F-108(0.5％w/v)、磁性颗粒(0.12％w/v)、THPTA(0.25mM)，可制备水相溶液的储备溶液1。
通过在水中混合含叠氮化物的聚合物和含炔的聚合物的聚合物对(3.5％w/v)、F-108(0.5％w/v)、磁性颗粒(0.12％w/v)、THPTA(0.25mM)和抗坏血酸钠(156mM)，可制备水相溶液的储备溶液2。
实验4：在没有细胞下的点击化学和胶凝。
为了制备离散液滴的乳液，可采用与图7中描述的类似的设备设置。具体地，可通过通道701供给储备溶液1(30μL，来自实验3)；可通过通道702供给储备溶液2(40μL，来自实验3)；以及可通过通道704供给CB油(200μL，来自实验2)。在收集孔中可获得液滴的油包水乳液的收集物。液滴的乳液可在孔(有盖)中保持约60分钟。随后的溶剂交换可将油相转化成水相。可视觉观察以及在显微镜下观察胶凝。可通过在显微镜下比较水相中的单分散(100分钟)和NaOH相中的单分散(5分钟)之间的尺寸数据，来测量凝胶的溶胀比。
实验5：在细胞存在下的点击化学和胶凝。
为了制备离散液滴的乳液，可采用与图7中描述的类似的设备设置。具体地，可通过通道701供给储备溶液1(30μL，来自实验3)；可通过通道702供给储备溶液2(40μL，来自实验3)和细胞(100个细胞/μL)；以及可通过通道704供给CB油(200μL，来自实验2)。在收集孔中可获得液滴的油包水乳液的收集物。液滴的乳液可在孔(有盖)中保持约60分钟。随后的溶剂交换可将油相转化成水相(5mM的EDTA)。凝胶可用磷酸盐缓冲盐水洗涤(3次)。可观察胶凝。在显微镜下可观察到单细胞捕捉的凝胶(例如，图19)。可通过比较油相中的单分散液滴(100分钟)和水相中的单分散珠(5分钟)之间的尺寸数据，来测量凝胶的溶胀比。
实验6：使用AIBN作为引发剂的聚合
附着有点击化学前体的共聚物聚(丙烯酰胺)可通过如下的自由基溶液聚合来合成：丙烯酰胺单体(50mmol，丙烯酰胺及其包含点击化学部分的衍生物的混合物)、NaF(1.6M)和2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(VA-044，0.05mmol)可溶解在水中。混合物可用氮气鼓泡半小时，然后在30℃至40℃下经受24小时。冷却至室温后，基于其在水性溶剂中的溶解度相对于有机溶剂(己烷、EtOAc和EtOH等)中的溶解度，可得到所需产物。
实施例2：炔丙基化单体和共聚物的合成
如方案9所示合成含炔丙基的单体2D。如所示，使炔丙醇与羰基二咪唑反应，以得到炔丙基化剂2A。用炔丙基化剂2A对胱胺2B进行单炔丙基化，得到单炔丙基化的胱胺2C，其进一步在游离胺上酰化，得到二硫化物连接的炔丙基化单体2D。单体2D为可降解的含炔单体。
方案9。
如下通过自由基溶液聚合合成附着有点击化学前体的共聚物(参见方案10和方案11)。
对于第一共聚物，将丙烯酰胺单体(50mmol，丙烯酰胺和单体2D的混合物)、NaF(1.6M)和2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(AIBN，0.05mmol)溶解在水中。用氮气鼓泡混合物30分钟，然后在30℃至40℃下经受24小时。冷却至室温后，基于其在水性溶剂中的溶解度相对于有机溶剂(己烷、EtOAc和EtOH等)中的溶解度，得到所需产物。
方案10。
对于第二共聚物，将聚(丙烯酰胺)聚合物和DMTMM溶解在水中，用NaOH将pH校正至7.5。加入3-叠氮基-1-丙胺，并将溶液在避光的条件下于室温搅拌约16小时。通过透析纯化产物并冻干，得到目标共聚物，为白色固体。
方案11。
实施例3：用点击化学产生的细胞珠用于单细胞DNA测序的用途
如实施例2所述进行叠氮化物和炔烃聚合物的合成。
在油相中制备铜(II)试剂
1)铜(II)盐的悬浮液。在室温下，在HFE-7500中搅拌约1.375mM的Krytox-COOH和约1.25mM的Cu(OAc)2约48小时。
2)GB油的制备。通过将约2.50mM的双-Krytox-乙二醇聚合物(Krytox-PEG-Krytox或BKEP或式I)和约0.25mM的Krytox在溶剂HFE-7500工程油中混合，制备GB油。批量预配制GB油。
3)油相溶液CB油的制备。铜(II)盐悬浮液和GB油以v/v＝1:1的比例结合在一起，所得混合物在室温下搅拌约1小时，并通过0.22μm的PES过滤器过滤，以除去不溶性铜(II)盐。滤液为CB油，其包含在HFE-7500中的1.25mM的BKEP、约1.375mM的Krytox-COOH和约0.625mM铜(II)。
水相溶液的制备
通过在水中混合含叠氮化物的聚合物(1.75％w/v)和含炔的聚合物(1.75％w/v)的聚合物对、F-108(0.5％w/v)、磁性颗粒(如表1中所示)、在水中的THPTA(1.00mM)、抗坏血酸钠(10.00mM)和任选的DMSO(如表1中所示)，制备包含抗坏血酸钠的储备溶液。对于用于细胞珠产生的每种样品类型，产生不含抗坏血酸钠的相应储备溶液(参见下文)。
表1
在细胞存在下的点击化学和胶凝
为了制备离散液滴的乳液，可采用与图7中描述的类似的设备设置。具体地，通过第一通道(例如701)供给具有抗坏血酸钠(60μL)和BJ细胞的储备溶液；通过第二通道(例如702)供给不具有抗坏血酸钠的相应储备溶液(40μL)；并且通过第三通道(例如704)供给无铜油(270μL)。在收集孔中获得液滴的油包水乳液的收集物。将液滴的乳液在1000rpm摇动下在孔(具有盖子)中保持约15分钟。然后，加入CB油至最终铜浓度为0.9mM。液滴的乳液在1000rpm摇动下在孔中保持另外45分钟。随后用溶剂交换将油相转化成水相(5mM的EDTA)。在磷酸盐缓冲盐水(3×)中洗涤凝胶，从而产生细胞珠。目视观察和在显微镜下观察胶凝。
DNA测序
如本文别处所述，处理所得细胞珠以进行DNA测序。简言之，将细胞珠与条形码珠一起分配到液滴中，裂解，并且将来自细胞的DNA条形码化。分离所得的条形码化DNA并进行核酸测序。分析每个样品的核酸测序结果并与最佳细胞珠性能的靶规格比较。该分析的结果示于表2中。
表2
图20显示来自一个样品AN400_0.06_DMSO的测序结果，证明使用这些条件的高质量测序结果。
实施例4：细胞定中心
如实施例2所述进行叠氮化物和炔烃聚合物的合成。
在油相中制备铜(II)试剂
1)铜(II)盐的悬浮液。在室温下，在HFE-7500中搅拌约1.375mM的Krytox-COOH和约1.25mM的Cu(OAc)2约48小时。
2)GB油的制备。通过将约2.50mM的双-Krytox-乙二醇聚合物(Krytox-PEG-Krytox或BKEP或式I)和约0.25mM的Krytox在溶剂HFE-7500工程油中混合，制备GB油。批量预配制GB油。
3)油相溶液CB油的制备。铜(II)盐悬浮液和GB油以v/v＝1:1的比例结合在一起，所得混合物在室温下搅拌约1小时，并通过0.22μm的PES过滤器过滤，以除去不溶性铜(II)盐。滤液为CB油，其包含在HFE-7500中的1.25mM的BKEP、约1.375mM的Krytox-COOH和约0.625mM的铜(II)。
水相溶液的制备
通过在水中混合含叠氮化物的聚合物(1.75％w/v)和含炔的聚合物(1.75％w/v)的聚合物对、F-108(0.5％w/v)、磁性颗粒(0.12％w/v)、在水中的THPTA(1.00mM)、以及抗坏血酸钠(150.00mM)，制备包含抗坏血酸钠的储备溶液。对于用于细胞珠产生的每种样品类型，产生不含抗坏血酸钠的相应储备溶液(参见下文)。
在细胞存在下的点击化学和胶凝
为了制备离散液滴的乳液，可采用与图7中描述的类似的设备设置。具体地，通过第一通道(例如701)供给具有抗坏血酸钠(60μL)和由受试者得到的外周血单核细胞(PBMC)的储备溶液；通过第二通道(例如702)供给不含抗坏血酸钠的相应储备溶液(40μL)；并且通过第三通道(例如704)供给无铜油(270μL)。在收集孔中获得液滴的油包水乳液的收集物。将液滴的乳液分离到两组孔中，并通过图21A所示的工作流程进行处理。覆盖一组乳液约15分钟，以1000rpm摇动以促进细胞定中心。第二组在不摇动的情况下覆盖约15分钟。然后，加入CB油至最终铜浓度为0.625mM。液滴的乳液在1000rpm摇动下在孔中保持另外45分钟。随后用溶剂交换将油相转化成水相(5mM的EDTA)。在磷酸盐缓冲盐水(3×)中洗涤凝胶，从而产生细胞珠。目视观察和在显微镜下观察胶凝。
核染色和成像
用核染色对细胞珠进行染色，并使用荧光显微镜进行成像。成像结果示于图21B(未定中心)和图21C(定中心)中。图22显示细胞中心分析的结果，证明与没有进行定中心程序的那些相比，经历定中心程序(摇动)的乳液产生了更多数量的细胞珠，其中细胞在珠的中心附近。
实施例5：影响DNA降解的细胞珠产生参数
产生包含叠氮化物和含炔聚合物、DNA和如图23中所示的另外的组分的多种乳液。提供150mM抗坏血酸钠。每种均使用无铜油产生。通过定量PCR(qPCR)测量来自每个的DNA浓度。这些结果表明，在顺磁颗粒(PMP)和抗坏血酸钠(Na Asc)存在下，由于DNA降解，DNA浓度降低。从条件中除去PMP恢复消除DNA降解。
实施例6：DMSO加入和/或PMP选择影响DNA降解
产生包含叠氮化物和含炔聚合物、DNA和如图24中所示的另外的组分的多种乳液。每种均使用含铜油产生。提供10mM抗坏血酸钠。测试了两种不同的PMP；SpheroTM羧基磁性颗粒(Sphero)，其包含围绕聚苯乙烯核心的氧化铁涂层，以及Dynabeads磁性珠(Dyna)，其包含被外部聚合物涂层围绕的氧化铁核心，各自有不同的DMSO浓度，如图X所示。这些结果表明，Dynabeads的使用和加入至少5％DMSO可防止DNA降解。
实施例7：用CuAcAc产生细胞珠
在不同的参数下测试六氟乙酰丙酮铜(II)(CuAcAc)的使用，其作为用于点击化学介导的细胞珠产生的铜源。
图25A显示使用在10mM至200mM范围的变化的抗坏血酸钠(Na Asc)浓度产生细胞珠的结果。如本文所述使用以下参数产生细胞珠：1mM的THPTA、1mM的CuAcAc和2.5mM的KmPEG油。这些结果证明，在这些条件下，100mM抗坏血酸钠提供了最佳的细胞珠产生。
图25B显示使用从0分钟到过夜(ON)范围的变化的胶凝时间产生细胞珠的结果。如本文所述使用以下参数产生细胞珠：1mM的THPTA、1mM的CuAcAc、2.5mM的KmPEG油和100mM抗坏血酸钠。这些结果证明，在这些条件下，60分钟的胶凝时间为实现最佳细胞珠产生所需的最小值。
图25C显示使用在0.5mM至8mM范围的变化的THPTA浓度产生细胞珠的结果。如本文所述使用以下参数产生细胞珠：1mM的CuAcAc、2.5mM的KmPEG油和20mM抗坏血酸钠。这些结果证明，在这些条件下，5mM的THPTA提供了最佳的细胞珠产生。
图25D显示使用在2.5mM至100mM范围的变化的抗坏血酸钠(Na Asc)浓度产生细胞珠的结果。如本文所述使用以下参数产生细胞珠：5mM的THPTA、1mM的CuAcAc和2.5mM的KmPEG油。这些结果证明，在这些条件下，50mM抗坏血酸钠提供了最佳的细胞珠产生。
图26A显示使用在0.3125mM至3.75mM范围的变化的CuAcAc浓度产生细胞珠的结果。如本文所述使用以下参数产生细胞珠：5mM的THPTA、2.5mM的KmPEG油和20mM抗坏血酸钠。这些结果证明，在这些条件下，1mM的CuAcAc提供了最佳的细胞珠产生。
图26B显示使用从0分钟到过夜(ON)范围的变化的胶凝时间产生细胞珠的结果。如本文所述使用以下参数产生细胞珠：5mM的THPTA、1mM的CuAcAc、2.5mM的KmPEG油和50mM抗坏血酸钠。这些结果证明，在这些条件下，15分钟的胶凝时间为实现最佳细胞珠产生所需的最小值。
表3显示鉴定为最佳的使用CuAcAc产生细胞珠的参数，仅需要15分钟的胶凝时间。
表3
组分 最终浓度
叠氮化物聚合物混合物 1.75％w/v
炔烃聚合物混合物 1.75％w/v
F-108 0.50％w/v
磁性颗粒(PMP) 0.12％w/v
配体(THPTA) 5.00mM
还原剂(Na Asc)。 50.00mM
添加剂(DMSO) 5％v/v
实施例8：用Cu2OAc产生细胞珠
在不同参数下测试使用乙酸铜(Cu2OAc)作为用于点击化学介导的细胞珠产生的铜源。
图27A显示使用在0.05mM至8mM范围的变化的THPTA浓度产生细胞珠的结果。如本文所述使用以下参数产生细胞珠：5mM抗坏血酸钠、0.625mM的Cu2OAc和2.5mM的KmPEG油。这些结果证明，在这些条件下，1mM的THPTA提供了最佳的细胞珠产生。对于THPA浓度为0.05mM、5mM和8mM，没有观察到胶凝。
图27B显示使用在2.5mM至100mM范围的变化的抗坏血酸钠(Na Asc)浓度产生细胞珠的结果。如本文所述使用以下参数产生细胞珠：1mM的THPTA、0.625mM的Cu2OAc和2.5mM的KmPEG油。这些结果证明，在这些条件下，50mM抗坏血酸钠提供了最佳的细胞珠产生。
图27C显示使用在2.5mM至100mM范围变化的抗坏血酸钠(NaAsc)浓度产生细胞珠的结果。如本文所述使用以下参数产生细胞珠：1mM的THPTA、1mM的Cu2OAc和2.5mM的KmPEG油。这些结果证明，在这些条件下，20mM抗坏血酸钠提供了最佳的细胞珠产生。
图27D显示使用在2.5mM至100mM范围变化的抗坏血酸钠(NaAsc)浓度产生细胞珠的结果。如本文所述使用以下参数产生细胞珠：1mM的THPTA、2mM的Cu2OAc和2.5mM的KmPEG油。这些结果证明，在这些条件下，20mM抗坏血酸钠提供了最佳的细胞珠产生。
图28A显示使用在0.025mM至5mM范围变化的THPTA浓度产生细胞珠的结果。如本文所述使用以下参数产生细胞珠：2mM的Cu2OAc、20mM抗坏血酸钠和2.5mM的KmPEG油。这些结果证明，在这些条件下，1mM的THPTA提供了最佳的细胞珠产生。
图28B显示使用从0分钟到过夜(ON)范围变化的胶凝时间产生细胞珠的结果。如本文所述使用以下参数产生细胞珠：1mM的THPTA、2mM的Cu2OAc、2.5mM的KmPEG油和20mM抗坏血酸钠。这些结果证明，在这些条件下，30分钟的胶凝时间为实现最佳细胞珠产生所需的最小值。
表4显示鉴定为最佳的使用Cu2OAc产生细胞珠的参数，仅需要30分钟的胶凝时间。
表4
组分 最终浓度
叠氮化物聚合物混合物 1.75％w/v
炔烃聚合物混合物 1.75％w/v
F-108 0.50％w/v
磁性颗粒(PMP) 0.12％w/v
配体(THPTA) 1.00mM
还原剂(Na Asc)。 20.00mM
添加剂(DMSO) 5％v/v
实施例9：铜纳米颗粒/细胞络合物的产生
铜纳米颗粒(CuNP)从US Research Nanomaterials Inc.(美国研究纳米材料公司)获得。将10mg的CuNP悬浮在1ml完全细胞培养基中。将CuNP超声处理2分钟，然后涡旋10分钟。将10ml完全细胞培养基加入到CuNP悬浮液中，并在150g下离心5分钟，以除去大颗粒。收集上清液，并在1000g下离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于1ml完全细胞培养基中。将得到的CuNP悬浮液在浴超声波仪中超声处理30分钟。
接着，将细胞以107个细胞/ml重悬于完全细胞培养基中。将1mL的CuNP分散体加入到细胞悬浮液中，并在4℃下孵育15分钟。然后，将混合物在50g、4℃下离心5分钟，轻轻混合，并使用相同条件再次离心。用10ml完全细胞培养基洗涤细胞沉淀两次，在20g、4℃下离心，每次洗涤后除去上清液。最后，将CuNP/细胞混合物重悬于500μl完全培养基中，用于细胞珠产生。
实施例10：用于细胞珠产生的铜纳米颗粒的用途
如本文所述，将CuNP/细胞混合物与用于产生细胞珠的聚合物一起分配到液滴中。使用CuNP作为催化剂，通过点击化学，交联包含细胞/CuNP络合物的液滴中的聚合物，从而产生细胞珠。不含细胞/CuNP络合物的液滴中的聚合物不交联。产生细胞珠群体。
虽然在此已经显示和描述了本发明的优选实施方式，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施方式仅作为示例提供。本发明不受说明书中提供的具体实施例的限制。尽管已经参照上述说明书描述了本发明，但是本文实施方式的描述和说明不意味着以限制的意义来解释。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员可想到许多变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文所述的具体描述、配置或相对比例，其取决于各种条件和变量。应当理解，在实施本发明时可采用本文所述的本发明实施方式的各种替代。因此，可预期本发明还将涵盖任何这样的替代、修改、变化或等效物。下面的权利要求书旨在限定本发明的范围，并且这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物由此被涵盖。

Claims (73)

1.一种凝胶，包含：
(a)细胞或细胞核；
(b)两种或更多种聚合物；以及
(c)多个接头，所述多个接头中的每一个包含1,2,3-三唑部分，其中所述接头使所述两种或更多种聚合物交联，其中所述多个接头中的每一个包括不稳定键和所述不稳定键包括二硫键。
2.根据权利要求1所述的凝胶，其中所述两种或更多种聚合物中的每个独立地包含选自由以下组成的组中的至少一种：聚烯烃、丙烯酸类、乙烯基聚合物、聚酰胺、聚酰亚胺、甲醛树脂、聚氨酯、纤维素、和热塑性弹性体。
3.根据权利要求2所述的凝胶，其中所述聚烯烃为烯烃共聚物,和/或热塑性弹性体为热塑性聚氨酯。
4.根据权利要求1所述的凝胶，其中所述两种或更多种聚合物中的每个独立地为聚丙烯酰胺。
5.根据权利要求4所述的凝胶，其中所述多个接头中的每一个独立地与所述两种或更多种聚合物的酰胺连接。
6.根据权利要求1所述的凝胶，其中所述不稳定键为化学不稳定键、热不稳定键或光不稳定键。
7.根据权利要求1所述的凝胶，其中所述1,2,3-三唑部分通过在足以形成所述1,2,3-三唑部分的条件下用炔基处理叠氮基的方法形成。
8.根据权利要求1所述的凝胶，还包含至少一种包封在所述凝胶内的试剂。
9.根据权利要求1所述的凝胶，其中所述凝胶为水凝胶。
10.根据权利要求1所述的凝胶，其中所述凝胶还包含带电物质。
11.根据权利要求10所述的凝胶，其中所述带电物质带正电。
12.根据权利要求11所述的凝胶，其中所述带电物质包括三甲基铵。
13.根据权利要求10所述的凝胶，其中所述带电物质带负电。
14.根据权利要求13所述的凝胶，其中所述带电物质包括磷酸盐。
15.根据权利要求10所述的凝胶，其中所述带电物质与所述聚合物或凝胶网络附着。
16.根据权利要求1所述的凝胶，其中所述两种或更多种聚合物中的至少一种为带电聚合物。
17.根据权利要求16所述的凝胶，其中所述带电聚合物为带正电聚合物。
18.根据权利要求17所述的凝胶，其中所述带正电聚合物包含壳聚糖或聚乙烯亚胺。
19.根据权利要求16所述的凝胶，其中所述带电聚合物为带负电聚合物。
20.根据权利要求19所述的凝胶，其中所述带负电聚合物包含藻酸盐。
21.根据权利要求1所述的凝胶，其中所述两种或更多种聚合物中的至少一种包含带电部分，并且其中所述带电部分通过接头与所述两种或更多种聚合物中的所述至少一种连接。
22.根据权利要求21所述的凝胶，其中所述接头包括不稳定键，所述不稳定键能够将所述带电部分从所述两种或更多种聚合物中的所述至少一种切割。
23.根据权利要求21所述的凝胶，其中所述不稳定键为化学不稳定键、热不稳定键或光不稳定键。
24.一种形成包含细胞或细胞核的凝胶的方法，包括：
(a)提供(i)第一聚合物，其中所述第一聚合物包含多个第一交联前体，所述多个第一交联前体中的每一个包含叠氮基；(ii)第二聚合物，其中所述第二聚合物包含多个第二交联前体，所述多个第二交联前体中的每一个包含炔基；以及(iii)所述细胞或所述细胞核；(b)通过所述第一交联前体的第一部分和所述第二交联前体的第二部分之间的反应，使所述第一聚合物和所述第二聚合物交联，从而形成包含所述细胞或所述细胞核的所述凝胶，其中所述反应在所述叠氮化物和所述炔烃之间形成1,2,3-三唑；和
其中所述第一聚合物和/或所述第二聚合物还包括不稳定键和所述不稳定键是二硫键。
25.根据权利要求24的方法，其中所述两种或更多种聚合物中的每个独立地包含选自由以下组成的组中的至少一种：聚烯烃、丙烯酸类、乙烯基聚合物、聚酰胺、聚酰亚胺、甲醛树脂、聚氨酯、纤维素、和热塑性弹性体。
26.根据权利要求25所述的凝胶，其中所述聚烯烃为烯烃共聚物,和/或热塑性弹性体为热塑性聚氨酯。
27.根据权利要求24所述的方法，其中在(b)中的所述反应期间至少约80％的所述不稳定键保持完整。
28.根据权利要求24所述的方法，还包括在(b)之前，提供配置成催化(b)中的所述反应的催化剂。
29.根据权利要求28的方法，还包括在(b)之后，从所述凝胶中除去所述催化剂和/或其衍生物。
30.根据权利要求24所述的方法，其中所述凝胶由多种所述第一聚合物和多种所述第二聚合物形成。
31.根据权利要求24所述的方法，其中所述凝胶为水凝胶。
32.根据权利要求24所述的方法，还包括在(b)之后，裂解所述细胞或所述细胞核，以将一种或多种细胞或细胞核成分释放到所述凝胶中。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述一种或多种细胞或细胞核成分包含核酸。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述核酸包含核糖核酸。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述核糖核酸为信使核糖核酸(mRNA)。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述核糖核酸为微小核糖核酸(miRNA)。
37.根据权利要求33所述的方法，其中所述核酸包含脱氧核糖核酸(DNA)。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述DNA为基因组DNA。
39.根据权利要求32所述的方法，其中所述一种或多种细胞或细胞核成分包括染色质。
40.根据权利要求32所述的方法，其中所述一种或多种细胞或细胞核成分包含蛋白质。
41.根据权利要求32所述的方法，其中所述一种或多种细胞或细胞核成分能够保留在所述凝胶中。
42.根据权利要求32所述的方法，其中所述一种或多种细胞或细胞核成分能够在所述凝胶内保留至少1小时。
43.根据权利要求38所述的方法，还包括使所述DNA变性。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述变性包括使所述凝胶与化学试剂接触。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述化学试剂为碱性试剂。
46.根据权利要求24所述的方法，还包括在(b)之后，使所述细胞或所述细胞核渗透化。
47.根据权利要求24所述的方法，还包括在(b)之前，将所述第一聚合物、所述第二聚合物和所述细胞或细胞核共同分配到分配物中。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述分配物为孔。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述分配物为乳液中的水性液滴。
50.根据权利要求47所述的方法，其中所述分配物包含被配置成催化(b)中的所述反应的试剂。
51.根据权利要求49所述的方法，其中所述乳液包含油相，所述油相包含含有铜(II)部分的试剂，并且其中所述水性液滴包含能够将所述铜(II)部分还原成铜(I)部分的还原剂，其中所述铜(I)部分催化(b)中的所述反应。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述乳液包含促进所述铜(II)部分从所述油相输送到所述水性液滴中的试剂。
53.根据权利要求47所述的方法，还包括在(b)之前，使所述细胞或细胞核在所述分配物中裂解或渗透化。
54.一种用于产生细胞珠的方法，包括：
(a)产生分配物，所述分配物包含(i)来自多个细胞的细胞或来自多个核的核以及(ii)带电聚合物或凝胶前体；以及
(b)使所述分配物经受足以使所述聚合物或凝胶前体反应的条件，以产生包含所述细胞或所述核或其衍生物的带电聚合物或凝胶网络，从而提供所述细胞珠。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述带电聚合物或凝胶前体包含正电荷。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述带电聚合物或凝胶前体包含壳聚糖或聚乙烯亚胺。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述带电聚合物或凝胶前体包含负电荷。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述带电聚合物或凝胶前体包含藻酸盐。
59.根据权利要求54所述的方法，还包括在(b)之前，使所述细胞珠经受足以裂解所述细胞或细胞核的条件，以将一种或多种细胞或细胞核成分释放到所述细胞珠中。
60.根据权利要求54所述的方法，还包括在(b)之后，使所述细胞珠经受足以裂解所述细胞或细胞核的条件，以将一种或多种细胞或细胞核成分释放到所述细胞珠中。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述一种或多种细胞或细胞核成分包含核酸。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述核酸包含核糖核酸。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述核糖核酸为信使核糖核酸(mRNA)。
64.根据权利要求61所述的方法，其中所述核酸包含脱氧核糖核酸。
65.根据权利要求60所述的方法，其中所述一种或多种细胞或细胞核成分包含蛋白质。
66.根据权利要求60所述的方法，其中所述一种或多种细胞或细胞核成分能够保留在所述细胞珠内。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述一种或多种细胞或细胞核成分能够在所述细胞珠内保留至少1小时。
68.一种用于分析来自细胞的一种或多种组分的组合物，包含细胞珠，所述细胞珠包含聚合的或交联的聚合物网络，所述聚合物网络包含细胞或细胞核，所述细胞或细胞核包含所述一种或多种组分，其中所述聚合的或交联的聚合物网络带有电。
69.根据权利要求68所述的组合物，其中所述聚合物网络带正电。
70.根据权利要求69所述的组合物，其中所述聚合物网络包含聚乙烯亚胺或壳聚糖。
71.根据权利要求68所述的组合物，其中所述聚合物网络带负电。
72.根据权利要求71所述的组合物，其中所述聚合物网络包含藻酸盐。
73.根据权利要求68所述的组合物，其中所述一种或多种组分包含核酸。
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