JP6608381B2 - 生物学的試料分析のための光選択的方法 - Google Patents
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Description
特に断りのない限り、技術的用語は、従来の使用に従って用いられる。分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin、Genes VII、Oxford University Press出版、2000(ISBN 019879276X);Kendrewら(編)、The Encyclopedia of Molecular Biology、Blackwell Publishers出版、1994(ISBN 0632021829);及びRobert A.Meyers(編)、Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference、Wiley,John & Sons,Inc.出版、1995(ISBN 0471186341)、並びに他の類似した参考文献に見出され得る。
本開示は、組織及び細胞試料などの生物学的試料についての様々な分析技術に関する。本開示により企図された様々な分析技術には、標的検出、遺伝子シークエンシング(例えば、次世代シークエンシング)、多重化、増幅(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応など)、質量分析に基づいたタンパク質分析などを挙げることができるが、それらに限定されない。本明細書に開示された分析技術は、光化学に基づいたテクノロジーを用いることにより容易にすることができる。
試料において1つ若しくは複数の標的を検出し、及び/又は遺伝子異常の存在を決定するために有用な遺伝子情報を提供するためのプローブ実施態様が本明細書に開示されている。いくつかの実施態様において、プローブは、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料、新鮮な試料、又は凍結試料を分析することを容易にするために用いられる。試料は、組織試料、細胞試料、又は可溶型タンパク質試料であり得る。追加として、開示されたプローブは、検出タグの実質的に無制限の数の組み合わせを提供することができる。この独特な特徴は、多重化アッセイにおいて複数の標的を検出するのに特に適している。
プローブのある特定の実施態様は、生物学的標的などの特定の結合ペアと結合するのに適した特異的結合部分(SBM)を含む。プローブはまた、光反応性部分(PRM)を含んでもよい。実例的な実施態様において、光反応性部分は、光開裂性部分である。特に、光開裂性部分は、適切な波長を有する光への曝露で、特異的結合部分などの他のプローブ成分から切断することが可能であり得る。プローブの実施態様はさらに、下流分析(例えば、アレイに基づいた分析、シークエンシング、及び/又はPCR増幅)に適した検出タグ((TAG)を含んでもよい。これらの成分、加えて、他のプローブ成分のそれぞれは、下記でより詳細に論じられている。
光反応性部分は、光により反応し、又は切断される部分である。いくつかの実施態様において、光反応性部分は、1つ又は複数のプローブ成分から切断される。いくつかの実施態様において、光開裂性部分は、光によって化学的に活性化されて、それが連結されている成分(又は複数の成分)から分離され、典型的には、(結合切断などにより)化学的に分離することが可能である。いくつかの実施態様において、切断事象は、プローブの部分を分離する(例えば、特異的結合部分を検出タグから分離する)。他の実施態様において、切断事象は、保護基を切断する。いくつかの実施態様において、光開裂性部分は、ある特定の波長の光を吸収することが可能である。特定の開示された実施態様において、光開裂性部分は、紫外線及び/又は可視光により切断され得る。適切な紫外線は、典型的には、約250nmから約375nmまで、又は約260nmから約365nmまで、又は約280nmから約350nmまでなどの.約200nmから約400nmまでの範囲の波長を有する。適切な可視光は、典型的には、約450nmから約750nmまで、又は約500nmから約725nmまで、又は約550nmから約700nmまでなどの約400nmから約790nmまでの範囲の波長を有する。
という記号は、光開裂性部分が結合し得る他の成分(例えば、特異的結合部分、リンカー、検出タグなど)への省略された結合を示すために用いられる。
特異的結合部分は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質(例えば、抗体又はその断片)、核酸、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド(例えば、DNA、RNA、miRNAなど)、特異的結合ペアのメンバー(例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなど)、プライマー、アプタマー、プラスミド、又はそれらの組み合わせから選択することができる。特異的結合部分として用いられる適切な抗体には、一次抗体及び/又は二次抗体が挙げられるが、それらに限定されない。例えば、抗体は、試料中の標的と直接的に結合する一次抗体であってもよいし、又はそれは、別の抗体を通して試料中の標的と間接的に結合する二次抗体(例えば、抗種(anti−species)抗体)であってもよい。抗体はまた、モノクローナル抗体であり得る。適切な例示的な特異的抗体には、HER−2/neuウサギモノクローナル抗体、PRウサギモノクローナル抗体、トポイソメラーゼIIaウサギモノクローナル抗体、ERウサギモノクローナル抗体、Ki−67ウサギモノクローナル抗体、p53抗体、及び本明細書に開示された特定の標的配列の何れかを含め、知られている標的、又は今後決定される標的を有する試料を分析することに用いるのに適し得る任意の他の抗体が挙げられるが、それらに限定されない。本明細書に開示されたプローブは、特異的結合部分として抗体全体に限定されず、結合可変領域などの抗体断片を含んでもよい。
プローブのある特定の開示された実施態様は、検出タグを含む。いくつかの実施態様において、検出タグは、固有配列識別子であり得る。他の実施態様において、検出タグは、タグ配列であり得る。
ある特定の実施態様において、プローブは、特異的結合部分、光開裂性部分、及び検出タグ以外の1つ又は複数の追加の成分を含んでもよい。
式中、R5は、ヒドロキシル、エーテル、アミン、及び置換アミンから選択され、R6は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、−ORm、−NRm、及び−SRm(ただし、mは1−20であり、nは1−20である)から選択され、Zは、酸素、硫黄、又はNRa(ただし、Raは、水素、脂肪族、アリール、又はアルキルアリールから選択される)から選択される。
本明細書に記載されたプローブは、今知られている、又は今後開発される任意の方法により作製され得る。プローブを作製するための方法は、プローブに含まれることになっている特定の成分に、少なくとも一部、基づいて選択され得る。本明細書に開示された方法は、当業者により理解されているように、本明細書に明確に開示されたものとは異なる成分に適応するように変化及び改変され得る。
式中、A及びBは、本明細書に開示されたプローブ成分と反応するのに適した、類似した、又は異なる反応基(例えば、カルボニル反応基、アミン反応基、チオール反応基などであり、しかも、検出可能な標識又は特異的結合部分と反応するのに適している)を含み、xは、2から10までの整数(例えば、2、3、又は4)であり、yは1から50まで、例えば、3から20まで又は4から12までなどの2から30までの整数である。
本明細書に開示されたプローブ成分の1つ又は複数は、ある特定の条件下で多かれ少なかれロバストであるように構成され得る。例えば、プローブ中に存在するリンカー及び/又は光開裂性部分は、光化学的及び/又は化学的に誘導されて、そのような光化学的及び/又は化学的操作後に多かれ少なかれロバストである種になり得る。いくつかの実施態様において、特異的に結合するプローブは、試料と結合する前又は後に、よりロバストになるリンカー及び/又は光開裂性部分を有するように構成することができる。したがって、これらのプローブは、特定の波長の光への曝露により切断されない検出タグを含む。よりロバストな光開裂性部分を含まないプローブが切断される。その後、二次切断事象は、異なる波長の光、より長時間の照射、より強い光源、熱的切断、化学的切断、酵素的切断、又はそれらの組み合わせを用いることなどにより、特異的に結合したプローブを切断することを企図され得る。
本明細書に開示されたプローブ及び方法の実施態様は、多くの異なる生物学的標的を同定及び/又は定量化するために用いられ得る。標的タンパク質が言及される場合のこの開示を通じて、そのタンパク質に関連した任意のポリヌクレオチドもまた標的として用いられ得ることは理解されている。標的は、ウイルスゲノム由来などの、ウイルス、細菌、又は細胞内寄生生物などの病原体由来のタンパク質又は核酸分子であり得る。例えば、標的タンパク質は、疾患に関連した(例えば、相関した、原因として関与した、など)標的ポリヌクレオチドから産生され得る。ある特定の開示された実施態様において、対象となる標的(1つ又は複数)は、一塩基多型、プロモーターメチル化、mRNA発現、siRNA、特定コピー数の変化、突然変異、ある特定の発現レベル、再編成、又はそれらの組み合わせなどの遺伝子異常を含む可能性がある特定の核酸配列であり得る。いくつかの実施態様において、標的は、血清、血漿、及び/又は尿などの生物学的試料から得られる可溶型タンパク質である。開示された方法のいくつかの実施態様は、同じ試料から(例えば、同じ組織切片から)同時に、同じ標的(例えば、HER2)のDNA、RNA、及びタンパク質を検出及び定量化するために用いられ得る。
本明細書に記載されたプローブ実施態様を用いる方法、加えて、組織試料又は他の細胞標本を、組織状況及び完全性を維持しながら、単離及び/又は分析するための新規な方法のいくつかの実施態様が本明細書に開示されている。特定の開示された実施態様において、方法はさらに、多重化能力の向上、感度の増加、相対的定量化、及び/又は分解能の向上を提供するためにそれに続く分析技術(例えば、PCR、次世代シークエンシング、アレイハイブリダイゼーションなど)を用いることを含み得る。
特定の開示された実施態様において、方法は、対象となる1つ又は複数の標的を含む組織試料などの生物学的試料を供給することを含む。生物学的試料を、特異的結合部分の標的との結合を促進するのに十分な条件を用いて、プローブと接触させる。いくつかの実施態様において、プローブは、特異的結合部分、光開裂性部分、及び検出タグを含み得る。他の実施態様において、プローブは、光開裂性部分を含まなくてもよく、むしろ、試料は、プローブ、及び光開裂性部分を含む別個の成分を含む組成物に曝露される。方法はさらに、光開裂性部分を切断するのに適した波長及び強度を有する光を生物学的試料の特定の選択されたセクションに曝露して、それにより検出タグを遊離させることを含み得る。その後、検出タグは検出され得る。標的の存在及び/又は場所は、検出可能な標識を(例えば、視覚的に、及び/又は機器を用いて)検出することにより決定され得る。標的のアイデンティティはまた、タグ配列、タグ−鋳型二重鎖、及び/又は固有配列識別子などのプローブの部分を光化学的に単離することにより決定され得る。方法は、1つ若しくは複数の追加の工程を有してもよく、1つ若しくは複数の工程が手作業で実施されてもよいし、又はその工程のいくらか若しくは全部が自動システムにより実施されてもよい。
組織、細胞、又は他の生物学的試料(例えば、血清、血漿、及び/又は尿)などの、方法の様々な実施態様に用いられる試料は、常套的なスクリーニングのために対象から、又は遺伝子異常、感染、若しくは新生物形成などの障害を有するのではないかと疑われる対象から得ることができる。試料は、新鮮な、凍結された、ホルマリン固定された、パラフィン包埋された、又はそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施態様において、方法はまた、「正常な」試料と呼ばれる、遺伝子異常、疾患、障害などを有しない試料にも適用することができる。そのような正常な試料は、とりわけ、他の試料との比較のためのコントロールとして、有用である。試料は、多くの種々の目的のために分析することができる。例えば、試料は、科学的研究において、又は疑われる病弊の診断のために、又は治療成功、生存についての予後の指標としてなど、用いることができる。試料は、単一の標的を含むことができ、又は本明細書に開示された1つ若しくは複数のプローブ実施態様により特異的に結合され得る複数の標的を含むことができる。方法は、様々な試料に用いられ得るが、溶液に基づいた試料に存在しない本来の状況的情報を有する組織試料について特に有利である。特に、細胞間の関係、並びにそれどころか、細胞のサイズ、形、及び分布は、その組織が溶解され、消化され、粉砕されたならば失われる大量の情報を提供する。この状況的情報の重要性は、一次染色(すなわち、ヘマトキシリン及びエオシン、H&Eでの染色)のがんの診断に対する意義によって証明されている。非特異的染色であるため、H&E染色は、状況的情報のみを提供するが、それはがんの診断においてゴールドスタンダードである。
試料が調製された後、その後、生物学的試料は、1つ又は複数のプローブに曝露され得る。例えば、試料は、プローブ又はプローブの混合物を含む溶液と試料を接触させることにより、プローブに曝露され得る。プローブを含有する溶液は、バッファー組成など任意の生物学的に許容される組成で作製することができる。いくつかの実施態様において、バッファーは、50mM Tris/HCl、10mM KCl、5mM (NH4)2SO4、2mM MgCl2を含む。他の実施態様において、バッファーは、TES、HEPES、Trisなどの当技術分野で典型的に用いられるバッファーから選択され得る。
実例的な実施態様において、光反応性プローブを用いて状況的診断を実施するためのシステムはさらに、試料の位置を決定し、それにより、光源が照射されるように構成される試料上の場所に対する場所入力の自動的関係を可能にするように構成される登録システムを含む。一実施態様において、システムは、基材に付着した試料を受けるように構成される試料プラットフォームを含み、登録システムは、光源に関して基材の位置を決定することにより試料の位置を関連づけるように構成される。別の実施態様において、基材は、登録マークを刻み込まれた顕微鏡スライドガラスである。別の実施態様において、登録システムは、登録マークを検出するように構成される。さらに別の実施態様において、登録システムは、2つ又はそれ以上の登録マークを検出するように構成され、その2つ又はそれ以上の登録マークが基材上に刻み込まれている。さらに別の実施態様において、登録システムは、登録マークの場所を約500μm以内の所まで、約300μm以内の所まで、約100μm以内の所まで、約50μm以内の所まで、又は約10μm以内の所まで、同定するように構成される。さらに他の実例的な実施態様において、システムは、登録マークとして組織を用いる。
標的は、今知られている、又は今後開発される様々な検出スキームを用いて検出され得る。特定の開示された実施態様において、検出工程は、まず、プローブの単離された部分を得ること、及びプローブの単離された部分を分析/シークエンシングすることを含み得る。例えば、光開裂性部分が切断された後、プローブの部分が放出され、放出された部分が、試料を適切なバッファー溶液で洗浄することなどにより、試料から単離される。単離された部分が、ヌクレオチド配列によってコードされる情報を含む場合には、単離された部分は、その後、次世代シークエンシングを用いることなどにより、シークエンシングされる。必要、又は望ましいならば、プローブの単離された部分は、ポリメラーゼ連鎖反応を実施することなどにより、増幅されてもよい。特定の開示された実施態様において、増幅工程及びシークエンシング工程は組み合わせられ得る。いくつかの実施態様において、照射される試料の部分は、増幅を受け得るが、照射されない試料の部分は増幅されない。
特定の開示された実施態様において、方法は、試料において1つ又は複数の標的を検出するのに適した組織化学的アッセイを含み得る。これらの実施態様に用いられるプローブは、典型的には、特異的結合部分としての抗体、光開裂性部分、及びタグ配列又は固有配列識別子を含む。方法の特定の実施態様は、組織試料(例えば、FFPE組織試料)などの生物学的試料を、試料中の標的と直接的か、又は標的と間接的かの何れかで結合することができる抗体を含む1つ又は複数のプローブに曝露することに関する。例えば、特定の実施態様は、まず、試料を一次抗体と接触させ、続いて、試料を、二次抗体、光開裂性部分、及び固有配列識別子(又はタグ配列)を含むプローブと接触させることに関し、二次抗体が一次抗体を特異的に認識する。固有配列識別子が用いられる場合には、それは、選択的照射によって放出され得、検出された標的を同定するために、その配列が決定され得る。この実施態様はまた、シークエンシング読み取りの数が、結合した抗体−固有配列識別子コンジュゲートの数とそのまま一致し得るため、組織における結合した抗体の数を定量化するために用いることができる。
1つ又は複数の標的が、光化学に基づいたin situハイブリダイゼーションアッセイを用いて検出される、方法の実施態様もまた本明細書に開示される。特定の開示された実施態様において、方法は、オリゴ/ポリヌクレオチド、光開裂性部分、及びタグ配列又は固有配列識別子を含むプローブに試料を曝露することに関する。プローブを、組織試料にハイブリダイズするようにさせ、その後、試料の部分に光源を用いて照射する。
特定の開示された実施態様において、in situポリメラーゼ伸長反応を促進するために光化学が用いられ得、ポリメラーゼ酵素がin situポリメラーゼ媒介性伸長、in situPCR、及び/又はin situニックトランスレーションのために組織に加えられ得る。例えば、特定の実施態様において、点突然変異を有する核酸標的は、オリゴ/ポリヌクレオチド、及びそのオリゴ/ポリヌクレオチドの1つの末端、典型的には3’末端をブロックする光開裂性部分を含むプローブに核酸標的を曝露することにより分析され得る。オリゴ/ポリヌクレオチドはさらに、検出可能な標識を含んでもよい。
本明細書に記載された成分、方法、キット、及びシステムは、主に、特定の試料に用いられる1つ又は2つのプローブについての説明を提供する。この関連において有用であるが、本手法の1つの重要な利点は、検出様式がオリゴヌクレオチドに基づいていることである。それとして、結合事象の検出及び定量化は、高レベルの多重化の能力がある(及びそれに常套的に適用される)、ロバストかつよく知られたオリゴヌクレオチド手法を用いて実施される。実例的な実施態様において、約2個から約100,000個の間の標的が検出される。他の実施態様において、約10個から約100,000個の間の標的が検出される。別の実施態様において、約10個から約1000個の間の標的が検出される。さらに別の実施態様において、約5個より多い標的が検出される。別の実施態様において、約10個より多い標的が検出される。
本明細書に開示された方法の実施態様の何れかを実行するためのシステムもまた開示される。いくつかの実施態様において、システムは、試料を含むスライドを受け入れるように構成されたスライドトレー、特異的結合部分、光開裂性部分、及び検出タグを含むプローブなどの開示されたプローブ実施態様を分配するように構成されたディスペンサーを含む。システムはまた、試料を選択的に照射するように構成された光源を含み、その照射により、光開裂性部分を切断し、検出タグを放出する。開示されたシステムに用いられるスライドは、単一の標本スライド、アレイスライド、又はマイクロアレイスライドであり得る。光源は、レーザー、LED、又はランプなどの本明細書に開示された光源の何れかから選択され得る。
開示されたシステムに用いられるキットの実施態様もまた本明細書に開示される。状況的診断を実施するための例示的キットが本明細書に開示される。キットは、特異的結合部分、光開裂性部分、及び検出タグを含むプローブ試薬溶液など、開示された実施態様を実施するために用いられる明らかな成分を含み得る。
本明細書に開示された方法の実施態様は、病理組織学についての分野で現在用いられる方法を超える進歩を提供する。いくつかの実施態様において、開示された方法は、方法の実施態様に用いられる標識及びプローブが直接的に検出され、さらなる増幅を必要としないため、定量化可能な結果を提供する。方法のある特定の実施態様に用いられる検出タグが一意的に異なり、開示されたプローブに用いるのに無限の数の異なる種が利用可能であるため、開示された方法の実施態様は、多重化アッセイに適している。当技術分野で知られた多くの多重化方法は、ISHプローブに付着することができる検出可能なタグの数、及び/又は免疫組織化学(IHC)分析に用いられる検出システムの型(例えば、比色及び/又は蛍光検出スキーム)によって制限される。そのような制限に取り組むための方法は存在するが、これらの方法は、典型的には、組織試料を解離し、かつ溶解することを必要とし、それにより全ての組織状況を破壊する。本明細書に開示された方法は、これらの望ましくない工程を回避し、IHC及びISH分析において重要である維持された組織状況的情報のレベルを提供する。開示された方法はまた、繰り返される分析、アーカイブ化、及び/又は立体構造的分析のために組織試料を保存するという利点を提供する。開示された方法は、多重化アッセイを容易にするだけでなく、ある特定の実施態様はさらに、特定の試料の異なる部分上に複数の異なる多重化アッセイを繰り返す能力を提供する。当技術分野で現在知られた方法は、組織不均一性を同じように扱うことができない。
プローブ設計:
いくつかの実施態様において、17番染色体アルファサテライトリピート配列(配列番号4)か、又はALU反復配列(配列番号5)の何れかへの3’結合配列、及び5’非結合配列を有するオリゴヌクレオチドDNAプローブを合成した。いくつかの実験において、7番染色体のセントロメア領域由来のα7t1アルファサテライトリピートの、ニックトランスレーションされてDIG標識されたクローンを、非UV感受性コントロールプローブとして用いた。組織照射の実証のために用いられるプローブを、2つのDNP(ジニトロフェノール)ハプテンを含有する5’非結合部分を有するように設計し(DNP−TATTTT−DNP−TATTTT)、DNAバーコードのPCR検出を実証するために用いられるプローブを、DNA固有配列識別子(配列番号1)に隣接するM13プライマー(フォワード:5’が配列番号6である、リバース:5’が配列番号7である)についてのプライミング部位を含有する非結合性5’テールを有するように設計した。その2つの配列要素を、光開裂性部分(Ambergen)を介して連結した。
in situハイブリダイゼーション(ISH)手順を、BENCHMARK XT自動スライド染色機上で実行した。プローブを、ホルムアミド含有バッファー中、42℃で2時間、ハイブリダイズさせた。プローブを洗浄し、スライドを染色機器から取り出し、照射した。UV照射後、ハイブリダイズしたプローブを、Benchmark XT機器において、Ventana SISH検出を用いて検出した。
365nmで放射するLED光源(XeLED−Ni1UV−R3−365、Xenopus Electronix)を用いて、組織を2cmの距離で30秒間、照射した。UV光をブロックするために組織切片の上にアルミホイルを置いた。その後の照射方法は、20×顕微鏡対物レンズを通過したメタルハライドランプ(X−Cite、Lumen Dynamics)からのUV光を用いた。UVエネルギー線量は、10秒間−1分間の間、50−10mWの範囲であった。DMDデバイスUV源の強度は130mW/cm2であった。スライドを20秒間、照射した。
UV開裂性DNAオリゴヌクレオチドが適切なDNAプローブであるかどうかを決定するために、CHR−17オリゴヌクレオチドを、標的結合領域と、検出可能なDNP標識を含む検出領域との間に光開裂性部分を有するように、設計した。そのプローブを組織試料にハイブリダイズさせ、スライドを機器から取り出し、その後、UV光を照射した。その後、スライドを機器に戻し、UV開裂性DNAタグの存在を、銀ISH[SISH]検出キットを用いて決定した。ニックトランスレーションされたDIG CHR−7プローブでのコントロールもまた用いた。
この実施態様において、(オリゴヌクレオチド、光開裂性部分、及びDNP標識で標識されたタグ配列を含む)ALU DNA ISHプローブを、DNAプローブのDNA検出領域に付着したDNAハプテンの有意な量のSISHシグナルオフを置くように設計した。そのプローブを、組織試料上の様々なスポットにハイブリダイズさせ、過剰なプローブを洗浄し、組織試料を含むスライドを自動染色機から取り出し、3つの方法の1つを用いて照射した。一実施態様において、試料を、20×対物レンズを用いて50mWでおよそ20秒間、照射した。図11は、光を照射されなかったコントロールALUプローブの画像を提供する。
この特定の実施態様において、CHR−17オリゴヌクレオチドを、DNAポリメラーゼIについてのプライマーとして用いた。そのプローブを組織にハイブリダイズさせ、その後、それを洗浄した。ニックトランスレーションプロトコールを用いて、DNAポリメラーゼI(例えば、スライドあたり10、1、又は0.1ユニットのDNAポリメラーゼ)及び他の伸長試薬を、試料に加えて、CHR−17オリゴヌクレオチドの3’末端を2時間の伸長時間で、伸長させた。その後、DIG−dUTPを加えて、抗DIG,AP Red検出キットを用いてプライマー伸長を検出した。これらの特定の例についての結果は、AP red標識が試料において検出されたため、ポリメラーゼ連鎖伸長が起こったことを示した。
この特定の実施態様において、光開裂性部分、及び(プライマー部分、配列識別子部分、及び第2のプライマー部分を含む)固有配列識別子を含むDNAプローブを用いた。DNAプローブを、BenchMark XT機器において扁桃腺組織にハイブリダイズさせた。その後、スライドを取り出し、UV光を、20×対物レンズを用いて、50mWでおよそ20秒間、照射した。遊離した固有配列識別子を含有するスライド上の液体を収集し、次のPCR反応において鋳型として用いた。
一実施態様において、ビオチン化二次抗体を、ストレプトアビジンを用いてビオチン化タグ配列と結合させた。抗原賦活化標的を、まず一次抗体で標識し、続いて、ビオチン化抗−種二次抗体に結合させた。ストレプトアビジンを用いて、ビオチン化タグをビオチン化抗体と連結させた。ストリンジェントな洗浄後、タグを鋳型オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。その後、スライドをエキソヌクレアーゼで処理した。全ての工程を、VMSI Benchmark XT染色機において実施した。洗浄及び風乾後、鋳型を、PCR定量化のために溶液中へ移した。
この特定の実施態様において、光開裂性リンカー(TriLinkから市販されており、構造は下記に提供されている)を介して3つの固有配列識別子配列(配列番号21−23)に付着したALU及びCHR17オリゴ/ポリヌクレオチド配列(それぞれ、配列番号5及び配列番号4)を設計した。プローブ(1μg/mlの最終濃度)を扁桃腺組織にハイブリダイズさせ、デジタルミラーディスプレイ(DMD)照射技術を用いてUV照射に曝露した。照射を、全DMDアレイフィールド(19,151×14,363μm)を用いて、130mW/cm2のUV強度で実行した。コントロールスライドをUV光で処理しないままにした。
この特定の実施態様において、組織内の標的配列から伸長する能力を、PE1.0−CHR7(配列番号45)及びPE1.0−CHR17(配列番号46)プローブを用いて試験した。これらの実験は、光反応性工程の複雑さを加えることなく、ポリメラーゼ伸長を実証している。配列は以下であった:
PE1.0−CHR7(配列番号45):
・5’−AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCTAGCCATTTGATGCCAACAGTAGAAAGGG−3’
PE1.0−CHR17(配列番号46):
・5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATTCAAATCCCCGAGTTGAACTTTCCTTTCAAAGTTCACGT−3’
この特定の実施態様において、CHR7及びCHR17プライマー(それぞれ、配列番号20及び4)を、それぞれ0.1μg/mlの濃度で組織試料に同時にハイブリダイズさせた。収集された、伸長した配列を、伸長したCHR7及びCHR17リバースプライマーの両方を用いる二重PCRによって増幅した(図21)。この特定の実施態様は、開示された方法が、多重化アッセイに適していることを確立している。この場合もやはり、これらを、根本的な伸長手法のロバスト性を示すために、光反応性工程の非存在下で行った。
今、図22(A)−(B)に関して、図22(A)は、配列を、5’末端のビオチン分子(四角形)を用いて精製し得る手法を示す概略図である。PS1及び(プローブ配列から離れた領域に相補的である)CHR7R5を用いて、in situポリメラーゼ伸長を検出した。図22(B)は、その後のPCR増幅の230bpの伸長した産物が、ケージドチミジンを含まないコントロールプローブ、ビオチン−PS1−CHR7(レーン1−2)に関して検出されたことを示すゲルの写真である。
・PS1(配列番号42):5’−TAACTTACGGAGTCGCTCTACG−3’
・CHR7(配列番号43):5’−TCTAGCCATTTGATGCCAACAGTAGAAAGGG−3’
・ビオチン−PS1−CHR7LAN5C(配列番号44):5’/{ビオチン}/TAACTTACGGAGTCGCTCTACGTCTAGCCAT*T*T*GAT*GCCAACAGT*AGAAAGGG−3’
・T*は、プローブのケージドバージョンにおけるケージドチミジンの位置を表す。
この実施態様において、本発明者らは、単一の遺伝子の光選択的in situポリメラーゼ伸長を実証する。今、図23(A)−(B)関して、ケージドチミジン有り、及び無しの、BRAFエクソン13(図23(A))及びHER2エクソン10(図23(B))に特異的なプローブを設計した。両方のプライマーをハイブリダイズさせ、60℃で1時間、ポリメラーゼ伸長させた。ケージドチミジンとハイブリダイズしたスライドを、UV光で処理し、一方、その残りを暗闇中に保った。(マーカーレーンを除いて)レーン1は、ケージドチミジンを含まないコントロールプローブを示す;このように、予想通り、伸長産物が生じ、検出されている。レーン2は、光に曝されなかったケージドチミジン含有プローブを示す。伸長が起きなかったことはゲルから明らかである。レーン3は、UV光に曝されたケージドチミジン含有プローブを示し、伸長した産物が、コントロールプローブ(すなわち、ケージドチミジンを含まないプローブ)から予想されたものと類似したレベルで検出されている。光活性化ヌクレオチドは、両方のプライマーにおいて5つの異なる場所に含まれた。両方のエクソンプライマーを、5’末端でビオチン標識し、伸長したプライマーを、98℃での3−4分間の変性後、ストレプトアビジンビーズで精製した。精製産物のアリコートを、対応するプライマーペアでPCR増幅し、Invitrogen 4%E−ゲルで検出した。以下のプローブ配列がこの研究に用いられた:
・ビオチン−HER2エクソン10(配列番号47):5’−ビオチン−TAACTTACGGAGTCGCTCTACGGCATGGAGCACT*T*GCGAGAGGT*GAGGGCAGT*T*A−3’
・ビオチンBRAFエクソン13(配列番号48):5’−ビオチン−TAACTTACGGAGTCGCTCTACGAGTGGTGTGAGGGCTCCAGCTTGTAT*CACCAT*CT*AT*T*G−3’
・T*は、プローブのケージドバージョンにおけるケージドチミジンの位置を表す。
本明細書に提供される核酸及びアミノ酸配列は、37C.F.R.§1.822において定義されているように、ヌクレオチド塩基については標準文字略語、及びアミノ酸については3文字コードを用いて示される。各核酸配列の1鎖のみが示されるが、相補鎖は、表示された鎖への任意の参照により含まれるものと理解される。
Claims (16)
- 組織試料中でインビトロの状況的分子検出を実施するための方法であって、
組織試料を、光反応性部分と標的に対する特異的結合部分と検出タグとを含むプローブと、試料中での特異的結合部分と標的の結合を促進するのに十分な条件を用いて接触させること、
試料に結合しないプローブを除去すること、
状況的情報に基づいて、照射のための試料の領域を選択すること、
組織試料の選択領域に、光反応性部分を反応させるのに十分な波長及び強度の光を照射し、それにより、さらなる反応のために検出タグを遊離させること、
検出タグに作用する酵素に組織試料を曝露させて、変化をもたらすこと、及び
変化を検出すること、を含み、ここで、検出タグが伸長可能なプライマーであり、光反応性部分が光開裂性ブロッキング基であり、酵素がポリメラーゼであり、変化が、組織試料の選択された照射部分における鋳型配列上のdATP、dCTP、dTTP、及びdGTPの存在下でのプライマー配列の伸長であり、該光開裂性ブロッキング基がポリメラーゼブロッキング部分としての役割を果たし、適切な波長の光に曝露されていない試料のそれらの特定の部分上で伸長可能なプライマーをポリメラーゼ酵素により伸長されることからブロックし、光開裂性部分がケージドATP分子を含み、ケージドATP分子が、試料上に存在するプローブをリン酸基で修飾することが可能であるATP分子へ変換され、該リン酸基が検出可能な標識、特異的結合ペアのメンバー、又はそれらの組み合わせで修飾され、該検出可能な標識が検出されるか又は特異的結合ペアのメンバーを用いて該プローブが単離される、方法。 - プローブが2以上の検出タグを含むか、又は組織試料が2以上のプローブと接触させられ、選択領域を照射した後に、隣接する検出タグをライゲーションすることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 光開裂性部分がケージドATP分子を含み、ケージドATP分子が、試料上に存在するプローブをリン酸基で修飾することが可能であるATP分子へ変換される、請求項1に記載の方法。
- リン酸基を検出可能な標識、特異的結合ペアのメンバー、又はそれらの組み合わせで修飾すること、及び
検出可能な標識を検出すること又は特異的結合ペアのメンバーを用いてプローブを単離することをさらに含む、請求項3に記載の方法。 - 接触させることが、複数の標的に対する特異的結合部分を有する複数のプローブを含み、複数の異なるプローブが、固有検出タグ及び固有特異的結合部分を含み、検出タグを検出することが複数の固有検出タグを検出することを含む、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- 選択することが、追加の領域を選択することをさらに含み、
方法が、
追加の領域を繰り返しかつ別々に照射すること、
追加の選択領域から検出タグを繰り返しかつ別々に検出すること、及び
試料の分子プロフィールを作成するために、選択領域からの検出タグの検出を試料に関連づけることをさらに含み、分子プロフィールが、試料全体の選択区域から検出された検出タグを有する各選択区域に関係している、請求項1から5の何れか一項に記載の方法。 - 検出タグを検出することが、試料において標的の数を定量化することを含む、請求項1から6の何れか一項に記載の方法。
- 特異的結合部分が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プライマー、アプタマー、結合可変領域、プラスミド、DNA、RNA、miRNA、又はそれらの組み合わせから選択される、請求項1から7の何れか一項に記載の方法。
- 試料の第2の選択領域に照射して、光反応性部分を反応させ、それにより、試料の第2の選択領域から、さらなる反応のために検出配列を遊離させること、及び
試料の第2の選択領域内の標的に結合していた検出タグを検出すること
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 検出タグが固有配列識別子又はタグ配列である、請求項1に記載の方法。
- 試料の領域を選択することが、試料の1つ若しくは複数の部分を手作業でマークすること、又は試料の1つ若しくは複数の部分をデジタル的にマークすることを含む、請求項1に記載の方法。
- 選択に用いられる状況的情報が、一次染色、二次染色、蛍光画像化、位相差画像化、形態学的試料特性画像化、画像分析、デジタル画像分析、細胞選択、又はグループ化選択の1つ又は複数の組み合わせを用いて作成される、請求項1から11の何れか一項に記載の方法。
- 検出タグの検出が、次世代シークエンシングを用いて検出タグをシークエンシングすること、PCRを用いて検出タグを分析すること、又はアレイプラットフォームを用いて検出タグを分析することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 試料を、第2の特異的結合部分と第2の光反応性部分と第2の検出タグを含む第2のプローブと接触させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 光反応性部分と第2の光反応性部分が同じであり、検出タグと第2の検出タグが異なり、特異的結合部分と第2の特異的結合部分が異なる、請求項14に記載の方法。
- 組織試料中で状況的分子診断を実施するためのキットであって、光反応性部分と標的に対する特異的結合部分と検出タグとを含むプローブを含み、
ここで、組織試料は、試料中での特異的結合部分の標的に対する結合を促進するのに十分な条件を用いて、該プローブと接触させられ、
試料に結合しないプローブが除去され、
状況的情報に基づいて、照射のための試料の領域が選択され、
組織試料の選択領域が、光反応性部分を反応させるのに十分な波長及び強度の光で照射され、それにより、さらなる反応のために検出タグが遊離させられ、
検出タグに作用する酵素に組織試料が曝露されて、変化がもたらされ、及び
変化が検出され、ここで、検出タグが伸長可能なプライマーであり、光反応性部分が光開裂性ブロッキング基であり、酵素がポリメラーゼであり、変化が、組織試料の選択された照射部分における鋳型配列上のdATP、dCTP、dTTP、及びdGTPの存在下でのプライマー配列の伸長であり、該光開裂性ブロッキング基がポリメラーゼブロッキング部分としての役割を果たし、適切な波長の光に曝露されていない試料のそれらの特定の部分上で伸長可能なプライマーをポリメラーゼ酵素により伸長されることからブロックし、光開裂性部分がケージドATP分子を含み、ケージドATP分子が、試料上に存在するプローブをリン酸基で修飾することが可能であるATP分子へ変換され、該リン酸基が検出可能な標識、特異的結合ペアのメンバー、又はそれらの組み合わせで修飾され、該検出可能な標識が検出されるか又は特異的結合ペアのメンバーを用いて該プローブが単離され、それにより、組織試料中で状況的分子診断が実施される、キット。
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