CN110124100A - 一种可实现药物定向定量释放的载药人工骨支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出一种可实现药物定向定量释放的载药人工骨支架及其制备方法，采用粉末黏结技术，将纳米级羟基磷灰石、微米级聚己内酯相互混合均匀，利用计算机处理人工骨支架三维CAD模型，用含有具有ATP导向的载药介孔二氧化硅纳米颗粒的生物黏结剂来使每层粉末混合黏结，得到一种符合天然骨孔隙率，抗感染，生物力学可控的骨支架。本发明中以中间一层为ATP‑aptamer的三明治结构DNA封堵介孔二氧化硅，利用伤口感染处会存在大量的ATP，由于ATP与ATP‑aptamer有更高的亲和力，ATP把aptamer从三明治结构的DNA上竞争下来，离开颗粒表面，释放介孔二氧化硅颗粒中装载的药物，实现药物的定向定量释放；当伤口处没有感染时，伤口处不会存在大量的ATP，介孔被封住，药物分子无法逃逸出孔道。

Description

一种可实现药物定向定量释放的载药人工骨支架及其制备 方法
技术领域
本发明涉及医用人工骨移植材料的技术领域，具体涉及一种通过介孔二氧化硅为载体进行药物定向释放的人工骨支架的制备方法。
背景技术
在骨科领域，由于严重创伤、骨肿瘤、骨髓炎等多种原因所致的骨缺损十分常见。创伤性骨损修复过程中，极易引发感染，替代骨移植成功与否与是否感染密切相关。感染性骨缺损的治疗由于既要对骨缺损部位进行修复，又要防治感染，一直以来是骨科临床上所面临的难题。感染之后细菌在植入体表面形成生物膜而使单纯的植骨术因感染不易控制而失败，因此患者往往不能进行一期植骨，而须彻底清创，待感染因素消除、伤口愈合、血管重建后再进行二期植骨修复骨缺损。这种治疗方法既增加了患者的痛苦，也延长了治疗时间。
考虑到骨支架所需的抗感染特性，将载有抗生素的具有ATP导向的介孔二氧化硅纳米颗粒加入骨支架中，既可以有效降低感染的风险，也可以避免抗生素的过度使用对人体造成伤害。人工骨作为成骨细胞的载体，起着为成骨细胞生长提供充足的营养物质和生存空间的重要作用，具有抗感染特性的人工骨可以减少患者感染风险，依靠纳米材料的特性，既可保证骨支架的力学性能，又可达到药物在体内的缓释效果。
理想的人工骨修复材料概括起来应具备的特性有:(1)良好的生物相容性与弱的免疫排斥反应；(2)无炎症产生、无毒性骨；(3)传导性与骨诱导再生性；(4)一定的机械强度；(5)药物可定向定量释放；(6)适当的孔径与孔隙率；(7)生物降解性，其降解速度不超过新骨长入的骨组织修复速度；(8)可塑性能在原位固化，固化时间适中，并且能在较低温度下凝固，放热少，对周围骨组织无损伤，并且可预制成所需的任意形状。
在人工骨支架领域，药物的控制释放方法目前主要有时间控制与分布控制两种。其中，时间控制是为了实现缓慢释放，使药物能够在一段很长的时间内持续释放。时间控制的机理包括降解控制释放机理与扩散控制释放机理。降解控制释放机理指的是药物随材料的降解而不断地释放出来，药物释放速率决定于材料的降解速度；扩散控制释放机理是利用药物载体与机体的药物浓度差来实现药物的不断释放，浓度差会随着药物释放程度的增加而减小，因此这一释放机理的最大特点是释放速度逐渐减小。当然，也存在以上两种控制释放机理相混合的药物控制释放方式。分布控制是为了实现药物在伤口处的靶向作用，在伤口部位使药物浓度控制在治疗范围，在其他部位控制药物浓度低于药物致毒最低浓度，但是却无法达到真正的精准定向定量释放药物。
介孔二氧化硅具有良好的生物相容性，其包裹的核-壳材料不仅保持了功能性核的性质，介孔二氧化硅壳层还赋予了该复合材料高的比表面积、可调控的多孔结构，提供了高效负载药物分子、生物大分子、纳米粒子等客体分子的场所，而且这种开放的介孔通道还有利于壳层内外物质的交换，在吸附、分离、生物医药、化学/生物传感等领域都有着广泛的应用价值。依替米星系半合成水溶性抗生素，属氨基糖苷类。体外抗菌作用研究表明：该品抗菌谱广，对多种病原菌有较好抗菌作用，其中对大肠埃希杆菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌属、沙雷菌属、奇异变形杆菌、沙门菌及葡萄菌属等有较高的抗活菌性，对部分假单胞杆菌等具有一定抗菌活性，对部分庆大霉素、小诺霉素和头孢唑啉耐药的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和克雷伯氏肺炎杆菌，其体外MIC值仍在该品治疗剂量的血药浓度范围内。
aptamer是一种人工合成的核苷酸链，能与特定的目标分子(可以是ATP)以很高的亲和力特异性结合。作为一种特殊的核苷酸链，aptamer具有很好的生物相容性，而且可以通过一定的设计形成不同的构型却不影响其特异性，利用这一特性设计控制释放体系，可以达到封堵分子本身特异性识别目标物的效果，使控制释放体系的构建变得更加简单，而且能够有效提高控制释放体系的生物相容性、目标响应敏感性与特异性。
一种多梯度载药浓度人工骨支架的制备方法(专利号CN108379654A)，提出了药物的梯度释放，虽然可以一定程度上减小药物对人体的副作用，但是无法实现药物的定向定量释放，将药物的副作用降到最小。
目前尚无报道将以ATP为导向包埋有依替米星的纳米介孔二氧化硅颗粒同生物胶水混合制备人工骨支架，达到药物定向定量释放的效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物相容性好、力学性能可控、易降解、抗感染且可实现药物定向定量释放的人工骨支架。采用粉末黏结技术，将纳米级羟基磷灰石、微米级聚己内酯相互混合均匀，利用计算机处理人工骨支架三维CAD模型，用含有具有ATP导向的载药介孔二氧化硅纳米颗粒的生物黏结剂来使每层粉末混合黏结，得到一种符合天然骨孔隙率，抗感染，生物力学可控的骨支架。
本发明以三明治结构的DNA(中间一层为ATP-aptamer)封堵介孔二氧化硅，利用伤口感染处会存在大量的ATP，由于ATP与ATP-aptamer有更高的亲和力，ATP把aptamer从三明治结构的DNA上竞争下来，离开颗粒表面，释放介孔二氧化硅颗粒中装载的药物，实现药物的定向定量释放；当伤口处没有感染时，伤口处不会存在大量的ATP，介孔被封住，药物分子无法逃逸出孔道。
基于上述原理，本发明的技术方案为：
所述一种可实现药物定向定量释放的载药人工骨支架，其特征在于：通过用生物水凝胶粘结羟基磷灰石和聚己内酯混合粉末，然后固化干燥得到；所述生物水凝胶通过加入具有ATP导向的载药介孔二氧化硅纳米颗粒实现药物的定向定量释放。
所述一种可实现药物定向定量释放的载药人工骨支架的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：将5’端炔基修饰的单链DNA1、单链DNA2与人工核苷酸链ATP-aptamer互补杂交，得到三明治结构DNA；
步骤2：将叠氮功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒分散在依替沙星溶液中，在摇床中孵育至少24小时；
步骤3：在步骤2得到的溶液中，加入步骤1得到的三明治结构DNA、摩尔浓度为0.1M/L的CuBr溶液和摩尔浓度为0.1M/L的苯并三唑基乙胺溶液，在4℃条件下搅拌至少48小时，制得所需样品；
步骤4：将步骤3得到的样品用Tris-HCl缓冲液洗涤数次，收集洗涤后的沉淀，在真空冷冻干燥箱中干燥至少12小时，得到包载有依替沙星的aptamer功能化的ATP响应型介孔二氧化硅纳米颗粒；
步骤5：将步骤4得到的介孔二氧化硅纳米颗粒与生物胶水混合后得到粘稠状混合物，再加入4.0％胶水体积的固化促进剂聚酰胺和6.0％胶水体积的增塑剂PBMA，混合均匀后加入3D挤压成型机的储液腔中；将粒径为100±10nm大小的羟基磷灰石颗粒与100±30μm的聚己内酯颗粒按照质量比为1:4制得混合材料并加入3D挤压成型机的储料舱中；
步骤6：扫描人体损伤处骨组织，获取损伤骨组织图像数据；依据损伤骨组织图像数据重构人体损伤部位的骨骼三维模型；将得到的骨骼三维模型分割成若干层二维截面图形并导入3D挤压成型机中；
步骤7：3D挤压成型机根据导入的每层数据先在成型工作台上均匀的铺上一层混合材料，再将储液腔中的载药生物胶水喷洒到混合材料上，固化后再重复下一层，直至所有分层打印完毕，支架制作完成，取出支架，对支架进行后续强化处理。
进一步的优选方案，所述一种可实现药物定向定量释放的载药人工骨支架的制备方法，其特征在于：步骤1中，将5’端炔基修饰的单链DNA1、单链DNA2与人工核苷酸链ATP-aptamer放入离心管中，在95℃放置一端时间后，使DNA变成直线单链，然后缓慢冷却，使三条DNA充分互补杂交，获得三明治结构DNA。
有益效果
(1)本发明的人工骨支架制备过程无需烧结，利用了生物微球可降解易溶于水的性质来处理，这保证了生物陶瓷材料的纯净，减少了生物陶瓷被污染的几率，同时还可以精确的控制处理时间。
(2)一般的生物胶黏剂均有黏度低，填隙性能差等缺点，往往因渗透率的原因而不能对多孔表面进行粘接，且固化后脆性较大。针对上述缺陷，本发明分别在生物胶黏剂中添加固化促进剂和增稠增韧改性剂使其充分混合，通过控制固化促进剂的加入量调整生物胶黏剂的固化时间，从而达到了对生物胶黏剂增稠增韧且瞬干的效果，进而增加了生物陶瓷支架的强度和可靠性。
(3)本发明的载药人工骨支架，通过加入抗生素使得骨支架具有一定的抗感染性，减轻患者痛苦，有效减少或者避免二次感染的可能，而且由于是通过介孔二氧化硅载药，因而可以利用介孔二氧化硅的控制释放体系实现对于药物的定向运输，定时定量释放，从而使得药物直达病灶，避免了多余药物带来的的副作用。
本发明制作方法简单，原材料易于获得，植入后生物表现性有了很大的提高，生物学性能和机械性能接近天然骨。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明中的一种可实现药物定向定量释放的载药人工骨支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：取摩尔浓度为100μM/L的5’端炔基修饰的单链DNA1(臂ssDNA1)、单链DNA2(臂ssDNA2)与人工核苷酸链(ATP-aptamer)各1.5mL放入离心管中；在95℃放置5分钟使DNA变成直线单链，然后缓慢冷却，使三条DNA能充分互补杂交，获得三明治结构的DNA；
步骤2：称取10mg叠氮功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN-N3)充分分散在2mL浓度为2mM/L的依替沙星溶液中，在摇床中孵育24小时；
步骤3：在步骤2得到的溶液中，加入步骤1得到的三明治结构DNA、1μL摩尔浓度为0.1M/L的CuBr溶液和2μL摩尔浓度为0.1M/L的苯并三唑基乙胺溶液，在4℃条件下搅拌48小时，制得所需样品；
步骤4：将步骤3得到的样品用Tris-HCl缓冲液洗涤数次，收集洗涤后的沉淀，在真空冷冻干燥箱中干燥12小时，得到包载有依替沙星的aptamer功能化的ATP响应型介孔二氧化硅纳米颗粒(aptamer-MSN)；
步骤5：将步骤4得到的介孔二氧化硅纳米颗粒与生物胶水混合后得到粘稠状混合物，再加入4.0％胶水体积的固化促进剂聚酰胺和6.0％胶水体积的增塑剂PBMA，混合均匀后加入3D挤压成型机的储液腔中；将粒径为100±10nm大小的羟基磷灰石颗粒与100±30μm的聚己内酯颗粒按照质量比为1:4制得混合材料并加入3D挤压成型机的储料舱中；
步骤6：采用Micro-CT扫描人体损伤处骨组织，获取损伤骨组织图像数据；将获取的损伤骨组织图像数据导入Mimics软件，重构人体损伤部位的骨骼三维模型；将得到的骨骼三维模型按从下至上顺序分割成间距0.6mm的二维截面图形N份，再将这N份二维截面图形导入3D挤压成型机中；
步骤7：启动3D挤压成型机，设置i＝1；在成型工作台上均匀的铺上一层羟基磷灰石与聚己内酯的混合材料；再将储液腔中的载药生物胶水喷洒到第i层羟基磷灰石和聚己内酯的混合粉末上，生物胶水平均用量为0.0004ml/mm2，打印完一层后，i＝i+1；直至所有分层打印完毕，支架制作完成，取出支架，对支架进行强化打磨等后续处理。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (3)

1.一种可实现药物定向定量释放的载药人工骨支架，其特征在于：通过用生物水凝胶粘结羟基磷灰石和聚己内酯混合粉末，然后固化干燥得到；所述生物水凝胶通过加入具有ATP导向的载药介孔二氧化硅纳米颗粒实现药物的定向定量释放。
2.一种可实现药物定向定量释放的载药人工骨支架的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：将5’端炔基修饰的单链DNA1、单链DNA2与人工核苷酸链ATP-aptamer互补杂交，得到三明治结构DNA；
步骤2：将叠氮功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒分散在依替沙星溶液中，在摇床中孵育至少24小时；
步骤3：在步骤2得到的溶液中，加入步骤1得到的三明治结构DNA、摩尔浓度为0.1M/L的CuBr溶液和摩尔浓度为0.1M/L的苯并三唑基乙胺溶液，在4℃条件下搅拌至少48小时，制得所需样品；
步骤4：将步骤3得到的样品用Tris-HCl缓冲液洗涤数次，收集洗涤后的沉淀，在真空冷冻干燥箱中干燥至少12小时，得到包载有依替沙星的aptamer功能化的ATP响应型介孔二氧化硅纳米颗粒；
步骤5：将步骤4得到的介孔二氧化硅纳米颗粒与生物胶水混合后得到粘稠状混合物，再加入4.0％胶水体积的固化促进剂聚酰胺和6.0％胶水体积的增塑剂PBMA，混合均匀后加入3D挤压成型机的储液腔中；将粒径为100±10nm大小的羟基磷灰石颗粒与100±30μm的聚己内酯颗粒按照质量比为1:4制得混合材料并加入3D挤压成型机的储料舱中；
步骤6：扫描人体损伤处骨组织，获取损伤骨组织图像数据；依据损伤骨组织图像数据重构人体损伤部位的骨骼三维模型；将得到的骨骼三维模型分割成若干层二维截面图形并导入3D挤压成型机中；
步骤7：3D挤压成型机根据导入的每层数据先在成型工作台上均匀的铺上一层混合材料，再将储液腔中的载药生物胶水喷洒到混合材料上，固化后再重复下一层，直至所有分层打印完毕，支架制作完成，取出支架，对支架进行后续强化处理。
3.根据权利要求2所述一种可实现药物定向定量释放的载药人工骨支架的制备方法，其特征在于：步骤1中，将5’端炔基修饰的单链DNA1、单链DNA2与人工核苷酸链ATP-aptamer放入离心管中，在95℃放置一端时间后，使DNA变成直线单链，然后缓慢冷却，使三条DNA充分互补杂交，获得三明治结构DNA。
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