CN101613698A

CN101613698A - 一种扩增低含量基因突变dna的引物设计方法及其应用

Info

Publication number: CN101613698A
Application number: CN200910111500A
Authority: CN
Inventors: 阮力; 何东华; 郑立谋
Original assignee: Amoy Diagnostics Co Ltd
Current assignee: Amoy Diagnostics Co Ltd
Priority date: 2009-04-13
Filing date: 2009-04-13
Publication date: 2009-12-30
Anticipated expiration: 2029-04-13
Also published as: CN101613698B

Abstract

一种扩增低含量基因突变DNA的引物设计方法，涉及一种DNA扩增技术。本发明所提供的引物，可分为四个区域，从5′端到3′端分别为GC区、5′端配对区、3A区、3′端突变配对区。其特征在于：每对所述引物对中的一条引物的5′末端均加有一段与待扩增靶序列无关的寡核苷酸尾，离3′末端的第5～8个寡核苷酸处插入3个A碱基片段，突变位置放在3′末端1－4位。本发明的引物设计方法能够有效的在较高野生型DNA背景时突变基因DNA含量较低的情况下特异扩增目的产物，可进行单重或多重PCR扩增，在核酸检测中可以得到广泛应用。

Description

一种扩增低含量基因突变DNA的引物设计方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种新的核酸扩增引物设计方法，尤其涉及一种基于高野生型DNA背景下，扩增低含量基因突变DNA的引物设计方法，及其在核酸检测上的应用。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是基因扩增技术的一次重大飞跃，该技术1985年由美国PE公司遗传部的Kary B Mullis教授发明。PCR技术首先应用于人β-珠蛋白DNA扩增及镰刀状红细胞贫血症的产前诊断。由于此项技术可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测到单分子或在10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品。因而，此技术在短短的几年内就广泛的应用于分子生物学、医学、微生物学、遗传学等领域。

PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶(如Taq酶等)的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分三步：①变性(denaturation)：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。②退火(annealling)：当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补复性的机会较少。③延伸(extension)：在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷之磷酸底物及Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。以上3步为一个循环，每一个循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制。决定PCR扩增特异性的引物是由人工合成的一段寡核苷酸。在反应最初阶段，原来的DNA起着起始模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧地增多而成为主要模板。因此，绝大多数扩增产物将受到所加引物5′末端的限制，最终扩增产物是介于两种引物5′端之间的DNA片段。

随着生命科学研究的不断进展，人们已经认识到核酸是决定遗传信息的关键物质，通过检测样品中是否存在某种(些)核酸及其序列变异，就可以判断出检测对象是否携带某种病原微生物及其抗药性、患有某种疾病或处于某种遗传状态等。因此，核酸分析技术已经广泛应用于生命科学研究的众多领域，包括病原微生物的鉴定、分型和耐药性检测；疾病诊断与预后等。

现有PCR技术设计的引物缺陷主要有：1)特异性不好，针对基因突变的普通方法设计的引物，常常产生非特异性扩增条带。2)选择性不好，在较高的野生型模板的背景下，针对较低含量的基因突变DNA的检测能力有限，而往往大部分引起肿瘤的突变都是体细胞突变，突变细胞都是掺杂在野生型细胞内的，因此所提的DNA也是带有大量野生型DNA的。

发明内容

本发明的目的在于针对在较高野生型模板的背景下，为有效扩增目的片段产物，提供一种简单、廉价、高效的高特异的扩增目的产物的PCR扩增引物设计方法及其应用。

本发明的技术方案如下：首先按常规方法设计一对靶序列特异性引物，然后在每对所述引物对中的一条引物的5′末端加一段与待扩增靶序列无关的GC寡核苷酸尾，离3′末端的第5~8个寡核苷酸处插入3个A碱基片段，突变位置放在3′末端1-4位。

本发明所设计的引物结构，见附图1(a)，所设计的引物对中的一条引物包括四个区域，从5′端到3′端分别为GC区、5′端配对区、3A区和3′端突变配对区；所设计的引物总长度不大于40bp。

为了使所设计的引物具有合适的TM值，所述寡核苷酸尾长度优选为2-5bp，Tm值在6-10℃，碱基数量优选为3bp。该GC区根据待扩增靶序列的特点来选择，确保该区域与待扩增靶序列不会配对，且3个寡核苷酸可以是GGG或CCC，也可以是GC混合的碱基，但是所添加的无关碱基不与引物其他地方形成明显的二级结构。

引物5′端配对区碱基数在16-26个碱基，Tm值在50-55℃左右，在引物退火时起到保证引物与靶序列有一定的结合效率的作用。

由于本发明主要针对基因突变中的点突变、缺失突变以及插入突变等，仅仅靠增加GC区对提高扩增的目的性和有效性是不够的，为了提高扩增的目的性和有效性，本发明在离引物3′末端的第5-8位碱基处插入3个与靶序列不匹配的A碱基片段。经研究表明，在离引物3′末端的第5-8位碱基处插入3个A碱基片段，可以增加引物的特异性。根据具体序列的不同，保持引物3′末端突变匹配区的Tm值在10-15℃，尽量减少引物二级结构，选择引物3′末端的第5-8位碱基处引入3个A碱基。由于该3个A碱基不与待扩增靶序列匹配，故这3个碱基会在退火与靶序列结合形成凸起的小尖泡，会影响整个引物与靶序列结合效率，此时引物能否扩增主要取决于引物3′末端的几个碱基与靶序列的结合力量和效率。引物3′末端突变结合匹配区的5-8个碱基，突变碱基一般位于3′末端的3-4位，也可以根据序列的不同将突变碱基放在3′末端最后1位，从而更有利于与待扩增靶序列的特异性结合。当引入的这3个碱基不是A而是其它T、G、C，或者碱基数不是3个时，此时引物与待扩增靶序列的结合就没有3个A碱基好。

本发明设计的引物进行PCR扩增反应示意图如图1(b)所示：

应用本发明设计的引物进行PCR扩增，包括如下步骤：1)预变性；2)包括若干变性、引物退火和引物延伸循环的第一部分PCR扩增；3)包括若干变性、引物退火和引物延伸循环的第二部分PCR扩增。为了提高产物的扩增率，第二步骤PCR扩增循环数设置为3-10个循环，退火温度设为50-55℃，研究表明退火温度设定为50-55℃时，该温度下最有利于本发明设计的引物与突变模板特异结合。第三步骤PCR扩增循环数设置为35-45个，优选35个循环，可根据需要而定，退火温度为第一部分退火温度再加5-8℃。由于每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，经过第二步骤扩增之后，本发明设计的引物所扩增的产物得到大量的积累。这些积累的产物又重新作为扩增的模板，此时引物能够与这些模板完全匹配，结合效率大幅度提升。经过第一部分3-10个循环扩增，少量的突变被富集8-1024倍(即2³-2¹⁰)。进一步研究显示，此时退火温度增加5-8度能够增加引物和模板的特异性结合效率，而引物与不匹配模板(即野生型模板)的结合效率变得更低，完全处于与第二部分PCR产物结合的劣势，几乎不会有任何扩增。这样待检DNA模板中极少量的突变DNA，即便含量只有0.1-1％也能够很好检出。

依本发明设计的引物进行PCR扩增反应时，反应液中DNA聚合酶、dNTP、Mg²⁺和反应缓冲液等组分与普通PCR相同，并可根据不同的反应予以优化。

与目前通常PCR扩增设计引物的方法相比，本发明的PCR扩增引物设计方法具有以下特点和优点：

1)、在PCR引物对的一条基因特异性引物的5′端加上了3个G或C，它们与扩增靶基因无关的序列，这样既不影响起始PCR扩增反应的效率，同时增加了引物对TM值，又可增加之后的PCR扩增的特异性。

2)、在PCR引物离3′末端的第5-8位寡核苷酸处插入3个A碱基片段，由于该3个碱基A不与待扩增靶序列匹配，故这3个碱基会凸起形成小尖泡，此时3′末端的各个碱基与靶序列的结合会收到影响，从而更有利于与待扩增靶序列结合，增加扩增的特异性。

3)、基于前两点所述，本发明的引物设计方法针对基因突变中的点突变、缺失突变以及插入突变等，结合荧光实时PCR技术可以十分有效的解决目前对于临床上肿瘤中常见的体细胞基因突变检测灵敏度不够这一难点。

附图说明

图1(a)为本发明所设计的引物结构示意图；

图1(b)为发明设计的引物进行PCR扩增反应示意图；

图2为本发明实施例1中设计的引物检测样品的荧光强度曲线，其中：

(a)为按照常规设计的引物来检测样品的K-ras基因GGT＞GAT突变以及对照样品的不同梯度的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线；

(b)为按本发明所述设计的引物来检测样品的K-ras基因GGT＞GAT突变以及对照样品的不同梯度荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线；

(c)为按照常规设计的引物来检测不含K-ras基因GGT＞GAT突变的阴性对照样品的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线；

(d)为按本发明所述设计的引物来检测不含K-ras基因GGT＞GAT突变的阴性对照样品的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线；

图3为本发明实施例2中设计的引物检测样品的荧光强度曲线，其中：

(a)为按照常规设计的引物来检测样品的EGFR基因19外显子的E746_A750del突变以及对照样品的不同梯度的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线；

(b)为按本发明所述设计的引物来检测样品的EGFR基因19外显子的E746_A750del突变以及对照样品的不同梯度荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线；

(c)为按照常规设计的引物来检测不含EGFR基因19外显子的E746_A750del突变的阴性对照样品的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线；

(d)为按本发明所述设计的引物来检测不含EGFR基因19外显子的E746_A750del突变的阴性对照样品的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线；

图4为本发明实施例2中设计的引物检测样品的荧光强度曲线，其中：

(a)为按照常规设计的引物来检测样品的EGFR基因21外显子的T790M突变以及对照样品的不同梯度的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线；

(b)为按本发明所述设计的引物来检测样品的EGFR基因21外显子的T790M突变以及对照样品的不同梯度荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线；

(c)为按照常规设计的引物来检测不含EGFR基因21外显子的T790M突变的阴性对照样品的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线；

(d)为按本发明所述设计的引物来检测不含EGFR基因21外显子的T790M突变的阴性对照样品的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线；

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述。以下实施例不构成对本发明的限定。

实施例一

本实施例中以本发明方法设计一对引物同时结合荧光定量PCR技术和双环探针技术来检测K-ras基因12密码子GGT＞GAT的基因突变。

材料：

1.样品和对照品的制备

1).样品处理和模板提取

接收来自临床的石蜡组织样品，样品切成5-10μm，加入1ml二甲苯脱蜡，离心收集沉淀，加入1ml无水乙醇到沉淀中，室温或37℃晾干，加入蛋白酶K和Buffer ATL，56℃消化裂解1小时，90℃孵化1h，加入200ml Buffer AL混匀再加入200μl无水乙醇充分混匀，将上清小心转移到QIA 2ml离心柱中，6000×g(8000rpm)离1min，加入500μl Buffer AW1，6000×g(8000rpm)离1min，小心打开盖子加入500μl Buffer AW2，6000×g(8000rpm)离1min，空管离心20000×g(14000rpm)离3min，加入100μl BufferATE于膜中央，温育5分钟，20000×g(14000rpm)离1min。取3μl测OD值，将提取的样品DNA稀释到2ng/μl，取5μl进行PCR反应。

2)对照阳性样品的制备

根据Cosmic数据公布的K-ras基因12密码子的野生型基因序列和GGT＞GAT突变基因序列，人工合成一段带有K-ras基因12密码子GGT＞GAT突变的序列，将该序列连接到T载体中。作为检测时的阳性对照品，分别稀释到10³、10²、10¹、10⁰四个梯度浓度。

2.引物和探针的设计和制备

根据Cosmic数据公布的K-ras基因12密码子的野生型基因序列和突变基因序列比较分析，设计一对探针为K-ras-P。根据Cosmic数据公布的HGH基因的野生型基因序列分析，设计一对引物和探针分别为：HGH-F、HGH-R、HGH-P。

K-ras-P：FAM-5’-GGCACTCAAGAGTGCCTTGACGATACAATCGTCA3’-TAMRA

HGH-F：GCAGTGCCTTCCCAACCA

HGH-R：CATTCCCCAAGAGCTTACAAAC

HGH-P：HEX-5’-GTTGTCTTGACAACGCTATGCTCCATAGC-3’-TAMRA

根据Cosmic数据公布的K-ras基因12密码子的野生型基因序列和突变基因序列比较分析，按照常规设计一对基本扩增引物，上下游引物命名为K-ras-F1、K-ras-R1。然后，如本发明前文所述，在引物的目标核酸片段设计独特的标示序列，上下游引物命名分别为K-ras-F2、K-ras-R2。其中，序列中带下划线的是标示序列，斜体碱基为突变特异性碱基：

K-ras-F1：AACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA

K-ras-R1：TCGTCCACAAAATGATTCTG

K-ras-F2：GGGAACTTGTGGTAGTTGGAGAAACTGATGG

K-ras-R2：TCGTCCACAAAATGATTCTG

将以上设计的引物和探针送到DNA合成公司合成，合成完后用Tris-HCl(pH8.0)稀释。

3.荧光PCR扩增，其反应体系为：

1×PCR缓冲液

MgCl₂ 7.0mmol

dNTP各 1.0mmol

K-ras各对引物 0.5~1.0μmol

K-ras探针 0.5~1.0μmol

HGH引物 0.5~1.0μmol

HGH探针 0.5~1.0μmol

Taq酶 1.0U

模板 5μl

总体积 25μl

实时PCR反应条件是：96℃预变性3分钟，10个循环95℃变性15秒，55℃退火25秒，72℃延伸10秒，35个循环95℃变性15秒，58℃退火25秒，72℃延伸10秒，35个循环，后35个循环在退火时检测FAM和HEX荧光信号。

4.检测

采用MX3000P实时PCR扩增仪(SRATGENE公司)退火阶段检测荧光，将含反应液的PCR管逐一放到荧光PCR扩增仪进行检测。根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：Ct值为0或35：阴性；Ct值小于28：阳性；Ct在28-35之间：样品需重新检测，仪器检测时间为：90分钟。

图2(a)为按照常规设计的引物来检测样品的K-ras基因GGT＞GAT突变以及对照样品的不同梯度的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线；图2(b)为按本发明所述设计的引物来检测样品的K-ras基因GGT＞GAT突变以及对照样品的不同梯度荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线；

5.特异性分析

特异性检测：以SW48细胞的DNA作为对照，分别用常规设计的引物和按照本发明设计的引物进行K-ras基因GGT＞AGT突变检测，特异性分析结果表明，常规设计的引物在高浓度背景下阴性对照(SW48细胞DNA)偶尔会出现假阳性，即有较弱的荧光信号。而按本发明所述设计的引物只有在含有K-ras基因GGT＞AGT突变的样品有荧光信号，阴性对照(SW48细胞DNA)并没有荧光信号。同时采集血站100例血液样品，进一步证明两种引物的特异性。结果表明按本发明所述设计的引物明显会优于按常规设计的引物。见图2(c)(d)。

6.灵敏度分析

以合成的含有K-ras基因GGT＞AGT突变的质粒DNA进行定量分析，取经定量后浓度为1000个拷贝数的样品DNA，进行10倍稀释，共做3个稀释度，然后分别用按常规设计的引物和按本发明所述设计的引物对这4个稀释度8个平行组进行荧光PCR灵敏度检测。结果表明按本发明所述设计的引物的灵敏度高，1-5 copys/μl即可检出，而按常规的引物设计方法设计的引物最低检测限为10-100copys/μl。

7.选择性试验

分别用按常规设计的引物和按本发明所述设计的引物对以合成的含有K-ras基因GGT＞GAT突变的质粒DNA的1000、100、10、1个拷贝数在10ng的背景下进行荧光PCR检测。结果显示按本发明设计的引物的选择性好。

8.重复性试验

分别取10例经传统测序方法验证为阳性和阴性的样品，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不0.1个循环。

实施例二

本实施例中以本发明方法设计一对引物同时结合荧光定量PCR技术和双环探针技术来检测EGFR基因19外显子的E746_A750del基因突变。

材料：

1.样品和对照品的制备

1).样品处理和模板提取

2).对照阳性样品的制备

根据Cosmic数据公布的EGFR基因19外显子的的野生型基因序列和E746_A750del突变基因序列，人工合成一段带有EGFR基因19外显子的E746_A750del突变的序列，将该序列连接到T载体中。作为检测时的阳性对照品，分别稀释到10³、10²、10¹、10⁰四个。

2.引物和探针的设计和制备

根据Cosmic数据公布的EGFR基因19外显子的野生型基因序列和E746_A750del的突变基因序列比较分析，设计一对探针为EGFR-19-P。根据Cosmic数据公布的HGH基因的野生型基因序列分析，设计一对引物和探针分别为：HGH-F、HGH-R、HGH-P。

EGFR-19-P：FAM-5′TTCTGCTAAAGCAGAAACTCACATCGAGATGTGA-3′-TAMRA

HGH-F：GCAGTGCCTTCCCAACCA

HGH-R：CATTCCCCAAGAGCTTACAAAC

HGH-P：HEX-5’-GTTGTCTTGACAACGCTATGCTCCATAGC-3’

-TAMRA

根据Cosmic数据公布的EGFR基因19外显子的野生型基因序列和E746_A750del的突变基因序列比较分析，按照常规设计一对基本扩增引物，上下游引物命名为EGFR-F1、EGFR-R1。然后，如本发明前文所述，在引物的目标核酸片段设计独特的标示序列，上下游引物命名分别为EGFR-F2、EGFR-R2。其中，序列中带下划线的是标示序列，斜体碱基为突变特异性碱基：

EGFR-F1：GTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAAAC

EGFR-R1：CCTGAGGTTCAGAGCCATGGAC

EGFR-F2：GGGGTTAAAATTCCCGTCGCTATAAACAAAAC

EGFR-R2：CCTGAGGTTCAGAGCCATGGAC

3.荧光PCR扩增，其反应体系为：

1×PCR缓冲液

MgCl₂ 7.0mmol

dNTP各 1.0mmol

EGFR各对引物 0.5~1.0μmol

EGFR探针 0.5~1.0μmol

HGH引物 0.5~1.0μmol

HGH探针 0.5~1.0μmol

Taq酶 1.0U

模板 5μl

总体积 25μl

4.检测

图3(a)为按照常规设计的引物来检测样品的EGFR基因19外显子的E746_A750del突变以及对照样品的不同梯度的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线；图3(b)为按本发明所述设计的引物来检测样品的EGFR基因19外显子的E746_A750del突变以及对照样品的不同梯度荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线；

5.特异性分析

特异性检测：以SW48细胞的DNA作为对照，分别用常规设计的引物和按照本发明设计的引物进行EGFR基因19外显子的E746_A750del突变检测，特异性分析结果表明，常规设计的引物在高浓度背景下阴性对照(SW48细胞DNA)偶尔会出现假阳性，即有较弱的荧光信号。而按本发明所述设计的引物只有在含有EGFR基因19外显子的E746_A750del突变的样品有荧光信号，阴性对照(SW48细胞DNA)并没有荧光信号。同时采集血站100例血液样品，进一步证明两种引物的特异性。结果表明按本发明所述设计的引物明显会优于按常规设计的引物。见图3(c)(d)。

6.灵敏度分析

以合成的含有EGFR基因19外显子的E746_A750del突变的质粒DNA进行定量分析，取经定量后浓度为1000个拷贝数的样品DNA，进行10倍稀释，共做3个稀释度，然后分别用按常规设计的引物和按本发明所述设计的引物对这4个稀释度8个平行组进行荧光PCR灵敏度检测。结果表明按本发明所述设计的引物的灵敏度高，1-5copys/μl即可检出，而按常规的引物设计方法设计的引物最低检测限为10-100copys/μl。

7.选择性试验

分别用按常规设计的引物和按本发明所述设计的引物对以合成的含有EGFR基因19外显子的E746_A750del突变的质粒DNA的1000、100、10、1个拷贝数在10ng的背景下进行荧光PCR检测。结果显示按本发明设计的引物的选择性好。

8.重复性试验

实施例三

本实施例中以本发明方法设计一对引物同时结合荧光定量PCR技术和双环探针技术来检测EGFR基因21外显子的T790M基因突变。

材料：

1.样品和对照品的制备

1).样品处理和模板提取

2).对照阳性样品的制备

根据Cosmic数据公布的EGFR基因21外显子的野生型基因序列和T790M突变基因序列，人工合成一段带有EGFR基因21外显子的T790M突变的序列，将该序列连接到T载体中。作为检测时的阳性对照品，分别稀释到10³、10²、10¹、10⁰四个。

2.引物和探针的设计和制备

根据Cosmic数据公布的EGFR基因21外显子的野生型基因序列和T790M的突变基因序列比较分析，设计一对探针为EGFR-21-P。根据Cosmic数据公布的HGH基因的野生型基因序列分析，设计一对引物和探针分别为：HGH-F、HGH-R、HGH-P。

EGFR-21-P：FAM-5′-AAGTAAGCCTCCTTACTTTGCCTCCTTCTGCAAGGAGGC-3′-TAMRA

HGH-F：GCAGTGCCTTCCCAACCA

HGH-R：CATTCCCCAAGAGCTTACAAAC

HGH-P：HEX-5’-GTTGTCTTGACAACGCTATGCTCCATAGC-3’

-TAMRA

根据Cosmic数据公布的EGFR基因21外显子的野生型基因序列和T790M的突变基因序列比较分析，按照常规设计一对基本扩增引物，上下游引物命名为EGFR-21-F1、EGFR-21-R1。然后，如本发明前文所述，在引物的目标核酸片段设计独特的标示序列，上下游引物命名分别为EGFR-21-F2、EGFR-21-R2。其中，序列中带下划线的是标示序列，斜体碱基为突变特异性碱基：

EGFR-21-F1：GTCAAGATCACAGATTTTGGGCG

EGFR-21-R1：TCCCTGGTGTCAGGAAAATGCT

EGFR-21-F2：GGGGTCAAGATCACAGATTTTGAAAGGCGGG

EGFR-21-R2：TCCCTGGTGTCAGGAAAATGCT

3.荧光PCR扩增，其反应体系为：

1×PCR缓冲液

MgCl₂ 7.0mmol

dNTP各 1.0mmol

EGFR-21各对引物 0.5~1.0μmol

EGFR-21探针 0.5~1.0μmol

HGH引物 0.5~1.0μmol

HGH探针 0.5~1.0μmol

Taq酶 1.0U

模板 5μl

总体积 25μl

4.检测

图4(a)为按照常规设计的引物来检测样品的EGFR基因21外显子的T790M突变以及对照样品的不同梯度的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线；图4(b)为按本发明所述设计的引物来检测样品的EGFR基因21外显子的T790M突变以及对照样品的不同梯度荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线；

5.特异性分析

特异性检测：以SW48细胞的DNA作为对照，分别用常规设计的引物和按照本发明设计的引物进行EGFR基因21外显子的T790M突变检测，特异性分析结果表明，常规设计的引物在高浓度背景下阴性对照(SW48细胞DNA)偶尔会出现假阳性，即有较弱的荧光信号。而按本发明所述设计的引物只有在含有EGFR基因21外显子的T790M突变的样品有荧光信号，阴性对照(SW48细胞DNA)并没有荧光信号。同时采集血站100例血液样品，进一步证明两种引物的特异性。结果表明按本发明所述设计的引物明显会优于按常规设计的引物。见图4(c)(d)。

6.灵敏度分析

以合成的含有EGFR基因21外显子的T790M突变的质粒DNA进行定量分析，取经定量后浓度为1000个拷贝数的样品DNA，进行10倍稀释，共做3个稀释度，然后分别用按常规设计的引物和按本发明所述设计的引物对这4个稀释度8个平行组进行荧光PCR灵敏度检测。结果表明按本发明所述设计的引物的灵敏度高，1-5copys/μl即可检出，而按常规的引物设计方法设计的引物最低检测限为10-100copys/μl。

7.选择性试验

分别用按常规设计的引物和按本发明所述设计的引物对以合成的含有EGFR基因21外显子的T790M突变的质粒DNA的1000、100、10、1个拷贝数在10ng的背景下进行荧光PCR检测。结果显示按本发明设计的引物的选择性好。见图4(d)。

8.重复性试验

Claims

1、一种扩增低含量基因突变DNA的引物设计方法，首先设计一对靶序列基本扩增引物，然后在每对所述引物对中的一条引物的5′末端加一段与待扩增靶序列无关的GC寡核苷酸尾，离3′末端的第5~8个寡核苷酸处插入3个A碱基片段，突变位置放在3′末端1-4位。

2、根据权利要求1所述的一种扩增低含量基因突变DNA的引物设计方法，其特征在于：所述GC寡核苷酸尾长度为2-5个碱基。

3、根据权利要求2所述的一种扩增低含量基因突变DNA的引物设计方法，其特征在于：所述GC寡核苷酸尾的碱基数量优选为3bp，由GGG、CCC或是GC混合的碱基组成。

4、根据权利要求1所述的一种扩增低含量基因突变DNA的引物设计方法，其特征在于：所设计的引物总长度不大于40bp。

5、一种PCR扩增方法，包括如下步骤：1)预变性；2)包括变性、引物退火和引物延伸循环的第一部分PCR扩增，循环数为3-10个；3)包括变性、引物退火和引物延伸循环的第二部分PCR扩增，循环数为35-45个，其特征在于：所述的PCR引物为如权利要求1所述方法设计而得，第二部分PCR扩增的退火温度比第二部分PCR扩增的退火温度高5℃-8℃。

6、根据权利要求5所述的一种PCR扩增方法，其特征在于：所述的第一部分PCR扩增的退火温度为50-55℃。

7、根据权利要求5所述的一种PCR扩增方法，其特征在于：所述的第二部分PCR扩增的退火温度为58-60℃。

8、权利要求1所述的一种扩增低含量基因突变DNA的引物设计方法于核酸检测中的应用。

9、根据权利要求8所述的引物设计方法于核酸检测中的应用，其特征在于：所述核酸检测采用PCR方法、基因芯片检测、膜杂交检测。