CN102392015A - 一种针对序列未知基因进行pcr引物设计的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物PCR检测技术领域，具体为一种针对序列未知基因进行PCR引物设计的方法。本发明依据相同基因在不同物种之间具有保守序列的原理，通过BLAST软件进行核苷酸序列比对，找到序列未知基因的保守序列，并据此设计引物对序列未知基因进行PCR检测。本发明解决了传统方法对序列未知基因进行PCR检测时操作复杂、费用过高的问题。根据本发明的跨物种PCR引物设计方法，成功扩增出了一个序列未知的中国仓鼠基因。该发明技术设计简单可行，操作限制少，应用范围广，结果可靠，而且成本低廉。

Description

一种针对序列未知基因进行 PCR 引物设计的方法

技术领域

本发明属于生物PCR检测技术领域，是一种利用生物信息学和PCR技术，从已知序列基因的保守序列设计引物来对序列未知基因进行PCR检测的方法。

背景技术

PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种特异性扩增DNA的体外酶促反应，可以短时间扩增出已知序列的DNA，用于检测表达、诊断、签定、制备探针等，是一项极其有效和实用的技术。PCR的特点表明，如果不知道某个基因的DNA或mRNA序列，就无法对该基因进行结构和功能的深入研究，目前人和小鼠等常见物种的大部分基因序列已经很清楚，但一些实验室常用物种的基因还有很大部分在genebank中找不到其准确的序列。研究工作中经常碰到的问题是，需要诊断某一未知病原微生物的感染，或需要检测一个序列未知基因的表达情况等。对于诊断某一未知病原微生物的感染，由于一般微生物的基因组序列简单，现行常用的办法就是直接对该未知病原生物进行测序，知道其序列后，再设计特异性引物用于大规模临床上的诊断。对于检测一个序列未知基因的表达情况，现行常用的办法是cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)，RACE技术可以在有部分mRNA序列已知的条件下，帮助获得目标基因的完整长度的mRNA序列。RACE成功的前提是mRNA反转录成cDNA序列的反应要控制的很好，但由于mRNA易于降解，反转录反应特别容易受到丰度低和高级结构的影响。而利用同位素或生物素进行标记的探针对cDNA文库进行杂交筛选的方法，则更是费时费力，为研究者在不得已的情况下的最后选择。以上传统的方法对操作技术和设备要求极高，费用昂贵，一般实验室不具备这种条件。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作快速简单，成本低廉，高效准确，从已知序列基因的保守序列设计引物来对序列未知基因进行PCR检测的方法。

本发明依据相同基因在不同物种之间具有保守序列的原理，通过BLAST软件进行核苷酸序列比对，找到序列未知基因的保守序列，并据此设计引物对序列未知基因进行PCR检测。

本跨物种PCR引物设计方法，具体步骤如下：

（1）通过BLAST核苷酸序列比对，找到不同物种之间需要检测的目的基因的保守序列；

（2）根据该保守序列，用引物设计软件primer5.0设计引物；

（3）把引物再通过BLAST核苷酸序列比对，确保引物3’端的高度保守性。

本发明的优点

本发明使用特异性引物扩增未知序列与RACE等方法一样。但和以前的方法相比，更具有如下优点：

1、技术简单可行。本发明充分利用生物信息学提供的已有信息，通过BLAST核苷酸序列比对找到序列未知基因的保守序列，根据找到的保守序列来设计引物来对序列未知基因进行PCR检测。

2、简化劳动。与传统的方法相比，避免了对基因组进行大规模测序，节省了大量的时间和财力。

3、应用范围广。只要能找到基因的保守序列，就可以对任何物种的该基因进行跨物种PCR检测。

4、引物特异性强。本发明设计引物所结合区域都是该基因的保守序列，使得扩增特异性和效率大大增强。

5、实验操作对人员与环境无害。不需要探针和构建cDNA文库，所以避免了使用同位素。

6、成本低。只相当于普通的PCR，无需昂贵的试剂和仪器。

本发明为针对序列未知基因进行PCR检测提供了一种操作快速简单，成本低廉，高效准确的方法，在检测一个序列未知基因的表达情况时必定具有广泛的应用前景。

具体实施方式

我们在科研过程中需要检测中国仓鼠一个参与DNA修复基因DNA-PKcs mRNA的表达情况，但由于中国仓鼠DNA-PKcs mRNA在Genebank上找不到相应的序列，我们通过此发明来设计引物，对序列未知的中国仓鼠DNA-PKcs基因进行PCR检测。

（一）跨物种同源比对法来设计PCR的引物

1、通过BLAST核苷酸序列比对，找到小白鼠和人的DNA-PKcs mRNA的保守序列，下表中显示的序列为小白鼠和人的DNA-PKcs mRNA的最保守序列，其保守性达84%，Query行为小白鼠的DNA-PKcs mRNA序列，Sujct行为人的DNA-PKcs mRNA序列；

2、通过保守序列用引物设计软件primer5.0分别来设计上下游引物，下表为PCR的引物序列；

。

把引物再通过BLAST核苷酸序列比对来确定引物3’端和小白鼠同源，如上表所示，标出的为上下游引物，引物的3’端都与模板绝对配对。

（二）聚合酶链反应（PCR）

首先用无酶水稀释引物使其浓度为10 μM，按下述方案进行PCR：

每个PCR反应体系为25μl：

10×PCR Buffer（含Mg2+） 2.5μl

dNTP Mixture (10mM) 0.5μl

上游特异性引物 0.5μl

下游特异性引物 0.5μl

Taq mix DNA polymerase 0.5μl

cDNA 2.5μl

去离子水 18μl

扩增条件为：

预变性95℃×3min；变性95℃×30s，退火58℃×30s，延伸72℃×45s 共30循环；再延伸72℃×10 min, 延伸后4˚C冷却5 min结束反应。

（三）2%琼脂糖凝胶电泳，鉴定PCR产物

取100bp Ladder的标准品5μl，加1μl的上样缓冲液，15μl PCR产物亦加3μl上样缓冲液，依次加入加样孔中，2%琼脂糖凝胶电泳：1×TBE缓冲液，初始电压100V，样品出孔后80V。紫外灯观察电泳情况，电泳结束后立即用凝胶分析系统扫描凝胶。

实验效果

根据本发明的跨物种PCR引物设计方法，成功扩增出了中国仓鼠的DNA-PKcs基因。DNA-PKcs的扩增上下游引物分别是：Forward primer 5’-GGCACTGCGTTCCCACTT-3’； Reverse primer5’-ATTTCTTGAATCCATGATCCTCC-3’，扩增片段大小为400bp。

该发明技术设计简单可行，操作限制少，应用范围广，结果可靠，而且成本低廉。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> 一种针对序列未知基因进行PCR引物设计的方法

<130> 001

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

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<400> 2

atttcttgaa tccatgatcc tcc 23

Claims (1)

1.一种针对序列未知基因进行PCR引物设计的方法，其特征在于具体步骤为：

（1）通过BLAST核苷酸序列比对，找到不同物种之间需要检测的目的基因的保守序列；

（2）根据该保守序列，用引物设计软件primer5.0设计引物；

（3）把引物再通过BLAST核苷酸序列比对，确保引物3’端的高度保守性。