CN101798570A - 从基因组dna中快速扩增目的基因的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种关于基因克隆的方法。基因组DNA中快速扩增目的基因的方法，其包括如下步骤：①基因组DNA制备；②设计基因外显子的扩增引物；③外显子扩增，分别扩增各个外显子；④基因片段扩增。本发明即是通过一种特殊的引物设计方法，首先从基因组中扩增出所需的外显子，纯化后混合，再用两端引物，在Touch-down的程序中扩增出所需的目的基因。这种基因拼接的方法，避免了RNA制备、反转录合成cDNA的过程，因此可以快速准确的在数小时内完成基因克隆，同时应用这种方法可以克隆任一知道序列信息的cDNA序列，且扩增长度不受限制。

Description

从基因组DNA中快速扩增目的基因的方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种关于基因克隆的方法。
背景技术
目前，扩增目的基因常用方法有两种：PCR扩增和基因合成。传统的PCR扩增比较繁琐，因为基因组中含有内含子，以及一些特殊基因的低拷贝数，加上其他一些不能确定的因素，要从基因组DNA中直接扩增获得目的基因几乎是不可能的，所以一般都是经过组织RNA提取，反转录合成cDNA后应用传统的PCR技术扩增出目的基因。而其中的RNA提取操作过程要求严格，且很容易失败；加上一些含有目的基因的组织很难得到，所以此种方法有一定的局限性。应用化学合成的方法虽然可以得到目的基因，但是如果所需基因片段较长合成费用将会很昂贵。
随着人类基因组计划以及一些真核生物基因组测序的完成，从基因组数据库查找所需基因的信息已不是难事，利用各种PCR技术扩增或是合成目的基因也已成为研究热点。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种快速从基因组DNA中扩增目的基因的方法。
为了实现上述目的，采用以下技术方案：
从基因组DNA中快速扩增目的基因的方法，其包括如下步骤：
①基因组DNA制备；
②设计基因外显子的扩增引物；
③外显子扩增，分别扩增各个外显子；
④基因片段扩增。
进一步的技术方案是，
设计基因外显子的扩增引物的具体过程是，先查到基因的外显子序列信息，针对每个外显子分别设计重叠引物(设计方式遵从一般引物设计规则即可)。第一个外显子的反向引物和最后一个外显子的正向引物分别设计酶切位点。外显子扩增的扩增程序选用touch-downPCR程序。
再进一步的技术方案是，
基因片段扩增的具体过程是，将步骤③中扩增得到的所有外显子胶回收纯化后等体积混合后作为模板，用第一个外显子的反向引物和最后一个外显子的正向引物扩增得到目的基因片段，扩增程序选用touch-down PCR程序。
本发明即是通过一种特殊的引物设计方法，首先从基因组中扩增出所需的外显子，纯化后混合，再用两端引物，在Touch-down的程序中扩增出所需的目的基因。这种基因拼接的方法，避免了RNA制备、反转录合成cDNA的过程，因此可以快速准确的在数小时内完成基因克隆，同时应用这种方法可以克隆任一知道序列信息的cDNA序列，且扩增长度不受限制。申请人已利用该技术成功克隆长度1540bp的人a-葡萄糖苷酶基因片段及长度1365bp的人MICA基因，具体过程在后续具体实施方式中详述。
附图说明
图1为外显子扩增引物设计原理示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明的基因扩增方法作进一步的具体说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例一：人a-葡萄糖苷酶基因片段扩增
1.人基因组DNA的制备：
健康人的血液样本由四医大儿科实验室惠赠，全血基因组DNA提取试剂盒(溶液型)购自长沙联博志达生物技术公司。基因组DNA提取方法按照试剂盒说明操作，所得人基因组DNA于-20℃保存备用。
2.人a-葡萄糖苷酶基因第25到第36个外显子的扩增引物设计：
根据查到的人a-葡萄糖苷酶基因的外显子序列信息(NM_004668.2)，针对12个外显子分别设计重叠引物，具体操作如图1所示(仅为原理示意图)：
12个外显子设计引物序列如下表：
  引物名称   引物序列   碱基数
  Hglu ex25F   CCCGAGCTCGTTGCCATTATCACAGAT   27
  Hglu ex25R   AATTGGATGCCTCCCAGATACAGCCACGGGCA   32
  Hglu ex26F   TATCTGGGAGGCATCCAATTCTTCTGGAGT   30
  Hglu ex26R   GATCATAAATCTTGAACTGCAGCATTTCAT   30
  Hglu ex27F   GCAGTTCAAGATTTATGATCCCAACAAGAA   30
  Hglu ex27R   AGAGTCCCAAATTATAGTGCCTGTACTCTT   30
  Hglu ex28F   GCACTATAATTTGGGACTCTCAGCTCCTT   29
  Hglu ex28R   TCTTCTTGTACCCTGGGGGCTGGTCTCGGGA   31
  Hglu ex29F   GCCCCCAGGGTACAAGAAGAATTCCTATGGT   31
  引物名称   引物序列   碱基数
  Hglu ex29R   AACGTCACATCCATGGCATTGCTGTTCAGCA   31
  Hglu ex30F   AATGCCATGGATGTGACGTTCCAGCCCCT   29
  Hglu ex30R   GGCCAATCAACTCAGTGTACTGCTGGGTGA   30
  Hglu ex31F   GTACACTGAGTTGATTGGCCGGCCTGTGAT   30
  Hglu ex31R   ACTGCACATCATAAGGGATCTGGGCAGCCA   30
  Hglu ex32F   GATCCCTTATGATGTGCAGTACTCAGACAT   30
  Hglu ex32R   TGGCTGGATCCAGAATGAGGATGACCCGCA   30
  Hglu ex33F   CCTCATTCTGGATCCAGCCATTTCTGGCAA   30
  Hglu ex33R   TCAGGCCAGACCTTTCCCCAGACAATGTCT   30
  Hglu ex34F   CTGGGGAAAGGTCTGGCCTGATTTTCCTGA   30
  Hglu ex34R   TCGATATAGCTCCACTTGGCTGTCCCAGT   29
  Hglu ex35F   CCAAGTGGAGCTATATCGAGCTTATGTGGCCT   32
  Hglu ex35R   TCATTCATATCAATCCACATGCCATCAAACT   31
  Hglu ex36F   CATGTGGATTGATATGAATGAACCATCAAGCT   32
  Hglu ex36R   CCCCTCGAGTGGCATGTAGGGAGGGT   26
其中Hglu ex25F，Hglu ex36R两引物(即第一个外显子的反向引物和最后一个外显子的正向引物)分别设计相应的酶切位点以方便克隆到后面用到的载体中，本试验设计的酶切位点分别为XhoI和SacI。
3.外显子扩增：
应用上述引物先分别扩增12个外显子，体系如下：
50μl体系
ddH2O          37μl
25mMMg2+       3μl
10XPCR buffer  5μl
10mMdNTP       1μl
引物1          1μl
引物2          1μl
模板           1.5μl
Pfu酶          0.5μl
引物1和引物2分别指待扩增外显子的正向引物和反向引物，模板即步骤1中所制备的基因组DNA。扩增程序均选用touch-down PCR程序。即94℃5min预变性，退火温度从64-54℃每降一度为一循环共10个循环(其中解链温度为94℃30s，退火30s，延伸温度为72℃1min)，然后于54℃循环25圈，72℃延伸10min。
4.人a-葡萄糖苷酶基因片段(2860bp-4399bp)扩增：
将上步扩增得到的12个外显子胶回收纯化后等体积混合后作为模板，用引物Hglu ex25F，Hglu ex36R扩增得到人a-葡萄糖苷酶基因片段(2860bp-4399bp)。反应体系同上，扩增程序选用touch-down PCR程序。即94℃5min预变性，退火温度从64-54℃每降一度为一循环共10个循环(其中解链温度为94℃1min，退火1min，延伸温度为72℃2min)，然后于54℃循环25圈，72℃延伸10min。
实施例二：人MICA基因的克隆
1.人基因组DNA的制备：
人基因组DNA的制备方法同实施例一。
2.人MICA基因克隆的引物设计：
根据查到的人a-葡萄糖苷酶基因的外显子序列信息(NM_000247.1)，针对6个外显子分别设计重叠引物，设计原理如附图1所示。
6个外显子设计引物序列如下表：
  引物名称   引物序列   碱基数
  HMICA ex1F   CCCGAATTCCACTGCTTGAGCCGCTGAGA   29
  HMICA ex1R   CTGTGGGGCTCAGCAGCAGCTCCCGGA   27
  HMICA ex2F   GCTGCTGCTGAGCCCCACAGTCTTCGTTAT   30
  HMICA ex2R   GGGAATGCAAGCCTTCTTTCTGGTCCTTGA   30
  HMICA ex3F   CAGAAAGAAGGCTTGCATTCCCTCCAGGAGA   31
  HMICA ex3R   ATGGGGGGCACTGTTCTCCTCAGGACTA   26
  HMICA ex4F   AGGAGAACAGTGCCCCCCATGGTGAATGT   29
  引物名称   引物序列   碱基数
  HMICA ex4R   AGCACTTTCCCAGAGGGCACAGGGTGAGT   29
  HMICA ex5F   GTGCCCTCTGGGAAAGTGCTGGTGCTTCA   29
  HMICA ex5R   CTCACGAGCTCTGGACCCTCTGCAGCTGAT   30
  HMICA ex6F   GAGGGTCCAGAGCTCGTGAGCCTGCAGGT   29
  HMICA ex6R   CCCCTCGAGAATATGGTACAGCTGCAAA   28
3.外显子扩增：
应用上述引物先分别扩增6个外显子，体系如下：
50μl体系
ddH2O            37μl
25mMMg2+         3μl
10XPCR buffer    5μl
10mMdNTP         1μl
引物1            1μl
引物2            1μl
模板             1.5μl
Pfu酶            0.5μl
引物1和引物2分别指待扩增外显子的正向引物和反向引物，模板即本实施例步骤1中所制备的基因组DNA。扩增程序均选用touch-down PCR程序。即94℃5min预变性，退火温度从62-52℃每降一度为一循环共10个循环(其中解链温度为94℃30s，退火30s，延伸温度为72℃1min)，然后于52℃循环25圈，72℃延伸10min。
4.人MICA基因(1365bp)扩增：
将上步扩增得到的6个外显子胶回收纯化后等体积混合后作为模板，用引物HMICA ex1F，HMICA ex6R扩增得到人MICA基因。反应体系同上，扩增程序选用touch-down PCR程序。即94℃5min预变性，退火温度从62-52℃每降一度为一循环共10个循环(其中解链温度为94℃1min，退火1min，延伸温度为72℃2min)，然后于54℃循环25圈，72℃延伸10min。
上述两个是实例中touch-down PCR程序的温度和时间参数可以根据实际需要调整。
以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案。不脱离本发明精神和范围的任何修改或局部替换，应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110>珠海市英平生物科技有限公司
<120>从基因组DNA中快速扩增目的基因的方法
 
<160>2
 
<210>1
<211>1540bp
<212>人a-葡萄糖苷酶片段
<213>人
 
<220>2860bp-4399bp
<223>参考序列NM_004668.2
 
<400>1
2860 g ttgccattat cacagatatt
2881 gatcttctcc tgggagaagc atacacagtg gaatggagca taaagataag ggatgaagaa
2941 aaaatagact gttaccctga tgagaatggt gcttctgccg aaaactgcac tgcccgtggc
3001 tgtatctggg aggcatccaa ttcttctgga gtcccttttt gctattttgt caacgaccta
3061 tactctgtca gtgatgttca gtataattcc catggggcca cagctgacat ctccttaaag
3121 tcttccgttt atgccaatgc cttcccctcc acacccgtga acccccttcg cctggatgtc
3181 acttaccata agaatgaaat gctgcagttc aagatttatg atcccaacaa gaatcggtat
3241 gaagttccag tccctctgaa catacccagc atgccatcca gcacccctga gggtcaactc
3301 tatgatgtgc tcattaagaa gaatccattt gggattgaaa ttcgccggaa gagtacaggc
3361 actataattt gggactctca gctccttggc tttaccttca gtgacatgtt tatccgcatc
3421 tccacccgcc ttccctccaa gtacctctat ggctttgggg aaactgagca caggtcctat
3481 aggagagact tggagtggca cacttggggg atgttctccc gagaccagcc cccagggtac
3541 aagaagaatt cctatggtgt ccacccctac tacatggggc tggaggagga cggcagtgcc
3601 catggagtgc tcctgctgaa cagcaatgcc atggatgtga cgttccagcc cctgcctgcc
3661 ttgacatacc gcaccacagg gggagttctg gacttttatg tgttcttggg gccgactcca
3721 gagcttgtca cccagcagta cactgagttg attggccggc ctgtgatggt accttactgg
3781 tctttggggt tccagctgtg tcgctatggc taccagaatg actctgagat cgccagcttg
3841 tatgatgaga tggtggctgc ccagatccct tatgatgtgc agtactcaga catcgactac
3901 atggagcggc agctggactt caccctcagc cccaagtttg ctgggtttcc agctctgatc
3961 aatcgcatga aggctgatgg gatgcgggtc atcctcattc tggatccagc catttctggc
4021 aatgagacac agccttatcc tgccttcact cggggcgtgg aggatgacgt cttcatcaaa
4081 tacccaaatg atggagacat tgtctgggga aaggtctggc ctgattttcc tgatgttgtt
4141 gtgaatgggt ctctagactg ggacagccaa gtggagctat atcgagctta tgtggccttc
4201 ccagactttt tccgtaattc aactgccaag tggtggaaga gggaaataga agaactatac
4261 aacaatccac agaatccaga gaggagcttg aagtttgatg gcatgtggat tgatatgaat
4321 gaaccatcaa gcttcgtgaa tggggcagtt tctccaggct gcagggacgc ctctctgaac
4381 caccctccct acatgcca
 
<210>2
<211>1365bp
<212>人MICA基因
<213>人
 
<220>全长
<223>参考序列NM_000247.1
 
<400>2
   1 cactgcttga gccgctgaga gggtggcgac gtcggggcca tggggctggg cccggtcttc
  61 ctgcttctgg ctggcatctt cccttttgca cctccgggag ctgctgctga gccccacagt
 121 cttcgttata acctcacggt gctgtcctgg gatggatctg tgcagtcagg gtttctcact
 181 gaggtacatc tggatggtca gcccttcctg cgctgtgaca ggcagaaatg cagggcaaag
 241 ccccagggac agtgggcaga agatgtcctg ggaaataaga catgggacag agagaccaga
 301 gacttgacag ggaacggaaa ggacctcagg atgaccctgg ctcatatcaa ggaccagaaa
 361 gaaggcttgc attccctcca ggagattagg gtctgtgaga tccatgaaga caacagcacc
 421 aggagctccc agcatttcta ctacgatggg gagctcttcc tctcccaaaa cctggagact
 481 aaggaatgga caatgcccca gtcctccaga gctcagacct tggccatgaa cgtcaggaat
 541 ttcttgaagg aagatgccat gaagaccaag acacactatc acgctatgca tgcagactgc
 601 ctgcaggaac tacggcgata tctaaaatcc ggcgtagtcc tgaggagaac agtgcccccc
 661 atggtgaatg tcacccgcag cgaggcctca gagggcaaca ttaccgtgac atgcagggct
 721 tctggcttct atccctggaa tatcacactg agctggcgtc aggatggggt atctttgagc
 781 cacgacaccc agcagtgggg ggatgtcatg cctgatggga atggaaccta ccagacctgg
 841 gtggccacca ggatttgcca aggagaggag cagaggttca cctgctacat ggaacacagc
 901 gggaatcaca gcactcaccc tgtgccctct gggaaagtgc tggtgcttca gagtcattgg
 961 cagacattcc atgtttctgc tgttgctgct gctgctattt ttgttattat tattttctat
1021 gtccgttgtt gtaagaagaa aacatcagct gcagagggtc cagagctcgt gagcctgcag
1081 gtcctggatc aacacccagt tgggacgagt gaccacaggg atgccacaca gctcggattt
1141 cagcctctga tgtcagatct tgggtccact ggctccactg agggcgccta gactctacag
1201 ccaggcagct gggattcaat tccctgcctg gatctcacga gcactttccc tcttggtgcc
1261 tcagtttcct gacctatgaa acagagaaaa taaaagcact tatttattgt tgttggaggc
1321 tgcaaaatgt tagtagatat gaggcgtttg cagctgtacc atatt

Claims (5)

1.从基因组DNA中快速扩增目的基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
①基因组DNA制备；
②设计基因外显子的扩增引物；
③外显子扩增，分别扩增各个外显子；
④基因片段扩增。
2.根据权利要求1所述的从基因组DNA中快速扩增目的基因的方法，其特征在于，
设计基因外显子的扩增引物的具体过程是，先查到基因的外显子序列信息，针对每个外显子分别设计重叠引物。
3.根据权利要求2所述的从基因组DNA中快速扩增目的基因的方法，其特征在于，
第一个外显子的反向引物和最后一个外显子的正向引物分别设计酶切位点。
4.根据权利要求3所述的从基因组DNA中快速扩增目的基因的方法，其特征在于，
外显子扩增的扩增程序选用touch-down PCR程序。
5.根据权利要求3所述的从基因组DNA中快速扩增目的基因的方法，其特征在于，
基因片段扩增的具体过程是，将步骤③中扩增得到的所有外显子胶回收纯化后等体积混合后作为模板，用第一个外显子的反向引物和最后一个外显子的正向引物扩增得到目的基因片段，扩增程序选用touch-down PCR程序。
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