CN1482259A - 一种快速筛选葫芦科rip新基因的方法 - Google Patents

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rip
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rip gene
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林奇英
林毅
吴祖建
谢联辉
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FUZHOU TENGLONG BIOLOGIC Co Ltd
Fujian Agriculture and Forestry University
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FUZHOU TENGLONG BIOLOGIC Co Ltd
Fujian Agriculture and Forestry University
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Abstract

本发明涉及一种快速筛选葫芦科RIP基因的方法，即根据已知的葫芦科RIP氨基酸序列上、下游两段高度保守的氨基酸序列及其密码子偏好设计简并引物对LY1/LY2，以总DNA为模板进行Touchdown－PCR扩增，对未报道过RIP基因的葫芦科植物，直接将PCR产物克隆测序，即可获得新的RIP基因；对已报道过RIP基因的葫芦科植物，根据RIP基因LY1/LY2区段的限制性片段长度多态性，可快速区分已知和未知的RIP基因；可克服以前先分离RIP后克隆其基因方法的目的性差、费工、费时的不足，具有筛选快速、准确等特点，广泛应用于RIP基因的筛选。

Description

一种快速筛选葫芦科RIP新基因的方法
所属技术领域
本发明属生物农药和生物医药领域，涉及核糖体失活蛋白(ribosome-inactivatingprotein，RIP)基因的筛选方法。
背景技术
核糖体失活蛋白因具有抗肿瘤和抗病毒等医用价值，以及抗植物病毒和病原真菌等农用价值，受到医药科学家和农药研究者的共同青睐。迄今，至少有50个I型RIP和15个II型RIP的基因序列被测定。但是，人们对RIP的认识还处在起步阶段，尤其对其生理功能的认识一直未能取得较大的进展。RIP是一种具有多种酶学活性和多样化生物学功能的蛋白质，不同RIP具有各自独特的功能，其潜在活性还在不断发现之中[8]。对植物中RIP基因家族及其表达调控的研究，有助于了解其生理功能。另外，对不同RIP及其基因的认识，也有助于更好地了解RIP的结构与功能关系以及分子演化进程。而构建广谱抗病毒抗真菌植物和基因工程单链免疫毒素也需要不断有新型的RIP基因。因此，新型RIP及其基因的分离和表达，具有极其重要的意义。本发明以前的方法都是先分离RIP，后克隆其基因，这种方法往往是工作量大，而且往往是做大量分离工作后还无法筛选到新的RIP基因；因此，迄今并无一种行之有效并能够快速筛选到RIP新基因的方法。
发明内容
本发明的目的是建立一种快速筛选葫芦科RIP基因的方法，为新型RIP基因资源的快速筛选服务。
RIP基因快速筛选的方法：根据已知的葫芦科RIP蛋白氨基酸序列上、下游两段高度保守的氨基酸序列及其密码子偏好设计简并引物对LY1/LY2，以总DNA为模板进行Touchdown-PCR扩增。对未报道过RIP基因的葫芦科植物，直接将PCR产物克隆测序，即可获得新的RIP基因；对已报道有RIP基因的葫芦科植物，根据RIP基因LY1/LY2区段的限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)，可快速区分已知的RIP基因和未知的RIP基因。
引物序列如下：
LY1，5’-GT[A/G]AC[G/C/A]AA[C/T]GT[C/T]TA[T/C]ITIATGGG-3’
LY2，5’-[C/G/T]GCIA[A/T]I[A/T][G/A]IAT[T/C]TG[T/C]TTGGAIAG-3’
Touch-down PCR扩增反应程序为：94℃变性50s，64～48℃退火50s，每2个循环降2℃，48℃时17个循环，72℃延伸2min。
本发明所提供的方法快速、简便。为快速获得RIP新基因提供了新途径，这与以往先分离RIP后克隆其基因的路线正好相反。该方法同样适用于从其它科植物中快速获得RIP新基因。
实施例
以葫芦科RIP基因的快速筛选为例，步骤如下：
a、引物设计
在对已知的葫芦科RIP氨基酸序列进行系统比较，根据上、下游两段高度保守的氨基酸序列及其密码子偏好设计简并引物对LY1/LY2，序列如下：
LY1，5’-GT[A/G]AC[G/C/A]AA[C/T]GT[C/T]TA[T/C]ITIATGGG-3’
LY2，5’-[C/G/T]GCIA[A/T]I[A/T][G/A]IAT[T/C]TG[T/C]TTGGAIAG-3’
b、总DNA的提取
试剂配制：
试剂甲：即CTAB抽提液  含2％CTAB，100mM Tris-HCl pH8.0，1.4M NaCl，20mM EDTApH8.0，1％β-巯基乙醇
试剂乙：酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1
试剂丙：氯仿∶异戊醇(24∶1)
试剂丁：即CTAB沉淀液  每L含5g CTAB，0.04M NaCl
试剂戊：即TE缓冲液每mL含10μg RNase A，pH8.0
取0.3g叶片，冰冻研磨，加试剂甲，混匀，65℃保温30min；冰浴1～2min；加1倍体积的试剂乙，0.5倍体积Tris饱和酚和0.5倍体积试剂丙，混匀后12,000rpm离心10min，取上清，加入等体积试剂丙，轻缓颠倒混匀，14,000rpm离心8min；取上清，加2倍体积试剂丁，室温放置60min，12,000rpm离心10min，弃上清，加入350μL 1.2M NaCl溶解沉淀，加入等体积试剂丙，轻缓颠倒混匀，14,000rpm离心8min；取上清，加0.6倍体积异丙醇，12,000rpm离心10min，弃上清，加入500μL 70％乙醇，洗2次，干燥；最后用50μL试剂戊溶解沉淀，得总DNA。
c、PCR扩增
反应体系为：
超纯水                                  12μL
10×PCR缓冲液(含25mmol/L Mg2+)         2μL
dNTPs(每份10mmol/L)                     0.5μL
引物LY1(10pm/μL)                               2μL
引物LY2(10pm/μL)                               2μL
总DNA                                           1μL
Taq DNA聚合酶(4U/M1)                            0.5μL
总体积                                          20μL
反应程序为：94℃变性50s，64～48℃退火50s，每2个循环降2℃，48℃时17个循环，72℃延伸2min。
其余步骤，分别是：d、琼脂糖凝胶电泳及DNA片段的回收，e、连接载体，f、大肠杆菌感受态细胞的简易制备，g、转化，h、质粒的提取，i、酶切鉴定，j、克隆子序列的测定及分析。为常规的分子生物学操作，按《精编分子生物学实验指南》(北京：科学出版社，1998)中的相关说明进行。

Claims (4)

1、一种RIP基因快速筛选的方法：根据已知的葫芦科RIP蛋白氨基酸序列上、下游两段高度保守的氨基酸序列及其密码子偏好设计简并引物对LY1/LY2，以总DNA为模板进行Touchdown-PCR扩增。对未报道过RIP基因的葫芦科植物，直接将PCR产物克隆测序，即可获得新的RIP基因；对已报道有RIP基因的葫芦科植物，根据RIP基因LY1/LY2区段的限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)，可快速区分已知的RIP基因和未知的RIP基因。
2、根据权利要求1所述的一种RIP基因快速筛选的方法，其特征是引物序列如下：
LY1，5’-GT[A/G]AC[G/C/A]AA[C/T]GT[C/T]TA[T/C]ITIATGGG-3’
LY2，5’-[C/G/T]GCIA[A/T]I[A/T][G/A]IAT[T/C]TG[T/C]TTGGAIAG-3’
3、根据权利要求1所述的一种RIP基因快速筛选的方法，其特征是Touch-down PCR扩增体系为：
超纯水                                   12μL
10倍PCR缓冲液(含25mm0l/L Mg2+)           2μL
dNTPs(每份10mmol/L)                      0.5μL
引物LY1(10pm/μL)                        2μL
引物LY2(10pm/μL)                        2μL
总DNA                                    1μL
Taq DNA聚合酶(4U/M1)                     0.5μL
总体积                                   20μL
Touch-down PCR扩增反应程序为：94℃变性50s，64～48℃退火50s，每2个循环降2℃，48℃时17个循环，72℃延伸2min。
4、根据权利要求1所述的一种RIP基因快速筛选的方法，其特征是总DNA的提取工艺为：
试剂配制：
试剂甲：即CTAB抽提液含2％CTAB，100mM Tris-HCl pH8.0，1.4M NaCl，20mM EDTA pH8.0，
        1％β-巯基乙醇；
试剂乙：酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1；
试剂丙：氯仿∶异戊醇(24∶1)；
试剂丁：即CTAB沉淀液每L含5g CTAB，0.04M NaCl；
试剂戊：即TE缓冲液每mL含10μg RNase A，pH8.0；
取0.3g叶片，冰冻研磨，加试剂甲，混匀，65℃保温30min；冰浴1～2min；加1倍体积的试剂乙，0.5倍体积Tris饱和酚和0.5倍体积试剂丙，混匀后12,000rpm离心10min，取上清，加入等体积试剂丙，轻缓颠倒混匀，14,000rpm离心8min；取上清，加2倍体积试剂丁，室温放置60min，12,000rpm离心10min，弃上清，加入350μL 1.2M NaCl溶解沉淀，加入等体积试剂丙，轻缓颠倒混匀，14,000rpm离心8min；取上清，加0.6倍体积异丙醇，12,000rpm离心10min，弃上清，加入500μL70％乙醇，洗2次，干燥；最后用50μL试剂戊溶解沉淀，得总DNA。
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CN101798570A (zh) * 2010-03-09 2010-08-11 珠海市英平生物科技有限公司 从基因组dna中快速扩增目的基因的方法
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