CN116656810A - 胰腺癌的生物标志物、核酸产品和试剂盒 - Google Patents

胰腺癌的生物标志物、核酸产品和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种胰腺癌的生物标志物、核酸产品和试剂盒。该生物标志物为KCNA3基因，通过检测该生物标志物的甲基化水平诊断胰腺癌。以KCNA3基因作为胰腺癌的生物标志物,来诊断或辅助诊断胰腺癌，具有良好的灵敏度和特异性，是一种可靠的胰腺癌的生物标志物。

Description

胰腺癌的生物标志物、核酸产品和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种胰腺癌的生物标志物、核酸产品和试剂盒。
背景技术
胰腺癌具有侵袭性强、恶性程度高、手术切除率低、患者生存周期短等特点。胰腺癌可分为胰腺导管腺癌和胰腺神经内分泌肿瘤。胰腺导管腺癌是胰腺最常见的恶性肿瘤(约95％)，大多数胰腺导管腺癌起源于前体病变，称为胰腺上皮内瘤变。吸烟、饮酒、肥胖、慢性糖尿病、非素食等饮食因素和遗传性因素是胰腺癌发病的高危因素。胰腺癌在全球癌症死亡率中排名第七，在2020年，全球胰腺癌新增病例495773例，死亡病例466003例，新增病例与死亡病例相当。随着发病率的增加，预计在2030年，胰腺癌或将成为恶性肿瘤中第二位致死性肿瘤。然而，由于患者通常不会出现特异性的症状，同时缺乏高灵敏度和高特异性的肿瘤标志物，以及早期肿瘤成像困难等因素，胰腺癌往往在晚期才被诊断出来，其5年生存率仅为5％～10％。
从癌前病变到发展为胰腺癌是一个缓慢的过程，胰腺内的肿瘤细胞往往需要超过10年的时间才会发生远端转移，这为胰腺癌的早期诊断提供了巨大的机会。目前推荐用于诊断胰腺癌的成像技术是多排CT(MDCT)血管造影术。磁共振(MRI)胆管胰腺造影术也可用于胰腺癌的诊断，其可以提供详细的胆道成像且评估肝脏转移等。考虑到胰腺癌的确诊需要病理学检测，大多数患者会接受内镜超声检查及细针穿刺活检。然而，影像学检查视野局限，易受到胃肠道气体、患者体型等因素的影响；而内镜超声作为有创操作，其高度依赖操作者的技术水平和经验。
除上述方法外，寻找和检测有预测能力的生物标志物则可能对胰腺癌的早期诊断和治疗提供帮助。血清癌抗原CA19-9是一种已报道与胰腺癌相关的生物标志物，但是CA19-9缺乏足够的敏感性和特异性(灵敏度约52％)；并且，约有10％-15％的人群缺乏合成CA19-9所需的酶，致使检测血清中CA19-9的水平对这部分患者也是没用的。因此，仍然缺乏可靠的用于诊断胰腺癌的生物标志物。
发明内容
基于此，有必要提供一种胰腺癌的生物标志物，通过检测该生物标志物的甲基化水平来诊断胰腺癌，具有良好的灵敏度和特异性，可靠性高。
一种胰腺癌的生物标志物，所述生物标志物为KCNA3基因，通过检测所述生物标志物的甲基化水平诊断胰腺癌。
经本发明的发明人研究发现，以KCNA3基因作为胰腺癌的生物标志物，通过检测KCNA3基因的甲基化水平来诊断或辅助诊断胰腺癌，具有良好的灵敏度和特异性，KCNA3基因是一种可靠的胰腺癌的生物标志物。
在其中一个实施例中，包括用于检测KCNA3基因甲基化水平的检测引物对。
在其中一个实施例中，所述核酸产品包括用于检测Chr1：110673623～110675315区域的甲基化水平的检测引物对。
在其中一个实施例中，所述核酸产品包括用于检测Chr1：110674072～110675224区域的甲基化水平的检测引物对。
在其中一个实施例中，所述核酸产品还包括与所述检测引物对对应的检测探针，所述检测探针上连接有荧光基团。
在其中一个实施例中，所述检测引物对包括以下引物对中的至少一组：
用于检测Chr1:110673623～110673768区域内的正链的甲基化水平的第一引物对、用于检测Chr1：110673770～110673921区域内的正链的甲基化水平的第二引物对、用于检测Chr1：110673921～110674046区域内的正链的甲基化水平的第三引物对、用于检测Chr1：110674072～110674200区域内的正链的甲基化水平的第四引物对、用于检测Chr1：110674205～110674345区域内的正链的甲基化水平的第五引物对、用于检测Chr1：110674351～110674429区域内的正链的甲基化水平的第六引物对、用于检测Chr1：110674436～110674586区域内的正链的甲基化水平的第七引物对、用于检测Chr1：110674592～110674796区域内的正链的甲基化水平的第八引物对、用于检测Chr1：110674828～110674935区域内的正链的甲基化水平的第九引物对、用于检测Chr1：110674945～110675061区域内的正链的甲基化水平的第十引物对、用于检测Chr1：110675081～110675215区域内的正链的甲基化水平的第十一引物对、用于检测Chr1：110675216～110675315区域内的正链的甲基化水平的第十二引物对、用于检测Chr1：110675315～110675230区域内的负链的甲基化水平的第十三引物对、用于检测Chr1：110675224～110675125区域内的负链的甲基化水平的第十四引物对、用于检测Chr1：110675117～110674932区域内的负链的甲基化水平的第十五引物对、用于检测Chr1：110674928～110674807区域内的负链的甲基化水平的第十六引物对、用于检测Chr1：110674797～110674679区域内的负链的甲基化水平的第十七引物对、用于检测Chr1：110674678～110674463区域内的负链的甲基化水平的第十八引物对、用于检测Chr1：110674450～110674288区域内的负链的甲基化水平的第十九引物对、用于检测Chr1：110674279～110674091区域内的负链的甲基化水平的第二十引物对、用于检测Chr1：110674060～110673855区域内的负链的甲基化水平的第二十一引物对、和用于检测Chr1：110673849～110673623区域内的负链的甲基化水平的第二十二引物对。
在其中一个实施例中，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：1～SEQIDNO：2所示；和/或，所述第二引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：3～SEQIDNO：4所示；和/或，所述第三引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：5～SEQIDNO：6所示；和/或，所述第四引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：7～SEQIDNO：8所示；和/或，所述第五引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：9～SEQIDNO：10所示；和/或，所述第六引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：11～SEQIDNO：12所示；和/或，所述第七引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：13～SEQIDNO：14所示；和/或，所述第八引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：15～SEQIDNO：16所示；和/或，所述第九引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：17～SEQIDNO：18所示；和/或，所述第十引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：19～SEQIDNO：20所示；和/或，所述第十一引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：21～SEQIDNO：22所示；和/或，所述第十二引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：23～SEQIDNO：24所示；和/或，所述第十三引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：25～SEQIDNO：26所示；和/或，所述第十四引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：27～SEQIDNO：28所示；和/或，所述第十五引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：29～SEQIDNO：30所示；和/或，所述第十六引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：31～SEQIDNO：32所示；和/或，所述第十七引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：33～SEQIDNO：34所示；和/或，所述第十八引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：35～SEQIDNO：36所示；和/或，所述第十九引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：37～SEQIDNO：38所示；和/或，所述第二十引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：39～SEQIDNO：40所示；和/或，所述第二十一引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：41～SEQIDNO：42所示；和/或，所述第二十二引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：43～SEQIDNO：44所示。
在其中一个实施例中，与所述第一引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：45所示；和/或，与所述第二引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：46所示；和/或，与所述第三引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：47所示；和/或，与所述第四引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：48所示；和/或，与所述第五引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：49所示；和/或，与所述第六引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：50所示；和/或，与所述第七引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：51所示；和/或，与所述第八引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：52所示；和/或，与所述第九引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：53所示；和/或，与所述第十引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：54所示；和/或，与所述第十一引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：55所示；和/或，与所述第十二引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：56所示；和/或，与所述第十三引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：57所示；和/或，与所述第十四引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：58所示；和/或，与所述第十五引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：59所示；和/或，与所述第十六引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：60所示；和/或，与所述第十七引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：61所示；和/或，与所述第十八引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：62所示；和/或，与所述第十九引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：63所示；和/或，与所述第二十引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：64所示；和/或，与所述第二十一引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：65所示；和/或，与所述第二十二引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：66所示。
一种诊断胰腺癌的试剂盒，包括上述的核酸产品。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
KCNA3(potassium voltage-gated channel subfamily Amember 3，Gene ID：3738)即钾电压门控通道亚家族A成员3，它具有多种生物学功能，包括调节神经递质的释放、心率、胰岛素分泌、神经元兴奋性、上皮电解质转运、平滑肌收缩和细胞体积等。此外，KCNA3基因还在T细胞的增殖和活化中起重要作用。KCNA3位于人类1号染色体上。以GRCh38.p13为参考基因组，KCNA3的物理位置为Ch1：110653560～110674940。需要说明的还是，本文中提到的位点或区域的位置均是以GRCh38.p13为参考。
表观遗传学的累积性改变在癌症的发生、发展中起重要作用，肿瘤抑制基因启动子区域的DNA甲基化被认为是肿瘤发生的主要表观遗传机制。异常的基因甲基化是胰腺癌发生的早期事件，这些基因可能是胰腺癌早期诊断的潜在生物标志物。基于液体活检技术的细胞游离DNA(cfDNA)的甲基化分析为发现具有诊断或预后潜力的生物标志物提供了一种新方法。经本发明的发明人研究发现，以KCNA3基因作为胰腺癌的生物标志物，通过检测KCNA3基因的甲基化水平来诊断或辅助诊断胰腺癌，具有良好的灵敏度和特异性，可以有效地提高胰腺癌的检出率。
基于此，本申请一实施方式提供了一种胰腺癌的生物标志物，该生物标志物为KCNA3基因，通过检测所述生物标志物的甲基化水平诊断胰腺癌。
在一些实施例中，检测KCNA3基因的甲基化水平的目标区域(简称“目标区域”)为KCNA3基因的CpG岛。
在一些实施例中，目标区域为Chr1：110673623～110675315。进一步地，目标区域为Chr1：110674072～110675224。更进一步地，目标区域为Chr1：110674592～110675117。采用Chr1：110674592～110675117作为目标区域时，检测的灵敏度和特异性更高。
可选地，目标区域为：Chr1：110674592～110674796。可选地，目标区域为：Chr1：110674828～110674935。可选地，目标区域为：Chr1：110674945～110675061。可选地，目标区域为：Chr1：110675117～110674932。可选地，目标区域为：Chr1：110674928～110674807。
在其中一个实施例中，目标区域为以下区域的至少一种：Chr1：110674592～110674796的正链、Chr1：110674828～110674935的正链、Chr1：110674945～110675061的正链、Chr1：110675117～110674932的负链和Chr1：110674928～110674807的负链。
在一些实施例中，通过检测上述目标区域中的目标位点的甲基化水平诊断胰腺癌。在一个可选地具体示例中，目标区域为Chr1：110674592～110674796区域的正链，目标位点为以下位点中的至少一个：Chr1：110674608、Chr1：110674680、Chr1：110674687、Chr1：110674689、Chr1：110674695、Chr1：110674780和Chr1：110674784。
在一个可选地具体示例中，目标区域为Chr1：110674828～110674935的正链，目标位点为以下位点中的至少一个：Chr1：110674831、Chr1：110674845、Chr1：110674872、Chr1：110674875、Chr1：110674881、Chr1：110674887、Chr1：110674892、Chr1：110674920和Chr1：110674922。
在一个可选地具体示例中，目标区域为Chr1：110674945～110675061的正链，目标位点为以下位点中的至少一个：Chr1：110674945、Chr1：110674953、Chr1：110674961、Chr1：110674965、Chr1：110674998、Chr1：110675012、Chr1：110675017、Chr1：110675050、Chr1：110675057、Chr1：110675059和Chr1：110675061位点。
在一个可选地具体示例中，目标区域为Chr1：110675117～110674932的负链，目标位点为以下位点中的至少一个：Chr1：110675094、Chr1：110675060、Chr1：110675058、Chr1：110675051、Chr1：110674954、Chr1：110674946和Chr1：110674944位点。
在一个可选地具体示例中，目标区域为Chr1：110674928～110674807区域负链，目标位点为以下位点中的至少一个：Chr1：110674923、Chr1：110674921、Chr1：110674856、Chr1：110674846、Chr1：110674826、Chr1：110674815和Chr1：110674812位点。
可以理解的是，在检测目标区域的甲基化水平时，可以针对上述任一目标区域的全区域进行检测，还可以针对上述任一目标区域的部分区域进行检测。
基于上述，本申请一实施方式还提供了一种诊断胰腺癌的试剂盒，该试剂盒包括用于检测KCNA3基因甲基化水平的试剂。
在一些实施例中，上述诊断胰腺癌的试剂盒包括核酸产品。该核酸产品用于检测KCNA3基因甲基化水平。
具体地，核酸产品包括用于检测KCNA3基因甲基化水平的检测引物对。在一些实施例中，上述核酸产品包括用于检测Chr1：110673623～110675315区域内甲基化水平的检测引物对。进一步地，上述核酸产品包括用于检测Chr1：110674072～110675224区域内甲基化水平的检测引物对。更进一步地，上述核酸产品包括用于检测Chr1：110674592～110675117区域内甲基化水平的检测引物对。可选地，上述核酸产品包括用于检测Chr1：110674592～110674796区域内甲基化水平的检测引物对。可选地，上述核酸产品包括用于检测Chr1：110674828～110674935区域内甲基化水平的检测引物对。可选地，上述核酸产品包括用于检测Chr1：110674945～110675061区域内甲基化水平的检测引物对。可选地，上述核酸产品包括用于检测Chr1：110675117～110674932区域内甲基化水平的检测引物对。可选地，上述核酸产品包括用于检测Chr1：110674928～110674807区域内甲基化水平的检测引物对。
在一些实施例中，用于检测KCNA3基因甲基化水平的检测引物对包括以下引物对中的至少一组：
用于检测Chr1:110673623～110673768区域内的正链的甲基化水平的第一引物对、用于检测Chr1：110673770～110673921区域内的正链的甲基化水平的第二引物对、用于检测Chr1：110673921～110674046区域内的正链的甲基化水平的第三引物对、用于检测Chr1：110674072～110674200区域内的正链的甲基化水平的第四引物对、用于检测Chr1：110674205～110674345区域内的正链的甲基化水平的第五引物对、用于检测Chr1：110674351～110674429区域内的正链的甲基化水平的第六引物对、用于检测Chr1：110674436～110674586区域内的正链的甲基化水平的第七引物对、用于检测Chr1：110674592～110674796区域内的正链的甲基化水平的第八引物对、用于检测Chr1：110674828～110674935区域内的正链的甲基化水平的第九引物对、用于检测Chr1：110674945～110675061区域内的正链的甲基化水平的第十引物对、用于检测Chr1：110675081～110675215区域内的正链的甲基化水平的第十一引物对、用于检测Chr1：110675216～110675315区域内的正链的甲基化水平的第十二引物对、用于检测Chr1：110675315～110675230区域内的负链的甲基化水平的第十三引物对、用于检测Chr1：110675224～110675125区域内的负链的甲基化水平的第十四引物对、用于检测Chr1：110675117～110674932区域内的负链的甲基化水平的第十五引物对、用于检测Chr1：110674928～110674807区域内的负链的甲基化水平的第十六引物对、用于检测Chr1：110674797～110674679区域内的负链的甲基化水平的第十七引物对、用于检测Chr1：110674678～110674463区域内的负链的甲基化水平的第十八引物对、用于检测Chr1：110674450～110674288区域内的负链的甲基化水平的第十九引物对、用于检测Chr1：110674279～110674091区域内的负链的甲基化水平的第二十引物对、用于检测Chr1：110674060～110673855区域内的负链的甲基化水平的第二十一引物对、和用于检测Chr1：110673849～110673623区域内的负链的甲基化水平的第二十二引物对。。
可选地，第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：2所示。第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：4所示。第三引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO：5～SEQ ID NO：6所示。第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：8所示。第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：9～SEQ ID NO：10所示。第六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：11～SEQ ID NO：12所示。第七引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：13～SEQ IDNO：14所示。第八引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：15～SEQ ID NO：16所示。第九引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：17～SEQ ID NO：18所示。第十引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：19～SEQ ID NO：20所示。第十一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：21～SEQ ID NO：22所示。第十二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：23～SEQ ID NO：24所示。第十三引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：25～SEQIDNO：26所示。第十四引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：27～SEQIDNO：28所示。第十五引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：29～SEQIDNO：30所示。第十六引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：31～SEQIDNO：32所示。第十七引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：33～SEQIDNO：34所示。第十八引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：35～SEQIDNO：36所示。第十九引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：37～SEQIDNO：38所示。第二十引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：39～SEQIDNO：40所示。第二十一引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：41～SEQIDNO：42所示。第二十二引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：43～SEQIDNO：44所示。
在一些实施例中，上述诊断胰腺癌的试剂盒利用荧光定量法检测KCNA3基因甲基化水平。具体地，上述核酸产品还包括与检测引物对对应的检测探针，检测探针上连接有荧光基团。
可选地，与第一引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：45所示。与第二引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：46所示。与第三引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：47所示。与第四引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：48所示。与第五引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：49所示。与第六引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：50所示。与第七引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：51所示。与第八引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：52所示。与第九引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：53所示。与第十引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：54所示。与第十一引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：55所示。与第十二引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：56所示。与第十三引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：57所示。与第十四引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：58所示。与第十五引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：59所示。与第十六引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：60所示。与第十七引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：61所示。与第十八引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：62所示。与第十九引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：63所示。与第二十引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：64所示。与第二十一引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：65所示。与第二十二引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO：66所示。
在一些实施例中，上述核酸产品还包括内参引物对和与内参引物对对应的内参探针。可选地，内参引物对ACTB基因设计的ACTB引物对。在一个可选地具体示例中，ACTB引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：67～68所示，与ACTB引物对对应的内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：69所示。可以理解的是，在其他实施例中，还可以选择其他基因作为内参基因，此时，内参引物对和内参探针对应设计即可。
在一些实施例中，检测探针和内参探针上均连接有荧光基团和淬灭基团。可选地，荧光基团位于探针的5’端，淬灭基团位于探针的3’端。可选地，检测探针和内参探针上连接有荧光基团分别独立的选自FAM、HEX、VIC、CY5、ROX、Texsa Red、JOE及Quasar 705中的一种。当然，在同一个反应体系中有两种以上的探针时，不同探针上连接的荧光基团不同。可以理解的是，检测探针和内参探针上连接的荧光基团不限于上述，还可以是其他荧光基团。
在一些实施例中，上述试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。核酸提取试剂用于提取核酸；甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变；质控试剂用于质控；PCR反应试剂用于构建PCR扩增反应体系；核酸测序试剂用于测序。
在其中一个实施例中，甲基化转化试剂为亚硫酸盐转化试剂或酶法转化试剂。
在其中一个实施例中，PCR反应试剂包括PCR缓冲液、dNTP、MgCl2和DNA聚合酶。
在其中一个实施例中，质控试剂包括阳性参考品和阴性参考品。
可以理解的是，在其他实施例中，上述诊断胰腺癌的试剂盒检测KCNA3基因甲基化水平的方法不限于荧光定量法，还可以是其他方法，例如甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法或甲基化敏感性限制性内切酶法。对应地，上述诊断胰腺癌的试剂盒包括相应的试剂。
在一些实施例中，上述诊断胰腺癌的试剂盒适用的样本包括但不限于血液样本和组织样本。
经验证，上述诊断胰腺癌的试剂盒的检测灵敏度可以达到95.7％，特异性可以达到100％，利于胰腺癌的早期诊断。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。实施例1～22中的核苷酸序列如SEQ ID NO：45～66所示的探针均为Taqman探针，5’端的报告基团为FAM，3’端淬灭基团为MGB；核苷酸序列如SEQ ID NO：69所示的探针的5’端的报告基团为VIC，3’端淬灭基团为BHQ1。在实施例1～22中，核酸组合23为核苷酸序列如SEQ ID NO.67～68所示的内参引物对、和与内参引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：69所示的探针，具体序列见表1。
实施例1
本实施例提供用于胰腺癌诊断或辅助诊断的试剂盒，包括核酸组合1和核酸组合23。核酸组合1包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示的引物对、和与该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：45所示的探针，具体序列见表1。该核酸组合1可检测KCNA3基因上Chr1：110673623-110673768区域(区域1)正链的甲基化水平。区域1正链的核苷酸序列如下(5’-3’)：
CGCATGGACGCCTTCAGCGTTTGCCCGAGGATCTGCAGCCCCTTGGAGTGGCGCGACAGCTTGAAGATGCGGAAGACCCTTACCAGGCGGATGACCCTCAGGATGGCCAGAGACATGGCCTGCTGTCCATTGCCCTGTCGTTCGGC。
核酸组合1可检测位于区域1正链上的Chr:110673623、Chr:110673631、Chr:110673640、Chr:110673674、Chr:110673676、Chr:110673692、Chr:110673761和Chr:110673765位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例2
本实施例提供用于胰腺癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合2和核酸组合23。核酸组合2包括核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示的引物对、和与该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：46所示的探针，具体序列见表1。核酸组合2可检测KCNA3基因上Chr1：110673770-110673921区域(区域2)正链的甲基化。区域2正链核苷酸序列如下(5’-3’)：
AGCTCGGTACCCAGAGTGATAAAATAAGGAATGATGGCCACAATGTCGATCAGGTTCATGATGTTTCGCGAGAAGGTGGCTTTGCTAGGACAAGCGAAGAACCGCACCAGCAGTTCGAAGGAGAACCAGATGATGCACAGCGTCTCCACCAC。
核酸组合2可检测位于区域2正链上Chr:110673774、Chr:110673864、Chr:110673872、Chr:110673885、Chr:110673910和Chr:110673921位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例3
本实施例提供用于胰腺癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合3和核酸组合23。核酸组合3包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示的引物对、和与该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：47所示的探针，具体序列见表1。核酸组合3可检测KCNA3基因上Chr1：110673921-110674046区域(区域3)正链的甲基化。区域3正链的核苷酸序列如下(5’-3’)：
CGAAGAAGGGATCGGAGAAGCTGGAGGCTCCTGCGCGGGACCCCGACGTGCTGTTGCCGGCTGCTTCGAATGAGTCCTGCGACGTCGAGGCGGGGTAGTCCTTCTCGTCGCGGAACTCCGGCAGCG。
核酸组合3可检测位于区域3正链上Chr:110673921、Chr:110673933、Chr:110673954、Chr:110673956、Chr:110673964、Chr:110673967、Chr:110674029、Chr:110674031、Chr:110674039和Chr:110674045位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例4
本实施例提供用于胰腺癌诊断或辅助诊断的试剂盒，包括核酸组合4和核酸组合23。核酸组合4包括核苷酸序列如SEQ ID NO：7～8所示的引物对、和与该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：48所示的探针，具体序列见表1。该核酸组合4可检测KCNA3基因上Chr1：110674072～110674200区域(区域4)正链的甲基化水平。区域4正链的核苷酸序列如下(5’-3’)：
GATGAGGATGACCAGCACGGACACGATGGCGATGCCCCGGGCCGGCCCGGAGCTCTCGGGGTACTCGAAGAGCAGCCACACCTGGCGCTGGAAGTCGCGGCGGGGCAAGGGCCGCTCCTCCTCCCGCAG。
核酸组合1可检测位于区域1正链上的Chr1：110674089、Chr1：110674095、Chr1：110674114、Chr1：110674119、Chr1：110674128、Chr1：110674137、Chr1：110674184和Chr1：110674196位置上胞嘧啶的甲基化程度。
实施例5
本实施例提供用于胰腺癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合5和核酸组合23。核酸组合5包括核苷酸序列如SEQ ID NO：9～10所示的引物对、和与该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：49所示的探针，具体序列见表1。核酸组合5可检测KCNA3基因上Chr1：110674205～110674345区域(区域5)正链的甲基化。区域5正链核苷酸序列如下(5’-3’)：
CCCTCGTCCTCGCGGAACTTCTCCATGGCCTCCTCGCCCAGCTGGTAGAAGCGGATCTCCTCGGAGAAAATGTCGATGGGCACGTTGACCGGCCGGCGGATGCGGCCCCCGGACTGATAGTAGTAGAGGATGGCGTCGAAG。
核酸组合5可检测位于区域5正链上Chr1：110674209、Chr1：110674215、Chr1：110674217、Chr1：110674266、Chr1：110674278、Chr1：110674287、Chr1：110674338和Chr1：110674341位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例6
本实施例提供用于胰腺癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合6和核酸组合23。核酸组合6包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11～12所示的引物对、和与该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：50所示的探针，具体序列见表1。核酸组合6可检测KCNA3基因上Chr1：110674351～110674429区域(区域6)正链的甲基化。区域6正链的核苷酸序列如下(5’-3’)：
CCGGTTGCGGTCGAAGAAGTACTCGTTGCGGAGCGGGTCGAAGTACCTCATGCGCCGCTTGGGGTCGCCCAGCAGCGTC。
核酸组合6可检测位于区域6正链上Chr1：110674352、Chr1：110674358、Chr1：110674362、Chr1：110674379、Chr1：110674384、Chr1：110674389、Chr1：110674416和Chr1：110674426位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例7
本实施例提供用于胰腺癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合7和核酸组合23。核苷酸组合7包括核苷酸序列如SEQ ID NO：13～14所示的引物对、和与该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：51的探针，具体序列见表1。核酸组合7可检测KCNA3基因上Chr1：110674436～110674586区域(区域7)正链的甲基化。区域7正链的核苷酸序列如下(5’-3’)：
AACTGGCAAAGGGTCTTCAGCTGCGTCTCGAAGCGCAGCCCGGAGATGTTGATGACCACGCGCTCCCCGCAGCAGTCCTGCTCGCCCGCGGCCGGCAGTGAGGGCGGCAGCGGCTCGTAGCGGTCGCAGCCGCCGCCGCCACAGCCGCCTT。
核酸组合7可检测位于该区域正链上Chr1：110674459、Chr1：110674528、Chr1：110674540、Chr1：110674546、Chr1：110674566、Chr1：110674569、Chr1：110674572和Chr1：110674581位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例8
本实施例提供用于胰腺癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合8和核酸组合23。核酸组合8包括核苷酸序列如SEQ ID NO：15～16所示的引物对、与该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：52所示的探针，具体序列见表1。核酸组合8可检测KCNA3基因上Chr1：110674592～110674796区域正链(区域8)的甲基化。区域8正链核苷酸序列如下：
GGGGCCCCTCCACCATCGGCCACCTCCGGCTCCAGCAGGTGGTCCCCGGGCACCACGGTCATGTCGGGCGGCAGCTCGCGGCCTGCGGCGGGCTCCGCGTAGCCGTGGTTCACCAGCGTGTGGGCACCGCCGCTGCTCGCTGGGCGCTGAGGAGGGTGGGCGCGGTGGCGGGCTGAGGGCGGCGGCGGCGAGCGCAGAAGGCTGA。
核酸组合8可检测位于该区域正链上Chr1：110674608、Chr1：110674680、Chr1：110674687、Chr1：110674689、Chr1：110674695、Chr1：110674780和Chr1：110674784位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例9
本实施例提供用于胰腺癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合9和核酸组合23，核酸组合9包括核苷酸序列如SEQ ID NO：17～18所示的引物对、和与该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：53所示的探针，具体序列见表1。核酸组合9可检测KCNA3基因上Chr1：110674828～110674935区域(区域9)正链的甲基化。区域9正链的核苷酸序列如下：
CAGCGGTGAGGCCAGGTCGCTCCTCCTCGCGCTCCCCGCCCTTTCGCCGCCTCCGCCCCCGAGCCGAGCCCACCGCCTGTTGCAGCCAAAGCCGCGATGCTCTGTCTG。
核酸组合9可检测位于区域9正链上Chr1：110674831、Chr1：110674845、Chr1：110674872、Chr1：110674875、Chr1：110674881、Chr1：110674887、Chr1：110674892、Chr1：110674920和Chr1：110674922位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例10
本实施例提供用于胰腺癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合10和核酸组合23。核酸组合10包括核苷酸序列如SEQ ID NO：19～20所示的引物对、和与该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：54所示的探针，具体序列见表1。核酸组合10可检测KCNA3基因上Chr1：110674945～110675061区域(区域10)正链的甲基化。区域10正链的核苷酸序列如下：
CGGTCAGCCGGGCTCCCGCACGGGGACGCCTCCTCCCTCCTTCTCGCGCTCTCCGCCCCCTCCCCTGCGGGGCGCGCGCCCGCCTCCGCGTCCCCTTAGGATTCCCGCCCACCGCGC。
核酸组合10可检测位于区域10正链上Chr1：110674945、Chr1：110674953、Chr1：110674961、Chr1：110674965、Chr1：110674998、Chr1：110675012、Chr1：110675017、Chr1：110675050、Chr1：110675057、Chr1：110675059和Chr1：110675061位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例11
本实施例提供用于胰腺癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合11和核酸组合23。核酸组合11包括核苷酸序列如SEQ ID NO：21～22所示的引物对、和与该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：55所示的探针，具体序列见表1。核酸组合11可检测KCNA3基因上Chr1：110675081～110675215区域(区域11)正链的甲基化。区域11的正链核苷酸序列如下：
GGGGGCAGCCGCCGGGCCTGCATTTCTTGCAGCCCTCAAGGCCCCTCGGTGTCAGCGAAAGAGCCCTCATGTTGTACCTCGGCGCCCCGCGGGAATGCCCACCCAGCAGAGCCGGCCCACGGGGAGTCAGGCTGC。
核酸组合11可检测位于区域11正链上Chr1：110675090、Chr1：110675093、Chr1：110675160、Chr1：110675163、Chr1：110675168、Chr1：110675170、和Chr1：110675200位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例12
本实施例提供用于胰腺癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合12和核酸组合23。核酸组合12包括核苷酸序列如SEQ ID NO：23～24所示的引物对、和与该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：56所示的探针，具体序列见表1。核酸组合12可检测KCNA3基因上Chr1：110675216-110675315区域(区域12)正链的甲基化。区域12正链的核苷酸序列如下：
CGGCCCGGGCCCCTAGGCTCCGCCCGCTTCTGGTCAGCGCCCCTCGCCCCCGGCCCGCCTGGCCGCGTCCCAGTCGCCAGGGTTTTCGGCCCGTGGGCCG
核酸组合12可检测位于区域12正链上Chr1:110675216、Chr1:110675221、Chr1:110675236、Chr1:110675271、Chr1:110675279、Chr1:110675281、Chr1:110675290、Chr1:110675302、Chr1:110675307和Chr1:110675314位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例13
本实施例提供用于胰腺癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合13和核酸组合23。核酸组合13包括核苷酸序列如SEQ ID NO：25～26所示的引物对、和与该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：57所示的探针，具体序列见表1。核酸组合13可检测KCNA3基因上Chr1：110675315-110675230区域(区域13)负链的甲基化。区域13负链的核苷酸序列如下：
CGGCCCACGGGCCGAAAACCCTGGCGACTGGGACGCGGCCAGGCGGGCCGGGGGCGAGGGGCGCTGACCAGAAGCGGGCGGAGCCT
核酸组合13可检测位于该区域负链上Chr1:110675315、Chr1:110675308、Chr1:110675303、Chr1:110675282、Chr1:110675280、Chr1:110675272、Chr1:110675267、Chr1:110675241和Chr1:110675237位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例14
本实施例提供用于胰腺癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合14和核酸组合23。核酸组合14包括核苷酸序列如SEQ ID NO：27～28所示的引物对、和与该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：58所示的探针，具体序列见表1。核酸组合14可检测KCNA3基因上Chr1：110675224～110675125区域(区域14)负链的甲基化。区域14负链的核苷酸序列如下：
CCCGGGCCGGCAGCCTGACTCCCCGTGGGCCGGCTCTGCTGGGTGGGCATTCCCGCGGGGCGCCGAGGTACAACATGAGGGCTCTTTCGCTGACACCGAG。
核酸组合14可检测位于该区域负链上Chr1：110675222、Chr1：110675217、Chr1：110675171、Chr1：110675169、Chr1：110675164、Chr1：110675161、Chr1：110675137和Chr1：110675128位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例15
本实施例提供用于胰腺癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合15和核酸组合23。核酸组合15包括核苷酸序列如SEQ ID NO：29～30所示的引物对、和与该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：59所示的探针，具体序列见表1。核苷酸组合15可检测KCNA3基因上Chr1：110675117～110674932区域(区域15)负链的甲基化。区域15负链的核苷酸序列如下：
GAGGGCTGCAAGAAATGCAGGCCCGGCGGCTGCCCCCGAGAGCGGGACGCGCGCCCGCGCGGTGGGCGGGAATCCTAAGGGGACGCGGAGGCGGGCGCGCGCCCCGCAGGGGAGGGGGCGGAGAGCGCGAGAAGGAGGGAGGAGGCGTCCCCGTGCGGGAGCCCGGCTGACCGCGCCAGACCCAGA。
核酸组合15可检测位于该区域负链上Chr1：110675094、Chr1：110675060、Chr1：110675058、Chr1：110675051、Chr1：110674954、Chr1：110674946、和Chr1：110674944位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例16
本实施例提供用于胰腺癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合16和核酸组合23，核酸组合16包括核苷酸序列如SEQ ID NO：31～32所示的引物对、和与该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：60所示的探针，具体序列见表1。核酸组合16可检测KCNA3基因上Chr1：110674928～110674807区域(区域16)负链的甲基化。区域16负链的核苷酸序列如下：
AGCATCGCGGCTTTGGCTGCAACAGGCGGTGGGCTCGGCTCGGGGGCGGAGGCGGCGAAAGGGCGGGGAGCGCGAGGAGGAGCGACCTGGCCTCACCGCTGCCGCCTCTTCCCCGCCGCATG。
核酸组合16可检测位于该区域负链上Chr1：110674923、Chr1：110674921、Chr1：110674856、Chr1：110674846、Chr1：110674826、Chr1：110674815、和Chr1：110674812位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例17
本实施例提供用于胰腺癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合17和核酸组合23。核酸组合17包括核苷酸序列如SEQ ID NO：33～34所示的引物对、和与该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：61所示的探针，具体序列见表1。核酸组合17可检测KCNA3基因上Chr1：110674797～110674679区域(区域17)负链的甲基化。区域17负链的核苷酸序列如下：
CTCAGCCTTCTGCGCTCGCCGCCGCCGCCCTCAGCCCGCCACCGCGCCCACCCTCCTCAGCGCCCAGCGAGCAGCGGCGGTGCCCACACGCTGGTGAACCACGGCTACGCGGAGCCCGC。
核酸组合17可检测位于该区域负链上Chr1：110674785、Chr1：110674781、Chr1：110674778、Chr1：110674775、Chr1：110674737、Chr1：110674730、Chr1：110674723和Chr1：110674720位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例18
本实施例提供用于胰腺癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合18和核酸组合23。核酸组合18包括核苷酸序列如SEQ ID NO：35～36所示的引物对、和与该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：62所示的探针，具体序列见表1。核酸组合18可检测KCNA3基因上Chr1：110674678-110674463区域(区域18)负链的甲基化。区域18负链的核苷酸序列如下：
CGCAGGCCGCGAGCTGCCGCCCGACATGACCGTGGTGCCCGGGGACCACCTGCTGGAGCCGGAGGTGGCCGATGGTGGAGGGGCCCCGCCTCAAGGCGGCTGTGGCGGCGGCGGCTGCGACCGCTACGAGCCGCTGCCGCCCTCACTGCCGGCCGCGGGCGAGCAGGACTGCTGCGGGGAGCGCGTGGTCATCAACATCTCCGGGCTGCGCTTCGA。
核酸组合18可检测位于该区域负链上Chr1:110674678、Chr1:110674671、Chr1:110674669、Chr1:110674661、Chr1:110674567、Chr1:110674561、Chr1:110674557、Chr1:110674552、Chr1:110674547、Chr1:110674477、Chr1:110674470和Chr1:110674465位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例19
本实施例提供用于胰腺癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合19和核酸组合23。核酸组合19包括核苷酸序列如SEQ ID NO：37～38所示的引物对、和与该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：63所示的探针，具体序列见表1。核酸组合19可检测KCNA3基因上Chr1：110674450-110674288区域(区域19)负链的甲基化。区域19负链的核苷酸序列如下：
GACCCTTTGCCAGTTCCCCGAGACGCTGCTGGGCGACCCCAAGCGGCGCATGAGGTACTTCGACCCGCTCCGCAACGAGTACTTCTTCGACCGCAACCGGCCCAGCTTCGACGCCATCCTCTACTACTATCAGTCCGGGGGCCGCATCCGCCGGCCGGTCAAC。
核酸组合19可检测位于该区域负链上Chr1:110674432、Chr1:110674427、Chr1:110674390、Chr1:110674385、Chr1:110674380、Chr1:110674375、Chr1:110674308、Chr1:110674302、Chr1:110674299、Chr1:110674295和Chr1:110674288位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例20
本实施例提供用于胰腺癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合20和核酸组合23。核酸组合20包括核苷酸序列如SEQ ID NO：39～40所示的引物对、和与该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：64所示的探针，具体序列见表1。核酸组合20可检测KCNA3基因上Chr1：110674279-110674091区域(区域20)负链的甲基化。区域20负链的核苷酸序列如下：
CGACATTTTCTCCGAGGAGATCCGCTTCTACCAGCTGGGCGAGGAGGCCATGGAGAAGTTCCGCGAGGACGAGGGCTTCCTGCGGGAGGAGGAGCGGCCCTTGCCCCGCCGCGACTTCCAGCGCCAGGTGTGGCTGCTCTTCGAGTACCCCGAGAGCTCCGGGCCGGCCCGGGGCATCGCCATCGTGTC。
核酸组合20可检测位于该区域负链上Chr1:110674279、Chr1:110674267、Chr1:110674257、Chr1:110674173、Chr1:110674170、Chr1:110674168、Chr1:110674158、Chr1:110674110、Chr1:110674102和Chr1:110674096位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例21
本实施例提供用于胰腺癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合21和核酸组合23。核酸组合21包括核苷酸序列如SEQ ID NO：41～42所示的引物对、和与该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：65所示的探针，具体序列见表1。核酸组合21可检测KCNA3基因上Chr1：110674060-110673855区域(区域21)负链的甲基化。区域21负链的核苷酸序列如下：
CTTCTGCCTGGAGACGCTGCCGGAGTTCCGCGACGAGAAGGACTACCCCGCCTCGACGTCGCAGGACTCATTCGAAGCAGCCGGCAACAGCACGTCGGGGTCCCGCGCAGGAGCCTCCAGCTTCTCCGATCCCTTCTTCGTGGTGGAGACGCTGTGCATCATCTGGTTCTCCTTCGAACTGCTGGTGCGGTTCTTCGCTTGTCCTA。
核酸组合21可检测位于该区域负链上Chr1:110674046、Chr1:110674040、Chr1:110674007、Chr1:110674004、Chr1:110674001、Chr1:110673988、Chr1:110673873和Chr1:110673865位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例22
本实施例提供用于胰腺癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核酸组合22和核酸组合23。核酸组合22包括核苷酸序列如SEQ ID NO：43～44所示的引物对、和与该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：66所示的探针，具体序列见表1。核酸组合22可检测KCNA3基因上Chr1：110673849-110673623区域(区域22)负链的甲基化。区域22负链的核苷酸序列如下：
GCCACCTTCTCGCGAAACATCATGAACCTGATCGACATTGTGGCCATCATTCCTTATTTTATCACTCTGGGTACCGAGCTGGCCGAACGACAGGGCAATGGACAGCAGGCCATGTCTCTGGCCATCCTGAGGGTCATCCGCCTGGTAAGGGTCTTCCGCATCTTCAAGCTGTCGCGCCACTCCAAGGGGCTGCAGATCCTCGGGCAAACGCTGAAGGCGTCCATGCG。
核酸组合22可检测位于该区域负链上Chr1:110673839、Chr1:110673837、Chr1:110673775、Chr1:110673766、Chr1:110673762、Chr1:110673641、Chr1:110673632和Chr1:110673624位置上胞嘧啶的甲基化。
表1
/>
测试一
1.DNA模板的提取
收集武汉大学中南医院临床病理科室确诊为胰腺癌的胰腺组织样本23例，收集健康人的抗凝血血液样本22例作为对照。胰腺组织样本均为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
当所用DNA来源于胰腺组织时，采用QIAamp DNAFFPE Tissue Kit(56404)提取组织DNA，具体操作参见试剂盒说明书。
当所用DNA来源于白细胞时，采用天根生化科技(北京)有限公司的离心柱型血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)进行白细胞基因组DNA提取，具体操作参见试剂盒说明书。
2.亚硫酸氢盐的转化
将提取好的各样本的全部基因组分别进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843)，具体实验操作参见试剂盒说明书。
3.甲基化荧光定量PCR反应
将各亚硫酸氢盐转化后的DNA分别进行甲基化荧光定量PCR反应以检测目标区域在组织样本和血液样本中的甲基化水平，每个目标区域单独进行检测，即一个PCR管中每次只加入一个目标区域的检测引物对和对应的探针，同时加入内参基因ACTB的检测引物对和对应的探针。各个基因区域及ACTB基因的上下游引物及探针序列如表1所示。
检测目标区域的探针为Taqman探针，5’端的报告基团为FAM，3’端猝灭基团为MGB，ACTB探针5’端的报告基团为VIC，3’端猝灭基团为BHQ1。PCR反应体系各组分配方如表2所示。
表2
PCR反应条件如表3所示。
表3
/>
阴性对照和阳性对照：在对目的基因的不同区域分别进行检测时，阴性对照和阳性对照应进行同步检测。阴性对照为纯化水。阳性对照为含有ACTB基因和目标基因序列的人工合成质粒，浓度为103拷贝/微升，阳性对照的制备方法为：将完全甲基化的各目的基因的扩增区域对应的经亚硫酸氢盐转化后的序列(即各扩增区域中除了CG二核苷酸中的C保持不变外，其余位置的C均变成T，其他三种碱基的种类和位置保持不变)进行人工合成，并克隆至载体，形成人工合成质粒。
Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。
质量控制：阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照的Ct值应在26-30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
4.QPCR结果分析
结果分析和判读方法：若某一检测区域在样本上的Ct值≤38，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阳性；若某一检测区域在样本上的Ct值>38，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阴性。将样本的甲基化检测结果同病理结果进行对比，计算甲基化检测的灵敏度和特异性，结果如表4所示。在本实施例中，灵敏度为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例，特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。
表4
从表4可以看出，KCNA3基因区域1～22对胰腺癌组织样本和健康人白细胞样本的检出效果各不相同。整体来看，KCNA3基因区域1～22(Chr1:110673623～110675315)检测癌症组织样本的灵敏度大于52％，检测健康人白细胞样本的特异性大于72％。此外，KCNA3基因区域4～11以及区域14～17(Chr1:110674072～110675224)展示出较好的检测灵敏度和特异性，其检测癌症组织样本的灵敏度大于65％，其检测健康人白细胞样本的特异性大于81％。最优地，KCNA3基因区域8、区域9、区域10、区域15和区域16(Chr1:110674592～110675117)的检测灵敏度和特异性明显优于其它区域，这几个区域在胰腺癌组织样本中的检出率均大于91％，其在健康人白细胞样本中的特异性均高于95％。
测试二
1.样本收集、DNA模板的提取和亚硫酸氢盐转化同测试一。
2.PCR扩增及测序
设计甲基化和非甲基化引物对，见表5，分别以亚硫酸氢盐转化后的组织基因组DNA或白细胞基因组DNA为模板，进行PCR反应扩增KCNA3基因区域Chr1:110674592～110675117，PCR反应体系见表6，PCR扩增程序见表7。在PCR扩增结束后，使用混合引物(包含甲基化引物对和非甲基化引物对)对扩增产物进行桑格尔测序(送测序公司)，同时从5’端和3’端测序。
表5
表6
组分 用量(μL)
10×Taq buffer(Mg2+Free) 5
25mM Mg2+ 4
dNTP Mix(10mM each) 1
甲基化上游引物(10μM) 1
甲基化下游引物(10μM) 1
非甲基化上游引物(10μM) 0.5
非甲基化下游引物(10μM) 0.5
热启动Taq DNA聚合酶 0.5
模板DNA 10
超纯水 补至50
表7
3.结果分析
根据测序峰图对每个样本的扩增子中的CpG位点的甲基化情况进行分析。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果为胸腺嘧啶，则其为非甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果仍然为胞嘧啶，则其为完全甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果既有胞嘧啶也有胸腺嘧啶(双峰)，则其为部分甲基化的。如果扩增子中95％以上的CpG二核苷酸中胞嘧啶是甲基化的，则认为此样本在该基因区域中是甲基化阳性的。对于KCNA3基因区域Chr1:110674592～110675117，共有71个CpG二核苷酸，若某一样本该区域中至少有67个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是甲基化的，则此样本在该区域为甲基化阳性的。将样本的甲基化检测结果同病理结果进行对比，计算甲基化检测的灵敏度和特异性，结果见表8。
表8
以上数据表明，除了使用甲基化荧光定量PCR外，通过亚硫酸氢盐测序的方法检测KCNA3基因区域Chr1:110674592～110675117的甲基化状态，同样可以有效区分胰腺癌样本和健康样本，检测灵敏度和特异性均在91％以上。
测试三
考虑到使用甲基化荧光定量PCR的方法检测受试者样本的甲基化程度更加便捷和节约时间，本申请收集了受试者的血液样本，联合表1中展示的引物对和探针检测受试者血浆cfDNA的甲基化状态，进而判断其是否为癌症阳性。具体操作如下：于武汉某医院收集经组织活检确诊为胰腺癌患者的血浆样本及健康人的血浆样本，每人收集5mL，共收集到胰腺癌患者的血浆样本13例、健康人血浆样本20例。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取，具体操作参见试剂盒说明书；并按照测试一提供方法进行重亚硫酸氢盐转化、选用表1中针对KCNA3基因基于22个区域的特异性引物和探针组合进行QPCR实验，PCR检测结果如表9所示。
表9
由表9可以看出，KCNA3基因区域1～22(Chr1:110673623～110675315)对胰腺癌血浆样本的检测灵敏性均大于46％，对健康人血浆样本的检测特异性均高于或等于60％。KCNA3基因区域4～11以及区域14～17(Chr1:110674072～110675224)检测胰腺癌血浆样本的灵敏度均大于61％，其检测健康人血浆样本的特异性均大于或等于80％。此外，KCNA3基因区域8、区域9、区域10、区域15和区域16(Chr1:110674592～110675117)的检测灵敏度和特异性最优，这几个区域的检测灵敏性和特异性分别大于或等于84％和95％。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。
序列表
<110> 武汉艾米森生命科技有限公司
<120> 胰腺癌的生物标志物、核酸产品和试剂盒
<160> 73
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgtatggacg tttttagcgt tt 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accgaacgac aaaacaataa aca 23
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agttcggtat ttagagtgat aaaat 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtaataaaaa cgctatacat catct 25
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgaagaaggg atcggagaag t 21
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgctaccgaa attccgcg 18
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gatgaggatg attagtacgg atacg 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctacgaaaaa aaaaacgacc cttac 25
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttttcgtttt cgcggaattt 20
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cttcgacgcc atcctctact actat 25
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcggttgcgg tcgaagaag 19
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aacgctacta aacgacccca aa 22
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
attggtaaag ggtttttagt tgcg 24
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaaacgacta taacgacgac gacta 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggggtttttt tattatcggt tattt 25
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tcaaccttct acgctcgcc 19
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agcggtgagg ttaggtcgtt tt 22
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caaacaaaac atcgcgactt taact 25
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cggttagtcg ggttttcgta c 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcgcgataaa cgaaaatcct a 21
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gggggtagtc gtcgggttt 19
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acaacctaac tccccgtaaa cc 22
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cggttcgggt ttttaggttt c 21
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cgacccacga accgaaaac 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cggtttacgg gtcgaaaatt 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaactccgcc cgcttctaat 20
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ttcgggtcgg tagtttgatt tt 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctcgatatca acgaaaaaac cct 23
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gagggttgta agaaatgtag gttcg 25
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctaaatcta acgcgatcaa ccg 23
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<212> DNA
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agtatcgcgg ttttggttgt aat 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
catacgacga aaaaaaaacg aca 23
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttagtttttt gcgttcgtcg tc 22
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgaactccg cgtaaccgta 20
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<211> 19
<212> DNA
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cgtaggtcgc gagttgtcg 19
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gattttttgt tagtttttcg agacg 25
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<211> 21
<212> DNA
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gttaaccgac cgacgaatac g 21
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cgatattttt ttcgaggaga ttcg 24
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<212> DNA
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<400> 40
aacacgataa cgataccccg aa 22
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tttttgtttg gagacgttgt cg 22
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
taaaacaaac gaaaaaccgc ac 22
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ggggttattt tttcgcgaaa ta 22
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgcataaacg ccttcaacg 19
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
cgcgatagtt tgaagatgcg ga 22
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gcgaagaatc gtattagtag ttcga 25
<210> 47
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ttgcgcggga tttcgacgt 19
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcggttcgga gttttcgggg tattc 25
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ttcggagaaa atgtcgatgg gtacg 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttgcggagcg ggtcgaagta tttta 25
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
cggtagtgag ggcggtagcg gt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
cgggtttcgc gtagtcgtgg tttat 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
tcgtcgtttt cgttttcgag tcgag 25
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
tcgttttttt ttttgcgggg cg 22
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttatgttgta tttcggcgtt tcgcg 25
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gttcgtttgg tcgcgtttta gtcgt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
acgcggttag gcgggtcg 18
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ttcgcggggc gtcgaggtat 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgcggtgggc gggaatttta 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcgaggagga gcgatttggt tt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cggttgcgat cgttacgagt cg 22
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggggtcgatt cgtttcgtaa cgag 24
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcgtcgcgat ttttagcgtt aggtg 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
gggcgacgtc gtaggattta ttcg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
tcgagttggt cgaacgatag ggtaa 25
<210> 67
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggagtggttt ttgggtttg 19
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggggtttgtt tgtttgtggt tg 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
ggtgaaacat tcccacaaaa cac 23

Claims (11)

1.一种胰腺癌的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为KCNA3基因，通过检测所述生物标志物的甲基化水平诊断胰腺癌。
2.如权利要求1所述的生物标志物在制备用于诊断胰腺癌的试剂或试剂盒中的应用。
3.一种核酸产品，其特征在于，包括用于检测KCNA3基因甲基化水平的检测引物对。
4.根据权利要求3所述的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品包括用于检测Chr1：110673623～110675315区域的甲基化水平的检测引物对。
5.根据权利要求4所述的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品包括用于检测Chr1：110674072～110675224区域的甲基化水平的检测引物对。
6.根据权利要求3～5任一项所述的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品还包括与所述检测引物对对应的检测探针，所述检测探针上连接有荧光基团。
7.根据权利要求6所述的核酸产品，其特征在于，所述检测引物对包括以下引物对中的至少一组：
用于检测Chr1:110673623～110673768区域内的正链的甲基化水平的第一引物对、用于检测Chr1：110673770～110673921区域内的正链的甲基化水平的第二引物对、用于检测Chr1：110673921～110674046区域内的正链的甲基化水平的第三引物对、用于检测Chr1：110674072～110674200区域内的正链的甲基化水平的第四引物对、用于检测Chr1：110674205～110674345区域内的正链的甲基化水平的第五引物对、用于检测Chr1：110674351～110674429区域内的正链的甲基化水平的第六引物对、用于检测Chr1：110674436～110674586区域内的正链的甲基化水平的第七引物对、用于检测Chr1：110674592～110674796区域内的正链的甲基化水平的第八引物对、用于检测Chr1：110674828～110674935区域内的正链的甲基化水平的第九引物对、用于检测Chr1：110674945～110675061区域内的正链的甲基化水平的第十引物对、用于检测Chr1：110675081～110675215区域内的正链的甲基化水平的第十一引物对、用于检测Chr1：110675216～110675315区域内的正链的甲基化水平的第十二引物对、用于检测Chr1：110675315～110675230区域内的负链的甲基化水平的第十三引物对、用于检测Chr1：110675224～110675125区域内的负链的甲基化水平的第十四引物对、用于检测Chr1：110675117～110674932区域内的负链的甲基化水平的第十五引物对、用于检测Chr1：110674928～110674807区域内的负链的甲基化水平的第十六引物对、用于检测Chr1：110674797～110674679区域内的负链的甲基化水平的第十七引物对、用于检测Chr1：110674678～110674463区域内的负链的甲基化水平的第十八引物对、用于检测Chr1：110674450～110674288区域内的负链的甲基化水平的第十九引物对、用于检测Chr1：110674279～110674091区域内的负链的甲基化水平的第二十引物对、用于检测Chr1：110674060～110673855区域内的负链的甲基化水平的第二十一引物对、和用于检测Chr1：110673849～110673623区域内的负链的甲基化水平的第二十二引物对。
8.根据权利要求7所述的核酸产品，其特征在于，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQID NO：1～SEQ ID NO：2所示；和/或，所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：3～SEQID NO：4所示；和/或，所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：6所示；和/或，所述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：8所示；和/或，所述第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：9～SEQ ID NO：10所示；和/或，所述第六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：11～SEQ ID NO：12所示；和/或，所述第七引物对的核苷酸序列如SEQID NO：13～SEQ ID NO：14所示；和/或，所述第八引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：15～SEQ ID NO：16所示；和/或，所述第九引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：17～SEQ ID NO：18所示；和/或，所述第十引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：19～SEQ ID NO：20所示；和/或，所述第十一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：21～SEQ ID NO：22所示；和/或，所述第十二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：23～SEQ ID NO：24所示；和/或，所述第十三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：25～SEQ ID NO：26所示；和/或，所述第十四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：27～SEQ ID NO：28所示；和/或，所述第十五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：29～SEQ ID NO：30所示；和/或，所述第十六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：31～SEQ IDNO：32所示；和/或，所述第十七引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：33～SEQ ID NO：34所示；和/或，所述第十八引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：35～SEQ ID NO：36所示；和/或，所述第十九引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：37～SEQ ID NO：38所示；和/或，所述第二十引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：39～SEQ ID NO：40所示；和/或，所述第二十一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：41～SEQ ID NO：42所示；和/或，所述第二十二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：43～SEQ ID NO：44所示。
9.根据权利要求8所述的核酸产品，其特征在于，与所述第一引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO：45所示；和/或，与所述第二引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO：46所示；和/或，与所述第三引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO：47所示；和/或，与所述第四引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO：48所示；和/或，与所述第五引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO：49所示；和/或，与所述第六引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO：50所示；和/或，与所述第七引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO：51所示；和/或，与所述第八引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO：52所示；和/或，与所述第九引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ IDNO：53所示；和/或，与所述第十引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO：54所示；和/或，与所述第十一引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO：55所示；和/或，与所述第十二引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO：56所示；和/或，与所述第十三引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO：57所示；和/或，与所述第十四引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO：58所示；和/或，与所述第十五引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO：59所示；和/或，与所述第十六引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO：60所示；和/或，与所述第十七引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO：61所示；和/或，与所述第十八引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO：62所示；和/或，与所述第十九引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO：63所示；和/或，与所述第二十引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO：64所示；和/或，与所述第二十一引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO：65所示；和/或，与所述第二十二引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO：66所示。
10.一种诊断胰腺癌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3～9任一项所述的核酸产品。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。
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