CN104711338A - miR-24作为血浆/血清miRNA检测的内参基因的应用 - Google Patents

miR-24作为血浆/血清miRNA检测的内参基因的应用 Download PDF

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CN104711338A CN201310681099.1A CN201310681099A CN104711338A CN 104711338 A CN104711338 A CN 104711338A CN 201310681099 A CN201310681099 A CN 201310681099A CN 104711338 A CN104711338 A CN 104711338A
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Abstract

本发明公开了miR-24作为血浆/血清miRNA检测的内参基因的应用。本发明还保护一种检测血浆或血清中miRNA的相对表达量的方法，包括如下步骤：（1）提取待测血浆或血清的总RNA并反转录为cDNA；（2）以步骤（1）获得的cDNA为模板，分别检测其中目的miRNA的编码序列的含量和miR-24的编码序列的含量；（3）根据步骤（2）的结果，以所述miR-24为内参基因，计算目的miRNA的相对表达量。采用miR-24为内参基因可以实现不同实验室间研究结果的比较，促进各实验结果的归一化处理，进而促进血清/血浆miRNA研究结果向临床成果转化，为临床医生提供更加精确的诊断、分型、预后判断以及个体化治疗的有力工具。

Description

miR-24作为血浆/血清miRNA检测的内参基因的应用
技术领域
本发明涉及miR-24作为血浆/血清miRNA检测的内参基因的应用。
背景技术
MicroRNAs（即miRNAs）是近年来发现的一类长约18-24个核苷酸的非编码小RNA，在基因组中占1-3%，但预计其可以调控30%的基因表达。miRNA首先在细胞核内由RNA聚合酶II转录生成pri-miRNA，pri-miRNA经Drosha核酸酶处理生成70个核苷酸左右的pre-miRNA，并通过Exportin-5依赖的转运机制运送至胞浆。在胞浆中pre-miRNA经Dicer核酸酶进一步剪切成为成熟的miRNA。成熟miRNA以互补配对的方式与靶mRNA的3’-UTR区、5’-UTR区甚至开放读码框结合，造成靶mRNA的降解或转录抑制。MiRNA的互补配对并非绝对互补，因此同一个miRNA可以调控多个mRNA，同时同一个位点也可能同时受多个miRNA调控。
目前大量文献证实miRNA涉及生理、病理，包括增殖、分化、迁移、凋亡等几乎所有过程，与许多疾病的发生发展密切关联，同时在这些疾病中都检测到其与正常组织的差异表达情况，因此miRNA已经成为包括肿瘤在内的多种疾病的诊断、分型以及预后的候选标志物。
血液游离核酸作为疾病标志物始于1948年。由于核酸检测手段多样，定量简便，DNA和RNA相继成为研究热点。但DNA特异性较差且不能实时反应变化情况，而RNA在血液中非常容易降解，不够稳定。MiRNA作为新兴研究热点，具有在血清/血浆中稳定性好，对酸碱、反复冻融（10次）、常温放置（24小时）以及RNA酶等均不敏感的特性，表达稳定。血液游离miRNA来源非常复杂，包括血细胞miRNA释放，组织细胞中直接渗出miRNA等，在癌症患者中还包括肿瘤组织胞外体和超微小泡的外泌作用释放miRNA等，无论其来源如何，血液游离miRNA以其表达稳定、易检测、具有疾病特异性等特点成为优质血液来源生物标志物。
目前研究人员常用于血清/血浆控制miRNA表达差异的方法有三种：一是利用所有可检测到的miRNA的平均值作为参照；二是利用血清/血浆总体积作为参照；三是利用外源添加的非人类定量miRNA作为参照。以上方法都解决了部分差异控制的问题，但都存在一定的缺陷：第一种方法仅限于高通量的检测平台，如高通量测序、miRNA芯片等技术，在低通量检测平台检测少量特定的miRNA时无法使用；第二、三种方法可以有效控制实验技术带来的差异，但无法控制个体本身的生物学差异。
发明内容
本发明的目的是提供miR-24作为血浆/血清miRNA检测的内参基因的应用。
本发明要求保护miR-24作为内参基因的应用。
所述应用中，所述miR-24具体作为血浆或血清中miRNA检测的内参基因。
所述应用中，所述miR-24具体作为单独的内参基因（即无需与其他内参基因组合使用）。
本发明还保护一种检测血浆或血清中miRNA的相对表达量的方法，包括如下步骤：
（1）提取待测血浆或血清的总RNA并反转录为cDNA；
（2）以步骤（1）获得的cDNA为模板，分别检测其中目的miRNA的编码序列的含量和miR-24的编码序列的含量；
（3）根据步骤（2）的结果，以所述miR-24为内参基因，计算目的miRNA的相对表达量。‘
所述方法应用于非治疗目的和非诊断目的。
本发明还要求保护用于检测血浆或血清中miR-24的物质的应用；所述应用为：以miR-24为内参基因，检测其它miRNA相对于所述内参基因在血浆或血清中的相对表达量。
本发明还要求保护用于检测血浆或血清中miR-24的物质在制备试剂盒中的应用；所试剂盒的用途为：以miR-24为内参基因，检测其它miRNA相对于所述内参基因在血浆或血清中的相对表达量。
本发明还保护一种试剂盒，含有用于检测血浆或血清中miR-24的物质；所试剂盒的用途为：以miR-24为内参基因，检测其它miRNA相对于所述内参基因在血浆或血清中的相对表达量。所述试剂盒可为基于real-time PCR的试剂盒，如基于Taqman探针法的real-time PCR试剂盒或基于荧光染料法的real-time PCR试剂盒。
以上任一所述miR-24如序列表的序列1所示。
以上任一所述血浆或血清可来源于结直肠癌患者、肺癌患者或健康人。
采用miR-24为内参基因可以实现不同实验室间研究结果的比较，促进各实验结果的归一化处理，进而促进血清/血浆miRNA研究结果向临床成果转化，为临床医生提供更加精确的诊断、分型、预后判断以及个体化治疗的有力工具。
miRNA作为新型生物标志物，在血清/血浆中受内外因素干扰较小、表达稳定、检测手段多样、定量检测精确。因此以miRNA作为血清/血浆中的内参基因有助于外周血标志物在诊断、分型以及预后等方面的价值转化以及不同实验室间检测结果的对比。以单个miRNA作为血清或血浆中的内参基因，适用于高、低通量的检测平台，对于大规模临床检测应用，降低了操作难度，简化了操作流程。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。miR为单链RNA，实施例中提供的各个miR的序列均为5’→3’方向。
实施例1、通过TLDA芯片筛选候选内参基因
利用TLDA芯片分别检测已经医院确诊但未经任何治疗的结直肠癌患者、肺癌患者和健康人的血浆miRNA的表达谱及含量，分析不同病例和对照间miRNA表达的稳定性和表达量，筛选得到稳定高表达的miRNA作为候选内参miRNA。
1、血浆样本的制备
分别采集已经医院确诊但未经任何治疗的结直肠癌患者（49人）、肺癌患者（6人）和健康人（58人）的血浆。
将结直肠癌患者分为5组，相关信息见表1。
表1结直肠癌患者的信息
肺癌患者为一组，相关信息见表2。
表2肺癌患者的信息
年龄 性别
患者1 62 男
患者2 55 女
患者3 58 女
患者4 61 男
患者5 47 男
患者6 70 男
健康人分为6组，相关信息见表3。
表3健康人的信息
采集血浆的方法如下：
（1）用EDTA抗凝采血管收集外周血4-5mL，轻轻倒转采血管4-5次以利抗凝。
（2）将完成步骤（1）的采血管放入水平式离心机中，室温、2500g离心10分钟（该步骤在采血4小时内进行），吸取上层血浆至1.5ml离心管（或2ml离心管，注意轻柔操作避免扰动和吸取到含白细胞的中间层）。
（3）取步骤（2）得到的血浆，室温、10000g离心10min，吸取上清（血浆样本），冻存于-80℃冰箱中或直接进行下一步实验。
2、混合血浆样本的制备
结直肠癌患者第一组至第四组，将每组的10个血浆样本混合，依次得到结直肠癌混合血浆样本一、结直肠癌混合血浆样本二、结直肠癌混合血浆样本三和结直肠癌混合血浆样本四。结直肠患者第五组，将9个血浆样本混合，得到结直肠癌混合血浆样本五。
健康人第一组至第四组，将每组的10个血浆样本混合，依次得到健康混合血浆样本一、健康混合血浆样本二、健康混合血浆样本三和健康混合血浆样本四。健康人第五组，将9个血浆样本混合，得到健康混合血浆样本五。
3、利用miRNeasy Mini Kit(QIAGEN公司，产品目录号：217004)并按试剂盒说明书分别提取步骤2得到的各个混合血浆样本或步骤1制备的各个血浆样本的总RNA，总RNA得率约为100ng/100μL血浆。
4、分别取步骤3得到的各个总RNA，采用MicroRNA Reverse TranscriptionKit（Life Technologies公司，产品目录号4366596）将100ng总RNA反转录为cDNA。
5、采用预扩增试剂盒（Life Technologies公司，MegaplexTMPrimer Pools,HumanPools Set v3.0和PreAmp Master Mix，产品目录号分别为4444750和4391128）并按试剂盒说明书，将步骤4得到的cDNA进行预扩增，然后利用TaqMan humanMicroRNA Array Set v3.0芯片（Life Technologies公司，产品目录号：4444913）进行检测（所有cDNA中各个miRNA的表达量的检测均是在完全平行的体系和完全相同的条件下进行的），获得miRNA表达谱（TLDA芯片可用于检测768种miRNA，设置荧光阈值为自动，原始输出结果为每种miRNA的Ct值）。
比较5个结直肠癌混合血浆样本（结直肠癌混合血浆样本一至结直肠癌混合血浆样本五）与5个健康混合血浆样本（健康混合血浆样本一至健康混合血浆样本五），并将所有CV值（CV=标准偏差/平均值×100%）小于5%的miRNA按照Ct值从小到大进行排序，前五名依次为hsa-miR-19b-3p（序列：UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA；结直肠癌混合血浆样本一的Ct值为17.02，结直肠癌混合血浆样本二的Ct值为15.95，结直肠癌混合血浆样本三的Ct值为15.97，结直肠癌混合血浆样本四的Ct值为15.99，结直肠癌混合血浆样本五的Ct值为15.94，健康混合血浆样本一的Ct值为16.97，健康混合血浆样本二的Ct值为15.99，健康混合血浆样本三的Ct值为15.98，健康混合血浆样本四的Ct值为14.96，健康混合血浆样本五的Ct值为15.96）、hsa-miR-16-5p（序列：UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG；结直肠癌混合血浆样本一的Ct值为16.99，结直肠癌混合血浆样本二的Ct值为15.95，结直肠癌混合血浆样本三的Ct值为15.98，结直肠癌混合血浆样本四的Ct值为15.97，结直肠癌混合血浆样本五的Ct值为16.01，健康混合血浆样本一的Ct值为16.97，健康混合血浆样本二的Ct值为16.97，健康混合血浆样本三的Ct值为15.97，健康混合血浆样本四的Ct值为14.97，健康混合血浆样本五的Ct值为15.95）、hsa-miR-126-5p（序列：CAUUAUUACUUUUGGUACGCG；结直肠癌混合血浆样本一的Ct值为16.97，结直肠癌混合血浆样本二的Ct值为15.95，结直肠癌混合血浆样本三的Ct值为15.97，结直肠癌混合血浆样本四的Ct值为15.96，结直肠癌混合血浆样本五的Ct值为16.96，健康混合血浆样本一的Ct值为16.97，健康混合血浆样本二的Ct值为15.97，健康混合血浆样本三的Ct值为16.60，健康混合血浆样本四的Ct值为15.98，健康混合血浆样本五的Ct值为15.97）、hsa-miR-24（序列：UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG；结直肠癌混合血浆样本一的Ct值为17.97，结直肠癌混合血浆样本二的Ct值为16.96，结直肠癌混合血浆样本三的Ct值为15.99，结直肠癌混合血浆样本四的Ct值为16.97，结直肠癌混合血浆样本五的Ct值为18.02，健康混合血浆样本一的Ct值为17.98，健康混合血浆样本二的Ct值为16.96，健康混合血浆样本三的Ct值为17.03，健康混合血浆样本四的Ct值为16.00，健康混合血浆样本五的Ct值为16.97）、hsa-miR-20a（序列：UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG；结直肠癌混合血浆样本一的Ct值为17.95，结直肠癌混合血浆样本二的Ct值为17.98，结直肠癌混合血浆样本三的Ct值为16.96，结直肠癌混合血浆样本四的Ct值为16.95，结直肠癌混合血浆样本五的Ct值为17.97，健康混合血浆样本一的Ct值为17.98，健康混合血浆样本二的Ct值为16.97，健康混合血浆样本三的Ct值为16.94，健康混合血浆样本四的Ct值为15.95，健康混合血浆样本五的Ct值为16.97）。
比较6个肺癌血浆样本（肺癌患者1的血浆样本、肺癌患者2的血浆样本、肺癌患者3的血浆样本、肺癌患者4的血浆样本、肺癌患者5的血浆样本和肺癌患者6的血浆样本）和9个健康血浆样本（健康人50的血浆样本、健康人51的血浆样本、健康人52的血浆样本、健康人53的血浆样本、健康人54的血浆样本、健康人55的血浆样本、健康人56的血浆样本、健康人57的血浆样本和健康人58的血浆样本），并将所有CV值小于5%的miRNA按照Ct值从小到大进行排序，前五名依次为hsa-miR-146a-5p（序列：UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU；肺癌患者1的血浆样本的Ct值为24.98，肺癌患者2的血浆样本的Ct值为25.98，肺癌患者3的血浆样本的Ct值为23.95，肺癌患者4的血浆样本的Ct值为23.95，肺癌患者5的血浆样本的Ct值为22.97，肺癌患者6的血浆样本的Ct值为22.95，健康人50的血浆样本的Ct值为23.98，健康人51的血浆样本的Ct值为23.96，健康人52的血浆样本的Ct值为21.98，健康人53的血浆样本的Ct值为22.93，健康人54的血浆样本的Ct值为25.98，健康人55的血浆样本的Ct值为22.97，健康人56的血浆样本的Ct值为22.95，健康人57的血浆样本的Ct值为22.97，健康人58的血浆样本的Ct值为23.99）、hsa-miR-222-3p（序列：AGCUACAUCUGGCUACUGGGU；肺癌患者1的血浆样本的Ct值为23.94，肺癌患者2的血浆样本的Ct值为24.91，肺癌患者3的血浆样本的Ct值为22.94，肺癌患者4的血浆样本的Ct值为23.95，肺癌患者5的血浆样本的Ct值为22.95，肺癌患者6的血浆样本的Ct值为22.93，健康人50的血浆样本的Ct值为23.94，健康人51的血浆样本的Ct值为23.95，健康人52的血浆样本的Ct值为22.94，健康人53的血浆样本的Ct值为24.94，健康人54的血浆样本的Ct值为25.94，健康人55的血浆样本的Ct值为23.94，健康人56的血浆样本的Ct值为23.94，健康人57的血浆样本的Ct值为23.94，健康人58的血浆样本的Ct值为23.96）、hsa-miR-24（序列：UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG；肺癌患者1的血浆样本的Ct值为22.93，肺癌患者2的血浆样本的Ct值为23.98，肺癌患者3的血浆样本的Ct值为21.98，肺癌患者4的血浆样本的Ct值为21.97，肺癌患者5的血浆样本的Ct值为21.98，肺癌患者6的血浆样本的Ct值为21.98，健康人50的血浆样本的Ct值为22.97，健康人51的血浆样本的Ct值为23.01，健康人52的血浆样本52的Ct值为20.97，健康人53的血浆样本的Ct值为22.97，健康人54的血浆样本的Ct值为24.98，健康人55的血浆样本的Ct值为22.99，健康人56的血浆样本的Ct值为23.98，健康人57的血浆样本的Ct值为22.97，健康人58的血浆样本的Ct值为22.99）、hsa-miR-320a（序列：AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA；肺癌患者1的血浆样本的Ct值为22.98，肺癌患者2的血浆样本的Ct值为22.97，肺癌患者3的血浆样本的Ct值为21.99，肺癌患者4的血浆样本的Ct值为22.97，肺癌患者5的血浆样本的Ct值为21.95，肺癌患者6的血浆样本的Ct值为22.99，健康人50的血浆样本的Ct值为22.97，健康人51的血浆样本的Ct值为22.99，健康人52的血浆样本的Ct值为21.99，健康人53的血浆样本的Ct值为22.96，健康人54的血浆样本的Ct值为22.96，健康人55的血浆样本的Ct值为22.98，健康人56的血浆样本的Ct值为22.97，健康人57的血浆样本的Ct值为21.97，健康人58的血浆样本的Ct值为22.97）、hsa-miR-484（序列：UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU；肺癌患者1的血浆样本的Ct值为23.97，肺癌患者2的血浆样本的Ct值为24.97，肺癌患者3的血浆样本的Ct值为22.97，肺癌患者4的血浆样本的Ct值为23.99，肺癌患者5的血浆样本的Ct值为23.97，肺癌患者6的Ct值为23.96，健康人50的血浆样本的Ct值为25.99，健康人51的血浆样本的Ct值为25.98，健康人52的血浆样本的Ct值为23.98，健康人53的血浆样本的Ct值为25.99，健康人54的血浆样本的Ct值为25.98，健康人55的血浆样本的Ct值为24.99，健康人56的血浆样本的Ct值为26.98，健康人57的血浆样本的Ct值为24.97，健康人58的血浆样本的Ct值为23.98）。
结直肠癌/健康对照组和肺癌/健康对照组两组前五名重叠的只有miR-24（序列表的序列1：UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG）。
实施例2、内参基因在不同个体中稳定表达
1、分别取实施例1的步骤1中得到的结直肠癌患者（49人）和健康人（49人）的血浆样本。
2、利用miRNeasy Mini Kit并按试剂盒说明书分别提取步骤1得到的各个血浆样本的总RNA。
3、分别取步骤2得到的各个总RNA，采用MicroRNA Reverse TranscriptionKit将100ng总RNA反转录为cDNA。
4、以步骤3得到的cDNA为模板，利用real-time PCR（Taqman探针法）检测各个血浆样本中miR-24的表达量、miR-16（miR-16：UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG）的表达量和miR-484（miR-484：UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU）的表达量（所有cDNA中各个miRNA的表达量的检测均是在完全平行的体系和完全相同的条件下进行的）。
原始输出的结果是Ct值，阈值为0.1，原始输出结果经Normfinder软件处理后得到的结果见表4。
表449位结直肠癌患者的血浆样本和58位健康人的血浆样本的检测结果
hsa-miR-16 hsa-miR-24 hsa-miR-484 阈值
结直肠癌患者1的血浆样本 23.01 27.95 26.61 0.10
结直肠癌患者2的血浆样本 20.43 25.44 28.47 0.10
结直肠癌患者3的血浆样本 22.25 26.95 28.05 0.10
结直肠癌患者4的血浆样本 21.65 26.36 25.57 0.10
结直肠癌患者5的血浆样本 23.37 27.22 27.55 0.10
结直肠癌患者6的血浆样本 23.29 29.04 27.20 0.10
结直肠癌患者7的血浆样本 23.87 30.54 28.92 0.10
结直肠癌患者8的血浆样本 23.17 27.55 31.85 0.10
结直肠癌患者9的血浆样本 23.28 31.14 28.36 0.10
结直肠癌患者10的血浆样本 24.19 30.18 27.71 0.10
结直肠癌患者11的血浆样本 25.52 32.60 29.98 0.10
结直肠癌患者12的血浆样本 22.17 26.37 27.07 0.10
结直肠癌患者13的血浆样本 23.02 26.97 26.98 0.10
结直肠癌患者14的血浆样本 28.98 35.04 33.08 0.10
结直肠癌患者15的血浆样本 25.40 30.51 28.78 0.10
结直肠癌患者16的血浆样本 24.40 29.11 30.99 0.10
结直肠癌患者17的血浆样本 26.08 31.93 28.66 0.10
结直肠癌患者18的血浆样本 22.05 26.92 26.21 0.10
结直肠癌患者19的血浆样本 22.36 27.89 27.53 0.10
结直肠癌患者20的血浆样本 28.18 33.71 31.95 0.10
结直肠癌患者21的血浆样本 26.40 31.26 29.04 0.10
结直肠癌患者22的血浆样本 24.81 30.71 28.39 0.10
结直肠癌患者23的血浆样本 23.57 27.39 29.00 0.10
结直肠癌患者24的血浆样本 25.64 31.25 28.60 0.10
结直肠癌患者25的血浆样本 22.12 26.27 26.76 0.10
结直肠癌患者26的血浆样本 24.97 29.34 27.82 0.10
结直肠癌患者27的血浆样本 22.67 30.66 27.44 0.10
结直肠癌患者28的血浆样本 24.78 29.78 27.69 0.10
结直肠癌患者29的血浆样本 21.72 25.89 26.36 0.10
结直肠癌患者30的血浆样本 24.09 29.54 27.44 0.10
结直肠癌患者31的血浆样本 23.78 28.57 28.50 0.10
结直肠癌患者32的血浆样本 21.63 26.25 25.30 0.10
结直肠癌患者33的血浆样本 22.07 26.33 25.29 0.10
结直肠癌患者34的血浆样本 24.31 28.69 27.06 0.10
结直肠癌患者35的血浆样本 23.04 28.09 26.84 0.10
结直肠癌患者36的血浆样本 24.01 29.39 36.19 0.10
结直肠癌患者37的血浆样本 24.01 30.68 35.22 0.10
结直肠癌患者38的血浆样本 23.26 28.07 34.66 0.10
结直肠癌患者39的血浆样本 24.85 29.27 36.98 0.10
结直肠癌患者40的血浆样本 25.61 30.17 35.37 0.10
结直肠癌患者41的血浆样本 24.84 29.53 38.13 0.10
结直肠癌患者42的血浆样本 22.13 27.22 34.32 0.10
结直肠癌患者43的血浆样本 23.21 27.66 27.29 0.10
结直肠癌患者44的血浆样本 24.83 32.01 31.58 0.10
结直肠癌患者45的血浆样本 31.18 39.08 Undetermined 0.10
结直肠癌患者46的血浆样本 22.46 26.70 34.47 0.10
结直肠癌患者47的血浆样本 26.01 30.77 Undetermined 0.10
结直肠癌患者48的血浆样本 24.65 29.92 34.35 0.10
结直肠癌患者49的血浆样本 24.74 31.22 34.60 0.10
健康人1的血浆样本 26.50 30.27 30.13 0.10
健康人2的血浆样本 24.62 30.26 28.09 0.10
健康人3的血浆样本 25.08 29.55 29.21 0.10
健康人4的血浆样本 25.97 30.26 28.49 0.10
健康人5的血浆样本 25.16 29.61 27.89 0.10
健康人6的血浆样本 27.02 31.58 29.17 0.10
健康人7的血浆样本 25.16 28.89 29.90 0.10
健康人8的血浆样本 24.68 28.43 26.98 0.10
健康人9的血浆样本 24.05 28.12 26.54 0.10
健康人10的血浆样本 25.30 29.09 27.75 0.10
健康人11的血浆样本 25.43 29.64 27.23 0.10
健康人12的血浆样本 26.31 29.92 27.92 0.10
健康人13的血浆样本 25.29 29.17 27.89 0.10
健康人14的血浆样本 27.90 31.15 27.51 0.10
健康人15的血浆样本 23.89 27.96 26.52 0.10
健康人16的血浆样本 25.95 29.97 27.94 0.10
健康人17的血浆样本 22.82 26.33 25.38 0.10
健康人18的血浆样本 25.23 29.87 27.50 0.10
健康人19的血浆样本 24.30 28.71 27.95 0.10
健康人20的血浆样本 23.82 27.33 27.04 0.10
健康人21的血浆样本 25.57 29.26 27.32 0.10
健康人22的血浆样本 24.85 29.93 27.18 0.10
健康人23的血浆样本 26.02 29.79 27.50 0.10
健康人24的血浆样本 24.84 29.16 26.94 0.10
健康人25的血浆样本 25.99 29.84 27.59 0.10
健康人26的血浆样本 24.66 28.16 26.67 0.10
健康人27的血浆样本 25.32 28.36 30.22 0.10
健康人28的血浆样本 25.17 31.02 28.66 0.10
健康人29的血浆样本 24.89 28.86 28.68 0.10
健康人30的血浆样本 24.26 29.21 29.44 0.10
健康人31的血浆样本 23.27 27.18 28.20 0.10
健康人32的血浆样本 25.76 29.90 29.26 0.10
健康人33的血浆样本 23.81 27.21 28.25 0.10
健康人34的血浆样本 22.61 26.57 29.35 0.10
健康人35的血浆样本 25.20 29.52 29.03 0.10
健康人36的血浆样本 24.32 28.31 28.18 0.10
健康人37的血浆样本 23.41 27.20 27.94 0.10
健康人38的血浆样本 23.16 27.53 26.52 0.10
健康人39的血浆样本 22.96 26.81 29.06 0.10
健康人40的血浆样本 24.79 28.92 27.04 0.10
健康人41的血浆样本 25.40 30.76 28.43 0.10
健康人42的血浆样本 24.07 28.56 30.26 0.10
健康人43的血浆样本 31.32 33.75 31.13 0.10
健康人44的血浆样本 24.61 29.42 27.50 0.10
健康人45的血浆样本 26.25 29.93 30.64 0.10
健康人46的血浆样本 23.71 27.85 27.64 0.10
健康人47的血浆样本 26.94 31.69 30.66 0.10
健康人48的血浆样本 24.72 28.75 27.78 0.10
健康人49的血浆样本 30.27 35.55 32.80 0.10
利用Normfinder分析real-time PCR检测的各个miRNA在不同血浆中的稳定性，稳定值（stability）越低稳定性越高。miR-24的稳定值最低，稳定性最高。miR-24可以作为单独的内参基因。

Claims (8)

1.miR-24作为内参基因的应用；所述miR-24如序列表的序列1所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用中，所述miR-24作为血浆或血清中miRNA检测的内参基因。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述应用中，所述miR-24作为单独的内参基因。
4.一种检测血浆或血清中miRNA的相对表达量的方法，包括如下步骤：
（1）提取待测血浆或血清的总RNA并反转录为cDNA；
（2）以步骤（1）获得的cDNA为模板，分别检测其中目的miRNA的编码序列的含量和miR-24的编码序列的含量；所述miR-24如序列表的序列1所示；
（3）根据步骤（2）的结果，以所述miR-24为内参基因，计算目的miRNA的相对表达量。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法应用于非治疗目的和非诊断目的。
6.用于检测血浆或血清中miR-24的物质的应用；所述应用为：以miR-24为内参基因，检测其它miRNA相对于所述内参基因在血浆或血清中的相对表达量；所述miR-24如序列表的序列1所示。
7.用于检测血浆或血清中miR-24的物质在制备试剂盒中的应用；所试剂盒的用途为：以miR-24为内参基因，检测其它miRNA相对于所述内参基因在血浆或血清中的相对表达量；所述miR-24如序列表的序列1所示。
8.一种试剂盒，含有用于检测血浆或血清中miR-24的物质；所试剂盒的用途为：以miR-24为内参基因，检测其它miRNA相对于所述内参基因在血浆/血清中的相对表达量；所述miR-24如序列表的序列1所示。
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