CN103233074A - 一种菊花ssr引物的开发方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种菊花SSR引物的开发方法。利用NCBI数据库现有的序列数据，结合Perl编程语言方法，对大量序列信息进行批量处理，进行SSR序列查找和SSR标记引物设计，克服了SSR开发效率低、耗时久、成本高等障碍。以不同栽培菊花品种为材料，对设计的SSR引物进行验证，若有条带检测出，即为成功的SSR引物。应用本方法成功地设计了363对SSR引物，为菊花SSR引物开发进而实现分子标记辅助选择育种和比较基因组学研究等提供了新的方法和思路。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种菊花SSR引物的开发方法。
背景技术
菊花（Chrysanthemum morifolium）原产我国，栽培品种多为六倍体及其非整倍体，是我国十大传统名花和世界四大切花之一，具有观赏、食用和药用价值（李鸿渐，1993），距今已有1600多年的栽培历史，由毛华菊、野菊和紫花野菊等天然杂交并经人工长期选育而成(Chen，1957;Chen，1985)。菊花花型、花色、株型等极其丰富，是盆栽、切花和园林地被应用的重要花卉种类，具有很高的观赏和应用价值，在花卉生产中占有十分重要的地位。
分子标记能在DNA水平上反映植物遗传基础的差异，是植物遗传育种领域内的一项新兴技术。简单重复序列（SSR）广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，由于SSR的重复次数不同和重复程度不同，使其呈现高度的多态性。SSR标记的原理是：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，揭示其多态性。目前SSR标记被认为是可靠性最高的分子标记类型之一。
随着菊花分子生物学研究的深入，分子育种在菊花中的应用将倍受关注。菊花遗传连锁图谱构建是菊花基因组研究的基础，它不仅在重要性状基因的定位、克隆及分子标记辅助选择育种及比较基因组学研究等方面具有重要现实意义，还能有力推进菊花基因组结构和起源进化研究。虽然SSR标记因其丰富的多态性和共显性等优点，得以广泛应用，但是使用该技术的前提是要有相应的SSR引物。即在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。目前，大多数SSR引物的发掘是根据传统方法获得的，即构建基因组文库，然后用含有SSR的探针与之杂交，筛选阳性克隆，测序，再根据SSR两侧的DNA序列设计引物。该方法虽然测序容易，但SSR阳性克隆的得率很低。植物中已报道的阳性克隆比率约为2%～3%，成功获得引物的机率则更低。鉴于传统方法开发引物的效率很低，人们开发了富集法，即通过建立和筛选微卫星富集文库，以SSR克隆的得率。新方法虽然降低了实验成本，缩短了实验周期，且成功率高，但实验过程复杂繁琐，另外对实验室的条件也有着很高的要求。限制了此类方法在菊花遗传研究和种质改良中的应用，导致了菊花尚无SSR引物开发的报道。
EST‐SSR是SSR的重要组成部分，近年来随着测序工作的增加，数据库中EST序列的数量也随之增加，使得通过数据库搜寻法获得EST‐SSR成为可能。但是从美国国家生物技术信息中心（NCBI）保存的数据成千上万，对大量的EST序列进行格式处理、剔除载体序列和冗余序列仍是一个不小的工作量。Perl是一种自由且功能强大的编程语言。它被用作Web编程、数据库处理、XML处理以及系统管理等等。随着生物信息学的发展，Perl更多的应用到了生物数据的操作和检索中，使得对大批量数据统一处理成为可能。在此基础上进行SSR引物开发更能提高分离效率，节约时间和资金。
目前研究表明，虽然有一定数目的菊花EST序列信息在NCBI数据库中能检索到，但是利用其开发SSR费时费力，效率低下，尚未有相关SSR引物报道。因此，如果利用NCBI数据库中的EST序列信息，批量开发SSR引物的技术成熟，将会对菊花重要性状基因的定位、克隆及分子标记辅助选择育种和比较基因组学研究等方面有重要意义
发明内容
本发明的目的是针对目前菊花资源遗传丰富，但尚无SSR标记引物和反应体系情况，提供一种菊花SSR引物的开发方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种菊花SSR引物的开发方法，其特征在于包含如下步骤：
1）菊花EST序列的获得
登陆美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，选择dbEST数据库，以栽培菊花拉丁名Chrysanthemum morifolium为关键词，进行菊花EST数据检索。将获取到的数据以fasta格式保存并下载，以便进一步利用；
将下载的数据使用SeqVerterTM软件进行序列格式转化为DNAStar格式，保存以便进一步利用；
将格式化后的序列利用序列克隆载体去除软件VecScreen进行处理(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html)，去除序列中污染的克隆载体序列；
2）菊花SSR序列的识别
安装Perl语言5.16版本，从http://pgrc.ipk‐gatersleben.de/misa/下载est_timmer.pl并运行est_timmer.pl去除EST序列中过短的序列（<100bp）和过长的序列（>2000bp）；从http://www.bioinformatics.org/cd‐hit/中下载CD_HIT软件，利用其去除冗余序列；从http://pgrc.ipk‐gatersleben.de/misa/下载misa.pl程序以识别和定位序列中的SSR；参数设置如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数至少为15、6、5、4、3。
3）菊花SSR引物的设计
使用Perl环境下primer3模块批量设计SSR引物：引物设计参数为引物长度18‐22bp，Tm55‐65℃，其中前后引物Tm值相差4℃，产物大小为100‐400bp。
4）菊花SSR引物有效性和通用性鉴定
提取不同菊花品种的DNA，统一稀释为50ng/μl，‐20℃保存备用。PCR反应体系采用10μL的反应体系，其中包括50ng模板DNA，1.5mmol·L‐1Mg2+、400μmol·L‐1dNTPs、0.5U TaqDNA聚合酶、1μmol·L‐1引物及10×PCR buffer。
SSR反应程序：94℃预变性5min；然后进入30个循环94℃变性30s，55‐60℃复性30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min。
反应结束后，产物加入2μL loading buffer，以100bp DNA ladder为DNA分子量标准，采用8%的非变性聚丙烯酰胺进行电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，200V稳压电泳2‐2.5h，至loadingbuffer移到凝胶底部时电泳结束。电泳结束后，采用银染法染色，最后将凝胶置于凝胶成像系统上拍照。若有100‐400bp扩增子检测出，该引物即为有效引物；利用其近缘属不同野生种材料的DNA进行引物通用性鉴定，若有100‐400bp扩增子检测出，该引物即具有通用性；
利用本发明所述的菊花SSR引物的开发方法获得的菊花SSR引物对，包括表1中的任意一对:
表1
| 引物编号 | 正向引物 | 反向引物 |
| 引物1 | AAAAGCTTGTCCACCACCAC（SEQ ID NO.1） | TAGGAGGGCTAGGTTTCGGT（SEQ ID NO.2） |
| 引物2 | AACGCCTCATGGCTAGTACG（SEQ ID NO.3） | TGACTTCACATTGGCATTGG（SEQ ID NO.4） |
| 引物3 | AACTTGCTTGCACCTACGCT（SEQ ID NO.5） | CCTTGGGCTCTTCCTTCTTT（SEQ ID NO.6） |
| 引物4 | AAGAACACCCCTAACCGGAG（SEQ ID NO.7） | GGGTCTAGGTCTGAATTTGAGG（SEQ ID NO.8） |
| 引物5 | AAGTAACAAAAATGGCCGGA（SEQ ID NO.9） | ACGGTTGTCCCAAGCATTAC（SEQ ID NO.10） |
| 引物6 | AATCCACTTAACAGGGCACG（SEQ ID NO.11） | TCGCCATACCACTTGATTGA（SEQ ID NO.12） |
| 引物7 | AATCCCAGATTTCAATCCCC（SEQ ID NO.13） | GGTCGAACGTCTTCAATGCT（SEQ ID NO.14） |
| 引物8 | AATCCCCAGATTTCAATCCC（SEQ ID NO.15） | TTGGAGTAAGCAGCCGATCT（SEQ ID NO.16） |
| 引物9 | AATTCACAAACAATATGACACCAA（SEQ ID NO.17） | CTGATGACCCTGAGGCATTT（SEQ ID NO.18） |
| 引物10 | AATTCCCAAGGCATCATCAC（SEQ ID NO.19） | TGAAGTGTTCTTCACGGCTG（SEQ ID NO.20） |
| 引物11 | ACAAAAGGCGACACACACAA（SEQ ID NO.21） | ATCTTCTTCCAACAGGCGAA（SEQ ID NO.22） |
| 引物12 | ACACACACACCCAACCAAAA（SEQ ID NO.23） | TTGAGTCTGGCAACACAAGC（SEQ ID NO.24） |
| 引物13 | ACATACCCAAACCGCATCAT（SEQ ID NO.25） | CTATCCGGCTAGACAGCAGC（SEQ ID NO.26） |
| 引物14 | ACATGGCACTTTCATCCTCC（SEQ ID NO.27） | GTGTGGACTGCCATTGTTTG（SEQ ID NO.28） |
| 引物15 | ACCAAAGCTAAAGCAGCCAA（SEQ ID NO.29） | ATCGACTCCTCCAGCTACCA（SEQ ID NO.30） |
| 引物16 | ACCACAACCAAACACGATCA（SEQ ID NO.31） | TTTCAGGTAGTCCGGTCTGG（SEQ ID NO.32） |
| 引物17 | ACCACCACAACCTGGGAATA（SEQ ID NO.33） | TGACATGGGCCAAAACTACA（SEQ ID NO.34） |
| 引物18 | ACCACCCCAATTTGTAAGCA（SEQ ID NO.35） | AAGGTCAACAGCTTCCTCCA（SEQ ID NO.36） |
| 引物19 | ACCATCACCCTTACCACCAC（SEQ ID NO.37） | GACGCTGATAAGTGCGACAA（SEQ ID NO.38） |
| 引物20 | ACCCAATGCATCATCACTCA（SEQ ID NO.39） | TGAAGTGTTCTTCACGGCTG（SEQ ID NO.40） |
有益效果本发明提供的利用NCBI现有数据，高效地完成对菊花SSR开发和利用的技术，与现有技术相比具有如下优点和积极效果：
（1）本发明利用NCBI现有数据，结合生物信息学技术进行菊花SSR标记引物的开发，克服了菊花SSR引物获取困难和无SSR引物的问题，拓宽了菊花分子标记辅助育种的思路和领域，扩展了栽培菊花种质鉴定的方式。
（2）在Perl语言的基础上，使用est_timmer，CD_HIT，misa和primer3等软件，批量的处理数据，开发SSR引物，提高了开发效率，节约了时间和资金。
（3）使用不同品种的菊花对设计的引物进行PCR鉴定，结果真实可靠。
（4）在本发明基础上，使利用SSR分子标记技术进一步开展菊花遗传育种研究成为可能，同时还可结合现代分子生物学等手段对菊花进行染色体组分析、起源演化及亲缘关系研究等，有重要的理论意义和现实意义。
附图说明
图1、不同类型SSR引物在菊花栽培品种中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图
A：条带单一、无多态性的引物组合（引物4）。B条带较少、多态性较差的引物组合（引物9）。C：多态性较高，条带较丰富的引物组合（引物17）。
具体实施方式
本发明所提供的利用NCBI数据库现有的数据，并结合Perl语言方法进行SSR序列查找和SSR标记引物设计和验证，其具体实施方式如下：
1）菊花EST序列的获得
登陆美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站，选择dbEST数据库，以栽培菊花拉丁名Chrysanthemum morifolium为关键词，进行菊花EST数据检索。将获取到的数据以fasta格式保存并下载，以便进一步利用；
将下载的数据使用SeqVerterTM软件进行序列格式转化为DNAStar格式，保存以便进一步利用；
将格式化后的序列利用序列克隆载体去除软件VecScreen进行处理(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html)，去除序列中污染的克隆载体序列；
2）菊花SSR序列的识别
安装Perl语言5.16版本，默认安装在C盘根目录下。从http://pgrc.ipk‐gatersleben.de/misa/下载est_timmer.pl并运行est_timmer.pl去除EST序列中过短的序列（<100bp）和过长的序列（>2000bp），运行命令为：C:\perl\bin>perl est_trimmer.pl A.fasta–amb=2,50–tr5=T,5,50–tr3=A,5,50–cut=100,2000。输出两个文件A.fasta.log和A.fasta.results(A为文件代号)。
从http://www.bioinformatics.org/cd‐hit/中下载CD_HIT软件，利用其去除冗余序列：把A.fasta.results复制到cd_hit文件夹中并重命名为B.fasta，运行cd_hit.exe，Perl环境下运行命令为：C:\perl\bin\cd_hit>cd_hit.exe–i B.fasta–o C.fasta–c1.00–n5–M2000，输出三个文件，其中C.fsata文件用于下一步处理(A、B和C均为文件代号)。
从http://pgrc.ipk‐gatersleben.de/misa/下载misa.pl程序以识别和定位序列中的SSR；参数设置如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数至少为15、6、5、4、3。
将C.fsata文件拷贝至C盘perl\bin目录下，Perl环境下运行命令：C:\perl\bin>perl misa.plC.fasta，运行后产生C.fasta.misa和C.fasta.statistics两个文件，其中C.fasta.misa用于后续引物设计。
2）菊花SSR引物的设计
使用Perl环境下primer3模块批量设计SSR引物：引物设计参数为Tm55‐65℃，引物长度为18‐22bp。
运行p3_out.pl，Perl环境下运行命令为：C:\perl\bin>perl p3_in.pl C.fasta.misa，产生了一个名为C.fasta.p3in的primer3的输入文件；
再复制C.fasta.p3in文件到C盘perl\bin\primer3\bin根目录下，运行primer3_core.exe实现批量的引物设计，Perl环境下运行命令为：C:\perl\bin\primer3\bin>primer3_core.exe<C.fasta.p3in>C.fasta.p3out，产生一个名为C.fasta.p3out的文件；
最后将C.fasta.p3out文件复制至C盘perl\bin目录下，运行p3_out.pl，其命令为：C:\perl\bin>perl p3_out.pl C.fasta.p3out C.fasta.misa，运行后得到C.fasta.results文件，此即为设计好的引物；
2）引物有效性和通用性鉴定
提取不同菊花品种的DNA，统一稀释为50ng/μl，‐20℃保存备用。PCR反应体系采用10μL的反应体系，其中包括50ng模板DNA，1.5mmol·L‐1Mg2+、400μmol·L‐1dNTPs、0.5U TaqDNA聚合酶、1μmol·L‐1引物及10×PCR buffer。
SSR反应程序：94℃预变性5min；然后进入30个循环94℃变性30s，55‐60℃复性30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min。
反应结束后，产物加入2μL loading buffer，以100bp DNA ladder为DNA分子量标准，采用8%的非变性聚丙烯酰胺进行电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，200V稳压电泳2‐2.5h，至loadingbuffer移到凝胶底部时电泳结束。电泳结束后，采用银染法染色，最后将凝胶置于凝胶成像系统上拍照。
实施例1：
应用上述方法从NCBI上共计下载到EST序列7180条，开发SSR引物363对，具体说明如下：
以栽培菊花拉丁名Chrysanthemum morifolium为关键词，进行菊花EST数据检索。将获取到的数据7180条序列，去除载体和冗余后共检测到501条潜在的SSR序列，占总数的6.98%。使用primer3.0批量设计软件共设计获得SSR引物363对。
从363对设计的SSR引物中随机抽选20对（见表1），使用43个栽培菊花品种进行验证。结果表明：选取的20对引物均可在43个品种中检测到清晰的扩增条带，说明引物的设计成功率较高。这其中有单一的、无多态性的引物组合（见图1A）；有多态性较差的引物组合（见图1B）；另外还有多态性较高，条带较丰富的引物组合（见图1C）。
Claims (4)
1.一种菊花SSR引物的开发方法，其特征在于包含如下步骤：
1）菊花EST序列的获得
登陆NCBI网站，选择dbEST数据库，进行菊花EST数据检索，将获取到的序列利用序列克隆载体去除软件VecScreen进行处理，去除序列中污染的克隆载体序列；
2）菊花SSR序列的识别
安装Perl语言5.16版本，从http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/下载est_timmer.pl并运行est_timmer.pl去除EST序列中过短的序列和过长的序列；
从http://www.bioinformatics.org/cd-hit/中下载CD_HIT软件，利用其去除冗余序列；
从http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/下载misa.pl程序以识别和定位序列中的SSR，参数设置如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数至少为15、6、5、4、3。
3）菊花SSR引物的设计
使用primer3模块http://sourceforge.net/projects/primer3/files/primer3/1.1.4/primer3-1.1.4-WINXP.zip/download批量设计SSR引物，引物设计参数为引物长度18-22bp，Tm55-65℃，其中前后引物Tm值相差4℃，产物大小为100-400bp；
4）菊花SSR引物有效性和通用性鉴定
提取不同栽培菊花的DNA，统一稀释为50ng/μl，-20℃保存备用。PCR反应体系采用10μL的反应体系，其中包括50ng模板DNA，1.5mmol·L-1Mg2+、400μmol·L-1dNTPs、0.5U TaqDNA聚合酶、1μmol·L-1引物及10×PCR buffer。
SSR反应程序为：94℃预变性5min；然后进入30个循环94℃变性30s，55-60℃复性30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min。
反应结束后，产物加入2μL loading buffer，以100bp DNA ladder为DNA分子量标准，采用8%的非变性聚丙烯酰胺进行电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，200V稳压电泳2-2.5h，至loading buffer移到凝胶底部时电泳结束。电泳结束后，采用银染法染色，最后将凝胶置于凝胶成像系统上拍照，若有100‐400bp扩增子检测出，该引物即为有效引物；利用其近缘属不同野生种材料的DNA进行引物通用性鉴定，若有100‐400bp扩增子检测出，该引物即具有通用性。
2.根据权利要求1所述的菊花SSR引物的开发方法，其特征在于步骤1）所述的菊花EST序列的获得：登陆NCBI网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，选择dbEST数据库，以栽培菊花拉丁名Chrysanthemum morifolium为关键词，进行菊花EST数据检索，将获取到的数据以fasta格式保存并下载，以便进一步利用；将下载的数据使用SeqVerterTM软件进行序列格式转化为DNAStar格式，保存以便进一步利用；将格式化后的序列利用序列克隆载体去除软件VecScreen进行处理http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html，去除序列中污染的克隆载体序列。
3.根据权利要求1所述的菊花SSR引物的开发方法，其特征在于步骤2）中所述的过短的序列指大小小于100bp的序列，所述的过长的序列指大小大于2000bp的序列。
4.利用权利要求1所述的菊花SSR引物的开发方法获得的菊花SSR引物对，其特征在于包括以下引物对中的任意一对:
引物1：正向引物：SEQ ID NO.1，反向引物：SEQ ID NO.2；
引物2：正向引物：SEQ ID NO.3，反向引物：SEQ ID NO.4；
引物3：正向引物：SEQ ID NO.5，反向引物：SEQ ID NO.6；
引物4：正向引物：SEQ ID NO.7，反向引物：SEQ ID NO.8；
引物5：正向引物：SEQ ID NO.9，反向引物：SEQ ID NO.10；
引物6：正向引物：SEQ ID NO.11，反向引物：SEQ ID NO.12；
引物7：正向引物：SEQ ID NO.13，反向引物：SEQ ID NO.14；
引物8：正向引物：SEQ ID NO.15，反向引物：SEQ ID NO.16；
引物9：正向引物：SEQ ID NO.17，反向引物：SEQ ID NO.18；
引物10：正向引物：SEQ ID NO.19，反向引物：SEQ ID NO.20；
引物11：正向引物：SEQ ID NO.21，反向引物：SEQ ID NO.22；
引物12：正向引物：SEQ ID NO.23，反向引物：SEQ ID NO.24；
引物13：正向引物：SEQ ID NO.25，反向引物：SEQ ID NO.26；
引物14：正向引物：SEQ ID NO.27，反向引物：SEQ ID NO.28；
引物15：正向引物：SEQ ID NO.29，反向引物：SEQ ID NO.30；
引物16：正向引物：SEQ ID NO.31，反向引物：SEQ ID NO.32；
引物17：正向引物：SEQ ID NO.33，反向引物：SEQ ID NO.34；
引物18：正向引物：SEQ ID NO.35，反向引物：SEQ ID NO.36；
引物19：正向引物：SEQ ID NO.37，反向引物：SEQ ID NO.38；
引物20：正向引物：SEQ ID NO.39，反向引物：SEQ ID NO.40。
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