CN103421769A - 一种与猪胴体性状相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种与猪胴体性状相关SNP分子标记的制备与应用，从猪Col2A1基因中克隆获得一种作为分子标记应用的与猪胴体性状相关的基因片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，在SEQ ID NO：1的276bp处有一个A276-G276的碱基替换，导致SmaI-RFLP多态性。本发明还公开了制备与猪胴体性状相关分子标记的方法以及制备的分子标记在猪胴体性状多态性检测中的应用，为猪的标记辅助选择提供了一个新的标记。

Description

一种与猪胴体性状相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种利用COL2A1基因单核苷酸多态性预测猪胴体性状的方法及其分子标记，该方法与猪胴体性状相关的SNP分子标记有关。 

背景技术

分子标记辅助选择是基因工程在现代家畜育种中的一项重要应用，通过分子标记的方法，不仅能缩短育种时限，大大减少育种的人力物力消耗；另外，分子标记的多样性更使得分子标记在动物育种中的应用潜力大大提高（鲁绍熊,吴常信.,2000）。用于辅助选择的分子标记包括蛋白质标记，微卫星标记，SNP标记等。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态，形成的遗传标记。其数量多，多态性丰富。其检测方法包括PCR-SSCP，PCR-RFLP，测序及SNP芯片等。限制性内切酶片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过琼脂糖电泳进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性）(BeuzenN.D.,et al.2000)。 

研究表明，猪的体长等体尺数据遗传力高，与体重，繁殖率等经济性状显著相关。而骨骼的发育直接影响体长。因此影响骨骼发育的基因成为我们寻找与猪体长数据相关基因的候选对象。II型胶原α1链（COL2A1）基因编码主要的软骨基质蛋白II型胶原是软骨基质的主要蛋白质，也是软骨细胞特异性标志蛋白之一。该蛋白是透明软骨和玻璃体的主要组成部分，由三个相同的多肽链形成纤维，是一个重要的细胞外基质的结构组成。COL2A1基因能否正常表达对软骨的发育具有决定作用，该基因是软骨细胞增殖时所不可或缺的基因，而软骨的发育又是骨骼发育的基础。发生在该基因第23外显子1510G→A的突变，直接导致先天性脊柱骨骺发育不良，其症状表现为脊柱弯曲，个头矮小等症状。猪的COL2A1基因位于第5号染色体，全长为23725Kb，拥有40个外显子。研究表明，猪COL2A1基因在骨关节炎病变组织中的表达量下调（Jefferies et al.,2002）；与前腿踝骨疾病和前肢不整齐脚趾性状显著相关（Fan Bin,et al.,2009）。 

目前，针对猪胴体性状的分子标记研究很少，本发明在猪COL2A1基因的编码区找到的体尺性状SNP分子标记属首次发现。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种与猪胴体性状相关的单核苷酸多态性（SNP）分子标记。本发明另一个目的在于提供与猪胴体性状相关的单核苷酸多态性分子标记的应用。 

本发明的技术方案如下所述： 

申请人从报道的猪Col2A1基因中克隆得到一种与猪胴体性状相关的SNP分子标记，其核苷酸序列如下所示： 

GCCTTGTTCG CCTTTGAAGC CAGCAATTCC AGGCTCACCC TTGACAAAGG AGAAAGGCAG GTTCTCACAT 

TCTCTTCTTT CCGTGGCCCT GCCCCCACCT CCCAAGACCC TTGAAGGCAT CCACTGAAGG ACACGGTGTG 

CGCTCAGGAA GGGGAGATGC AGGTATGATT CCAGGGCCGT TGGTAGGCCT TGGGGTTCCC TCTGGGTCTT 

ACCGTTTGAC CTTTCGGGCC CAGAGGACCA GTTGCACCTT GAGGGCCGGG TGGACCACGG GGCCCRGGGA 

AGCCAGGAGC ACCAGCAATG CCAGGAGCAC CCTGTCGGCA TGAGCAGAAA GAGGGGCATC AGGAAAGAGG 

TTGAGGAGGG ACTGAC 

上述序列中的276位中的R是A或G，导致SmaI-RFLP多态性。 

申请人设计了扩增上述Col2A1基因片段的引物对（该引物对也是扩增本发明的分子标记的引物对），其DNA序列如下所示： 

正向引物：5'GCCTTGTTCGCCTTTGA 3'； 

反向引物：5'GTCAGTCCCTCCTCAACCTC 3' 

具体方法是：提取猪基因组DNA；根据http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/中公布的猪Col2A1基因序列信息，SNP登录号为：rs80827825SNP位点的信息，设计PCR扩增引物（其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示）。用该引物对进行PCR扩增，得到长为366bp的扩增片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示（或见图1，其中：序列中的R显示碱基突变位置，即第276位），该突变导致SmaI-RFLP多态性，进而对所获得的PCR产物酶切分型，进行基因型与猪胴体性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供一个新的分子标记。 

更详细的技术方案参见《具体实施方式》。 

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是从ncbi网站下载的猪Col2A1基因全序列中的的部分核苷酸序列。 

图1：猪COL2A1基因rs80827825SNP多态位点酶切判型结果。图中：M泳道为DNA分子量标记(DL2000，Takara)。 

图2：QPCR检测rs80827825SNP位点不同基因型个体的胴体性状与猪COL2A1基因表达的 关系。 

图3：应用QPCR检测rs80827825SNP位点不同基因型个体的胴体性状与猪COL2A1基因表达的关系(图中纵坐标显示的是相对表达量)。 

具体实施方式

实施例1： 

一、猪基因组DNA提取（样品为纯种大白猪，由中国湖北省武汉市华中农业大学实验猪场提供的常规品种） 

本发明所使用猪群体（纯种大白猪）的DNA样品全部采用北京天根生化技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit）（按该试剂盒说明书进行操作）提取，具体步骤如下所述： 

（1）将取自纯种大白猪耳样（组织）放入2ml的EP管中，用酒精棉擦拭干净的眼科手术剪剪成糊状后加入200μl缓冲液GA（该试剂盒自带）。 

（2）再加入20μl蛋白酶K溶液(该试剂盒自带），混匀后置于56℃水浴锅中消化过夜。 

（3）加入200μl缓冲液GB（该试剂盒自带），充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。 

（4）加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。 

（5）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。 

（6）向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD（该试剂盒自带），12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 

（7）向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW（该试剂盒自带），12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 

（8）重复操作步骤7。 

（9）将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 

（10）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。 

（11）对提取出的DNA的浓度及质量进行检测后置于－20℃下保存备用。 

二、rs80827825SNP位点的PCR扩增 

rs80827825SNP位点位于猪Col2A1基因的第20个外显子上，目的片段扩增并检测突变所用引物对的核苷酸序列如下所示： 

正向引物：5'GCCTTGTTCGCCTTTGA3'； 

反向引物：5'GTCAGTCCCTCCTCAACCTC3'； 

反应体系为20μL，其中DNA模板1μL（约100ng）,10×buffer(含Mg2+)2μL，上述正反向引物终浓度各0.3μm，dNTPs混合物终浓度为75μM，0.6U Taq DNA聚合酶，不足部分用双蒸水补足。 

PCR扩增程序：95℃预变性5min，94℃30s，56℃30s，72℃20s，循环35次，最后72℃延伸5min，15℃停止反应。 

本实施例中，PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物，片段全长为366bp。 

三、PCR-SmaI-RFLP检测分子标记G276-A276 

将PCR产物5μL，10xbuffer 1μL，限制性内切酶Sma I为0.5μL(10U)，用双蒸水补足10μL，样品混匀后离心，在37℃培养箱酶切8h或过夜。2%琼脂糖凝胶电泳分离后紫外灯下检测拍照，记录基因型。结果见图1。 

分子标记基因型分析：如图1所示，用上述引物对扩增猪基因组DNA获得的366bp的特异性扩增片段，序列分析在276bp处存在A276-G276突变，并导致Sma I多态性。该基因突变位点由两个等位基因控制，其中A是没有形成酶切位点的等位基因，G是形成酶切位点的等位基因。这两个等位基因可组成三种基因型：其中AA型为未发生酶切的纯合型（电泳检测时只有366bp一条DNA带），GG型为发生酶切的纯合型（电泳检测时出现275bp和91bp的两条DNA带），AG为杂合型（电泳检测时出现366bp，276bp和90bp三条DNA带）。 

实施例2 

一、构建家系及基因型扫描 

用于性状关联分析的试验猪群（纯种大白猪）是由申请人所在的华中农业大学动物遗传育种与繁殖分子生物学实验室与辉瑞制药有限公司合作组建的FCR项目试验群体，该群体由华中农业大学实验猪场喂养，共计236头，体重达到80-100kg时进行屠宰，样品收集分21个批次进行，屠宰测定性状包括关联分析所用的体长数据包括：胴体长（CL）、胴体斜长（CDL）、肋骨数（RN）等。纯种大白猪基因组DNA全部由华中农业大学所在的动物遗传育种与繁殖分子生物学实验室从每个纯种大白猪个体耳缘组织样品中提取获得（制备方法参见实施例1），置于-20°C保存备用。 

对236头纯种大白猪的DNA样品用PCR-SamI-RFLP方法进行基因分型，检测rs80827825SNP位点的多态性。结果表明，AA基因型有142个，基因型频率为0.60；AG基因型81个，基因型频率为0.34；GG基因型有13个，基因型频率为0.06。 

二、猪Col2A1基因分子标记rs80827825SNP位点A276-G276与猪胴体性状的关联分析 

根据本发明所使用的资源家系的群体结构及其影响因素，申请人运用混合线性模型来分析猪Col2A1基因rs80827825SNP位点的不同基因型对测定的猪胴体性状的影响，采用 SAS(Version 8.1，共享软件)软件中Mixed Models程序进行数据处理与统计分析，模型如下： 

Yij＝μ＋genotypei＋εij 

其中，Yij表示处理后的性状值，μ表示每个性状的均值，genotypei表示基因型效应，εij为随机误差。 

分析结果表明，rs80827825SNP位点的多态性与猪胴体直长呈显著相关（P<0.05）；与猪胴体斜长同样呈显著相关（P<0.05）；但是与猪肋骨数的关联不显著。rs80827825位点的多态性与猪体长性状关联分析的详细结果见表1。等位基因G相对于A的平均显性度为0.150，因此G等位基因是猪胴体直长和斜长的有利标记。 

表1猪COL2A1基因rs80827825位点的多态性与胴体直长及部分体长性状的关联分析 

注：^*表示P<0.05。表中性状值为平均数±标准误。 

实施例3猪COL2A1基因在不同胴体体长个体中的表达差异检测 

一、选择个体提取RNA。 

从上述实施例1-2的群体中选取rs80827825位点基因型分别为GG和AA的个体，提取软骨组织总RNA（制备方法如下所述）。测量每个个体的胴体直长和斜长，结果见表2。 

表2 Col2A1基因表达情况QPCR分析个体信息 

总RNA提取采用Invitrogen公司的 

Reagent试剂盒提取，具体操作步骤如下： 

（1）取出保存的纯种大白猪软骨组织样，放入盛有液氮的研钵中研成粉末，称取0.05-0.1g的粉末于1.5mL的EP管中，加入1mlTRIZOL（溶液），剧烈振荡，吹打均匀，并将所得混合液移到1.5mL的EP管中，15-30℃温育5min； 

（2）加入0.2mL三氯甲烷，剧烈振荡15s后于15-30℃温育3min； 

（3）将离心管置于冷冻离心机上，2-8℃，10000rpm/min下离心15min，小心吸取上清转入另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后于15-30℃下温育15min以沉淀总RNA； 

（4）将离心管置于冷冻离心机2-8℃10000rpm/min离心15min，弃上清； 

（5）加入1mL用冰预冷的75%乙醇漂洗，2-8℃7000rpm/min离心5min，弃上清，于室温下干燥10min； 

（6）将提取的总RNA溶于20μL焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水，并取出1μL用 

640核酸蛋白测定仪测定总RNA浓度，余下样品于-20℃保存备用。 

根据ncbi中人和小鼠的序列信息，设计猪COL2A1基因定量PCR引物，检测该基因在不同个体的软骨组织中的表达量。 

正向引物：5'GCCCTGCTGGTCCCCAAGGA3' 

反向引物：5'AAGGCCACTGGGACCTCGCT3' 

反应体系：反应总体积为15μL，其中CDNA模板2μL,2×SYBR 

GreenΙqPCRmix(TOYOBO)7.5μL，上述实施例3中的正、反向引物终浓度各0.3μm，不足部分以双蒸水补足。 

反应程序：94℃预变性4min；94℃20s，60℃30s，72℃20s，40个循环；随后以比退火温度低两℃的温度以每分钟上升0.5℃的程序绘制溶解曲线。每个循环，程序都会记录下每个孔对应的Ct值。 

二、QPCR数据分析：数据分析在Excel中进行，采用的是2-△△Ct法（Livak KJ,,et al.,2001），即反应的相对量以目标基因与内参基因（内参基因为RPL32，其登录号为NM_001001636.1http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/48675934）的Ct值（取三个重复的平均值）的差值ΔCt计算，再选取其中一个样品的ΔCt作为参照（一般情况下以ΔCt最大的作为减数），用其它样品的ΔCt减去参照ΔCt得到ΔΔCt，其中Ct值大于35的视为无表达。最后各基因的相对表达水平以2-ΔΔCt值表示。 

三、结果显示，COL2A1基因在胴体长较长的个体中的表达量明显高于在胴体长较短的个体中的表达量，差异达极显著水平（p＜0.01）（见图2）。 

主要参考文献 

1 鲁绍雄,吴常信.动物育种方法的回顾与展望.国外畜牧科技.2000,27(1):24-28. 

2 Beuzen N.D.,Stear M.J.and Chang K.C.molecular markers and their use in animal breeding.The veterinary journal.2000,160:42-52. 

3 Jefferies D,Farquharson C,Thomson J,et al.Differences in metabolic parameters and gene expression related to osteochondrosis/osteoarthrosis in pigs fed 25-hydroxyvitamin D3.Vet Res.2002,33:383-396. 

3 Bin Fan,Suneel K.O.,BennyE.M.,et al.Large-scale association study for structural soundness and leg locomotion traits in the pig.Genet Sel Evol.2009,41(1):14-24. 

4 Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method.Methods.2001 Dec;25(4):402-8． 

Claims (4)

1.一种与猪胴体性状相关的SNP分子标记，其核苷酸序列如下所示：

GCCTTGTTCGCCTTTGAAGCCAGCAATTCCAGGCTCACCCTTGACAAAGGAGAAAGGCAGGTTCTCACATTCTCTTCTTT

CCGTGGCCCTGCCCCCACCTCCCAAGACCCTTGAAGGCATCCACTGAAGGACACGGTGTGCGCTCAGGAAGGGGAGATGC

AGGTATGATTCCAGGGCCGTTGGTAGGCCTTGGGGTTCCCTCTGGGTCTTACCGTTTGACCTTTCGGGCCCAGAGGACCA

GTTGCACCTTGAGGGCCGGGTGGACCACGGGGCCCRGGGAAGCCAGGAGCACCAGCAATGCCAGGAGCACCCTGTCGGCA

TGAGCAGAAAGAGGGGCATCAGGAAAGAGGTTGAGGAGGGACTGAC

上述序列中的R是A或G，导致SmaI-RFLP多态性。

2.扩增如权利要求1所述分子标记的引物对，其DNA序列如下所示：

正向引物：GCCTTGTTCGCCTTTGA；

反向引物：GTCAGTCCCTCCTCAACCTC。

3.权利要求1所述的分子标记在猪胴体性状检测中的应用。

4.权利要求2所述的引物对在猪胴体性状检测中的应用。

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