KR101623238B1 - 돼지 육질 진단용 단일염기다형성 마커 조성물 및 이를 이용한 돼지 육질의 진단방법 - Google Patents

돼지 육질 진단용 단일염기다형성 마커 조성물 및 이를 이용한 돼지 육질의 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지 육질 진단용 단일염기다형성 마커 조성물 및 이를 이용한 돼지 육질의 진단방법에 관한 것으로서, 서열번호 1 내지 서열번호 8의 26번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 5-50개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돼지 육질 진단용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 SNP 마커를 이용한 돼지 육질의 진단방법 및 진단용 키트를 제공한다. 이를 토대로 육질이 우수한 한국재래돼지 및 개량종돈을 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

돼지 육질 진단용 단일염기다형성 마커 조성물 및 이를 이용한 돼지 육질의 진단방법{Single nucleotide polymorphism marker composition for determination of meat quality in pig and method for determination of meat quality in pig using same marker}
본 발명은 돼지 육질 진단용 단일염기다형성 마커 조성물 및 이를 이용한 돼지 육질의 진단방법에 관한 것이다.
한국재래돼지는 전체 양돈산업에서 차지하는 비중이 매우 낮지만, 현재 제주지역과 강원지역에서 재래돼지를 이용한 브랜드 돈육이 생산되고 있고, 재래돼지고기가 소비자로부터 품질이 우수하다는 인식을 갖고 있다. 하지만 한국재래돼지는 양돈산업경쟁체제에서는 재래돼지의 사료비 대비 낮은 산육능력과 성장률로 인해 수익성이 매우 낮아 양축농가가 생산을 기피하고 있는 실정이다.
한편, 고급육의 돼지고기를 생산하기 위해 돼지를 선발하는 종래의 방법은, 지방형질에 관련된 표현형가에 근거한 방법을 이용하고 있다. 지방은 돼지고기의 맛에 부드러운 조직감과 풍미에 영향을 주기 때문이다. 하지만 최근 육류의 지방을 조성하는 포화지방산을 많이 섭취할 경우 소비자들의 건강에 유해를 일으키며, 육식의 부정적인 인식을 초래하고 있다. 최근 고급육의 소고기를 생산하기 위하여 지방산 조성 (포화지방산/불포화지방산)을 조절하는 유전적 요인을 찾기 위해 연구 중에 있다. 하지만 현재 소고기보다 돼지고기의 소비량이 많은 우리나라에서는 아직 돼지의 유전적 요인에 관한 연구는 매우 미흡한 실정이다.
현재 우리나라 양돈산업은 총체적인 위기국면으로 돌입하고 있다. FTA(자유무역협정) 체결에 따른 수입돈육 가격 경쟁력 증강, 수입 돈육의 점유율 증대, 국산 돈육의 판매부진 및 재고 채화, 안정성, 고품질 및 안정적인 가격 등 소비자 욕구 증가 등 열악한 환경에 처해 있다. 따라서 세계적인 고급품질의 돈육으로 경쟁력을 갖추어야 한다. 따라서 고급 돈육을 생산하기 위한 방법으로 종축을 선발하는 것이다. 최근 가축에 있어서 종축 선발 시 유전체 정보를 포함하는 것이 세계적인 추세로, 돼지 육질관련 단일염기다형성 유전자형은 돼지 선발에 있어서 매우 유용하다.
한편, 한국공개특허 제10-2012-0131724호는 돼지의 육질 진단을 위한 유전자 마커 및 진단방법에 대한 것으로서, 돼지 종돈을 선발하는 경우 정확성을 높이고 유전능력 개량을 극대화할 수 있는 표지인자 도움 선발(marker assisted selection, MAS)에 활용할 수 있는 표지인자에 대해 개시하고 있지만, 본 발명의 SNP 마커에 대한 언급은 없다.
따라서, 본 발명자들은 돼지의 근내지방도, 조회분, pH, CIE-A ,CIE-B, CIE-L과 관련된 정보를 신속하게 판별할 수 있어, 육질이 우수한 한국재래돼지 및 개량종돈을 개발하는데 유용하게 사용될 수 있는 SNP 마커를 개발하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 8의 26번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 5-50개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돼지 육질 진단용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 SNP 마커를 이용한 돼지 육질의 진단방법 및 진단용 키트를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1 내지 서열번호 8의 26번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 5-50개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돼지 육질 진단용 조성물을 제공한다.
상기 SNP 마커는 그 개개로도 돼지 육질 진단용 마커로서 유용하며, 상기 마커를 조합하여 마커수를 많이 포함할수록 육질 진단의 정확도가 높아질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "N>M" (이때, N 및 M은 각각 독립적으로 A, C, T 또는 G이다.)은 유전자 염기서열에서 N 염기가 M 염기로 치환된 것을 의미한다. 한편, 본 명세서의 서열번호 1 내지 서열번호 10의 염기서열은 각각 다중염기기재 방식에 따라 작성하였다.
또한, 본 발명은 (1) 개체로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계; (2) 상기 (1)단계로부터 수득한 DNA을 주형으로 하여, 서열번호 1 내지 서열번호 8의 26번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 SNP 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (3) 상기 PCR 산물로부터 상기 SNP 마커의 유전자형을 확인하는 단계; 및 (4) 상기 유전자형으로 조회분, 근내지방도, pH, CIE-A, CIE-B 및 CIE-L으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 특성을 판별하는 단계를 포함하는 돼지 육질의 진단방법을 제공한다.
상기 DNA의 공급부위는 특별히 한정된 것은 아니며, 일례로, 근육, 표피, 혈액, 뼈, 장기로부터 얻을 수 있고, 바람직하게는 근육 또는 혈액으로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 일례로, 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며 (참조: Rogers & Bendich (1994), 출발물질이 mRNA인 경우에는, 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 8의 26번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 5-50개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 프로브를 포함하는 돼지 육질 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 돼지 육질 진단은 조회분, 근내지방도, pH, CIE-A, CIE-B 및 CIE-L으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 특성을 판별하는 것을 특징으로 한다.
상기 진단용 키트에는 본 발명의 돼지 육질 진단용 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머 뿐만 아니라, 중합 반응에 필요한 시약, 예를 들면 dNTP, 각종의 중합효소 및 발색제 등을 포함할 수 있다. 한편, 본 발명의 키트는 DNA 칩, 마이크로어레이 등으로 응용될 수도 있다.
상기 "증폭시킬 수 있는 프라이머"란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
상기 "프로브"는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 본 발명에 이용되는 프로브는 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 완전하게 (perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 (substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다.
본 발명은 돼지 육질 진단용 단일염기다형성 마커 조성물 및 이를 이용한 돼지 육질의 진단방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 단일염기다형성 마커는 돼지의 근내지방도, 조회분, pH, CIE-A ,CIE-B, CIE-L과 관련된 정보를 신속하게 판별할 수 있어, 육질이 우수한 한국재래돼지 및 개량종돈을 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 돼지 시료 수집
시료는 충북대학교(충북 청원군 샘터농장)에서 제주 난지연구소에 사육한 한국 재래돼지 수컷 3두, 암컷 9두를 요크셔 수컷 3두, 암컷 14두를 양방향으로 교배하여 총 128두의 F1중에서 KY 19두(수컷 5두, 암컷 14두)와 YK 38두(수컷 9두, 암컷 29두)를 임의 선별해 임의 교배시켜 F2를 구축하였고 그 중 235두를 실험집단으로 이용하여 근내지방도, 조회분, pH, CIE-A , CIE-B, CIE-L을 측정하였다. F2 집단의 등심에서 근내지방도의 일반성분 분석을 하였다. AOAC(1990)의 프로토콜에 의하여 흉최장근으로부터 조회분을 측정하였고 도살 후 24시간 지난 후에 pH를 측정하였다. 육질색인 CIE-(A,B,L)은 1℃에서 30분 blooming 된 후에 절단되 표면상에 Minolta Charoameter의해 결정하였다.
< 실시예 2> 유전자형 분석
상기 실시예 1에서 수집한 교잡집단을 대상으로 고밀도 Illumina porcine 62,123 SNPs 어레이를 이용하여 분석하였다. 각각의 SNP에 대하여 형질과 연관분석을 최소자승법을 이용하여 하기 두 단계로 전장연관분석(GWAS)을 수행하였다.
먼저, 표현형을 보정하기 위해, 표현형에 영향을 미치는 부, 성별 그리고 slaughter-date를 고정효과로 도체일령을 공변이로 보았으며 Genome relaionship matrix로 하는 혼합모형(Genomic BLUP)을 적용하여 ASREML version 3.0 software을 실시 하였다. 그 후 잔차, 즉 보정한 표현형 값을 각 SNP에 대하여 연관분석을 실시하였다. 상기 시료들은 임의로 선택된 시료이기에 유전적 관계는 독립적이라 가정하였다.
본 모델은 단순 회귀분석 형태로 분석식은 다음과 같다.
Y = μ + βX + e, X = 1, 0, -1 for 각 SNP의 AA, AB, BB 유전자형
(β는 해당 표현형에 대한 SNP의 상가적(additive) 효과를 나타냄)
각 형질별 연관분석 결과, 유의수준이 1x10-3 이하인 P 값을 가진 SNP를 해당 형질과 통계적 유의도를 가진 연관성을 보인다고 판단하고 이를 선별하였다. 그 결과, 근내지방도, 조회분, pH, CIE-A , CIE-B, CIE-L 과 관련된 6개의 육질 관련 형질과 관련하여 15개의 SNP를 확인하였다.
6개의 육질 관련 형질의 기초 통계량을 하기 표 1에 나타내었다.
변수 N 평균값 표준편차 최소값 최대값 C.V.
C_ash(조회분) 235 1.046 0.145 0.472 1.628 0.139
MAR(근내지방도) 235 2.509 1.081 1 5 0.431
pH 235 5.654 0.262 5.197 6.65 0.046
CIE_L 235 52.363 5.510 33.805 70.96 0.105
CIE_A 235 5.753 2.051 1.658 12.147 0.356
CIE_B 235 7.344 1.784 4.245 14.747 0.243
본 발명을 통해 수득한 형질별로 유의적으로 연관된 SNP 정보를 하기 표 2 내지 표 7에 나타내었다. 각 표에서 Minor allele에 대한 additive 추정값으로 나타내었다.
조회분 관련 SNP 정보
SNP MinorA/
MajorB		 Chr. bp Add stderr P (-)LOGP NAA NAB NBB %σp
M1GA0011405 [G/A] 7 131,384,084 -0.035 0.010 0.001 3.131 38 121 76 0.050
근내지방도 관련 SNP 정보
SNP MinorA/
MajorB		 Chr. bp Add stderr P (-)LOGP NAA NAB NBB %σp
H3GA0022758 [G/A] 7 107,631,473 0.135 0.032 0.000 4.518 47 106 82 0.067
pH 관련 SNP 정보
SNP MinorA/
MajorB		 Chr. bp Add stderr P (-)LOGP NAA NAB NBB %σp
ASGA0032334 [A/G] 7 32,652,249 -0.034 0.009 0.000 3.710 43 121 71 0.060
ALGA0040094 [A/G] 7 32,745,291 -0.031 0.009 0.001 3.206 36 111 88 0.049
DRGA0007481 [G/A] 7 32,759,257 -0.032 0.009 0.001 3.215 27 96 111 0.047
MARC0033365 [G/A] 7 32,879,381 -0.032 0.009 0.001 3.222 27 96 112 0.046
ASGA0032422 [A/G] 7 33,307,828 -0.033 0.009 0.000 3.442 26 96 113 0.050
ASGA0032428 [A/G] 7 33,450,657 -0.033 0.009 0.000 3.442 26 96 113 0.050
ALGA0040181 [G/A] 7 33,471,536 -0.033 0.009 0.000 3.435 26 96 112 0.051
SIRI0000046 [G/A] 7 33,507,326 -0.033 0.009 0.000 3.442 26 96 113 0.050
CIE_L 관련 SNP 정보
SNP MinorA/
MajorB		 Chr. bp Add stderr P (-)LOGP NAA NAB NBB %σp
INRA0028058 [G/A] 7 113,559,818 -1.644 0.491 0.001 3.019 0 80 130 0.065
CIE_A 관련 SNP 정보
SNP MinorA/
MajorB		 Chr. bp Add stderr P (-)LOGP NAA NAB NBB %σp
H3GA0022758 [G/A] 7 107,631,473 0.382 0.072 0.000 6.539 47 106 82 0.099
ASGA0035681 [A/C] 7 107,693,708 -0.352 0.087 0.000 4.122 15 89 131 0.065
CIE_B 관련 SNP 정보
SNP MinorA/
MajorB		 Chr. bp Add stderr P (-)LOGP NAA NAB NBB %σp
H3GA0022758 [G/A] 7 107,631,473 0.247 0.070 0.000 3.323 47 106 82 0.047
ASGA0035681 [A/C] 7 107,693,708 -0.290 0.082 0.001 3.289 15 89 131 0.050
본 발명을 통해 수득한 형질별로 유의적으로 연관된 SNP 염기서열 정보를 하기 표 8 내지 표 12에 나타내었다. 하기 표 8 내지 표 12에서 [A/B]란 염기 A가 염기 B로 점돌연변이된 SNP임을 의미한다.
조회분
SNP RS번호 Probe 서열
번호
M1GA0011405 rs81397066 TCTAGGAGTGGAATTTGCTCACACA[A/G]ATAGATACCGGGTTGACTTTTAAAG 1
근내지방도
SNP RS번호 Probe 서열
번호
H3GA0022758 rs80920694 CACGTGGAAATCAGCCGCAGAATCA[C/T]AGAACTGAGGCCTGAAAGCAGCTGC 9
pH
SNP RS번호 Probe 서열
번호
ASGA0032334 rs80975991 CATAATTTCTCCAGGTCAATCAGCT[C/T]ATAATTTCTCAGGGTGTGAGGAAAA 2
ALGA0040094 rs80975379 GCTGGGAGTTTAGCTGACCTTCTTT[C/T]GCATAAAATTGTGGTTTTCATCCCC 3
ASGA0032422 rs80955385 TACTAACCCGCAGTCGGACAGCTGG[C/T]TGGGTCAAGGAGGTTGGGATGGAAG 4
ASGA0032428 rs80810649 TTGGTCCCAACAGCTCTCGGGTGGG[C/T]GGATGGCCTTGCTTGGGGTTGGGGG 5
ALGA0040181 rs80895410 GCTGGCAGGTGGGCAGAGCCAGGAG[C/T]GACAGTGAACGCAAATCCTGGCCGG 6
SIRI0000046 rs319114622 TGCCTGCGGAGCGGGGAGCAGAAGC[A/G]GGTCACAGACGGTGCACGGCAGGGG 7
CIE_L
SNP RS번호 Probe 서열
번호
INRA0028058 rs336042505 CAGACTCAAAGACATGGAAGACAAA[C/T]CTATRGTTACCAAAGGGGAGATGGA 8
CIE_A 및 CIE_B
SNP RS번호 Probe 서열
번호
H3GA0022758 rs80920694 CACGTGGAAATCAGCCGCAGAATCA[C/T]AGAACTGAGGCCTGAAAGCAGCTGC 9
ASGA0035681 rs80981893 TTATATCCTGAGCAACTGGAAAGAA[G/T]AAGCTGGTATTTCCTGAAAAACAGA 10
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yeungnam University <120> Single nucleotide polymorphism marker composition for determination of meat quality in pig and method for determination of meat quality in pig using same marker <130> ADP-2013-0395 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 51 <212> DNA <213> pig <400> 1 tctaggagtg gaatttgctc acacaratag ataccgggtt gacttttaaa g 51 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> pig <400> 2 cataatttct ccaggtcaat cagctyataa tttctcaggg tgtgaggaaa a 51 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> pig <400> 3 gctgggagtt tagctgacct tctttygcat aaaattgtgg ttttcatccc c 51 <210> 4 <211> 51 <212> DNA <213> pig <400> 4 tactaacccg cagtcggaca gctggytggg tcaaggaggt tgggatggaa g 51 <210> 5 <211> 51 <212> DNA <213> pig <400> 5 ttggtcccaa cagctctcgg gtgggyggat ggccttgctt ggggttgggg g 51 <210> 6 <211> 51 <212> DNA <213> pig <400> 6 gctggcaggt gggcagagcc aggagygaca gtgaacgcaa atcctggccg g 51 <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> pig <400> 7 tgcctgcgga gcggggagca gaagcrggtc acagacggtg cacggcaggg g 51 <210> 8 <211> 51 <212> DNA <213> pig <400> 8 cagactcaaa gacatggaag acaaayctat rgttaccaaa ggggagatgg a 51 <210> 9 <211> 51 <212> DNA <213> pig <400> 9 cacgtggaaa tcagccgcag aatcayagaa ctgaggcctg aaagcagctg c 51 <210> 10 <211> 51 <212> DNA <213> pig <400> 10 ttatatcctg agcaactgga aagaakaagc tggtatttcc tgaaaaacag a 51

Claims (5)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 8의 26번째 뉴클레오티드인 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 5-50개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 조회분, pH 및 국제조명위원회 색도(Commission International de L' Eclairage; CIE)-L로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 특성을 판별하는 것을 특징으로 하는 돼지 육질 진단용 조성물.
  2. 삭제
  3. (1) 개체로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계;
    (2) 상기 (1)단계로부터 수득한 DNA을 주형으로 하여, 서열번호 1 내지 서열번호 8의 26번째 뉴클레오티드인 SNP 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
    (3) 상기 PCR 산물로부터 상기 SNP 마커의 유전자형을 확인하는 단계; 및
    (4) 상기 유전자형으로 조회분, pH 및 국제조명위원회 색도(Commission International de L' Eclairage; CIE)-L로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 특성을 판별하는 단계를 포함하는 돼지 육질의 진단방법.
  4. 서열번호 1 내지 서열번호 8의 26번째 뉴클레오티드인 SNP 마커를 포함하는 5-50개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 프로브를 포함하며, 조회분, pH 및 국제조명위원회 색도(Commission International de L' Eclairage; CIE)-L로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 특성을 판별하는 것을 특징으로 하는 돼지 육질 진단용 키트.
  5. 삭제
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Asian-Aust. J. Anim. Sci. 2011, Vol. 24, No. 9, pp. 1184-1191.
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