CN204417518U - 鸡繁殖基因启动区snp分型及启动子活性检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种鸡繁殖基因启动区SNP分型及启动子活性检测试剂盒，包括盒体、盒体内的衬垫、衬垫上的孔腔，孔腔内分别设有用于DRD1基因5’调控区PCR扩增的上下游引物混合物P、DNA Tag酶、DNA Tag酶扩增缓冲液、dNTP、内切酶缓冲液、MspI内切酶、pGL3-DRD1-570-GG-Basic/promoter质粒1、pGL3-DRD1-570-AA–Basic/promoter质粒2、pGL3-Basic质粒3、pRL-CMV质粒4、转染试剂、1×PBS、Dual-Glo Luciferase Reagent双荧光素酶试剂、Dual-Glo Stop & Glo Substrate双荧光素酶终止反应底物、Dual-Glo Luciferase Reagent Buffer双荧光素酶缓冲液。本实用新型保证了SNP分型的准确性并确定对鸡繁殖性状有显著遗传效应的突变位点，确保了实验结果的准确性，并使实验者省去了构建载体的繁琐步骤。本实用新型设计合理，使用方便、结果可靠且成本低廉。
Description
技术领域
本实用新型属于生物技术领域，利用PCR-RFLP和双报告基因技术检测提供一种鸡繁殖性状相关基因——多巴胺受体D1(DRD1)5’调控区SNP分型及启动子活性快速检测试剂盒。
背景技术
多巴胺受体D1(dopamine receptor D1gene,DRD1)是由七个跨膜区域组成的G蛋白偶联受体家族成员之一。在鸟类中，多巴胺通过血管活性肠肽激活DRD1在下丘脑的水平来刺激催乳素的分泌(Youngren at el,2002)，且经过多巴胺受体阻断剂处理的母鸡抑制了催乳素的分泌，导致了就巢性的终止(Millam at el,1980；Shi at el,1999)，说明鸟类的繁殖行为和多巴胺受体的调节有关。鸡DRD1基因广泛表达于下丘脑和垂体且此表达与鸡的生殖系统有关，且在催乳素较多的产蛋期，DRD1基因在垂体的表达量增加(Chaiseha at el,2003)，说明DRD1基因可能是控制鸡繁殖性状的主效基因或候选基因。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，作为第三代遗传标记已得到飞速发展，目前已经有多种发展成熟的检测技术，如单链构象多态性(SSCP)、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、DNA芯片以及Taqman探针等技术手段。限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术就是利用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分型。该技术具有特异性高、检测快速、通用性强、适用范围广、成本低廉等特点，目前已成功应用于人类疾病及禽病相关基因分子标记的SNP检测和基因诊断试剂盒的研发。
报告基因是一种编码某种易于检测蛋白质或酶的基因，通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控。该技术的主要优点是高灵敏度、可信性及检测方便且适合大规模检测。目前已广泛应用于启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导与药物的筛选等多种细胞事件。随着技术和检测方法的进步，荧光分析以其能够将细胞内报告基因的活性可视化和对细胞的非破坏性而越来越成为主流，因此荧光素酶和绿色荧光蛋白这两种可发出荧光的报告基因成为众多报告基因中的后起之秀。双报告基因技术结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试，在单管中进行双荧光素酶报告基因测试，快速、灵敏、简便。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，双报告基因技术使偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照，使测试不被实验条件变化所干扰，确保了实验结果的准确性。
经过对现有国内外文献和专利的检索，至今未见有DRD1基因5’调控区多态性位点及其启动子活性与鸡繁殖性状相关性的报道。
实用新型内容
本实用新型的目的是为了给鸡繁殖性状相关基因——DRD1基因5’调控区G-570A(由启动子的第一个碱基向调控区方向的第570个碱基)位点的检测提供一种基因分型及启动子活性检测试剂盒，该试剂盒准确性高、快速、价格低廉。
本实用新型的目的是通过以下技术方案实现的，鸡繁殖性状相关基因——DRD1基因5’调控区SNP分型及启动子活性快速检测试剂盒，包括盒体，所述盒体内设有衬垫，衬垫上设有孔腔，孔腔内分别设有用于DRD1基因5’调控区PCR扩增的上下游引物混合物P、DNA Tag酶、DNA Tag酶扩增缓冲液、dNTP、内切酶缓冲液、MspI内切酶、pGL3-DRD1-570-GG-Basic/promoter质粒1、pGL3-DRD1-570-AA–Basic/promoter质粒2、pGL3-Basic质粒3、pRL-CMV质粒4、转染试剂、1×PBS、Dual-Glo Luciferase Reagent双荧光素酶试剂、Dual-Glo Stop&Glo Substrate双荧光素酶终止反应底物、Dual-Glo Luciferase Reagent Buffer双荧光素酶缓冲液。
优选地，所述盒体横截面是圆形。
优选地，所述盒体上设有盒盖，盒盖为圆形。
引物混合物P表示用于DRD1基因5’调控区PCR扩增的上下游引物混合物，引物信息如下：
上游引物S：5'ACAAAGTGAAGAATTGCTCGCCG 3'
下游引物A：5'GCAATCACTTTTCCATGCTTGCAT 3'。
质粒1(pGL3-DRD1-570-GG-Basic/promoter)表示将启动子区域(-570碱基为G)正确插入报告基因质粒(pGL3-Basic)中的重组质粒(大写字母为启动子区域，小写字母为pGL3-Basic质粒部分序列，带框ATG为启动子，带框G为启动子第一个字母向调控区方向的第570个碱基)，其信息如下：
ggtaccgagctcttacgcgtTGCTGGGTTTGTAAGATTTGCTATGCAATTCCAAACCTAAATGAGGAGAAGAGGCGGCCCTGCATCCCAGAGCAAACAGAAACCAAGGTGAAAGGTAGGAGCCAGAATTTCTCATTTCAATAAAACTAAATAACCTGAGCTACTTCTTACTGAAAACCTTTAAAACACACCTGCTCTGTGCTTATTTCCTTTGTCTCTGGAAGTGTAAAACTTGAAACAAAGTGAAGAATTGCTCGCTGTGCTGCCCAGAAGCAGAGAACTGATGGATTTTGTAACAGGAGTGTGCTGAGGAGGAAGGATGGGGTGTTTAATCAGTGAGACACTTAGGGAACCAAAGCAGAGGAA AAGCACCTCGTACAGTACGCATCAGTAAATATGAAGGGCTAGTGCAATGGACGCTGGAAACACTCGATCAATAGTCTATTTAAGTGGGAATATATGCAAGCATGGAAAAGTGATTGCTTTCCGGTCTGTGGGGTATATTTGCAGAGGACAGCAGCAGAACATTTGCAGGTGAGCTGTCTGAATTAGGCTGCTTCGTGCTGGGGTGGTGCAGCGTGTTTCTGAAGGGATCGCTTAAAAACCCCTCTGTATTTGTGCATTTTCGGTTCCTGCTCATAGAGCTTTCAATGTCGTTCAGGGAGATTCAGAGTGGATGAAGTCCATCTGGGCTTGAGGGGACCGTAACCAAGAGCCTTTGGTCTGTCCAGAGATGACTAATTAACGGACGTCTCATGTCTGCTATCTGTAAGGAAAGGAGCTGATGTTGTCATGAGAATCATGATGTGATTTTCCCTCAGGAGAAACTACTTGGAACGACACCACTATGGATGGGGAAGGGTTGCTTGTGGAAAGGGACTCTTCCTTTCGGATCCTCACctcgaGatctgcgatctaagtaagctt。
质粒2(pGL3-DRD1-570-AA-Basic/promoter)表示将启动子区域(-570碱基为A)正确插入报告基因质粒(pGL3-Basic)中的重组质粒(大写字母为启动子区域，小写字母为pGL3-Basic质粒部分序列，带框ATG为启动子，带框A为启动子第一个字母向调控区方向的第570个碱基)，其信息如下：
ggtaccgagctcttacgcgtTGCTGGGTTTGTAAGATTTGCTATGCAATTCCAAACCTAAATGAGGAGAAGAGGCGGCCCTGCATCCCAGAGCAAACAGAAACCAAGGTGAAAGGTAGGAGCCAGAATTTCTCATTTCAATAAAACTAAATAACCTGAGCTACTTCTTACTGAAAACCTTTAAAACACACCTGCTCTGTGCTTATTTCCTTTGTCTCTGGAAGTGTAAAACTTGAAACAAAGTGAAGAATTGCTCGCTGTGCTGCCCAGAAGCAGAGAACTGATGGATTTTGTAACAGGAGTGTGCTGAGGAGGAAGGATGGGGTGTTTAATCAGTGAGACACTTAGGGAACCAAAGCAGAGGAAAAGCACCTCGTACAGTACGCATCAGTAAATATGAAGGGCTAGTGCAATGGACGCTGGAAACACTCGATCAATAGTCTATTTAAGTGGGAATATATGCAAGCATGGAAAAGTGATTGCTTTCCGGTCTGTGGGGTATATTTGCAGAGGACAGCAGCAGAACATTTGCAGGTGAGCTGTCTGAATTAGGCTGCTTCGTGCTGGGGTGGTGCAGCGTGTTTCTGAAGGGATCGCTTAAAAACCCCTCTGTATTTGTGCATTTTCGGTTCCTGCTCATAGAGCTTTCAATGTCGTTCAGGGAGATTCAGAGTGGATGAAGTCCATCTGGGCTTGAGGGGACCGTAACCAAGAGCCTTTGGTCTG TCCAGAGATGACTAATTAACGGACGTCTCATGTCTGCTATCTGTAAGGAAAGGAGCTGATGTTGTCATGAGAATCATGATGTGATTTTCCCTCAGGAGAAACTACTTGGAACGACACCACTATGGATGGGGAAGGGTTGCTTGTGGAAAGGGACTCTTCCTTTCGGATCCTCACctcgaGatctgcgatctaagtaagctt。
与现有技术相比，本实用新型具有以下有益效果：
第一，本实用新型通过设计特异性引物，PCR扩增和RFLP方法，使得产物更具特异性，保证了SNP分型的准确性并确定对鸡繁殖性状有显著遗传效应的突变位点。
第二，本实用新型通过对DRD1基因5’调控区不同基因型载体的构建，细胞转染和双报告基因检测启动子活性，验证了启动区不同基因型启动子活性，确保了实验结果的准确性，并使实验者省去了构建载体的繁琐步骤。
第三，本实用新型设计合理，使用方便、结果可靠且成本低廉。
附图说明
图1是本实用新型鸡繁殖性状相关基因——DRD1基因5’调控区SNP分型及启动子活性快速检测试剂盒的结构示意图；
图2a是细胞铺板示意图；
图2b是细胞铺板后的96孔板加样孔示意图；
图3是细胞转染示意图；
图4是启动子活性检测示意图；
图中：1盒盖，2盒体，3衬垫，4引物混合物P，5DNA Tag酶，6DNA Tag酶扩增缓冲液，7dNTP，8内切酶缓冲液，9内切酶(MspI)，10质粒1(pGL3-DRD1-570-GG-Basic/promoter)，11质粒2(pGL3-DRD1-570-AA–Basic/promoter)，12质粒3(pGL3-Basic)，13质粒4(pRL-CMV)，14转染试剂，151×PBS，16双荧光素酶试剂(Dual-Glo Luciferase Reagent)，17双荧光素酶终止反应底物(Dual-Glo Stop&Glo Substrate)，18双荧光素酶缓冲液(Dual-Glo Luciferase Reagent Buffer)。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本实用新型作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
如图1所示，本实用新型鸡繁殖性状相关基因——DRD1基因5’调控区SNP分型及启 动子活性快速检测试剂盒包括盒盖1、盒体2。盒体内设有衬垫3，衬垫内设有孔腔，孔腔中分别设有引物混合物P 4、DNA Tag酶5、DNA Tag酶扩增缓冲液6、dNTP7、内切酶缓冲液8、内切酶(MspI)9，、质粒1(pGL3-DRD1-570-GG-Basic/promoter)10、质粒2(pGL3-DRD1-570-AA–Basic/promoter)11、质粒3(pGL3-Basic)12、质粒4(pRL-CMV)13、转染试剂14、1×PBS15、双荧光素酶试剂(Dual-Glo Luciferase Reagent)16、双荧光素酶终止反应底物(Dual-Glo Stop&Glo Substrate)17、双荧光素酶缓冲液(Dual-Glo Luciferase Reagent Buffer)18。
盒体横截面可以是圆形。
上述试剂盒还包括盒盖1，盒盖1盖合在盒体上。盒体可以为圆形。
本实用新型试剂盒的使用方法：
1、PCR扩增SNP位点所在片段
1)PCR扩增反应体系准备
PCR的反应体系为25μl，其中包括：
在200μl的PCR薄壁管中，按照以上反应体系加入试剂，充分混匀后短暂离心。
2)PCR扩增反应程序设置
在Eppendorf PCR仪上设置如表1所述，程序设置完毕后，将PCR反应管放入PCR仪进行反应扩增。
表1 PCR扩增反应程序
3)反应结束后，取5μl反应产物在1.5％琼脂糖胶，0.5×TBE中电泳，检测反应是否成 功。
2、RFLP酶切并鉴定基因型
第一步所得PCR产物取7ul，加入2ul内切酶缓冲液，内切酶(MspⅠ)0.5ul，超纯水10.5μl，充分混匀后短暂离心，然后放入37℃水浴锅中水浴8小时，最后取6ul酶切产物在3％琼脂糖凝胶，0.5×TBE中电泳，用凝胶成像分析系统显像，鉴定基因型。
3、启动子活性检测
1)细胞培养
根据实验要求，选择合适的细胞进行培养，等待细胞成长稳定后即可进行细胞铺板。
2)细胞铺板
根据实验要求选择96孔板或48孔板进行细胞铺板，对于特定的细胞类型，我们推荐使用96孔板规格来优化转染条件。将培养好的293T(推荐使用，易活、易生长、转染效率高)细胞按照每孔1-2×104转接到96孔板中，不同基因型的启动子(质粒1和2)建议做5-7重复，并做一组空白对照(质粒3)，待细胞长至70-80％时转染。
3)细胞转染
①在转染前，每孔加100μL新鲜的含血清和双抗的培养基，放置30-60分钟；
②每孔量：加0.2μg pGL3-Basic质粒(如图2a、2b，A排1至7列加质粒1，B排1至7列加质粒2，C排1至7列加质粒3)和0.01μg pRL-CMV到10μL高糖的无血清的DMEM中，振荡离心；
③每孔量：加0.5μL转染试剂到10μL高糖的DMEM中，振荡离心；
④迅速将稀释好的质粒加到稀释好的转染试剂中(注意顺序不能颠倒)；
⑤迅速振荡、离心，并将混合液在室温放置15-20min(注意不要超过20min)；
⑥每孔加入20μL混合液并轻柔混匀；
⑦在转染后24-48小时后检测转染效率。
4)启动子活性检测
①将转染24小时后的细胞用1×PBS洗2次，倒干液体后，每孔加入20ul 1×PBS，并将其对应转入不透光的96孔白板(必须和所用的荧光发光仪相兼容)；
②向每孔中加入20ul双荧光素酶试剂(Dual-Glo Luciferase Reagent)，避光振荡至少10min，让细胞充分裂解，然后在荧光发光仪中测量萤火虫荧光值；
③计算好实验所需的双荧光素酶终止试剂(Dual-Glo Stop&Glo Reagent)的用量，在避光容器中，将双荧光素酶终止反应底物(Dual-Glo Stop&Glo Substrate)以1:100稀释到双荧光素酶缓冲液(Dual-Glo Stop&Glo Buffer)中(切记现用现配，切不可一下稀释所有试剂)， 以得到所需体积的双荧光素酶终止试剂(Dual-Glo Stop&Glo Reagent)。每孔加入20ul稀释好的双荧光素酶终止试剂(Dual-Glo Stop&Glo Reagent)，至少等待10分钟，然后测量海肾荧光值，海肾荧光的平板测量顺序应该与萤火虫荧光相同。
本实用新型通过设计特异性引物，PCR扩增和RFLP方法，使得产物更具特异性，保证了SNP分型的准确性并确定对鸡繁殖性状有显著遗传效应的突变位点。
本实用新型通过对DRD1基因5’调控区不同基因型载体的构建，细胞转染和双报告基因检测启动子活性，验证了启动区不同基因型启动子的活性，确保了实验结果的准确性，并使实验者省去了构建载体的繁琐步骤。
本实用新型设计合理，使用方便、结果可靠且成本低廉。
实施例1
运用本试剂盒对216只文昌鸡DRD1基因5’调控区G-570A SNP位点进行分型。
1、样品
采集216只文昌鸡的血液，应用传统的苯酚/氯仿法提取DNA，并将DNA浓度稀释到50ng/μl。
2、PCR扩增反应及结果
PCR扩增及检测结果按照试剂盒使用方法步骤1进行，DRD1基因PCR产物大小为247bp，与预计的结果一致，1.5％琼脂糖检测结果。
3、DRD1基因PCR扩增产物的RFLP鉴定
DRD1PCR产物RFLP鉴定按照试剂盒使用方法步骤2进行，3％琼脂糖检测结果。
4、DRD1基因质粒1和质粒2重组鉴定
将DRD1基因5’启动区目的片段正确插入载体PGL3-Basic，1.5％琼脂糖检测结果。
5、293T细胞铺板
按照实验要求进行细胞铺板，尽量使细胞贴壁均匀，每个样品7个重复，见图2a、2b。
6、细胞转染
细胞转染操作方法(见图3)：
(1)待细胞长至70-80％时即可进行转染，在转染前，每孔加100μL新鲜的含血清和双抗的培养基，放置30-60分钟；
(2)每孔量：加0.2μg pGL3-Basic质粒(如图2a、2b，A排1至7列加质粒1，B排1至7列加质粒2，C排1至7列加质粒3)和0.01μg pRL-CMV到10μL高糖的无血清的DMEM 中，振荡离心；
(3)每孔量：加0.5μL转染试剂到10μL高糖的DMEM中，振荡离心；
(4)迅速将稀释好的质粒加到稀释好的转染试剂中(注意顺序不能颠倒)；
(5)迅速振荡、离心，并将混合液在室温放置15-20min(注意不要超过20min)；
(6)每孔加入20μL混合液并轻柔混匀；无需去处血清或更换培养条件；
在转染后24-48小时后检测转染效率，无需去处转染试剂和质粒。
7、启动子活性检测
启动子活性检测方法(见图4)：
(1)将转染24小时后的细胞用1×PBS洗2次，倒干液体后，每孔加入20ul 1×PBS，并将其对应转入不透光的96孔白板，向每孔中加入20ul双荧光素酶试剂(Dual-Glo Luciferase Reagent)，避光振荡至少10min，让细胞充分裂解；
(2)测量萤火虫荧光值；
(3)将双荧光素酶终止反应底物(Dual-Glo Stop&Glo Substrate)以1:100稀释到双荧光素酶缓冲液(Dual-Glo Stop&Glo Buffer)中，以得到所需体积的双荧光素酶终止试剂(Dual-Glo Stop & Glo Reagent)；
(4)将双荧光素酶终止试剂(Dual-Glo Stop&Glo Reagent)加入板中，室温放置10分钟至2小时；
(5)测量海肾荧光值。
Claims (3)
1.鸡繁殖基因启动区SNP分型及启动子活性检测试剂盒，包括盒体(2)，其特征是，所述盒体(2)内设有衬垫(3)，衬垫上设有孔腔，孔腔内分别设有用于DRD1基因5’调控区PCR扩增的上下游引物混合物P(4)、DNA Tag酶(5)、DNA Tag酶扩增缓冲液(6)、dNTP(7)、内切酶缓冲液(8)、MspI内切酶(9)、pGL3-DRD1-570-GG-Basic/promoter质粒1(10)、pGL3-DRD1-570-AA–Basic/promoter质粒2(11)、pGL3-Basic质粒3(12)、pRL-CMV质粒4(13)、转染试剂(14)、1×PBS(15)、Dual-Glo Luciferase Reagent双荧光素酶试剂(16)、Dual-Glo Stop&Glo Substrate双荧光素酶终止反应底物(17)、Dual-Glo Luciferase Reagent Buffer双荧光素酶缓冲液(18)。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是，所述盒体横截面是圆形。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征是，所述盒体上设有盒盖(1)，盒盖(1)为圆形。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116287318A (zh) * | 2023-04-14 | 2023-06-23 | 江苏省家禽科学研究所 | 一种高繁慢羽优质肉鸡新品系的制种方法 |
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| CN116287318B (zh) * | 2023-04-14 | 2023-10-20 | 江苏省家禽科学研究所 | 一种高繁慢羽优质肉鸡新品系的制种方法 |
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