CN106191265A - 一种检测公鸡慢羽突变基因型的方法 - Google Patents

一种检测公鸡慢羽突变基因型的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106191265A
CN106191265A CN201610578763.3A CN201610578763A CN106191265A CN 106191265 A CN106191265 A CN 106191265A CN 201610578763 A CN201610578763 A CN 201610578763A CN 106191265 A CN106191265 A CN 106191265A
Authority
CN
China
Prior art keywords
genotype
cock
pcr
dna
fluorescent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610578763.3A
Other languages
English (en)
Inventor
许继国
张细权
聂庆华
李健
林希冉
陈杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Agricultural University
Original Assignee
South China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Agricultural University filed Critical South China Agricultural University
Priority to CN201610578763.3A priority Critical patent/CN106191265A/zh
Publication of CN106191265A publication Critical patent/CN106191265A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于动物育种检测技术领域，具体公开了一种检测公鸡慢羽突变基因型的方法。包括以下步骤：S1.抽取被检测个体的血样DNA，并且将之稀释至40～100nmol/μL；S2.实时荧光定量PCR：荧光定量PCR仪的型号为美国Bio‑rad CFX96；荧光定量试剂为Bio‑rad SYBR Green荧光定量PCR Mix；荧光定量引物序列如SEQ ID NO：1～4所示；S3.计算被检个体的△Ct值，根据△Ct判定个体的基因型，当△Ct>1.5时为杂合子，0.3<△Ct<1.3为纯合子，1.5≥△Ct≥1.3时淘汰。本方法具有周期短，速度快，准确率100%，环节少，不易出错等特点。

Description

一种检测公鸡慢羽突变基因型的方法
技术领域
本发明涉及动物育种检测技术领域，具体地，涉及一种检测公鸡慢羽突变基因型的方法。
背景技术
由于慢羽等位基因(K)控制的慢羽表型对快羽等位基因(k)控制的快羽表型为显性，因此仅仅通过表型无法判定慢羽表型公鸡个体的慢羽等位基因(K)的基因型。申请号为200910062895.0的专利公开了一种鸡快慢羽分子鉴定方法；申请号为201310502809.X的专利公开了一种鸡快慢羽基因型的鉴别方法和及雏鸡雌雄鉴别方法；申请号为201510680524.4的专利公开了一种鸡快慢羽表型的分子鉴定引物及鉴定方法，然而这些分子检测方法也仅仅停留在分辨公鸡是否为慢羽，无法判定其公鸡个体的慢羽等位基因(K)的基因型。申请号201310435980.3的专利公开了一种鸡慢羽纯系的快速选育方法，该方法判定慢羽突变的基因型依然只能通过测交的方法，不仅过程繁杂，费时费力，且容易出错。
发明内容
本发明为了克服现有技术的上述不足，提供了一种检测公鸡慢羽突变基因型的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种检测公鸡慢羽突变基因型的方法，具体包括如下步骤：
S1.抽取被检测个体的血样DNA，并且将之稀释至40～100nmol/μL；
S2.实时荧光定量PCR：荧光定量PCR仪的型号为美国Bio-rad CFX96；荧光定量试剂为Bio-rad SYBR Green荧光定量PCR Mix；荧光定量引物序列如SEQ ID NO:1～4所示；
S3.计算被检个体的△Ct值，根据△Ct判定个体的基因型，当ΔCt>1.5时为杂合子，0.3<ΔCt<1.3为纯合子，1.5≥ΔCt≥1.3时淘汰。
(Elferink MG et al.，BMC Genomics.2008，9(391)基于慢羽突变特点，公开了一种根据纯合子和杂合子之间的拷贝数差异来鉴定慢羽公鸡的慢羽突变等位基因的基因型的方法。本发明申请人依据其提供的方法对已知慢羽基因型的个体进行验证实验时发现，利用不同型号和品牌的实时荧光定量PCR仪以及不同品牌的荧光定量试剂时，其结果并不一致，不能够准确鉴定慢羽基因型。这点发现和以往本领域技术人员的认识不太一样。通常建立一种基础方法之后，本领域技术人员都会认为仪器型号、试剂类型不会对方法的普遍适用性造成根本性影响，但是，本发明发现，利用不同型号和品牌的实时荧光定量PCR仪以及不同品牌的荧光定量试剂时，其结果并不一致，而且，还发现仪器型号、试剂类型、样品DNA浓度对检测结果的影响作用不是独立的，这三种因素之间相辅相成，综合起作用。因此，发明人综合仪器型号、试剂类型、样品DNA浓度对检测结果的综合影响因素，建立了一套准确率100％的检测方法。慢羽表型是由于Z染色体上部分片段重复导致的，在重复片段结合位点两侧设计特异性引物BreakF和BreakR(产物为说明书附图1中的灰色线段)以及重复片段外侧设计特异性引物(产物为说明书附图1中的黑色线段)，利用实时荧光定量PCR的方法，计算Break和Control之间的△Ct值。当被检个体为杂合子时理论的△Ct＝Ct(Break)-Ct(Control)＝1，当被检个体为纯合子时△Ct＝Ct(Break)-Ct(Control)＝0。
作为优选实施方式，步骤S2所述荧光定量PCR扩增体系如下：PCR MIX：10μL、双蒸水:7.6μL、DNA模板：2μL、上游引物：0.2μL、下游引物：0.2μL；扩增程序如下：94℃变性5s；94℃、5s，58℃、5s，72℃、5s 32次循环32次；72℃延伸10min。
更优选地，S1中取被检测个体的血样DNA，并且将之稀释至80nmol/μL。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)周期短，速度快，从拿到待检个体血样到决定被检个体的选淘只需要2天时间，每人每天至少可以完成144个体的检测；(2)准确率100％，由于该方法是检测与慢羽表型相关的致因突变的基因型，因此该方法可以做到100％的准确；(3)环节少，不易出错，与测交等不同，整个过程只涉及采样和基因型分型两个步骤，因此不易出错。
附图说明
图1为检测原理示意图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 不同浓度的DNA对检测结果的影响
本实施例所用动物材料为35只已知为慢羽纯合子的公鸡个体，35只已知为慢羽杂合子的公鸡个体。
一种检测公鸡慢羽突变基因型的方法，包括如下步骤：
S1.DNA抽提：采用一次性注射器从鸡翅下静脉中抽取约1mL血液，注入经高压灭菌并装有约200μL的2％无菌EDTA抗凝剂的1.5mL离心管中，轻轻摇匀，记录翅号，-20℃保存备用。
基因组DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法(奥斯泊F等，1998)：
(1)取全血30μL置于1.5mL离心管，分别加入470μL1×SET缓冲液、12.5μL20％SDS和6μL10mg/mL蛋白酶K，混合均匀后放于55℃水浴过夜；
(2)取出样本于1.5mL离心管，加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；
(3)取上清，再次加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；
(4)取上清，加入500μL氯仿-异戊醇(23：1)轻摇20min，10,000rpm离心10min；
(5)取上清，加入1mL冰无水乙醇(-20℃)，来回摇摆以沉淀DNA，10,000rpm离心10min后倒出乙醇；
(6)用1mL 75％乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱内烘干；
(7)待DNA完全干燥后加入300μL灭菌后的双蒸水溶解，50℃水浴锅中过
夜以溶解DNA；
(8)存放于-20℃冰箱中保存备用。
(9)测定被检个体的DNA浓度，每个样本抽取50μL并且将之稀释至80ng/μL。
S2.实时荧光定量PCR：将上述未稀释和稀释至80ng/uL的DNA样本分别进行实时荧光定量PCR，以检测DNA浓度对于基因型判定的准确性。利用Bio-rad CFX96进行实时荧光定量PCR，定量试剂采用Bio-rad SYBR Green荧光定量PCR Mix。扩增体系为：PCR MIX：10μL、双蒸水：7.6μL、DNA模板：2μL、上游引物：0.2μL、下游引物：0.2μL；
扩增程序为：94℃变性5s，94℃变性5s；94℃、5s，58℃、5s，72℃、5s，循环32次；72℃延伸10min。
S3.计算被检个体的△Ct值：分别计算不同浓度下不同基因型个体对应的△Ct值，结果统计见表1。由结果可以看出，DNA浓度统一为80ng/μL的情况下纯合子对应的△Ct值范围为0.33～1.3，杂合子对应1.5～3.04，两种基因型对应的△Ct值范围无交集；当被检个体DNA未进行稀释统一浓度的情况下，纯合子对应的△Ct值范围为0.45～1.56，杂合子对应1.52～2.99，在其交集范围(1.52～1.56)有1个慢羽纯合子和4个杂合子。从上述结果来看，在统一为80ng/μL的浓度的情况下，能得到的结果准确率为100％，而不统一浓度的情况下7.14％(5/70)的个体尚不能判定准确结果。
表1不同浓度下慢羽纯合子和慢羽杂合子△Ct值统计
同时，发明按照上述方法将DNA浓度分别统一为40ng/μL、100ng/μL、30ng/μL或140ng/μL，分别对35只已知为慢羽纯合子的公鸡个体，35只已知为慢羽杂合子的公鸡个体进行△Ct值统计，发现当DNA浓度分别统一为30ng/μL或140ng/μL时，纯合子对应的△Ct值范围和杂合子对应的△Ct值范围存在交叉现象，不能100％准确判断纯合子和杂合子。
实施例2 两种不同型号实时荧光定量PCR仪对检测结果的影响
本实施例所用动物材料为35只已知为慢羽纯合子的公鸡个体，35只已知为慢羽杂合子的公鸡个体；荧光定量PCR仪型号为ABI 7300与Bio-rad CFX96。
一种检测公鸡慢羽突变基因型的方法，包括如下步骤：
S1.DNA抽提：采用一次性注射器从鸡翅下静脉中抽取约1mL血液，注入经高压灭菌并装有约200μL的2％无菌EDTA抗凝剂的1.5mL离心管中，轻轻摇匀，记录翅号，-20℃保存备用。
基因组DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法(奥斯泊F等，1998)：
(1)取全血30μL置于1.5mL离心管，分别加入470μL1×SET缓冲液、12.5μL20％SDS和6μL10mg/mL蛋白酶K，混合均匀后放于55℃水浴过夜；
(2)取出样本于1.5mL离心管，加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；
(3)取上清，再次加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；
(4)取上清，加入500μL氯仿-异戊醇(23：1)轻摇20min，10,000rpm离心10min；
(5)取上清，加入1mL冰无水乙醇(-20℃)，来回摇摆以沉淀DNA，10,000rpm离心10min后倒出乙醇；
(6)用1mL75％乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱内烘干；
(7)待DNA完全干燥后加入300μL灭菌后的双蒸水溶解，50℃水浴锅中过夜以溶解DNA；
(8)存放于-20℃冰箱中保存备用。
(9)测定被检个体的浓度，并且将之稀释至80ng/μL。
S2.实时荧光定量PCR：实时荧光定量PCR采用Bio-rad SYBR Green荧光定量PCRMix。扩增体系为：PCR MIX：10μL、双蒸水:7.6μL、DNA模板：2μL、上游引物：0.2μL、下游引物：0.2μL；
扩增程序为：94℃变性5s，94℃变性5s；94℃、5s，58℃、5s，72℃、5s，循环32次；72℃延伸10min。
S3.计算被检个体的△Ct值：分别计算不同实时荧光定量PCR仪对应的△Ct值，结果统计见表2。由结果可以看出，Bio-rad CFX96对应的纯合子△Ct值范围为0.33～1.3，杂合子对应1.5～3.04，两种基因型对应的△Ct值范围无交集；用ABI 7300检测纯合子△Ct值为0.3～1.61，杂合子对应的△Ct值范围为1.44～3，在其交集范围(1.44～1.61)有5个慢羽纯合子和6个杂合子。从上述结果来看，应用Bio-rad CFX96能得到的结果准确率为100％，而ABI7300则有15.7％(11/70)的个体尚不能判定准确结果。
表2不同型号实时荧光定量PCR仪对应的△Ct值
实施例3 不同实时荧光定量试剂对检测结果的影响
本实施例所用动物材料为35只已知为慢羽纯合子的公鸡个体，35只已知为慢羽杂合子的公鸡个体；荧光定量PCR仪型号为Bio-rad CFX96。
一种检测公鸡慢羽突变基因型的方法，具体步骤同实施例1，唯一不同的所使用的荧光定量试剂分别为Bio-rad SYBR Green荧光定量PCR Mix或KAPA SYBR FAST qPCRMaster Mix。结果发现，用KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix的试剂根本扩增不出来结果。
实施例4 确认△Ct(Ct(Break)-Ct(Control))值的范围
本实施例所用动物材料为35只已知为慢羽纯合子的公鸡个体，35只已知为慢羽杂合子的公鸡个体。
一种检测公鸡慢羽突变基因型的方法，包括如下步骤：
S1.DNA抽提：采用一次性注射器从鸡翅下静脉中抽取约1mL血液，注入经高压灭菌并装有约200μL的2％无菌EDTA抗凝剂的1.5mL离心管中，轻轻摇匀，记录翅号，-20℃保存备用。
基因组DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法(奥斯泊F等，1998)：
(1)取全血30μL置于1.5mL离心管，分别加入470μL1×SET缓冲液、12.5μL20％SDS和6μL10mg/mL蛋白酶K，混合均匀后放于55℃水浴过夜；
(2)取出样本于1.5mL离心管，加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；
(3)取上清，再次加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；
(4)取上清，加入500μL氯仿-异戊醇(23：1)轻摇20min，10,000rpm离心10min；
(5)取上清，加入1mL冰无水乙醇(-20℃)，来回摇摆以沉淀DNA，10,000rpm离心10min后倒出乙醇；
(6)用1mL75％乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱内烘干；
(7)待DNA完全干燥后加入300μL灭菌后的双蒸水溶解，50℃水浴锅中过夜以溶解DNA；
(8)存放于-20℃冰箱中保存备用。
(9)测定被检个体的浓度，并且将之稀释至80ng/μL。
S2.实时荧光定量PCR：利用Bio-rad CFX96进行实时荧光定量PCR，定量试剂采用Bio-rad SYBR Green荧光定量PCR Mix。扩增体系为：PCR MIX：10μL、双蒸水:7.6μL、DNA模板：2μL、上游引物：0.2μL、下游引物：0.2μL；
扩增程序为：94℃变性5s，94℃变性5s；94℃、5s，58℃、5s，72℃、5s，循环32次；72℃延伸10min。
S3.计算被检个体△Ct值，确认慢羽纯合子与杂合子个体的△Ct值的范围(见表3)。由表3中的数据可以看出纯合子个体的△Ct值范围为0.33～1.30，最大值为1.30；杂合子个体△Ct值范围为1.50～3.04，最小值为1.50。据此我们将判定慢羽基因型的范围标准制定如下：△Ct≥1.50时为杂合子，△Ct≤1.30为纯合子，1.50＞△Ct＞1.30时不做鉴定并且将之淘汰。
表3 35只已知为慢羽纯合子的公鸡个体和35只已知为慢羽杂合子的公鸡个体的△Ct
注：表格中以斜体标示的为纯合和杂合子对应的△Ct值的最大值和最小值。
实施例5 从被检个体中挑出慢羽杂合子
本实施例所用材料为已知基因型的慢羽个体，其中有杂合子和纯合子。
一种检测公鸡慢羽突变基因型的方法，包括如下步骤：
S1.DNA抽提：采用一次性注射器从鸡翅下静脉中抽取约1mL血液，注入经高压灭菌并装有约200μL的2％无菌EDTA抗凝剂的1.5mL离心管中，轻轻摇匀，记录翅号，-20℃保存备用。
基因组DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法(奥斯泊F等，1998)：
(1)取全血30μL置于1.5mL离心管，分别加入470μL1×SET缓冲液、12.5μL20％SDS和6μL10mg/mL蛋白酶K，混合均匀后放于55℃水浴过夜；
(2)取出样本于1.5mL离心管，加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；
(3)取上清，再次加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；
(4)取上清，加入500μL氯仿-异戊醇(23：1)轻摇20min，10,000rpm离心10min；
(5)取上清，加入1mL冰无水乙醇(-20℃)，来回摇摆以沉淀DNA，10,000rpm离心10min后倒出乙醇；
(6)用1mL75％乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱内烘干；
(7)待DNA完全干燥后加入300μL灭菌后的双蒸水溶解，50℃水浴锅中过夜以溶解DNA；
(8)存放于-20℃冰箱中保存备用。
(9)测定被检个体的浓度，并且将之稀释至80ng/μL。
S2.实时荧光定量PCR：利用Bio-rad CFX96进行实时荧光定量PCR，定量试剂采用Bio-rad SYBR Green荧光定量PCR Mix。PCR反应扩增体系：PCR MIX：10μL、双蒸水:7.6μL、DNA模板：2μL、上游引物：0.2μL、下游引物：0.2μL；扩增程PCR反应扩增程序：94℃变性5s，94℃变性5s；94℃、5s，58℃、5s，72℃、5s，循环32次；72℃延伸10min。
S3.计算被检个体△Ct值，判定个体的基因型。根据△Ct值的范围，将被检个体分型，结果见表4。结果显示79个体中有76个被准确判型，在给出判型结果的76个体中准确率达到了100％；另外3个体不能够判型。从该实施例的结果来看，该方法可以快速准确的鉴定慢羽纯合子公鸡，为慢羽纯系的快速建立提供技术支持。
表4分子方法对已知基因型慢羽个体进行基因型鉴定的结果
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种检测公鸡慢羽突变基因型的方法
<130> 2016
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> ControlF
<400> 1
acgctggctt tcccaacag 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> ControlR
<400> 2
agactgccac ataccagaag ca 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> BreakF
<400> 3
acaagtgtca gactagggct agca 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> BreakR
<400> 4
tgaaaccatc cctggagaga tg 22

Claims (3)

1.一种检测公鸡慢羽突变基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.抽取被检测个体的血样DNA，并且将之稀释至40～100nmol/μL；
S2.实时荧光定量PCR：荧光定量PCR仪的型号为美国Bio-rad CFX96；荧光定量试剂为Bio-rad SYBR Green荧光定量PCR Mix；荧光定量引物序列如SEQ ID NO：1～4所示；
S3.计算被检个体的△Ct值，根据△Ct判定个体的基因型，当△Ct>1.5时为杂合子，0.3<△Ct<1.3为纯合子，1.5≥△Ct≥1.3时淘汰。
2.根据权利要求1以所述的方法，其特征在于，S2中荧光定量PCR扩增体系如下：PCRMIX：10μL、双蒸水: 7.6μL、DNA模板：2μL、上游引物：0.2μL、下游引物：0.2μL；扩增程序如下：94℃变性5s；94℃、5s，58℃、5s，72℃、5s，循环32次；72℃延伸10min。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，S1中将之稀释至80 nmol/μL。
CN201610578763.3A 2016-07-20 2016-07-20 一种检测公鸡慢羽突变基因型的方法 Pending CN106191265A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610578763.3A CN106191265A (zh) 2016-07-20 2016-07-20 一种检测公鸡慢羽突变基因型的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610578763.3A CN106191265A (zh) 2016-07-20 2016-07-20 一种检测公鸡慢羽突变基因型的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106191265A true CN106191265A (zh) 2016-12-07

Family

ID=57491257

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610578763.3A Pending CN106191265A (zh) 2016-07-20 2016-07-20 一种检测公鸡慢羽突变基因型的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106191265A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107937568A (zh) * 2018-01-15 2018-04-20 西南大学 一种prlr基因的新应用及其方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101619354A (zh) * 2009-07-02 2010-01-06 华中农业大学 鸡快慢羽分子鉴定方法
CN103509874A (zh) * 2013-10-23 2014-01-15 北京市华都峪口禽业有限责任公司 鸡快慢羽基因型的鉴别方法及雏鸡雄雌鉴别方法
CN105132580A (zh) * 2015-10-19 2015-12-09 河北农业大学 一种慢羽公鸡基因型的检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101619354A (zh) * 2009-07-02 2010-01-06 华中农业大学 鸡快慢羽分子鉴定方法
CN103509874A (zh) * 2013-10-23 2014-01-15 北京市华都峪口禽业有限责任公司 鸡快慢羽基因型的鉴别方法及雏鸡雄雌鉴别方法
CN105132580A (zh) * 2015-10-19 2015-12-09 河北农业大学 一种慢羽公鸡基因型的检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARTIN G ELFERINK等: "Partial duplication of the PRLR and SPEF2 genes at the late feathering locus in chicken", 《BMC GENOMICS》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107937568A (zh) * 2018-01-15 2018-04-20 西南大学 一种prlr基因的新应用及其方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Persson et al. Comparison between RT droplet digital PCR and RT real-time PCR for quantification of noroviruses in oysters
Hiller et al. A “forward genomics” approach links genotype to phenotype using independent phenotypic losses among related species
Hall et al. A strain‐specific multiplex RT‐PCR for Australian rabbit haemorrhagic disease viruses uncovers a new recombinant virus variant in rabbits and hares
Fortes et al. A single nucleotide polymorphism-derived regulatory gene network underlying puberty in 2 tropical breeds of beef cattle
CN105112569A (zh) 基于宏基因组学的病毒感染检测及鉴定方法
Sooryanarain et al. Hepatitis E virus in pigs from slaughterhouses, United States, 2017–2019
CN105821042A (zh) 人脐带血间充质干细胞基因组稳定性相关的miRNA及其应用
CN104561327B (zh) 一种同时检测马和驴源性成分的双重荧光pcr方法
US20150232952A1 (en) Quantitative genetic analysis of articles including gossypium barbadense and gossypium hirsutum cotton
US20160326601A1 (en) Method for detecting a chicken beard trait
CN108182346B (zh) 预测siRNA针对某类细胞的毒性的机器学习模型的建立方法及其应用
Kito et al. miRNA profiles of tubular cells: diagnosis of kidney injury
Liu et al. A comprehensive catalogue of regulatory variants in the cattle transcriptome
CN102586473B (zh) 一种乙型肝炎病毒基因分型pcr检测试剂盒
CN107236825A (zh) 用于real‑time RPA快速检测和区分PRV野毒和疫苗毒的核酸及方法
CN105821143A (zh) 一种用于检测高血压易感性相关的snp位点的引物及检测方法
CN106191265A (zh) 一种检测公鸡慢羽突变基因型的方法
CN106636466A (zh) 一种乙型肝炎病毒共价闭合环状dna精确定量的方法
Lunt et al. Cultured skin fibroblast cells derived from bluetongue virus-inoculated sheep and field-infected cattle are not a source of late and protracted recoverable virus
CN104313124A (zh) 一种检测牛igf-1基因的特异性引物、其荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法和应用
CN105132562B (zh) 用于鉴定桃果实非酸性状的分子标记、引物对及其应用
CN104561328B (zh) 一种检测食品中狗源性成分的试剂盒及其应用
Kobylak et al. PCR and real‐time PCR approaches to the identification of Arthroderma otae species Microsporum canis and Microsporum audouinii/Microsporum ferrugineum
CN104894266B (zh) 一种检测牛MSTN基因mRNA表达水平的特异性引物和荧光定量检测试剂盒
CN104561329B (zh) 一种检测食品中狍子源性成分的试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination