CN113699245A

CN113699245A - 一种多重pcr体系快速检测鸡快慢羽表型的方法

Info

Publication number: CN113699245A
Application number: CN202110793860.5A
Authority: CN
Inventors: 陈思睿; 吕慧娇; 屈元启; 张康宁; 翟尚昆; 王涛
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-07-14
Filing date: 2021-07-14
Publication date: 2021-11-26

Abstract

本申请提供了一种鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，使用针对PRLR基因和SPEF2基因设计的引物K‑R1：SEQ ID NO.1、引物K‑F1：SEQ ID NO.2和引物K‑R2：SEQ ID NO.3进行扩增。相比传统PCR方法，本申请的3引物PCR方法节约成本，假阴性率低且判断准确。

Description

一种多重PCR体系快速检测鸡快慢羽表型的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域和鸡遗传育种领域，尤其涉及一种3条引物PCR体系快速检测鸡快慢羽表型的方法。

背景技术

在现代养鸡行业中，雌雄鉴别发挥着重要作用。而雌雄鉴别的技术主要有翻肛鉴别和金银羽色、快慢羽速自别雌雄等。由于翻肛鉴别需要鉴别人员掌握一定的技术，且在鉴别过程中会对雏鸡造成伤害，导致雏鸡死亡率增高。故为保证养鸡行业的经济效益，采用一种对鸡群无伤害的雌雄自别技术显得格外重要。

鸡的自别雌雄中，快慢羽速鉴别的应用最为广泛。羽速鉴别比翻肛鉴别速度快、准确率高、对雏鸡伤害小，不需要饲养人员掌握一定的技术，操作简单，直接凭肉眼分辨雏鸡快慢羽速即可鉴别公母。雏鸡在出生时，被羽主要为主翼羽和覆主翼羽。根据主翼羽和覆主翼羽的长短大小，可以将雏鸡分为快羽和慢羽。主翼羽明显长于覆主翼羽的为快羽，主翼羽等于或明显短于覆主翼羽的为慢羽。不同雏鸡个体翼羽的生长速度差异较大，主要是受Z染色体上的一对等位基因的控制。慢羽相对于快羽为显性，显性基因座用K表示，隐性基因座用k表示(Serebrovsky,1922)。目前，在家禽生产应用中，快慢羽自别雌雄已经建立许多商品鸡配套系。主要都是用快羽公鸡(kk)和慢羽母鸡(KW)杂交，所得后代公鸡均为慢羽(Kk)，母鸡均为快羽(kW)，且在雏鸡出壳24小时以内能够用肉眼区分，能快速准确的鉴别雌雄并分开饲养。因此，快慢羽基因被广泛应用于现代蛋鸡和肉鸡生产中，创造了巨大的经济效益。

Bacon等(1988)研究白来航中的ev21群体发现慢羽基因座K与禽内源性白血病毒(ev21)之间的存在紧密的连锁关系(遗传距离<0.3cM)。因此，快慢羽的早期判断主要是通过检测个体中是否有内源病毒ev21的插入。有ev21插入的个体判为慢羽，没有插入的个体为快羽。但随后Boichard等(1994)研究发现在一些褐壳系鸡群中，少量快羽个体中也有ev21的插入，而且一些慢羽个体中不存在ev21的插入。在伊莎(ISA)肉鸡的一些品系中，发现了少量的慢羽个体并不存在ev21原病毒的基因序列。因此，仅凭是否有ev21的插入来鉴别快慢羽个体是不够的。Elferink等(2008)发现了快羽基因座k位点与慢羽基因座K位点的差异,推测了K/k等位基因座的结构：认为慢羽基因座K横跨PRLR基因和SPEF2基因，并有约176kb的串联重复，并开发了一种能够区分纯合与杂合晚羽雄性鸡的测试方法；随后罗成龙等(2012)利用了SNP对快慢羽杏花鸡羽速性状进行了基因组关联分析，证实了Elferink等人的猜想；卜贵鲜等(2013)在罗曼鸡的慢羽K基因座上发现了一个新的重复PRLR基因。

发明内容

本发明人通过大量创造性试验进行研究和探索，提供一种3条引物PCR体系快速检测鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，该方法能准确、快速的鉴定鸡快慢羽的表型。

一方面，本申请提供了一种鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，其特征在于，使用针对PRLR基因和SPEF2基因设计的引物组进行扩增。

进一步地，引物组中的引物序列为引物K-R1：SEQ ID NO.1；引物K-F1：SEQ IDNO.2；引物K-R2：SEQ ID NO.3；。

进一步地，方法包括DNA提取的步骤。

进一步地，方法包括以琼脂糖凝胶电泳检测的步骤。

进一步地，琼脂糖凝胶电泳检测中快羽个体只有一条带，长度为445bp；慢羽个体有两条带，长度分别为235bp和445bp；引物对K-F1和K-R1扩出445bp的条带，而引物对K-F1和K-R2扩出235bp的条带。

进一步地，扩增的反应体系为：2×PCR Mix 7.5μL、ddH₂O 5.6μL、引物K-F1 0.3μL、引物K-R1 0.3μL、引物K-R2 0.3μL、DNA模板1μL；

进一步地，扩增的反应程序为：①95℃5min，②95℃30sec，③60℃30sec，④72℃30sec，⑤Go to②for 35cycles，⑥72℃10min，⑦4℃保存。

另一方面，本申请提供了上述方法在鸡雌雄鉴定中的应用。

另一方面，本申请提供了上述方法在鸡育种中的应用。

另一方面，本申请提供了上述方法在鸡遗传学研究中的应用。

另一方面，本申请提供了一种鸡快慢羽表型的PCR鉴定试剂盒，其特征在于包含以下引物：引物K-R1：SEQ ID NO.1；引物K-F1：SEQ ID NO.2；引物K-R2：SEQ ID NO.3。

本申请中DNA提取步骤可以使用已知的提取方法或者试剂盒进行。

琼脂糖凝胶电泳结果的检测可以采用目视、仪器等方式进行，不排除进一步酶切扩增产物以满足某些检测方式的需求。

有益效果：

与现有技术相比，本发明涉及的鸡羽型分子鉴定方法具有如下优点：

(1)利用已知快慢羽表型建立起的鸡快慢羽表型的鉴定方法，通过鉴别结果与已知表型之间的对比，快慢羽表型准确率100％。

(2)与4条引物的多重PCR法相比，本发明采用3条引物多重PCR法，操作简单、工作量小、节约成本。

(3)与常规PCR法相比，本发明采用3条引物多重PCR法，能够有效的降低假阴性率。

附图说明

图1为引物特异性检测结果：图中4、5、6、7泳道只有一条条带，长度为445bp,为快羽；9、10、11、12泳道有两条条带，长度从下往上分别为235bp和445bp,为慢羽；泳道2、8、13为DNA MarkerI，从下向上分别为100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp；泳道2为200bpladder，从下至上(前四条)分别为200bp,400bp，600bp,800bp；泳道3为空白对照检测引物特异性。；

图2为扩大群体检测部分结果：图中，2-25泳道均有两条条带，长度从下往上分别为235bp和445bp,为慢羽；泳道1为DNA MarkerI，从下向上分别为100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp。；

图3为扩大群体检测部分结果：图中，2-25泳道只有445bp的条带，为快羽；泳道1为DNA MarkerI，从下向上分别为100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp。。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的一种多重PCR体系快速检测鸡快慢羽表型的方法做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

以下实施例中所使用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。

实施例1一种3条引物PCR体系快速检测鸡快慢羽表型的方法建立与可靠性验证

鸡快慢羽基因座已被定位在10.38Mb～11.63Mb区间(2.1版本鸡基因组物理图谱为9.86Mb～11.11Mb)(ICGSC Gallus_gallus-4.0/galGal4,Nov.2011,UCSC)。Elferink等(2008)首次提出了K基因的结构，认为慢羽基因座K横跨PRLR基因和SPEF2基因，并有约176kb的串联重复。本发明主要是针对串联重复的两个基因：PRLR基因和SPEF2基因序列进行引物设计，通过不同的个体进行检测、验证。

(1)引物设计及合成

根据快、慢羽基因结构的差异设计特异性引物，并由上海生工进行合成。(PRLR基因和SPEF2基因序列信息分别如下：

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_006127.3？report＝genbank&from＝10470115&to＝10500913&strand＝true

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_006127.3？report＝genbank&from ＝10653561&to＝10723067)然后确定引物特异性，进行PCR扩增，选择最优的PCR反应体系及条件。

引物K-R1：5′-TGGTCCATAA CTGTTGAGAC-3′(SEQ ID NO.1)

引物K-F1：5′-TCCACATGGCCTGCAGTTCA-3′(SEQ ID NO.2)

引物K-R2：5′-GTCAGACTAG GGCTAGCATT-3′(SEQ ID NO.3)

(2)鸡血DNA的提取

①采取传统酚-仿法提取鸡(已知快慢羽表型)的DNA

提取步骤：

1)取鸡新鲜血液30μL于2mL离心管内，加细胞裂解液700μL；

2)加蛋白酶k(20mg/L)20μL，然后放在匀速翻转振荡器上振荡20min；

3)充分混匀后,放在恒温振荡水浴锅里55℃消化过夜(约12-15h)；

4)向样品中加600μL的Tris-酚，振荡10min后，12000rpm室温离心10分钟；

5)吸约600μL上清液至2mL新离心管(弃下层溶液)，然后重复步骤4；

6)吸约500μL上清液至2mL新离心管；

7)加酚仿(Tris-酚和氯仿等体积混合配制，静置过夜)600μL,充分振荡10分钟；

8)12000rpm室温离心10分钟；

9)吸约400μL上清液至2mL新离心管，加氯仿600μL，充分振荡10分钟；

10)12000rpm室温离心10分钟；

11)吸约300μL上清液至1.5mL新离心管(预先加入1mL无水乙醇)；

12)上下翻转、颠倒直至絮状DNA沉淀析出；

13)8000rpm室温离心5分钟，弃上清；

14)加70％的酒精300μL洗涤沉淀；

15)重复步骤13；

16)离心管开盖，置于通风橱内风干DNA 2-3h；

17)加ddH₂O或TEb保存液100-200μL，4℃溶解；

②快速提取鸡血DNA：

裂解液：

10×PCR Buffer 10μL

蛋白酶K 30μL

ddH₂O 60μL

分装，每管10μL，然后加入1μL抗凝血。55℃消化30min，95℃15min，4℃保存。进行PCR时吸取1μL该裂解液作模板。

(3)PCR反应体系

15μL体系：

反应程序：

(4)琼脂糖凝胶检测

用移液枪吸取2-3μL的PCR产物于2％的琼脂糖凝胶上进行检测，电压采用110V，电泳时间为40分钟，采用DNAmarker I做标记。

(5)检验方法的可靠性

借助698份已知快慢羽表型个体的鸡血样DNA，利用该方法鉴定其表型，并与已知的表型结果进行对比，检验该鉴定方法的可靠性。本实验所用血样采自于中国农大涿州养殖基地的洛岛白、白来航。

①首先通过预实验，选择已知快慢羽表型个体共8个，采集血液，提取DNA，进行PCR扩增，上样到2％的琼脂糖凝胶上进行检测，电压采用110V，电泳时间为40分钟,采用DNAmarker I做标记，并设计空白对照检测引物特异性。检测结果与快慢羽表型记录100％吻合，检测结果如图1所示。

②然后扩大实验群体，选择已知快慢羽表型个体共698个，采集血液，提取DNA，进行PCR扩增，上样到2％的琼脂糖凝胶上进行检测，电压采用110V，电泳时间为40分钟，采用DNA marker I做标记。通过检测结果进行快慢羽表型判别，然后与血样记录进行核对，检测结果与快慢羽表型记录100％吻合；部分结果如图2、图3所示。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种多重PCR体系快速检测鸡快慢羽表型的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

tggtccataa ctgttgagac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

tccacatggc ctgcagttca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

gtcagactag ggctagcatt 20

Claims

1.一种鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，其特征在于，使用针对PRLR基因和SPEF2基因设计的引物组进行扩增。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述引物组中的引物序列为引物K-R1：SEQ IDNO.1；引物K-F1：SEQ ID NO.2；引物K-R2：SEQ ID NO.3。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括DNA提取的步骤。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述方法包括以琼脂糖凝胶电泳检测的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其中琼脂糖凝胶电泳检测中快羽个体只有一条带，长度为445bp；慢羽个体有两条带，长度分别为235bp和445bp；引物对K-F1和K-R1扩出445bp的条带，而引物对K-F1和K-R2扩出235bp的条带。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中扩增的反应体系为：2×PCR Mix 7.5μL、ddH₂O 5.6μL、引物K-F1 0.3μL、引物K-R1 0.3μL、引物K-R2 0.3μL、DNA模板1μL。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中扩增的反应程序为：①95℃5min，②95℃30sec，③60℃30sec，④72℃30sec，⑤Go to②for 35cycles，⑥72℃10min，⑦4℃保存。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法在鸡雌雄鉴定中的应用。

9.根据权利要求1-7任一项所述的方法在鸡育种中的应用。

10.一种鸡快慢羽表型的PCR鉴定试剂盒，其特征在于包含以下引物：引物K-R1：SEQ IDNO.1；引物K-F1：SEQ ID NO.2；引物K-R2：SEQ ID NO.3。